KR100699084B1

KR100699084B1 - 어류 세린 프로티나제,그 약제학적 및 화장품으로서의 용도

Info

Publication number: KR100699084B1
Application number: KR1020017016291A
Authority: KR
Inventors: 브라기 뱌나슨 존
Original assignee: 브라기 뱌나슨 존
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2007-03-23
Anticipated expiration: 2020-06-15
Also published as: AU4947800A; CN1197617C; NZ516632A; PL352318A1; PL202532B1; MXPA01013246A; US6846485B2; CN1356907A; KR20020025082A; DK1202743T3; US20020141987A1; WO2000078332A3; ES2231200T3; PT1202743E; NO20016159D0; AU779700B2; EP1202743A2; RU2264824C2; WO2000078332A2; IS2782B

Abstract

대서양 대구와 같은 대구에서 유래한 트립신 및 카이모트립신을 포함하는 어류 유래의 세린 프로티나제는 다양한 질병 및 장애를 치료 및/또는 예방하는 용도로 사용된다. 이러한 질병 및 장애는 염증성 질병, 바이러스, 박테리아 및 곰팡이류에 의한 감염성 질병, 및 수용체 매개 결합 관련 병리를 가진 질병이 포함된다. 프로티나제를 포함하는 약제학적 및 화장품용 조성물에 관하여 개시한다.

프로티나제, 트립신, 카이모 트립신, 대구

Description

어류 세린 프로티나제, 그 약제학적 및 화장품으로서의 용도 {FISH SERINE PROTEINASES AND THEIR PHARMACEUTICAL AND COSMETIC USE}

본 발명은 광범위하게는 질병의 치료, 예방 및 화장품 분야에 관련되며, 구체적으로는 어류 유래 세린 프로티나제(Serine Proteinases)의 약제학적 및 화장품으로서의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 활성물질로서 대서양 대구(Atlantic cod)로부터 추출한 트립신 (trypsin) 및/또는 카이모트립신 (chymotrypsin) 및 이들 효소와 관련된 세린 프로티나제를 포함하는 약제학적 또는 화장품용 활성 조성물을 제공한다.

미국 특허 제4,801,451호 및 제4,963,491호는 남극새우(Euphasia superba)로부터 추출한 엑소- 와 엔도 펩티다제(Exo- and endopeptideses)의 혼합물 및 이들 혼합물의 세제로서의 용도에 관해 기재하고 있다. 미국특허 제4,801,451호는 이들 효소의 상처부위의 이물질 또는 죽은 조직을 제거하는 용도에 관해 기재하고 있다. 국제특허출원 WO 85/04809호는 새우 효소의 소화촉진제로서의 용도에 관해 기재하고 있으며, 유럽특허 제0170115호는 새우효소의 혈전용해제로서의 용도에 관해 기재하고 있다.

그러나 상기 선행기술 문헌들은 모두 정제되지 않은, 거의 동정되지 않은 물질에 관해서만 기술하고 있을 뿐이다. 정제된 펩티다제 또는 펩티다제 혼합물은 약제학적으로 유용한 제품을 제공하는 데 있어 보다 더 바람직하다. 또한, 정제된 펩티다제 또는 펩티다제 혼합물이 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 정맥염, 습진, 발진, 건선 또는 감염성 질환 등의 치료에 유용하다는 기재는 찾아볼 수 없다.

국제특허출원 WO 96/24371호는 남극새우 유래의 다기능성 효소와 실제구조가 유사한 새우 유래의 다기능성 단백 분해 효소와, 갑각류 및 어류유래의 단백 분해 효소의 용도에 대하여 기재하고 있다. 또한, 상기 출원은 상기 다기능성 효소의 정제 방법 및 그 약제학적, 화장품용 및 그 외 다른 용도에 관해 기재하고 있다. 상기 출원은 남극새우 유래의 다기능성 효소와의 실제 구조 유사성에 있어서 새우 유래 다기능성 하이드롤라제(hydrolase)와 최소 70%의 상동성을 가진다고 기재하고 있다. 본 발명의 대구 유래의 트립신 및 카이모트립신은 새우 유래의 다기능성 효소와 70% 이하의 상동성을 보인다. 또한 대구 유래의 트립신 및 카이모트립신은 다기능성 효소도 아니다. 본 효소들의 알려진 주요 활성은 각각 트립신 단백분해제 및 카이모트립신 단백분해제이다.

본 발명의 주요목적은 체내 질병 및 장애의 치료를 위해 국부 혹은 국소 투여가 가능한 약제 또는 약제학적 조성물 및 화장품용으로서 대구 유래의 트립신 및 카이모트립신을 이용하는 용도를 제공하는 것이다. 효소가 절개된 상처부위나 점막을 통해 체내로 침투되지 않도록 하면서, 국소 또는 체내 장애의 치료를 위해 국소적으로 사용하는 경우 아래 실시예에 기재된 바와 같이 놀라운 효과가 있음을 알 수 있다. 이는 새우 유래의 다기능성 하이드롤라제를 여러 국소 통증을 치료하기 위해 주사하는 것과 같이 다른 효소들의 관련용도에 관해 기재하고 있는 선행기술과 상반되는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 체내 질병의 치료를 위하여 국부 또는 국소투여시 피부를 통과하여 다른 단백질 또는 비단백질 활성 물질을 수송하는 대구 유래 트립신 및 카이모트립신의 약제학적 조성물 또는 약제로서의 용도에 관한 것이다. 이러한 세린 프로티나제는 다양한 질병에 높은 약제학적 활성을 갖는다.

[발명의 요약]

본 발명은 첫째, 어류 세린 프로티나제의 약제로서의 용도에 관한 것이다. 특히 유용한 프로티나제는 대서양 대구와 같은 대구 유래의 트립신 또는 카이모트립신이다.

또한, 본 발명은 사람 및 동물의 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하는 어류 세린 프로티나제의 용도에 관한 것이다. 예방 또는 치료가능한 질병 및 장애는 통증, 급성 염증, 만성 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염(bursitis), 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염, 건염, 발진, 건선, 여드름, 습진, 안면 세보릭 습진, 손, 얼굴 또는 목 등의 습진, 얼굴 감염, 아틀레스 풋(athlete's foot), 피스틀 감염(fistulae infections), 감염성 국소 위염, 신생아의 배꼽 감염, 주름, 흉터, 티눈(kelloids), 종기(boils), 사마귀, 알레르기성 가려움증, 치질, 상처, 상처 감염, 화상 상처, 곰팡이류 감염, 자가면역 질환을 포함하는 면역 질환 등이다.

더 나아가, 본 발명은 건강한 피부로부터 죽은 또는 벗겨지는 피부를 제거하기 위한 약제, 또는 수용체 매개성 결합 관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하는 어류 세린 프로티나제의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 어류 세린 프로티나제를 포함하는 약제학적, 화장품용 조성물 및 사람 또는 동물의 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 사람 또는 동물에 약제학적 유효량의 어류 세린 프로티나제를 투여하는 방법을 포함한다.

상술한 본 발명에 따라, 본 발명은 (ⅰ) 대구 내장의 수(水)추출물을 생산하는 단계; (ⅱ) 파라아미노벤즈아미딘 친화성 리간드(p-aminobenzamidine affinity ligand)를 이용한 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 하나 또는 여러 단계의 크로마토그래피를 이용하여 수추출물을 처리하는 단계; 및 (ⅲ) 파라아미노벤즈아미딘 친화성 리간드에 결합한 트립신을 분리하는 단계를 포함하는 상업적 규모의 정제된 대구 트립신 동위효소(isoenzyme)의 생산방법 및 상업적 규모의 대구 트립신 정제 조성물을 제공한다.

본 발명은 대구 유래의 트립신, 다른 관련 트립신 또는 동물 특히, 대구를 포함하는 어류같은 수중 동물로부터 유래한 세린 프로티나제의 다양한 의료 및 화장품용 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, "효소"는 따로 명기하는 않는 이상 활성 효소를 의미하며, 또한 "트립신 또는 다른 관련 펩티다제"는 트립신 타입 펩티다제(EC 3.4.21.4) 및 대서양 대구 트립신과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 모든 펩티다제를 의미한다.(Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Gudmundsdottir et al., Eur. J. Biochem. 217:1091-1097, 1993) 또한, "카이모트립신 또는 다른 관련 펩티다제"는 카이모트립신 타입의 모든 펩티다제(EC 3.4.21.1) 및 대서양 대구 카이모트립신 A 및 B와 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 모든 펩티다제를 의미한다.(Asgeirsson and Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B: 327-335-94, 1991; Gudmundsdottir et al., Biochim et Biophys. Acta 1219:211-214, 1994)

특히, 본 발명의 효소는 통증, 염증, 급성 또는 만성 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절염, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염, 습진, 발진, 건선, 여드름, 상처, 칸디다증 등의 치료에 유용하다. 본 발명의 유용한 실시예에 따르면, 대구 트립신, 대구 카이모트립신 또는 그 혼합물을 정제된 펩티다제 또는 정제된 펩티다제와 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체(carrier)(특히, 하이드로젤 그러나 이에 국한되는 것은 아님.)와의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물의 형태로 환부에 국소투여한다. 또한, 본 발명의 효소는 포진(herpes outbreaks)과 같은 바이러스 감염 질환, 균상종, 박테리아 또는 기생충 감염, 대장염, 위염, 치질, 각막 상처, 치아 플러그, 자가면역 질환을 포함하는 면역 질환 등의 치료에 유용하다.

대구 유래 트립신, 카이모트립신 효소와 유사한 실제 구조를 갖는 효소들은 대구 효소와 같은 유용성을 갖는다.

특히, 이러한 트립신, 카이모트립신 효소는 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 정맥염 등의 치료에 유용하다. 이러한 치료에 있어서 트립신, 카이모트립신 또는 그 혼합물 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체(특히, 하이드로젤 그러나 이에 국한되는 것은 아님.)를 포함하는 약학적 조성물을 관절염 또는 염증부위에 국소 또는 국부적으로 투여한다. 또한, 본 발명의 트립신, 카이모트립신 효소는 포진과 같은 바이러스 감염 질환, 균상종, 박테리아 또는 기생충감염, 대장염, 위염, 치질, 각막 상처, 치아 플러그, 여드름, 상처, 칸티다증, 자가면역 질환을 포함하는 면역질환 등의 치료에 유용하다.

특히, 본 발명은 대서양 대구 또는 다른 동물로부터 유래한 트립신의 의료적, 약제학적 및 화장품용 용도에 관한 것이다. 정제 및 동정된 대서양 대구 유래의 트립신의 동위효소는 세가지가 있으며, 이들은 트립신 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ으로 명명된 바 있다.(Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989) 소 트립신과 같은 포유동물 트립신의 아미노말단 서열이 I-V-G-G-Y-Q/E-C-E/T-K/R-H-S-Q-A-H-QV-S-L-N-S 인데 비하여, 대구 트립신의 아미노말단 서열은 I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S 이다. 대구 트립신의 세가지 동위효소는 모두 유사한 24kDa의 분자량을 가진다.

또한, 본 발명은 대서양 대구 또는 다른 동물로부터 유래한 카이모트립신의 의료적, 약제학적 및 화장품용 용도에 관한 것이다. 정제 및 동정된 대서양 대구 유래의 카이모트립신의 동위효소는 두가지가 있으며, 이들은 트립신 A 및 B로 명명된 바 있다.(Asgeirsson and Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991) 소 트립신A와 같은 포유동물 카이모트립신의 아미노말단 서열이 C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L (A형 사슬) 및 I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D (B형 사슬) 인데 비하여, 대구 카이모트립신의 아미노말단 서열은 C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I/V-T-G-Y (A형 사슬) 및 I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q (B형 사슬) 이다. 대구 카이모트립신의 두 가지 동위효소는 모두 유사한 26kDa의 분자량을 가진다.

대구 트립신 및 카이모트립신은 간, 비장 및 알을 제외한 대구 내장으로부터 분리 및 정제된다. 본 발명자는 대구 트립신 및 카이모트립신을 상업적 규모로 생산하는데 유용한 방법을 발견하였다. 본 발명의 효소는 물과 내장의 비율에 관계없이, 바람직하게는 내장과 물의 비율(w/w)을 1:1 내지 1:10으로 하여, 천천히 교반하면서 전체 또는 분쇄된 대구 내장으로부터 수추출한다. 미정제의 추출액과 잔여 내장을 분리한 후, 침전법 또는 여과법으로 투명한 추출액을 얻는다. 투명한 용액을 초여과법으로 농축하고, 이때, 여러 단계를 포함하는 컬럼크로마토그래피 정제 단계에 적합한 생물성 이물질이 적은 용액을 얻기 위하여 이온교환수지를 선택적으로 포함하여 미세여과할 수 있다. 다음으로 대구 트립신은 친화성 크로마토그래피를 이용하고, 카이모트립신은 소수성 반응 크로마토그래피를 이용하여 정제한다. 이 때, 대구 트립신은 아미노벤즈아미딘 친화성 크로마토그래피를 이용하고, 카이모트립신은 페닐 세파로즈 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 기재하고 있는 대구 트립신 및 카이모트립신의 상업적 규모의 생산은 주문에 따라 1g 내지 10g 이상 또는, 10g 내지 100g 이상의 양을 신뢰성있고 확고하게 대량생산하는 정도의 방법을 의미한다.

정제 효소 또는 정제 효소 혼합물은 0 내지 85%(vol/vol)의 글리세롤(Glycerol)과 같은 다가 알콜(Polyvalent Alcohol, Polyol)을 포함하는 물과 하이드로젤 조제로 사용하는 것이 바람직하다. CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (carbobenzoxy Gly-Pro-Arg-para nitroanalide)에 대하여 적합한 농도의 트립신 활성은 최종 하이드로젤 100ml당 0.1 내지 10,000 활성효소단위이며, Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA에 대하여 적합한 농도의 카이모트립신 활성은 최종 하이드로젤 100ml당 0.1 내지 10,000 활성효소단위이다.

본 발명은 또한 대구 트립신, 관련 펩티다제 및 약제학적으로 적용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 (a) 본 발명의 정제된 효소의 유효량을 사용하는 특정조건에 관련된 방법, (b) 상기 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 물질, (c) 상기 방법에 사용하기 위한 효소의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물, 및 (d) 상기 방법에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 효소 또는 효소 조성물의 용도를 제공한다. 상기 방법은:

치료 또는 예방에 바람직한 유효량의 대구 트립신 및 관련 펩티다제를 투여하여, 통증, 염증, 급성 또는 만성 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염 등에서 선택된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 것이다;

또한, 피부과 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 유효량을 투여하여, 여드름, 발진, 건선, 안면 세보릭 습진, 손, 얼굴, 머리가죽 또는 목 등의 습진, 치질과 같은 피부과 증상을 치료 또는 예방하기 위한 것이다;

또한, 치료한 상처 부위에 괴사조직이 없도록 (미생물 감염 방지에 필요한 유효량의 효소를 투여하거나 미생물 감염 방지에 바람직한 유효량의 효소를 투여하면서 상처 치유를 촉진하여) 상처 감염의 치료 또는 예방하고, 죽은 피부의 제거에 바람직한 유효량을 투여하여 피부의 외관을 위하여 건강한 피부로부터 죽은 또는 벗겨지는 피부를 제거하기 위한 것이다;

또한, 암치료에 바람직한 유효량 또는 전이 억제 또는 금지에 필요한 유효량을 투여하여 혈우병, 아테롬성 동맥경화증, 천식 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증상, 건막과 같은 조직 유착, 복부 수술후 혹은 관절 유착, 재관류 부상, 말라리아, 자가면역성 질환과 같은 면역질환, 세포사멸, 대장염, 크론병과 같은 장염을 치료 또는 예방하기 위한 것이다;

또한, 미생물 감염 예방 또는 치료에 바람직한 유효량 또는 세포 대 세포, 세포 대 바이러스의 부착을 막는데 바람직한 유효량의 대구 트립신을 투여하여 포진 바이러스 감염(HSV-1, HSV-2, 대상포진, 생식기 포진 감염), HIV, 간염, 인플루엔자, 코로나바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 라이노바이러스(rhinovirus), 파필로마바이러스(papilloma virus) 감염; 위염, 설사 등의 소화기 질환을 일으키는 감염; 효모감염, 곰팡이류 손톱 감염, 칸디다 감염 등을 포함하는 전신, 피부, 구강, 질, 인후두의 곰팡이 감염; 보다 바람직하게는 눈에 직접 투여함으로 치료되는 눈의 미생물 감염; 포도상 구균, 연쇄상 구균, 클렙실라, 슈도모나스, 임질균(Neisseria gonorrheae), 헤모필루스, 클라미디아, 시필리스(syphilis) 또는 대장균 감염증 등에 의한 미생물 감염, 연성하감을 유발하는 미생물 감염; 면역손상환자의 기회성 미생물 감염을 치료 및 예방하기 위한 것이다; 및

치석 제거에 바람직한 유효량을 투여하여 치석을 제거하거나, 혈전 용해에 필요한 유효량을 투여하여 혈전을 용해하기 위한 것이다.

본 방법은 대구 트립신 및/또는 카이모트립신 또는 상기한 관련 펩티다제를 포함하는 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 조성물은 죽은 세포, 발산 세포(divergent cell)의 제거에도 사용할 수 있다.

본 발명은 대구 트립신 및/또는 카이모트립신 또는 상기한 관련 펩티다제를 포함하는 국소 화장품 또는 약학적 조성물, 젤, 크림, 좌제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 다음을 제공한다. (a) 세포간 부착, 세포와 바이러스의 부착에 관련된 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포간 부착 또는 세포와 바이러스간 부착에 관련된 세포나 바이러스 수용기(acceptor) 또는 수용체 부착 성분을 제거하거나 불활성화 시키기에 효과적인 항부착 유효량의 대구 트립신, 카이모트립신 또는 이와 관련된 펩티다제를 투여하는 것을 포함한다, (b) 그러한 방법에 사용되는 조성물이나 물질, (c) 그러한 방법에 사용하기 위한 유효량의 효소를 포함하는 약제학적 조성물, 및 (d) 그러한 방법에 사용되는 약제 생산에 사용되는 효소 조성물의 사용. 일반적으로 이러한 증상은 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 정맥염, 습진, 발진, 건선, 여드름, 상처, 칸디다증, 자가면역 질환을 포함하는 면역질환, 쇼크, 암 전이, 장기 이식 후 거부반응, 미생물 감염 등이다. 바람직하게는 (a) 그 증상은 미생물 감염, 면역 질환, 혈우병, 아테롬성 동맥경화증, 암, 천식, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증상, 결막염, 재관류 부상, 통증 등의 그룹으로부터 선택된다. (b) 대구 트립신이 절단하는 CD4, CD8, CD54(ICAM-1), CD31, CD62L, CD102(ICAM-2), CD11a/CD18로부터 선택되는 세포 대 세포, 또는 세포 대 바이러스 유착 증상과 관련되는 세포 표면 수용체는 본 효소의 투여로 인하여 제거되거나 불활성화된다. 바람직하게는 치료 및 예방되는 미생물 감염은 포진, HIV, 간염, 파필로마 감염; 장염 및 설사를 유발하는 감염; 구강, 질, 인후두 칸디다 감염 같은 칸디다 감염; 감기, 인플루엔자 감염; 포도상 구균, 연쇄상 구균, 클렙실라, 슈도모나스, 헤모필루스, 또는 대장균 감염증; 일차 또는 이차 나병 감염; 결막염, 결핵을 유발하는 감염 등이다.

한 실시예에서 본 발명은 대구 트립신 또는 카이모트립신을 투여함으로서 병리 미생물의 전염을 억제하거나 예방하는 방법을 제공하고 있다. 더 바람직하게는 대구 트립신 및/또는 카이모트립신 효소는 미생물의 첫번 감염관문이 되는 신체의 부분에 투여한다. 하나의 실시예에서는 스프레이, 연고, 세정액을 예를 들어 HIV 또는 간염의 전염을 막기 위해 성행동 관련 신체부분에 투여한다. 또 다른 실시예에서는 라이노바이러스 또는 코로나 바이러스 등 일반 감기 바이러스의 전염을 억제 또는 막기 위해 대구 트립신 또는 카이모트립신 효소나 관련 펩티다제를 에어로졸로 공기에 살포한다.

한편으로는 세포 부착 성분을 제거하기 위해서 조직, 체액, 세포 조성물을 외용으로 치료하는 방법은, 한 사람에게서 다른 사람에게 이식되는 조직, 체액, 세포 조성물의 면역 거부를 감소시킨다. 다른 면에서는 그러한 치료는 미생물에 감염된 후 조직, 체액, 세포 조성물에서 발견되는 세포 부착성분을 제거하거나 불활성화시킨다.

패혈성 쇼크, 독성 쇼크 등을 치료하거나 예방하기 위해서 대구 트립신이나 이와 관련된 펩티다제를 투여할 때 적당한 투여경로는 전신 투여가 있다. 쇼크, 질홍반과 관련된 질감염에는 크림, 겔, 좌약이 투여방법으로 이용될 수 있다.

통증, 염증, 급성 염증, 만성 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염 등을 치료하거나 예방하기 위한 적당한 투여경로는 제한없이 크림, 겔, 좌약을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니고, 특히 글리세롤 또는 다가 알콜을 포함하는 하이드로겔 등이 있다.

발진, 건선, 여드름, 안면 세보릭 습진, 손, 얼굴, 머리가죽, 목 등의 습진을 포함하는 습진, 얼굴감염, 아틀레스 풋, 피스틀 감염, 감염성 국소 위염, 신생아의 배꼽 감염, 주름, 흉터, 티눈, 종기(boils), 사마귀, 알레르기성 가려움증, 치질, 상처, 상처 감염, 화상 상처, 피부의 외관을 위하여 건강한 피부로부터 죽은 또는 벗겨지는 피부를 제거, 효모감염, 곰팡이류 손톱감염, 칸디다 감염 등을 포함하는 전신, 피부, 구강, 질, 인후두의 곰팡이 감염, 자가면역 질환을 포함하는 면역 질환 등을 대구 트립신 및/또는 카이모트립신 또는 상기한 관련 펩티다제를 투여하여 치료하거나 예방하기 위한 적당한 투여경로는 크림, 겔, 좌약이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 글리세롤이나 다른 다가 알콜을 함유하는 하이드로겔 등이 있다.

본 발명의 또 하나의 목적은 통증, 염증, 급성 염증, 만성 염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염, 발진, 건선, 여드름, 안면 세보릭 습진, 손, 얼굴, 머리가죽, 목 등의 습진을 포함하는 습진, 얼굴감염, 아틀레스 풋, 피스틀 감염, 감염성 국소 위염, 신생아의 배꼽감염, 주름, 흉터, 티눈, 종기(boils), 사마귀, 알레르기성 가려움증, 치질, 상처, 상처 감염, 화상 상처, 피부의 외관을 위하여 건강한 피부로부터 죽은 또는 벗겨지는 피부를 제거, 효모감염, 곰팡이류 손톱 감염, 칸디다 감염 등을 포함하는 전신, 피부, 구강, 질, 인후두의 곰팡이 감염, 자가면역 질환을 포함하는 면역 질환 등의 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. 또 다른 목적은 상기 질환 치료용 조성물을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다. 세번째 목적은 외용 또는 국소 투여시 투여량을 포함하여 상기 질환 치료용 조성물을 투여하는 방법을 제공하는데에 있다. 이와 같이 본 발명은 효소가 사용된 적이 없거나 혹은 더 나은 효소가 사용된 적이 없는 경우에 사용되는 효소를 포함하는 조성물에 그 기반을 두고 있다.

통증, 염증, 관절염, 혹(swelling), 부종, 건선, 습진, 피부염, 발진 그 외 서론부에서 기술한 여러 증상 등을 경감시킬 수 있는 유효량의 대구 트립신 및/또는 카이모트립신을 포함하는 조성물을 사용함으로서 상기 목적은 달성될 수 있다. 대구 효소는 대구 내장으로부터 비교적 간단한 방법에 의하여 고수율로 얻어질 수 있다. 대구 효소는 비교적 간단한 방법으로 상업적 규모 및 괜찮은 수율로 정제될 수 있다고 알려졌다. 정제된 대구 트립신은 세 종류의 주 동위효소를 함유하고 정제된 대구 카이모트립신은 두 종류의 주 동위효소를 함유한다. 하나 또는 모든 동위효소는 본 발명의 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 대구 트립신 및 카이모트립신은 세포 생존에 영향을 주지 않고 CD4, CD8, CD54(ICAM-1), CD31, CD62L, CD102(ICAM-2), CD11a/CD18, TNF-alpha, IL-1, MMP-9과 같은 세포표면 부착 분자, 박테리아 장내 독소(enterotoxin), 사이토카인, 염증매개물, 매트릭스 메탈로프로티나제(MMPs)를 효과적으로 제거하거나 불활성화할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이와 같은 부착 부분의 절단, 사이토카인, 염증 매개물, 메트릭스 메탈로프로티나제(MMPs)의 불활성화 등은 모두는 아니더라도 대구 트립신 및 카이모트립신이 유효한 대부분의 질병에 대한 대구 트립신 및 카이모트립신의 약효에 대한 부분적인 설명이 된다. 또한 TNF-alpha는 관절염, 건선, 암, 염증에 연관이 있다. (Cytokines, Eds. Mire-Slui and Thrope, Academic press, 1998, p350 참조)

대구 트립신 및 카이모트립신은 여러면에서 기존의 프로테아제에 비하여 효과가 우수한 것으로 보인다. 이런 견지에서 가장 활성이 높은 13가지의 프로테아제는 혈장의 억제효과를 기준으로 상기 특정 세포 표면 부착 분자, 박테리아 장내 독소, 사이토카인, 염증 매개물, 매트릭스 메탈로프로티나제(MMPs) 등의 16개에 대한 활성도를 측정한 결과 대서양 대구 트립신 및 카이모트립신의 활성도가 월등하였다. 프로테아제는 높음에서 매우 높음의 경우 2점을 기록하였고, 낮음에서 보통의 경우 1점, 매우 낮음에서 활성 없음의 경우 0점을 기록하였다. (프로테아제의 혈장 억제활성은 점수를 역전함) 이러한 기준으로 보았을때 새우 다기능성 프로테아제가 16점을 얻었는데 비하여 대서양 대구 트립신은 30점을, 카이모트립신은 29점을 기록하였다. 소의 트립신 및 카이모트립신 프로테아제는 이런 면에서 부족하다. 더 나아가서 대구 트립신 및 카이모 트립신은 활성의 비교를 위하여 기존 크로모제닉 기질을 이용했을 때 소의 대응 효소보다 2배에서 20배 정도 활성도가 높았다.(Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Asgeirsson and Bjarnason., Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991)

대구 내장은 본 발명의 대구 트립신 및 카이모트립신 효소의 주요 공급처이다. 예를 들어 본 효소는 냉동 내구 내장으로부터 상업적 규모로 추출될 수 있다. 정화되고 농축된 추출액은 원한다면 상업적 규모의 이온교환 크로마토그래피로 분획할 수 있고 바람직하게는 먼저 양이온교환 크로마토그래피 및 둘째로 음이온교환 크로마토그래피를 통하고 관련 엘라스타제나 콜라게나제 같은 세린 프로티나제를 제거한다. 마지막으로 대구 트립신은 아미노벤즈아미딘 친화성 크로마토그래피, 카이모트립신의 경우는 페닐세파로즈 크로마토그래피같은 소수성 반응 크로마토그래피를 이용하여 상업적 규모로 정제된다.

본 발명의 대구 트립신은 효소와 친화성 리간드 사이의 결합을 불안정화하는 조건을 가하여 친화성 매트릭스로부터 제거할 수 있다. 그러한 조건은 바람직하기로는 30% 내지 그 이상의 글리세롤 농도에서 고농도의 염, 다음의 저 pH의 조건이다. 컬럼 용출액은 산 용출단계 다음에는 대구 트립신을 안정화하기 위해 중성화액을 거친다 (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). 대구 카이모트립신은 효소와 소수성 결합 리간드사이의 결합을 불안정화하는 조건을 가하여 페닐세파로즈 크로마토그래피로부터 용출한다. 그러한 조건은 수중 혹은 완충액 중의 고농도의 글리세롤이며 바람직하기로는 50%이상 농도를 말한다 (Asgeirsson and Bjarnason., Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991). 이러한 방법에 의하여 순도 90% 이상의 대구 트립신 및 카이모트립신을 추출할 수 있다. 대구 트립신분획은 SDS 전기영동에 의하면 한 개의 밴드로, 아이소일렉트릭 포커싱(isoelectric focusing)에 의하면 세 개의 밴드로 분리되고, 크로마토포커싱 크로마토그래피에 의하면 세 개의 트립신 동위효소와 관련된 세 개의 피크로 나타나는 바와 같이 (도 1) 세 종류 효소형이나 동위효소를 함유하고 있다. 음이온교환 크로마토그래피를 적용하지 않는다면 트립신Ⅳ 안에도 최소 네 개의 동위효소가 부가적으로 대구 트립신 분획에 포함되어 있다. 이들은 부가적으로 모노-Q 또는 DEAE-음이온교환 크로마토그래피로 이하 분획(subfraction)으로 분리할 수 있다.

대서양 대구 이외의 다른 원료 유래의 세린 프로테아제는 분자량, 등전점, 아미노산 서열, 온도, pH 안정성, 온도 내지 pH 최고치, 단백 분해 특이성, 반응속도조건 및 실시예에 예시된 대서양 대구 트립신의 여러 다른 조건들에 대하여 대서양 대구 트립신과 비교할 수 있다. (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989) 대구 트립신의 활성도는 타이로신 알지닌 메틸 에스테르(TAME)를 기질로 사용하여 측정할 수 있다. 활성도 60U/mg를 보이는 새우 다기능성 하이드롤라제에 비하여 친화성 컬럼으로 정제하여 분리된 대구 트립신(90-100% 순도)은 pH 8.1, 25°C에서 최소 140U/mg 활성도를 보인다. 또한 Cbz-Gly-Pro-Arg-파라니트로아날라이드(Cbz-GPR-pNA)를 기질로 사용하면 트립신의 활성도를 측정할 수 있는데 바람직하게는 특이 활성도 최소 100U/mg을 얻는다. 더 나아가서, Bz-Arg-pNA을 이용하여 기질 반응효율상수(substrate catalytic efficiency constants, k_cat/K_m)를 측정할 수 있는 바, 소 트립신은 3 s^-1mM^-1인데 비하여, 대구 트립신Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 경우는 각각 52, 20, 7 s^-1mM^-1의 기질 반응효율상수(k_cat/K_m)를 얻었다.(Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989) 대구 카이모트립신 및 소 카이모트립신의 경우에도 유사한 차이가 관찰되었다.(Asgeirsson and Bjarnason., Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335, 1991)

트립신Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ의 등전점이 각각 6.6, 6.2, 5.5이고 트립신Ⅳ 동종효소는 더 낮은 한편, 대구 트립신의 분자량은 24kDa정도이다, 대구 트립신은 수개의 동종형때문에 각 아미노산의 다양성을 포함하는 다음의 서열로 표현된다.

I-V-G-G-Y-E-C-T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y/F-C-G-G-S-L-I-N-K/E-D/Q-W-V-V-S-A-A-H-C-Y-K-S-V-L-R-V-R-L-G-E-H-H-I-R-V-N-E-G-T-E-Q-Y/F-I-S-S-S-S-V-I/X-R-H-P-N-Y-S-S-Y-N-I-N/D-N-D-I-M-L-I-K-L-T-K/E-P-A-T-L-N-Q-Y-V-H-A-V-A-L-P-T-E-C-A-A-D-A-T-M-C-T-V-S-G-W-G-N-T-M-S-S-V-A/D-D-G-D-K-L-Q-V/C-L-N/S-L-P-I-L-S-H-A-D-C-A-N-S-Y-G-P-G-M-I-T-Q-S-M-F-C-A-G-Y-L-E-G-G-K-D-S-C-Q-G-D-S-G-G-P-V-V-C-N-G-V-L-Q-G-V-G-V-V-S-W-G-Y-G-C-A-E-R-D-H/N-P-G-V-Y-A-K-V-M/V/C-V-L-S-G-W-V-R-D-T-M-A-N/S-Y

X는 아미노산이 없는 경우이거나 모든 아미노산이 올 수 있으며, 아미노산 9 위치에서 대구 트립신 Ⅱ, Ⅲ은 아미노산 R인데 비하여, 대구 트립신Ⅰ은 아미노산 K서열을 가진다.(Gudmundsdottir et al., 1993 및 미공개 자료)

일반적으로 대구 트립신은 10mM 염화칼슘을 포함하는 5°C, pH 7.0 완충액에 18시간을 저장하여도 TAME 활성도 50%을 유지할 수 있을 정도로 충분히 안정하다. 그러나, pH 2.0, 5°C에서 18시간 저장하면 활성도의 10%만 유지된다 (도 2).

TAME을 기질로 하는 대구 트립신의 pH적정치는 7.0 내지 8.7 정도이며 8.0이 선호된다 (도 3). TAME를 기질로 사용시 10mM 염화칼슘 존재시 pH 8.1, 25°C에서의 Km 값은 대구 트립신Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 경우 각각 0.029mM, 0.021mM, 0.049mM이다. 바람직하게는 TAME 기질의 최고 활성도의 온도는 50°C 내지 60°C사이이다. (도 4)

본 발명의 대구 트립신 및 카이모트립신 효소는 국소적, 경구, 직장, 질내, 점적(예를 들면, 요도로 또는 직장으로), 폐로 예: 에어로졸, 눈으로 액을 투여하고 전신적으로는 예를 들어 근육내, 피하, 복강내, 동맥내, 정맥내로 투여한다. 대구 효소는 용액의 형태로 또는 약제학적으로 수용 가능한 담체 또는 표준제약 실무에 따른 부형제와 결합하여 투여한다. 경구투여로는 대구 효소는 정제, 캡슐, 로젠지, 껌, 트로키, 분말, 시럽, 엘릭시, 수용액, 부유액 등의 형태로 투여한다. 정맥내 주사를 위하여는 전체 용매 농도가 등장액이 되도록 준비하여야 한다. 눈에 투여하려면 연고 또는 점안액은 투여용기나 아이드로퍼 등의 점안용기를 통하여 투여될 수 있다. 폐 투여에는 에어로졸을 제조하기 위한 희석액, 매개물질(carrier) 등이 선택될 것이다. 국소투여에는, 대구 트립신 효소는 20% 내지 30% 정도 또는 85%와 같은, 0 내지 85%의 글리세롤을 함유하는 하이드로겔로 투여된다.

국부적 치료를 위하여는 대구 트립신 효소의 적합한 일회분 투여량은 0.01㎍/cm² 내지 1mg/cm², 바람직하게는 0.1㎍/cm² 내지 0.01mg/cm²(0.01 mg/ml 효소 겔 사용)이다. 전신적 치료를 위하여는 대구 트립신 효소의 혈장내 농도를 0.1mg/100ml 내지 100mg/100ml를, 바람직하게는 0.5mg/100ml 내지 2.0mg/100ml를 유지하도록 투여량이 선택될 것이다. 선호되는 전신 투여량의 또 다른 값은 0.1mg/kg 내지 10mg/kg, 더 바람직하게는 1mg/kg이다. 질내 또는 요도관내 투여를 위하여는 적합한 대구 트립신 효소의 세정/점적액은 농도 1㎍/ml 내지 15mg/ml, 더 바람직하게는 100㎍/ml 내지 3mg/ml이다. 모든 치료에 있어서, 효소 조성물은 하루에 1회 내지 10회 투여될 것이며, 더 바람직하게는 하루에 2회 내지 5회 투여될 것이다. 이러한 값은 질병의 종류 및 정도, 나이, 몸무게, 환자의 의학적 상태와 같은 많은 요인에 의하여 달라질 것이며 이는 의료분야 당업자라면 용이하게 알 수 있을 것이다. 실제적으로 더 높은 고농도도 부작용없이 사용될 수 있으리라 예상된다.

상처치료를 위해서는 대구 트립신 효소는 상처의 최초 드레싱 처치를 하는 때보다 더 자주 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 대구 트립신은 상처의 드레싱 처치를 할 때마다 투여한다. 대구 트립신 효소는 최소한 격일로 한번, 바람직하게는 매일, 또는 하루에 여러차례 투여될 수 있다. 습진, 건선같은 피부 증상의 경우, 대구 트립신 효소 및/또는 카이모트립신 효소 하이드로겔은 선호적으로 매일 투여되며, 바람직하게는 매일 2회 투여된다. 급성, 만성 염증, 관절염, 염증성 관절, 활액낭염, 골관절염 등에는 대구 트립신 효소는 선호적으로 매일 투여되며, 바 람직하게는 매일 2회 투여된다.

이하의 많은 임상 실시예에서 기재하고 있는 바와 같이 본 발명의 대구 효소 하이드로겔은 염증상태를 치료 및 예방하는데 유효하다. 전형적으로 치료 시작 후 2 내지 3일 이내에 염증은 수용가능한 정도로 감소된다. 실시예는 또한 본 효소는 통증 경감에도 유효하다는 것을 보여준다. 통증 경감은 치료 시작 후 20분 내지 2시간 내에 보고된다. 통증 경감은 치료된 조직의 감각상실을 수반하지 않는다. 환자가 약한 통증, 혹은 상처가 약간 아픈 정도를 느끼는 정도일 때 치료 후 1일 이내에 더욱 완전한 통증 경감을 느낄 수 있다.

일반적으로 본 발명에 따른 대구 효소는 유효량이 투여될 것이다. 유효량이란 (1) 치료하려는 질병의 증상을 경감, (2) 치료하려는 질병의 치료와 관련된 약물학적인 변화 유도, (3) 감염물질에 의한 감염 또는 재감염을 억제 또는 예방, (4) 비감염성 질병의 발생 억제 (예를 들면, 세포부착현상을 방지함으로써 치료될 수 있는 질병)하는데 효과적인 양이다. 상처 치료에는 유효량은, 정기적으로 투여된다면, 감염 발생을 억제하는 정도를 포함한다. 다른 면에서는, 상처 치료를 위하여는 유효량은 상처치유에 걸리는 시간을 단축하기에 효과가 있는 양도 포함한다.

단백질의 퍼센트 상동성을 측정할 수 있는 수많은 방법이 당업계에 알려져 있다. 한 선호되는 방법은 서열비교를 하는 GAP 컴퓨터 프로그램 6.0 버전이다. 이 프로그램은 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹으로부터 입수할 수 있으며, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2, 482 (1981)에 의하여 수정된 Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970)의 배열방법을 사용한다. 다른 입수가능한 방법은 FASTA컴퓨터 프로그램이다.

이후, 제한 없는 실시예 및 도면을 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

도 1은 아미노벤즈아미딘 친화성 컬럼 정제 단계를 거친 대구 트립신 분획의 크로마토포커싱 크로마토그래피를 보여준다. 파라아미노벤즈아미딘 컬럼으로부터 용출된 분획은 10mM 염화칼슘을 함유하는 25mM 모노에탄올아민/초산 pH 9.4로 전처리한 세파덱스 G-25 컬럼으로 겔 여과되었고 부가적으로 같은 액으로 전처리한 PBE-94 이온교환수지(Pharmacia, Sweden)컬럼을 통과시켰다. 컬럼은 10mM 염화칼슘을 함유하는 폴리버퍼 94(초산으로 pH 5.5로 조정)로 용출하였다. 기질 TAME(채워진 동그라미), 280nm(열린 동그라미), pH(열린 다이아몬드)의 활성도가 측정되었다. 첫번째로 용출된 분획은 트립신Ⅰ, 두번째 분획은 트립신Ⅱ, 세번째 분획은 트립신Ⅲ라 명명되었다.

도 2는 여러 pH에서의 배양, 2가지의 시간후의 잔여 TAME 활성에 의하여 측정되어지는 파라아미노벤즈아미딘에 의하여 정제된 대서양 대구 트립신의 안정성에 있어서 pH가 미치는 영향을 보여준다. 대서양 대구 트립신 샘플은 여러 pH에 5°C, 30분간(열린 동그라미) 및 18시간(채워진 사각형)동안 배양되었다. TAME 기질에 대한 잔여 활성도는 pH 8.1, 25°C에서 측정되었다.

도 3은 TAME 기질에 의하여 측정되는 파라아미노벤즈아미딘에 의하여 정제된 대서양 대구 트립신의 활성도의 pH 의존도를 보여준다. 완충액은 최종농도 0.1M로 10mM 염화칼슘을 함유하는 아세틱산(pH 3.0-5.9), hepes/HCl(pH 6.0-8.0) 및 글라이신산(pH 8.3-9.0)이다.

도 4는 TAME 기질에 의하여 측정되는 대서양 대구 트립신의 활성도 및 소 트립신 활성도의 온도 의존도 비교를 보여준다. 효소는 전열처리된 온도조절 큐벳에 첨가되어 짧은 안정화 시간 후 가수분해 평균속도를 3분간 측정하였다.

실시예 1

대구로부터 프로테아제 혼합물의 준비

약 100kg의 냉동 대구 내장을 해동하여 4배 분량의 냉수가 있는 추출탱크에 첨가하고 수산화나트륨액으로 pH 8-9가 되도록 조절하였다. 혼합액은 0 내지 5°C로 2 내지 6시간동안 교반하였다. 30분정도의 침전 후, 수추출액을 펌프로 잔여내장으로부터 분리하여 침전탱크에 저장하였다. 수추출액은 냉장된 침전탱크에서 침전되도록 24시간 내지 60시간동안 방치되었다. 상등액은 상등액탱크에서 펌프를 사용하여 분리되어 저장탱크에 저장하였다. 상등액은 3mS/cm 이하의 전도가로 수용할 수 있는 정도의 이온강도를 가지도록 초여과법 및 여과법으로 10배 내지 20배 농축되었다.

실시예 2

농축된 대구 내장 추출액으로부터 대구 트립신의 정제

실시예 1에서 얻어진 여과된 농축액 10L는 첫째, CM 고속 양이온교환수지(Pharmacia, Sweden), 둘째, DEAE 고속 음이온교환수지(Pharmacia, Sweden), 셋째, 세파로즈 수지에 결합된 파라아미노벤즈아미딘 친화성 리간드(Pharmacia, Sweden) 등으로 연속적으로 연결된 1L 폐쇄 크로마토그래피 컬럼에 투여되었다. 컬럼은 컬럼 10배 부피의 2.5mM 염화칼슘을 함유하는 25mM 트리스 완충액, pH 7.8(A 완충액)으로 충전되었다. 농축액은 분당 100ml의 유속으로 유입되었다. 컬럼으로 농축액의 도입이 끝난 후 잔여물은 A 완충액 8L로 연속 컬럼시스템으로 세척되었다. 이 세척이 완료된 후 파라아미노벤즈아미딘 친화성 컬럼은 다른 컬럼으로부터 분리되어 0.5M NaCl, 2.5M 염화칼슘을 함유하는 5배 컬럼분량의 25mM 트리스 완충액 pH 7.5 고농도의 염 용액으로 세척하였다. 대구 트립신은 친화성 리간드로부터 10mM 염화칼슘 및 30% 글리세롤을 함유하는 25mM 초산액, pH 3.2로 컬럼으로부터 용출하였다. 대구 트립신 분획은 30% 글리세롤을 함유하는 200mM 트리스, pH 8.5, 중화액으로 저장되었다. 정제된 대구 트립신 조제액은 SDS PAGE 전기영동 및 FPLC 모노 Q 크로마토그래피상으로 균질한 것으로 보이며 아이소일렉트로 포커싱으로는 3개의 트립신 동위효소 밴드를 보인다. 효소 조제액은 상기한 바와 같이 Cbz-GPR-pNA를 기질로 사용시 100U/mg 정도의 특이적 활성도를 보였다. 정제된 조제액은 0.22 마이크론 필터로 -20°C에서 여과 살균되었다.

실시예 3

농축된 대구 내장 추출액으로부터 대구 트립신의 다른 상업적 규모 정제

실시예 1에서 얻어진 여과된 농축액 10L는 세파로즈 수지에 결합된 파라아미노벤즈아미딘 친화성 리간드(Pharmacia, Sweden)에 투여되었다. 컬럼은 컬럼 10배 부피의 2.5mM 염화칼슘을 함유하는 25mM 트리스 완충액, pH 7.8(A 완충액)으로 충전되었다. 농축액은 분당 100ml의 유속으로 유입되었다. 컬럼으로 농축액의 도입이 끝난후 잔여물은 A 완충액 8L로 세척되었다. 친화성 컬럼은 추가적으로 0.5M NaCl, 2.5M 염화칼슘을 함유하는 5배 컬럼 분량의 25mM 트리스 완충액 pH 7.5 고농도의 염 용액으로 세척하였다. 대구 트립신은 친화성 리간드로부터 10mM 염화칼슘 및 30% 글리세롤을 함유하는 25mM 초산액, pH 3.2로 컬럼으로부터 용출하였다. 대구 트립신 분획은 30% 글리세롤을 함유하는 200mM 트리스, pH 8.5, 중화액으로 저장되었고 5 내지 6g의 트립신이 함유되어 있었다.

정제된 대구 트립신 조제액은 SDS PAGE 전기영동상으로 균질한 것으로 보이며 아이소일렉트로 포커싱에 의하면 3개의 트립신 동위효소 밴드를 보인다. 부 분획은 다시 FPLC 모노 Q 크로마토그래피로 분리하여 최소 4개 이상의 동위효소들을 동정하였다: 트립신 IVa, IVb, IVc 및 IVd. 효소 조제액은 상기한 바와 같이 Cbz-GPR-pNA를 기질로 사용시 100U/mg 정도의 특이적 활성도를 보였다. 정제된 조제액은 0.22 마이크론 필터로 -20°C에서 여과 살균되었다.

실시예 4

대구 트립신의 하이드로겔 조제액 준비

실시예 2의 정제된 대구 트립신 조제액은 0.8% w/v 카르보머 940, 30% 글리세롤 및 0.08% 파라옥시벤조에이트를 함유하는 수성겔로 이루어진 하이드로콜로이드 겔과 혼합하였다. 대구 트립신 조제액은 mg당 1 효소단위(U/mg)의 최종농도의 최종 겔-효소 혼합액을(효소 하이드로겔 연고), 효소를 가지도록 하이드로겔과 1:1 비율로 혼합하였고 효소단위는 상기한 바와 같이 Cbz-GPR-pNA를 기질로 사용하여 측정하였다. 따라서 생산된 효소 하이드로겔 연고는 0.01mg/ml 또는 1U/ml 대구 트립신 효소, 0.4% w/v 카르보머 940, 20% 글리세롤 및 0.04% 파라옥시벤조에이트를 함유하였다. 이 효소 하이드로겔 연고는 펜자임 100으로 명명되었다.

실시예 5

펜자임 100을 이용한 골관절염 치료

급성 또는 극심한 증상을 보이는 17명의 골관절염 환자를 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 두 번, 취침전에는 필수적으로 아침에는 대부분의 경우에 투여하였다. 효소겔 5ml을 무릎, 엉덩이, 양손 등의 환부에 도포하였으며, 증상이 심한 경우에는 더 많은 양이 투여되었다. 도포된 양, 가능한 시간, 필요 및 환자의 요구에 따라 10분에서 30분간 건조될 수 있도록 방치하였다. 이런 건조는 헤어드라이같은 바람을 날리는 기구로 촉진할 수 있다. 대부분의 환자들은 2 내지 4일 이내에, 모든 환자가 일주일 내에 증상의 경감을 경험하였다. 환자번호 71은 치료 전에는 계단을 오르내릴 수 없었으나 치료 후에는 곤란을 느끼지 않았다.

펜자임 100을 이용한 골관절염 치료

환자번호	성별-나이	환부	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
1	F-67	무릎, 손	1-2	2일
4	M-74	무릎	1-2	3일
17	M-54	무릎	1	4일
19	M-55	무릎	2	3일
21	F-73	엉덩이	2	2일
30	F-77	무릎	2	3일
36	F-68	무릎, 엉덩이	2	3일
51	F-63	엉덩이	2	3일
53	F-75	무릎, 엉덩이	1-2	3일
54	F-73	무릎	1-2	4일
55	M-67	다친 무릎	1	4일
65	F-37	무릎, 손	2	3일
67	F-72	무릎	1-2	4일
71	F-78	무릎, 등	2	3일
72	M-54	손	1	2일
73	F-76	손, 엉덩이	1-2	3일
77	M-75	손, 발, 등	1-2	3일

몇몇 환자들(환자번호 19, 21)은 치료를 중단할 수 있었으며 따라서 질병으로부터의 장기간 또는 영구적인 회복을 한 것으로 보인다.

실시예 6

건염 환자의 치료

잠을 잘 수 없을 정도로 증상이 극심한 건염 환자 8명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번이나 두번, 환부의 넓이에 따라 5ml 내지 10ml 씩 환부에 투여하였다. 도포된 양, 가능한 시간, 필요 및 환자의 요구에 따라 10분에서 30분간 건조될 수 있도록 방치하였다. 대부분의 환자들은 2 내지 4일 이내에 모든 환자가 2주일 이내에 증상의 경감을 경험하였으나 다른 경우는 특히 엘보우의 건염인 경우에 (테니스 엘보우나 골퍼 엘보우), 더 오랜 후에야 증상 경감을 경험하였다. 이 결과는 표 6에 요약되어 있다.

건열 환자의 치료

환자 번호	성별-나이	환부	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
15	F-45	어깨	2	2일
37	F-50	어깨, 팔	2	2일
57	F-55	어깨	1-2	4일
79	F-43	어깨	2	2일
47	M-63	골퍼스 엘보우	1	2주
49	M-34	테니스 엘보우	1	1주
84	F-33	테니스 엘보우	2	2일
20	M-24	점퍼스 엘보우	2	3일

이런 모든 환자들은 증상으로부터 영구적인 회복을 하였으며 치료를 중단하였다.

실시예 7

섬유성 근육통의 치료

극심한 섬유성 근육통 환자 두 명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번이나 두번, 환부의 넓이에 따라 5ml 내지 10ml 씩 환부에 투여하였다. 도포된 양, 가능한 시간, 필요 및 환자의 요구에 따라 10분에서 30분간 건조될 수 있도록 방치하였다. 환자번호 78, F-50, 환자번호 92, F-53 모두는 3주 내에 증상의 경감을 경험하였다. 환자 모두 통증이 재발시 효소겔 치료를 하였다.

실시예 8

류마티스성 관절염의 치료

극심한 증상의 환자를 포함하여 류마티스성 관절염 환자 다섯 명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번이나 두번, 환부의 넓이에 따라 3ml 내지 5ml 씩 국소적으로 환부에 투여하였다. 도포된 겔의 두께에 따라 15분간 건조될 수 있도록 방치하였다. 이런 건조 시간은 헤어드라이같은 바람을 날리는 기구로 짧아질 수 있다. 환자 5명 모두 5일 내에 증상의 경감을 경험하였다. 이 결과는 표 8에 요약되어 있다.

류마티스성 관절염의 치료

환자 번호	성별-나이	환부	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
14	M-55	손	1	5일
61	F-47	엉덩이, 손	3	4일
65	F-37	목, 손	2	2일
78	F-50	목, 손	2	2일
94	M-36	손, 가슴	1	3일

환자번호 61은 치료전에는 아침에 도움이 없이는 침대로부터 일어날 수 없는 정도였으며, 계단을 오르내릴 수 없었으나 치료후에는 혼자 이를 수행할 수 있을 정도가 되었다. 환자번호 94는 호흡시 가슴에 통증을 느꼈으나 펜자임 100으로 치료한 3일 후 증상이 경감되었으며 모든 환자들은 정기적 또는 간헐적인 효소겔 치료로 증상을 조절할 수 있었다.

실시예 9

정맥염의 치료

수면이 불가능할 정도의 극심한 증상의 환자를 포함하여, 종아리의 모든 경우의 혈전성 정맥염, 정맥성 혈전, 만성 정맥염후 증상, 정맥류성 정맥과 같은 여러 종류의 정맥염 환자 다섯 명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번이나 두 번, 취침전과 때로는 아침에, 국소적으로 종아리에 투여하였다. 효소겔은 15분간 건조될 수 있도록 방치하였다. 환자 5명 모두 수주 내에 증상의 경감을 경험하였다. 이 결과는 표 9에 요약되어 있다.

정맥염의 치료

환자 번호	성별-나이	환부	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
2	F-69	다리	1-2	3주
28	M-54	종아리	1	2주
56	M-71	종아리	1-2	2주
59	F-59	종아리	1	2주
68	F-72	종아리	1-2	4-5일

환자번호 2는 만성 정맥염후 증상으로 진단을 받았다. 환자번호 68은 취침전에 효소겔 치료를 받지 않으면 통증으로 정상적인 수면을 취할 수 없었다. 모든 환자들은 정기적 또는 간헐적인 효소겔 치료로 증상을 조절할 수 있었다.

실시예 10

건선의 치료

극심한 증상의 만성 환자를 포함하여 건선 환자 6명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였으나 대부분의 환자는 펜자임 100(1U/ml 대구 트립신)로는 느린 또는 불확실한 치료효과만을 보이기 때문에 두배의 대구 트립신 농도 또는 2U/ml를 포함하는 펜자임 200이라 명명된 효소겔로 치료하였다. 대구 트립신 많은 양(펜자임 200)으로 치료받은 환자는 대구 트립신 적은 양(펜자임 100)으로 치료받은 환자에 비하여 더 나은 증상 개선을 보였다. 펜자임 200C라 명명된 각 효소 1U/ml 씩의 대구 트립신과 대구 카이모트립신의 혼합물도 시험되었는데 펜자임 200과 비슷한 결과를 얻었다. 효소겔은 하루에 한번이나 두번, 언제나 취침전에 그리고 겔은 밤새 피부에 남도록 방치되었고 어떤 경우에는 아침에도 목욕후 옷입기전 투여 하였다. 겔은 얇은 층으로 도포되고 5분간 건조되었다. 환자 6명 모두 이주 내에 증상의 경감을 경험하였다. 치료는 때로는 태양욕 또는 자외선 치료법 등의 통상적인 자가 치료법과 함께 병용 투여되었다. 이 결과는 표 10에 요약되어 있다.

건선의 치료

환자 번호	성별-나이	겔형	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
3	F-45	펜자임 200	1-2	4-5일
7	M-63	펜자임 100	1-2	2주
18	M-55	펜자임 100	1-2	1주
69	M-29	펜자임 200	1-2	1주
86	F-30	펜자임 200	1-2	1주
88	M-21	펜자임 200	1-2	1주

환자번호 3은 다섯 살 이후 극심한 만성 건선으로 고통받아왔다. 그녀는 모든 가능한 치료요법을 행하였으나 제한된 효과만을 얻었을 뿐이다. 펜자임 200 치료로는 장시간의 증상 경감만을 얻을 수 있었다. 그녀는 4일 후 증상경감을 느낄 수 있었고, 2-3주간의 치료 후에는 취침 전 하루 한번 투여로 증상이 완전히 제거되었다고 하였다. 극심한 만성 건선 환자인 환자번호 69는 반점이 영구적으로 제거됨을 경험하였다. 모든 환자들은 정기적 또는 간헐적인 효소겔 치료로 증상을 조절할 수 있었다.

실시예 11

여드름 및 종기의 치료

여드름 환자 2명(환자번호 25, F-16 및 환자번호 63, M-17) 및 종기환자 (환자번호 64, M-22)는 실시예 4의 대구 트립신 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번, 5ml 씩 국소적으로 환부(얼굴)에 투여되었다. 도포된 겔은 15분간 건조하여 이후에 피부에 남게 하였다. 환자 3명 모두 2주 내에 증상의 경감을 경험하였고 증상의 재발시에만 효소겔을 투여하였다.

실시예 12

습진, 피부염, 다른 피부의 치료

습진, 피부염 및 다른 여러 피부질환 환자 18 명을 실시예 4의 효소 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 효소겔은 하루에 한번(때로는 두번), 취침 전 저녁경에 투여하였다. 겔은 얇은 층으로 도포되었고 5분 내지 10분 후 건조되었다. 심한 증상의 경우 더 많은 양이 도포되었다. 건조시간은 헤어드라이같은 바람을 날리는 기구로 짧아질 수 있다. 대부분의 환자들은 2일 내지 4일 이내에 모든 환자가 1주일 이내에 증상의 경감을 경험하였다. 이 결과는 표 12에 요약되어 있다.

습진, 피부염, 다른 피부 증상의 치료

환자 번호	성별-나이	증상, 부위	일일 투여 횟수	투여후 증상경감
32	M-24	지루성, 모발	1	2-3일
45	M-23	지루성, 모발	1	3-4일
23	F-26	발한이상증, 손바닥	2	7일
40	F-21	발한이상증, 손바닥	1	4일
41	F-45	발한이상증, 손바닥	2	3일
48	F-33	발한이상증, 발바닥	1	2주
66	F-40	두드러기, 얼굴	1	2일
50	F-25	손톱주위염, 손톱	2	5일
20	M-2	농가진, 입	2	5일
11	M-50	자극된 피부, 얼굴	2	2-3일
98	F-52	자극된 피부, 얼굴	2	2-3일
12	M-2	소아 습진	1	6일
46	F-5	소아 습진	1	5일
87	F-7	소아 습진	1	5일
99	M-2	소아 습진	1	8일
97	F-52	주사비, 얼굴	2	5-6일
100	F-69	대상포진, 얼굴	2	2일
101	F-47	원반성 낭창	2	7일

어떤 환자들은 (환자번호 40, 41, 48, 66, 50, 20, 46, 87, 97, 100)은 치료를 중지할 수 있었으며 장기적 혹은 영구적인 증상 제거를 경험하였으나 다른 환자들은 정기적 또는 간헐적인 효소겔 치료로 증상을 조절하였다.

실시예 13

상처의 치료

화상 환자 2명(환자번호 44, M-4, 환자번호 85, M-9)은 실시예 4의 하이드로겔 연고(펜자임 100)로 치료하였다. 수술 후 상처가 아물지 않은 환자 2명(환자번호62, F-47, 환자번호 96, M-70)도 치료하였다. 효소겔은 하루에 최소 2번 국소적 으로 환부에 투여하고 환부에 남겨두었다. 환자 4명 모두 1주 내지 3주 내에 문제없고 좋은 상처의 쾌유를 경험하였다.

실시예 14

대구 카이모트립신을 이용한 치료

실시예 5 내지 13에 있어서 대구 트립신 효소 하이드로겔은 대구 카이모트립신 효소 하이드로겔 또는 대구 트립신과 카이모트립신 혼합물을 함유하는 하이드로겔로 대치되었다.

Claims

대구로부터 유래된 세린 프로티나제를 포함하는, 통증, 급성염증, 만성염증, 관절염, 염증이 유발된 관절, 활액낭염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아성 류마티스성 관절염, 패혈증성 관절염, 섬유근육통, 전신 낭창성 홍반, 정맥염, 건염, 발진, 건선, 여드름, 습진, 안면 세보릭 습진, 손, 얼굴, 머리가죽, 목 등의 습진, 얼굴 감염, 아틀레스 풋, 피스틀 감염, 감염성 국소 위염, 신생아의 배꼽 감염, 주름, 흉터, 티눈, 종기, 사마귀, 알레르기성 가려움증, 치질, 상처, 상처 감염, 화상 상처, 곰팡이류 감염 및 자가면역 질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 사람 또는 동물의 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
제 1항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 트립신, 카이모트립신 및 그 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 다기능성이 아닌 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 1항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 대서양 대구로부터 유래된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 1항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 대서양 대구로부터 유래된 트립신인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 5항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 트립신Ⅰ, 트립신Ⅱ, 트립신Ⅲ, 트립신Ⅳa, 트립신Ⅳb, 트립신Ⅳc, 트립신Ⅳd로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 4항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 카이모트립신 A, 카이모트립신 B로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 1항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 대서양 대구로부터 유래된 트립신Ⅰ, 트립신Ⅱ, 트립신Ⅲ, 트립신Ⅳ 중 어느 하나와 최소 90% 아미노산 서열 상동성을 가지는 트립신 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
제 1항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 대서양 대구로부터 유래된 카이모트립신 A, 카이모트립신 B 중 어느 하나와 최소 90% 아미노산 서열 상동성을 가지는 카이모트립신인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
삭제
대구의 세린 프로티나제를 포함하며 죽은 또는 벗겨지는 피부가 있는 것을 제외하면 건강한 피부로부터 죽은 또는 벗겨지는 피부를 제거하기 위한 약제학적 조성물
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충, 프로토조아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 병원 생물체에 의하여 유발되는 질병의 치료 및 예방용 약제학적 조성물
삭제
삭제
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제 1항에 있어서, 국소적 사용을 위한 약제학적 조성물
제 19항에 있어서, 하이드로겔인 약제학적 조성물
제 20항에 있어서, 글리세롤을 포함하는 다가 알콜을 부가적으로 포함하는 약제학적 조성물
삭제
대구로부터 유래된 어류 세린 프로티나제를 포함하는 화장품용 조성물.
제 23항에 있어서, 상기 세린 프로티나제는 트립신, 카이모트립신 및 그 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장품용 조성물.
제 23항에 있어서, 하이드로겔임을 특징으로 하는 화장품용 조성물.
제 23항에 있어서, 글리세롤을 포함하는 다가 알콜을 부가적으로 포함하는 화장품용 조성물.
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