RS60541B1 - Kompozicije za inhibiciju masp-2 zavisne aktivacije komplementa - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-MASP-2 inhibitorna antitela i kompozicije koje sadrže takva antitela za primenu u inhibiranju štetnih efekata MASP-2 zavisne aktivacije komplementa.

STANJE TEHNIKE

[0002] Sistem komplementa obezbeđuje rano delujući mehanizam za početak, pojačanje i orkestraciju imune reakcije na mikrobnu infekciju i druge akutne insulte (M.K. Liszewski i J.P. Atkinson, 1993, u Fundamental Immunology, treće izdanje, urednik W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York) kod ljudi i drugih kičmenjaka. Dok aktivacija komplementa obezbeđuje vrednu prvu liniju odbrane protiv potencijalnih patogena, aktivnosti komplementa koje stimulišu zaštitnu imunu reakciju takođe mogu predstavljati i potencijalnu pretnju za domaćina (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol.15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Na primer, proteolitički proizvodi C3 i C5 regrutuju i aktiviraju neutrofile. Mada su neophodni za odbranu domaćina, aktivirani neutrofili su nediskriminatorni u svom oslobađanju destruktivnih enzima i mogu izazvati oštećenje organa. Pored toga, aktivacija komplementa može izazvati taloženje litičkih komponenata komplementa na obližnjim ćelijama domaćina, kao i na mikrobnim ciljevima, što rezultuje lizom ćelija domaćina.

[0003] Sistem komplementa je takođe uključen u patogenezu brojnih akutnih i hroničnih bolesnih stanja, uključujući: infarkt miokarda, moždani udar, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), reperfuzionu povredu, septični šok, kapilarno curenje posle toplotnih opekotina, post-kardiopulmonarno bajpas zapaljenje, odbacivanje transplantata, reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, mijasteniju gravis, i Alchajmerovu bolest. U skoro svim ovim stanjima, komplement nije uzrok, ali je jedan od nekoliko faktora koji su uključeni u patogenezu. Međutim, aktivacija komplementa može biti glavni patološki mehanizam i predstavlja efektivnu tačku za kliničku kontrolu u mnogim od ovih bolesnih stanja.

[0004] Rastuće prepoznavanje značaja komplementom posredovane povrede tkiva kod mnoštva bolesnih stanja podstaklo je potrebu za lekovima koji su efektivni inhibitori komplementa. Do danas je Ekulizumab (Soliris®), antitelo protiv C5, jedini lek koji cilja komplement i koji je odobren za humanu upotrebu. Međutim, C5 je samo jedan od nekoliko efektorskih molekula lociranih "nizvodno" u sistemu komplementa, i blokada C5 ne inhibira aktivaciju sistema komplementa. Zbog toga bi inhibitor koraka inicijacije aktivacije komplementa imao značajne prednosti u odnosu na "nizvodni" inhibitor komplementa.

[0005] Trenutno je široko prihvaćeno da sistem komplementa može biti aktiviran preko tri karakteristična puta: klasičnog puta, lektinskog puta, i alternativnog puta. Klasični put se obično aktivira kompleksom koji se sastoji od antitela domaćina vezanih za stranu česticu (tj. antigen) i stoga zahteva ranije izlaganje antigenu radi generisanja specifične reakcije antitela. Pošto aktivacija klasičnog puta zavisi od prethodne adaptivne imune reakcije domaćina, klasični put je deo stečenog imunog sistema. Nasuprot toga, i lektinski, i alternativni putevi su nezavisni od adaptivnog imuniteta i deo su urođenog imunog sistema.

[0006] Aktivacija sistema komplementa rezultuje sekvencijalnom aktivacijom zimogena serin proteaze. Prvi korak u aktivaciji klasičnog puta je vezivanje specifičnog prepoznajućeg molekula, C1q, za antigen-vezane IgG i IgM komplekse. C1q je povezan sa proenzimima C1r i C1s serin proteaze kao kompleks zvani C1. Posle vezivanja C1q za imuni kompleks, autoproteolitičko sečenje Arg-Ile mesta C1r je praćeno C1-posredovanim sečenjem i aktivacijom Cls, kome zato treba sposobnost da seče C4 i C2. C4 se seče na dva fragmenta, označena sa C4a i C4b, a slično tome, C2 se seče na C2a i C2b. C4b fragmenti su sposobni za formiranje kovalentnih veza sa susednim hidroksilnim ili amino grupama i generisanje C3 konvertaze (C4b2a) putem nekovalentne interakcije sa C2a fragmentom aktiviranog C2. C3 konvertaza (C4b2a) aktivira C3 proteolitičkim sečenjem na C3a i C3b potkomponente, što dovodi do generisanja C5 konvertaze (C4b2a3b), što sečenjem C5 dovodi do formiranja kompleksa koji napada membranu (C5b kombinovan sa C6, C7, C8 i C9, takođe se označava sa "MAC") i koji može pokidati ćelijske membrane, a što dovodi do ćelijske lize. Aktivirani oblici C3 i C4 (C3b i C4b) su kovalentno deponovani na stranim ciljnim površinama, koje su prepoznate kao receptori komplementa na mnoštvu fagocita.

[0007] Nezavisno od toga, prvi korak aktivacije sistema komplementa preko lektinskog puta je takođe vezivanje specifičnih prepoznatljivih molekula, koje je praćeno aktivacijom pridruženih proenzima serin proteaze. Međutim, umesto da se vezuju za imune komplekse pomoću C1q, prepoznatljivi molekuli u lektinskom putu sadrže grupu proteina koji vezuju ugljene hidrate (manan-vezujući lektin (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i C-tip lektina CL-11), koji se skupa nazivaju lektinima. Vidi J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol.21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Vidi takođe J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen S. et al., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

[0008] Ikeda et al. su prvi pokazali da bi, slično C1q, i MBL mogao da aktivira sistem komplementa posle vezivanja za kvaščevim mananom obložene eritrocite na C4-zavisni način (Ikeda et al., J. Biol. Chem.262:7451-7454, 1987). MBL, član kolektinske familije proteina, je kalcijum-zavisni lektin koji se vezuje za ugljene hidrate sa 3- i 4-hidroksi grupama orijentisanim u ekvatorijalnoj ravni piranoznog prstena. Prominentni ligandi za MBL su, shodno tome, D-manoza i N-acetil-D-glukozamin, dok ugljeni hidrati koji ne odgovaraju ovom prostornom zahtevu imaju nedektabilni afinitet za MBL (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992).

Interakcija između MBL i monovalentnih šećera je ekstremno slaba, sa konstantama disocijacije koje su tipično u jednocifrenom milimolskom opsegu. MBL ostvaruje čvrsto, specifično vezivanje za glikan ligande aviditetom, tj. istovremenom interakcijom sa više monosaharidnih ostataka lociranih u neposrednoj blizini jedan drugom (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys.299:129-136, 1992). MBL prepoznaje ugljenohidratne strukture koje obično odlikuju mikroorganizme kao što su bakterije, kvasci, paraziti i izvesni virusi. Nasuprot tome, MBL ne prepoznaje D-galaktozu i sijalinsku kiselinu, penultimatne i ultimatne šećere koji obično odlikuju "zreli" kompleks glikokonjugata koji je prisutan na glikoproteinima sisarske plazme i ćelijske površine. Smatra se da ova specifičnost vezivanja promoviše prepoznavanje "stranih" površina i da pomaže zaštitu od "automatske aktivacije." Međutim, MBL se vezuje sa visokim afinitetom za klastere visoko-manoznih "prekursora" glikana na N-vezanim glikoproteinima i glikolipidima sekvestriranim u endoplazmatičnom retikulumu i Goldžiju sisarskih ćelija (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem.257:3788-3794, 1982). Zbog toga su oštećene ćelije potencijalne mete za aktivaciju lektinskim putem preko MBL vezivanja.

[0009] Fikolini poseduju drugačiji tip lektinskog domena od MBL, koji se naziva fibrinogenu-sličan domen. Fikolini vezuju šećerne ostatke na Ca<++>-nezavisan način. Kod ljudi su identifikovane tri vrste fikolina (L-fikolin, M-fikolin i H-fikolin). Dva serumska fikolina, L-fikolin i H-fikolin, imaju zajedničku specifičnost za N-acetil-D-glukozamin; međutim, H-fikolin se takođe vezuje za N-acetil-D-galaktozamin. Razlika u specifičnosti za šećere kod L-fikolina, H-fikolina, CL-11 i MBL znači da različiti lektini mogu biti komplementarni i da različito ciljaju glikokonjugate, mada uz preklapanje. Ovaj koncept je podržan nedavnim izveštajem da se, od poznatih lektina u lektinskom putu, samo L-fikolin specifično vezuje za lipoteihonsku kiselinu, glikokonjugat ćelijskog zida nađen kod svih Gram-pozitivnih bakterija (Lynch, N.J., et al., J. Immunol.172:1198-1202, 2004). Kolektini (tj. MBL) i fikolini nemaju značajnih sličnosti aminokiselinskih sekvenci. Međutim, dve grupe proteina imaju slične organizacije domena i, kao C1q, se skupljaju u oligomerne strukture, što maksimizira mogućnost višemesnog vezivanja.

[0010] Serumske koncentracije MBL su visoko varijabilne u zdravim populacijama i ovo je genetski kontrolisano polimorfizmom/mutacijama i u promoterskim, i kodirajućim regionima MBL gena. Budući da je protein akutne faze, ekspresija MBL je dalje povećana u toku zapaljenja. L-fikolin je prisutan u serumu u koncentracijama sličnim onima MBL. Zbog toga je L-fikolinski ogranak lektinskog puta potencijalno uporediv sa MBL krakom po jačini. MBL i fikolini takođe mogu funkcionisati kao opsonini, koji omogućavaju fagocitima da ciljaju MBL- i fikolinom-odlikovane površine (vidi Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004); Matsushita i Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002); Aoyagi et al., J Immunol 174(1):418-25 (2005). Ova opsonizacija zahteva interakciju ovih proteina sa fagocitnim receptorima (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Med.169:1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem.271:2448-54, 1996), čiji identitet još uvek nije utvrđen.

[0011] Humani MBL formira specifičnu i visoko-afinitetnu interakciju preko svog kolagenu-sličnog domena sa jedinstvenim C1r/C1s-sličnim serin proteazama, koje se nazivaju MBL-povezane serin proteaze (MASPs). Do danas su opisana tri MASPs. Prvo je identifikovan samo jedan enzim "MASP" i karakterisan je kao enzim koji je odgovoran za iniciranje kaskade komplementa (tj. sečenje C2 i C4) (Matsushita M i Fujita T., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992), Ji, Y.H., et al., J. Immunol.150:571-578, 1993). Zatim je bilo sukcesivno utvrđeno da je MASP aktivnost bila, u stvari, mešavina dve proteaze: MASP-1 i MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). Međutim, pokazano je da je sam MBL-MASP-2 kompleks dovoljan za aktivaciju komplementa (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol.

165:2093-2100, 2000). Pored toga, samo je MASP-2 sekao C2 i C4 velikim brzinama (Ambrus, G., et al., J. Immunol.770:1374-1382, 2003). Shodno tome, MASP-2 je proteaza koja je odgovorna za aktivaciju C4 i C2 da bi se generisala C3 konvertaza C4b2a. Ovo je značajna razlika u odnosu na C1 kompleksa klasičnog puta, gde koordinisana akcija dve specifične serin proteaze (C1r i C1s) dovodi do aktivacije sistema komplementa. Pored toga, bila je izolovana treća, nova proteaza, MASP-3, (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 i MASP-3 su alternativno spojeni proizvodi istog gena.

[0012] MASPs dele identične organizacije domena sa onima kod C1r i C1s, enzimskim komponentama C1 kompleksa (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans.

28:545, 2000). Ovi domeni obuhvataju N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEGF/koštano morfogenog proteina (CUB), domen sličan epidermalnom faktoru rasta, drugi CUB domen, tandem domena proteina kontrole komplementa, i domen serin proteaze. Kao i kod C1 proteaza, aktivacija MASP-2 se događa putem sečenja Arg-Ile veze bliske domenu serin proteaze, koja razdvaja enzim na disulfidno-vezane A i B lance, pri čemu se zadnje pomenuti sastoji od domena serin proteaze.

Nedavno je bila opisana genetski određena definijencija MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med.349:554-560, 2003). Mutacija samo jednog nukleotida dovodi do Asp-Gly zamene u CUB1 domenu i daje MASP-2 koji nije sposoban da se vezuje za MBL.

[0013] MBL takođe može biti povezan sa alternativno spojenim oblikom MASP-2, poznatim kao MBL-povezani protein od 19 kDa (MAp19) (Stover, C.M., J. Immunol.

162:3481-90, 1999) ili mali MBL-povezani protein (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol.11:859-863, 1999), kome nedostaje katalitička aktivnost MASP-2. MAp19 sadrži prva dva domena MASP-2, praćena dodatnom sekvencom od četiri jedinstvene aminokiseline. MASP 1 i MASP 2 geni su locirani na humanim hromozomima 3 i 1, respektivno (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

[0014] Nekoliko linija dokaza sugeriše da postoje različiti MBL-MASPs kompleksi, a velika frakcija MASPs u serumu nije u kompleksu sa MBL (Thiel, S., et al., J.

Immunol.165:878-887, 2000). I H-, i L-fikolin se vezuju za sve MASPs i aktiviraju lektinski put komplementa, kao što to radi MBL (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol.168:3502-3506, 2002). I lektinski, i klasični put formiraju zajedničku C3 konvertazu (C4b2a) i ta dva puta konvergiraju u ovom koraku.

[0015] Za lektinski put se generalno smatra da ima glavnu ulogu u odbrani domaćina protiv infekcije kod naivnog domaćina. Jak dokaz za uključenost MBL u odbranu domaćina dolazi od analize pacijenata sa smanjenim serumskim nivoima funkcionalnog MBL (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). Takvi pacijenti ispoljavaju podložnost ponovljenim bakterijskim i gljivičnim infekcijama. Ovi simptomi su obično evidentni rano u životu, u toku očitog prozora ranjivosti, pošto titar antitela poreklom od majke nestaje, ali pre nego što se razvije potpuni repertoar reakcija antitela. Ovaj sindrom često nastaje usled mutacija na nekoliko mesta u kolagenskom delu MBL, koje remete adekvatno formiranje MBL oligomera. Međutim, pošto MBL može funkcionisati kao opsonin nezavisan od komplementa, nije poznato do koje mere je povećana podložnost infekcijama zbog poremećene aktivacije komplementa.

[0016] Za razliku od klasičnog i lektinskog puta, nisu pronađeni inicijatori alternativnog puta koji ispunjavaju funkcije prepoznavanja koje vrše C1q i lektini kod druga dva puta. Trenutno je opšte prihvaćeno da je alternativni put spontano podložan niskom nivou brze aktivacije, koji se može lako pojačati na stranim ili drugim abnormalnim površinama (bakterije, kvasci, virusima inficirane ćelije, ili oštećeno tkivo) kojima nedostaju adekvatni molekulski elementi koji održavaju spontanu aktivaciju komplementa pod kontrolom. Postoje četiri proteina plazme koji su direktno uključeni u aktivaciju alternativnog puta: C3, faktori B i D, i properdin. Mada postoje opsežni dokazi koji ukazuju i na klasični, i na alternativni put komplementa u patogenezi neinfektivnih humanih bolesti, uloga lektinskog puta tek počinje da se utvrđuje. Skorašnje studije pružaju dokaze da aktivacija lektinskog puta može biti odgovorna za aktivaciju komplementa i sa njime povezanim zapaljenjem kod ishemijske/reperfuzione povrede. Collard et al. (2000) izveštava da kultivisane endotelne ćelije koje su podvrgnute oksidativnom stresu vezuju MBL i da ispoljavaju taloženje C3 posle izlaganja humanom serumu (Collard, C.D., et al., Am.

J. Pathol.156:1549-1556, 2000). Pored toga, tretman humanim serumima sa blokirajućim anti-MBL monoklonskim antitelima inhibirao je MBL vezivanje i aktivaciju komplementa. Ova otkrića su proširena na pacovski model miokardijalne ishemijereperfuzije, u kome su pacovi tretirani blokirajućim antitelom usmerenim protiv pacovskog MBL ispoljili znatno manje mikardijalno oštećenje posle okluzije koronarne arterije nego pacovi koji su bili tretirani kontrolnim antitelom (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). Molekularni mehanizam MBL vezivanja za vaskularni endotelijum posle oksidativnog stresa nije jasan; jedna skorašnja studija sugeriše da aktivacija lektinskog puta posle oksidativnog stresa može biti posredovana MBL vezivanjem za vaskularne endotelijalne citokeratine, a ne za glikokonjugate (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol.159:1045-1054, 2001). Druge studije su ukazale na klasični i alternativni put u patogenezi ishemijske/reperfuzione povrede, a uloga lektinskog puta u ovoj bolesti ostaje kontroverzna (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol.162:363-367, 2003).

[0017] Jedna skorašnja studija je pokazala da je MASP-1 (i eventualno takođe MASP-3) potreban za konverziju alternativnog puta aktivacije enzima Faktora D iz njegovog zimogenog oblika u njegov enzimski aktivni oblik (vidi Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)). Fiziološki značaj ovog procesa je naglašen odsustvom funkcionalne aktivnosti alternativnog puta u plazmi MASP-1/3 deficijentnih miševa. Proteolitička generacija C3b od nativnog C3 je potrebna za funkcionisanje alternativnog puta. Pošto C3 konvertaza alternativnog puta (C3bBb) sadrži C3b kao esencijalnu podjedinicu, pitanje koje se odnosi na poreklo prvog C3b preko alternativnog puta je predstavljalo nerešen problem i podstaklo je znatna istraživanja.

[0018] C3 pripada porodici proteina (zajedno sa C4 i α-2 makroglobulinom) koji sadrže retku posttranslacionu modifikaciju poznatu kao tioestarska veza. Tioestarska grupa se sastoji od glutamina, čija terminalna karbonil grupa obrazuje kovalentnu tioestarsku vezu sa sulfhidril grupom tri aminokiseline udaljenu od cisteina. Ova veza je nestabilna i elektrofilni glutamil-tioestar može reagovati sa nukleofilnim radikalima, kao što su hidroksil ili amino grupe i, shodno tome, može formirati kovalentnu vezu sa drugim molekulima. Tioestarska veza je prihvatljivo stabilna kada je izolovana unutar hidrofobnog džepa intaktnog C3. Međutim, proteolitičko sečenje C3 na C3a i C3b rezultuje izlaganjem veoma reaktivne tioestarske veze na C3b i, sledstveno, nukleofilnim napadom od strane susednog radikala koji sadrži hidroksil ili amino grupe, C3b postaje kovalentno vezan za cilj. Pored njegove dobro dokumentovane uloge u kovalentnom vezivanju C3b za ciljeve komplementa, smatra se da C3 tioestar takođe ima centralnu ulogu u iniciranju alternativnog puta. Prema opšte prihvaćenoj "teoriji održavanja", alternativni put se inicira generisanjem fluidno-fazne konvertaze, iC3Bb, koja se formira od C3 sa hidrolizovanim tioestrom (iC3; C3(H2O)) i faktorom B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol.7:143-162, 1984). C3b-sličan C3(H2O) se generiše od nativnog C3 sporom spontanom hidrolizom internog tioestra u proteinu (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med.154:856-867, 1981). Putem aktivnosti C3(H2O)Bb konvertaze, C3b molekuli se talože na ciljnoj površini, čime se inicira alternativni put.

[0019] Veoma malo je poznato o inicijatorima aktivacije alternativnog puta. Smatra se da aktivatori obuhvataju kvaščeve ćelijske zidove (zimosan), mnoge čiste polisaharide, zečje eritrocite, izvesne imunoglobuline, viruse, gljive, bakterije, životinjske tumorske ćelije, parazite, i oštećene ćelije. Jedina karakteristika koja je zajednička za ove aktivatore je prisustvo ugljenog hidrata, ali je kompleksnost i različitost ugljenohidratnih struktura učinila teškim određivanje zajedničkih molekulskih determinanti koje se prepoznaju. Opšte je prihvaćeno da je alternativni put aktivacije kontrolisan finom ravnotežom između inhibitornih regulatornih komponenata ovog puta, kao što su Faktor H, Faktor I, DAF, CR1 i properdin, koji je jedini pozitivni regulator alternativnog puta. Vidi Schwaeble W.J. i Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).

[0020] Pored očigledno neregulisanog mehanizma aktivacije koji je gore opisan, alternativni put takođe može obezbediti moćni ciklus amplifikacije za C3 konvertazu lektinskog/klasičnog puta (C4b2a), pošto bilo koji generisani C3b može učestvovati sa faktorom B u formiranju dodatne C3 konvertaze alternativnog puta (C3bBb). C3 konvertaza alternativnog puta je stabilizovana vezivanjem properdina. Properdin produžava od šest do deset puta poluživot C3 konvertaze alternativnog puta.

Dodavanje C3b C3 konvertazi alternativnog puta dovodi do formiranja C5 konvertaze alternativnog puta.

[0021] Smatra se da sva tri puta (tj. klasični, lektinski i alternativni) konvergiraju u C5, koji se seče da bi se formirali proizvodi sa višestrukim prozapaljenskim efektima. Konvergentni put se naziva terminalnim putem komplementa. C5a je najpotentniji anafilatoksin, koji indukuje alteracije u glatkim mišićima i vaskularnom tonusu, kao i vaskularnoj permeabilnosti. On je takođe moćan hemotaksin i aktivator i neutrofila, i monocita. C5a-posredovana ćelijska aktivacija može znatno pojačati zapaljenske reakcije indukcijom oslobađanja više dodatnih zapaljenskih medijatora, uključujući citokine, hidrolitičke enzime, metabolite arahidonske kiseline i reaktivne kiseonične vrste. C5 sečenje dovodi do formiranja C5b-9, koji je takođe poznat kao kompleks koji napada membrane (MAC). Sada postoje jaki dokazi da sublitičko MAC taloženje može igrati važnu ulogu u zapaljenju, pored njegove uloge kao kompleksa koji formira litičke pore.

[0022] Pored njegove suštinske uloge u imunoj odbrani, sistem komplementa doprinosi oštećenju tkiva u mnogim kliničkim stanjima. Shodno tome, postoji nasušna potreba da se razviju terapeutski efektivni inhibitori komplementa za sprečavanje ovih štetnih efekata.

[0023] WO2004/106384 opisuje pacovska anti-humana MASP-2 antitela.

WO2005/123128 opisuje mišji monoklonski anti-pacovski ili -humani MASP-2.

Schwaeble et al., 2001, PNAS vol.108, br.18, 7523-7528 opisuju humano antihumano MASP-2 antitelo AbDH3.

SUŠTINA PRONALASKA

[0024] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima, a bilo koji drugi aspekti ili primeri izvođenja koji su ovde navedeni i ne spadaju u okvir patentnih zahteva su dati isključivo radi informacije.

[0025] Prema jednom aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za humani MASP-2, koje sadrži:(i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence; i (ii) varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, pri čemu sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca CDR-H3 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:38 ili SEQ ID NO:90, i njene konzervativne modifikacije sekvence, pri čemu varijabilni region lakog lanca CDR-L3 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:51 ili SEQ ID NO:94, i njene konzervativne modifikacije sekvence, i pri čemu izolovano antitelo inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0026] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem je realizovano humano antitelo koje se vezuje za humani MASP-2, pri čemu antitelo sadrži: I) a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži: i) teški lanac CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 SEQ ID NO:21; i ii) teški lanac CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 SEQ ID NO:21; i iii) teški lanac CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 SEQ ID NO:21; i b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži: i) laki lanac CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i ii) laki lanac CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i iii) laki lanac CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; ili II) njegovu varijantu koja je inače identična pomenutim varijabilnim domenima, izuzev do ukupno kombinovanih 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i do ukupno 10 kombinovanih aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0027] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem je realizovano izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se vezuje za humani MASP-2, pri čemu antitelo sadrži: I) a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži: i) teški lanac CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 SEQ ID NO:20; i ii) teški lanac CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 SEQ ID NO:20; i iii) teški lanac CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 SEQ ID NO:18 ili SEQ ID NO:20; i b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži: i) laki lanac CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; i ii) laki lanac CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; i iii) laki lanac CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; ili II) njegovu varijantu, koja je inače identična pomenutim varijabilnim domenima, izuzev do ukupno kombinovanih 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i do ukupno 10 kombinovanih aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0028] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem je realizovano izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se vezuje za humani MASP-2, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 ili SEQ ID NO:21.

[0029] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem je realizovano izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se vezuje za humani MASP-2, koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži jednu od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27.

[0030] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom su realizovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinske sekvence anti-MASP-2 antitela, ili njihove fragmente, prema predmetnom pronalasku.

[0031] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovana ćelija koja sadrži najmanje jedan od molekula nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinske sekvence anti-MASP-2 antitela, ili njihove fragmente, prema predmetnom pronalasku.

[0032] Prema sledećem aspektu, pronalaskom je realizovan metod za generisanje izolovanog MASP-2 antitela koji sadrži kultivaciju ćelija koje sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinske sekvence anti-MASP-2 antitela prema predmetnom pronalasku pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju molekula nukleinske kiseline koji kodiraju anti-MASP-2 antitelo i izolaciju pomenutog anti-MASP-2 antitela.

[0033] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se disosuje od humanog MASP-2 sa KD od 10nM ili manjim, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom, i inhibira C4 aktivaciju mananom obloženog supstrata sa IC50 od 10nM ili manjim u 1% seruma. U nekim primerima izvođenja, pomenuto antitelo ili njegov antigen vezujući fragment specifično prepoznaje bar deo epitopa koji prepoznaje referentno antitelo, pri čemu pomenuto referentno antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:20 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:24.

[0034] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom su realizovane kompozicije koje sadrže potpuno humana monoklonska antiMASP-2 antitela prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0035] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem su realizovani metodi inhibicije MASP-2 zavisne aktivacije komplementa u humanom subjektu koji sadrže administraciju humanog monoklonskog antitela prema pronalasku u količini koja je dovoljna da inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa u pomenutom humanom subjektu.

[0036] Prema sledećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan artikal za proizvodnju koji sadrži jediničnu dozu humanog monoklonskog MASP-2 antitela prema pronalasku koja je podesna za terapeutsku administraciju humanom subjektu, pri čemu je jedinična doza u opsegu od 1mg do 1000mg.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0037] Gore navedeni aspekti i mnoge prateće prednosti ovog pronalaska će moći da se lakše shvate na osnovu sledećeg detaljnog opisa, posmatranog zajedno sa priloženim nacrtom, pri čemu:

SLIKA 1A je dijagram koji prikazuje genomsku strukturu humanog MASP-2;

SLIKA 1B je dijagram koji prikazuje domensku strukturu humanog MASP-2 proteina;

SLIKA 2 grafički prikazuje rezultate ELISA testa izvedenog na poliklonskim populacijama selektovanim iz scFcv biblioteke faga panirane protiv različitih MASP-2 antigena, kao što je opisano u Primeru 2;

SLIKE 3A i 3B prikazuju rezultate testiranja 45 kandidata scFv klonova u pogledu funkcionalne aktivnosti u testu komplementa, kao što je opisano u Primeru 3; SLIKA 4 grafički prikazuje rezultate eksperimenta koji je bio izveden radi upoređivanja C3c nivoa u tri seruma (humanom, pacovskom i NHP), kao što je opisano u Primeru 4;

SLIKA 5A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci regiona teškog lanca (ostaci 1-120) najaktivnijih klonova koje otkriva dve karakteristične grupe koje pripadaju VH2 i VH6 genskoj familiji, respektivno, kao što je opisano u Primeru 4;

SLIKA 5B je poravnanje aminokiselinskih sekvenci scFv klonova 17D20, 17N16, 18L16 i 4D9, kao što je opisano u Primeru 4;

SLIKA 6 grafički prikazuje inhibitorne aktivnosti preparata IgG4 konvertovanih klonova majki u C3b testu taloženja uz korišćenje 90% humane plazme, kao što je opisano u Primeru 5;

SLIKA 7A grafički prikazuje rezultate ELISA testa na 17N16 klonovima majki prema klonovima ćerki titrovanim na huMASP2A, kao što je opisano u Primeru 6; SLIKA 7B grafički prikazuje rezultate ELISA testa na 17D20 klonovima majki prema klonovima ćerki titrovanim na huMASP2A, kao što je opisano u Primeru 6; SLIKA 8 je poravnanje proteinskih sekvenci klona majke 17N16 i 17N9 klona ćerke koje pokazuje da laki lanci (počevši od SYE) imaju 17 aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između ova dva klona, kao što je opisano u Primeru 6; SLIKA 9 je poravnanje proteinskih sekvenci CDR-H3 regiona sekvenci klonova #35, #59 i #90 nastalih mutagenezom u poređenju sa 17D20 klonom majkom, kao što je opisano u Primeru 7;

SLIKA 10A je poravnanje proteinskih sekvenci CDR3 regiona 17D20 klona majke sa klonom sa izmešanim lancem 17D20md21N11 i mutagenetičkim klonom #35 CDR-H3 klona prikazanim na SLICI 9 kombinovanim sa VL 17D20md21N11 (VH35-VL21N11), kao što je opisano u Primeru 7;

SLIKA 10B je poravnanje proteinskih sekvenci VL i VH regiona 17D20 klona majke i klona ćerke 17D20md21Nl 1, kao što je opisano u Primeru 7;

SLIKA 11A grafički prikazuje rezultate testa C3b taloženja izvedenog za izotipske varijante klonova ćerki (MoAb#1-3), koje potiču od klona majke 17N16 humanog anti-MASP-2 monoklonskog antitela, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 11B grafički prikazuje rezultate testa C3b taloženja izvedenog za izotipske varijante klonova ćerki (MoAb#4-6), koje potiču od klona majke 17D20 humanog anti-MASP-2 monoklonskog antitela, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKE 12A i 12B grafički prikazuju testiranje klonova majki i MoAb#1-6 u C3b testu taloženja u 95% seruma, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 13 grafički prikazuje inhibiciju C4b taloženja u 95% normalnog humanog seruma, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 14 grafički prikazuje inhibiciju C3b taloženja u 95% seruma afričkih zelenih majmuna, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 15 grafički prikazuje inhibiciju C4 aktivnosti sečenja prethodno sastavljenog MBL-MASP2 kompleksa pomoću MoAb#2-6, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 16 grafički prikazuje preferencijalno vezivanje MoAb#6 za humani MASP2 u poređenju sa C1s, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 17 grafički prikazuje da je lektinski put bio potpuno inhibiran posle intravenske administracije anti-humanog MoAb#OMS646 afričkim zelenim majmunima, kao što je opisano u Primeru 10;

SLIKA 18A je Kaplan-Majerov dijagram preživljavanja koji prikazuje procenat preživljavanja u toku vremena posle izlaganja 7.0 Gy zračenja kod kontrolnih miševa i miševa tretiranih sa anti-mišjim MASP-2 antitelom (mAbM11) ili antihumanim MASP-2 antitelom (mAbOMS646), kao što je opisano u Primeru 11; SLIKA 18B je Kaplan-Majerov dijagram preživljavanja koji prikazuje procenat preživljavanja u toku vremena posle izlaganja 6.5 Gy zračenja kod kontrolnih miševa i miševa tretiranih anti-mišjim MASP-2 antitelom (mAbM11) ili antihumanim MASP-2 antitelom (mAbOMS646), kao što je opisano u Primeru 11; SLIKA 18C je Kaplan-Majerov dijagram preživljavanja koji prikazuje procenat preživljavanja u toku vremena posle izlaganja 8.0 Gy zračenja kod kontrolnih miševa i miševa tretiranih anti-humanim MASP-2 antitelom (mAbOMS646), kao što je opisano u Primeru 11;

SLIKA 19 grafički prikazuje rezultate analize površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) na anti-MASP-2 antitelu OMS646 (jedinice reakcije (vezivanja) prema vremenu u sekundama), koji pokazuju da se imobilizovano OMS646 vezuje za rekombinantni MASP-2 sa Koff brzinom od oko 1-3x10<-4>S<-1>i Kon brzinom od oko 1.6-3x10<6>M<-1>S<-1>, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 20 grafički prikazuje rezultate ELISA testa za određivanje afiniteta vezivanja anti-MASP-2 antitela OMS646 za imobilizovani humani MASP-2, koji pokazuju da se OMS646 vezuje za imobilizovani rekombinantni humani MASP-2 sa KD od približno 100 pM, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 21A grafički prikazuje nivo C4 aktivacije na mananom obloženoj površini u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646), koji pokazuje da OMS646 inhibira C4 aktivaciju na mananom obloženoj površini sa IC50 od približno 0.5 nM u 1% humanog seruma, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 21B grafički prikazuje nivo C4 aktivacije na IgG-obloženoj površini u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646), koji pokazuje da OMS646 ne inhibira aktivaciju komplementa komponente C4 zavisnu od klasičnog puta, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 22A grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvo anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnog za lektinski put, koji pokazuje da OMS646 inhibira lektinom-posredovano MAC taloženje sa IC50 vrednosti od približno 1 nM, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 22B grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnog za klasični put, koji pokazuje da OMS646 ne inhibira klasičnim putem posredovano MAC taloženje, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 22C grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnog za alternativni put, koji pokazuje da OMS646 ne inhibira alternativnim putem posredovano MAC taloženje, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 23A grafički prikazuje nivo C3 taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) na spektru koncentracija u 90% humanog seruma pod uslovima specifičnim za lektinski put, koji pokazuje da OMS646 blokira C3 taloženje pod fiziološkim uslovima, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 23B grafički prikazuje nivo C4 taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) na spektru koncentracija u 90% humanog seruma pod uslovima specifičnim za lektinski put, što pokazuje da OMS646 blokira C4 taloženje pod fiziološkim uslovima, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 24A grafički prikazuje nivo C4 taloženja u odsustvu ili prisustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) u 90% seruma makaki majmuna pod uslovima specifičnim za lektinski put, što pokazuje da OMS646 inhibira C4 taloženje lektinskim putem u serumu makaki majmuna na način zavisan od doze sa IC50 vrednostima u opsegu od 30 do 50nM, kao što je opisano u Primeru 12; i SLIKA 24B grafički prikazuje nivo C4 taloženja u odsustvu ili prisustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) u 90% seruma afričkih zelenih majmuna pod uslovima specifičnim za lektinski put, što pokazuje da OMS646 inhibira C4 taloženje lektinskim putem u serumu afričkih zelenih majmuna na način zavisan od doze sa IC50 vrednostima u opsegu od 15 do 30 nM, kao što je opisano u Primeru 12.

OPIS SPISKA SEKVENCI

[0038]

SEQ ID NO:1 humani MASP-2 cDNK

SEQ ID NO:2 humani MASP-2 protein (sa liderom)

SEQ ID NO:3 humani MASP-2 protein (zreli)

SEQ ID NO:4 pacovski MASP-2 cDNK

SEQ ID NO:5 pacovski MASP-2 protein (sa liderom)

SEQ ID NO:6 pacovski MASP-2 protein (zreli)

ANTIGENI (u vezi sa humanim MASP-2 zrelim proteinom)

[0039]

SEQ ID NO:7 CUBI domen humanog MASP-2 (aa 1-121)

SEQ ID NO:8 CUBI/EGF domeni humanog MASP-2 (aa 1-166)

SEQ ID NO:9 CUBI/EGF/CUBII domeni humanog MASP-2 (aa 1-277) SEQ ID NO:10 EGF domen humanog MASP-2 (aa 122-166)

SEQ ID NO:11 CCPI/CCPII/SP domeni humanog MASP-2 (aa 278-671) SEQ ID NO:12 CCPI/CCPII domeni humanog MASP-2 (aa 278-429)

SEQ ID NO:13 CCPI domen humanog MASP-2 (aa 278-347)

SEQ ID NO:14 CCPII/SP domen humanog MASP-2 (aa348-671)

SEQ ID NO:15 CCPII domen humanog MASP-2 (aa 348-429)

SEQ ID NO:16 SP domen humanog MASP-2 (aa 429-671)

SEQ ID NO:17: mutant sa inaktiviranom serin-proteazom (aa 610-625 sa mutiranim Ser 618)

VH lanci ANTI-MASP-2 MONOKLONSKIH ANTITELA

[0040]

SEQ ID NO:1817D20mc varijabilni region teškog lanca (VH) polipeptid SEQ ID NO:19 DNK koja kodira 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) varijabilni region teškog lanca (VH) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:2017D20_dc35VH21N11VL (OMS646) varijabilni region teškog lanca (VH) polipeptid

SEQ ID NO:2117N16mc varijabilni region teškog lanca (VH) polipeptid VL lanci ANTI-MASP-2 MONOKLONSKIH ANTITELA

[0041]

SEQ ID NO:2217D20mc varijabilni region lakog lanca (VL) polipeptid

SEQ ID NO:23 DNK koja kodira 17D20_dc21N11VL (OMS644) varijabilni region lakog lanca (VL) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:2417D20_dc21N11VL (OMS644) varijabilni region lakog lanca (VL) polipeptid

SEQ ID NO:2517N16mc varijabilni region lakog lanca (VL) polipeptid

SEQ ID NO:26 DNK koja kodira 17N16_dc17N9 (OMS641) varijabilni region lakog lanca (VL) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:2717N16_dc17N9 (OMS641) varijabilni region lakog lanca (VL) polipeptid

CDR-ovi TEŠKOG LANCA ANTI-MASP-2 MONOKLONSKIH ANTITELA

[0042]

SEQ ID NOS:28-31 CDR-H1

SEQ ID NOS:32-35 CDR-H2

SEQ ID NOS:36-40 CDR-H3

CDR-ovi LAKOG LANCA ANTI-MASP-2 MONOKLONSKIH ANTITELA

[0043]

SEQ ID NOS:41-45 CDR-L1

SEQ ID NOS:46-50 CDR-L2

SEQ ID NOS:51-54 CDR-L3

Sekvence MASP-2 antitela

[0044]

SEQ ID NO:55: scFv klon majka 17D20 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:56: scFv klon majka 18L16 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:57: scFv klon majka 4D9 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:58: scFv klon majka 17L20 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:59: scFv klon majka 17N16 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:60: scFv klon majka 3F22 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:61: scFv klon majka 9P13 polipeptid cele dužine

SEQ ID NO:62: DNK koja kodira IgG4 konstantni region teškog lanca divljeg tipa SEQ ID NO:63: polipeptid IgG4 konstantni region teškog lanca divljeg tipa SEQ ID NO:64 DNK koja kodira IgG4 konstantni region teškog lanca sa mutantnim S228P

SEQ ID NO:65: IgG4 konstantni region teškog lanca sa mutantnim S228P polipeptidom

SEQ ID NO:66: scFv klon ćerka 17N16m_d17N9 polipeptid cele dužine SEQ ID NO:67: scFv klon ćerka 17D20m_d21N11 polipeptid cele dužine SEQ ID NO:68: scFv klon ćerka 17D20m_d3521N11 polipeptid cele dužine SEQ ID NO:69: DNK koja kodira IgG2 konstantni region teškog lanca divljeg tipa SEQ ID NO:70: polipeptid IgG2 konstantni region teškog lanca divljeg tipa SEQ ID NO:71: 17N16m_d17N9 genska sekvenca lakog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57))

SEQ ID NO:72: 17N16m_d17N9 proteinska sekvenca lakog lanca (sa signalnim peptidom aa1-19)

SEQ ID NO:73: 17N16m_d17N9 IgG2 genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:74: 17N16m_d17N9 IgG2 proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:75: 17N16m_d17N9 IgG4 genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:76: 17N16m_d17N9 IgG4 proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:77: 17N16m_d17N9 IgG4 mutirana genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:78: 17N17m_d17N9 IgG4 mutirana proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:79: 17D20_3521N11 genska sekvenca lakog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:80: 17D20_3521N11 proteinska sekvenca lakog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:81: 17D20_3521N11 IgG2 genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:82: 17D20_3521N11 IgG2 proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:83: 17D20_3521N11 IgG4 genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:84: 17D20_3521N11 IgG4 proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:85: 17D20_3521N11 IgG4 mutirana genska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom kodiranim sa nt 1-57)

SEQ ID NO:86: 17D20_3521N11 IgG4 mutirana proteinska sekvenca teškog lanca (sa signalnim peptidom aa 1-19)

SEQ ID NO:87: scFv klon ćerka 17N16m_d17N9 DNK koja kodira polipeptid cele dužine (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:88: scFv klon ćerka 17D20m_d21N11 DNK koja kodira polipeptid cele dužine (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:89: scFv klon ćerka 17D20m_d3521N11 DNK koja kodira polipeptid cele dužine (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:90: konsenzusni teški lanac CDR-H3 od 17D20m i d3521N11 SEQ ID NO:91: konsenzusni laki lanac CDR-L1 od 17D20m i d3521N11 SEQ ID NO:92: konsenzusni laki lanac CDR-L1 od 17N16m i d17N9

SEQ ID NO:93: konsenzusni laki lanac CDR-L2 od 17D20m, d3521N11, 17N16m i d17N9

SEQ ID NO:94: konsenzusni laki lanac CDR-L3 od 17N16m i d17N9

DETALJNI OPIS

[0045] Predmetni pronalazak se odnosi na potpuno humana antitela koja se vezuju za humani MASP-2 i inhibiraju lektinom-posredovanu aktivaciju komplementa, dok ostavljaju komponentu imunog sistema klasičnog (C1q-zavisnog) puta intaktnom.

Humana anti-MASP-2 antitela su identifikovana skriningom biblioteke za prikazivanje na fagima, kao što je opisano u Primerima 2-9. Kao što je opisano u Primerima 10-12, identifikovana su visoko afinitetna anti-MASP-2 antitela sa sposobnošću da inhibiraju lektinom-posredovanu aktivaciju komplementa, kao što je pokazano i in vitro testovima, i in vivo. Fragmenti varijabilnog lakog i teškog lanca antitela su izolovani i u scFv formatu, i u IgG formatu cele dužine. Humana anti-MASP-2 antitela su korisna za inhibiciju ćelijske povrede povezane sa aktivacijom komplementa lektinom-posredovanim putem, dok ostavljaju komponentu imunog sistema klasičnog (C1q-zavisnog) puta intaktnom.

I. DEFINICIJE

[0046] Osim ako ovde nije posebno definisano, svi izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje bi im dali prosečni stručnjaci iz oblasti predmetnog pronalaska. Sledeće definicije su date u cilju da se obezbedi jasnoća u vezi izraza koji se upotrebljavaju u opisu i patentnim zahtevima za opisivanje predmetnog pronalaska.

[0047] Kada se ovde koristi, izraz "MASP-2-zavisna aktivacija komplementa" obuhvata MASP-2-zavisnu aktivaciju lektinskog puta, koja se događa pod fiziološkim uslovima (tj. u prisustvu of Ca<++>), što dovodi do formiranja C3 konvertaze lektinskog puta C4b2a i, posle akumulacije C3 proizvoda sečenja C3b, sukcesivno do C5 konvertaze C4b2a(C3b)n.

[0048] Kada se ovde koristi, izraz "alternativni put" se odnosi na aktivaciju komplementa koja je pokrenuta, na primer, zimosanom iz gljivičnih i kvaščevih ćelijskih zidova, lipopolisaharidom (LPS) iz Gram negativnih spoljašnjih membrana, i zečjih eritrocita, kao i mnogim čistim polisaharidima, zečjim eritrocitima, virusima, bakterijama, životinjskim tumorskim ćelijama, parazitima i oštećenim ćelijama, i za koje se tradicionalno smatra da potiču od spontanog proteolitičkog generisanja C3b od faktora komplementa C3.

[0049] Kada se ovde koristi, izraz "lektinski put" se odnosi na aktivaciju komplementa koja se događa putem specifičnog vezivanja serumskih i neserumskih proteina koji se vezuju za ugljene hidrate, uključujući manan-vezujući lektin (MBL), CL-11 i fikoline (H-fikolin, M-fikolin, ili L-fikolin).

[0050] Kada se ovde koristi, izraz "klasični put" se odnosi na aktivaciju komplementa koja je pokrenuta antitelom vezanim za stranu česticu i koja zahteva vezivanje prepoznatljivog molekula C1q.

[0051] Kada se ovde koristi, izraz "MASP-2 inhibitorno antitelo" se odnosi na bilo koje anti-MASP-2 antitelo, ili njegov MASP-2 vezujući fragment, koji se vezuje za ili direktno sadejstvuje sa MASP-2 i efektivno inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa. MASP-2 inhibitorna antitela koja su korisna u metodu prema pronalasku mogu smanjiti MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 20%, kao što je više od 30%, ili više od 40%, ili više od 50%, ili više od 60%, ili više od 70%, ili više od 80%, ili više od 90%, ili više od 95%.

[0052] Kada se ovde koristi, izraz "MASP-2 blokirajuće antitelo" se odnosi na MASP-2 inhibitorna antitela koja smanjuju MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 90%, kao što je više od 95%, ili više od 98% (tj. koja rezultuju MASP-2 aktivacijom komplementa od samo 10%, kao što je samo 9%, ili samo 8%, ili samo 7%, ili samo 6%, kao što je samo 5% ili manje, ili samo 4%, ili samo 4%, ili samo 3% ili samo 2% ili samo 1%).

[0053] Izrazi "antitelo" i "imunoglobulin" se ovde upotrebljavaju jedan umesto drugog. Ove izraze će dobro razumeti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti i oni se odnose na protein koji se sastoji od jednog ili više polipeptida koji se specifično vezuju za antigen. Jedan oblik antitela sačinjava osnovnu strukturnu jedinicu antitela. Ovaj oblik je tetramer i sastoji se od dva identična para lanaca antitela, pri čemu svaki par ima jedan laki i jedan teški lanac. U svakom paru, varijabilni regioni lakog i teškog lanca su zajedno odgovorni za vezivanje za antigen, a konstantni regioni su odgovorni za efektorske funkcije antitela.

[0054] Kada se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata antitela i njihove fragmente antitela koji potiču od bilo kog sisara koji proizvodi antitela (npr. miša, pacova, zeca, i primata, uključujući čoveka), ili od hibridoma, selekcije faga, rekombinantne ekspresije ili transgenskih životinja (ili drugih metoda za proizvodnju antitela ili fragmenata antitela), koji se specifično vezuju za MASP-2 polipeptide ili njihove delove. Nije namera da izraz "antitelo" bude ograničen u pogledu izvora antitela ili načina na koji je ono napravljeno (npr. pomoću hibridoma, selekcije faga, rekombinantne ekspresije, transgenske životinje, peptidne sinteze itd). Ilustrativna antitela obuhvataju poliklonska, monoklonska i rekombinantna antitela; multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela); humanizovana antitela; mišja antitela; himerična, mišje-humana, mišje-primatska, primatska-humana monoklonska antitela; i anti-idiotipska antitela, i mogu biti bilo koji intaktni molekul ili njegov fragment. Kada se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata ne samo intaktno poliklonsko ili monoklonsko antitelo, već takođe i njegove fragmente (kao što su dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), jednolančane (ScFv), njegove sintetičke varijante, prirodne varijante, fuzione proteine koji sadrže deo antitela sa antigen-vezujućim fragmentom željene specifičnosti, humanizovana antitela, himerična antitela, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koja sadrži antigen-vezujuće mesto ili fragment (mesto koje prepoznaje epitop) željene specifičnosti.

[0055] Kada se ovde koristi, izraz "antigen-vezujući fragment" se odnosi na polipeptidni fragment koji sadrži najmanje jedan CDR imunoglobulinskog teškog i/ili lakog lanca koji se vezuje za humani MASP-2. U tom pogledu, antigen-vezujući fragment ovde opisanih antitela može sadržati 1, 2, 3, 4, 5, ili svih 6 CDR-ova VH i VL sekvenci koje su ovde navedene od antitela koja vezuju MASP-2. Antigenvezujući fragment ovde opisanih MASP-2-specifičnih antitela je sposoban za vezivanje za MASP-2. U izvesnim primerima izvođenja, antigen-vezujući fragment ili antitelo koje sadrži antigen-vezujući fragment, posreduje inhibiciju MASP-2 zavisne aktivacije komplementa.

[0056] Kada se ovde koristi, izraz "anti-MASP-2 monoklonska antitela" se odnosi na homogenu populaciju antitela, pri čemu je monoklonsko antitelo sastavljeno od aminokiselina koje su uključene u selekciju vezivanja epitopa na MASP-2. Anti-MASP-2 monoklonska antitela su visoko specifična za MASP-2 ciljni antigen. Izraz "monoklonsko antitelo" ne obuhvata samo intaktna monoklonska antitela i monoklonska antitela cele dužine, već takođe i njihove fragmente (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), jednolančana (ScFv), njihove varijante, fuzione proteine koji sadrže antigen-vezujući deo, humanizovana monoklonska antitela, himerična monoklonska antitela, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koja sadrži antigen-vezujući fragment (mesto prepoznavanja epitopa) željene specifičnosti i sposobnosti za vezivanje za epitop.

[0057] Kada se ovde koristi, atribut "monoklonski" označava karakter antitela, kao da je dobijeno od u suštini homogene populacije antitela, i nije namenjen da bude ograničavajući u pogledu izvora antitela ili načina na koji je dobijeno (npr. pomoću hibridoma, selekcije faga, rekombinantne ekspresije, transgenskih životinja itd.). Izraz obuhvata cele imunoglobuline, kao i fragmente itd. opisane gore pod definicijom "antitelo". Monoklonska antitela se mogu dobiti korišćenjem bilo koje tehnike koja obezbeđuje kontinualnu proizvodnju molekula antitela pomoću ćelijskih linija u kulturi, kao što je hibridoma metod koji su opisali Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, ili ona mogu biti dobijena rekombinantnim DNK metodama (vidi, npr. US patent br.4,816,567 nosioca Cabilly). Monoklonska antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteke faga sa antitelima uz korišćenje tehnika koje su opisali Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, i Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. Takva antitela mogu biti bilo koje imunoglobulinske klase, uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i bilo koju njihovu potklasu.

[0058] Poznati imunoglobulinski polipeptidi obuhvataju kapa i lambda lake lance i alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon i mu teške lance ili ekvivalente u drugim vrstama. Imunoglobulinski "laki lanci" cele dužine (od oko 25 kDa ili oko 214 aminokiselina) sadrže varijabilni region od oko 110 aminokiselina na NH2-terminusu i kapa ili lambda konstantni region na COOH-terminusu. Slično tome, imunoglobulinski "teški lanci" cele dužine (od oko 50 kDa ili oko 446 aminokiselina) sadrže varijabilni region (od oko 116 aminokiselina) i jedan od gore navedenih konstantnih regiona teškog lanca, npr. gama (od oko 330 aminokiselina).

[0059] Osnovna jedinica četvorolančanog antitela je heterotetramerni glikoprotein koji se sastoji od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom koji se zove J lanac, i zato sadrži 10 antigen-vezujućih mesta. Izlučena IgA antitela se mogu polimerizovati da bi formirala polivalentne strukture koje sadrže 2-5 osnovnih 4-lančanih jedinica zajedno sa J lancem. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više puta pomoću jedne ili više disulfidnih veza, u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute međulančane disulfidne mostove. Međusobno uparivanje VH i VL formira jedno antigen-vezujuće mesto.

[0060] Svaki H lanac ima na N-terminusu, varijabilni domen (VH), koji je praćen sa tri konstantna domena (CH) za svaki od α i γ lanaca, i četiri CH domena (CH) za μ i ε izotipove.

[0061] Svaki L lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VL), praćen konstantnim domenom (CL) na svom drugom kraju. VL je poravnat sa VH i CL je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (CH1). L lanac bilo koje vrste kičmenjaka se može svrstati u jedan od dva jasno različita tipa, koji se nazivaju kapa (κ) i lambda (λ), bazirano na aminokiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena (CL).

[0062] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini se mogu svrstati u različite klase ili izotipove. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene sa alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) i mu (μ), respektivno. γ i α klase se dalje dele na potklase na osnovu malih razlika u CH sekvenci i funkciji, na primer, ljudi izražavaju sledeće potklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.

[0063] Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, vidi, npr. Basic and Clinical Immunology, 8. izdanje, Daniel P. Stites, Abba I. Terr i Tristram G. Parslow (uredn.); Appleton i Lange, Norwalk, Conn., 1994, strana 71 i poglavlje 6.

[0064] Izraz "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se izvesni segmenti V domena ekstenzivno razlikuju po sekvenci među antitelima. V domen posreduje vezivanje antigena i definiše specifičnost posebnog antitela za njegov posebni antigen.

Međutim, varijabilnost nije ravnomerno distribuirana među spektrom od 110 aminokiselinskih varijabilnih domena. Umesto toga, V regioni se sastoje od relativno invarijantnih delova koji se zovu regioni okvira (engl. framework regions, skr. FRs) od 15-30 aminokiselina razdvojenih kraćim regionima ekstremne varijabilnosti zvanih "hipervarijabilni regioni", od kojih svaki ima dužinu od 9-12 aminokiselina. Svaki od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FRs, koji uglavnom usvajaju konfiguraciju beta-pločice, povezane sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima formiraju deo strukture npločice. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FRs i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (vidi Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali ispoljavaju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC).

[0065] Kada se ovde koristi, izraz "hipervarijabilni region" se odnosi na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region generalno sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (tj. od oko ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca, i od oko 31-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kada se vrši numeracija u skladu sa Kabat sistemom numeracije, kao što je opisano u Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)); i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (tj. ostatke 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca, i 26-32 (HI), 52-56 (H2) i 95-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kada se vrši numeracija u skladu sa Chothia sistemom numeracije, kao što je opisano u Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje"/CDR (npr. ostatke 27-38 (L1), 56-65 (L2) i 105-120 (L3) u VL, i 27-38 (HI), 56-65 (H2), i 105-120 (H3) u VH kada se vrši numeracija u skladu sa IMGT sistemom numeracije, kao što je opisano u Lefranc, J.P., et al., Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)).

[0066] Kada se ovde koristi, izraz "fragment antitela" se odnosi na deo koji je dobijen ili potiče od antiMASP-2 antitela cele dužine, koji generalno sadrži njegov antigenvezujući ili varijabilni region. Ilustrativni primeri fragmenata antitela obuhvataju Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2 i Fv fragmente, scFv fragmente, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela, bispecifična i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0067] Kada treba da se koriste bispecifična antitela, ona mogu biti uobičajena bispecifična antitela, koja se mogu proizvesti na različite načine (Holliger, P. i Winter G. Current Opinion Biotechnol.4, 446-449 (1993)), npr. pripremljena hemijski ili od hibridnih hibridoma, ili mogu biti bilo koji gore navedeni fragmenti bispecifičnih antitela.

[0068] Kada se ovde koristi, "jednolančani Fv" ili "scFv" fragment antitela sadrži VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni samo u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena, koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Vidi Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore uredn., Springer-Verlag, New York, str.269-315 (1994). "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera domena varijabilnog regiona jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. Od savijanja ova dva domena potiče šest hipervarijabilnih petlji (po tri petlje za H i L lanac) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i prenose antigen-vezujuću specifičnost na antitelo. Međutim, čak i samo jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR-a specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i vezuje antigen, mada sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

[0069] Kada se ovde koristi, izraz "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost antitela da se pretežno vezuje za poseban analit koji je prisutan u homogenoj smeši različitih analita. U izvesnim primerima izvođenja, interakcija specifičnog vezivanja će vršiti diskriminaciju između poželjnih i nepoželjnih analita u uzorku, u nekim primerima izvođenja više od oko 10 do 100-struku ili veću (npr. više od oko 1000- ili 10,000-struku). U izvesnim primerima izvođenja, afinitet između agensa za hvatanje i analita kada se oni specifično vezuju u kompleks agensa za hvatanje/analita je karakterisan sa KD (konstantom disocijacije) manjom od oko 100 nM, ili manjom od oko 50 nM, ili manjom od oko 25 nM, ili manjom od oko 10 nM, ili manjom od oko 5 nM, ili manjom od oko 1 nM.

[0070] Kada se ovde koristi, izraz "varijanta" anti-MASP-2 antitela se odnosi na molekul koji se razlikuje po aminokiselinskoj sekvenci od aminokiselinske sekvence "roditeljskog" ili referentnog antitela po adiciji, deleciji, i/ili supstituciji jednog ili više od aminokiselinskih ostataka u sekvenci roditeljskog antitela. U jednom primeru izvođenja, varijanta anti-MASP-2 antitela se odnosi na molekul koji sadrži varijabilne regione koji su identični sa roditeljskim varijabilnim domenima, izuzev po kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 89 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca, i/ili kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija sa pomenutim CDR regionima varijabilnog regiona lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske supstitucije su konzervativne modifikacije sekvence.

[0071] Kada se ovde koristi, izraz "roditeljsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je kodirano aminokiselinskom sekvencom koja se koristi za dobijanje varijante.

Prvenstveno, roditeljsko antitelo ima humani region okvira i, ako su prisutni, ima konstantni region, odnosno regione humanog antitela. Na primer, roditeljsko antitelo može biti humanizovano ili potpuno humano antitelo.

[0072] Kada se ovde koristi, izraz "izolovano antitelo" se odnosi na antitelo koje je identifikovano i izdvojeno i/ili rekuperisano iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi remetili dijagnostičke ili terapeutske primene antitela, i mogu obuhvatati enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske solute. U poželjnim primerima izvođenja, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95% tež. antitela kao što se određuje Lowry metodom, a najpoželjnije više od 99% tež.; (2) do stepena dovoljnog za dobijanje najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem sekvencera sa obrtnom čašom; ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima uz korišćenje Komasi plave, ili prvenstveo, srebrne boje. Izolovano antitelo sadrži antitelo in situ u okviru rekombinantnih ćelija, pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično se, međutim, izolovano antitelo priprema pomoću najmanje jednog koraka prečišćavanja.

[0073] Kada se ovde koristi, izraz "epitop" se odnosi na deo antigena za koji se monoklonsko antitelo specifično vezuje. Epitopske determinante se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Specifičnije, izraz "MASP-2 epitop", kada se ovde koristi se odnosi na deo odgovarajućeg polipeptida za koji se antitelo imunospecifično vezuje, kao što se određuje pomoću bilo kog metoda dobro poznatog u odgovarajućoj oblasti, na primer, imunotestovima. Antigeni epitopi ne moraju nužno biti imunogeni. Takvi epitopi mogu biti linearni po prirodi ili mogu biti diskontinualni epitop. Shodno tome, kada se ovde koristi, izraz "konformacioni epitop" se odnosi na diskontinualni epitop formiran prostornim odnosom između aminokiselina antigena drugačijih od neprekidnog niza aminokiselina.

[0074] Kada se ovde koristi, izraz "manan-vezujući lektin" ("MBL") je ekvivalentan sa manan-vezujućim proteinom ("MBP").

[0075] Kada se ovde koristi, "kompleks koji napada membrane" ("MAC") se odnosi na kompleks terminalnih pet komponenata komplementa (C5-C9) koji se umeće i kida membrane. Takođe se označava sa C5b-9.

[0076] Kada se ovde koristi, "subjekt" obuhvata sve sisare, uključujući, bez ograničenja, ljude, nehumane primate, pse, mačke, konje, ovce, koze, krave, zečeve, svinje i glodare.

[0077] Kada se ovde koriste, aminokiselinski ostaci su skraćeno označeni kao što sledi: alanin (Ala;A), asparagin (Asn;N), asparaginska kiselina (Asp;D), arginin (Arg;R), cistein (Cys;C), glutaminska kiselina (Glu;E), glutamin (Gln;Q), glicin (Gly;G), histidin (His;H), izoleucin (Ile;I), leucin (Leu;L), lizin (Lys;K), metionin (Met;M), fenilalanin (Phe;F), prolin (Pro;P), serin (Ser;S), treonin (Thr;T), triptofan (Trp;W), tirozin (Tyr;Y), i valin (Val;V).

[0078] U najširem smislu, prirodne aminokiseline se mogu podeliti na grupe na osnovu hemijskih karakteristika bočnog lanca odgovarajuće aminokiseline. Pod "hidrofobnom" aminokiselinom se podrazumeva Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys ili Pro. Pod "hidrofilnom" aminokiselinom se podrazumeva Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg ili His. Ovo grupisanje aminokiselina se može dalje dodatno izvršiti kao što sledi. Pod "nenaelektrisanom hidrofilnom" aminokiselinom se podrazumeva Ser, Thr, Asn ili Gln. Pod "kiselom" aminokiselinom se podrazumeva Glu ili Asp. Pod "baznom" aminokiselinom se podrazumeva Lys, Arg ili His.

[0079] Kada se ovde koristi, izraz "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ilustrovan supstitucijom među aminokiselinama u okviru svake od sledećih grupa: (1) glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin, (2) fenilalanin, tirozin, i triptofan, (3) serin i treonin, (4) aspartat i glutamat, (5) glutamin i asparagin, i (6) lizin, arginin i histidin.

[0080] Kada se ovde koristi, "izolovani molekul nukleinske kiseline" je molekul nukleinske kiseline (npr. polinukleotid) koji nije integrisan u genomsku DNK organizma. Na primer, DNK molekul koji kodira faktor rasta koji je bio izdvojen iz genomske DNK ćelije je izolovani DNK molekul. Sledeći primer izolovanog molekula nukleinske kiseline je hemijski sintetizovani molekul nukleinske kiseline koji nije integrisan u genom organizma. Molekul nukleinske kiseline koji je bio izolovan iz specifične vrste je manji od kompletnog DNK molekula hromozoma te vrste.

[0081] Kada se ovde koristi, "konstrukt molekula nukleinske kiseline" je molekul nukleinske kiseline, bilo jednolančani ili dvolančani, koji je bio modifikovan ljudskom intervencijom da bi sadržao segmente nukleinske kiseline kombinovane i postavljene u rasporedu koji ne postoji u prirodi.

[0082] Kada se ovde koristi, "ekspresioni vektor" je molekul nukleinske kiseline koji kodira gen koji se izražava u ćeliji domaćinu. Tipično, ekspresioni vektor sadrži transkripcioni promoter, gen, i transkripcioni terminator. Genska ekspresija se obično stavlja pod kontrolu promotera, i takav gen se navodi kao "operativno povezan sa" promoterom. Slično tome, regulatorni element i promoter jezgra su operativno povezani ako regulatorni element moduliše aktivnost promotera jezgra.

[0083] Kada se ovde koriste, smatra se da izrazi "približno" ili "oko" u vezi sa nekim brojem generalno obuhvataju brojeve koji spadaju u opseg od 5% u bilo kom smeru (više od ili manje od) broja, osim ako nije drugačije navedeno ili ako nije drugačije evidentno iz konteksta (izuzev tamo gde bi takav broj prešao 100% moguće vrednosti). Tamo gde su navedeni opsezi, krajnje tačke su uključene u opseg, osim ako nije drugačije navedeno ili ako nije drugačije evidentno iz konteksta.

[0084] Kada se ovde upotrebljavaju oblici jednine "neki", "jedan" i "taj" oni obuhvataju aspekte množine, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Shodno tome, na primer, navođenje "jedne ćelije" obuhvata samo jednu ćeliju, kao i dve ili više ćelija; navođenje "jednog agensa" obuhvata jedan agens, kao i dva ili više agenasa; navođenje "jednog antitela" obuhvata mnoštvo takvih antitela i navođenje "regiona okvira" obuhvata navođenje jednog ili više regiona okvira i njihovih ekvivalenata koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, i tako dalje.

[0085] Svaki primer izvođenja u ovom opisu treba primeniti mutatis mutandis na svaki drugi primer izvođenja, osim ako nije eksplicitno navedeno drugačije.

[0086] Standardne tehnike se mogu koristiti za rekombinaciju DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se mogu izvršiti u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što se obično izvodi u odgovarajućoj oblasti ili je ovde opisano. Ove i srodne tehnike i procedure se mogu generalno izvesti uobičajenim metodama dobro poznatim u odgovarajućoj oblasti i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmotrene u predmetnom opisu. Vidi npr. Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (uredio: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); ili druge relevantne "Current Protocol" publikacije i druge slične reference. Osim ako nisu obezbeđene specifične definicije, nomenklatura koja je korišćena u vezi sa njima, i laboratorijske procedure i tehnike molekularne biologije, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i tamo se uobičajeno koriste. Standardne tehnike mogu biti korišćene za rekombinantnu tehnologiju, molekularnu biologiju, mikrobiologiju, hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, i primenu, i lečenje pacijenata.

[0087] Smatra se da bilo koji primer izvođenja koji je razmotren u ovom opisu može biti primenjen u pogledu bilo kog metoda, kita, reagensa, ili kompozicije prema pronalasku, i obratno. Pored toga, kompozicije prema pronalasku se mogu koristiti za ostvarivanje metoda prema pronalasku.

II. Rezime

[0088] Lektini (MBL, M-fikolin, H-fikolin, L-fikolin i CL-11) su specifični prepoznatljivi molekuli koji pokreću urođeni sistem komplementa, a sistem sadrži lektinski inicijacijski put i pridruženu amplifikacionu petlju terminalnog puta koja pojačava lektinom-iniciranu aktivaciju terminalnih efektorskih molekula komplementa. C1q je specifični prepoznatljivi molekul koji pokreće stečeni sistem komplementa, a taj sistem sadrži klasični inicijacijski put i pridruženu amplifikacionu petlju terminalnog puta koja pojačava C1q-iniciranu aktivaciju terminalnih efektorskih molekula komplementa. Mi nazivamo ova dva glavna sistema aktivacije komplementa lektinzavisnim sistemom komplementa i C1q-zavisnim sistemom komplementa, respektivno.

[0089] Pored njegove suštinske uloge u imunoj odbrani, sistem komplementa doprinosi oštećenju tkiva u mnogim kliničkim stanjima. Shodno tome, postoji nasušna potreba da se razviju terapeutski efektivni inhibitori komplementa za sprečavanje ovih štetnih efekata.

[0090] Kao što je opisano u US patentima br.7,919,094, US 2011/0091450 i US2011/0311549, od kojih je svaki prenet na Omeros Corporation, podnosioca predmetne prijave, putem korišćenja MASP-2 -/- mišjeg modela je bilo utvrđeno da je moguće inhibirati lektinom posredovani MASP-2 put, uz ostavljanje klasičnog puta intaktnim. Zahvaljujući saznanju da je moguće inhibirati lektinom posredovani MASP-2 put, uz ostavljanje klasičnog puta intaktnim došlo se do shvatanja da bi bilo izuzetno poželjno da se specifično inhibira samo sistem aktivacije komplementa koji izaziva specifičnu patologiju, bez kompletnog isključivanja sposobnosti imune odbrane komplementom. Na primer, u bolesnim stanjima u kojima je aktivacija komplementa dominantno posredovana lektin-zavisnim sistemom komplementa, bilo bi podesno da se specifično inhibira samo ovaj sistem. Ovo bi ostavilo C1q-zavisni sistem aktivacije komplementa intaktnim da bi vršio obradu imunih kompleksa i da bi pomogao u odbrani domaćina protiv infekcije.

[0091] Poželjna proteinska komponenta za ciljanje u razvoju terapeutskih agenasa za specifično inhibiranje lektin-zavisnog sistema komplementa je MASP-2. Od svih poznatih proteinskih komponenata lektin-zavisnog sistema komplementa (MBL, H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin, MASP-2, C2-C9, Faktor B, Faktor D, i properdin), samo MASP-2 je jedinstven u lektin-zavisnom sistemu komplementa i potreban je sistemu da bi funkcionisao. Lektini (MBL, H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i CL-11) su takođe jedinstvene komponente u lektin-zavisnom sistemu komplementa. Međutim, gubitak bilo koje od lektinskih komponenata ne bi nužno inhibirao aktivaciju sistema zbog lektinske redundancije. Bilo bi neophodno da se inhibira svih pet lektina da bi se garantovala inhibicija aktivacije lektin-zavisnog sistema komplementa. Pored toga, pošto je poznato da MBL i fikolini takođe imaju opsoničnu aktivnost nezavisnu od komplementa, inhibicija lektinske funkcije bi rezultovala gubitkom ovog korisnog odbrambenog mehanizma domaćina protiv infekcije. Nasuprot tome, ova komplement-nezavisna lektinska opsonična aktivnost bi ostala intaktna ako bi MASP-2 bio inhibitorni cilj. Dodatna korist od MASP-2 kao terapeutskog cilja za inhibiranje aktivacije lektin-zavisnog sistema komplementa je ta što je koncentracija MASP-2 u plazmi među najnižim među proteinima komplementa (≈ 500 ng/ml); zbog toga su odgovarajuće niske koncentracije visoko-afinitetnih inhibitora MASP-2 dovoljne za ostvarivanje potpune inhibicije, kao što je pokazano ovde u Primerima.

[0092] U skladu sa gore navedenim, kao što je ovde opisano, predmetnim pronalaskom su realizovana monoklonska potpuno humana anti-MASP-2 antitela koja se vezuju za humani MASP-2 sa visokim afinitetom i sposobna su da inhibiraju aktivaciju lektinom-posredovanog puta komplementa.

III. MASP-2 INHIBITORNA ANTITELA

[0093] Prema jednom aspektu, pronalaskom je realizovano monoklonsko potpuno humano anti-MASP-2 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se specifično vezuje za humani MASP-2 i inhibira ili blokira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa. MASP-2 inhibitorna antitela mogu efektivno inhibirati ili efektivno blokirati aktivaciju MASP-2-zavisnog sistema komplementa inhibicijom ili blokiranjem biološke funkcije MASP-2. Na primer, inhibitorno antitelo može efektivno inhibirati ili blokirati interakcije MASP-2 protein-sa-proteinom, ometati MASP-2 dimerizaciju ili povezivanje, blokirati Ca<2+>vezivanje, ili ometati aktivno mesto MASP-2 serin proteaze.

MASP-2 epitopi

[0094] Pronalaskom su realizovana potpuno humana antitela koja se specifično vezuju za humani MASP-2. MASP-2 polipeptid odlikuje molekularna struktura koja je slična MASP-1, MASP-3, i C1r i C1s, proteazama C1 sistema komplementa. cDNK molekul naveden u SEQ ID NO:1 kodira reprezentativni primer MASP-2 (koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:2) i obezbeđuje humani MASP-2 polipeptid sa lider sekvencom (aa 1-15) koja se seče posle izlučivanja, što rezultuje zrelim oblikom humanog MASP-2 (SEQ ID NO:3). Kao što je prikazano na SLICI 1A, humani MASP 2 gen sadrži dvanaest egzona. Humana MASP-2 cDNK je kodirana egzonima B, C, D, F, G, H, I, J, K i L. cDNK molekul naveden u SEQ ID NO:4 kodira pacovski MASP-2 (koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:5) i obezbeđuje pacovski MASP-2 polipeptid sa lider sekvencom koja se seče posle izlučivanja, što rezultuje zrelim oblikom pacovskog MASP-2 (SEQ ID NO:6).

[0095] Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da sekvence navedene u SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:4 predstavljaju pojedinačne alele humanog i pacovskog MASP-2, respektivno, i da se očekuje da se pojave alelske varijacije i alternativno spajanje. Alelske varijante nukleotidnih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:4, uključujući one koje sadrže tihe mutacije i one u kojima mutacije rezultuju promenama aminokiselinske sekvence se nalaze u okviru predmetnog pronalaska. Alelske varijante MASP-2 sekvence se mogu klonirati testiranjem cDNK ili genomskih biblioteka od različitih pojedinaca prema standardnim procedurama.

[0096] Domeni humanog MASP-2 proteina (SEQ ID NO:3) su prikazani na SLICI 1B i u TABELI 1 dole, i obuhvataju N-terminalni C1r/C1s/morskog ježa VEGF/koštani morfogeni proteinski (CUBI) domen, domen sličan epidermalnom faktoru rasta, drugi CUB domen (CUBII), kao i tandem domena komplementa kontrole proteina CCP1 i CCP2, i domen serin proteaze. Alternativno spajanje MASP-2 gena rezultuje sa MAp19. MAp19 je neenzimski protein koji sadrži N-terminalni CUB1-EGF region MASP-2 sa četiri dodatna ostatka (EQSL).

[0097] Pokazano je da se nekoliko proteina vezuje ili da sadejstvuje sa MASP-2 putem interakcija protein-sa-proteinom. Na primer, poznato je da se MASP-2 vezuje za i da formira Ca<2+>zavisne komplekse sa lektinskim proteinima MBL, H-fikolinom i L-fikolinom. Pokazano je da svaki kompleks MASP-2/lektin aktivira komplement putem MASP-2-zavisnog sečenja proteina C4 i C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem.

262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med.176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol.168:3502-3506, 2002). Studije su pokazale da su CUB1-EGF domeni MASP-2 presudni za povezivanje MASP-2 sa MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol.166:5068, 2001). Takođe je pokazano da CUB1EGFCUBII domeni posreduju dimerizaciju MASP-2, koja je potrebna za formiranje aktivnog MBL kompleksa (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem.275:30962-30969, 2000). Zbog toga se mogu identifikovati MASP-2 inhibitorna antitela koja se vezuju za ili remete MASP-2 ciljne regione za koje je poznato da su važni za MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa.

TABELA 1: MASP-2 polipeptidni domeni

[0098] U jednom primeru izvođenja, anti-MASP-2 inhibitorna antitela prema pronalasku se vezuju za deo humanog MASP-2 proteina cele dužine (SEQ ID NO:3), kao što je CUBI, EGF, CUBII, CCPI, CCPII, ili SP domen MASP-2. U nekim primerima izvođenja, anti-MASP-2 inhibitorna antitela prema pronalasku se vezuju za epitop u CCP1 domenu (SEQ ID NO:13 (aa 278-347 SEQ ID NO:3)). Na primer, identifikovana su anti-MASP-2 antitela (npr. OMS646) koja se vezuju samo za MASP-2 fragmente koji sadrže CCP1 domen i inhibiraju MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa, kao što je opisano u Primeru 9.

Afinitet vezivanja MASP-2 inhibitornih antitela

[0099] Anti-MASP-2 inhibitorna antitela se specifično vezuju za humani MASP-2 (naveden kao SEQ ID NO:3, kodiran sa SEQ ID NO:1), sa afinitetom najmanje deset puta većim nego za druge antigene u sistemu komplementa. U nekim primerima izvođenja, MASP-2 inhibitorna antitela se specifično vezuju za humani MASP-2 sa afinitetom vezivanja najmanje 100 puta većim nego za druge antigene u sistemu komplementa.

[0100] U nekim primerima izvođenja, MASP-2 inhibitorna antitela se specifično vezuju za humani MASP-2 sa KD (konstantom disocijacije) manjom od oko 100 nM, ili manjom od oko 50 nM, ili manjom od oko 25 nM, ili manjom od oko 10 nM, ili manjom od oko 5 nM, ili manjom ili jednakom oko 1 nM, ili manjom ili jednakom 0.1nM. Afinitet vezivanja MASP-2 inhibitornih antitela se može odrediti korišćenjem podesnog testa vezivanja poznatog iz odgovarajuće oblasti, kao što je ELISA test, kao što je ovde opisano u Primerima 3-5.

Potencija MASP-2 inhibitornih antitela

[0101] U jednom primeru izvođenja, MASP-2 inhibitorno antitelo je dovoljno potentno za inhibiranje MASP-2 zavisne aktivacije komplementa sa IC50 ≤ 30 nM, a prvenstveno manjim ili oko 20 nM, ili manjim od oko 10 nM ili manjim od oko 5 nM, ili manjim ili jednakim oko 3nM, ili manjim ili jednakim oko 1 nM kada se meri u 1% seruma.

[0102] U jednom primeru izvođenja, MASP-2 inhibitorno antitelo je dovoljno potentno da inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa sa IC50 ≤ 30 nM, a prvenstveno manjim ili oko 20 nM, ili manjim od oko 10 nM ili manjim od oko 5 nM, ili manjim ili jednakim oko 3nM, ili manjim ili jednakim oko 1 nM, kada se meri u 90% seruma.

[0103] Inhibicija MASP-2-zavisne aktivacije komplementa je karakterisana najmanje jednom od sledećih promena komponente sistema komplementa koja se pojavljuje kao rezultat administracije MASP-2 inhibitornog antitela: inhibicija generisanja ili produkcije proizvoda aktivacije MASP-2-zavisnog sistema komplementa C4a, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC) (izmereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 2 u US patentu br.7,919,094), kao i njihovih proizvoda kataboličke degradacije (npr.

C3desArg), redukcija C4 sečenja i C4b taloženja (mereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 5) i njegovih sledstvenih proizvoda katalitičke degradacije (npr. C4bc ili C4d), ili redukcija C3 sečenja i C3b taloženja (mereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 5), ili njegovih sledstvenih proizvoda katalitičke degradacije (npr. C3bc, C3d, itd).

[0104] U nekim primerima izvođenja, MASP-2 inhibitorna antitela prema pronalasku su sposobna da inhibiraju C3 taloženje u celom serumu na manje od 80%, kao što je manje od 70%, kao što je manje od 60%, kao što je manje od 50%, kao što je manje od 40%, kao što je manje od 30%, kao što je manje od 20%, kao što je manje od 15%, kao što je manje od 10% od kontrolnog C3 taloženja.

[0105] U nekim primerima izvođenja, MASP-2 inhibitorna antitela prema pronalasku su sposobna da inhibiraju C4 taloženje u celom serumu na manje od 80%, kao što je manje od 70%, kao što je manje od 60%, kao što je manje od 50%, kao što je manje od 40%, kao što je manje od 30%, kao što je manje od 20%, kao što je manje od 15%, kao što je manje od 10% od kontrolnog C4 taloženja.

[0106] U nekim primerima izvođenja, anti-MASP-2 inhibitorna antitela selektivno inhibiraju MASP-2 aktivaciju komplementa (tj. vezuju se za MASP-2 sa najmanje 100-struko ili većim afinitetom nego za C1r ili C1s), ostavljajući C1q-zavisnu aktivaciju sistema komplementa funkcionalno intaktnom (tj. zadržano je najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95%, ili najmanje 98%, ili 100% aktivnosti klasičnog puta).

[0107] U nekim primerima izvođenja, predmetna anti-MASP-2 inhibitorna antitela imaju sledeće karakteristike: (a) visoki afinitet za humani MASP-2 (npr. KD od 10 nM ili manju, a prvenstveno KD od 1nM ili manju), i (b) inhibiraju MASP-2 zavisnu aktivnost komplementa u 90% humanog seruma sa IC50 od 30 nM ili manjim, a prvenstveno sa IC50 od 10nM ili manjim).

[0108] Kao što je opisano u Primerima 2-12, identifikovana su potpuno humana antitela koja se vezuju sa visokim afinitetom za MASP-2 i inhibiraju lektinomposredovanu aktivaciju komplementa, dok ostavljaju komponentu klasičnog (C1qzavisnog) puta imunog sistema intaktnom. Fragmenti varijabilnog lakog i teškog lanca antitela su sekvencirani, izolovani i analizirani i u scFv formatu, i u IgG formatu cele dužine. SLIKA 5A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci sedam scFv anti-MASP-2 klonova za koje je bilo identifikovano da imaju visoki afinitet vezivanja sa MASP-2 i sposobnost da inhibiraju MASP-2 zavisnu aktivnost. SLIKA 5B je poravnanje aminokiselinskih sekvenci četiri scFv klonova majki 17D20, 17N16, 18L16 i 4D9, koje pokazuje regione okvira i CDR regione. scFv klonovi majke 17D20 i 17N16 su bili podvrgnuti afinitetnom sazrevanju, što je dovelo do generisanja klonova ćerki sa većim afinitetom i povećanom potencijom u poređenju sa klonovima majkama, kao što je opisano u Primerima 6 i 7. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca (VH) (aa 1-120) i varijabilnih regiona lakog lanca (VL) (aa 148-250) scFv klonova su prikazani na SLIKAMA 5A i 5B, a rezultujućih klonova ćerki su dati dole u TABELI 2.

[0109] Pozicije koje se mogu supstituisati u humanom anti-MASP-2 inhibitornom antitelu, kao i izbor aminokiselina koje mogu biti supstituisane na ovim pozicijama su otkrivene poravnanjem aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca gore razmotrenih antiMASP-2 inhibitornih antitela, i određivanjem koje aminokiseline se pojavljuju na kojim pozicijama tih antitela. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja su poravnate aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca sa SLIKA 5A i 5B i određen je identitet aminokiselina na svakoj poziciji ilustrativnih antitela. Kao što je ilustrovano na SLIKAMA 5A i 5B (koje ilustruju aminokiseline koje su prisutne na svakoj poziciji teških i lakih lanaca ilustrativnih MASP-2 inhibitornih antitela), lako je identifikovano nekoliko pozicija koje se mogu supstituisati, kao i aminokiselinski ostaci koji mogu biti supstituisani na tim pozicijama. U sledećem ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselinske sekvence lakih lanaca majki i ćerki klonova su poravnate i određen je identitet aminokiselina na svakoj poziciji ilustrativnih antitela da bi se odredile pozicije koje se mogu supstituisati, kao i aminokiselinski ostaci koji mogu biti supstituisani na ovim pozicijama.

TABELA 2: Sekvence reprezentativnih anti-MASP-2 antitela

[0110] U izvesnim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan), sa onim od bilo koje sekvence varijabilnog domena teškog lanca navedenim u TABELI 2.

[0111] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17D20 (VH), navedenim kao SEQ ID NO:18. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:18.

[0112] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96% identičan, najmanje oko 97% identičan, najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17D20_cd35VH2N11 (VH), navedenim kao SEQ ID NO:20. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:20.

[0113] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17N16 (VH), navedenim kao SEQ ID NO:21. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:21.

[0114] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan), sa onim bilo koje sekvence varijabilnog domena lakog lanca navedenim u TABELI 2.

[0115] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17D20 (VL), navedenim kao SEQ ID NO:22. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima laki lanac koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:22.

[0116] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17D20_35VH-21N11VL (VL), navedenim kao SEQ ID NO:24. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima laki lanac koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:24.

[0117] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17N16 (VL), navedenim kao SEQ ID NO:25. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima laki lanac koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:25.

[0118] U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini identičan (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identičan, ili najmanje oko 97% identičan, ili najmanje oko 98% identičan, ili najmanje 99% identičan) sa 17N16_17N9 (VL), navedenim kao SEQ ID NO:27. U nekim primerima izvođenja, predmetno humano anti-MASP-2 monoklonsko inhibitorno antitelo ima laki lanac koji sadrži, ili se sastoji od SEQ ID NO:27.

[0119] U nekim primerima izvođenja, anti-MASP-2 antitela sadrže teški ili laki lanac koji je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se hibridizuje pod strogo kontrolisanim uslovima u nukleotidnu sekvencu koja kodira teški ili laki lanac, kao što je navedeno u TABELI 2. Strogo kontrolisani uslovi uključuju inkubaciju na 50°C ili više u 0.1xSSC (15 mM slani rastvor/0.15mM natrijum citrat).

[0120] U nekim primerima izvođenja, anti-MASP-2 inhibitorna antitela imaju varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan ili više CDR-ova (CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji su u suštini identični (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identični, ili najmanje oko 97% identični, ili najmanje oko 98% identični, ili najmanje 99% identični), ili sadrže ili se sastoje od identične sekvence u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom CDR-ova bilo koje od varijabilnih sekvenci teškog lanca prikazanih na SLIKAMA 5A ili 5B, ili opisanih dole u TABELAMA 3A-F i TABELI 4.

[0121] U nekim primerima izvođenja, anti-MASP-2 inhibitorna antitela imaju varijabilni region lakog lanca koji sadrži jedan ili više CDR-ova (CDR1, CDR2 i/ili CDR3) koji su u suštini identični (npr. najmanje oko 70%, najmanje 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96% identični, ili najmanje oko 97% identični, ili najmanje oko 98% identični, ili najmanje 99% identični), ili sadrže ili se sastoje od identične sekvence u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom CDR-ova bilo koje od varijabilnih sekvenci lakog lanca prikazanih na SLIKAMA 5A ili 5B, ili opisanih dole u TABELAMA 4A-F i TABELI 5.

Varijabilni region teškog lanca

[0122]

TABELA 3A: Teški lanac (aa 1-20)

[0123] Dole su prikazane sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) za klonove majke i klonove ćerke koji su navedeni gore u TABELI 2 i TABELAMA 3A-F.

[0124] Kabat CDR-ovi (31-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3)) su podebljani; a Chothia CDR-ovi (26-32 (HI), 52-56 (H2) i 95-101 (H3)) su podvučeni.

TABELA 4: CDR-ovi teškog lanca

Varijabilni regioni lakog lanca

[0125]

TABELA 5A: Laki lanac (aa 1-20)

[0126] Dole su prikazane sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za klonove majke i klonove ćerke koji su navedeni gore u TABELI 2 i TABELAMA 5A-F.

[0127] Kabat CDR-ovi (24-34 (L1); 50-56 (L2); i 89-97 (L3) su podebljani; a Chothia CDR-ovi (24-34 (L1); 50-56 (L2) i 89-97 (L3) su podvučeni. Ovi regioni su isti bilo da su numerisani po Kabat ili Chothia sistemu.

TABELA 6: Laki lanac CDR-ovi (Kabat/chothia)

[0128] Prema jednom aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje se vezuje za humani MASP-2, a koje sadrži:

(i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sekvence; i (ii) varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, pri čemu sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca CDR-H3 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:38 ili SEQ ID NO:90, i njene konzervativne modifikacije sekvenci, pri čemu sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca CDR-L3 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:51 ili SEQ ID NO:94, i njene konzervativne modifikacije sekvenci, i pri čemu izolovano antitelo inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0129] U jednom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca CDR-H2 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:32 ili 33, i njene konzervativne modifikacije sekvenci. U jednom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca CDR-H1 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:28 ili SEQ ID NO:29, i njene konzervativne modifikacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca CDR-L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:93 i njene konzervativne modifikacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca CDR-L1 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO:91 ili SEQ ID NO:92 i njene konzervativne modifikacije. U jednom primeru izvođenja, CDR-H1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži SEQ ID NO:28.

[0130] U jednom primeru izvođenja, CDR-H2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži SEQ ID NO:32. U jednom primeru izvođenja, CDR-H3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži SEQ ID NO:90, (kao što je prikazano u TABELI 4). U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:90 sadrži R (Arg) na poziciji 8.

[0131] U jednom primeru izvođenja, CDR-L1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži SEQ ID NO:91 (kao što je prikazano u TABELI 6). U jednom primeru izvođenja, aminokiselina navedena u SEQ ID NO:91 sadrži E (Glu) na poziciji 2. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:91 sadrži Y (Tyr) na poziciji 8.

[0132] U jednom primeru izvođenja, CDR-L2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 93 (kao što je prikazano u TABELI 6), i pri čemu aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:93 sadrži K (Lys) na poziciji 2. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:93 sadrži Q (Gln) na poziciji 3.

[0133] U jednom primeru izvođenja, CDR-L3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži SEQ ID NO:51.

[0134] U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo ili njegov fragment antigen se vezuje za humani MASP-2 sa KD od 10 nM ili manjim. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo ili njegov antigen vezujući fragment inhibira C4 aktivaciju u in vitro testu u 1% humanog seruma sa IC50 od 10 nM ili manjim. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo ili njegov antigen vezujući fragment inhibira C4 aktivaciju u 90% humanog seruma sa IC50 od 30 nM ili manjim. U jednom primeru izvođenja, njene konzervativne modifikacije sekvenci sadrže ili se sastoje od molekula koji sadrži varijabilne regione koji su identični sa navedenim varijabilnim domenom, odnosno domenima, izuzev do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca, i/ili do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija sa pomenutim CDR regionima varijabilnog regiona lakog lanca.

[0135] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano humano antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji vezuje humani MASP-2, pri čemu to antitelo sadrži: I) a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 SEQ ID NO:21; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 SEQ ID NO:21; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 SEQ ID NO:21; i b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i ii) CDRL2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i iii) CDRL3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; ili II) njegovu varijantu koja je inače identična pomenutim varijabilnim domenima, izuzev do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili 102 pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ili 97 pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, teški lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:21. U jednom primeru izvođenja, laki lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:25. U jednom primeru izvođenja, laki lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:27.

[0136] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za humani MASP-2, pri čemu to antitelo sadrži: I) a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži: i) teški lanac CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 SEQ ID NO:20; i ii) teški lanac CDRH-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 SEQ ID NO:20; i iii) teški lanac CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 SEQ ID NO:18 ili SEQ ID NO:20; i b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži: i) laki lanac CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; i ii) laki lanac CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; i iii) laki lanac CDRL3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:24; ili II) njegovu varijantu koja je inače identična pomenutim varijabilnim domenima, izuzev do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili 102 pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ili 97 pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, teški lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:20, ili njenu varijantu koje sadrže najmanje 80% identičnosti sa SEQ ID NO:20 (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identičnosti sa SEQ ID NO:20). U jednom primeru izvođenja, teški lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:18, ili njenu varijantu koje sadrže najmanje 80% identičnosti sa SEQ ID NO:18 (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identičnosti sa SEQ ID NO:18). U jednom primeru izvođenja, laki lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:22, ili njenu varijantu koje sadrže najmanje 80% identičnosti sa SEQ ID NO:22 (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identičnosti sa SEQ ID NO:22). U jednom primeru izvođenja, laki lanac pomenutog antitela sadrži SEQ ID NO:24, ili njenu varijantu koje sadrže najmanje 80% identičnosti sa SEQ ID NO:24 (npr. najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identičnosti sa SEQ ID NO:24).

[0137] U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo se vezuje za epitop u CCP1 domenu MASP-2.

[0138] U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo se vezuje za humani MASP-2 sa KD od 10 nM ili manjim. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo inhibira C3b taloženje u in vitro testu u 1% humanog seruma sa IC50 od 10 nM ili manjim. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo inhibira C3b taloženje u 90% humanog seruma sa IC50 od 30 nM ili manjim.

[0139] U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 i F(ab’)2. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo je jednolančani molekul. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo je IgG2 molekul. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo je IgG1 molekul. U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo je IgG4 molekul. U jednom primeru izvođenja, pomenuti IgG4 molekul sadrži S228P mutaciju.

[0140] U jednom primeru izvođenja, pomenuto antitelo u suštini ne inhibira klasični put (tj. aktivnost klasičnog puta je najmanje 80%, ili najmanje 90% ili najmanje 95%, ili najmanje 95% intaktna).

[0141] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovano izolovano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se disosuju od humanog MASP-2 sa KD od 10nM ili manjim, što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom i inhibiraju C4 aktivaciju na mananom obloženom supstratu sa IC50 od 10nM ili manjim u 1% seruma. U nekim primerima izvođenja, pomenuto antitelo ili njegov antigen vezujući fragment specifično prepoznaje bar deo epitopa koji prepoznaje referentno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:20 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:24, kao što je referentno antitelo OMS646 (vidi TABELU 22). U skladu sa gore navedenim, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema izvesnim poželjnim primerima izvođenja predmetne primene može biti onaj koji se nadmeće za vezivanje sa humanim MASP-2 sa bilo kojim ovde opisanim antitelom koje se (i) specifično vezuje za antigen i (ii) sadrži ovde opisani VH i/ili VL domen, ili sadrži ovde opisani CDR-H3, ili bilo koju njihovu varijantu. Nadmetanje između vezujućih elemenata se lako može testirati in vitro, na primer, korišćenjem ELISE i/ili tagovanjem specifičnog reporter molekula za jedan vezujući element koji se može detektovati u prisustvu drugog, netagovanog elementa, odnosno elemenata, da bi se omogućila identifikacija specifičnih vezujućih elemenata koji se vezuju za isti epitop ili preklapajući epitop. Shodno tome, sada je realizovano specifično antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji sadrže antigen-vezujuće mesto humanog antitela koje se nadmeće sa ovde opisanim antitelom koje se vezuje za humani MASP-2, kao što je bilo koji od OMS641 do OMS646 kao što je navedeno u TABELI 24, za vezivanje za humani MASP-2.

Varijantna MASP-2 inhibitorna antitela

[0142] Gore opisana humana monoklonska antitela mogu biti modifikovana da bi se dobila varijantna antitela koja inhibiraju MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa. Varijantna antitela mogu biti napravljena supstitucijom, adicijom ili delecijom najmanje jedne aminokiseline gore opisanog humanog monoklonskog antitela.

Generalno, ova varijantna antitela imaju opšte karakteristike gore opisanih humanih antitela i sadrže bar CDR-ove gore opisanog humanog antitela, ili, u izvesnim primerima izvođenja, CDR-ove koji su veoma slični CDR-ovima gore opisanog humanog antitela.

[0143] U poželjnom primeru izvođenja, varijanta sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više hipervarijabilnih regiona roditeljskog antitela. Na primer, varijanta može sadržati najmanje jednu, npr. od oko jedne do oko deset, kao što je najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 supstitucija, a prvenstveno od oko dva do oko šest, supstitucija u jednom ili više CDR regiona roditeljskog antitela. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili 102 pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, pomenuta varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicije 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 51, 52, 89, 92, 93, 95, 96 ili 97 pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca.

[0144] U nekim primerima izvođenja, varijanta antitela ima aminokiselinsku sekvencu koja je inače identična sa varijabilnim domenom predmetnog antitela navedenim u TABELI 2, izuzev do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i/ili do kombinovanih ukupno 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija u okviru pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0145] Obično će varijanta imati aminokiselinsku sekvencu koja ima identičnost od najmanje 75% aminokiselinske sekvence sa sekvencama varijabilnog domena teškog ili lakog lanca roditeljskih antitela, još poželjnije od najmanje 80%, još poželjnije od najmanje 85%, još poželjnije od najmanje 90%, i najpoželjnije od najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti. Identičnost ili homologija u vezi ove sekvence je ovde definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koje su identične sa ostacima roditeljskog antitela, posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je neophodno, da bi se ostvario maksimalni procenat identičnosti sekvenci. Ne treba smatrati da nijedno od N-terminalnih, C-terminalnih, ili internih produženja, delecija, ili insercija u sekvencu antitela (kao što su, na primer, signalne peptidne sekvence, linker sekvence, ili tagovi, kao što su HIS tagovi) utiče na identičnost sekvenci ili homologiju. Varijanta zadržava sposobnost da se vezuje za humani MASP-2 i prvenstveno ima svojstva koja su superiorna u odnosu na ona roditeljskog antitela. Na primer, varijanta može imati jači afinitet vezivanja i/ili povećanu sposobnost da inhibira ili blokira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa.

[0146] Da bi se analizirala takva svojstva, trebalo bi da se uporedi Fab oblik varijante sa Fab oblikom roditeljskog antitela ili oblik varijante cele dužine sa oblikom roditeljskog antitela cele dužine, na primer, pošto je otkriveno da format anti-MASP-2 antitela utiče na njegovu aktivnost u testovima biološke aktivnosti koji su ovde opisani. Varijanta antitela koja je ovde od posebnog interesa je ona koju odlikuje bar oko 10-struko, prvenstveno bar oko 20-struko, i najpoželjnije bar oko 50-struko, povećanje biološke aktivnosti kada se uporedi sa roditeljskim antitelom.

[0147] Antitela prema pronalasku mogu biti modifikovana da bi se povećala željena svojstva, kao što može biti poželjno da se kontroliše serumski poluživot antitela. Generalno, molekuli kompletnog antitela imaju veoma dugu serumsku trajnost, dok se fragmenti (<60-80 kDa) veoma brzo isfiltriraju kroz bubrege. Zbog toga, ako je poželjno dugotrajno dejstvo MASP-2 antitela, onda je MASP-2 antitelo prvenstveno kompletno IgG antitelo cele dužine (kao što je IgG2 ili IgG4), dok ako je poželjno kraće dejstvo MASP-2 antitela, onda može biti poželjan fragment antitela. Kao što je opisano u Primeru 5, utvrđeno je da S228P supstitucija u regionu zgloba IgG4 povećava serumsku stabilnost. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, predmetno MASP-2 antitelo je IgG4 antitelo cele dužine sa S228P supstitucijom.

Jednolančana antitela

[0148] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, MASP-2 inhibitorno antitelo je jednolančano antitelo, koje je definisano kao genetski modifikovani molekul koji sadrži varijabilni region lakog lanca, varijabilni region teškog lanca, povezane podesnim polipeptidnim linkerom kao genetski fuzionisani jednolančani molekul. Takva jednolančana antitela se nazivaju takođe "jednolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. scFv antitela koja se vezuju za MASP-2 se mogu orijentisati varijabilnim lakim regionom bilo amino terminalno u odnosu na varijabilni teški region ili karboksilno terminalno od njega. Ilustrativna scFv antitela prema pronalasku su ovde navedena kao SEQ ID NOS: 55-61 i SEQ ID NOS: 66-68.

Metodi za proizvodnju antitela

[0149] U mnogim primerima izvođenja, nukleinske kiseline koje kodiraju predmetno monoklonsko antitelo su uvedene direktno u ćeliju domaćina, i ćelija je inkubirana pod uslovima koji su dovoljni za indukciju ekspresije kodiranog antitela.

[0150] U nekim primerima izvođenja, otkrivanjem je realizovan molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-MASP-2 antitelo, ili njegov fragment, prema pronalasku, kao što je antitelo ili njegov fragment koji su navedeni u TABELI 2. U nekim primerima izvođenja pronalaskom je realizovan molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:88 i SEQ ID NO:89.

[0151] U nekim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovana ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-MASP-2 antitelo prema pronalasku.

[0152] U nekim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovana ekspresiona kaseta koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-MASP-2 antitelo prema pronalasku.

[0153] U nekim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan metod za proizvodnju anti-MASP-2 antitela koji sadrži kultivaciju ćelije koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-MASP-2 antitelo prema pronalasku.

[0154] Prema izvesnim srodnim primerima izvođenja realizovana je rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više ovde opisanih konstrukata; nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje antitelo, CDR, VH ili VL domen, ili njegov antigen vezujući fragment; i metod za proizvodnju kodiranog proizvoda, koji metod sadrži ekspresiju kodirajuće nukleinske kiselinske kiseline za te svrhe. Ekspresija se može podesno izvesti kultivacijom pod podesnim uslovima rekombinantnih ćelija domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu. Posle proizvodnje ekspresijom, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu biti izolovani i/ili prečišćeni korišćenjem bilo koje podesne tehnike, a onda se mogu primeniti po želji.

[0155] Na primer, bilo koja ćelija podesna za ekspresiju ekspresionih kaseta se može upotrebiti kao ćelija domaćin, na primer, kvaščeve, insektne, biljne, itd. ćelije. U mnogim primerima izvođenja, upotrebljava se sisarska ćelijska linija domaćina koja normalno ne proizvodi ta antitela, a njihovi primeri su sledeći: majmunske bubrežne ćelije (COS ćelije), majmunske bubrežne CVI ćelije transformisane pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embrionske bubrežne ćelije (HEK-293, Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); bubrežne ćelije mladunčadi hrčka (BHK, ATCC CCL 10); jajne ćelije kineskog hrčka (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); majmunske bubrežne ćelije (CVI ATCC CCL 70); bubrežne ćelije afričkih zelenih majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA, ATCC CCL 2); pseće bubrežne ćelije (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre "buffalo" pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane plućne ćelije (W138, ATCC CCL 75); humane jetrene ćelije (hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); NIH/3T3 ćelije (ATCC CRL-1658); i mišje L ćelije (ATCC CCL-1). Dodatne ćelijske linije će biti očigledne onima koji su prosečni stručnjaci iz odgovarajuće oblasti. Širok spektar ćelijskih linija se može dobiti od the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209.

[0156] Metodi za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti. Podesni metodi obuhvataju elektroporaciju, tehnologiju čestičnog pištolja, kalcijum fosfatno taloženje, direktnu mikroinjekciju i slično. Izbor metoda generalno zavisi od tipa ćelije koja se transformiše i okolnosti pod kojima se odvija transformacija (tj. in vitro, ex vivo, ili in vivo). Opšte razmatranje ovih metoda se može naći u Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3. izd., Wiley & Sons, 1995. U nekim primerima izvođenja se koriste lipofektamin i kalcijumom posredovane tehnologije genskog transfera.

[0157] Pošto predmetne nukleinske kiseline budu uvedene u ćeliju, ćelija se obično inkubira, normalno na 37°C, ponekad uz selekciju, tokom vremena koje je podesno da se omogući ekspresija antitela. U većini primera izvođenja, antitelo se obično izlučuje u supernatant medijuma u kome ćelija raste.

[0158] U sisarskim ćelijama domaćinima se može koristiti više ekspresionih sistema baziranih na virusima za izražavanje predmetnog antitela. U slučajevima gde se adenovirus koristi kao ekspresioni vektor, sekvenca koja kodira antitelo od interesa može biti ligatirana u adenovirusni transkripcioni/translacioni kontrolni kompleks, npr. kasni promoter i tripartitnu lider sekvencu. Ovaj himerični gen onda može biti umetnut u adenovirusni genom putem in vitro ili in vivo rekombinacije. Insercija u neesencijalni region virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) će rezultovati rekombinantnim virusom koji je vijabilan i sposoban za izražavanje molekula antitela u inficiranim domaćinima. (npr. vidi Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Efikasnost ekspresije se može povećati uključivanjem podesnih elemenata koji povećavaju transkripciju, transkripcionih terminatora, itd. (vidi Bittner et al., Methods in Enzymol.153:51-544 (1987)).

[0159] Za dugotrajna rekombinantna antitela za proizvodnju sa visokim prinosom se može koristiti stabilna ekspresija. Na primer, genetskim inženjeringom se mogu dobiti ćelijske linije koje stabilno izražavaju molekul antitela. Umesto korišćenja ekspresionih vektora koji sadrže virusne izvore replikacije, ćelije domaćina se mogu transformisati imunoglobulinskim ekspresionim kasetama i selektabilnim markerom. Posle uvođenja strane DNK, genetskim inženjeringom dobijene ćelije se mogu ostaviti tako da rastu 1-2 dana u obogaćenim medijumima, a zatim prebaciti u selektivne medijume. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu prenosi otpornost na selekciju i omogućava da se ćelije stabilno integrišu plazmid u hromozom i da rastu da bi se formirali fokusi koji dalje mogu biti klonirani i ekspandovani u ćelijskim linijama. Takve genetskim inženjeringom dobijene ćelijske linije mogu biti posebno korisne za skrining i evaluaciju jedinjenja koji sadejstvuju direktno ili indirektno sa molekulom antitela.

[0160] Kada se jednom proizvede molekul antitela prema pronalasku, on može biti prečišćen bilo kojim metodom poznatim iz odgovarajuće oblasti za prečišćavanje imunoglobulinskog molekula, na primer, hromatografijom (npr. jonoizmenjivačkom, afinitetnom, a naročito afinitetnom za specifični antigen posle Proteina A, i kolonskom hromatografijom sa isključenjem po veličini), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivosti, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. U mnogim primerima izvođenja, antitela se izlučuju iz ćelije u medijum za kultivaciju i izoluju se iz medijuma za kultivaciju. Na primer, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid se može uvesti u blizinu kodirajućeg regiona antitela ili fragmenta, na primer, kao što je predviđeno u nukleotidima 1-57 od SEQ ID NO:71, koji kodiraju signalni peptid koji je realizovan u aminokiselinama 1-19 od SEQ ID NO:72. Takav signalni peptid može biti integrisan susedno 5’ kraju aminokiselinskih sekvenci koje su ovde navedena za predmetna antitela da bi se olakšala proizvodnja predmetnih antitela.

Farmaceutski nosači i vehikulumi

[0161] Prema sledećem aspektu, pronalaskom su realizovane kompozicije za inhibiciju štetnih efekata MASP-2-zavisne aktivacije komplementa koje sadrže terapeutski efektivnu količinu humanog anti-MASP-2 inhibitornog antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0162] Generalno, kompozicije humanog MASP-2 inhibitornog antitela prema predmetnom pronalasku, kombinovane sa bilo kojim drugim izabranim terapeutskim agensima, su podesno sadržane u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Nosač je netoksičan, biokompatibilan i izabran je tako da ne deluje štetno na biološku aktivnost MASP-2 inhibitornog antitela (i bilo kog drugog od terapeutskih agenasa kombinovanih sa njim). Ilustrativni farmaceutski prihvatljivi nosači za polipeptide su opisani u US patentu br.5,211,657 čiji je nosilac Yamada. Anti-MASP-2 antitela mogu biti formulisana u preparate u čvrstim, polučvrstim, gel, tečnim ili gasovitim oblicima, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, masti, rastvori, depozitorijumi, inhalanti i injekcije koji omogućavaju oralnu, parenteralnu ili hiruršku administraciju. Otkrivanje takođe razmatra lokalnu administraciju kompozicija oblaganjem medicinskih naprava ili slično.

[0163] Podesni nosači za parenteralnu primenu putem injektabilne, infuzione ili irigacione i topikalne primene obuhvataju destilovanu vodu, fiziološki fosfatnipuferovani slani rastvor, normalni ili laktatni Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, Henkov rastvor, ili propandiol. Pored toga, sterilna, neisparljiva ulja se mogu koristiti kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. Za ove svrhe se može koristiti bilo koje biokompatibilno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, mogu se koristiti masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, za pripremu injektabilnih preparata. Nosač i agens mogu biti sjedinjeni kao tečnost, suspenzija, polimerizujući ili nepolimerizujući gel, pasta ili melem.

[0164] Nosač takođe može sadržati vehikulum za kontrolisano oslobađanje (tj. produženo, odloženo ili regulisano) agensa, odnosno agenasa ili za povećanje isporuke, resorpcije, stabilnosti ili farmakokinetike terapeutskog agensa, odnosno agenasa. Takav vehikulum može obuhvatati, kao neograničavajući primer, mikročestice, mikrosfere, nanosfere ili nanočestice sastavljene od proteina, lipozoma, ugljenih hidrata, sintetičkih organskih jedinjenja, neorganskih jedinjenja, polimernih ili kopolimernih hidrogelova i polimernih micela. Podesni sistemi primene sa hidrogelom i micelama obuhvataju PEO:PHB:PEO kopolimere i komplekse kopolimer/ciklodekstrin opisane u WO 2004/009664 A2 i PEO i komplekse PEO/ciklodekstrin opisane u US prijavi patenta br.2002/0019369 A1. Takvi hidrogelovi se mogu ubrizgati lokalno na mestu ciljnog dejstva, ili subkutano ili intramuskularno da bi formirali depo sa kontrolisanim oslobađanjem.

[0165] Za intra-artikularnu primenu, MASP-2 inhibitorno antitelo može biti nošeno u gore opisanim tečnim ili gel nosačima koji su injektabilni, gore opisanim vehikulumima sa kontrolisanim oslobađanjem koji su injektabilni, ili hijaluronskom kiselinom ili derivatom hijaluronske kiseline.

[0166] Za intratekalnu (IT) ili intracerebroventrikularnu (ICV) primenu, podesni sterilni sistemi za primenu (npr. tečnosti; gelovi, suspenzije, itd.) se mogu koristiti za administraciju predmetnog pronalaska.

[0167] Kompozicije prema predmetnom pronalasku takođe mogu sadržati biokompatibilne ekscipijense, kao što su sredstva za dispergovanje ili vlaženje, sredstva za suspendovanje, razređivače, pufere, poboljšavače prodiranja, emulgatore, veziva, zgušnjavače, arome (za oralnu administraciju).

[0168] Da bi se ostvarile visoke koncentracije anti-MASP-2 antitela za lokalnu primenu, antitela mogu biti formulisana kao suspenzija čestica ili kristala u rastvoru za sledstvenu injekciju, kao što je za intramuskularnu depo injekciju.

[0169] Još specifičnije u vezi anti-MASP-2 antitela, ilustrativne formulacije mogu biti date parenteralno kao injektabilne doze rastvora ili suspenzije jedinjenja u fiziološki prihvatljivom razređivaču sa farmaceutskim nosačem koji može biti sterilna tečnost, kao što su voda, ulja, slani rastvor, glicerol ili etanol. Pored toga, pomoćne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, surfaktanti, pH puferske supstance i slično, mogu biti prisutne u kompozicijama koje sadrže anti-MASP-2 antitela. Dodatne komponente farmaceutskih kompozicija obuhvataju petroleum (kao što je životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla), na primer, sojino ulje i mineralno ulje. Generalno, glikoli, kao što su propilen glikol ili polietilen glikol su poželjni tečni nosači za injektabilne rastvore.

[0170] Anti-MASP-2 antitela se takođe mogu davati u obliku depo injekcije ili implantabilnog preparata koji može biti formulisan na takav način da dozvoli kontrolisano ili varirajuće oslobađanje aktivnih sastojaka.

[0171] Farmaceutske kompozicije koje sadrže MASP-2 inhibitorna antitela se mogu davati na više načina, u zavisnosti od toga da li je lokalni ili sistemski način administracije najpodesniji za stanje koje se leči. Pored toga, kao što je ovde gore opisano u vezi ekstrakorporealnih reperfuzionih procedura, MASP-2 inhibitorna antitela se mogu davati putem uvođenja kompozicija prema predmetnom pronalasku u recirkulišuću krv ili plazmu. Dalje, kompozicije prema predmetnom pronalasku se mogu davati prevlačenjem ili ugrađivanjem kompozicija na ili u implantabilnu medicinsku napravu.

SISTEMSKA PRIMENA

[0172] Kada se ovde koriste, izrazi "sistemska primena" i "sistemska administracija" treba da obuhvate, ali nisu ograničeni na oralni i parenteralni način primene, uključujući intramuskularni (IM), subkutani, intravenski (IV), intra-arterijski, inhalacioni, sublingvalni, bukalni, topikalni, transdermalni, nazalni, rektalni, vaginalni i druge načine administracije koji efektivno rezultuju rasprostiranjem isporučenog antitela do jednog ili više mesta ciljnog terapeutskog dejstva. Poželjni načini sistemske primene za predmetne kompozicije obuhvataju intravenski, intramuskularni, subkutani i inhalacioni. Može se shvatiti da će tačan sistemski način administracije za izabrane agense koji se koriste u specifičnim kompozicijama prema predmetnom pronalasku biti određen delimično na osnovu podložnosti agensa metaboličkim transformišućim putevima povezanim sa datim načinom administracije.

[0173] MASP-2 inhibitorna antitela i polipeptidi se mogu davati subjektu kome je to potrebno bilo kojim podesnim sredstvom. Metode primene MASP-2 antitela i polipeptida obuhvataju administraciju oralnim, pulmonarnim, parenteralnim (npr. intramuskularnom, intraperitonealnom, intravenskom (IV) ili subkutanom injekcijom), inhalacionim (kao što je putem formulacije finog praška), transdermalnim, nazalnim, vaginalnim, rektalnim, ili sublingvalnim načinima administracije, i mogu biti formulisani u farmaceutskim oblicima koji su podesni za svaki način administracije.

[0174] Kao reprezentativni primer, MASP-2 inhibitorna antitela i peptidi se mogu uvesti u živo telo nanošenjem na telesnu membranu koja može da apsorbuje polipeptide, na primer, na nazalnu, gastrointestinalnu i rektalnu membranu.

Polipeptidi se obično nanose na apsorptivnu membranu zajedno sa poboljšavačem prodiranja. (Vidi, npr. Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13:241, 1990.) Na primer, STDHF je sintetički derivat fusidinske kiseline, steroidnog surfaktanta koji je po strukturi sličan žučnim solima i koristi se kao poboljšavač prodiranja za nazalnu primenu. (Lee, W.A., Biopharm.22, Nov./Dec. 1990.)

[0175] MASP-2 inhibitorna antitela i polipeptidi mogu biti uvedeni zajedno sa drugim molekulom, kao što je lipid, da bi se polipeptidi zaštitili od enzimske degradacije. Na primer, kovalentno vezivanje polimera, a naročito polietilen glikola (PEG), se koristi za zaštitu pojedinih proteina od enzimske hidrolize u telu i zato produžava poluživot (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Za isporuku proteina su opisani mnogi polimerni sistemi (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res.6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci.79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci.78:219, 1989).

[0176] Nedavno su bili razvijeni lipozomi sa poboljšanom serumskom stabilnosti i poluvremenima cirkulacije (vidi, npr. US patent br.5,741,516, koji je dobio Webb). Pored toga, razmotrene su različite metode lipozoma i preparata sličnih lipozomima kao potencijalni nosači lekova (vidi, npr. US patent br.5,567,434, koji je dobio Szoka; US patent br.5,552,157, koji je dobio Yagi; US patent br.5,565,213, koji je dobio Nakamori; US patent br.5,738,868, koji je dobio Shinkarenko; i US patent br.

5,795,587, koji je dobio Gao).

[0177] Za transdermalne primene, MASP-2 inhibitorna antitela i polipeptidi mogu biti kombinovani sa drugim podesnim sastojcima, kao što se nosači i/ili adjuvansi. Ne postoje granice u pogledu prirode takvih drugih sastojaka, izuzev što oni moraju biti farmaceutski prihvatljivi za njihovu ciljnu administraciju, i ne smeju degradirati aktivnost aktivnih sastojaka kompozicije. Primeri podesnih nosača obuhvataju masti, kreme, gelove, ili suspenzije, sa ili bez prečišćenog kolagena. MASP-2 inhibitorna antitela i polipeptidi takođe mogu biti impregnirani u transdermalne flastere i zavoje, a prvenstveno u tečnom ili polutečnom obliku.

[0178] Kompozicije prema predmetnom otkrivanju se mogu sistemski davati na periodičnoj osnovi, u intervalima koji su određeni tako da se održi željeni nivo terapeutskog efekta. Na primer, kompozicije se mogu davati, recimo subkutanom injekcijom, svake dve do četiri nedelje ili u manje učestalim intervalima. Režim doziranja će biti određen od strane lekara koji razmatra različite faktore koji mogu imati uticaj na dejstvo kombinacije agenasa. Ovi faktori će obuhvatati meru progresije stanja koje se leči, pacijentovu starost, pol i težinu, kao i druge kliničke faktore. Doziranje za svaki pojedini agens će varirati kao funkcija MASP-2 inhibitornog antitela koje je uključeno u kompoziciju, kao i u zavisnosti od prisustva i prirode bilo kakvog vehikuluma leka (npr. vehikulum za kontrolisano oslobađanje). Pored toga, dozirana količina može biti podešena na osnovu učestanosti administracije i farmakokinetičkog ponašanja agensa, odnosno agenasa koji se daju.

LOKALNA PRIMENA

[0179] Kada se ovde koristi, izraz "lokalna" obuhvata nanošenje leka u ili oko mesta ciljnog lokalizovanog dejstva, i može obuhvatati, na primer, topikalnu primenu na koži ili drugim pogođenim tkivima, oftalmičku primenu, intratekalnu (IT), intracerebroventrikularnu (ICV), intra-artikularnu, intrakavitalnu, intrakranijalnu ili intravezikularnu administraciju, stavljanje ili irigaciju. Lokalna administracija može biti poželjna da bi se omogućila administracija manje doze, da bi se izbegla sistemska neželjena dejstva, i za precizniju kontrolu vremena primene i koncentracije aktivnih sastojaka na mestu lokalne primene. Lokalna administracija obezbeđuje poznatu koncentraciju na ciljnom mestu, bez obzira na varijabilnost metabolizma, cirkulaciju itd. između pacijenata. Poboljšana kontrola doziranja je takođe obezbeđena direktnim načinom primene.

[0180] Lokalna primena MASP-2 inhibitornog antitela se može ostvariti u kontekstu hirurških metoda za lečenje bolesti ili stanja, kao što je, na primer, u toku procedura, kao što su hirurški arterijski bajpas, aterektomija, laserske procedure, ultrazvučne procedure, balonska angioplastika i ugradnja stenta. Na primer, MASP-2 inhibitor se može davati subjektu zajedno sa procedurom balonske angioplastike. Procedura balonske angioplastike obuhvata umetanje katetera koji ima izduvani balon u arteriju. Izduvani balon se postavlja u blizinu aterosklerotičnog plaka i naduvava se tako da se plak sabija na vaskularni zid. Kao rezultat ovoga, površina balona je u kontaktu sa slojem vaskularnih endotelnih ćelija na površini krvnog suda. MASP-2 inhibitorno antitelo može biti fiksirano na kateter za balonsku angioplastiku na takav način da dozvoljava oslobađanje agensa na mestu aterosklerotičnog plaka. Agens može biti fiksiran na kateter sa balonom u skladu sa standardnim procedurama poznatim iz odgovarajuće oblasti. Na primer, agens može biti čuvan u odeljku katetera sa balonom sve dok se balon ne naduva, u kom trenutku se oslobađa u lokalno okruženje. Alternativno tome, agens može biti impregniran na površini balona, tako da dolazi u kontakt sa ćelijama arterijskog zida kada se balon naduva. Agens se takođe može isporučiti u perforiranom kateteru sa balonom, kao što je onaj koji je opisan u Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85:1110-1117, 1992. Vidi takođe objavljenu PCT prijavu WO 95/23161 za ilustrativnu proceduru fiksiranja terapeutskog proteina na kateter za balonsku angioplastiku. Isto tako, MASP-2 inhibitorno antitelo može biti uključeno u gel ili polimernu prevlaku nanetu na stent, ili može biti inkorporirano u materijal stenta, tako da stent eluira MASP-2 inhibitorno antitelo posle vaskularnog postavljanja.

Režimi lečenja

[0181] Kompozicije MASP-2 inhibitornog antitela koje se koriste u lečenju artritisa i drugih muskuloskeletnih poremećaja mogu biti lokalno isporučene intra-artikularnom injekcijom. Takve kompozicije mogu podesno sadržati vehikulum sa kontrolisanim oslobađanjem. Kao sledeći primer slučajeva u kojima može biti poželjna lokalna primena, kompozicije MASP-2 inhibitornog antitela koje se koriste u lečenju urogenitalnih stanja mogu biti podesno usađene intravezikalno ili u neku drugu urogenitalnu strukturu.

[0182] U profilaktičkim primenama, farmaceutske kompozicije se daju subjektu koji je podložan ili je na neki drugi način izložen riziku od stanja povezanog sa MASP-2-zavisnom aktivacijom komplementa u količini koja je dovoljna da se eliminiše ili smanji rizik od razvoja simptoma stanja. U terapeutskim primenama, farmaceutske kompozicije se daju subjektu koji je suspektan ili već boluje od stanja povezanog sa MASP-2-zavisnom aktivacijom komplementa u terapeutski efektivnoj količini dovoljnoj za ublažavanje ili bar delimično smanjenje simptoma stanja. I u profilaktičkom, i u terapeutskom režimu, kompozicije koje sadrže MASP-2 inhibitorna antitela se mogu davati u nekoliko doza, sve dok se ne ostvari dovoljan terapeutski ishod kod subjekta. Primena kompozicija MASP-2 inhibitornog antitela prema predmetnom pronalasku se može izvesti samo jednom administracijom kompozicije, ili ograničenom sekvencom administracija, za lečenje akutnog stanja, npr. reperfuzione povrede ili druge traumatske povrede. Alternativno tome, kompozicija se može davati u periodičnim intervalima tokom produženog vremenskog perioda radi lečenja hroničnih stanja, npr. artritisa ili psorijaze.

[0183] MASP-2 inhibitorne kompozicije koje se koriste u predmetnom pronalasku se mogu davati neposredno ili ubrzo posle akutnog događaja koji rezultuje aktivacijom lektinskog puta, kao što je posle ishemijskog događaja i reperfuzije ishemičnog tkiva. Primeri obuhvataju miokardnu ishemijsku reperfuziju, bubrežnu ishemijsku reperfuziju, cerebralnu ishemijsku reperfuziju, transplantaciju organa i ponovno pričvršćivanje prsta/ekstremiteta. Drugi akutni primeri uključuju sepsu. MASP-2 inhibitorna kompozicija prema predmetnom pronalasku se može davati što je pre moguće posle akutnog događaja koji je aktivirao lektinski put, a prvenstveno u roku od dvanaest sati i još poželjnije u roku od dva do tri sata posle aktivirajućeg događaja, kao što je sistemskom primenom MASP-2 inhibitorne kompozicije.

[0184] Metode i kompozicije prema predmetnom pronalasku se mogu koristiti za inhibiciju zapaljenja i srodnih procesa koji obično nastaju usled dijagnostičkih i terapeutskih medicinskih i hirurških procedura. Da bi se inhibirali takvi procesi, MASP-2 inhibitorna kompozicija prema predmetnom pronalasku se mora primeniti periproceduralno. Kada se ovde koristi, "periproceduralno" se odnosi na administraciju inhibitorne kompozicije preproceduralno i/ili intraproceduralno i/ili postproceduralno, tj. pre procedure, pre i u toku procedure, pre i posle procedure, pre, u toku i posle procedure, u toku procedure, u toku i posle procedure, ili posle procedure. Periproceduralna primena se može izvršiti lokalnom administracijom kompozicije na hirurškom ili proceduralnom mestu, kao što je injekcijom ili kontinualnom ili diskontinualnom irigacijom mesta ili sistemskom administracijom. Podesni metodi za lokalnu perioperativnu primenu rastvora MASP-2 inhibitornog antitela su opisani u US patentima br.6,420,432 koji je dobio Demopulos i 6,645,168 koji je dobio Demopulos. Podesne metode za lokalnu primenu hondroprotektivnih kompozicija koje sadrže MASP-2 inhibitorna antitela su opisane u međunarodnoj PCT prijavi patenta WO 01/07067 A2. Podesne metode i kompozicije za ciljnu sistemsku primenu hondroprotektivnih kompozicija koje sadrže MASP-2 inhibitorna antitela su opisane u međunarodnoj PCT prijavi patenta WO 03/063799 A2.

Doziranja

[0185] MASP-2 inhibitorna antitela se mogu davati subjektu kome je to potrebno u terapeutski efektivnim dozama radi lečenja ili ublažavanja stanja povezanih sa MASP-2-zavisnom aktivacijom komplementa. Terapeutski efektivna doza se odnosi na količinu MASP-2 inhibitornog antitela koja je dovoljna da rezultuje ublažavanjem simptoma stanja.

[0186] Toksičnost i terapeutska efikasnost MASP-2 inhibitornih antitela se mogu odrediti standardnim farmaceutskim procedurama koje koriste eksperimentalne životinjske modele, kao što je ovde opisani afrički zeleni majmun. Korišćenjem takvih životinjskih modela se mogu odrediti NOAEL (engl. no observed adverse effect level – nivo na kome nisu uočeni neželjeni efekti) i MED (engl. minimally effective dose – minimalna efektivna doza) korišćenjem standardnih metoda. Odnos doza između NOAEL i MED efekata je terapeutski odnos, koji je izražen kao odnos NOAEL/MED. MASP-2 inhibitorna antitela koja odlikuju veliki terapeutski odnosi ili indeksi su najpoželjnija. Podaci dobijeni iz testova na ćelijskim kulturama i životinjskim studijama se mogu koristiti za formulisanje opsega doza za primenu kod ljudi.

Doziranje MASP-2 inhibitornog antitela se prvenstveno nalazi u opsegu koncentracija u cirkulaciji koje uključuju MED sa malo toksičnosti ili bez nje.

Doziranje može varirati u okviru ovog opsega u zavisnosti od farmaceutskog oblika koji se koristi i primenjenog načina administracije.

[0187] Za bilo koju formulaciju jedinjenja, terapeutski efektivna doza se može odrediti korišćenjem životinjskih modela. Na primer, doza može biti formulisana u životinjskom modelu da bi se ostvario opseg cirkulišućih koncentracija u plazmi koji uključuje MED. Kvantitativni nivoi MASP-2 inhibitornog antitela u plazmi se takođe mogu meriti, na primer, pomoću tečne hromatografije visokih performansi.

[0188] Pored studija toksičnosti, efektivno doziranje se takođe može odrediti na osnovu količine MASP-2 proteina koji je prisutan u živućem subjektu, kao i afiniteta vezivanja MASP-2 inhibitornog antitela. Pokazalo se da su MASP-2 nivoi kod normalnih humanih subjekata prisutni u serumu u niskim nivoima u opsegu od 500 ng/ml, a MASP-2 nivoi kod specifičnog subjekta se mogu odrediti korišćenjem kvantitativnog testa za MASP-2 koji je opisan u Moller-Kristensen M., et al., J.

Immunol. Methods 282:159-167, 2003.

[0189] Generalno, doziranje davanih kompozicija koje sadrži MASP-2 inhibitorna antitela varira u zavisnosti od takvih faktora kao što su starost subjekta, težina, visina, pol, opšte medicinsko stanje i prethodna medicinska istorija. Kao ilustracija, MASP-2 inhibitorna antitela se mogu davati u opsezima doziranja od oko 0.010 do 10.0 mg/kg, a prvenstveno od 0.010 do 1.0 mg/kg, još poželjnije od 0.010 do 0.1 mg/kg telesne težine subjekta.

[0190] Terapeutska efikasnost MASP-2 inhibitornih kompozicija i metoda prema predmetnom otkrivanju kod datog subjekta, i podesna doziranja se mogu odrediti u skladu sa testovima komplementa koji su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Komplement generiše brojne specifične proizvode. U toku poslednje dekade, razvijeni su senzitivni i specifični testovi i komercijalno su raspoloživi za većinu od ovih proizvoda aktivacije, uključujući male fragmente aktivacije C3a, C4a, i C5a i velike fragmente aktivacije iC3b, C4d, Bb, i sC5b-9.

Većina ovih testova primenjuje antitela koja reaguju sa novim antigenima (neoantigenima) izloženim na fragmentu, ali ne na nativnim proteinima od kojih su formirani, što čini ove testove veoma jednostavnim i specifičnim. Većina se oslanja na ELISA tehnologiju, mada se radioimunotest još uvek ponekad koristi za C3a i C5a. Ovi zadnje pomenuti testovi mere i neprerađene fragmente, i njihove ’desArg’ fragmente, koji su glavni oblici koji se nalaze u cirkulaciji. Neprerađeni fragmenti i C5adesArg se brzo raščišćavaju vezivanjem za receptore na ćelijskim površinama i zato su prisutni u veoma niskim koncentracijama, dok se C3adesArg ne vezuje za ćelije i akumulira se u plazmi. Merenje C3a obezbeđuje senzitivni indikator aktivacije komplementa nezavisan od puta. Alternativni put aktivacije se može proceniti merenjem Bb fragmenta. Detekcija fluidnog-faznog proizvoda aktivacije puta napada na membrane, sC5b-9, obezbeđuje dokaz da je komplement aktiviran do završetka. Pošto i lektinski, i klasični put generišu iste proizvode aktivacije, C4a i C4d, merenje ova dva fragmenta ne obezbeđuje nikakvu informaciju o tome koji od ova dva puta je generisao proizvode aktivacije.

[0191] Inhibicija MASP-2-zavisne aktivacije komplementa je karakterisana najmanje jednom od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se pojavljuje kao rezultat administracije anti-MASP-2 antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom: inhibicija generisanja ili proizvodnje proizvoda MASP-2-zavisne aktivacije sistema komplementa C4b, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC), smanjenje C4 sečenja i C4b taloženja, ili smanjenje C3 sečenja i C3b taloženja.

Artikli za proizvodnju

[0192] Prema sledećem aspektu, predmetnim otkrivanjem je realizovan artikl za proizvodnju koji sadrži humano MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je ovde opisano, u jediničnom farmaceutskom obliku koji je podesan za terapeutsku administraciju humanom subjektu, kao što je, na primer, jedinična doza u opsegu od 1mg do 5000mg, kao što je od 1 mg do 2000mg, kao što je od 1mg do 1000 mg, kao što je 5mg, 10mg, 50mg, 100mg, 200mg, 500mg, ili 1000mg. U nekim primerima izvođenja, artikl za proizvodnju sadrži kontejner i etiketu ili umetak pakovanja na kontejneru ili pridružen njemu. Podesni kontejneri obuhvataju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti napravljeni od različitih materijala, kao što su staklo ili plastika. Kontejner drži kompoziciju koja je efektivna za lečenje stanja i može imati sterilni pristupni port (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti pomoću hipodermalne igle za injekciju). Najmanje jedan aktivni sastojak u kompoziciji je MASP-2 inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku. Etiketa ili umetak pakovanja ukazuju da je kompozicija koja se upotrebljava za lečenje u specifičnom stanju. Etiketa ili umetak pakovanja dalje sadrže uputstva za administraciju kompozicije antitela pacijentu. Artikli za proizvodnju i kitovi koji sadrže kombinovane terapije koje su ovde opisane su takođe razmotreni.

Terapeutske primene anti-MASP-2 inhibitornih antitela

[0193] Prema sledećem aspektu, otkrivanjem je realizovan metod inhibicije MASP-2 zavisne aktivacije komplementa kod humanog subjekta koji sadrži administraciju humanog monoklonskog anti-MASP-2 inhibitornog antitela prema pronalasku u količini koja je dovoljna za inhibiranje MASP-2 zavisne aktivacije komplementa kod pomenutog humanog subjekta.

[0194] U skladu sa ovim aspektom pronalaska, kao što je opisano u Primeru 10, MASP-2 inhibitorna antitela prema predmetnom pronalasku su sposobna da inhibiraju lektinski put kod afričkih zelenih majmuna posle intravenske administracije. Kao što je prikazano u TABELI 24, Primer 8, bilo je utvrđeno da je antitelo koje je bilo upotrebljeno u ovoj studiji, OMS646, potentnije u humanom serumu. Kao što je poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, nehumani primati se često koriste kao model za evaluaciju antitela kao terapeutika.

[0195] Kao što je opisano u US patentu br.7,919,094, US prijavi patenta pod rednim br. 13/083,441 po kojoj se još uvek vodi postupak, i US prijavi patenta pod rednim brojem br.12/905,972 po kojoj se još uvek vodi postupak (od kojih je svaka preneta na Omeros Corporation, podnosioca predmetne prijave), postoje implikacije da MASP-2 zavisna aktivacija komplementa doprinosi patogenezi brojnih akutnih i hroničnih bolesnih stanja, uključujući vaskularno stanje posredovano MASP-2-zavisnim komplementom, ishemijsku reperfuzionu povredu, aterosklerozu, zapaljenski gastrointestinalni poremećaj, pulmonarno stanje, ekstrakorporealnu reperfuzionu proceduru, muskuloskeletno stanje, bubrežno stanje, stanje kože, transplantaciju organa ili tkiva, poremećaj ili povredu nervnog sistema, krvni poremećaj, urogenitalno stanje, dijabetes, hemoterapiju ili zračnu terapiju, malignitet, endokrini poremećaj, poremećaj koagulacije, ili oftalmološko stanje. Zbog toga se MASP-2 inhibitorna antitela prema predmetnom pronalasku mogu primeniti za lečenje gore navedenih bolesti i stanja.

[0196] Kao što je dalje opisano u Primeru 11, MASP-2 inhibitorna antitela prema predmetnom pronalasku su efektivna u lečenju sisarskog subjekta koji je pod rizikom ili koji boluje od štetnih efekata akutnog radijacionog sindroma, zbog čega ispoljavaju terapeutsku efikasnost in vivo.

[0197] Sledeći primeri samo ilustruju najbolji način koji je sada razmotren za primenu pronalaska u praksi, ali ga ne treba smatrati kao ograničenje pronalaska.

PRIMER 1

[0198] Ovaj Primer opisuje rekombinantnu ekspresiju i produkciju rekombinantnog humanog, pacovskog i mišjeg MASP-2 cele dužine, polipeptida koji potiču od MASP-2 i katalitički inaktiviranih mutantnih oblika MASP-2.

Ekspresija humanog i pacovskog MASP-2 cele dužine:

[0199] cDNK sekvenca humanog MASP-2 cele dužine (SEQ ID NO: 1), koja kodira humani MASP-2 polipeptid sa lider sekvencom (SEQ ID NO:2) je bila subklonirana u sisarski ekspresioni vektor pCI-Neo (Promega), koji pokreće eukariotsku ekspresiju pod kontrolom CMV pojačavačkog/promoterskog regiona (opisano u Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). Pacovska MASP-2 cDNK cele dužine (SEQ ID NO:4), koja kodira pacovski MASP-2 polipeptid sa lider sekvencom (SEQ ID NO:5) je bila subklonirana u pED ekspresioni vektor. MASP-2 ekspresioni vektori su onda bili transfektovani u adherentnu ćelijsku liniju jajnih ćelija kineskog hrčka DXB1 korišćenjem standardne kalcijum fosfatne transfekcione procedure koja je opisana u Maniatis et al., 1989. Ćelije transfektovane ovim konstruktima rastu veoma sporo, što ukazuje da je kodirana proteaza citotoksična. Zreli oblik humanog MASP-2 proteina (SEQ ID NO:3) i zreli oblik pacovskog MASP-2 proteina (SEQ ID NO:6) su bili izlučeni u medijum za kultivaciju i bili su izolovani kao što je opisano dole.

Ekspresija katalitički neaktivnog MASP-2 cele dužine:

Obrazloženje:

[0200] MASP-2 je aktiviran autokatalitičkim sečenjem posle prepoznavanja potkomponenti MBL, C-tipa lektina CL-11, ili fikolina (bilo L-fikolina, H-fikolina ili M-fikolina), koji se kolektivno nazivaju lektini, vezivanjem za njihov odgovarajući ugljenohidratni skelet. Autokatalitičko sečenje rezultuje aktivacijom MASP-2 koja se često događa u toku procedure izolacije MASP-2 iz seruma, ili u toku prečišćavanja posle rekombinantne ekspresije. Da bi se dobio stabilniji proteinski preparat za korišćenje kao antigen, bio je stvoren katalitički neaktivan oblik MASP-2, označen sa MASP-2A, zamenom serinskog ostatka koji je prisutan u katalitičkoj trijadi domena proteaze sa alaninskim ostatkom u zrelom pacovskom MASP-2 proteinu (SEQ ID NO:6 Ser617 do Ala617); ili u zrelom humanom MASP-2 proteinu (SEQ ID NO:3 Ser618 do Ala618).

[0201] Da bi se generisali katalitički neaktivni humani i pacovski MASP-2A proteini, bila je izvedena mesno-usmerena mutageneza, kao što je opisano u US2007/0172483, koji je ovde uključen kao referenca. PCR proizvodi su bili prečišćeni posle elektroforeze na agaroznom gelu i pripreme trake, a samo pojedinačna adenozinska preklapanja su bila generisana korišćenjem standardne procedure praćenja. Adenozinom praćeni MASP-2A je onda bio kloniran u pGEM-T laki vektor, transformisan u E. coli. Svaki od humanog i pacovskog MASP-2A je bio dalje subkloniran u sisarske ekspresione vektore pED ili pCI-Neo i transfektovan je u ćelijsku liniju jajnih ćelija kineskog hrčka DXB1 kao što je opisano dole.

Konstrukcija ekspresionih plazmida koji sadrže polipeptidne regione koji potiču od humanog Masp-2.

[0202] Sledeći konstrukti su bili proizvedeni korišćenjem MASP-2 signalnog peptida (ostaci 1-15 SEQ ID NO:2) da bi se izlučili različiti domeni MASP-2. Konstrukt koji izražava humani MASP-2 CUBI domen (SEQ ID NO:7) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira ostatke 1-121 od MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju N-terminalnom CUB1 domenu). Konstrukt koji izražava humani MASP-2 CUBI/EGF domen (SEQ ID NO:8) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira ostatke 1-166 od MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju N-terminalnom CUBI/EGF domenu). Konstrukt koji izražava humani MASP-2 CUBI/EGF/CUBII domen (SEQ ID NO:9) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 1-277 od MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju N-terminalnom CUBIEGFCUBII domenu). Konstrukt koji izražava humani MASP-2 EGF domen (SEQ ID NO:10) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 122-166 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju EGF domenu). Konstrukt koji izražava humane MASP-2 CCPI/CCPII/SP domene (SEQ ID NO:11) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 278-671 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju CCPI/CCPII/SP domenima). Konstrukt koji izražava humane MASP-2 CCPI/CCPII domene (SEQ ID NO:12) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 278-429 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju CCPI/CCPII domenima). Konstrukt koji izražava CCPI domen MASP-2 (SEQ ID NO:13) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 278-347 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju CCPI domenu). Konstrukt koji izražava CCPII/SP domene MASP-2 (SEQ ID NO:14) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 348-671 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju CCPII/SP domenima). Konstrukt koji izražava CCPII domen MASP-2 (SEQ ID NO:15) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 348-429 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju CCPII domenu). Konstrukt koji izražava SP domen MASP-2 (SEQ ID NO:16) je bio napravljen PCR amplifikacijom regiona koji kodira aa ostatke 429-671 MASP-2 (SEQ ID NO:3) (koji odgovaraju SP domenu).

[0203] Gore navedeni MASP-2 domeni su bili amplifikovani pomoću PCR korišćenjem VentR polimeraze i pBS-MASP-2 kao šablona, prema utvrđenim PCR metodima.5’ prajmerska sekvenca sensnog prajmera je bila uvedena u BamHI restrikciono mesto (podvučeno) na 5’ kraju PCR proizvoda. Antisensni prajmeri za svaki od MASP-2 domena su bili konstruisani tako da uvedu stop kodon praćen EcoRI mestom na kraju svakog PCR proizvoda. Kada su jednom bili amplifikovani, DNK fragmenti su bili digestirani sa BamHI i EcoRI i klonirani su na odgovarajuća mesta pFastBac1 vektora. Rezultujući konstrukti su bili karakterisani restrikcionim mapiranjem i potvrđeni dsDNK sekvenciranjem.

Rekombinantna eukariotska ekspresija MASP-2 i proizvodnja proteina enzimski neaktivnog pacovskog i humanog MASP-2A.

[0204] MASP-2 i MASP-2A ekspresioni konstrukti koji su gore opisani su bili transfektovani u DXB1 ćelije korišćenjem standardne kalcijum fosfatne transfekcione procedure (Maniatis et al., 1989). MASP-2A je bio proizveden u serumu bez medijuma da bi se obezbedilo da preparati ne budu kontaminirani drugim serumskim proteinima. Medijum konfluentnih ćelija je bio sakupljan svakog drugog dana (ukupno četiri puta). Nivo rekombinantnog MASP-2A je prosečno bio približno 1.5 mg/litru medijuma za kultivaciju svake od dve vrste.

[0205] Prečišćavanje MASP-2A proteina: MASP-2A (Ser-Ala mutant koji je gore opisan) je bio prečišćen afinitetnom hromatografijom na MBP-A-agaroznim kolonama. Ova strategija je omogućila brzo prečišćavanje bez korišćenja dodatnih tagova. MASP-2A (100-200 ml medijuma razređenog jednakom zapreminom svakog pufera za nanošenje (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, koji je sadržao 150 mM NaCl i 25 mM CaCl2) je bio stavljen na MBP-agaroznu afinitetnu kolonu (4 ml) prethodno uravnoteženu sa 10 ml pufera za nanošenje. Posle ispiranja sa još 10 ml pufera za nanošenje, protein je bio eluiran u frakcijama od 1 ml sa 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, koji je sadržao 1.25 M NaCl i 10 mM EDTA. Frakcije koje su sadržale MASP-2A su bile identifikovane pomoću SDS-poliakrilamidne gel elektroforeze. Ukoliko je bilo potrebno, MASP-2A je bio dalje prečišćen jonoizmenjivačkom hromatografijom na MonoQ koloni (HR 5/5). Protein je bio dijalizovan sa 50 mM Tris-Cl pH 7.5, koji je sadržao 50 mM NaCl i nanet je na kolonu uravnoteženu u istom puferu. Posle ispiranja, vezani MASP-2A je bio eluiran sa 0.05-1 M NaCl gradijentom preko 10 ml.

[0206] Rezultati: Prinosi od 0.25-0.5 mg MASP-2A proteina su bili dobijeni iz 200 ml medijuma. Molekulska masa od 77.5 kDa koja je određena pomoću MALDI-MS je veća od izračunate vrednosti nemodifikovanog polipeptida (73.5 kDa) zbog glikozilacije. Vezivanje glikana na svako od N-glikozilacionih mesta je odgovorno za uočenu masu. MASP-2A migrira kao jedna jedina traka na SDS-poliakrilamidnim gelovima, što pokazuje da ona nije proteolitički prerađena u toku biosinteze. Težinski uprosečena molekulska masa je bila određena ravnotežnim ultracentrifugiranjem u skladu sa izračunatom vrednosti za homodimere glikozilovanog polipeptida.

PRIMER 2

[0207] Ovaj Primer opisuje metod skrininga koji je bio upotrebljen za identifikaciju visoko-afinitetnih potpuno humanih anti-MASP-2 scFv antitela kandidata koja blokiraju MASP-2 funkcionalnu aktivnost za progresiju u afinitetno sazrevanje.

Polazište i obrazloženje:

[0208] MASP-2 je kompleksni protein sa mnogim posebnim funkcionalnim domenima, koji obuhvataju: mesto, odnosno mesta vezivanja za MBL i fikoline, serin proteazno katalitičko mesto, mesto vezivanja za proteolitički supstrat C2, mesto vezivanja za proteolitički supstrat C4, MASP-2 mesto sečenja za autoaktivaciju MASP-2 zimogena, i dva mesta vezivanja Ca<++>. Bili su identifikovani fragmenti scFv antitela koji se vezuju sa visokim afinitetom za MASP-2, a identifikovani Fab2 fragmenti su bili testirani u funkcionalnom testu da bi se odredilo da li su oni bili sposobni da blokiraju MASP-2 funkcionalnu aktivnost.

[0209] Da bi se blokirala MASP-2 funkcionalna aktivnost, antitelo ili fragment antitela scFv ili Fab2 se mora vezivati i uticati na strukturni epitop na MASP-2 koji je potreban za MASP-2 funkcionalnu aktivnost. Zato mnoga ili sva anti-MASP-2 scFvs ili Fab2s sa visokim afinitetom vezivanja ne moraju inhibirati MASP-2 funkcionalnu aktivnost, osim ako se vezuju za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u MASP-2 funkcionalnu aktivnost.

[0210] Funkcionalni test koji meri inhibiciju formiranja C3 konvertaze lektinskog puta je bio upotrebljen za evaluaciju "blokirajuće aktivnosti" anti-MASP-2 scFvs. Poznato je da je primarna fiziološka uloga MASP-2 u lektinskom putu da generiše sledeću funkcionalnu komponentu lektinom-posredovanog puta komplementa, odnosno C3 konvertaze lektinskog puta. C3 konvertaza lektinskog puta je kritični enzimski kompleks (C4b2a) koji proteolitički seče C3 na C3a i C3b. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4b2a); međutim, MASP-2 funkcionalna aktivnost je potrebna da bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje sadrže C3 konvertazu lektinskog puta. Pored toga, sve posebne funkcionalne aktivnosti MASP-2 koje su gore navedene su izgleda potrebne da bi MASP-2 generisao C3 konvertazu lektinskog puta. Iz ovih razloga, smatra se da je poželjni test za korišćenje u evaluaciji "blokirajuće aktivnosti" fragmenata antitela anti-MASP-2 Fab2s i scFv funkcionalni test koji meri inhibiciju formiranja C3 konvertaze lektinskim putem.

[0211] Predviđeni ciljni profil za terapeutska anti-MASP-2 antitela koji doprinosi >90% ablaciji lektinskog puta in vivo posle administracije 1 mg/kg čoveku je IC50 <5nM u 90% plazme. Odnos između in vitro farmakološke aktivnosti u ovim formatima testa i in vivo farmakodinamika je bila eksperimentalno validirana korišćenjem antiglodarskih MASP-2 antitela.

[0212] Kriterijumi za selekciju prve generacije MASP-2 blokirajućih antitela za terapeutsku primenu su kao što sledi: visoki afinitet za MASP-2 i funkcionalne IC50 vrednosti do ~25 nM. Pored toga, kandidati su bili podvrgnuti skriningu u pogledu unakrsne-reaktivnosti sa nehumanim primatskim serumom, i sa pacovskim serumom.

Metodi:

Skrining scFv fagemidne biblioteke protiv MASP-2 antigena

Antigeni:

[0213] Humani MASP-2A sa N-terminalnim 5X His tagom, i pacovski MASP-2A sa N-terminalnim 6X His tagovima su bili generisani korišćenjem reagenasa opisanih u Primeru 1 i prečišćenih iz supernatanta kulture pomoću nikl-afinitetnog hromatografa, kao što je prethodno opisano (Chen et al., J. Biol. Chem.276:25894-02 (2001)).

[0214] OMS100, humano anti-MASP-2 antitelo u Fab2 formatu, bilo je upotrebljeno kao pozitivna kontrola za vezivanje MASP-2.

Opis fagemidne biblioteke:

[0215] Biblioteka za prikazivanje na fagima sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog i teškog lanca je bila podvrgnuta paniranju antigena putem automatizovanog skrininga antitela i selekcije radi identifikacije visoko afinitetnih scFv antitela za pacovski MASP-2 protein i humani MASP-2 protein.

Metodi paniranja:

[0216] Rezime: Dve strategije paniranja su bile upotrebljene za izolovanje iz fagemidne biblioteke faga koji se vezuju za MASP-2 u ukupno tri ciklusa paniranja. Obe strategije su uključivale paniranje u rastvoru i izlovljavanje faga vezanog za MASP-2. MASP-2 je bio imobilizovan na magnetnim perlama bilo preko His-tag (korišćenjem NiNTA perli) ili preko biotina (korišćenjem Streptavidin perli) na cilju.

[0217] Prva dva ciklusa paniranja su uključivala alkalno eluiranje (TEA), a treći ciklus paniranja je bio prvo eluiran kompetitivno sa MBL pre uobičajenog koraka alkalnog (TEA) eluiranja. Negativna selekcija je bila izvedena pre ciklusa 2 i 3, i ovo je bilo protiv funkcionalnih analoga, C1s i C1r klasičnog puta komplementa. Posle paniranja je bilo praćeno specifično obogaćivanje faga sa scFv fragmentima protiv MASP-2A, pa je bilo utvrđeno da li je strategija paniranja bila uspešna (podaci nisu prikazani).

[0218] scFv geni iz ciklusa paniranja 3 su bili klonirani u pHOG ekspresionom vektoru, i podvrgnuti su filterskom skriningu u maloj razmeri da bi se potražili specifični klonovi protiv MASP-2A, kao što je dole opisano.

TABELA 7: Metode paniranja faga (biotin/streptavidin)

TABELA 8: Metode paniranja faga (HIS/NiNTA)

Reagensi za paniranje:

[0219]

Humani MASP-2A

OMS100 antitelo (pozitivna kontrola)

Kozji anti-humani IgG (H+L) (Pierce #31412)

NiNTA perle (Qiagen #LB13267)

Dynabeads® M-280 Streptavidin, 10 mg/ml (LB12321)

Normalni humani serum (LB 13294)

Poliklonski zečji anti-humani C3c (LB13137)

Kozji anti-zečji IgG, HRP (American Qualex #A102PU)

[0220] Da bi se testirao tagovani MASP-2A antigen, bio je izveden eksperiment kako bi se uhvatilo pozitivno kontrolno OMS100 antitelo (200 ng/ml) koje je prethodno inkubirano sa biotinom-tagovanim MASP-2A ili HIS-tagovanim MASP-2A antigenom (10 μg), sa 50 μl NiNTA perli u 4% mleka PBS ili 200 μl Streptavidin perli, respektivno. Vezano MASP-2A-OMS100 antitelo je bilo detektovano sa kozjim-antihumanim IgG (H+L) HRP (1:5000) i TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin) supstratom.

ELISA test sa NiNTA perlama

[0221] 50 μl NiNTA perli je bilo blokirano sa 1 ml 4% mleka u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru (PBS), pa je inkubirano na rotacionom točku tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Paralelno, 10 μg MASP-2A i OMS100 antitela (razređenog do 200 ng/ml u 4% mleka-PBS) je bilo prethodno inkubirano tokom jednog sata. Perle su onda bile isprane tri puta sa 1 ml PBS-T korišćenjem magneta između svakog koraka. MASP-2A prethodno inkubiran sa OMS100 antitelom je bio dodat ovim ispranim perlama. Smeša je bila inkubirana na rotacionom točku tokom 1 h na ST, a onda je isprana tri puta sa 1 ml PBS-T uz korišćenje magneta kao što je gore opisano. Epruvete su bile inkubirane 1 h na ST sa kozjim anti-humanim IgG (H+L) HRP razređenim 1:5000 u 4% mleka u PBS. Za negativne kontrole, bio je dodat kozji-anti-humani IgG (H+L) HRP (1:5000) ispranim i blokiranim NiNTA perlama u posebnoj epruveti.

[0222] Uzorci su bili inkubirani na rotacionom točku tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a onda su isprani tri puta sa 1 ml PBS-T i jednom sa 1x PBS korišćenjem magneta kao što je gore opisano. Bilo je dodato 100 μl TMB supstrata, pa je inkubirano 3 min na sobnoj temperaturi. Epruvete su bile stavljene u magnetni stalak na 2 min da bi se perle koncentrisale, a onda je TMB rastvor bio prenet u mikrotitarsku ploču, pa je reakcija bila zaustavljena sa 100 μl 2M H2SO4. Apsorbansa na 450nm je bila očitana u ELISA čitaču.

ELISA test sa streptavidin perlama

[0223] Ovaj test je bio izveden kao što je gore opisano za ELISA test sa NiNTA perlama, ali korišćenjem 200 μl Streptavidin perli po uzorku umesto njih, i nebiotinilovanih antigena.

[0224] Rezultati: His-tagovani i biotinom-tagovani MASP-2A antigeni, preinkubirani sa pozitivnom kontrolom OMS100 antitelom, bili su uspešno uhvaćeni NiNTA perlama, ili Streptavidin perlama, respektivno.

Paniranje

[0225] Tri ciklusa paniranja scFv biblioteke faga protiv HIS-tagovanog ili biotinomtagovanog MASP-2A su bila izvedena kao što je prikazano u TABELI 7 ili TABELI 8, respektivno. Treći ciklus paniranja je bio eluiran prvo sa MBL, a onda sa TEA (alkalni). Da bi se pratilo specifično obogaćivanje faga koji prikazuju scFv fragmente protiv ciljnog MASP-2A, poliklonska fagna ELISA protiv imobilizovanog MASP-2A je bila izvedena kao što je opisano dole.

MASP-2A ELISA na poliklonskim fagima obogaćenim posle paniranja

[0226] Posle tri ciklusa paniranja sa scFv bibliotekom faga protiv humanog MASP-2 kao što je opisano gore, specifično obogaćivanje faga sa scFv fragmentima protiv ciljnog MASP-2A je bilo praćeno izvođenjem ELISA testa na obogaćenim poliklonskim populacijama faga generisanim paniranjem protiv imobilizovanog MASP-2A kao što je opisano dole.

Metode:

[0227] 5 ng/ml MASP-2A je bilo imobilizovano na Maxisorp ELISA pločama u PBS preko noći na 4°C. Pakovani fagi iz sva tri ciklusa paniranja su bili razređeni 1:3 u 4% mleka-PBS i titrirani sa 3-strukim razređenjima. Negativna kontrola je bio M13 pomoćni fag.

[0228] Blok je bio 4% mleka u PBS. Ploče su bile isprane 3x u 200 μl PBS-Tween 0.05% (v/v) između svakog koraka. Primarno antitelo je bilo zečje α-fd (M13 obloženi protein), 1:5000 u 4% mleka-PBS (w/v). Konjugat je bio zečji α-kozji-HRP sa 1:10.000 u 4% mleka-PBS (w/v). Supstrat je bio ABTS. Sve zapremine, izuzev ispiranja i blokiranja, bile su 100 μl/bunarčiću. Sve inkubacije su bile 1 sat uz mućkanje na sobnoj temperaturi.

Rezultati:

[0229] Rezultati fagne ELISE pokazali su specifično obogaćivanje sa scFv’s protiv MASP-2A za obe strategije paniranja. Vidi SLIKU 2. Kao što je prikazano na SLICI 2, ta strategija koja uključuje hvatanje pomoću NiNTA magnetnih perli je dala obogaćivanje scFv na fagima protiv MASP-2A posle dva ciklusa paniranja, dok su obe strategije imale dobra obogaćivanja i u kompetitivnom, i TEA eluiranju, posle trećeg ciklusa paniranja. Fag negativne kontrole je bio M13 pomoćni fag, koji nije ispoljio unakrsnu reakciju protiv MASP-2A za svoje najmanje razređenje. Ovi rezultati pokazuju da je signal uočen usled scFv specifičnog vezivanja za MASP-2A.

Filterski skrining:

[0230] Bakterijske kolonije koje sadrže plazmide koji kodiraju scFv fragmente iz trećeg ciklusa paniranja su bile sakupljene, pa su rešetkasto nanete na nitrocelulozne membrane i rasle su preko noći na neindukujućem medijumu da bi se proizvele osnovne ploče. Bilo je sakupljeno i analizirano ukupno 18,000 kolonija iz trećeg ciklusa paniranja, polovina od kompetitivnog eluiranja i polovina od sledstvenog TEA eluiranja.

[0231] Nitrocelulozne membrane sa bakterijskim kolonijama su bile indukovane sa IPTG da bi izrazile i izlučile rastvorljivi scFv protein i bile su dovedene u kontakt sa sekundarnom nitroceluloznom membranom prevučenom MASP-2A antigenom zajedno sa paralelnom membranom prevučenom sa 4% mleka u PBS (blokirajući rastvor).

[0232] ScFvs koji se vezao za MASP-2A je bio detektovan preko njihovog c-Myc taga sa mišjim α-cMyc mAb i zečjim α-mišjim HRP. Pogoci koji su odgovarali scFv klonovima koji su bili pozitivni na MASP-2A i negativni na mleko-PBS su bili izabrani za dalju ekspresiju, i sledstvenu ELISA analizu.

[0233] Rezultati: Paniranje scFv fagemidne biblioteke protiv MASP-2A praćeno scFv konverzijom i filterskim skriningom dalo je 137 pozitivnih klonova. Većina pozitivnih klonova poticala je od kompetitivnog eluiranja sa MBL, korišćenjem i NiNTA i Streptavidin strategija. Svi pozitivni klonovi su nastavili sa mikro ekspresijom (200 μl razmera) i sledstvenom ekstrakcijom. ScFv su bili izolovani iz periplazme bakterija inkubacijom bakterijske suspenzije sa puferom za lizu saharoze i lizozimom tokom jednog sata, posle čega je supernatant bio izolovan korakom centrifugiranja.

Supernatant koji je sadržao scFv izlučen u medijum zajedno sa sadržajem periplazme je bio analiziran pomoću dva testa: ELISOM uz korišćenje fizički adsorbovanog MASP-2A, i analize vezivanja korišćenjem MASP-2A kuplovanog sa aminom na CM5 čipu na Biocore, kao što je detaljnije opisano dole.

MASP-2A ELISA na ScFv klonovima kandidatima identifikovanim paniranjem/ scFv konverzijom i filterskim skriningom

Metode:

[0234] 4 mg/ml MASP-2A je bilo imobilizovano na Maxisorp ELISA pločama (Nunc) u PBS preko noći na 4°C. Sledećeg dana su ploče bile blokirane ispiranjem tri puta sa PBS-Tween (0.05%). Sirovi scFv materijal (100 μl ekstrakta medijumaperiplazme) od svakog od 137 scFv kandidata (generisanih kao što je opisano gore) je bio dodat u bunarčiće ploče. Kao sledeće je bio dodat anti-cMyc, i u finalnom koraku HRP-konjugovano zečje anti-mišje je bilo primenjeno za detekciju vezanog scFv. Reakcija je bila razvijena u peroksidaznom supstratu 1-koraku ABTS (Calbiochem). Pozitivna kontrola je bilo OMS100 (anti-MASP-2 antitelo u Fab2 formatu) razređeno do 10 μg/ml u PBS-Tween 0.05%. Negativna kontrola je bila medijum-periplazma od XL1-Blue bez plazmida.

[0235] Ispiranja sa 3x 200 ml PBS-Tween 0.05% (v/v) su bila izvedena između svakog koraka.

[0236] Primarno antitelo je bilo mišje α-cMyc, 1:5000 u PBS-Tween 0.05% (w/v).

[0237] Konjugat je bio zečji α-kozji-HRP sa 1:5000 u PBS-Tween 0.05% (w/v) ili Kozji anti-humani IgG (H+L, Pierce 31412). Supstrat je bio ABTS, sa 15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi. Sve zapremine, izuzev ispiranja i blokiranja, bile su 100 μl/bunarčiću. Sve inkubacije su bile tokom 1 sata sa mućkanjem na sobnoj temperaturi.

[0238] Rezultati: 108/137 klonova je bilo pozitivno u ovom ELISA testu (podaci nisu prikazani), od kojih je 45 klonova bilo dalje analizirano kao što je opisano dole.

Pozitivna kontrola je bilo OMS100 Fab2 razređeno do 10 μg/ml u PBS-Tween, i ovaj klon je bio pozitivan. Negativna kontrola je bila medijum-periplazma od XL1-Blue bez plazmida, koja je bila negativna.

PRIMER 3

[0239] Ovaj primer opisuje MASP-2 funkcionalni metod skrininga koji je bio korišćen za analizu visoko-afinitetnih potpuno humanih anti-MASP-2 scFv antitela kandidata u pogledu sposobnosti da blokiraju MASP-2 aktivnost u normalnom humanom serumu.

Obrazloženje/polazište

Test za merenje inhibicije formiranja C3 konvertaze lektinskog puta:

[0240] Funkcionalni test koji meri inhibiciju formiranja C3 konvertaze lektinskog puta je bio primenjen za evaluaciju "blokirajuće aktivnosti" anti-MASP-2 scFv klonova kandidata. C3 konvertaza lektinskog puta je enzimski kompleks (C4b2a) koji proteolitički seče C3 na dva potentna prozapaljenska fragmenta, anafilatoksin C3a i opsonični C3b. Formiranje C3 konvertaze je izgleda ključni korak u lektinskom putu u pogledu posredovanja zapaljenja. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4b2a); zbog toga anti-MASP-2 antitela (ili Fab2) neće direktno inhibirati aktivnost prethodno postojeće C3 konvertaze. Međutim, MASP-2 serin proteazna aktivnost je potrebna da bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje sadrže C3 konvertazu lektinskog puta. Zbog toga će anti-MASP-2 scFv koje inhibira MASP-2 funkcionalnu aktivnost (tj. blokirajući anti-MASP-2 scFv) inhibirati de novo formiranje C3 konvertaze lektinskog puta. C3 sadrži neuobičajenu i visoko reaktivnu tioestarsku grupu kao deo svoje strukture. Posle sečenja C3 pomoću C3 konvertaze u ovom testu, tioestarska grupa na C3b može formirati kovalentnu vezu sa hidroksilnim ili amino grupama na makromolekulima imobilizovanim na dnu plastičnih bunarčića preko estarskih ili amidnih veza, čime se olakšava detekcija C3b u ELISA testu.

[0241] Kvaščev manan je poznati aktivator lektinskog puta. U sledećem metodu za merenje formiranja C3 konvertaze, plastični bunarčići obloženi mananom su bili inkubirani sa razređenim humanim serumom da bi se aktivirao lektinski put.

Bunarčići su onda bili isprani i testirani u pogledu C3b imobilizovanog na bunarčićima uz korišćenje standardnih ELISA metoda. Količina C3b generisanog u ovom testu je direktan odraz de novo formiranja C3 konvertaze lektinskog puta. Anti-MASP-2 scFv’s u izabranim koncentracijama su bila testirana u ovom testu u pogledu svoje sposobnosti da inhibiraju formiranje C3 konvertaze i sledstveno generisanje C3b.

Metode:

[0242] 45 klonova kandidata identifikovanih kao što je opisano u Primeru 2 je bilo izraženo, prečišćeno i razređeno do iste koncentracije rastvora, koji je bio ponovo razređen u GVB puferu koji je sadržao Ca<++>i Mg<++>(4.0 mM barbitala, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatina, pH 7.4) da bi se obezbedilo da svi klonovi imaju istu količinu pufera. Svaki od scFv klonova je bio testiran u triplikatu u koncentraciji od 2 μg/ml. Pozitivna kontrola je bilo OMS100 Fab2 i testirano je sa 0.4 μg/ml. Formiranje C3c je bilo praćeno u prisustvu i odsustvu scFv/IgG klonova.

[0243] Manan je bio rastvoren do koncentracije od 20 μg/ml (1 mg/bunarčiću) u 50mM karbonatnog pufera (15mM Na2CO3 35mM NaHCO3 1.5 mM NaN3), pH 9.5 i njime je prevučena ELISA ploča preko noći na 4°C. Sledećeg dana, mananom obložene ploče su bile isprane 3X sa 200 μl PBS.100 μl 1% HSA blokirajućeg rastvora je onda bilo dodato u bunarčiće i inkubirani su tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su bile isprane 3X sa 200 μl PBS, i čuvane su na ledu sa 200 μl PBS sve do dodavanja uzoraka.

[0244] Normalni humani serum je bio razređen do 0.5% u CaMgGVB puferu, i scFv klonovi ili OMS100 Fab2 pozitivna kontrola su bili dodati u triplikatima sa 0.01 μg/ml; 1 μg/ml (samo OMS100 kontrola) i 10 μg/ml ovom puferu i preinkubiran je 45 minuta na ledu pre dodavanja blokiranoj ELISA ploči. Reakcija je bila inicirana inkubacijom tokom jednog sata na 37°C i bila je zaustavljena prenošenjem ploča u ledeno kupatilo. C3b taloženje je bilo detektovano zečje α-mišjim C3c antitelom, što je bilo praćeno kozje α-zečjim HRP. Negativna kontrola je bio pufer bez antitela (bez OMS100 = maksimalno C3b taloženje), a pozitivna kontrola je bio pufer sa EDTA (bez C3b taloženja). Pozadinska vrednost je bila određena izvođenjem istog testa, ali u manan negativnim bunarčićima. Pozadinski signal protiv ploče bez manana je bio oduzet od manan pozitivnih signala. Kriterijum za odsecanje je bio podešen na polovinu aktivnosti irelevantnog scFv klona (VZV) i samog pufera.

[0245] Rezultati: Bazirano na kriterijumu za odsecanje, utvrđeno je da je ukupno 13 klonova blokiralo aktivnost MASP-2 kao što je prikazano na SLIKAMA 3A i 3B. Svih 13 klonova koji su proizveli > 50% supresije puta je bilo selekcionisano i sekvencirano dajući 10 jedinstvenih klonova, kao što je prikazano dole u TABELI 9. Za deset različitih klonova prikazanih u TABELI 9 je bilo utvrđeno da rezultuju prihvatljivom funkcionalnom aktivnosti u testu komplementa. Utvrđeno je da svih deset klonova ima istu potklasu lakog lanca, λ3, ali tri različite potklase teškog lanca, VH2, VH3 i VH6. Identičnost sekvenci klonova sa sekvencama germinativne linije je takođe prikazana u TABELI 9.

[0246] Kao što je prikazano gore u TABELI 9, 10 različitih klonova sa prihvatljivom funkcionalnom aktivnošću i jedinstvenim sekvencama je bilo izabrano za dalju analizu. Kao što je navedeno u TABELI 9, neki od klonova su bili detektovani dva ili tri puta, bazirano na identičnosti sekvenci (vidi prvu kolonu TABELE 9 sa imenima klonova).

Ekspresija i prečišćavanje deset svFc klonova kandidata

[0247] Deset klonova kandidata prikazanih u TABELI 9 je bilo izraženo u razmeri od jednog litra i prečišćeno je izmenom jona u nikl hromatografiji. Posle toga je uzorak svakog klona bio puštan na koloni za hromatografiju isključenjem po veličini da bi se odredio sadržaj monomera i dimera. Kao što je prikazano dole u TABELI 10, skoro svi scFv klonovi su bili prisutni u obliku monomera, i ova frakcija monomera je bila izolovana radi daljeg testiranja i rangiranja.

TABELA 10: Analiza sadržaja monomera

Testiranje frakcije monomera u pogledu vezivanja i funkcionalne aktivnosti

[0248] Klonovi prikazani u TABELI 10 su bili izraženi u razmeri od 1 L, pa su prečišćeni na metalnoj hromatografiji i izmeni jona, te su razdvojeni u frakcije monomera hromatografijom isključenjem po veličini (SEC), a funkcionalni testovi su bili ponovljeni da bi se odredile IC50 vrednosti i unakrsna-reaktivnost.

Funkcionalni test na frakcijama monomera:

[0249] Frakcija monomera od gornjih deset klonova, prikazanih u TABELI 10, bila je prečišćena i testirana u vezi funkcionalnog IC50 nM u serijama razređivanja u kojima je svako primilo isti koncentraciju GVB pufera sa kalcijumom i magnezijumom i humanim serumom. scFv klonovi su bili testirani u 12 razređenja u triplikatu.

Pozitivna kontrola je bilo OMS100 Fab2. C3b taloženje je bilo praćeno u prisustvu i odsustvu antitela. Rezultati su prikazani dole u TABELI 11.

Test vezivanja:

[0250] Afinitet vezivanja KD je bio određen na dva različita načina za prečišćene frakcije monomera od deset scFv klonova kandidata. MASP-2A je bio imobilizovan kuplovanjem aminom na CM5 čipu, ili je fiksna koncentracija scFv (50 nM) bila prvo uhvaćena visoko afinitetnim α-cMyc antitelom kuplovanim sa aminom, pa je sledeći niz koncentracija MASP-2A u rastvoru bio propušten preko čipa. Rezultati su prikazani dole u TABELI 11.

Rezultati:

[0251]

TABELA 11: Rezime funkcionalne inhibitorne aktivnosti (IC50) i MASP-2 afiniteta vezivanja (KD) za deset scFv klonova kandidata testiranih u monomernom stanju

Diskusija rezultata:

[0252] Kao što je prikazano u TABELI 11, u funkcionalnom testu, pet od deset scFv klonova kandidata je dalo IC50 nM vrednosti manje od 25 nM ciljnog kriterijuma uz korišćenje 0.5% humanog seruma. Kao što je opisano dole, ovi klonovi su bili dalje testirani u prisustvu nehumanog primatskog seruma i pacovskog seruma da bi se odredila funkcionalna aktivnost kod drugih vrsta. Što se tiče afiniteta vezivanja, u rastvoru, svi afiniteti vezivanja su bili u opsegu niskog nM ili bolji, dok su u uobičajenom testu sa imobilizovanim MASP-2, samo dva klona (4D9 i 17D20) imala afinitete u niskom nM opsegu. Opservacija viših afiniteta u testu baziranom na rastvoru je verovatno nastala usled činjenice da se antigen multimerizuje kada je u rastvoru. Takođe, kada je cilj imobilizovan na čipu (putem orijentisanog kuplovanja) epitop može biti maskiran, čime se smanjuju uočeni afiniteti u testu sa imobilizacijom.

PRIMER 4

[0253] Ovaj Primer opisuje rezultate testiranja deset humanih anti-MASP-2 scFv klonova kandidata u pogledu unakrsne reaktivnosti sa pacovskim MASP-2 i određivanje IC50 vrednosti ovih scFv klonova u funkcionalnom testu da bi se odredila njihova sposobnost da inhibiraju MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa u humanom serumu, nehumanom primatskom serumu, i pacovskom serumu.

Metode:

Unakrsna reaktivnost sa pacovskim MASP-2

[0254] Deset scFv klonova kandidata, prikazanih u TABELI 9 u Primeru 3, bili su testirani u pogledu unakrsne-reaktivnosti protiv pacovskog MASP-2A u uobičajenom ELISA testu protiv adsorbovanog pacovskog MASP-2A. Pacovski MASP-2A je bio razređen na 4 μg/ml u PBS i njime je obložena Maxisorp ELISA ploča (Nunc) preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploča je bila blokirana ispiranjem tri puta u PBS-Tween (0.05%). ScFv klonovi (100 μl) razređeni u 20 μg/ml u PBS-Tween su bili dodati u ploču, i dalje su titrirani sa 4-strukim razređenjima tri puta. MASP-2A specifični svFc klonovi (bunarčići koji su sadržali vezano scFv) su bili detektovani sa anti-cMyc i zečjim anti-mišjim HRP sekundarnim antitelom. Reakcija je bila razvijena u peroksidaznom supstratu TMB (Pierce). Pozitivna kontrola je bilo OMS100 Fab2 razređeno na 10 μg/ml u PBS-Tween. Svi testirani klonovi su ispoljili unakrsnu reakciju sa pacovskim MASP-2A, što je bilo očekivano pošto je drugi ciklus paniranja bio sa pacovskim MASP-2 (podaci nisu prikazani).

Funkcionalna karakterizacija deset scFv klonova kandidata u humanom serumu, nehumanom primatskom (NHP) serumu i pacovskom serumu

Određivanje osnovne linije C3c nivoa u različitim serumima

[0255] Prvo je bio izveden eksperiment za upoređivanje osnovne linije C3b nivoa u tri seruma (humani, pacovski i NHP) kao što sledi.

[0256] Manan je bio razređen na 20 μg/ml i njime je obložena ELISA ploča preko noći na 4°C. Sledećeg dana su bunarčići bili blokirani sa 1% HSA. Normalni humani, pacovski i serum afričkih zelenih majmuna (nehumani primatski "NHP") serum je bio razređen počevši od 2% sa dvostrukim razređenjima u CaMgGVB puferu. Reakcija je bila inicirana inkubacijom tokom jednog sata na 37°C, a bila je zaustavljena prenošenjem ploče u ledeno kupatilo. C3b taloženje je bilo detektovano zečjim antimišjim C3c antitelom, što je bilo praćeno kozjim anti-zečjim HRP. Negativna kontrola je bio pufer bez antitela (bez OMS100 rezultira maksimalnim C3b taloženjem) i pozitivna kontrola za inhibiciju je bio pufer sa EDTA (bez C3b taloženja).

[0257] SLIKA 4 grafički prikazuje osnovnu liniju C3c nivoa u tri seruma (humani, pacovski i NHP). Kao što je prikazano na SLICI 4, C3c nivoi su bili veoma različiti u različitim testiranim serumima. Kada se upoređuju C3c nivoi, izgleda da je 1% humanog seruma dalo ekvivalentne nivoe kao 0.2% NHP i 0.375% pacovskog seruma. Na osnovu ovih rezultata, koncentracije seruma su bile normalizovane tako da bi scFv rezultati mogli da se direktno uporede u tri različita tipa seruma.

Funkcionalni test ScFv klonova u različitim serumima

[0258] Prečišćene frakcije monomera od deset scFv klonova kandidata su onda bile testirane u pogledu funkcionalnog IC50 nM u humanom serumu, pacovskom serumu i serumu afričkih zelenih majmuna (nehumani primat "NHP"). Test je bio izveden kao što je opisano u Primeru 3, korišćenjem 1000 nM scFv prečišćenog proteina i normalnog humanog seruma koji je bio razređen do 0.9% u CaMgGVB puferu; seruma afričkih zelenih majmuna koji je bio razređen do 0.2% u CaMgGVB puferu; ili pacovskog seruma koji je bio razređen do 0.375% u CaMgGVB puferu. Svih deset scFv klonova je bilo testirano u serijama razređivanja u kojima su primili istu koncentraciju GVB pufera sa kalcijumom i magnezijumom i serumom. scFv klonovi su bili testirani u dvanaest razređenja u triplikatima. Pozitivna kontrola je bilo OMS100 Fab2 za 100 ng/ml ili dodatak EDTA reakciji. Negativna kontrola je bila irelevantna scFv kontrola ili PBS bez scFv. C3b taloženje je bilo praćeno u prisustvu i odsustvu scFv ili Fab2 antitela. Pozadinski signal OMS100 za 100 ng/ml je bio oduzet od svih signala. TABELA 12 rezimira rezultate funkcionalnih testova u sva tri seruma.

TABELA 12: Funkcionalna IC50 (nM) aktivnost scFv klonova u tri različita tipa seruma.

Rezime rezultata funkcionalne aktivnosti u scFv klonovima kandidatima u različitim serumima:

[0259] Svih deset scFv klonova je ispoljilo funkciju i u humanom, i u serumu nehumanih primata (NHP) pošto su serumi bili normalizovani u odnosu na nivoe C3b taloženja. Šest najaktivnijih klonova u humanom serumu su bili:

9P13>17N16>17D20>4D9>3F22>18L16, koji su rangirani od najboljeg do najgoreg. U NHP serumu, klonovi su rangirani (od najboljeg do najgoreg):

17L20>17N16>17D20>9P13>18L16>3F22. I 17N16, i 17D20 su rangirani u tri najbolja i za humani, i za NHP serum.17D20 je takođe ispoljio izvesnu aktivnost u pacovskom serumu.

[0260] Na osnovu ovih rezultata, utvrđeno je da su najbolja tri scFv klona bili: 18L16, 17D20 i 17N16. Ova tri klona su bila dalje analizirana u razređenju humanog seruma (1% seruma) kao što je prikazano dole u TABELI 13.

TABELA 13: C3 Test tri klona kandidata: (IC50 nM) u razređenju seruma (1%)

[0261] SLIKA 5A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci scFv klonova cele dužine 17D20, 18L16, 4D9, 17L20, 17N16, 3F22 i 9P13. scFv klonovi sadrže varijabilni region teškog lanca (aa1-120), region linkera (aa121-145), i varijabilni region lakog lanca (aa 146-250). Kao što je prikazano na SLICI 5A, poravnanje regiona teškog lanca (ostaci 1-120) najaktivnijih klonova otkriva dve karakteristične grupe koje pripadaju VH2 i VH6 genskoj familiji, respektivno. Kao što je prikazano na SLICI 5A, VH region u pogledu klonova VH2 klase: 17D20, 18L16 i 4D9 ima varijabilnost na 20 aa pozicija u regionu od ukupno 120 aminokiselina (tj.83% identičnosti).

[0262] Kao što je dalje prikazano na SLICI 5A, VH region u pogledu klonova VH6 klase: 17L20, 17N16, 3F22, i 9P13, ima varijabilnost na 18 aa pozicija u regionu od ukupno 120 aminokiselina (tj.85% identičnosti).

[0263] SLIKA 5B je poravnanje sekvenci scFv klonova 17D20, 17N16, 18L16 i 4D9.

TABELA 14: Sekvenca ScFv klonova kandidata prikazanih na SLIKAMA 5A i 5B

[0264] Prioriteti u rangiranju su bili (1) funkcionalna potencija i potpuno blokiranje u humanom serumu; (2) NHP unakrsna-reaktivnost i (3) diverzitet sekvenci.17D20 i 17N16 su bili izabrani kao najbolji predstavnici iz svake genske familije.18L16 je bio izabran kao treći kandidat sa primetnim diverzitetom CDR3 sekvence.

[0265] 17N16 i 17D20 su bili dva najbolja izbora zbog kompletnog funkcionalnog blokiranja, sa najboljim funkcionalnim potencijama protiv humanog; značajnom majmunskom unakrsnom-reaktivnosti i različitim VH genskim familijama.3F22 i 9P13 su bili eliminisani zbog VH sekvenci skoro identičnih sa 17N16.18P15, 4J9 i 21B17 su bili eliminisani zbog skromne potencije.17L20 nije bio ispitivan, jer je samo delimično blokirao.

[0266] 18L16 i 4D9 su imali slične aktivnosti i primetan diverzitet u poređenju sa 17D20.18L16 je bio izabran zbog veće primatske unakrsne-reaktivnosti od 4D9.

[0267] Zbog toga, na bazi ovih kriterijuma, sledeća tri klona majke: 17D20, 17N16 i 18L16 su bila prosleđena u afinitetno sazrevanje kao što je dalje opisano dole.

PRIMER 5

[0268] Ovaj Primer opisuje kloniranje tri klona majke 17D20, 17N16 i 18L16 (identifikovana kao što je opisano u Primerima 2-4) u IgG4 format divljeg tipa, i utvrđivanje funkcionalnosti tri klona majke kao IgGs cele dužine.

Obrazloženje:

[0269] Potpuno humana anti-MASP-2 scFv antitela sa umerenom funkcionalnom potencijom su bila identifikovana korišćenjem prikazivanja na fagima kao što je opisano u Primerima 2-4. Tri takva klona majke, 17D20, 17N16 i 18L16 su bila izabrana za afinitetno sazrevanje. Da bi se odredila funkcionalnost ovih klonova majki kao IgGs cele dužine, od ovih antitela su bili napravljeni mutantni formati IgG4 divljeg tipa i IgG4 sa S228P regionom zgloba. S228P region zgloba mutanta je bio uključen da bi se povećala serumska stabilnost (vidi Labrijn A.F. et al., Nature Biotechnology 27:767 (2009)).

[0270] Aminokiselinska sekvenca IgG4 divljeg tipa je navedena kao SEQ ID NO:63, kodirana je sa SEQ ID NO:62.

[0271] Aminokiselinska sekvenca IgG4 S228P je navedena kao SEQ ID NO:65, kodirana je sa SEQ ID NO:64.

[0272] IgG4 molekuli su takođe bili isečeni u F(ab’)2 formate pepsinskom digestijom i frakcionisani su hromatografijom isključenjem po veličini da bi se klonovi majke direktno uporedili sa OMS100 kontrolnim antitelom, koje je F(ab)2 molekul.

Metode:

Generisanje klonova u format cele dužine

[0273] Tri klona majke su bila konvertovana u format IgG4 divljeg tipa i IgG4 mutantni S228P format. Ovo je bilo izvedeno putem PCR izolacije odgovarajućih VH i VL regiona od gore navedenih klonova majki i njihovim kloniranjem u pcDNK3 ekspresione vektore koji su imali odgovarajuće konstantne regione teškog lanca za kreiranje okvirnih fuzija da bi se proizvelo željeno antitelo. Tri klona majke u mutantnom IgG4 formatu su onda bila isečena pepsinom da bi se generisali F(ab’)2 fragmenti, a zadnje pomenuti su bili prečišćeni frakcionisanjem na koloni za hromatografiju isključenjem po veličini.

Test vezivanja

[0274] Klonovi kandidati majke konvertovani u IgG4 format su bili prolazno transfektovani u HEK 293 ćelije, a supernatanti od prolazne transfekcije su bili titrirani u ELISA testu. Klonovi su ispoljili odličnu reaktivnost sa fizički adsorbovanim humanim MASP-2A, i rangirani su po sledećem redosledu: 17N16>17D20>18L16 (podaci nisu prikazani).

[0275] Klonovi su onda bili prečišćeni i ponovo testirani u ELISI i testu aktivnosti kao što sledi. Humanim MASP-2A sa 3 μg/ml u PBS je bila obložena maxisorp ploča, IgG (45 μg/ml), a Fab’2 (30 μg/ml) su bili razređeni u PBS-Tween do početne koncentracije od 300 nM, i dalje sa 3-strukim razređenjima. IgGs su bili detektovani sa HRP konjugovanim kozjim α-humanim IgG (Southern Biotech) i F(ab’)2 su bili detektovani sa HRP-konjugovanim kozjim α-humanim IgG H+L (Pierce 31412). Reakcija je bila razvijena TMB supstratom, a zaustavljena je sa 2M H2SO4. Rezultati su prikazani dole u TABELI 15.

TABELA 15: Afinitet vezivanja za humani MASP-2

Funkcionalni test

[0276] Test sa C3 konvertazom uz korišćenje 1% normalnog humanog seruma (NHS), kao što je opisano u Primeru 4, bio je upotrebljen za upoređivanje funkcionalne aktivnosti scFv klonova majki i njihovih parnjaka IgG4 cele dužine u 1% NHS. Manan je bio razređen do koncentracija od 20 μg/ml i njime je obložena ELISA ploča preko noći na 4°C. Sledećeg dana, bunarčići su bili blokirani sa 1% humanog seruma. Humani serum je bio razređen do 1% u CaMgGVB puferu, a prečišćena antitela; scFv (900 nM), F(ab’)2 (300 nM), IgG (300 nM) su bila dodata u duplikatima serija različitih razređenja u istoj količini pufera, i preinkubirana su tokom 45 minuta na ledu pre dodavanja blokiranoj ELISA ploči. Reakcija je bila inicirana inkubacijom na 37°C tokom jednog sata, a bila je zaustavljena stavljanjem ploče na led. C3b taloženje je bilo određeno zečjim α-mišjim C3c antitelom, praćenim kozjim α-zečjim HRP. Pozadinska vrednost za OMS100 sa 50 nM na manan pozitivnim pločama je bila oduzeta od krivih. Rezime rezultata ove analize je prikazan dole u TABELI 16.

TABELA 16: Test C3 konvertaze uz korišćenje 1% humanog seruma (IC50 nM)

[0277] Funkcionalna potencija IgG4 klonova majki je takođe bila upoređena sa IgG4 zglobnim mutantnim (S228P) formatom za svaki klon. Numeričke IC50 vrednosti za C3b test taloženja uz korišćenje 1% NHS su prikazani dole u TABELI 17.

TABELA 17: Divlji tip (IgG4) prema zglobnom mutantnom formatu (S228P) u testu C3b taloženja u 1% humanog seruma (IC50 nM)

[0278] Kao što je prikazano gore u TABELI 17, u nekim slučajevima, neočekivana agonistička farmakologija je bila uočena za IgG-ove koji potiču od antagonističkih scFv-ova. Mehanistička osnova za ovu opservaciju nije shvaćena.

[0279] Aktivnosti IgG4 konvertovanih klonova majki sa inhibitornom funkcijom u 1% NHS bili su dalje evaluirani pod strože kontrolisanim uslovima testiranja koji su još više podražavali fiziološke uslove. Da bi se procenila aktivnost antitela pod fiziološkim uslovima, bilo je izvršeno testiranje IgG4 preparata klonova majki u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju C3b taloženje zavisno od lektinskog puta (LP) u mananom obloženim pločama pod strože kontrolisanim uslovima testiranja uz korišćenje minimalno razređene (90%) humane plazme.

[0280] Rezultati testa C3b taloženja u 90% humane plazme su prikazani na SLICI 6. Pošto su MASP-2 i njegovi supstrati prisutni u mešavini za test u približno 100-struko većoj koncentraciji nego u razređenju seruma za test uz korišćenje 1% normalnog humanog seruma, bio je generalno očekivan pomeraj udesno antagonističke krive doza-reakcija. Kao što je prikazano na SLICI 6, kao što je očekivano, pomeraj u desno prema manje očiglednim potencijama je bio uočen za OMS100 i za sva testirana MASP-2 antitela. Međutim, kao iznenađujuće, nije bilo uočeno smanjenje vidljive potencije za mutant sa regionom zgloba (S228P) od 17D20, i potencija u ovom formatu je bila uporediva sa onom koja je izmerena u 1% plazme (vidi TABELU 17). U 90% NHS testiranom formatu funkcionalne potencije za 17D20 IgG4 (S228) je utvrđeno da je bila umereno manja nego za OMS100 Fab2, što je u suprotnosti sa rezultatima testa u 1% NHS, gde je OMS100 bilo od 50 do 100-struko potentnije od 17D20 IgG4 S228P (podaci nisu prikazani). IgG4 oblik 17N16 divljeg tipa je takođe ispoljio potpunu inhibiciju u 90% NHS, ali nešto manje potentnu u ovom testiranom formatu (IC50 ≈ 15nM), dok je IgG4 oblik 18L16 divljeg tipa bio manje potentan i samo delimično inhibitoran, kao što je prikazano na SLICI 6.

[0281] Na osnovu ovih nalaza, aktivnost IgG4 konvertovanih klonova majki je bila dalje evaluirana ispitivanjem C4b taloženja pod strogim uslovima testiranja (90% NHS). Ovaj testirani format predstavlja direktnu meru aktivnosti antitela na enzimsku reakciju katalizovanu pomoću MASP-2.

Test merenja inhibicije C4 sečenja zavisnog od MASP-2

[0282] Polazište: Serin proteazna aktivnost MASP-2 je visoko specifična i identifikovana su samo dva proteinska supstrata za MASP-2; C2 i C4. Sečenje C4 generiše C4a i C4b. Anti-MASP-2 Fab2 se može vezivati za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u sečenje C4 (npr. MASP-2 mesto vezivanja za C4; MASP-2 serin proteazno katalitičko mesto) i zahvaljujući tome inhibira funkcionalnu aktivnost MASP-2 na sečenju C4.

[0283] Kvaščev manan je poznati aktivator lektinskog puta. U sledećem metodu za merenje C4 aktivnosti sečenja MASP-2, plastični bunarčići obloženi mananom su bili inkubirani 90 minuta na 4°C sa 90% humanog seruma da bi se aktivirao lektinski put. Bunarčići su onda isprani, pa su testirani u pogledu humanog C4b imobilizovanog na bunarčićima korišćenjem standardnih ELISA metoda. Količina C4b generisanog u ovom testu je mera MASP-2 zavisne C4 aktivnosti sečenja. Anti-MASP-2 antitela u izabranim koncentracijama su bila testirana u ovom testu u pogledu svoje sposobnosti da inhibiraju C4 sečenje.

[0284] Metode: Ploče Costar Medium Binding sa 96 bunarčića su bile inkubirane preko noći na 5°C sa mananom razređenim u 50 mM karbonatnog pufera, pH 9.5 sa 1.0 μg/50 μL/bunarčiću. Svaki bunarčić je bio ispran 3X sa 200 μL PBS. Bunarčići su onda bili blokirani sa 100 μL/bunarčiću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS i inkubirani su jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 3X sa 200 μL PBS. Uzorci anti-MASP-2 antitela su bili razređeni do izabranih koncentracija u Ca<++>i Mg<++>koji je sadržao GVB pufer (4.0 mM barbitala, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatina, pH 7.4) na 5° C.90% humanog seruma je bilo dodato gornjim uzorcima na 5°C i 100 μL je bilo preneto u svaki bunarčić. Ploče su bile pokrivene i inkubirane 90 min u kupatilu sa ledenom vodom da bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem EDTA u reakcionu smešu. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL sa PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), pa je onda svaki bunarčić bio ispran 2X sa 200 μL PBS.100 μL/bunarčiću 1:700 razređenja sa biotinom konjugovanog pilećeg anti-humanog C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Švedska) je bilo dodato u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml goveđeg serumskog albumina (BSA) i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL PBS. 100 μL/bunarčiću 0.1 μg/ml sa peroksidazom konjugovanog streptavidina (Pierce Chemical #21126) je bilo dodato u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml BSA i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL sa PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) i inkubirano je na sobnoj temperaturi 16 min. Reakcija peroksidaze je bila zaustavljena dodavanjem 100 μL/bunarčiću 1.0 M H3PO4 i bio je izmeren OD450.

Rezultati:

[0285] U ovom formatu, oba IgG4 oblika 17D20 su inhibirala lektinskim putem izazvano C4b taloženje, mada su IC50 vrednosti bile ≈3-struko veće u poređenju sa testom C3b taloženja. Interesantno je da je 17N16 IgG4 divljeg tipa ispoljio dobru aktivnost u ovom testu sa IC50 vrednosti i profilom doza-reakcija uporedivim sa testom C3b taloženja.18L16 je bio znatno manje potentan i nije ostvario potpunu inhibiciju u ovom formatu (podaci nisu prikazani).

Diskusija:

[0286] Kao što je opisano u Primerima 2-5, potpuno humana anti-MASP-2 scFv antitela sa funkcionalnom blokirajućom aktivnosti su bila identifikovana primenom prikazivanja na fagima. Tri takva klona, 17N16, 17D20 i 18L16, su bila izabrana za afinitetno sazrevanje i dalje testiranje. Da bi se odredila funkcionalnost ovih klonova majki kao IgG-ova cele dužine, bili su proizvedeni mutantni oblici IgG4 divljeg tipa i IgG4 sa regionom zgloba S228P ovih antitela. Kao što je opisano u ovom Primeru, većina IgG-ova cele dužine je imala poboljšanu funkcionalnu aktivnost u poređenju sa njihovim scFv parnjacima kada su testirana u formatu standardnog funkcionalnog testa sa 1% humane plazme. Da bi se procenila aktivnost antitela pod fiziološkim uslovima, testiranje preparata IgG4 klona majke je bilo izvedeno pod strogo kontrolisanim uslovima testiranja uz korišćenje 90% humane plazme. Pod ovim uslovima, nekoliko antitela je ispoljilo funkcionalne potencije koje su bile u suštini bolje od očekivanih, bazirano na njihovim performansama u standardnim funkcionalnim testovima sa (1%) plazme.

PRIMER 6

[0287] Ovaj Primer opisuje mešanje lanca i afinitetno sazrevanje klonova majki 17D20, 17N16 i 18L16, i analizu rezultujućih klonova ćerki.

Metode:

[0288] Da bi se identifikovala antitela sa poboljšanom potencijom, tri scFv klona majke, 17D20, 17N16 i 18L16, koji su identifikovani kao što je opisano u Primerima 2-5, bili su podvrgnuti mešanju lakog lanca. Ovaj proces je uključen u generisanje kombinacione biblioteke koja se sastoji od VH svakog od klonova majki uparenog sa bibliotekom naivnih, humanih lambda lakih lanaca (VL) koji su poticali od šest zdravih donora. Ova biblioteka je onda bila pretražena u pogledu scFv klonova sa poboljšanim afinitetom vezivanja i/ili funkcionalnošću.

[0289] 9,000 klonova ćerki sa izmešanim lakim lancem je bilo analizirano po jednom klonu majci, odnosno ukupno 27,000 klonova. Svaki klon ćerka je bio indukovan tako da izrazi i izluči rastvorljivi scFv, i bio je podvrgnut skriningu u pogledu sposobnosti da se vezuje za humani MASP-2A. ScFv-ovi koji su se vezivali za humani MASP-2A su bili detektovani pomoću njihovog c-Myc taga. Ovaj inicijalni skrining je rezultovao selekcijom ukupno 119 klonova, koja je uključivala 107 klonova ćerki iz 17N16 biblioteke, 8 klonova ćerki iz 17D20 biblioteke, i 4 klona ćerke iz 18L16 biblioteke.

[0290] 119 klonova je bilo izraženo u malim razmerama, pa je prečišćeno na NiNTA kolonama, i testirano u pogledu afiniteta vezivanja u ELISA testu protiv fizički adsorbovanog humanog MASP-2A.

Rezultati:

[0291] Rezultati ELISA testa na reprezentativnom podskupu 119 klonova ćerki su prikazani na SLIKAMA 7A i B. SLIKA 7A grafički prikazuje rezultate ELISA testa na 17N16 klonu majci prema klonovima ćerkama titriranim na huMASP-2A. SLIKA 7B grafički prikazuje rezultate ELISA testa na 17D20 klonu majci prema klonovima ćerkama titriranim na huMASP-2A.

[0292] Kao što je prikazano na SLICI 7A, klonovi ćerke 17N16m_d16E12 i 17N16m_d17N9, koji potiču od 17N16 klona majke su imali afinitete koji su bili veći nego oni od klona majke. Takođe, kao što je prikazano na SLICI 7B, jedan klon koji potiče od 17D20 klona majke, 17D20m_d18M24, je imao veći afinitet od klona majke. Ova tri klona, i dodatna tri klona: 17N16m_d13L12, 17N16m_d16K5, 17N16m_d1G5, i 17D20m_d1824 koji su imali niži nivo ekspresije bili su izraženi u razmerama od 0.5 L, pa su prečišćeni u frakciju monomera hromatografijom isključenjem po veličini i bili su ponovo testirani u ELISA i funkcionalnom testu. 18L16 biblioteka nije proizvela bilo kakve klonove ćerke sa željenim afinitetom vezivanja.

[0293] Posle prečišćavanja, šest klonova ćerki je bilo testirano u testu komplementa u pogledu inhibitorne aktivnosti. Rezultati su prikazani u TABELI 18.

TABELA 18: Test komplementa klona majke i klonova ćerki

[0294] Kao što je prikazano gore u TABELI 18, samo jedan od klonova, 17N16m_d17N9, imao je afinitet i aktivnost u istom rangu kao klon majka.

[0295] SLIKA 8 je poravnanje aminokiselinskih sekvenci scFv klona majke 17N16 cele dužine (SEQ ID NO:59) i 17N16m_d17N9 klona ćerke (SEQ ID NO:66), koje pokazuje da laki lanci (polazeći od SYE) imaju 17 aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između dva klona.

[0296] Ponovni skrining 17N16 lambda biblioteke je rezultovao sa nekoliko dodatnih klonova ćerki kandidata, od kojih je 17N16m_d27E13 bio identifikovan u ELISA i testu komplementa, i bio je uključen u grupu klonova ćerki kandidata za dalje analize.

Testiranje klonova ćerki u različitim serumima

[0297] Klonovi ćerke kandidati su bili analizirani u različitim serumima kao što sledi. Manan je bio razređen u 20 μg/ml i njime je bila obložena ELISA ploča preko noći na 4°C. Sledećeg dana, bunarčići su bili blokirani sa 1% HSA. Serum afričkih zelenih majmuna je bio razređen do 0.2%, pacovski serum je bio razređen do 0.375% i humani serum je bio razređen do 1% u CaMgGVB puferu. Bio je dodat prečišćeni scFv od svakog od kandidata klonova ćerki u duplikatima u serijama različitih koncentracija do iste količine pufera i prethodno je inkubirano 45 minuta na ledu pre dodavanja blokiranoj ELISA ploči. Reakcija je bila inicirana inkubacijom tokom jednog sata na 37°C, a bila je zaustavljena prenošenjem ploče u ledeno kupatilo. C3c oslobađanje je bilo detektovano zečje α-mišje C3c antitelom, što je bilo praćeno kozje α-zečjim HRP. Pozadinska vrednost OMS100 za 0.1 μg/ml na manan negativnim pločama je bila oduzeta od ovih krivih. Rezultati su sumirani dole u TABELI 19.

TABELA 19: IC50 vrednosti za klon majku 17N16 i klonove ćerke 17N16m_d17N9 i 17N16m_d27E13 u različitim serumima.

Diskusija rezultata:

[0298] Kao što je prikazano u TABELI 19, klon ćerka 17N16m_d17N9 ima veću funkcionalnu aktivnost od klona majke. Poboljšana funkcija u pacovskom serumu pored razlike sekvence od sedamnaest aminokiselina u lakom lancu u poređenju sa klonom majkom čini ovaj klon pozitivnim kandidatom. Na osnovu ovih podataka, klon ćerka 17N16m_d17N9 je bio izabran za dalju analizu.

PRIMER 7

[0299] Ovaj Primer opisuje generisanje i analizu klona ćerke 17D20m_d3521N11, koji potiče od klona majke 17D20.

Polazište/obrazloženje:

[0300] Da bi se poboljšao afinitet klona majke kandidata 17D20mc, bila je izvedena dodatna "transparentna-mutageneza" na prve tri aminokiseline u CDR3 teškog lanca (CDR-H3). Ovo je bila kampanja mutageneze paralelna sa normalnim mešanjem lakog lanca od 17D20mc. Zbog toga su bile konstruisane tri različite scFv biblioteke pomoću PCR gde su aminokiselinske pozicije 1, 2 i 3 bile randomizovane da bi se postavilo svih mogućih 20 aminokiselina korišćenjem degenerativnih kodona. Posle kloniranja biblioteka, bila je izvršena ekspresija u mikrorazmerama i scFv vezivanje je bilo praćeno na MASP-2A obloženom CM5 čipu (nije prikazano). BIAcore analiza ekspresije u mikrorazmerama je bila izvedena na tri različite biblioteke na čipovima obloženim sa MASP-2A, randomizovanih na poziciji 1, 2, ili 3 i bili su identifikovani potencijalno interesantni klonovi ćerke.

[0301] Bilo je uočeno da za aminokiselinske pozicije 1 i 2 od CDR-H3, nije bio pronađen klon koji je imao poboljšanu brzinu disocijacije u poređenju sa klonom majke kandidatom 17D20m. Međutim, nekoliko kandidata sa mutacijama na aminokiselinskoj poziciji 3 u CDR-H3 ispoljilo je poboljšane brzine disocijacije u poređenju sa klonom majkom 17D20m. Ovi klonovi (#35, #59 i #90) su bili sekvencirani da bi se identifikovala mutacija. Sekvence dva "transparentnommutagenezom" dobijena klona su upoređene sa 17D20mc (originalna sekvenca). Interesantno, svi sekvencirani klonovi izuzev jednog (#90), su imali Ala-Arg supstituciju u poređenju sa majkom kandidatom.

[0302] SLIKA 9 je poređenje sekvenci za aminokiselinsku sekvencu regiona teškog lanca scFv klona majke 17D20m (aa 61-119 SEQ ID NO:18) i aminokiselinsku sekvencu CRD-H3 regiona scFv klonova sa mutacijama u CDR-H3, klona #35 (aa 61-119 SEQ ID NO:20, koji ima supstituciju R sa A na poziciji 102 SEQ ID NO:18), klona #59 (ista sekvenca kao klon #35), i klona #90 (supstitucija P sa A na poziciji 102 SEQ ID NO:18).

Analiza mutantnih klonova #35 i #59

[0303] Mutantni klonovi #35 i #59 su bili izraženi u maloj razmeri, pa su dalje testirani u poređenju sa klonom majke kandidatom 17D20 u titraciji-ELISI na imobilizovanom MASP-2A (10 μg/ml). scFvs su bili serijski razređeni 5-struko počevši od 20 μg/ml, a vezivanje je bilo detektovano korišćenjem anti-Myc (mišjeg)/anti-mišjeg HRP. Blago poboljšano vezivanje je bilo uočeno u ELISA testu kod klonova kandidata #35 i #59 u poređenju sa klonom majke kandidatom 17D20 (podaci nisu prikazani).

[0304] Poboljšani klon #35 je bio kombinovan sa najboljim klonom sa izmešanim lakim lancem 17D20m_d21N11. Mutacija u VH kandidata 17D20md35 (Ala-Arg) je bila kombinovana sa lakim lancem kandidata 17D20m_d21N11, što je rezultovalo klonom nazvanim VH35-VL21N11, koji je inače označen sa 3521N11.

[0305] SLIKA 10A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci za sekvencu CDR3 regiona klona majke 17D20 (aa 61-119 SEQ ID NO:18), istog regiona klona ćerke 17D20m_d21N11, koji ima istu sekvencu, i istog regiona mutageneznog klona #35 kombinovanog sa VL od 17D20m_d21N11, koji se naziva "3521N11" (aa 61-119 SEQ ID NO:20). Istaknuti regioni VH sekvence sadrže CDRH3, a mutirani ciljni rezidualni region je podvučen.

[0306] SLIKA 10B je poravnanje proteinskih sekvenci scFv cele dužine koji sadrži VL i VH regione 17D20 klona majke (SEQ ID NO:55) i klona ćerke 17D20m_d21N11 (SEQ ID NO:67). scFv klon ćerka 17D20m_d3521N11 je naveden kao SEQ ID NO:68. Napomena: utvrđeno je da je X ostatak na SLICI 10B na poziciji 220 "E", kao što je navedeno u SEQ ID NO:68.

[0307] Titracioni ELISA test za skup scFvs prikazanih na SLICI 10 je bio izvedena na MASP-2 (10 μg/ml). Rezultati su prikazani u TABELI 20.

TABELA 20: ELISA na humanom MASP-2

[0308] 17D20m_d3521N11 klon ćerka je bio dalje analiziran u pogledu funkcionalne aktivnosti kao što je opisano dole u Primeru 8.

PRIMER 8

[0309] Ovaj Primer opisuje konverziju i analizu klonova ćerki kandidata 17N16m_d17N9 i 17D20m_d3521N11 u IgG4, IgG4/S228P i IgG2 formatu.

Obrazloženje/polazište

[0310] Metode skrininga antitela koje su opisane u Primerima 2-7 su identifikovale dva klona majke, 17N16 i 17D20, sa podesnom funkcionalnošću. Afinitetno sazrevanje ovih klonova majki je dalo klonove ćerke koji su ispoljili približno 2-struko poboljšanje potencije u poređenju sa klonovima majkama u surogatnim funkcionalnim testovima na scFv nivou. Klonovi ćerke sa najboljom aktivnosti su 17N16m_d17N9 i 17D20m_d3521N11. Kao što je opisano u Primeru 6, u poređenju sa funkcionalnom aktivnosti 17N16 klona majke sa klonovima ćerkama sa izmešanim lakim lancem (scFv format, 1% NHS test) bilo je utvrđeno da je 17N16m_d17N9 bio malo potentniji od klona majke i da je imao najbolju funkcionalnu potenciju od svih klonova ćerki testiranih u ovom testu.

Metode:

[0311] Poređenje funkcionalne potencije scFv klonova kandidata je bilo izvedeno u testu C3 konverzije (1% humanog seruma i 90% humanog seruma), i u testu C4 konverzije (90% humanog seruma), izvedenim kao što je opisano u Primeru 5.

[0312] Rezultati su prikazani dole u TABELI 21.

TABELA 21: Poređenje funkcionalne potencije u IC50 (nM) vodećih klonova ćerki i njihovih odgovarajućih klonova majki (svi u scFv formatu)

[0313] Kao što je prikazano gore u TABELI 21, 17N16m_d17N9 je imao dobru aktivnost kada je testiran u 90% normalnog humanog seruma (NHS) u C3 testu i bio je potentniji od drugih klonova ćerki u ovom formatu.

Konverzija klonova kandidata u IgG4, IgG4/S228P i IgG2 formatu

[0314] Svi ovi klonovi kandidati su bili konvertovani u IgG4, IgG4/S228P i IgG2 format za dalje analize.

SEQ ID NO:62: cDNK koja kodira IgG4 divljeg tipa

SEQ ID NO:63: IgG4 polipeptid divljeg tipa

SEQ ID NO:64 cDNK koja kodira IgG4 mutantni S228P

SEQ ID NO:65: IgG4 mutantni S228P polipeptid

SEQ ID NO:69: cDNK koja kodira IgG2 divljeg tipa

SEQ ID NO: 70: IgG2 polipeptid divljeg tipa

TABELA 22: Rezime klonova kandidata:

[0315] Monoklonska antitela #1-6 su bila testirana u pogledu sposobnosti da unakrsno reaguju sa nehumanim MASP-2 proteinom (afričkog zelenog (AG) majmuna) u C3 testu da bi se odredilo da li bi ova antitela mogla biti primenjena za testiranje toksičnosti u životinjskom modelu koji bi bio prediktivan za ljude.

Monoklonska antitela #1-6 su takođe bila testirana u testu C3b taloženja i C4 testu u 90% humanog seruma. Rezultati su prikazani dole u TABELI 23.

TABELA 23: Humana anti-MASP-2 MoAbs (IC50 nM) u 90% humanog seruma

[0316] SLIKA 11A grafički prikazuje rezultate testa C3b taloženja izvedenog za izotipske varijante klona ćerke (MoAb#1-3), koje potiču od humanog anti-MASP-2 monoklonskog antitela klona majke 17N16.

[0317] SLIKA 11B grafički prikazuje rezultate testa C3b taloženja izvedenog za izotipske varijante klona ćerke (MoAb#4-6), koje potiču od humanog anti-MASP-2 monoklonskog antitela klona majke 17D20.

[0318] Kao što je prikazano u TABELI 23 i na SLIKAMA 11A i 11B, humana anti-MASP-2 monoklonska antitela (MoAb#1-6) se vezuju za MASP-2 sa visokim afinitetom, i inhibiraju funkciju C3 i C4 aktivnosti u 90% humanog seruma. Takođe je uočeno da humana anti-MASP-2 MoAbs unakrsno reaguju sa nehumanim MASP-2 proteinom (afričkog zelenog majmuna), što obezbeđuje životinjski model za studije toksičnosti koje bi bile prediktivne za ljude.

[0319] MoAb#1-6 su bila dalje analizirana u 95% humanog seruma, 95% seruma afričkog zelenog. Rezultati su sumirani dole u TABELI 24.

TABELA 24

[0320] SLIKA 12A i 12B grafički ilustruju testiranje klonova majki i MoAb#1-6 u testu C3b taloženja u 95% normalnog humanog seruma.

[0321] SLIKA 13 grafički prikazuje inhibiciju C4b taloženja u 95% normalnog humanog seruma.

[0322] SLIKA 14 grafički prikazuje inhibiciju C3b taloženja u 95% seruma afričkih zelenih majmuna.

[0323] MoAb#1-6 su bila dalje testirana u pogledu selektivnosti inhibiranja lektinskog puta testiranjem inhibicije pacovskog C3b, inhibicije prethodno spojenih MBL-MASP-2 kompleksa; inhibicije klasičnog puta i selektivnosti preko C1s. Rezultati su sumirani u TABELI 25.

TABELA 25: Rezime rezultata funkcionalnih testova

[0324] SLIKA 15 grafički prikazuje inhibiciju aktivnosti sečenja C4 prethodno spojenog MBL-MASP-2 kompleksa pomoću MoAb#2, 3, 5 i 6.

[0325] SLIKA 16 grafički prikazuje preferencijalno vezivanje MoAb#6 za humani MASP-2 u poređenju sa C1s.

Tabela 26: Rezime sekvenci klonova ćerke u različitim formatima:

PRIMER 9

[0326] Ovaj Primer opisuje mapiranje epitopa koje je bilo izvedeno za nekoliko blokirajućih humanih anti-MASP-2 MoAbs.

Metode:

[0327] Sledeći rekombinantni proteini su bili proizvedeni kao što je opisano u Primeru 1:

Humani MAp19

Humani MASP2A

Humani MASP-2 SP

Humani MASP-2 CCP2-SP

Humani MASP-2 CCP1-CCP2-SP

Humani MASP-1/3 CUB1-EGF-CUB2

Humani MASP-1 CCP1-CCP2-SP

[0328] Anti-MASP-2 antitela OMS100 i MoAb#6 (35VH-21N11VL), za koja je bilo pokazano da se vezuju za humani MASP-2 sa visokim afinitetom i da imaju sposobnost da blokiraju aktivnost funkcionalnog komplementa (vidi Primeri 6-8) bila su analizirana u pogledu vezivanja za epitop dot blot analizom.

Dot blot analiza

[0329] Serijska razređenja rekombinantnih MASP-2 polipeptida koji su gore opisani su bila tačkasto stavljena na nitroceluloznu membranu. Količina tačkasto stavljenog proteina je varirala od 50 ng do 5 pg, u desetostrukim koracima. U kasnijim eksperimentima, količina tačkasto stavljenog proteina je varirala od 50 ng naniže do 16 pg, ponovo u petostrukim koracima. Membrane su bile blokirane sa 5% obranog mleka u prahu u TBS (blokirajući pufer), a onda su inkubirane sa 1.0 μg/ml anti-MASP-2 Fab2s u blokirajućem puferu (koji je sadržao 5.0 mM Ca<2+>). Vezana Fab2s su bila detektovana korišćenjem HRP-konjugovanog anti-humanog Fab (AbD/Serotec; razređen 1/10,000) i ECL kita za detekciju (Amersham). Jedna membrana je bila inkubirana sa poliklonskim zečjim-anti humanim MASP-2 Ab (opisanim u Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)) kao pozitivnom kontrolom. U ovom slučaju vezano Ab je bilo detektovano korišćenjem HRP-konjugovanog kozjeg anti-zečjeg IgG (Dako; razređen 1/2,000).

Rezultati:

[0330] Rezultati su sumirani u TABELI 27.

TABELA 27: Mapiranje epitopa

[0331] Rezultati pokazuju da su MoAb#6 i OMS100 antitela visoko specifična za MASP-2 i da se ne vezuju za MASP-1 ili MASP-3. Nijedno antitelo vezano za Map19 i MASP-2 fragmente nije sadržalo CCP1 domen od MASP-2, što dovodi do zaključka da mesta vezivanja obuhvataju CCP1 domen.

PRIMER 10

[0332] Ovaj Primer pokazuje da humano anti-MASP-2 MoAb#6 inhibira lektinski put kod afričkih zelenih majmuna posle intravenske administracije.

Metode:

[0333] MoAb#6 je bilo intravenski dato prvoj grupi od tri afrička zelena majmuna u dozi od 1 mg/kg i drugoj grupi od tri afrička zelena majmuna u dozi od 3 mg/kg.

Uzorci krvi su uzeti 2, 4, 8, 10, 24, 48, 72 i 98 sati posle administracije i bili su testirani u pogledu prisustva aktivnosti lektinskog puta.

[0334] Kao što je prikazano na SLICI 17, lektinski put je bio potpuno inhibiran posle intravenske administracije anti-humanog MoAb#6.

PRIMER 11

[0335] Ovaj Primer pokazuje da je MASP-2 inhibitor, kao što je anti-MASP-2 antitelo, efektivan za tretiranje izlaganja radijaciji i/ili za lečenje, ublažavanje ili prevenciju akutnog radijacionog sindroma.

Obrazloženje:

[0336] Izlaganje visokim dozama jonizujućeg zračenja izaziva mortalitet pomoću dva osnovna mehanizma: toksičnost za koštanu srž i gastrointestinalni sindrom.

Toksičnost za koštanu srž rezultuje padom svih hematoloških ćelija, koja predisponira organizam na smrt usled infekcije i hemoragije. Gastrointestinalni sindrom je ozbiljniji i nastaje usled gubitka intestinalne barijerne funkcije usled dezintegracije crevnog epitelnog sloja i gubitka intestinalne endokrine funkcije. Ovo dovodi do sepse i pratećeg sindroma sistemske zapaljenske reakcije, koji može rezultovati smrću.

[0337] Lektinski put komplementa je urođeni imuni mehanizam koji inicira zapaljenje kao reakciju na povredu tkiva i izlaganje stranim površinama (tj. bakterijama).

Blokada ovog puta dovodi do boljih ishoda u mišjim modelima ishemijske intestinalne povrede tkiva ili septičnog šoka. Pretpostavlja se da lektinski put može pokrenuti prekomerno i štetno zapaljenje kao reakciju na radijacijom indukovanu povredu tkiva. Blokada lektinskog puta, shodno tome, može smanjiti sekundarnu povredu i povećati preživljavanje posle akutnog izlaganja radijaciji.

[0338] Cilj studije izvedene kao što je opisano u ovom Primeru je bio da se odredi efekat blokade lektinskog puta na preživljavanje u mišjem modelu radijacione povrede administracijom anti-mišjeg MASP-2 antitela.

Studija #1

Metode i materijali:

[0339] Materijali. Testirani artikli koji su upotrebljeni u ovoj studiji su bili (i) visoko afinitetno anti-mišje MASP-2 antitelo (mAbM11) i (ii) visoko afinitetno anti-humano MASP-2 antitelo (mAbOMS646) koje blokira MASP-2 proteinsku komponentu komplementa lektinskog puta koje su bile proizvedene u transfektovanim sisarskim ćelijama. Dozirane koncentracije su bile 1 mg/kg anti-mišjeg MASP-2 antitela (mAbM11), 5mg/kg anti-humanog MASP-2 antitela (mAbOMS646), ili sterilnog slanog rastvora. Za svaku sesiju doziranja bila je pripremljena adekvatna zapremina svežeg rastvora za doziranje.

[0340] Životinje. Mladi mužjaci Swiss-Webster miševa su bili dobijeni od Harlan Laboratories (Houston, TX). Životinje su bile smeštene u kavezima sa čvrstim dnom sa Alpha-Dri prostirkom i obezbeđene su im sertifikovana PMI 5002 Rodent Diet (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) i voda ad libitum. Temperatura je bila praćena, a soba za držanje životinja je funkcionisala sa ciklusom osvetljenja od 12 sati svetlosti/12 sati mraka.

[0341] Ozračivanje. Posle 2-nedeljne aklimatizacije u objektu, miševi su bili ozračeni sa 6.5, 7.0 i 8.0 Gy izlaganjem celog tela u grupama od 10 sa brzinom doziranja od 0.78 Gy/min uz korišćenje Therapax X-RAD 320 sistema opremljenog sa 320-kV generatorom rentgenskog zračenja visoke stabilnosti, metalno-keramičkom rentgenskom cevi, varijabilnim kolimatorom i filterom rentgenskog zračenja (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT).

[0342] Formulacija i administracija leka. Odgovarajuće zapremine koncentrovanih radnih rastvora su bile razređene ledeno hladnim slanim rastvorom da bi se pripremili rastvori za doziranje od 0.2 mg/ml anti-mišjeg MASP-2 antitela (mAbM11) ili 0.5 mg/ml antihumanog MASP-2 antitela (mAbOMS646) prema protokolu.

Administracija anti-MASP-2 antitela mAbM11 i mAbOMS646 je bila putem IP injekcije uz korišćenje igle veličine 25 na osnovu težine životinja da bi se isporučilo 1 mg/kg mAbM11, 5mg/kg mAbOMS646, ili slani rastvor kao vehikulum.

[0343] Dizajn studije. Miševi su bili na slučajan način raspodeljeni u grupe kao što je opisano u TABELI 28. Telesna težina i temperatura su bili mereni i zapisivani svakodnevno. Miševi u Grupama 7, 11 i 13 su bili usmrćeni 7. dana posle ozračivanja, a krv je uzeta kardijačnom punkturom pod dubokom anestezijom.

Preživele životinje su 30. dana posle ozračivanja bile usmrćene na isti način i uzeta im je krv. Plazma je bila pripremljena od sakupljenih uzoraka krvi prema protokolu i vraćena je sponzoru na analizu.

TABELA 28: Grupe za studiju

[0344] Statistička analiza. Kaplan-Majerove krive preživljavanja su bile generisane i korišćene za upoređivanje srednjeg vremena preživljavanja između tretiranih grupa uz korišćenje log-Rank i Wilcoxon metoda. Bile su zabeležene srednje vrednosti sa standardnim odstupanjima, ili proseci sa standardnom greškom od proseka.

Statistička poređenja su bila izvršena korišćenjem dvostranog neuparenog t-testa između kontrolnih ozračenih životinja i pojedinačno tretiranih grupa.

Rezultati Studije #1

[0345] Kaplan-Majerovi dijagrami preživljavanja za grupe izložene 6.5, 7.0 i 8.0 Gy su prikazani na SLIKAMA 18A, 18B i 18C, respektivno, i sumirani su dole u TABELI 29. Generalno, tretiranje anti-mišjim MASP-2 ab (mAbM11) pre ozračivanja je povećalo preživljavanje ozračenih miševa u poređenju sa vehikulumom tretiranim ozračenim kontrolnim životinjama i za 6.5 (20% povećanje), i za 7.0 Gy (30% povećanje) nivoe izlaganja. Na nivou izlaganja od 6.5 Gy, tretman posle zračenja sa anti-mišjim MASP-2 ab rezultovao je umerenim povećanjem preživljavanja (15%) u poređenju sa vehikulumom tretiranim kontrolnim životinjama.

[0346] Radi poređenja, sve tretirane životinje za 7.0 Gy i 8.0 Gy nivo izlaganja su ispoljile povećanje preživljavanja u poređenju sa vehikulumom tretiranim ozračenim kontrolnim životinjama. Najveća promena u preživljavanju se dogodila kod životinja koje su primile mAbOMS646, sa 45% povećanja opstanka u poređenju sa kontrolnim životinjama za 7.0 Gy nivo izlaganja, i 12% povećanja opstanka za 8.0 Gy nivo izlaganja. Dalje, za 7.0 Gy nivo izlaganja, mortaliteti u mAbOMS646 tretiranoj grupi su se prvo desili na 15. dan posle ozračivanja u poređenju sa 8. danom posle ozračivanja za vehikulumom tretirane ozračene kontrolne životinje, što je povećanje od 7 dana u odnosu na kontrolne životinje. Srednje vreme do mortaliteta za miševe koji su primili mAbOMS646 (27.3 ± 1.3 dana) se značajno povećalo (p = 0.0087) u poređenju sa kontrolnim životinjama (20.7 ± 2.0 dana) za 7.0 Gy nivo izlaganja.

[0347] Procentualna promena telesne težine u poređenju sa danom pre ozračivanja (-1. danom) je bila beležena tokom studije. Prolazni gubitak težine se dogodio kod svih ozračenih životinja, bez dokaza diferencijalnih promena zbog mAbM11 ili mAbOMS646 tretmana u poređenju sa kontrolama (podaci nisu prikazani). Na kraju studije, sve preživele životinje su ispoljile povećanje telesne težine u odnosu na početnu telesnu težinu (dan -1).

TABELA 29: Stope preživljavanja testiranih životinja izloženih zračenju

Diskusija

[0348] Akutni radijacioni sindrom se sastoji od tri definisana podsindroma: hematopoetičkog, gastrointestinalnog, i cerebrovaskularnog. Uočeni sindrom zavisi od doze radijacije, pri čemu su hematopoetički efekti uočeni kod ljudi sa značajnim delimičnim ili izlaganjem radijaciji celog tela koje je prelazilo 1 Gy. Hematopoetički sindrom je karakterisan ozbiljnom depresijom funkcije koštane srži koja dovodi do pancitopenije sa promenama u krvnoj slici, broju crvenih i belih krvnih ćelija, i trombocita koje se pojavljuju uporedo sa oštećenjem imunog sistema. Kada dođe do najniže tačke, sa malim brojem neutrofila i trombocita prisutnih u perifernoj krvi, onda groznica, komplikacije sepse i nekontrolisana hemoragija dovode do smrti.

[0349] U predmetnoj studiji, utvrđeno je da je administracija mAbH6 povećala preživljavanje izlaganja celog tela rentgenskom zračenju kod mužjaka Swiss-Webster miševa ozračenih sa 7.0 Gy. Značajno je da je za 7.0 Gy nivo izlaganja, 80% životinja koje su primile mAbOMS646 preživelo do 30 dana u poređenju sa 35% vehikulumom tretiranih ozračenih kontrolnih životinja. Važno je da se prvi dan smrti u ovoj tretiranoj grupi nije dogodio sve do 15. dana posle ozračivanja, što je 7-dnevno povećanje u odnosu na ono što je uočeno kod vehikulumom tretiranih ozračenih kontrolnih životinja. Čudno je da za manje izlaganje rentgenskom zračenju (6.5 Gy), administracija mAbOMS646 izgleda nije uticala na preživljavanje ili odlaganje mortaliteta u poređenju sa vehikulumom tretiranim ozračenim kontrolnim životinjama.

Moglo bi biti više razloga za ovu razliku u reakcijama između nivoa izlaganja, mada bi verifikacija bilo koje hipoteze mogla zahtevati dodatne studije, uključujući uzimanje uzoraka u međuvremenu za mikrobiološke kulture i hematološke parametre. Jedno objašnjenje može biti jednostavno da bi broj životinja dodeljenih grupama mogao sprečiti da se vide bilo kakve fine razlike povezane sa tretmanom. Na primer, za grupe veličine n=20, razlika u preživljavanju između 65% (mAbOMS646 za 6.5 Gy izlaganje) i 80% (mAbH6 za 7.0 Gy izlaganje) je 3 životinje. Sa druge strane, razlika između 35% (vehikulumom tretirana kontrola za 7.0 Gy izlaganje) i 80% (mAbOMS646 za 7.0 Gy izlaganje) je 9 životinja i ona obezbeđuje pouzdan dokaz u pogledu razlike uzrokovane tretmanom.

[0350] Ovi rezultati pokazuju da su anti-MASP-2 antitela efektivna u lečenju sisarskog subjekta koji je pod rizikom ili koji boluje od štetnih efekata akutnog radijacionog sindroma.

Studija #2

[0351] Swiss Webster miševi (n=50) su bili izloženi jonizujućem zračenju (8.0 Gy). Bio je određen efekat terapije anti-MASP-2 antitelom (OMS6465mg/kg), davanim 18 sati pre i 2 sata posle izlaganja zračenju, i nedeljno posle toga, na mortalitet.

Rezultati Studije #2

[0352] Bilo je utvrđeno da je administracija anti-MASP-2 antitela OMS646 povećala preživljavanje miševa izloženih 8.0 Gy, sa podešenom medijanom stope preživljavanja od 4 do 6 dana u poređenju sa miševima koji su primili vehikulum kontrolu, i mortalitet je bio smanjen za 12% kada je bio upoređen sa miševima koji su primili vehikulum kontrolu (log-rank test, p=0.040).

Studija #3

[0353] Swiss Webster miševi (n=50) su bili izloženi jonizujućem zračenju (8.0 Gy) u sledećim grupama: (I: vehikulum) kontrola slani rastvor; (II: nisko) anti-MASP-2 antitelo OMS646 (5mg/kg) je dato 18 sati pre ozračivanja i 2 sata posle ozračivanja, (III: visoko) OMS646 (10mg/kg) je dato 18 sati pre ozračivanja i 2 sata posle ozračivanja; i (IV: visoko posle) OMS646 (10mg/kg) je dato samo 2 sata posle ozračivanja.

Rezultati Studije #3

[0354] Bilo je utvrđeno da je administracija anti-MASP-2 antitela pre i posle ozračivanja povećala srednje preživljavanje od 4 do 5 dana u poređenju sa životinjama koje su primile vehikulum kontrolu. Mortalitet kod anti-MASP-2 antitelom tretiranih miševa je bio smanjen za 6-12% u poređenju sa vehikulum kontrolnim miševima. Dalje je uočeno da nisu bili uočeni značajni štetni efekti tretmana.

[0355] Ukratko, rezultati iz ovog Primera pokazuju da su anti-MASP-2 antitela prema pronalasku efektivna u lečenju sisarskog subjekta koji je pod rizikom, ili boluje od štetnih efekata akutnog radijacionog sindroma.

PRIMER 12

[0356] Ovaj Primer opisuje dalju karakterizaciju OMS646 antitela (17D20m_d3521N11), potpuno humanog anti-humanog MASP-2 IgG4 antitela sa mutacijom u regionu zgloba).

Metode:

[0357] OMS646 (17D20m_d3521N11), potpuno humano anti-humano MASP-2 IgG4 antitelo sa mutacijom u regionu zgloba) je bilo generisano kao što je opisano gore u Primerima 2-8. OMS646 antitelo je bilo prečišćeno iz supernatanata kulture ekspresije CHO ćelijske linije stabilno transfektovane sa ekspresionim konstruktima koji kodiraju teški i laki lanac OMS646. Ćelije su bile gajene u PF-CHO medijumu 16 do 20 dana, a supernatant bez ćelija je bio uzet kada je vijabilnost ćelija opala ispod 50%. OMS646 je bilo prečišćeno Protein A afinitetnim hromatografom, što je bilo praćeno izmenom jona, koncentracijom i promenom pufera u PBS.

1. OMS646 se vezuje za humani MASP-2 sa visokim afinitetom

Analiza površinskom plazmonskom rezonancom (Biocore) vezivanja imobilizovanog OMS646 za rekombinantni humani MASP-2

Metode:

[0358] OMS646 je bilo imobilizovano u različitim gustinama pomoću kuplovanja aminom na CM5 čipu i bila je beležena asocijacija i disocijacija rekombinantnog humanog MASP-2 rastvorenog u 9 nM, 3 nM, 1 nM ili 0.3 nM tokom vremena da bi se odredile konstante brzine asocijacije (Kon) i disocijacije (Koff). Konstanta ravnotežnog vezivanja (KD) je bila izračunata na osnovu eksperimentalnih Kon i Koff vrednosti.

Rezultati:

[0359] SLIKA 19 grafički prikazuje rezultate analize površinskom plazmonskom rezonancom (Biocore) na OMS646, koji pokazuju da se imobilizovani OMS646 vezuje za rekombinantni MASP-2 sa Koff brzinom od oko 1-3x10<-4>S<-1>i Kon brzinom od oko 1.6-3x10<6>M<-1>S<-1>, što ukazuje na afinitet (KD od oko 92pM) pod ovim eksperimentalnim uslovima. U zavisnosti od gustine imobilizovanog OMS646 i koncentracije MASP-2 u rastvoru, bile su određene eksperimentalne KD vrednosti u opsegu od 50 do 250pM.

ELISA test vezivanja OMS646 za imobilizovani rekombinantni humani MASP-2

[0360] Metode: ELISA test je bio izveden da bi se odredilo doza-reakcija vezivanje OMS646 za imobilizovani rekombinantni MASP-2. Rekombinantni humani MASP-2 (50 ng/bunarčiću) je bio imobilizovan na maxisorp ELISA pločama (Nunc) u PBS preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče su bile blokirane ispiranjem tri puta sa PBS-Tween (0.05%). Serija razređivanja niza OMS646 u blokirajućem puferu (opseg koncentracija od 0.001 do 10 nM) je onda bila dodata MASP-2 obloženim bunarčićima. Posle 1 sata inkubacije da bi se omogućilo OMS646 vezivanje za imobilizovani antigen, bunarčići su bili isprani da bi se odstranilo nevezano OMS646. Vezano OMS646 je bilo detektovano korišćenjem HRP-obeleženog kozjeg antihumanog IgG antitela (Qualex; razređeno 1:5000 u blokirajućem puferu), što je bilo praćeno razvijanjem TMB peroksidaznim supstratom (Kirkegaard & Perry Laboratories). Peroksidazna reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 100 μl/bunarčiću 1.0 M H3PO4, a konverzija supstrata je bila kvantifikovana fotometrijski na 450nM uz korišćenje čitača ploča sa 96 bunarčića (Spectramax). Korišćen je algoritam za fitovanje krive sa samo jednim mestom vezivanja (Graphpad) za izračunavanje KD vrednosti.

Rezultati:

[0361] SLIKA 20 grafički prikazuje rezultate ELISA testa za određivanje afiniteta vezivanja OMS646 za imobilizovani humani MASP-2. Kao što je prikazano na SLICI 20, utvrđeno je da se OMS646 vezuje za imobilizovani rekombinantni humani MASP-2 sa KD od 85±5 pM, što je konzistentno sa rezultatima dobijenim u Biocore analizi, kao što je prikazano na SLICI 19. Ovi rezultati pokazuju da OMS646 ima visoki afinitet za humani MASP-2, sa KD od približno 100pM.

2. OMS646 inhibira C4 aktivaciju na mananom obloženoj površini, ali ne na imunim kompleksom obloženoj površini

Metode:

[0362] C4 aktivacija je bila merena na mananom obloženoj površini ili na imunim kompleksom obloženoj površini u prisustvu ili odsustvu OMS646 na opsegu koncentracija prikazanom na SLIKAMA 21A i 21B, respektivno kao što sledi.

[0363] U sledećem metodu za merenje aktivnosti sečenja C4 sa MASP-2, plastični bunarčići obloženi mananom su bili inkubirani 60 minuta na 37°C sa 1% humanog seruma da bi se aktivirao lektinski put. Bunarčići su onda bili isprani i testirani u pogledu humanog C4b imobilizovanog na bunarčićima uz korišćenje standardnih ELISA metoda. Količina C4b generisanog u ovom testu je mera aktivnosti sečenja C4 zavisne od MASP-2. Anti-MASP-2 antitela u izabranim koncentracijama su bila testirana u ovom testu u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju sečenje C4.

Metode:

C4 aktivacija na mananom obloženim površinama:

[0364] Da bi se odredio efekat OMS646 na lektinski put, ploče Costar Medium Binding sa 96 bunarčića su bile obložene mananom inkubacijom preko noći na 5°C sa 50 μL 40 μg/mL rastvora manana razređenog u 50 mM karbonatnog pufera, pH 9.5. Svaki bunarčić je bio ispran 3X sa 200 μL PBS. Bunarčići su onda bili blokirani sa 100 μL/bunarčiću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS i inkubirani su jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 3X sa 200 μL of PBS. U posebnoj ploči sa 96 bunarčića, serijska razređenja MASP-2 antitela (OMS646) su bila preinkubirana sa 1% humanog seruma u GVB puferu koji je sadržao Ca<++>i Mg<++>(4.0 mM barbitala, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatina, pH 7.4) tokom 1 sata na 5° C. Ove preinkubirane smeše antiteloserum su posle toga bile prenete u odgovarajuće bunarčiće mananom obložene test ploče. Aktivacija komplementa je bila inicirana prenošenjem test ploče u vodeno kupatilo na 37°C. Posle inkubacije od 60 minuta, reakcija je bila zaustavljena dodavanjem EDTA reakcionoj smeši. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL sa PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), a onda je svaki bunarčić bio ispran sa 2X sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću 1:100 razređenja pilećeg antihumanog C4c konjugovanog sa biotinom (Immunsystem AB, Uppsala, Švedska) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml goveđeg serumskog albumina (BSA) i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću 0.1 μg/ml streptavidina konjugovanog sa peroksidazom (Pierce Chemical #21126) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml BSA i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz blago mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 5 x 200 μL sa PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) i inkubirano na sobnoj temperaturi 10 minuta. Peroksidazna reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 100 μL/bunarčiću 1.0 M H3PO4 i bio je izmeren OD450.

C4 aktivacija na imunim kompleksom obloženim površinama

[0365] Da bi se izmerio efekat OMS646 na klasični put, gore opisani test je bio modifikovan za korišćenje imunim-kompleksom obloženih ploča. Test je bio izveden kao što je gore detaljno opisano za lektinski put, sa tom razlikom što su bunarčići bili obloženi prečišćenim ovčijim IgG korišćenim za stimulaciju C4 aktivacije klasičnim putem.

Rezultati:

[0366] SLIKA 21A grafički prikazuje nivo C4 aktivacije na mananom obloženoj površini u prisustvu ili odsustvu OMS646. SLIKA 21B grafički prikazuje nivo C4 aktivacije na IgG-obloženoj površini u prisustvu ili odsustvu OMS646. Kao što je prikazano na SLICI 21A, OMS646 inhibira C4 aktivaciju na mananom obloženoj površini sa IC50 od približno 0.5nM u 1% humanog seruma. IC50 vrednost dobijena u 10 nezavisnih eksperimenata je bila 0.52±0.28 nM (srednja±SD). Nasuprot tome, kao što je prikazano na SLICI 21B, OMS646 nije inhibirao C4 aktivaciju na IgG-obloženoj površini. Ovi rezultati pokazuju da OMS646 blokira lektin-zavisnu, ne i od klasičnog puta-zavisnu aktivaciju komponente C4 komplementa.

3. OMS646 specifično blokira lektin-zavisnu aktivaciju terminalnih komponenti komplementa

Metode:

[0367] Efekat OMS646 na taloženje kompleksa koji napada membrane (MAC) je bio analiziran korišćenjem uslova specifičnih za put i to za lektinski put, klasični put i alternativni put. Za ove svrhe je bio korišćen Wieslab Comp300 kit za skrining komplementa (Wieslab, Lund, Švedska) prema instrukcijama proizvođača.

Rezultati:

[0368] SLIKA 22A grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnim za lektinski put. SLIKA 22B grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnim za klasični put. SLIKA 22C grafički prikazuje nivo MAC taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima testa specifičnim za alternativni put.

[0369] Kao što je prikazano na SLICI 22A, OMS646 blokira lektinskim putemposredovanu aktivaciju MAC taloženja sa IC50 vrednosti od približno 1nM. Međutim, OMS646 nema efekat na MAC taloženje generisano aktivacijom posredovanom klasičnim putem (SLIKA 22B) ili aktivacijom posredovanom alternativnim putem (SLIKA 22C).

4. OMS646 efektivno inhibira aktivaciju lektinskog puta pod fiziološkim uslovima

Metode:

[0370] Lektin zavisna C3 i C4 aktivacija je bila određena u 90% humanog seruma u odsustvu i u prisustvu različitih koncentracija OMS646 kao što sledi:

Test C4 aktivacije

[0371] Da bi se odredio efekat OMS646 na lektin-zavisnu C4 aktivaciju, ploče Costar medium binding sa 96 bunarčića su bile obložene preko noći na 5°C sa 2 μg manana (50 μl 40 μg/mL rastvora u 50 mM karbonatnog pufera, pH 9.5. Ploče su onda bile isprane tri puta sa 200 μl PBS i blokirane su sa 100 μL/bunarčiću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS jedan sat na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje. U posebnoj preinkubacionoj ploči, izabrane koncentracije OMS646 su bile pomešane sa 90% humanog seruma i inkubirane 1 sat na ledu. Ove preinkubirane smeše antitelo-serum su bile onda prenete u mananom obložene bunarčiće test ploče na ledu. Test ploče su onda bile inkubirane 90 minuta u kupatilu sa ledenom vodom da bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem EDTA reakcionoj smeši. Svaki bunarčić je bio ispran 5 puta sa 200 μL PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), a onda je svaki bunarčić bio ispran dva puta sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću 1:1000 razređenja pilećeg antihumanog C4c konjugovanog sa biotinom (Immunsystem AB, Uppsala, Švedska) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml goveđeg serumskog albumina (BSA) i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran 5 puta sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću 0.1 μg/mL streptavidina konjugovanog sa peroksidazom (Pierce Chemical #21126) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/ml BSA i inkubirano je 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz nežno mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran pet puta sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću peroksidaznog supstrata TMB (Kirdegaard & Perry Laboratories) i inkubirano je na sobnoj temperaturi 16 minuta. Peroksidazna reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 100 μL/bunarčiću 1.0M H3PO4 i bio je izmeren OD450.

Test C3 aktivacije

[0372] Da bi se odredio efekat OMS646 na lektin-zavisnu C3 aktivaciju, testovi su bili izvedeni na identičan način kao gore opisani test C4aktivacije, izuzev što je C3 taloženje bilo određeno kao krajnja tačka. C3 taloženje je bilo kvantifikovano kao što sledi. Na kraju reakcije taloženja komplementa, ploče su bile isprane što je opisano gore i zatim su inkubirane 1 sat sa 100 μL/bunarčiću 1:5000 razređenja zečjeg antihumanog C3c antitela (Dako) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/mL goveđeg serumskog albumina (BSA). Svaka ploča je bila isprana pet puta sa 200 μL PBS, a onda je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi sa 100 μL/bunarčiću HRP-obeleženog kozjeg anti-zečjeg IgG (American Qualex Antitela) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/mL BSA. Ploče su bile isprane pet puta sa 200 μL PBS, a onda je bilo dodato 100 μL/bunarčiću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) i inkubirano je na sobnoj temperaturi 10 minuta. Peroksidazna reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 100 μL/bunarčiću 1.0M H3PO4 i bio je izmeren OD450. IC50 vrednosti su bile izvedene primenom algoritma za fitovanje sigmoidne krive dozareakcija (GraphPad) na eksperimentalnim skupovima podataka.

Rezultati:

[0373] SLIKA 23A grafički prikazuje nivo C3 taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) na opsegu koncentracija u 90% humanog seruma pod uslovima specifičnim za lektinski put. SLIKA 23B grafički prikazuje nivo C4 taloženja u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) na opsegu koncentracija u 90% humanog seruma pod uslovima specifičnim za lektinski put. Kao što je prikazano na SLICI 23A, OMS646 je blokirao C3 taloženje u 90% humanog seruma sa IC50 = 3±1.5 nM (n=6). Kao što je prikazano na SLICI 23B, OMS646 je blokirao C4 taloženje sa IC50 = 2.8±1.3 nM (n=6).

[0374] Ovi rezultati demonstriraju da OMS646 obezbeđuje potentnu, efektivnu blokadu aktivacije lektinskog puta pod fiziološkim uslovima, čime se obezbeđuje podrška za primenu malih terapeutskih doza OMS646. Na osnovu ovih podataka, očekuje se da će OMS646 blokirati >90% lektinski put u cirkulaciji pacijenta sa koncentracijom u plazmi 20 nM (3μg/mL) ili manjom. Na osnovu zapremine plazme tipičnog čoveka od približno 3L, i saznanja da se najveći deo materijala datog antitela zadržava u plazmi (Lin Y.S. et al., JPET 288:371 (1999)), očekuje se da će doza OMS646 od bar 10 mg data intravenski biti efektivna za blokiranje lektinskog puta u toku akutnog vremenskog perioda (tj. prolaznog vremenskog perioda, kao što je od 1 do 3 dana). U kontekstu hronične bolesti može biti poželjno da se lektinski put blokira tokom produženog vremenskog perioda da bi se ostvarila maksimalna korist od lečenja. Shodno tome, za takva hronična stanja može biti poželjna doza OMS646 od 100mg, za koju se očekuje da će biti efektivna na blokiranje lektinskog puta kod odraslog humanog subjekta tokom najmanje jedne nedelje ili duže. Imajući u vidu spori klirens i dugi poluživot koji se obično uočavaju za antitela kod ljudi, moguće je da će doza OMS646 od 100 mg biti efektivna duže od jedne nedelje, kao što je 2 nedelje, ili čak 4 nedelje. Očekuje se da će veće doze antitela (tj. veće od 100 mg, kao što je 200 mg, 500 mg ili više, kao što je 700mg ili 1000mg), imati duže vreme trajanja dejstva (npr. više od 2 nedelje).

5. OMS646 blokira aktivaciju lektinskog puta kod majmuna

[0375] Kao što je opisano gore u Primeru 10 i prikazano na SLICI 17, utvrđeno je da OMS646 odstranjuje sistemsku aktivnost lektinskog puta tokom vremenskog perioda od oko 72 sata posle intravenske administracije OMS646 (3 mg/kg) afričkim zelenim majmunima, što je praćeno ponovnim uspostavljanjem aktivnosti lektinskog puta.

[0376] Ovaj Primer opisuje naknadnu studiju u kojoj je lektin-zavisna C4 aktivacija bila određena u 90% seruma afričkih zelenih majmuna ili u 90% seruma makaki majmuna na opsegu koncentracija OMS646 i u odsustvu OMS646, kao što sledi: Da bi se odredio efekat OMS646 na lektin-zavisnu C4 aktivaciju u različitim nehumanim vrstama primata, Costar medium binding ploče sa 96 bunarčića su bile obložene preko noći na 5°C sa 2 μg manana (50 μl 40 μg/mL rastvora u 50 mM karbonatnog pufera, pH 9.5). Ploče su onda bile isprane tri puta sa 200 μL PBS i blokirane su sa 100 μL/bunarčiću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS 1 sat na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje. U posebnoj preinkubacionoj ploči, izabrane koncentracije OMS646 su bile pomešane sa 90% seruma uzetog od afričkih zelenih majmuna ili makaki majmuna, i inkubirani su 1 sat na ledu. Ove preinkubacione smeše antitelo-serum su onda bile prenete u mananom obložene bunarčiće test ploča na ledu. Test ploče su onda bile inkubirane 90 minuta u kupatilu sa ledenom vodom da bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem EDTA reakcionoj smeši. Svaki bunarčić je bio ispran pet puta sa 200 μL PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), a onda je svaki bunarčić bio ispran dva puta sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću 1:1000 razređenja pilećeg antihumanog C4c konjugovanog sa biotinom (Immunosystem AB, Uppsala, Švedska) u PBS koji je sadržao 2.0 mg/mL BSA i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran pet puta sa 200 μL PBS.100 μL/bunarčiću 0.1 μg/mL streptavidina konjugovanog sa peroksidazom (Pierce Chemical #21126) je bilo dodato u PBS koji je sadržao 2.0 mg/mL BSA i inkubirano je jedan sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz nežno mešanje. Svaki bunarčić je bio ispran pet puta sa 200 μL PBS. Bilo je dodato 100 μL/bunarčiću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) i inkubirano je na sobnoj temperaturi 10 minuta. Reakcija peroksidaze je bila zaustavljena dodavanjem 100 μL/bunarčiću 1.0 M H3PO4 i bio je izmeren OD450. IC50 vrednosti su bile izvedene primenom algoritma za fitovanje sigmoidne krive doza-reakcija (GraphPad) na skupove eksperimentalnih podataka.

Rezultati:

[0377] Doza-reakcija inhibicije lektinskog puta u 90% seruma makaki majmuna (SLIKA 24A) i u 90% seruma afričkih zelenih majmuna (SLIKA 24B) je bila uočena sa IC50 vrednosti u opsegu od 30 nM do 50 nM, i od 15 nM do 30 nM, respektivno.

[0378] Ukratko, bilo je uočeno da OMS646, potpuno humano anti-humano MASP-2 IgG4 antitelo (sa mutacijom u regionu zgloba) ima sledeća poželjna svojstva: visoki afinitet vezivanja za humani MASP-2 (KD u opsegu od 50 do 250 pM, sa Koff brzinom u opsegu od 1-3x10<-4>S<-1>i Kon brzinom u opsegu od 1.6-3x10<6>M<-1>S<-1>; funkcionalnom potencijom u humanom serumu sa inhibicijom C4 taloženja sa IC50 od 0.52±0.28 nM (n=10) u 1% humanog seruma; i IC50 od 3±1.5nM u 90% seruma); i unakrsnomreaktivnosti kod majmuna koji ispoljavaju inhibiciju C4 taloženja sa IC50 u opsegu od 15 do 50 nM (90% majmunskog seruma).

[0379] Kao što je opisano gore, očekuje se da doze od bar 10 mg OMS646 (koje odgovaraju 0.15 mg/kg za prosečnog čoveka) budu efektivne za akutno blokiranje lektinskog puta u humanoj cirkulaciji (npr. tokom perioda od najmanje 1 do 3 dana), dok se očekuje da će doze od 100 mg OMS646 (koje odgovaraju 1.5 mg/kg za prosečnog čoveka) blokirati lektinski put u cirkulaciji pacijenta tokom najmanje jedne nedelje ili duže. Veće doze OMS646 (npr. doze veće od 100mg, kao što je najmanje 200mg, najmanje 300mg, najmanje 400mg, najmanje 500mg, ili više), a prvenstveno subkutani (sc) ili intramuskularni (im) načini administracije se mogu koristiti za dalje produženje vremenskog prozora efektivne ablacije lektinskog puta do dve nedelje, a prvenstveno četiri nedelje.

[0380] Na primer, kao što je prikazano ovde u eksperimentalnim podacima, kod primata je doza OMS646 od 1 mg/kg rezultovala inhibicijom lektinskog puta od 1 dana, a doza OMS646 od 3 mg/kg je rezultovala inhibicijom lektinskog puta od oko 3 dana (72 sata). Zato je procenjeno da bi veće doze od 7 do 10mg/kg bile efektivne za inhibiranje lektinskog puta tokom vremenskog perioda od oko 7 dana. Kao što je ovde prikazano, OMS646 je imalo 5-10-struko veću potenciju protiv humanog MASP-2 u poređenju sa majmunskim MASP-2. Pretpostavljajući da su farmakokinetike uporedive, očekivani opsezi doza za ostvarivanje efektivne ablacije lektinskog puta kod ljudi su prikazani dole u TABELI 30.

TABELA 30: OMS646 doziranje radi inhibiranja lektinskog puta in vivo

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji vezuje humani MASP-2 i inhibira MASP-2 zavisnu aktivaciju komplementa, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO: 20; i

b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 24.

2. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, pri čemu su antitelo ili njegov antigen vezujući fragment izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv, Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, jednolančanog antitela, ScFv, univalentnog antitela kome nedostaje region zgloba i celog antitela.

3. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuto antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od IgG2 molekula, i IgG1 molekula i IgG4 molekula.

4. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 3, pri čemu IgG4 molekul sadrži S228P mutaciju.

5. Molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu MASP-2 antitela, ili njegov antigen vezujući fragment, prema zahtevu 1.

6. Ekspresiona kaseta koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira MASP-2 antitelo prema pronalasku prema zahtevu 5.

7. Ćelija koja sadrži najmanje jedan od molekula nukleinske kiseline koji kodiraju MASP-2 antitelo prema zahtevu 1, prema zahtevu 5 ili zahtevu 6.

8. Metod za generisanje izolovanog anti-MASP-2 antitela koji sadrži kultivaciju ćelije prema zahtevu 7 pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju molekula nukleinske kiseline koji kodiraju anti-MASP-2 antitelo prema zahtevu 1 i izolaciju pomenutog anti-MASP-2 antitela.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humano monoklonsko anti-MASP-2 antitelo, ili njegov fragment, prema zahtevu 1, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9, pri čemu je kompozicija formulisana za intra-arterijsku, intravensku, intrakranijalnu, intramuskularnu, inhalacionu, nazalnu ili subkutanu administraciju.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 koja sadrži jediničnu dozu od 1 mg do 1000 mg izolovanog antitela ili njegovog fragmenta prema zahtevu 1.