RS60711B1 - Novi izooblici tripsina i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nove izooblike ZT tripsina. Posebno, pronalazak se odnosi na upotrebu izooblika ZT tripsina u medicinskim spravama, farmaceutskim sredstvima i kozmetičkim sredstvima.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Proteinaze su enzimi koje su definisane njihovom sposobnošću cepanja proteina. Proteinaze mogu da cepaju supstrate na različitim amino ostacima u proteinskoj sekvenci pokazujući razliku u specifičnosti za supstrat. Tripsini su proteinaze i delom su određene njihovim preferencijama u cepanju C-terminalnih ostataka arginina ili lizina (Olsen, Ong et al., 2004, Mol Cell Proteomics 3: 608-614). Postupak multipleksnog profilisanja supstrata otkriva mesta cepanja proteinaza i prikazuje kritičan značaj ostataka koji okružuju njihovo mesto vezivanja za njihovu specifičnost (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100).

[0003] U.S. Patent Br-i. 4,801,451 i 4,963,491 prikazuju smešu egzo- i endopeptidaza izolovanih iz antarktičkog krila (Euphasia superba) i upotrebu ove smeše kao rastvora za čišćenje. 4,801,451 prikazuje upotrebu takvih enzima za uklanjanje strane materije i mrtvog tkiva iz rana. WO 85/04809 prikazuje upotrebu enzima poreklom iz krila kao agensa koji promoviše digestiju. EP-A1-0170115 prikazuje upotrebu enzima poreklom iz krika za razlaganje krvnih ugrušaka. Međutim, svaka od ovih referenci prikazuje nečiste ili slabo karakterisane materijale. Prečišćena peptidaza ili smeša prečićenih peptidaza je poželjna kako bi se obezbedio farmaceutski koristan proizvod.

[0004] WO 96/24371 prikazuje upotrebu multifunkcionalnog proteolitičkog enzima poreklom iz krila i proteolitičkih enizma dobijenih iz familije rakova i riba koji su strukturno slični sa multifunkcionalnim enzimom poreklom iz antarktičkog krila. Dokument se takođe odnosi na postupke prečišćavanja multifunkcionalnog enzima i na farmaceutske, kozmetičke i druge upotrebe multifunkcionalnog enzima. Strukturalna sličnost sa multifunkcionalnim enzimom koji je dobijen iz antarktičkog krila u tom dokumentu je definisana kao najmanje 70% homologija sa multifunkcionalnom hidrolazom koja je dobijena iz krila.

[0005] WO 2000078332 prikazuje upotrebu tripsina poreklom iz bakalara i himotripsina u farmaceutskim kompozicijama ili lekovima za lokalnu i topikalnu primenu za lečenje bolesti unutrašnjeg sistema i poremećaja i za kozmetičku upotrebu takvih enzima. Topikalna upotreba za lečenje lokalnih, poremećaja unutrašnjih sistema, bez da enzim mora da prođe kroz otvorene rane ili mukozno tkivo, otkrivena je kao efikasna. Serinske proteinaze prikazane u WO 2000078332 su proteinaze sa najmanje 90% homologijom u sekvenci amonokiselina sa tripsinom I, tripsinom II, tripsinom III, tripsinom IV dobijenim iz atlanskog bakalara i proteinaze koje su himotripsin imaju najmanje 90% homologiju sekvence aminokiselina sa bilo kojim himotripsinom A i himotripsinom B izolovanim iz atlanskog bakalara.

[0006] Komplementarna DNK (cDNK) koja kodira tripsin Y je izolovana iz biblioteke cDNK atlantskog bakalara (Spilliaert i Gudmundsdottir, 1999, Mar Biotechnol (NY) 1: 598-607). Tripsin Y poreklom iz bakalara je približno 45% identičan sa dva tripsin I i X atlanskog bakalara (WO 2000078332). Nativni tripsin Y i rekombinantni oblici tripsina Y su prethodno ukratko opisani (Palsdottir i Gudmundsdottir, 2007, Protein Expr Purif 51: 243-252, Palsdottir and Gudmundsdottir, 2008, Food Chemistry 111: 408-414).

Suština pronalaska

[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove izooblike tripsina, pod imenom izooblici ZT tripsina. Takvi izooblici se dobijaju iz riba, kao što je atlantski bakalar, ili se mogu dobiti u rekombinantnom obliku upotrebom proteinskih ekspresionih sistema. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje kompozicije koje sadrže najmanje jedan izolovan izooblik ZT tripsina bakalara prema predmetnom pronalasku, zajedno sa odgovarajućim ekscipijentima i nosačima.

[0008] Pronalazači su identifikovali neočekivane, korisne i jedinstevene karakteristike novih izooblika ZT tripsina u odnosu na prethodno poznate tripsine. Ove karakteristike obezbeđuju prednost u korišćenju izooblika ZT tripsina za različite primene u medicinskim spravama, farmaceutskim sredstvima i kozmetičkim sredstvima. Predmetni pronalazak obezbeđuje pomenute izooblike ZT tripsina per se i za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje su uzrokovane patogenim organizmima. Ovo je od posebnog značaja za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti u gornjem respiratornom traktu koja je uzrokovana patogenim mikroorganizmima. Za tu svrhu, izooblici ZT tripsina mogu na primer da se koriste u medicinskim spravama kao aktivni sastojak(ci) u farmaceutskom sredstvu. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje pomenute izooblike ZT tripsina za upotrebu u lečenju infekcija rana i rana uzrokovanih opekotinama, za upotrebu u uklanjanju mrtve ili ljušćene kože sa inače zdrave kože na primer u medicinskoj spravi, kao što je farmaceutsko sredstvo ili kozmetičko sredstvo. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke za dobijanje izooblika ZT tripsina bakalara iz predmetnog pronalaska.

• Na osnovu multipleksnog profilisanja supstrata, izooblici ZT tripsina preferiraju cepanje na Arg ostacima u poređenju sa tripsinom I.

Tripsin I preferira cepanje na Lys ostacima u poređenju sa izooblicima ZT tripsina.

• Multipleksno profilisanje supstrata pokazuje da različiti aminokiselinski ostaci u supstratu koji okružuju mesto cepanja imaju veliki uticaj na cepanje (oko četiri aminokiselinska ostatka na N terminalnoj strani i oko četiri aminokiselinska ostatka na C terminalnoj strani). Izooblici ZT tripsina preferiraju određene aminokiselinske ostatke koji okružuju mesto cepanja preko tripsina I.

• Aminokiselinske sekvence bogate u argininu i lizinu se često mogu pronaći u virusnim-, bakterijskim- i parazitskim sekvencama koje su povezane sa infekcijom.

• Numeričke vrednosti zasnovane na standardnom rezultatima (Z-rezulat) odnosa (podaci multipleks profilisanja supstrata) pokazuju da su izooblici ZT tripsina mnogo bolje prilagođeni za cepanje peptida koji sadrži nekoliko uzastopnih baznih aminokiselinskih ostataka (Arg i Lys) u poređenju sa tripsinom I. Na osnovu podataka, izooblici ZT tripsina mogu da deluju kao antimikrobijalni agensi protiv virusa i bakterija i mogu da deluju cepanjem na grupisane bazne aminokiselinske ostatke kao što su lizin i arginin.

Detaljan opis pronalaska

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove izooblike tripsina, poznate pod imenom izooblici ZT tripsina. Takvi izooblici se mogu izolovati iz riba, kao što je atlantski bakalar, ili se mogu dobiti u rekombinantnom obliku upotrebom proteinskih ekspresionih sistema. Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu takvih izooblika ZT tripsina za lečenje i prevenciju bolesti i u kozmetičkoj oblasti. Posebno, pronalazak se odnosi na nove izooblike ZT tripsina atlanskog bakalara, koje su korisne kao farmaceutska sredstva, u medicinskim spravama, i u kozmetičkim sredstvima.

Kratak opis nacrta

[0010]

SL1 prikazuje izolovanje izooblika ZT tripsina sa anjon izmenjivačkom hromatografijom. Hromatogram sa MonoQ razdvajanja benzamidinom prečišćenih izooblika tripsina bakalara pokazuje apsorbancu na 280 nm u odnosu na vreme eluiranja. Izooblici tripsina bakalara su naneti na MonoQ kolonu i proteini su eluirani gradijentom soli (istačkana linija). Strelica pokazuje maksimum koji sadrži izooblike ZT tripsina. Kolona je ekvilibrisana sa puferom (20 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0), i enzimi su eluirani sa linearnim 0-150 mM NaCl gradijentom u zapreminama 40 kolona, linearnim 150-620 mM NaCl u zapreminama 6 kolona, 620-850 mM NaCl u zapreminama 10 kolona na brzini protoka od 1 mL/min.

SL 2 prikazuje SDS-PAGE ZT izooblika tripsina bakalara. SDS-PAGE analiza anjon izmenjivačke hromatografije maksimuma obeleženog tripsinom ZT iz Slike 1. Tripsin 1, tripsin 5 i tripsin 7 su pročišćeni i izolovani iz izooblika X i tripsina bakalara. Tripsin X bakalara je blisko povezan sa tripsinom I bakalara, sa razlikom od oko osam aminokiselinskih ostataka. Proteini su razvijeni sa SDS-PAGE i gel je obojen srebrom. Kolone i brojevi sa leve strane pokazuju kretanje i molekulsku težinu u kDa standardnih proteina (Dalton Mark VII-L) razdvojenih na gelu.

SL 3 prikazuje Western blot analizu tripsina X bakalara (tripsin 1, tripsin 5 i tripsin 7) i izooblike ZT tripsina. Tripsin X bakalara i izooblici ZT tripsina su izloženi SDS-PAGE. Nakon transfera, uzorci su imunoblotovani sa antitelima koja reaguju na tripsin I/X (panel na vrhu) i izooblikom ZT tripsina (panel pri dnu). Ovo pokazuje da su izooblici ZT tripsina razdvojeni od tripsina I/X izmenom anjona. Kao što se može uočiti na SL 3, poliklonalno antitelo koje reaguje protiv izooblika ZT tripsina nema ukrštenu reakciju sa tripsinom I/X i peptidno antitelo koje je nastalo protiv tripsina I/X nema ukrštenu reakciju sa izooblicima ZT tripsina.

SL 4 prikazuje Venn.ov dijagram koji ilustruje zajednička i jedinstvena cepanja dobijena od tripsina ZT i tripsina I u tri različite vremenske tačke u multipleks analizi profilisanja supstrata. Broj zajedničkih (crno) i jedinstvenih mesta cepanja sa tripsin ZT (belo na levoj strani) i tripsina I (belo na desnoj strani) posle perioda inkubacije od 5 min. (A), 15 min. (B) i 60 min (C). Slika prikazuje da u svim vremenskim tačkama postoje zajednička mesta cepanja i jedinstvena mesta cepanja za tripsin ZT i tripsin I kod 124 definisana peptida (svaki sadrži 14 aminokiselinskih ostataka) u biblioteci. Podaci pokazuju da je specifičnost supstrata za tripsin ZT različita od onog za tripsin I.

SL 5 prikazuje antiviralnu aktivnost tripsina ZT protiv enterovirusa (Koksakivirus B2). Y osa prikazuje procenat inficiranih bunarića u poređenju sa kontrolom i X osa pokazuje kontrolu (levi stub) i lečenje sa izooblicima ZT tripsina (desni stub).

[0011] Pronalazači su identifikovali nove izooblike tripsina koji su poznati pod imenom izooblici ZT tripsina. Tripsin ZT uključuje najmanje sledeće izooblike: izooblik ZT-1 tripsina atlanskog bakalara, izooblik ZT-2 tripsina atlanskog bakalara, izooblik ZT-3 tripsina atlanskog bakalara i izooblik ZT-4 tripsina atlanskog bakalara. Sva četiri izooblika ZT tripsina atlanskog bakalara imaju sličnu molekulsku masu od oko 25 kDa. Izooblici ZT tripsina atlanskog bakalara iz predmetnog pronalaska su predstavljeni sledećim aminokiselinskim sekvencama:

gde

X1je izabran od I i V;

X2je izabran od Q i H;

X3je izabran od D i E;

X4je izabran od R i N;

X5je L;

X6je izabran od T i P;

X7je izabran od D i A;

X8je izabran od E i Q;

X9je izabran od A i S;

X10je izabran od V i M;

X11je izabran od A i V;

X12je izabran od Y i F;

X13je izabran od A i V;

X14je izabran od Q i R;

X15je izabran od L i E;

X16je izabran od Y i S; i

X17je izabran od Y i F.

Izooblik ZT-1 tripsina atlanskog bakalara

Izooblik ZT-2 tripsina atlanskog bakalara

Izooblik ZT-3 tripsina atlanskog bakalara

Izooblik ZT-4 tripsina atlanskog bakalara

[0012] Izooblici ZT tripsina iz predmetnog pronalaska su manje od 50% slične u sekvenci aminokiselina sa tripsinima koji su prikazani u WO 2000078332 i manje od 45% homologije sa himotripsinima koji su prikazani u WO 2000078332.

[0013] Gore navedeni izooblici ZT tripsina predstavljaju aktivne varijante ovih tripsina, tj. varijante koje se aktiviraju kada se N kraj tripsina iseče. Ovi tripsini su proteini koji su eksprimirani u piloričnom cekumu (tkivo pankreasa kod riba) sa brojnim aminokiselinama na N terminalnom kraju koje su važne za sekreciju izvan ćelije i za održavanje enzima inaktivnim. Izooblici ZT tripsina pune dužine su ovde takođe prikazani kao

Izooblik ZT-1 tripsina atlanskog bakalara pune dužine

Izooblik ZT-2 tripsina atlanskog bakalara pune dužine

Izooblik ZT-3 tripsina atlanskog bakalara pune dužine

Izooblik ZT-4 tripsina atlanskog bakalara pune dužine

[0014] Multipleksno profilisanje supstrata se koristi za analizu specifičnosti enzima za supstrat (proteinaze) (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Proteinaze mogu da cepaju supstrate na različitim amino ostacima u peptidnoj sekvenci što pokazuje razliku u specifičnosti za supstrat. Tripsini se određuju prema njihovim preferencijama u cepanju C-kraja do ostataka arginina ili lizina. Neočekivano, multipleksno profilisanje supstrata na izooblicima ZT tripsina otkrilo je da aminokiseline koje okružuju arginin ili lizin u supstratu imaju različit efekat na njegovo cepanje u poređenju sa tripsinom I. Ukratko, izooblici ZT tripsina ili tripsina I su inkubirani (5, 15 i 60 min.) sa bibliotekom peptida (124 definisanih peptida, 14-mer sekvenci, ukupno 1612 peptidnih veza) sa ekstenzivnim fizičkohemijskim diverzitetom (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Nakon inkubacije, mesta cepanja su identifikovana maseno spektrometrijskom analizom. Rezultati su prikazani u sledećim primerima i pokazuju da postoje brojna mesta cepanja koja su jedinstvena za tripsin ZT u poređenju sa tripsinom I. Takođe, identifikovana su mesta cepanja koja pokazuju preferencijalno cepanje sa izooblicima ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I. Dalje, novi izooblici ZT tripsina imaju specifičnost prema supstratu koja se razlikuje u poređenju sa tripsinom I, prikazano u WO 2000078332. Ova otkrića su bila neočekivana. Na osnovu rezultat iz multipleksne analize profilisanja supstrata, tabela koja sadrži numeričke vrednsoti na osnovu odnosa standardnog rezultata (Z-rezultat) na P4-P4’ pozicijama u supstratu je dobijena was generated gde je specifičnost tripsina ZT prema supstratu upoređena sa tripsinom I. Pozitivne vrednsoti (Z-rezultat) odražava prefenciju za aminokiselinski ostatak u određenoj P poziciji u korist izooblika ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I.

[0015] Izooblici ZT tripsina imaju specifična antimikrobna svojstva. Na osnovu vrednosti koje su dobijene i predstavljene u primerima, može se uočiti da su izooblici ZT tripsina mnogo bolje adaptirani u cepanju peptida koji sadrži nekoliko uzastopnih pozitivno naelektrisanih ostataka (arginin ili lizin) u poređenju sa tripsinom I. Ovi tipovi sekvenci (sekvence bogate u aminokiselini lizinu i argininu) se često nalaze kod virusnih proteina (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Gallaher and Garry, 2015, Viruses 7: 285-305).

[0016] Viroporini je grupa proteina koja interaguje sa plazma membranama pri čemu modifikuje permeabilnost i mogu da promovišu oslobađanje virusnih partikula. Grupisani ostaci lizina i/ili arginina su važni za aktivnost viroporina. Na osnovu multipleksne analize profilisanja supstrata, izooblici ZT tripsina mogu da deluju ako antiviralni agensi protiv RNK virusa tako što mogu da cepaju ove grupisane bazne aminokiselinske ostatke. Opisano je da se viroporini nalaze u brojnim virusnim familijama, uključujući Flaviviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Coronaviridae, Reoviridae i Paramyxoviridae (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387). Ispitivanja su pokazala da su bazni ostaci, lizin ili arginin, u viroporinima ključni uslov za njihovu funkciju. Većina viroporina je identifikovana kod RNK virusa. Virusi koji sadrže viroporine bogate lizinom i argininom koji mogu da budu meta za izooblike ZT tripsina uključuju virus humane imunodeficijencije (HIV), rotavirus, Ebolu, Reston virus (RESTV), Lloviu virus (LLOV), Sudan virus (SUDV), Bundibugyo (BDBV), Tai Forest virus (TAFV) (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Gallaher and Garry, 2015, Viruses 7: 285-305).

[0017] Viroporini se mogu pronaći u širokom opsegu DNK i RNK virusa kao što su Paramecium bursaria chlorella virus 1, simian virus 40 (SV40), humani polioma JC (JCV), koronavirus teškog akutnog respiratonog sindroma (SARS-CoV) (Kang, Moroni et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5318-5324, Liao, Tam et al., 2006, Adv Exp Med Biol 581: 199-202, Daniels, Sadowicz et al., 2007, PLoS Pathog 3: e98).

[0018] Visoko bazni virusni proteini, koji su poznati pod imenom agnoproteini, nedavno su identifikovani kod DNK virusa kao što su virusi iz familije Polyomaviridae i Papillomaviridae (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387). Ovi proteini pokazuju brojne karakteristike viroporina. Konzervisane sekvence su identifikovane kod agnoproteina koji sadrže brojne grupisane bazne aminokiselinske ostatke (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387). Na osnovu multipleksne analize profilisanja supstrata, izooblici ZT tripsina mogu da delujuju kao antiviralna sredstva protiv DNK virusa tako što mogu da cepaju grupisane bazne aminokiselinske ostatke (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387).

[0019] Mnogi virusi i bakterije su razvili mehanizme za sticanje ulaska u ćeliju korišćenjem peptida ili proteina koji penetriraju u ćeliju (Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860). Virusi uključuju pestiviruse iz familije Flaviviridae, herpes virus (HSV-1), humani virus imunodeficijencije (HIV-1, hepatitis B i humani respiratorni sincicijalni virus (RSV) (Elliott and O’Hare, 1997, Cell 88: 223-233, Oess and Hildt, 2000, Gene Ther 7: 750-758, Langedijk, 2002, J Biol Chem 277: 5308-5314, Langedijk, Olijhoek et al., 2005, International Congress Series 1277: 95-107, Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14, Godet, Guergnon et al., 2010, PLoS One 5: e13760). Dalje, ovi tipovi proteina su pronađeni kod bakterija kao što su Mycobacterium tuberculosis (Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14). Peptidima koji penetriraju u ćeliju (CPP) je zajedničko da su bogati u baznim aminokiselinskim ostacima posebno argininima (Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860). Porini su proteini u spoljašnjoj membrani koji igraju važnu ulogu u bakterijskoj patogenosti i zaštiti i iz tog razloga su korisne mete za terapeutike (Galdiero, Falanga et al., 2012, Curr Protein Pept Sci 13: 843-854). Ovi proteini često sadrže uzastopne ostatke aminokiseline arginina. Na osnovu multipleksne analize profilisanja supstrata izooblici ZT tripsina mogu da deluju kao antimikrobni agensi protiv virusa i bakterija tako što mogu da cepaju grupisane bazne aminokiselinske ostatke.

[0020] Paraziti zavise od determinanti virulentnosti kao što su proteini koji sadrže domene koji su bogati argininom na primer Toxoplasma gondii (Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933). Multipleksna analiza profilisanja supstrata je pokazala da bi izooblici ZT tripsina mogli da budu od koristi protiv parazita dejstvom koje je usmereno protiv takvih proteina.

[0021] Alat za pretraživanje osnovnog lokalnog poravnanja sekvenci (BLAST) je korišćen za pretraživanje nekih od jedinstvenih i preferencijalnih aminokiselinskih sekvenci koje cepaju izooblici ZT tripsina. Rezultati pretraživanja su pokazali da se ovi tipovi sekvenci mogu pronaći kod mnogih patogena uključujući viruse (npr. iz Paramyxoviridae i Coronaviridae familije virusa), bakterija (npr. roda Haemophilus) i parazita (npr. roda Plasmodium). Familija Paramyxoviridae uključuje viruse kao što su respiratorni sincicijalni virus (RSV) i humani virusi parainfluence i virusi koji uzrokuju zauške i boginje. Familija Coronaviridae uključuje viruse koji uzrokuju teški akutni respiratorni sindrom (SARS). Rod Haemophilus bakterija uključuje Haemophilus parainfluenzae koji je povezan sa endokarditisom, meningitisom, i bakteremijom. Rod Plasmodium uključuje Plasmodium falciparum koji je uzročnik malarije.

[0022] Pod izrazom "medicinska sprava" je označeno, ali nije ograničeno na, bilo koji instrument, aparat, primenu, softver, materijal ili drugi član za svrhu dijagnoze, prevencije, praćenja, lečenja, ili ublažavanja bolesti, kao što je dijagnoza, praćenje, lečenje, ublažavanje ili kompenzacija; za povredu ili hendikep, kao što je ispitivanje, zamena ili modifikovanje anatomije ili od fiziološkog postupka; kontrola začeća; uključujući sprave koje ne postižu njihovo namenjeno dejstvo u ili humanom telu farmakološkim, imunološkim ili metaboličkim sredstvima – ali takvim sredstvima se može pomoći u njihovoj funkciji.

[0023] Predmetni pronalazak se odnosi na nove izooblike ZT tripsina. Pronalazak opisuje nepredviđena i jedinstvena svojstva cepanja proteina izooblicima ZT tripsina koje ih čine značajnim u medicinskim primenama. Posebno, pronalazak se odnosi na nove izooblike ZT tripsina atlanskog bakalara, koji su korisni kao farmaceutska sredstva, u medicinskim spravama, i u kozmetičkim sredstvima.

[0024] U jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je izolovani izooblik ZT tripsina bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1.

[0025] U jednom izvođenju iz ovog aspekta obezbeđen je izolovani izoooblik ZT tripsina bakalara, koji je izabran između tripsina ZT-1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2; tripsin ZT-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3; tripsin ZT-3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4; i tripsin ZT-4, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5.

[0026] U jednom aspektu iz pronalaska, obezbeđena je kompozicija koja sadrži najmanje jedan izooblik ZT tripsina bakalara prema pronalasku, zajedno sa pogodnim ekscipijentima i nosačima. Pomenuti izooblik ZT tripsina bakalara može da bude izabran između ZT-1 tripsina bakalara, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2; ZT-2 tripsina bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvenci prema SEQ ID NO:3; ZT-3 tripsina bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4; i ZT-4 tripsina bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5.

[0027] Obično, pomenuta kompozicija sadrži pomenute izooblike ZT tripsina bakalara koje se nalaze u smeši sa drugim tripsinima bakalara. Poželjno, pomenuti izooblici ZT tripsina bakalara sadrže najmanje 5% (mas/mas) ukupnog sadržaja tripsina bakalara u pomenutoj kompoziciji, kao što je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50% ili više (mas/mas) ukupnog sadržaja tripsina bakalara u pomenutoj kompoziciji.

[0028] Pomenuta kompozicija se obično primenjuje lokalno, kao losion, hidrogel, sprej za usta ili sprej za nos. Pomenuta kompozicija dalje može da sadrži polivalentni alkohol, kao što je glicerol.

[0029] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u terapiji.

[0030] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti uzrokovane patogenim organizmom koji je izabran iz grupe koja se sastoji od virusa, bakterije, gljivice, parazita i protozoe.

[0031] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti u gornjem respiratornom traktu koja je uzrokovana patogenim organizimima kao što su virusi, bakterije i gljivice.

[0032] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u lečenju ili prevenciji bola, akutnog zapaljenja, hroničnog zapaljenja, artritisa, zapaljenja zglobova, burzitisa, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, septičkog artritisa, fibromijalgije, sistemskog eritemskog lupsa, flebitisa, tendinitisa, osipa, psorijaze, akni, ekcema, facijalnog seborejičnog ekcema, ekcema ruku, lica ili vrata, infekcija prepucijuma, atletskog stopala, infekcija fistule, inficiranih lokalnih ulcera, infekcija pupka kod novorođenčadi, bora, ožiljaka, keloida, potkožnih čireva, bradavica i alergijskog svraba, hemoroida, gljivične infekcije i imunološkog poremećaja uključujući autoimunu bolest.

[0033] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u lečenju infekcija rana i rana izazvanih opekotinama.

[0034] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u uklanjanju mrtve ili oljuštene kože sa inače zdrave kože.

[0035] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta kompozicija je obezbeđena za upotrebu u kozmetičke svrhe. Pomenuta kompozicija dalje može da sadrži dodatno kozmetički aktivno jedinjenje.

[0036] U jednom aspektu iz pronalaska, obezbeđen je postupak za lečenje bolesti, koji sadrži davanje terapeutski efikasne količine kompozicije prema predmetnom pronalasku, pacijentu kome je potrebno.

[0037] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta bolest je uzrokovana patogenim organizmom koji je izabran iz grupe koji se sastoji iz virusa, bakterije, gljivice, parazita i protozoe

[0038] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta bolest je bolest u gornjem respiratornom traktu koja je uzrokovana patogenim organizmima kao što su virusi i bakterije.

[0039] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta bolest je odabrana iz bola, akutnog zapaljenja, hroničnog zapaljenja, artritisa, zapaljenja zglobova, burzitisa, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, septičnog artritisa, fibromijalgije, sistemskog eritemskog lupusa, flebitisa, tendinitisa, osipa, psorijaze, akni, ekcema, facijalnog seborejičnog ekcema, ekcema ruku, lica ili vrata, infekcija prepucijuma, atletskog stopala, infekcija fistule, inficiranih lokalnih ulcera, infekcija pupka kod novorođenčadi, bora, ožiljaka, keloida, potkožnih čireva, bradavica i alergijskog svraba, hemoroida, gljivične infekcije i imunološkog poremećaja uključujući autoimuni poremećaj.

[0040] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuta bolest su infekcije rane ili rane uzrokovane opekotinama.

[0041] U jednom aspektu iz pronalaska, obezbeđen je izolovani izooblik ZT tripsina bakalara, koji je izabran iz tripsina ZT-1 pune dužine, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:19; tripsin ZT-2 pune dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20; tripsin ZT-3 pune dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:21; i tripsin ZT-4 pune dužine, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:22.

[0042] U jednom aspektu iz pronalaska, obezbeđen je postupak za dobijanje izooblika ZT tripsina bakalara koje sadrže sekvencu aminokiselina prema bilo kojoj od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:5, koji obuhvata

(i) ekstrakciju tripsina ZT iz utrobe bakalara,

(ii) nanošenje ekstrakta na najmanje jedan ili više koraka u hromatografiji, uključujući korak afinitetne hromatografije upotrebom p-aminobenzamidinskog afinitetnog liganda, i

(iii) desorbovanje i eluciju izooblika ZT tripsina bakalara vezanog za p-aminobenzamidinski afinitetni ligand.

[0043] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuti postupak dalje obuhvata najmanje jedan korak koriščenja anjonske izmenjivačke smole posle pomenutog koraka afinitetne hromatografije (ii).

[0044] U jednom izvođenju iz ovog aspekta, pomenuti izooblici ZT tripsina iz bakalara su odabrani od tripsina ZT-1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2; tripsina ZT-2 koji sadrži

1

aminokiselinsku sekvecu prema SEQ ID NO:3; tripsina ZT-3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4; i tripsina ZT-4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, ili njihove smeše.

[0045] Utroba bakalara se obično koristi za prečišćavanje i izolovanje izooblika ZT tripsina. Pronalazači su identifikovali nove postupke koji se opisuju gore u tekstu, koji su korisni za komercijalnu proizvodnju izooblika ZT tripsina. Ekstrakcija se izvodi na pH 6-8 na temperaturi koja je ispod 10°C. Utroba bakalara je pomešana sa vodom u odnosu (mas/mas) 1:6 do 1:20. Ekstrakt se odvaja od ostataka iznutrica i dalje se prečišćava taloženjem i ceđenjem. Zatim sledi mikroceđenje i ultraceđenje pri čemu se dobija rastvor koji sadrži izooblike ZT tripsina koje se koriste za hromatografsko razdvajanje koje može da obuhvati nekoliko koraka.

[0046] Afinitetna hromatografija se izvodi, poželjno sa amino benzamidinskom afinitetnom hromatografijom, da bi se prečistili izooblici ZT tripsina. Izooblici ZT tripsina mogu da se dalje prečiste hromatografijom za izmenu anjona.

[0047] Jedan postupak primene izooblika ZT tripsina ili smeša prečišćenih tripsina iz bakalara koje sadrže izooblike ZT tripsina, je u dobijanju hidrogela ili losiona i vode koja sadrži 0 do 90% (zap/zap) polivalentnog alkohola (poliola) kao što je glicerol. Pogodna koncentracija izooblika ZT tripsina obuhvata najmanje odnos 1 prema 100 koncentracije proteina prema drugim oblicima tripsina, poželjno 5%, ili više (mas/mas) od ukupnog sadržaja tripsina iz bakalara. Aktivnost tripsina je 0.1 do 10,000 enzimskih jedinica aktivnosti za CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (karbobenzoksi Gly-Pro-Arg-para nitroanilid) na 100 mililitara finalnog preparata hidrogela/losiona.

[0048] Prikazano je, ali ne predstavlja deo pronalaska, (a) postupci koji se odnose na određena stanja upotrebom efikasnih količina prečišćenih izooblika ZT tripsina kao što se gore opisuje, (b) kompozicije ili supstance za upotrebu u takvim postupcima, (c) kompozicije farmaceutske ili medicinske sprave koja sadrži efikasne količine izooblika ZT tripsina za upotrebu u takvim postupcima, i (d) upotrebe enzima ili kompozicije enzima za dobijanje leka (farmaceutskih ili medicinskih sprava) za upotrebu u takvim postupcima.

[0049] Prikazani postupci, ali koji nisu deo pronalaska, su između ostalog za:

lečenje ili prevenciju patogene bolesti uzrokovane virusima, bakterijama i gljivama koje se na primer pojavljuju u gornjem respiratornom traktu, donjem respiratornom traktu i u plućima;

lečenje ili profilaktičku prevenciju dermatoloških stanja kao što su npr. akne, osip, psorijaza ili ekcem, uključujući facijalni seborejični ekscim ili ekcem ruku, lica, lobanje ili vrata, hemoroide i slično, pri čemu poželjno količina izooblika ZT tripsina i drugih tripsina koji se primenjuju je efikasna količina za dermatološko stanje koje se leči ili gde se vrši prevencija;

lečenje bolesti pluća gde se izooblici ZT tripsina koriste sa ili bez drugih tripsina su korišćeni na primer u visoko efikasnom inhalatoru sa dozom koja se podešava pritiskom u dozi efikasnoj za lečenje;

lečenje ili profilaktička prevencija infekcija rane i rana sa debrisom (nanošenjem na ranu efikasne količine izooblika ZT tripsina za sprečavanje mikrobne infekcije sa ili bez drugih tripsina ili poboljšanjem zarastanja rana primenom efikasnih količina izooblika ZT tripsina za inhibiranje mikroba sa ili bez drugih tripsina, kada se rana tretira može u suštini da se oslobodi of nekrotičnog tkiva;

lečenja opekotina, gde je poželjno količina izooblika tripsina ZT sa ili bez drugih tripsina primenjena u dovoljnoj količini da se promoviše zarastanje;

lečenje opekotina od sunca, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se daje u dovoljnoj količini da se promoviše zarastanje; lečenje opekotina od zračenja, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se daje u dovoljnoj količini da se promoviše zarastanje;

uklanjanje mrtve ili ljustene kože skin sa inače zdrave kože da se poboljša izgled kože, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se daje u efikasnoj količini za uklanjanje mrtve kože;

lečenje ispucalih peta, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih trpsina se daje u količini koja je dovoljna za efikasan tretman;

za održavanje iritirane kože, kao što su suvi delovi, svrab, crvenilo i mrlje, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se daje u dovoljnoj količini za efikasan tretman; lečenje ili profilaktička prevencija cistične fibroze, kancera, npr. davanjem efikasne količine za lečenje tumora ili metastaza tumora prevencijom ili inhibicijom količinom izooblika ZT tripsina, ateroskleroze, astme, septičkog šoka, sindroma toksičnog šoka, adhezija tkiva kao što je zaštitni omotač tetiva, abdominalne post-hirurške ili adhezije zglobova, reperfuzione povrede, malarija, imunski poremećaj kao što je autoimunska bolest, apoptoza, kolitis i enteritis, kao što je Kronova bolest, gde su poželjno efikasne količine izooblika ZT tripsina i srodnih peptidaza;

lečenje ili profilaktička prevencija mikrobne infekcije, npr. virusna infekcja kao što je rinovirus (RV), respiratorni sincicijalni virus (RSV), influenca, infekcija herpes virusom (npr. HSV-1 , HSV-2, herpes zoster ili genitalna herpes infekcija), HIV, hepatitis, koronavirus, citomegalovirus ili papiloma virusna infekcija; infekcije koja uzrokuje gastrointestinalnu bolest kao što je ulcer ili dijareja; gljivična infekcija kao što je sistemska, kožna, oralna, vaginalna ili gljivična infekcija jednjaka, uključujući npr. infekciju kvascem, uključujući gljivičnu infekciju nokta i infekcije izazvane sa Candida; mikrobne infekcije oka, poželjno tretirane sa davanjima u oko; bakterijske infekcije uključujući infekciju sa Helicobacter pylori, Staphylococcus spp., Meticilin-rezistentnim Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Streptococcus mitis, Streptococcus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia spp., syphilis i E. coli infekcije i bakterijske infekcije koje uzrokuju meki čir; oportunističke mikrobne infekcije kod imunokompromitovanih pacijenata gde poželjno primenjena količina tripsina bakalara je efikasna količina za lečenje ili prevenciju mikrobne infekcije ili ima inhibitornu aktivnost prema ćelijaćelija ili ćelija-virus adheziji;

lečenje ili profilaktička prevencija indikacije koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz bola, zapaljenja, akutnog ili hroničnog zapaljenja, artririsa, upaljenih zglobova, burzitisa, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoridnog artritisa, septičkog artritisa, fibromijalgije, sistemskog eritemskog lupusa i flebitisa, gde poželjno količina je efikasna količina za lečenje ili prevenciju; uklanjanje dentalnih plaka, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se daje u količini koja je efikasna za uklanjanje dentalnih plaka; i

liziranja krvnih ugrušaka, gde poželjno količina izooblika ZT tripsina je količina koja je efikasna za liziranje ugrušaka.

[0050] Ovaj postupak obuhvata davanje kompozicije koja sadrži izooblike ZT tripsina kao što je opisano gore u tekstu.

[0051] Pronalazak obezbeđuje lokalne kozmetičke i medicinske kompozicije koje sadrže izooblike ZT tripsina kao što je opisano gore u tekstu; i gel, krema ili supozitorna kompozicija.

[0052] Takođe je prikazano, ali nije deo pronalaska, postupak inhibiranja ili profilaktičkog sprečavanja prenošenja patogenog mikroba davanjem izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina. Poželjno, tripsin ZT sa ili bez drugih tripsina se primenjuje na delu tela koji obuhvata primarni ulaz za prenos za mikrob u pitanju. U jednom izvođenju, sprej, mast ili ispiranje se nanosi na telesni otvor koji je uključen u seksualnoj aktivnosti, na primer, za sprečavanje HIV-a ili prenošenja hepatitisa. U drugom prikazu izooblik ZT tripsina ili srodnih peptidaza su primenjeni u gornjim respiratornim putevima, na primer, preko aerosoli, za inhibiranje ili spečavanje prenošenja virusa obične prehlade, kao što je rinovirus ili koronavirus.

[0053] Prikazani postupak, ali nije deo pronalaska van-telesnog lečenja tkiva, telesne tečnosti ili kompozicije ćelija da bi se uklonile komponente ćelijske adhezije smanjuje imunsko odbacivanje tkiva, telesne tečnosti ili kompozicije ćelija koje su transplantirane sa jedne individue na drugu. U drugom asplektu, takvi tretmani uklanjaju ili inaktiviraju komponente ćelijske adhezije koja se nalazi u tkivu koje se tretira, telesnoj tečnosti ili kompoziciji ćelija koje su uključene u mikrobnoj infekciji.

[0054] U lečenju ili kao profilaksa, koji su prikazani ali nisu deo pronalaska, sprečavanja septičkog šoka ili sindroma toksičnog šoka davanjem izooblika ZT tripsina ili srodnih peptidaza, odgovarajući načini davanja uključuju sistemsko davanje. Za vaginalne infekcije koje su povezane sa šokom, vaginalni sekreti, kreme, gelovi ili supozitorije mogu da se koriste kao postupak davanja. U lečenju ili profilaksi, koja je prikazana ali nije deo pronalaska, sprečavanje bola, zapaljenja, akutnog ili hroničnog zapaljenja, artritisa, upaljenih zglobova, burzitisa, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, septičkog artritisa, fibromijalgije, sistemskog eritemskog lupusa, flebitisa davanjem izooblika ZT tripsina ili srodnih peptidaza, odgovarajući načini davanja će bez ograničenja uključiti kreme, gelove ili supozitorije, posebno ali bez ograničenja na hidrogelove koji sadrže glicerol ili druge poliole.

[0055] U lečenju ili kao profilaksa, koji su prikazani ali nisu deo pronalaska, spečavanje osipa, psorijaze, akni, ekcema, uključujući facijalni seborejični ekcem ili ekcem ruku, lica, skalpa ili vrata, infekcija prepucijuma, atletskog stopala, infekcija fistula, inficiranih lokalnih ulcera, infekcija pupka kod novorođenčadi, bora, ožiljaka i keloida, potkožnih čireva, bradavica i alergijskog svraba, hemoroida, i slično, rana, inficiranih rana, rana od opekotina, uklanjanje mrtve ili oljuštene kože sa druge strane zdrave kože da bi se poboljšao izgled kože, gljivična infekcija kao što je sistemska, kožna, oralna, vaginalna ili gljivična infekcija jednjaka, uključujući na primer, infekciju kvascem, uključujući gljivičnu infekciju nokta i infekcije izazvane gljivicom Candida i imunski poremećaji uključujući autoimunske bolesti davanje izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina, odgovarajući načini davanja će uključiti kreme, gelove ili supozitorije, posebno ali bez ograničenja na hidrogelove koji sadrže glicerol ili druge poliole.

[0056] Gore navedeni ciljevi su postignuti upotrebom kompozicije koja sadrži efikasnu količinu izooblika ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina koja je sposobna za oslobađanje od bola, zapaljenje, artritis, oticanje, edem, psorijazni ekcem, dermatitis, osip i/ili druge simptome bolesti koja se pominje u uvodnom delu. Izooblici ZT tripsina mogu da se dobiju u visokom prinosu i na relativno jednostavan način iz utrobe bakalara. Pronađeno je da izooblici ZT tripsina mogu da se prečiste na komercijalnoj skali na relativno direktan način sa razumnim prinosima. Izooblici ZT tripsina bez ili zajedno sa drugim atlantskim serin proteazama mogu da se koriste za svrhu pronalaska.

[0057] Izooblici ZT tripsina koje su prikazani u predmetnom pronalasku mogu da se desorbuju sa afinitetnog matriksa primenom uslova koji će destabilizovati interakciju između enzima i afinitetnog liganda. Takvi uslovi uključuju visoku koncentraciju soli praćenu niskim pH, poželjno u 30% ili više glicerola. Eluentu kolone je omogućeno da protiče u neutralizujući pufer da bi stabilizovao tripsin bakalara posle koraka elucije kiselinom. Izooblici ZT tripsina mogu nakon toga da se prečiste upotrebom izmenjivača anjona i eluiraju sa povećanjem koncentracije soli. Ovim postupcima izooblici ZT tripsina sa čistoćom u višku od oko 90% mogu da se izoluju. Prema tome, dobijena frakcija tripsina bakalara sadrži 2-3 glavna izooblika kako je prikazano SDS elektroforezom, koja daje dve trake i MALDI-TOF maseno spektrometrijskom analizom. Molekularna masa izooblika ZT tripsina je oko 25 kDa, pri čemu izračunata izoelektrična točka je 4.35 - 4.49 u zavisnosti od izooblika.

[0058] Izooblici ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina u specifičnim formulacijama mogu da se koriste kao farmaceutska sredstva, u medicinskim spravama (kao što su hemijske formulacije) ili u kozmetici u zavisnosti od namenjene upotrebe. Izooblici ZT tripsina (sa ili bez drugih tripsina) iz pronalaska mogu

1

da budu, u prikazanom postupku ali ne deo pronalaska, primenjeni lokalno, oralno, rektalno, vaginalno, ukapavanjem (na primer u urinarni trakt ili u fistule), ili plućnim putem npr. korišćenjem aerosola (na primer upotrebom inhalatora za doziranje pod pritiskom (pMDI)), nanošenjem kapi u oči, ili sistemski, kao što je parenteralno, uključujući, na primer, intramuskularno, subkutanozno, intraperitonealno, intraarterialno ili intravenozno. Izooblici ZT tripsina se primenjuju u rastvoru ili kombinovano sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom prema standarnoj farmaceutskog praksi. Za oralni način davanja, izooblici ZT tripsina su korišćeni u obliku tableta, kapsula, lozengi, žvakaćih guma, pastila, prahova, sirupa, eliksira, vodenih rastvora i suspenzija, i slično. Za parenteralno davanje, obično se pripremaju sterilni rastvori izooblika ZT tripsina, i pH vrednosti rastvora su pogodno podešene i puferovane. Za intravenoznu upotrebu, ukupnu koncentracija rastvora treba kontrolisati da bi preparat bio izotoničan. Za očnu primenu, ulja ili tečnosti za ukapavanje mogu da se isporuče sistemima za isporuku na oči koji su poznati u oblasti tehnike kao što su aplikatori ili kapaljke za oči. Za plućnu primenu, rastvarači i/ili nosači će biti izabrani da budu odgovarajući da omoguće obrazovanje aerosola. Za lokalne primene, izooblici ZT tripsina se obično primenjuju u hidrogelu, koji sadrži 0 do 85% glicerola, kao što je oko 20% do 30% glicerola i moguće do 85 % glicerola.

[0059] Za lokalne tretmane, pogodna doza izooblika tripsina ZT sa ili bez drugih tripsina po opsezima primene od oko 0.01 µg/cm<2>do oko 1 mg/cm<2>, poželjno od oko 0.1 µg/cm<2>do oko 0.01 mg/cm<2>(upotrebom npr. oko 0.01 mg/ml enzima gela). Za sistemske tretmane, doze će generalno biti izabrane da održe nivo izooblika ZT tripsina u serumu sa ili bez drugih tripsina između oko 0.1 mg/100 ml i oko 100 mg/100ml, poželjno između oko 0.5 mg/100 ml i oko 2.0 mg/100 ml. U alternativnoj meri poželjnih količina za sistemsko davanje, poželjno od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, poželjnije oko 1 mg/kg, će biti korišćeno. Za vaginalne i tretmane urinarnog trakta, podgodni rastvori za ispiranje/ukapavanje izooblika ZT tripsina generalno će imati koncentracije od oko 1 µg/ml do oko 15 mg/ml, poželjno od oko 100 µg/ml do oko 3 mg/ml. Za sve tretmane, enzimska kompozicija će generalno biti primenjena od oko 1 do oko 10 puta dnevno, poželjno od oko 2 do oko 5 pet puta dnevno. Ove vrednosti, naravno, variraće sa brojnim faktorima uključujući tip i ozbiljnost bolesti, i starost, težinu i medicinsko stanje pacijenta, kao što je prepoznato od strane stručnjaka iz medicinskih. Veruje se da u suštini veće doze mogu da se koriste bez značajnih štetnih efekata.

[0060] Za zarastanje rana, izooblici ZT tripsina sa ili bez drugih tripsina se poželjno primenjuju češće jednostavno od vremena kada je rana prvo presvučena. Poželjno, izooblici ZT tripsina su primenjeni najmanje oko svakog puta kada se dešava presvlačenje rane. Izooblici ZT tripsina mogu takođe da se primene najmanje oko svakog drugog dana, poželjnije, svakog dana, ili nekoliko puta dnevno. Za dermatološke situacije kao što je ekcem, psorijaza i slično, hidrogel izooblika ZT tripsina (sa ili bez drugih tripsina) se poželjno primenjuje svakog dana, poželjnije dva puta dnevno. Za akutno ili hronično zapaljenje, artritis, zapaljenje zglobova, burzitis, osteoartritis, i slično, izooblici ZT tripsina se poželjno primenjuju svakog dana poželjnije dva puta dnevno.

[0061] U oblasti tehnike su poznati brojni postupci za određivanje procenta homologije proteina. Procenat indentita je izračunat korišćenjem ClustalW2 (verzija Clustal2.1) prilikom poređenja sekvenci (EMBL-EBI Internet stranica http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ datum 4 maj 2015).

[0062] Pronalazak će sada biti opisan brojnim ne-ograničavajućim primerima.

PRIMER 1.

Dobijanje smeše proteaza iz bakalara

[0063] Oko 100 kg smrznute utrobe atlanskog bakalara je otopljeno i dodato je u četvorostruku zapreminu hladne vode za piće u rezervoar za ekstrakciju i pH je podešena do oko pH 6 sa rastvorom natrijum hidroksida. Smeša je mešana u trajanju oko 10 h na 0 do 5°C. Nakon kratkog perioda sirovog taloženja (oko 30 minuta) vodeni ekstrakt je ispušten sa preostale nerastvorljive utrobe sa pumpom i sakupljen je u rezervoaru za taloženje. Vodenom ekstraktu je omogućeno da odstoji u ohlađenom rezervoaru za taloženje kako bi se istaložio oko 40 do 80 h. Supernatant je odliven sa rezervoara supernatanta do rezervnog rezervoara pomoću pumpe. Supernatant je koncentrovan 10 do 20-puta sa ultraceđenjem i diaproceđen je do prihvatljivog nivoa jonske jačine sa provodljivosti ispod oko 2.5 mS/cm. Dobijeno je oko 10-15 litara ultraproceđenog i diaproceđenog proteinskog koncentrata.

PRIMER 2.

Prečišćavanje izooblika ZT tripsina bakalara iz koncentrovanog ekstrakta utorbe bakalara

[0064] Oko 12 litara ultraproceđenog i diaproceđenog koncentrata kako je dobijeno u Primeru 1 je naneto na kontinuirane, povezane serije od oko 1 litara pakovanih hromatografskih kolona, prva sadrći karboksimetil (CM) brzog protoka katjon izmenjivačku smolu (GE zdravstvo) i druga paminobenzamidinski afinitetni ligand kuplovan sa sefaroznom smolom (GE zdravstvo). CM i paminobenzamidinske kolone su pre-ekvilibrisane sa oko 10 zapremina kolone od 25 mM Tris pufera pH 7.8, koji sadrži 2.5 mM kalcijum hlorid (pufer A). Koncentrat je ispumpan na CM i paminobenzamidinske kolone u brzini protoka od oko 100 ml po minuti. Kada je nanošenje koncentrovanog rastvora na kolone završeno, preostali materijal je ispran sa kontinualnog sistema kolone sa oko 8 litara pufera A. Nakon što je ovo ispiranje završeno, p-aminobenzamidinska afinitetna kolona je isključena iz CM kolone i isprana je sa oko zapremina 5 kolone rastvora visoke koncentracije soli 25 mM Tris bufera pH 7.5 koji sadrži 0.5 M NaCl i 2.5 mM kalcijum hlorida. Tripsini bakalara su nakon toga desorbovani sa afinitetnog liganda i eluirani sa kolone sa kiselim rastvorom 25 mM sirćetne kiseline pH 3.2 koji sadrži 10 mM kalcijum hlorid i 30% glicerol.

[0065] Preparat koji sadrži prečišćen izooblik ZT tripsina bakalara je bio homogen sa SDS PAGE elektroforezom. Prečišćen preparat je sterilizovan filterom kroz filter sa veličinom pora 0.22 mikrona i skladišten je smrzavanjem na oko -20°C. Preparat koji sadrži izooblik ZT tripsina bakalara je sterilizovan filterom kroz filter sa veličinom pora 0.22 mikrona skladišten je smrzavanjem na oko -20°C. Preparat koji sadrži izooblik ZT tripsina bakalara je nanet na hromatografsku kolonu za izmenu anjona (MonoQ) i proteini su eluirani gradijentom soli (SL 1). Kolona je ekvilibrisana sa puferom (20 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0), i enzimi su eluirani sa linearnim 0-150 mM NaCl gradijentom u 40 zapremina kolona, linearnim 150-620 mM NaCl u 6 zapremina kolona, 620-850 mM NaCl u 10 zapremina kolona na brzini protoka od 1 mL/min. Proteini u maksimumu obeleženog tripsina ZT iz SL 1 su izloženi SDS-PAGE analizi (SL 2). Proteinska traka na gelu sa maksimuma tripsina ZT je isečena sa gela i analizirana je upotrebom Matricom-Potpomognute Laserske Desorpcije/Jonizacije „Time-of-Flight“ Masene Spektrometrije (MALDI-TOF MS). Analiza masenom spektrometrijom (MS) otkrila je identitet sa tripsinom ZT-1, tripsinom ZT-2, tripsinom ZT-3 i tripsinom ZT-4 (Tabela 1 i Tabela 2). Antitela protiv tripsina I i tripsina X se dobijaju u zečevima protiv peptida ((NH2-) CVLSGWVRDTMA (-COOH)) (SEQ ID NO: 23) odgovaraju ostacima 228-239 na ekstremnom C kraju tripsina I bakalara i tripsina X bakalara. Antitela su afinitetno prečišćena iz zečjeg seruma upotrebom peptida koji je spojen sa nosačem kuglice od gela. Poliklonalna antitela protiv izooblika ZT tripsina su dobijena u mišjoj acitnoj tečnosti kako je opisano u Overkamp et al. (Overkamp, Mohammed-Ali et al., 1988, J Immunoassay 9: 51-68). Prečišćen oblik rekombinantnog tripsina ZT-4 je ubrizgan intraperitonealno (i.p.) u Balb/C2 miševe. Miševi su žrtvovani u danu 34 i sakupljena je ascitna tečnost. Odgovarajuća antitela u korišćena u Western blot analizi. Western blot analiza je izvedena na proteinima u maksimum obeleženom tripsinu ZT sa SL 1 (SL 3). Antitelo specifično za izooblik ZT tripsina je reagovalo protiv proteina iz maksimuma obeleženog ZT tripsina dok antitelo protiv tripsina I i tripsina X nije reagovalo (SL 3).

1

[0066] Tabela 1 prikazuje peptidne mase koje su dobijene MS analizom na proteinskoj traci sa SDS-PAGE gela u Slici 2 (uzorak nije guanidilovan), videti kolonu 1 Mr (expt). Mr označava relativnu molekulsku masu u Da. Kolone 2, 3 i 4 pokazuju izračunate vrednosti (za mase koje odgovaraju masama u koloni 1) sa in silico digestije tripsinom aminokiselinskih sekvenci tripsina ZT-1, tripsina ZT-2, tripsina ZT-3 i tripsina ZT-4. Kolona 5 prikazuje sekvencu peptida koji daje vrednost mase iz in silico digestije. Kolona 6 pokazuje modifikacije različitih peptida na osnovu in silico digestije.

Tabela 1.

[0067] Sekvence u Tabeli 1 su prikazane prema sledećim:

1

[0068] Tabela 2 prikazuje peptidne mase koje su dobijene MS analizom na proteinskoj traci sa SDS-PAGE gela u Slici 2 (uzorak je guanidilovan), videti kolonu 1 Mr (expt). Mr označava relativnu molekulsku masu u Da. Kolone 2, 3 i 4 prikazuju izračunate vrednosti (za mase koje odgovaraju masama u koloni 1) sa in silico digestije tripsinom aminokiselinskih sekvenci tripsina ZT-1, tripsina ZT-2, tripsina ZT-3 i tripsina ZT-4. Kolona 5 prikazuje sekvencu peptida koji daje vrednost mase sa in silico digestije. Kolona 6 pokazuje modifikacije različitih peptida na osnovu in silico digestije.

1

1

[0069] Sekvence u Tabeli 2 su prema sledećim:

(nastavak)

PRIMER 3.

Multipleks profilisanje supstrata na izooblicima ZT tripsina

[0070] Multipleks profilisanje supstrata je korišćeno za analizu specifičnosti supstrata za enzime (proteinaze) (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Proteinaze mogu da cepaju supstrat na različitim aminokiselinskim ostacima u peptidnoj sekvenci što pokazuje razliku u specifičnosti prema supstratu. Tripsini se određuju prema njihovoj preferenciji u cepanju C-kraja do arginininskih ili lizinskih ostataka.

Enzimski Izooblici

[0071] Izoenzimi tripsina bakalara su razdvojeni nanošenjem benzamidinom prečišćenog tripsina bakalara na MonoQ HR 5/5 kolonu za izmenu jona. Za izolaciju tripsina I, kolona je ekvilibrisana sa 20 mM Tris, 5 mM etanolaminom, 10 mM CaCl2, pH 9.1, i enzimi su eluirani sa linearnim 0-200 mM NaCl gradijentom u 80 zapremina kolona, linearnim 200-1000 mM NaCl gradijentom u 10 zapremina kolona na brzini protoka od 1 mL/min. Pre nanošenja, pH uzorka je podešen do pH 9.1 sa 1 M NaOH.

[0072] Za izolovanje izooblika ZT tripsina, kolona je ekvilibrisana sa 25 mM Tris, 25 mM CaCl2,15% (zap/zap) glicerolom, pH 7.5, i enzimi su eluirani sa linearnim 0-150 mM NaCl gradijentom u 5

1

zapremina kolone, linearnim 150-550 mM NaCl gradijentom u 20 zapremina kolone, linearnim 500-1000 mM NaCl gradijentom u 1 zapremini kolone na brzini protoka od 1 mL/min.

[0073] Kompozicija oba uzorka enzima (tripsin ZT i tripsin I) je podešena tako da je finalna koncentracija Tris bila 60 mM, CaCl230 mM i glicerola 15% (zap/zap) sa pH of 8.5.

Multipleks analiza profilisanja supstrata

[0074] Prečišćeni izooblici ZT tripsina ili tripsina I su inkubirani (5, 15 i 60 min.) sa bibliotekom peptida (124 definisanih peptida, 14-mer sekvenci, ukupno 1612 peptidnih veza) sa ekstenzivnim fizičkohemijskom diverzitetom kao što je opisano u O’Donoghue, Eroy-Reveles et al. (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Posle inkubiranja, mesta cepanja su identifikovana analizom pomoću masene spektrometrije (O’Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100).

Rezultati

[0075] Multipleks analiza profilisanja supstrata neočekivano je pokazala da postoje brojna mesta cepanja koja su jedinstena za izooblike ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I, kao što je prikazano u WO 2000078332 (SL 4 i Tabela 4). Takođe, identifikovana su mesta cepanja koja su pokazala preferencijalno cepanje sa izooblicima ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I (Tabela 4). Na osnovu rezultat iz multipleks analize profilisanja supstrata, dobijena je tabela koja sadrži numeričke vrednosti na osnovu standardnih rezultata (Z-rezultat) odnosa na P4-P4’ položajima u supstratu gde specifičnost supstrata tripsina ZT je upoređena sa tripsinom I (Tabela 3). Pozitivne vrednosti (Z-rezultat) odražavaju preferenciju aminokiselinskog ostatka u određenom P položaju u korist izooblika ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I. Neočekivano, multipleks profilisanje supstrata na izooblicima ZT tripsina otkrilo je da aminokiseline koje okružuju arginin ili lizin u supstratu imaju različit efekat na njegovo cepanje u poređenju sa tripsinom I.

[0076] Tabela 3 pokazuje numeričke vrednosti koje su zasnovane na standardnim rezultatima (Z-rezultat) odnosa na P4-P4’ položajima u supstratu u poređenju sa specifičnosti supstrata tripsina ZT i tripsina I nakon inkubacije od 5, 15 i 60 min. Aminokiselinski ostaci u supstratu koji su podvrgnuti cepanju naznačeni su sa P1,P2, P3, P4 u N-terminalnom smeru od cepane veze (Schechter and Berger, 1967, Biochem Biophys Res Commun 27: 157-162, Schechter and Berger, 1968, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902). Ostaci u C-terminalnom smeru naznačeni su sa P1’, P2’, P3’, P4’. P položaji su obezbeđeni u kolonama i redovima i prikazuju aminokiseline u različitim P položajima. Pozitivne vrednosti (Zrezultat) u tabeli odražava preferenciju za aminokiselinski ostatak u određenom P položaju u korist izooblika ZT tripsina u poređenju sa tripsinom I. Negativne vrednosti (Z-rezultat) odražava preferenciju u korist tripsina I u poređenju sa tripsinom ZT. Na primer, na osnovu vrednosti iz Tabele 3 može se uočiti da je ZT tripsin mnogo bolje adaptiran u cepanju peptida koji sadrži nekoliko uzastopnih pozitivno naelektrisanih ostataka (arginin ili lizin) u poređenju sa tripsinom I. Ponovo, ovi tipovi sekvenci, to jest aminokiselinske sekvence koje su bogate lizinom i argininom, često se mogu naći u proteinskim toksinima, proteinima i peptidima koji su uključeni u patogenezu (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860, Gallaher and Garry, 2015, Viruses 7: 285-305). Kao što je prethodno pomenuto, izooblici ZT tripsina prema tome, imaju svojstva koja su korisna protiv proteina odgvornih za patogenost mnogih mikroorganizama.

2

Tabela 3.

[0077] Tabela 4 pokazuje prekursorske jonske intenzitete odabranih peptida iz multipleksnog profilisanja posle inkubacije sa tripsinom ZT ili sa tripsinom I. Prekursorski jonski intenziteti su intenziteti peptidnih maksimuma u MS pre fragmentacije koji predstavljaju u meru relativnog viška za date vrste. X u peptidnoj sekvenci označava čuvano mesto za odsustvo aminokiseline u peptidnoj sekvenci. Podaci pokazuju da izooblici ZT tripsina su isključivo sposobni da cepaju tri peptidne sekvence (QGKKAPXX, WGNRSPLE i QAVRPNGM) u poređenju sa tripsinom I. Dalje, podaci pokazuju da izooblici ZT tripsina preferencijalno cepaju dva peptida u poređenju sa tripsinom I. Izooblici ZT tripsina sposobni su da cepaju XIARQPWN tokom 5 minuta i FDNRVGKW tokom 15 minuta pri čemu cepanje unutar ova dva peptida je detektovano samo sa tripsinom I nakon inkubacije od 60 minuta.

Tabela 4.

PRIMER 4.

Prečišćavanje izooblika ZT tripsina bakalara iz koncentrovanog ekstraktra utrobe bakalara

[0078] Oko 12 litara ultraproceđenog i diaproceđenog koncentrata kao što je dobijeno u Primeru 1 je naneto na kontinuirane povezane serije od oko 1 litra pakovanih hromatografskih kolona, prva sadrži CM brzi protok smolu za izmenu katjona (GE zdravstvo), druga p-aminobenzamidini afinitetni ligand koji je kuplovan sa sefaroznom smolom (GE zdravstvo) i treća DEAE brzi protok smola za izmenu anjona (GE zdravstvo). CM i p-aminobenzamidine kolone su pre-ekvilibrisane sa oko 10 zapremina kolone 25 mM Tris pufera pH 7.8, koji sadrži 2.5 mM kalcijum hlorid. Koncentrat je ispumpan na CM i paminobenzamidine kolone u brzini protoka od oko 100 ml po minuti. Kada je završeno nanošene koncentrovanog rastvora na kolone, preostali materijal je ispran sa kontinuiranog sistema kolone sa oko 8 litara pufera A. Nakon što je ovo ispiranje završeno, p-aminobenzamidina afinitetna kolona je isključena sa CM kolone i isprana je sa 5 zapremina kolone visokog rastvora soli 25 mM Tris pufera pH 7.5 koji sadrži 0.5 M NaCl i 2.5 mM kalcijum hlorid. Tripsini bakalara su nakon toga desorbovani sa afinitetnog liganda i eluirani sa kolone sa kiselim rastvorom 25 mM sirćetne kiseline pH 3.2 koja sadrži 10 mM kalcijum hlorid i 30% glicerol. Frakcija tripsina bakalara je sakupljena u neutralizujućem puferu 200 mM Tris pH 8.5 koji sadrži 30% glicerol. DEAE kolona za izmenu anjona je pre-ekvilibrisana sa oko 10 zapremina kolone 25 mM Tris pufera pH 7.8, koji sadrži 2.5 mM kalcijum hlorid. Frakcija tripsina bakalara je naneta na DEAE smolu za izmenu anjona i isprana je sa oko 5 zapremina kolone pufera za ekvilibrisanje. Izooblici ZT tripsina su nakon toga desorbovani sa kolone upotrebom 0.9 M NaCl gradijenta rastvora soli. Prečišćeni preparat izooblik ZT tripsina bakalara bio je homogen sa SDS PAGE elektroforezom i FPLC Mono Q hromatografijom. Prečišćen preparat je sterilizovan filterom kroz filter sa veličinom pora 0.22 mikrona i skladišten je smrzavanjem na oko -20°C.

PRIMER 5.

Dobijanje preparata hidrogela tripsina bakalara, uključujući izooblike ZT tripsina bakalara

[0079] Prečišćen izooblik ZT tripsina bakalara koji sadrži preparat iz Primera 2 je pomešan sa hidrokoloidnim gelom koji sadrži vodeni gel koji se sastoji iz 0.8% mas/zap Karbomera 940 i 40% glicerola. Preparat tripsina bakalara je pomešan u odnosu 1:1 sa hidrogelom da se dobije finalna koncentracija 4 enzimske jedinice po mg (U/mg) u finalnoj smeši gela-enzima (enzim hidrogel mast),

2

enzimska jedinica je određena upotrebom Cbz-GPR-pNA kao supstrata kao što je prethodno opisano. Prema tome, dobijena mast enzima hidrogela sastoji se iz oko 0.01 mg/ml, ili 1 U/ml enzima tripsina bakalara, 0.4% Karbomera 940, 20% glicerola i 0.04% paraoksibenzoata.

PRIMER 6.

Antiviralna aktivnost izooblika ZT tripsina protiv enterovirusa kao modela za rinovirus

[0080] Pikornavirusi su mali jednolančani RNK virusi poztivnog lanca kojima nedostaje lipidni omotač. Enterovirus i rinovirus su dva roda Picornaviridae. Enterovirus se inicijalno replicira u orofarinksu i preživljava kiselo okruženje u stomaku. Tanko crevo je glavno mesto invazije enterovirusa. Rinovirus se replicira u nazalnim putevima ali se uništava u kiselom okruženju stomaka. Rinovirus i enterovirus imaju identičnu morfologiju ali se mogu razlikovati na osnovu klinčkih, biofizičkih i epidemioloških ispitivanja. Rinovirus je problematičan za održavanje u ćelijskim kulturama (Racaniello, 2007, Fields virology, 5th ed: 795-838). Prema tome, enterovirus se koristi kao model za rinovirus da bi se analizirala antiviralna svojstva izooblika ZT tripsina.

Materijali i Postupci

Štok rastvor Enterovirusa

[0081] Enterovirus (Koksakivirus B2) je izolovan iz pacijenta u Univerzitetskoj bolnci Islanda, odeljenju za Virologiju i gajen je u MA-104 ćelijama (ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna) ili Vero ćelije (ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna). Koksakivirus B2 je titriran (TCID50 = 8,23) prema Reed-Muench (REED i MUENCH, 1938, American Journal of Epidemiology 27: 493-497).

Enzimski izooblici

[0082] Izoenzimi tripsina bakalara su razdvojeni primenom benzamidin prečišćenog tripsina bakalara na MonoQ HR 5/5 kolonu za izmenu jona. Za izolovanje izooblika ZT tripsina, kolona je ekvilibrisana sa 25 mM Tris, 25 mM CaCl2, pH 7.5, i enzimi su eluirani sa linernim 0-400 mM NaCl gradijentom u zapremini 5 kolona, linearnim 400-1000 mM NaCl u zapremini 20 kolona na brzini protoka od 1 mL/min.

Tretman

[0083] MA-104 ćelije su gajene u mikrotitarskoj ploči sa 96-bunarića do postizanja 95% konfluentnosti. Enterovirus je razblažen iz štoka rastvora do 10<-6>upotebom minimalnog esencijalnog medijuma (MEM) i 1.5 mL iz razblaženog rastvora je preneto u dve različite bočice. Bočice su tretirane sa 1.5 mL izooblicima ZT tripsina i 1.5 mL MEM kao pozitivnom kontrolom. Negativna kontrola je MEM (3 mL) bez virusa. Sve bočice su inkubirane na 34 °C i 5% CO290 min pre dodavanja 100 mL rastvora benzamidin agaroze da bi se uklonio preostali tripsin i dodatno su inkubirane 30 min. Rastvor je centrifugiran na 5500 oum tokom 3 min pre prenošenje 2 mL supernatanta u Eppendorf epruvetu.200 µL rastvora je sipano u svaki bunarić, ukupno 10 bunarića u mikrotitarskoj ploči. Ploča je inkubirana 30 min. Posle inkubacije, medijum je uklonjen i MEM sa 1% serumom novorođenog govečeta (NCS) je dodat u svaki bunarić. Mikroskop je korišćen za praćenje prisustva infekcije.

Rezultati

[0084] Izooblici ZT tripsina su veoma efikasni kao antiviralni agensi protiv enterovirusa (Koksakivirus B2) koji je korišćen kao model za rinovirus. Rezultati su prikazani na SL 5.

2

2

2

2

2

1

�

4

4

4

4

�

4

�

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovani ZT izooblik tripsina bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1.

2. Izolovani ZT izooblik tripsina bakalara prema zahtevu 1, izabran između tripsina ZT-1 bakalara, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2; tripsina ZT-2 bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3; tripsina ZT-3 bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4; i tripsina ZT-4 bakalara koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5.

3. Kompozicija koja sadrži najmanje jedan ZT izooblik tripsina bakalara prema zahtevu 1 ili 2, zajedno sa pogodnim ekscipijentima i nosačima.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, gde pomenuti ZT izooblik(ci) tripsina bakalara su prisutni u smeši sa drugim tripsinima bakalara.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, gde pomenuti ZT izooblik(ci) tipsina bakalara sadrži najmanje 5% (mas/mas) ukupnog sadržaja tripsina bakalara u pomenutoj kompoziciji.

6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 3 do 5, koja se može davati lokalno, kao losion, hidrogel, sprej za usta ili sprej za nos.

7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 3 do 6, koji dalje sadrži polivalentni alkohol, kao što je glicerol.

8. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 3 do 7, za upotrebu u terapiji.

9. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 3 do 7, za upotrebu u (a) lečenju ili prevenciji bolesti uzrokovane patogenim organizmom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz virusa, bakterije, gljivice, parazita i protozoe;

(b) lečenju ili prevenciji bolesti u gornjem respiratornom traktu uzrokovane patogenim organizmima kao što su virusi, bakterije i gljivice;

(c) lečenju ili prevenciji bola, akutnog zapaljenja, hroničnog zapaljenja, artritisa, upaljenih zglobova, burzitisa, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, artritisa uzrokovanog sepsom, fibromijalgije, sistemskog eritemskog lupusa, flebitisa, tendinitisa, osipa, psorijaze, akni, ekcema, facijalnog seborejičnog ekcema, ekcema ruku, lica ili vrata, infekcija prepucijuma, atletskog stopala, infekcije fistula, inficiranih lokalnih ulcera, infekcije pupka kod novorođenčadi, bora, ožiljaka, keloida, potkožnih čireva, bradavica i alergijskog svraba, hemoroida, gljivične infekcije i imunološkog poremećaja uključujući autoimuni poremećaj;

(d) lečenju infekcija rana i rana od opekotina; i/ili

(e) uklanjanju mrtve ili ljuštene kože od inače zdrave kože.

10. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 3 do 7, za kozmetičku upotrebu.

11. Kompozicija za kozmetičku upotrebu, prema zahtevu 10, pomenuta kompozicija dalje sadrži dodatno kozmetički aktivno jedinjenje.

12. Postupak za dobijanje ZT izooblika tripsina bakalara koji sadrže aminokiselinsku sekvencu prema bilo kom od SEQ ID NO:2 do SEQ ID NO:5, koji obuhvata

(i) dobijanje vodenog ekstrakta utrobe bakalara,

(ii) izlaganje vodenog ekstrakta najmanje jednom ili koraku hromatografije, uključujući korak afinitetne hromatografije upotrebom p-aminobenzamidinskog afinitetnog liganda, i

(iii) desorpciju i eluiranje ZT izooblika tripsina bakalara vezanih sa p-aminobenzamidinskim afinitetnim ligandom.

13. Postupak prema zahtevu 12, koji dalje sadrži najmanje jedan korak upotrebom anjonske izmenjivačke smole nakon pomenutog koraka afinitetne hromatografije (ii) i/ili

dalje sadrži najmanje jedan korak upotrebom katjonske izmenjivačke smole pre koraka afinitetne hromatografije (ii).

14. Postupak prema zahtevu 12 ili 13, gde pomenuti desorbovani i eluirani ZT izooblici tripsina bakalara su sterilno proceđeni upotrebom filtera sa 0.45 µm ili manjom veličinom otvora.

15. Postupak prema bilo kom od zahteva 12 do 14, gde pomenuti ZT izooblici tripsina bakalara su izabrani između tripsina ZT-1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:2; tripsina ZT-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3; tripsina ZT-3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4; i tripsina ZT-4, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5, ili njihove smeše.

1