RS60612B1 - Anti-cd40 antitela - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak generalno se odnosi na humanizovana anti-CD40 antitela za dijagnostičku i terapeutsku upotrebu. Specifičnije, ovde su opisana humanizovana anti-CD40 antitela i njihova upotreba za tretiranje raznih bolesti ili poremećaja okarakterisanih ćelijama koje eksprimiraju CD40. Takođe su opisane farmaceutske kompozicije i kompleti koji obuhvataju humanizovano anti-CD40 antitelo.

STANJE TEHNIKE

[0002] CD40 je 48kDa tip I integralni membranski glikoprotein i član receptorske superfamilije faktora tumorske nekroze (TNF). CD40 je izražen u raznim ćelijskim vrstama uključujući normalne i neoplastične B ćelije, interdigitirajuće ćelije, karcinomske, epitelne ćelije (npr. keratinociti), fibroblaste (npr. sinoviociti) i trombocite. Takođe je prisutan na monocitima, makrofagama, nekim endotelijalnim ćelijama, i folikularnim dendritskim ćelijama. CD40 se eksprimira rano u B ćelijskoj ontogenezi, pojavljujući se na B ćelijskim prekursorima nakon pojavljivanja CD10 i CD19, ali pre eksprimiranja CD21, CD23, CD24, i pojave površinskog imunoglobulina M (sIgM) (Uckun et al., 1990, Blood 15:2449). CD40 takođe je detektovan na plazma ćelijama izvedenim iz tonzila i koštane srži (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84:2597).

[0003] Veznik CD40 je CD40L (takođe se naziva i CD154, gp39, i TRAP), član TNF superfamilije. CD40L je transmembranski protein eksrimiran predominantno na aktiviranim CD4<+>T ćelijama i malom podskupu CD8+ T ćelija (Recenzirano od strane (Van Kooten C. and Banchereau, 2000).

[0004] Interakcija CD40 sa CD40L indukuje i humoralne i ćelijama posredovane imune odgovore. CD40 reguliše par veznik-receptor radi aktiviranja B ćelija i drugih antigenpredstavljajućih ćelija (APC) uključujući dendritske ćelije (DC-e) (Recenzirano od strane (Toubi and Shoenfeld, 2004); (Kiener, et al., 1995). Funkcija CD40 na B ćelije opšrino je ispitana. Aktivacija CD40 na B ćelijama idnukuje proliferaciju, diferencijaciju u ćelije koje luče antitela i prebacivanje izotipa u germinalnim centrima sekundarnih limfoidnih organa. In vitro ispitivanja su pokazala direktan efekat CD40 aktivacije na proizvodnju citokina (IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), ekspresiju adhezionih molekula i kostimulatornih receptora (ICAM, CD23, CD80 i CD86), i povećanu eksprsiju MHC klase I, MHC klase II, i TAP transportera od strane B limfocita (Liu, et al., 1996). Za mnoge od ovih procesa, CD40 deluje u dogovoru ili sa citokinima ili drugim interakcijama receptor-veznik.

[0005] CD40 signaliziranje na monocitima i DC-a rezultira kao pojačano preživljavanje kao i lučenje citokina (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α i MIP-1α). CD40 ligacija na ovim APC-a takođe vodi ka povećanoj regulaciji kostimulatornih molekula kao što su (ICAM-1, LFA-3, CD80, i CD86). Aktivacija CD40 receptora je jedan od kritičnih signala koja omogućava potpuno sazrevanje DC u efikasne APC-e koje vode T ćeliju aktivaciju (Banchereau and Steinman, 1998) (Van Kooten C. i Banchereau, 2000).

[0006] Nedavna ispitivanja na mišjim modelima pokazala su da CD40 signalizacija na dendritskim ćelijama takođe igra važnu ulogu u generisanju TH17 ćelija koje se smatraju medijatorima autoimunosti u bolestima kao što su artritis i multipla skleroza (lezzi, et al., 2009) (Perona-Wdesni, et al., 2009).

[0007] Dostupnost CD40 i CD40L nokaut miševa kao i agonistička i antagonistička anti-mišja antitela daju mogućnost ispitivanja uloge CD40-CD40L interakcija u nekoliko modela bolesti. Davanje blokirajućih anti-CD40L pokazalo je da je dobrobitno u nekoliko modela autoimunosti uključujući spontane bolesti kao što je lupus nefritis kod SNF1 miševa ili dijabetes kod NOD miševa ili u eksperimentalno indukovanim oblicima bolesti kao što je kolagenom indukovan artritis (CIA) ili eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE) (Toubi and Shoenfeld, 2004). CIA kod miševa inhibiran je pomoću anti-CD40L mAb koje blokira razvoj upale zglobova, titri antitela u serumu u kolagen, infiltraciju zapaljenskih ćelija u podsinovijalno tkivo pored erozije hrskavice i kosti (Durie, et al., 1993). I za lupus nefritis i za EAE, pokazano je da anti-CD40L takođe može da ublaži tok bolesti, što potvrđuje ulogu CD40-CD40L u efektorskoj fazi bolesti (Kalled, et al., 1998); (Howard, et al., 1999).

[0008] Uloga za CD40-CD40L interakcije u razvoju EAE takođe je ispitana na CD40L-deficijentnim miševima koji nose transgeni T ćelijski receptor specifičan za mijelinski osnovni protein. Kod ovih miševa ne uspeva da se razvije EAE nakon pajmiranja sa antigenom, a CD4+ T ćelije ostaju u stanju mirovanja i ne proizvode INF-γ (Grewal, et al., 1996).

[0009] Dalje, inhibitorna antitela usmerena protiv CD40 pokazala su dobrobitne efekte kod modela zapaljenskih bolesti kao što je EAE. Lamann i saradnici pokazuju da antagonističko mišje anti-humano CD40 mAb mu5D12 i himerna verzija ovog mAb efektivno sprečava kliničku ekspresiju hroničnog demijelinizirajućeg EAE uzgajanim marmoset majmunima (Laman, et al., 2002); (Boon, et al., 2001). Propratno ispitivanje pokazalo je da je terapeutski tretman sa himernim anti-humanim CD40 antitelom redukovalo MRI-detektabilnu upalu i odložilo širenje pred-postojećih lezija u mozgu u marmoset EAE modelu (Hart, et al., 2005).

[0010] Anti-CD40 antitela sa agonističkom aktivnošću testirana su u mišjim modelima artritisa sa nekim suprotstavljajućim rezultatima. Kako se očekivalo za imunostimulatorni agens, agonističko anti-mišje CD40 mAb FGK45 pokazalo je da pogoršava bolest u DBA/1 mišjem modelu kod CIA (Tellander, et al., 2000). Međutim, u drugom hroničnom CIA modelu FGK45, i drugo agonističko anti-mišje CD40 mAb, 3/23, oba su pokazala pozitivne terapeutske efekte (Mauri, et al., 2000). Postulirano je od strane ove grupe da agonistička antitela u ovom terapeutskom tretmanskom režimu imaju dobrobitni efekat indukujući imune devijacije ka Th2 odgovoru sa sniženim nivoima IFN-γ i povišenim nivoima IL-4 i IL-10 (Mauri, et al., 2000).

[0011] Takođe je zabeleženo sprečavanje odbacivanja transplantata blokiranjem CD40/CD154 interakcija. Upotreba ch5D12, himernoog anti-CD40 antagonista, u ispitivanjima bubrežnih alograftova na rezuz majmunima pokazala je da je antagonizam CD40 dovoljan za modifikaciju bolesti i produžavanje vremena preživljavanja nakon 100 dana. Kada je ch5D12 kombinovan sa anti-CD86 antitelom i dat samo na početku alograftnih ispitivanja praćeno produženim tretmanom sa ciklosporinom, postignuta su vremena preživljavanja veća od 4 godine, što ukazuje da ova kombinacija potencijalno može da indukuje toleranciju (Haanstra, et al., 2005).

[0012] Tako, postoji dosta predkliničkih ispitivanja koja pružaju dokaz za krucijalnu ulogu CD40-CD40L para u vođenju efikasnog T ćelijski-zavisnog imunog odgovora. Blokiranje CD40 signalizacije je prema tome prepoznato kao pogodna i potrebna terapeutska strategija za suzbijanje patogenog autoimunog odgovora kod bolesti kao što su RA, multipla skleroza ili psorijaza. Međutim, do danas, ne postoje CD40 antitela koja su odobrena za terapeutske intervencije takvih poremećaja zbog otkrića da su anti-CD40 antitela prethodno u razvoju pokazala da imaju značajne sporedne efekte. Anti-CD40 antitelo, ovde označeno i kao 4D11, opisano je u US 2004/0120948. Međutim, zabeleženo je da ovo antitelo ima kratak polu-život (Aoyagi et al., 2009, American Journal of Tansplantation, 9(8): 1732-1741). Tako, ostaje značajna potreba za terapeutskim agensima koji se mogu upotrebiti za uticanje na aktivnost CD40-CD40L i blokiranje CD40 signalizacije. Ova potreba mogla bi se rešiti novim humanizovanim Anti-CD40 antitelima koje se specifično vezuju za CD40 i koja pokazuju antigen vezujuću specifičnost, afinitet, i farmakokinetičke i farmakodinamičke osobine koje omogućavaju njihovu upotrebu u terapeutskom uticanju na CD40 bazirane poremećaje.

KRATAK OPIS OVOG PRONALASKA

[0013] Pronalazak je naveden u priloženom setu patentnih zahteva. Tehnička rešenja i/ili primeri opisa koji sledi koji nisu pokriveni priloženim patentnim zahtevima se ne smatraju da su deo pronalaska. Ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovano monoklonalno antitelo gde se pomenuto antitelo specifično vezuje za humani CD40 koji ima antagonističku aktivnost IC50 manju od 1nM i nema agonizam do 100 µg/ml u B ćelijskoj proliferacije i gde je pomenuto antitelo dalje okarakterisano time što to antitelo ima in vivo polu-život kod ne-humanih primata od najmanje 10 dana.

[0014] Humanizovano monoklonalno antitelo može dalje biti okarakterisano time što to antitelo ima polu-život kod makaki majmuna duži od 8 dana pri dozi manjoj od 30 mg/kg.

[0015] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-CD40 antitelo sa varijabilnim teškim lancem i varijabilnim lakim lancem koji obuhvataju aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO (SEK ID BR):53 i SEQ ID NO:52, respektivno, pri čemu antitelo sadrži humani imunoglobulinski Fc region i pri čemu antitelo je IgG1 antitelo.

[0016] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je humanizovano anti-CD40 antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, ili SEQ ID NO:35.

[0017] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je humanizovano anti-CD40 antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:31.

[0018] Ovde je opisano monoklonalno antitelo naznačeno time da ono sadrži težak lanac i laki lanac, pri čemu CDR1 sekvenca teškog lanca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9 do SEQ ID NO:11, CDR2 sekvenca teškog lanca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:12 do SEQ ID NO:15 i CDR3 sekvenca teškog lanca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:16 do SEQ ID NO:17; i gde CDR1 sekvenca lakog lanca ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:18 do SEQ ID NO:21, CDR2 sekvenca lakog lanca od SEQ ID NO:22 do SEQ ID NO:23 i CDR3 sekvenca lakog lanca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:24 do SEQ ID NO:25.

[0019] Takođe je ovde opisano monoklonalno antitelo naznačeno time da sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 10, CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:13 i CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:16; i gde navedeno antitelo sadrži CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:19, CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:22 i CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:24.

[0020] Takođe je ovde opisano monoklonalno antitelo opisano ovde je naznačeno time da sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 9, CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:14 i CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:16; i gde navedeno antitelo sadrži CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:20, CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:22 i CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:24.

[0021] Takođe je ovde opisano monoklonalno antitelo opisano ovde je naznačeno time da sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 9, CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:14 i CDR3 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:16; i gde navedeno antitelo sadrži CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:20, CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:22 i CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:24.

[0022] Takođe je ovde opisano monoklonalno antitelo opisano ovde je naznačeno time da sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO: 11, CDR2 sekvencu teškog lanca sa SEQ ID NO:15 i CDR3 sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO:17; i gde navedeno antitelo sadrži CDR1 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:21, CDR2 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:23 i CDR3 sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:25.

[0023] Takođe su ovde opisane individualne sekvence za teške lance poželjnih antitela pronalaska.

[0024] Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom; ili SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom.

[0025] U jednom tehničkom rešenju, pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom.

[0026] U drugom tehičkom rešenju, pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom.

[0027] U drugom tehičkom rešenju, pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom.

[0028] Takođe opisano ovde je izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani CD40, koji sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži okvirni region koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom okvirnog regiona humanog varijabilnog domena teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 ili SEQ ID NO:30, i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu sa odgovarajućim varijabilnim domenom lakog lanca sa SEQ ID NO:26.

[0029] Drugo tehničko rešenje se odnosi na izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CD40, koje sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži okvirni region koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom okvirnog regiona humanog varijabilnog domena teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:35, i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu sa odgovarajućom lakolančanom varijabilnom sa SEQ ID NO:31.

[0030] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo opisano u tehničkom rešenju odmah iznad, gde aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO:32; u drugom tehničkom rešenju, aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO:33; i u drugom tehničkom rešenju, aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO:35.

[0031] Takođe opisano ovde je izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani CD40, koji sadrži humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži okvirni region koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom okvirnog regiona humanog varijabilnog domena teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 ili SEQ ID NO: 40, i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu sa odgovarajućim lakim lancem sa SEQ ID NO:36.

[0032] Antitela ovog pronalaska mogu dalje biti okarakterisana time što pomenuta antitela ne stimulišu proizvodnju citokina iz B ćelija u odsustvu CD40L.

[0033] Antitela ovog pronalaska mogu dalje biti okarakterisana time što se pomenuta antitela vezuju za humani CD40 u prisustvu 50% humanog seruma uz redukovanje brzine na gore za manje od dva puta.

[0034] Antitela ovog pronalaska mogu dalje biti okarakterisana time što pomenuto antitelo proizvodi inhibiciju IgM i IgG proizvodnje kod sisara pri koncentraciji od 1 mg/kg.

[0035] Antitela ovog pronalaska mogu se koristiti u raznim terapeutskim, profilaktičkim, dijagnostičkim i drugim metodama. Na primer, ovaj pronalazak opisuje upotrebu u blokiranju funkcije humanog CD40 kod sisara, koja obuhvata davanje pomenutom sisaru kompozicije koja obuhvata antitelo ovog pronalaska u količini dovoljnoj da blokira CD40 posredovan imuni odgovor kod pomenutog sisara.

[0036] U jednom aspektu antitelo ovog pronalaska koristi se za tretiranje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja kod sisara. U jednom tehničkom rešenju bolest ili poremećaj je odabrana od grupe koju čine bolesti kalem protiv domaćina, autoimuna ili zapaljenska bolest, i CD-40 eksprimirajući kancer. Ovde se takođe govori o antitelu prema pronalasku za upotrebu u tretiranju ili ublažavanje bolesti kalem protiv domaćina kod sisara, koje obuhvata davanje pomenutom sisaru kompozicije koja obuhvata antitelo ovog pronalaska u količini dovoljnoj da umanji jedan ili više simptoma bolesti kalem protiv domaćina kod pomenute životinje.

[0037] Primera radi, autoimuna ili zapaljenska bolest može da uključuje, ali bez ograničavanja, reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, proliferativni lupus glomerulonefritis, zapaljensku bolest creva (IBD), psorijazu, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), Kronovu bolest i sistemski lupus eritematozus (SLE), Hašimotov tiroiditis, primarni miksoedem, tirotoksikozu/Gravesovu bolest, pernicioznu anemiju, autoimuni atrofični gastritis, autoimuni karditis, Adisonovu bolest, preuranjenu menopauzu, tip 1-dijabetes melitus, Goodpastureov sindrom, mijasteniju gravis, autoimunu hemolitičnu anemiju, idiopatsku leukopeniju, primarnu bilijarnu cirozu, aktivni hronični hepatitis (HBs Ag negativni), kriptogenu cirozu, Sjogrenov sindrom, dermatomiozitis, sklerodermu, mešovitu bolest vezivnog tkiva, diskoidni lupus eritematozus, i sistemski vaskulitis. U primernim ostvarenjima, sisar ima reumatoidni artritis.

[0038] Antitelo za primenu prema pronalasku može dalje da obuhvata drugi terapeutski agens odabran od grupe koju čine TNF-antagonist, bolest-modifikujući antireumatski lek, CTLA4-antagonist, anti-IL-6 receptor mAb i anti-CD20 mAb.

[0039] U specifičnim primerima izvođenja, zapaljenska bolest ili autoimuna bolest je zapaljenska bolest ili autoimuna bolest koja je povezana sa ćelijama koje eksprimiraju i CD40 i CD20.

[0040] U specifičnim primerima izvođenja, kompozicija antitela treba da se administrira patenteralnim putem davanja.

[0041] U specifičnim primerima izvođenja, kompozicija antitela treba da se administrira intravenozno ili subkutano.

[0042] Dodatne upotrebe ovog pronalaska obuhvataju inhibiranje proizvodnje antitela B ćelijama kod humanog pacijenta koji obuhvata davanje pomenutom humanom pacijentu efektivne količine Anti-CD40 antitela ovog pronalaska.

[0043] Specifičnije, humani pacijent ima zapaljensku bolest ili autoimunu bolest koja je povezana sa CD40-eksprimirajućim ćelijama.

[0044] U primernim ostvarenjima humani pacijent boluje od autoimune bolesti odabrane od grupe koju čine autoimuna ili zapaljenska bolest odabrana od grupe koju čine reumatoidni artritis, multipla skleroza, proliferativni lupus glomerulonefritis, zapaljenska bolest creva (IBD), psorijaza, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), Kronova bolest i sistemski lupus eritematozus (SLE), Hašimotov tiroiditis, primarni miksoedem, tirotoksikoza/Gravesova bolest, perniciozna anemija, autoimuni atrofični gastritis, autoimuni karditis, Adisonova bolest, preuranjena menopauza, tip 1-dijabetes melitus, Goodpastureov sindrom, mijastenija gravis, autoimuna hemolitična anemija, idiopatska leukopenija, primarna bilijarna ciroza, aktivni hronični hepatitis (HBs Ag negativni), kriptogena ciroza, Sjogrenov sindrom, dermatomiozitis, skleroderma, mešovita bolest vezivnog tkiva, diskoidni lupus eritematozus, i sistemski vaskulitis.

[0045] Još jedno tehničko rešenje pronalaska odnosi se na inhibiranje rasta ćelija koje eksprimiraju humani CD40 antigen, koje obuhvata davanje antitela ovog pronalaska ćelijama, koje antitelo specifično se vezuje za humani CD40 antigen ćelijske površine, gde vezivanje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za CD40 antigen inhibira rast ili diferencijaciju ćelija.

[0046] Takođe se pominje antitelo ovog pronalaska za upotrebu u tretiranju subjekta koji ima CD40-povezan poremećaj, koje obuhvata davanje tom subjektu antitelo ovog pronalaska, koje antitelo se vezuje za humani CD40, gde vezivanje antitela za CD40 inhibira rast ili diferencijaciju ćelija kod CD40-povezanog poremećaja. Te ćelije mogu biti ali nisu ograničene na B limfoblastoidne ćelije, pankreatitične, plućne ćelije, ćelije dojke, ćelije jajnika, ćelije debelog creva, ćelije prostate, ćelije kože, ćelije glave i vrata, ćelije bešike, ćelije kostiju ili ćelije bubrega.

[0047] Antitelo za upotrebu u inhibiranju rasta ili diferencijacije ćelija može biti korisno u tretmanu za hroničnu limfocitičnu leukemiju, Burkitov limfom, multipli mijelom, T ćelijski limfom, Ne-Hodžkinov Limfom, Hodžkinovu Bolest, Valdenstromovu makroglobulinemiju ili Kaposijev sarkom.

[0048] Takođe je razmatrano antitelo ovog pronalaska za primenu u indukovanju trošenja perifernih B ćelija, koje obuhvata davanje ćelijama antitela ovog pronalaska, gde se antitelo specifično vezuje za humani CD40 antigen ćelijske površine, gde vezivanje antitela za CD40 antigen indukuje trošenje ćelija.

1

[0049] U specifičnim primerima izvođenja, antitelo treba da se administrira subjektu koji ima imuni poremećaj. Na primer, imuni poremećaj je reumatoidni artritis ili sistemski lupus eritematozus.

[0050] Takođe se pominje antitelo pronalaska za upotrebu u tretiranju reumatoidnog artritisa kod subjekta, gde je pomenuto antitelo antagonističko antitelo koje blokira funkciju CD40 kod pomenutog subjekta.

[0051] Poželjno, antitelo treba da se administrira u količini efektivnoj da inhibira diferencijaciju B ćelija i menjanje izotipa antitela kod pomenutog subjekta.

[0052] U drugim primerima izvođenja, antitelo treba da se administrira u količini efektivnoj da inhibira proizvodnju citokina i hemokina i poboljša regulaciju adhezionih molekula u T-ćelijama i makrofagama kod pomenutog subjekta. Poželjno, antitelo daje se u količini efektivnoj da inhibira aktivaciju dendritskih ćelija kod pomenutog subjekta.

[0053] U drugim primerima izvođenja, antitelo se koristi u količini efektivnoj da inhibira proizvodnju prozapaljenskih citokina, hemokina, metaloproteinaza matrice, prostaglandina, i uspori regulaciju adhezionih molekula u ne-imunim ćelijama kod pomenutog subjekta.

[0054] U specifičnim primerima izvođenja, antitelo se administrira u kombinaciji sa režimom koji obuhvata davanje metotreksata i/ili davanje Enbrel/Humira.

[0055] Subjekat kome se daje terapija je onaj koji ima reumatoidni artritis i koji nije reagovao na tretman samo sa metotreksatom.

[0056] U specifičnim primerima izvođenja, upotreba obuhvata tretiranje pomenutog subjekta režimom koji obuhvata davanje metotreksata i/ili davanje Enbrel/Humira.

[0057] Antitelo za primenu iz ovog pronalaska može dalje biti okarakterisano time što tretman pomenutog subjekta pomenutim antagonističkim Anti-CD40 antitelom poseduje superiornu efikasnost u odnosu na tretman samo sa metotreksatom, samim Enbrelom, kombinacijom Enbrel+metotreksat.

[0058] Antitelo za primenu iz ovog pronalaska može dalje biti okarakterisano time što tretman pomenutog subjekta pomenutim antagonističkim Anti-CD40 antitelom poseduje superiornu efikasnost u odnosu na tretman sa Enbrel MTX kod pacijenata koji su imali neodgovarajući odgovor na metotreksat.

[0059] U specifičnim primerima izvođenja, antitelo se administrira u kombinaciji sa režimom koji obuhvata anti-TNF agens.

[0060] U specifičnim primerima izvođenja, subjekt je okarakterisan kao neko ko ima reumatoidni artritis i koji nije reagovao na tretman samo sa anti-TNF. U takvim primerima izvođenja, primena može da obuhvata tretiranje pomenutog subjekta režimom koji obuhvata tretman anti-TNF agensom u kombinaciji sa pomenutim antagonističkim Anti-CD40 antitelom.

[0061] U specifičnim primerima izvođenja, tretman pomenutog subjekta pomenutim antagonističkim Anti-CD40 antitelom poseduje superiornu efikasnost u odnosu na tretman anti-TNF agensom.

[0062] U daljim primerima izvođenja, upotreba je okarakterisana time što tretman pomenutog subjekta pomenutim antagonističkim Anti-CD40 antitelom poseduje superiornu efikasnost u odnosu na tretman sa Orencijom ili Rituksanom kod pacijenata koji su imali neodgovarajući odgovor na sam anti-TNF agens.

[0063] Ovaj pronalazak dalje opisuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata: (i) humanizovano anti-CD40 antitelo kakvo je ovde opisano; i (ii) farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U takvim kompozicijama, antitelo može poželjno biti konjugovano sa drugim agensom, kao što je na primer, citotoksični agens, PEG-nosač, enzim ili marker.

[0064] Ovde se takođe govori o izolovanom polinukleotidu ili polinukleotidima koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca sa SEQ ID NO:58, i koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca sa SEQ ID NO:52, gde antitelo sadrži humani imunoglobulinski Fc region i gde antitelo je IgG1 antitelo.

[0065] Ovaj pronalazak dalje se odnosi na upotrebu ovde opisanih antitela za proizvodnju leka za blokiranje funkcije humanog CD40 kod sisara gde taj lek blokira CD40 posredovan imuni odgovor kod pomenutog sisara.

[0066] U jednom primeru izvođenja ovaj pronalazak se odnosi na proizvodnju leka za tretiranje ili ublažavanje bolesti kalem protiv domaćina kod sisara.

[0067] U primernim ostvarenjima, lek se proizvodi za tretman autoimune ili zapaljenske bolesti odabrane od grupe koju čine reumatoidni artritis, multipla skleroza, proliferativni lupus glomerulonefritis, zapaljenska bolest creva (IBD), psorijaza, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), Kronova bolest i sistemski lupus eritematozus (SLE), Hašimotov tiroiditis, primarni miksoedem, tirotoksikoza/Gravesova bolest, perniciozna anemija, autoimuni atrofični gastritis, autoimuni karditis, Adisonova bolest, preuranjena menopauza, tip 1-dijabetes melitus, Goodpastureov sindrom, mijastenija gravis, autoimuna hemolitična anemija, idiopatska leukopenija, primarna bilijarna ciroza, aktivni hronični hepatitis (HBs Ag negativni), kriptogena ciroza, Sjogrenov sindrom, dermatomiozitis, skleroderma, mešovita bolest vezivnog tkiva, diskoidni lupus eritematozus, i sistemski vaskulitis.

[0068] U nekim primerima izvođenja, lek može dalje da obuhvata drugi terapeutski agens odabran od grupe koju čine TNF-antagonist, bolest-modifikujući antireumatski lek, CTLA4-antagonist, anti-IL-6 receptor mAb i anti-CD20 mAb.

[0069] Lek se može proizvesti za upotrebu za parenteralnu putanju davanja. Lek se može proizvesti za intravenoznu ili subkutanu upotrebu.

[0070] Još jedan primer izvođenja opisuje upotrebu ovde opisanih antitela za proizvodnju leka za inhibiranje proizvodnje antitela B ćelijama kod humanog pacijenta.

[0071] Još jedan primer izvođenja opisuje upotrebu ovde opisanih antitela za proizvodnju leka za inhibiranje rasta i/ili diferencijacije ćelija koje eksprimiraju humani CD40 antigen.

[0072] Još jedan primer izvođenja opisuje upotrebu ovde opisanih antitela za proizvodnju leka za tretman subjekta koji ima CD40-povezan poremećaj gde vezivanje antitela u pomenutom leku za CD40 inhibira rast ili diferencijaciju ćelija kod CD40-povezanog poremećaja.

1

[0073] Lek se može proizvesti za upotrebu u tretmanu ćelija u CD40-povezanom poremećaju odabranih od B limfoblastoidnih ćelija, pankreatitičnih, plućnih ćelija, ćelija dojke, ćelija jajnika, ćelija debelog creva, ćelija prostate, ćelija kože, ćelija glave i vrata, ćelija bešike, ćelija kostiju ili ćelija bubrega.

[0074] Lek se može proizvesti za upotrebu u tretmanu hronične limfocitične leukemije, Burkitovog limfoma, multiplog mijeloma, limfoma T ćelija, Ne-Hodžkinovog Limfoma, Hodžkinove Bolest, Valdenstromove makroglobulinemije ili Kaposijevog sarkoma.

[0075] Još jedan primer izvođenja opisuje upotrebu antitela ovog pronalaska u proizvodnji leka za indukovanje trošenja perifernih B ćelije pri čemu se antitelo tog leka specifično vezuje za ćelijske površine humanog CD40 antigena, gde vezivanje antitela za CD40 antigen indukuje trošenje ćelija.

[0076] Lek se može proizvesti za upotrebu u tretmanu subjekta koji ima imuni poremećaj.

[0077] Lek se može proizvesti za upotrebu u tretmanu reumatoidnog artritisa ili sistemskog lupus eritematozusa.

[0078] Još jedan primer izvođenja opisuje upotrebu antitela ovog pronalaska u proizvodnji leka za tretman reumatoidnog artritisa kod subjekta.

[0079] Lek se može proizvesti za upotrebu u inhibiranju diferencijacije B ćelija i menjanja izotipa antitela kod pomenutog subjekta.

[0080] Lek se može proizvesti za upotrebu u inhibiranju proizvodnje citokina i hemokina i poboljšanju regulacije adhezionih molekula u T-ćelijama i makrofagama kod pomenutog subjekta.

[0081] Lek se može proizvesti za upotrebu u inhibiranju aktivacije dendritskih ćelija kod pomenutog subjekta.

[0082] Lek se može proizvesti za upotrebu u inhibiranju proizvodnje prozapaljenskih citokina, hemokina, metaloproteinaza matrice, prostaglandina, i usporavanju regulacije adhezionih molekula u ne-imunim ćelijama kod pomenutog subjekta.

[0083] U određenim primerima izvođenja, lek se proizvodi kao kombinovani lek za davanje u kombinaciji sa režimom koji obuhvata davanje metotreksata i/ili davanje Enbrel/Humira.

[0084] U drugim primerima izvođenja, lek se proizvodi kao kombinovani lek i lek pored antitela ovog pronalaska dalje obuhvata anti-TNF agens.

KRATAK OPIS NEKOLIKO PRIKAZA CRTEŽA

[0085]

Slika 1: A. Krive vezivanja i odgovarajuće EC50 vrednosti humanizovanog antitela na CD40 transfektovanim HEK- 293 ćelijama izmerene su protočnom citometrijom. B. Poređenje vezivanja antitela A, antitela B i antitela C sa CD40 transfektovanim HEK ćelijama izmereno je protočnom citometrijom. Prikazani su reprezentativni podaci za jedan eksperiment

Slika 2: Krive vezivanja i odgovarajuće EC50 vrednosti humanizovanog antitela na RAMOS ćelijama izmerene su protočnom citometrijom. Prikazani su reprezentativni podaci za jedan eksperiment.

Slika 3: Testiranje mišjeg i humanizovanog antitela na antagonističku aktivnost u ispitivanju proliferacije humanih primarnih B ćelija. (A) Titracione krive reprezentativnog antitela i dobijene IC50 vrednosti prikazane su za svako mišje prekursorsko antitelo. Prikazani su reprezentativni podaci za jednog donora. (B) Razvučenost inhibicionih kriva koje pokazuju antagonizam raznih humanizovanih anti-CD40 antitela u poređenje sa 4D11.

Slika 4: Rezime rezultata ispitivanja humanizovanog antitela na antagonističku (IC50) i agonističku (SI= indeks stimulacije) aktivnost u ogledu humane primarne B ćelijske proliferacije. Razna anti-CD40 antitela, 4D11, G28.5 i 5D12, prikazana su radi poređenja.

Slika 5: Ispitivanje antitela B, antitela A i antitela C na inhibiranje sa CD40 indukovane CD86-ushodne regulacije u ogledima ispitivanja sa punom ljudskom krvi. 4D11 anti-CD40 antitelo prikazano je radi poređenja. IgG1 izotip kontrola nije pokazala nikakave efekte u ovom ispitivanju. Prikazani su reprezentativni podaci za jednog donora.

Slika 6: Rezime rezultata ispitivanja antitela B na inhibiranje CD40 indukovane CD86-ushodne regulacije na humanim prečišćenim B ćelijama i punoj ljudskoj krvi. Prikazani su podaci i na (A) IC50 i (B) IC90 tačkama. IgG1 izotip kontrola nije pokazala bilo kakve efekte u bilo kom ispitivanju. Podaci za više donora (n=4-5) sumirani su u tabeli

1

Slika 7: Ispitivanje antitela B, antitela A i antitela C na inhibiranje CD40 indukovane CD86 ushodne - poboljšane regulacije u ispitivanjima pune krvi makaki majmuna. lgG1 izotip kontrola nije pokazala nikakve efekte u ovom ispitivanju. Prikazani su reprezentativni podaci za jednog donora.

Slika 8: Vremenske krive plazma koncentracija za antitelo A (levi panel) i antitelo B (desni panel) kod makaki majmuna nakon davanja 1 i 10 mg/kg svakog antitela. Podaci predstavljaju rezime upotrebe na 3 životinje za svako antitelo.

Slika 9: Promena procenata CD86-pozitivnih B ćelija od makaki majmuna pre davanja (Antitela B) i (Antitela A) i na 3 vremenske tačke nakon tretman tretiranja svakim antitelom. Antitelo B (gornji paneli) i Antitelo A primenjena su na 3 životinje svaka sa 1 mg/kg (levi paneli) ili 10 mg/kg (desni paneli).

Slika 10: (A) Human IgG i (B) human IgM nivoi kod NSG miševa 2 nedelje nakon ubrizgavanja 1.25 x 10<6>humanog PBMC. Miševi su tretirani nosačem, izotip kontrolom i antitelima Antitelo A, Antitelo B i Antitelo C pri dozi od 1 mg/kg jedan dan pre transfera humanog PBMC Slika 11: Vezivanje raznih mišjih anti-humanih CD40 antitela na humane trombocite.

Slika 12: Rezime rezultata poređenja vezivanja antitela B sa anti-CD40 mAb 4D11 na humanim B ćelijama i trombocitima u punoj krvi

Slika 13: ADCC aktivnost sa konstruktima divljeg tipa i nokaut IgG1

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0086] Danas je poznato da je CD40 posredovana signalizacija umešana u mnoštvo ciljanih poremećaja. Pored dostupnosti raznih predkliničkih podataka koji pokazuju da intervenisanje u ovim poremećaji može biti terapeutski dobrobitno, i dalje ostaje potreba za antagonističkim anti-CD40 antitelima koje se mogu koristiti u tretiranju autoimunih bolesti. Ovaj pronalazak se odnosi na humanizovana antitela koja prepoznaju CD40. Sekvenca ovih humanizovanih antitela identifikovana je na osnovu sekvenci određenih vodećih mišjih antitela.

[0087] Izrazi "CD40" i "CD40 površinski antigen" odnose se na glikoprotein sa približno 48 kD eksprimiran na površini normalnih i neoplastičnih B ćelija, koji deluje kao receptor za signalizaciju uključenu u ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju (Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138:788-785). cDNK molekul koji kodira CD40 izolovan je iz biblioteke pripremljene od ćelijske linije Raji Burkitovog limfoma (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J.8:1403).

[0088] Kako se ovde koristi, ćelija koja endogeno eksprimira CD40 je bilo koja ćelija

1

okarakterisana površinskom ekspresijom CD40, uključujući, ali ne ograničavajući se na, normalne i neoplastične B ćelije, interdigitirajuće ćelije, bazalne epitelne ćelije, ćelije karcinoma, makrofage, endotelijalne ćelije, folikularne dendritske ćelije, tonzilne ćelije, i plazma ćelije izvedene iz koštane srži. U nekim primerima izvođenja, CD40 molekul je humani CD40 molekul.

[0089] Antitela ovog pronalaska specifično se vezuju za humani rekombinantni i nativni CD40. Humanizovano monoklonalno antitelo kod kojeg se pomenuto antitelo specifično vezuje za humani CD40 koji ima antagonističku aktivnost IC50 manju od 1 nM i nema agonizama do 100 µg/ml u B ćelijskoj proliferaciji i kod kojeg je pomenuto antitelo dalje okarakterisano time što antitelo ima in vivo polu-život kod ne-humanih primata od najmanje 10 dana.

[0090] Poželjno antitelo specifično se vezuje za CD40 u CD40-Fc konjugat sa EC50 manjom od 1 nM i CD40 u CD40 eksprimirajućim ćelijama sa EC50 manjom od 2.5 nM. Antagonističke osobine antitela definisane su time što imaju IC50 antagonističke aktivnosti B ćelija ili dendritskih ćelija, manju od 1 nM. Antitelo dalje ima superiorne farmakokinetičke osobine koje imaju povećan in vivo polu-život u poređenju sa drugim anti-CD40 antitelima (npr., anti- CD40 antitelo 4D11).

[0091] Kako se ovde koristi, ćelija koja eksprimira CD40 je bilo koja ćelija okarakterisana površinskom ekspresijom CD40, uključujući, ali ne ograničavajući se na, normalne i neoplastične B ćelije, interdigitirajuće ćelije, bazalne epitelne ćelije, ćelije karcinoma, makrofage, endotelijalne ćelije, folikularne dendritske ćelije, tonzilne ćelije, i plazma ćelije izvedene iz koštane srži. U nekim primerima izvođenja, CD40 molekul je humani CD40 molekul.

[0092] Antitela ovog pronalaska prepoznaju specifičan "CD40 antigen epitop" i "CD40 epitop". Kako se ovde koristi ovi termini odnose se na molekul (npr., peptid) ili fragment molekula sposoban za imunoreaktivnost sa anti-CD40 antitelom i, na primer, uključuju CD40 antigenu determinantu prepoznatu od strane bilo kojih antitela sa kombinacijom sekvence teškog lanca/lakog lanca, SEQ ID NO.26 lakog lanca sa bilo kojom od SEQ ID NO: 27, 28, 29 ili 30 teškog lanca; ili SEQ ID NO: 31 lakog lanca sa bilo kojom od SEQ ID NO 32, 33, 34 ili 35 teškog lanca; ili SEQ ID NO 36 lakog lanca sa bilo kojom od SEQ ID NO 37, 38, 39 ili 40 teškog lanca. CD40 antigen epitopi mogu biti uključeni u proteine, proteinske fragmente, peptide

1

ili slično. Epitopi su najuobičajenije proteini, kratki oligopeptidi, oligopeptidni mimici (tj., organska jedinjenja koja oponašaju karakteristike vezivanja antitela CD40 antigena), ili njihove kombinacije.

[0093] Generalizovana struktura antitela ili imunoglobulina dobro je poznata stručnjacima iz ove oblasti, ovi molekuli su heterotetramerni glikoproteini, tipično od oko 150,000 daltona, sačinjeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac kovalentno je povezan sa teškim lancem jednom disulfidnom vezom kako bi se obrazovao heterodimer, a heterotramerni molekul obrazuje se putem kovalentne disulfidne veze između dva identična teška lanca ovih heterodimera. Iako su laki i teški lanci međusobno povezani jednom disulfidnom vezom, broj disulfidnih veza između dva teška lanca varira imunoglobulinskim izotipom. Svaki teški i laki lanac takođe su regularno razmaknuti međulančanim disulfidnim mostovima. Svaki teški lanac ima amino-terminus, varijabilni domen (VH), praćen sa tri ili četiri konstantna domena (CH1, CH2, CH3, i CH4), kao i region zgloba između CH1i CH2. Svaki laki lanac ima dva domena, amino-terminalni varijabilni domen (VL) i karboksi-terminalni konstantan domen (CL). VLdomen udružuju se ne-kovalentno sa VHdomenom, pri čemu je CLdomen uobičajeno povezan sa CH1domenom putem disulfidne veze. Naročito se smatra da aminokiselinski ostaci obrazuju prostor između varijabilnih domena lakih i teških lanaca (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol.186:651-663.)

[0094] Određeni domeni unutar varijabilnih domena opširno se razlikuju između različitih antitela tj., oni su "hipervarijabilni." Ovi hipervarijabilni domeni sadrže ostatke koji su direktno umešani u vezivanje i specifičnost svakog pojedinačnog antitela za svoju specifičnu antigenu determinantu. Hipervarijabilnost, u varijabilnim domenima i lakog lanca i teškog lanca, koncentrisana je u tri segmenta poznata kao regioni određivanja komplementarnosti (CDR-ovi) ili hipervarijabilne petlje (HVL-ovi). CDR-ovi su definisani sekvencionim poređenjem u Kabat et al., 1991, u: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., pri čemu su HVL-ovi strukturalno definisani u skladu sa trodimenzionalnom strukturom varijabilnog domena, kako je opisano u Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Kada ova dva postupka rezultiraju u blago različitim identifikacijama CDR-a, poželjna je strukturalna definicija. Kako je definisano od strane Kabat-a, CDR-L1 je smešten oko ostataka 24-34, CDR-L2, oko ostataka 50-56, i CDR-L3, oko ostataka 89-97 u varijabilnom domenu lakog lanca; CDR-H1 smešten je oko ostataka 31-35, CDR-H2 oko ostataka 50-65, i CDR-H3 oko ostataka 95-102 u varijabilnom domenu

1

teškog lanca. CDR1, CDR2, CDR3 teških i lakih lanaca prema tome definišu jedinstvene i funkcionalne karakteristike specifične za dato antitelo.

[0095] Tri CDR-a unutar svakog teškog i lakog lanca razdvojena su regionima okvira (FR), koji sadrže sekvence koje teže da budu manje varijabilne. Od amino terminusa do karboksi terminusa varijabilnih domena teškog i lakog lanca, FR-ovi i CDR-ovi raspoređeni su sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Uglavnom β-listasta konfiguracija FR-ova dovodi CDR-ove unutar svakog od lanaca u bliskoj blizini svakog drugog kao i do CDR-ova od drugog lanca. Dobijena konfortacija doprinosi mestu vezivanja antigena (videti Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, tom I, strane 647-669), iako nisu svi CDR ostaci nužno direktno uključeni u antigen vezivanje.

[0096] FR ostaci i Ig konstantni domeni nisu direktno uključeni u antigen vezivanje, ali doprinose antigen vezivanju i/ili posreduju efektorskoj funkciji antitela. Smatra se da neki FR ostaci imaju značajan efekat na antigen vezivanje najmanje na tri načina: nekovalentnim vezivanjem direktno za epitop, međusobnim interakcijama sa jednim ili više CDR ostataka, i uticanjem na prostor između teških i lakih lanaca. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u antigen vezivanje već posreduju razne Ig efektorske funkcije, kao što je učešće antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost antitela (ADCC), komplement zavisnu citotoksičnost (CDC) i zavisnu ćelijsku fagocitozu antitela (ADCP).

[0097] Laki lanci imunoglobulina kičmenjaka dodeljeni su jednoj ili dvema jasno različitim klasama, kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci iz konstantnog domena. Poređenjem, teški lanci imunoglobulina sisara dodeljeni su jednoj ili pet glavnih klasa, u skladu sa sekvencom konstantnih domena: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. IgG i IgA su dalje podeljeni na podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, δ, ε, γ, i µ, respektivno. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije klasa nativnih imunoglobulini dobro su poznate.

[0098] Izrazi, "antitelo", "anti-CD40 antitelo", "humanizovano anti-CD40 antitelo", i "varijanta humanizovanog anti-CD40 antitela" ovde se koriste u najširem smislu i specifično obuhvataju monoklonalna antitela (uključujući monoklonalna antitela pune dužine), poliklonalna antitela,

1

multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmente antitela kao što su varijabilni domeni i drugi delovi antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost, npr., CD40 vezivanje.

[0099] Izraz "monoklonalno antitelo" (mAb) odnosi se na antitelo populacije suštinski homogenih antitela; odnosno, pojedinačna antitela u toj populaciji su identična osim za prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su veoma specifična, pri čemu su usmerena protiv jedne antigene determinante, "epitopa". Prema tome, određujuća reč "monoklonalno" ukazuje na suštinski homogenu populaciju antitela usmerenu na identične epitope i koja nije konstruisana zahtevajući proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Treba napomenuti da se monoklonalna antitela mogu izraditi bilo kojom tehnikom ili postupkom poznatim u struci; uključujući npr., hibridoma postupak (Kohler et al., 1975, Nature 256:495), ili postupke rekombinantne DNK poznate u struci (videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,816,567), ili postupke izolovanja monoklonalnog rekombinantno proizvedenog primenom biblioteka antitela faga, upotrebom postupaka opisanih u Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597.

[0100] Himerna antitela sastoje se od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca nekog antitela jedne vrste (npr., ne-humani sisar kao što je miš) i konstantnih regiona teških i lakih lanaca antitela druge vrste (npr., čovek) i mogu se dobiti vezivanjem DNK sekvenci koje kodiraju varijabilne regione antitela prvih vrsta (npr., miš) za DNK sekvence za konstantne regione antitela drugih (npr. čovek) vrsta i transformisanjem domaćina ekspresionim vektorom koji sadrži povezane sekvence radi omogućavanja proizvodnje antitela. Alternativno, himerno antitelo takođe može biti neko u kojem su jedan ili više regiona ili domena teškog i/ili lakog lanca identični sa, homologni sa, ili varijanta odgovarajuće sekvence u monoklonalnom antitelu iz druge imunoglobulinske klase ili izotipa, ili iz konsenzus ili embrionske sekvence. Himerna antitela mogu da uključe fragmente takvih antitela, pod uslovom da fragment antitela pokazuju željenu biološku aktivnost roditeljskog antitela, na primer vezivanje za isti epitop (videti, npr., U.S. Pat. Br.4,816,567; i Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

[0101] Izrazi, "fragment antitela", "Anti-CD40 fragment antitela", "fragment humanizovanog anti-CD40 antitela", "varijanta fragmenta humanizovanog anti-CD40 antitela" odnose se na deo anti-CD40 antitela pune dužine, kod kojeg su varijabilni region ili funkcionalna sposobnost zadržani, na primer, specifičnim CD40 epitopnim vezivanjem. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv i scFv-Fc fragment, dijatelo,

2

linearno antitelo, jedno-lančano antitelo, minitelo, dijatelom obrazovane fragmente antitela, i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0102] Antitela pune dužine mogu se tretirati enzimima kao što je papain ili pepsin kako bi se generisali korisni fragmenti antitela. Papainska digestija koristi se za proizvodnju dva identična antigen-vezujuća fragmenta antitela koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigenvezujućim mestom, i preostalim "Fc" fragmentom. Fab fragment takođe sadrži konstantan domen lakog lanca i CH1domen teškog lanca. Pepsinski tretman daje F(ab')2fragment koji ima dva antigen-vezujuća mesta i koji je i dalje sposoban za umrežavanje antigena.

[0103] Fab' fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata prisustvom dodatnih ostataka uključujući jedan ili više cisteina iz region zgloba antitelo na C-terminusu CH1domena. F(ab')2fragmenti antitela su parovi Fab' fragmenata povezani cisteinskim ostacima u regionu zgloba. Ostali hemijski kuplirajući fragmenti antitela takođe su poznati.

[0104] "Fv" fragment sadrži kompletno antigen-prepoznavanje i mesto vezivanja koje se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog i jednog lakog lanca u uskoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji, tri CDR-a svakog varijabilnog domena ulaze u reakciju radi definisanja antigen-vezujućeg mesta na površini VH-VLdimera. Kolektivno, šest CDR-ova potvrđuje antigen-vezujuću specifičnost za antitelo.

[0105] "Jedno-lančani Fv" ili "scFv" fragment antitela je jednolančana Fv varijanta koja obuhvata VHi VLdomene nekog antitela kod kojih su domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Jednolančani Fv sposoban je za prepoznavanje i vezivanje antigena. scFv polipeptid može opciono da sadrži polipeptidni linker smešten između VHi VLdomena radi olakšavanja formiranja željene trodimenzionalne strukture za antigen vezivanje sa scFv (videti, npr., Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore eds., Springer-Verlag, Njujork, str.269-315).

[0106] Drugi prepoznati fragmenti antitela uključuju one koji obuhvataju par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) radi formiranja para antigen vezivajućih regiona. Ova "linearna antitela" mogu biti bispecifična ili monospecifična kako je opisano u , na primer, Zapata et al.

1995, Protein Eng.8(10):1057-1062.

[0107] Humanizovano antitelo ili humanizovani fragment antitela je specifična vrsta himernog antitela koja uključuje varijantu imunoglobulinske aminokiselinske sekvence, ili njen fragment, koja je sposobna za vezivanja za prethodno određeni antigen i koja obuhvata jedan ili više FR-ova koji suštinski imaju aminokiselinsku sekvencu iz humanog imunoglobulina i jedan ili više CDR-ova koji suštinski imaju aminokiselinsku sekvencu iz ne-humanog imunoglobulina. Ova ne-humana aminokiselinska sekvenca često se naziva "import" sekvenca i tipično se uzima iz domena "import" antitela, naročito varijabilnog domena. Generalno, humanizovano antitelo uključuje najmanje CDR-ove ili HVL-ove ne-humanog antitela, smeštene između FR-ova humanog varijabilnog domena teškog ili lakog lanca. Ovaj pronalazak opisuje specifična humanizovana anti-CD40 antitela koja sadrže CDR-ove izvedene iz mišjih monoklonalnih antitela prikazane u Tabelama 3 i 4 smeštene između FR-ova humane embrionske sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca. Podrazumeva se da određeni mišji FR ostaci mogu biti značajni za funkciju humanizovanog antitela te su prema tome, određeni ostaci varijabilnih domena teškog i lakog lanca humane embrionske sekvence modifikovani da budu isti kao oni koji odgovaraju mišjoj sekvenci.

[0108] U još jednom aspektu, humanizovano anti-CD40 antitelo obuhvata suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena (kao što je sadržano, na primer, u Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, i Fv fragmentima) u kojima svi, ili suštinski svi, od CDR-ova odgovaraju onim od ne-humanog imunoglobulina, i specifično, svi od CDR-ova su mišje sekvence kakve su navedene u Tabelama 1 do 4 u nastavku i svi, ili suštinski svi, od FR-ova su oni od humane imunoglobulinske konsenzus ili embrionske sekvence. U još jednom aspektu, humanizovano anti-CD40 antitelo takođe uključuje najmanje deo imunoglobulinskog Fc regiona, tipično onog humanog imunoglobulina. Obično, antitelo sadrži i varijabilni domen lakog lanca kao i teškog lanca. Antitelo takođe može da uključuje jedan ili više CH1, zglobnih, CH2, CH3, i/ili CH4regiona teškog lanca, kada je pogodno.

[0109] Humanizovano anti-CD40 antitelo može biti odabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Na primer, konstantan domen može biti komplement fiksirajući konstantan domen u kojem je poželjno da humanizovano antitelo pokazuje citotoksičnu aktivnost, a izotip je tipično IgG1. Tamo gde takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantan domen može biti drugog izotipa, npr., IgG2. Alternativno humanizovano anti-CD40 antitelo može da obuhvata sekvence iz više od jedne imunoglobulinske klase ili izotipa, a odabir određenog konstantnog domena radi optimizovanja željene efektorske funkcije je unutar uobičajenih sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti. U specifičnim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su IgG1 antitela a poželjnije, IgG1 antitela u kojima postoji nokaut efektorske funkcije.

[0110] FR-ovi i CDR-ovi, ili HVL-ovi, humanizovanog anti-CD40 antitela ne moraju precizno da odgovaraju roditeljskim sekvencama. Na primer, jedan ili više ostataka u import CDR, ili HVL, ili konsenzus ili embrionskoj FR sekvenci mogu biti izmenjeni (npr., mutagenizovani) supstitucijom, umetanjem, brisanjem tako da dobijeni aminokiselinski ostatak više nije identičan originalnom ostatku u odgovarajućem položaju u bilo kojoj roditeljskoj sekvenci, već antitelo zadržava funkciju vezivanja za CD40. Takva izmena tipično neće biti obimna, a to će biti konzervativne promene. Obično, najmanje 75% ostataka humanizovanog antitela odgovaraće onim roditeljske konsenzus ili embrionske FR i import CDR sekvence, češće najmanje 90%, i najčešće više od 95%, ili više od 98% ili više od 99%.

[0111] Imunoglobulinski ostaci koji utiču na prostor između varijabilnih regiona teških i lakih lanaca ("VL-VHprostor") su oni koji utiču na blizinu ili orijentaciju dva lanca u odnosu na jedan na drugi. Određeni ostaci koji mogu biti uključeni u međulančane interakcije uključuju VLostatke 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, i 98 i VHostatke 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, i 103 (koristeći numerički sistem naveden u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). U.S. Pat. Br. 6,407,213 takođe opisuje ostatke kao što su VLostaci 43 i 85, a VHostaci 43 i 60 takođe mogu biti uključeni u ovu interakciju. Tako iako su ovi ostaci indikovani samo za humani IgG, mogu se primeniti i na druge vrste. Značajni ostaci antitela za koje se razumno očekuje da su uključeni međulančane interakcije su odabrani za supstituciju u konsenzus sekvenci.

[0112] Izrazi "konsenzus sekvenca" i "konsenzus antitelo" odnose se na aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata najčešće javljajući aminokiselinski ostatak na svakoj lokaciji u svim imunoglobulinima određene klase, izotipa, ili podjedinične strukture, npr., humani imunoglobulinski varijabilni domen. Konsenzus sekvenca može biti na osnovu imunoglobulina određenih vrsta ili mnogih vrsta. "Konsenzus" sekvenca, struktura, ili antitelo podrazumeva se da obuhvata konsenzus humanu sekvencu kakva je opisana u određenim primerima izvođenja, i koje se odnose na aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata najčešće javljajuće aminokiselinske ostatke na svakoj lokaciji u svim humanim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa,

2

ili podjedinične strukture. Tako, konsenzus sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima na svakom položaju aminokiselinu koja je prisutna u jednom ili više poznatih imunoglobulina, ali koja ne može tačno duplirati celu aminokiselinsku sekvencu iz bilo kojeg imunoglobulina. Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona ne dobija se iz bilo kojeg prirordno proizvedenog antitela ili imunoglobulina. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., i njihove varijante. FR-ovi konsenzus sekvenci teškog i lakog lanca, i njihove varijante, obezbeđuju korisne sekvence za pripremanje humanizovanog anti-CD40 antitela. Videti, na primer, U.S. Pat. Br. 6,037,454 i 6,054,297.

[0113] Humane embrionske sekvence prirodno se nalaze u ljudskoj populaciji. Kombinacija ovih embrionskih gena generiše raznolikost antitela. Sekvence embrionskog antitela za laki lanac antitela dolaze od konzervativnih humanih embrionskih kapa ili lambda v-gena i j-gena. Slično sekvence teškog lanca dolaze od embrionskih v-, d- i j-gena (LeFranc, M-P, i LeFranc, G, "The Imunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).

[0114] Kako se ovde koristi, "varijanta", "anti-CD40 varijanta", "varijanta humanizovanog anti-CD40", ili "varijanta humanizovanog anti-CD40" svaki se odnosi na humanizovano anti-CD40 antitelo koje ima najmanje varijabilni mišji CDR teškog lanca iz bilo koje sekvence iz SEQ ID NO: 1 do 4 ili mišju CDR sekvencu lakog lanca izvedenu iz mišjeg monoklonalnog antitela kako je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO:5 do SEQ ID NO:8 i FR sekvence izvedene iz humanih konsenzus sekvenci. Varijante uključuju one sa jednom ili više aminokiselinskih promena u jednom ili oba varijabilna domena i lakog i teškog lanca, pod uslovom da aminokiselinska promena suštinski ne umanjuje vezivanje antitela za CD40. Primerna humanizovana antitela proizvedena ovde uključuju ona označena kao antitelo A, antitelo B i antitelo C, a razne sekvence teškog i lakog lanca istih prikazane su u SEQ ID NO 26 do SEQ ID NO:40.

[0115] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili izolovano iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Komponente onečišćenja prirodnog okruženja antitela su oni materijali koji mogu uticati na dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela, i mogu biti enzimi, hormoni, ili drugi proteinski ili neproteinski rastvori. U jednom aspektu, antitelo je prečišćeno do najmanje više od 95% izolacije po masi antitela.

[0116] Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije u kojoj je proizvedeno, budući da najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela nije prisutna. Međutim, obično izolovano antitelo biće pripremljeno najmanje jednom fazom prečišćavanja u kojoj se uklanja materijal rekombinantnih ćelija.

[0117] Izraz "performanse antitela" odnosi se na faktore koji doprinose da antitelo prepozna antigen ili efikasnost antitela in vivo. Promene u aminokiselinskoj sekvenci iz antitela mogu da utiču na osobine antitela kao što je sklapanje, i može da utiče na fizičke faktore kao što je inicijalna brzina vezivanja antitela za antigen (ka), konstanta disocijacije antitela od antigena (kd), konstanta afiniteta antitela za antigen (Kd), konfortacija antitela, proteinska stabilnost, i polu-život antitela.

[0118] Izraz "epitopno označavanje" kada se ovde koristi, odnosi se na anti-CD40 antitelo spojeno za neku "epitopnu oznaku". "Epitopna oznaka" je polipeptid koji ima dovoljan broj aminokiselina da obezbedi epitop za proizvodnje antitela, ali je konstruisana tako da se ne meša u željenu aktivnost humanizovanog anti-CD40 antitela. Epitopska oznaka obično je dovoljno unikatna tako da antitelo podignuto protiv epitopne oznake se suštinski ne umrežava sa drugim epitopima. Pogodni polipeptidi za označavanje generalno sadrže najmanje 6 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže oko 8 do 50 aminokiselinskih ostataka, ili oko 9 do 30 ostataka. Primeri epitopnih oznaka i antitela koje se vezuje za epitop uključuju HA polipeptinu oznaku gripa i njeno antitelo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; c-myc oznaku i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 u njima sadržana antitela (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol.

5(12):3610-3616; i glikoproteinsku oznaku D Herpes simpleks virusa (gD) i njeno antitelo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). U određenim primerima izvođenja, epitopna oznaka je "epitop vezivanja receptora spasavanja". Kako se ovde koristi, izraz "epitop vezivanja receptora spasavanja" odnosi se na epitope Fc regiona IgG molekula (kao što je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4) koji je odgovoran za in vivo povećavanje serumskog polu-života IgG molekula.

[0119] U nekim primerima izvođenja, antitela ovog pronalaska mogu biti konjugovana sa citotoksičnim agensima. To je bilo koja supstanca koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva razaranje ćelija. Izraz je namenjen da uključi radioaktivne izotope (kao što je I<131>, I<125>, Y<90>, i Re<186>), hemoterapijske agense, i toksine kao što su enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, i njihovi fragmenti. Takvi citotoksični agensi mogu

2

se kuplovati sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska upotrebom standarnih procedura, i koristiti, na primer, za tretiranje pacijenta koji je indikovan za terapiju antitelom.

[0120] "Hemoterapijski agens" je hemijsko jedinjenje korisno u tretmanu kancera. Postoje mnogi primeri hemoterapijskih agenasa koji mogu biti konjugovani sa terapeutskim antitelima ovog pronalaska. Primeri takvih hemoterapijskih agenasa uključuju alkilirajuće agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkilni sulfonati kao što je busulfan, improsulfan, i piposulfan; aziridini kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa, i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid, i trimetilolomelamin; acetogenini (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove adozelesin, karzelesin, i bizelesin sintetičke analoge); kriptoficini (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin, auristatini, (uključujući analoge monometil-auristatin E i monometil-auristatin F); duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotni iperiti kao što je hlorambucil, hlomafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembikin, fenestarin, prednimustin; trofosfamid, uramustin; nitozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su enedinski antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kalihemicin gama1I i kaliheamicin phiI1, videti na primer, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezani hromoproteinski enedinski antibiotski hromomofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (Adriamicin™) (uključujući morfolinodoksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, i deoksidoksorubicin), epirubucin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što je mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analog folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tiogvanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadranali kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljači folne kiseline kao što je

2

frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksat; defofamin; demokolcin; diazikvon; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtanzinoidi kao što je majtanzin i anzamitocini; mitogvazon, mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; podofilina kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitabronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr., paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin (Gemzar™); 6-tiogvanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin Navelbine™); novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; topoizomeraza inhibitor RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivati bilo kojeg od navedenog. U ovu definicuju takođe su uključeni anti-hormonalni agensi koji deluju u cilju regulisanja ili inhibiranja hormonske aktivnosti na tumorima kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori estrogenskog receptora (SERM-ovi), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući Nolvadex™), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i toremifen (Fareston™); aromataza inhibitori koji inhibiraju enzim aromataze, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (Megace™), eksemestan, formestan, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™), i anastrozol (Arimidex™); i anti-androgeni kao što je flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivati bilo kojeg od navedenog. Bilo koji ili više od ovih agenasa mogu se konjugovati sa humanizovanim antitelom ovog pronalaska kako bi se obezbedio koristan terapeutski agens za tretman raznih poremećaje.

[0121] Antitela takođe mogu biti konjugovana za prolekove. "Prolek" je prekursor ili derivativni oblik farmaceutski aktivne supstance koji je manje citotoksičan za ćelije tumora u poređenju sa roditeljskim lekom i sposoban je da se enzimatski aktivira ili konvertuje u aktivniji oblik. Videti, na primer, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemoterapy", In Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615th Meeting Belfast i Stella et al., 1985, "Prodrugs: A

2

Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), str.247-267, Humana Press. Korisni prolekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, prolekove koji sadrže fosfat, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat prolekove koji sadrže peptid, D-aminokiselinski-modifikovane prolekove, glikozilirane prolekove, prolekove koji sadrže β-laktam, prolekove koji sadrže opciono suptituisan fenoksiacetamid, i prolekove koji sadrže opciono suptituisan fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridinske prolekove koji se mogu konvertovati u aktivniji lek bez citotoksina. Primeri citotoksičnih lekova koji se mogu izvesti u oblik proleka uključuju, ali nisu ograničeni na prethodno opisane hemoterapijske agense.

[0122] Za dijagnostičke kao i svrhe terapeutskog praćenja, antitela ovog pronalaska takođe mogu biti konjugovana sa oznakom, bilo samom oznakom ili oznakom i dodatnim drugim agensom (prolek, hemoterapijski agens i slično). Oznaka, kako se razlikuje od drugih agenasa odnosi se na agens koji je detektabilno jedinjenje ili kompozicija i može biti konjugovana direktno ili indirektno za humanizovano antitelo ovog pronalaska. Sama oznaka može biti detektabilna (npr., radioizotopne oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimatske oznake, može katalizovati hemijsku izmenu supstratnog jedinjenja ili kompozicije koja je detektabilna. Obeleženo humanizovano anti-CD40 antitelo može se pripremiti i koristiti u raznim primenama uključujući in vitro i in vivo dijagnostike.

[0123] Antitela ovog pronalaska mogu biti formulisana kao deo lipozomalne pripreme radi njihove efektne dostave in vivo. "Lipozom" je mali mehur sačinjen od raznih tipova lipida, fosfolipida, i/ili surfaktanta. Lipozomi su korisni za dostavu, sisaru, jedinjenja ili formulacije, kao što je ovde opisano humanizovano anti- CD40 antitelo, opciono, kuplovano sa ili u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski aktivnih agenasa i/ili oznaka. Komponente lipozoma uobičajeno su organizovane u dvoslojnu formaciju, slično lipidnoj organizaciji bioloških membrana.

[0124] Određeni aspekti ovog pronalaska odnose se na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više domena humanizovanog antitela ovog pronalaska. Molekul "izolovane" nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminantnog molekula nukleinske kiseline sa kojim je uobičajeno povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Molekul izolovane nukleinske kiseline razlikuje se od molekula nukleinske kiseline budući da postoji u prirodnim ćelijama.

2

[0125] U raznim aspektima ovog pronalaska jedan ili više domena humanizovanog antitela biće rekombinantno eksprimirani. Takva rekombinantna ekspresija može uključiti jednu ili više kontrolnih sekvenci, tj., polinukleotidnih sekvenci potrebnih za ekspresiju radno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence pogodne za upotrebu u prokariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotorike, operatorske, i sekvence ribozomskog mesta vezivanja. Eukariotske kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, promotore, poliadenilacione signale, i pojačivače. Ove kontrolne sekvence mogu se koristiti za ekspresiju i proizvodnju humanizovanog anti-CD40 antitela u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćinima.

[0126] Sekvenca nukleinske kiseline "operativno je povezana" kada je smeštena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, predsekvenca nukleinske kiseline ili sekrecioni lider operativno je povezan za nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid ukoliko se eksprimira kao predprotein koji učestvuje u lučenju polipeptida; promotor ili pojačivač operativno je povezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko utiče na transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma operativno je povezano sa kodirajućom sekvencom ukoliko je smešten tako da olakšava translaciju. Generalno, "operativno povezan" znači da su povezane DNK sekvence naspramne, i, u slučaju sekrecionog lidera, naspramne i u okviru čitanja. Međutim, pojačivači su opciono naspramni. Vezivanje se može postići ligacijom na pogodnim mestima restrikcije. Ukoliko takva mesta ne postoje, mogu se koristiti sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri.

[0127] Kako se ovde koristi, izrazi "ćelija", "ćelijska linija", i "ćelijska kultura" koriste se naizmenično i sve takve oznake uključuju njihovo potomstvo. Tako, "transformanti" i "transformirane ćelije" uključuju primarnu ćeliju subjekta i kulture izvedene od nje bez obzira na broj transfera.

[0128] Izraz "sisar" u cilju tretmana odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući ljude, domaće i životinje sa farme, i životinje iz zoološkog vrta, sportske životinje i ljubimci, kao što su psi, konji, mačke, krave, i slično. Poželjno, sisar je čovek.

[0129] "Poremećaj", kako se ovde koristi, predstavlja bilo koje stanje koje se može poboljšati tretmanom ovde opisanim humanizovanim anti-CD40 antitelom. On uključuje hronične i akutne

2

poremećaje ili bolesti uključujući i ona patološka stanja koja stavljaju sisara u sitaciju da ima predispozicije za poremećaj o kome je reč. Neograničavajući primeri ili poremećaji koji se tretiraju obuhvataju kancer, hematološke malignitete, benigne i maligne tumore, leukemije i limfoidne malignitete i zapaljenske, angiogenske, autoimune i imunološke poremećaje.

[0130] Izrazi "kancer" i "kancerogeni" odnose se na ili opisuju fiziološka stanja kod sisara koja su tipično okarakterisana neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju.

[0131] Kako se ovde koristi, izraz "CD40-povezani poremećaj" ili "CD40-povezana bolest" odnosi se na stanje u kojem je indikovana modifikacija ili eliminacija ćelija koje eksprimiraju CD40. One uključuju CD40-eksprimirajuće ćelije koje pokazuju abnormalnu proliferaciju ili CD40-eksprimirajuće ćelije koje su povezane sa kancerogenim ili malignim rastom. Određeniji primeri kancera koji pokazuju abnormalnu ekspresiju CD40 antigena uključuju B limfoblastoidne ćelije, Burkitov limfom, multipli mijelom, Limfom T ćelija, Kaposijev sarkom, osteosarkom, epidermalne i endotelijalne tumore, kancere pankresa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, glave i vrata, kože (melanom), bešike, i bubrega. Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničene na, leukemije, limfome, uključujući B ćelijski limfom i Ne-Hodžkinov limfom, multipli mijelom, Valdenstromovu makroglobulinemiju; čvrste tumore, uključujući sarkome, kao što je osteosarkom, Evingov sarkom, maligni melanom, adenokarcinom, uključujući adenokarcinom jajnika, Kaposijev sarkom/Kaposijev tumor i karcinom skvamoznih ćelija.

[0132] CD40-povezan poremećaj takođe uključuje bolesti i poremećaje imunog sistema, kao što su autoimuni poremećaji i zapaljenski poremećaji. Takva stanja uključuju, ali nisu ograničena na, reumatoidni artritis (RA), sistemski lupus eritematozus (SLE), sklerodermu, Sjogrenov sindrom, multiplu sklerozu, psorijazu, zapaljensku bolest creva (npr., ulcerativni kolitis i Kronova bolest), zapaljenje pluća, astmu, i idiopatsku trombocitopetičnu purpuru (ITP).

[0133] Izraz "zaustaviti rast" ili "inhibiranje rasta" kada se ovde koristi odnosi se na inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija, naročito neoplastičnih ćelija tipa koje eksprimiraju CD40 antigen. Tako, inhibicija rasta, na primer, značajno redukuje procenat neoplastičnih ćelija u S fazi.

[0134] Izraz "intravenozna infuzija" odnosi se na uvođenje agensa u venu životinje ili humanog pacijenta tokom vremena dužeg od približno 15 minuta, generalno između približno 30 do 90 minuta.

[0135] Izraz "intravenozni bolus" ili "intravenozno ubrizgavanje" odnosi se na davanje leka u venu životinje ili čoveka tako da telo prima lek tokom približno 15 minuta ili manje, generalno 5 minuta ili manje.

[0136] Izraz "subkutano davanje" odnosi se na uvođenje agensa pod kožu životinjskog ili humanog pacijenta, poželjno unutar džepa između kože i tkiva koje se nalazi ispod nje, relativno sporom, produženom dostavom iz posude leka. Stiskanje ili povlačenje kože od tkiva može stvoriti džep.

[0137] Izraz "subkutana infuzija" odnosi se na uvođenje leka pod kožu životinjskog ili humanog pacijenta, poželjno unutar džepa između kože i tkiva koje se nalazi ispod nje, relativno sporom, produženom dostavom iz posude leka tokom odreženog vremenskog perioda uključujući, ali ne ograničavajući se na, 30 minuta ili manje, ili 90 minuta ili manje. Opciono, infuzija se može izvesti subkutanim implantiranjem pumpe za dostavu leka umetnute između kože životinjskog ili humanog pacijenta, pri čemu pumpa dostavlja prethodno određenu količinu leka tokom prethodno određenom vremenskog perioda, kao što je 30 minuta, 90 minuta, ili vremenski period koji obuhvata dužinu tretmanskog režima.

[0138] Izraz "subkutani bolus" odnosi se davanje leka ispod kože životinjskog ili humanog pacijenta, pri čemu dostava bolus injektovanjem traje manje od približno 15 minuta; u još jednom aspektu, manje od 5 minuta, i u još jednom aspektu, manje od 60 sekundi. U još jednom aspekt,u davanje je unutar džepa između kože i tkiva koje se nalazi ispod nje, pri čemu se džep može stvoriti stiskanjem ili povlačenjem kože od tkiva.

[0139] Izraz "terapeutski efektivna količina" koristi se tako da se odnosi na količinu aktivnog agensa koja olakšava ili ublažava jedan ili više simptoma poremećaja koji se tretira. Da bi se to postiglo, potrebna je da ta količina ima dobar ishod pacijenta, efekat zaustavljanja rasta ili da izaziva brisanje ćelije. U jednom aspektu, terapeutski efektivna količina ima aktivnost apoptoze, ili da je sposobna da indukuje ćelijsku smrt. U još jednom aspektu, terapeutski efektivna količina odnosi se na ciljanu koncentraciju u serumu za koju se pokazalo da je efektivna u, na primer, usporavanju progresije bolesti. Efikasnost se može izmeriti uobičajenim načinima, u zavisnosti

1

od stanja koje se tretira. Na primer, kod neoplastičnih bolesti ili poremećaja koji su okarakterisani ćelijama koje eksprimiraju CD40, efikasnost se može meriti procenjivanjem vremena do progresije bolesti, ili određivanjem brzina odgovora.

[0140] Izrazi "tretman" i "terapija" i slično, kako se ovde koristi, namenjeni su da uključuju terapeutske kao i profilaktičke, ili suzbijajuće mere ta bolest ili poremećaj koje vode ka bilo kom klinički poželjnom ili dobrobitnom efektu, uključujući, ali ne ograničavajući se na ublažavanje ili olakšanje jednog ili više simptoma, nazadovanje, usporavanje ili ukidanje progresije te bolesti ili poremećaja. Tako, na primer, izraz tretman uključuje davanje agensa pre ili nakon započinjanja simptoma bolesti ili poremećaja čme se sprečava ili ukljanja jedan ili više znakova bolesti ili poremećaja. Kao još jedan primer, izraz uključuje davanje agensa nakon kliničke manifestacije bolesti radi pobeđivanja simptoma bolesti. Dalje, davanje agensa nakon započinjanja kliničkih simptoma razvijeno je gde davanje utiče na kliničke parametre bolesti ili poremećaja, kao što je stepen povrede tkiva ili količina ili proširenost metastaza, bilo tretman vodi ili ne vodi ka ublažavanju bolesti, obuhvata "tretman" ili "terapiju" kako se ovde koristi. Štaviše, dokle god kompozicije ovog pronalaska bilo same bilo u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom olakšavaju ili poboljšavaju najmanje jedan simptom poremećaja koji se tretira u poređenju sa simptomom u odsustvu upotrebe kompozicije humanizovanog CD40 antitela, rezultat bi trebalo da se smatra efektivnim tretmanom osnovnog poremećaja bez obzira da li se svi simptomi poremećaja ublažavaju ili ne.

[0141] Izraz "uputstva" koristi se za instrukcije koje su uobičajeno uključene u komercijalna pakovanja teraputskih proizvoda, koje sadrže informaciju o indikacijama, upotrebi, davanjima, kontraindikacijama i/ili upozorenjima koja se tiču upotrebe takvih terapeutskih proizvoda.

Antitela

[0142] Ovde su opisana i uključena humanizovana anti-CD40 antitela, i kompozicije i predmeti proizvodnje koji obuhvataju jedno ili više humanizovanih anti-CD40 antitela ovog pronalaska. Takođe su opisani agensi vezivanja koji uključuju antigen-vezujući fragment humanizovanog anti-CD40 antitela. Humanizovana anti-CD40 antitela i agensi vezivanja mogu zaustaviti rast ćelija, izazvati brisanje ćelija koje eksprimiraju CD40 ili drugačije indukovati ili izazvati citotoksični ili citostatični efekat na ciljanim ćelijama. Humanizovana anti-CD40 antitela i agensi vezivanja mogu se iskoristiti u tretmanu različitih bolesti ili poremećaja okarakterisani proliferacijom ćelija koje eksprimiraju CD40 površinski antigen. Humanizovano anti-CD40

2

antitelo i CD40 agens vezivanja svaki uključuje najmanje deo koji specifično prepoznaje CD40 epitop (tj., antigen-vezujući fragment).

[0143] U prvobitnoj karakterizaciji, mišja antitela odabrana su na osnovu karakterizacije CD40 vezivanja.

[0144] Iz ovih prvobitnih ispitivanja, mišja antitela odabrana su da imaju nakon varijabilnih regiona teškog lanca prikazanih u Tabeli 1 i varijabilne regione lakog lanca prikazane u Tabeli 2:

Tabela 1: CD40 Mišje vodeće - VH Sekvence

[0145] Sekvence humanog okvira odabrane su za svaku od mišjih vodilja na osnovu homologije okvira, CDR strukture, očuvanih kanonskih ostataka, očuvanih ostataka prostora pakovanja i drugih parametara.

[0146] Mišji CDR-ovi teškog lanca i lakog lanca raznih mišjih antitela odabranih antitela prikazani su u Tabeli 3 i Tabeli 4, respektivno:

Tabela 3:

CDR sekvence TEŠKOG LANCA

4

H-CDR1 naveden gore koristi sekvencu koja koristi Chothia numerički sistem (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948). Kabatov numerički sistem za sekvence označen je podebljanim italizovanim tekstom, a IMGT numeracija pokazana je podvučenim tekstom ostataka u prethodnoj tabeli za CDR1 i CDR2. Sekvence za H-CDR3 za svaki od 2H11, 10F2 i 19B10 je TTSYYVGTYGY (SEQ ID NO:77) i za 20E2 je ARQDGYRYAMDY (SEQ ID NO:78).

Tabela 4:

CDR sekvence LAKOG LANCA

Ponovo, Chothia numerički sistem koristi se u Tabeli 4 sa Kabatovim numeričkim sistemom za sekvence koje su označene zadebljanim italizovanim tekstom, a IMGT numerički sistem prikazan je podvučenim tekstom.

[0147] Fab-ovi koji pokazuju bolje ili jednako vezivanje u poređenju sa himernim roditeljskim Fab-om, odabrani su za konverziju u IgG. Klonovi iz 20E2 serija konvertovani su u dva različita IgG formata: a) lgG4DM (dvostruki mutant) ima dve mutacije u Fc / region zgloba, Ser228Pro koji redukuje polu-molekulsku formaciju i Leu235Glu koji dalje redukuje FcγR vezivanje. b) IgG1KO (nokaut efektorske funkcije) ima dve mutacije u Fc regionu, Leu234Ala i Leu235Ala, koje redukuju efektorsku funkciju kao što je FcγR i komplement vezivanja. Oba IgG formata opisani su u literaturi. Primer 1 opisuje humanizaciju tri kandidata u više detalja. Rezultati takvih humanizacija rezultiraju sekvencom humanizovanog antitela, koja ima sekvence teškog lanca i lakog lanca prikazane u nastavku:

[0148] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo može, na primer, blokirati proliferaciju ili drugačije zaustaviti rast ćelije ili izazvati njeno trošenje, smrt, ili njeno drugačije brisanje, na primer, putem vezivanja CD40 površinskog antigena. Na primer, u T i B ćelijskom malignitetu, anti-tumor efekti (npr., zaustavljanje rasta sa ili bez ćelijskog brisanja ili apoptoze) često se dobijaju kada su maligne ćelije izložene stimulansu koji vodi ka aktivaciji normalnih limfocita. Ovo aktivacijom-indukovano zaustavljanje rasta posmatrano je sa signalima putem ili antigen receptora ili kostimulatornih receptora (videti, npr., Ashwell et al., 1987, Science 237:61; Bridges et al., 1987, J. Imunol.139:4242; Page i Defranco, 1988, J. Imunol. 140:3717; i Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501). CD40 stimulacija, kao rezultat specifičnog vezivanja bilo antitelom ili rastvorljivim ligandom, inhibira rast B ćelijskog limfoma (videti, npr., Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794). Agensi koji inhibiraju rast malignih ćelija na ovaj način koji su usmereni direktno protiv CD40 površinskog antigena, predstavljaju primere poželjnih agenasa.

[0149] CD40 specifični agensi uključuju antigen-vezujući fragment humanizovanog anti-CD40 antitela koji se vezuje za CD40 (npr., humani CD40 ili njegova varijanta). CD40 specifični agensi i antitela mogu se opciono konjugovati sa ili spojiti sa citotoksičnim ili hemoterapijskim agensom. U aspektima u kojima se humanizovano antitelo vezuje za CD40 površinski antigen i izaziva trošenje vrsta ćelija koje eksprimiraju CD40, vezivanje je generalno okarakterisano vraćanjem u ćeliju CD40 površinskog antigena in vivo. Pogodni agensi vezivanja vezuju CD40 antigen sa dovoljnim afinitetom i/ili naklonošću tako da je CD40 specifični agens korisan kao terapeutski agens specifičnim ciljanjem ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0150] U nekim aspektima, humanizovano antitelo smanjuje vezivanje CD40 liganda sa CD40 za najmanje 45%, za najmanje 50%, za najmanje 60% ili za najmanje 75% ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95%.

[0151] Humanizovana anti-CD40 antitela koja su ovde opisana, obuhvataju aminokiselinsku sekvencu iz ostataka koji su izvedeni iz antitela A (nije u skladu sa pronalaskom: sekvenca teškog lanca = SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29 ili SEQ ID NO:30; sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:26), antitela B (u skladu sa pronalaskom izuzev za SEQ ID NO:34: sekvenca teškog lanca = SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 34; ili SEQ ID NO:35; sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:31) i antitela C (nije u skladu sa pronalaskom: sekvenca

4

teškog lanca = SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 ili SEQ ID NO:40; sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:36) sa CDR-ovima opisanih u tekstu iznad i aminokiselinskih ostataka izvedenih iz regiona okvira humanog imunoglobulina. Humanizovana anti-CD40 antitela opciono uključuju specifične aminokiselinske supstitucije u konsenzus ili embrionskim regionima okvira.

[0152] Specifična supstitucija aminokiselinskih ostataka u ovim položajima okvira može da poboljša razne aspekte performansi antitela uključujući afinitet i/ili stabilnost vezivanja, pored toga pokazano u humanizovanom antitelu obrazovanom "direktnom zamenom" CDR-ova ili HVL-ova u humane embrionske regione okvira, kako je prikazano u donjim primerima.

[0153] Ovde su takođe opisana monoklonalna antitela sa sekvencama teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:4 i sekvencama lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO:5 do SEQ ID NO:8 (videti Tabele 1 i 2 iznad). CDR sekvence ovih mišjih antitela prikazane su u Tabelama 3 i 4 smeštajući takve CDR-ove u FR-ove humanih konsenzus varijabilnih domena teškog i lakog lanca koji daju korisna humanizovana antitela ovog pronalaska.

[0154] Humanizovana anti-CD40 antitela opisana ovde obuhvataju najmanje varijabilni domen teškog ili lakog lanca koji obuhvata CDR-ove ili HVL-ove mišjih monoklonalna antitela kako je prikazano u Tabelama 1 do 4 iznad i FR-ove humanih embrionskih varijabilnih domena teškog i lakog lanca. Humanizovana antitela pripremljena ovde su: antitelo A, antitelo B i antitelo C i razne sekvence teškog i lakog lanca istog prikazane su u SEQ ID NOs (SEK ID BROJEVIMA):26 do SEQ ID NO:40.

[0155] U specifičnim primerima izvođenja, razmatrana su antitela koja imaju sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO SEQ ID NO:35, u kombinaciji sa sekvencom lakog lanca iz SEQ ID NO:31.

[0156] CDR-ovi ovih sekvenci prikazani su u Tabelama 3 i 4. Razmatrano je da himerna antitela sa zamenjenim CDR regionima (tj., na primer zamena jednog ili dva CDR-a antitela A sa analozima CDR Antitela C) između ovih primernih imunoglobulina takođe mogu dati korisna antitela.

[0157] Ovde je takođe opisano da je humanizovano anti-CD40 antitelo fragment antitela. Razni fragmenti antitela generalno su opisani iznad i postoje tehnike koje su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela. Fragmenti se mogu izvesti putem proteolitičke digestije netaktnutog antitela (videti, npr., Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; i Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativno, fragmenti se mogu proizvesti direktno u rekombinantnim ćelijama domaćinima. Na primer, Fab'-SH fragmenti mogu se direktno izolovati iz E. coli i hemijski kuplovati radi obrazovanja F(ab')2fragmenata (videti, npr., Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Drugim pristupom, F(ab')2fragmenti mogu biti izolovani direktno iz kulture rekombinantnih ćelija domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela očigledne su stručnjaku.

[0158] U nekim primerima izvođenja, antitelo uključuje konstantan region koji posreduje efektorsku funkciju. Konstantan region može da obezbedi odgovore antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC), antitelo-zavisne ćelijske fagocitoze (ADCP) i/ili komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC) protiv CD40-eksprimirajuće ciljane ćelije. Efektorski domen(i) može biti, na primer, Fc region lg molekula. Tipično, CD40 agens vezivanja regrutuje i/ili aktivira citotoksična bela krvna zrnca (npr., prirodne ubijajuće (NK) ćelije, fagocitotilne ćelije (npr., makrofage), i/ili serum komplementne komponente).

[0159] Efektorski domen nekog antitela može biti od bilo koje pogodne životinjske vrste i izotipa kičmenjaka. Izotipovi iz različitih životinjskih vrsta razlikuju se u sposobnosti da posreduju efektorske funkcije. Na primer, sposobnost humanog imunoglobulina da posreduje CDC i ADCC/ADCP generalno je redosleda IgM≈IgG1≈IgG3>IgG2>IgG4i IgG1≈IgG3>IgG2/IgM/IgG4, respektivno. Mišji imunoglobulini posreduju CDC i ADCC/ADCP generalno redosledom mišjeg IgM≈IgG3>>IgG2b>IgG2a>>IgG1i IgG2b>IgG2a>IgG1>>IgG3, respektivno. U još jednom primeru, mišji IgG2aposreduje ADCC dok i mišji IgG2ai IgM posreduju CDC.

Modifikacije Antitela

[0160] Humanizovana anti-CD40 antitela i agensi mogu da uključe modifikacije humanizovanog anti-CD40 antitela. Na primer, može biti poželjno modifikovati antitelo u odnosu na efektorsku funkciju, tako da pojača efektivnost antitela u tretiranju kancera. Jedna takva modifikacija je uvođenje cisteinskog ostatka(aka) u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo poseduje poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano komplementomposredovano ubijanje ćelija i/ili antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). Videti, na primer, Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; i Shopes, 1992, J. Imunol. 148:2918-2922. Homodimerna antitela koja imaju pojačanu anti-tumorsku aktivnost takođe se mogu pripremiti primenom heterobifunkcionalnih umreživača kako je opisano od strane Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativno, antitelo može biti konstruisano da sadrži dvostruke Fc regione, ojačavajući lizu komplementa i ADCC sposobnosti antitela. Videti Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.

[0161] Antitela sa poboljšanom sposobnošću za podržavanje ADCC generisana su modifikovanjem glikozilacionog šablona njihovog Fc regiona. Ovo je moguće budući da je glikozilacija antitela na asparaginskom ostatku, N297, u CH2domenu uključena u interakciju između IgG i Fcγ receptora potrebnih za ADCC. Ćelijske linije domaćini konstruisane su za eksprimiranje antitela sa izmenjenom glikozilacijom, kao što je povećani bisekcioni N-acetilglukozamin ili redukovana fukoza. Redukcija fukoze obezbeđuje veće osnaživanje u ADCC aktivnosti nego povećano prisustvo bisekcionog N-acetilglukozamina. Štaviše, osnaživanje ADCC antitelima sa niskom fukozom zavisno je od FcγRIIIa V/F polimorfizma.

[0162] Modifikujuća aminokiselinska sekvenca iz Fc regiona antitela predstavlja alternativu glikozilacionom konstruisanju radi osnaživanja ADCC. Mesto vezivanja na humanom IgG1 za Fcγ receptore određeno je obimnom mutacionom analizom. To vodi ka generisanju humanizovanog IgG1 antitela sa Fc mutacijama koje povećavaju afinitet vezivanja za FcγRIIIa i osnažuju ADCC in vitro. Dodatno, Fc varijante dobijene su mnogim različitim permutacijama karakteristika vezivanja, npr., poboljšano vezivanje za specifične FcγR receptore sa nepromenjenim ili umanjenim vezivanjem za druge FcγR receptore.

[0163] Još jedan aspekt uključuje imunokonjugate koji obuhvataju humanizovano antitelo konjugovano za citotoksični agens kao što je hemoterapijski agens, toksin (npr., enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).

[0164] Hemoterapijski agensi korisni u generisanju takvih imunokonjugata opisani su iznad. Enzimatski aktivni toksin i njegovi fragmenti koji se mogu koristiti za formiranje korisnih imunokonjugata uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, eksotoksin A lanac (od Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A

4

lanac, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantin proteini, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, trikoteceni, i slično. Razni radionuklidi dostupni su za proizvodnju radiokonjugovanih humanizovanih anti-CD40 antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re.

[0165] Konjugati humanizovanog anti-CD40 antitela i citotoksični ili hemoterapijski agens može se pripremiti poznatim postupcima, upotrebom raznih bifunkcionalnih protein kuplujućih agenasa kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunckionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), dizocijanati (kao što je toluen 2,6-dizocijanat), i jedinjenja bis-aktivnog fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može se pripremiti kako je opisan u Vitetta et al., 1987, Science 238:1098. Ugljenikom-14-obeležen 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primerni helirajući agens za konjugovanje radionukleotida za antitelo. Konjugati se takođe mogu formirati raskidivim linkerima.

[0166] U još jednom primeru izvođenja, antitelo može biti konjugovano za "receptor" (kao što je streptavidin) radi utilizacije u predtargetovanju tumora. U ovoj proceduri, antitelo-receptor konjugat daje se pacijentu, praćeno uklanjanjem nevezanog konjugata iz cirkulacije primenom agensa čišćenja, a zatim davanjem "veznika" koji selektivno vezuje receptor (npr., avidin), pri čemu je veznik konjugovan za citotoksični agens (npr., radionuklid).

[0167] Humanizovana anti-CD40 antitela opisana ovde takođe mogu biti formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo pripremljeni su postupcima poznati u struci, kao što je opisano u Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; i U.S. Pat. Br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa pojačanim vremenom cirkulacije opisani su u, na primer, U.S. Pat. Br.5,013,556.

[0168] Naročito korisni lipozomi mogu biti generisani postupkom revezno faznog isparavanja sa lipidnom kompozicijom koja obuhvata fosfatidilholin, holestarol i PEG-derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se istiskuju kroz filtere definisane veličine pora kako bi dali lipozome željenog prečnika. Fab' fragmenti nekog antitela opisani ovde mogu biti konjugovani za lipozome kako je opisano u Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288 putem disulfidne razmenjivačke reakcije. Hemoterapijski agens (kao što je doksorubicin) opciono je sadržan u lipozomu. Videti, npr., Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst.

81(19):1484.

[0169] Antitela ovde opisana i uključena takođe se mogu koristiti u ADEPT (Antitelomusmerena enzimska prolek terapija) procedurama konjugovanjem antitela za prolek-aktivirajući enzim koji konvertuje prolek (npr., peptidil hemoterapijski agens), u aktivni anti-kancer lek. Videti, na primer, WO 81/01145, WO 88/07378, i U.S. Pat. Br. 4,975,278. Enzimska komponenta imunokonjugata korisna za ADEPT je enzim sposoban za delovanje na prolek na takav način da ga konvertuje u njegov aktivniji, citotoksični oblik. Specifični enzimi koji su korisni u ADEPT uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalnu fosfatazu za konvertovanje prolekova koji sadrže fosfat u slobodne lekove; arilsulfataza za konvertovanje prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminaza za konvertovanje ne-toksičnog 5-fluorocitozina u antikancer lek, 5-fluorouracil; proteaze, kao što je serratia proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze, i katepsini (kao što je katepsini B i L), za konvertovanje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, za konvertovanje prolekova koji sadrže D-aminokiselinske supstituente; enzime koji cepaju ugljene hidrate kao što je βgalaktozidaza i neuraminidaza za konvertovanje glikoziliranih prolekove u slobodne lekove; βlaktamazu za konvertovanje lekova derivatizovanih sa β-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, za konvertovanje lekova derivatizovanih na njihovim aminskim azotima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. Alternativno, antitela sa enzimskom aktivnosti ("abzimi") mogu se koristiti da konvertuju prolekove u slobodne aktivne lekove (videti, na primer, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Antitelo-abzim konjugati mogu se pripremiti poznatim postupcima za dostavu abzima do tumor ćelijske populacije, na primer, kovalentnim vezivanjem enzima za humanizovano anti-CD40 antitelo/heterobifunckionalne umrežavajuće reagense opisani gore. Alternativno, fuzioni proteini koji obuhvataju barem region vezivanja antigena nekog antitela opisanog ovde povezan sa barem funkcionalno aktivnim delom enzima kako je prethodno opisano mogu se konstruisati primenom rekombinantnih DNK tehnika (videti, npr., Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

[0170] Kako je ovde opisano, može biti poželjno upotrebiti humanizovani fragment anti-CD40

4

antitela, pre nego netaktnuto antitelo, kako bi se povećala penetracija tumora, na primer. Može biti poželjno modifikovati fragment antitela radi povećanja njegovog serumskog polu-života. To se može postići, na primer, inkorporiranjem receptora spasavanja epitopskog vezivanja u fragment antitela. U jednom postupku, pogodan region fragmenta antitela može biti izmenjen (npr., mutiran), ili epitop može biti inkorporiran u peptidnu oznaku koja je zatim fuzionisana za fragment antitela bilo na kraju ili u sredini, na primer, DNK ili peptidnom sintezom. Videti, npr., WO 96/32478.

[0171] U određenim primerima izvođenja, kovalentne modifikacije humanizovanog anti-CD40 antitela takođe su uključene. Kovalentne modifikacije uključuju modifikaciju cisteinil ostataka, histidil ostataka, lizinil i amino-terminalnih ostataka, arginil ostataka, tirozil ostataka, karboksil bočnih grupa (aspartil ili glutamil), glutaminil i asparaginil ostataka, ili seril, ili treonil ostataka. Još jedna vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko kuplovanje glkozida za antitelo. Takve modifikacije mogu biti izvedene hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim cepanjem antitela, ukoliko je primenjivo. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela mogu se uvesti u molekul reagovanjem ciljanih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizujućim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabrani bočnim lancima ili amino- ili karboksi-terminalnim ostacima.

[0172] Uklanjanje bilo koje grupe ugljenog hidrata prisutnog u antitelu mogu se postići hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija opisana je od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i by Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzimatsko cepanje grupa ugljenih hidrata na antitelima može se postići upotrebom raznih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano u Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350.

[0173] Još jedna vrsta korisne kovalentne modifikacije obuhvata vezivanje antitela za jedan od raznih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol, polipropilen glikol, ili polioksialkileni, na način naveden u jednom ili više od U.S. Pat. Br.4,640,835, U.S. Pat. Br.4,496,689, U.S. Pat. Br.

4,301,144, U.S. Pat. Br.4,670,417, U.S. Pat. Br.4,791,192 i U.S. Pat. Br.4,179,337.

Humanizacija i varijante aminokiselinskih sekvenci

[0174] Varijante aminokiselinskih sekvenci anti-CD40 antitela mogu se pripremiti uvođenjem poželjne nukleotidne promene u DNK anti-CD40 antitela, ili peptidnom sintezom. Takve varijante uključuju, na primer, brisanja iz, i/ili umetanja u i/ili supstitucije, ostataka unutar

4

aminokiselinskih sekvenci iz anti-CD40 antitela gornjih primera. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja, i supstitucija izvodi se kako bi se postigao konačni konstrukt, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske promene takođe mogu da izmene post-translacione procese humanizovanog ili varijante anti-CD40 antitela, kao što je menjanje broja ili položaja glikozilacionih mesta.

[0175] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona anti-CD40 antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu, naziva se "alanin skenirajuća mutageneza," kako je opisano u Cunningham i Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Tu, ostatak ili grupa ciljanih ostataka je identifikovana (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni neutralnim ili negativno naelektrisanim aminokiselinama (tipično alanin) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa CD40 antigenom. Te aminokiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim se refiniširaju uvođenjem dalje ili druge varijante na, ili za, mesta supstitucije. Tako, dok je mesto uvođenja varijacije aminokiselinske sekvence prethodno određeno, priroda mutacije per se ne mora da bude prethodno određena. Na primer, kako bi se analizirale performanse mutacije na datom mestu, alaninsko skeniranje ili nasumična mutageneza sprovode se na ciljanom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante anti-CD40 antitela skeniraju se na željenu aktivnost.

[0176] Umetanja aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije koje se kreću po dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ili više ostataka, kao i umetanje intrasekvence jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetanja uključuju anti-CD40 antitelo spojeno sa epitope oznakom. Druge varijante umetanja molekula anti-CD40 antitela uključuju fuziju sa Nor C-terminus anti-CD40 antitelom enzima ili polipeptida koji povećava serumski polu-život antitela.

[0177] Još jedna vrsta varijante je varijanta aminokiselinske supstitucije. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u uklonjenom molekulu anti-CD40 antitela i različit ostatak umetnut na njegovo mesto. Mesta najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se FR alteracije takođe pominju. Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 5 pod naslovom "poželjne supstitucije". Ukoliko takve supstitucije rezultiraju u promeni u biološkoj aktivnosti, tada značajnije promene, označene kao "primerne supstitucije", ili kako je dalje opisano ispod u vezi sa aminokiselinskim klasama, mogu biti uvedene, a proizvodi skrinovani.

4

TABELA 5:

[0178] U proteinskoj hemiji, generalno je prihvaćeno da se biološke karakteristike antitela mogu postići biranjem supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u oblasti supstitucije, na primer, kao list ili namotana konfortacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) grupisanja bočnih

4

lanaca. Prirodno javljajući ostaci izvedeni su na grupama na osnovu zajedničkih karakteristika bočnih lanaca:

(1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutralno hidrofilni: cys, ser, thr;

(3) kiseli: asp, glu;

(4) bazni: asn, gin, his, lys, arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i

(6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0179] Ne-konzervativne supstitucije će podrazumevati zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.

[0180] Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje pravilne konfortacije humanizovanog ili varijante anti-CD40 antitela takođe može biti suptituisan, generalno serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula, sprečilo abnormalno umrežavanje, ili obezbedile utvrđene tačke konjugacije citotoksičnih ili citostatičnih jedinjenja. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) može se dodati antitelu radi poboljšanja njegove stabilnosti (naročito kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0181] Vrsta supstitucione varijante uključuje supstituisanje jednog ili više ostataka hipervarijabilnih regiona roditeljskog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Generalno, dobijena varijanta(e) odabrana za dalji razvoj imaće poboljšane biološke karakteristike u odnosu na roditeljsko antitelo od kog je generisano. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti je afinitet sazrevanja primenom prikaza faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr., mesta 6-7) mutirana su radi generisanja svih mogućih amino supstitucija na svakom mestu. Varijante antitela tako generisane prikazane su na monovalentan način od filamentoznih fagoznih čestica kao fuzije za gen III proizvod M13 upakovan unutar svake čestice. Varijante fagoznog prikaza zatim su skrinovane na njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja). Kako bi se identifikovala mesta kandidati hipervarijabilnih regiona za modifikaciju, može se izvesti alanin skenirajuća mutageneza kako bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji doprinose značajno vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti dobro da se analizira kristalna struktura antigen-antitelo kompleksa radi identifikovanja tački kontakta između antitela i humanog CD40. Takvi ostaci kontakta i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa tehnikama koje su ovde

4

razmatrane. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti podvrgnut je skriningu kakav je ovde opisan i antitela sa superiornim karakteristika u jednom ili više relevantnih ispitivanja mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0182] Još jedan tip aminokiselinskih varijanti antitela menja originalni glikozilacioni šablon antitela. Pod "menjanjem" misli se na brisanje jednog ili više grupa ugljenih hidrata pronađenih u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna u antitelu.

[0183] U nekim tehničkim rešenjima može biti poželjno modifikovati antitela ovog pronalaska kako bi se dodala mesta glikozilacije. Glikozilacija antitela tipično je ili N-povezana ili O-povezana. N-povezana se odnosi na pričvršćenje grupe ugljenih hidrata za bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznate za enzimsko pričvršćivanje grupe ugljenog hidrata za asparaginski bočni lanac. Tako, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu kreira potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija odnosi se na pričvršćivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidroksiaminokiseline, najuobičajenije serin ili treonin, iako 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin se takođe mogu koristiti. Tako, kako bi se glikozilovao dati protein, npr., antitelo, aminokiselinska sekvenca iz proteina konstruiše se da sadrži jednu ili više gore pomenutih tripeptidnih sekvenci (za N-povezana glikozilaciona mesta). Izmene se takođe mogu izvesti dodavanjem, ili supstituisanjem, jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka sa sekvencom originalnog antitela (za O-povezana glikozilaciona mesta).

[0184] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinskih sekvenci anti-CD40 antitela pripremljeni su raznim postupcima poznatim u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovanje iz prirodnog izvora (u slučaju prirodno javljajućih varijanti aminokiselinskih sekvenci) ili pripremanje oligonukleotid-posredovane (ili mestom-usmerene) mutageneze, PCR mutageneze, i kasetne mutageneze ranije pripremljene varijantne ili nevarijantne verzije anti-CD40 antitela.

Polinukleotidi, vektori, ćelije domaćini, i rekombinantni postupci

[0185] Ostali primeri izvođenja obuhvataju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvencu koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo, vektore, i ćelije domaćine koji obuhvataju polinukleotide, i rekombinantne tehnike za proizvodnju humanizovanog antitela. Izolovani polinukleotidi mogu da kodiraju bilo koji željeni oblik anti-CD40 antitela uključujući, na primer, monoklonalna antitela pune dužine.

[0186] Neki primeri izvođenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju antitelo sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog regiona teškog lanca iz bilo koje od SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, ili SEQ ID NO:35. Neki primeri izvođenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju antitelo sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO:31.

[0187] U jednom aspektu, izolovana polinukleotidna sekvenca(e) kodira antitelo sa varijabilnim regionom teškog lanca i varijabilnim regionom lakog lanca koje obuhvata aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom.

[0188] Polinukleotid(i) koji obuhvata sekvencu koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo ili njen lanac može biti spojen za jednu ili više regulatornih ili kontrolnih sekvenci, kako je poznato u struci, i može biti sadržan u pogodnim ekspresionim vektorima ili ćelijama domaćinima kako je poznato u struci. Svaki od polinukleotidnih molekula koji kodiraju varijabilne regione teških ili lakih lanaca mogu se nezavisno spojiti sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira konstantan domen, kao što je humani konstantan domen, omogućavajući proizvodnju netaknutog antitela. Alternativno, polinukleotidi, ili njihovi delovi, mogu se međusobno spojiti, obezbeđujući šablon za proizvodnju jednolančanog antitela.

[0189] Za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotid koji kodira antitelo umetnut je u replikacioni vektor za kloniranje (amplifikaciju DNK) ili za ekspresiju. Dostupni su mnogi pogodni vektori koji eksprimiraju rekombinantno antitelo. Vektorske komponente generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalna sekvenca, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivački element, promotor, i transkripciona terminaciona sekvenca.

[0190] Humanizovana anti-CD40 antitela takođe se mogu proizvesti kao fuzioni polipeptidi, u kojima je antitelo fuzionisano sa heterolognim polipeptidom, kao što je signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na amino terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Heterologna signalna sekvenca tipično odabrana je ona koja je prepoznata i

1

obrađena (tj., pocepan signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine koje ne prepoznaju i obrađuju signalnu sekvencu humanizovanog anti-CD40 antitela, signalna sekvenca može biti suptituisana prokariotskom signalnom sekvencom. Signalna sekvenca može biti, na primer, alkalna fosfataza, penicilinaza, lipoprotein, toplotno stabilni enterotoksin II lideri, i slično. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti suptituisana, na primer, lider sekvencom dobijenom od alfa-faktora invertaze kvasca (uključujući Saccharomyces i Kluyveromyces α-faktor lidere), kiselom fosfatazom, C. albicans glukoamilazom, ili signalom opisanim u WO90/13646. U ćelijama sisara, signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simpleks gD signal, mogu se koristiti. DNK za takav prekursorski region povezan je u okviru čitanja sa DNK koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo.

[0191] Ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava da se vektor replikuje u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, kod klonirajućih vektora ova sekvenca je ona koja omogućava da se vektor replikuje nezavisno od domaćinske hromozomne DNK, i uključuje porekla replikacionih ili autonomno replicirajućih sekvenci. Takve sekvence dobro su poznate za različite bakterije, kvasac, i viruse. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 pogodno je za većinu Gram-negativnih bakterija, 2-υ. poreklo plazmida pogodno je za kvasac, a razna virusna porekla (SV40, polioma, adenovirus, VSV, i BPV) korisni su za klonirajuće vektore u ćelijama sisara. Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za ekspresione vektore sisara (SV40 poreklo može se tipično koristiti samo jer sadrži rani promotor).

[0192] Ekspresioni i klonirajući vektori mogu da sadrže gen koji kodira selektabilan marker kako bi se olakšala identifikacija ekspresije. Tipično selektabilni marker geni kodiraju proteine koji pobeđuju rezistentnost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat, ili tetraciklin, ili su alternativno, komplementni autotrofnim nedostacima, ili u drugim alternativama obezbeđuju specifične nutrijente koji nisu prisutni u medijumu kompleksa, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.

[0193] Jedan primer selekcione šeme koristi lek da zaustavi rast ćelije domaćina. Te ćelije koje su uspešno transformisane sa heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i time prežive režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu, i higromicin. Uobičajeni selektabilni marekeri za ćelije sisara

2

su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo, kao što je DHFR (dihidrofolatna reduktaza), timidin kinaza, metalotionein-I i -II (kao što su metalotioneinski geni primata), adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, i slično. Ćelije transformisane sa DHFR selekcionim genom prvo se identifikuju uzgajanjem svih transformanata u hranljivoj podlozi koja sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Kada se koristi divlji tip DHFR, pogodna ćelijska linija domaćin je ćelija jajnika Kineskog hrčka (CHO) kojoj nedostaje DHFR aktivnost (npr., DG44).

[0194] Alternativno, ćelije domaćini (naročito domaćini divljeg tipa koji sadrže endogenu DHFR) transformisane ili transformisane zajedno sa DNK sekvencama koje kodiraju anti-CD40 antitelo, divlji-tip DHFR proteina, i još jedan selektabilan marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), mogu biti odabrani ćelijskim rastom u podlozi koja sadrži selekcioni agens za selektabilan marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin, ili G418. Videti, npr., U.S. Pat. Br.4,965,199.

[0195] Kada se izvodi rekombinantna proizvodnja u ćelijama kvasca kao ćeliji domaćinu, TRP1 gen prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) može se upotrebiti kao selektabilan marker. TRP1 gen obezbeđuje selekcioni marker za mutant soj kvasca kojem nedostaje sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC Br. 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Prisustvo trp1 lezije u ćelijskom genomu domaćinu kvasca zatim obezbeđuje efektivno okruženje za detektovanje transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično, Leu2p-deficijentni sojevi kvasca kao što su ATCC 20,622 i 38,626 komplementni su sa poznatim plazmidima koji nose LEU2 gen.

[0196] Dodatno, vektori izvedeni iz 1.6 µm cirkularnog plazmida pKD1 mogu se upotrebiti za transformaciju Kluyveromyces kvasaca. Alternativno, ekspresioni sistem za masovnu proizvodnju rekombinantnog telećeg himozina prijavljen je za K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Stabilni multi-kopijski ekspresioni vektori za lučenje zrelog rekombinantnog humanog serum albumina od strane industrijskih sojeva Kluyveromyces takođe su opisani (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).

[0197] Ekspresioni i klonirajući vektori obično sadrže promotor koji je prepoznat od strane organizma domaćina i koji je operativno povezan sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira Anti-CD40 antitelo ili njegov polipeptidni lanac. Promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promotor, β-laktamazu i laktoza promotor sisteme, alkalnu fosfatazu, triptofan (trp) promotor sistem, i hibridne promotore kao što je tac promotor. Ostali poznati bakterijski promotori takođe su pogodni. Promotori za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe sadrže Shine-Dalgamo (S.D.) sekvencu operatovno povezanu sa DNK koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo.

[0198] Mnoge eukariotske promotor sekvence su poznate. Virtuelno svi eukariotski geni imaju AT-bogat region smešten približno 25 do 30 baza nakon mesta gde je transkripcija započeta. Još jedna sekvenca pronađena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region u kojem N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju mnogih eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve od ovih sekvenci pogodno su umetnute u eukariotske ekspresione vektore.

[0199] Primeri pogodnih promovišućih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotore za 3-fosfogliceratnu kinazu ili druge glikolitične enzime, kao što je enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukozna izomeraza, i glukokinaza.

[0200] Inducibilni promotori imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisane stanjem rasta. Oni uključuju promotorne regione kvasca za alkoholnu dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, derivatne enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu, i enzime odgovorne za utilizaciju maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promotori za upotrebu u ekspresiji kvasca dalje su opisani u EP 73,657. Pojačivači kvasca takođe se poželjno koriste sa promotorima kvasca.

[0201] Transkripcija humanizovanog anti-CD40 antitela iz vektora u ćelijama domaćinima sisara je kontrolisana, na primer, promotorima dobijenim od genoma virusa kao što je polioma virus, fowlpox virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, avian sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), iz heterolognih promotora sisara, npr., aktin promotor ili imunoglobulinski promotor, ili od promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.

4

[0202] Rani i kasni promotori SV40 virusa pogodno se dobijaju kao SV40 restrikciohi fragment koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promotor humanog citomegalovirusa je pogodno dobijen kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za eksprimiranje DNK kod domaćina sisara upotrebom goveđeg papiloma virusa kao vektora, opisan je u U.S. Pat. Br. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema opisana je u U.S. Pat. Br.

4,601,978. Videti takođe i Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601, koji opisuje ekspresiju humane p-interferon cDNK u mišjim ćelijama pod kontrolom timidin kinaza promotora iz herpes simpleks virusa. Alternativno, dugo ponavljanje terminala rous sarkoma virusa može se primeniti kao promotor.

[0203] Još jedan upotrebljiv element koji se može koristiti u rekombinantnom ekspresionom vektoru je pojačivačka sekvenca, koja se koristi da poveća transkripciju DNK koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo višim eukariotima. Mnoge pojačivačke sekvence poznate su iz gena sisara (npr., globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein, i insulin). Međutim, obično se koristi pojačivač iz eukariotskog ćelijskog virusa. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnijoj strani porekla replikacije (bp 100-270), rani promotorski pojačivač citomegalovirusa, polioma pojačivač na kasnijoj strani porekla replikacije, i pojačivači adenovirusa. Videti i Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 za opisivanje pojačivačkih elemenata za aktivaciju eukariotskih promotora. Pojačivač može biti spojen u vektoru na položaju 5' ili 3' sa sekvencom koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo, ali je poželjno smešten na položaju 5' od promotora.

[0204] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (ćelije kvasca, gljivica, insekta, biljke, životinje, čoveka, ili nukleirane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) takođe mogu da sadrže sekvence potrebne za prekidanje transkripcije i za stabilisanje mRNK. Takve sekvence uobičajeno su dostupne iz 5' i, ponekad 3', netranslatiranih regiona eukariotskih ili viralnih DNK-a ili cDNK-a. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u netranslatiranom delu mRNK koja kodira anti-CD40 antitelo. Jedna korisna transkripciona terminaciona komponenta je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor opisan u njemu. U nekim primerima izvođenja, humanizovana anti-CD40 antitela mogu se eksprimirati primenom CHEF sistema. (Videti, npr., U.S. Pat. Br.5,888,809)

[0205] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili eksprimiranje DNK u vektorima su prokariotske, ćelije kvasca, ili više eukariotske ćelije opisane gore. Pogodni prokarioti za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bakcili kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41 P opisan je u DD 266,710 objavljeno 12. aprila 1989), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedan poželjan E. coli klonirajući domaćin je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako su pogodni i drugi sojevi kao su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.

[0206] Pored prokariotskih, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac pogodni su klonirajući ili ekspresioni domaćini za vektore koji kloniraju humanizovano anti-CD40 antitelo. Saccharomyces cerevisiae, ili slični pekarski kvasac, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Međutim, veliki broj drugih rodova, vrsta, i sojeva uobičajeno je dostupan i ovde koristan, kao što je Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćini takvi kao, npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. termotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljive kao što su, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0207] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranog humanizovanog anti-CD40 antitela izvedene su iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata, uključujući, npr., brojne bakulovirusne sojeve i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćine instekata za domaćine kao što je Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica), i Bombyx mori (svileni crv). Razni virusni sojevi za transfekciju javno su dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu se koristiti, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.

[0208] Ćelijske kulture biljaka pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajiza, i duvana takođe se mogu upotrebiti kao domaćini.

[0209] U još jednom aspektu, ekspresija humanizovanog anti-CD40 izvodi se u ćelijama kičmenjaka. Propagiranje ćelija kičmenjaka u kulturi (tkivnoj kulturi) postala je rutinska procedura, a tehnike su široko dostupne. Primeri korisnih ćelijskih linija sisara domaćina predstavljaju CV1 linija bubrega majmuna transformisanu sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije podklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol.36: 59), ćelije bubrega mladunaca hrčka (BHK, ATCC CCL 10), ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; npr., DG44), mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod.23:243-251), ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL- 1587), ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2), ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre Bafalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75), humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065), mišji tumor dojki (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 ćelije (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci.383: 44-68), MRC 5 ćelije, FS4 ćelije, i humana hepatoma linija (Hep G2).

[0210] Ćelije domaćini su transformisane gore opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju humanizovanih anti-CD40 antitela i uzgajane u uobičajenoj hranljivoj podlozi pogodno modifikovanoj za indukovanje promotora, biranjem transformanata, ili amplifikacijom gena koji kodiraju željene sekvence.

[0211] Te ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju humanizovanog anti-CD40 antitela opisanog ovde mogu se uzgajati u raznim podlogama. Komercijalno dostupne podloge kao što su Hamo-ov F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Minimalni osnovni medijum ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), i Dulbekov Modifikovan Iglov Medijum ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) pogodni su za uzgajanje tih ćelija domaćina. Dodatno, bilo koja podloga opisana u jednom ili više od Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, U.S. Pat. Br. 4,767,704, U.S. Pat. Br. 4,657,866, U.S. Pat. Br.

4,927,762, U.S. Pat. Br. 4,560,655, U.S. Pat. Br. 5,122,469, WO 90/103430, i WO 87/00195 mogu se koristiti kao hranljive podloge za uzgajanje tih ćelija domaćina. Bilo koja od ovih podloga može biti dopunjena ako je potrebno hormonima i/ili drugim faktoima rasta (kao što je insulin, transferin, ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što je natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozin i timidin), antibioticima (kao što je gentamicin), mikroelementima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna pri konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Drugi suplementi takođe mogu biti uključeni pri poželjnim koncentracijama koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti. Uslovi kultivisanja, kao što je temperatura, pH, i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijama domaćinima odabranim za ekpsresiju, i poznati su stručnjaku iz ove oblasti.

[0212] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intraćelijski, u periplazmičnom prostoru, ili direktno izlučeno u podlogu. Ukoliko se antitelo proizvodi intraćelijski, te ćelije mogu biti prekinute da oslobode protein kao prvu fazu. Određene nečistoće, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrafugiranjem ili ultrafiltriranjem. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 opisuje proceduru za izolovanje antitela koja se luče u periplazmičnom prostoru E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ćelijski ostaci mogu se ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo luči u podlogu, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema generalno se prvo koncentruju primenom komercijalno dostupnog filtera za koncetrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koju od gornjih faza za inhibiranje proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni da spreče rast kontaminanata. Razni postupci mogu se primeniti za izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

[0213] Kompozicija antitela pripremljena iz tih ćelija može se prečistiti primenom, na primer, hidroksilapatit hromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom, i afinitetnom hromatografijom, pri čemu je afinitetna hromatografija tipična tehnika za prečišćavanje. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrsta i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protein A može se primeniti za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim gama1, gama2, ili gama4 teškim lancima (videti, npr., Lindmark et al., 1983 J. Imunol. Meth. 62:1-13). Protein G prepručen je za sve mišje izotipove i humani gama3 (videti, npr., Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). Matrica za koju je afinitetni ligand pričvršćen je najčešće agaroza, ali su i druge matrice dostupne. Mehanički stabilne matrice kao što je staklo kontrolisane poroznosti ili poli(stirendivinil)benzen omogućavaju brže stope protoka i kraća vremena obrade u odnosu na ona postignuta agarozom. Kada antitelo obuhvata CH3domen, za prečišćavanje korisna je Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Ostale tehnike za prečišćavanje proteina kao što je frakcionisanje na jono-izmenjivačkoj koloni, taloženje etanola, reverzno fazna HPLC, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE™ hromatografija na anjon- ili katjon-izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartične kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i taloženje amonijum sulfata takođe su dostupni u zavisnosti od antitela koje se izoluje.

[0214] Nakon bilo koje prelimiranje faze(a) prečišćavanja, mešavina koja obuhvata antitelo od interesta i kontaminante može biti podvrgnuta hromatografiji hidrofobne interakcije niske pH primenom elucionog pufera pri pH između oko 2.5-4.5, tipično izvedenoj pri niskim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0.25M soli).

[0215] Takođe su ovde opisane nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod blago, umereno i veoma strogim uslovima, kakvi su ovde definisani, za sve ili deo (npr., deo koji kodira varijabilni region) nukleotidne sekvence predstavljene izolovanom polinukleotidnom sekvencom(ama) koje kodiraju antitelo ili fragment antitela sa varijabilnim regionom teškog lanca i varijabilnim regionom lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:26, respektivno; SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:26, respektivno; SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:26, respektivno; SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:26, respektivno; SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, respektivno; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, respektivno; SEQ ID NO:34 i SEQ ID NO:31, respektivno; SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, respektivno; SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:36, respektivno; SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:36, respektivno; SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:36, respektivno; SEQ ID NO:40 i SEQ ID NO: 36, respektivno. Hibridizujući deo hibridizujuće nukleinske kiseline tipično je najmanje 15 (npr., 20, 25, 30 ili 50) nukleotida u dužini. Hibridizujući deo hibridizujuće nukleinske kiseline je najmanje 80%, npr., najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, identičan sa sekvencom dela ili svih od nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-CD40 polipeptid (npr., varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca), ili njenim komplementom. Hibridizujuće nukleinske kiseline ovde opisane vrste mogu se koristiti, na primer, kao klonirajuća proba, prajmer, npr., PCR prajmer, ili dijagnostička proba.

[0216] Ovde su takođe opisani izolovani polinukleotidi koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu sa varijabilnim regionom teškog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci iz bilo koje od SEQ ID NO: 1 do 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, ili SEQ ID NO: 40. Ovde su takođe opisani izolovani polinukleotidi koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu sa varijabilnim domenom lakog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci iz bilo koje od SEQ ID NO: 5 do 8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, ili SEQ ID NO:36.

[0217] Izolovana polinukleotidna sekvenca(e) koja je ovde opisana kodira antitelo ili fragment antitela sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim regionom lakog lanca, pri čemu svaki uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci iz antitela ili fragmenta antitela sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim regionom lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:34 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:36, redom; SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:36, redom; SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:36, redom SEQ ID NO:40 i SEQ ID NO: 36, redom.

[0218] Takođe je ovde opisan polinukleotid opisan odmah iznad, gde varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca kodiranog antitela ili fragmenta antitela uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom antitela ili fragmenta antitela koji ima varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence sa, u jednom tehničkom rešenju, SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:26, redom; SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:34 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:36, redom; SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:36, redom; SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:36, redom; i SEQ ID NO:40 i SEQ ID NO: 36, redom.

[0219] Kako se ovde koristi, izrazi "identičnost" ili "procentualni identitet," u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specifičan procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se porede i usklade za maksimalnu korespondenciju. Kako bi se odredio procentualni identitet, sekvence su usklađene radi optimalnih poređenja (npr., praznine se mogu uvesti u sekvencu prve aminokiseline ili sekvencu nukleinske kiseline radi optimalnog usklađivanja sa drugom sekvencom amino ili nukleinske kiseline). Zatim se porede aminokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim položajima ili nukleotidnim položajima. Kada je položaj u prvoj sekvenci zauzet istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao i odgovarajući položaj u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na tim položajima. Procentualni identitet između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele te sekvence (tj., % identiteta=# identičnih položaja/ukupan # položaja (npr., preklapajući položaji)x100). U nekim primerima izvođenja, dve sekvence koje se porede su iste dužine kada se praznine uvedu u sekvence, kako je pogodno (npr., izuzimajući dodatnu sekvencu koja se pruža izvan sekvenci koje se porede). Na primer, kada se sekvence varijabilnog regiona porede, vodeće i/ili sekvence konstantnog domena ne uzimaju se u obzir. Za poređenje sekvenci između dve sekvence, "odgovarajući" CDR odnosi se na CDR na istom mestu u obe sekvence (npr., CDR-H1 svake sekvence).

[0220] Određivanje procentualnog identiteta ili procenta sličnosti između dve sekvence može se postići primenom matematičkog algoritma. Poželjan, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam prema Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovan kao kod Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam uključen je u NBLAST i XBLAST programe od Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST nukleotidne pretrage mogu se izvesti NBLAST programom, zbir=100, dužina karaktera=12, kako bi se dobile nukleotidne sekvence homologne nukleinskoj kiselini koja kodira protein od interesa. BLAST protein pretrage mogu se izvesti XBLAST programom, zbir=50, dužina karaktera=3, kako bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinu od interesa. Kako bi se dobila poravnanja sa prazninama u svrhe poređenja, BLAST sa prazninama može se koristiti kako je opisano u Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast može koristiti za izvođenje ponovljene pretrage koja detektuje udaljene veze između molekula (Id.). Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST, i PSI-Blast programi, mogu se koristiti uobičajeni parametri respektivnih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Još jedan poželjan, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam prema Myers and Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam uključen je u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za GCG poravnavanje sekvenci. Kada se

1

koristi ALIGN program za poređenje aminokiselinskih sekvenci, mogu se koristiti PAM120 tabela težinskih ostataka, kaznena dužina (vrednost) praznine od 12, i kaznena praznina od 4. Dodatni algoritmi za analiziranje sekvenci poznati su u struci i uključuju ADVANCE i ADAM kako je opisan u Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; i FASTA opisan od strane Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Unutar FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage. Ukoliko je ktup=2, slični regioni u dve sekvence koje se porede pronađeni su pretragom parova poravnatih ostataka; ukoliko je ktup=1, ispituju se jedne aminokiseline. ktup može biti podešen na 2 ili 1 za proteinske sekvence, ili od 1 do 6 za DNK sekvence. Uobičajena vrednost ukoliko ktup nije specificiran iznosi 2 za proteine i 6 za DNK. Alternativno, poravnanje proteinske sekvence može se izvesti primenom CLUSTAL W algoritma, kako je opisano u Higgins et al., 1996, Methods Enzymol.

266:383-402.

Ne-Terapeutske upotrebe

[0221] Ovde opisana antitela korisna su kao afinitetni agensi prečišćavanja. U ovom procesu, antitela se imobilizuju na čvrstoj fazi kao što je Protein A smola, primenom postupaka dobro poznatih u struci. Imobilisano antitelo dovodi se u kontakt sa uzorkom koji sadrži CD40 protein (ili njegov fragment) koji treba da se prečisti, a zatim se podloga pere pogodnim rastvaračen koji suštinski uklanja sve materijale u uzorku osim CD40 proteina, koji se vezan za imobilizovano antitelo. Konačno, podloga se pere još jednim pogodnim rastvaračem kako bi se CD40 protein oslobodio od antitela.

[0222] Humanizovana anti-CD40 antitela takođe su korisna u dijagnostičkim ispitivanjima za detektovanje i/ili kvantifikovanje CD40 proteina, na primer, detektovanje CD40 ekspresije u specifičnim ćelijama, tkivima, ili serumu.

[0223] Poželjno je u nekim primerima izvođenja, na primer, u dijagnostičke svrhe obeležiti antitelo detektabilnom grupom. Dostupne su brojne detektabilne oznake, uključujući radioizotope, fluorescentne oznake, oznake enzimskog supstrata i slično. Ta oznaka može biti indirektno konjugovana za antitelo primenom raznih poznatih tehnika. Na primer, antitelo može biti konjugovano sa biotinom, a bilo koja od tri široke kategorije prethodno pomenutih oznaka može biti konjugovana sa avidinom, ili obrnuto. Biotin se selektivno vezuje za i time, oznaka može biti konjugovana sa antitelom na ovaj indirektan način. Alternativno, kako bi se postigla indirektna konjugacija oznake sa antitelom, antitelo može biti konjugovano sa malim haptenom

2

(kao što je digoksin), a jedna od različitih vrsta prethodno pomenutih oznaka konjuguje se sa antitelom protiv haptena (npr., antitelo protiv digoksina). Na taj način, postiže se indirektna konjigacija oznake sa antitelom.

[0224] Primerne radioizotopne oznake uključuju<35>S,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I. Antitelo može biti obeleženo radioizotopom, primenom tehnike opisane u, na primer, Current Protocols in Imunology, Volumes 1 i 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. Radioaktivnost se može izmeriti, na primer, scintilacionim brojanjem.

[0225] Dostupne su primerne fluorescentne oznake koje uključuju oznake dobijene od rethin zemljanih helata (helati evropijuma) ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, Lissamin, fikoeritrin, i Teksas Crveno. Fluorescentne oznake mogu se konjugovati za antitelo poznatom tehnikom, kao što su one opisane u Current Protocols in Imunology, gore, na primer. Fluorescencija se može izmeriti primenom fluorimetra.

[0226] Postoje razne dobro-okarakterisane oznake enzimskog supstrata koje su poznate u struci (videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,275,149 kao pregled). Enzim generalno katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata koja se meri raznim tehnikama. Na primer, promena može promena u boji supstrata koja se može meriti spektrofotometrijski. Alternativno, enzim može promeniti fluorescenciju ili hemiluminescenciju supstrata. Tehnike za kvantifikovanje promena u fluorescenciji opisane su gore. Hemiluminescentan supstrat postaje elektronski uzburkaniji hemijskom reakcijom i tada može da emituje svetlo koje se može izmeriti, upotrebom hemiluminometra, na primer, ili donirati energiju fluorescentnom pmaocu.

[0227] Primeri enzimatskih oznaka uključuju luciferaze kao što je luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Pat. Br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malatna dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što je peroksidaza rena (HRPO), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lisozim, saharid oksidaze (kao što je glukozna oksidaza, galaktozna oksidaza, i glukozna-6-fosfat dehidrogenaza), heterocidne oksidaze (kao što je urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidaza, mikroperoksidaza, i slično. Tehnike za konjigovanje enzima za antitela opisane su, na primer, u O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.

[0228] Primeri kombinacija enzim-supstrat uključuju, na primer: peroksidaza rena (HRPO) sa vodonik peroksidazom kao supstratom, gde hidrogen peroksidaza oksidiše prekursor bojenja kao što je ortofenilen diamin (OPD) ili 3,3',5,5'-tetrametil benzidin hidrohlorid (TMB); alkalna fosfataza (AP) sa para-Nitrofenil fosfatom kao hromogeni supstrat; i β-D-galaktozidaza (β-D-Gal) sa hromogenim supstratom kao što je p-nitrofenil-β-D-galaktozidaza ili fluorogeni supstrat 4-metilumbelliferil-β-D-galaktozidaza.

[0229] Brojne druge kombinacije enzim-supstrat dostupne su stručnjacima iz ove oblasti. Za opšti pregled, videti U.S. Pat. Br.4,275,149 i U.S. Pat. Br.4,318,980.

[0230] U drugom tehničkom rešenju, humanizovano anti-CD40 antitelo se koristi neobeleženo i detektuje se obeleženim antitelom koje se vezuje za humanizovano anti-CD40 antitelo.

[0231] Ovde opisana antitela mogu se uposliti u bilo kom poznatom postupku za ispitivanje, kao što su ispitivanja kompetitivnog vezivanja, direktna i indirektna sendvič ispitivanja, i ispitivanja imunotaloženja. Videti, npr., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.1987).

Dijagnostički kompleti

[0232] Humanizovano anti-CD40 antitelo može se koristiti u dijagnostičkim kompletima, tj., upakovanoj kombinaciji reagenasa u prethodno određenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog ispitivanja. Kada je antitelo obeleženo enzimom, komplet može da uključuje supstrate i kofaktore koje zahteva enzim kao što je supstrat prekursor koji obezbeđuje detektabilan hromofor ili fluorofor. Dodatno, drugi aditivi mogu biti uključeni kao kao što su stabilizatori, puferi (na primer blokirajući puferi ili puferi lizije), i slično. Relativne količine raznih reagenasa mogu veoma varirati kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagenasa koje suštinski optimizuju osetljivost ispitivanja. Reagensi se mogu obezbediti kao suvi prahovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijense koji u rastvoru obezbeđuju rastvor reagensa sa pogodnom koncentracijom.

Terapeutske upotrebe

[0233] U još jednom primeru izvođenja, humanizovano anti-CD40 antitelo opisano ovde korisno je u tretmanu raznih poremećaja povezanih sa ekspresijom CD40 kakvo je ovde opisano.

4

[0234] Humanizovano anti-CD40 antitelo ili agens treba da se administrira na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intraplućno, i intranazalno, i, ukoliko je potreban lokalni imunosupresivni tretman, intraleziono davanje (uključujući perfuziju ili na neki drugi način dovođenje u kontakt kalema sa antitelom pre transplantacije). Humanizovano anti-CD40 antitelo ili agens mogu se dati, na primer, kao infuzija ili kao bolus injekcija. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularno, intravenozno, intraarterijalno, intraperitonealno, ili subkutano davanje. Dodatno, humanizovano anti-CD40 antitelo pogodno se daje pulsna infuzija, naročito opadajućom dozom antitela. U jednom aspektu, doziranje se daje ubrizgavanjima, najpoželjnije intravenoznim ili subkutanim ubrizgavanjima, u zavisnosti da li je davanje kratkotrajno ili hronično.

[0235] Za prevenciju ili tretman bolesti, pogodna doza antitela zavisiće od raznih faktora kao što je tip bolesti koja se tretira, kako je prethodno definisano, težine i toka bolesti, da li se antitelo daje preventivno ili terapeutski, prethodna terapija, istorija bolesti pacijenta kao i odgovor na antitelo, i slobode odlučivanja lekara. Antitelo se pogodno daje pacijentu u jednom ili tokom serija tretmana.

[0236] U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 20 mg/kg (npr., 0.1-15 mg/kg) antitela predstavlja početnu predloženu dozu za davanje pacijentu, bilo, na primer, jednim ili više odvojenih davanja, ili kontinualnom infuzijom. Tipična dnevna doza može da varira od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. Za ponovljajuća davanja tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman je održiv dok se ne pojavi željeno suzbijanje simptoma bolesti. Međutim, i drugi dozni režimi mogu biti korisno. Progresija ove terapije lako se prati uobičajenim tehnikama i ispitivanjima. Primeri doznih režima opisani su u WO 94/04188.

[0237] Izraz "suzbijanje" ovde se koristi u istom kontekstu kao i "ublažavanje" i "zaobilaženje" sa značenjem umanjivanja jedne ili više karakteristika bolesti.

[0238] Kompozicija antitela formuliše se, dozira, i daje na način konzistentan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji se u ovom smislu uzimaju u razmatranje uključuju određeni poremećaj koji se tretira, određeni sisar koji se tretira, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta dostave agensa, postupka davanja, rasporeda davanja, i drugih faktora poznatih medicinskom radniku. "Terapeutski efektivna količina" antitela za davanje upravlja se takvim razmatranjima, i predstavlja minimalnu količinu potrebnu za sprečavanje, ublažavanje, ili tretiranje poremećaja povezanog sa CD40 ekspresijom.

[0239] Antitelo ne mora da bude, ali je opciono, formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za prevenciju ili tretiranje poremećaja o kojem se radi. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisiće od količine humanizovanog anti-CD40 antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili tretmana, i drugih faktora o kojima je prethodno diskutovano. Oni se generalno koriste u istim dozama i načinima davanja kao i oni koje prethodno koriste ili oko od 1 do 99% do sada uposlenih doza.

CD40-povezani poremećaji

[0240] Anti-CD40 antitela ili agensi korisni su za tretiranje ili prevenciju CD40-eksprimirajućeg kancera ili imunološkog poremećaja okarakterisanog ekspresijom CD40, npr., nepoželjnom aktivacijom imunih ćelija (npr., limfociti ili dendritske ćelije). Takva ekspresija CD40 može biti usled, na primer, povećanih CD40 proteinskih nivoa na ćelijskoj površini i/ili izmenjene antigeničnosti eksprimiranog CD40. Tretman ili prevencija imunološkog poremećaja, u skladu sa ovde opisanim postupcima, postiže se davanjem e subjektu kome je to potrebno takvih tretmanskih ili preventivnih efektivnih količina anti-CD40 antitela ili agensa, pri čemu se antitelo (i) vezuje za aktivirane imune ćelije koje eksprimiraju CD40 i koje su povezane sa stanjem bolesti i (ii) ispoljava citotoksični, citostatični, ili imunosuzbijajući efekat na aktivirane imune ćelije.

[0241] Imunološke bolesti koje su okarakterisane nepoželjnom aktivacijom imunih ćelija i koje se mogu tretirati ili prevenirati ovde opisanim postupcima, mogu se klasifikovati, na primer, po tipu(ovima) hipeosetljive reakcije(a) koja je uzrok poremećaja. Ove reakcije tipično su klasifikovane na četiri tipa: anafilatičke reakcije, citotoksične (citolitiče) reakcije, reakcije imunog kompleksa, ili reakcije imuniteta posredovanog ćelijama (CMI) (koje se takođe nazivaju i odloženi tip hiperosetljive (DTH) reakcije). (Videti, npr., Fundamental Imunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed.1993).)

[0242] Specifični primeri takvih imunološki bolesti uključuju sledeće: reumatoidni artritis, autoimune demijelinativne bolesti (npr., multipla skleroza, alergijski encefalomijelitis), endokrina optalmopatija, uveoretinitis, sistemski lupus eritematozus, mijastenija gravis, Graveova bolest, glomerulonefritis, autoimuni hepatološki poremećaj, zapaljenska bolest creva (npr., Kronova bolest ili ulcerativni kolitis), anafilaksa, alergijska reakcija, Sjogrenov sindrom, tip I dijabetes melitus, primarna bilijarna ciroza, Vegnerova granulomatoza, fibromijalgija, polimiozitis, dermatomiozitis, zapaljenska mijozitis, višestruko endokrino otkazivanje, Schmidtov sindrom, autoimuni uveitis, Adisonova bolest, adrenalitis, tiroiditis, Hašimotov tiroiditis, autoimuna tiroidna bolest, perniciozna anemija, gastrična atrofija, hronični hepatitis, lupoid hepatitis, ateroskleroza, podakutan kutani lupus eritematozus, hipoparatiroidizam, Dressler-ov sindrom, autoimuna trombocitopenjia, idiopatska trombocitopenična purpura, hemolitična anemija, pemphigus vulgaris, pemphigus, dermatitis herpetiformis, alopecia arcata, pemfigoid, skleroderma, progresivna sistemska skleroza, CREST sindrom (kalcinoza, Raynaud-ov fenomen, dismotilnost jednjaka, sklerodaktil), i telangiektazija), muška i ženska autoimuna sterilnost, ankilozni spondolitis, ulcerativni kolitis, mešovita bolest vezivnog tkiva, poliarteritis nedosa, sistemski nekrotizujući vaskulitis, atopični dermatitis, atopični rinitis, Goodpastureov sindrom, Chagas-ova bolest, sarkoidoza, reumatična groznica, astma, ponavljajući abortus, antifosfolipidni sindrom, farmerova pluća, eritema multiforme, post kardiotomijski sindrom, Cushing-ov sindrom, autoimuni hronični aktivni hepatitis, Pluća uzgajivača ptica, toksična epidermalna nekroliza, Alport-ov sindrom, alveolitis, alergijski alveolitis, fibrozni alveolitis, intersticijalna plućna bolest, eritema nodozum, pioderma gangrenozum, transfuziona reakcija, Takayasu-jev arteritis, polimijalgija reumatika, privremeni arteritis, šistosomijaza, arteritis velikih ćelija, askarijaza, aspergiloza, Sampter-ov sindrom, ekcem, limfomtoidna granulomatoza, Behcet-ova bolest, Caplan-ov sindrom, Kawasaki bolest, tropska groznica, encefalomijelitis, endokarditis, endomiokardijalna fibroza, endoftalmitis, erythema elevatum et diutinum, psorijaza, eritroblastoza fetalis, eozinofilni fasciitis, Shulman-ov sindrom, Felty-ev sindrom, filarioza, ciklitis, hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, Fuch-jev ciklitis, IgA negropatija, Henoch-Schonlein purpura, bolest kalem protiv domaćina, odbacivanje translpantata, kardiomijopatija, Eaton-Lambert sindrom, povratni polihondritis, krioglobulinemija, Waldenstrom-ova makroglobulemija, Evan-ov sindrom, akutni respiratorni distres sindrom, zapaljenje pluća, osteoporoza, odložen tip hiperosetljivosti i autoimuno otkazivanje gonadame.

[0243] Shodno tome, ovde opisane primene obuhvataju tretman poremećaja B limfocita (npr., sistemski lupus eritematozus, Goodpastureov sindrom, reumatoidni artritis, i tip I dijabetes), Th1-limfocita (npr., reumatoidni artritis, multipla skleroza, psorijaza, Sjorgren-ov sindrom, Hašimotov tiroiditis, Graveova bolest, primarna bilijarna ciroza, Vegnerova granulomatoza, tuberkuloza, ili bolest kalem protiv domaćina), ili Th2-limfocita (npr., atopični dermatitis, sistemski lupus eritematozus, atopična astma, rinokonjunktivitis, alergijski rinitis, Omenn-ov sindrom, sistemska skleroza, ili hronična bolest kalem protiv domaćina). Generalno, poremećaji koji uključuju poremećaje u koje su umešane dendritske ćelije Th1-limfocita ili Th2-limfocita.

[0244] Reumatoidni artritis (RA) je jedno od najčešćih zapaljenskih autoimunih bolesti koja pogađa približno 1% populacije. Iako su dostupni efikasni tretmani (npr. MTX i anti-TNF agensi), i dalje nije ispunjena velika medicinska potreba, naročito onih pacijenata koji nemaju adekvatan odgovor na anti-TNF terapije (oko 30% pacijenata). Dodatno, čak do 50% pacijenata prekine tretman TNF-antagonistima unutar 5 godina, uglavnom zbog sporednih efekata, ali i zbog toga što sve veći broj pacijenata gubi terapeutsku korist. Zbog toga je važno da se utvrde efektivne terapije koje ciljaju zapaljenje i uništavanje zglobova kod RA, ali koje se ne oslanjaju u potpunosti na direktnu inhibiciju TNF. Veoma poželjan pristup je ciljanje ko-stimulatornih ćelijskih putanja. Jedan od ključnih receptor-ligand parova u kostimulaciji je CD40/CD40L. Ovaj sistem omogućava interakcije između imunih ćelija, i između imunih i neimunih ćelija, od kojih su sve važne u patogenezi RA. Blokiranje CD40 antagonističkim antitelom ovog pronalaska može imati jedan ili više sledećih efekata na RA:

1) Inhibiranje diferencijacije B ćelija i menjanje izotipa antitela;

2) Inhibiranje proizvodnje citokina i hemokina i poboljšavanje regulacije adhezionih molekula u T-ćelijama i makrofagama;

3) Inhibiranje aktivacije dendritskih ćelija i

4) Inhibiranje proizvodnje prozapaljenskih citokina, hemokina, matrica metaloproteinaze, prostaglandina, i usporavanje regulacije adhezionih molekula u ne-imunim ćelijama (npr. epitelne, endotelijalne i mezenhimalne ćelije).

[0245] Ovde se izričito razmatraju terapeutske upotrebe koje postužu jedan ili više gore navedenih efekata. Pored RA, kompozicije ovog pronalaska naročito su korisne u tretiranju multipla skleroze, psorijae (uključujući psorijazni artritis), juvenilni reumatoidni artritis. Zapaljenska bolest creva, sistemski lupus eritematozus, i transplantacija čvrstih organa.

[0246] Reumatoidni artritis (RA) je hronična, sistemska autoimuna bolest sa prevalencom od približno 1% kod odraslih. Pomenuta bolest nastavlja da izaziva značajan morbiditet i prevremenu smrt (smrt je pre svega zbog ubrzane kardiovaskularne bolesti). Identifikovano je da se oštećenje zglobova javlja veoma rano u toku ove bolesti sa čak 30% pacijenata koji pokazuju radiografski dokaz koštanih erozija u vreme dijagnoze, povećavajući se do 60% nakon 1 godine. Trenutne smernice preporučuju započinjanje terapije uobičajenim antireumatskim lekovima (DMARD-ovi) koji modifikuju bolest, unutar 3 meseca od kada je postavljena konačna dijagnoza. DMARD-ovi imaju potencijal da redukuju ili spreče oštećenje zglobova i očuvaju funkciju zglobova. Trenutno, reumatolozi biraju metotreksat (MTX) kao početnu DMARD terapiju za većinu pacijenata.

[0247] TNF-antagonisti etanercept (Enbrel®), infliksimab (Remicade®), adalimumab (Humira®), CTLA4-antagonist abatacept (Orencia®), anti-IL-6 receptor mAb tocilizumab i anti-CD20 mAb rituksimab (Rituxan®) efikasni su u tretmanu RA. Trenutne smernice generalno preporučuju upotrebu bioloških DMARD-ova za tretman aktivnog RA nakon neadekvatnog odgovora na tradicionalne DMARD-ove.

[0248] Nedavna ispitivanja na pacijentima sa ranim agresivnim RA bez prethodnog MTX tretmana pokazala su da je kombinacija MTX sa TNF-antagonistom bila superiornija u odnosu na svaku drugu kada se koristila kao monoterapija. Najupečatljiviji rezultat bila je značajna radiološka korist ove kombinovane terapije. Tako, kombinacija MTX i TNF-inhibitora trebalo bi da se koristikod pacijenata sa najvećim rizikom od agresivne bolesti i agresivnog fenotipa (npr. visoki rezultati aktivnosti, funkcionalno oštećenje, seropozitivnost za reumatoidni faktor (RF) ili antitelo protiv cikličnog citrulinskog peptida (CCP), povišeni CRP, radiografske erozije). Međutim, očekuje se da se u kliničkoj praksi TNF-antagonisti retko upotrebljavaju kao terapija prve linije. Istraživanje sprovedeno Aprila 2005 od strane US reumatologa pokazalo je da su faktori koji najviše utiču na odluku o upšotrebi TNF-antagonista sledeći: neuspešnost MTX ili višestrukih DMARD-ova, globalna procena lekara, funkcionalno oštećenje, i radiografko pogoršanje ili erozije. Trenutno, procenjeno je da 20% pacijenata sa RA prima TNF-inhibitornu terapiju u US.

[0249] Suštinski procenat RA pacijenata nema adekvatnu pomoć sa trenutnim tretmanima uključujući biološke terapije, bilo zbog netolerancije na lek ili toksičnost leka ili zbog nepostojanja odgovora. Čak do 50% pacijenata prekine TNF-antagonistički tretman unutar 5 godina, uglavnom zbog štetnih efekata, ali zbog toga što sve veći broj pacijenata prestane daodgovara na nju.

[0250] U nekim primerima izvođenja, imunološki poremećaj je imunološki poremećaj posredovan T ćelijama, kao što je poremećaj T ćelija u kojem su aktivirane T ćelije povezane sa poremećajem koji eksprimira CD40. Anti-CD40 antitela ili agensi mogu se davati kako bi se oštetile takve CD40-eksprimirajuće aktivirane T ćelije. U specifičnom primeru izvođenja, davanje anti-CD40 antitela ili agensa može da ošteti CD40-eksprimirajuće aktivirane T ćelije, pri čemu ostale T ćelije suštinski nisu potrošene od strane anti-CD40 ili agensa. U ovom kontekstu, "koje suštinski nisu potrošene" označava da manje od oko 60%, ili manje od oko 70% ili manje od oko 80% ostalih ćelija nisu potrošene.

[0251] Anti-CD40 antitela i agensi kakvi su ovde opisani takođe su korisni za tretiranje ili preveniranje CD40-eksprimirajućeg kancera. Tretman ili prevencija CD40-eksprimirajućeg kancera, u skladu sa ovde opisanim primenama, postiže se davanjem subjektu kome je to potrebno takve tretmanske ili preventivne efektivne količine anti-CD40 antitela ili agensa, čime se antitelo ili agens (i) vezuje za CD40-eksprimirajuće kancerogene ćelije i (ii) ispoljava citotoksični ili citostatični efekat radi trošenja ili inhibiranja proliferacije CD40-eksprimirajućih kancerogenih ćelija.

[0252] CD40-eksprimirajući kanceri koji se mogu tretirati ili prevenirati primenom antitela ovog pronalaska uključuju, na primer, leukemiju, kao što je akutna leukemija, akutna limfocitična leukemija, akutna mijelocitična leukemija (npr., mijeloblastična, promijelocitična, mijelomonocitična, monocitična, ili eritroleukemija), hronična leukemija, hronična mijelocitična (granulocitična) leukemija, ili hronična limfocitična leukemija; Policythemia vera; Limfom (npr., Hodžkinova bolest ili Ne-Hodžkinova bolest); multiple mijelom, Valdenstromova makroglobulinemija; bolest teških lanaca; čvrsti tumori kao što su sarkomi i karcinomi (npr., fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogenski sarkom, osteosarkom, hordoma, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangio endotelijski sarkom, sinovioma, mezotelioma, Ewing-ov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, kolorektalni karcinom, pankreatitični kancer, kancer dojke, kancer jajnika, kancer prostate, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojnih žlezda, karcinom lojnih žlezda, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, seminoma, embrionalni karcinom, Wilms-ov tumor, kancer grlica materice, kancer materice, tumor na testisima, plućni karcinom, karcinom pluća malih ćelija, karcinom pluća ne-malih ćelija, karcinom bešike, epitelni karcinom, gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustična neuroma, oligodendrogliom, menangiom, melanom, neuroblastom, retinoblastom, nazofaringealni karcinom, ili karcinom jednjaka).

Farmaceutske kompozicije i njihovo davanje

[0253] Kompozicija koja obuhvata anti-CD40 antitelo može se davati subjektu koji ima ili je u riziku od dobijanja imunološkog poremećaja ili CD40-eksprimirajućeg kancera. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu anti-CD40 antitela u proizvodnji leka za prevenciju ili tretman CD40 eksprimirajućeg kancera ili imunološkog poremećaja. Izraz "subjekat" kako se ovde koristi označava bilo kog pacijenta sisara kome se može davati CD40-vezujući agens, uključujući, npr., ljude i he-humane pacijente, kao što su primati, glodari, i psi. Subjekti kojima je specifično namenjen ovaj tretman upotrebom ovde opisanih postupaka uključuju ljude. Antitela se mogu davati sama ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama u prevenciji ili tretmanu imunološkog poremećaja ili CD40-eksprimirajuće kancera.

[0254] Poželjna antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su one koje obuhvataju humanizovano antitelo sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog regiona teškog lanca sa bilo kojom od SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:35.

[0255] Neka tehnička rešenja uključuju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca sa SEQ ID NO:31. Posebno poželjne kompozicije humanizovanih antitela sadrže antitelo ili fragment antitela sa varijabilni domen teškog lanca i varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama sa SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:33 i SEQ ID NO:31, redom; SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:31, redom. Razmatrani unutar predmetnog pronalaska su izolovani polinukleotidi koji kodiraju bilo koju od sekvenci teškog lanca sa SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, ili SEQ ID NO:35. Druga tehnička rešenja su usmerena na izolovane nukleinske kiseline koje kosiraju sekvencu lakog lanca sa SEQ ID NO:31.

[0256] U određenim primerima izvođenja, kada se razmatra tretiranje RA, kompozicije ovog pronalaska mogu se koristiti za redukovanje znakova i simptoma, indukujući glavniklinički odgovor i redukovajući progresiju strukturnog oštećenja kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnim RA koji ne reaguju adekvatno na sam MTX. Trenutni primeri takvih terapija su: Enbrel/Humira (Podaci za Humira i Enbrel dobijeni su u dve različite populacije pacijenata). Kompozicije ovog pronalaska mogu se koristiti umesto Enbrel/Humira terapiju ili u kombinaciji

1

sa Enbrel/Humira terapijom za subjekte koji ne reaguju na sam MTX. Poželjno, u takvim primerima izvođenja, kompozicije ovog pronalaska imaju superiorniju efikasnost u odnosu na Enbrel MTX kod pacijenata koji su imali neodgovarajući odgovor na metotreksat kako je određeno na primer: ACR20 na 6 meseci >85% za jedinjenje plus MTX (GS: Enbrel MTX 71% vs. Placebo MTX 27%, Humira MTX na 12 mes. 59% vs. Placebo MTX 24%)*. Dodatni kriterijumi za superiornu efikasnost kompozicija ovog pronalaska mogu da uključuju: Inhibiciju progresije strukturačnog oštećenja tokom perioda od jedne godine slično Enbrel-u (nakon 52 nedelje srednje modifikovan Sharp skor Humira MTX 0.1 vs. Placebo MTX 2.7)*. U daljim primerima izvođenja, kompozicije proizvode "glavni klinički odgovor" koji je superiorniji od Enbrel-a kod pacijenata koji nisu adekvatno odregaovali na metotreksat kako je izmereno sa ACR70 (20% za Humira MTX, 4% za Placebo MTX)*.

[0257] U drugim primerima izvođenja, kompozicije ovog pronalaska mogu biti indikovane za redukovanje znakova i simptoma, indukujući glavni klinički odgovor i redukujući napredovanje strukturalnog oštećenja kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnog RA koji nisu imali adekvatan odgovor na anti-TNF agense. Trenutni Gold standard: ne-anti-TNF biološka terapija. Poželjno, kod takvih subjekata, kompozicije ovog pronalaska poseduju ne-inferiornu efikasnost u poređenju sa ne-anti-TNF biološku (npr. Orencia, Rituxan) histološkim poređenjem kod pacijenata koji su imali neodgovarajući odgovor na anti-TNF agens: ACR20 na 6 meseci >50% za jedinjenje plus DMARD (GS: Orencia DMARD 50% vs. placebo DMARD 20%). U daljim primerima izvođenja, kompozicije ovog pronalaska inhibiraju napredovanje strukturnog oštećenja tokom perioda od jedne godine procenjeno prihvaćenim postupcima za X-zračno ocenjivanje erozije zglobova i sužavanje prostora oko zglobova, slično Rituxan (nakon 52 nedelje srednji modifikovani Sharp skor Rituxan MTX 1.0 vs. Placebo MTX 2.31).

[0258] Razni sistemi dostave poznati su i mogu se koristiti za davanje CD40 agensa vezivanja. Postupci uvođenja uključuju ali nisu ograničeni na intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, subkutane, intranazalne, epiduralne, i oralne načine davanja. CD40 agens vezivanja može se davati, na primer infuzijom, bolus injekcijom ili injekcijom, i može se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima kao što su hemoterapijski agensi. Davanje može biti sistemsko ili lokalno. U poželjnim primerima izvođenja, davanje se izvodi subkutanom injekcijom. Formulacije za takve injekcije mogu se pripremiti u na primer prethodno napunjenim špricevima, koje se mogu davati jednom svake druge nedelje.

2

[0259] Bezbednosne karakteristike antitela ovog pronalaska određene su i poželjno uključuju jednu ili više karakteristika kao što su: bez klinički značajnih interakcija sa drugim lekovima koji se uobičajeno koriste za tretiranje reumatoidnog artritisa (npr. DMARD-ovi, Steroidi, NSAID-ovi,); nema veće stipe prekida usled bezbednosnih ili tolerišućih razloga u poređenju sa Enbrelom; Stopa ozbiljnih infekcija nije veća od onih kod anti-TNF agenasa ili drugih uobičajenih bioloških agenasa; Učestalost i/ili ozbiljnost reakcije na mestu injektovanja ili reakcija na infuziju slična Enbrel-u; bez ili uz minimalan razvoj otpornosti na lek (manje od 5%) nakon ponovljenih ciklusa terapije; bez ili uz minilano neutralisanje antitela; nema dokaza pojačane agregacije trombocita /aktivacije koja može voditi ka tromboemboličnim pojavama in vivo ili trompocitne/endotelijalne dysfunkcije koja može da dovede do krvarenja.

[0260] U specifičnim primerima izvođenja, kompozicija humanizovanog anti-CD40 antitela treba da se administrira injektovanjem, kateterom, supozitorijama, ili putem impanta, pri čemu je taj implant poroznog, neporoznog, ili želatinastog materijala, uključujući membrane, kao što su silikonske membrane, ili vlakno. Tipično, se daje kompozicija, koriste se materijali koji ne apsorbuju anti-CD40 antitelo ili agens.

[0261] U drugim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo se dostavlja sistemom za kontrolisanu dostavu. U jednom primeru izvođenja, može se koristiti pumpa (videti, npr., Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U još jednom primeru izvođenja, mogu se koristiti polimerni materijali. (Videti, npr., Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen i Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger i Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Videti takođe i Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Drugi sistemi kontrolisanog solobađanja opisani su, na primer, kod Langer-a, gore.

[0262] CD40 vezujući agens (npr. anti-CD40 antitelo) može se davati kao farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivnu količinu vezujućeg agensa i jedan ili više farmaceutski kompatibilnih sastojaka.

[0263] U tipičnim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija formulisana je u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravenozno ili subkutano davanje čoveku. Tipično, kompozicije za davanje injektovanjem su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je potrebno, farmaceutski proizvod takođe može da uključi agens za rastvaranje i lokalni anestetik kao što je lignokain koji umiruje bol na mestu injektovanja. Generalno, sastojci su dostavljeni ili odvojeno ili zajedno umešani u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica koja pokazuje količinu aktivnog agensa. Kada se taj farmaceutski proizvod daje infuzijom, može biti smešten u infuzionu bocu koja sadrži sterilnu vodu ili slani rastvor farmaceutske čistoće. Kada se taj farmaceutski proizvod daje injekcijom, može biti obezbeđena ampula sterilne vode za injekcije ili slani rastvor u kojem se sastojci mogu umešati pre davanja.

[0264] Dalje, farmaceutska kompozicija može biti obezbeđena kao farmaceutski komplet koji obuhvata (a) kontejner koji sadrži CD40 agens vezivanja (npr., anti-CD40 antitelo) u liofilizovanom obliku i (b) drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv rastvarač (npr., sterilna voda) za injektovanje. Farmaceutski prihvatljiv rastvarač može se koristiti ra rekonstrukciju ili razblaživanje liofilizovanog anti-CD40 antitela ili agensa. Opciono povezano sa takvim kontejnerom(ima) može biti uputstvo u obliku propisanom od strane vladina agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih proizvoda ili bioloških proizvoda, koje uputstvo utiče na odobrenje od strane agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za davanje ljudima.

[0265] Količinu CD40 agensa vezivanja (npr., anti-CD40 antitelo) koja je efektivna u tretmanu ili prevenciji imunološkog poremećaja ili CD40-eksprimirajućeg kancera, može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Dodatno, in vitro ispitivanja mogu se opciono uposliti kako bi se pomoglo identifikovanje optimalnih doznih opsega. Precizna doza koja se upošljava u formulaciji takođe zavisi od načina davanja, i stadiuma imunološkog poremećaja ili CD40-eksprimirajućeg kancera, i treba da se bira u skladu sa procenom lekara i okolnosti za svakog pacijenta. Efekativne doze mogu se predvideti iz kriva doznog odgovora izvedene iz in vitro ili ispitnih sistema životinjskog modela.

[0266] Na primer, toksičnost i terapeutska efikasnost anti-CD40 antitela ili agensa mogu se

4

odrediti u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama standardnim farmaceutskim procedurama za određivanje ED50( doza terapeutski efektivna u 50% populacije). Poželjan je CD40-vezujući agens (npr., anti-CD40 antitelo) koji pokazuje veliki terapeutski indeks. Kada CD40-vezujući agens pokazuje toksične sporedne efekte, može se koristiti sistem za dostavu koji usmerava CD40-vezujući agens na mesto oštećenog tkiva čime se minimizuje potencijalno oštećenje ne-CD40-eksprimirajućih ćelija i, na taj način, redukuju sporedni efekti.

[0267] Podaci dobijeni ispitivanjima u ćelijskoj kulturi i ispitivanjima na životinjama mogu se koristiti u formulisanju opsega doziranja za upotrebu kod ljudi. Doziranje CD40 agensa vezivanja tipično se nalazi unutar opsega cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50sa malo ili ni malo toksičnosti. Doziranje može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doziranja koji je uposlen ili načina davanja koji se sprovodi. Z bilo koji CD40 agens vezivanja koji se koristi u postupku, može se proceniti terapeutski efektivna doza prvenstveno iz ispitivanja u ćelijskoj kulturi. Doza se može formulisati u životinjskom modelu kako bi se postigao opseg cirkulišuće koncentracije u plazmi koji uključuje the IC50(tj., koncentracija test jedinjenja koje postiže polu-maksimalnu inhibiciju simptoma) kasko je određeno u ćelijskoj kulturi. Takva informacija može se koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi, ELISA i slično.

[0268] Generalno, doza anti-CD40 antitela ili CD40 agensa vezivanja koji se daje pacijenta sa imunološkim poremećajem ili CD40-eksprimirajućim kancerom tipično iznosi oko 0.1 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase subjekta. Doza data subjektu je oko 0.1 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 15 mg/kg, ili oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne mase subjekta.

[0269] Primerne doze uključuju, ali nisu ograničene na, od 1 ng/kg do 100 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, doza je oko 0.5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg ili oko 16 mg/kg. Ta doza može se davati, na primer, dnevno, jednom nedeljno (nedeljno), dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno, pet puta nedeljno, šest nedeljno, dvonedeljno ili mesečno, svaka dva meseca, ili svaka tri meseca. U specifičnim primerima izvođenja, ta doza je oko 0.5 mg/kg/nedelja, oko 1 mg/kg/nedelja, oko 2 mg/kg/nedelja, oko 3 mg/kg/nedelja, oko 4 mg/kg/nedelja, oko 5 mg/kg/nedelja, oko 6 mg/kg/nedelja, oko 7 mg/kg/nedelja, oko 8 mg/kg/nedelja, oko 9 mg/kg/nedelja, oko 10 mg/kg/nedelja, oko 11 mg/kg/nedelja, oko 12 mg/kg/nedelja, oko 13 mg/kg/nedelja, oko 14 mg/kg/nedelja, oko 15 mg/kg/nedelja ili oko 16 mg/kg/nedelja. U nekim primerima izvođenja, dozni se kreće od oko 1 mg/kg/nedelja do oko 15 mg/kg/nedelja.

[0270] U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju humanizovano anti-CD40 antitelo mogu dalje da obuhvataju terapeutski agens, bilo konjugovan ili nekonjugovan za agens vezivanja. Anti-CD40 antitelo može se ko-administrirati u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih agenasa za tretman ili prevenciju imunoloških poremećaja ili CD40-eksprimirajućih kancera. Na primer, kombinovana terapija može da uključi citostatični, citotoksični, ili imunosupresivni agens. Kombinovana terapija takođe može da uključi, npr., davanje agensa koji cilja receptor ili kompleks receptora različit od CD40 na površini aktiviranih limfocita, dendritskih ćelija ili CD40-eksprimirajućih kancerogenih ćelija. Primer takvog agens uključuje drugo, ne-CD40 antitelo koje se vezuje za molekul na površini aktiviranog limfocita, dendritske ćelije ili CD40-eksprimirajuće kancer ćelije. Još jedan primer uključuje ligand koji cilja takav receptor ili kompleks receptora. Tipično, takvo antitelo ili ligand vezuje se za receptor ćelijske površine na aktiviranim limfocitima, dendritske ćelije ili CD40-eksprimirajuće kancer ćelije i osnažuje citotoksični ili citostatični efekat anti-CD40 antitela dostavljanjem citostatičnog ili citotoksičnog signala do aktiviranog limfocita, dendritske ćelije ili CD40-eksprimirajuće kancer ćelije.

[0271] Takvo kombinovano terapijsklo davanje može imati dodatni ili sinergistički efekat na parametre bolesti (npr., ozbiljnost simptoma, broj simptoma, ili učestalost vraćanja).

[0272] U odnosu na terapeutske režime za kombinovano davanje, u specifičnom primeru izvođenja, anti-CD40 antitelo daje se istovremeno as terapeutskim agensom. U još jednom specifičnom primeru izvođenja, terapeutski agens daje pre ili nakon davanja anti-CD40 antitela, za najmanje sat i do nekoliko meseci, na primer najmanje sat, pet sati, 12 sati, san, nedelju, mesec, ili tri meseca, pre ili nakon davanja anti-CD40 antitela.

[0273] Korisne klase citotoksičnih ili imunosupresivnih agenasa uključuju, na primer, antitubulin agense, auristatine (npr., MMAE, ili MMAF), povezivače malog žleba DNK, inhibitore DNK replikacije, alkilirajuće agense (npr., kompleksi platine kao što je cis-platin, mono(platina), bis(platina) i tri-nuklearna platina kompleksi i karboplatin), antracikline, antibiotike, antifolate, antimetabolite, senzitizatore za hemoterapiju, duokarmicine, etopozid, fluorinisane pirimidine, jonofore, leksitropsine, nitrozoureje, platinole, prethodno formirajuća jedinjenja, antimetabolite purina, puromicine, radijacione senzitizatore, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze, vinka alkaloide, ili slično.

[0274] Pojedinačni citotoksični ili imunosupresivni agensi uključuju, na primer, androgen, antramicin (AMC), asparaginazu, 5-azacitidin, azatioprin, bleomicin, busulfan, butionin sulfoksimin, kamptotecin, karboplatin, karmustin (BSNU), CC-1065, hlorambucil, cisplatin, kolhicin, ciklofosfamid, citarabin, citidin arabinozid, citohalazin B, dakarbazin, daktinomicin (ranije aktinomicin), daunorubicin, dekarbazin, docetaksel, doksorubicin, estrogen, 5-fluordeoksiuridin, 5-fluorouracil, gramicidin D, hidroksiureu, idarubicin, ifosfamid, irinotekan, lomustin (CCNU), mehloretamin, melfalan, 6-merkaptopurin, metotreksat, mitramicin, mitomicin C, mitoksantron, nitroimidazol, paklitaksel, plikamicin, prokarbizin, streptozotocin, tenopozid, 6-tiogvanin, tiotepu, topotekan, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, VP-16 i VM-26.

[0275] U nekim specifičnim primerima izvođenja, terapeutski agens je citotoksični agens. Pogodni citotoksični agensi uključuju, na primer, dolastatine (npr., auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, AEB ili AEVB), povezivače malih žlebova DNK (npr., enedini i leksitropsini), duokarmicini, taksani (npr., paklitaksel i docetaksel), puromicini, vinka alkaloidi, CC-1065, SN-38, topotekan, morfolino-doksorubicin, rizoksin, cijanomorfolino-doksorubicin, echinomicin, kombretastatin, netropsin, epotilon A i B, estramustin, kriptofizini, cemadotin, majtanzinoidi, diskodermolid, eleuterobin, ili mitokdantron.

[0276] U nekim primerima izvođenja, citotoksični agens je uobičajeni hemoterapijski proizvod kao što su, na primer, doksorubicin, paklitaksel, melfalan, vinka alkaloidi, metotreksat, mitomicin C ili etopozid. Dodatno, potentni agensi kao što je analog CC-1065, kaliheamicin, majtanzin, analog dolastatina 10, rizoksin, i palitoksin mogu se povezati sa njihovim anti-CD40 antitelima ili agensima.

[0277] U specifičnim primerima izvođenja, citotoksični ili citostatični agens je auristatin E (takođe poznat u struci kao dolastatin-10) ili njegov derivat. Tipično, derivat auristatina E je, npr., estar formiran između auristatina E i keto kiseline. Na primer, auristatin E može se uvesti u reakciju sa paraacetilnom benzojevom kiselinom ili benzoilvalerinskom kiselino kako bi se proizveli AEB i AEVB, respektivno. Drugi tipični derivati auristatina uključuju AFP, MMAF, i MMAE. Sinteza i struktura auristatina E i njegovih derivata opisane su u, na primer, U.S. objavama patentnih prijava Br. 2004-0157782 A1 i 2005-0238649; međunarodnoj patentnoj prijavi Br. PCT/US03/24209, međunarodnoj patentnoj prijavi Br. PCT/US02/13435, i U.S. Pat. Br. 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; i 4,486,414.

[0278] U specifičnim primerima izvođenja, citotoksični agens je agens vezivanja malih žlebova DNK. (Videti, npr., U.S. Pat. Br. 6,130,237.) Na primer, u nekim primerima izvođenja, agens vezivanja malih žlebova je CBI jedinjenje. U drugim primerima izvođenja, agens vezivanja malih žlebova je enedini (npr., kaliheamicin).

[0279] Primeri anti-tubulin agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, taksane (npr., Taxol® (paklitaksel), Taxotere® (docetaksel)), T67 (Tularik), vinka alkiloide (npr., vinkristin, vinblastin, vindesin, i vinorelbin), i dolastatine (npr., auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Drugi antitubulin agensi uključuju, na primer, derivate bakatina, analoge taksana (npr., epotilon A i B), nokodazol, kolhicin i kolcimid, estramustin, criptofizine, cemadotin, majtanzinoide, kombretastatine, diskodermolid, i eleuterobin.

[0280] U nekim primerima izvođenja, citotoksični agens is a majtanzinoid, još jedna grupa antitubulin agenasa. Na primer, u specifičnim primerima izvođenja, majtanzinoid je majtanzin ili DM-1 (ImunoGen, Inc.; videti i Chari et al., 1992, Cancer Res.52:127-131).

[0281] U nekim primerima izvođenja, terapeutski agens nije radioizotop.

[0282] U nekim primerima izvođenja, citotoksični ili imunosupresivni agens je antimetabolit. Antimetabolit može biti, na primer, antagonist purina (npr., azotioprin ili mikofenolat mofetil), inhibitor dihidrofolat reductaze (npr., metotreksat), aciklovir, gangciklovir, zidovudin, vidarabin, ribavarin, azidotimidin, citidin arabinozid, amantadin, dideoksiuridin, jododeoksiuridin, poskamet, ili trifluridin.

[0283] U drugim primerima izvođenja, citotoksični ili imunosupresivni agens je takrolimus, ciklosporin ili rapamicin. U daljim primerima izvođenja, citotoksični agens je aldesleukin, alemtuzumab, alitretinoin, alopurinol, altretamin, amifostin, anastrozol, arsenični trioksid, beksaroten, beksaroten, kalusteron, kapecitabin, celekoksib, kladribin, Darbepoetin alfa, Denileukin diftitoks, deksrazoksan, dromostanolon propionat, epirubicin, Epoetin alfa, estramustin, eksemestan, Filgrastim, floksuridin, fludarabin, fulvestrant, gemcitabin, gemtuzumab ozogamicin, goserelin, idarubicin, ifosfamid, imatinib mezilat, Interferon alfa-2a, irinotekan, letrozol, leukovorin, levamisol, mekloretamin ili azotni iperit, megestrol, mesna, metotreksat, metoksalen, mitomicin C, mitotan, nandrolon fenpropionat, oprelvekin, oksaliplatin, pamidronat, pegademaza, pegaspargaza, pegfilgrastim, pentostatin, pipobroman, plicamicin, porfimer natrijum, prokarbazin, kvinakrin, razburikaza, revlimid, Sargramostim, streptozocin, tamoksifen, temozolomid, tenipozid, testolakton, tiogvanin, toremifen, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoin, uramustin, valrubicin, vinblastin, vinkristin, vinorelbin i zoledronat.

[0284] U dodatnim primerima izvođenja, lek je humanizovano anti-HER2 monoklonalno antitelo; RITUXAN (rituksimab; Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.); himerno anti-CD20 monoklonalno antitelo); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; mišje IgG2a antitelo); Cetuximab Erbitux (Imclone Sistemi Inc., NY; anti-EGFR IgG himerno antitelo); Vitaxin (MedImuni, Inc., MD); Campath I/H (Leukosite, MA; humanizovano IgG1 antitelo); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; humanizovano anti-CD33 IgG antitelo); LymphoCide (Imunomedics, Inc., NJ; humanizovano anti-CD22 IgG antitelo); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; humanizovano anti-HLA-DR antitelo); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; radioobeleženo mišje anti-HLA-Dr10 antitelo); Allomune (BioTransplant, CA; humanizovano anti-CD2 mAb); Avastin (Genentech, Inc., CA; an anti-VEGF humanized antibody); Epratuzamab (Imunomedics, Inc., NJ i Amgen, CA; anti-CD22 antitelo); i CEKiselinae (Imunomedics, NJ; humanizovano anti-CEA antitelo).

[0285] Druga pogodn antitela uključuju, ali nisu ograničena na, antitela protiv sledećih antigena: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfa fetoprotein, CA 242, placentalna alkalna fosfataza, specifičan antigen prostate, prostatična kiselina fosfataza, epidermalni faktor rasta, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, anti transferin receptor, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, specifičan antigen prostate, IL-2 receptor, CD20, CD52, CD33, CD22, humani horionski gonadotropin, CD38, mucin, P21, MPG, i Neu onkogenski proizvod.

[0286] U nekim primerima izvođenja, terapeutski agens je imunosupresivni agens. Imunosupresivni agens može biti, na primer, ganciklovir, etanercept, takrolimus, ciklosporin, rapamicin, ciklofosfamid, azatioprin, mikofenolat mofetil ili metotreksat. Alternativno, imunosupresivni agens može biti, na primer, a glukokortikoid (npr., kortizol ili aldosteron) ili analog glukokortikoida (npr., prednizon ili deksametazon).

[0287] Pogodne ciklooksigenaza inhibitori uključuju meklofenaminsku kiselinu, mefenaminska kiselina, karprofen, diklofenak, diflunizal, fenbufen, fenoprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, nabumeton, naproksen, sulindak, tenoksicam, tolmetin, i acetilsalicilnu kiselinu.

[0288] Pogodni inhibitori lipoksigenaze uključuju redoks inhibitore (npr., derivati katehol butana, nordihidrogvajaretinska kiselina (NDGA), maoprokol, fenidon, lanopalen, indazolinoni, nafazatrom, benzofuranol, alkilhidroksilamin), i ne-redoks inhibitore (npr., hidroksitiazoli, metoksialkiltiazoli, benzopirani i njhivoi derivati, metoksitetrahidropiran, bosvalne kiseline i acetilovani derivati bosvalne kiseline, i kvinolinmetoksifenilsirćetne kiseline suptituisane radikalima cikloalkila), i prekursori redoks inhibitora.

[0289] Drugi pogodni inhibitori lipoksigenaze uključuju antioksidanse (npr., fenol, propil galat, flavonoidi i/ili prirodno javljajući supstrati koji sadrže flavonoide, hidroksilovani derivati flavona, flavonol, dihidrokvercetin, luteolin, galangin, orobol, derivati halkona, 4,2',4'-trihidroksihalkon, orto-aminofenoli, N-hidroksiuree, benzofuranoli, ebselen i vrste koje povećavaju aktivnost redukujućih selenoenzima), agensi heliranja železa (npr., hidroksaminske kiseline i njihovi derivati, N-hidroksiuree, 2-benzil-1-naftol, kateholi, hidroksilamini, karnozol troloks C, katehol, naftol, sulfasalazin, zileuton, 5- hidroksiandranilinska kiselina i 4-(omegaarilalkil) fenilalkanojske kiseline), jedinjenja koja sadrže imidazol (npr., ketokonazol i itrakonazol), fenotiazini, i derivati benzopirana.

[0290] Dalji pogodni inhibitori lipoksigenaze uključuju inhibitore eikozanoida (npr., oktadekatetraenojne, eikosatetraenojne, dokosapentaenojne, eikosaheksaenojne i dokosaheksaenojne kiseline i njihovi estri, PGE1 (prostaglandin E1), PGA2 (prostaglandin A2), viprostol, 15-monohidroksieikosatetraenojne, 15-monohidroksieikosatrienojne i 15-monohidroksieiosapentaenojne kiseline, i leukotrieni B5, C5 i D5), jedinjenja koja utiču na protoke kalcijuma, fenotiazini, difenilbutilamini, verapamil, fuskozid, kurkumin, hlorogena kiselina, kofeinska kiselina, 5,8,11,14-eikosatetrajenoična kiselina (ETYA), hidroksifenilretinamid, lonapalen, eskulin, dietilkarbamazin, fenantrolin, baikalein, proksikromil, tioetri, dialil sulfid i di-(1-propenil) sulfid.

[0291] Antagonisti receptora leukotriena uključuju kalcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck i Co. MK-591, Merck i Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SK i F-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 i Teijin TEI-1338.

Predmeti proizvodnje

[0292] U još jednom aspektu, ovde je uključen predmet proizvodnje koji sadrži materijale korisne za tretman ovde opisanih poremećaja. Taj predmet proizvodnje obuhvata kontejner i oznaku. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, fijolice, špriceve, i ispitne epruvete. Ti kontejneri mogu biti formirani od raznih materijala kao što je staklo ili plastika. Taj kontejner drži kompoziciju koja je efektivna za tretiranje stanja i mora imati sterilan pristupni port. Na primer, kontejner može biti kesa sa intravenoznim rastvorom ili fijola koja ima zatvarač koji se može probušiti potkožnom injekcionom iglom. Aktivni agens u kompoziciji je humanizovano anti-CD40 antitelo. Oznaka na ili povezana sa kontejnerom ukazuje na to da se kompozicija koristi za tretiranje odabranog stanja. Predmet proizvodnje može dalje da obuhvata drugi kontejner koji obuhvata farmaceutski-prihvatljiv pufer, kao što je fosfat-puferovani slani rastvor, Ringerov rastvorn, i rastvor dekstroze. On dalje može da uključi druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući drufe pufere, rastvarače, filtere, igle, špriceve, i umetke sa uputstvima za upotrebu.

[0293] Ovaj pronalazak dalje je opisan u primerima koji slede, koji nisu namenjeni da ograniče obim ovog pronalaska.

1

PRIMERI

Primer 1: Proizvodnja humanizovanog anti-CD40 antitela

[0294] Mišji antitela 20E2, i 2H11 prikazana su u Tabelama 1 i 2. Završena je humanizacija 20E2, i 2H11 klonova. Izrađena je biblioteka u kojoj se humani i mišji ostaci razlikuju na takav način da u bilo kom datom položaju može postojati ili humani ili mišji ostatak. Takva biblioteka izrađena je za one aminokiseline koje se razlikuju između humanog embrionskog i mišjeg antitela. Odabrani su samo klonovi koji zadržavaju funkciju roditeljskog antitela.

[0295] Na ovaj način, Antitelo a, Antitelo B i Antitelo C su humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 20E2 (Antitelo A i Antitelo B) ili 2H11 (Antitelo C) klonirano u humani IgG1-KO (KO=nokaut)/kapa kičme. IgG1-KO ima dve mutacije u Fc regionu, Leu234Ala i Leu235Ala radi redukovanja FcγR i komplementa vezivanja.

[0296] Rezultati takvih humanizacija rezultirali su kao razne humanizovane varijabilne sekvence teških i lakih lanaca, prikazane ispod:

2

4

[0297] Primerna humanizovana antitela koja su opisana su ona koja imaju sekvence teških i lakih lanaca navedene sledećoj tabeli. Zadebljane podvučene sekvence u sledećoj tabeli su varijabilni domeni dok su normalne, nepodvučene sekvence konstantni domeni :

tteo ( eš aac, gG) 8

[0298] Varijabilni regioni were podklonirani su na jedan ili dva različita pogodna IgG ekspresiona vektora:

A) humani IgG1-KO (nokaut)/kapa format sa Leu234Ala, Leu235Ala dvostrukim mutacijama u Fc regionu radi redukovanja efektorske funkcije kao što je FcγR i komplement vezivanja

B) humani IgG4-DM (dvostruki mutant)/kapa format sa Ser228Pro mutacijom u regionu zgloba radi redukovanja pojavljivanja IgG4 polu-molekula i Leu235Glu mutacijom radi daljeg redukovanja FcγR vezivanja

[0299] Dva kandidata Antitelo A i Antitelo B prečišćena su i procenjena na osnovu sledećih kriterijuma:

• Pojavljivanje CCF (zamućenost)

• Filtracione karakteristike CCF

• Prinos na rProteinA-u

• Zamućenost nakon eluiranja i neutralisanja

• Ratvorljivi agregati (SEC)

• Čistoća/obrazac kontaminacije (SDS)

• Obrazac naelektrisanja (IEF)

Primer 2: In vitro podaci

[0300] Antitelo A, Antitelo B i Antitelo C okarakterisana su zajedno sa antitelima 4D11 (Kirin/ Astellas) i PG-102 (PanGenetics) koja su proizvedena na osnovu objavljenih sekvenci. Podaci za Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C i 4D11 prikazani su ispod. PG-102 pokazuje agonističku aktivnost i samo nepotpunu inhibiciju proliferacije B ćelija (nije prikazano). Tabela 2.2. sumura dobijene podatke. Detaljniji opisa podataka sledi u Tabeli 2.2.

Tabela 2.2. Rezime in vitro popodaka antitela A, Antitela B i Antitela C i Kirinovog 4D11 Anti-CD40 antitela.

A. Vezivanje humanizovanog antitela za celularni CD40 i rekombinantan CD40 protein [0301] Specifično vezivanje humanizovanog antitela za celularni CD40 analizirano je protočnom citometrijom upotrebom humanih CD40-transfektovanih HEK293 ćelija. Primećeno je vezivanje zavisno od koncentracije antitela A, Antitelo B, i Antitelo C. Antitela koja su pokazala sličan profil vezivanja prikazana su na FIG 1B. EC50 vrednosti antitela ovog pronalaska i Kirin-ovo antitelo 4D11 bila su sva u ustom opsegu od ∼1 nM što je najverovatnije na granici osetljivosti ispitivanja zbog visokih nivoa CD40 u transfektovanim ćelijama. Specifično vezivanje humanizovanog antitela za celularni CD40 na humanim Ramos ćelijama takođe je pokazalo vezivanje zavisno od koncentracije. Antitela su pokazala nešto različitije profile vezivanja (prikazano na FIG 2) i EC50 vrednosti između 0.21-1.22 nM. Vezivanje nije primećeno na CD40 negativnim ćelijama kao što su ne-transfektovane HEK293 ćelije ili T ćelijska linija HSB-2 čime se potvrđuje selektivno vezivanje za CD40 (podaci nisu prikazani).

[0302] Afinitet vezivanja antitela A, antitela B i antitela C za humani CD40-Fc protein izmereno je putem ForteBio Octet i otkrivene su konstante disocijacije (KD) od <100 pM. Zbog efekata avidnosti bivalincije antitela i CD40-Fc sprečeno je precizno određivanje Kd-i ispod 100 pM. Dodatno, vezivanje za CD40-Fc analizirano je u odsustvu i prisustvu 50% humanog seruma i nije primećen značajan efekat seruma na vezivanje (podaci nisu prikazani)

B. Aktivnost humanizovanog antitela u ispitivanjima aktivacije/proliferacije B ćelija

[0303] Aktivnost humanizovanog antitela testirana je u ispitivanju proliferacije B ćelije u kojem su humane B ćelije izvedene iz periferne krvi stimulisane rekombinantnim CD40L u prisustvu IL-2 i IL-4. Antitelo A, Antitelo B i Antitelo C pokazala su potentnu inhibiciju proliferacije B ćelija (prikazano na FIG 3A i 3B). Poređenje krive inhibicije i IC50 vrednosti BI antitela i Kirin antitela 4D11, ukazuje da 4D11 antitelo ima veću potentnost (FIG 3B i 4) kada je testirano na više donora. Kada je testirano na agonističku aktivnost u odsustvu CD40L, antitela, Antitelo B Antitelo A i Antitelo C nisu indukovala B ćelijsku proliferaciju iznad pozadinskih nivoa pri koncentraciji od do 10 µg/ml (67 nM) (prikazano na FIG 4) slično 4D11 antitelu.

[0304] Konkurentno antitelo 4D11 pokazalo je da je blago potentnije sa prosečnom IC50 of ∼0.02 nM, kao i odsustvo agonističkih efekata. Podaci za tri BI antitela i 4D11 sumirani su na FIG 4 i gornjoj Tabeli 2.2. Još jedno konkuretno antitelo, PG-102 (izvedeno iz klona 5D12), koje je takođe testirano u ovom ispitivanju, pokazalo je značajne agonističke efekte stimulišući proliferaciju B ćelija u odsustvu CD40L (FIG 4). Prema tome, manjak agonističke aktivnosti vodećih kandidata jasno ih razlikuje od PG-102.

[0305] U drugom ispitivanju antitela su procenjena na inhibiranje CD86 poboljšanom regulacijom u humanim B ćelijama. U ovom slučaju, ispitivanje se može izvesti sa punom ljudskom krvi ili u prečišćenim B ćelijama, obe u prisustvu egzogenog CD40L. U skladu sa podacima proliferacije B ćelija, Antitelo B Antitelo A i Antitelo C testirana u punoj ljudskoj krvi pokazala su potentnu inhibiciju CD40-posredovanog CD86 poboljšanom regulacijom kako je izmereno protočnom citometrijom (prikazano na FIG 5). Antitelo C pokazalo je sličnu potentnost sa 4D11 u ovom ispitivanju dok je potentnost antitela B i antitela A bila nešto slabija. Poređenje antitela B i 4D11 na prečišćene B ćelije ili u punoj krvi, pokazalo je da je potentnost antitela B (IC50 i IC90 vrednosti) relativno nepromenjena za prečišćene B ćelije u poređenju sa

1

B ćelijama u prisustvu drugih ćelija ili seruma koji nose CD40, dok 4D11 prolazi kroz dramatično pomeranje u potenciji u uslovima pune krvi (prikazano na FIG 6).

[0306] Slični podaci su dobijeni kada su Antitelo B Antitelo A i Antitelo C procenjeni na inhibiranje CD86 poboljšanom regulacijom na B ćelijama makaki majmuna izvođenjem sa uzorcima pune krvi (prikazano na FIG 7). Antitelo B Antitelo A i Antitelo C testirani na punoj krvi makaki majmuna pokazala su potentnu ihnibiciju CD40-posredovanog CD86 poboljšanom regulacijom kako je izmereno protočnom citometrijom. Prema tome, sva ova antitela pokazuju funkcionalnu unakrsnu reaktivnost ka CD40 makaki majmuna sa sličnom potencijom ka humanom CD40.

[0307] Aktivnosti antitela B IgG1KOb i antitela B IgG1WT procenjene su na sposobnost da posreduju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (FIG 13). U ovom ispitivanju RAMOS ćelije su inkubirane sa humanom PBMC na efektoru za odnos ciljanih ćelija od 50:1. Antitelo B IgG1KOb i Antitelo B IgG1WT titrirana su iz 20 ug/ml , a stepen ćelijske smrti praćem je oslobađanjem LDH. Prikazani su podaci jednog reprezentativnog eksperimenta. Podaci pokazuju da je Antitelo A IgG1Wt 20E2-12-RIgG1WT efektivni posrednik ADCC, a da Antitelo B IgG1KOb koje sadrži mutacije koje eliminišu efektorsku funkciju nema ADCC aktivnost.

Primer 3: Farmakokinetička/farmakodinamička ispitivanja

A. Jedno-dozno IV davanje antitela A i antitela B pri 1 ili 10 mg/kg makaki majmunima [0308] Svako antitelo A i antitelo B dozirano je pri 1 i 10 mg/kg IV mužijacima, makaki majmuna (N=3)/doza. Uzorci krvi sakupljeni su od 0-504 sati (3 nedelje), serum je izdvojen, a uzorci su smešteni na -20°C do analiziranja. Uzorci su analizirani sendvič ELISA kako je prethodno opisano. Profili koncentracije seruma u vremenu oba antitela kod majmuna nakon obe IV doze i farmakokinetički parametri sumirani su na FIG 8 i Tabelama 2.7.1 (Antitelo A) i 2.7.2 (Antitelo B) prikazanim u nastavku. Oba antitela pokazala su dozno zavisne farmakokinetike što ukazuje da se pri niskoj dozi, klirens uglavnom pripisuje konzistentnosti sa dispozicijom posredovanom ciljanjem dok je pri višoj dozi antitelo očišćeno pre svega katabolizmom. Slični dozno-zavisni farmakokinetički profili primećeni su za druge Mab koja ciljaju ciljeve povezane sa membranama (npr. CD19, CD20, EGFR, CD146 i HER2). Klirens za Antitelo A bio je 0.8 i 0.1 mL/h/kg za 1 i 10 mg/kg doze, respektivno. Klirens za Antitelo B bio je 0.7 i 0.1 mL/hr/kg za 1 i 10 mg/kg doze, respektivno. Slično, polu-život antitela A iznosio je 1 i 13 dana za 1 i 10 mg/kg doze, respektivno, a polu-život antitela B iznosio je 2 i 13 dana za iste respektivne doze.

2

Iako je antitelo B imalo marginalno duži polu-život pri višoj dozi u odnosu na istu dozu za antitelo A, ova razlika ne bi trebalo da se prevede u postojaniju izloženost nakon hroničnog davanja. AUC za oba jedinjenja bio je supraproporcionalan, a zapremina distribucije (Vss) za oba jedinjenja približno je odgovarao zapremini plazme (∼40 mL/kg) pokazujući ograničenu distribuciju u tkivu što je tipično primećeno za veće, polarnije proteinske terapeutske proizvode. Sve ukupno, nije bilo znatnih razlika u farmakokinetičkim parametrima između ova dva antitela.

Tabela 2.7.1: Farmakokinetički parametri antitela A kod mužijaka, makaki majmuna (N=3)/doza nakon jedne 1 i 10 mg/kg IV doza.

Tabela 2.7.2: Farmakokinetički parametri antitela B kod mužijaka, makaki majmuna (N=3)/doza nakon jedne 1 i 10 mg/kg IV doza.

B. Ex vivo Farmakodinamičko ispitivanje

[0309] Kao deo prethodno opisanog FK ispitivanja, analizirani su farmakodinamički efekti anti-CD40 antitela. U tom smislu, uzorci pune krvi inkubisani su rekombinantnim CD40L preko noći, a povećanje CD86 ekspresije na B ćelije zabeleženo je protočnom citometrijom. Uzorci su analizirani na dan 0 (pre tretmana), dan 2, 7 i 14 nakon doziranja. Iako je povećanje u CD86 ekspresiju relativno malo (∼5-20-%) primećen je dozno-zavisni efekat (prikazano na FIG 9). U grupi životinja doziranih sa 10 mg/kg antitela A i antitela B, CD86 indukcija potpuno je inhibirana 2, 7 i 14 dana konzistentno sa održivim izlaganjem pri toj dozi. Životinje dozirane sa 1 mg/kg pokazala su potpunu inhibiciju na dan 2, delimičnu inhibiciju na dan 7 i nikakvu inhibiciju na dan 14. Gubitak farmakodinamičkog efekta tokom vremena odgovara bržem klirensu antitela u grupu koja je primala nižu dozu.

Primer 4: Ispitivanja povezana sa toksičnošću: CD40 na trombocitima

[0310] CD40 konstitutivno je eksprimiran na humanim trombocitima (Henn, et al., 2001) i (Inwald, et al., 2003), dok je CD40L rapidno i tranzijentno eksprimiran na ćelijskoj površini aktiviranih trombocita (Henn, et al., 2001). Kako se za anti-CD40 antitela bez FcγR vezivanje nije moglo očekivati da imaju efekte na trombocitima, važno je direktno pokazati da je to ove slučaj. Ispitivanja protočne citometrije izvedena su kako bi se pokazalo vezivanje anti-CD40 vodećih kandidata za humane i makaki trombocite.

[0311] Prethodno je pokazano protočnom citometrijom da se G28.5 i mAb 89 anti-CD40 mAb vezuju za mirujuće humane trombocite (Henn, et al., 2001). Ovo je potvrđeno primenom FITC-obeleženog G28.5 antitela. Pripremljena su 5-struka serijska razblaženja G28.5, a opseg od 0.5 µg/ml do 0.32ng/ml inkubisan je u 100 µl trombocita dobijenih od ljudi (2 donora) ili makaki majmuna (3 donora) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Dodatno, APC-obeleženo anti-CD45 mAb korišćeno je za identifikovanje trombocita vezanih za druge CD40<+>ćelijske tipove tako da isključuju ove ćelije iz analize. Nakon bojenja antitela, trombociti su oprani i fiksirani sa Optilyse C i izvedena je protočna citometrija. Određen je srednji intezitet fluorescencije (MFI) merenjem vezivanja antitela za CD45<->trombocite.

[0312] Komercijalno dostupno 5c3 i odabrana antitela ovog pronalaska anti-CD40 mišja mAb su obelećena sa FITC. Potvrđeno je vezivanje za Ramos ćelije. Broj FITC molekula po molekulu antitela kretao se od 2 do 4 FITC po molekulu antitela. Pet-struka serijska razblaćenja komercijalnog i kandidatnog anti-CD40 mAb pripremljena su u opsegu od 0.5 µg/ml do 0.32 ng/ml i inkubisana sa ljudskim (3 donora) i makaki (2 donora) trombicitima tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

[0313] Reprezentativni grafikon koji pokazuje vezivanje mišjeg kandidata anti-CD40 mAb za humane trombocite prikazan je na FIG 11. Četiri kandidatna monoklonalna antitela pokazala su specifično vezivanje za humane trombociti u poređenju sa FITC-obeleženim izotip kontrolnim antitelom. 10F2, 2H11, 19B10 i 20E2 pokazala su uporedivo vezivanje sa trombocitima. Sličan trend primečen je i za makaki trombocite (podaci nisu prikazani).

[0314] Pored ovih ispitivanja, direktno obeleženo antitelo B i 4D11 upoređena su na aktivnost da se vežu za trombocite i B ćelije u uzorcima pune krvi čoveka i makaki majmuna (prikazano na FIG 12). 4D11 pokazuje slično vezivanje (kako je prikazano sa EC50) i za B ćelije i

4

trombocite u krvnim uzorcima čoveka i makaki majmuna. Antitelo B pokazuje sličan obrazac, ali sa znatno slabijom potencijom vezivanja.

Primer 5: In vivo farmakološka ispitivanja u NSG mišjem modelu

[0315] Efikasnost humanizovanih antitela, antitelo A, procenjena je u proizvodnji modela antitela u kojem su humani PBMC injektovani u imunodeficijentne NSG miševe kako bi se generisao kalem vs. domaćin odgovor. Značajna proizvodnja humanog IgM (hIgM) i IgG (hIgG) može se primetiti počevši od 2 nedelje nakon prihvatanja kalema. Tretman antitelom A pri dozi od 5 i 1 mg/kg značajno je inhibirao hIgG i hIgM odgovor u 2 i 3 nedelji nakon prihvatanja kalema. Upoređujuće antitelo (4D11) procenjeno je pri jednoj 5 mg/kg dozi i takoše je pokazalo ukidanje odgovora. U drugom ispitivanju sva antitela Antitelo A, Antitelo B i Antitelo C testirana su pri jednoj dozi od 1 mg/kg i pokazala su potpunu inhibiciju IgM i IgG odgovora u 2 nedelji (FIG 10).

Primer 6: Analiza biomarkera

[0316] Poboljšana regulacija receptora: CD40L-indukovana poboljšana regulacija receptora može se izmeriti protočnom citometrijom. Puna ljudska krv može biti stimulisana optimizovanom koncentracijom rastvorljivog CD40L, a puna koncentracija CD20+Receptor+ ćelije može biti izmerena protočnom citometrijom. Promena u procentu CD86 ekspresije na CD20 pozitivne ćelije izmerena je paralelno sa makaki fk ispitivanjem koje ispituje antitela A i B (FIG 9). Podaci pokazuju inhibiciju CD86 poboljšane regulacije u vremenskim tačkama konzistentna sa izlaganjem antitela.

[0317] Ciljana proteomika: Povišeno lučenje proteina nakon CD40 stimulacije u punoj krvi može se koristiti ka potencijalni biomarker(i). Optimizovane koncentracije rastvorljivog CD40L i vreme stimulisanja utvrđeni su primenom Luminex platforme multipleks perla koja detektuje MDC/CCL22 i nekoliko drugih izlučenih proteina. Klinički uzorci biće procenjeni iz pune ljudske krvi u punom doznom ospegu anti-CD40 mAb.

[0318] Zauzetost receptora: Zauzetost CD40 receptora može se odrediti u in vitro ili ex vivo ispitivanju na osnovu analite protočne citomerije B ćelija u punoj ljudskoj krvi. Trenutni kandidati antitelo predmeta pronalaska i nekompetitivno anti-CD40 antitelo 5C3 koristiće se za kvantitativno ispitivanje zauzetosti receptora.

Primer 7: Anti-Tumor Aktivnost humanizovanog anti-CD40 antitela

[0319] U nekim slučajevima može biti poželjno da se odrede antitumor karakteristike antitela ovog pronalaska. Takvo određivanje može se izvesti ispitivanjem antitumor aktivnosti humanizovanog anti-CD40 antitela na SCID mišjem limfom ksenograft modelu. U takav SCID model mogu se injektovati kancer ćelije radi uvođenja tumora, npr., 5x 10<6>milion tumor ćelija može se injektovati subkutano u SCID miševe (10/grupa) trinaest dana pre početka tretmana lekom. Mišja anti-CD40 antitela ovog pronalaska ili poređenje (npr., kontrola ili drugo humanizovano antitelo) data su intra-peritonealno 3 nedeljno (4 mg/kg/doza) sa 8 ili 5 datih doza. Razvoj i rast tumora praćeno je kod miševa, a zapremina tumora može se meriti nedeljno tokom odabranog ispitnog perioda, npr., 14-dnevnog ispitnog perioda. Poželjno rezultati će pokazati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili višestruko povećanje u rastu tumora kod kontrolnih miševa u poređenju sa miševima tretiranim sa antitelima ovog pronalaska. Poželjno, tokom perioda tretiranja, rast tumora kod miševa tretiranih sa antitelima ovog pronalaska biće zanemarljiv. Takvi podaci mogu potkrepiti činjenicu da je testirano humanizovano antitelo efektivno u suzbijanju rasta tumora u ovom B limfom ksenograft modelu.

Primer 8: Produženo preživljavanje humanizovanim anti-CD40 antitelom

[0320] Efikasnost humanizovanog anti-CD40 antitela na preživljavanje tumor-nosećih miševa kakvi su prethodno opisani može se ispitati na SCID mišjem limfom ksenograft modelu. SCID miševi (10/grupa) inokulisani su intravenozno sa 1 x 10<6>miliona tumor ćelija tri dana pre tretmana antitelom. Miševi su zatim tretirani mišjim ili humanizovanim anti-CD40 antitelima ovog pronalaska ili Ig kontrolom, davani intraperitonealno dve nedeljno (4 mg/kg/doza) za ukupno pet doza. Mišji kavezi zatim su pregledavani dnevno na smrtnost kako bi se odredio nivo efikasnosti antitela u prolongiranju preživljavanja subjekta koji ima kancer.

1

11

12

1

14

1

1

1

1

�

11

11

11

11

11

11

11

��

12

12

12

��

12

��

1

11

12

�

14

1

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Humanizovano anti-CD40 antitelo koje ima varijabilan teški lanac i varijabilan laki lanac koji sadrže aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:53 i SEQ ID NO:52, redom, gde antitelo sadrži humani imunoglobulinski Fc region i gde antitelo je IgG1 antitelo.

2. Humanizovano anti-CD40 antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 1 koje ima laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO:31 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35.

3. Humanizovano anti-CD40 antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, gde antitelo ima Leu234Ala i Leu235Ala mutaciju u Fc regionu.

4. Humanizovano anti-CD40 antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 za primenu u lečenju ili ublažavanju bolesti ili poremećaja kod sisara.

5. Humanizovano anti-CD40 antitelo za primenu kao u patentnom zahtevu 4, gde bolest ili poremećaj je odabran iz grupe koja se sastoji od: bolesti kalem protiv domaćina, autoimune ili inflamatorne bolesti, i CD40-eksprimirajućeg kancera.

6. Humanizovano anti-CD40 antitelo za primenu kao u patentnom zahtevu 5, gde autoimuna ili inflamatorna bolest je odabrana iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, multiple skleroze, proliferativnog lupus glomerulonefritisa, inflamatorne bolesti creva (IBD), psorijaze, idiopatske trombocitopenične purpure (ITP), Kronove bolesti i sistemskog lupusa eritematozusa (SLE), Hašimoto tiroiditisa, primarnog miksoedema, tirotoksikoze/Gravesove bolesti, perniciozne anemije, autoimunog atrofičnog gastritisa, autoimunog karditisa, Adisonove bolesti, preuranjene menopauze, tip 1-dijabetes melitusa, Goodpastureovog sindroma, mijastenije gravis, autoimune hemolitičke anemije, idiopatske leukopenije, primarne bilijarne ciroze, aktivnog hroničnog hepatitisa (HBs Ag negativan), kriptogene ciroze, Sjogrenovog sindroma, dermatomiozitisa, skleroderme, mešovite bolesti vezivnog tkiva, diskoidnog lupus eritematozusa, i sistemskog vaskulitisa.

7. Humanizovano anti-CD40 antitelo za primenu kao u bilo kom od patentnih zahteva 4-6, za primenu sa drugim terapijskim agensom.

8. Humanizovano anti-CD40 antitelo za primenu kao u bilo kom od patentnih zahteva 4-7, gde navedeno antitelo se administrira putem parenteralnog načina, intravenskog načina ili subkutanog načina administracije.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži: (i) humanizovano anti-CD40 antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3; i (ii) farmaceutski prihvatljiv ekscipijens; i gde antitelo je po izboru konjugovano sa drugim agensom.

10. Izolovani polinukleotidi koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovano anti-CD40 antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca sa SEQ ID NO: 53 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca sa SEQ ID NO: 52, gde antitelo sadrži humani imunoglobulinski Fc region i gde antitelo je IgG1 antitelo.

1