I. 定義
除非本文明確地定義，否則本文使用的所有術語具有與本發明領域的普通技術人員所理解的含義相同的含義。為了在本說明書和申請專利範圍中用於描述本發明的術語方面提供清楚，提供以下定義。貫穿本公開內容闡述了另外的定義。
在本說明書中，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應當理解為包括在所列範圍內的任何整數的值，並且在適當時包括其分數(諸如整數的十分之一和百分之一)，除非上下文另外指出或顯而易見。本文列出的與任何物理特徵(諸如聚合物亞基、尺寸或厚度)相關的任何數字範圍應當理解為包括在所列範圍內的任何整數，並且在適當時包括其分數，除非上下文另外指出或顯而易見。本文中使用的術語“約”意在表示所提供的範圍或值可能變化所示範圍或值的±10%，除非另外指出。
應當理解，本文中使用的術語“一個”、“一種”和“所述”表示一種或多種所提及組分。替代物(例如“或”)的使用應當理解為是指替代物中的任一個、兩個或任何組合。本文中使用的術語“包括”、“具有”和“包含”同義地使用，這些術語及其變體意圖被解釋為非限制性的。
“任選的”或“任選地”是指，隨後描述的要素、組分、事件或情况可能發生或可能不發生，並且該描述包括要素、組分、事件或情况發生的情况和不發生的情况。
應當理解，本申請公開了源自本文描述的結構和亞基的各種組合的單個構建體或構建體集合，達到如同單獨闡述每個構建體或構造體集合的相同程度。因此，特定結構或特定亞基的選擇是在本公開內容的範圍內。
術語“基本上由……組成”不等同於“包含”，並表示請求項的指定材料或步驟，或表示不實質上影響所要求保護的主題的基本特徵的那些。例如，在以下情况下，蛋白結構域、區域或模塊(例如，結合結構域)或蛋白“基本上由特定氨基酸序列組成”：當結構域、區域、模塊或蛋白的氨基酸序列包括延伸、缺失、突變或其組合(例如，在氨基端或羧基端或在結構域之間的氨基酸)時，它們聯合貢獻所述結構域、區域、模塊或蛋白的至多20% (例如，至多15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的長度並且沒有實質上影響(即，不將活性降低超過50%，諸如不超過40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%)所述結構域、區域、模塊或蛋白的活性(例如，結合蛋白的靶標結合親和力)。
本文中使用的術語“治療”、“處理”或“改善”表示對受試者的疾病、障礙或病症的醫學管理。一般而言，以足以引發治療或預防益處的量施用包含本公開內容的抗體或其抗原結合片段的適當劑量或治療方案。治療或預防/預防性益處包括：改善的臨床結果；與疾病相關的症狀的减輕或緩解；减少的症狀發生；改善的生活質量；更長的無疾病狀態；疾病程度的减輕，疾病狀態的穩定；疾病進展的延遲或預防；减輕；存活；延長的存活期；或它們的任何組合。
本公開內容的抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、載體、宿主細胞或組合物的“治療有效量”或“有效量”表示足以產生治療效果的組合物或分子的量，所述治療效果包括：改善的臨床結果；與疾病相關的症狀的减輕或緩解；减少的症狀發生；改善的生活質量；更長的無疾病狀態；疾病程度的减輕，疾病狀態的穩定；疾病進展的延遲；减輕；存活；或以統計上顯著的方式延長的存活期。當提及單獨施用的單個活性成分時，治療有效量表示該成分或單獨表達該成分的細胞的作用。當提及組合時，治療有效量表示產生治療效果的活性成分或組合的輔助活性成分與表達活性成分的細胞的組合量，無論是連續、依次還是同時施用。
本文中使用的“受試者”包括所有哺乳動物，包括、但不限於人類、非人靈長類動物、狗、猫、馬、綿羊、山羊、奶牛、兔、猪和嚙齒類動物。受試者可以是雄性或雌性，並且可以是任何合適的年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成年和老年受試者。
本文中使用的“氨基酸”表示天然存在的和合成的氨基酸、以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及以後經過修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物表示具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構(即，與氫、羧基基團、氨基基團和R基團結合的α-碳)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這樣的類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物表示化學化合物，其結構不同於氨基酸的一般化學結構，但是其作用方式類似於天然存在的氨基酸。
本文中使用的“突變”表示，分別與參照或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列的變化。突變可以產生幾種不同類型的序列變化，包括核苷酸或氨基酸的置換、插入或缺失。
在最寬的含義上，天然存在的氨基酸可以基於各個氨基酸的側鏈的化學特性分組。“疏水”氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。“親水”氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。
“保守置換”表示不會顯著影響或改變特定蛋白的結合特徵的氨基酸置換。通常，保守置換是其中被置換的氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘替換的置換。保守置換包括在以下組之一中發現的置換：組1：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)；組2：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；組3：天冬醯胺(Asn或N)、穀氨醯胺(Gln或Q)；組4：精氨酸(Arg或R)、賴氨酸(Lys或K)、組氨酸(His或H)；組5：異亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、纈氨酸(Val或V)；和組6：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外地或可替換地，氨基酸可以通過類似的功能、化學結構或組成(例如，酸性、鹼性、脂族、芳族或含硫)分為保守置換組。例如，為了置換的目的，脂族分組可以包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其它保守置換組包括：含硫的：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性的：Asp、Glu、Asn和Gln；小的、脂族的、非極性的或弱極性的殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；極性的、帶負電荷的殘基和它們的醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；極性的、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；大的脂族的、非極性的殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和大的芳族的殘基：Phe、Tyr和Trp。另外的信息可以參見Creighton (1984) Proteins, W.H.Freeman and Company。
本文中使用的“蛋白”或“肽”或“多肽”表示氨基酸殘基的聚合物。蛋白適用於天然存在的氨基酸聚合物，以及這樣的氨基酸聚合物：其中一個或多個氨基酸殘基是對應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，和非天然存在的氨基酸聚合物。也考慮本公開內容的蛋白、肽和多肽的變體。在某些實施方案中，變體蛋白、肽和多肽包含與本文描述的定義或參考氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%同一性的氨基酸序列或由其組成。
“核酸分子”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“多核酸”表示包括共價連接的核苷酸的寡聚或聚合化合物，其可以由天然的亞基(例如，嘌呤或嘧啶鹼基)或非天然的亞基(例如，嗎啉環)組成。嘌呤鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，且嘧啶鹼基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括多核糖核酸(RNA)，其包括例如mRNA、微RNA、siRNA、病毒基因組RNA和合成的RNA；和多脫氧核糖核酸(DNA)，其包括例如cDNA、基因組DNA和合成的DNA。RNA和DNA可以是單鏈的或雙鏈的。如果是單鏈的，則核酸分子可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼氨基酸序列的核酸分子包括編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的某些版本還可能包含內含子，從而通過共轉錄或轉錄後機制除去內含子。換而言之，作為遺傳密碼的冗餘或簡併性的結果，或者通過剪接，不同的核苷酸序列可能編碼相同的氨基酸序列。
也考慮本公開內容的核酸分子的變體。變體核酸分子與本文描述的定義或參考多核苷酸的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%同一性，且優選95%、96%、97%、98%、99%或99.9%同一性，或在0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉在約65-68℃或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和50%甲醯胺在約42℃的嚴謹雜交條件下與多核苷酸雜交。核酸分子變體保留編碼其結合結構域的能力，所述結合結構域具有本文描述的功能性，諸如結合靶分子。
“序列同一性百分比”表示通過對比序列而確定的兩個或多個序列之間的關係。確定序列同一性的優選方法被設計為在被對比的序列之間產生最佳匹配。例如，將所述序列比對以達到最佳對比目的(例如，為了最佳比對，可以在第一個和第二個氨基酸或核酸序列中的一個或兩者中引入缺口)。此外，出於對比目的，可以忽略不同源的序列。除非另外指出，否則本文提及的序列同一性百分比是在參考序列的長度上計算。確定序列同一性和相似性的方法可以在公眾可得到的計算機程序中找到。使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)或Megalign (DNASTAR)軟件，可以執行序列比對和同一性百分比計算。在BLAST程序中使用的數學算法可以參見Altschul等人, Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997。通過已知方法可以確定用於測量比對的適當參數，包括在所對比序列的全長上實現最大比對所需的任何算法。
術語“分離的”是指，將物質從其原始環境(例如，如果它是天然存在的，則為天然環境)中移出。例如，存在於活動物中的天然存在的核酸或多肽是未分離的，但是與在天然系統中的一些或全部共存物質分開的相同核酸或多肽是分離的。這樣的核酸可以是載體的一部分和/或這樣的核酸或多肽可以是組合物(例如，細胞裂解物)的一部分，並且仍然是分離的，因為這樣的載體或組合物不是所述核酸或多肽的天然環境的一部分。在某些實施方案中，“分離的”還可以描述在人體外的抗體、抗原結合片段、多核苷酸、載體、宿主細胞或組合物。
術語“基因”是指參與產生多肽鏈的DNA或RNA的區段；在某些上下文中，它包括在編碼區之前和之後的區域(例如，5’非翻譯區(UTR)和3’UTR)以及在各個編碼區段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
“功能變體”表示這樣的多肽或多核苷酸：其在結構上類似於或基本上在結構上類似於本公開內容的親本或參考化合物，但在組成上略有不同(例如，一個或多個鹼基、原子或官能團是不同的，被添加或除去)，使得所述多肽或編碼的多肽能够以親本多肽的至少50%效率、優選至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、100%活性水平、或高於所述親本多肽的活性水平來執行親本多肽的至少一種功能。換而言之，在以下情况下，本公開內容的多肽或編碼多肽的功能變體具有“類似的結合”、“類似的親和力”或“類似的活性”：與親本或參考多肽相比，所述功能變體在所選的測定(諸如用於測量酶活性或結合親和力的測定)中表現出性能的改善或不超過50%的性能下降。
本文中使用的“功能部分”或“功能片段”表示僅包含親本或參考化合物的結構域、部分或片段的多肽或多核苷酸，並且所述多肽或編碼的多肽保留至少50%的與親本或參考化合物的結構域、部分或片段相關的活性，優選親本多肽的至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、100%活性水平，或大於親本多肽的活性水平，或者提供生物學益處(例如，效應子功能)。在以下情况下，本公開內容的多肽或編碼多肽的“功能部分”或“功能片段”具有“類似的結合”或“類似的活性”：與親本或參考多肽相比，所述功能部分或片段在所選的測定中表現出性能的改善或不超過50%的性能下降(優選不超過20%或10%下降，或在親和力方面與親本或參照相比不超過對數差異)。
本文中使用的術語“經工程改造的”、“重組的”或“非天然的”表示這樣的生物體、微生物、細胞、蛋白、多肽、核酸分子或載體：其包括至少一種遺傳改變或已經通過外源或異源核酸分子的引入而被修飾，其中這樣的改變或修飾通過基因工程(即人干預)而引入。遺傳改變包括例如引入編碼功能性RNA、蛋白、融合蛋白或酶的可表達核酸分子的修飾，或細胞遺傳物質的其它核酸分子添加、缺失、置換或其它功能性破壞。另外的修飾包括例如非編碼調節區，其中所述修飾會改變多核苷酸、基因或操縱子的表達。
本文中使用的“異源的”或“非內源性的”或“外源的”表示對於宿主細胞或受試者而言非天然的任何基因、蛋白、化合物、核酸分子或活性，或對於已被改變的宿主細胞或受試者而言天然的任何基因、蛋白、化合物、核酸分子或活性。異源的、非內源性的或外源的包括這樣的基因、蛋白、化合物或核酸分子：其已經被突變或以其它方式改變，使得天然的和被改變的基因、蛋白、化合物或核酸分子之間的結構、活性或兩者不同。在某些實施方案中，異源的、非內源性的或外源的基因、蛋白或核酸分子(例如，受體、配體等)對於宿主細胞或受試者而言可能不是內源性的，而是編碼這樣的基因、蛋白或核酸分子的核酸可能已經通過接合、轉化、轉染、電穿孔等添加到宿主細胞中，其中所添加的核酸分子可以整合到宿主細胞基因組中或可以作為染色體外遺傳物質(例如，作為質粒或其它自複製的載體)存在。術語“同源的”或“同源物”表示在宿主細胞、物種或菌株中發現或衍生出的基因、蛋白、化合物、核酸分子或活性。例如，編碼多肽的異源或外源多核苷酸或基因可以與天然多核苷酸或基因同源並編碼同源的多肽或活性，但所述多核苷酸或多肽可以具有改變的結構、序列、表達水平或其任何組合。非內源性多核苷酸或基因以及編碼的多肽或活性可以來自相同的物種、不同的物種或其組合。
在某些實施方案中，如果宿主細胞天然的核酸分子或其部分已經被改變或突變，則其將被視為宿主細胞異源的；或者如果宿主細胞天然的核酸分子已經用異源表達控制序列改變或者已經用通常與宿主細胞天然的核酸分子不相關的內源表達控制序列改變，則其可以被視為異源的。此外，術語“異源”可以表示不同的、改變的或並非宿主細胞內源性的生物活性。如本文描述的，可以將超過一個異源核酸分子作為單獨的核酸分子、作為多個單獨控制的基因、作為多順反子核酸分子、作為編碼抗體或抗原結合片段(或其它多肽)的單個核酸分子或其任何組合引入宿主細胞中。
本文中使用的術語“內源性的”或“天然的”表示通常存在於宿主細胞或受試者中的多核苷酸、基因、蛋白、化合物、分子或活性。
本文中使用的術語“表達”表示基於核酸分子(諸如基因)的編碼序列產生多肽的過程。該過程可以包括轉錄、轉錄後控制、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後控制、翻譯後修飾或其任何組合。表達的核酸分子通常可操作地連接至表達控制序列(例如，啓動子)。
術語“可操作地連接”表示兩個或更多個核酸分子在單個核酸片段上的結合，使得一個核酸分子的功能受另一個影響。例如，當啓動子能够影響編碼序列的表達時(即，編碼序列是在啓動子的轉錄控制下)，所述啓動子與所述編碼序列可操作地連接。“無連接”是指，結合的遺傳元件不彼此緊密地關聯，並且一個元件的功能不會影響其它元件。
如本文描述的，可以將超過一個異源核酸分子作為單獨的核酸分子、作為多個單獨控制的基因、作為多順反子核酸分子、作為編碼蛋白(例如，抗體的重鏈)的單個核酸分子或其任何組合引入宿主細胞中。當將兩個或更多個異源核酸分子引入宿主細胞時，應當理解，所述兩個或更多個異源核苷酸分子可以作為單個核酸分子(例如，在單個載體上)、在單獨的載體上引入，在單個位點或多個位點處整合到宿主染色體中，或它們的任何組合。提及的異源核酸分子或蛋白活性的數目表示不同編碼核酸分子的數目或不同蛋白活性的數目，不表示引入宿主細胞中的單獨核酸分子的數目。
術語“構建體”表示含有重組核酸分子的任何多核苷酸(或者，當上下文清楚指示時，本公開內容的融合蛋白)。(多核苷酸)構建體可以存在於載體(例如，細菌載體、病毒載體)中或可以整合到基因組中。“載體”是能够運輸另一種核酸分子的核酸分子。載體可以是例如質粒、黏粒、病毒、RNA載體或線性或環狀DNA或RNA分子，其可以包括染色體、非染色體、半合成的或合成的核酸分子。本公開內容的載體還包括轉座子系統(例如，睡美人(Sleeping Beauty)，參見，例如，Geurts等人, Mol. Ther. 8:108, 2003: Mátés等人, Nat. Genet. 41:753, 2009)。示例性載體是能够自主複製的那些(附加型載體)，能够將多核苷酸遞送到細胞基因組中的那些(例如，病毒載體)，或者能够表達它們所連接的核酸分子的那些(表達載體)。
本文中使用的“表達載體”、“克隆載體”或“載體”表示含有核酸分子的DNA構建體，所述核酸分子可操作地連接至能够在合適宿主中實現核酸分子的表達的合適控制序列。這樣的控制序列通常包括用於實現轉錄的啓動子、任選的用於控制這樣的轉錄的操縱基因序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、和控制轉錄和翻譯的終止的序列。所述載體可以是質粒、噬菌體顆粒、病毒，或簡單地是潜在基因組插入物。一旦轉化進合適的宿主，所述載體可以獨立於宿主基因組複製並發揮作用，或者在某些情况下，整合到基因組本身中，或者在沒有載體序列的情况下將載體中所包含的多核苷酸遞送到基因組中。在本說明書中，“質粒”、“表達質粒”、“病毒”和“載體”經常互換使用。
在將核酸分子插入細胞中的上下文中，術語“引入”是指“轉染”，“轉化”或“轉導”，並包括將核酸分子整合進真核或原核細胞中，其中所述核酸分子可以整合進細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中、轉化為自主複製子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。
在某些實施方案中，本公開內容的多核苷酸可以可操作地連接至載體的某些元件。例如，可以可操作地連接多核苷酸序列，其是影響它們所連接的編碼序列的表達和處理所需的。表達控制序列可以包括適當的轉錄起始、終止、啓動子和增強子序列；有效的RNA加工信號諸如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；增強蛋白穩定性的序列；以及在可能時增強蛋白分泌的序列。如果表達控制序列與目標基因相鄰，則表達控制序列可以可操作地連接，並且以反式或在一定距離起作用來控制目標基因的表達控制序列也可以被認為可操作地連接。
在某些實施方案中，載體包含質粒載體或病毒載體(例如，慢病毒載體或γ-逆轉錄病毒載體)。病毒載體包括逆轉錄病毒，腺病毒，細小病毒(例如，腺伴隨病毒)，冠狀病毒，負鏈RNA病毒諸如正黏病毒(例如，流感病毒)，彈狀病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)，副黏病毒(例如，麻疹病毒和仙台病毒)，正鏈RNA病毒諸如小核糖核酸病毒和甲病毒，和雙鏈DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1和2型單純疱疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、巨細胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鶏痘和金絲雀痘)。其它病毒包括例如諾沃克病毒、披膜病毒、黃病毒、裏奧病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆轉錄病毒的例子包括禽白血病-肉瘤、哺乳動物C-型、B-型病毒、D型病毒、HTLV-BLV組、慢病毒、泡沫病毒(Coffin, J.M., Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology，第三版, B.N.Fields等人，編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。使用逆轉錄病毒和慢病毒病毒載體以及包裝細胞用含有轉基因的病毒顆粒轉導哺乳動物宿主細胞的方法是本領域已知的，並且已經在以前描述，例如，見：美國專利8,119,772；Walchli等人, PLoS One 6:327930, 2011；Zhao等人, J. Immunol. 174:4415, 2005；Engels等人, Hum.Gene Ther.14:1155, 2003；Frecha等人, Mol. Ther. 18:1748, 2010；和Verhoeyen等人, Methods Mol.Biol.506:97, 2009。逆轉錄病毒和慢病毒載體構建體和表達系統也是商購可得的。其它病毒載體也可以用於多核苷酸遞送，包括DNA病毒載體，包括例如基於腺病毒的載體和基於腺伴隨病毒(AAV)的載體；從單純疱疹病毒(HSV)衍生出的載體，包括擴增子載體、複製缺陷型HSV和减弱的HSV(Krisky等人, Gene Ther.5:1517, 1998)。
可以與本公開內容的組合物和方法一起使用的其它載體包括從桿狀病毒和α-病毒衍生出的那些(Jolly, D J.1999.Emerging Viral Vectors.第209-40頁，Friedmann T.編. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab)，或質粒載體(諸如睡美人或其它轉座子載體)。
當病毒載體基因組包含要作為單獨轉錄物在宿主細胞中表達的多個多核苷酸時，病毒載體還可以包含在兩個(或更多個)轉錄物之間的另外序列，從而允許雙順反子或多順反子表達。用於病毒載體中的這樣的序列的例子包括內核糖體進入位點(IRES)、弗林蛋白酶切割位點、病毒2A肽或其任何組合。
質粒載體，包括用於體外表達一種或多種蛋白或用於直接施用給受試者的基於DNA的質粒載體，也是本領域已知的。這樣的載體可以包含細菌複製起點、病毒複製起點、編碼質粒複製所需組分的基因和/或一種或多種選擇標志物，並且還可以含有允許雙順反子或多順反子表達的另外序列。
本文中使用的術語“宿主”表示被靶向用異源核酸分子進行遺傳修飾以產生目標多肽(例如，本公開內容的抗體)的細胞或微生物。
宿主細胞可以包括可接受載體或核酸的摻入或表達蛋白的任何單個細胞或細胞培養物。該術語也包括宿主細胞的後代，無論在遺傳上或在表型上相同還是不同。合適的宿主細胞可以取决於載體，且可以包括哺乳動物細胞、動物細胞、人細胞、猿猴細胞、昆蟲細胞、酵母細胞和細菌細胞。通過使用病毒載體，經由磷酸鈣沉澱的轉化、DEAE-葡聚糖、電穿孔、顯微注射或其它方法，可以誘導這些細胞以整合所述載體或其它物質。參見，例如, Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)。
本文中使用的“抗原”表示引發免疫應答的免疫原性分子。該免疫應答可能涉及抗體產生、特異性免疫活性細胞的活化、補體的活化、抗體依賴性細胞毒性或其任何組合。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂質等。顯而易見的是，可以從生物樣品合成、重組生產或衍生出抗原。可以含有一種或多種抗原的示例性生物樣品包括組織樣品、糞便樣品、細胞、生物流體或其組合。已經被修飾或遺傳工程改造以表達抗原的細胞可以產生抗原。抗原也可以存在於傳染原內部或表面，諸如存在於病毒粒子中，或在被傳染原感染的細胞的表面上表達或存在。
術語“表位”或“抗原性表位”包括被同源結合分子(諸如免疫球蛋白或其它結合分子、結構域或蛋白)識別並特異性結合的任何分子、結構、氨基酸序列或蛋白决定簇。表位决定簇通常含有分子的化學活性表面基團，諸如氨基酸或糖側鏈，並且可以具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。當抗原是或包含肽或蛋白時，所述表位可以由連續氨基酸構成(例如，線性表位)，或者可以由來自蛋白的不同部分或區域的氨基酸構成，所述氨基酸通過蛋白折疊而接近(例如，不連續或構象表位)，或者由無論蛋白折疊如何都緊密接近的非連續氨基酸構成。
術語“抗體”表示由一種或多種多肽組成的免疫球蛋白分子，所述多肽通過至少一個表位識別位點特異性地結合抗原。例如，術語“抗體”包括完整抗體，其至少包含通過二硫鍵連接的兩條重鏈和兩條輕鏈；以及完整抗體的任何抗原結合部分或片段，其具有或保留與完整抗體所識別的抗原靶分子結合的能力，諸如scFv、Fab或Fab’2片段。該術語還包括任何種類或子類的抗體的全長或片段，包括IgG及其子類(諸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgE、IgA和IgD。
本文中以最寬的含義使用術語“抗體”，包括抗體及其抗體片段，它們源自任何產生抗體的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔和靈長類動物，包括人)，或源自雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達或轉基因動物(或產生抗體或抗體片段的其它方法)。術語“抗體”無意在抗體的來源或其製備方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物、肽合成等)方面進行限制。示例性抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體；多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)；人源化抗體；全人抗體、鼠抗體；嵌合的、小鼠-人、小鼠-靈長類動物、靈長類動物-人單克隆抗體；和抗獨特型抗體，並且可以是任何完整分子或其片段。本文中使用的術語“抗體”不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括其片段(諸如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)、及其合成變體、天然存在的變體、包含具有所需特異性的抗原結合片段的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、以及包含所需特異性的抗原結合位點或片段(表位識別位點)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型。該術語包括免疫球蛋白的遺傳工程改造的和/或以其它方式修飾的形式，諸如細胞內抗體、肽體、雙體、三體、四體、串聯的二-scFv、串聯的三-scFv等，包括其抗原結合片段。
術語“VH”和“VL”分別表示來自抗體重鏈和抗體輕鏈的可變結合區。VL可以是κ類鏈或λ類鏈。所述可變結合區包含離散的、定義明確的亞區，被稱為互補性决定區(CDR)和框架區(FR)。CDR位於抗體的高變區(HVR)內，並表示在抗體可變區內的氨基酸序列，所述序列通常共同賦予抗體的抗原特異性和/或結合親和力。連續的CDR(即CDR1和CDR2，以及CDR2和CDR3)在一級結構中被框架區彼此分離。
本文中使用的“嵌合抗體”是一種重組蛋白，其含有源自非人物種(例如，嚙齒動物)抗體的可變結構域和互補性决定區，而抗體分子的其餘部分源自人抗體。在某些實施方案中，嵌合抗體由一種抗體的抗原結合片段構成，所述抗原結合片段可操作地連接或以其它方式融合至不同抗體的異源Fc部分。例如，小鼠-人嵌合抗體可以包含融合到源自人抗體的Fc部分的小鼠抗體的抗原結合片段。在某些實施方案中，異源Fc結構域可以來自與親本抗體不同的Ig類，包括IgA (包括亞類IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG (包括亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。
本文中使用的“人源化抗體”是一種分子，通常使用重組技術製備，其具有源自非人類物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的該分子的剩餘免疫球蛋白結構。人源化抗體與嵌合抗體的不同之處在於，通常僅使用來自非人物種的CDR，其被嫁接到人可變結構域中的適當框架區上。抗原結合位點可以是野生型，或者可以通過一個或多個氨基酸置換來修飾。在某些實施方案中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其它實施方案中，人源化抗體具有相對於原始抗體而言被改變的一個或多個CDR(1、2、3、4、5、6個)，其也被稱為“源自”原始抗體的一個或多個CDR的一個或者多個CDR。
本文中使用的術語“抗體片段”表示源自全長抗體或與全長抗體相關的部分，通常包括其抗原結合區或可變區。抗體片段的示例性例子包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、雙體、直鏈抗體、單鏈抗體分子和由多個抗體片段形成的多特異性抗體。
本文中使用的術語“抗原結合片段”表示含有免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的至少一個CDR的多肽片段，其特異性地結合產生的抗體所針對的抗原。抗原結合片段可以包含來自抗體的VH和VL序列的1、2、3、4、5個或全部6個CDR。
“Fab”(抗原結合片段)是抗體中與抗原結合的部分，並包括通過鏈間二硫鍵與輕鏈連接的重鏈的可變區和CH1。每個Fab片段在抗原結合方面都是單價的，即它具有單個抗原結合位點。抗體的胃蛋白酶處理產生單個大的F(ab')2片段，其大致對應於具有二價抗原結合活性的兩個二硫鍵連接的Fab片段並且仍然能够交聯抗原。Fab和F(ab’)2都是“抗原結合片段”的例子。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於，在CH1結構域的羧基端有幾個另外殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中關於Fab’而命名，其中恆定結構域的半胱氨酸殘基帶有游離巰基。F(ab')2抗體片段經常作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段對產生。抗體片段的其它化學偶聯也是已知的。
Fab片段可以例如通過肽接頭連接，以形成單鏈Fab，在本文中也被稱作“scFab”。在這些實施方案中，在天然Fab中存在的鏈間二硫鍵可能不存在，並且接頭完全或部分用於連接或鏈接單個多肽鏈中的Fab片段。重鏈衍生的Fab片段(例如，包含VH + CH1或“Fd”、由其組成或基本上由其組成)和輕鏈衍生的Fab片段(例如，包含VL + CL、由其組成或基本上由其組成)可以以任何排列連接以形成scFab。例如，可以根據(重鏈Fab片段-接頭-輕鏈Fab片段)或(輕鏈Fab片段-接頭-重鏈Fab片段)在N-端至C-端方向排列scFab。
“Fv”是含有完整抗原識別和抗原結合位點的小抗體片段。該片段通常由緊密地非共價結合的一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。但是，甚至單個可變結構域(或僅包含三個抗原特異性CDR的Fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力，儘管親和力通常低於整個結合位點。
“單鏈Fv”也縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接至單個多肽鏈中的VH和VL抗體結構域的抗體片段。scFv多肽可以包含設置在VH和VL結構域之間並連接VH和VL結構域的多肽接頭，這使得scFv能够保留或形成抗原結合所需的結構，儘管接頭並非總是必需的。使用本領域眾所周知的標準技術，可以將這樣的肽接頭摻入融合多肽中。另外，或可替換地，Fv可以具有在VH和VL之間形成並穩定VH和VH的二硫鍵。關於scFv的綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷, Rosenburg和Moore編, Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)。在某些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含scFv，所述scFv包含VH結構域、VL結構域、以及將VH結構域連接至VL結構域的肽接頭。在特定實施方案中，scFv包含通過肽接頭連接至VL結構域的VH結構域，其可以處於VH-接頭-VL取向或VL-接頭-VH取向。本公開內容的任何scFv都可以被工程改造，使得VL結構域的C-端末端通過短肽序列連接至VH結構域的N-端末端，或者反之亦然(即，(N)VL(C)-接頭-(N)VH(C)或(N)VH(C)-接頭-(N)VL(C))。可替換地，在某些實施方案中，接頭可以連接至VH結構域、VL結構域或兩者的N-端部分或末端。
可以選擇用於scFv或其它融合蛋白(諸如本文描述的被靶向的補體活化分子)中的肽接頭序列，例如基於：(1)它們採用柔性延伸構象的能力；(2)它們不能或缺乏採用特定二級結構的能力，所述特定二級結構可以與第一和第二多肽上和/或靶分子上的功能表位相互作用；和/或(3)缺乏或相對缺乏可能與多肽和/或靶分子反應的疏水或帶電殘基。關於接頭設計(例如，長度)的其它考慮可以包括其中VH和VL可以形成功能性抗原結合位點的構象或一系列構象。在某些實施方案中，肽接頭序列含有例如Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，諸如Thr和Ala，也可以被包括在接頭序列中。可以有用地用作接頭的其它氨基酸序列包括在以下文獻中公開的那些：Maratea等人, Gene 40:39 46(1985); Murphy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986)；美國專利號4,935,233,和美國專利號4,751,180。可以使用任何合適的接頭，並且通常可以是約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100個氨基酸長度，或小於約200個氨基酸長度，並且將優選地包含柔性結構(可以為通過接頭連接的兩個區域、結構域、基序、片段或模塊之間的構象運動提供柔性和空間)，並且將優選地是生物惰性的和/或在人類中具有低的免疫原性風險。
抗體可以是單特異性的(例如，與單個表位結合)或多特異性的(例如，與多個表位和/或靶分子結合)。在某些實施方案中，雙特異性或多特異性抗體或抗原結合片段可以包含一個、兩個或更多個抗原結合結構域(例如，VH和VL)。可以存在與相同或不同表位結合的兩個或更多個結合結構域，在某些實施方案中，本文提供的雙特異性或多特異性抗體或抗原結合片段可以是兩個或更多個結合結構域，它們結合完全不同的抗原或病原體。
可以以各種形式構建抗體和抗原結合片段。示例性抗體形式公開在Spiess等人, Mol.Immunol.67(2):95 (2015)，以及Brinkmann和Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)，所述形式及其製備方法通過引用併入本文，並包括例如雙特異性T細胞接合物(BiTE)、DART、凸起-進入-孔洞(KIH)組件、scFv-CH3-KIH組件、KIH普通輕鏈抗體、TandAb、三體、TriBi微體、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv2、四價HCab、細胞內抗體、CrossMab、雙重作用Fab (DAF) (二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、電荷對、Fab-臂交換、SEED體、Triomab、LUZ-Y組件、Fcab、κλ-體、正交Fab、DVD-Ig (例如，美國專利號8,258,268，所述形式通過引用整體併入本文)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L、H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody和DVI-IgG (四合一)、以及所謂的FIT-Ig (例如，PCT公開號WO 2015/103072，所述形式通過引用整體併入本文)、所謂的WuxiBody形式(例如，PCT公開號WO 2019/057122，所述形式通過引用整體併入本文)和所謂的In-Elbow-Insert Ig形式(IEI-Ig；例如，PCT公開號WO 2019/024979和WO 2019/025391，所述形式通過引用整體併入本文)。
抗體或抗原結合片段可以包含兩個或更多個VH結構域、兩個或更多個VL結構域、或二者(即，兩個或更多個VH結構域和兩個或更多個VL結構域)。在特定實施方案中，抗原結合片段包含形式(N-端至C-端方向) VH-接頭-VL-接頭-VH-接頭-VL，其中兩個VH序列可以相同或不同且兩個VL序列可以相同或不同。這樣的連接的scFv可以包括被布置成與給定靶標結合的VH和VL結構域的任何組合，並且呈包含兩個或更多個VH和/或兩個或更多個VL的形式，可以結合一個、兩個或更多個不同的表位或抗原。應當理解，包含多個抗原結合結構域的形式可以包括呈任何組合或取向的VH和/或VL序列。例如，抗原結合片段可以包含形式VL-接頭-VH-接頭-VL-接頭-VH、VH-接頭-VL-接頭-VL-接頭-VH或VL-接頭-VH-接頭-VH-接頭-VL。
本文中使用的修飾詞“單克隆的”指示抗體的特徵是從基本均勻的抗體群體獲得，並且無意在抗體的來源或製備方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)方面進行限制。術語“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且包括其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)、其變體、包含抗原結合部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合的單克隆抗體和免疫球蛋白分子的任何其它經修飾構型，所述經修飾構型包含具有所要求的特異性和結合表位的能力的抗原結合片段(表位識別位點)。使用提供在培養物中通過連續細胞系產生抗體分子的任何技術，諸如Kohler, G.，等人, Nature 256:495, 1975描述的雜交瘤方法，可以獲得單克隆抗體，或者可以通過重組DNA方法製備它們(參見，例如，Cabilly的美國專利號4,816,567)。使用Clackson, T.，等人, Nature 352:624 628, 1991,和Marks, J.D.，等人, J. Mol. Biol. 222:581 597, 1991中描述的技術，也可以從噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體。這樣的抗體可以屬於任何免疫球蛋白種類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亞類。
公認的免疫球蛋白多肽包括κ和λ輕鏈以及α、γ (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重鏈，或其它物種中的等同物。全長免疫球蛋白“輕鏈”(具有約25 kDa或約214個氨基酸)包含在NH2端的約110個氨基酸的可變區和在COOH-端的κ或λ恆定區。全長免疫球蛋白“重鏈”(具有約50 kDa或約446個氨基酸)類似地包含一個可變區(具有約116個氨基酸)和前述重鏈恆定區之一，例如γ(具有約330個氨基酸)。
基本的四鏈抗體單元是由兩個相同輕(L)鏈和兩個相同重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體與此方案的不同之處在於，它由五個基本異四聚體單元以及一個稱為J鏈的另外多肽組成，並因此含有10個抗原結合位點。分泌型IgA抗體也不同於基本結構，因為它們可以聚合以形成多價組裝物，其包含兩到五個基本四鏈單元以及J鏈。每個L鏈通過一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩個H鏈則通過一個或多個二硫鍵中的一個或多個(取决於H鏈同種型)彼此連接。每個H和L鏈還具有規則間隔的鏈內二硫鍵。VH和VL的配對一起形成單個抗原結合位點。
每個H鏈在N-端具有可變結構域(VH)，在α、γ和δ鏈的情况下，其後是三個恆定結構域(CH1、CH2、CH3)，或者在μ和ε鏈的情况下，其後是四個CH結構域(CH1, CH2, CH3, CH4)。
每個L鏈在N-端具有可變結構域(VL)，其後是在其另一端的恆定結構域(CL)。當L鏈和H鏈配對時，VL與VH對齊，並且CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)對齊。來自任何脊椎動物物種的L鏈都可以基於其恆定結構域(CL)的氨基酸序列分為被稱作κ (kappa)和λ (lambda)的兩種類型之一。
根據其重鏈的恆定結構域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分為不同的類別或同種型。有五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其重鏈分別命名為α (alpha)、δ (delta)、ε (epsilon)、γ (gamma)和μ(mu)。基於CH序列和功能的微小差異，γ和α類進一步分為亞類，例如，人類表達以下亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
關於不同類別抗體的結構和性質，參見，例如，Basic and Clinical Immunology，第8版, Daniel P.Stites, Abba I.Terr和Tristram G.Parslow (編); Appleton和Lange, Norwalk, Conn., 1994，第71頁和第6章。
術語“可變”表示以下事實：V結構域的某些區段在抗體之間的序列差異很大。V結構域介導抗原結合並定義特定抗體對其特定抗原的特異性。但是，變異性在可變結構域的110個氨基酸跨度上並非均勻分布。相反，V區域由15-30個氨基酸的被稱為框架區(FR)的相對不變的段組成，所述段被各9-12個氨基酸長度的稱為“高變區”的極端變異性的較短區域隔開。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各包含四個FR(主要採用β-折疊構型)，所述FR由三個高變區連接，它們形成連接n-折疊結構的環，且在某些情况下形成n-折疊結構的一部分。在每個鏈中的高變區由FR保持緊密靠在一起，且與來自其它鏈的高變區一起，促進抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat，等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991))。恆恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出各種效應子功能。
本文中使用的“效應子功能”表示可歸因於抗體的Fc區的那些生物活性。抗體效應子功能的例子包括參與抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC)、C1q結合和補體依賴性的細胞毒性、Fc受體結合、吞噬作用、細胞表面受體的下調和B-細胞活化。可以對Fc結構域進行修飾，諸如氨基酸置換，以便改變(例如，增強或减少)含Fc多肽的一種或多種功能。這樣的功能包括例如Fc受體結合、抗體半衰期調節、ADCC功能、蛋白A結合、蛋白G結合和補體結合。修飾Fc功能的氨基酸修飾包括，例如，T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、H433K/N434F、M428L/N434S、E233P/L234V/L235A/G236Δ/A327G/A330S/P331S、E333A、S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297Q、K322A、S228P、L235E/E318A/K320A/K322A、L234A/L235A和L234A /L235A/P329G突變。其它Fc修飾及其對Fc功能的影響是本領域已知的。
本文中使用的術語“高變區”表示抗體的負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區含有幾個“互補性决定區”(CDR)。重鏈包含三個CDR序列(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，且輕鏈包含三個CDR序列(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。存在多種用於鑑定和編號組成CDR的氨基酸的系統。例如，當根據Kabat，等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)中所述的Kabat編號系統進行編號時，高變區通常包含在輕鏈可變結構域中約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)處的CDR，和在重鏈可變結構域中約殘基31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)處的CDR；和/或當根據Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)中所述的Chothia編號系統進行編號時，高變區通常包含在輕鏈可變結構域中約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)處的CDR，和在重鏈可變結構域中約殘基26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-102 (H3)處的CDR；和/或當根據Lefranc, J.P.，等人, Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M.，等人, Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)中所述的IMGT編號系統進行編號時，高變區通常包含在VL中約殘基27-38 (L1)、56-65 (L2)和105-117 (L3)處的CDR，和在VH中約殘基27-38 (H1)、56-65 (H2)和105-117 (H3)處的CDR。使用抗原受體編號和受體分類(ANARCI)軟件工具(2016, Bioinformatics 15:298-300)，可以對不同分子的等效殘基位置進行注釋和對比。因此，根據一種編號方案對本文提供的示例性可變結構域(VH或VL)序列的CDR的鑑定不排除包含相同可變結構域的CDR的抗體(如使用不同編號方案所確定的)。
本文中使用的“特異性地結合”表示這樣的抗體或抗原結合片段：其以特定親和力結合抗原，而不與樣品中的任何其它分子或組分顯著締合或結合。親和力可以定義為平衡締合常數(Ka)，計算為kon/koff的比率，單位為1/M，或者定義為平衡解離常數(Kd)，計算為koff/kon的比率，單位為M。
在某些上下文中，可以參考對抗原的親和力和/或親合力來描述抗體和抗原結合片段。除非另有說明，否則親合力表示抗體或其抗原結合片段與抗原的總結合強度，並反映結合親和力、抗體或抗原結合片段的價態(例如，抗體或抗原結合片段是否包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個結合位點)、以及例如是否存在可以影響結合的另一種試劑(例如，抗體或抗原結合片段的非競爭性抑制劑)。
除非明確地另外說明，否則本說明書中的每個實施方案在細節上做必要的修正後適用於每個其它實施方案。考慮到，在本說明書中討論的任何實施方案都可以關於本發明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物來實施，反之亦然。此外，本發明的組合物可以用於實現本發明的方法。
II. 概述
本公開內容提供了結合人MASP-2的抗體及其抗體結合片段，所述MASP-2是補體系統的凝集素途徑的活化劑。凝集素，諸如MBL、M-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白、膠原凝集素-10和膠原凝集素-11，是觸發先天性補體系統的特異性識別分子。補體系統還包括末端途徑擴增環，其擴增凝集素啓動的補體活化，從而導致更大量的末端補體效應分子的釋放。
除了其在免疫防禦中的重要作用外，補體系統在許多臨床條件下也會導致組織損傷。因此，迫切需要開發治療上有效的補體抑制劑來預防這些不良作用。認識到在保持經典和旁路途徑完整的同時可抑制補體凝集素途徑，便意識到非常希望僅特異性地抑制造成特定病理學的補體活化系統，而不完全關閉補體的免疫防禦能力。例如，在其中補體活化主要由凝集素途徑介導的疾病狀態中，僅特異性地抑制該途徑將是有利的。這將使補體經典途徑保持完整以操作免疫複合物加工並幫助宿主防禦感染。
補體系統的一個組分是MASP-2，它是開發特異性地抑制凝集素途徑的治療劑的可能靶標。在凝集素依賴性的補體系統的所有已知蛋白組分(諸如MBL、H纖維膠凝蛋白、M纖維膠凝蛋白、L纖維膠凝蛋白、膠原凝集素、MASP-1、MASP-2、C4和C2)中，只有MASP-1和MASP-2是凝集素途徑所特有的，並且是系統功能所必需的。凝集素(諸如MBL、H纖維膠凝蛋白、M纖維膠凝蛋白、L纖維膠凝蛋白、膠原凝集素-10和膠原凝集素-11)也是凝集素途徑中的獨特組分。但是，由於凝集素冗餘，任何一種凝集素組分的喪失不一定抑制系統的活化。為了保證凝集素依賴性的補體活化系統的抑制，有必要抑制所有凝集素。此外，由於也已知MBL和纖維膠凝蛋白具有獨立於補體的調理活性，凝集素途徑功能的抑制將導致抗感染的這種有益宿主防禦機制的喪失。相反，當MASP-2作為抑制靶標時，補體非依賴性的調理活性保持完整。MASP-2作為抑制凝集素途徑的治療靶標的另一個益處是，MASP-2的血漿濃度是任何補體蛋白中最低的(≈500 ng/ml)；因此，相應地低濃度的MASP-2的高親和力抑制劑可能足以達到完全抑制(Moller Kristensen, M.，等人, J. Immunol Methods 282:159 167, 2003)。這與MASP-1形成鮮明對比，MASP-1具有約10,000 ng/mL的血漿濃度，並因此預計需要實質上更高濃度的MASP-1的高親和力抑制劑才能達到完全抑制。
III. 抗體和抗原結合片段
本文提供了特異性地結合MASP-2的抗體及其抗原結合片段。在某些實施方案中，所述抗體及其抗原結合片段是分離的單克隆抗體或其抗原結合片段。在某些實施方案中，所述抗體及其抗原結合片段抑制凝集素途徑補體活化。本文描述的抗體和抗原結合片段可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或鼠抗體或前述任一種的抗原結合片段。另外，所述抗體及其抗原結合片段可以是單鏈抗體、ScFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、缺乏鉸鏈區的單價抗體或完整抗體。此外，所述抗體及其抗原結合片段可以是單價的、二價的或多價的。
在某些實施方案中，本文描述的抗體和抗原結合片段包含免疫球蛋白恆定區。所述抗體及其抗原結合片段可以是IgG免疫球蛋白或其片段。在某些實施方案中，所述IgG免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白。
在某些實施方案中，本文描述的抗體及其抗原結合片段特異性地結合位於人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域內的表位。在某些實施方案中，所述表位位於人MASP-2的氨基酸
496DIRMGTLKRLSPHYTQAW
513(SEQ ID NO:6)內。在某些實施方案中，所述抗體及其抗原結合片段與C4競爭對MASP-2的結合。
在一個方面，本發明提供了結合MASP-2的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)重鏈可變區，其包含具有序列NXXMH的HC-CDR1，其中在位置2的X是H或Y且其中在位置3的X是H或W；如SEQ ID NO:63 (DIDXSDSEXXYXXKFKD)所示的HC-CDR2，其中在位置4的X是P或A；且其中在位置9的X是T或I，且其中在位置10的X是H或Y，且其中在位置12的X是I或N；且其中在位置13的X是E或Q；和如SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)所示的HC-CDR3；和(b)輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO:64 (SASSSVXYMY)所示的LC-CDR1，其中在位置7的X是R或S；如SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)所示的LC-CDR2和如SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)所示的LC-CDR3。在一個實施方案中，根據(a)的重鏈可變區的HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWMH)。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR1包含SEQ ID NO: 14 (NYWMH)。在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR1包含SEQ ID NO: 56 (NYHMH)。在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR1包含SEQ ID NO: 57 (NHHMH)。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)。在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR2包含SEQ ID NO:22 (DIDPSDSEIYYNQKFKD)。在某些實施方案中，所述重鏈可變區的HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)。
在某些實施方案中，所述輕鏈可變區的LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)。在某些實施方案中，所述輕鏈可變區的LC-CDR1包含SEQ ID NO:39 (SASSSVSYMY)。
在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57，所述HC-CDR2包含SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO:53，所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:53，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:56；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:53，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:57；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:53，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36。
在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:56 (NYHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:57 (NHHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 ((DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:22 (DIDPSDSEIYYNQKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:39 (SASSSVSYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:22，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:39，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36。
在某些實施方案中，所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:25，所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:27，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:29，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:41，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:43，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:45。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50。在其它實施方案中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:47。在其它實施方案中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:47具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50，且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:47。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50。在其它實施方案中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:47。在其它實施方案中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO:47具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50，且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:47。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:8。在其它實施方案中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO:8具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:11。在其它實施方案中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO:11具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:8，且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:11。
在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:9。在其它實施方案中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO:9具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:12。在其它實施方案中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO:12具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性。在某些實施方案中，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO:9，且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:12。
在某些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段在六個CDR中的每一個中包含零個、一個、兩個或三個氨基酸置換，其中這些置換中的一個或多個任選地是保守置換和/或是種系編碼的氨基酸的置換。
下文表1A、1B和1C中提供了本文描述的某些抗-MASP-2抗體的可變區和CDR的序列的總結。(“SIN”表示SEQ ID NO)
在某些實施方案中，本文描述的抗體和抗原結合片段包含在Fc區中的一個或多個突變。例如，所述Fc區可以包含增強穩定性或效應子功能的一個或多個突變。在某些實施方案中，所述Fc區包含S228P氨基酸置換。在某些實施方案中，所述Fc區包含促進在低pH的FcRn相互作用的一個或多個突變。
在某些實施方案中，本文描述的抗體和抗原結合片段以小於0.2 nM、小於0.3 nM、小於0.4 nM、小於0.5 nM、小於0.6 nM、小於0.7 nM、小於0.8 nM、小於0.9 nM、小於1.0 nM、小於1.2 nM、小於1.4 nM、小於1.6 nM、小於1.8 nM、小於2.0 nM、小於2.5 nM、小於3.0 nM、小於3.5 nM、小於4.0 nM、小於4.5 nM、小於5.0 nM、小於5.5 nM、小於6.0 nM、小於6.5 nM、小於7.0 nM、小於7.5 nM、小於8.0 nM、小於8.5 nM、小於9.0 nM、小於9.5 nM、小於10.0 nM、小於12 nM、小於14 nM、小於16 nM、小於18 nM、小於20 nM、小於22 nM、小於24 nM、小於26 nM、小於28 nM或小於30 nM的親和力結合人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域。
在某些實施方案中，本文描述的抗體和抗原結合片段抑制補體活化的凝集素途徑。在某些實施方案中，所述抗體和抗原結合片段抑制哺乳動物血液中的凝集素途徑。在某些實施方案中，所述凝集素途徑抑制包含在靶細胞上的補體組分的沉積的减少。在某些實施方案中，所述凝集素途徑抑制包含C3b沉積、C4沉積或MAC沉積的减少。在某些實施方案中，所述凝集素途徑抑制包含在凝集素途徑特異性測定條件下補體組分的沉積的减少。在某些實施方案中，本文描述的抗體和抗原結合片段抑制哺乳動物血液中的補體活化的凝集素途徑，但是不會抑制哺乳動物血液中的補體活化的經典途徑。
IV. 多核苷酸、載體和宿主細胞
在另一個方面，本公開內容提供了分離的多核苷酸，其編碼本發明公開的抗體或其抗原結合片段或其部分(例如，CDR、VH、VL、重鏈或輕鏈)中的任一種。在某些實施方案中，所述多核苷酸針對在宿主細胞中的表達而進行密碼子優化。一旦已知或鑑定出編碼序列，就可以使用已知的技術和工具(諸如GenScript® OptimumGene™工具或ThermoFisher Scientific® GeneArt GeneOptimizer™)進行密碼子優化。密碼子優化的序列包括部分地密碼子優化的序列，其具有一個或多個為在宿主細胞中表達而優化的密碼子，以及完全密碼子優化的序列。還應當理解，編碼抗體及其抗原結合片段的多核苷酸可以具有不同的核苷酸序列，同時由於遺傳密碼的簡併性、剪接等而仍然編碼相同的蛋白。
在某些實施方案中，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:69-79中的任何一個或多個具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的多核苷酸。
在某些實施方案中，編碼抗體或其抗原結合片段的多核苷酸可以被包含在包括其它序列和/或特徵的多核苷酸中。例如，多核苷酸可以包括一個或多個可以用於控制或表達編碼蛋白的序列，諸如啓動子序列、聚腺苷酸化序列、編碼信號肽的序列等。所述多核苷酸可以包含脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
還提供了載體，其包含或含有編碼本發明公開的抗體或其抗原結合片段中的任一種的多核苷酸。可以使用任何合適的載體，包括病毒載體和質粒載體。在某些實施方案中，載體包含多核苷酸，其編碼抗體重鏈或其抗原結合片段和抗體輕鏈或其抗原結合片段，它們一起構成完整的抗體或其抗原結合片段。編碼抗體重鏈或其抗原結合片段和抗體輕鏈或其抗原結合片段的序列可以被包含在單個開放讀碼框內，在這樣的情况下，它們可以任選地被編碼蛋白酶切割位點的多核苷酸和/或編碼自切割肽的多核苷酸隔開。可替換地，編碼抗體重鏈或其抗原結合片段和抗體輕鏈或其抗原結合片段的序列可以被包含在單個載體上的單獨開放讀碼框內。在其它實施方案中，編碼抗體重鏈或其抗原結合片段和抗體輕鏈或其抗原結合片段的序列存在於兩個不同的載體上，使得第一載體編碼抗體重鏈或其片段，且第二載體編碼抗體輕鏈或其片段。
在另一個方面，本公開內容也提供了包含本文公開的多核苷酸或載體的宿主細胞。可以使用任何合適的細胞，其中可以引入這樣的多核苷酸或載體。這樣的細胞的例子包括真核細胞，包括酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞；和原核細胞，包括細菌細胞諸如大腸桿菌。在某些實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞是永生化的哺乳動物細胞系。適合用於生產和表達多核苷酸和載體的細胞是本領域已知的。
在某些實施方案中，可以用本文公開的多核苷酸或載體轉染細胞。術語“轉染”包括本領域技術人員已知的將核酸分子引入細胞中的任何方法。這樣的方法包括例如電穿孔、脂轉染、基於納米顆粒的轉染、基於病毒的轉染等。可以穩定地或瞬時地轉染宿主細胞。
在某些實施方案中，所述宿主細胞表達由多核苷酸或載體編碼的抗體或其抗原結合片段。這樣的表達可以包括翻譯後修飾諸如信號序列的除去、糖基化和其它這樣的修飾。在一個有關的方面，本公開內容提供了生產所提供的抗體及其抗原結合片段的方法，所述方法包含在允許表達所述抗體或其抗原結合片段的條件下培養宿主細胞足够的時間，並分離所述抗體或其抗原結合片段。可用於分離和純化重組產生的蛋白的方法包括例如，從將蛋白分泌到培養基中的合適宿主細胞獲得上清液，濃縮所述培養基，和通過使濃縮物穿過合適的純化基質或一系列基質來純化蛋白。純化蛋白的方法是本領域眾所周知的。
V. 藥物組合物
本文還提供了包含治療劑的組合物，所述治療劑單獨地或以任何組合選自本發明公開的抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、載體或宿主細胞中的任何一種或多種，並且還可以包括其它選擇的治療劑。這樣的組合物可以進一步包含一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
藥學上可接受的載體是無毒的、生物相容的，並且經過選擇不會有害地影響治療劑(以及與其組合的任何其它治療劑)的生物活性。肽的藥學上可接受的載體的例子描述於Yamada的美國專利號5,211,657。本文描述的治療劑可以配製成固體、半固體、凝膠、液體或氣體形式的製劑，諸如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒、軟膏劑、溶液、貯庫製劑(depository)、吸入劑和注射劑，從而允許口服、胃腸外或外科手術施用。還考慮通過包被醫療裝置等局部施用組合物。
通過注射、輸注或沖洗和局部遞送進行胃腸外遞送的合適載體包括蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、標準的或含乳酸鹽的林格氏溶液、右旋糖溶液、漢克氏溶液或丙二醇。此外，無菌的不揮發性油可以用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可以使用任何生物相容的油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，脂肪酸諸如油酸可以用於製備注射劑。載體和試劑可以混合為液體、懸浮液、可聚合的或不可聚合的凝膠、糊劑或油膏劑。
所述載體還可以包含遞送媒介物以維持(即，延長、延遲或調節)藥劑的遞送或增強治療藥劑的遞送、攝取、穩定性或藥代動力學。作為非限制性例子，這樣的遞送媒介物可以包括由蛋白、脂質體、碳水化合物、合成的有機化合物、無機化合物、聚合物或共聚物水凝膠和聚合物膠束組成的微米顆粒、微米球、納米球或納米顆粒。合適的水凝膠和膠束遞送系統包括在WO 2004/009664 A2中公開的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/環糊精複合物，以及在美國專利申請公開號2002/0019369 A1中公開的PEO和PEO/環糊精複合物。這樣的水凝膠可以在預期作用部位處局部注射，或皮下地或肌肉內地注射以形成持續釋放儲庫。
本發明的組合物可以通過任何合適的方法配製用於遞送，包括、但不限於口服、局部、透皮、舌下、含服、皮下、肌肉內、靜脈內、動脈內或作為吸入劑。本發明的組合物還可以包括生物相容的賦形劑，諸如分散劑或潤濕劑、助懸劑、稀釋劑、緩衝劑、穿透促進劑、乳化劑、黏合劑、增稠劑、矯味劑(對於口服施用)。
配製根據本發明的某些實施方案的藥物組合物，從而允許其中所含的活性成分在向患者施用所述組合物後可生物利用。將施用給受試者的組合物可以採取一個或多個劑量單位的形式，並且本文描述的治療劑的容器可以容納多個劑量單位。製備這樣的劑型的實際方法對於本領域技術人員來說是已知的或者是顯而易見的；例如，參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。在任何情况下，要施用的組合物將含有有效量的本公開內容的治療劑或組合物，用於根據本文的教導治療感興趣的疾病或病症。
組合物可以是固體或液體的形式。在某些實施方案中，所述載體是微粒，因此所述組合物是例如片劑或粉末形式。載體可以是液體，而組合物是例如口服油、可注射液體或氣霧劑，其可用於例如吸入施用。當意圖用於口服施用時，藥物組合物優選地呈固體或液體形式，其中將半固體、半液體、混懸液和凝膠形式包括於在本文中視作固體或液體的形式中。
作為用於口服施用的固體組合物，可以將藥物組合物配製成粉末、顆粒、壓縮片劑、丸劑、膠囊、口香糖、糯米紙囊劑等。這樣的固體組合物通常將含有一種或多種惰性填充劑或稀釋劑諸如蔗糖、玉米澱粉或纖維素。此外，以下一種或多種可能存在：黏合劑諸如羧甲纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑諸如澱粉、乳糖或糊精，崩解劑諸如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米澱粉等；潤滑劑諸如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑諸如膠體二氧化矽；甜味劑諸如蔗糖或糖精；矯味劑諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑；和著色劑。當所述組合物為膠囊劑(例如，明膠膠囊劑)的形式時，除了上述類型的材料外，它還可以含有液體載體諸如聚乙二醇或油。
所述組合物可以是液體的形式，例如，酏劑、糖漿劑、溶液、乳劑或混懸液。作為兩個實例，液體可以用於口服施用或用於通過注射遞送。當意圖用於口服施用時，除了本發明的化合物外，優選的組合物還含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增味劑中的一種或多種。在意圖通過注射施用的組合物中，可以包括表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、緩衝劑、穩定劑和等滲劑中的一種或多種。
無論它們是溶液、懸浮液還是其它類似形式，液體藥物組合物可以包括以下賦形劑中的一種或多種：無菌稀釋劑，諸如注射用水，鹽水溶液，優選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、不揮發性油諸如合成的甘油單酯或甘油二酯(其可以充當溶劑或懸浮介質)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張度的試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。可以將胃腸外製劑包封在由玻璃或塑料製成的安瓿瓶、一次性注射器或多次劑量管形瓶中。生理鹽水是優選的賦形劑。可注射的藥物組合物優選地是無菌的。
意圖用於胃腸外或口服施用的液體組合物應當含有一定量的本文描述的治療劑，使得將獲得合適的劑量。術語“胃腸外”包括皮下、靜脈內、肌肉內、胸骨內或動脈內注射或輸注。通常，治療劑為所述組合物的至少0.01%。當意圖用於口服施用時，該量可以變化為組合物重量的約0.1%至約70%。某些口服藥物組合物含有約4%至約75%的治療劑。
所述組合物可以意圖用於局部施用，在這樣的情况下，所述載體可以適當地包含溶液、乳劑、軟膏劑或凝膠基質。例如，基質可以包含以下一種或多種：礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑諸如水和醇、以及乳化劑和穩定劑。增稠劑可以存在於用於局部施用的組合物中。如果意圖用於透皮施用，則所述組合物可以包括透皮貼劑或離子透入(iontophoresis)裝置。藥物組合物可以意圖用於直腸施用，例如以栓劑形式，其將在直腸中融化並釋放藥物。用於直腸施用的組合物可以含有油性基質作為合適的無刺激性賦形劑。這樣的基質包括、但不限於羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
組合物可以包括改變固體或液體劑量單位的物理形式的各種材料。例如，所述組合物可以包括在活性成分周圍形成包衣殼的材料。形成包衣殼的材料通常是惰性的，並且可以選自例如糖、紫膠和其它腸溶包衣試劑。可替換地，可以將活性成分包裹在明膠膠囊劑中。固體或液體形式的組合物可以包括與本公開內容的治療劑結合並由此輔助所述化合物的遞送的試劑。可以在該能力中起作用的合適的試劑包括一種或多種蛋白或脂質體。
所述組合物可以基本上由可以作為氣霧劑施用的劑量單位組成。術語氣霧劑用於表示從膠體性質的系統到由加壓包裝組成的系統的各種系統。遞送可以是通過液化或壓縮氣體或通過分配活性成分的合適泵系統。氣霧劑可以在單相、雙相或三相系統中遞送，以便遞送活性成分。氣霧劑的遞送包括必要的容器、活化劑、閥門、子容器等，它們可以一起形成一個試劑盒。本領域普通技術人員無需過多實驗可以確定優選的氣霧劑。
應當理解，本公開內容的組合物還包括如本文描述的用於多核苷酸的載體分子(例如，脂質納米顆粒、納米級遞送平臺等)。
可以通過製藥領域熟知的方法製備藥物組合物。例如，可以如下製備意圖通過注射施用的組合物：將包含本文所述的治療劑以及任選的鹽、緩衝劑和/或穩定劑中的一種或多種的組合物與無菌蒸餾水混合從而形成溶液。可以加入表面活性劑以促進均勻溶液或懸浮液的形成。表面活性劑是與所述組合物非共價地相互作用從而促進在水性遞送系統中的溶解或均勻懸浮的化合物。
VI. 方法和用途
本文進一步提供了使用本公開內容的抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物在哺乳動物受試者中活化補體的凝集素途徑的方法。在某些實施方案中，該方法包括向有需要的哺乳動物受試者施用足以抑制哺乳動物補體活化的凝集素途徑的量的本公開內容的抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物。在某些實施方案中，該方法還可以包括在向受試者施用本發明的化合物之前，確定受試者患有凝集素途徑疾病或病症。在某些實施方案中，哺乳動物對象是人。
在某些實施方案中，提供本公開內容的抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物用於治療凝集素途徑疾病或障礙的方法。在某些實施方案中，提供本公開內容的抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物用於製造或製備藥物的方法，所述藥物用於治療凝集素途徑疾病或障礙。
如在美國專利號7,919,094、美國專利號8,840,893、美國專利號8,652,477、美國專利號8,951,522、美國專利號9,011,860、美國專利號9,475,885、美國專利號9,644,035、美國專利申請公開號US2013/0344073、US2013/0266560、US2015/0166675、US2017/0137537、US2017/0166660、US2017/0189525、US2017/0267781、US2017/0283508、US2017/0253667、US2018/0105604、WO2018/045054、WO2018/071701、WO2019/036460、WO2019/246,367、WO2021/178902和共同未决的美國專利申請系列號17/103,672 (它們每篇轉讓給Omeros Corporation，即本申請的受讓人，並且它們每篇特此通過引用併入)中所述，MASP-2依賴性的補體活化參與促成眾多急性和慢性疾病狀態的發病機制。例如，如在美國專利號8,951,522中所述，補體系統(先天性免疫系統的一部分)的主要功能是保護宿主免於傳染原，但是，補體系統的不適當或過度活化可以導致嚴重疾病，諸如血栓性微血管病(TMA，包括aHUS、TTP和HUS)，其中內皮損傷以及微脈管系統中的纖維蛋白沉積和富含血小板的血栓導致器官損傷。在內皮細胞應激或損傷的環境中，凝集素途徑在活化補體中起主導作用，並且阻止MASP-2的活化和凝集素途徑會停止導致膜攻擊複合物形成、血小板活化和白細胞募集的一系列酶促反應。如在美國專利號8,652,477中所述，除了啓動凝集素途徑外，MASP-2還可以活化凝血系統，並能够將凝血酶原切割為凝血酶。
因此，在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自由以下成員組成的集合：血栓性微血管病(TMA)、腎臟病症、由組織或器官移植引起的炎性反應、缺血再灌注損傷、與糖尿病相關的併發症、與血液透析相關的併發症、心血管疾病或障礙、炎症性胃腸道障礙、肺障礙、眼科疾病或障礙、彌散性血管內凝血、移植物抗宿主病、靜脈閉塞性疾病和彌漫性肺泡出血。
在某些實施方案中，提供了一種聯合療法，其包含本公開內容的一種或多種抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物以及一種或多種另外的治療劑。應當理解，在這樣的聯合療法中，本公開內容的一種或多種抗體或抗原結合片段、核酸、載體、細胞或組合物以及一種或多種另外的治療劑可以以任何次序和任何順序、在任何時間間隔或同時施用。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是血栓性微血管病(TMA)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、難治性TTP、Upshaw-Schulman綜合徵(USS)、溶血性尿毒癥綜合徵(HUS)、非典型溶血性尿毒癥綜合徵(aHUS)、非因子H依賴性的非典型溶血性綜合徵、繼發於感染的aHUS、血漿療法抗性的aHUS、繼發於癌症的TMA、繼發於化學療法或其它抗癌療法的TMA、繼發於移植的TMA或與造血幹細胞移植相關的TMA、繼發於感染的TMA和IgA血管炎。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是移植物抗宿主病(GVHD)，包括急性GVHD、慢性GVHD或類固醇抗性的GVHD。在某些實施方案中，遭受GVHD或處於發生GVHD的風險中的受試者以前已經經歷、正在經歷或將要經歷造血幹細胞移植。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是彌漫性肺泡出血(DAH)。在某些實施方案中，遭受DAH或處於發生DAH的風險中的受試者以前已經經歷、正在經歷或將要經歷造血幹細胞移植。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是毛細血管滲漏綜合徵、移植物植入綜合徵、液體過載或特發性肺炎綜合徵。在某些實施方案中，遭受這些疾病或障礙中的一種或多種或處於發生這些疾病或障礙中的一種或多種的風險中的受試者以前已經經歷、正在經歷或將要經歷造血幹細胞移植。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是靜脈閉塞性疾病(VOD)。在某些實施方案中，遭受VOD或處於發生VOD的風險中的受試者以前已經經歷、正在經歷或將要經歷造血幹細胞移植。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是與移植物抗宿主病或TMA相關的神經學症狀，諸如虛弱、感覺異常、四肢癱瘓、感覺運動缺陷、植物神經功能不全性多神經病或神經源性膀胱。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是腎臟病症，包括、但不限於膜增生性腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎、膜性增生性腎小球性腎炎(腎小球膜毛細血管性腎小球腎炎)、急性傳染後腎小球腎炎(鏈球菌感染後腎小球腎炎)、C3腎小球病、冷球蛋白血症性腎小球腎炎、微量免疫壞死性新月體性腎小球腎炎、狼瘡腎炎、亨諾-許蘭氏紫癜腎炎和IgA腎病。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是遭受以下疾病或處於發生以下疾病的風險中的受試者中的腎纖維化(例如，小管間質性纖維化)和/或蛋白尿：慢性腎臟疾病、慢性腎衰竭、腎中的膠原沉著病(包括膠原沉著性腎危象)、腎小球疾病(例如，局灶性節段性腎小球硬化症)、免疫複合物障礙(例如，IgA腎病、膜性腎病)、狼瘡腎炎、腎病綜合徵、糖尿病性腎病、小管間質性損傷和腎小球腎炎(例如，C3腎小球病)或與蛋白尿相關的疾病或病症，包括、但不限於腎病綜合徵、先兆子癇、子癇、腎臟的中毒性損害、澱粉樣變性、膠原血管疾病(例如，系統性紅斑狼瘡)、脫水、腎小球疾病(例如，膜性腎小球腎炎、膜性腎小球腎病、局灶性節段性腎小球腎炎、C3腎小球病、微小病變性腎病、類脂性腎病)、劇烈運動、應激、良性直立位(體位)蛋白尿、局灶性節段性腎小球硬化症、IgA腎病(即，Berger氏疾病)、IgM腎病、膜性增生性腎小球性腎炎、膜性腎病、微小病變性腎病、肉樣瘤病、Alport氏綜合徵、糖尿病(糖尿病性腎病)、藥物誘導的毒性(例如，NSAIDS、烟鹼、青黴胺、碳酸鋰、金和其它重金屬、ACE抑制劑、抗生素(例如，阿黴素)或阿片劑(例如，海洛因)或其它腎毒素)；法布裏氏病、感染(例如，HIV、梅毒、甲型、乙型或丙型肝炎、鏈球菌感染後感染、尿路血吸蟲病)；氨基酸尿症、範科尼綜合徵、高血壓性腎硬化、間質性腎炎、鐮刀形細胞病、血紅蛋白尿、多發性骨髓瘤、肌紅蛋白尿、器官排斥(例如，腎移植排斥)、埃博拉出血熱、指甲-髕骨綜合徵、家族性地中海熱、HELLP綜合徵、系統性紅斑狼瘡、韋格納氏肉芽腫病、類風濕性關節炎、糖原貯積病1型、古德帕斯徹氏綜合徵、亨諾-許蘭氏紫癜、已擴散至腎臟的泌尿道感染、舍格倫綜合徵和感染後腎小球腎炎。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是由組織或實體器官移植引起的炎性反應，包括、但不限於整個器官(例如，腎、心臟、肝、胰腺、肺、角膜等)或組織移植物(例如，瓣膜、腱、骨髓等)的同種移植或異種移植。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是移植物功能延遲。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是缺血再灌注損傷(I/R)，包括、但不限於心肌I/R、胃腸的I/R、腎I/R和主動脈動脈瘤修復後的I/R、與心肺轉流術相關的I/R、腦I/R、中風、與器官移植相關的血管再吻合術、或切斷或受傷的肢體或手指的再連接、移植物和/或再植物的血運重建、以及在休克和/或外科手術後的血液動力學復蘇。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是與非肥胖性糖尿病(1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)相關的併發症和/或與1型或2型(成人發作型)糖尿病相關的併發症，包括、但不限於糖尿病性血管病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病變或糖尿病性黃斑水腫。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是心血管疾病或障礙，包括、但不限於亨諾-許蘭氏紫癜腎炎、系統性紅斑狼瘡相關的血管炎、與類風濕性關節炎(也稱為惡性類風濕性關節炎)相關的血管炎、免疫複合物血管炎、抗中性白細胞細胞質自身抗體(ANCA)相關的血管炎、塔卡亞薩病、擴張型心肌病、糖尿病性血管病、川崎病(動脈炎)、靜脈氣體栓塞物(VGE)、以及支架放置、旋轉斑塊切除術和/或經皮腔內冠狀血管成形術(PTCA)後再狹窄的抑制。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是炎症性胃腸道障礙，包括、但不限於胰腺炎、憩室炎和腸障礙，包括克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、腸易激綜合徵和炎性腸病(IBD)。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是由消化道的纖維化造成或加重。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是胰腺纖維化。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是肺障礙，包括、但不限於急性呼吸窘迫綜合徵、輸血相關的急性肺損傷、缺血/再灌注急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、韋格納氏肉芽腫病、抗腎小球基底膜疾病(古德帕斯徹氏病)、胎便吸入綜合徵、吸入性肺炎、閉塞性細支氣管炎綜合徵、特發性肺纖維化、繼發於燒傷的急性肺損傷、非心源性肺水腫、輸血相關的呼吸抑制和肺氣腫。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是體外暴露觸發的炎性反應，且所述方法包含治療經歷體外循環程序的受試者，所述體外循環程序包括、但不限於血液透析、血漿去除術、白細胞單採術、體外膜氧合(ECMO)、肝素誘導的體外膜氧合LDL沉澱(HELP)和心肺轉流術(CPB)。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自炎症性的或非炎症性性的關節炎和其它肌肉骨胳障礙，包括、但不限於骨關節炎、類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、痛風、神經病性關節病、銀屑病關節炎、強直性脊柱炎或其它脊椎關節病和結晶性關節病、肌營養不良和系統性紅斑狼瘡(SLE)。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是皮膚障礙，包括、但不限於銀屑病、自身免疫性大疱性皮膚病、嗜酸性粒細胞性棘細胞層水腫、大疱性類天疱瘡、獲得性大疱性表皮松解症、特應性皮炎、妊娠疱疹和其它皮膚障礙，並且用於治療熱和化學燒傷，包括由此引起的毛細血管滲漏。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是周圍神經系統(PNS)和/或中樞神經系統(CNS)障礙或損傷，包括、但不限於多發性硬化(MS)、重症肌無力(MG)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、格林-巴利綜合徵、中風後再灌注、退行性椎間盤、腦創傷、帕金森病(PD)、阿爾茨海默氏病(AD)、Miller-Fisher綜合徵、腦創傷和/或出血、創傷性腦損傷、中樞神經系統纖維化、脫髓鞘和腦膜炎。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是膿毒症或由膿毒症引起的病症，包括、但不限於重度膿毒症、膿毒性休克、由膿毒症引起的急性呼吸窘迫綜合徵、溶血性貧血、全身性炎症應答綜合徵或失血性休克。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是泌尿生殖器障礙，包括、但不限於疼痛性膀胱疾病、感覺性膀胱疾病、慢性非細菌性膀胱炎和間質性膀胱炎、男性和女性不育、胎盤功能障礙和流產和先兆子癇。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是用化療劑和/或輻射療法治療的受試者中的炎性反應，包括、但不限於為了治療癌性病症。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是血管生成依賴性的癌症，包括、但不限於實體腫瘤、血源性腫瘤、高危類癌瘤和腫瘤轉移灶。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是血管生成依賴性的良性腫瘤，包括、但不限於血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼、類癌瘤和化膿性肉芽腫。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是內分泌障礙，包括、但不限於橋本甲狀腺炎、應激、焦慮、以及涉及催乳素、生長或胰島素樣生長因子和促腎上腺皮質激素從垂體的受調節釋放的其它潜在激素障礙。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是眼科疾病或障礙，包括、但不限於年齡相關性黃斑變性、青光眼和眼內炎。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是眼血管生成性疾病或病症，包括、但不限於年齡相關性黃斑變性、葡萄膜炎、眼黑素瘤、角膜新生血管形成、原發性翼狀胬肉、HSV間質角膜炎、HSV-l誘導的角膜淋巴管生成、增殖性糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、早產兒視網膜病變、視網膜靜脈閉塞、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、繼發於增殖性糖尿病性視網膜病變的玻璃體積血、視神經脊髓炎、前囊下白內障、後囊渾濁化和潮紅。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是彌散性血管內凝血(DIC)或其它補體介導的凝血障礙，包括繼發於膿毒症的DIC，重度創傷，包括神經學創傷(例如，急性頭損傷，參見Kumura等人, Acta Neurochirurgica 55:23-28 (1987)，感染(細菌、病毒、真菌、寄生蟲感染)，癌症，產科併發症，肝疾病，嚴重毒性反應(例如，蛇咬傷、昆蟲咬傷、輸血反應)，休克，中暑，移植排斥，血管動脈瘤，肝功能衰竭，通過化學療法或輻射療法的癌症治療，燒傷，或意外輻射暴露。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自由以下成員組成的集合：急性輻射綜合徵、緻密沉積物病、惡性萎縮性丘疹病、灾難性抗磷脂綜合徵(CAPS)、貝切特氏病、冷球蛋白血症、陣發性夜間血紅蛋白尿(“PNH”)和冷凝集素疾病。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自由以下成員組成的集合：aHUS、HSCT-TMA、IgAN和狼瘡腎炎(LN)。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙與纖維蛋白誘導的補體系統活化以及凝血和/或接觸系統系統的相關活化有關。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙或病症與補體相關的炎症、過度凝血或由纖維蛋白或活化的血小板引發的接觸系統活化相關。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自由以下成員組成的集合：動脈血栓形成、靜脈血栓形成、深靜脈血栓形成、手術後血栓形成、冠狀動脈旁路移植術和/或介入性心血管操作(例如，血管成形術或支架放置)後再狹窄、動脈粥樣硬化、斑塊破裂、斑塊不穩定性、再狹窄、低血壓、急性呼吸窘迫綜合徵(ARDS)、全身性炎症應答綜合徵(SIRS)、彌散性血管內凝血(DIC)、靜脈閉塞性疾病(VOD)、血栓性微血管病、狼瘡腎炎、淺表血栓性靜脈炎、因子V萊頓突變、缺血性/再灌注損傷、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、接受激素-替代療法(HRT)、阿爾茨海默氏病和/或遭受高凝狀態。在某些實施方案中，所述凝集素途徑是由以下至少一種或多種引起的獲得性高凝血狀態：經歷選自5-FU、GM-CSF、順鉑、肝素、COX-2抑制劑、造影劑、皮質類固醇和抗精神病藥的藥物的療法；靜脈淤滯(固定化、外科手術等)、抗磷脂綜合徵、癌症(早幼粒細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食管鱗狀細胞癌、胃和結腸腫瘤)、由創傷或外科手術引起的組織損傷、導管在中央靜脈中的存在、參與血塊形成的蛋白(例如，蛋白C)的獲得性缺乏、陣發性夜間血紅蛋白尿(PNH)、升高的高半胱氨酸水平、心力衰竭、機械瓣膜的存在、肺性高血壓伴原位血栓形成、心房顫動、肝素誘導的血小板减少症(HIT)、肝素誘導的血小板减少症和血栓形成(HITT)、川崎病伴原位血栓、大動脈炎伴原位血栓、轉移性癌症的血栓形成傾向、升高的因子VIII水平、妊娠、炎性腸病(IBD)、或由於導致高凝血狀態或增加發生高凝血狀態的風險的遺傳缺陷，諸如選自以下的遺傳缺陷：凝血酶原20210基因突變、MTHFR突變、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、蛋白A缺乏、蛋白Z缺乏、抗凝血酶缺乏和產生血栓形成傾向的遺傳性障礙。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是乳房纖維化、肌肉纖維化、腹膜後纖維變性、甲狀腺纖維化、淋巴結纖維化、膀胱纖維化、心臟纖維化、肝纖維化、關節纖維化、皮膚纖維化或胸膜纖維化。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是肌肉骨胳軟組織結構的纖維化(例如，黏連性囊炎、杜普伊特倫氏攣縮、骨髓增生異常病症伴增加的骨纖維化、骨質疏鬆症、骨髓纖維化、或與例如囊性纖維化相關的骨質减少)。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是由病毒感染(諸如α病毒感染、結核病感染或流感感染)引起的纖維化。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是與創傷相關的瘢痕形成，諸如外科手術併發症(例如，外科手術黏連，其中瘢痕組織可以在內臟器官之間形成，從而導致攣縮、疼痛，並可以導致不育)、化療藥物誘導的纖維化、或與燒傷相關的瘢痕形成。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是生殖器官的纖維化(例如，子宮內膜異位症和佩羅尼氏病)。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙適於用激肽釋放酶抑制劑治療。在某些實施方案中，所述凝集素途徑選自由以下成員組成的集合：遺傳性血管性水腫、糖尿病性黃斑水腫和在心肺轉流術期間出血。在某些實施方案中，所述凝集素途徑適於用凝血酶抑制劑治療，諸如動脈血栓形成、靜脈血栓形成、肺栓塞、心房顫動、肝素誘導的血小板减少症、從一種抗凝劑轉換為另一種抗凝血劑、或連續腎替代療法(CRRT)的體外回路通暢在具有HIT的危重患者中的標簽外使用(維持)。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙適於用因子XII抑制劑治療，諸如深靜脈血栓形成(主要預防和擴展治療)、肺栓塞、非瓣膜性心房顫動、患有或不患有心房顫動的受試者中急性冠狀動脈綜合徵以後復發性缺血的預防、終末期腎臟疾病、腦缺血、心絞痛、或减少或預防與醫療裝置(例如瓣膜、小口徑移植物等)和/或體外回路相關的凝血。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是增加血栓栓塞傾向的獲得性疾病或障礙，諸如選自以下的疾病或障礙：動脈粥樣硬化、抗磷脂抗體、癌症(例如，早幼粒細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結腸癌)、高同型半胱氨酸血症、感染、組織損傷、靜脈淤滯(諸如由於外科手術、矯形外科或麻痹性固定、心力衰竭、妊娠或肥胖)以及服用含有雌激素的口服避孕藥的受試者。在某些實施方案中，所述受試者需要抗凝血療法，並且本文描述的抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、載體、宿主細胞和/或組合物用作標準抗凝血療法(例如，華法林)的替代物。在某些實施方案中，所述受試者具有通常禁止標準抗凝血療法的病症，諸如CNS澱粉樣蛋白血管病。在所述方法的某些實施方案中，本文描述的抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、載體、宿主細胞和/或組合物作為橋接劑在受試者中進行圍手術期施用，所述受試者否則進行標準抗凝治療。在某些實施方案中，凝集素途徑疾病或障礙是鐮刀形細胞病，其是涉及血小板活化的血管閉塞性障礙。
在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2感染可以通過幾種不同的機制導致凝集素途徑疾病或障礙。除了急性或慢性SARS-CoV-2感染外，過去或現在的SARS-CoV-2感染還可能引發其它慢性病症。與SARS-CoV-2感染相關的凝集素途徑疾病或障礙可能通過MASP-2與病毒蛋白的直接相互作用(諸如MASP-2與SARS-CoV-2的結合)而產生。例如，凝集素途徑疾病或障礙可以通過MASP-2與SARS-CoV-2 S蛋白或N蛋白的結合而產生。可替換地，在凝集素途徑識別分子與在病毒表面上或在病毒感染的細胞的表面上存在的病毒糖蛋白的相互作用以後，可能會出現一些凝集素途徑疾病或障礙。此外，凝集素途徑疾病或障礙可能源自感染了SARS-CoV-2的細胞所呈現的DAMP對凝集素途徑的活化。在某些實施方案中，所述SARS-CoV-2感染是急性感染。在替代實施方案中，所述SARS-CoV-2感染是慢性感染。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是由過去的SARS-CoV-2感染引起的進行中的慢性病症。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙是急性呼吸窘迫綜合徵。在某些實施方案中，所述凝集素途徑疾病或障礙繼發於SARS-CoV-2感染。在某些實施方案中，本文公開的抗體或其抗原結合片段阻斷MASP-2與SARS-CoV-2 S蛋白和/或N蛋白的結合。
在下文中進一步詳細描述了凝集素途徑疾病和障礙的選定實施例。
非典型溶血性尿毒癥綜合徵 (aHUS).非典型溶血性尿毒癥綜合徵(aHUS)是一組被稱為“血栓性微血管病”的病症的一部分。在HUS的非典型形式(aHUS)中，該疾病與補體調節缺陷相關，並可以是散發的或家族性的。aHUS的家族病例與編碼補體活化或補體調節蛋白的基因中的突變相關，所述蛋白包括補體因子H、因子I、因子B、膜輔因子蛋白抑制劑(CD46)以及補體因子H相關蛋白1 (CFHR1)和補體因子H相關蛋白3 (CFHR3)。(Zipfel, P.F.，等人, PloS Genetics 3(3):e41 (2007))。與aHUS相關的這些多樣化基因突變的共同特點是在細胞或組織表面上的補體活化增強的傾向。在出現至少一種或多種指示aHUS的症狀(例如，貧血、血小板减少症和/或腎功能不全的存在)和/或血栓性微血管病在從受試者獲得的活組織檢查中存在後，受試者處於發生aHUS的風險中。受試者是否處於發生aHUS的風險中的確定包含確定受試者是否具有發生aHUS的遺傳傾向，這可以通過評估遺傳信息(例如來自包含受試者基因型的數據庫)來進行，或對受試者進行至少一次遺傳篩選試驗以確定與aHUS相關的遺傳標志物的存在或不存在(即，確定與aHUS相關的基因突變在編碼補體因子H (CFH)、因子I (CFI)、因子B (CFB)、膜輔因子蛋白抑制劑(CD46)、C3、補體因子H相關蛋白1 (CFHR1)或THBD (編碼抗凝血蛋白血栓調節蛋白)或補體因子H相關蛋白3 (CFHR3)或補體因子H相關蛋白4 (CFHR4)的基因中的存在或不存在)，無論通過基因組測序還是基因特異性分析(例如，PCR分析)，和/或確定受試者是否有aHUS家族史。關於與aHUS相關的基因突變的存在或不存在的基因篩查方法是非常確定的，例如，參見Noris M等人.“Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome,”2007年16年11月[ 2011年3月10日更新]. 見: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR，等人，編. GeneReviews™, Seattle (WA): University of Washington, Seattle。
造血幹細胞移植相關的 TMA (HSCT-TMA)造血幹細胞移植相關的TMA (HSCT-TMA)是由內皮損傷引發的危及生命的併發症。腎臟是最常見的受影響器官，儘管HSCT-TMA可能是一種也涉及肺、腸、心臟和腦的多系統疾病。即使輕度TMA的發生也與長期腎病損相關。同種異體HSCT後相關的TMA的發生基於不同的診斷標準和調節和移植物抗宿主病預防方案而在頻率上有所不同，神經鈣蛋白抑制劑是最常見的相關藥物(Ho VT等人, Biol Blood Marrow Transplant, l l(8):571-5, 2005)。
免疫球蛋白 A 腎病 (IgAN)免疫球蛋白A腎病(IgAN)是一種導致腎內炎症和腎損傷的自身免疫性腎臟疾病。IgAN是全球最常見的原發性腎小球疾病。由於每年發病率為每100,000人中的約2.5人，據估計，美國每1400人中的1人會發生IgAN。多達40%的IgAN患者將發生終末期腎臟疾病(ESRD)。患者通常表現為顯微鏡下血尿，伴有輕度至中度蛋白尿和不同程度的腎功能不全(Wyatt R.J.，等人, NEnglJ Med 36S(25):2402-4, 2013)。臨床標志物諸如受損的腎功能、持續高血壓和嚴重蛋白尿(每天超過1g)與不良預後相關(Goto M等人, Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009；Berthoux F. 等人, J Am Soc Nephrol 22(4):752-61, 2011)。在多個大型觀察性研究和前瞻性試驗中，蛋白尿是獨立於其它風險因素的最強預後因素(Coppo R. 等人, J Nephrol 18(5):503-12, 2005；Reich H. N.，等人, J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007)。據估計，如果不治療，15-20%的患者在疾病發作的10年內達到ESRD (D'Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000)。IgAN的診斷標志是IgA沉積(單獨或與IgG、IgM或兩者一起)在腎小球系膜中占優勢。
狼瘡腎炎 (LN)系統性紅斑狼瘡(SLE)的主要併發症是腎炎，也被稱作狼瘡腎炎，其被歸類為腎小球腎炎的次要形式。高達60%的具有SLE的成人在病程後期有某種形式的腎臟受累(Koda-Kimble等人, Koda-Kimble and Young's Applied Therapeutics: the clinical use of drugs，第10版, Lippincott Williams & Wilkins: 第792-9頁, 2012)，在美國，每100,000人中有20-70人患病。狼瘡腎炎經常出現在具有活動性SLE的其它症狀的患者中，所述其它症狀包括疲勞、發熱、皮疹、關節炎、漿膜炎或中樞神經系統疾病(Pisetsky D.S. 等人, Med Clin North Am 81(1): 113-28, 1997)。一些患者具有無症狀的狼瘡腎炎；但是，在定期隨訪期間，實驗室異常諸如升高的血清肌酸酐水平、低白蛋白水平或尿蛋白或沉澱物提示活動性狼瘡腎炎。
VI. 序列
在表2中總結了本說明書中提到的序列。
VII. 實施例實施例1
高親和力抗 - 人 MASP-2 抑制性抗體的產生使用Sigma佐劑系統(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)，用包括在C-端上的6xHis標簽的人MASP-2 CCP2/SP多肽(SEQ ID NO:1的氨基酸殘基364-686)免疫7至14周齡的C57BL/6 MASP-2敲除的小鼠。給每只小鼠腹膜內地注射與RIBI佐劑1:1混合的50 μg免疫原。14天后，用與RIBI佐劑1:1混合的額外免疫原增強免疫的小鼠。14天后，用在PBS中1:1混合的50 μg免疫原第三次增強小鼠。定期從尾放血製備小鼠的血清樣品，並關於抗原特異性抗體的存在進行ELISA試驗。具有顯著抗體滴度的小鼠在脾融合前4天接受在PBS中的融合前免疫原增強。融合前三天，用在PBS中的50 μg抗-CD40激動劑mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN)在尾根部皮下處理小鼠以增加B細胞數目。
處死小鼠，並收穫脾細胞，並將其使用50%聚乙二醇或50%聚乙二醇+ 10% DMSO與選定的鼠骨髓瘤細胞系P3/NSI/1-AG4-1 (NS-1) (ATCC No. TIB18)融合。融合產生雜交瘤細胞，將其鋪板於含有HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)培養基的96孔組織培養板中以抑制非融合細胞、骨髓瘤雜交細胞和脾雜交細胞的增殖。在雜交瘤選擇以後，通過ELISA測定培養上清液的MASP-2結合，並使用C3沉積測定法測定凝集素途徑活化的抑制。鑑定陽性雜交瘤，並通過系列稀釋法亞克隆。雜交瘤上清液的平行篩選產生了75個MASP-2結合和功能均為陽性的初始雜交瘤(C3沉積測定法)。在對75個初始雜交瘤進行進一步培養和重新試驗後，74個雜交瘤被證實為結合陽性，而39個雜交瘤被證實具有功能活性；將這39個雜交瘤通過連續稀釋進行克隆。 實施例2
重組抗體的克隆、純化和表徵使用RT-PCR從如在實施例1中所述鑑定的39個雜交瘤克隆中克隆重鏈和輕鏈可變區，並進行測序。在Expi293F細胞中產生小鼠-人嵌合的mAb作為重組蛋白，所述mAb由與人IgG4重鏈(SEQ ID NO:66)和κ輕鏈(SEQ ID NO:68)恆定區融合的小鼠mAb可變區組成。使用的IgG4恆定鉸鏈區(SEQ ID NO:66)含有穩定化S228P氨基酸置換。在某些實施方案中，將嵌合mAb與人IgG4恆定鉸鏈區(SEQ ID NO:67)融合，該鉸鏈區含有S228P氨基酸置換並且還含有促進在低pH的FcRn相互作用的某些突變。
確定了26個克隆是獨特的嵌合單克隆抗體。將這些嵌合單克隆抗體在瞬時轉染的Expi293F細胞中表達，純化，並試驗與人MASP-2的結合親和力以及抑制MASP-2介導的凝集素途徑活化的能力。
為了測量26種純化的重組MASP-2抗體與人MASP-2 (CCP1-CCP2-SP片段)的結合，如下進行固相ELISA測定。將MaxiSorp ELISA板在4℃用在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中的1.0 μg/mL的人MASP-2 (CCP1/2/SP片段)包被過夜。隨後將平板用1% BSA/PBS封閉，在PBS中洗滌，並然後在室溫與重組MASP-2 mAb在封閉緩衝液(PBST + 0.1% BSA)中的系列稀釋物一起溫育1小時。將平板洗滌(PBS-T, 0.05%)，並在室溫加入檢測抗體(山羊抗-人IgG-HRP) 1小時。在另一次洗滌(PBS-T, 0.05%)後，將平板用OPT EIA TMB (BD Biosciences #555214)顯影(5分鐘)。使用Spectramax M5e平板讀數器測量在A450的吸光度讀數。
在26種嵌合mAb中，發現22種具有與人MASP-2的良好結合(表觀Kd範圍為0.1 nM至1 nM)。發現26種嵌合mAb中的4種具有弱的/可忽略的與人MASP-2的結合。
為了測量26種純化的重組MASP-2抗體的阻斷補體活化的凝集素途徑的能力，如下進行C3沉積測定。將甘露聚糖在pH 9.6的50 mM碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3+ 1.5 mM NaN
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，向孔中加入250 μl的在PBS中的1% BSA，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl含有0.05%吐溫-20的PBS洗滌3次，並用200 μl PBS儲存在冰上，直到加入樣品。
將正常人血清在GVB/Ca/Mg緩衝液中稀釋至1.0%，並將26種純化的MASP-2 mAb以0.00001至100 nM的濃度範圍加入該緩衝液中，並在加入封閉的ELISA板之前在冰上預溫育10分鐘。通過將預溫育混合物轉移到甘露聚糖包被的測定板的孔中，啓動補體活化反應。在室溫溫育40分鐘後，通過將平板在ELISA洗滌緩衝液中洗滌三次來停止反應。用抗-人C3c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C3b沉積。陰性對照為不含血清的緩衝液(無C3沉積)，陽性對照為不含抑制性抗體的血清(最大C3b沉積)。截止值(cut-off)標準設置為不相關mAb和單獨緩衝液的活性的一半。
在篩選中鑑定的26種獨特的嵌合mAb中，確定在C3b沉積測定中具有最高抑制LP活性的三個克隆是OMS850、OMS860和OMS870。選擇這三種抗體用於如下所述的進一步表徵。
克隆OMS850、OMS860和OMS870的重鏈可變區和輕鏈可變區的序列如圖3所示(在圖3中，“SIN”=“SEQ ID NO:”)，並如下所示。在表1A、1B和1C (上文)和表S 3-6 (下文)中提供了各自的互補性决定區(CDR)和框架區(FR)。
下面給出了每種高親和力MASP-2抑制性抗體的重鏈可變區(VH)序列。Kabat CDR帶下劃線。
重鏈可變區：
OMS850_VH: SEQ ID NO:7 (小鼠親本)
QVQLQQPGAELVRPGSSVRLSCKASGYTFT
NYWMH WLKQRPIQGLEWIG
DIDPSDSETHYIEKFKD KATLTIDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAIYYCAR
GDITTTLRYFDV WGTGTTVTVSS
OMS860_VH: SEQ ID NO:8 (小鼠親本)
QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFT
NYWMH WVRQRPIQGLEWIG
DIDPSDSEIYYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAR
GDITTTLRYFDV WGTGTTVTVSS
OMS870 VH: SEQ ID NO: 9 (小鼠親本)
EVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFT
SYWMH WVKQRPGQGLEWIG
NINPSNGGTNCNEKFKN KATMTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR
WAYDAMDY WGQGTSVTVSS
下面給出了高親和力MASP-2抑制性抗體的輕鏈可變區(VL)序列。Kabat CDR帶下劃線。這些區域是相同的，無論是通過Kabat還是Chothia系統編號。
輕鏈可變區：
OMS850_VL: SEQ ID NO:10 (小鼠親本)
QIVLTQSPVIMSASPGEKVTMTC
SASSSVRYMY WYQQKPGSSPRLLIY
DTSNLAS GVPVRFSGSGSGTSNSLTISRMEAEDAATYYC
QQWSSYPLT FGAGTKLELKR
OMS860_VL: SEQ ID NO:11 (小鼠親本)
QIVLTQSPVIMSASPGEKVTITC
SASSSVSYMY WYQQKPGSSPRLLIY
DTSNLAS GVPVRFSGSGSGTSNSLTISRMEAEDAATYYC
QQWSSYPLT FGAGTKLELKR
OMS870 VL: SEQ ID NO:12 (小鼠親本)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC
RASESVDSYGNSFMH WYQQKPGQAPKLLIY
FASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYFC
QQSNEDPLT FGAGTKLELKR
實施例 3 候選 MASP-2 抑制性抗體的進一步表徵 1. 與重組人 MASP-2 的結合如在實施例1中所述，進行固相ELISA測定以測量三種選擇的MASP-2抑制性抗體與人MASP-2 (CCP1-CCP2-SP片段)的結合。結果顯示在圖4A-D中，並總結在下表7中。
2. 在人、食蟹猴、大鼠和小鼠血清中的 C3b 沉積測定將實施例2中所述的三種選擇的MASP-2抗體表達、純化並稀釋至相同的儲備濃度，將其再次在含有Ca
++和Mg
++的GVB緩衝液(4.0 mM巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl
2, 2.0 mM CaCl
2, 0.1%明膠, pH 7.4)中稀釋，以確保所有抗體克隆具有相同量的緩衝液。
A. 在人血清中的 C3b 沉積測定將甘露聚糖在pH 9.6的碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，然後將250 μl在PBS封閉溶液中的1% BSA添加到孔中，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl含有0.05%吐溫-20的PBS (ELISA洗滌緩衝液)洗滌3次。
將正常人血清在GVB/Ca/Mg緩衝液中稀釋至1.0%，並以0.00001至100 nM的最終濃度範圍添加MASP-2 mAb克隆OMS850、OMS860和OMS870，並在冰上預溫育15分鐘。通過將預溫育混合物轉移到甘露聚糖包被的、封閉的測定板的孔中引發反應，然後在室溫溫育40分鐘。通過將平板在洗滌緩衝液中洗滌三次來停止反應，並用抗-人C3c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C3b沉積。陰性對照為不含血清和抗體的緩衝液(不導致C3b沉積)，陽性對照為不含抗體的血清(最大C3b沉積)。截止值標準設置為不相關mAb和緩衝液的活性的一半。
B. 在食蟹猴血清中的 C3b 沉積測定將甘露聚糖在pH 9.6的碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，然後將250 μl在PBS封閉溶液中的1% BSA添加到孔中，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl PBS/吐溫-20洗滌3次。
將食蟹猴血清在GVB/Ca/Mg緩衝液中稀釋至0.25%，並以0.00001至100 nM的最終濃度範圍添加MASP-2 mAb克隆OMS850、OMS860和OMS870，並在冰上預溫育15分鐘。通過將預溫育混合物轉移到甘露聚糖包被的、封閉的測定板的孔中引發反應，然後在室溫溫育40分鐘。通過將平板用PBS/吐溫-20洗滌三次來停止反應。用抗-人C3c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C3b沉積。陰性對照為不含血清和抗體的緩衝液(不導致C3b沉積)，陽性對照為不含抗體的血清(最大C3b沉積)。截止值標準設置為不相關mAb和緩衝液的活性的一半。
C. 在大鼠血清中的 C3 沉積測定將甘露聚糖在pH 9.6的碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3+ 1.5 mM NaN
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，然後將250 μl的1% BSA封閉溶液添加到孔中，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl PBS/吐溫-20洗滌3次。
將大鼠血清在GVB/Ca/Mg緩衝液中稀釋至0.3%，並以0.00001至100 nM的最終濃度範圍添加MASP-2 mAb克隆OMS850、OMS860和OMS870，並在冰上預溫育15分鐘。通過將預溫育混合物轉移到甘露聚糖包被的、封閉的測定板的孔中引發反應，然後在室溫溫育40分鐘。通過將平板用洗滌緩衝液洗滌三次來停止反應。用抗-人C3c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C3b沉積。陰性對照為不含血清和抗體的緩衝液(不導致C3b沉積)，陽性對照為不含抗體的血清(最大C3b沉積)。截止值標準設置為不相關mAb和緩衝液的活性的一半。
D. 在小鼠血清中的 C3b 沉積測定將甘露聚糖在pH 9.6的碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3+ 1.5 mM NaN
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，然後將250 μl的在PBS封閉溶液中的1% BSA添加到孔中，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl PBS/吐溫-20洗滌3次。
將小鼠血清在GVB/Ca/Mg緩衝液中稀釋至1.0%，並以0.00001至100 nM的最終濃度範圍添加MASP-2 mAb克隆OMS850、OMS860和OMS870，並在冰上預溫育15分鐘。通過將預溫育混合物轉移到甘露聚糖包被的、封閉的測定板的孔中引發反應，然後在室溫溫育40分鐘。通過將平板轉移至冰浴來停止反應。用抗-人C3c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C3b沉積。陰性對照為不含血清和抗體的緩衝液(不導致C3b沉積)，陽性對照為不含抗體的血清(最大C3b沉積)。截止值標準設置為不相關mAb和緩衝液的活性的一半。
結果顯示在圖5A、5B、5C和5D中並總結在下面表8中。在圖5A-D中表示為“緩衝液”的數據點是僅緩衝液的陰性對照。
3. 在 50% 人血清中的 C4b 沉積測定將甘露聚糖在pH 9.6的碳酸鹽緩衝液(15 mM Na
2CO
3+ 35 mM NaHCO
3+ 1.5 mM NaN
3)中稀釋至50 μg/ml的濃度，並在4℃在ELISA板上包被過夜。第二天，然後將250 μl的在PBS封閉溶液中的1% BSA添加到孔中，並在室溫溫育2小時。將平板用300 μl PBS/吐溫-20洗滌3次。
將正常人血清在PBS中稀釋至50.0%，並將MASP-2 mAb克隆OMS850、OMS860和OMS870以0.0001至100 nM的最終濃度範圍加入該緩衝液，並在冰上預溫育15分鐘。通過將預溫育混合物轉移至甘露聚糖包被的、封閉的ELISA板引發反應，然後在4℃溫育7分鐘。用抗-人C4c抗體(Dako)、然後用山羊α-兔HRP (Southern Biotech)檢測C4b沉積。陰性對照為不含血清和抗體的緩衝液(=無C4b沉積)。在僅接收緩衝液的孔中測定背景。截止值標準設置為不相關mAb和緩衝液的活性的一半。
結果顯示在圖6中，並提供在下表9中。在圖6中表示為“緩衝液”的數據點是僅緩衝液的陰性對照。
考慮到如上所述在人、小鼠、大鼠和食蟹猴中的良好效能，選擇抗體OMS850用於人源化和進一步優化。
實施例 4 MASP-2 mAb OMS850 的人源化和變體的生產在人源化之前，分析抗-MASP-2抑制性的mAb OMS850的翻譯後修飾。在OMS850的VH CDR2 (DID
PSDSETHYIEKFKD (SEQ ID NO: 16))中鑑定出天冬氨酸異構化基序“DP”。通過定點誘變產生OMS850的變體，以將P53修飾為A、N、D、L、S和T。如上所述表達和純化所述變體。通過ELISA確定親和力，並使用上述完整的IgG4形式通過人血清中的C3沉積測定來評估效能。
結果顯示在圖7中，並提供在下表10中。
如在圖7中所示，在C3b沉積測定中確定了OMS850 VH P53A在人血清中具有最佳效能，如在C3b沉積測定中所測量的。因此，該P53A置換在下文所述的後續人源化過程中被摻入。
為了降低免疫原性風險，通過CDR移植法將代表性的高親和力MASP-2抑制性抗體OMS850人源化。將mAb OMS850的CDR移植到最接近的共有人框架序列中。通過Quickchange定點誘變(Agilent Technologies)修飾了一些Vernier區殘基。將所得的人源化的VH和VL區域轉移進基於pcDNA3.1的人IgG4和IgK表達構建體中，並如上所述表達和純化重組抗體。通過ELISA確定人源化抗體的親和力，並使用上面實施例3中所述的方法，通過使用在1%人血清中的完整IgG4形式的C3沉積測定法來評估效能。
第一種人源化的原型被開發並命名為OMS852。下面提供了OMS852人源化重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列。CDR (Kabat)帶下劃線。
OMS852 VH的完整序列(人源化): (SEQ ID NO: 46)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
NYWMHWLRQAPGQGLEWIG
DIDPSDSETHYIEKFKDRATLTIDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
GDITTTLRYFDVWGQGTLVTVSS
OMS852 VL的完整序列(人源化) (SEQ ID NO: 47)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC
SASSSVRYMYWYQQKPGKAPKLLIY
DTSNLASGVPSRFSGSGSGTDNTLTISSLQPEDFATYYC
QQWSSYPLTFGQGTKVEIKR
與OMS850親本mAb相比，使用OMS850 mAb的各種修飾形式的C3b沉積測定的結果如圖8A和圖8B所示，並總結在表11中。
單克隆抗體OMS852 4PA-1(其被人源化並摻入了先前鑑定的P53A修飾)被選擇用於進一步開發，並被命名為OMS854。
下面提供了人源化抗體OMS854的重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列。CDR (Kabat)帶下劃線。
OMS854 VH的完整序列: (SEQ ID NO: 48)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
NYWMHWLRQAPGQGLEWIG
DIDASDSETHYIEKFKDRATLTIDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
GDITTTLRYFDVWGQGTLVTVSS
OMS854 VL的完整序列(人源化) (SEQ ID NO: 47)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC
SASSSVRYMYWYQQKPGKAPKLLIY
DTSNLASGVPSRFSGSGSGTDNTLTISSLQPEDFATYYC
QQWSSYPLTFGQGTKVEIKR
如在表12中所示，對VH CDR1進行了進一步修飾，使得其包括至少一個、或任選兩個、或任選三個組氨酸。具有兩個組氨酸的變體被命名為OMS856。具有三個組氨酸的變體被命名為OMS858。
OMS856 VH的完整序列(SEQ ID NO:49)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
NYHMHWLRQAPGQGLEWIG
DIDASDSETHYIEKFKDRATLTIDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
GDITTTLRYFDVWGQGTLVTVSS
OMS858 VH的完整序列(SEQ ID NO:50)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
NHHMHWLRQAPGQGLEWIG
DIDASDSETHYIEKFKDRATLTIDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
GDITTTLRYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:65: 人IgG4恆定區
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 66: 具有S228P突變的人IgG4恆定區
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 67: 具有S228P突變以及促進在低pH的FcRn相互作用的突變(Xtend)的人IgG4恆定區
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:68: 人IgK恆定區
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:69: 編碼OMS850 VH的DNA (小鼠親本)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAGGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCATTGGTTGAAGCAGAGGCCTATACAAGGCCTTGAATGGATTGGTGACATTGACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACATTGAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTATAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGATCTATTACTGTGCAAGAGGGGATATTACTACGACCCTTAGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:70: 編碼OMS860 VH的DNA (小鼠親本)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCATTGGGTGAGACAGAGGCCTATACAAGGCCTTGAATGGATTGGTGACATTGACCCTTCTGATAGTGAAATTTACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACCGCCTATATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGATATTACTACGACCCTTAGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:71: 編碼OMS870 VH的DNA (小鼠親本)
GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTGCAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACAATGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGATGGGCCTACGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:72: 編碼OMS850 VL的DNA (小鼠親本)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGTAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTACGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTAACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
SEQ ID NO:73: 編碼OMS860 VL的DNA (小鼠親本)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGTAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAAAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTAACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCACTCACATTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
SEQ ID NO:74: 編碼OMS870 VL的DNA (小鼠親本)
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAACAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGGCACCCAAACTCCTCATCTATTTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTTCTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
SEQ ID NO:75: 編碼OMS852 VH的DNA
CAAGTCCAACTCGTCCAGTCCGGAGCAGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCGTGCAAAGCCTCCGGTTACACTTTCACCAACTATTGGATGCACTGGCTGCGCCAGGCGCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGGGATATCGACCCTTCGGACTCCGAAACTCATTACATTGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTCACCATCGATAAGAGCTCCTCGACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCAGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTGCGCGGGGCGACATTACAACGACCCTGCGGTACTTCGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTTGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:76: 編碼OMS852 VL的DNA
GATATTCAACTCACCCAGTCCCCTTCATCCCTTTCCGCTTCCGTCGGTGATAGAGTGACCATCACTTGCTCCGCGAGCTCTAGCGTGCGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCAAAGTTGCTCATCTATGACACTTCGAACCTGGCCTCCGGGGTGCCGTCACGGTTCTCCGGATCGGGATCGGGAACCGACAACACTCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAACAGTGGTCCTCCTACCCGCTGACGTTTGGCCAGGGAACCAAGGTCGAAATCAAGCGG
SEQ ID NO:77: 編碼OMS854的DNA
CAAGTCCAACTCGTCCAGTCCGGAGCAGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCGTGCAAAGCCTCCGGTTACACTTTCACCAACTATTGGATGCACTGGCTGCGCCAGGCGCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGGGATATCGACGCCTCGGACTCCGAAACTCATTACATTGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTCACCATCGATAAGAGCTCCTCGACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCAGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTGCGCGGGGCGACATTACAACGACCCTGCGGTACTTCGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTTGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:78: 編碼OMS856的DNA
CAAGTCCAACTCGTCCAGTCCGGAGCAGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCGTGCAAAGCCTCCGGTTACACTTTCACCAACTATCACATGCACTGGCTGCGCCAGGCGCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGGGATATCGACGCCTCGGACTCCGAAACTCATTACATTGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTCACCATCGATAAGAGCTCCTCGACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCAGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTGCGCGGGGCGACATTACAACGACCCTGCGGTACTTCGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTTGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:79: 編碼OMS858的DNA
CAAGTCCAACTCGTCCAGTCCGGAGCAGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCAGCGTGAAAGTGTCGTGCAAAGCCTCCGGTTACACTTTCACCAACCATCACATGCACTGGCTGCGCCAGGCGCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGGGATATCGACGCCTCGGACTCCGAAACTCATTACATTGAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACCCTCACCATCGATAAGAGCTCCTCGACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCAGAGGATACTGCTGTGTACTACTGTGCGCGGGGCGACATTACAACGACCCTGCGGTACTTCGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTTGTGACCGTGTCCTCC
實施例5
抗體 OMS858 特異性地阻斷凝集素途徑使用凝集素途徑、經典途徑和旁路途徑的途徑特異性條件，分析了mAb OMS858對膜攻擊複合物(MAC)沉積的影響。為此目的，按照製造商的說明書使用Wieslab COMPL300補體篩選試劑盒(Wieslab, Lund，瑞典)。對於經典途徑，補體在IgM上被活化。對於凝集素途徑，補體在甘露聚糖上被活化，而對於旁路途徑，補體在LPS上被活化。
圖9A圖示了在經典途徑特異性測定條件下在有或沒有抗-MASP-2抗體OMS858存在下的MAC沉積水平。圖9B圖示了在凝集素途徑特異性測定條件下在有或沒有抗-MASP-2抗體OMS858存在下的MAC沉積水平。圖9C圖示了在旁路途徑特異性測定條件下在有或沒有抗-MASP-2抗體OMS858存在下的MAC沉積水平。
如在圖9B中所示，mAb OMS858以約1 nM的IC
50值阻斷凝集素途徑介導的MAC沉積的活化。但是，mAb OMS858對經典途徑介導的活化(圖9A)或旁路途徑介導的活化(圖9C)所引發的MAC沉積沒有影響。已知抑制經典途徑的抗-C1s抗體(TNT003)作為對照被包括在圖9A中。已知抑制旁路途徑的抗-因子B抗體作為對照被包括在圖9B和9C中。
實施例6
抗體 OMS850 、 OMS858 、 OMS860 、 OMS870 的 MASP-2 結合表位的分析如下所示，將抗體OMS858生物素化並在Octet生物層干涉技術結合測定中試驗其與幾種不同MASP-2抗體同時結合的能力。使用EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Fischer Scientific, A39257)將抗體OMS858生物素化。在室溫，將超級抗生蛋白鏈菌素(SSA)生物傳感器(Fortebio 18-5057)在PBS中在室溫水合15分鐘。將3 mL的50 nM生物素化的OMS858在BLI芯片上捕獲，然後捕獲hMASP-2-CCP1-CCP2-SP。在固定化緩衝液(PBS, 0.02% BSA, 0.05%吐溫-20, pH 7.4)中製備五種試驗抗-MASP-2抗體之一的A500 nM溶液。使用的試驗抗體為OMS850、OMS860和OMS870(其生產如上所述)、以及先前鑑定的抗-MASP-2抗體OMS721和4A8。
第一列中的板孔接收200 μl的生物素化的OMS858，下一列中的孔接收200 μl的hMASP-2-CCP1-CCP2-SP。在板上的單獨列中，向每個孔中加入200 μl的500 nM試驗抗體。還使用未生物素化的OMS858或單獨緩衝液替代試驗抗體進行對照。
使用下述步驟在Octet上進行結合測定：基線建立(60s)、生物素化的OMS858的加載(180s)、基線建立(60s)、hMASP-2-CCP1-CCP2-SP的加載(180s)，然後是試驗抗體的結合(300s)和解離(300s)。
如在圖10中所示，抗體OMS850、OMS860和OMS870不能結合被OMS858捕獲的MASP-2，表明這些抗體結合MASP-2上的相同或部分重疊的表位。相比之下，先前鑑定的抗-MASP-2抗體OMS721和4A8能够結合被OMS858捕獲的MASP-2，表明這兩種抗體結合不同於OMS850、OMS860、OMS870和OMS858的在MASP-2上的表位。 實施例7
MASP-2 蛋白和 Fab mAb OMS858 複合物的結晶 1. MASP-2 蛋白製備如下製備重組MASP-2蛋白，其基於UniProt O00187，人甘露聚糖-結合凝集素絲氨酸蛋白酶2。產生人MASP-2 CCP2-SP和CCP2-SP-6HIS的表達構建體，用於在大腸桿菌細胞中重組表達。根據在Ambrus G. 等人, 2003中描述的方法進行MASP-2在大腸桿菌中作為包涵體的重組表達和蛋白純化，進行了輕微修改。對於HIS標記的版本，根據在Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook, Qiagen, 2007年3月中描述的方法在變性條件下純化MASP-2蛋白(CCP2-SP-6HIS)。
MASP-2的純化包括使用以下文獻描述的標準方法進行提取、解折疊、重折疊和色譜法：Harmat等人, J. Mol. Biol. 2004;342:1533-1546；和Gal等人, J. Biol. Chem. 2005;280:33435-33444；和Ambrus等人. J Immunol. 2003年2月1日;170(3):1374-82。在尺寸排阻色譜法以後，將重組MASP-2蛋白用旋轉濃縮器(Amicon NMWL 10kDa)從5 mg/mL濃縮至20 mg/mL。將濃縮的MASP-2蛋白樣品快速冷凍並儲存直至解凍用於複合物形成。通過Commassie Blue Simply Blue™ Safe Stain (Invitrogen)染色的SDS-PAGE監測純化和切割。
2. Fab mAb OMS858 蛋白製備使用FAbALACTICA® Fab試劑盒根據製造商的說明書對mAb OMS858進行蛋白水解性裂解，產生OMS858 Fab。
3. MASP-2-Fab mAb OMS858 複合物產生將Fab mAb OMS858和MASP-2蛋白樣品以等摩爾濃度溫育1小時。通過分析型尺寸排阻色譜法驗證MASP-2-Fab mAb OMS858複合物的成功產生。
4. MASP-2-Fab mAb OMS858 複合物結晶通過將等體積的MASP-2-Fab mAb OMS858複合物溶液與商購可得的結晶製劑組合，將結晶試驗設置為坐滴、蒸汽擴散實驗。以5至20 mg/mL的蛋白濃度使用MASP-2-Fab mAb OMS858複合物蛋白樣品。MASP-2-Fab mAb OMS858晶體在不到兩個月的時間內出現在含有100 mM醋酸鈉pH 5.26、200 mM硫酸銨、10.45% PEG 2000 MME的結晶製劑中。將晶體用低溫回路捕獲，用在結晶製劑中的20%甘油冷凍保護，然後在液氮中快速冷却。
實施例 8 X- 射線晶體學將如在實施例7中所述製備的MASP-2-Fab mAb OMS858複合物晶體用1.0Å波長的同步加速器X-射線衍射，並使用Dectris Pilatus和Eiger檢測器在束線SSRL BL9-2、BL14-1、BL12-2以及ALS扇區5處收集X-射線衍射數據。在表14中提供了MASP-2-Fab mAb OMS858複合物晶體的晶體參數、數據收集和精化(refinement)統計的總結。使用結構1Q3X的部分和3C08的部分作為搜索模型通過分子置換確定X射線結構，並用Buster 2.10.2或Refmac 5.8部分地精化。用Coot (Emsley等人, 2010)檢查電子密度，並進行迭代模型構建和精化循環，直到MASP-2和Fab mAb OMS858的密度清晰可見且R因子足够；在此時，認為完成了部分精化，並檢查了配體、溶劑和蛋白的模型。
實施例9
晶體結構分析使用LigPlot+(Laskowski和Swindels，2011)分析了精化結構的蛋白-蛋白和蛋白-溶劑相互作用類型和距離，其中氫鍵供體和受體之間的最大距離參數設置為3.35Å；且疏水接觸與任何接觸之間的非鍵合接觸參數(諸如范德華相互作用)具有3.90Å的最大接觸距離。
表15顯示了mAb OMS858和MASP-2的原子之間的H-鍵。表16顯示了MASP-2原子與Fab mAb OMS858原子的范德華相互作用，其通過使用“抗體”設置的基於LigPlot+的晶體結構分析得出。LigPlot+將這些稱為“非鍵合接觸”或“疏水接觸”。儘管有此名字，但存在包含可能氫鍵的原子對。因此，在某些情况下，表16還含有氫鍵相互作用。
圖11是顯示MASP-2絲氨酸蛋白酶結構域和Fab mAb OMS858的排列及其之間的接觸的示意圖。
圖12A是顯示mAb OMS858所結合的MASP-2表位的示意圖，其包括在MASP-2的SP結構域中的以下殘基：ASP496；LYS503；SER506；PRO507；HIS508和TRP513。如在圖12A中所示，OMS858所結合的表位包括兩個斑塊，第一個包括ASP496和TRP513，且第二個包括LYS503、SER506、PRO507和HIS508。
圖12B是顯示與圖12A所示的MASP-2表位結合的mAb OMS858的互補位的示意圖。如在圖12B中所示，所述互補位包括兩個連接的、對應的斑塊，其貢獻來自重鏈和輕鏈，特別是重鏈殘基HIS33、ASP50、ASP52、ASP55、GLU57、HIS59以及輕鏈殘基TYR31、ARG30和TRP90。
確定存在三個氫鍵和36個范德華接觸，如下所示：
圖13解釋了mAb OMS858互補位和MASP-2表位之間的相互作用，這通過LigPlot+軟件計算，其中使用具有氫鍵計算參數設置的“抗體”模式(氫鍵供體和受體之間的最大距離為3.35Å；且疏水接觸與任何接觸之間的非鍵合接觸參數(諸如范德華相互作用)具有3.90Å的最大接觸距離)，採用從相應的結晶MASP-2-化合物共結構導出的模型。氫鍵和極性接觸用虛線表示，距離單位為埃。
描繪了與化合物原子相互作用的氨基酸的原子以及根據晶體學數據具有足够2fo-fc電子密度的化合物原子。MASP-2氨基酸殘基編號(MASP-2 AA#)是根據Uniprot登錄代碼O00187，氨基酸的原子編號(AA原子)根據蛋白數據庫(Protein Data Bank)建立的慣例，並對應於表15和16中的那些。
OMS858氨基酸殘基編號根據如SEQ ID NO:50所示的VH和如SEQ ID NO:47所示的VL。OMS858互補位，包括重鏈可變區(環H1、環H2)和輕鏈可變區(環L3、環L1)，如圖13中虛線上面所示，MASP-2表位如圖13虛線下面所示。圖13中所示的某些氨基酸具有帶有輻射線的弧，表明它們與其它氨基酸的原子具有范德華相互作用(虛線)。氫鍵和極性接觸被描繪為以埃為單位提供的距離的虛線。碳原子顯示為實心圓圈；氮原子顯示為帶有+的空心圓圈；且氧原子顯示為帶有x的空心圓圈。OMS858的氨基酸Glu57和Arg30的側鏈在X-射線結構中僅部分地分辨出。因此，OMS858的額外氫鍵和離子相互作用可能存在於OMS858的VH GLU57和VL ARG30之間，在MASP-2上具有相反的殘基，前提是主鏈非常接近。具體而言，OMS858的VL ARG30可以與MASP-2的ASP496形成離子鍵，並且OMS858的VL ARC30可以與MASP-2的TRP513的芳香族部分形成π π-堆疊相互作用，且OMS858的VH GLU57可以與MASP-2的LYS503的氨基形成離子鍵或氫鍵)。
如在圖13中所示，OMS858通過3個H鍵與MASP-2結合，其中：VH中的殘基ASP52和ASP55與MASP-2中的LYS503結合，且VL中的殘基ASP50與MASP-2中的HIS508結合。如圖13進一步所示，OMS858通過范德華接觸結合MASP-2，所述范德華接觸存在於：VH的HIS33與MASP-2的SER506和PRO507之間；VH的ASP52、ASP55和GLU57與MASP-2的LYS503之間；VH的HIS59和ASP50與MASP-2的HIS508之間，VL的TRP90與HIS508之間；VL的ARG30與MASP-2的TRP513之間，和VL的TYR31與MASP-2的TRP513和ASP496之間。
在某些方面，所述MASP-2抑制性抗體通過范德華接觸與MASP-2的1、2、3、4、5、6個或所有以下殘基相互作用：SER506、PRO507、LYS503、HIS508、TRP513、ASP496和它們的組合。在某些方面，所述MASP-2抑制性抗體通過氫鍵與MASP-2的1或2個以下殘基相互作用：LYS503和HIS508。
圖14A解釋了MASP-2表位的三維結構，所述MASP-2表位包含OMS858所結合的ASP496、LYS503、SER506、PRO507、HIS508和TRP513。如在圖14A中所示，如DIRMGTLKRLSPHYTQAW (SEQ ID NO:6)(其對應於人MASP-2的氨基酸殘基496-513 (SEQ ID NO:1))所示的整個MASP-2表位位於單個反向平行的β鏈-環-β鏈元件上。
圖14B解釋了OMS858互補位的三維結構，所述OMS858互補位包含MASP-2所結合的重鏈的HIS33、ASP50、ASP52、ASP55、GLU57和HIS59以及輕鏈的ARG30、TYR31和TRP90。HIS33位於環H1上。ASP50、ASP52、ASP55、GLU57、HIS59形成反向平行的β鏈-環-β鏈元件。TYR31和ARG30是在輕鏈的環1上，且TRP90是在輕鏈的L3環上。
圖15解釋了MASP-2表位DIRMGTLKRLSPHYTQAW (SEQ ID NO:6)與OMS858的重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接觸。具體地，如在圖15中所示，重鏈可變區殘基ASP55、GLU57和ASP52與MASP-2的LYS503相互作用；且重鏈可變區殘基HIS33、HIS59和ASP50與MASP-2的SER506、HIS508和PRO507相互作用。如圖15進一步所示，輕鏈可變區殘基TRP90與MASP-2的PRO507和HIS508相互作用，且輕鏈可變區殘基ARG30和TYR31與MASP-2的ASP496和TRP513相互作用。
在某些方面，SEQ ID NO:1 (DIRMGTLKRLSPHYTQAW，如SEQ ID NO:6所示)的MASP-2 SP氨基酸殘基496-513通過范德華相互作用與OMS858相互作用。范德華相互作用包括不帶電荷的分子之間的弱、短距離靜電引力，其由永久或瞬時電偶極矩的相互作用產生。
如在表16中所示，OMS858 LC ARG30原子CB與在TRP513中的MASP-2原子CZ2和CE2相互作用。LC TYR31原子CE2與在TRP513的MASP-2原子CH2相互作用。HC HIS59原子CD2、NE2、CE1、ND1和CG與在HIS508中的MASP-2原子CD2相互作用。HC ASP50原子OD2與在HIS508中的MASP-2原子CD2相互作用。LC TRP90原子CH2與在HIS508中的MASP-2原子NE2相互作用。HC HIS59原子CD2、CG和CB與在HIS508中的MASP-2原子NE2相互作用。HC ASP50原子OD2與在HIS508中的MASP-2原子CD2和CE1相互作用。LC TRP90原子CZ2與HIS508的MASP-2原子CE1相互作用。HC HIS59原子CE1、ND1、CG、CB和OD2與在HIS508中的MASP-2原子CE1相互作用。HC HIS59原子CE1和CG與在HIS508中的MASP-2原子ND1相互作用。HC HIS59原子NE2、CE1和ND1與在HIS508中的MASP-2原子CG相互作用。HC HIS59原子ND1與在HIS508中的MASP-2原子CG相互作用。HC HIS59原子CE1與在HIS508中的MASP-2原子CB相互作用。HC ASP50原子CG與在HIS508中的MASP-2原子NE2相互作用。HC HIS33原子CE1和ND1與在PRO507中的MASP-2原子CD相互作用。HC HIS33原子CE1與在SER506中的MASP-2原子CA相互作用。HC GLU57原子CB與在LYS503中的MASP-2原子NZ相互作用。HC ASP55原子CG與在LYS503中的MASP-2原子NZ相互作用。HC ASP52原子CB與在LYS503中的MASP-2原子NZ相互作用。HC ASP55原子OD2與在LYS503中的MASP-2原子CE相互作用。HC ASP52原子OD2與在LYS503中的MASP-2原子CE和CD相互作用。LC TYR 31原子CE2與在ASP496中的MASP-2原子OD2相互作用。
總之，MASP-2抑制性抗體OMS858的晶體結構分析表明，該抗體結合在人MASP-2絲氨酸蛋白酶結構域中的新表位
496DIRMGTLKRLSPHYTQAW
513(SEQ ID NO:6)。應當指出，該表位結合結構域不同於絲氨酸蛋白酶活性三聯體區域(殘基HIS483、ASP532和SER633)。進一步指出，在人MASP-2絲氨酸蛋白酶結構域中的新表位
496DIRMGTLKRLSPHYTQAW
513(SEQ ID NO:6)與MASP-2上的C4相互作用位點之間存在重疊，其包括殘基LYS503和TRP513 (參見Kidmose等人, Proc Natl Acad Sci USA 109:15425 (2012))。因此，人MASP-2的LYS503和TRP513殘基可以結合，參與OMS858和C4的結合。 如在圖11-15中所述的mAb OMS858與MASP-2的排列遵循標準抗體-抗原識別形式，並暗示了一種作用機理，其中通過OMS858與C4競爭對MASP-2的結合而抑制凝集素途徑活性。 儘管僅對MASP-2-Fab mAb OMS858複合物進行了該晶體結構分析，如在實施例6中證實的，不僅如預期的那樣，親本mAb OMS850與OMS858交叉競爭，而且mAb OMS860和mAb OMS870也與OMS858交叉競爭。因此，OMS860和OMS870的結合表位與通過MASP-2-Fab mAb OMS858複合物分析鑑定出的在MASP-2絲氨酸蛋白酶上的表位相同或重疊。相反，MASP-2抑制性抗體4A8和OMS721不與OMS858交叉競爭，並因此結合MASP-2上的單獨表位。
實施例 10 產生狗樣人 MASP-2 以分析 HIS508 在 OMS858 結合中的作用如在實施例9中所述，MASP-2/OMS858複合物的結構觀察表明，HIS508是結合表位的關鍵側鏈，因為它通過與ASP50的H橋和與TRP90和HIS59的π相互作用而與OMS858的可變結構域的重鏈和輕鏈相互作用。
圖16是人MASP-2 (SEQ ID NO:1的氨基酸445-686)、食蟹猴MASP-2 (SEQ ID NO:4的氨基酸445-686)、狗MASP-2 (SEQ ID NO:5的氨基酸445-686)、小鼠MASP-2 (SEQ ID NO:2的氨基酸444-685):和大鼠MASP-2 (SEQ ID NO:3的氨基酸444-685)的MASP-2絲氨酸蛋白酶(SP)結構域的氨基酸比對。
SEQ ID NO:1: 人MASP-2: (NP_006601.2)
MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNHLGGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQTDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGYELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCEPVCGLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTAAGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRLSPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNNKVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWFVGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIENIISDF
SEQ ID NO:2:小鼠MASP-2 (NP_001003893.1)
MRLLIFLGLLWSLVATLLGSKWPEPVFGRLVSPGFPEKYADHQDRSWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSYRCEYDFVKLSSGTKVLATLCGQESTDTEQAPGNDTFYSLGPSLKVTFHSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDVDECRVSLGDSVPCDHYCHNYLGGYYCSCRAGYVLHQNKHTCSALCSGQVFTGRSGYLSSPEYPQPYPKLSSCTYSIRLEDGFSVILDFVESFDVETHPEAQCPYDSLKIQTDKGEHGPFCGKTLPPRIETDSHKVTITFATDESGNHTGWKIHYTSTARPCPDPTAPPNGSISPVQAIYVLKDRFSVFCKTGFELLQGSVPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPECSIIDCGPPDDLPNGHVDYITGPEVTTYKAVIQYSCEETFYTMSSNGKYVCEADGFWTSSKGEKLPPVCEPVCGLSTHTIGGRIVGGQPAKPGDFPWQVLLLGQTTAAAGALIHDNWVLTAAHAVYEKRMAASSLNIRMGILKRLSPHYTQAWPEEIFIHEGYTHGAGFDNDIALIKLKNKVTINGSIMPVCLPRKEAASLMRTDFTGTVAGWGLTQKGLLARNLMFVDIPIADHQKCTAVYEKLYPGVRVSANMLCAGLETGGKDSCRGDSGGALVFLDNETQRWFVGGIVSWGSINCGAADQYGVYTKVINYIPWIENIISNF
SEQ ID NO:3:大鼠MASP-2 (NP_742040.1)
MRLLIVLGLLWSLVATLLGSKWPEPVFGRLVSPGFPEKYGNHQDRSWTLTAPPGFRLRLYFTHFNLELSYRCEYDFVKLTSGTKVLATLCGQESTDTERAPGNDTFYSLGPSLKVTFHSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDVDECRTSLGDSVPCDHYCHNYLGGYYCSCRVGYILHQNKHTCSALCSGQVFTGRSGFLSSPEYPQPYPKLSSCAYNIRLEEGFSITLDFVESFDVEMHPEAQCPYDSLKIQTDKREYGPFCGKTLPPRIETDSNKVTITFTTDESGNHTGWKIHYTSTAQPCPDPTAPPNGHISPVQATYVLKDSFSVFCKTGFELLQGSVPLKSFTAVCQKDGSWDRPIPECSIIDCGPPDDLPNGHVDYITGPEVTTYKAVIQYSCEETFYTMSSNGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCKPVCGLSTHTSGGRIIGGQPAKPGDFPWQVLLLGETTAAGALIHDDWVLTAAHAVYGKTEAMSSLDIRMGILKRLSPHYTQAWPEAVFIHEGYTHGAGFDNDIALIKLKNKVTINRNIMPICLPRKEAASLMKTDFVGTVAGWGLTQKGFLARNLMFVDIPIVDHQKCATAYTKQPYPGAKVTVNMLCAGLDAGGKDSCRGDSGGALVFLDNETQRWFVGGIVSWGSINCGGSEQYGVYTKVTNYIPWIENIINNF
SEQ ID NO:4: 預測的食蟹猴MASP-2 (XP_005544869.1)
MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGHESTDTERAPGNDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPACDHHCHNHLGGFYCSCRVGYILHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPQPYPKLSSCTYSIRLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQIDSEEHGPFCGKTLPRRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHLSPVQAKYILKDSFSIFCEPGYELLQGHLPLKSFAAVCQKDGSWDQPMPSCSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPEVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGERSPPVCEPVCGLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGSTAAGALLYDNWVLTAAHAIYEQKHDASSLDIRLGALKRLSPHYTQAWAEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNNKVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGLLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYSGGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDNETQRWFVGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIKNIISNF
SEQ ID NO:5: 狗MASP-2 (XP_544572.4)
MRLLLFLGLLCGWAAAAPGPAWSQPLFGRLASPGFPGAYANHQERRWALTAPPGYRLRLYFTHFHLELSYLCEYDFVKLSSGTEVLATLCGQESTDTERAPGNDTFRSPGSSLDVTFRSDYSNEQPFTGFEAFYAAEDIDECQVSPGEAPPCDHHCHNHLGGFYCSCRQGYVLHRNKRTCSALCAGQVFTGRSGVLSSPEYPQPYPKLSSCTYSIRLEEGFSIVLDFVAPFDVESHPDALCPYDSLQVRTDKEEYGPFCGTTLPRRIETQSSAVAISFVTDQSGEHAGWRIRYSSSARPCPSPVAPPNGRITPVQAEYVLEDRVAVSCDPGYELLRGSSALESFTAVCQRDGSWDQPPPRCSAVDCGPPDDLPAGRVDFLTGPGVTTYGAGIRYHCDGSFYAMTAGDGKYVCEADGFWTSSKGEKSPPVCEPVCGVSTRTTEGRIYGGQKAKLGDFPWQVLLLGRTTAAGALLRDNWILTAAHAVYTQKAAASSLDIRMGALKRLSAQYTQARAEAIFIHEGYTPDAGFDNDIALIKLKNRVVINSNVLPICLPRKEAESFMRSEDIGTASGWGLTQRGFLARHLMFVDIPIVDHQKCTAAYEKLSYPGGRVTENMLCAGLEGGGKDSCRGDSGGALVFLDNETQRWFVGGIVSWGSTNCGEANQYGVYTKVINYIPWIENIINNF
從食蟹猴和小鼠生產重組MASP-2蛋白以評估OMS858抗體的物種交叉反應性。使用Phusion高保真度DNA聚合酶(New England BioLabs)對編碼人MASP-2的催化片段(CCP1-CCP2-SP結構域)的DNA進行PCR擴增，並使用In-Fusion HD克隆試劑盒(Clontech)將其克隆到pET-17b載體(Novagen)中。將6xHis-標簽連接至多肽的C-端進行純化。還製備了食蟹猴和小鼠的類似MASP-2表達構建體。
此外，產生了人MASP-2的“狗樣”變體。發現OMS858不抑制狗血清中的凝集素途徑活化(數據未顯示)。如在圖16中所示，狗MASP-2和人MASP-2在序列上不同。一種這樣的變異發生在對應於人MASP-2中HIS508的殘基處，這是狗MASP-2中的GLN。據預測，狗MASP-2中的穀氨醯胺與人MASP-2中的組氨酸所相互作用的互補位的兩個氨基酸中的僅一個良好相互作用，與人MASP-2相比，實際上削弱了狗MASP-2和OMS858之間的相互作用。為了產生人MASP-2的狗樣變體，使用PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(Agilent)通過基於PCR的定點誘變引入H508Q突變。基於晶體結構數據，預計與野生型人H508相比，OMS858對該MASP-2 H508Q突變具有更低的親和力。
將所有表達構建體轉化到BL21(DE3)pLysS大腸桿菌(Invitrogen)中，並根據製造商的方案表達重組蛋白，並使用鎳柱通過固定化的金屬親和色譜法(IMAC)純化。分別通過SDS-PAGE和肽切割測定來評估純化的蛋白的蛋白完整性和酶活性。
應用生物層干涉技術(BLI)分析與多種MASP-2蛋白結合的OMS858抗體。使用含有1% BSA和0.02%吐溫20的PBS作為測定緩衝液，使用Octet RED96系統(ForteBio)進行所有測量。首先將OMS858 (50 nM)裝載到抗人Fc捕獲生物傳感器(ForteBio)上。在基線的一個步驟以後，將捕獲的傳感器浸入含有不同濃度的靶蛋白(1.6-50 nM)的孔中進行締合步驟(120秒)，並然後轉移到空孔中進行解離步驟(200秒)。在所有實驗中，還將捕獲的傳感器浸入不含分析物的孔中，以允許單個參考减法來補償捕獲的抗體的自然解離。使用Octet數據分析軟件(ForteBio)分析記錄的結合傳感圖以確定結合親和力(KD)。
如在表17中所示，具有H508Q“狗樣”突變的人MASP-2使結合親和力降低至約1/450。
實施例 11 食蟹猴研究： OMS856 和 OMS858 的 PK/PD給首次用於實驗的食蟹猴(n=3)靜脈內或皮下施用1.5 mg/kg的OMS856和OMS858。在第-7天採集每只動物的血液樣品，並然後在施用後0.083、1、4、24、72、168、240、336、504、672、840和1008小時採集血液樣品，並試驗凝集素途徑活性的存在情况和施用的抗體的量。
在包被有5 μg/ml甘露聚糖的ELISA板中在4℃進行凝集素途徑測定過夜。然後將平板在室溫用PBS中的1% BSA封閉2小時。將食蟹猴血清在PBS中進行兩倍稀釋，並加入甘露聚糖包被的孔中，並在4℃溫育14分鐘。此後，將平板在PBS/吐溫-20中洗滌三次，並用兔抗-人C4c (Dako)，然後加入山羊α-兔HRP (Southern Biotech)探測C4沉積。
圖17A和圖17B圖示了在分別靜脈內施用1.5 mg/kg OMS856或OMS858以後食蟹猴的凝集素途徑活性相對於時間的關係。
圖18A和圖18B圖示了在分別皮下施用1.5 mg/kg OMS856或OMS858以後食蟹猴的凝集素途徑活性相對於時間的關係。
如在圖17A和圖18A中所示，食蟹猴在靜脈內和皮下施用1.5 mg/kg OMS856以後表現出持久的全身性凝集素途徑抑制。
如在圖17B和圖18B中所示，食蟹猴在靜脈內和皮下施用1.5 mg/kg OMS858以後表現出持久的全身性凝集素途徑抑制。
實施例 12 OMS858 在血栓形成的小鼠模型中的分析進行了一項研究以確定OMS858在氯化鐵誘導的小鼠頸動脈閉塞模型中的最小有效劑量和最大作用。
暴露雄性C57B1/6小鼠的左頸動脈，並在血管周圍安裝來自Transonic的微型流量探頭(0.7mm)。施用試驗化合物以後，通過應用一張浸透3.5% FeCl
3的濾紙(1.5mm x 1mm)誘導血栓形成。將濾紙直接放置在與血管外膜表面接觸的頸動脈上。暴露3分鐘以後，除去濾紙，並用鹽水洗滌血管。連續記錄頸動脈血流量，直到血管完全閉塞或最長45分鐘的時間。達到閉塞的時間(TTO)被定義為從應用FeCl
3到血流量下降到低於0.1 mL/min持續至少30秒的時間或直到信號幅度降低到足以阻止探頭觀察心搏的時間。將在45分鐘觀察期結束時未閉塞的血管用45分鐘的TTO評分。
在研究前24小時，將小鼠(每個劑量組，n=8)以以下劑量通過皮下注射施用OMS858：1 mg/kg、3 mg/kg、10mg/kg和30 mg/kg。在FeCl
3攻擊前1小時施用的30 mg/kg的乙醯基水楊酸(ASA)用作陽性對照。一種不相關的抗體用作陰性對照。
結果顯示在表18中，並圖示在圖19中。如在表18和圖19中所示，OMS858的最大效果與ASA相當。如表18和圖19進一步所示，OMS858在最低試驗劑量(1 mg/kg)是有效的。媒介物處理的對照小鼠的TTO為14.7±4.6分鐘。如預期的，ASA預處理顯著延長TTO至36.4±5.7分鐘，而同種型對照抗體預處理未顯著延長TTO (9.3±1.5分鐘)，這證實了試驗系統的適用性。與媒介物組相比，用1、3、10和30 mg/kg劑量的OMS858預處理小鼠顯著延長TTO(分別為40.4±4.6、37.0±5.2、39.1±3.9分鐘和37.4±5.0)。在評價的OMS858劑量中沒有觀察到明顯的劑量-應答關聯，表明在該小鼠模型中，在1mg/kg皮下的劑量水平可以達到最大藥理作用。
實施例 13 OMS858 對人血清中經典、凝集素和旁路途徑誘導的 C5b-9 活化的作用為了評估OMS858抑制凝集素途徑的功能選擇性，使用了Wieslab®補體系統篩選試劑盒。如下評估OMS858的功能活性：用連續稀釋的OMS858預溫育人血清樣品，然後在途徑特異性測定條件下活化補體並定量C5b-9沉積。 將在途徑特異性測定緩衝液中稀釋的人血清樣品用OMS858的系列稀釋液預溫育，然後在用經典途徑特異性的(A)、凝集素途徑特異性的(B)或旁路途徑特異性的(C)補體活化劑預包被的適當Wieslab®測定孔中在37℃溫育1小時。使用對C5b-9新抗原特異性的鹼性磷酸酶綴合的抗體，定量末端補體活化產物C5b-9 (也被稱作MAC)的沉積。 如在圖20A-20C中所示，OMS858以0.81 nM (121.5 ng/mL)的IC50值抑制凝集素途徑誘導的C5b-9活化，而在直到500nM的濃度不影響經典或旁路途徑誘導的C5b-9活化。
實施例 14 與人 MASP-2 結合的單克隆抗體 OMS858 的進一步表徵將表面等離子體共振(SPR)用於測定液相酶原和催化活性形式的人MASP-2與固定化的OMS858的相互作用的締合和解離速率常數(分別為kon和koff)。將優化的方法和濃度系列用於詳細表徵相互作用，並將獲得的速率常數用於計算OMS858-MASP-2相互作用的解離平衡常數(KD)。
催化活性的MASP-2與OMS858結合的k
on和k
off分別為3.38 x 10
7M
-1s
-1和9.71 x 10
-3s
-1，產生287pM的K
D值。酶原MASP-2與OMS858結合的k
on和k
off分別為2.41 x 10
5M
-1s
-1和1.72 x 10
-4s
-1，產生715pM的KD值。參見表19。
通過固相酶聯免疫吸附測定(ELISA)評價OMS858對MASP-2的結合特異性。將重組人MASP-2或C1r、C1s、CFD、MASP-1和MASP-3固定化在聚苯乙烯板上，並測量OMS858結合的劑量-應答。通過使用4參數邏輯模型的非線性回歸來估計表觀解離常數(KD)。
試驗了兩批不同的OMS858。OMS858與人MASP-2結合的平均表觀KD為0.047 μg/mL。在直到100 μg/mL的OMS858濃度，未觀察到與C1r、C1s、MASP-1、MASP-3或因子D的顯著結合，表明OMS858對MASP-2的選擇性是對補體系統的密切相關絲氨酸蛋白酶的至少2000倍。將選擇性倍數計算為K
D(相關絲氨酸蛋白酶)/平均K
D(MASP-2)。見表20。
實施例 15 單克隆抗體 OMS858 在各種哺乳動物物種中的功能活性的表徵使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量50%血清中凝集素依賴性的C4活化，以表徵人、食蟹猴、狗、兔的血清中和小鼠水蛭素血漿中OMS858的功能效能。如下評估OMS858的功能活性：用連續稀釋的OMS858預溫育來自各個物種的血清或水蛭素血漿樣品，然後將混合物添加到甘露聚糖包被的ELISA板孔中，這驅動體外凝集素依賴性的C4活化。通過分析凝集素途徑抑制濃度-應答曲線並確定IC
50值，估計OMS858抑制MASP-2活性的功能效能。
在人血清中，OMS858顯示出對凝集素依賴性補體活化的有效抑制，平均IC
50值為1.09 nM (164 ng/mL)。在食蟹猴血清和小鼠血漿中測得的OMS858抑制凝集素途徑活化的平均IC
50值分別為44.1 nM (6.620 μg/mL)和11.9 nM (1.79 μg/mL)。相比之下，OMS858在直到500 nM的濃度沒有可察覺地抑制兔和狗血清中的凝集素依賴性補體活化。見表21。小鼠和食蟹猴與人的功能效能的對比表明，OMS858在這些物種中的功能效能分別比人低至1/10.9和1/40.5。將相對於人的效能計算為查詢物種的IC
50值與用人血清獲得的IC
50的比率。見表22。
實施例 16 OMS858 在小鼠和食蟹猴中的藥效動力學在血清離體暴露於甘露聚糖包被的表面後測量PD活性(凝集素途徑活性的抑制)，隨後使用電化學發光免疫測定(ECLIA)評價補體活化。在小鼠中，將個體動物補體活化片段沉積與在基線/對照動物處收集的樣品中的平均補體活化片段沉積進行對比，並將數據以抑制百分比表示。在猴中，將個體C4沉積數據與個體動物的基線應答進行對比，並以抑制百分比表示。
小鼠的結果如圖24所示。通過ECLIA測量，小鼠中的基線LP活性存在高變異性。在0.1 mg/kg不存在可檢測的PD效應。但是，在0.3 mg/kg皮下劑量組中直到施用後72小時，在1 mg/kg靜脈內劑量組中直到施用後504小時，和在1和3 mg/kg皮下劑量組中直到施用後1008小時，平均MASP-2抑制大於50%。除了作用持續時間隨著劑量水平增加而增加的趨勢外，在較高的OMS858濃度，MASP-2抑制也有增加的趨勢。大於6 μg/mL的OMS858濃度(在1 mg/kg靜脈內和皮下和3 mg/kg皮下劑量組中實現)一致地導致大於50% MASP-2抑制。這些數據提示，劑量水平為1 mg/kg或更高的OMS858在延長的時間段內一致地實現對小鼠中MASP-2活性的實質性抑制。
給雄性食蟹猴(n=3/組)通過皮下(SC)注射施用0.1、0.3、1或3 mg/kg的OMS858，或通過靜脈內(IV)注射施用1mg/kg的OMS858。在施用前和在施用後0.083、1、4、24、48、72、168、240、336、504、672、840、1008、1176、1344、1512、1680、1848和2016小時採集血清樣品用於測定OMS858濃度和OMS858藥效動力學活性。
猴的結果如圖21所示。在皮下施用1mg/kg的OMS858的食蟹猴中，觀察到從OMS858施用後24小時至48小時開始並持續約336小時的約70-80%的凝集素途徑活性抑制，隨後抑制隨時間的推移逐漸下降。在皮下施用3mg/kg的OMS858的食蟹猴中，觀察到從OMS858施用後約24小時開始並在施用後持續約672小時的凝集素途徑活性的幾乎完全(＞95%)抑制，隨後抑制隨著時間的推移逐漸下降。在靜脈內施用1mg/kg的OMS858後也觀察到凝集素途徑活性的幾乎完全抑制，在1 mg/kg皮下觀察到最大效應的相似持續時間，並且隨著時間的推移逐漸减少。
在食蟹猴中的OMS858血清濃度和PD活性之間存在一致的關係，因此高於約20 μg/mL的OMS858的血清濃度導致凝集素途徑活性的高度(＞80%)抑制，而低於約3 μg/mL的血清濃度導致最小的抑制。OMS858血清濃度和PD應答數據的建模表明S形藥物濃度-應答曲線，EC
50值(導致半數最大凝集素途徑抑制的OMS858濃度)為約9 μg/mL。參見圖22。
實施例 17 OMS858 在小鼠和食蟹猴中的藥代動力學在雄性CD-1小鼠中和在雄性食蟹猴中表徵在單次皮下施用0.1、0.3、1或3 mg/kg或單次靜脈內推注施用1 mg/kg以後OMS858的PK。在小鼠(N=3/組/時間點；終末採樣)中在施用前和在施用後0.083 (僅靜脈內)、24、48、72、168、240、336、504、672、840、1008、1176和1344小時採集血液樣品，以及在猴(N=3/組/時間點；系列採樣)中在施用前和在施用後約0.083、1、4、24、48、72、168、240、336、504、672、840、1008、1176、1344、1512、1680、1848和2016小時採集血液樣品。
通過皮下或靜脈內注射給小鼠和猴單次施用OMS858後測得的PK參數匯總如表23所示。在圖23中顯示了給小鼠(左圖)和猴(右圖)單次靜脈內或皮下施用後平均OMS858血清濃度隨時間推移的圖。
在單次皮下施用後，在小鼠中達到最大濃度的中位時間(t
max)為施用後24至168小時，在猴中為施用72或168小時。在單次皮下或靜脈內施用後，在小鼠中OMS858的消除t
1/2為203至409小時，在猴中為196至487小時。在小鼠和猴中，最大觀察濃度(C
max)和總暴露(外推到無限大的時間-濃度曲線下的面積[AUC
INF])通常以與劑量成比例的方式隨劑量增加。在單次皮下施用1 mg/kg的OMS858後，使用總暴露(AUC
INF)測定的生物利用度在小鼠中為85.7%，在猴中為93.0%。
實施例 18 OMS858 在健康人受試者中的 1 期單次劑量臨床研究進行在健康受試者中靜脈內(IV)和皮下(SC)施用OMS858的單次遞增劑量盲研究，以評估與安慰劑相比的安全性、耐受性、PK、PD和免疫原性。共48名健康人志願者被分為6個組群，每組8名受試者。在每個組群中，給6名受試者施用OMS858，給2名受試人員施用安慰劑。受試者和施用劑量的醫務人員都對哪些受試者接受OMS858和哪些受試者接受安慰劑不知情。6個組群的劑量如下：
● 組群1: 單次靜脈內劑量的0.01 mg/kg OMS858或安慰劑
● 組群2: 單次靜脈內劑量的0.03 mg/kg OMS858或安慰劑
● 組群3: 單次靜脈內劑量的0.1 mg/kg OMS858或安慰劑
● 組群4: 單次靜脈內劑量的0.3 mg/kg OMS858或安慰劑
● 組群5: 單次皮下劑量的1.0 mg/kg OMS858或安慰劑
● 組群6: 單次皮下劑量的OMS858或安慰劑，基於來自更早組群的數據確定劑量
受試者為18-60歲的健康男性或女性人類，在篩選時體重為50-110 kg，身體質量指數為18-30 kg/m
2。在篩選時、在施用前第-1天、在施用後立即、在施用後0.5、12、24、48、72、96、120、144和168小時以及在施用後第15、22、29、57和85天，採集血液樣品。主要終點是OMS858的安全性和耐受性評估。次要終點是OMS858的PK和PD的表徵，以及在施用後針對OMS858的抗-藥物抗體(ADA)的存在情况的評估。探索性終點是分析OMS858對MASP-2和甘露聚糖-結合凝集素(MBL)水平的影響。
安全性和耐受性評估包括監測不良事件、生命體徵、心電圖、體格檢查、用於臨床評估的血液和尿液樣品的試驗以及臨床狀態的其它測量。對來自受試者的血液和/或血清樣品測定PK分析、PD分析，如通過C4沉積測定、MASP-2水平、MBL水平、ADA和其它有關生物標志物所測量的凝集素途徑抑制確定的。
組群1、組群2、組群3和組群4的中間PK和PD數據如圖25-26所示。直到圖25-26所示的時間點，未觀察到安全性或耐受性問題。OMS858的PK測量顯示直到圖25所示的時間點與劑量成比例的暴露。如在圖26中所示，在所有三個組群中觀察到OMS858的穩健和持續PD應答。如在圖27中所示，基於來自組群1-3的數據，觀察到良好的PK/PD關係，EC
50為170 ng/mL且EC
90為400 ng/mL。
IX. 示例性實施方案
在本說明書中提及的所有出版物、專利申請和專利通過引用併入本文。
雖然已經解釋和描述了本發明的某些實施方案，但是應當理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情况下可以在其中做出各種改變。儘管已經結合具體實施方案描述了本發明，但是應當理解，所要求保護的發明不應當不適當地限於這樣的具體實施方案。實際上，對醫學、免疫學、藥理學或相關領域的技術人員來說顯而易見的所描述的具體實施方案的各種修改意圖在本發明範圍內。
因此，為了清楚起見，提供了描述具體實施方案的以下編號段落，但不應解釋為限制申請專利範圍。
1. 一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其特異性地結合位於人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域內的表位，其中所述表位位於氨基酸
496DIRMGTLKRLSPHYTQAW
513(SEQ ID NO:6)內，其中所述抗體或其抗原結合片段抑制凝集素途徑補體活化。
2. 段落1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與C4競爭對MASP-2的結合。
3. 段落1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與人MASP-2 Lys 503和/或His 508中的至少一個形成氫鍵。
4. 段落1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與人MASP-2 His 508形成氫鍵。
5. 段落1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與以下人MASP-2氨基酸中的一個或多個形成范德華接觸：Asp 496、Lys 503、Ser 506、Pro 507、His 508和Trp 513。
6. 段落1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含：
(a)重鏈可變區，其包含具有序列NXXMH的HC-CDR1，其中在位置2的X是H或Y且其中在位置3的X是H或W；如SEQ ID NO:63 (DIDXSDSEXXYXXKFKD)所示的HC-CDR2，其中在位置4的X是P或A；且其中在位置9的X是T或I，且其中在位置10的X是H或Y，且其中在位置12的X是I或N；且其中在位置13的X是E或Q；和如SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)所示的HC-CDR3；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO:64 (SASSSVXYMY)所示的LC-CDR1，其中在位置7的X是R或S；如SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)所示的LC-CDR2，和如SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)所示的LC-CDR3；或
(b)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO:25 (SYWMH)所示的HC-CDR1，如SEQ ID NO:27 (NINPSNGGTNCNEKFKN)所示的HC-CDR2和如SEQ ID NO:29 (WAYDAMDY)所示的HC-CDR3；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO:41 (RASESVDSYGNSFMH)所示的LC-CDR1，如SEQ ID NO:43 (FASNLES)所示的LC-CDR2，和如SEQ ID NO:45 (QQSNEDPLT)所示的LC-CDR3。
7. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWMH)。
8. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:56 (NYHMH)。
9. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO: 57 (NHHMH)。
10. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)。
11. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:22 (DIDPSDSEIYYNQKFKD)。
12. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)。
13. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)。
14. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:39 (SASSSVSYMY)。
15. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWMH)、SEQ ID NO:56 (NYHMH)或SEQ ID NO:57 (NHHMH)，所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)或SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
16. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)或SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
17. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:56 (NYHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)或SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
18. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:57 (NHHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)或SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
19. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:16 (DIDPSDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
20. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
21. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:56 (NYHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 (DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
22. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:57 (NHHMH)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:53 ((DID
ASDSETHYIEKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:32 (SASSSVRYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
23. 段落6(a)的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述HC-CDR1包含SEQ ID NO:14 (NYWM)；所述HC-CDR2包含SEQ ID NO:22 (DIDPSDSEIYYNQKFKD)，且所述HC-CDR3包含SEQ ID NO:18 (GDITTTLRYFDV)，且所述LC-CDR1包含SEQ ID NO:39 (SASSSVSYMY)，且所述LC-CDR2包含SEQ ID NO:34 (DTSNLAS)，且所述LC-CDR3包含SEQ ID NO:36 (QQWSSYPLT)。
24. 段落6(a)的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的重鏈和與SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:47具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的輕鏈。
25. 段落6(a)的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的重鏈和與SEQ ID NO:47具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的輕鏈。
26. 段落6(a)的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO:8具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的重鏈和與SEQ ID NO:11具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的輕鏈。
27. 段落6(b)的分離的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO:9具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的重鏈和與SEQ ID NO:12具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的輕鏈。
28. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自由以下成員組成的集合：人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、鼠抗體和前述任一種的抗原結合片段。
29. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段選自由以下成員組成的集合：單鏈抗體、ScFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、缺乏鉸鏈區的單價抗體和完整抗體。
30. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其進一步包含免疫球蛋白恆定區。
31. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是人源化的。
32. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是選自IgG1、IgG2和IgG4的IgG免疫球蛋白。
33. 段落1-27中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含在Fc區中的一個或多個突變。
34. 段落33的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區包含S228P氨基酸置換。
35. 段落1-34中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段以小於20 nM的親和力結合人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域。
36. 段落35的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段以小於10 nM的親和力結合人MASP-2的絲氨酸蛋白酶結構域。
37. 段落1-34中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段抑制哺乳動物血液中的凝集素途徑。
38. 段落37的分離的抗體或其抗原結合片段，其中凝集素途徑抑制包含在凝集素途徑特異性測定條件下C3b沉積的减少。
39. 段落37的分離的抗體或其抗原結合片段，其中凝集素途徑抑制包含在凝集素途徑特異性測定條件下C4沉積的减少。
40. 段落37的分離的抗體或其抗原結合片段，其中凝集素途徑抑制包含在凝集素途徑特異性測定條件下MAC沉積的减少。
41. 段落1-34中的任一段的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段不會抑制哺乳動物血液中的經典途徑。
42. 一種組合物，其包含段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的賦形劑。
43. 段落42的組合物，其中所述組合物被配製用於皮下施用。
44. 一種分離的多核苷酸，其編碼來自段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區。
45. 編碼來自段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的分離的多核苷酸和編碼來自段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的分離的多核苷酸的組合。
46. 一種克隆載體或表達載體，其包含段落44的多核苷酸或段落45的多核苷酸的組合。
47. 第一種克隆載體或表達載體與第二種克隆載體或表達載體的組合，所述第一種克隆載體或表達載體包含編碼來自段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的分離的多核苷酸，所述第二種克隆載體或表達載體包含編碼來自段落1-34中的任一段的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的分離的多核苷酸。
48. 一種宿主細胞，其包含段落46或段落47的一種或多種克隆載體或表達載體。
49. 一種用於生產段落1-34中的任一段的抗體或抗原結合片段的方法，所述方法包含培養如請求項48的宿主細胞和分離所述抗體或其抗原結合片段。
50. 一種在哺乳動物中抑制凝集素途徑補體活化的方法，所述方法包含給有此需要的哺乳動物受試者施用足以抑制所述哺乳動物中的凝集素途徑補體活化的量的、包含高親和力MASP-2抑制性抗體或其抗原結合片段的根據段落42的組合物。
51. 段落50的方法，其中所述有此需要的受試者患有凝集素途徑疾病或障礙或處於發生凝集素途徑疾病或障礙的風險中，所述凝集素途徑疾病或障礙選自由以下成員組成的集合：血栓性微血管病(TMA)、腎臟病症、由組織或器官移植引起的炎性反應、缺血再灌注損傷、與糖尿病相關的併發症、心血管疾病或障礙、炎症性胃腸道障礙、肺障礙、眼科疾病或障礙、彌散性血管內凝血、移植物抗宿主病、靜脈閉塞性疾病和彌漫性肺泡出血。