RS60634B1 - Postupci razdvajanja dijastereoizomera gemcitabin-fosfata - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupak razdvajanja fosfatnih dijastereoizomera gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata. Preciznije, odnosi se na postupke pripreme (S)- i/ili (R)- fosfatnog(ih) dijastereoizomera u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

POZADINA

[0002] Gemcitabin (1; u prodaji kao Gemzar®) je efikasni nukleozidni analog koji je trenutno odobren za lečenje kancera dojke, ne-sitnoćelijskog kancera pluća, kancera jajnika i kancera pankreasa i široko se upotrebljava za lečenje raznih drugih kancera uključujući kancer bešike, bilijarnog trakta, kolorektalni i limfom.

[0003] Klinička upotrebljivost gemcitabina je ograničena nizom inherentnih i stečenih mehanizama rezistencije. Na ćelijskom nivou rezistencija zavisi od tri parametra: (i) regulaciono smanjivanje dezoksicitidin kinaze, neophodne za aktivaciju u fosforilisani oblik; (ii) smanjena ekspresija transportera nukleozida, posebno, hENT1 potrebnog za preuzimanje od strane ćelija kancera; i (iii) regulaciono povećanje katalitičkih enzima naročito citidin deaminaze koji vrši degradaciju gemcitabina.

[0004] WO2005/012327 opisuje niz derivata nukleotid fosfata za gemcitabin i molekule leka srodnog nukleozida. Među njima je gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2) identifikovan kao posebno efikasno jedinjenje. Čini se da ovi derivati izbegavaju mnoge od inherentnih i stečenih mehanizma rezistencije koji ograničavaju upotrebljivost gemcitabina ("Application of ProTide Technology to Gemcitabine: A Successful Approach to Overcome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent NUC-1031) in Clinical Development"; Slusarczyk et al; J. Med. Chem.; 2014, 57, 1531-1542).

[0005] NUC-1031 2 se tipično priprema kao smeša dva dijastereoizomera, epimerna na fosfatnom centru.

[0006] NUC-1031 2 je izuzetno lipofilan i stoga slabo rastvorljiv u vodi (po proračunu: <0,1 mg/mL), i jonizabilni ostaci imaju izračunate pKa koje leže izvan pH opsega pogodnog za parenteralnu primenu. U suštini je nerastvorljiv u vodi, bez obzira na sadržaj soli ili pH, i to ima implikacije na razvoj formulacija za isporučivanje jedinjenja u dovoljno visokim dozama za efikasno lečenje. To takođe ima implikacije na razvoj efikasnih proizvodnih postupaka koji će omogućiti da se NUC-1031 proizvede troškovno efikasno.

[0007] Nedavno je otkriveno da (S)-epimer 3 gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata ima dovoljnu rastvorljivost u smešama većeg broja polarnih organskih rastvarača sa vodom da bi se učinio pogodnim za formulaciju i primenu kao terapijski agens. Rastvorljivost (R)-epimera 4 je znatno niža. U nekim smešama rastvarača razlika u rastvorljivosti između (S)-epimera i (R)-epimera je preko 100 puta. Stoga se očekuje da se upotrebom (S)-epimera mogu razviti klinički efikasniji, praktičniji i za pacijenta prihvatljiviji postupci primene nego što se mogu razviti upotrebom (R)-epimera ili upotrebom smeše. Stoga je poželjno da se gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 može obezbediti u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0008] Niska rastvorljivost NUC-1031 u mnogim rastvaračima, posebno u onima koji se uobičajeno upotrebljavaju u razdvajanju jedinjenja upotrebom HPLC, znači da će biti potrebne velike količine rastvarača za svako razdvajanje zasnovano na HPLC. Ovo znači da bi bilo koji postupak razdvajanja zasnovan na HPLC u industrijskoj razmeri bio sa visokim troškovima, trošio bi velike količine energije i materijala i proizvodio bi velike količine otpada.

[0009] WO2014/076490 opisuje metodologiju za selektivni pristup fosfatnim dijastereoizomerima nukleotid fosfatnih derivata, uključujući NUC-1031.

[0010] Iako se u vreme podnošenja ove prijave primena gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata kao (S)-epimera čini poželjnom, takođe se mogu razumeti razlozi za potrebu da se dobije (R)-epimer u dijastereoizomerno čistom obliku. Ovi bi uključivali izvođenje komparativnih testova, radi pretvaranja (R)-epimera u (S)-epimer ili zbog toga što (R)-epimer obezbeđuje prednosti u odnosu na (S)-epimer koje prevazilaze njegovu nisku rastvorljivost.

[0011] Zaista pokazano je da (R)-epimer ima poluživot u inkubaciji sa izolovanim humanim ćelijama jetre koji je četiri puta duži od (S)-epimera. Duži poluživot povezan sa (R)-izomerom ukazuje na manji unutrašnji klirens i trebalo bi da rezultira različitim farmakokinetičkim i farmakodinamičkim profilom u odnosu na (S)-izomer koji može ponuditi neke prednosti.

[0012] I (S)- i (R)-epimeri su terapijski aktivni.

[0013] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata 3 u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0014] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata 4 u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0015] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi postupak obezbeđivanja jednog ili više (S) i/ili (R)-epimera u suštinski dijastereoizomerno čistom(im) obliku(cima) koji je skalabilan, ekonomičan i/ili efikasan, npr. skalabilniji, ekonomičniji i/ili efikasniji od pustupaka koji upotrebljavaju HPLC. Stoga, cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi postupak obezbeđivanja jednog ili više (S) i/ili (R)-epimera u suštinski dijastereoizomerno čistom(im) obliku(cima) koji je pogodan za proizvodnju u velikim razmerama.

[0016] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi jednostavan postupak, tj. postupak koji uključuje minimalni broj koraka postupka i/ili reagenasa za obezbeđivanje jednog ili više (S) i/ili (R)-epimera u suštinski dijastereoizomerno čistom(im) obliku(cima).

[0017] Drugi cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je obezbeđivanje postupka koji osigurava da su razdvojeni (S)- ili (R)-epimeri obezbeđeni u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku i istovremeno zadovoljavaju ili premašuju neophodne kriterijume propisane od strane organizacija kao što je FDA u SAD koji se tiču količina i prirode bilo kojih nečistoća u tragovima koje nastaju iz sinteze i razdvajanja.

[0018] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska zadovoljavaju neke ili sve gore navedene ciljeve.

KRATAK SAŽETAK OBJAVE

[0019] U prvom aspektu ovog pronalaska obezbeđen je postupak obezbeđivanja najmanje jednog dijastereoizomera gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dijastereoizomerne čistoće veće od 85%, pri čemu postupak sadrži korake:

suspendovanje smeše gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata i gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u rastvaraču ili smeši rastvarača kako bi se formirala kaša; i

filtriranje kaše kako bi se obezbedio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat i filtrat koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat rastvoren u rastvaraču ili smeši rastvarača;

pri čemu je čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85% i/ili filtrat sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

[0020] Pronalazači su pronašli da je razlika u rastvorljivosti između (R)- i (S)-epimera dovoljno velika da se epimeri mogu razdvojiti upotrebom ove jednostavne tehnike. Iznenađujuće, ovaj postupak obezbeđuje ne samo dijastereoizomerno obogaćen gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat, već se mogu formirati jedan ili oba epimera u suštinski dijastereoizomerno obogaćenom obliku. U svim testiranim rastvaračima (S)-epimer ima veću rastvorljivost od (R)-epimera. Stoga, (S)-epimer je tipično prisutan u dijastereoizomerno obogaćenom obliku kao rastvor u filtratu i (R)-epimer će tipično biti prisutan u dijastereoizomerno obogaćenom obliku kao čvrsta supstanca na filteru.

[0021] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska obezbeđuju filtrat koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85% i čvrsti proizvod koji je smeša dijastereoizomera. Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska obezbeđuju čvrstu supstancu koja je gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85% i filtrat koji sadrži smešu dijastereoizomera. Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska obezbeđuju i čvrstu supstancu koja je gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%, i filtrat koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

[0022] Formiranje kaše se može izvršiti na temperaturi okoline (tj. od 20°C do 30°C). Pronalazači su pronašli da se dobre dijastereoizomerne čistoće za respektivne epimere mogu dobiti bez izvođenja bilo kog koraka zagrevanja ili hlađenja.

[0023] Međutim, poželjno je da se kaša zagreva tokom najmanje dela koraka formiranja kaše. Stoga, može biti da se kaša zagreva kada je već formirana. Kaša se može zagrevati na temperaturu od oko 30°C do oko 80°C, npr. od oko 40°C do oko 70°C. U određenim poželjnim primerima izvođenja, kaša se zagreva na temperaturu od oko 50°C do oko 60°C.

Kaša se može zagrevati tokom dana ili kraće. Kaša se može zagrevati tokom 30 minuta ili duže. Period od 1 do 3 sata može biti prikladan.

[0024] Kaša se takođe može komešati tokom najmanje dela koraka formiranja kaše. Kaša se može komešati tokom 3 dana ili kraće, npr. dan ili kraće. Kaša se može komešati tokom 30 minuta ili više. Period od 1 do 6 sati može biti prikladan. Komešanje može da uključuje mešanje, mućkanje, ili oba. Kaša se može zagrevati i mešati istovremeno ili suštinski istovremeno.

[0025] Ukoliko se kaša zagreva, poželjno je ne hladiti kašu pre filtriranja.

[0026] Postupak može dodatno sadržati korak ispiranja čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata. Ovaj korak se dešava nakon razdvajanja filtracijom. Ovo će se tipično izvoditi sa istim rastvaračem ili smešom rastvarača koji su upotrebljeni za stvaranje kaše, mada je razumljivo da se može upotrebljavati i drugi rastvarač za ispiranje čvrste supstance ili, gde je kaša formirana sa smešom rastvarača, samo jedan od rastvarača u smeši se upotrebljava za ispiranje čvrste supstance. Gde je kaša bila zagrevana, ovaj korak ispiranja se može izvesti upotrebom rastvarača ili smeše rastvarača koji su na povišenoj temperaturi, npr. od oko 40°C do oko 70°C, mada to neće uvek biti slučaj. Rastvarač ili smeša rastvarača mogu biti na istoj temperaturi kao i kaša.

[0027] Ovaj korak ispiranja pomenut u prethodnom paragrafu se uobičajeno izvodi dok se čvrsta supstanca nalazi na filteru kako bi se dobio filtrat ispiranja. Tipično, filtrat ispiranja se kombinuje sa prvim filtratom. U čitavoj ovoj specifikaciji, kada se upotrebljava u sprezi sa preradom filtrata nakon filtracije, termin "filtrat" je namenjen da obuhvati i kombinovani filtrat dobijen kombinovanjem prvog filtrata i filtrata ispiranja formiranog na ovaj način, i takođe, gde prvi filtrat nije kombinovan sa filtratom ispiranja, termin je namenjen da označava samo prvi filtrat.

[0028] "Suštinski dijastereomerno čist" za potrebe ovog pronalaska je definisan kao dijastereoizomerne čistoće veće od oko 85%. Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska postižu izolovanje (R)- i/ili (S)- gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dijastereoizomernih čistoća znatno većih od 85%. Stoga, jedan ili svaki epimer gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dobijen postupkom reakcije može imati dijastereoizomernu čistoću veću od oko 90%. Dijastereoizomerna čistoća jednog ili oba dobijena epimera postupcima ovog pronalaska može biti veća od 95%, 98%, 99%, ili čak 99,5%.

[0029] Kako bi se epimer dobio u "dijastereoizomerno obogaćenom obliku" za potrebe ovog pronalaska je definisan sa značenjem da je veća proporcija dobijenog gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-fosfata tog epimera nego što je bio prisutan u početnoj smeši. Uobičajeno početna smeša će biti proizvod originalne sinteze gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata. Može biti da je odnos (R):(S) epimeru u početnom materijalu između 10:1 i 1:10. Poželjno, odnos (R):(S) epimeru je između 5:1 i 1:5, npr. između 3:1 i 1:3 ili između 2:1 i 1:2.

[0030] Neko razdvajanje dijastereoizomera je primećeno za sve testirane rastvarače.

[0031] Može biti da je rastvarač ili da smeša rastvarača sadrži rastvarač odabran od polarnog protičnog rastvarača i polarnog aprotičnog rastvarača. Drugi rastvarači koji mogu biti prisutni u smeši rastvarača uključuju polarne protične rastvarače, polarne aprotične rastvarače, nepolarne rastvarače i vodu. Može biti da je rastvarač toluen ili da smeša rastvarača sadrži toluen. Može biti da je rastvarač rastvarač odabran od: C2-C4alkohola, acetonitrila (ACN), toluena, acetona, metil etil ketona (MEK) i njihovih smeša, ili može biti da smeša rastvarača sadrži jedan ili više od ovih rastvarača zajedno sa dodatnim rastvaračem ili rastvaračima. U određenim slučajevima, rastvarač je rastvarač odabran od: C3-C4alkohola (npr. n-propanol, izo-propanol (IPA), n-butanol), acetonitrila i njihovih smeša, ili da smeša rastvarača sadrži jedan ili više od tih rastvarača. Može biti da je rastvarač ili da smeša rastvarača sadrži C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol). U određenim poželjnim primerima izvođenja, rastvarač je ili smeša rastvarača sadrži IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, rastvarač je ili smeša rastvarača sadrži acetonitril.

[0032] Može biti da je rastvarač C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol). U određenim poželjnim primerima izvođenja rastvarač je IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, rastvarač je acetonitril.

[0033] Termini "C2-C4alkohol" i "C3-C4alkohol" su namenjeni da obuhvate i alkohole ravnog lanca i razgranatog lanca. Stoga, radi potpunosti, termin C2-C4alkohol označava alkohol odabran od etanola, n-propanola, izo-propanola, n-butanola, izobutanola, sec-butanola i terc-butanola.

[0034] Smeša rastvarača može sadržati vodu. Može biti da su relativne proporcije rastvarača i vode takve da su voda i rastvarač mešljivi. U ovom slučaju, voda može delovati kao antirastvarač, smanjujući rastvorljivost gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata u sistemu rastvarača. Ukoliko je voda prisutna, može je biti 20% ili manje od ukupne zapremine smeše rastvarača (tj. zapremina rastvarača plus zapremina vode), npr.10% ili manje ili 5% ili manje. Može je biti 0,1% ili više od ukupne zapremine smeše rastvarača.

[0035] Smeša rastvarača može sadržati drugi polarni protični rastvarač i/ili polarni aprotični rastvarač. Smeša rastvarača može sadržati nepolarni rastvarač, npr. alkan ili cikloalkan.

Primeri alkana i cikloalkana uključuju: pentane, heksane, heptane, oktane i cikloheksane. Gde smeša rastvarača sadrži nepolarni rastvarač, tipično će biti slučaj da je nepolarni rastvarač prisutan u količini manjoj od 50% od smeše rastvarača. To, međutim, neće uvek biti slučaj, i razumljivo je da nepolarni rastvarač predstavlja do 90% od smeše rastvarača.

[0036] Može biti da rastvarač nije prisutan u smeši i upotrebljava se suštinski čist osim manjih nečistoća (tj. koji ima čistoću veću od 95%, npr. veću od 99%).

[0037] Rastvarač može biti suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol) ili acetonitril. U određenim poželjnim primerima izvođenja rastvarač je suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, rastvarač je suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) acetonitril.

[0038] Može biti da rastvarač nije odabran od: etanola, glicerola, propilen glikola, PEG 400 (polietilen glikol), NMP i DMSO. Gde se kaša formira upotrebom smeše rastvarača, može biti da smeša rastvarača ne sadrži rastvarač odabran od: etanola, glicerola, propilen glikola, PEG 400 (polietilen glikol), NMP i DMSO.

[0039] Mogu postojati okolnosti u kojima je prikladno uključiti jedan ili više izotopski obeleženih rastvarača kako bi se olakšala naknadna analiza itd.

[0040] Postupak može biti postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u dijastereoizomerno čistom obliku.

[0041] Ukoliko je to slučaj, postupak može dodatno sadržati korak uklanjanja jednog ili više rastvarača iz filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kako bi se dobio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0042] Korak uklanjanja jednog ili više rastvarača može sadržati uklanjanje suštinski svih od jednog ili više rastvarača evaporacijom, npr. destilacijom ili evaporacijom pod sniženim pritiskom, iz gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata kako bi se dobio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0043] Korak uklanjanja rastvarača ili smeše rastvarača može sadržati:

uklanjanje dela rastvarača ili smeše rastvarača iz filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat evaporacijom, npr. destilacijom ili evaporacijom pod sniženim pritiskom, kako bi se obezbedio koncentrovani filtrat koji sadrži čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat;

opciono komešanje koncentrovanog filtrata; i

filtriranje koncentrovanog filtrata kako bi se dobio gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kao čvrsta supstanca u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0044] Koncentrovani filtrat sadrži suspendovanu čvrstu supstancu.

[0045] Kako se rastvor koncentruje, gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat kristališe i pronalazači su iznenađujuće pronašli da ovi kristali često imaju poboljšanu dijastereoizomernu čistoću u odnosu na filtrat dobijen u prvom koraku filtriranja. Tipično mešanje rastvora kada je već koncentrovan omogućava da se formira više kristala i povećava prinos. (S)-epimer je rastvorljiviji od (R)-epimera i zato je iznenađujuće da je (S)-epimer oslobođen sa većom čistoćom.

[0046] Može biti da je deo jednog ili više rastvarača koji je uklonjen od 10% do 90% od zapremine dobijene iz prvog koraka filtriranja. Poželjno, on je od 25% do 75% od zapremine dobijene iz prvog koraka filtriranja, npr. od 40% do 60%.

[0047] Koraci koncentrovanja i koraci komešanja (ukoliko postoje) mogu se dešavati istovremeno tokom najmanje dela trajanja svakog koraka.

[0048] Ukoliko se koncentrovani filtrat komeša, može se mešati 7 dana ili manje, npr. 5 dana ili manje. Može biti komešan tokom 1 sata ili više, npr.6 sati ili više, 12 sati ili više ili 1 dan ili više.

[0049] Korak uklanjanja rastvarača može sadržati uklanjanje suštinski svih od jednog ili više rastvarača iz gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata postupkom rekristalizacije/filtriranja kako di se dobio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku. Ovo je posebno poželjno gde se kaša održava na povišenoj temperaturi tokom koraka formiranja kaše i filtriranja.

[0050] Korak uklanjanja rastvarača može sadržati:

hlađenje filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kako bi se obezbedio ohlađeni filtrat koji sadrži čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat;

opciono komešanje ohlađenog filtrata; i

1

filtriranje ohlađenog filtrata kako bi se dobio gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kao čvrsta supstanca u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0051] Ohlađeni filtrat sadrži suspendovanu čvrstu supstancu.

[0052] Filtrat može biti ohlađen na temperaturu od oko -10°C do oko 45°C, npr. od oko 5°C do oko 40°C. Poželjno, filtrat se hladi na temperaturu od oko 15°C do oko 35°C. Filtrat može biti ohlađen postepeno ili korak po korak. Na primer, može biti ohlađen na jednu temperaturu (npr. temperatura od oko 25°C do oko 35°C) držan na toj temperaturi tokom nekog vremenskog perioda (npr. od oko sata do oko 2 dana) i zatim ohlađen na drugu nižu (npr. temperatura od oko 15°C do oko 25°C) temperaturu i držan na toj temperaturi tokom dodatnog vremenskog perioda (npr. od oko sata do oko 2 dana).

[0053] Postupak može sadržati korak dodavanja klice, početnog materijala (seed material) filtratu. To se može dešavati pre nego što se filtrat hladi, dok se filtrat hladi ili nakon što se filtrat ohladi. Poželjno je, međutim, da se dodaje kada je filtrat već ohlađen. Klica, početni materijal će tipično preuzeti oblik visoke dijastereoizomerne čistoće (npr. 90% ili veće ili 95% ili veće) gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata. Klica, početni materijal se može dodati kao čvrsta supstanca, ali pogodnije se može dodati kao kaša ili suspenzija. Kaša ili suspenzija mogu sadržati isti rastvarač ili smešu rastvarača kao filtrat. Gde filtrat sadrži smešu rastvarača, kaša ili suspenzija klice, početnog materijala može sadržati gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u jednom od tih rastvarača. Alternativno, kaša ili suspenzija klice, početnog materijala može sadržati gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u rastvaraču koji nije prisutan u filtratu.

[0054] Postupak može sadržati korak dodavanja dodatnog rastvarača u filtrat. To se može dešavati pre nego što se filtrat hladi, dok se filtrat hladi ili nakon što se filtrat ohladi. Poželjno je, međutim, da se dodaje kada je filtrat već ohlađen. Dodavanje dodatnog rastvarača će tipično služiti za smanjivanje rastvorljivosti gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u modifikovanom filtratu u odnosu na njegovu rastvorljivost u nemodifikovanom filtratu rastvarača ili smeše rastvarača. Dodatni rastvarač može biti voda. Dodatni rastvarač može biti nepolarni, npr. alkan ili cikloalkan ili njihove smeše. Gde filtrat sadrži smešu rastvarača, dodatni rastvarač može biti jedan ili više od onih rastvarača u smeši u kojima je rastvorljivost gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata niža nego što je za druge rastvarače u smeši. Stoga, tamo gde filtrat sadrži polarni protični ili aprotični rastvarač pomešan sa vodom, dodatni rastvarač može biti voda.

[0055] Ukoliko se ohlađeni filtrat komeša, može se komešan 7 dana ili manje, npr.5 dana ili manje. Može biti komešan tokom 1 sata ili više, npr. 6 sati ili više, 12 sati ili više, 1 dan ili više.

[0056] Koraci hlađenja i koraci komešanja (ukoliko postoje) mogu se dešavati istovremeno tokom najmanje dela trajanja svakog koraka.

[0057] Postupak može dodatno sadržati korak ispiranja suštinski dijastereoizomerno čistog čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata. Ovo se tipično izvodi sa istim rastvaračem ili smešom rastvarača od kojih se sastojao filtrat, mada je razumljivo da se za ispiranje čvrste supstance može upotrebljavati drugačiji rastvarač ili, gde je filtrat sadržao smešu rastvarača, da se samo jedan od rastvarača u toj smeši upotrebljava za ispiranje čvrste supstance. Ovaj postupak ispiranja se tipično izvodi dok je čvrsta supstanca na filteru. Ovaj korak ispiranja se tipično izvodi upotrebom hladnog (npr. temperature od oko 5 do oko 20°C) rastvarača ili smeše rastvarača.

[0058] Preostali rastvarač(i) se mogu ukloniti iz čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku, npr. zagrevanjem čvrste supstance pod vakuumom.

[0059] Postupak može biti postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata u dijastereoizomerno čistom obliku.

[0060] Ukoliko je ovo slučaj, postupak može dodatno sadržati korake:

suspendovanje čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dobijenog iz prve filtracije u drugom rastvaraču ili drugoj smeši rastvarača kako bi se formirala druga kaša; i

filtriranje druge kaše kako bi se obezbedio suštinski dijastereoizomerno čist čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat.

[0061] Drugi rastvarač ili druga smeša rastvarača može biti ista ili različita od one koja se upotrebljava u prvom koraku suspendovanja.

[0062] Može biti da je drugi rastvarač ili da druga smeša rastvarača sadrži rastvarač odabran od polarnog protičnog rastvarača i polarnog aprotičnog rastvarača. Može biti da je drugi rastvarač ili da druga smeša rastvarača sadrži toluen. Drugi rastvarači koji mogu biti prisutni u drugoj smeši rastvarača uključuju polarne protične rastvarače, polarne aprotične rastvarače, nepolarne rastvarače i vodu. Može biti da je drugi rastvarač ili da druga smeša rastvarača sadrži rastvarač odabran od: C2-C4alkohola, acetonitrila (ACN), toluena, acetona, metil etil ketona (MEK) i njihovih smeša. Može biti da je drugi rastvarač ili da druga smeša rastvarača sadrži rastvarač odabran od: C3-C4alkohola (npr. n-propanol, izo-propanol (IPA), n-butanol), acetonitrila i njihovih smeša. Može biti da je drugi rastvarač ili da druga smeša rastvarača sadrži C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol). U određenim poželjnim primerima izvođenja, drugi rastvarač je ili druga smeša rastvarača sadrži IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, drugi rastvarač je ili druga smeša rastvarača sadrži acetonitril.

[0063] Može biti da je drugi rastvarač C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol). U određenim poželjnim primerima izvođenja drugi rastvarač je IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, drugi rastvarač je acetonitril.

[0064] Druga smeša rastvarača može sadržati vodu. Može biti da su relativne proporcije rastvarača i vode takve da su voda i rastvarač mešljivi. U ovom slučaju, voda može delovati kao anti-rastvarač, smanjujući rastvorljivost gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata u drugom sistemu rastvarača. Ukoliko je voda prisutna, može je biti 20% ili manje od ukupne zapremine druge smeše rastvarača (tj. zapremina rastvarača plus zapremina vode), npr. 10% ili manje ili 5% ili manje. Može je biti 0,1% ili više od ukupne zapremine druge smeše rastvarača.

[0065] Druga smeša rastvarača može sadržati drugi polarni protični rastvarač i/ili polarni aprotični rastvarač. Druga smeša rastvarača može sadržati nepolarni rastvarač, npr. alkan ili cikloalkan. Primeri alkana i cikloalkana uključuju: pentane, heksane, heptane, oktane i cikloheksane. Gde druga smeša rastvarača sadrži nepolarni rastvarač, tipično će biti slučaj da je nepolarni rastvarač prisutan u količini manjoj od 50% od druge smeše rastvarača. To, međutim, neće uvek biti slučaj, i razumljivo je da nepolarni rastvarač predstavlja do 90% od druge smeše rastvarača.

[0066] Može biti da drugi rastvarač nije prisutan u smeši i upotrebljava se suštinski čist osim manjih nečistoća (tj. koji ima čistoću veću od 95%, npr. veću od 99%).

[0067] Drugi rastvarač može biti suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) C3-C4alkohol (npr. n-propanol, IPA, n-butanol) ili acetonitril. U određenim poželjnim primerima izvođenja drugi rastvarač je suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) IPA. U drugim poželjnim primerima izvođenja, drugi rastvarač je suštinski čist (tj. koji ima čistoću veću od 95%) acetonitril.

[0068] Objava se takođe odnosi na kristalni oblik gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata, kristalni oblik je oblik I. Navedeni kristalni oblik (tj. Oblik I) može biti okarakterisan time što navedeni oblik ima XRPD obrazac sa najmanje dva pika (npr. najmanje četiri pika)

1

na 2θ odabranom od 5,0, 6,7, 8,0, 11,3, 20,2 i 21,4 kada se meri upotrebom Cu zračenja sa Kα2/Kα1odnosom od 0,5. Može biti da navedeni kristalni oblik ima XRPD obrazac sa pikovima na 2θ 5,0, 6,7, 8,0, 11,3, 20,2 i 21,4 kada se meri upotrebom Cu zračenja sa Kα2/Kα1odnosom od 0,5. Može biti da navedeni kristalni oblik ima XRPD obrazac suštinski kao što je prikazano na Slici 1. Može biti da navedeni kristalni oblik ima FTIR obrazac, kada se meri kao suspenzija u Nujol-u, suštinski kao što je prikazano na Slici 2.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0069] Primeri izvođenja pronalaska su dodatno opisani ovde u nastavku sa pozivanjem na prateće crteže, u kojima:

Slika 1 je XRPD spektar gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata kristalnog oblika I.

Slika 2 je FTIR spektar gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata kristalnog oblika I.

DETALJAN OPIS

[0070] Gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat dobijen iz postupaka pronalaska može postojati u obliku monokristala ili u smeši kristalnih oblika ili može biti amorfan.

[0071] Postupci predmetnog pronalaska se takođe mogu upotrebljavati kako bi se obezbedili svi farmaceutski prihvatljivi izotopski obeleženi oblici jedinjenja 3 ili 4, pri čemu su jedan ili više atoma zamenjeni atomima koji imaju isti atomski broj, ali atomska masa ili maseni broj je različit od atomske mase ili masenog broja preovlađujućeg izotopa koji se uobičajeno nalazi u prirodi.

[0072] Primeri izotopa pogodnih za uključivanje u jedinjenja koji su upotrebljeni u i dobijeni pomoću pronalaska uključuju izotope vodonika, kao što su<2>H i<3>H, ugljenika, kao što su<11>C, 13C i<14>C, hlora, kao što je<36>Cl, fluora, kao što je<18>F, joda, kao što su<123>I i<125>I, azota, kao što su 13N i 15N, kiseonika, kao što su<15>O,<17>O i<18>O, fosfora, kao što je<32>P, i sumpora, kao što je 35S.

[0073] Određena izotopski obeležena jedinjenja, na primer, ona koja inkorporiraju radioaktivni izotop, korisna su u studijama distribucije leka i/ili supstrata u tkivu.

Radioaktivni izotopi tricijum, tj. 3H, i ugljenik-14, tj.<14>C, su posebno korisni u ovu svrhu s obzirom na njihovu lakoću inkorporacije i spremna sredstva za detekciju.

[0074] Zamena sa težim izotopima kao što je deuterijum, tj.<2>H, može pružiti određene terapijske prednosti koje rezultiraju, od veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog in vivo poluživota ili smanjenih potreba za doziranjem, i samim tim mogu biti poželjniji u nekim okolnostima.

[0075] Zamena sa izotopima koji emituju pozitron, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, može biti korisna u studijama pozitron emisione tomografije (Positron Emission Tomography - PET) za ispitivanje zauzetosti receptora supstrata.

[0076] Izotopski obeležena jedinjenja se mogu uopšteno pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim iskusnima u struci ili postupcima analognim onima opisanim upotrebom odgovarajućeg izotopski obeleženog reagensa umesto neobleženog reagensa koji je prethodno korišćen.

[0077] U struci je poznato da se može dobiti obrazac rendgenske difraktometrije praha (X-ray powder diffraction) koji ima jednu ili više grešaka u merenju u zavisnosti od uslova merenja (kao što su oprema, priprema uzorka ili upotrebljeni uređaj). Posebno, opšte je poznato da intenziteti u obrascima rendgenske difraktometrije praha mogu fluktuirati u zavisnosti od uslova merenja i pripreme uzorka. Na primer, osobe koje su iskusne u struci rendgenske difraktometrije praha će shvatiti da relativni intenziteti pikova mogu varirati u zavisnosti od orijentacije uzorka koji se testira i od tipa i podešavanja instrumenta koji se upotrebljava. Iskusna osoba će takođe shvatiti da na poziciju refleksija može uticati tačna visina na kojoj uzorak sedi u difraktometru i nulta kalibracija difraktometra. Površinska planarnost uzorka takođe može imati mali efekat. Stoga će osoba koja je iskusna u struci ceniti da podaci difraktometrijskog obrasca koji su ovde prikazani ne treba da se tumače kao apsolutni i bilo koji kristalni oblik koji obezbeđuje obrazac difraktometrijskog praha koji je suštinski identičan onima koji su ovde objavljeni spada u obim predmetne objave (za dalje informacije videti Jenkins, R & Snyder, R.L., "Introduction to X-Ray Powder Diffractometry" John Wiley & Sons, 1996).

[0078] U čitavom opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, reči "sadrže" i "čine" i njihove varijacije znače "uključujući ali nije ograničeno na", i one nisu namenjene da (i ne) isključuju druge delove, aditive, komponente, cele brojeve ili korake. U čitavom opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, jednina obuhvata množinu osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije. Posebno, gde se upotrebljava neodređeni član, specifikaciju treba razumeti kao razmatranje množine kao i jednine, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije.

1

[0079] Odlike, celi brojevi, karakteristike, jedinjenja, hemijski oblici ili grupe opisani u vezi sa posebnim aspektom, primerom izvođenja ili primerom pronalaska treba razumeti tako da su primenljivi na bilo koji drugi aspekt, primer izvođenja ili primer koji su ovde opisani osim ukoliko su sa njima nekompatibilni. Sve od odlika koje su objavljene u ovoj specifikaciji (uključujući bilo koje prateće patentne zahteve, apstrakt i crteže), i/ili svi od koraka bilo koje metode ili postupka koji su tako objavljeni, mogu se kombinovati u bilo kojoj kombinaciji, osim kombinacija gde se makar neke od takvih odlika i/ili koraka međusobno isključuju. Pronalazak nije ograničen na detalje bilo kojih prethodnih primera izvođenja. Pronalazak se proširuje na bilo koju novu ili bilo koju novu kombinaciju odlika objavljenih u ovoj specifikaciji (uključujući bilo koje prateće patentne zahteve, apstrakt i crteže), ili na bilo koju novu, ili bilo koju novu kombinaciju koraka bilo koje metode ili postupka koji su tako objavljeni.

[0080] Pažnja čitaoca je usmerena na sve naučne radove i dokumente koji su podneti istovremeno sa ili pre ove specifikacije u vezi sa ovom prijavom i koji su otvoreni za javni uvid sa ovom specifikacijom.

[0081] Sledeće skraćenice se upotrebljavaju u ovoj specifikaciji:

ACN - acetonitril DMF - N,N-dimetilformamid

DMSO -dimetilsulfoksid IPA - izopropil alkohol

MEK - metil etil keton MIBK - metil izo-butil keton

NMP - N-metilpiroldinon PEG - polietilen glikol

TBDMS - terc-butildimetilsilil TBME - terc-butil metil etar

TFA – trifluorosirćetna kiselina

FDA – Administracija za hranu i lekove

[0082] Pojedinačni izomeri gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata mogu se okarakterisati upotrebom sledećih postupaka karakterizacije:

Proton (1H), ugljenik (13C), fosfor (31P) i fluor (19F) NMR spektri snimljeni su na Bruker Avance 500 spektrometru na 25°C. Spektri su automatski kalibrisani do pika deuterisanog rastvarača i svi<13>C NMR i<31>P NMR su proton-dekuplovani. Čistoća krajnjih jedinjenja je verifikovana da bude >95% HPLC analizom upotrebom Varian Polaris C18-A (10 μM) kao analitičke kolone sa gradijentnom elucijom H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min. HPLC

1

analiza sprovedena je pomoću Varian Prostar (LC Workstation-Varian prostar 335 LC detektor).

2’-dezoksi-2’,2’-difluoro-D-citidin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3

[0083] (ES+) m/z, pronađeno: (M Na<+>) 603,14. C25H27F2N4O8NaP potrebno: (M+) 580,47.

<31>P NMR (202 MHz, MeOD): δP3,66

<1>H NMR (500 MHz, MeOD): δH7,58 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-6), 7,38 - 7,32 (m, 7H, ArH), 7,26 - 7,20 (m, 3H, ArH), 6,24 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-1’), 5,84 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 5,20 (AB sistem, JAB= 12,0 Hz, 2H, OCH2Ph), 4,46 - 4,43 (m,1H, H-5’), 4,36 - 4,31 (m, 1H, H-5’), 4,25 - 4,19 (m, 1H, H-3’), 4,07 - 4,00 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1,38 (d, J = 7,2 Hz, 3H, CHCH3).

<19>F NMR (470 MHz, MeOD): δF- 118,0 (d, J = 241 Hz, F), - 120,24 (široko d, J = 241 Hz, F).

<13>C NMR (125 MHz, MeOD): δC174.61 (d, 3JC-P= 5,0 Hz, C=O, estar), 167,63 (C-NH2), 157,74 (C=O baza), 152,10 (d, 2JC-P= 7,0 Hz, C-Ar), 142,40 (CH-baza), 137,22 (C-Ar), 130,90, 129,63, 129,39, 129,32, 126,32 (CH-Ar), 124,51 (d, 1JC-F= 257 Hz, CF2), 121,47, 121,43 (CH-Ar), 96,67 (CH-baza), 85,92 (široki signal, C-1’), 80,31 (C-4’), 71,27 (očigledno t, 2JC-F= 23,7 Hz, C-3’), 68,03 (OCH2Ph), 65,73 (d, 2JC-P= 5,30 Hz, C-5’), 51,66 (CHCH3), 20,42 (d, 3JC-P= 6,25 Hz, CHCH3).

[0084] HPLC na reverznim fazama, eluiranjem sa H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min, pokazala je jedan pik dijastereoizomera sa tR= 22,53 min.

2’-dezoksi-2’,2’-difluoro-D-citidin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat 4

[0085] (ES+) m/z, pronađeno: (M Na<+>) 603,14. C25H27F2N4O8NaP potrebno: (M+) 580,47.

<31>P NMR (202 MHz, MeOD): δP3,83

1H NMR (500 MHz, MeOD): δH7,56 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-6), 7,38 - 7,31 (m, 7H, ArH), 7,23 - 7,19 (m, 3H, ArH), 6,26 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-1’), 5,88 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 5,20 (s, 2H, OCH2Ph), 4,49 - 4,46 (m, 1H, H-5’), 4,38 - 4,34 (m, 1H, H-5’), 4,23 - 4,17 (m, 1H, H-3’), 4,07 - 4,01 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1,38 (d, J = 7,2 Hz, 3H, CHCH3).

<19>F NMR (470 MHz, MeOD): δF- 118,3 (d, J = 241 Hz, F), - 120,38 (široko d, J = 241 Hz, F).

1

<13>C NMR (125 MHz, MeOD): δC174,65 (d, 3JC-P= 5,0 Hz, C=O, estar), 167,65 (C-NH2), 157,75 (C=O baza), 152,10 (d, 2JC-P= 7,0 Hz, C-Ar), 142,28 (CH-baza), 137,50 (C-Ar), 130,86, 129,63, 129,40, 129,32, 126,31 (CH-Ar), 124,50 (d, 1JC-F= 257 Hz, CF2), 121,44, 121,40 (CH-Ar), 96,67 (CH-baza), 85,90 (široki signal, C-1’), 80,27 (C-4’), 71,30 (očigledno t, 2JC-F= 23,7 Hz, C-3’), 68,02 (OCH2Ph), 65,50 (C-5’), 51,83 (CHCH3), 20,22 (d, 3JC-P= 7,5 Hz, CHCH3).

[0086] HPLC na reverznim fazama, eluiranjem sa H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min, pokazala je jedan pik dijastereoizomera sa tR= 21,87 min.

Primer 1 - Pregled rastvarača

[0087] Prvo je izvršen pregled rastvarača sa 17 različitih rastvarača (videti Tabelu 1). Otprilike 25 mg dijastereomerne smeše (33:67 (R):(S)) NUC-1031 suspendovano je u rastvaračima koji su na listi (1 mL) i mešano preko noći. U slučaju da je došlo do rastvaranja dodato je još čvrste supstance. Suspenzije su istaložene i relativne količine dva dijastereoizomera u rastvoru su određene pomoću HPLC.

Tabela 1: Boldovani procenti ukazuju na visoko (> 85%) dijastereoizomerno obogaćenje u rastvoru.

1

[0088] Stoga su brojni rastvarači (aceton, EtOH, IPA, MEK, CAN, nPrOH, toluen, nBuOH) pokazali visoko dijastereoizomerno obogaćenje (S)-epimera u rastvoru. Pregled je identifikovao tri rastvarača koja su dovela do odličnog (>94%) obogećenja (S)-dijastereoizomera u rastvoru: izopropanol, acetonitril i n-butanol.

Primer 2 - Optimizacija kristalizacije

[0089] Obogećenje obezbeđeno acetonitrilom i izopropanolom je procenjeno u rasponu koncentracija i temperatura (videti Tabelu 2). Sprovedene su dve vrste eksperimenata: jednostavne kaše (20°C) u različitim zapreminama i kaše/rekristalizacije na 80°C. Za eksperimente 200 mg dijastereomerne smeše (33:67 (R):(S)) je suspendovano u rastvaračima i zapremini koje su navedene ispod i opciono zagrevano do refluksa i ohlađeno na 20°C. Suspenzije su mešane preko noći i izolovane. Relativne proporcije dva epimera prisutna i u rastvoru i u čvrstom kolaču su određene pomoću HPLC.

Tabela 2

1

2

[0090] Za svaki uzorak, tretman je ponovljen ali to nije dovelo do dodatnog obogaćenja. Ovo pokazuje da jednostavno rastvaranje dijastereoizomerne smeše, kako je opisano u izjavi prvog aspekta, može obezbediti odlično dijastereoizomerno obogećenje, posebno (S)-epimera. Na ovaj efekat suštinski ne utiče koncentracija rastvarača u odnosu na masu NUC-1031 i takođe suštinski ne utiče temperatura. Stoga postupak obezbeđuje efikasnu tehniku razdvajanja na temperaturi okoline.

Primer 3 – Povećanje razmere

[0091] 2 x 25 g dijastereomerne smeše (R) i (S) epimera (33:67 (R):(S)) je svaka rastvorena u 75 vol. acetonitrila na 25°C. Suspenzije su kombinovane tokom filtracije. Prva filtracija je obezbedila rastvor A2 i čvrstu supstancu A1. Kolač sa filtera je ponovo pretvoren u kašu i rezultujuća suspenzija je filtrirana kako bi se dobio drugi rastvor B2 i drugi čvrst kolač B1 (videti Tabelu 3).

Tabela 3

Primer 4 - Dodatno obogaćenje dijastereoizomerne čistoće (S)-epimera

[0092] Ostatak dva rastvora A2 i B2 iz povećanja razmere u acetonitrilu (približno 2,6 L) je kombinovan, koncentrovan do oko 50% od prvobitne zapremine i mešan tokom 3 dana. Formirana suspenzija je filtrirana i to je rezultiralo vrlo visoko dijastereoizomerno obogaćenim čvrstim uzorkom (S)-epimera na filteru (Tabela 4).

Tabela 4

[0093] Stoga, (S)-epimer se može dobiti u odličnoj dijastereoizomernoj čistoći u velikoj razmeri upotrebom postupaka pronalaska. Ovo predstavlja značajnu prednost za proizvodnju u većoj razmeri pošto postupak izbegava potrebu za hromatografskim korakom sa svim pratećim poteškoćama.

Primer 5 - Dodatno obogaćenje dijastereoizomerne čistoće (R)-epimera

[0094] Kako bi se dobilo visoko dijastereoizomerno obogaćenje (R)-epimera, uzorci čvrste supstance B1 su pretvoreni u kašu u smešama rastvarača (50 mg čvrste supstance u 1 mL smeše rastvarača navedenih u Tabeli 5) i filtrirani. Rezultujuće čvrste supstance su obogaćene (R)-epimerom, kao što je naznačeno u Tabeli 5, sa najboljim rezultatom koji je dobijen sa vodom koja je dodata acetonitrilu kao anti-rastvarač.

Tabela 5

[0095] Prinos iz smeše acetonitril/voda je bio nizak tako da je eksperiment ponovljen sa manjom količinom vode u smeši rastvarača. Rezultati su pokazali poboljšano izdvajanje i neko dijastereoizomerno obogaćenje (Tabela 6).

Tabela 6

[0096] Materijal koji uglavnom sadrži (R)-epimer (čvrsta supstanca B2) je ponovo pretvoren u kašu u 20 zapremina ACN/voda 10/1 tokom 18h i filtriran i dobijena čvrsta supstanca je isprana acetonitrilom. Rezultujuća čvrsta supstanca je sadržala (R)-epimer sa odličnom dijastereoizomernom čistoćom (Tabela 7).

Tabela 7

2

[0097] Stoga, (R)-epimer se može dobiti u odličnoj dijastereoizomernoj čistoći u velikoj razmeri upotrebom postupaka pronalaska. Ponovo, ovo predstavlja značajnu prednost za proizvodnju u većoj razmeri pošto postupak izbegava potrebu za hromatografskim korakom sa svim pratećim poteškoćama.

Primer 6 - Dodatni optimizovan postupak za izolovanje (S)-epimera upotrebom IPA

[0098] 2'-dezoksi-2', 2'-difluoro-D-citidin-5'-O-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfat (120 g; 4:6 (R):(S); takođe je sadržao 5% po težini nepoznatih nečistoća koje su rezultat postupka kojim je jedinjenje pripremljeno) je dodat u IPA (600 mL) kako bi se formirala kaša. Kaša je zagrevana na 50-54°C i komešana na toj temperaturi tokom 2 sata. Kaša je zatim filtrirana dok je topla. Kolač je ispran dodatnim delom toplog (50-52°C) IPA (60 mL), dok je još uvek na filteru. Filtrat je polako (tokom oko 2 sata) ohlađen na 26-30°C oko 2 sata i klica, početni materijal (600 mg ili 95% dijastereoizomerne čistoće s-izomera kao kaša u 12 ml IPA). Smeša je mešana 18 sati na 26-30°C. Smeša je zatim ohlađena na 18-22°C i mešana tokom dodatnih 8 sati. Suspenzija je filtrirana i kolač je ispran ohlađenim (oko 15°C) IPA (120 mL). Čvrst proizvod je osušen pod vakuumom na oko 42°C kako bi se obezbedio (S)-epimer (25% prinosa zasnovano na ukupnoj količini gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata startnog materijala; krajnja dijastereoizomerna čistoća: 96-98%).

Primer 7 – Polimorf I (S)-epimera NUC-1031

[0099] Postupak opisan u Primeru 6 obezbeđuje (S)-epimer NUC-1031 kao kristalni oblik, Oblik I. Oblik I je polimorf slobodne baze bez rastvarača (S)-epimera. Ovaj oblik se razlikuje od onog za koji je primećeno da ga (S)-epimer usvaja kada je izolovan nakon razdvajanja epimera hromatografskim tehnikama i takođe oblika za koji je primećeno da ga (S)-epimer usvaja kada je dobijen kao deo smeše dva izomera. Pronađeno je da je polimorf I termodinamički najstabilniji polimorfni oblik (S)-izomera.

Rendgenska difraktometrija praha (X-ray Powder Diffraction - XRPD)

[0100] Uzorak Polimorfa I (S)-epimera NUC-1031 je skeniran između 3 i 35° 2θ. Materijal je bio nežno kompresovan u bunarić montiran na Kapton filmu. Uzorak je zatim stavljen u PANalytical X ́Pert Pro difraktometar koji radi u režimu transmisije i analiziran je upotrebom sledećih eksperimentalnih uslova:

Poreklo sirovih podataka XRD merenje (*.XRDML) Startna pozicija [°2θ] 3.0066

Krajnja pozicija [°2θ] 34. 9866

Veličina koraka [°2θ] 0.0130

Vreme koraka skeniranja [s] 67.9377

Vrsta skeniranja Neprekidno

PSD mod Skeniranje

PSD dužina [°2θ] 3.35

Ofset [°2θ] 0.0000

Vrsta divergentnog proreza fiksna veličina proreza 1.0000

divergencije [°]

Dužina uzorka [mm] 10.00

Temperatura merenja [°C] 25.00

Materijal anode Cu

Kα1[Å] 1.54060

Kα2[Å] 1.54443

Odnos Kα2/ Kα10.50000

Podešavanja generatora 40 mA, 40 kV

Radijus goniometra [mm] 240.00

Dist. fokus-Diverg. prorez [mm] 91.00

Monohromator za slučajne zrake Ne

Obrtanje Ne

[0101] Rezultujući spektar je prikazan na Slici 1. Primećeni pikovi su bili sledeći:

2

Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (Fourier Transform Infrared Spectroscopy - FTIR)

[0102] Infracrvena spektroskopija Polimorfa I (S)-epimera NUC-1031 izvedena je na Bruker ALPHA P spektrometru. Uzorak je meren kao suspenzija u Nujol-u (parafinsko ulje), koji ima glavne pikove na 2950 - 2800 cm-1 , 1465 - 1450 cm-1 i 1380 - 1370 cm-1. Zbog toga,

2

zabeleženi spektri su pokazali ove apsorpcije pored pikova apsorpcije materijala. Suspenzije su postavljene na sredinu ploče spektrometra i spektri su dobijeni upotrebom sledećih parametara:

Rezolucija: 4 cm-1

Vreme skeniranja pozadine: 16 skenova

Vreme skeniranja uzorka: 16 skenova

Sakupljanje podataka: 4000 do 400 cm-1

Rezultujući spektar: Transmitanca

Softver: OPUS verzija 6

[0103] Rezultujući spektar je prikazan na Slici 2. Primećeni pikovi su bili sledeći:

2

2

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Postupak obezbeđivanja najmanje jednog dijastereoizomera gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dijastereoizomerne čistoće veće od 85%, naznačen time što postupak sadrži korake:

suspendovanje smeše gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata i gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u rastvaraču ili smeši rastvarača kako bi se formirala kaša; i

filtriranje kaše kako bi se obezbedio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat i filtrat koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat rastvoren u rastvaraču ili smeši rastvarača;

pri čemu je čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85% i/ili filtrat sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se kaša zagreva kada je već formirana; opciono na temperaturu od 30°C do 80°C.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što se kaša ne hladi pre filtracije.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što dodatno sadrži korak ispiranja čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je postupak postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata dijastereoizomerne čistoće veće od 85%, i pri čemu postupak dodatno sadrži korak uklanjanja jednog ili više rastvarača iz filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kako bi se dobio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što korak uklanjanja rastvarača ili smeše rastvarača sadrži:

2

uklanjanje dela rastvarača ili smeše rastvarača iz filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat evaporacijom, npr. destilacijom ili evaporacijom pod sniženim pritiskom, kako bi se obezbedio koncentrovani filtrat koji sadrži čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat;

opciono komešanje koncentrovanog filtrata; i

filtriranje koncentrovanog filtrata kako bi se dobio gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kao čvrsta supstanca dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što korak uklanjanja rastvarača ili smeše rastvarača sadrži:

hlađenje filtrata koji sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kako bi se obezbedio ohlađeni filtrat koji sadrži čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat;

opciono komešanje ohlađenog filtrata; i

filtriranje ohlađenog filtrata kako bi se dobio gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat kao čvrsta supstanca dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što dodatno sadrži korak dodavanja klice, početnog materijala filtratu.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, naznačen time što dodatno sadrži korak dodavanja dodatnog rastvarača filtratu.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9, naznačen time što dodatno sadrži ispiranje čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je postupak postupak obezbeđivanja gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata dijastereoizomerne čistoće veće od 85%;

opciono pri čemu postupak dodatno sadrži korake:

suspendovanje čvrstog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata dobijenog iz prve filtracije u drugom rastvaraču ili drugoj smeši rastvarača kako bi se formirala druga kaša; i

filtriranje druge kaše kako bi se obezbedio čvrst gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat dijastereoizomerne čistoće veće od 85%.

12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačen time što je rastvarač ili smeša rastvarača sadrži rastvarač odabran od polarnog protičnog rastvarača i polarnog aprotičnog rastvarača.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je rastvarač ili smeša rastvarača sadrži izopropil alkohol.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što je rastvarač izopropil alkohol.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je rastvarač ili smeša rastvarača sadrži acetonitril.

1