[go: up one dir, main page]

RS60021B1 - Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40l - Google Patents

Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40l

Info

Publication number
RS60021B1
RS60021B1 RS20200157A RSP20200157A RS60021B1 RS 60021 B1 RS60021 B1 RS 60021B1 RS 20200157 A RS20200157 A RS 20200157A RS P20200157 A RSP20200157 A RS P20200157A RS 60021 B1 RS60021 B1 RS 60021B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cd40l
disease
domain
antibody
bms2h
Prior art date
Application number
RS20200157A
Other languages
English (en)
Inventor
Steven G Nadler
James K Tamura
Laura Price
Robert P Rehfuss
Suzanne J Suchard
Anish Suri
James William Bryson
Aaron Yamniuk
Steven Grant
Olga Ignatovich
Philip Drew
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Domantis Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47046896&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60021(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co, Domantis Ltd filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS60021B1 publication Critical patent/RS60021B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/36—Opioid-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Obezbeđena su antitela i njihovi fragmenti koji ciljaju CD40L, kompozicije koje sadrže iste, i metode korišćenja istih za lečenje bolesti koje uključuju aktivnost CD40L.
STANJE TEHNIKE
[0002] CD40 ligand (CD40L), takođe poznat kao CD154, gp39, TNF-povezani aktivacioni protein (TRAP), 5c8 antigen, ili T-BAM, je trimerni transmembranski protein faktora nekroze tumora (TNF) molekulske superfamilije. CD40L je primarno eksprimiran na aktiviranim T ćelijama, kao i na aktiviranim leukocitima, eozinofilima, bazofilima, prirodnim ćelijama ubicama, mastocitima, i neimunskim ćelijama kao što su trombociti i aktivirane endotelne ćelije. CD40L takođe postoji u rastvorljivom obliku (sCD40L) koji se dobija cepanjem vezanog na membranu CD40L koje zavisi od mikrozomalnog stimulusa. Većina sCD40L u cirkulaciji (>90%) potiče iz trombocita.
[0003] CD40L vezuje CD40, transmembranski glikoprotein tipa I koji pripada familiji TNF receptora (TNFR). Iako se svi monomerni, dimerni, i trimerni oblici sCD40L mogu vezati za CD40, trimerni oblik sCD40L ima najsnažniju biološku aktivnost kroz oligomerizaciju ćelijske površine CD40, što je zajednička osobina familije TNFR. Najviša ekspresija CD40 primećena je na antigen prezentujućim ćelijama (APCs), kao što su B ćelije, makrofagi, i dendritske ćelije, dok je niža ekspresija ovog receptora primećena na mnogim drugim ćelijskim tipovima, uključujući ćelije stroma i timični epitel. Interakcija CD40-CD40L je neophodna za normalne interakcije T-B ćelija, uključujući pojačanu kostimulaciju, T-ćelijsko prajmiranje, proizvodnju citokina, zamenu klase antitela i sazrevanje afiniteta i proizvodnju antitela i autoantitela.
[0004] Presudna uloga CD40-CD40L interakcija u imunološkim i inflamatornim odgovorima učinila ih je obećavajućom metom za lečenje patoloških imuno-inflamatornih procesa. Blokada interakcija CD40-CD40L pomoću specifičnih CD40L monoklonskih antitela (mAb) uspešno sprečava odbacivanje alografta kod primata i leči autoimune bolesti i aterosklerozu na životinjskim modelima. Montgomery et al., Transplantation 74: 1365-1369 (2002). Pojedinačni domen-antitelo (dAb) specifičan za humani CD40L opisan je u WO 2005/035572. Polipeptidi antitela koji su monovalentni za vezivanje CD40L mogu inhibirati aktivnost CD40L izbegavajući potencijalne neželjene efekte koji mogu da se jave kod antitela sposobnih za divalentno ili multivalentno vezivanje CD40L.WO 2006/030220. Davanje pacijentu efikasne količine anti-CD40L antitela u kratkotrajnom lečenju može izazvati dugoročnu toleranciju na antigen kod navedenog pacijenta. WO 2010/023482.
[0005] Kod ljudi su korišćena dva različita klona anti-CD40L mAb u kliničkim ispitivanjima za lečenje različitih autoimunih bolesti. Maribel et al., Mol. Immunol. 45: 937-44 (2008). Monoklonska antitela, međutim, mogu da pokažu neobično visoku učestalost tromboembolijskih (TE) komplikacija, kao što su aterotrombotski događaj centralnog nervnog sistema, infarkt miokarda, plućna embolija, i tromboza dubokih vena. Na primer, korisnost anti-CD40L mAb klona hu5c8 (anti-CD40L mAb, Biogen) ograničena je neobično visokom učestalošću TE komplikacija. Smatra se da TE, od ovih antitela potiče od formiranja imunoloških kompleksa višeg reda (IC) od mAb-a sa membranski vezanim CD40L na trombocitima, ili sCD40L prolivenim iz trombocita, koji se mogu vezati i na taj način agregirati susedne trombocite preko svojih FcgRIIa receptora, što rezultira stvaranjem tromba. Rizik od tromboembolije doveo je do zastoja u svim kliničkim ispitivanjima koja su u toku. Boumpas et al., Arthritis & Rheumatism 48: 719-727 (2003).
REZIME
[0006] U kliničkom okruženju su još uvek potrebni antagonisti antitela protiv CD40L za koje je manja verovatnoća da će izazvati agregaciju trombocita i tako izazvati tromboemboliju. Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polipeptid antitela koji je fuzioni polipeptid koji sadrži prvi promenljivi domen i Fc domen, pri čemu prvi promenljivi domen specifično vezuje humani CD40L, gde CD40L sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO (SEK ID BR): 1, pri čemu prvi varijabilni domen sadrži BMS2h-572-633 (SEQ ID NO: 274), i gde je Fc domen IgG1 Fc domen izabran od CT-Dugog domena (amino kiseline 139 do 370 SEQ ID NO: 1362), CT-kratki domen (amino kiseline 138 do 362 SEQ ID NO: 1363), N297Q Dugi Fc domen (amino kiseline 139 do 370 SEQ ID NO: 1364), ili N297Q Kratki Fc domen (amino kiseline 138 do 362 SEQ ID NO: 1365). Tako su obezbeđeni novi polipeptidi antitela koji specifično vezuju humani CD40L. Povoljno je da polipeptidi antitela ne izazivaju agregaciju trombocita. Polipeptidi antitela su korisni u lečenju bolesti koje uključuju aktivaciju CD40L, uključujući autoimune bolesti, odbacivanje transplantata, i alergijske odgovore. Polipeptidi antitela sadrže varijabilni domen.
[0007] Ovde je takođe stavljen na uvid javnosti polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L, pri čemu je polipeptid antitela domen antitela (dAb).
[0008] Ovde je takođe stavljen na uvid javnosti polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L, pri čemu polipeptid antitela dalje sadrži drugi varijabilni domen koji specifično vezuje drugi antigen, pri čemu je drugi antigen onaj antigen koji nije humani CD40L. Drugi antigen može biti skup molekula diferencijacije (CD) ili molekul Klase II Glavnog Histokompatibilnog Kompleksa (Major Histocompatibility Complex (MHC) Class II). Alternativno, drugi antigen može biti serumski albumin (SA).
[0009] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptide antitela koji su ovde dati. Dalje se razmatra vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu. Izolovana ćelija domaćina može da sadrži takav vektor.
[0010] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efikasnu količinu trenutno obezbeđenog polipeptida antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija dalje može da sadrži imunosupresivni/imunomodulatorni i/ili antiinflamatorni agens.
[0011] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da se koristi u postupku lečenja imune bolesti kod pacijenta kome je potrebno takvo lečenje. Primer medicinske primene daje farmaceutsku kompoziciju u kombinaciji sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili antiinflamatornim agensom. Imuna bolest može biti autoimuna bolest ili bolest povezana sa kalemom. Alternativno, imuna bolest je bolest povezana sa kalemom. Nadalje, bolest povezana sa kalemom može da obuhvati odbacivanje čvrstog organa, tkiva i/ili ćelija. Alternativno, bolest povezana sa kalemom je bolest kalem protiv domaćina (graft versus host disease (GVHD)). Bolest povezana sa kalemom može dalje biti akutno odbacivanje transplantata. Alternativno, bolest povezana sa kalemom može biti hronično odbacivanje transplantata.
[0012] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da se koristi za lečenje bolesti povezanih sa kalemom, pri čemu je farmaceutska kompozicija namenjena za koadministraciju sa CTLA4 mutantnim molekulom. CTLA4 mutantni molekul može biti L104EA29Y-Ig (belatacept).
[0013] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da se koristi za lečenje imunološke bolesti kod pacijenta kome je potrebno takvo lečenje, pri čemi je imunološka bolest izabrana od grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozantnog spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uha, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući dijabetes Tipa 1 i/ili Tipa 2, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesova bolest, Guillain-Barreovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenične purpure, inflamatorne bolesti creva, imunološkog odgovora na rekombinantne produkte lekova, sistemskog eritematoznog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, mijastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatije, tiroiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-a, atopijske alergije, bronhijalne astme, ekcema, lepre, šizofrenije, nasledne depresije, transplantacije tkiva i organa, sindroma hroničnog umora, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, moždanog udara, autizma, epilepsije, Artusovog fenomena, anafilaksije, zavisnosti od alkohola, i narkomanije. Alternativno, imunološka bolest može biti mijastenija gravis, idiopatska trombocitopenjska purpura, ili sistemska skleroza.
[0014] Takođe je obezbeđena upotreba, izolovanog polipeptida antitela ovde stavljena na uvid javnosti, za pripremu leka za lečenje pacijenta, pri čemu pacijent ima imunološku bolest. Dalje je data upotreba, izolovanog polipeptida antitela ovde stavljena na uvid javnosti, za pripremu leka za ublažavanje bar jednog sindroma imunološke bolesti kod pacijenta kome je to potrebno.
[0015] U jednom tehničkom rešenju, prvi varijabilni domen sastoji se od aminokiselinske sekvence BMS2h-572-633 (SEQ ID NO: 274).
[0016] U drugom tehničkom rešenju, polipeptid antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1355. U još jednom tehničkom rešenju, polipeptid antitela se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1355.
KRATAK OPIS SLIKA
[0017]
SL. 1A prikazuje domen antitela koji sadrži VHvarijabilni domen BMS2h-572-633 spojen za modifikovani rep iz Abatacepta IgG1.
SL. 1B pokazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1355) varijabilnog domena BMS2h-572-633. Fc fuzioni protein je dimer molekulske težine 77,984 Daltona, sa svakim polipeptidnim lancem koji se sastoji od 354 amino kiseline. Varijabilni domen je spojen sa veznikom za mutirani Fc konstrukt humanog IgG1, pri čemu su tri cisteinska ostataka supstituisana serinom, a jedan prolin je supstituisan serinskim ostatkom.
SL. 2 prikazuje radni model CD40-40L puta. Gornji panel demonstrira početne faze susreta između T ćelije i APC-a. Početni susret vođen uključivanjem pMHC kompleksa (signal 1) T ćelijskog receptora (TCR) zajedno sa ranom interakcijom CD28-CD80 (signal 2) dovoljan je za površinsku ekspresiju trimernog CD40L (donji panel). Angažovanje CD40 od strane CD40L rezultira brojnim biološkim odgovorima navedenim u sivim kvadratima. SL. 3 obezbeđuje sekvence (SEQ ID NOS 1356-1361, redom, kako se pojavljuju) različitih Fc domena. Veznik regioni su prikazani u kvadratima.
SL. 4 pokazuje primere različitog Fc-formatiranog domena antitela (SEQ ID NOS 1362-1365, redom, kako se pojavljuje). Veznik regioni su naznačeni u kvadratima.
SL. 5 prikazuje SPR senzogramske podatke za vezivanje 12.5-0.39nM BMS-986004 (2:1 serije razblaženja) na biot-IZ-hCD40L zarobljenom na streptavidin SPR senzorskom čipu na 25°C. Obojene linije pokazuju podatke sa dvostruko referentnog senzograma, a crne linije 1:1 Langmuir-ovo fitovanje podataka, sa očiglednim uticajem aviditeta na Kd vrednosti od 0.11 nM.
SL. 6 pokazuje ITC podatke titracije 19 µM IZ-hCD40L u 2 µM BMS-986004 (black) ili 18 µM BMS-986004 u 2 µM IZ-hCD40L (plavo). Molarni odnos (vidljiva stehiometrija) je definisan po molu IZ-hCD40L trimera i po molu bivalentnog BMS-986004 Fc-dimera. Vrednosti molarnog odnosa dobijene kao tačke ekvivalencije na apscisi sugerišu da se više od jednog mola BMS-986004 može vezati po molu IZ-hCD40L trimera; međutim, tačan strukturni model kompleksa ne može da se odredi samo iz podataka ITC. Kvadrati predstavljaju integrisane podatke toplote vezivanja a čvrste linije najbolje odgovaraju "dvostrukom setu model mesta".
SL. 7 pokazuje in vivo efikasnost mišjeg CD40L surogata dAb-Fc (odgovor antitela izazvan KLH-om).
SL. 8 demonstrira da mišji dAb BMS-2m-126-24-Fc i antitelo MR-1 inhibraju kolitis izazvan TNBS-om kod miševa.
SL. 9 pokazuje da BMS-2m-126-24-Fc i CTLA4-Ig deluju sinergistički da produže preživljavanje srčanih alografta.
SL. 10 obezbeđuje hipotetički model za posredovanu agregaciju trombocita anti-CD40 monoklonskim antitelom.
SL. 11A pokazuje koncentraciju u plazmi BMS-986004 u odnosu na vremenski profil nakon IV doziranja od 11 mg/kg kod majmuna.
SL. 11B demonstrira koncentraciju u plazmi BMS-986003 u odnosu na vremenski profil nakon IV doziranja od 2 mg/kg kod majmuna.
SL. 12 predstavlja koncentraciju u plazmi BMS-986003 (nakon SC doziranja na 0.2, 2 i 20 mg/kg kod majmuna) i 5c8 IgG1 (nakon IV doziranja na 20 mg/kg kod majmuna) u odnosu na vremenski profil.
SL. 13 pokazuje koncentraciju u plazmi BMS-2m-126-24-CT nakon 1 mg/kg IV i SC doziranja i 10 mg/kg SC doziranja miševima, u odnosu na vremenski profil.
SL. 14 demonstrira PK/PD modelovanje BMS-986003 i 5c8-IgG1 izloženosti u plazmi i odgovor antitela protiv KLH (IgG Titri).
SL. 15 pokazuje PK/PD modelovanje BMS-986004 izloženosti u plazmi i ex vivo RO na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
SL. 16 demonstrira da IV.3 blokira 5c8/sCD40L IC-posredovanu aktivaciju trombocita u humanoj krvi.
SL. 17 pokazuje efekat Fc varijanti na aktivaciju trombocita u humanoj krvi.
SL. 18 demonstrira aktivaciju trombocita sa 5c8-CT/sCD40L IC u krvi od humanih donora genotipovanih za FcgRIIa polimorfizam.
SL. 19 dijagrami aktivacije trombocita različitim antitelima u krvi od humanih donora. SL. 20 pokazuje nivoe aktiviranja trombocita različitim antitelima, uključujući BMS-986003, u transgenim miševima koji eksprimiraju hFcgRIIa.
SL. 21, 22, 23, i 24 pokazuju ClustalW2 poravnanje reprezentativnih domena polipeptida antitela od linija BMS2h-572, BMS2h-719, BMS2h-503, i BMS2h-116, redom. SL. 21 stavlja na uvid javnosti SEQ ID NOS 243, 251, 257, 262 i 274-276, redom, prema redosledu pojavljivanja, SL.22 stavlja na uvid javnosti SEQ ID NOS 352, 354-355 i 357-361, redom, prema redosledu pojavljivanja, SL.23 stavlja na uvid javnosti SEQ ID NOS 1087-1088, redom, prema redosledu pojavljivanja, i SL.24 stavlja na uvid javnosti SEQ ID NOS 970-971 i 974, redom, prema redosledu pojavljivanja.
SL. 25 pokazuje podatke SPR senzorskih programa za eksperimente vezivanja korišćenjem monovalentnih dAb BMS2h-503-1, BMS2h-572-6, BMS2h-719-17, i monovalentnog Fab fragmenta od 5c8, pri čemu se navedeni molekuli takmiče jedan sa drugim za vezivanje na CD40L (biotinilirani IZ-hCD40L).
SL. 26 pokazuje podatke SPR senzorskih programa za eksperimente vezivanja od BMS2h-572-619-CT-dugog, BMS2h-572-633-CT- dugog, BMS2h-572-6-CT- dugog, BMS2h-719-202-CT- dugog, BMS2h-572-608-CT- dugog, BMS2h-572-634-CT- dugog, BMS2h-572-614-CT- dugog, BMS2h-572-635-CT- dugog, i 5c8-CT- dugih molekula bilo prema CD40L monomeru (gornja 3 panela) ili CD40L trimeru (donja 3 panela).
DETALJAN OPIS
[0018] Obezbeđeni su polipeptidi antitela koji specifično vezuju humani CD40L. Polipeptidi antitela ne aktiviraju trombocite, i polipeptidi antitela su korisni u lečenju bolesti koje uključuju aktivaciju CD40L, kao što su bolesti povezane sa kalemom i autoimune bolesti. Polipeptidi antitela mogu biti izabrani pomoću primarnog skrininga koji koristi testove vezivanja ćelija, nakon čega sledi jedna ili više rundi sazrevanja afiniteta usmerenog od pogrešnog ili degenerisanog oligonukleotida. Kao rezultat, obezbeđen je rod polipeptida antitela koji se specifično vezuju za CD40L.
[0019] "Rod" je skup srodnih polipeptida antitela koji su pripremljeni iz uobičajenog prekursora sazrevanjem afiniteta usmerenog od pogrešnog ili degenerisanog oligonukleotida, kao što je stavljeno na uvid javnosti u primerima ispod, i za koje se očekuje da vezuju CD40L. Nomenklatura polipeptida antitela koristi se za označavanje različitih rodova. Nomenklatura "BMS2h-572", na primer, odnosi se na polipeptide antitela iz roda 572, koji su podignuti protiv humanog CD40L. "Rod BMS2h-572" polipeptida antitela uključuje BMS2h-572-1 do BMS2h-572-19, BMS2h-572-21 do BMS2h-572-24, BMS2h-572-601 do BMS2h-572-627, i BMS2h-572-630 do BMS2h-572-635.
[0020] Prema tome, u jednom aspektu, polipeptid antitela ovde stavljen na uvid javnosti može da sadrži varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L, pri čemu se polipeptid antitela može takmičiti sa vezivanjem bilo kog od domena antitela (dAb) navedenih u TABELI 1 ili TABELI 3. Na primer, polipeptid antitela može da se takmiči sa dAb izabranim iz 2h roda. dAb takođe može biti izabran od roda odabranog iz grupe koja se sastoji od BMS2h-116, BMS2h-503, BMS2h-572, i BMS2h-719, kao što je dAb BMS2h-572-633, BMS2h-572-608, ili BMS2h-572-614, na primer. U drugom aspektu, polipeptid antitela ovde stavljen na uvid javnosti može specifično da vezuje humani CD40L kao bilo koji od dAb-a navedenih u TABELI 1 i TABELI 3. Na primer, polipeptid antitela može da sadrže varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L kao dAb BMS2h-572-633, BMS2h-572-608, ili BMS2h-572-614, na primer. Polipeptid antitela predmetnog pronalaska sadrži varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L kao dAb BMS2h-572-633.
[0021] Ovde stavljeni na uvid javnosti polipeptidi antitela mogu biti domen antitela koji sadrži jedan varijabilni domen. Polipeptidi antitela ovde stavljeni na uvid javnosti takođe mogu sadržati dodatne domene, kao što je Fc domen. Na primer, polipeptid antitela može da sadrži drugi varijabilni domen koji specifično vezuje humani serum albumin (HSA). Takvi dvostruko specifični polipeptidi antitela mogu imati, na primer, produženi polu-život. Polipeptidi antitela predmetnog pronalaska sadrže Fc domen.
[0022] Kao što je ovde korišćeno, "specifično vezivanje" odnosi se na vezivanje antigena sa polipeptidom antitela sa konstantom disocijacije (Kd) od oko 1 µM ili nižom mereno, na primer, rezonancijom površinskog plazmona (surface plasmon resonance (SPR)). Pogodni sistemi testova uključuju BIAcore™ sistem rezonancije površinskog plazmona i BIAcore™ kinetički softver za procenu (npr., verzija 2.1). Afinitet ili Kdza interakciju specifičnog vezivanja može biti oko 1 µM ili niži, oko 500 nM ili niži ili oko 300 nM ili niži.
[0023] Izraz "oko" razumeće prosečan poznavalac oblasti i donekle će se razlikovati u kontekstu u kojem se koristi. Generalno, "oko" obuhvata raspon vrednosti koje su plus/minus 10% od referentne vrednosti.
[0024] U skladu sa ovim detaljnim opisom, primenjuju se sledeće skraćenice i definicije. Mora da se napomene kako se ovde koristi, forme jednine "a", "an", i "the" (engl.) uključuju referentne množine osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Tako, na primer, upućivanje na "an antibody" (antitelo) uključuje mnoštvo takvih antitela i upućivanje na "the dosage" (doziranje) uključuje upućivanje na jednu ili više doza i njihovih ekvivalenata poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti, i tako dalje.
1. Aktivnosti CD40L i CD40L
[0025] Obezbeđeni su polipeptidi antitela koji vezuju humani CD40L. CD40L je takođe poznat kao CD154, gp39, TNF-povezani aktivirajući protein (TRAP), 5c8 antigen, ili T-BAM. Relevantne strukturne informacije za humani CD40L mogu da se nađu, na primer, na UniProt Accession Number P29965. "Humani CD40L" se odnosi na CD40L koji sadrži sledeću aminokiselinsku sekvencu:
[0026] CD40L je takođe bio sekvenciran u Sus scrofa, Mus musculus, Canis familiaris, Bos ffini, Macaca mulatta, Aotus tivirgatus, Callithrix jacchus, Cercocebus torquatus atys, Macaca nemestrina, Rattus norvegicus, Gallus gallus, Felis catus, i Sus scrofa.
[0027] Vezivanje ovih polipeptida antitela na CD40L antagonizuje aktivnost CD40L. "CD40L aktivnosti" uključuju, ali nisu ograničeni na, kostimulaciju i aktivaciju APC u saradnji sa stimulacijom T ćelijskog receptora od strane MHC molekula na APC, sekreciju svih imunoglobulinskih izotipova u prisustvu citokina, stimulaciju proliferacije B ćelija, proizvodnju citokina, zamenu klase antitela i sazrevanje afiniteta. Na primer, pacijenti sa X-vezanim hiper-IgM sindromom eksprimiraju funkcionalni CD40 na svojim B ćelijama, ali njihove aktivirane T ćelije imaju defektni CD40L protein, što rezultira njegovom nemogućnošću da aktivira B ćelije i indukuje zamenu imunoglobulinskih izotipova. Aruffo et al., Cell 72:291-300 (1993).
[0028] Aktivnosti CD40L mogu biti posredovane interakcijom sa drugim molekulima. "CD40 aktivnosti" uključuju funkcionalnu interakciju između CD40L i sledećih molekula: CD40 (CD40L receptor), α5β1 integrin, i αIIbβ3. Na primer, CD40L veže svoj receptor, CD40, koji je eksprimovan na različitim APC, kao što su B ćelije, makrofagi, i dendritske ćelije, kao i na stromalnim ćelijama, vaskularnim endotelnim ćelijama, i trombocitima.
[0029] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "aktivirati," "aktivira," i "aktivirano" odnose se na povećanje date merljive CD40L aktivnosti od najmanje 10% u odnosu na referencu, na primer, najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, ili čak 100%, ili više. Aktivnost CD40L je "antagonizovana" ako je aktivnost smanjena za najmanje 10%, i u uzornom tehničkom rešenju, najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, ili čak 100% (tj., nema detektabilne aktivnosti), u odnosu na odsustvo antagonista. Na primer, polipeptid antitela može antagonizovati neku ili svu CD40L aktivnost. U jednom tehničkom rešenju, polipeptid antitela neaktivira proliferaciju B ćelija. U drugom tehničkom rešenju, polipeptid antitela neaktivira sekreciju citokina pomoću T ćelija ili dendritskih ćelija (DCs), pri čemu je citokin najmanje jedan citokin izabran iz grupe koja se sastoji od IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-α, i IFN-γ.
2. Polipeptidi Antitela
[0030] Polipeptidi antitela sadrže varijabilni domen. U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, polipeptidi antitela su u obliku dAb koji sadrži jedan varijabilni domen. Polipeptidi antitela mogu biti molekuli anti-CD40L imunoglobulini pune dužine koji sadrže dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Deo amino kraja svakog lanca može zatim da uključuje varijabilni domen (VLili VH) od oko 100-120 amino kiselina. Utvrđeni komplementarni regioni (CDR) sadržani u njima su prvenstveno odgovorni za prepoznavanje antigena, iako okvirni ostaci mogu igrati ulogu u vezivanju epitopa. Karboksi-terminalna "polovina" svakog teškog lanca definiše konstantni region (Fc) prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju.
[0031] Polipeptidi antitela takođe mogu biti "fragmenti" koji sadrže deo molekula imunoglobulina pune dužine protiv CD40L koji sadrži varijabilni domen koji specifično veže CD40L. Tako, na primer, termin "polipeptidi antitela" uključuje antigen-vezujući teški lanac, laki lanac, teški lanaclaki lanac dimer, Fab fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, jednolančani lanac Fv (scFv), i dAb. Termin "polipeptidi antitela" tako uključuje polipeptide napravljene rekombinantnim inženjeringom i ekspresijom, kao i monoklonska antitela proizvedena prirodnom rekombinacijom i sekrecijom od strane hibridomskih ćelija klonova.
[0032] Laki lanaci su klasifikovani kao kapa (κ) ili lambda (λ), i karakteriše ih određeni konstantni region, CL, kao što je poznato u oblasti. Teški lanaci su klasifikovani kao γ, µ, α, δ, ili ε, i definišu redom izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i četiri domena (CH1, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE. Antitela protiv CD40L mogu imati konstantni region teškog lanca izabran od bilo koje klase imunoglobulina (IgA, IgD, IgG, IgM, i IgE).
[0033] Svaki varijabilni domen lakog lanca (VL) i varijabilni domen teškog lanca (VH) sastoji se od tri CDR-a i četiri okvirna regiona (FRs), raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Tri CDR-a lakog lanca se nazivaju "LCDR1, LCDR2, i LCDR3" a tri CDR-a teškog lanca se nazivaju "HCDR1, HCDR2, i HCDR3."
[0034] Kao što je ovde korišćeno, termin "Fc domen" se odnosi na konstantni region sekvenci antitela koji sadrži CH2 i CH3 konstantne domene kao ograničene prema Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izd., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991). Generalno, Fc domen može biti, na primer, izveden iz IgG1 ili IgG4 Fc regiona. Fc domen je prema pronalasku IgG1 Fc domen.
[0035] Prema pronalasku, varijabilni domen je spojen sa Fc domenom. Opšti primeri različitih Fcformatiranih domena antitela i njihovih potentnosti kao i Fc- formatiranih domena antitela prema pronalasku i njihovih potentnosti dati su u TABELI 6. SL. 3 pruža sekvence različitih ovde obezbeđenih Fc domena. Veznik regioni prikazani su u kvadratima. Kao što je korišćeno u TABELI 6, "Fc" označava da je dAb spojen sa humanim IgG1 kratkim Fc. "CT Dugi Fc", takođe nazvan CT-L2, odnosi se na Fc iz CTLA4 (amino kiseline 139 do 370 od SEQ ID NO: 1362). Podvučene S su tačke mutacije cistein-u-serin koje su napravljene da eliminišu disulfide u Fc zglobu. "CT Kratki", takođe nazvan CT-S1, je kraći od CT Dugačkog za 7 amino kiselina (amino kiseline 138 do 362 od SEQ ID NO: 1363). "N297Q Dugi Fc", takođe označen kao N297Q-L4, je Fc domen humanog IgG1 sa N297Q mutacijom napravljenom da eliminiše N-vezani ugljeni hidrat u Fc (amino kiseline 139 do 370 od SEQ ID NO: 1364). "N297Q Kratki Fc", takođe nazvan N297Q-S3, kraći je od N297Q Dugog Fc za 7 amino kiselina, i humani je IgG1 sa N297Q tačkastom mutacijom napravljenom da eliminiše N-vezani ugljeni hidrat u Fc domenu (amino kiseline 138 do 362 od SEQ ID NO: 1365). "CT-Fc SP5" je CT Dugi Fc, pri čemu se SP5 odnosi na osteonektin signalni peptid korišćen za sekreciju iz sisarskog domaćina ekspresije. Mesto cepanja je označeno sa "^". SL.4 dalje daje primere različitih formata Fc domena.
[0036] Kada je varijabilni domen spojen sa Fc domenom, karboksilni kraj varijabilnog domena (bilo VLili VHdomen, uključujući dAb-a) može biti povezan ili spojen sa amino krajem Fc CH2 domena. Alternativno, karboksilni kraj varijabilnog domena može biti povezan ili spojen sa amino krajem CH1 domena, koji je sam povezan sa domenom Fc CH2 domena. Protein može da sadrži zglobni region između CH1 i CH2 domena u celosti ili delimično.
[0037] CDR sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, varijabilni domen polipeptida antitela može da sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 regione koji imaju istu sekvencu aminokiselina kao CDR1, CDR2, i CDR3 regioni jednog od dAb-ova navedenih u TABELI 1 ili TABELI 3 ili se razlikuju od CDR1, CDR2, i CDR3 regiona za jednu, dve, ili tri amino kiseline. Na primer, polipeptid antitela može da sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 regione koji imaju istu sekvencu amino kiselina kao CDR1, CDR2, i na primer CDR3 regione od BMS2h-572-633, BMS2h-572-608, ili BMS2h-572-614.
[0038] "Domen antitela" (dAb) sadrži jedan varijabilni (VLor VH) domen koji je sposoban da specifično i monovalentno vezuje antigen, kao što je CD40L. Na primer, dAb može imati VHHstrukturu, karakterističnu za kamelidni dAb. "VHdomen" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se da uključuje VHHstrukturu. U drugom tehničkom rešenju, VHdomeni (uključujući sve karakteristike i kombinaciju karakteristika predstavljenih ovde kao tehničko rešenje) su različiti od VHHdomena. dAb-a mogu da formiraju homo- ili heterodimere u rastvoru. Iako nije ograničeno ni jednom određenom teorijom, veruje se da ovde stavljeni na uvid javnosti dAb-a ne uzrokuju agregaciju trombocita, jer antitela koja sadrže mutirane Fc konstrukte ne vezuju FcγRIIa (takođe poznat kao CD32a) na površini trombocita i ne aktiviraju trombocite.
[0039] Kao što je ovde korišćeno, termin "varijabilni domen" odnosi se na varijabilne domene imunoglobulina definisane kod Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5to izd., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991). Numerisanje i pozicioniranje CDR ostataka amino kiselina unutar varijabilnih domena je u skladu sa dobro poznatom Kabat konvencijom o numerisanju.
[0040] Izraz "humani," kada se primeni na polipeptide antitela, znači da polipeptid antitela ima sekvencu, npr., okvirnih regiona i/ili CH domena, izvedenu od humanog imunoglobulina.
Sekvenca je "izvedena od" kodirajuće sekvence humanog imunoglobulina kada je sekvenca ili: (a) izolovana iz humane jedinke ili iz ćelije ili ćelijske linije humane jedinke; (b) izolovana iz biblioteke sekvenci kloniranih gena humanih antitela ili iz sekvenci varijabilnih domena humanih antitela; ili (c) preinačena mutacijom i selekcijom iz jednog ili više gore navedenih polipeptida. "Izolovano" jedinjenje kao što je ovde korišćeno znači da je jedinjenje uklonjeno iz najmanje jedne komponente sa kojom je jedinjenje prirodno povezano u prirodi.
[0041] Polipeptidi antitela se mogu davati humanim pacijentima istovremeno izbegavajući u velikoj meri imuni odgovor protiv antitela koji je često izazvan davanjem antitela drugih vrsta, npr., miša. Na primer, murinska antitela mogu da se "humanizuju" kalemljenjem murinskih CDR-ova na humani varijabilni domen FR, prema postupcima dobro poznatim u oblasti. Humana antitela kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti, međutim, mogu biti proizvedena bez potrebe za genetskom manipulacijom sekvence murinskih antitela.
[0042] Varijabilni domeni mogu da sadrže jedan ili više FR sa istom sekvencom aminokiselina kao kod odgovarajućeg okvirnog regiona koji je kodiran od strane genskog germline segmenta humanog antitela. Na primer, domen antitela može da sadrži VHsegmente DP47, DP45, ili DP38 gena germinativne linije, Vκsegment DPK9 gena germinativne linije, JHsegment JH4b, ili Jκsegment Jκ1.
[0043] Mogu se izvršiti promene u polipeptidnim sekvencama antitela uz zadržavanje sposobnosti da specifično vežu CD40L. Specifično, polipeptidi antitela (npr., dAb) mogu da sadrže promenljiv varijabilni domen koji zadržava funkciju specifičnog vezivanja CD40L kao dAb BMS2h-572-633. U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, promenljivi varijabilni domen može da se takmiči sa BMS2h-572-633 za specifično vezivanje za CD40L. Sazrevanje afiniteta sklonog greškama, kao što je stavljeno na uvid javnosti u primerima ispod, pruža jedan ogledni metod za pravljenje i identifikaciju polipeptida antitela sa promenljivim sekvencama koje specifično vezuju CD40L.
[0044] Na primer, promenljivi varijabilni domen može da se razlikuje od jednog od varijabilnih domena navedenih u TABELI 1 i TABELI 3, do 10 amino kiselina ili bilo koje integralne vrednosti između, kada promenljivi varijabilni domen specifično veže CD40L. Alternativno, promenljivi varijabilni domen može imati najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identične sekvence) u odnosu na sekvencu navedenu u sadašnjem Spisku sekvenci. Aminokiselinski ostaci koji nisu identični ili amino kiseline koje se razlikuju između dve sekvence mogu predstavljati aminokiselinske supstitucije, adicije, ili delecije. Ostaci koji se razlikuju između dve sekvence ne pojavljuju se na identičnim položajima, kada su dve sekvence poravnate bilo kojim pogodnim algoritmom poravnjanja aminokiselinskih sekvenci, kao što je BLAST.
[0045] U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, aminokiselinske substitucije mogu biti izvršene u pojedinačnim FR regionim, tako da FR sadrži 1, 2, 3, 4, ili 5 različitih amino kiselina u odnosu na aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg FR kodiranog od strane germinativne linije genskog segmenta humanog antitela. U drugom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, promenljivi varijabilni domen može da sadrži jednu ili dve supstitucije aminokiseline u CDR. U drugim aspektima ovde stavljenim na uvid javnosti, supstitucije aminokiseline u FR i CDR regionima mogu biti kombinovane. Reprezentativni varijabilni domeni koji specifično vezuju CD40L su navedeni u TABELI 1 i TABELI 3.
[0046] Informacije koje se odnose na granice VLili VHdomena gena teškog i lakog lanca mogu da se koriste za dizajniranje PCR prajmera za proširenje varijabilnog domena iz klonirane kodirajuće sekvence teškog ili lakog lanca koja kodira polipeptid antitela za koji se zna da vezuje CD40L. Prošireni varijabilni domen može biti ubačen u pogodan ekspresioni vektor, npr., pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Kiseline Res.19:4133-4137) i eksprimovan, ili sam ili kao spojen sa drugom sekvencom polipeptida, korišćenjem tehnike dobro znane u oblasti. Na osnovu otkrivenih sekvenci aminokiselina i polinukleotida, fuzioni protein se može dobiti i prečistiti koristeći samo uobičajenu veštinu u bilo kojoj pogodnoj ćelijskoj liniji domaćina, kao što su CHO, 293, COS, NSO, i slično, a zatim prečišćavanjem koristeći jednu ili kombinaciju metoda, uključujući protein A afinitetnu hromatografiju, izmenu jona, reverzno fazne tehnike, ili slično.
[0047] U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, polipeptid antitela može biti "dvostruko specifičan" polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40L. Dvostruko specifični polipeptidi antitela sadrže drugi varijabilni domen koji specifično vezuje drugi antigen koji nije humani CD40L.
[0048] U drugom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, drugi antigen može biti molekul na ćelijskoj površini imunološke efektorske ćelije ili rastvorljivi molekul kao što je, na primer, citokin. Vezivanje dvostruko specifičnog polipeptid antitela može se koristiti da se suprotstavi CD40L i da se suprotstavi biološkoj aktivnosti drugog antigena. Molekuli ćelijske površine imunih efektorskih ćelija uključuju skup molekula diferencijacije (CD). Reprezentativni CD markeri navedeni su na Internet at hypertext transfer protocol
http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_of_differentiation (poslednji put izmenjen 8. Avgusta, 2012). Molekuli ćelijske površine imunih efektorskih ćelija takođe uključuju molekule Glavnog Kompleksa Histokompatibilnosti (Major Histocompatibility Complex (MHC)) Klase II. Antitela protiv ovih molekula ćelijskih površina su poznati u oblasti i mogu se koristiti kao izvor varijabilnog domena za konstruisanje dvostruko specifičnog plipeptida antitela.
[0049] U jednom aspektu ovde stavljenom na uvid javnosti, polipeptidi antitela dvostruko specifičnog liganda mogu biti povezani "aminokiselinskim veznikom" ili "veznikom." Na primer, dAb može biti spojen sa N-krajem aminokiselinskog veznika, a drugi dAb može biti spojen sa C-krajem veznika. Iako aminokiselinski veznici mogu biti bilo koje dužine i sastoje se od bilo koje kombinacije aminokiselina, dužina veznika može biti relativno kratka (npr., pet amino kiselina ili manje) da bi se smanjile interakcije između povezanih domena. Aminokiselinski sastav veznika takođe može biti podešen da smanji broj aminokiselina sa glomaznim bočnim lancima ili aminokiseline koje verovatno uvode sekundarne strukture. Pogodni amino kiselinski veznici uključuju, ali nisu ograničeni na, one do 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, ili 25 aminokiselina u dužini. Reprezentativne sekvence aminokiselinskih veznika uključuju (GGGGS)n(SEQ ID NO: 12), pri čemu n može biti bilo koji celi broj između 1 i 5. Ostale sekvence pogodnog veznika mogu biti izabrane od grupe koja se sastoji od AS, AST, TVAAPS (SEQ ID NO: 13), TVA, i ASTSGPS (SEQ ID NO: 14).
[0050] Vezivanje drugog antigena može da poveća in vivo poluživot polipeptida antitela. Na primer, drugi varijabilni domen dvostruko specifičnog polipeptida antitela može specifično da vezuje serum albumin (SA), npr., humani serum albumin (HSA). Polipeptid antitela formatiran da se vezuje za I može imati povećan in vivo t-α ("alfa poluživot") ili t-β ("beta poluživot") poluživot u odnosu na isti neformatirani polipeptid antitela. Poluživoti t-α i t-β mere koliko brzo je supstanca distribuirana i eliminisana iz tela. Povezivanje na I može da se postigne fuzijom peptida antitela sa drugim varijabilnim domenom sposobnim da specifično vezuje I, na primer. Antitela protiv humanog serum albumina su dobro poznata u struci. Videti, npr., Abcam®, antitela Humanog Serum Albumina ab10241, ab2406, i ab8940, dostupna na Internet at hypertext transfer protocol www.abcam.com/index.html, ili GenWay, ALB antitelo, dostupno na Internet at hypertext transfer protocol www.genwaybio.com. Varijabilni domeni koji specifično vezuju I mogu se dobiti od bilo kog od ovih antitela, a zatim se spojiti sa polipeptidom antitela stavljenog na uvid javnosti upotrebom rekombinantnih tehnika koje su dobro poznate u oblasti.
[0051] Alternativno, povezivanje polipeptida antitela sa I može se postići direktnim spajanjem sekvence polipeptida antitela za I kodirajuću sekvencu upotrebom tehnika dobro poznatim stručnjacima. I kodirajuća sekvenca može da se dobije, na primer, korišćenjem PCR prajmera izvedenih iz cDNK sekvence dostupne na GenBank Accession No. NM000477.
[0052] tα-poluživot od kompozicije I-povezanog domena antitela može biti povećan za 10% ili više. tα-poluživot od kompozicije I-povezanog domena antitela može biti u opsegu od 0.25 časova do 6 sati. tβ-poluživot od kompozicije I-povezanog domena antitela može biti povećan za 10% ili više. tβ-poluživot od kompozicije I-povezanog domena antitela može biti u opsegu od 12 do 48 sati.
[0053] U drugom tehničkom rešenju, polipeptid antitela može biti formatiran da poveća njegov in vivo poluživot PEGilacijom. U jednom tehničkom rešenju, PEG je kovalentno povezan. U drugom tehničkom rešenju, PEG je povezan za polipeptid antitela na ostatku cisteina ili lizina. U još jednom tehničkom rešenju, polipeptid antitela vezan za PEG ima hidrodianamičku veličinu od najmanje 24 kD. U još jednom tehničkom rešenju, ukupna veličina PEG-a je od 20 do 60 kD zaključno. U još jednom tehničkom rešenju, domen antitela vezan za PEG ima hidrodinamičku veličinu od najmanje 200 kD.
[0054] PEGilacija se može postići korišćenjem nekoliko PEG zakačenih grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na aktivni estar N-hidroksilsukcinimid, sukcinimidil propionat, maleimid, vinil sulfon, ili tiol. PEG polimer može biti povezan sa polipeptidom antitela bilo na unapred određenom položaju, ili se može nasumično povezati sa domenom molekula antitela. PEGilacija se takođe može posredovati preko peptidnog veznika vezanog za domen antitela. Odnosno, PEG deo može da se veže za peptidni veznik spojen sa polipeptidom antitela, pri čemu veznik pruža mesto (npr., slobodni cistein ili lizin) za PEG vezivanje. Postupci PEGilacije antitela su dobro poznati u oblasti, kao što je stavljeno na uvid javnosti u Chapman, et al., "PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review," Adv. Drug Deliv. Rev.54(4):531-45 (2002), na primer.
[0055] Polipeptidi antitela takođe mogu biti dizajnirani tako da formiraju dimer, trimer, tetramer, ili drugi multimer. Polipeptidi antitela, npr., dAb-a, mogu biti povezani da formiraju multimer pomoću nekoliko metoda poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ekspresiju monomera kao fuzionog proteina, povezivanje dva ili više monomera preko peptidnog veznika između monomera, ili hemijskim spajanjem monomera nakon translacije, bilo jednim sa drugim direktno, ili preko veznika disulfidnim vezama, ili vezivanjem na di-, tri- ili multivalentni vezni deo (npr., PEG sa više krakova). U jednom tehničkom rešenju, multimer može da veže jedan molekul CD40.
3. Farmaceutske kompozicije i Metode Lečenja
[0056] Farmaceutska kompozicija sadrži terapijski efikasnu količinu jednog ili više polipeptida antitela i po izboru farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor fosfatnog pufera, dekstrozu, glicerol, etanol i slično, kao i njihove kombinacije. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoćnih supstanci, kao što su agensi vlaženja i emulgatori, konzervansi, ili puferi koji poboljšavaju rok trajanja ili efikasnost fuzionog proteina. Kompozicije mogu biti formulisane tako da obezbede brzo, neprekidno, ili odloženo oslobađanje aktivnog sastojka (sastojaka) nakon primene. Pogodne farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu pripremu su dobro poznati u oblasti. Videti, npr., Remington, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co. (2005).
[0057] Farmaceutska kompozicija dalje može da sadrži imunosupresivni/imunomodulatorni i/ili anti-inflamatorni agens. Farmaceutska kompozicija može da se koristi za postupak lečenja imune bolesti kod pacijenta kome je potrebno takvo lečenje. Suprotstavljanje CD40L-posredovanoj T ćelijskoj aktivaciji može inhibirati neželjene T ćelijske odgovore koji se javljaju na primer tokom autoimunosti, odbacivanja transplantata, ili alergijskih odgovora. Inhibiranje CD40L-posredovane T ćelijske aktivacije može ublažiti napredovanje i/ili težinu ovih bolesti.
[0058] Kao što je ovde korišćeno, "pacijent" znači životinja, npr. sisar, uključujući ljude. Pacijentu se može dijagnostikovati imunološka bolest. "Lečenje" ili "lečiti" ili "tretirati" odnosi se na postupak koji uključuje ublažavanje napredovanja ili ozbiljnosti simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti. "Imuna bolest" se odnosi na svaku bolest povezanu sa razvojem imune reakcije kod pojedinaca, uključujući ćelijsku i/ili humoralnu imunu reakciju. Primeri imunih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na bolest povezanu sa kalemom, inflamacijom, alergijom, i autoimunom bolešću. Autoimuna bolest može biti izabrana od grupe koje se sastoji od sistemskog lupus eritematozusa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, dijabetesa, psorijaze, skleroderme, ateroskleroze, inflamatorne bolesti creva, i ulceroznog kolitisa.
[0059] Bolesti koje se mogu lečiti davanjem farmaceutske kompozicije mogu biti izabrane od grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozantnog spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimunih bolesti uva, autoimunih bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 diabjabetes, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barreovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenične purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na produkte rekombinantnih lekova (npr., Faktor VII kod hemofilije), sistemskog lupus eritematozusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, mijastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatije, tiroiditisa, odbacivanja transplantata, i vaskulitisa. Autoimuno-posredovana stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, stanja u kojima je tkivo koje je pogođeno primarna meta, a u nekim slučajevima i sekundarna meta. Takva stanja uključuju, ali nisu ograničena na, AIDS, atopijsku alergiju, bronhijalnu astmu, ekcem, leprozu, šizofrenju, naslednu depresiju, transplantaciju tkiva i organa, sindrom hroničnog umora, Alzhajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, infarkt miokarda, moždani udar, autizam, epilepsiju, Artusov fenomen, anafilaksiju, alkoholnu zavisnost, i narkomaniju.
[0060] Poželjne indikacije za primenu ovih farmaceutskih kompozicija su, na primer, imuna trombocitopenijska purpura, sistemska skleroza, mijastenija gravis, odbacivanje alografta, i bolest kalem protiv domaćina.
[0061] Farmaceutska kompozicija može da se daje sama ili u kombinovanoj terapiji, (tj., istovremeno ili sekvencijalno) sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili antiinflamatornim agensom. Različite imune bolesti mogu zahtevati upotrebu specifičnih pomoćnih jedinjenja korisnih u lečenju imune bolesti, koja se mogu odrediti na bazi od pacijenta do pacijenta. Na primer, farmaceutska kompozicija može biti primenjena u kombinaciji sa jednim ili više pogodnih adjuvansa, npr., citokina (IL-10 i IL-13, na primer) ili drugih imuno stimulatora, npr., hemokina, antigenima povezanim sa tumorom, i peptidima. Pogodni adjuvansi su poznati u oblasti.
[0062] Na primer, farmaceutska kompozicija stavljena na uvid javnosti može se davati istovremeno ili uzastopce, sa mutantnim molekulom antigena 4 (CTLA4) citotoksičnog T-limfocita, kao što je L104EA29Y-Ig (belatacept). CTLA4 veže CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) sa većim aviditetom od CD28, i prolazno se eksprimira na T ćelijama posle njihove aktivacije, što prekida interakciju između CD28 i CD80/86. Oosterwegel et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 294-300 (1999). Ovo stvara negativan povratni signal za aktivaciju T ćelija.
[0063] CTLA4 mutantni molekuli, uključujući L104EA29Y-Ig, imaju povećan aviditet vezivanja za CD80/86 u poređenju sa divljim-tipom CTLA4. Posredovanje CD28-CD80/86 puta pomoću L104EA29Y-Ig uspešno je sprovedena, na primer, za lečenje bolesti povezanih sa kalemom u modelima transplantata kod primata koji nisu ljudi, samostalno ili u kombinaciji sa drugim imunosupresivnim agensima. Larsen et al., Amer. J. Transplant. 5: 443 (2005). U.S. Patentna Prijava pod brojem 2010/0166774 opisuje strukturu L104EA29Y-Ig, metode za proizvodnju, i formulaciju koja sadrži CTLA4 molekul. U.S. Patenti Broj 7,094,874 i 7,482,327 dalje stavljaju na uvid javnosti primenu (uključujući ko-primenu sa jednim ili više drugih lekova) i raspored doziranja L104EA29Y-Ig.
[0064] Bilo koji pogodan metod ili put može da se koristi za primenu polipeptida antitela ili farmaceutske kompozicije. Putevi davanja uključuju, na primer, oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, ili intramuskularnu primenu. Terapijski efikasna doza primenjenih polipeptid(a) antitela zavise od brojnih faktora, uključujući, na primer, vrstu i ozbiljnost imune bolesti koja se leči, upotrebu kombinovane terapije, put primene polipeptid(a) antitela ili farmaceutske kompozicije, i težinu pacijenta. Neograničavajući raspon za terapijski efikasne količine domena antitela je 0.1-20 mg/kg, i u jednom aspektu, 1-10 mg/kg, u odnosu na telesnu težinu pacijenta. Doza polipeptid(a) antitela se može dalje voditi količinom polipeptid(a) antitela koja je potrebna za suprotstavljanje CD40 u in vitro i/ili in vivo modelima bolesnih stanja. Reprezentativni modeli su opisani dole i u primerima.
4. In Vitro a In Vivo Modeli
[0065] Sposobnost polipeptida antitela stavljenog na uvid javnosti da se suprotstavi CD40L može da se testira u jednom od nekoliko dostupnih in vitro ili in vivo model sistema. Prikladni sistemi za ljude, životinje, i model sistemi ćelija opisani su ispod. Dalje su opisani sistemi ćelijskog testa u primerima.
4.1. Imuna Trombocitopenijska Purpura (ITP) In Vivo Model:
[0066] Patel et al., British J. Haematology 141: 545-548 (2008) saopštavaju o potencijalnoj ulozi CD40-CD40L u patogenezi ITP-a. Autoantitela protiv trombocita kod pacijenata sa ITP, se vežu za trombocite koji cirkulišu i ubrzavaju njihovo uništavanje. Primarni mehanizam kojim antitela protiv CD40L, smatra se, povećavaju broj trombocita u ITP je blokiranje bazirano na T ćelijskoj aktivaciji autoreaktivnih B ćelija, koje proizvode antitela protiv trombocita. Antitela protiv CD40L mogu takođe da blokiraju ekspresiju CD40L na trombocitima, čime sprečavaju autoprezentaciju glikoproteinskih antigena trombocita na makrofagima. Nadalje, anti-CD40L mAb-a inhibiraju direktne interakcije između trombocita CD40L i drugih ćelija, poput plazmacitoidnih dendritskih ćelija (DCs), koje su nedavno bile uključene u pokretanje odgovora interferona (IFN) tipa I kod pacijenata sa humanim lupusom. Duffau et al., Sci. Transl. Med.2: 47 (2010).
[0067] Patel et al. demonstrirali su efikasnost dva humanizovana monoklonska antitela protiv CD40L, hu5c8 i IDEC-131, kod 46 humanih pacijenata sa hroničnom ITP upornom za konvencionalno lečenje. Pacijenti su imali ukupnu stopu odgovora od 24%, koju karakteriše povećan broj trombocita. Ovo je pokazalo potencijalnu ulogu CD40-CD40L u patogenezi ITP-a.
4.2. Lupus In Vivo i In Vitro Modeli:
[0068] Ekspresija glomerularnog i tubularnog CD40 je izrazito regulisana kod proliferativnog nefritisa. Nekoliko studija je prijavilo hiperekspresiju CD40L od strane T ćelija i povišene koncentracije rastvorljivih sCD40L kod humanog lupusa. Kimura et al., Therapeutic Apheriss and Dialysis 9: 64-68 (2005); Vakkalanka et al., Arthritis & Rheumatism 42: 871-881 (1999).
[0069] Sistemski lupus eritematozus (SLE) je hronična autoimuna bolest koja se karakteriše proizvodnjom više autoantitela i hiperaktivnošću B ćelije. Grammer et al., J. Clin. Invest. 112: 1506-1520 (2003) saopštavaju rezultate lečenja pacijenata sa SLE humanizovanim anti-CD40L mAb 5c8 (BG9588). Videti takođe Huang et al., Arthritis & Reumatism 46: 1554-1562 (2002). Grammer et al. saopštavaju da su CD19+ periferne B ćelije ispitivane pre i posle lečenja sa anti-CD40L mAb. Pre tretmana, SLE pacijenti su manifestovali aktivirane B ćelije koje su esprimirale CD40L, CD69, CD38, CD5, i CD27. Aktivirane B ćelije nestale su sa periferije tokom i nakon lečenja. Pre lečenja, pacijenti sa aktivnom SLE imali su cirkulirajuće CD38<bright>ćelije koje luči Ig, koje nisu pronađene kod normalnih pojedinaca. Nestanak ovih plazma ćelija tokom lečenja bio je povezan sa smanjenjima anti-dvostruko uvijene DNK (anti-dsDNK) Ab nivoa, proteinurije i indeksa aktivnosti SLE bolesti. U skladu sa ovim pronalaskom, periferne B ćelije uzgajane in vitro spontano su razmnožavale i lučile Ig na način koji je inhibiran od strane mAb protiv CD40L. CD38+/++IgD+, CD38+++, i CD38+IgD- B podgrupe ćelija prisutne u perifernoj krvi pacijenata sa SLE takođe su nestale nakon lečenja sa mAb protiv CD40L. Zajedno, ovi rezultati sugerišu da spontane CD40L-CD40 interakcije kod pacijenata sa aktivnim SLE pobuđuju aktivaciju, proliferaciju, i diferencijaciju B ćelija kao i plazma ćelija koje luče autoantitela i posreduju proteinuriju i aktivnost bolesti.
[0070] Proliferativni lupus glomerulonefritis je dugotrajna autoimuna bolest sa postupkom voskiranja i opadanja, koju karakteriše povećani nivo antitela protiv dsDNK antitela, smanjena koncentracija C3 u serumu, i hematurija. Boumpas et al, Arthritis & Rheumatism 48: 719-727 (2003) saopštavaju rezultate faze II, multicentrične, otvorene studije koja procenjuje toksičnost i efikasnost BG9688, humanizovanog anti-CD40L monoklonskog antitela, kod pacijenata sa proliferativnim lupus glomerulonefritisom. Iako je studija morala da bude povremeno prekinuta zbog tromboembolijskih događaja koji su se javljali kod pacijenata u nekoliko BG9588 protokola, kratak tok lečenja antitelom protiv CD40L kod pacijenata sa proliferativnim lupus nefritisom je smanjio antitela protiv dsDNK, povećao koncentraciju C3, i smanjio hematuriju, sugerišući da lek ima imunomodulatornu funkciju.
4.3. Inflamatorna Bolest Creva (IBD) In Vivo Modeli:
[0071] Kronova bolest (CD) i ulcerativni kolitis (UC) su IBD-i koje su okarakterisane leukocitnim infiltratima u zapaljenoj crevnoj mukozi, koji se uglavnom sastoji od aktiviranih ćelija CD25+, B ćelija i makrofaga. Ludwiczek et al., Int. J. Colorectal Dis.18: 142-147 (2003) saopštavaju da su kod CD pacijenata, nivoi sCD40L u plazmi bili značajno viši nego kod zdravih pojedinaca. Štaviše, CD pacijenti sa fistulama i/ili apscesima imali su značajno više nivoe sCD40L od pacijenata sa nekomplikovanim CD-om. Takođe je objavljeno da put CD40-CD40L doprinosi proinflamatornoj funkciji ćelija crevnog epitela kod IBD. Borcherding et al., Am. J. Pathol.176: 1816-1827 (2010). Pacijenti sa CD takođe imaju povećan rizik od sistemske tromboembolije, a hiperaktivno stanje trombocita kod takvih pacijenata verovatno je rezultat pojačanog oslobađanja sCD40L što je posledica njihovog većeg endogenog sadržaja CD40L. Menchen et al., Gut 58: 920-928 (2009); videti takođe Danese et al., Gut 52: 1435-1441 (2003).
[0072] Kasran et al., Aliment. Pharmacol. Ther. 22: 111-122 (2005) istraživali su upotrebu himernog mAb ch5D12 protiv humanog CD40 za lečenje Kronove bolesti. mAb je primenjeno na 18 pacijenata sa umerenim do teškim CD-om u pojedinačnoj dozi, ispitivanjem I/Iia faze eskalacije otvorene doze. Od 18 pacijenata, 13 (ili 72%) je imalo povoljan odgovor na infuziju antitela, a 4 pacijenta (ili 22%) su doživeli remisiju. Lečenje sa mAb protiv CD40 smanjilo je mikroskopsku aktivnost i intenzitet bolesti infiltracije ćelije lamina propria, i mAb je dobro podnošen.
4.4. Reumatoidni Artritis (RA), Juvenilni Idiopatski Artritis (JIA), i Psorijatični Artritis (PsA) In Vivo Modeli:
[0073] Reumatoidni artritis je sistemska autoimuna bolest sa intraartikularnom upalom kao dominantnim svojstvom, koja pogađa do 1% populacije. Bolest se može klinički dalje podeliti prisustvom ili odsustvom autoantitela (antitela na ciklični citrulinirani peptid (CCP) ili reumatoidni faktor (RF), koji su međusobno veoma povezani. Raychaudhuri et al., Nature Genetics 40: 1216-1223 (2008) su saopštili da su sproveli meta analizu od dve publikovane genom široko povezane (genome-wide association (GWA)) studije ukupno od 3,393 slučajeva i 12,462 kontrola, kako bi identifikovali RA mesto rizika Evropskih populacija. Oni su genotipizovali 31 najbolje rangirane polimorfizme kratkih nukleotida (SNPs) koji nisu prethodno povezani sa RA u nezavisnoj replikaciji od 3,929 autoantitelo-pozitivnih RA slučajeva i 5,807 podudarnih kontrola iz osam zasebnih kolekcija. Identifikovali su uobičajenu varijantu na lokumu gena CD40, što je podrazumevalo centralnu ulogu za signalni put CD40 u RA patogenezi. Snažna povezanost gena CD40 sa podložnošću RA snažno je ponovljena u drugoj studiji u velikoj UK kohorti od 3,962 pacijenata sa RA. Orozso et al., Ann. Rheum. Dis.69: 813-816 (2010).
[0074] Glavna uloga CD40L pronađena je takođe i u patogenezi juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA). Prahalad et al., Pediatric Rheumatology 6: 1-8 (2008). JIA je heterogena grupa artropatija nepoznate etiologije. Pronađeno je da je sCD40L bio značajno povišen u serumu dece sa JIA, zajedno sa nekim citokinima. Logistička regresiona analiza sugerisala je da su sCD40L, kao i IL-6 i TNFα, pozitivno povezani sa JIA. sCD40L je povišen kod svih JIA podtipova, sa najvišim nivoima među težim podtipovima. Ovi rezultati uključuju sCD40L kao potencijalni biomarker za lečenje i praćenje pacijenata sa JIA.
[0075] Takođe je pokazano da aktivirane T ćelije pacijenata sa psorijatičnim artritisom (PsA), a naročito onih sa aktivnom bolešću, imaju značajno povećanu ekspresiju CD40L. Daoussis et al., Rheumatology 46: 227-231 (2007). Ovi rezultati ukazuju na ulogu puta CD40-CD40L u patogenezi PsA i da terapija koja selektivno cilja CD40L može koristiti PsA pacijentima.
4.5. Sistemska Skleroza In Vivo Modeli:
[0076] Sistemska skleroza (SSc) je autoimuni poremećaj vezivnog tkiva koji je karakterisan fibroznim i vaskularnim promenama na koži i unutrašnjim visceralnim organima. U studiji u kojoj su učestvovala 52 pacijenta iz Japana sa SSc, nivoi sCD40L u serumu su povišeni u poređenju sa zdravim kontrolama. Komura et al., J. Reumatol.31: 514-519 (2004). Štaviše, nivoi sCD40L kod pacijenata sa SSc bili su viši nego kod pacijenata sa Sistemskim lupus eritematozusom (SLE) koji su imali povišene nivoe sCD40L u poređenju sa kontrolama, i nivoe sCD40L pozitivno korelirane sa nivoima C reaktivnog peptida kod pacijenata sa SSc. Takođe je objavljeno da blokada CD40L sa antitelom protiv CD40L u uzgajanim T i B ćelijama od SSc pacijenata inhibira proizvodnju antitela protiv topoizomeraze I. Kuwana et al., J. Immunol. 155: 2703-2714 (1995). Ovi rezultati sugerišu da inhibicija CD40-CD40L interakcija može biti potencijalni terapijski cilj u lečenju SSc kao i SLE.
4.6. Ateroskleroza In Vivo Modeli:
[0077] Nekoliko studija sugerisalo je ulogu signalnog puta CD40-CD40L tokom aterogeneze. Mach et al. pokazali su to kod miševa, lečenje monoklonskim antitelom protiv CD40L ograničavalo je aterosklerozu kod miševa kojima nedostaje receptor za lipoprotein niske gustine, koji su bili na dijeti sa visokim holesterolom 12 nedelja. Nature 394: 200-203 (1998). Antitelo je smanjilo veličinu aterosklerotičnih lezija aorte za 59% a njihov sadržaj lipida za 79%. Pored toga, ateroma miševa tretiranih antitelom protiv CD40L sadrži značajno manje makrofaga i T limfocita, i pokazuje smanjenu ekspresija molekula-1 vaskularne adhezije.
[0078] Lečenje antitelom protiv CD40L kod miševa sa manjom gustinom lipoproteinskih receptora tokom druge polovine režima ishrane sa visokim holesterolom u trajanju od 26 nedelja nije unazadilo, ali je značajno smanjilo dalje napredovanje utvrđenih aterosklerotičnih lezija u lučnoj aorti a posebno u grudnoj i trbušnoj aorti, u poređenju sa kontrolnim lečenjem. Schonbeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci.97: 7458-7463 (2000). Osim toga, anti-CD40L lečenje promenilo je sastav ateroma na način za koji se smatra da favorizuje stabilnost plaka, npr., smanjeni relativni sadržaj makrofaga i lipida, kao i povećan relativni sadržaj ćelija glatkih mišića i kolagena. Ove studije daju podršku važnosti signalnog puta CD40-CD40L u aterosklerozi i njenim komplikacijama, poput bolesti koronarne arterije.
4.7. Odbacivanje alografta u In Vivo Modelima:
[0079] Usmeravanje puta CD40-CD40L dugo je bilo od velikog interesa za prevenciju odbacivanja transplanata čvrstih organa (SOT), posebno u svetlu obećavajućih podataka iz brojnih objavljenih studija o transplantaciji kod primate koji nisu ljudi. Pokazano je da smanjena ekspresija CD40L na ex vivo aktiviranim CD4+ T limfocitima korelira sa odličnom funkcijom bubrežnog alografta. Lederer et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 133: 276-284 (2004). Osim toga, nekoliko studija je pokazalo da anti-CD40L mAbs mogu i da spreče i da preokrenu akutno odbacivanje alografta kod primata. Na primer, Kirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8789-8794 (1997) su objavili da, kod rezus majmuna transplantirani bubrežni alografti, sami anti-CD40L mAb 5C8 ili u kombinaciji sa CTLA4-Ig značajno produžavaju preživljavanje bez odbacivanja. Samo mAb hu5c8 specifično za CD40L takođe je dozvolilo alogensko kalemljenje ostrvaca i dugoročnu insulinsku nezavisnost kod rezus majmuna kojima je transplantiran adekvatan broj održivih ostrvaca pankreasa. Kenyon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8132-8137 (1999). Preston et al., Amer. J. Transplantation 5: 1032-1041 (2005) su izvršili transplantaciju bubrega kod rezus majmuna koji su neusklađeni sa MHC-om i tretirali su primaoce sa kombinacijom mAb IDEC-131 specifičnim za CD40L, i/ili sirolimusa, i/ili pre transplantacije donor-specifičnom transfuzijom. IDEC-131 je bio veoma efikasan u sprečavanju odbacivanja bubrežnog alografta kod primata. Kod majmuna cinomolgusa koji su bili podvrgnuti alotransplantaciji bubrega, lečenje sa anti-CD40L mAb ABI793 efikasno je sprečilo odbacivanje kalema graft. Schuler et al., Transplantation 77: 717-726 (2004). Pored sprečavanja odbacivanja alografta, mAb-a specifična za CD40L su indukovala donor specifičnu toleranciju u modelima transplantacije primata. Preston et al., Amer. J. Transplantation 5: 1032-1041 (2005); Kenyon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8132-8137 (1999).
[0080] Kod humanih pedijatrijskih pacijenata koji su pretrpeli akutno odbacivanje kalema nakon transplantacije jetre ili tankog creva, primećena je korelacija između ekspresije CD40L na CD8+ T ćelijama i rizika od odbacivanja transplantata. Ashokkumar et al., Amer. J. Transplantation 9: 179-191 (2009) and Ashokkumar et al., Surgery 146: 166-173 (2009). Slično tome, kod odraslih pacijenata koji su pretrpeli odbacivanje alografta posle transplantacije jetre ili bubrega, histološka analiza pokazala je povezanost između ekspresije CD40L i akutnog ili hroničnog odbacivanja. Bartlett et al., Amer. J. Transplantation 3: 1363-1368 (2003) and Biancone et al., Nephrol. Diall. Translpant. 13: 716-722 (1998).
[0081] Nekoliko studija podržavaju ciljanje CD40L preko CD40 kako bi se postigla bolja efikasnost pri transplantaciji. Na primer, opstanak kalema je duži i trajniji kada je CD40L selektivno blokiran, u poređenju sa CD40. Gilson et al., J. Immunol. 183: 1625-35 (2009). Osim toga, nedavni podaci sugerišu da blokada CD40L može povećati indukciju Tregs-a i/ili supresorskih ćelija da podstaknu preživljavanje kalema. Garcia et al., J. Clin. Inv. 120: 2486-96 (2010). Takođe, blokada CD40L, ali ne i CD40, pokazala je indukciju dugo živeće imunološke tolerancije što rezultira u neodređenom preživljavanju kalema, naročito u kombinaciji sa blokadom B7 puta. Kenyon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8132-8137 (1999); Kawai et al., Amer. J. Transplantation 4: 1391-1398 (2004); Preston et al., Amer. J. Transplantation 5: 1032-1041 (2005); Adams et al., J. Immunol. 174: 542-50 (2005). Sinergija blokiranja puteva CD40-40L i B7-CD28 u poboljšanju preživljavanja kalema je posebno važna, jer predstavlja trenutno stavljen na uvid javnosti domen antitela kao prirodni izbor za kombinaciju sa belataceptom (CTLA4-Ig) za SOT.
4.8. Bolest Kalem-protiv-Domaćina In Vivo Model:
[0082] Hronična i akutna bolest kalem protiv domaćina (raft-versus-host disease (cGVHD i aGVHD)) su komplikacije koje mogu nastati nakon presađivanja matičnih ćelija ili koštane srži u kojima presađene ćelije donora napadaju telo primaoca transplantata. Akutna GVHD kod ljudi događa se oko 60 dana posle transplantacije i dovodi do oštećenja kože, jetre i creva dejstvom citolitičkih limfocita. Hronična GVHD nastaje kasnije i sistemska je autoimuna bolest koja pogađa pre svega kožu, što rezultira poliklonskom aktivacijom B ćelija i hiperprodukcijom Ig-a i autoantitela.
[0083] Izgleda da su interakcije CD40L-CD40 kritične za razvoj obe i cGVHD i aGVHD. Durie et al., J. Clin. Invest.94: 1333-1338 (1994). U mišjem in vivo modelu, antitela protiv CD40L su blokirala naredne pojave povezane sa fenomenom cGVHD: splenomegalijom, in vitro proizvodnjom poliklonskog Ig-a, povišenim nivoima serumskog IgE-a i serumskih autoantitela protiv DNK, i stvaranjem citotoksičnih T ćelija protiv domaćina. Proizvodnja antitela ostala je inhibirana duži vremenski period nakon prestanka primene antitela protiv CD40L. Kod miševa sa aGVHD, koja je povezana sa indukcijom temeljnog antialogenskog citotokičnog T ćelijskog (CTL) odgovora, lečenje sa anti-CD40L sprečilo je stvaranje CTL koji potiče od H-2b. Rezultati studije sugerišu da su interakcije CD40L-CD40 kritične kod GVHD i da CD40L može biti koristan ligand za ciljanje imunoterapijskih agenasa u kontroli GVHD.
4.9. Mijastenija Gravis In Vivo Model:
[0084] Mijastenija gravis (MG) i njen životinjski model, experimentalni autoimuni MG (EAMG), su autoimuni poremećaji zavisni od T-ćelija uzrokovani autoantitelima protiv nikotinskih acetilholinskih receptora (AChR) na neuromuskularnoj spojnici mišića. Uloga CD40-CD40L u EAMG-u prikazana je u CD40L (CD40L-/-) nokautiranim miševima. Shi et al, Eur. J. Immunol.
28: 3587-3593 (1998). CD40L nokautirani miševi bili su u potpunosti otporni na EAMG indukciju i imali su smanjene Th1 i Th2 odgovore kao i ozbiljno oslabljene reakcije AChR reaktivnih B ćelija zavisnih od T-ćelija.
[0085] Takođe je pokazano da blokada signala CD40L-CD40 pomoću antitela protiv CD40L može suzbiti EAMG. Im et al., J. Immunol. 166: 6893-6898 (2001). Antitela koja su davana pacovima u hroničnom stadijumu EAMG suzbijaju kliničku progresiju autoimunog odgovora i dovode do smanjenja AChR-specifičnog humoralnog odgovora i hipersenzitivnosti odloženog tipa. Efekat lečenja anti-CD40L-om tokom hronične faze EAMG je od posebne važnosti za humanu MG, koja je hronična bolest. To sugeriše da se antagonizujući CD40L može koristiti za imunoterapiju MG i drugih autoimunih bolesti posredovanih antitelom.
5. Tromboembolija
[0086] CD40-CD40L interakcije na T i antigen prezentujućim ćelijama su važne za adaptivne imune odgovore, kao što su proliferacija B-ćelija, proizvodnja imunoglobulina (Ig), regulacija kostimulisane aktivnosti (CD80, CD86), proizvodnja citokina, i zamena klasa Ig-a. Receptor i ligand su takođe eksprimirani na trombocitu (bez-cilja ćelijska populacija), gde se CD40 konstitutivno nalazi na trombocitima, dok se CD40L eksprimira na aktiviranim trombocitima i cepa na sCD40L (>90% cirkulirajućih sCD40L se dobija iz trombocita). Feroni et al., Curr. Med. Chem.14: 2170-2180 (2007). Najmanje tri monoklonsko antitela (mAb) protiv CD40L prouzrokovala su TE u kliničkim i/ili nekliničkim ispitivanjima sprovedenim na primatima koji nisu čovek (NHP). hu5c8 (BG9588) izazvao je TE u više kliničkih ispitivanja (lupus i bubrežna transplantacija). Boumpas et al., Arthritis & Rheumatism 48: 719-727 (2003). IDEC131 izazvao je TE kod jednog pacijenta u ispitivanju Kronove bolesti, što je dovelo do prekida ispitivanja u to vreme. Sidiropoulus & Boumpas, Lupus 13: 391-397 (2004). Oba, i hu5c8 i ABI1793 (koji vezuje CD40 na različitom epitopu od 5c8) uzrokovali su TE/trombozu ispitivanjima transplantacije bubrega kod cinomolgus ili rezus majmuna. Schuler et al., Transplantation 77: 717-726 (2004); Kanmaz et al., Transplantation 77: 914-920 (2004); Koyama et al., Transplantation 77: 460-461 (2004). U stavljanju na uvid javnosti koje nije objavljeno, Biogen je registrovao učestalost tromboze od 1/4 i 6/12 kod rezus majmuna kojima je davano 5 i 20 mg/kg nedeljno, redom, tokom 6 meseci, ali ne i kod majmuna cinomolgus sa kojima je davano 50 mg/kg istom učestalošću i trajanjem. Osnova razlika u vrstama nije jasna.
[0087] Jedna od hipoteza je da je TE povezana sa primenom ovih antitela posredovana anti-CD40Lmab-CD40L imunim kompleksom (IC)-posredovanim unakrsnim povezivanjem trombocita, olakšana IC vezivanjem za FcgRIIa, IgG Fc receptor, izazivajući aktivaciju i agregaciju (SL.10). Blokiranje interakcije Fc dela IgG sa FcgRIIa stoga da se ublaži umrežavanje trombocita u mrežu i trombozu. Pristupi i metode razvijeni za procenu rizika za TE/trombozu opisani su u Primerima ispod.
PRIMERI
[0088] TABELA 1 prikazuje reprezentativne sekvence amino kiselina protiv humanog CD40L VH domena korisne za polipeptide antitela stavljene na uvid javnosti. TABLE 2 stavlja na uvid javnosti reprezentativne nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence VH domena navedenih u TABELI 1. TABELA 3 prikazuje reprezentativne sekvence amino kiseline protiv humanog CD40L VK domena korisne za polipeptide antitela ovog pronalaska. TABELA 4 za uzvrat stavlja na uvid javnosti reprezentativne nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence VK domena navedenih u TABELI 3. Kao što je dobro poznato u oblasti, više kodona može kodirati istu amino kiselinu. Nukleinske kiseline koje kodiraju proteinsku sekvencu tako uključuju nukleinske kiseline koje imaju degeneraciju kodona. Polipeptidi antitela stavljeni na uvid javnosti u TABELI 1 i TABELI 3 specifično vezuju CD40L. Napravljeni su korišćenjem ponovljenog početnog/primarnog skrininga i afinitetnih metodologija opisanih u primerima koji slede.
TABELA 1
TABELA 2
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena BMS2h-114 (SEQ ID NO: 489)
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena BMS2h-206 (SEQ ID NO: 550)
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena BMS2h-767 (SEQ ID NO: 922)
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
Humane Anti-CD40L Nukleotidne Kodirajuće Sekvence VH Domena
TABELA 3
TABELA 4
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-100 (SEQ ID NO: 1154)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-116-13 (SEQ ID NO: 1170)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-437-1 (SEQ ID NO: 1238)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-494-3 (SEQ ID NO: 1275)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-546 (SEQ ID NO: 1312)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena BMS2h-612 (SEQ ID NO: 1328)
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Humane Anti-CD40L Kodirajuće Nukleotidne Sekvence VK Domena
Primer 1
Stvaranje Humanih Anti-CD40L Varijabilnih Domena BMS2h-2 do BMS2h-785
[0089] Sledeći primer opisuje stvaranje 2h linije varijabilnih domena anti-humanih CD40L, označenih BMS2h-2 do BMS2h-785. Nakon rekombinantne ekspresije repertoara pojedinih imunoglobulinskih varijabilnih domena na površini faga, izbor se vrši kontaktiranjem repertoara faga sa imobilizovanim ciljnim antigenom, ispiranjem radi uklanjanja nevezanog faga, i propagiranjem vezanog faga. Ovaj postupak se često naziva "pomicanje." Primenljivo je na skrining pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, kao i drugih fragmenata antitela koji se mogu eksprimirati u biblioteci prikaza, npr., scFv, Fab, and Fab'. Alternativno, fag može biti unapred izabran za ekspresiju pravilno uvijenih članova varijanti tako što se pomiče protiv imobilizovanog generičkog liganda (npr., protein A ili protein L) koji je vezan samo sa uvijenim članovima. Ovo ima prednost u smanjenju udela nefunkcionalnih članova, čime se povećava udeo članova koji mogu verovatno vezati ciljni antigen. Pre-selekcija generičkim ligandima uči se, na primer, u WO 99/20749. Pregled biblioteka faga antitela je uopšteno opisana, na primer, kod Harrison et al., Meth. Enzymol.267: 83-109 (1996).
[0090] Pregled se obično izvodi pomoću prečišćenog atigena imobilizovanog na čvrstom nosaču, na primer, plastičnim cevima ili bunarima, ili na hromatografskom matriksu, na primer Sepharose™ (Pharmacia). Skrining ili selekcija mogu se takođe izvesti na kompleksnim antigenima, kao što je površina ćelija (Marks et al., BioTechnology 11: 1145 (1993); de Kruif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3938 (1995)). Druga alternativa uključuje selekciju vezivanjem biotiniliranog antigena u rastvoru, zatim hvatanjem na zrncima obloženim streptavidinom.
dAb Selekcija za Klon Serija BMS2h-719 i BMS2h-7xx:
[0091] Tri ciklusa selekcije koristeći smanjene koncentracije antigena (500 nM u ciklusu 1; 50 nM u ciklusu 2; 50 nM ili 5 nM u ciklusu 3 zavisno od iskorišćene biblioteke) izvedene su paralelno protiv biotiniliranog (1.2 molova biotin/mol CD40L) humanog CD40L monomera trostrukog mutanta (T211E, S222Y, H224K, [108-261] Konstrukt #7) kojeg je obezbedio Bristol-Myers Squibb. Fage iz naïve 4G i 6G Domantis dAb biblioteke su kombinovane u bazama a) do g) naznačenim niže pre početka selekcije:
a) 4G VH CDR3 je dužine između 7 - 10 amino kiselina.
b) 4G VH CDR3 je dužine između 11 - 15 amino kiselina.
c) 4G VH CDR3 je dužine između 7 - 15 amino kiselina.
d) 4G VK
e) 6G VH CDR3 je dužine između 7-9
f) 6G VH CDR3 je dužine između 10-15
g) 6G VK
[0092] Svaki ciklus selekcije uključivao je dodavanje željene koncentracije biotiniliranog CD40L u smešu od 200 µl faga (iz jedne od gore navedenih baza naïve biblioteke, ili naredne selekcije izlaznog faga) i 1000 µl 2% MPBS (Fiziološki rastvor Fosfatnog Pufera) koji sadrži 2% (m/V) Marvel [Premier Foods, UK]) i inkubirano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata mešanjem sa kraja na kraj. Biotiniliran antigen kompleksa faga je zatim zarobljen dodavanjem 100 µl resuspendovanog Dynabeads M-280 Streptavidina [Invitrogen, UK] i inkubiran tokom 5 minuta sa mešanjem sa kraja na kraj na sobnoj temperaturi. Dynabeads su zatim prerađeni magnetnim separatorom KingFisher [Thermo Fisher Scientific, UK] i isprani 7 x 1 ml PBST (PBS sadrži 0.1% (v/v) polioksietilenesorbitan 20 monolaureata [Sigma-Aldrich, UK]) a zatim sa 1 x 1 ml PBS-a. Vezani fagi koji su se zadržavli na ispranim Dynabeads-ima eluirani su inkubacijom sa 500 µl tripsin-PBS-a (50 µl 10 mg/ml tripsina [Sigma-Aldrich, UK] rastvoreno u 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM CaCl2dodato u 450 µl PBS-a). Rastvor koji sadrži fage je prerađen i 250 µl je korišćeno za infekciju 1.75 ml logaritamske faze rasta E. coli TG1 (pri OD600od 0.4) tokom 30 minuta na 37°C. Zaražena kultura faga E. coli TG1 centrifugirana je na 11,600 g u mikro centrifugi tokom 1 minuta a dobijeni pelet ćelija je resuspendovan u 1 ml 2xTY (16 g Triptona, 10g Ekstrakta Kvasca i 5 g NaCl u 1 litru, autoklavirano tokom 15 minuta na 121°C) i nanesen na Petri šolju od 9 cm koja sadrži TYE medijum obogaćen sah 15 µg/ml tetraciklina. Ploče su inkubirane preko noći na 37°C zatim je u svaku ploču dodato 2 ml 2xTY uz dodatak 15% glicerola a ćelije su razmrdane staklenim štapićem i dobro izmešane. Pedeset mikrolitara struganih bakterija je korišćeno za inokulaciju 50 ml 2xTY uz dodatak 15 µg/ml tetraciklina i uzgajano je preko noći na 37°C uz mućkanje na 250 opm. Kultura je centrifugirana preko noći na 3,300 g tokom 15 min da se peletiraju bakterije. Za taloženje faga, dodato je 10 ml PEG/NaCl (20% Polietilen glikola 8000, 2.5 M NaCl) u 40 ml supernatanta. Rastvor fage/PEG je pomešan i ostavljen na ledu tokom 1 h, zatim je centrifugiran na 3,300 o tokom 30 min na 4°C i supernatant je odbačen. Pelet je ponovo suspendovan u u 2 ml PBS-a i centrifugiran na 11,600 o tokom 10 min u mikro centrifugi da bi se uklonio preostali bakterijski otpad. Rezultirajući supernatant koji sadrži fage je zatim korišćen za sledeći ciklus selekcije protiv odgovarajuće koncentracije biotiniliranog CD40L monomera trostruko mutantnog antigena.
ELISA Faga:
[0093] ELISA-e monoklonskih faga su izvedene posle selekcije ciklusa 2 i 3. Sva ispiranja izvedena su korišćenjem 3 ispiranja od 250 µl PBST-a a zatim 3 ispiranja od 250 µl PBS-a. Ploče su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl/bunar sa 1 µg/ml NeutrAvidin [Thermo Scientific, UK] u 0.2M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4. Ploče su isprane i zatim blokirane sa 2% MPBS-a tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane i inkubirane sa 50 µl/bunar of ∼1.0 µg/ml biotiniliranim trostruko mutiranim humanim CD40L monomerom u 2% MPBS-a. Ploče su isprane i dodato je 25 µl/bunar supernatanta faga u jednaku zapreminu 2% MPBS-a i inkubirano je tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i vezani fagi su detektovani sa 50 µl/bunar anti-M13-HRP konjugata [GE Healthcare, UK] razblaženi 1:5000 u 2% MPBS i inkubirani tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i ELISA razvijena korišćenjem 50 µl/bunar rastvora SureBlue 1-Component TMB MikroBunar Peroksidaza [KPL Inc, USA]. Kolorimetrijska reakcija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine 1 M HCl i ELISA ploče su očitane na 450 nm. Specifični fagi su identifikovani poređenjem bunara prekrivenih sa NeutrAvidinom ali bez biotiniliranog trostruko mutiranog CD40L monomera.
Oporavak dAb gena iz MidiPrep pDOM4 Plazmida:
[0094] dAb V-geni iz naredna 3 ciklusa izlaza su obrađeni digestijom DNK restrikcionim enzimom fagnog vektora pDOM4:
a) 4G VH CDR3 je dužine između 7 - 10 amino kiselina (50 nM koncentracija antigena). b) 4G VH CDR3 je dužine između 11 - 15 amino kiselina (50 nM koncentracija antigena). c) 4G VH CDR3 je dužine između 11 - 15 amino kiselina (5 nM koncentracija antigena). d) 4G VH CDR3 je dužine između 7 - 15 amino kiselina (50 nM koncentracija antigena).. e) 4G VK (50 nM koncentracija antigena).
f) 4G VK (5 nM koncentracija antigena).
g) 6G VH CDR3 je dužine između 7-9 (50 nM koncentracija antigena).
h) 6G VH CDR3 je dužine između 10-15 (5 nM koncentracija antigena).
[0095] Približno 20 µg MidiPrep [Qiagen, UK] DNK je digestirano sa SalI i NotI na sledeći način: 20 µl DNK (∼1 µg/µl) je pomešano sa 1.5 µl SalI (20 U/µl) [NEB, UK] i 3 µl NotI (10 U/µl) [NEB, UK], 4 µl Pufera 3 [NEB, UK], 0.4 µl BSA (10 mg/ml) [NEB, UK] i kultura tkiva nivoa vode [Sigma, UK] su dodati u 40 µl. Uzorci su inkubirani tokom 5 sati na 37°C u vazdušnom inkubatoru nakon čega su digestirani geni dAb izolovani prevođenjem digestivne smeše preko 2% agaroznog gela [E-gel, Invitrogen, UK], odgovarajuće DNK trake su izrezane i očišćene korišćenjem PCR kompleta za prečišćavanje [Qiagen, UK]. Prečišćeni V-geni su bili vezani u SalI i NotI dvostruko digestirani pDOM5 ekspresioni vektor.
ELISA Rastvorljivog dAb-a:
[0096] Vezana dAb-a su identifikovana na sledeći način. Devedeset i šest pojedinačnih kolonija koje sadrže dAb V-gene klonirane u rastvorljivi dAb vektor ekspresije pDOM5, odabrane su sa svakog izlaza u 200 µl Terrific Bujonu koji sadrži OnEx Autoindukcioni medijum [Novagen, UK] i inkubirane preko noći na 37° C uz mućkanje pri 250 opm u Klasteru sa bunarima za kulturu ćelija Costar 96 [Corning Incorporated, USA] zapečaćeni su sa gas propustljivom lepljivom plastičnom trakom. Kulture su centrifugirane da bi se peletirale ćelije i supernatanti ispitali antigen vezujućim ELISA za dAb-a koji se vežu za CD40L monomer trostruko mutiran i IZ-CD40L mutant (CD40L sadrži trodimenzionalni domen izoleucinskog rajsfešlusa, isporučeno od Bristol-Myers Squibb). MaxiSorp imunoploče sa 96 bunara [Nunc, USA] su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl/bunar 1 µg/ml NeutrAvidin u 0.2 M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4. Sva ispiranja bila su kao što je opisano u ELISA faga. Ploče su blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 200 µl PBS-a koji sadrži 1% Tween 20. Ploča je zatim isprana i inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 50 µl/bunar 1 µg/ml biotiniliranog humanog CD40L monomera trostruko mutiranog u PBST ili 1 µg/ml biotiniliranog humanog IZ-CD40L mutanta u PBST (oba antigena obezbeđena su od Bristol-Myers Squibb). ELISA ploča je isprana i supernatant kulture koja sadrži dAb pročišćen centrifugiranjem na 1,800 o tokom 10 min na 4°C, zatim je dodat u ELISA ploču (30 µl/bunar) kojoj je dodata ista zapremina PBST-a. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i zatim isprane. Vezano dAb je otkriveno dodavanjem 50 µl/bunar 9E10 [anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, UK] razblaženo 1:2000 u PBST-u i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi; ELISA ploča je zatim isprana i 50 µl/bunar anti-mišjeg Fc-HRP [Sigma-Aldrich, UK] razblaženo 1:2000 u PBST-u dodato i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i ELISA je razvijena dodavanjem 50 µl/bunar rastvora SureBlue 1-Component TMB MikroBunar Peroksidaze [KPL Inc, USA] i dozvoljeno je razvijanje boje. Kolorimetrijska reakcija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine 1 M HCl i ELISA ploča je očitana na 450 nm. dAba koja vezuju antigen identifikovana su upoređivanjem intenziteta signala iz bunara sa humanim CD40L monomerom trostruko mutiranim i humanim IZ-CD40L mutantom sa kontrolnim bunarima koji ne sadrže antigen.
Ekspresija & Prečišćavanje dAb na Skali od 50 ml:
[0097] Jedinstvena dAb-a su identifikovana DNK sekvenciranjem ELISA pozitivnih klonova. Identifikovana jedinstvena dAb-a eksprimirana su na sledeći način u erlenmajerima od 250 ml, u koje je dodato:
a) 50 ml Terrific Bujona [Sigma-Aldrich, UK].
b) 100 µg/ml karbenicilina [Sigma-Aldrich, UK].
c) 1 kap antipene A204 [Sigma-Aldrich, UK].
d) Novagen Overnight Express Autoinduction komplet [Novagen, UK].
[0098] Strugana bakterija sa sveže sakupljene agarne ploče prečnika 9 cm ili iz glicerolske zalihe željenog klona dAb je korišćena za inokulaciju Terrific Bijona, zatim je balon zapečaćen sa Milliwrap PTFE membranom [Millipore, UK], i inkubirano je tokom 48 sati, 250 opm mućkajući na 30°C. Bakterijska kultura koja je stajala preko noći pročišćena je centrifugiranjem i VH ili VK dAb su prečišćeni korišćenjem Streamline Proteina A [GE Healthcare, UK] ili Protein L agaroze [generisan u-kući] redom. Dobijeni prečišćeni proteini su testirani sa RBA da bi se utvrdilo koji klonovi mogu inhibirati vezivanje CD40L za CD40.
Test Vezivanja CD40L za Perla Receptor :
[0099] Inhibitorna dAb-a su prvobitno identifikovana skriningom prečišćenog dAb u testu vezivanja CD40L za perla receptor (RBA). Kuglice od sfernog streptavidin polistirena (0.5% m/V, 6.7µm prečnika) [Saxon, Europe] su pripremljene i isprane u skladu sa uputstvima proizvođača. Kuglice su zatim peletirane na 11,600 g tokom 1 minuta, supernatant je odbačen i kuglice su resuspendovane u 1 ml PBS-a vorteksovanjem. Korak ispiranja je ponovljen još dva puta, supernatant je odbačen i kuglice su resuspendovane u 1 ml (0.5 mg/ml) biotiniliranog humanog IZ-CD40L u PBS-u i inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi sa rotacijom sa kraja na kraj. Nakon inkubacije, kuglice su peletirane i isprane tri puta sa 1 ml PBS-a kao ranije a zatim su resuspendovane u 0.5 ml PBS-akoji sadrži 0.1% goveđeg serum albumina (bovine serum albumin (BSA)). Kuglice obložene antigenom su zatim razblažene 1:10 u PBS-o koji sadrži 0.1% BSA pre upotrebe. Reagensi za RBA test su dodati kao što sledi da bi se duplirali u bunarima na FMAT ploči sa 384-bunara sa crnim stranama i providnim dnom [Applied Biosystems, UK]:
a) 12.5 µl dAb proteina ili kontrole pufera. Početna koncentracija za titraciju dAb je obično 10 µM (krajnja koncentracija) koja je razblažena 1:3.3 (tj., 30 µl uzorka je dodat u 70 µl PBS-koji sadrži 0.1% BSA) da bi se dobila efektivna kriva titracije sa 8 tačaka.
b) 12.5 µl CD40-Fc [snabdeveno od Bristol-Myers Squibb, USA; lot CY24Feb06-1] sa 0.2 µg/ml (za krajnju koncentraciju od 0.05 µg/ml) razblaženo u PBS-u koji sadrži 0.1% BSA. c) 12.5 µl smeše mišjeg anti-humanog Fc [Sigma-Aldrich, UK] sa 2 µg/ml (za krajnju koncentraciju od 0.5 µg/ml) i kozjeg anti-mišjeg Alexa Fluor 647 [Invitrogen, UK] sa 1 µg/ml (za krajnju koncentraciju od 0.25 µg/ml) razblaženo u PBS-u koji sadrži 0.1% BSA.
d) 12.5 µl IZ-CD40L obloženih kuglica opisanih gore su dodate u sredinu bunara tako da se nisu rasule do ivice bunara.
[0100] Ploča sa 384 bunara, nakon dodavanja reagenasa, inkubirana je na sobnoj temperaturi tokom 6 sati u mraku a zatim je očitana u AB8200 FMAT sistemu [Applied Biosystems, UK].
Primer 2
Selekcija dAb za Klon BMS2h-572
[0101] Tri ciklusa selekcije koristeći smanjene koncentracije antigena (300 nM u ciklusu 1; 30 nM u ciklusu 2; 3 nM u ciklusu 3) izvedena su paralelno protiv biotiniliranog (1.42 mola biotin/mola trimera) humanog izoleucin rajsfešlus-CD40L (IZ-hCD40L) obezbeđenog od Bristol-Myers Squibb. Fage iz naïve 4G i 6G Domantis dAb biblioteke su kombinovane u bazama a) do h) naznačenim dole pre pokretanja selekcija:
a) 4G VH CDR3 je dužine između 7 - 9 aminokiselina.
b) 4G VH CDR3 je dužine između 10 - 12 aminokiselina.
c) 4G VH CDR3 je dužine između 13 - 15 aminokiselina.
d) 4G VK
e) 6G VH CDR3 je dužine između 7-9
f) 6G VH CDR3 je dužine između 10-12
g) 6G VH CDR3 je dužine između 13-15
h) 6G VK
[0102] Svaki ciklus selekcije uključivao je dodavanje željene koncentracije biotiniliranog CD40L smeši faga (iz jedne od gore navedenih baza naïve biblioteke, ili naknadne selekcije izlaza faga) u 1000 µl 2% MPBS (Fosforni Puferovani Fiziološki rastvor koji sadrži 2% (m/V) Marvel [Premier Foods, UK]) i inkubiranje na sobnoj temperaturi tokom 1 sata mešanjem sa kraja na kraj. Biotinilirani antigeni kompleks faga je zatim zarobljen dodavanjem 100 µl resuspendovanih Dynabeads-a M-280 Streptavidina [Invitrogen, UK] (ciklusi 1 i 3) ili 50 µl M-280 tosilaktiviranih Dynabeads-a (Invitrogen) koji su bili spojeni sa NeutrAvidin [Thermo Fisher Scientific, UK] (ciklus 2) i inkubira se tokom 5 minuta uz mešanje sa kraja na kraj na sobnoj temperaturi. Dynabeads-i su zatim oporavljeni korišćenjem KingFisher magnetnog separatora [Thermo Fisher Scientific, UK] i isprano je 7 x 1 ml PBST (PBS koji sadrži 0.1% (v/v) polioksietilensorbitan 20 monolaurata [Sigma-Aldrich, UK]) a zatim 1 x 1 ml PBS. Vezane fage koje su preostale na ispranim Dynabeads-ima su eluirane inkubacijom sa 500 µl tripsin-PBS (50 µl od 10 mg/ml tripsina [Sigma-Aldrich, UK] rastvorenog u 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM CaCl2dodato u 450 µl PBS). Rastvor koji sadrži fage je oporavljen i 250 µl korišćeno je za infekciju 1.75 ml logaritamske faze rasta E. coli TG1 (pri OD600do 0.4) tokom 30 minuta na 37°C. E. coli TG1 fagama zaražena kultura je centrifugirana na 11,600 g u mikro centrifugi tokom 1 minuta i dobijeni ćelijski pelet je resuspendeovan u 1 ml 2xTY (16 g Triptona, 10g Ekstrakta Kvasca i 5 g NaCl u 1 litru, autoklavirano tokom 15 minuta na 121°C) i naneto je na Petri šolju od 9 cm koja sadrži TYE medijum obogaćen sa 15 µg/ml tetraciklina. Ploče su inkubirane preko noći na 37°C zatim je 2 ml od 2xTY obogaćenog sa 15% glicerola dodato na svaku ploču i ćelije su razuđene staklenim štapićem i dobro izmešane. Pedeset mikrolitara ostruganih bakterija korišćeno je za inokulaciju 50 ml 2xTY obogaćenog sa 15 µg/ml tetraciklina i uzgajano je preko noći na 37°C uz mućkanje pri 250 opm. Kultura koja je stajala preko noći je centrifugirana na 3,300 g tokom 15 min da se peletiraju bakterije. Za taloženje faga, dodato je 10 ml PEG/NaCl (20% Polietilen glikol 8000, 2.5 M NaCl) u 40 ml supernatanta. Rastvor fage/PEG je pomešan i ostavljen na ledu tokom 1 h, zatim je centrifugiran na 3,300 g tokom 30 min na 4°C i supernatant je odbačen. Pelet je resuspendovan u 2 ml PBS-a i centrifugiran na 11,600 g tokom 10 min u mikro centrifugi da bi se uklonili preostali bakterijski ostaci. Rezultirajući supernatant koji sadrži fage je zatim korišćen za sledeći ciklus selekcije protiv odgovarajuće koncentracije biotiniliranog IZ-hCD40L.
ELISA Faga :
[0103] ELIZA-e monoklonskih faga su izvedene narednom selekcijom ciklusa 2 i 3. Sva ispiranja izvedena su korišćenjem 3 ispiranja od 250 µl PBST-a praćeno sa 3 ispiranja od 250 µl PBS-a. Ploče su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl/bunar 1 µg/ml IZ-hCD40L u PBS-u. Ploče su isprane i zatim blokirane sa 2% MPBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i 25 µl/bunar supernatanata faga je dodato u istoj zapremini od 2% MPBS-a i inkubirane su tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i vezane fage detektovane sa 50 µl/bunar anti-M13-HRP konjugata [GE Healthcare, UK] razblažene 1:5000 u 2% MPBS i inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i ELISA razvijena korišćenjem 50 µl/bunar rastvora SureBlue 1-Component TMB MikroBunar Peroksidaze [KPL Inc, USA]. Kolorimetrijska reakcija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine 1 M HCl i ploča ELISA očitana na 450 nm. Specifične fage su identifikovane poređenjem bunara koji nisu obloženi antigenom, ali su na isti način tretirani.
Oporavak dAb gena iz pDOM4 plazmida:
[0104] dAb V-geni iz izlaza ciklusa 2 i 3 su oporavljeni SalI i NotI restrikcionom enzimskom digestijom vektora faga pDOM4 i vezani u SalI i NotI dvostruko digestirani pDOM5 vektor ekspresije.
Rastvorljivi dAb ELISA:
[0105] Vezana dAb-a su identifikovana na sledeći način. Devedeset šest pojedinačnih kolonija koje sadrže dAb V-gene su klonirane u ekspresioni vektor pDOM5 rastvorljivog dAb odabranog sa svakog izlaza u 200 µl Terrific Bujon-a koji sadrži OnEx Autoindukcioni medijum [Novagen, UK] i inkubirane preko noći na 37° C uz mućkanje pri 250 opm u Klasteru Kultura Ćelija sa 96 bunara Costar [Corning Incorporated, USA] zapečaćeno sa gas propustljivom lepljivom plastičnom trakom. Kulture su centrifugirane da se dobije pelet ćelija i supernatanti su testirani antigen vezujućom ELISA za dAb-a koja su vezana za IZ-hCD40L. Imunoploče sa 96 bunara MaxiSorp [Nunc, USA] su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl/bunar 1 µg/ml IZ-hCD40L u PBS-u. Sva ispiranja su bila kao što je opisano za ELISA faga. Ploče su blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 200 µl PBS-a koji sadrži 1% Tween 20. ELISA ploča je isprana i supernatant kulture koja sadrži dAb je pročišćen centrifugiranjem na 1,800 g tokom 10 min na 4°C, a zatim je dodat u ELISA ploču (30 µl/bunar) kojoj je dodata jednaka zapremina PBST-a. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i zatim su isprane. Vezano dAb je detektovano dodavanjem 50 µl/bunar 9E10 [anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, UK] razblaženo 1:2000 u PBST-u i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi; ELISA ploča je zatim isprana i 50 µl/bunar anti-mišjeg Fc-HRP [Sigma-Aldrich, UK] razblaženo 1:2000 u PBST-u dodato i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i ELISA razvijena dodavanjem 50 µl/bunar rastvora SureBlue 1-Component TMB MikroBunar Peroksidaze [KPL Inc, USA] i dozvoljeno je razvijanje boje. Kolorimetrijska reakcija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine 1 M HCl i ELISA ploča je očitana na 450 nm. dAb-a koja vezuju antigen identifikovana su poređenjem intenziteta signala iz IZ-hCD40L bunara sa kontrolnim bunarima koji ne sadrže antigen.
Primer 3
Identifikacija Klonova BMS2h-503-1, BMS2h-719-2, i BMS2h-572-6
[0106] BMS2h-503, BMS2h-719 i BMS2h-572 dAb-a podvrgnuta su sazrevanju afiniteta sklonog greškama da bi se generisali rodovi BMS2h-503, BMS2h-719 i BMS2h-572, redom. Ovo je izvedeno korišćenjem slučajne mutageneze gde je u proseku 3.6 amino kiselinskih promena uvedeno po dAb-u. Biblioteke faga (prosečne veličine 6x10<8>) su izabrane koriščenjem biotiniliranog monomernog i trimernog humanog CD40L sa naizmeničnim hvatanjem zrnca streptavidin/neutravidin antigenom (kao što je opisano). Izvršena su tri ciklusa selekcije korišćenjem smanjenih koncentracija antigena (100 nM u ciklusu 1; 10 nM u ciklusu 2; 1 nM u ciklusu 3). Sekvenciranje je korišćeno za praćenje različitosti nakon svakog ciklusa selekcije. Izabrani izlazi (ciklus 2 izabran na CD40L trimeru za BMS2h-572; ciklus 3 izabran na CD40L trimeru za BMS2h-503 i ciklus 3 izabran na CD40L monomeru za BMS2h-719) su subklonirani u rastvorljivi ekspresioni vektor pDOM13 (bez oznake C kraja) (kao što je opisano) i prikazani kao monoklonski supernatanti bakterijske mikro-kulture od strane BIAcore za poboljšanje stopa otpuštanja (off-rates) u poređenju sa roditeljskim klonovima na oba i monomernom i trimernom CD40L. Identifikovane poboljšane varijante su sekvencionirane DNK i jedinstvena dAb-a eksprimirana, prečišćeno i zatim testirano korišćenjem BMS2h perlia RBA kao i ćelijski CD40L vođenih testova (kao što je opisano). Kao rezultat, identifikovana su BMS2h-503-1 (sekvenca navedena u TABELI 3), BMS2h-719-2 i BMS2h-572-6 dAb-a (sekvence navedene u TABELI 1). Aktivnosti ovih dAb-a su navedene u TABELI 5 ispod.
Formatiranje BMS2h-503-1, BMS2h-719-2 i BMS2h-572-6 kao Fc fuzije
[0107] BMS2h-572-6, BMS2h-503-1 i BMS2h-719-2 dAb-a su klonirana u pDOM38 vektor koji sadrži Fc rep izveden iz humanog IgG1 da bi se stvorili redom DMS0502, DMS0500 i DMS0501. BMS2h-572-6, BMS2h-503-1 i BMS2h-719-2 dAb-a su takođe klonirana u pDOM38 vektor koji sadrži Fc rep izveden iz humanog IgG4 da bi se stvorili redom DMS0505, DMS0506 i DMS0504. Konstrukti su prolazno eksprimirani u HEK293 ćelijama a proteini su prečišćeni korišćenjem Proteina A. Prečišćene Fc fuzije su analizirane Biacore-om za vezivanje monomernog i trimernog CD40L kao i različitim ćelijskim testovima (kao što je opisano).
Identifikacija klonova BMS2h-572-608, BMS2h-572-614 i BMS2h-572-619
[0108] BMS2h-572-6 dAb je podvrgnuto afinitetnom sazrevanju korišćenjem dopingovanog oligo pristupa. Za ovo dAb izgrađene su četiri doping biblioteke:
Biblioteka 1 - 5 ostataka u raznolikom CDR1
Biblioteka 2 - 6 ostataka u raznolikom CDR2
Biblioteka 3 - 13 ostataka u raznolikom CDR2
Biblioteka 4 - 7 ostataka u raznolikom CDR3
[0109] U svakoj biblioteci, izvršena je diverzifikacija korišćenjem nnS kodona gde n zadržava veliku frakciju matične baze (85%) a ostatak je podeljen između ekvimolarnih količina preostale tri baze (5% svaka) i S označava G ili C. Biblioteke faga (prosečne veličine 8x10<8>) su odabrane korišćenjem biotiniliranog monomernog i trimernog humanog CD40L sa neizmeničnim hvatanjem perli streptavidin/neutravidin antigenom (kao što je opisano). Biblioteke 2 i 3 su izvučene zajedno tokom procesa selekcije. Izvršena su tri ciklusa selekcija korišćenjem smanjene koncentracije antigena (50 nM u ciklusu 1; 5 nM u ciklusu 2; 1 nM u ciklusu 3 sa 200 puta više konkurenta -nebiotiniliranog CD40L trimera). Sekvenciranje je korišćeno za praćenje različitosti nakon svakog ciklusa selekcije. Selekcije izlaza (ciklusi 2 i 3) su subklonirane u rastvorljivi vektor ekspresije pDOM13 (bez oznake C kraja) (kao što je opisano) i prikazane kao monoklonski supernatanti bakterijske mikro-kulture pomoću BIAcore za poboljšanje stopa otpuštanja (off-rates) u poređenju sa roditeljskim klonovima na oba i monomernom i trimernom CD40L. Identifikovane poboljšane varijante su DNK sekvencirane i jedinstvena dAb-a eksprimirana, prečišćena i zatim testirana koristeći BMS2h zrnca RBA kao i ćelijski CD40L pokrenute testove (kao što je opisano). Kao rezultat, BMS2h-572-608, BMS2h-572-614 i BMS2h-572-619 dAb-a su identifikovana.
Izgradnja klona BMS2h-572-633
[0110] Analiza sekvence otkrila je da su sve razlike u aminokislinama između BMS2h-572-608 i roditeljskog dAb BMS2h-572-6 smeštene u CDR1 a razlike između BMS2h-572-614 i roditeljskog dAb BMS2h-572-6 su smeštene u CDR3. Oba zrela dAb-a su delila CDR2 sa roditeljskim dAb BMS2h-572-6. Ovo je stvorilo priliku za konstrukciju kombinovanog mutanta koji je imao CDR1 od BMS2h-572-608 i CDR3 od BMS2h-572-614. Prvo, CDR1 region od BMS2h-572-608 bio je PCR pojačan. Drugo, CDR2+CDR3 fragment od BMS2h-572-614 bio je PCR pojačan. Zatim je usledilo SOE PCR sklapanje dva fragmenta kako bi se stvorio kombinovani mutant BMS2h-572-633. Sastavljeni dAb PCR proizvod kloniran je u u rastvorljivi ekspresioni vektor pDOM13 (bez oznake C kraja), sekvenca je verifikovana, eksprimirana, prečišćena a zatim testirana korišćenjem BMS2h peril RBA kao i ćelijskim CD40L pokrenutim testovima (kao što je opisano).
Formatiranje BMS2h-572-633 kao Fc fuzije
[0111] BMS2h-572-633 dAb je klonirano u pDOM38 vektor koji sadrži Fc rep izveden iz humanog IgG1 da bi se stvorio DMS0507. Konstrukt je bio prolazno eksprimiran u HEK293 ćelijama a protein je prečišćen korišćenjem Proteina A. Prečišćena Fc fuzija je testirana Biacoreom za vezivanje monomernog i trimernog CD40L kao i različitim ćelijskim testovima (kao što je opisano).
Primer 4
Ćelijski Testovi Aktivnosti CD40L
[0112] Anti-humana CD40L dAb-a su funkcionalno testirana zbog njihove sposobnosti da se suprotstave aktivnostima CD40L. CD40L aktivnosti koje su testirane bile su proliferacija B ćelija i proizvodnja citokina pomoću hCD40L vođene aktivacije primarnih monocita izvedenih iz dendritskih ćelija (DCs). Ako nije drugačije navedeno, svi testovi su izvršeni u RPMI medijumu obogaćenom sa 10% fetalnim serumom teleta (FCS). Rezultati različitih testova, detaljno su opisani u nastavku ispod, i prikazani su u TABELI 5 i TABELI 6.
Proliferacija prrimarne humane B ćelije vođena rastvorljivim IZ-hCD40L-om:
[0113] 1x10<5>humanih B ćelija krajnika su inkubirane sa 0.6 µg/ml IZ-hCD40L zajedno sa promenljivom titracijom od dAb ili mAb u konačnoj zapremini od 200µl/bunar u ploči sa okruglim dnom sa 96-bunara. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata nakon čega je dodavan timidin (<3>H; 0.5µci/bunar) tokom 6 sati. Proliferacija B ćelija kvantifikovana je na osnovu ugradnje timidina. Svi testovi, osim ako nije drugačije navedeno, izvedeni su u RPMI medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog seruma teleta (FCS).
Proliferacija primarne humane B ćelije vođena CHO-hCD40L-om:
[0114] CHO ćelije su transficirane humanim CD40L da bi se stvorila stabilna ćelijska linija koja eksprimira visoke nivoe CD40L na ćelijskoj površini. CHO-CD40L ćelije su ozračene na 10,000 Rada pre inkubacije sa humanim B ćelijama.1x10<5>tonzilarnih humanih B ćelija je inkubirano sa 1x10<3>CHO-CD40L ćelijama (1:100 odnos CHO-CD40L: humane B ćelije) zajendno sa promenljivom titracijom od dAb ili mAb u konačnoj zapremini od 200µl/bunar u ploči sa okruglim dnom sa 96-bunara. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata nakon čega je dodavan timidin (<3>H; 0.5µci/bunar) tokom 6 sati. Proliferacija B ćelija kvantifikovana je na osnovu ugradnje timidina. Svi testovi, osim ako nije drugačije navedeno, izvedeni su u RPMI medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog seruma teleta (FCS).
Primarna proliferacija B ćelija vođena T ćelijama:
[0115] T ćelije su izolovane iz mononuklearnih ćelija humane periferne krvi (PBMCs) i obogaćene su korišćenjem afiniteta ovčijih crvenih krvnih ćelija (SRBC). Obogaćene humane T ćelije su uzgajane sa PM-LCLs (EBV-transformisana B ćelijska linija; ozračena na 10,000 Rada) u odnosu 5:1 (T:LCL) tokom 6 dana na 37°C da bi se dobila populacija alogenskih T ćelija. 6. dana, proširene T ćelije su izolovane i ozračene na 3000 Rada, a zatim uzgajane (5x10<4>T ćelija/bunar) sa primarnim humanim B ćelijama krajnika (1x10<5>B ćelija/bunar) u odnosu 1:2 i stavljene u ploču sa ravnim dnom obloženu sa anti-CD3 mAb (OKT3) sa 96 bunara. Promenljive titracije od dAbs/mAb-a su dodate u svaki bunar; krajnja zapremina u svakom bunaru je bila 200 µl. Ploče za testiranje su inkubirane na 37°C tokom 3 dana. Proliferacija humanih B ćelija određena je dodatkom timidina (<3>H; 0.5µci/bunar) kulturama u poslednjih 18 sati. Svi testovi, osim ako nije drugačije navedeno, izvedeni su u RPMI medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog seruma teleta (FCS). U nekim slučajevima, supernatant je sakupljen i mereno je prisustvo IL-6.
CHO-hCD40L-vođena aktivacija dendritskih ćelija (DCs) izvedenih iz primarnih humanih monocita:
[0116] Humani PBMC su obogaćeni za monocite potrošnjom T ćelija preko SRBC resetovanja. Monocitima obogaćeni PBMCs su uzgajani sa 10 ng/ml GM-CSF i 5 ng/ml IL-4 u pločama sa 6-bunara tokom šest dana na 37°C. Kultivirane ploče su napunjene sa svežim medijumom (sa GM-CSF i IL-4) 2. i 5. dana. Nezrele DC-e su korišćene u ćelijskim testovima 6. dana.8x10<4>nezrelih DCs su uzgajane sa 4x10<3>CHO-hCD40L ćelija (ozračenih nat 10,000 Rada) zajedno sa promenljivim titracijama od dAbs/mAbs u ploči sa ravnim dnom sa 96-bunara. Nakon 24 sata, supernatanti su sakupljeni i testirani na prisustvo različitih citokina (IL-12, TNF, IL-23). DC aktivacija je određena nivoima proizvodnje citokina. Svi testovi, osim ako nije drugačije navedeno, izvedeni su u RPMI medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog seruma teleta (FCS).
TABELA 5
Potentnost Monomernih Molekula dAb u Testovima Različitih Primarnih Ćelija
TABELA 6
Primer 5
Kinetike Vezivanja i CD40L Afinitet Različitih Antitela
[0117] BMS-986004 je dimerni fuzioni protein, sastavljen od modifikovanog Fc fragmenta IgG1 povezan sa C-krajem dAb BMS2h-572-633. Rezonancija površinskog plazmona (SPR) je korišćena da definiše kinetike i afinitet BMS-986004 ili monovalentne komponente domena antitela BMS2h-572-633 koja se vezuje za CD40L. Vrednosti BMS-986004 su upoređene sa vrednostima za referentna antitela 5c8-IgGl i 5c8-CT i fragment monovalentne komponente 5c8 FAB. SPR eksperimenti koristili su hCD40L konstrukt koji sadrži motiv N-terminalnog izoleucina sa patentnim zatvaračem (IZ-hCD40L) koji olakšava specifično sklapanje molekula CD40L u prirodni trimerni oblik. Biotinilirana verzija IZ-hCD40L (biot-IZ-hCD40L) sa ekvivalentnom aktivnošću vezivanja takođe je korišćena za neke SPR eksperimente.
[0118] Domen monovalentog BMS2h-572-633 antitela vezuje biot-IZ-hCD40L sa Kd od 7.8 nM, u poređenju sa afinitetom od 5.4 nM za monovalenti 5c8 FAB fragment, TABELA 7. Pošto je BMS-986004 bivalentno, a meta IZ-hCD40L je trovalentna, na SPR vezujuće podatke utiče aviditet bez obzira da li se CD40L cilj nalazi na površini čipa ili u rastvoru. Da bi se procenio afinitet vezivanja pod uticajem aviditeta, SPR podaci za vezivanje BMS-986004 na površini biot-IZ-hCD40L postavljeni su na 1:1 Langmuir model, sugerišući konstantu disocijacije manju od 1 nM, TABELA 7. Slični rezultati dobijeni su za 5c8-IgG1 i 5c8-CT.
TABELA 7
Vrednosti kinetike i afiniteta IZ-hCD40L kako je određeno korišćenjem
[0119] SL.5 pokazuje podatke SPR senzograma vezivanja 12.5-0.39nM BMS-986004 (2:1 serije razblaženja) na biot-IZ-hCD40L zarobljen na streptavidin SPR senzorskom čipu na 25°C. Obojene linije prikazuju podatke sa dvostruko-referentnim senzograma, a crne linije pokazuju 1:1 Langmuir postavljene podatke, sa očiglednom vrednošću Kd od 0.11 nM pod uticajem aviditeta.
[0120] Afinitet i termodinamike vezivanja BMS-986004 na CD40L takođe su okarakterisani u rastvoru korišćenjem izotermalne titracione kalorimetrije (ITC) pri temperaturama u rasponu od 15-37°C. Ovi podaci su sugerisali da prisustvo više termodinamički različitih načina vezivanja (SL. 6) sa Kd vrednostima za različite moduse koji prelaze granicu detekcije visokog afiniteta (Kd <2 nM) (TABELA 8), u skladu sa SPR podacima. Afinitet monovalentnog 5c8 FAB fragmenta za IZ-hCD40L kako je određeno ITC-om (3.5 nM) takođe je bio u skladu sa vrednošću koja je određena SPR-om.
TABELA 8
Primer 6
Afinitet Fc receptora za Različita Antitela
[0121] Fc-domen BMS-986004 (nazvan "CT") je konstruisan od divljeg tipa IgG1 Fc da zadrži sposobnost vezivanja za FcRn, ali da poremeti vezivanje za Fcγ receptore. Da bi potvrdili da konstruisan molekul ima željeni profil vezivanja Fc receptora, afiniteti vezivanja BMS-986004 za humani FcRn, i humane Fcγ receptore CD64 (FcγRI), CD32a (FcγRIIa), CD32b/c (FcγRIIb/c), CD16a (FcγRIIIa), CD16b (FcγRIIIb) mereni su korišćenjem SPR, u poređenju sa 5c8-IgG1 i 5c8-CT. Za ove eksperimente, BMS-986004 je zarobljen preko domena antitela na domenima na površini senzora biot-IZ-hCD40L, a rastvorljivi proteini Fc receptora su testirani na vezivanje za izloženi Fc domen. Isto tako, 5c8-IgG1 i 5c8-CT su zarobljeni na površini biot-IZ-hCD40L preko FAB domena, vezivanjem rastvorljivog FcR.
[0122] BMS-986004 vezuje FcRn sa Kd od 670 nM na pH 6.0 što je relevantan pH za vezivanje unutar endozoma, TABELA 9. Međutim, vezivanje je bilo značajno smanjeno (Kd >5000 nM) na neutralnom pH sugerišući efikasno oslobađanje od FcRn pod tim uslovima. BMS-986004 vezuje CD64 sa Kd od 0.6 nM, i imao je statistički slab afinitet za CD32a, CD32b/c, CD16a i CD16b (Kd >3000 nM). Oba i 5c8-IgG1 i 5c8-CT su imali sličan afinitet FcRn kao BMS-986004. 5c8-CT, koji ima identičan "CT" Fc region kao BMS-986004, takođe je imao slična svojstva FcγR vezivanja kao BMS-986004, dok je 5c8-IgG1, koji ima divlji tip IgG1 Fc domena, snažnije vezan za FcγRs, TABELA 9.
TABELA 9
Primer 7
In-vitro Testovi zasnovani na Ćeliji
[0123] Potentnost BMS-986004 je procenjena u testovima različitih primarnih imunih ćelija da bi se obezbedila snažna potentnost u različitim tipovima ćelija. Testovi proliferacije primarne humane B ćelije sprovedeni su na dva načina, kao što je detaljno opisano gore u Primeru 4: (1) rekombinantni CD40L trimer korišćen je za pokretanje B ćelijske proliferacije; i (2) CHO ćelije koje eksprimiraju CD40L na membrani (CHO-CD40L) korišćene su da iniciraju B ćelijsku proliferaciju. Korisnost CHO-CD40L ćelija bila je posebno važna da osigura da se signali sa CD40L vezanog za membranu inhibiraju podjednako dobro u poređenju sa rastvorljivim CD40L trimerom. CHO-CD40L ćelije bile su takođe korišćene za pokretanje aktivacije primarnih humanih DCs diferenciranih iz kulture monocita, PBMC-izvedenih, u prisustvu GM-CSF i IL-4. Slično tome, T-B MLR testom je merena aktivacija B ćelija CD40L-om prisutnom na aktiviranim T ćelijama. U svim gore opisanim primarnim testovima, BMS-986004 je bio moćan za referentni nivo 5c8 mAb: potentnosti su bile u rasponu od jednocifrenog nM do sub-nM, zavisno od testa (TABELA10).
Primer 8
Procena Zauzetosti Receptora Pune Krvi (RO)
[0124] Metoda zauzetosti receptora razvijena je za merenje angažovanosti BMS-986003 u uzorcima pune krvi cinomoglusa za ciljne CD40L i, naknadno, u BMS-986004 uzorcima humane pune krvi. BMS-986003 je dAb koje deli istu sekvencu aminokiselina kao BMS-986004, izuzev neurođenog ostatka glicina na njegovom amino kraju.
[0125] Zauzetost se meri na CD4+ T ćelijama protočnom citometrijom, korišćenjem mAb anti-CD40L koji se nadmeće za vezivanje za CD40L sa BMS-986003 / BMS-986004, a unakrsno je reaktivno sa humanim i cinomoglusovim CD40L. U prisustvu vezanog dAb, mAb detektovan anti-CD40L je blokiran na vezivanje za CD40L načinom zavisnim od koncentracije čime obezbeđuje meru zauzetosti cilja. S obzirom da je osnovni CD40L eksprimiran na niskim nivoima u T ćelijama u mirovanju u perifernoj krvi, RO je procenjen i u nestimuliranim uzorcima krvi i u uzorcima gde je fitohemaglutinin (PHA) korišćen da indukuje regulaciju naviše CD40L na površini T ćelije. Krive potentnosti vezivanja nastale su posle ex vivo tretmana pune krvi sa BMS-986003 i BMS-986004. Dobijene prosečne vrednosti EC50i EC90prikazane su u TABELI 11.
TABELA 11
)
[0126] Ciljna potentnost vezivanja u punoj krvi za BMS-986003 i BMS-986004 usko je povezana između čoveka i cinomolgus majmuna. Vrednosti EC50za BMS-986003 i BMS-986004 su takođe slične kada su povezane sa osnovnim i PHA-indukovanim CD40L. Pored toga, ove vrednosti su uporedive sa vrednostima dobijenim u testovima zasnovanim na humanim in vitro ćelijama (videti TABELU 10). Na osnovu izmerenih vrednosti EC90, trebalo bi da se postigne puna zasićenost cilja u perifernoj krvi u koncentracijama ≤ 10nM.
[0127] Da bi se podržao pretklinički PK/PD profil BMS-986003 i BMS-986004, RO je procenjen u obe i u cinomolgus KLH studiji (imunizacija sa hemocijaninom iz keyhole limpet – morskih puževa) sa BMS-986003 i u IV premošćenoj studiji sa BMS-986004. Više detalja ovih zaključaka može se naći u donjim Primerima.
Primer 9
In vivo Farmakologija
[0128] Da bi se pokazala efikasnost CD40L dAb u modelima mišje bolesti, mišji CD40L dAb 2m126-24 je formatiran sa mišjim IgG1 Fc sa D265A tačkom mutacije kako bi se dodatno smanjila funkcija Fc efektora. Ovaj mišji surogat dAb 2m126-24-Fc pokazuje potentnost uporedivu sa BMS-986004 i MR-1, CD40L antitelom hrčka protiv miša (TABELA 12).
Inhibicija odgovora antitela izazvanog KLH pomoću mišjeg CD40L dAb
[0129] Ženski BALB/c miševi su injektovani intraperitonealno (i.p.) sa 250 µg KLH nultog dana. Miševi su dozirani subkutano (s.c.) sa MR-1 ili BMS-2m-126-24-Fc u naznačenim dozama na dan-1 i dan 6. Krv je sakupljena i serum je analiziran na anti-KLH IgM 7. Dana i IgG 14. dana ELISA-om. Serum od BALB/c miševa prikupljen 14. dana posle imunizacije KLH je sakupljen i korišćen kao pozitivan komparator, a podaci su izraženi kao odnos titra testiranog seruma i titra sabranog BALB/c seruma. Kao što je prikazano na SL. 7, BMS-2m-126-24-Fc pokazao je dozno zavisnu supresiju IgG titra sa maksimalnim dejstvom prikazanim na 3 mg/kg, sa ED50 izračunatim da bude 0.26 mg/kg. Oba, i CD40L dAb i antitelo su testirani na 1 mg/kg, pokazujući 70% u odnosu na 30% smanjenja IgG odgovora, redom. Slična izloženost dAb i antitela primećena je na 1 mg/kg, što sugeriše da je dAb nešto jači od antitela pri suzbijanju KLH-indukovanog IgG odgovora. Zaključno, CD40L dAb je pokazalo najmanje isti nivo efikasnosti kao anti-CD40L antitelo u inhibiciji odgovora antitela zavisnog od T.
Inhibicija TNBS-indukovanog Kolitisa pomoću Mišijeg CD40L dAb
[0130] Muški SJL/J miševi su intrarektalno administrirani sa 2.5 mg Trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS) u 50% EtOH preko katetera ubačenog 4 cm daleko od anusa. Miševi su dozirani jednom s.c. sa MR-1 ili BMS-2m-126-24-Fc u naznačenim dozama 4 sata pre injektiranja TNBS-a. SL. 8 prikazuje promene srednje telesne težine i procenat preživljavanja grupa miševa koji su tretirani sa PBS/IgG ili varirajućim nivoima doze MR-1 ili dAb. Abatacept je korišćen kao pozitivna kontrola (20 mg/kg, i.p. svaki drugi dan). Tipičan profil kolitisa izazvanog TNBS-om prikazan je u kontrolnoj grupi IgG: gubitak telesne težine, vrhunac 3-4 dana; smrt povezana sa kolitisom koja se dogodila 3. dana i kasnije; i preživeli miševi koji pokazuju znakove oporavka posle 4. dana. Tretman sa CD40L dAb ili antitelom (oba testirana na 2, 8 i 20 mg/kg) izazvao je inhibiciju gubitka težine u zavisnosti od doze i povećanje stope preživljavanja; oba jedinjenja od 8 mg/kg daju stepen efikasnosti koji je uporediv sa onim kod Abatacepta od 20 mg/kg. Zaključno, mišji CD40L dAb BMS-2m-126-24-Fc pokazao je uporedivu efikasnost sa antitelom protiv CD40L MR-1 u modelu akutnog kolitisa izazvanog TNBS-om.
Sinergistički Efekat između CTLA4 Ig i Mišjeg CD40L dAb kod Miševa u "Od srca do uha" Modela Transplantacije
[0131] Srčani kalemi neonatalnih (48-72 sati) C57B1/6 miševa implantirani su u potkožni džep stvoren u ušnoj školjki BALB/c miševa. Miševi su tretirani sa CTLA4-Ig (i.p.2x/nedelja), BMS-2m126-24-Fc (s.c.1x /nedelja), ili kombinacijom oba u naznačenim dozama, sa prvim doziranjem započetim dan pre transplantacije. Vreme do odbacivanja bilo je definisano odsusutvom srčane kontraktilnosti tri uzastopna dana što se dnevno procenjivalo uređajem elektrokardiogramom (ECG) alografta. Kao što se očekivalo, bez ikakvog lečenja, C57BL/6 miševi koji su primili neonatalno BALB/c srce odbacili su kalem ubrzo nakon toga, sa srednjim vremenom preživljavanja (MST) od 12 dana. Monoterapija sa 3, 20 mg/kg dAb ili 25 mg/kg CTLA4-Ig nije imala ili je malo uticala na produženje preživljavanja alografta (MST: 12, 15 i 13 dana redom). Međutim, u grupama tretiranim kombinacijom od 20 mg/kg dAb i 25 mg/kg od CTLA4-Ig, preživljavanje kalema je bilo značajno produženo pokazujući MST od 35 dana (SL.9). Ovi podaci su pružili obrazloženje za kombinovanje CD40L dAb sa belataceptom kod humanih pacijenata sa transplantacijom bubrega. Buduće studije transplantacije kod primata koji nisu ljudi dalje će definisati nivo doze i proceniti potencijalni efekat na indukciju tolerancije sa CD40L dAb BMS-986004.
Primer 10
In vivo Nekliničke Farmakokinetike (PK) i Farmakodinamike (PD)
[0132] Izvršena su različita in vivo ispitivanja kako bi se karakterisali PK i PD BMS-986004, BMS-986003, i mišji CD40L dAb-Fc surogata BMS-2m-126-24-CT, u nekliničkim uslovima. Ključni nalazi su rezimirani u nastavku.
ELISA za merenje BMS-986004 dAb
[0133] Enzimski test imunoadsorpcije (Enzyme-linked immunosorbency assay (ELISA)) bazira se na bioanalitičkim metodama razvijenim da podrže PK studije, akutne i hronične studije efikasnosti kod miševa, i istraživačke PK/PD studije koje koristecinomolgus majmune. U svim slučajevima, dobijena je puna krv i pripremljena je plazma u prisustvu EDTA, uzorci su zatim podvrgnuti ELISA testovima.
[0134] Koncentracije u plazmi BMS-986004 merene su ELISA testom koji je koristio humani CD40L antigen za hvatanje analita iz testiranih uzoraka. Testirani uzorci bili su odmrznuti na 4°C, dobro izmešani i razblaženi 1:100 u ispitivanom razblaživaču sastavljenom od 1 × PBS, 0.05% Tween-20, i 1% BSA (PTB). Sledeća razblaženja uzorka izvedena su korišćenjem 1% normalne plazme majmuna/PTB kao razblaživača. To je omogućilo ispitivanje analita kod nekoliko razblaženja (10<2>- 10<5>) zadržavajući matriks uzorka na 1%.
[0135] Rekombinantni trimerni humani CD40L je dobijen iz Protein Structure and Science (PSS), LVL i vezan je na ploče sa 96 bunara u krajnjoj koncentraciji od 2 µg/mL. Testirani uzorci, uzorci kontrole kvaliteta (QC) i standardi su detektovani pomoću afinitetno prečišćenog zečijeg poliklonskog antitela sa okvirom domena anti-teškog lanca (Vh) (Covance Research Products, Denver, PA) razblaženog u koncentraciji od 0.25 µg/ml u PTB, nakon čega je dodato magareće peroksidazom rena obeleženo anti zečje poliklonsko sekundarno antitelo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) sa supstratom (TMB - tetrametilbenzidin), i enzimska reakcija je zaustavljena sa 1 M fosfornom kiselinom. Apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 450 nm. Analiza BMS-986004 u testiranim uzorcima je izvršena pomoću standardne krive. Standardni kalibratori krive pripremljeni na dan svakog izvođenja u 1% majmunskoj plazmi korišćeni su za definisanje dinamičkog raspona bioanalitičke metode. Raspon rezultirajuće standardne krive u 100% plazmi bio je 10 - 1200 ng/mL. Referentni standard za BMS-986004 je dobijen od Biologics Process and Product Development (BPPD), HPW. Referentni standardni materijal bio je reprezantativan za proizvodnu seriju i korišćen je u protokolu studije. Standardne krive i QCs procenjeni su korišćenjem kriterijuma za tačnost i preciznost od ≤ 20% što se smatralo prihvatljivim za perfomanse testiranja. Testirani uzorci su kvantifikovani korišćenjem 4-parametarskog modela logističkog podešavanja regresije procenjenim recipročnom koncentracijom (1/x) dobijenom iz kalibratora.
[0136] Performanse QC uzoraka, merene odstupanjem izračunate koncentracije od njegove normalne vrednosti ukazalo je da je referentni materijal stabilan u čistoj plazmi majmuna u koncentracijama od 30 - 1000 ng/ml kada je čuvan na -70° C preko 2 meseca.
ELISA za merenje mišjeg surogat dAb
[0137] Mišji CD40L-specifični dAb BMS-2m-126-24-CT je meren u uzorcima plazme miša dajući podatke o izložensti kao podršku nekoliko akutnih i hroničnih studija efikasnosti kao i PK proceni.
[0138] Iako je format testa za mišje dAb-a bio prilično sličan onom za humana dAb-a u uzorcima majmuna, bilo je nekoliko razlika. Matriks plazme miša je razblažen do 1:10 (10%) u ispitivanom razblaženju, a sva naredna razblaženja testiranih uzoraka izvedena su korišćenjem 10% mišjeg matriksa. Isto tako, svi standardi i QCs su takođe inkubirani na ELISA pločama u mišjoj plazmi od 10%. Koncentracija BMS-2m-126-24-CT u testiranim uzorcima miševa je merena korišćenjem mišjeg CD40L za hvatanje analita. Pošto mišji dAb ima Vk okvir, svi testirani uzorci, QCs, i standardi otkriveni sa afinitetno prečišćenim zečjim anti-kapa (Vk) domenom poliklonskog antitela (Covance Research Products, Denver, PA) su razblaženi do koncentracije od 0.5 µg/mL u PTB-u. Ostatak testa i postupka ispitivanja bio je sličan proceduri za analizu humanih CD40L dAb-a. Kriterijumi prihvatanja za unazad izračunate koncentracije standarda i QCs bili su takođe slični onima za humane CD40L dAb-a. Kvantitativni raspon BMS-2m-126-24-CT utvrđen iz standardne krive bio je 12.5 do 600 ng/mL u čistom matriksu uzorka.
Nekliničke Farmakokinetike
[0139] TABELA 13 rezimira PK parametre za BMS-986004, BMS-986003, i BMS-2m-126-24-CT kod nekliničkih životinjskih vrsta.
TABELA 13
PK Parameteri Pojedinačne-doze (srednja vrednost± SD) iz Dve Nekliničke Životinjske Vrste
[0140] BMS-986004 i BMS-986003 su pokazali uporedne PK profile kod majmuna (SL. 11A i SL. 11B). Posle IV primene, koncentracije BMS-986004 i BMS - 986003 u plazmi pokazale su bieksponencijalni pad redom do 504 i 408 h. Nakon 50% majmuna obuhvaćenih u obe studije primećen je ubrzani klirens. Ispitivanje imunogenosti uzoraka plazme prikupljenih u 38 dana posle BMS-986004 tretmana ukazalo je na to da su svi majmuni razvili antitelo protiv lekova (ADA); i da su majmuni sa višim nivoom ADA pokazali brži klirens. Iako nije sproveden test imunogenosti za IV PK ispitivanje sa BMS-986003, sličan nivo imunogenosti primećen je kod majmuna nakon potkožnog doziranja BMS-986003 u PK/PD studiji, sugerišući da su oba proteina bila imunogenska kod majmuna. Stoga je terminalni poluživot (T1/2) od 124 i 106 h za BMS-986004 i BMS-986003 bio određen korišćenjem samo prikupljenih izloženosti do dve nedelje (336 h). Zapreminska distribucija u stanju ravnoteže (Vss) BMS-986004 i BMS-986003 bila je 0.098 i 0.074 L/kg, redom. Vrednosti su veće od zapremine plazme (0.06 L/kg) ali manje od zapremine vanćelijske tečnosti (0.2 L/kg), što sugeriše da proteini uglavnom borave u vanćelijskom prostoru. Ukupni telesni plazma klirens (CLTp) BMS-986004 i BMS-986003 bio je 0.59 i 0.65 mL/h/kg, redom.
[0141] PK parametri BMS-986004 kod majmuna su upoređeni sa onim abatacepta, protein slične veličine (78.5 prema 78-kDa BMS-986004, baziranog na aminokiselinskoj sekvenci), sa istim modifikovanim humanim IgG1 Fc formatom. Kao što se očekivalo, parameteri BMS-986004 su bili gotovo identični sa onim abatacepta (CLTp od 0.6 mL/h/kg, Vss od 0.087 L/kg, T1/2 od 5 d), što sugeriše da će humani PK BMS-986004 i abatacept verovatno biti slični.
[0142] Apsorpcija BMS-986003 posle supkutane (SC) primene je procenjena u PK/PD ispitivanju kod majmuna. Majmuni su tretirani sa BMS-986003 kao pojedinačna podkožna doza od 0 (kontrola nosača), 0.2, 2 i 20 mg/kg, 24 h pre imunizacije sa keyhole limpet hemocijaninom (KLH), antigenom zavisnim od T ćelije. Nakon doziranja, BMS-986003 je polako apsorbovan, sa Tmax u rasponu od 6-96 h (SL. 12). Izgleda da je izloženost BMS-986003 bila manja od proporcionalne doze u svim doznim nivoima. Sa doznim odnosom od 1:10:100, prosečni odnosi Cmax i AUC0-inf su bili 1:12:80 i 1:7:44, redom. Sa izloženošću nakon IV doze (2 mg/kg) kao referencom, i uz predpostavku linearnog PK nakon IV doziranja, bioraspoloživost SC-a BMS-986003 bila je 88%, 74%, i 44% pri 0.2, 2, i 20 mg/kg, redom. Terminalni T1/2 je bio zamaskiran imunogenošću koja je primećena kod većine majmuna već 2 do 5 nedelja nakon doziranja. Zbog toga je, T1/2 procenjeno na 85, 66, i 105 h pri 0.2, 2 i 20 mg/kg, redom.
[0143] PK od 5c8-IgG1, monoklonsko antitelo protiv humanog CD40L korišćeno kao pozitivna kontrola u PK/PD studiji, procenjeno je posle IV primene u dozi od 20 mg/kg (SL.12). 5c8-IgG1 je pokazao 10 puta veću izloženost u plazmi i 4 puta dužu T1/2 u poređenju sa BMS-986003 datog SC u istoj dozi (TABELA 13).
[0144] PK od mišjeg surogat dAb-Fc fuzionog proteina, BMS-2m-126-24-CT, je procenjen na miševima posle pojedinačne IV i SC primene (TABELA 13). Posle pojedinačne IV (1 mg/kg), koncentracije u plazmi su pratile monoeksponencijalni pad sa terminalnim T1/2 od 101 h (SL.13). CLTp je bio 1.85mL/h/kg; i Vss je bila na 0.26L/kg, što ukazuje na vanćelijsku distribuciju. Posle pojedinačnih SC doza od 1 i 10 mg/kg, BMS-2m-126-24-CT je polako apsorbovan sa Tmax od 24 h. Sistemske izloženosti povećale su se proporcionalno dozi. Sa doznim odnosom od 1:10, Cmax i AUC0-inf su porasli u proporciji od 1:11. Terminalni T1/2 je bio 100 i 120 h pri 1 i 10 mg/kg, redom. Odnos izloženosti prilagođen dozi (AUC0-inf) posle SC i IV primene bio je veći od 1, što ukazuje na potpunu apsorpciju posle SC primene.
Farmakokinetika / Farmakodinamičko Modelovanje
[0145] PD od BMS-986003 je meren kao supresija odgovora antitela protiv KLH u PK/PD studiji. BMS-986003 potiskuje 70% odgovora antitela na KLH (% odgovora
u najvećoj dozi od 20 mg/kg. Marginalni (15%) i bez supresije odgovor antitela se dešava na 2 i 0.2 mg/kg. Za poređenje, 5c8-IgG1 je pokazao 10 puta veću izloženost plazmi i 4 puta dužu Tl/2 nego BMS-986003 pri istom doznom nivou (20 mg/kg). Kao rezultat, 5c8-IgG1 je potisnuo 97% odgovora antitela protiv KLH. Da bi se uporedila in vivo potentnost između BMS-986003 i 5c8-IgG1, izvršeno je PK/PD modelovanje korišćenjem SAAM II (verzija 1.2.1, Seattle, WA). Koncentracije u plazmi BMS-986003 nakon SC primene opisane su koristeći kinetiku apsorpcije prvog reda zajedno sa dvokompartmanskim modelom, pri čemu se eliminacija dogodila i u centralnim i u perifernim odeljcima. Zbog komplikacija od imunogenosti i moguće nelinearne apsorpcije, PK podaci su bili prilagođeni pojedinačno za svaku dozu.
[0146] Za 5c8-IgGl, korišćen je dvokompartmanski model sa centralnom eliminacijom. Odgovor antitela protiv KLH, izražen kao prosečna vrednost IgG titara, modeliran je korišćenjem modela transdukcije signala sa 6 kompartmana. Kinetike od KLH u telu pretpostavlja se da je po modelu 1 kompartmana. Inhibicija proizvodnje IgG pomoću BMS-986003 i 5c8-IgGl opisana je korišćenjem Imax modela, sa maksimalnom inhibicijom jednakom 100%. Kao što je prikazano na SL. 14, model prilagođenih kriva bio je u stanju da opiše i PK i PD profil. IC50 u plazmi od BMS-986003 i 5c8-IgGl za suzbijanje proizvodnje IgG izazvane sa KLH procenjen je redom na 74 ± 14 i 60 ± 18 nM. Ovi rezultati su pokazali da je potentnost ova dva molekula bio uporediv in vivo.
[0147] Zauzetost CD40L receptora (receptor occupancy (RO)) za BMS-986004 je izmerena u IV PK studiji. Posle IV davanja od 11 mg/kg, RO od BMS-986004 na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (peripheral-blood mononuclear cells (PBMC)) je zavisila od vremena i koncentracije. PK/PD modelovanje je izvršeno da bi se procenila RO EC50. Koncentracije u plazmi su bile modelovane korišćenjem modifikovanog modela dva odeljka sa dodatnom ADA posredovanom konstantom eliminacije prvog reda koja je uvedena na 504 h nakon doziranja; i RO je modelovan pomoću Emax modela
Kao što je prikazano na SL.15, podešene krive su mogle da opišu i izloženost i RO, sa procenjenim RO EC50 od 3.4 ± 0.3 nM i γ (factor nagiba) od 3.1 ± 0.1. Za poređenje, RO EC50 bio je ∼22-puta niži od IC50 odgovora antitela na KLH od 74 ± 14 nM, što sugeriše da je potrebno >95% RO da bi se postigla značajna supresija (>50%) antitela protiv KLH.
Primer 11
Neklinički Toksikološki Test pojedinačne doze PK/PD
[0148] Ciljevi ove studije bili su da 1) utvrde podnošljivost BMS-986003, uključujući njegovu potencijalnu imunogenost, kada se daje subkutano kao pojedinačna doza majmunima; 2) procene njegovu PD (npr., inhibiciju odgovora antitela na antigen koji zavisi od T-ćelije) i PK profile; 3) procene zauzetost receptora za BMS-986003 i broj perifernih T-ćelija nakon potkožnog doziranja; i 4) izaberu pomoćne doze za studije transplantacije bubrega i prvo doziranje koje nije humano.
[0149] BMS-986003 bio je davan s.c. u zadnji deo grudnog koša kao pojedinačne doze od 0 (nosač kontrola), 0.2, 2, ili 20 mg/kg grupama od 2 cinomolgus majmuna po polu. Dodatna dva majmuna/pol primili su jednu intravensku dozu od 20 mg/kg 5c8-IgG1, monoklonskog antitela na humani CD40L koje je korišćeno kao pozitivna kontrola u ovoj studiji. Sve doze su davane sa 2 mL/kg na nosaču (PBS; pH 7.2). Da bi se procenili efekti na odgovor antitela zavisnih od T-ćelije, životinje su imunizovane otprilike 24 sata posle doziranja sa članom testa ili neposredno posle doziranja pozitivne kontrole sa 10 mg KLH-a intramuskularnim injektiranjem (zadnji kvadriceps ili bedreni butni deo). Kriterijumi za procenu uključuju preživljavanje, PK, imunogenost, PD (inhibicija odgovora antitela na antigen zavistan od T-ćelije, KLH), kliničke znakove, telesne težine, potrošnju hrane, imunofenotipizaciju periferne krvi, popunjenost receptora, i kliničkupatologiju procene (hematologija, hemija seruma, i koagulacija). Životinje su vraćene na lager nakon perioda od 6-nedelja posmatranja posle doze.
[0150] U dozama ≤ 20 mg/kg, BMS-986003 je bio polako apsorbovan (Tmax = 6-96 h) a vrednosti Cmax i AUCtot povećale su se manje od proporcionalne doze u svim grupama doza i nije bilo vidljivih polnih razlika. Procenjene vrednosti T1/2 kreću se u rasponu od 69-104 h za sve doze. BMS-986003 je bio u osnovi imunogen; svi majmuni su razvili pozitivan odgovor antitela protiv leka (anti-drug antitelo (ADA)) tokom perioda od 6 nedelja posle doze. Kod 0.2 i 2 mg/kg, srednja grupa ukupnog ADA odgovora dostigla je vrhunac 22. dana na srednjim grupama krajnje tačke titara (EPT) od 4203 i 6469, redom. Pri 20 mg/kg, ADA odgovor, iako pozitivan, bio je donekle odložen i delimično potisnut, u skladu sa ciljanom farmakologijom, dostižući vrhunac 36 dana na srednjoj grupi EPT od 1828. Dalja karakterizacija antitela pokazala je većinu vezivanja na delu molekula dAb (ne-Fc) a pokazalo se da ova antitela blokiraju vezivanje BMS-986003 za CD40L u 2 različita formata imunoanalize što sugeriše da se ADA neutrališu. Pored toga, čini se da formiranje ADA ubrzava eliminaciju BMS-986003 kod nekoliko majmuna.
[0151] Srednji PK parameteri za BMS-986003 prikazani su u TABELI 14.
TABELA 14
a u ja e je b a ad 0%, stoga / je saopšte a.
[0152] Nije bilo kliničkih opažanja vezanih za BMS-986003- ili 5c8-IgG1 ili uticaja na telesne težine ili parametre kliničke patologije osim što je 1 mužjak tretiran sa 5c8-IgG1 imao smanjeni broj crvenih krvnih zrnaca (0.74 × kontrola), hemoglobin (0.73× pre doze), i hematokrit (0.75× pre doze) osmog dana, a 3 od 4 majmuna koji su primili 5c8-IgG1 imali su smanjene limfocite (0.53× to 0.65× pre doze) osmog dana, što ukazuje na trošenje limfocita.
[0153] Zauzetost CD40L receptora je generalno bila zavisna od vremena i doze i bila je održivija nakon primene od 20 mg/kg BMS-986003, u skladu sa većim i dugotrajnijim izlaganjem pri ovoj dozi i PD aktivnosti. Za BMS-986003, prosečan pik zauzetosti receptora u mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) je postignuta nakon 24 sata (97%), 6 sati (99%) ili 48 sati (99%) posle doze, smanjujući se na <90% popunjenosti na 240, 360, ili 696 sati i na <50% popunjenosti na 360, 696, ili 1032 sati, pri 0.2, 2, ili 20 mg/kg, redom. Poređenjem, za 5c8-IgG1 pri 20 mg/kg, srednji pik zauzetosti receptora na PBMC postignut je za 48 sati (≥ 100%), i održavan je na ≥ 97% tokom čitave studije (1032 sata ili do 44. dana).
[0154] BMS-986003 je suzbio odgovor antitela na KLH samo pri visokoj dozi od 20 mg/kg. U danima od 8-30 pri 20 mg/kg, bilo je 69 do 83% supresije geometrijske grupe srednjeg odgovora antitela na KLH, u odnosu na kontrolnu grupu, sa pikom supresije od 83% koja se dešava 16. dana. Nije došlo do supresije odgovora antitela pri 0.2 ili 2 mg/kg BMS-986003. Ovi podaci pokazuju da je BMS-986003 na stalnoj zauzetosti receptora od >90% tokom najmanje 1 meseca i pri stalnim koncentracijama u plazmi iznad ∼10 µg/mL do 11. dana u stanju da inhibira odgovor antitela zavisnog od T-ćelije kod majmuna cinomolgus. Za antitelo pozitivne kontrole, 5c8-IgG1, supresija od 74-97% geometrijske grupe srednjeg odgovora antitela na KLH dogodila se u danima 8-30, sa maksimalnim suzbijanjem od 97% do 16. dana, što je uglavnom održano do 30. dana.
[0155] Nema biološki relevantnih BMS-986003 povezanih promena apsolutnog broja B ćelija (CD45+, CD20+, CD3-), ukupnih T (CD45+, CD3+) ćelija, pomoćnih T (CD45+, CD3+, CD4+, CD8-) ćelija, citotoksičnih T (CD45+, CD3+, CD4-, CD8+) ćelija, ili ćelija prirodnih ubica (CD45+, CD3-, CD16+) nastalih tokom studija, što je potvrdilo nedostatak bilo koje Fc efektorske funkcije. Međutim, 8. dana, 3 od 4 majmuna tretiranih sa 20 mg/kg 5c8-IgG1 su smanjili T-limfocite (0.53×-0.66× pre doze), obe, i pomoćne T-ćelijske (0.64× to 0.77× pre doze) i citotoksičnih (0.40× do 0.61× pre doze) T-ćelijskih populacija, što sugeriše trošenje.
[0156] Zaključno, BMS-986003 primenjen putem pojedinačne SC doze od 0.2, 2, ili 20 mg/kg (AUC ≤ 14195 µg<∗>hr/mL) dobro je tolerisan kod cinomolgus majmuna bez štetnih efekata povezanih sa lekovima. Pozitivna kontrola, 5c8-IgG1, u dozi od 20 mg/kg, rezultirala je potpunom, neprekidnom inhibicijom odgovora antitela na KLH i stalnom zauzetošću receptora od skoro 100% tokom 30 dana posle doze. Blago trošenje T-ćelija bilo je takođe primećeno 8. dana kod majmuna koji su primili 5c8-IgG1 (0.40x do 0.77x pre doze), što nije primećeno kod BMS-986003. BMS-986003 je bio u stanju da suzbije odgovor antitela na KLH sa 20 mg/kg (maksimalna supresija od 83%) nakon imunizacije KLH prvog dana i imao je stalnu popunjenost receptora od ≥ 90% do 22. dana i ≥ 50% do 29. dana. Slično prigušivanje imunogenosti na BMS-986003 dogodilo se pri 20 mg/kg. Međutim, niže BMS-986003 doze od 0.2 i 2 mg/kg nisu suzbile odgovor antitela na KLH ili na odgovor antitela protiv leka. Nedostatak farmakologije u nižim dozama takođe je u korelaciji sa smanjenjem popunjenosti receptora (tj., <90% do 11 dana [0.2 mg/kg] ili 16 [2 mg/kg]; <50% do 16. dana [0.2 mg/kg] ili 30 [2 mg/kg]) i ubrzani klirens, pretpostavlja se zbog formiranja ADA. Inhibicija TDARa je u skladu sa mehanizmom dejstva ovog jedinjenja i nije se smatrala štetnom.
Primer 12
Procena Rizika za TE / Trombozu
[0157] Pretpostavljeno je da je TE povezan sa davanjem monoklonskih antitela protiv CD40L posredovan anti-CD40L mAb-CD40L imunim komplksom (IC)-posredovanim unakrsnim povezivanjem trombocita, olakšanim IC vezivanjem za FcgRIIa, IgG Fc receptorom, izazivajući aktivaciju i agregaciju (SL.10). Stoga se blokiranjem interakcije Fc dela IgG sa FcgRIIa očekuje da ublaži umrežavanje trombocita i trombozu. Sledeće metode i pristupi su dizajnirani da procene rizik od TE i/ili tromboze.
Testovi za aktiviranje trombocita In vitro
[0158] Nekoliko in vitro testova sprovedeno je kako bi se ispitala hipoteza da su trombociti aktivirani od strane CD40L mab/sCD40L IC na način koji zavisi od FcgRIIa. Pozitivna kontrola 5c8-IgG1 korišćena je za validaciju testova pre testiranja BMS-986003 i BMS-986004. Za ove testove korišćena je krv od ljudskih donora ili miševa koji esprimiraju hFcgRIIa receptor na trombocitima. Aktivacija trombocita je otkrivena protočnom citometrijom upotrebom antitela protiv dobro potvrđenih markera aktivacije trombocita P-selektina (CD62P) i PAC-1 (aktivirani GPIIb/IIIa). Ukratko, krv je razblažena 1:25 u modifikovanom Tyrodes-HEPES-u koji sadrži 1mM CaC12kome su dodata antitela za detekciju i reagensi testa, inkubirana, i analizirana na aktivaciju trombocita. Početni eksperimenti utvrdili su da sami sCD40L ili 5c8IgG1 ne aktiviraju trombocite, već različite odnose imuno kompleksa od 1:1 do 1:8 od 5c8:sCD40L značajno aktiviranih trombocita. U narednim eksperimentima korišćeni su 5c8-IgG1 ili 5c8-mIgG2a IC, uglavnom u molarnom odnosu 1:3 od 5c8:sCD40L.
Aktivacija trombocita pomoću 5c8/sCD40L IC može biti blokirana antiitelom protiv FcgRIIa
[0159] Ispitivanja su sprovedena sa blokirajućim antitelom FcgRIIa IV.3 da se proveri da li je aktiviranje trombocita pomoću 5c8/sCD40L IC bilo zaista posredovano od strane FcgRIIA. Krv od humanih donora je prethodno inkubirana sa 05µg/µl FcgRIIa blokirajućeg antitela IV.3 pre razblaživanja i inkubacije sa antitelom za detekciju kako je gore opisano. Adenozin difosfat (ADP), aktivator trombocita preko drugog mehanizma, korišćen je kao pozitivna kontrola. Kao što je prikazano na SL. 16, aktivacija trombocita pomoću 5c8/sCD40 IC bila je potpuno blokirana sa IV.3, dok aktiviranje ADP-om nije inhibirano blokirajućim antitelom, što ukazuje da je aktiviranje od strane IC posredovano FcgRIIa.
Selekcija inertnih Fc repova
[0160] Uslov za potencijalne molekule kandidata bilo je odsustvo vezivanja za FcgRIIa da se spreči potencijalna aktivacija trombocita. Nekoliko konstrukata 5c8 koji sadrži različite mutacije izvedene iz IgG1 (npr.5c8-CT i N297Q) ili IgG4 (npr., 5c8-S228P) su eksprimirane i pregledane na Fc repove koji nisu aktivirali trombocite koristeći različite molarne odnose sCD40L prema mAbs. Divlji tip i najviše mutirani konstrukti aktiviranih trombocita osim 5c8-CT i 5c8-N297Q (SL. 17). Odsustvo Fc (5c8-Fab2) takođe nije aktiviralo trombocite što dalje potvrđuje da je IC aktiviranje trombocita Fc posredovano. CT rep je izabran da formatira dAb kandidate BMS-986003 i BMS-986004.
Efekat FcgRIIa polimorfizma na aktivaciju trombocita
[0161] Gen za FcgRIIa je promenljiv u kodonu 131, što rezultira His-Arg (CAT/CGT) polimorfizmom. Raspodela genotipa kod otprilike 100 jedinki sa približno jednakom raspodelom Kavkažana i Afro Amerikanaca bila je A/A (His homozigot; 14%), A/G (His/Arg heterozigot; 60%), i G/G (Arginine homozigot; 26%) za Kavkaške Amerikance i A/A (30%), A/G (51%), i G/G (19%) za Afro-Amerikance. Reilly et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1: 640-644 (1994). Primećena je agregacija trombocita zavisna od Fc u uzorcima R131 pojedinaca kada su tretirani sa anti-CD9 u mIgG2 ili mIgG1 Fc formatu, dok su trombociti H131 pojedinaca agregirani samo sa anti-CD9 kao mIgG2 formatom; ovo sugeriše da agregacija zavisna od Fc sa IgG1 mAb može potencijalno odvojiti populaciju pacijenata na one niskog i visokog odziva, o čemu je ranije saopšteno u vezi sa ovim polimorfizmom. Tomiyama et al., Krv 80: 2261-2268 (1992). Da bi se rešile bilo kakve potencijalne razlike u aktivaciji trombocita sa IgG1 i CT Fc repom, 19 donora je genotipizovano za hFcgRIIa polimorfzam i uzorci su testirani na aktivaciju trombocita. Polimorfizam baze donora (RR; 42%, HH; 21%, HR; 37%) je bio dovoljan da se procene eventualne razlike u aktivaciji trombocita na IgG1 format. Reprezantitivno u literaturnim izveštajima je, da je aktivacija trombocita sa 5c8-IgGl/sCD40L IC bila slična kod svih genotipizovanih pojedinaca. Nije pronađena aktivacija sa 5c8-CT/sCD40L IC (SL. 18), što sugeriše da nema ili je minimalni rizik od povećanja TE u populaciji pacijenata sa antitelom formatiranim sa CT repom.
BMS-986004: Aktivacija trombocita kod humanih donra krvi
[0162] Gore opisani eksperimenti korišćenjem 5c8, podržali su izbor CT-repa kao najboljeg formata za BMS-986004 (koji se takođe naziva BMS2h-572-633-CT-L2). Krv dobijena od 6 donora je tretirana sa 5c8-IgGl, 5c8-CT, F(ab)2, i BMS-986004. Trombocite su aktivirali 5c8-IgG1 ali ne i bilo koji od drugih konstrukata, uključujući BMS-986004 (SL. 19), što sugeriše da ovaj dAb nema ili je mali rizik od izazivanja aktivacije trombocita i TE u kliničkim studijama.
BMS-986003: Aktivacija trombocita u krvi miševa koji izražavaju hFcgRIIa
[0163] Da bi se dodatno potvrdila da je aktivacija trombocita antitelom protiv CD40L bila posredovana FcgRIIa receptorom, krv iz transgenih miševa koji su eksprimirali humani receptor (R131 genotip) je tretirana sa 5c8-IgGl, 5c8-IgG2a, dAb-IgG1, 5c8-CT, i BMS-986003 (koji se takođe naziva BMS-2h572-633-CT). Trombociti su specifično aktivirani od 5c8-IgG1, 5c8-IgG2a, i dAb-IgGl/sCD40L IC u krvi od miševa koji eksprimiraju hFcgRIIa, ali ne i divljeg tipa legla.
5c8-CT i BMS-986003 nisu aktivirali trombocite, što dalje potvrđuje nizak rizik za TE sa antitelima ovde stavljenim na uvid javnosti (SL.20).
Primer 13
Eksperimenti za Vezivanje Epitopa
[0164] SL.25 pokazuje podatke SPR senzorskih programa za eksperimente osmišljene da testiraju da li se ili ne monovalentni dAb molekuli BMS2h-503-1, BMS2h-572-6, BMS2h-719-17, i monovalentni fragment 5c8 Fab protiv CD40L takmiče jedan sa drugim za vezivanje na CD40L. Eksperimenti su izvedeni korišćenjem biotiniliranog CD40L (biot-IZ-hCD40L) koji je zarobljen na površini čipa streptavidinskog senzora. Testovi su uključivali redno injektiranje naznačenog molekula (faza "a"), odmah zatim injektiranje istog molekula u prisustvu drugog naznačenog molekula (faza "b"), a zatim disocijacijom (faza "c"). Takmičenje za vezivanje je identifikovano kao smanjenje (blokiranje) signala vezivanja za drugi molekul u prisustvu prvog, pri čemu nivo blokade reguliše kinetika asocijacije i disocijacije svakog molekula. Za svaki par ispitivanih molekula, pokazano je da je vezivanje drugog molekula smanjeno kada je prisutan prvi molekul. Ovi rezultati sugerišu da se BMS2h-503-1, BMS2h-572-6, BMS2h-719-17, i 5c8 Fab takmiče jedni sa drugima za vezivanje za biot-IZ-hCD40L.
[0165] SL. 26 pokazuje podatke SPR senzorskih programa za vezivanje naznačenih dAb-CT-dugih i 5c8-CT-dugih molekula bilo za humani CD40L monomer (trostruki CD40L mutant (T211E, S222Y, H224K, [108-261])) ili za CD40L trimer (IZ-hCD40L). dAb-CT-dugi i 5c8-CT-dugi molekuli su uhvaćeni preko njihovog "CT-dugog" Fc-domena na površini senzorskog čipa imobilizovanog antitela protiv humanog IgG Fc (Biacore, GE Healthcare). Podaci u gornja 3 panela pokazuju da se humani monomer CD40L veže specifično za BMS2h-719-202-CT-dugi i 5c8-CT-dugi, ali se ne vezuje za bilo koji od naznačenih dAb-CT-dugih molekula koji sadrže dAb iz BMS2h-572-6 roda. Suprotno tome, donja 3 panela pokazuju da se CD40L trimer (IZ-hCD40L) snažno vezuje za sve testirane dAb-CT-duge molekule iz roda od BMS2h-572-6, kao i za BMS2h-719-202-CT-dugog i 5c8-CT-dugog. Ovi rezultati sugerišu da su molekuli iz roda BMS2h-572-6xx-CT-dugih specifični za epitop koji je prisutan samo na CD40L trimeru a nije prisutan na monomernom humanom CD40L, dok se BMS2h-719-202-CT-dugi i 5c8-CT-dugi vezuju za epitop koji je prisutan i na CD40L monomeru i trimeru.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Izolovani polipeptid antitela koji je fuzioni polipeptid koji sadrži prvi varijabilni domen i Fc domen, pri čemu prvi varijabilni domen specifično vezuje humani CD40L, pri čemu CD40L sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 1, pri čemu prvi varijabilni domen sadrži BMS2h-572-633 koji ima aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 274, i gde Fc domen je IgG1 Fc domen izabran od CT-Dugog domena koji se sastoji od amino kiselina 139 do 370 od SEQ ID NO: 1362, CT-kratkog domena koji se sastoji od amino kiselina 138 do 362 od SEQ ID NO: 1363, N297Q Dugog Fc domena koji se sastoji od amino kiselina 139 do 370 od SEQ ID NO: 1364, ili N297Q Kratkog Fc domene koji se sastoji od amino kiselina 138 do 362 od SEQ ID NO: 1365.
2. Polipeptid antitela iz patentnog zahteva 1, gde se prvi varijabilni domen sastoji od aminokiselinske sekvence BMS2h-572-633 sa SEQ ID NO: 274.
3. Polipeptid antitela iz patentnog zahteva 1, gde navedeni polipeptid antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1355.
4. Polipeptid antitela iz patentnog zahteva 1, gde se navedeni polipeptid antitela sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1355.
5. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4.
6. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 5.
7. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži vektor iz patentnog zahteva 6.
8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efikasnu količinu polipeptida antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
9. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 8, koja dalje sadrži imunosupresivni/imunomodulatorni i/ili anti-inflamatorni agens.
10. Izolovani polipeptid antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4 za upotrebu u lečenju pacijenta, gde pacijent ima autoimunu bolest ili bolest povezanu sa kalemom.
11. Izolovani polipeptid antitela za primenu prema patentnom zahtevu 10, gde se izolovani polipeptid antitela administrira u kombinaciji sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili antiinflamatornim agensom; ili gde je izolovani polipeptid antitela za istovremenu administraciju sa CTLA4 mutantnim molekulom, poželjno sa CTLA4 mutantnim molekulom L104EA29Y-Ig takođe poznatim kao belatacept.
12. Izolovani polipeptid antitela za primenu prema patentnom zahtevu 10, gde navedena bolest povezana sa kalemom je izabrana od grupe koja se sastoji od odbacivanja transplantata čvrstog organa, tkiva i/ili ćelije, bolesti kalem protiv domaćina (GVHD), akutnog odbacivanja transplantata, i hroničnog odbacivanja transplantata; ili gde je navedena autoimuna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od: idiopatske trombocitopenične purpure, sistemskog lupus eritematozusa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, dijabetesa, psorijaze, skleroderme, ateroskleroze, inflamatorne bolesti creva, i ulcerativnog kolitisa.
13. Izolovani polipeptid antitela za primenu prema patentnom zahtevu 10, gde je autoimuna bolest idiopatska trombocitopenična purpura.
14. Izolovani polipeptid antitela za primenu prema patentnom zahtevu 10, gde je autoimuna bolest sistemski lupus eritematozus.
15. Izolovani polipeptid antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4 za primenu u lečenju pacijenta, pri čemu pacijent ima bolest izabranu iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankiloznog spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uva, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 dijabetes, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenične purpure, inflamatorne bolesti creva, imunološkog odgovora na rekombinantne proizvode lekova, sistemskog lupus eritematozusa, multiple skleroze, mijastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tiroiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-a, atopične alergije, bronhijalne astme, ekcema, sindroma hroničnog umora, Alzhajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, Arthus-ovog fenomena, anafilaksije, odbacivanja transplantata čvrstog organa, tkiva i/ili ćelija, bolesti kalem protiv domaćina (GVHD), akutnog odbacivanja transplantata, i hroničnog odbacivanja transplantata.
RS20200157A 2011-10-13 2012-10-12 Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40l RS60021B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161546800P 2011-10-13 2011-10-13
US201261655110P 2012-06-04 2012-06-04
EP12775423.2A EP2766395B1 (en) 2011-10-13 2012-10-12 Antibody polypeptides that antagonize cd40l
PCT/US2012/059977 WO2013056068A1 (en) 2011-10-13 2012-10-12 Antibody polypeptides that antagonize cd40l

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60021B1 true RS60021B1 (sr) 2020-04-30

Family

ID=47046896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200157A RS60021B1 (sr) 2011-10-13 2012-10-12 Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40l

Country Status (31)

Country Link
US (7) US8895010B2 (sr)
EP (1) EP2766395B1 (sr)
JP (1) JP6163158B2 (sr)
KR (1) KR101637915B1 (sr)
CN (1) CN104245732B (sr)
AR (1) AR088455A1 (sr)
AU (2) AU2012322093C1 (sr)
BR (1) BR112014009069A2 (sr)
CA (1) CA2851814C (sr)
CL (1) CL2014000958A1 (sr)
CO (1) CO7020864A2 (sr)
CY (1) CY1123618T1 (sr)
DK (1) DK2766395T3 (sr)
EA (1) EA030852B1 (sr)
ES (1) ES2769806T3 (sr)
HR (1) HRP20200230T1 (sr)
HU (1) HUE048365T2 (sr)
IL (1) IL231925B (sr)
LT (1) LT2766395T (sr)
MX (1) MX357231B (sr)
PE (1) PE20141478A1 (sr)
PL (1) PL2766395T3 (sr)
PT (1) PT2766395T (sr)
RS (1) RS60021B1 (sr)
SG (2) SG10201610288TA (sr)
SI (1) SI2766395T1 (sr)
SM (1) SMT202000091T1 (sr)
TW (1) TWI585102B (sr)
UY (1) UY34394A (sr)
WO (1) WO2013056068A1 (sr)
ZA (1) ZA201402603B (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SMT202000091T1 (it) 2011-10-13 2020-05-08 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidi anticorpali che antagonizzano cd40l
PL3489261T3 (pl) 2012-08-24 2021-08-16 The Regents Of The University Of California Przeciwciała i szczepionki do stosowania w leczeniu nowotworów z ekspresją ROR1 i w hamowaniu przerzutu
US20140106405A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR20160124912A (ko) * 2014-03-19 2016-10-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd40l에 대해 지시된 도메인 항체를 사용하여 이식 거부를 치료하는 방법
CN104090115B (zh) * 2014-07-10 2016-01-13 上海益诺思生物技术有限公司 次级t细胞依赖抗体反应检测外源性化合物免疫抑制方法
EA201790520A1 (ru) * 2014-09-10 2017-07-31 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы лечения аутоиммунного заболевания с применением доменного антитела, специфического к cd40l
KR101760707B1 (ko) * 2015-01-05 2017-07-24 한림대학교 산학협력단 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트
MA41459A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Als Therapy Development Inst Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l
US9512229B2 (en) * 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
KR101752280B1 (ko) 2015-03-31 2017-06-30 서울대학교산학협력단 영장류 cd154에 특이적인 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주
HUE051896T2 (hu) 2015-07-16 2021-03-29 Inhibrx Inc Multivalens és multispecifikus DR5-kötõ fúziós fehérjék
CA2994825A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd154 antibodies and methods of using them
MX2018003905A (es) 2015-09-30 2018-09-06 Janssen Biotech Inc Anticuerpos agonistas que se unen específicamente a cd40 humana y métodos de uso.
JP2018536404A (ja) 2015-11-09 2018-12-13 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｈｏ細胞において産生したポリペプチドの品質特性を操作する方法
CN105353135A (zh) * 2015-11-23 2016-02-24 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 阿尔茨海默病标志物的用途
CA3006398A1 (en) * 2015-11-27 2017-06-01 Ablynx Nv Polypeptides inhibiting cd40l
US20190086405A1 (en) 2016-03-16 2019-03-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing and treating lupus
BR112018076260A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a hpd-l1, anticorpo biespecífico ou proteína de fusão, uso de um anticorpo ou fragmento, método, composição farmacêutica, método de modulação, método de inibição, método de tratamento, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e imunocitocina
CA3029003A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CN106967171B (zh) * 2017-02-23 2021-04-27 郑州大学 一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法
US11440951B2 (en) 2017-03-13 2022-09-13 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Therapeutic antibodies to Marburg virus
EP3630843A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 ALS Therapy Development Institute Therapeutic anti-cd40 ligand antibodies
BR112021023048A2 (pt) 2019-05-21 2022-04-19 Novartis Ag Moléculas de ligação a cd19 e usos das mesmas
SMT202400527T1 (it) * 2019-07-01 2025-01-14 Tonix Pharma Ltd Anticorpi anti-cd154 e loro usi
KR20210006301A (ko) * 2019-07-08 2021-01-18 주식회사 프로젠 신규 융합단백질 및 그의 용도
US20210032356A1 (en) * 2019-08-02 2021-02-04 Eastern Virginia Medical School Method for treating seizures
WO2021113648A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Affinity molecules that direct the metabolism and polarization of macrophages and synergize the immune checkpoint blockade therapy
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CA3207098A1 (en) 2021-01-06 2022-07-14 Tonix Pharma Limited Methods of inducing immune tolerance with modified anti-cd154 antibodies
CN114149508B (zh) * 2021-11-25 2023-04-28 苏州普乐康医药科技有限公司 一种结合cd40l的融合蛋白及其应用
WO2024211211A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving transplant survival using il-2 receptor gamma chain antibodies
WO2024249042A2 (en) * 2023-05-26 2024-12-05 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies for human parainfluenza virus type 3
WO2025248134A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Tonix Pharma Limited Treatment methods comprising administration of modified cd154 antibodies

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
GB0006398D0 (en) 2000-03-16 2000-05-03 Novartis Ag Organic compounds
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
CN1835976B (zh) * 2003-06-13 2012-06-13 比奥根艾迪克Ma公司 无糖基抗-cd154(cd40配体)抗体及其用途
JP4667383B2 (ja) * 2003-06-13 2011-04-13 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド アグリコシル抗ｃｄ１５４（ｃｄ４０リガンド）抗体およびその使用
DK1639011T3 (da) 2003-06-30 2009-02-16 Domantis Ltd Pegylerede enkelt-domæne antistoffer (dAb)
CN101443043A (zh) * 2003-10-08 2009-05-27 杜门蒂斯有限公司 抗体组合物和方法
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
CN101061140B (zh) * 2004-09-17 2015-07-01 多曼蒂斯有限公司 单价结合cd40l的组合物和应用方法
LT1868635T (lt) 2005-04-06 2017-07-10 Bristol-Myers Squibb Company Imuninių sutrikimų, susijusių su transplantato persodinimu, gydymo būdas tirpiomis mutantinėmis ctla4 molekulėmis
CA2634547C (en) 2005-12-20 2016-10-11 Bristol-Myers Squibb Company Stable ctla4 formulation for subcutaneous administration
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
PL2125894T3 (pl) * 2007-03-22 2019-08-30 Biogen Ma Inc. Białka wiążące, w tym przeciwciała, pochodne przeciwciał i fragmenty przeciwciał, które swoiście wiążą się z CD154 i ich zastosowania
GB0815788D0 (en) * 2008-08-29 2008-10-08 Isis Innovation Therapeutic antibodies
RS60612B1 (sr) 2010-03-31 2020-08-31 Boehringer Ingelheim Int Anti-cd40 antitela
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
EP3604330A1 (en) 2011-02-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc antibody
US9475879B2 (en) 2011-04-21 2016-10-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibody polypeptides that antagonize CD40
SMT202000091T1 (it) * 2011-10-13 2020-05-08 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidi anticorpali che antagonizzano cd40l
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
KR20160124912A (ko) 2014-03-19 2016-10-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd40l에 대해 지시된 도메인 항체를 사용하여 이식 거부를 치료하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101637915B1 (ko) 2016-07-11
WO2013056068A1 (en) 2013-04-18
CN104245732A (zh) 2014-12-24
HUE048365T2 (hu) 2020-08-28
US20140099707A1 (en) 2014-04-10
US11180567B2 (en) 2021-11-23
SI2766395T1 (sl) 2020-09-30
LT2766395T (lt) 2020-03-25
SMT202000091T1 (it) 2020-05-08
MX357231B (es) 2018-07-02
US20160075790A1 (en) 2016-03-17
CA2851814A1 (en) 2013-04-18
NZ624772A (en) 2016-07-29
CN104245732B (zh) 2020-04-07
AU2012322093B2 (en) 2016-06-02
HRP20200230T1 (hr) 2020-06-26
EP2766395B1 (en) 2019-11-20
KR20140069349A (ko) 2014-06-09
AU2012322093A1 (en) 2014-05-29
SG10201610288TA (en) 2017-02-27
CO7020864A2 (es) 2014-08-11
CY1123618T1 (el) 2022-03-24
BR112014009069A2 (pt) 2020-10-27
EA201490745A1 (ru) 2014-11-28
JP6163158B2 (ja) 2017-07-12
IL231925B (en) 2019-11-28
US8981072B2 (en) 2015-03-17
EP2766395A1 (en) 2014-08-20
PT2766395T (pt) 2020-02-04
US20150023976A1 (en) 2015-01-22
PE20141478A1 (es) 2014-10-23
EA030852B1 (ru) 2018-10-31
ES2769806T3 (es) 2020-06-29
UY34394A (es) 2013-04-30
SG11201401385YA (en) 2014-09-26
US20190100595A1 (en) 2019-04-04
US20130095109A1 (en) 2013-04-18
US9228018B2 (en) 2016-01-05
TW201321411A (zh) 2013-06-01
US8895010B2 (en) 2014-11-25
HK1204789A1 (en) 2015-12-04
ZA201402603B (en) 2016-10-26
US9765150B2 (en) 2017-09-19
IL231925A0 (en) 2014-05-28
JP2014530611A (ja) 2014-11-20
AU2012322093C1 (en) 2016-12-22
AR088455A1 (es) 2014-06-11
TWI585102B (zh) 2017-06-01
MX2014004293A (es) 2014-07-24
DK2766395T3 (da) 2020-02-24
CL2014000958A1 (es) 2014-08-29
CA2851814C (en) 2018-11-06
AU2016202717A1 (en) 2016-05-19
US20180051091A1 (en) 2018-02-22
US10196451B2 (en) 2019-02-05
US20220073636A1 (en) 2022-03-10
PL2766395T3 (pl) 2020-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11180567B2 (en) Antibody polypeptides that antagonize CD40L
JP2020122013A (ja) Ｃｄ３イプシロンおよびｂｃｍａに対する二特異性抗体
US20200231676A1 (en) Methods of treating transplant rejection using a domain antibody directed against cd40l
HK1195914A (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40l
HK1195914B (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40l
NZ624772B2 (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40l
HK1204789B (zh) 拮抗cd40l的抗體多肽