RS60031B1

RS60031B1 - Humanizovana anti-tau(ps422) antitela i načini upotrebe

Info

Publication number: RS60031B1
Application number: RS20200281A
Authority: RS
Inventors: Joerg Benz; Bernd Bohrmann; Guy Georges; Ulrich Goepfert; Fiona Grueninger; Hubert Kettenberger; Olaf Mundigl; Michael Schraeml
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2020-04-30
Also published as: BR112016013562A2; PH12016500940A1; PT3083680T; ES2778498T3; SG11201605044RA; DK3083680T3; MX2016007208A; EP3083680A1; US9562091B2; TW201630933A; SI3083680T1; TWI545132B; KR20160099088A; EA201600473A1; IL245862A0; US10465000B2; US20170129949A1; AU2014368696A1; PL3083680T3; CL2016001519A1

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovana anti-tau(pS422) antitela koja se specifično vezuju za fosforilovani tau fragment ID. BR. SEKV.: 03 i njihovu upotrebu za lečenje bolesti mozga.

OSNOVA

Humani tau (tau protein povezan sa mikrotubulama (protein neurofibrilarnog klupka, upareni spiralni filament-tau, PHF-tau)) je neuronski protein povezan sa mikrotubulama koji se pretežno nalazi u aksonima i funkcijama za promociju polimerizacije tubulina i za stabilizaciju mikrotubula. U ljudskom mozgu se nalazi osam izoformi (izoforma A, B, C, D, E, F, G, fetalni-tau), a najduža izoforma sadrži 441 aminokiselinu (izoforma F, Uniprot P10636-8). Tau i njegova svojstva opisuju i Reynolds, C.H., i sar., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198.

Tau je u svom hiperfosforilovanom obliku glavna komponenta uparenih spiralnih filamenata (PHF), koji su gradivni blokovi neurofibrilarnih lezija kod Alchajmerove bolesti (AB) mozga. Tau se može fosforilovati na svojim serinskim ili treoninskim ostacima pomoću nekoliko različitih kinaza, uključujući GSK3beta, cdk5, MARK i članove porodice MAP kinaza.

Za tauopatije je karakteristična abnormalna hiperfosforilacija tau, i to su, prema Iqbal, K., i sar. (Biochim. Biophys. Acta 1739 (2005) 198-210):

• Alchajmerova bolest, uključujući samo oblik bolesti klupka

• Daunov sindrom kod odraslih

• Guam parkinsonizam-demencija

• Dementia pugilistica

• Pikova bolest

• Demencija sa argirofilnim zrncima

• Frontotemporalna demencija

• Kortikobazalna degeneracija

• Palidopontonigralna degeneracija

• Progresivna supranuklearna paraliza

• Gerstman-Štrojsler-Šajnkerova bolest sa klubadima.

Do sada je pronađeno gotovo 40 mesta serinske (S)/treoninske (T) fosforilacije u tau koji se formira u mozgovima pacijenata sa Alchajmerovom bolešću (Hanger, D.P., i sar., J. Biol. Chem. 282 (2007) 23645-23654). Razvoj tau patologije kod Alchajmerove bolesti je povezan sa njenim stanjem fosforilacije. Međutim, većina od 40 mesta fosforilacije nije povezana sa patologijom bolesti, jer se nalaze i u tau koji je ekstrahovan iz zdravog, fetalnog moždanog tkiva. Samo je nekoliko fosforilacija jedinstveno za bolest i smatra se da su odgovorne za abnormalnu agregaciju i karakterističnu nerastvorljivost koja definiše tau u PHF-u mozga sa Alchajmerom (Morishima-Kawashima, M., i sar., J. Biol. Chem.270 (1995) 823-829). Prema Pei, J.J., i sar. (J. Alzheimer’s Disease 14 (2008) 385-392), postojeća literatura pruža ograničene i nejasne podatke o tome koja su od ovih mesta specifična za mozgove sa AB-om. Pei je koristio listu fosfo-specifičnih antitela na tau, i izmerio je njihove nivoe u homogenatima medijalnog temporalnog korteksa kod 22 pacijenta sa AB-om i 10 kontrolnih uzoraka.

Bussiere, T. i sar. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230) su opisali da fosforilovani serin 422 na tau proteinima predstavlja patološki epitop nađen kod nekoliko bolesti sa neurofibrilarnom degeneracijom. Augustinack, J.C., i sar., (Acta Neuropathol.103 (2002) 26-35) su opisali da je pS422 povezan sa težinom neuronske patologije kod Alchajmerove bolesti. Guillozet-Bongaarts, A., (J. Neurochem. 97 (2006) 1005-1014) je opisao fosforilaciju tau u serinu 422 kao deo procesa sazrevanja PHF-a. Takođe je nađeno da je Tau pS422 povezan sa razvojem patologije na različitim modelima Alchajmerove bolesti kod transgenih miševa. Shodno tome, Deters, N. i sar. navode u Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405 da su dvostruko transgeni miševi Dom5/pR5 imali 7-struko povećan broj neurona hipokampusa koji sadrže tau specifično fosforilovani patološki S422 epitop. Goetz, J. i sar. (Science 293 (2001) 1491-1495) su izvestili o pojavi tau fosforilovanog na S422 u mozgu tau P301L transgenih miševa kojima su ubrizgani Abeta42 fibrili.

EP 2 009 104 se odnosi na epitope tau proteina koji se pojavljuju u fosforilovanom stanju u tau proteinu iz PHF-a Alchajmerove bolesti, i na upotrebu pomenutih epitopa za stvaranje antitela koja posebno detektuju tau protein Alchajmera. WO 2002/062851 i US 7,446,180 se odnose na antitela specifična za abnormalno skraćeni oblik tau proteina, i dijagnostičke i terapeutske aspekte vezane za Alchajmerovu bolest i srodne tauopatije.

WO 98/22120 se odnosi na postupak lečenja pacijenta sa Alchajmerovom bolešću, koji uključuje korak davanja pacijentu antitela protiv fosforilovanog tau fragmenta aminokiselina od oko 207 do oko 222, aminokiselina oko 224 do oko 240, i aminokiselina oko 390 do oko 408. Studije na životinjama u kojima je fosforilovani tau fragment 379-408 [P-Ser396,404] korišćen za vakcinaciju tau transgenih miševa spominju Asuni, A.A., i sar., J.

Neuroscience 27 (2007) 9115-9129. US 2008/0050383 se odnosi na postupke lečenja i prevencije Alchajmerove bolesti ili drugih tauopatija kod ispitanika davanjem fragmenta tau proteina.

Hasegawa, M. i sar. (FEBS Lett. 384 (1996) 25-30) izveštavaju o monoklonskom antitelu (AP422) specifičnog za fosfoserin 422 u tau proteinu povezanog sa mikrotubulama.

U WO 01/55725 je prijavljeno antitelo koje specifično prepoznaje tau i antitelo koje specifično prepoznaje fosfo-tau (181) za primenu u postupku za in vivo dijagnozu tauopatije i/ili za in vivo diferencijalnu dijagnozu tauopatije prema netauopatiji.

U WO 02/027017 je prijavljeno antitelo pripremljeno iz polipeptidnog imunogena koji ima fosforilovani serin. WO 02/062851 se odnosi na antitela specifična za abnormalno skraćeni oblik tau proteina, i dijagnostičke i terapeutske aspekte vezane za Alchajmerovu bolest i srodne tauopatije.

U WO 2004/016655 je prijavljeno antitelo specifično za tau protein centralnog nervnog sistema (CNS), naznačeno time što antitelo posebno prepoznaje tau protein CNS-a, ali ne i periferni tau protein, i naznačeno time što antitelo posebno prepoznaje aminokiselinsku sekvencu vezivnog dela između aminokiselinske sekvence kodirane eksonom 4 gena koji kodira tau protein i aminokiselinske sekvence kodirane eksonom 5 istog epitopa.

Monoklonska antitela na tau pS422 su opisana, na primer, u EP 1 876 185. Poliklonska antitela na tau pS422 su komercijalno dostupna (npr., ProSci Inc. i Biosource International).

U WO 2006/055178 je prijavljen postupak za inhibiciju fosforilacije tau proteina na Ser202/Thr205, koji uključuje kontakt uzorka koji sadrži tau protein sa antitelom ili fragmentom vezivanja antigena, koji vezuje amiloidne difuzne ligande beta porekla i na taj način inhibira fosforilaciju tau proteina na Ser202/Thr205.

Preparat antitela koje se specifično vezuje za tau fosforilovan na tyr394 i/ili tyr310 je prijavljen u WO 2007/019273. Studije na životinjama u kojima je fosforilovani tau fragment 379-408 [P-Ser396,404] korišćen za vakcinaciju tau transgenih miševa spominju Asuni, A.A. i sar., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129.

EP 2 009 104 se odnosi na epitope tau proteina koji se pojavljuju u fosforilovanom stanju u tau proteinu iz PHF-a Alchajmerove bolesti, i na upotrebu pomenutih epitopa za stvaranje antitela koja posebno detektuju tau protein Alchajmera.

US 2008/0050383 se odnosi na postupke lečenja i prevencije Alchajmerove bolesti ili drugih tauopatija kod ispitanika davanjem fragmenta tau proteina.

U WO 2010/037135 se navodi izolovani, sintetički ili rekombinantni polipeptid ili peptid koji obuhvata prvi domen koji sadrži ili se sastoji od liganda za receptor krvnomoždane barijere (KMB) ili ekvivalent, i drugi domen koji sadrži ili se sastoji od enzima ili kompozicije koja usporava stopu formiranja proteinskog agregata, inhibira stvaranje proteinskog agregata, ili preokreće, digestira ili rastvara proteinski agregat. Antitelo, posebno monoklonsko antitelo ili njegovi funkcionalni delovi, sposobno da prepozna i veže se za tau protein in vitro i/ili in vivo se navodi u WO 2010/115843.

U WO 2011/026031 se navodi monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje tau oligomere i ne vezuje rastvorljivi tau ili tau fibrile, korisne u lečenju tauopatije, npr., Alchajmerove bolesti, progresivne supranuklearne paralize i kortikobazalne degeneracije. U WO 2011/053565 se navodi izolovano antitelo koje specifično vezuje humani tau protein fosforilovan na jednom ili više Ser(238) i Thr(245).

U WO 2012/045882 se navodi antitelo koje se specifično vezuje za fosfo-epitop na tau proteinu sisara, korisno za lečenje neurodegenerativnih poremećaja poput tauopatija, i za lečenje ili ublažavanje kognitivnih deficita. U WO 2012/049570 se navodi humano monoklonsko anti-tau antitelo ili njegov fragment koji vezuje tau. Postupak za sprečavanje ili lečenje Alchajmerove bolesti ili drugih tauopatija kod ispitanika, koji uključuje primenu antitela na ljude kojima je potrebna terapija za Alchajmerovu bolest ili drugu tauopatiju, antitela koja imaju specifičnost za abnormalne oblike tau proteina, gde pomenuto antitelo ne pokazuje vezivanje i/ili reaktivnost na normalan tau protein i primenjuje se u uslovima i u količini delotvornim za prevenciju ili lečenje Alchajmerove bolesti ili druge tauopatije, prijavljen je u WO 2012/106363.

U WO 2012/149365 se navodi antitelo koje pokazuje reaktivnost sa agregiranim tau i u suštini nema reaktivnost sa neagregiranim tau, naznačeno time što agregirani tau sadrži najmanje dva međusobno umrežena tau proteina, bilo direktno ili preko linkera, na jednom ili više cisteinskih ostataka.

U WO 2010/142423 se navodi kompozicija korisna u lečenju tauopatije, npr., Alchajmerove bolesti, koja sadrži antitelo koje se vezuje za Tau, jedinjenje modifikovano fosforilovanim serinom na specifičnom položaju koje se specifično vezuje za specifični fosforilovani tau i njegov fragment i nosač.

U EP 1 876 185 A se navodi antitelo koje prepoznaje fosforilovane polipeptide. U WO 2013/151762 se navodi humanizovano tau antitelo. U WO 2014/016737 su navedena nova kokošja monoklonska antitela na humani fosforilovani tau i njihova primena. U WO 2014/016737 su navedena nova kokošja monoklonska antitela na humani fosforilovani tau i njihova primena. Antitela koja su selektivna za patološke tau dimere i prefibrilarne patološke tau oligomere i njihova primena u lečenju, dijagnostici i praćenju tauopatija, navedeni su u WO 2012/149365.

REZIME

Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Ovde su opisana antihumana tau(pS422) antitela, posebno humanizovana anti-humana tau(pS422) antitela, i postupci za njihovu primenu.

Humanizovana antitela, kao što je objavljeno ovde, nisu bila dostupna standardnim postupcima humanizacije. Bilo je potrebno uvesti nestandardne mutacije u aminokiselinsku sekvencu kako bi se dobilo humanizovano antitelo sa uporedivim karakteristikama vezivanja kao matično zečje antitelo koje sadrži varijabilne domene sa aminokiselinskom sekvencom ID. BR. SEKV.: 07 i ID. BR. SEKV.: 11. Ovo je posebno važno pošto su antitela, kao što je objavljeno ovde, namenjena prolasku krvno-moždane barijere čoveka i treba da budu efikasna u ljudskom mozgu. Shodno tome, opšte primenjeni kriterijumi za odabir humanizovanih antitela nisu dovoljno strogi da bi se mogli neposredno primeniti u ovom slučaju.

Ovde je opisano (humanizovano) antitelo koje se specifično vezuje za humani tau(pS422), naznačeno time što se antitelo

i) specifično vezuje za polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03, i/ili

ii) ne vezuje za humani tau pune dužine (ID. BR. SEKV.: 01) pri 1 µg/ml, i/ili iii) specifično vezuje za humani tau pune dužine fosforilovan na serinu na položaju 422 (ID. BR. SEKV.: 02), i/ili

iv) specifično vezuje za agregate humanog tau fosforilovanog na serinu na položaju 422 (ID. BR. SEKV.: 02), i/ili

v) specifično vezuje za humani tau koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 01 i koji ima aminokiselinsku mutaciju S422A.

Antitela, kao što je objavljeno ovde, pokazuju selektivnost u odnosu na humani tau fosforilovan na serinu na položaju 422, u odnosu na nefosforilovani humani tau divljeg tipa i tau mutant S422A. Nefosforilovani humani tau divljeg tipa i tau mutant S422A uopšte se ne vezuju, odnosno vezuju se sa nižim afinitetom.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja (humanizovano) antitelo koje se specifično vezuje za humani tau(pS422), naznačen time da antitelo sadrži

a) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, 18 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 13, 14 i 15, ili

b) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, 09 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 12, 05 i 15, ili

c) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, 09 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove ID. BR. SEKV.: 13, 14 i 15.

U jednoj realizaciji, antitelo sadrži

a) varijabilni domen teškog lanca ID. BR. SEKV.: 20 i varijabilni domen lakog lanca ID. BR. SEKV.: 17, ili

b) varijabilni domen teškog lanca ID. BR. SEKV.: 19 i varijabilni domen lakog lanca ID. BR. SEKV.: 16, ili

c) varijabilni domen teškog lanca ID. BR. SEKV.: 19 i varijabilni domen lakog lanca ID. BR. SEKV.: 17, ili

d) varijabilni domen teškog lanca ID. BR. SEKV.: 21 i varijabilni domen lakog lanca ID. BR. SEKV.: 17.

U jednoj realizaciji, antitelo je namenjeno za primenu u lečenju Alchajmerove bolesti. U jednoj realizaciji, antitelo ima utišanu efektorsku funkciju. U jednoj realizaciji, antitelo nema efektorsku funkciju. U jednoj realizaciji, antitelo je potklasa humanog IgG1 i ima mutacije L234A, L235A i P329G u oba teška lanca (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

U jednoj realizaciji, antitelo se

iv) specifično vezuje za agregate humanog tau fosforilovanog na serinu na položaju 422 (ID. BR. SEKV.: 02).

U jednoj realizaciji, antitelo ima vrednost EC50za

a) humani tau(pS422) fragment koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03 od 6 ng/ml ili manje, i/ili

b) humani tau(pS422) pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 02 od 4,5 ng/ml ili manje, i/ili

c) agregate humanog tau(pS422) koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 02 od 30 ng/ml ili manje, i/ili

d) humani tau koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 01 i koji ima aminokiselinsku mutaciju S422A od 125 ng/ml ili manje.

U jednoj realizaciji, antitelo se specifično vezuje za humani tau(pS422) (ID. BR. SEKV.: 02) i ne vezuje za humani tau (ID. BR. SEKV.: 01).

U jednoj realizaciji, antitelo je monoklonsko antitelo.

U jednoj realizaciji, antitelo je fragment antitela koji se vezuje za humani tau(pS422) i i) specifično se vezuje za polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03, i/ili

ii) ne vezuje se za humani tau pune dužine (ID. BR. SEKV.: 01) pri 1 µg/ml, i/ili iii) specifično se vezuje za humani tau pune dužine fosforilovan na serinu na položaju 422 (ID. BR. SEKV.: 02), i/ili

iv) specifično se vezuje za agregate humanog tau fosforilovanog na serinu na položaju 422 (ID. BR. SEKV.: 02), i/ili

v) specifično se vezuje za humani tau pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 01 i koji ima aminokiselinsku mutaciju S422A, i/ili

vi) ima vrednost EC50za humani tau(pS422) fragment koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03 od 6 ng/ml ili manje, i/ili

vii) ima vrednost EC50za humani tau(pS422) pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 02 od 4,5 ng/ml ili manje, i/ili

viii) ima vrednost EC50za agregate humanog tau(pS422) koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 02 od 30 ng/ml ili manje, i/ili

ix) ima vrednost EC50za humani tau koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 01 i koji ima aminokiselinsku mutaciju S422A od 125 ng/ml ili manje.

U jednoj realizaciji, antitelo je

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

c) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G,

d) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G,

e) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu, ili

f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja (humanizovano) anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time što

a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, naznačen time što

i) varijabilni domen sadrži HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, ID. BR. SEKV.: 18 i ID. BR. SEKV.: 10,

ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, naznačen time što C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i

iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, naznačen time što

i) varijabilni domen sadrži HVR-ove ID. BR. SEKV.: 13, ID. BR. SEKV.: 14 i ID. BR. SEKV.: 15,

ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,

i

c) antitelo

i) specifično se vezuje za polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03, i/ili

i) varijabilni domen sadrži HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, ID. BR. SEKV.: 09 i ID. BR. SEKV.: 10,

i) varijabilni domen sadrži HVR-ove ID. BR. SEKV.: 12, ID. BR. SEKV.: 05 i ID. BR. SEKV.: 15,

i

c) antitelo

1

i

c) antitelo

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 20,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

i

c) antitelo

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 19,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 16,

i

c) antitelo

1

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 19,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

i

c) antitelo

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 21, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, naznačen time što C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

i

c) antitelo

U jednoj poželjnoj realizaciji svih aspekata, anti-humano tau(pS422) antitelo je naznačeno time što antitelo u varijabilnom domenu teškog lanca na položajima 4, 24 i 78 ima valinski ostatak.

U jednoj poželjnoj realizaciji svih aspekata, anti-humano tau(pS422) antitelo je naznačeno time što antitelo u varijabilnom domenu teškog lanca na položaju 71 ima argininski ostatak.

1

Ovde je objavljena izolovana nukleinska kiselina koja kodira (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde.

Ovde je objavljena ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu, kao što je objavljeno ovde.

Ovde je objavljen postupak za proizvodnju (humanizovanog) antitela koji obuhvata korake uzgajanja ćelije domaćina, kao što je objavljeno ovde, tako da se proizvodi antitelo.

U jednoj realizaciji, postupak dalje uključuje korak izolovanja antitela iz ćelije ili medijuma za uzgajanje.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je farmaceutska formulacija koja sadrži (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija dalje sadrži dodatni terapeutski agens. U jednoj realizaciji, dodatni terapeutski agens je antiamiloidni terapeutski agens. U jednoj realizaciji, antiamiloidni terapeutski agens je antihumano alfa-sinuklein antitelo ili anti-Abeta antitelo.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu kao lek.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u lečenju Alchajmerove bolesti.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u lečenju prodromalne faze Alchajmerove bolesti.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u lečenju rane faze Alchajmerove bolesti.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u smanjenju neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u održavanju kognitivnog procesa i funkcije.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u usporavanju stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u usporavanju stope akumulacije neurofibrilarnog klupka.

U jednoj realizaciji prethodnih aspekata, primenjuje se za smanjivanje opterećenja neurofibrilarnog klupka čišćenjem tau(pS422).

U jednoj realizaciji prethodnih aspekata, primenjuje se za prevenciju nastanka neurofibrilarnog klupka.

1

U jednoj realizaciji prethodnih aspekata, primenjuje se za uklanjanje/čišćenje neurofibrilarnih klubadi.

U jednoj realizaciji, prevencija i/ili uklanjanje se vrši promovisanjem unutarćelijskog klirensa tau agregata.

U jednoj realizaciji prethodnih aspekata, primenjuje se za inhibiciju širenja neurofibrilarnog klupka. U jednoj realizaciji, inhibicija se vrši prevencijom interneuronskog prenosa patoloških tau oblika/semena.

Ovde su izloženi i postupci lečenja koji obuhvataju davanje (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za lečenje Alchajmerove bolesti, za lečenje prodromalne faze Alchajmerove bolesti, za lečenje rane faze Alchajmerove bolesti, za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422), za održavanje kognitivnog procesa i funkcije, za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja i/ili za usporavanje stope akumulacije neurofibrilarnog klupka.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za proizvodnju leka.

U jednoj realizaciji, lek je namenjen za lečenje Alchajmerove bolesti.

U jednoj realizaciji, lek je namenjen za lečenje prodromalne faze Alchajmerove bolesti.

U jednoj realizaciji, lek je namenjen za lečenje rane faze Alchajmerove bolesti.

U jednoj realizaciji, lek je namenjen za smanjivanje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

U jednoj realizaciji, lek je namenjen za održavanje kognitivnog procesa i funkcije. U jednoj realizaciji, lek je namenjen za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

Ovde je izložen postupak lečenja osobe koja ima Alchajmerovu bolest koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine (humanizovanog) anti-humanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde.

Ovde je izložen postupak za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422) koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine (humanizovanog) antihumanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, radi smanjenja neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

Ovde je izložen postupak za održavanje kognitivnog procesa i funkcije kod pojedinca koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine (humanizovanog) anti-humanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, radi održavanja kognitivnog procesa i

1

funkcije.

Ovde je izložen postupak za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja kod pojedinca koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine (humanizovanog) antihumanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, radi usporavanja stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) anti-humanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) anti-humanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, za održavanje kognitivnog procesa i funkcije.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) anti-humanog tau(pS422) antitela, kao što je objavljeno ovde, za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

Antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene u lečenju Alchajmerove bolesti.

Sa (humanizovanim) antitelima, kao što je objavljeno ovde, može se uticati na inhibiciju/smanjenje progresije Alchajmerove bolesti i neuropatologije.

(Humanizovana) antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene za zaštitu od razvoja Alchajmerove bolesti ili se čak mogu koristiti za zaustavljanje napredovanja Alchajmerove bolesti.

U jednoj realizaciji, (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, i) vezuje se za tau(pS422) u delovima mozga tau(pS422) transgenih miševa i pacijenata sa Alchajmerovom bolešću; i/ili obeležava tau(pS422) u tau(pS422) transgenim ćelijama.

(Humanizovana) antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene u lečenju Alchajmerove bolesti.

Ovde su objavljena (humanizovana) antitela koja se specifično vezuju za aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 03 u humanom tau(pS422).

(Humanizovana) antitela, kao što je objavljeno ovde, specifično se vezuju/prepoznaju oblike humanog tau(pS422) koji su relevantni za ranu i kasnu fazu bolesti.

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za prevenciju širenja Alchajmerove bolesti povezane sa humanim tau(pS422).

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za smanjenje dezintegracije lizozomalne membrane.

1

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za stabilizaciju lizozomalne membrane protiv destabilizacije i/ili dezintegracije indukovane humanim tau(pS422).

Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je primena (humanizovanog) antitela, kao što je objavljeno ovde, za prevenciju progresije Alchajmerove bolesti.

(Humanizovana) antitela, kao što je objavljeno ovde, funkcionišu posredovanjem antitela u inhibiciji zasejavanja humanog tau(pS422) i širenju između ćelija.

(Humanizovana) antitela, kao što je objavljeno ovde, štite lizozome od fibrilarnog oštećenja vezivanjem za humani tau(pS422).

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1: Poravnavanje sekvenci varijabilnih domena zečjeg i humanizovanog lakog lanca; CDR-i su uokvireni.

Slika 2: Poravnavanje sekvenci varijabilnih domena zečjeg i humanizovanog teškog lanca; CDR-i su uokvireni.

Slika 3: Biohemijsko vezivanje različitih kombinacija humanizovanog VH i VL za (A) fosforilovani tau peptid, (B) fosforilovani humani tau pune dužine, (C) nefosforilovani tau peptid, (D) nefosforilovani humani tau pune dužine; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22; koncentracije premaza: fosforilovani tau peptid: 50 ng/ml, svi ostali ciljevi: 1 µg/ml; (uporedivi rezultati se dobijaju ako je fosforilovani tau peptid premazan sa 1 µg/ml (podaci nisu prikazani)).

Slika 4: Biohemijsko vezivanje različitih kombinacija humanizovanog VH i VL za (A) = humani tau S422A mutant pune dužine, (B) = agregirani humani tau(pS422); (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22; koncentracije premaza: fosforilovani tau peptid: 50 ng/ml, svi ostali ciljevi: 1 µg/ml; (uporedivi rezultati se dobijaju ako je fosforilovani tau peptid premazan sa 1 µg/ml (podaci nisu prikazani)).

Slika 5: Vestern blot tehnika prikazuje selektivnost odabranih humanizovanih kombinacija VH/VL; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) =

VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22.

Slika 6: Vezivanje za hiperfosforilovani tau u moždanim ekstraktima kod

1

pacijenata obolelih od Alchajmerove bolesti; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH32/VL22.

KRATAK OPIS SEKVENCI ID. BR. SEKV.: 01 humani tau protein izoforme F (441 ostatak)

ID. BR. SEKV.: 02 humani tau protein izoforme F (441 ostatak) fosforilovan na serinskom ostatku na položaju 422

ID. BR. SEKV.: 03 fragment humanog tau proteina (416 do 430 ostataka ID. BR.

SEKV.: 01) sa fosforilovanim serinom na položaju 7 (odgovara položaju 422 ID. BR. SEKV.: 01): Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp

ID. BR. SEKV.: 04 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 05 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 06 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 07 zečje antitelo 086 VL00

ID. BR. SEKV.: 08 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 09 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 10 zečje antitelo 086

ID. BR. SEKV.: 11 zečje antitelo 086 VH00

ID. BR. SEKV.: 12 varijanta 1 humanizovanog CDRL1 -

ID. BR. SEKV.: 13 varijanta 2 humanizovanog CDRL1 -

ID. BR. SEKV.: 14 varijanta 1 humanizovanog CDRL2 -

ID. BR. SEKV.: 15 varijanta 1 humanizovanog CDRL3 -

ID. BR. SEKV.: 16 varijanta 1 humanizovanog VL - VL21

ID. BR. SEKV.: 17 varijanta 2 humanizovanog VL - VL22

ID. BR. SEKV.: 18 humanizovani

ID. BR. SEKV.: 19 varijanta 1 humanizovanog VH - VH32

ID. BR. SEKV.: 20 varijanta 2 humanizovanog VH - VH20

ID. BR. SEKV.: 21 varijanta 3 humanizovanog VH - VH33

ID. BR. SEKV.: 22 varijanta 2 humanizovanog CDRL2 -

ID. BR. SEKV.: 23 varijanta 3 humanizovanog CDRL2 -

ID. BR. SEKV.: 24 varijanta 2 humanizovanog CDRL3 -

ID. BR. SEKV.: 25 varijanta 3 humanizovanog CDRL3 -

ID. BR. SEKV.: 26 varijanta 4 humanizovanog CDRL3 -

2

ID. BR. SEKV.: 27 varijanta 5 humanizovanog CDRL3 -ID. BR. SEKV.: 28 varijanta 6 humanizovanog CDRL3 -

ID. BR. SEKV.: 29 varijanta 7 humanizovanog CDRL3 -

ID. BR. SEKV.: 30 varijanta 3 humanizovanog CDRL1 -

ID. BR. SEKV.: 31 varijanta 4 humanizovanog CDRL1

ID. BR. SEKV.: 32 varijanta 4 humanizovanog VL - VL01 ID. BR. SEKV.: 33 varijanta 5 humanizovanog VL - VL09 ID. BR. SEKV.: 34 varijanta 6 humanizovanog VL - VL12 ID. BR. SEKV.: 35 varijanta 7 humanizovanog VL - VL15 ID. BR. SEKV.: 36 varijanta 8 humanizovanog VL - VL16 ID. BR. SEKV.: 37 varijanta 9 humanizovanog VL - VL17 ID. BR. SEKV.: 38 varijanta 10 humanizovanog VL - VL19 ID. BR. SEKV.: 39 varijanta 11 humanizovanog VL - VL28 ID. BR. SEKV.: 40 varijanta 12 humanizovanog VL - VL33 ID. BR. SEKV.: 41 varijanta 13 humanizovanog VL - VL35 ID. BR. SEKV.: 42 varijanta 14 humanizovanog VL - VL39 ID. BR. SEKV.: 43 varijanta 15 humanizovanog VL - VL40 ID. BR. SEKV.: 44 varijanta 16 humanizovanog VL - VL41 ID. BR. SEKV.: 45 varijanta 17 humanizovanog VL - VL42 ID. BR. SEKV.: 46 varijanta 4 humanizovanog VH - VH01 ID. BR. SEKV.: 47 varijanta 5 humanizovanog VH - VH02 ID. BR. SEKV.: 48 varijanta 6 humanizovanog VH - VH03 ID. BR. SEKV.: 49 varijanta 7 humanizovanog VH - VH04 ID. BR. SEKV.: 50 varijanta 8 humanizovanog VH - VH14 ID. BR. SEKV.: 51 varijanta 9 humanizovanog VH - VH15 ID. BR. SEKV.: 52 varijanta 10 humanizovanog VH - VH18 ID. BR. SEKV.: 53 varijanta 11 humanizovanog VH - VH19 ID. BR. SEKV.: 54 varijanta 12 humanizovanog VH - VH22 ID. BR. SEKV.: 55 varijanta 13 humanizovanog VH - VH23 ID. BR. SEKV.: 56 varijanta 14 humanizovanog VH - VH24 ID. BR. SEKV.: 57 varijanta 15 humanizovanog VH - VH31

Tabela slaganja sekvenci:

DETALJAN OPIS REALIZACIJA PRONALASKA

I. DEFINICIJE

„Okvir humanog akceptora” je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Okvir humanog akceptora „dobijen od” okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da sadrži iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim realizacijama, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim realizacijama, okvir VL humanog akceptora je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.

„Afinitet” se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr., antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova para koji se vezuje (npr., antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifične realizacije date kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisane su u nastavku.

Termin „afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.

2

Termini „anti-humano tau(pS422) antitelo” i „antitelo koje se vezuje za humani tau(pS422)” se odnose na antitelo koje je sposobno da veže humani tau(pS422) sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje humanog tau(pS422). U jednoj realizaciji, opseg vezivanja anti-humanog tau(pS422) antitela za nepovezani tau(pS422) protein nehumanog porekla je manji za oko 10 % od vezivanja antitela za humani tau(pS422), kao što je izmereno, npr., radioimunotestom (RIA).

Termin „antitelo” je ovde upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.

„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr., scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

„Antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno antitelo se odnosi na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50 % ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50 % ili više. U jednoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen za 50 % ili više. U jednoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen za 80 % ili više. U jednoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen za 90 % ili više. U jednoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen za 95 % ili više. U jednoj poželjnoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo ima interakcije vezivanja sa istim ostacima kao referentno antitelo na antigenu.

Termin „himerno” antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.

„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

„Efektorske funkcije” ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koje variraju sa klasom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; sniženu regulaciju receptora na površini ćelija (npr., B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

„Efikasna količina” agensa, npr., farmaceutske formulacije, se odnosi na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

Termin „Fc region” u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je usklađena sa EU sistemom numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat, E.A. i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi za ukazivanje na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano. Termin „antitelo pune dužine” označava multimerni polipeptid koji se sastoji od dva polipeptida lakog lanca antitela i dva polipeptida teškog lanca antitela povezanih disulfidnim vezama, pri čemu u dva polipeptida teškog lanca antitela C-terminalni ostatak lizina (K) može biti prisutan ili odsutan.

Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno

2

od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost, kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.

„Okvir humanog konsenzusa” je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u radu Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, tomovi 1-3. U jednoj realizaciji, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u radu Kabat i sar., gore navedeno. U jednoj realizaciji, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u radu Kabat i sar., gore navedeno.

„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od HVR-ova nehumanog porekla i aminokiselinske ostatke od humanih FR-ova. U određenim realizacijama, humanizovano antitelo će obuhvatati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr., CDR), odgovaraju onima iz antitela nehumanog porekla, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr., antitela nehumanog porekla, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR“) i formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti“). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3).

U ovom dokumentu, HVR regioni uključuju

(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, C. i Lesk, A.M., J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917);

(b) CDR regione koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

2

(c) antigen kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum i sar. J. Mol. Biol.

262:732-745 (1996)); i

(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).

Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr., FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat i sar., gore navedeno.

„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterologih molekula. „Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i primate nehumanog porekla, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). U određenim primerima izvođenja, pojedinac ili ispitanik je čovek.

„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95 % ili 99 %, kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr., SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr., jonskom izmenom ili reverzno-faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti, npr., Flatman i sar., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

„Izolovana” nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.

„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-humano tau(pS422) antitelo” ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.

Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr., koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante opšteprisutne u neznatnim količinama.

2

Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Shodno tome, reč „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.

„Nativna antitela” ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.

Termin „uputstvo za upotrebu” se koristi da ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kompetitora koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog računarskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast

2

mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 kompanije Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornija je javno dostupan ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja sekvenci su postavljeni programom ALIGN-2 i nisu se menjali.

U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću ALIGN-2 računarskog programa.

Termin „farmaceutska formulacija” se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač” se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, bez ograničenja, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

2

Termin „humani tau(pS422)”, kako se ovde koristi, odnosi se na nativni humani tau(pS422) (UniProt P37840). Termin obuhvata neobrađen humani tau(pS422) „pune dužine”, kao i svaki oblik humanog tau(pS422) koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante humanog tau(pS422), npr., mutantne, splajsovane ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca humanog tau(pS422) je prikazana u ID. BR. SEKV.: 02.

U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redosledom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti, npr., Kindt, T.J. i sar. Kuby Immunology, 6, izd., W.H. Freeman i Co., N.Y. (2007), strana 91). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje specifičnosti vezivanja antigena. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VF domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VL, odnosno VH domena. Videti, npr., Portolano, S. i sar. J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628).

Termin „vektor”, kako se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.

II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI

A. Primer humanizovanih anti-humanih tau(pS422) antitela

Humanizovana antitela, kao što je objavljeno ovde, nisu bila dostupna standardnim postupcima humanizacije. Bilo je potrebno uvesti nestandardne mutacije u aminokiselinsku sekvencu kako bi se dobilo humanizovano antitelo sa uporedivim karakteristikama vezivanja kao matično zečje antitelo. Ovo je posebno važno pošto su antitela, kao što je objavljeno ovde, namenjena prolasku krvno-moždane barijere čoveka i treba da budu efikasna u ljudskom mozgu. Shodno tome, uopšteno primenjeni kriterijumi za odabir humanizovanih antitela nisu dovoljno strogi da bi se mogli neposredno primeniti u ovom slučaju.

Otkriveno je da su radi dobijanja pogodnog humanizovanog antitela koje se može razviti, dva cisteina koji formiraju disulfidni most u CDRL3 (laki lanac CDR3) morali da budu zamenjeni serinom, odnosno izoleucinom. Pored osiguranja ispravne orijentacije istog CDRL3, izoleucinski ostatak prisutan u sredini zečjeg CDRL3 je izbačen, što daje humanizovani CDRL3 koji je za jedan aminokiselinski ostatak manji od matičnog zečjeg CDRL3.

Nadalje je utvrđeno da je korisno održavati tri aminokiselinska ostatka valina u teškom lancu na položajima 4, 24 i 78. Bez ograničavanja ovom teorijom, pretpostavlja se da su ovi ostaci potrebni da bi se osigurala odgovarajuća prezentacija petlji koje vezuju antigen varijabilnog regiona teškog lanca. Pored toga, poželjno je prisustvo ostatka arginina na položaju 71.

Poravnanje sekvenci različitih humanizovanih varijabilnih domena lakog lanca prikazano je na Slici 1. Poravnanje sekvenci različitih humanizovanih varijabilnih domena teškog lanca prikazano je na Slici 2. Sva numeracija, kao što se ovde koristi, se zasniva na Kabatovoj šemi numeracije varijabilnih domena.

U sledećoj Tabeli su prikazane karakteristike različitih humanizovanih varijanti varijabilnog domena zečjeg lakog lanca u kombinaciji sa humanizovanim varijabilnim domenima teškog lanca VH14, odnosno VH20. Partner za vezivanje je bio humani tau(pS422).

1

2

Referentne vrednosti VH00 sa VL00 (zečje antitelo):

25 °C: kd = 2,6E-04; t/2 = 44 min.

37 °C: ka = 3,7E+04, kd = 5,25E-03, KD = 1,4E-08, t/2 = 22 min.

U sledećoj Tabeli su prikazane karakteristike različitih humanizovanih varijanti zečjeg varijabilnog domena lakog lanca u kombinaciji sa humanizovanim varijabilnim domenima lakog lanca VL17, odnosno VL19.

Referentne vrednosti VH00 sa VL00 (zečje antitelo):

25 °C: kd = 2,6E-04; t/2 = 44 min.

37 °C: ka = 3,7E+04, kd = 5,25E-03, KD = 1,4E-08, t/2 = 22 min.

U sledećoj Tabeli su prikazane kinetičke konstante za različite kombinacije VH/VL.

4

Biohemijsko vezivanje različitih kombinacija humanizovanih VH i VL prikazano je na Slikama 3 i 4.

U sledećoj Tabeli su prikazane specifičnosti vezivanja za različite kombinacije VH/VL (vrednosti EC50 u [ng/ml]).

Senzitivnost odabranih humanizovanih kombinacija VH/VL na humani tau mutant S422A može se videti pomoću tehnike Vestern blot, kao što je prikazano na Slici 5. Sve humanizovane varijante se selektivno vezuju za humani tau fosforilovan na S422. Postoji nizak nivo x-reaktivnosti sa fosfoepitopima koji nisu S422 kod matičnog zečjeg antitela, ali prikazane humanizovane varijante su u tom pogledu manje unakrsno reaktivne od matičnog zečjeg antitela.

Na Slici 6 je prikazano vezivanje za PHF-tau u moždanim ekstraktima kod pacijenata sa Alchajmerovom bolešću za matična zečja antitela i za odabrana humanizovana antihumana tau(pS422) antitela.

Sledeća Tabela sažima biološka svojstva odabranih humanizovanih kombinacija VH/VL.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje (humanizovano) anti-humano tau(pS422) antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 18; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 13; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 14; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje (humanizovano) anti-humano tau(pS422) antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 09; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 05; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje (humanizovano) anti-humano tau(pS422) antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 09; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 13; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 14; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje (humanizovano) antitelo koje sadrži sve tri VH sekvence HVR regiona izabrane od

i) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 18 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10, ili

ii) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 09 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10.

U jednoj realizaciji, antitelo sadrži

U drugoj realizaciji, antitelo dalje sadrži tri VL sekvence HVR regiona izabrane od i) (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 13, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 14 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15, ili

ii) (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 12, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 05 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15.

U sledećoj realizaciji, antitelo sadrži

i) (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 13, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 14 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15, ili

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje (humanizovano) antitelo koje sadrži i) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:18; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:13; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:14; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:15, ili

ii) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 09; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:05; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 15, ili iii) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:08; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:09; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:10; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:13; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:14; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:15.

U drugoj realizaciji, VH ili VL sadrže supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-humano tau(pS422) antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za humani tau(pS422).

U daljem aspektu pronalaska, anti-humano tau(pS422) antitelo prema bilo kojoj od gornjih realizacija je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednoj realizaciji, anti-humano tau(pS422) antitelo je fragment antitela, npr., Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugoj realizaciji, antitelo je antitelo pune dužine, npr., netaknuto IgG1 ili IgG4 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.

(Humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde, smanjuje nivoe tau(pS422) u mozgu transgenih tauPS2APP miševa.

U daljem aspektu, (humanizovano) anti-humano tau(pS422) antitelo prema bilo kojoj od gornjih realizacija može da uključi bilo koju karakteristiku, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku:

1. Afinitet antitela

U nekim realizacijama, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (KD) ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ili između 1 nM i 100 nM (npr., 10<-7>M ili manje, npr., od 10<-7>M do 10<-9>M).

U jednoj realizaciji, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednoj realizaciji, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja FAB u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti, npr., Chen, Y. i sar., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Radi postavljanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći se oblažu sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim blokiraju pomoću 2 %-tnog (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigen je pomešan sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u radu Presta, L.G. i sar., Cancer Res.57 (1997) 4593-4599).

Željeni Fab se zatim inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr., oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr., jedan sat). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1 %-tnog polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim se ploče mere na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja, izabrane su za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja.

Prema drugoj realizaciji, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25 °C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednoj realizaciji, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamina da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05%-tnim polisorbatom 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnoteže disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos koff/kon(videti, npr., Chen, Y. i sar., J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda stopa asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa opcijom mešanja.

2. Fragmenti antitela

U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson, P.J. i sar., Nat. Med.9 (2003) 129-134. Za pregled scFv fragmenata, videti, npr., Plueckthun, A., u; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore (izd.), Springer-Verlag, New York (1994), str. 269-315; videti takođe WO 93/16185; i US 5,571,894 i US 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa koji vezuju receptor i koji imaju produžen poluživot in vivo, videti u US 5,869,046.

Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. i sar., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; i Holliger, P. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Trijatela i tetratela su takođe opisana u radu Hudson, P.J. i sar., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr., US 6,248,516).

Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr., E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

3. Humanizovana antitela

Tipično, antitelo nehumanog porekla je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog antitela nehumanog porekla.

4

Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr., CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od antitela nehumanog porekla, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono obuhvata i najmanje deo ili punu dužinu humanog konstantnog regiona. U nekim realizacijama, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima antitela nehumanog porekla (npr., antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr., da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr., Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci.13 (2008) 1619-1633, a dalje ih opisuju, npr., Riechmann, I. i sar. Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, i US 7,087,409; Kashmiri, S.V. i sar. Methods 36 (2005) 25-34) (opisuju graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (opisuje „preuređivanje površine”); Dall’Acqua, W.F. i sar. Methods 36 (2005) 43-60 (opisuje „mešanje FR”); Osbourn, J. i sar. Methods 36 (2005) 61-68; i Klimka, A. i sar Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (opisuje pristup „vođene selekcije” kod mešanja FR).

Humani regioni okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, bez ograničenja: regione okvira izabrane postupkom „najboljeg slaganja” (videti, npr., Sims, M.J. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Presta, L.G. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humane germinativne linije (videti, npr., Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (videti, npr., Baca, M. i sar. J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 i Rosok, M.J. i sar. J. Biol. Chem. 271 (1996922611-22618).

4. Multispecifična antitela

U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr., bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim realizacijama, jedna od specifičnosti vezivanja je za humani tau(pS422), a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim realizacijama, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa humanog tau(pS422). Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac sa različitim specifičnostima (videti Milstein, C. i Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, i Traunecker, A. i sar. EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), i tehniku „knob-in-hole” (videti, npr., US 5,731,168). Multispecifična antitela se takođe mogu dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., US 4,676,980, i Brennan, M. i sar. Science 229 (1985) 81-83); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr., Kostelny, S.A. i sar. J. Immunol.

148 (1992) 1547-1553; primenom tehnologije „dijatela” za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (videti, npr., Holliger, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr., Gruber, M i sar. J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); i pripremom trispecifičnih antitela, kao što opisuju, npr., Tutt, A. i sar. J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Ovde su takođe obuhvaćena dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice” (videti, npr., US 2006/0025576).

Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujući Fab” ili „DAF”, koji sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za humani tau(pS422), kao i za drugi, različiti antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).

Ovde dato antitelo ili njegov fragment takođe obuhvata multispecifična antitela opisana u WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 i WO 2010/145793.

5. Varijante antitela

U pojedinim realizacijama, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.

a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja

U pojedinim realizacijama, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVRove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u sledećoj Tabeli pod naslovom „poželjne supstitucije”. Veće izmene su date u sledećoj Tabeli pod naslovom „Primeri supstitucija”, i kao što je više opisano u nastavku, u odnosu na klase bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr., zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

TABELA

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:

4

(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr., humanizovanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr., poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr., povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr., korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr., afiniteta vezivanja).

Izmene (npr., supstitucije) se mogu izvršiti u HVR-ima, npr., radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene se mogu izvršiti na „žarištima” HVR-a, tj. ostacima kodiranim kodonima koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr., Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), i/ili ostacima koji stupaju u kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka su opisali, npr., Hoogenboom, H.R. i sar. u Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. U nekim realizacijama afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kojeg od raznovrsnih postupaka (npr., PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr., 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr., primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.

U pojedinim realizacijama, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr., konzervativne supstitucije, kao što su ovde date) koje ne umanjuju značajno afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim realizacijama varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „skenirajuća mutageneza sa alaninom”, i opisali su je Cunningham, B.C. i Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr., naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuje i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr., alaninom ili polialaninom), da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili pored toga, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kompetitori za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom (npr., za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.

b) Varijante glikozilacije

U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.

Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično obuhvataju razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona (videti, npr., Wright, A. i Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku

4

kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „osnovi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim realizacijama, modifikacije oligosaharida u antitelu predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

c) Varijante Fc regiona

U određenim realizacijama, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela koje je ovde dato, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr., supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.

U pojedinim realizacijama, predmetni pronalazak razmatra varijantu antitela koje ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kompetitorom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrđivanja smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (shodno tome, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn.

Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sažeta u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch, J.V. i Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u US 5,500,362 (videti, npr., Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; i Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (videti Bruggemann, M. i sar. J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr., ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr., na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes, R. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Testovi vezivanja C1q se takođe mogu izvoditi kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, shodno tome, nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti

4

CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro, H. i sar. J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. i sar. Blood 101 (2003) 1045-1052; i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (videti, npr., Petkova, S.B. i sar. Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US 6,737,056). Takvi mutanti Fc regiona uključuju mutantne Fc regione sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” mutantni Fc region sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US 7,332,581).

Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs (videti, npr., US 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604).

U nekim realizacijama, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. smanjeno) vezivanje C1q i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), npr., kao što je opisano u US 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie, E.E. i sar. J. Immunol.

164 (2000) 4178-4184.

Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer, R.L. i sar. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. i sar. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela obuhvataju Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve varijante Fc regiona uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US 7,371,826).

Videti i Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351 za druge primere varijanti Fc-regiona.

d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom

U pojedinim realizacijama, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr., „tioMAb”, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U određenim realizacijama, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-

4

lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U pojedinim realizacijama, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti, kao što je opisano, npr., u US 7,521,541.

e) Derivati antitela

U pojedinim realizacijama, ovde dato antitelo, može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilena/anhidrida maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

U drugoj realizaciji, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednoj realizaciji, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.

B. Rekombinantni postupci i kompozicije

Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr., kao što je opisano u US 4,816,567. U jednoj realizaciji, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-humano tau(pS422) antitelo koje je ovde opisano. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili

4

aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr., lake i/ili teške lance antitela). U sledećoj realizaciji, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećoj realizaciji, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednoj takvoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska, npr., ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednoj realizaciji, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-humanog tau(pS422) antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je ranije u tekstu navedeno, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju anti-humanog tau(pS422) antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr., kao što je ranije u tekstu opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti, npr., US 5,648,237, US 5,789,199 i US 5,840,523. (Videti takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, tom 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str. 245-254, koji opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414; i Li, H. i sar. Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

4

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr., US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 i US 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linije bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije bubrega (ćelije 293 ili 293, kao što je opisano u, npr., Graham, F.L. i sar. J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije, kao što je opisano u, npr., Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK, ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano u, npr., Mather, J.P. i sar. Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub, G. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr., Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), str.255-268.

C. Testovi

Anti-humana tau(pS422) antitela, koja su ovde data, mogu se identifikovati, pretražiti ili naznačiti prema svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

1. Testovi vezivanja i drugi testovi

U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska je ispitano da bi se odredila njegova aktivnost vezivanja antigena, npr., poznatim postupcima, kao što je ELISA, alfaLISA, vestern blot, niz antitela ili reversnofazni niz, itd.

U primeru ELISA ili alfaLISA testa, tau(pS422) u rastvoru (ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd.) se vezuje antitelom za hvatanje, koje se specifično vezuje za prvi epitop na tau(pS422), ili tau(pS422) u određenoj konformaciji i antitelo za detekciju povezano sa entitetom za detekciju, koji se specifično vezuje za drugi epitop ili konformaciju tau(pS422). Očitavanje se temelji na entitetu za detekciju (hemiluminescencija, fluorescencija, luminescencija indukovana prenosom energije, itd.). U nekim slučajevima, isto antitelo može da se upotrebi u istom testu kao antitelo za hvatanje i detekciju, za otkrivanje agregiranih oblika tau(pS422) (videti, npr., Tokuda, T. i sar., Neurology 75 (2010) 1766-1772).

U slučaju niza antitela, antitela se primećuju na staklenim ili nitroceluloznim čipovima. Slajdovi se blokiraju i inkubiraju sa rastvorom koji sadrži tau(pS422), ispiraju kako bi se uklonila nevezana antitela, a vezana antitela se detektuju fluorescentno označenim odgovarajućim sekundarnim antitelom. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove. Slično kao kod reversnofaznog niza, rekombinantni tau(pS422), ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd. se primećuju na staklenim ili nitroceluloznim čipovima. Slajdovi se blokiraju i pojedinačni nizovi se inkubiraju sa antitelom na specifični epitop na tau(pS422). Nevezana antitela se ispiraju, a vezana antitela se detektuju pomoću fluorescentno obeleženog odgovarajućeg sekundarnog antitela. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove (Dernick, G., i sar., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331).

U primeru za vestern blot, agregirani rekombinantni tau(pS422) ili tau(pS422) dobijen iz ćelijskog supernatanta, lizata ćelija ili tkiva, telesnih tečnosti, itd. se odvaja prema molekulskoj masi u uslovima SDS PAGE ili nativnog gela i blotira se na nitroceluloznu ili PVDF membranu. Nakon blokiranja, membrana se inkubira sa antitelima specifičnim za aminokiselinsku sekvencu ili konformacije tau(pS422). Nakon toga, membrana se ispira radi uklanjanja nevezanog antitela. Vezana antitela se detektuju odgovarajućim sekundarnim antitelima povezanim sa entitetima za detekciju hemiluminiscencije ili fluorescencije ili drugim sredstvima detekcije. Antitela specifična za aminokiselinske sekvence tau(pS422) vezaće se za tau(pS422) u različitim agregatnim oblicima i sa različitim molekulskim masama sve dok epitop ne bude maskiran agregacijom. Sa druge strane, antitela specifična za konformaciju detektovaće samo određene agregatne oblike tau(pS422) otkrivajući samo trake na specifičnim molekulskim masama (videti, npr., Towbin, H., i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353; Burnette, W.N., Anal. Biochem.112 (1981) 195-203).

U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa (humanizovanim) antitelom, kao što je objavljeno ovde, u vezivanju za humani tau(pS422). U određenim realizacijama, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti

1

epitop (npr., linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezuje (humanizovano) antitelo, kao što je objavljeno ovde. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa na koje se antitelo vezuje su dati u Morris, G.E. (izd.), Epitope Mapping Protocols, u: Methods in Molecular Biology, tom 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).

U primeru kompetitivnog testa, imobilisani humani tau(pS422) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za humani tau(pS422) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za humani tau(pS422) ispituje. Kao kontrola, imobilisani humani tau(pS422) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za humani tau(pS422), višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani humani tau(pS422). Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani humani tau(pS422) u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na test uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za humani tau(pS422) (videti, npr., Harlow, E. i Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Poglavlje 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).

2. Testovi za merenje aktivnosti

U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju anti-humanih tau(pS422) antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, npr., zaštitu od/smanjenje/inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) i/ili zaštitu od/smanjenje/inhibiciju transfera oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju, i/ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422) u LUHMES ćelijama. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.

U pojedinim realizacijama, antitelo predmetnog pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost.

Zaštitna biološka aktivnost se može proceniti dodavanjem kondicioniranog medijuma koji sadrži sekretovani tau(pS422), koji izaziva ćelijsku smrt neuronskih ćelija primaoca. Ova toksičnost se može preokrenuti dodavanjem zaštitnih antitela, kao što je ovde opisano. Toksična priroda sekretovanog tau(pS422) je prethodno ustanovljena (Emmanouilidou, E., i sar, J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851).

D. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U pojedinim realizacijama, svako od anti-humanih tau(pS422) antitela, koja su ovde data, je korisno za detektovanje prisustva humanog tau(pS422) u biološkom uzorku. Termin „detekcija”, kao što se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U

2

pojedinim realizacijama, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što je moždano tkivo. U jednoj realizaciji, dato je anti-humano tau(pS422) antitelo za primenu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva humanog tau(pS422) u biološkom uzorku. U pojedinim realizacijama, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-humanim tau(pS422) antitelom, kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-humanog tau(pS422) antitela za humani tau(pS422), i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-humanog tau(pS422) antitela i humanog tau(pS422). Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednoj realizaciji, anti-humano tau(pS422) antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-humanim tau(pS422) antitelom, npr., kada humani tau(pS422) predstavlja biomarker za izbor pacijenata.

Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati primenom antitela predmetnog pronalaska uključuju neurodegeneraciju sa akumulacijom gvožđa u mozgu tipa 1 (NBIA1), čistu autonomnu insuficijenciju, Daunov sindrom, Guam kompleks i nekoliko poremećaja Levijevih tela, poput difuzne bolesti Levijevih tela (DLBD), varijante Levijevog tela kod Alchajmerove bolesti (LBVAD), određenih oblika Gošeove bolesti i demencije kod Parkinsonove bolesti (PDD).

U pojedinim realizacijama, data su obeležena anti-humana tau(pS422) antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr., putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza (US 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr., glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.

E. Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije anti-humanog tau(pS422) antitela, prema opisu iz ovog dokumenta, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su uglavnom netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecil dimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje za oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobuline; hidrofilne polimere, kao što je poli(vinilpirolidon); aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rhuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rhuPH20, opisuje US 2005/0260186 i US 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbede [[navesti lekove koji se mogu kombinovati sa anti-humanim tau(pS422) antitelom]]. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđene svrhe.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno mikrokapsula poli(metilmetakrilata), u

4

koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr., film ili mikrokapsule.

Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr., filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

F. Postupci lečenja i kompozicije

Svako od anti-humanih tau(pS422) antitela, koja su ovde data, može biti upotrebljeno u postupcima lečenja.

U jednom aspektu, obezbeđeno je anti-humano tau(pS422) antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je anti-humano tau(pS422) antitelo da se koristi u lečenju Alchajmerove bolesti. U pojedinim realizacijama, obezbeđeno je anti-humano tau(pS422) antitelo za primenu u postupku lečenja. U pojedinim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-humano tau(pS422) antitelo za primenu u postupku lečenja pojedinca koji ima Alchajmerovu bolest, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine anti-humanog tau(pS422) antitela. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr., kao što je opisano u nastavku. U daljim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-humano tau(pS422) antitelo za primenu u inhibiciji citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciji prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenju aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422). U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-humano tau(pS422) antitelo za primenu u postupku inhibicije citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibicije prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenja aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422) kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog tau(pS422) antitela za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnost kaspaze indukovane putem tau(pS422). „Pojedinac” prema svakoj od navedenih realizacija je poželjno čovek.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-humanog tau(pS422) antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednoj realizaciji, lek je namenjen za lečenje Alchajmerove bolesti. U daljoj realizaciji, lek je predviđen za upotrebu u postupku lečenja Alchajmerove bolesti koji uključuje davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima Alchajmerovu bolest. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr., kao što je opisano u nastavku. U daljoj realizaciji, lek je namenjen za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422). U daljoj realizaciji, lek je predviđen za primenu u postupku inhibicije citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibicije prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenja aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422) kod pojedinca koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine leka za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnost kaspaze indukovane putem tau(pS422). „Pojedinac” prema bilo kojoj od gorenavedenih realizacija može biti čovek.

Ovde je izložen postupak za lečenje Alchajmerove bolesti. U jednoj realizaciji, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima takvu Alchajmerovu bolest efikasne količine anti-humanog tau(pS422) antitela. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac” prema bilo kojoj od gorenavedenih realizacija može biti čovek.

Ovde je izložen postupak za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422). U jednoj realizaciji, postupak obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-humanog tau(pS422) antitela za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem tau(pS422) u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog tau(pS422) sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem tau(pS422). U jednoj realizaciji, „pojedinac” je čovek.

U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-humanih tau(pS422) antitela, npr., za primenu u bilo kom od gorenavedenih terapeutskih postupaka. U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-humanih tau(pS422) antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugoj realizaciji, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-humanih tau(pS422) antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr., kao što je opisano u nastavku.

Antitela predmetnog pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens.

Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednoj realizaciji, primena anti-humanog tau(pS422) antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.

Antitelo predmetnog pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr., putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Antitela predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene, kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr., 0,5 mg/kg-10 mg/kg) antitela može biti primerena početna doza za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Shodno tome, pacijentu se može dati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr., tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr., oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedeno uz upotrebu imunokonjugata predmetnog pronalaska umesto ili pored anti-humanog tau(pS422) antitela.

III. Proizvodi

U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži kompoziciju koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo predmetnog pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji predmetnog pronalaska može dalje da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili pored toga, proizvod može dalje da uključuje drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat predmetnog pronalaska umesto ili pored anti-humanog tau(pS422) antitela.

IV. PRIMERI REALIZACIJA

1. Humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za humani tau(pS422), naznačeno time što antitelo sadrži

2. Humanizovano antitelo prema stavki 1, sadrži

3. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 2, naznačeno time što se antitelo primenjuje u lečenju Alchajmerove bolesti.

4. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 3, naznačeno time što antitelo ima utišanu efektorsku funkciju.

5. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 4, naznačeno time što antitelo nema efektorsku funkciju.

6. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 5, naznačeno time što se antitelo

7. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 6, naznačeno time što antitelo ima vrednost EC50za

8. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 7, naznačeno time što se antitelo specifično vezuje za humani tau(pS422) (ID. BR. SEKV.: 02) i ne vezuje za humani tau (ID. BR. SEKV.: 01).

9. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 8, naznačeno time što antitelo u varijabilnom domenu teškog lanca ima ostatak valina na položajima 4, 24 i 78.

10. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, naznačeno time što antitelo u varijabilnom domenu teškog lanca ima ostatak arginina na položaju 71.

11. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 10, naznačeno time što je antitelo monoklonsko antitelo.

12. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 7, naznačeno time što je antitelo fragment antitela koji se vezuje za humani tau(pS422) i

13. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 11, naznačeno time što je antitelo

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

14. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

1

i

c) antitelo

15. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

i) varijabilni domen sadrži HVR-ove ID. BR. SEKV.: 08, ID. BR. SEKV.: 09 i ID.

2

BR. SEKV.: 10,

i

c) antitelo

16. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

i

c) antitelo

17. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 20,

4

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

i

c) antitelo

18. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 19,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 16, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,

i

c) antitelo

19. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time da

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 19,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

c) antitelo

20. Humanizovano anti-humano tau(pS422) antitelo, naznačeno time što

a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, naznačen time da

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 21,

i) varijabilni domen ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.: 17,

i

c) antitelo

i) specifično se vezuje za polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu ID. BR.

SEKV.: 03, i/ili

21. Farmaceutska formulacija koja sadrži humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 20 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

22. Farmaceutska formulacija prema stavki 21, koja dalje sadrži dodatni terapeutski agens.

23. Farmaceutska formulacija prema stavki 22, naznačena time što je dodatni terapeutski agens antiamiloidni terapeutski agens.

24. Farmaceutska formulacija prema stavki 23, naznačena time što je antiamiloidni terapeutski agens antihumano alfa-sinuklein antitelo ili anti-Abeta antitelo.

25. Upotreba humanizovanog antitela prema bilo kojoj od stavki 1 do 20 za proizvodnju leka.

26. Upotreba prema stavki 25, naznačena time što je lek namenjen za lečenje Alchajmerove bolesti.

27. Upotreba prema bilo kojoj od stavki 25 do 26, naznačena time što je lek namenjen za lečenje prodromalne faze Alchajmerove bolesti.

28. Upotreba prema bilo kojoj od stavki 25 do 27, naznačena time što je lek namenjen za lečenje rane faze Alchajmerove bolesti.

29. Upotreba prema bilo kojoj od stavki 25 do 28, naznačena time što je lek namenjen za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

30. Upotreba prema bilo kojoj od stavki 25 do 29, naznačena time što je lek namenjen za održavanje kognitivnog procesa i funkcije.

31. Upotreba prema bilo kojoj od stavki 25 do 30, naznačena time što je lek namenjen za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

32. Upotreba humanizovanog anti-humanog tau(pS422) antitela prema bilo kojoj od stavki 1 do 20 za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

33. Upotreba humanizovanog anti-humanog tau(pS422) antitela prema bilo kojoj od stavki 1 do 20 za održavanje kognitivnog procesa i funkcije.

34. Upotreba humanizovanog anti-humanog tau(pS422) antitela prema bilo kojoj od stavki 1 do 20 za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

35. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 20, naznačeno time što antitelo i) vezuje se za tau(pS422) u delovima mozga tau(pS422) transgenih miševa i pacijenata sa Alchajmerovom bolešću; i/ili obeležava tau(pS422) u tau(pS422) transgenim ćelijama.

36. Humanizovano antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 20, naznačeno time što se antitelo specifično vezuje za/prepoznaje oblike humanog tau(pS422) koji su relevantni za ranu i kasnu fazu bolesti.

V. PRIMERI

U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicija predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjene razne druge realizacije, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.

Materijali i postupci

Tehnike rekombinantne DNK

Standardni postupci su korišćeni za manipulaciju DNK, kao što je opisano u radu Sambrook, J. i sar. Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.

Sinteza gena i oligonukleotida

Željeni segmenti gena su pripremljeni hemijskom sintezom u kompaniji Geneart GmbH (Regensburg, Nemačka). Sintetisani fragmenti gena su klonirani u plazmidu E. coli za propagaciju/amplifikaciju. DNK sekvence subkloniranih genskih fragmenata su proverene sekvenciranjem DNK. Alternativno, kratki sintetički fragmenti DNK su sakupljeni žarenjem hemijski sintetisanih oligonukleotida ili putem PCR-a. Odgovarajuće oligonukleotide je pripremila kompanija metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Nemačka)

Reagensi

Sve komercijalne hemikalije, antitela i kompleti su korišćeni prema protokolu proizvođača, ako nije drugačije naznačeno.

Primer 1

Priprema i prečišćavanje zečjih antitela

Imunizacija

Za imunizaciju su korišćeni novozelandski zečevi iz Charles River Laboratories International, Inc. Fosfopeptid tau (416-430) [pS422] kuplovan sa KLH-om je rastvoren u K3PO4puferu, pH 7,0, u koncentraciji od 1 mg/ml i pomešan (1:1) sa kompletnim Frojndovim adjuvansom (CFA) do stvaranja stabilne emulzije. Tri zeca su primila intradermalnu (i.d.) injekciju od 2 ml emulzije, a zatim drugu intramuskularnu (i.m.) i treću subkutanu (s.c.) injekciju, svaka od 1 ml u intervalima od jedne nedelje. Četvrta i.m. injekcija od 1 ml data je dve nedelje kasnije, nakon čega su usledile dve dodatne s.c. injekcije od 1 ml u intervalu od četiri nedelje. 10 ml uzoraka periferne pune krvi je sakupljeno od svake životinje 4-6 dana nakon treće, četvrte, pete i šeste injekcije, i korišćeno je za sortiranje pojedinačnih ćelija u FACS-u. Istovremeno je prikupljeno dodatnih 0,5 ml seruma svake životinje, i korišćen je za određivanje specifičnog odgovora antitela na tau (416-463) [pS422].

Odgovor antitela

Odgovor antitela na imunizaciju je određen serijskim razblaživanjem seruma pomoću ELISA testa, u koji je 30 ng biotinilovanog tau (416-430) [pS422] po bunarčiću inkubirano preko noći u 1x PBS na 4 °C, na mikrotitarskim pločama sa 96 bunarčića prethodno premazanim streptavidinom (MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Nemačka). Za detekciju je korišćen kozji anti-zečji IgG povezan sa peroksidazom rena (The Jackson laboratory) razblažen u razmeri 1:16.000. Za vizuelizaciju je korišćen BM Blue POD supstrat, rastvor tetrametilbenzidina (TMB) za taloženje, spreman za upotrebu, kompanije Roche Diagnostics GmbH. Reakcija je prekinuta pomoću 1N HCl i izmerena u čitaču Tecan Infinite na 450/690 nm.

Kloniranje B-ćelija

Premazivanje ploča

Sterilne ploče sa 6 bunarčića premazane streptavidinom (čistoće za ćelijsku kulturu) inkubirane su sa smešom 3 biotinilovana kontrolna peptida (nefosforilovani tau (416-430), MCAK_Human (88-102) [95-pSer] i MAP2_Human (1802 -1816) [pSer-1802]) ili sa biotinilovanim fosfopeptidom tau (416-430) [pS422], svaki u koncentraciji od 0,5-1 µg/ml u PBS-u na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Pre upotrebe, ploče su tri puta isprane sterilnim PBS-om.. Ploče sa 6 bunarčića ćelijske kulture su premazane sa 2 µg/ml KLH-a (hemocijanin školjke Megathura Crenulata) u karbonatnom puferu (0,1 M natrijum bikarbonata, 34 mM dinatrijumhidrogenkarbonata, pH 9,55) i ostavljene preko noći na 4 °C. Pre upotrebe, ploče su tri puta isprane sterilnim PBS-om.

Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) zeca

EDTA koja sadrži punu krv je dva puta razblažena sa 1x PBS pre gradijentnog centrifugiranja na medijumu lympholyte mammal (Cedarlane Laboratories), što je urađeno radi izolovanja zečje PBMC ćelije. PBMC ćelije su ispirane dva puta pre bojenja antitelima.

EL-4 B5 medijum

RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Nemačka) dopunjen sa 10% FCS-a (Hyclone, Logan, UT, SAD), 2 mM glutamina, 1%-tnim rastvorom penicilina/streptomicina (PAA, Pasching, Austrija), 2 mM natrijum piruvata, 10 mM HEPES-a (PAN Biotech, Aidenbach, Nemačka) i 0,05 mM beta merkaptoetanola (Gibco, Paisley, Škotska)

Iscrpljivanje makrofaga/monocita

Sterilne ploče sa 6 bunarčića (čistoće za ćelijsku kulturu) koriste se za iscrpljivanje makrofaga i monocita putem nespecifične adhezije. Bunarčići su premazani ili sa KLH (hemocijanin školjke Megathura Crenulata) ili streptavidinom i kontrolnim peptidima. Svaki bunarčić je bio napunjen sa maksimalno 4 ml medijuma i do 6x10<6>mononuklearnih ćelija periferne krvi imunizovanog zeca, i ostavljeni da se vežu tokom 1 h na 37 °C u inkubatoru.

50% ćelija u supernatantu je korišćeno za korak panovanja; preostalih 50% ćelija bilo je direktno podvrgnuto imunološkom fluorescentnom bojenju i sortiranju pojedinačnih ćelija.

Panovanje B ćelija na peptidima

Ploče sa 6 bunarčića kulture tkiva premazane streptavidinom i biotinilovanim peptidom tau (416-430) [pS422] su zasejane sa do 6x10<6>ćelija na 4 ml medijuma i ostavljene da se vežu tokom 1 h na 37 °C u inkubatoru. Ćelije koje se nisu zalepile su uklonjene pažljivim ispiranjem bunarčića 1-2 puta 1x PBS-om. Preostale lepljive ćelije su odvojene tripsinom tokom 10 min na 37 °C u inkubatoru i potom dva puta isprane u medijumima. Ćelije su čuvane na ledu sve do imunološkog fluorescentnog bojenja.

Imunofluorescentno bojenje i sortiranje pojedinačnih ćelija

Anti-zečji IgG FITC koji se koristi za sortiranje pojedinačnih ćelija je iz kompanije AbD Serotec (STAR121F, Düsseldorf, Nemačka). Kod površinskog bojenja, ćelije iz koraka iscrpljivanja i panovanja su inkubirane sa antizečjim IgG FITC antitelom u PBS-u tokom 30 minuta prevrtanjem u hladnoj sobi na 4 °C u mraku. Nakon centrifugiranja, supernatanti su

1

uklonjeni aspiracijom. PBMC ćelije su prošle 2 ciklusa centrifugiranja i ispiranja ledeno hladnim PBS-om. Konačno, PBMC ćelije su ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u i smesta podvrgnute FACS analizama. Pre FACS analiza, dodat je propidijum jodid u koncentraciji od 5 µg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, SAD) da bi se razlikovale mrtve i žive ćelije. FACS je obavljen korišćenjem uređaja Becton Dickinson FACSAria opremljenog softverom FACSDiva (BD Biosciences, SAD) i pojedinačne, FITC-om označene, žive ćelije su deponovane na ploče sa 96 bunarčića.

Kultura B ćelija

Kultura B ćelija je pripremljena postupkom sličnim onom koji su opisali Zubler, R.H. i sar., J. Immunol. 134 (1985) 3662-3668. Ukratko, pojedinačno sortirane B ćelije uzgajane su u pločama sa 96 bunarčića sa 210 µl/bunarčiću medijuma EL-4 B5 sa Pansorbin ćelijama (1: 20.000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Nemačka), 5 %-tnim supernatantom timocita zeca i gama-ozračenim EL-4-B5 ćelijama mišjeg timoma (2 x 10<4>/bunarčiću) tokom 7 dana na 37 °C u atmosferi od 5 % CO2u inkubatoru. Supernatanti kulture B ćelija su uklonjeni za skrining i ćelije su odmah sakupljene za kloniranje gena varijabilnog regiona ili zamrznute na -80 °C u 100 µl RLT pufera (Qiagen, Hilden, Nemačka).

Skrining klona B-ćelije

Supernatanti kulture B-ćelija su pregledani na vezivanje za biotinilovani tau (416-430) [pS422] pomoću ELISA testa. Nefosforilovani tau (416-430), KLH (hemocijanin školjke Megathura Crenulata) i nepovezani fosfopeptid MCAK_Human (88-102) [95-pSer] su korišćeni kao kontrolni antigeni. Za pripremu ELISA ploča, mikrotitarske ploče prethodno premazane streptavidinom su inkubirane sa biotinilovanim tau (415-430) [pS422], sa 50 ng/ml, tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Premazivanje KLH-om ili kontrolnim peptidima je izvedeno sa 1 µg/ml. Supernatanti B ćelija su razblaženi 1:5 do 1:10 i inkubirani su u mikrotitarskim pločama premazanim antigenom tokom 60 min. Nakon intenzivnog ispiranja, detektovano je vezivanje zečjih antitela korišćenjem ovčjeg anti-zečjeg IgG antitela konjugovanog sa digoksigeninom za detekciju (Chemicon AQ301D). Nakon inkubacije sa TMB-om na sobnoj temperaturi, izmerena je apsorbanca na 370 nm-492 nm. Klonovi B-ćelija koji daju signale iznad osnovnih sa biotinilovanim tau (416-430) [pS422], ali ne i sa KLH-om i MCAK_Human (88-102) [95-pSer], dodatno su uzeti u obzir i podvrgnuti kloniranju gena varijabilnog regiona.

PCR amplifikacija V-domena i sekvenciranje

Ukupna RNK je pripremljena pomoću NucleoSpin<®>8/96 RNK kompleta (Macherey&Nagel; 740709,4, 740698) prema protokolu proizvođača. Svi koraci su izvedeni

2

na sistemu za rukovanje tečnostima epMotion 5075 (Eppendorf). RNK je eluirana sa 60 µl vode bez ribonukleaze. 6µl RNK je korišćeno za stvaranje kDNK reakcijom reversne transkriptaze koristeći Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) i oligo dT-prajmer prema uputstvu proizvođača. 4μl kDNK je korišćeno za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina (VH i VL) pomoću AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) u konačnoj zapremini od 50 µl pomoću prajmera rbHCfinal.up i rbHCfinal.do za teški lanac i rbLCfinal.up i rbLCfinal.do za laki lanac (videti Tabelu u nastavku). Uslovi za PCR su sledeći: vruć start na 94 °C tokom 5 min; 35 ciklusa od 20 s na 94 °C, 20 s na 70 °C, 45 s na 68 °C, i finalna ekstenzija na 68 °C tokom 7 min.

Tabela:

8µl od 50µl PCR rastvora je naneto na 48 E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02). Pozitivne PCR reakcije su prečišćene korišćenjem kompleta NucleoSpin<®>Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) prema protokolu proizvođača i eluirane u 50 µl elucionog pufera. 12 µl prečišćenih PCR proizvoda je sekvencirano direktno u oba smera korišćenjem rbHCfinal.up i rbHCfinal.do za teške lance i rbLCfinal.up i rbLCfinal.do za lake lance (videti prethodnu Tabelu).

Rekombinantna ekspresija zečjih monoklonskih antitela i zečjih/mišjih himernih antitela

Za rekombinantnu ekspresiju zečjih monoklonskih antitela, PCR proizvodi koji kodiraju VH ili VL klonirani su kao kDNK u ekspresione vektore postupkom „overhang“ kloniranja (Haun, R.S. i sar., BioTechniques 13 (1992) 515-518; Li, M.Z., i sar., Nature Methods 4 (2007) 251-256). Linearizovani ekspresioni plazmidi koji kodiraju zečji kapa ili gama konstantni region i VL VH umetaka amplifikovani su pomoću PCR-a korišćenjem preklapajućih prajmera. Prečišćeni PCR proizvodi su inkubirani sa T4 DNK-polimerazom što daje jednolančani previs. Reakcija je prekinuta dodavanjem dCTP-a. U sledećem koraku, plazmid i umetak su kombinovani i inkubirani sa RecA što indukuje rekombinaciju specifičnu za mesto. Rekombinovani plazmidi su transformisani u E.coli. Sledećeg dana, uzgajane kolonije su uzete i testirane na ispravni rekombinovani plazmid putem preparacije plazmida, restrikcione analize i DNK sekvenciranja. Za ekspresiju antitela, izolovani HC i LC plazmidi su prolazno kotransficirani u ćelije HEK293, a supernatanti su sakupljeni nakon 1 nedelje. Za kloniranje i ekspresiju zečjih mišjih himernih antitela, VH i VL regioni su amplifikovani pomoću PCR-a i supklonirani u ekspresione vektore koji sadrže mišji konstantni kapa ili mišji konstantni gama 1 region. Zečji/mišji himerni HC i LC plazmidi su izolovani, testirani restrikcionom analizom i DNK sekvenciranjem na ispravno umetanje i prolazno kotransficiranje u HEK293 ćelije. Supernatanti su sakupljeni nedelju dana nakon transfekcije.

Prečišćavanje antitela

Rekombinantno eksprimirana zečja antitela su prečišćena iz supernatanata ćelijske kulture na MabSelectSuRe™ kolonama (GE Healthcare). Pre nanošenja uzorka, kolona je ekvilibrisana sa 25 mmol/l Tris-HCl, 25 mmol/l NaCl, pH 7,4. Eluiranje antitela je postignuto sa 50 mmol/l acetata pH 3,14. Eluirani uzorak je odmah nanet na kolonu za desalinizaciju (Sephadex G25, GE Healthcare) i eluiran u 20 mmol/l His-HCl, 140 mmol/l NaCl pH 6,0. Taj pufer je takođe korišćen za čuvanje prečišćenog antitela. Opšta temperatura skladištenja je bila 4 °C, sobna temperatura tokom procesa prečišćavanja i -80 °C nakon alikvotacije. Rekombinantno eksprimirana zečja/mišja himerna antitela iz supernatanata ćelijske kulture su prečišćena na MabSelectSuRe™ kolonama (GE Healthcare). Pre nanošenja uzorka, kolona je ekvilibrisana sa 1 x PBS, pH 7,4. Eluiranje antitela je postignuto sa 100 mmol/L citrata pH 3,0. Eluirani uzorak je odmah neutralisan sa 2 mol/l Tris/HCl pH 9,0. Nakon toga, antitela su naneta na kolonu za gel hromatografiju (Superdex 200, GE Healthcare) i eluirana u 20 mmol/l His-HCl, 140 mmol/l NaCl pH 6,0. Taj pufer je takođe korišćen za čuvanje prečišćenih antitela. Opšta temperatura skladištenja je bila 4 °C, sobna temperatura tokom procesa prečišćavanja i -80 °C nakon alikvotacije.

Primer 2

Anti-tau pS422 monoklonska zečja antitela su visoko selektivna za tau fosforilovan na pS422 i vezuju se za fibrilarne agregate tau pS422

ELISA

Zečja monoklonska antitela su rekombinantno eksprimirana u HEK 293 ćelijama. Supernatanti ćelijske kulture ili prečišćena zečja antitela su testirani na vezivanje za biotinilovani tau (416-430) [pS422], nefosforilovani tau (416-430), KLH (hemocijanin školjke Megathura Crenulata) i nepovezani fosfopeptid MCAK_Human (88-102) [95-pSer] pomoću ELISA testa. Za pripremu ELISA ploča, mikrotitarske ploče prethodno premazane

4

streptavidinom su inkubirane sa biotinilovanim tau (415-430) [pS422], sa 50 ng/ml, tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Premazivanje KLH-om ili kontrolnim peptidima je izvedeno sa 1 µg/ml. Zečje anti tau pS422 antitelo (Abcam AB51071) ili zečje antitelo koje sadrži supernatante se inkubira u mikrotitarskim pločama sa obeleženim antigenom tokom 60 min u različitim koncentracijama. Nakon intenzivnog ispiranja, detektovano je vezivanje zečjih antitela korišćenjem ovčjeg anti-zečjeg IgG antitela konjugovanog sa digoksigeninom za detekciju (Chemicon AQ301D). Nakon inkubacije sa TMB-om na sobnoj temperaturi, izmerena je apsorbanca na 370 nm-492 nm. Vezivanje antitela je naznačeno njegovim vrednostima EC50. Vezivanje antitela za biotinilovane tau (416-430) [pS422] i nefosforilovane tau (416-430) peptide je naznačeno njegovim vrednostima EC50. Unakrsna reaktivnost sa KLH ili MCAK fosfopeptidom je procenjena merenjem u jednoj tački pri visokim koncentracijama, tj. pri razblaženju 1:5 supernatanata ćelijske kulture. Rezultati su prikazani u Tabeli u nastavku. Otkriveno je da su vrednosti EC50 za vezivanje za tau fosfopeptid više od 100 puta manje od vrednosti EC50 za vezivanje za tau peptid, što ukazuje na najmanje 100 puta veću selektivnost prema fosforilovanom tau fragmentu u odnosu na nefosforilovani tau peptid. Vezivanje za KLH i MCAK kontrolni fosfopeptid bilo je na osnovnom nivou sa svim antitelima, što je oko 1<3% od maksimalnih vrednosti sa tau fosfopeptidom.

Tabela:

Takođe, ispitivana je i specifičnost za rastvorljivi i agregirani tau pS422 pune dužine.

Fibrilarni agregati tau pS422 (300 µg/ml) su premazani na Maxisorb mikrotitarsku ploču na bazi polistirena (Nunc) i ostavljeni preko noći na sobnoj temperaturi. Na sličan način, rastvorljivi tau i tau pS422 pune dužine su premazani na Maxisorb mikrotitarsku ploču. Dodato je kontrolno zečje anti tau pS422 antitelo (Abcam AB51071) ili prečišćena zečja antitela, i inkubirana su 60 minuta u koncentraciji do 1000 ng/ml. Nakon intenzivnog ispiranja, detektovano je vezivanje zečjih antitela korišćenjem ovčjeg anti-zečjeg IgG antitela konjugovanog sa digoksigeninom za detekciju (Chemicon AQ301D). Nakon inkubacije sa TMB-om na sobnoj temperaturi, izmerena je apsorbanca na 370 nm-492 nm. Vezivanje antitela je naznačeno njegovim vrednostima EC50. Rezultati su prikazani u sledećoj Tabeli.

Tabela:

Zečja monoklonska antitela su vezana na tau-pS422 protein sa vrednostima EC50 manjim od 1 ng/ml. Detektovan je fibrilarni tau pS422 sa vrednostima EC50 u rasponu od 0,4 ng/ml do 14 ng/ml. Signali za vezivanje za nefosforilovani tau protein pune dužine nisu se razlikovali od osnovnih nivoa. Zbog toga je procenjeno da se svako od antitela vezuje za tau pS422 i fibrilarni tau pS422 sa selektivnošću koja je najmanje 100 puta veća u odnosu na tau.

BIAcore™

Vezivanje za fibrilarne tau pS422 agregate dalje je istraženo i potvrđeno BIAcore™ analizom. Merenja su izvršena pomoću instrumenta BIAcore 3000 na 37 °C. Pufer za sistem i uzorak je HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% polisorbata 20 (V/V)). BIAcore™ CM5 senzorski čip je podvrgnut postupku predkondicioniranja. Sekvencijalno, 0,1%-tni SDS, 50 mM NaOH, 10 mm HCl i 100 mm H3PO4su injektovani tokom 30 sekundi preko protočnih ćelija FC1, FC2, FC3 i FC4. Postupak kuplovanja amina je obavljen prema uputstvu proizvođača pomoću BIAcore 3000™ wizard v. 4.1. Nakon EDC/NHS aktivacije površine senzora, nefosfoselektivno anti-tau antitelo mAb <TAU>M4/53-IgG je imobilisano na senzorskim protočnim ćelijama FC2, FC3 i FC4. Kao kontrola, antitelo na CK-MM (izotip kreatin kinaze), koje prepoznaje irelevantni antigen, uhvaćeno je na FC1. mAb <TAU>M-4/53-IgG i antitelo na CK-MM su razblaženi na 30 µg/ml u 10 mM NaAc pH 5,0 i injektovani sa 10 µl/min tokom 7 minuta vremena kontakta radi imobilisanja 10.000 RU sistema za hvatanje antitela. Površina je deaktivirana saturacijom pomoću 1M etanolamina. Senzor je kondicioniran u 5 ciklusa sa fosforilovanim filamentoznim tau proteinom (osnovni rastvor 0,3 mg/ml razblažen 1:100 u HBS-EP) kao analit u rastvoru pri 10 µl/min tokom 2 minuta. Regeneracija je izvršena pomoću 10 mM glicina pH 2,5 pri 30 µl/min, tokom 3 minuta. Pretpostavlja se da vezivanje analita za mAb 4/53 ne disocira pTau filamente, jer nije uočena disocijacija pTau filamenata od strane mAb 4/53. Za sve dalje cikluse merenja, 0,3 mg/ml pTau filamenata je razblaženo 1:100 u HBS-EP puferu i injektovano pri 10 µl/min tokom 1 min, kako bi se pTau prezentovao odgovarajućim analitima antitela u heterogenom sendvič režimu. Analiti antitela su razblaženi u HBS-EP puferu do koncentracije od 100 nM i injektovani su u sistem pri 20 µl/min tokom 3 min. Nakon 3 minuta disocijacije, površina senzora je regenerisana pomoću 2 injektovanja 10 mM glicina pH 2,5 tokom 1 minuta pri 100 µl/min, nakon čega je sledilo ispiranje HBS-om tokom 15 sekundi pri 100 µl/min. Praćena je faza asocijacije i disocijacije interakcija. Budući da je analit antitela u rastvoru dvovalentan, kinetika opterećena avidnošću antitelo-pTau je naznačena dvofaznim modelom disocijacije, koji se sastoji od brzog koraka rane disocijacije na bazi afiniteta, praćenog kinetičkim korakom sa stabilizovanom avidnošću koji ograničava stopu u narednoj kompleksnoj disocijaciji. 10 sekundi (rano) i 50 sekundi (kasno) po okončanju injektovanja analita, kvantifikovani su kd i t/2(dis), gde je to bilo moguće. Kinetička merenja su procenjena korišćenjem postupka dvostrukog referenciranja. Prvo je oduzet signal iz FC1 reference kako bi se korigovao zbirni efekat pufera i nespecifično vezivanje. Drugo, oduzeto je injektovanje 0 nM analita da bi se korigovala disocijacija primarnih antitela iz odgovarajućeg sistema za hvatanje. Kinetičke brzine su procenjivane korišćenjem Lengmirovog prilagođenog modela disocijacije 1:1 prema BIAcore™ softveru za procenu v.4.1. Poluvreme stabilnosti kompleksa antigen/antitelo (min) izračunato je prema formuli ln(2)/60*kd.

Rezultati su sažeti u sledećoj Tabeli.

Tabela:

Primer 3

Vezivanje anti-tau pS422 monoklonskih zečjih antitela za intracelularni pTau u delovima mozga pacijenata obolelih od Alchajmerove bolesti

Ispitana je specifična i osetljiva imunohistohemijska detekcija pTau patologije u moždanom tkivu kod Alchajmerove bolesti monoklonskim zečjim anti-tau pS422 antitelima pomoću eksperimenata imunofluorescentnog bojenja korišćenjem kriosekcija ljudskog moždanog tkiva pacijenata sa AB-om. Procedura je suštinski ista, kao što je opisano u primeru X (mišja antitela). Zečji IgG su detektovani kozjim antizečjim sekundarnim antitelima konjugovanim sa Alexa Fluor488<®>(Invitrogen/Molecular Probes A11034). Specifično i osetljivo bojenje pTau naslaga i filamenata je vidljivo za klonove Mab 005, Mab 019, Mab 020, Mab 085, Mab 086 i Mab 097. Uočljive su intraćelijske pTau naslage, poput velikih neurofibrilarnih klubadi i izduženih neutrofilnih niti. Za sve ispitivane klonove je utvrđena minimalna efektivna koncentracija u rasponu između 0,08 i 0,016 µg/ml, što ukazuje na veoma osetljivo vezivanje za prave humane pTau naslage.

Primer 4

Humanizacija zečjih anti-humanih tau(pS422) antitela

„Varijabilni domen” (varijabilni domen lakog lanca (VL), varijabilni domen teškog lanca (VH)), kao što je ovde korišćeno, označava svaki od parova domena lakog i teškog lanca koji su direktno uključeni u vezivanje antitela za tau(pS422) antigen. Varijabilni domeni lakog i teškog lanca imaju istu opštu strukturu, i svaki domen sadrži četiri regiona okvira (FR) čije sekvence su široko konzervisane, povezane pomoću tri „hipervarijabilna regiona”.

Strukture VH i VL domena zečjeg antitela mAb 086 su analizirane in silico i upoređene sa bazom strukturnih podataka o humanim VH i VL domenima (IMGT). Izabran je panel strukturno najsličnijih V domena za graftovanje CDR-ova zečjih antitela na odabrane humane VH i VL domene. Pored toga, uzete su u obzir sličnosti u primarnoj sekvenci radi sužavanja izbora humanih V domena poravnavanjem primarne sekvence VH i VL domena zečjeg antitela sa repertoarom humanog V domena. U nekim varijantama humanizacije su uvedene povratne mutacije unutar humanih regiona okvira prema matičnim zečjim ostacima. Slično tome, mutacije u CDR-ima su uvedene u nekim varijantama, gde je to prikladno, da bi se povećao afinitet prema antigenu, održala tercijarna struktura CDR-a i uklonile neželjene karakteristike poput cisteinskih ostataka ili ostataka koji mogu biti modifikovani nakon prečišćavanja antitela.

Vektori teškog i lakog lanca koji sadrže svaku od humanizovanih varijanti su kotransficirani u HEK293 suspenzione ćelije u mikrotitarskim pločama za uzgajanje na matrični način, da bi se dobile ćelijske kulture koje eksprimiraju IgG pune veličine svih mogućih kombinacija lakog/teškog lanca. Nakon 5 dana uzgajanja na 37 °C, supernatanti su sakupljeni i prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije proteina A u mikrotitarskoj skali.

Primer 5

Stvaranje rekombinantnih ekspresionih vektora

a) Stvaranje vektora za ekspresiju teških lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog IgG1

Humanizovani teški lanac, koji kodira fuziju gena koja sadrži konstantni region humanog IgG1 (CH1, šarka, CH2, CH3) i VH domen humanizovanog anti-humanog tau(pS422) antitela dobijen od zečjeg antitela Mab 086, sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VH domen odgovarajućeg anti-humanog antitela specifičnog za tau(pS422) sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog IgG1.

Konstantni region humanog IgG1 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

(ID. BR. SEKV.: 58).

Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.

Transkripciona jedinica teškog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':

- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV) sa intronom A,

- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,

- varijabilni domen teškog lanca (VH) koji kodira nukleinsku kiselinu,

- konstantni region humanog IgG1 koji kodira nukleinsku kiselinu, i

- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).

b) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-kapa

Humanizovani kapa laki lanac, koji kodira fuziju gena koja sadrži konstantni region humanog Ig-kapa (CL-kapa) i VL (kapa) domen anti-humanog tau(pS422) antitela dobijen od zečjeg antitela Mab 086, sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (kapa) domen odgovarajućeg anti-humanog tau(pS422) antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-kapa.

Konstantni region humanog Ig-kapa ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

(ID. BR. SEKV.: 59).

Transkripciona jedinica kapa lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':

- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,

- konstantni region humanog Ig-kapa koji kodira nukleinsku kiselinu, i

- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).

c) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-lambda

Humanizovani lambda laki lanac, koji kodira fuziju gena koja sadrži konstantni region humanog Ig-lambda (CL-lambda) i VL (lambda) domen anti-humanog tau(pS422) antitela dobijen od zečjeg antitela Mab 086, sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (lambda) domen odgovarajućeg anti-humanog tau(pS422) antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-lambda.

Konstantni region humanog Ig-lambda ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

(ID. BR. SEKV.: 60).

Transkripciona jedinica lambda lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':

- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,

- konstantni region humanog Ig-lambda koji kodira nukleinsku kiselinu, i

- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).

d) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca kapa imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-kapa

Humani Ig-kapa laki lanac, koji kodira fuziju gena koai sadrži konstantni region humanog Ig-kapa (CL-kapa) i VL (kapa) domen anti-humanog tau(S422) antitela dobijen od zečjeg antitela Mab 086, sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (kapa) domen odgovarajućeg anti-humanog tau(pS422) antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-kapa. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu i između domena VL (kapa) i CL-kapa.

Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što

1

omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.

- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV)

- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,

- konstantni region humanog IgG kapa, i

- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).

e) Stvaranje vektora za ekspresiju lambda lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-lambda

Humani laki lanac Ig-lambda, koji kodira fuziju gena koja sadrži konstantni region humanog Ig-lambda (CL-lambda) i VL (lambda) domen anti-humanog tau(S422) antitela dobijen od zečjeg antitela Mab 086, sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (lambda) domen odgovarajućeg anti-humanog tau(pS422) antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-lambda. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu i između domena VL (lambda) i CL-lambda.

- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV)

- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,

- konstantni region humanog IgG lambda, i

- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).

Primer 6

Rekombinantna proizvodnja anti-humanih tau(pS422) antitela

Antitela su proizvedena u prolazno transficiranim HEK293 ćelijama (linija dobijena iz ljudskih embrionskih ćelija bubrega 293) uzgajena u medijumu F17 (Invitrogen Corp.). Za

2

transfekciju odgovarajućih vektora, kao što je opisano u primeru 5, korišćen je transfekcioni reagens „bez 293“ (Novagen). Antitela su eksprimirana iz pojedinačnih ekspresionih plazmida. Transfekcije se obavljaju na način naveden u uputstvu proizvođača. Supernatanti ćelijske kulture koji sadrže rekombinantno antitelo su sakupljani tri do sedam dana nakon transfekcije. Supernatanti su čuvani na sniženoj temperaturi (npr., -80 °C) do prečišćavanja.

Opšte informacije u vezi sa rekombinantnom ekspresijom humanih imunoglobulina, npr., u HEK293 ćelijama, date su u: Meissner, P. i sar., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Primer 7

Prečišćavanje rekombinantnih anti-humanih tau(pS422) antitela

Supernatanti kulture koji sadrže antitelo su filtrirani i prečišćeni u dva hromatografska koraka.

Antitela su uhvaćena afinitetnom hromatografijom korišćenjem HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) ekvilibrisanog PBS-om (1 mM KH2PO4, 10 mm Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl), pH 7,4. Nevezani proteini su uklonjeni ispiranjem ekvilibracionim puferom, a antitelo je izolovano 25 mM citratnim puferom, pH 3,1, koji je odmah nakon elucije podešen na pH 6,0 sa 1 M Tris-baze, pH 9,0.

Gel hromatografija na Superdex 200™ (GE Healthcare) je korišćena kao drugi korak prečišćavanja. Gel hromatografija je obavljena u 20 mM histidinskom puferu, 0,14 M NaCl, pH 6,0. Rastvori koji sadrže antitelo su koncentrovani pomoću Ultrafree-CL centrifugalnog filtera opremljenog Biomax-SK membranom (Millipore, Billerica, MA, SAD) i skladišteni na -80 °C.

Primer 8

Kinetički skrining

Kinetički skrining je obavljen kako su opisali Schraeml i sar. (Schraeml, M. i M. Biehl, Methods Mol. Biol.901 (2012) 171-181) na instrumentu BIAcore 4000, opremljenom BIAcore CM5 senzorom. Instrument BIAcore 4000 je bio pod kontrolom softverske verzije V1.1. Čip BIAcore CM5 serije S je montiran na instrument i hidrodinamički je obrađen i pripremljen prema uputstvu proizvođača. Pufer za instrument je bio HBS-EP pufer (10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (m/V) P20). Na površini senzora je pripremljen sistem za hvatanje antitela. Poliklonsko kozje anti-humano antitelo sa specifičnošću Fc-a humanog IgG (Jackson Lab.) imobilisano je pri 30 µg/ml u 10 mM natrijum acetatnom puferu (pH 5) na mestima 1, 2, 4 i 5 u protočnim ćelijama instrumenta 1, 2, 3 i 4 sa 10.000 RU koristeći NHS/EDC hemiju. U svakoj protočnoj ćeliji, antitela su uhvaćena na mestu 1 i mestu 5. Mesto 2 i mesto 4 su korišćena kao referentna mesta. Senzor je deaktiviran 1 M rastvorom etanolamina. Derivati humanizovanih antitela su naneti u koncentracijama između 44 nM i 70 nM u puferu za instrument dopunjenim sa 1 mg/ml CMD-a (karboksimetildekstran). Antitela su injektovana pri protoku od 30 µl/min tokom 2 minuta. Nivo hvatanja (capture level, CL) površinski prezentovanih antitela je izmeren u rel. jedinicama odgovora (response units, RU). Analiti u rastvoru, fosforilovani humani tau protein, nefosforilovani humani tau protein i fosforilovani humani tau mutantni protein T422S su injektovani pri 300 nM tokom 3 minuta, sa protokom od 30 µl/min. Disocijacija je praćena 5 min. Sistem hvatanja je regenerisan za 1 min, injektovanjem 10 mM glicinskog pufera pH 1,7 pri 30 µl/min preko svih protočnih ćelija. Dve tačke izveštavanja, zabeleženi signal malo pre kraja injektovanja analita, označen kao kasno vezivanje (binding late, BL), i zabeleženi signal malo pre kraja vremena disocijacije, označen kao kasna stabilnost (stability late, SL), korišćeni su da se naznače performanse kinetičkog skrininga. Nadalje, konstanta stope disocijacije kd (1/s) je izračunata prema Lengmirovom modelu, a poluživot kompleksa antitelo/antigen je izračunat u minutima prema formuli ln(2)/(60*kd). Molarni odnos (MR) je izračunat prema formuli MR = (kasno vezivanje (RU)) / (nivo hvatanja (RU)) * (MW(antitelo) / (MW(antigen)). U slučaju da je senzor konfigurisan sa odgovarajućom količinom hvatanja liganda antitela, svako antitelo bi trebalo da može funkcionalno da se veže najmanje za jedan analit u rastvoru, što je predstavljeno molarnim odnosom MR = 1,0. Zatim, molarni odnos je takođe i indikator za valentni režim vezivanja analita. Maksimalna valenca može biti MR = 2 za antitelo koje vezuje dva analita, po jedan sa svakom valencom Fab.

U drugoj realizaciji, kinetičke brzine su određene na 25 °C i 37 °C korišćenjem iste eksperimentalne postavke, ali uz korišćenje više serija koncentracija svakog analita u rastvoru pri 0 nM (pufer), 1,2 nM, 3,7 nM, 11,1 nM, 33,3 nM, 100 nM i 300 nM. Na osnovu ponašanja vezivanja zavisnog od koncentracije, kinetički podaci su izračunati korišćenjem BIAcore softvera za evaluaciju prema uputstvu proizvođača i Lengmirovog 1:1 modela sa RMAX global.

Primer 9

ELISA

Nepremazanim Maxisorb pločama je dodat nebiotinilovani peptid/protein/agregat, a streptavidinom premazanim Maxisorb pločama je dodat biotinilovani peptid/protein/agregat u PBS-u, i inkubirane su preko noći. Supernatant je odbačen, a bunarčići su tri puta isprani sa 90 µl pufera za ispiranje (1x PBS/0,1%-tni Tween 20). Preostala reaktivna mesta su blokirana

4

blokirajućim puferom (1xPBS/2%-tni BSA (goveđi serum albumin frakcija V, bez masnih kiselina, Roche, kat. br: 10735078001)/0,05%-tni Tween 20) inkubiranjem tokom 1 h. Supernatant je odbačen, i bunarčići su tri puta isprani sa 90 µl pufera za ispiranje. Uzorci i kontrolno antitelo su pripremljeni u 12 razblaženja (1:2) u ELISA puferu (1xPBS/0,5%-tni BSA (goveđi serum albumin frakcija V, bez masnih kiselina, Roche, kat. br: 10735078001)/0,05%-tni Tween 20) sa početnom koncentracijom od 500 ng/ml. Trajanje inkubacije je bilo 60 minuta na sobnoj temperaturi na vibracionom uređaju. Supernatant je odbačen, i bunarčići su tri puta isprani sa 90 µl pufera za ispiranje. Rastvori sekundarnog antitela su pripremljeni u ELISA puferu. Ukupno 25 µl smeše antitela je preneto u sve bunarčiće test ploče, a nakon toga je ploča inkubirana na vibracionom uređaju tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatant je odbačen, a bunarčići su tri puta isprani sa 90 µl pufera za ispiranje. U sve bunarčiće je dodato 25 µl rastvora ABTS-a. Apsorbanca je očitana na 405nm - 492nm.

�

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

��

12

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

a) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove SQ ID NO: 08, 18 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove SQ ID NO: 13, 14 i 15, ili

b) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove SQ ID NO: 08, 09 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove SQ ID NO: 12, 05 i 15, ili

c) u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-ove SQ ID NO: 08, 09 i 10, i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-ove SQ ID NO: 13, 14 i 15.

2. Humanizovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, sadrži

a) varijabilni domen teškog lanca SQ ID NO: 20 i varijabilni domen lakog lanca SQ ID NO: 17, ili

b) varijabilni domen teškog lanca SQ ID NO: 19 i varijabilni domen lakog lanca SQ ID NO: 16, ili

c) varijabilni domen teškog lanca SQ ID NO: 19 i varijabilni domen lakog lanca SQ ID NO : 17, ili

d) varijabilni domen teškog lanca SQ ID NO: 21 i varijabilni domen lakog lanca SQ ID NO: 17.

3. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 2, naznačeno time što antitelo ima utišanu efektorsku funkciju.

4. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačeno time što se antitelo

i) specifično vezuje za polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 03, i/ili

ii) ne vezuje za humani tau pune dužine (SQ ID NO: 01) pri 1 µg/ml, i/ili

iii) specifično vezuje za humani tau pune dužine fosforilovan na serinu na položaju 422 (SQ ID NO: 02), i/ili

iv) specifično vezuje za agregate humanog tau fosforilovanog na serinu na položaju 422 (SQ ID NO: 02).

5. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što antitelo ima vrednost EC50za

a) humani tau(pS422) fragment koji ima aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 03 od 6 ng/ml ili manje, i/ili

b) humani tau(pS422) pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 02 od 4,5 ng/ml ili manje, i/ili

c) agregate humanog tau(pS422) koji ima aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 02 od 30 ng/ml ili manje, i/ili

d) humani tau koji ima aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 01 i koji ima aminokiselinsku mutaciju S422A od 125 ng/ml ili manje.

6. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačeno time što se antitelo specifično vezuje za humani tau(pS422) (SQ ID NO: 02) i ne vezuje za humani tau (SQ ID NO: 01).

7. Humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačeno time što je antitelo

a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili

b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili

f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.

8. Farmaceutska formulacija koja sadrži humanizovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 8, koja dalje sadrži anti-humano alfasinuklein antitelo ili anti-Abeta antitelo.

10. Upotreba humanizovanog antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za proizvodnju leka.

11. Upotreba prema zahtevu 10, naznačena time što je lek namenjen za lečenje Alchajmerove bolesti.

12. Upotreba prema bilo kom od zahteva 10 do 11, naznačena time što je lek namenjen za lečenje prodromalne faze Alchajmerove bolesti.

13. Upotreba prema bilo kom od zahteva 10 do 11, naznačena time što je lek namenjen za lečenje rane faze Alchajmerove bolesti.

14. Upotreba prema bilo kom od zahteva 10 do 13, naznačena time što je lek namenjen za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

15. Upotreba prema bilo kom od zahteva 10 do 14, naznačena time što je lek namenjen za održavanje kognitivnog procesa i funkcije.

16. Upotreba prema bilo kom od zahteva 11 do 15, naznačena time što je lek namenjen za usporavanje stope kognitivnog i funkcionalnog opadanja.

17. Upotreba humanizovanog anti-humanog tau(pS422) antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za smanjenje neurodegeneracije indukovane putem tau(pS422).

12