RS60442B1 - Derivat triazolopirazinona koristan kao inhibitor humane pde1 - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na neki inhibitor humane PDE1, na farmaceutske kompozicije koje uključuju jedinjenje, na postupke za upotrebu jedinjenja u lečenju fizioloških poremećaja i na međuproizvode i procese korisne u sintezi jedinjenja.

[0002] Fosfodiesteraze (PDEe) su enzimi koji regulišu ćelijske nivoe cAMP i cGMP tako što kontrolišu brzinu kojom se ovi ciklični nukleotidi hidrolizuju. PDE1, kalcijum i kalmodulinzavisna PDE je jedna od najmanje 11 poznatih PDE familija. PDE1 se pojavljuje u brojnim tkivima, uključujući mozak, srce, pluća, bubrege i glatke mišiće. Pored toga, PDE1 obuhvata familiju tri poznata izooblika, PDE1A, PDE1B i PDE1C.

[0003] Kod pacijenata obolelih od dijabetesa se često razvija oblik hronične bolesti bubrega označene kao dijabetična bolest bubrega (ili dijabetična nefropatija). Procenjeno je da dijabetična bolest bubrega može da se javi kod više od 40 procenata pacijenata sa dijabetesom. Mogućnosti za tretman dijabetične bolesti bubrega su ograničene i uključuju upotrebu lekova koji snižavaju krvni pritisak, regulisanje vrednosti glukoze u krvi, pravilnu ishranu i kontrolu telesne težine i uključivanjem redovne fizičke aktivnosti. Prema tome, postoji potreba za izborom dodatnog tretmana za pacijente koji boluju od hronične bolesti bubrega, posebno od dijabetične bolesti bubrega.

[0004] United States Patent No.8,299,080 otkriva neke derivate hinoksalina koji imaju aktivnost inhibicije PDE9 korisnu za lečenje različitih poremećaja kao što su disurija i hipertenzija. Pored toga, European Patent No.0 040 401 otkriva neke supstituisane tiazolohinoksalin-4-one koji poseduju antihipertenzivno delovanje.

[0005] Ovaj pronalazak obezbeđuje neko novo jedinjenje koje je inhibitor humane PDE1. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje novo jedinjenje koje je selektivni inhibitor humanih PDE1A, PDE1B i PDE1C u odnosu na druge PDEe, kao što su PDE2A, PDE3A, PDE4D, PDE5A, PDE6AB, PDE7B, PDE8A. PDE9A, PDE10A i PDR11A. Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje novo jedinjenje koje može da ima antihipertenzivne efekte a takođe može da poboljša protok krvi u bubrezima. Pored toga, jedinjenje iz ovog pronalaska može da smanji renalne fibroze.

[0006] U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za lečenje hronične bolesti bubrega kod pacijenta, uključujući primenu efektivne količine jedinjenja Formule I na pacijentu kome je potreban takav tretman.

[0008] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za lečenje dijabetične bolesti bubrega kod pacijenta, uključujući primenu efektivne količine jedinjenja Formule I na pacijentu kome je potreban takav tretman.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za lečenje hipertenzije kod pacijenta, uključujući primenu efektivne količine jedinjenja Formule I na pacijentu kome je potreban takav tretman.

[0010] Pored toga, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I za upotrebu u terapiji.

Pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenje Formule I za upotrebu u tretmanu hronične bolesti bubrega. Pored toga, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I za upotrebu u tretmanu dijabetične bolesti bubrega. Pored toga, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I za upotrebu u tretmanu hipertenzije. Osim toga, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I u proizvodnji medikamenta za tretman hronične bolesti bubrega. Osim toga, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I u proizvodnji medikamenta za tretman dijabetične bolesti bubrega. Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I u proizvodnji medikamenta za tretman hipertenzije.

[0011] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje Formule I sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga.

Pronalazak dalje obezbeđuje proces za izradu farmaceutske kompozicije koji uključuje mešanje jedinjenja Formule I sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga. Ovaj pronalazak takođe obuhvata nove međuproizvode i procese za sintezu jedinjenja Formule I.

[0012] Kako se ovde koriste, nazivi "lečenje", "treatman" ili "tretirati" obuhvataju prohibiciju, obuzdavanje, usporavanje, zaustavljanje ili preobražaj progresije ili ozbiljnosti postojećih simptoma ili poremećaja.

[0013] Kako se ovde koristi, naziv "pacijent" se odnosi na sisare, kao što su miševi, zamorci, pacovi, psi ili ljudi. Razumljivo je da je preferirani pacijent čovek.

[0014] Kako se ovde koristi, naziv "efektivna količna" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja iz pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koja, nakon primene jedne ili više doza na pacijentu, obezbeđuje željeni efekat kod pacijenta sa dijagnozom ili u toku tretmana.

[0015] Stručnjak sa iskustvom u praksi može lako da odredi efektivnu količinu koristeći poznate tehnike ili na osnovu rezultata dobijenih pod analognim okolnostima. U određivanju efektivne količine za pacijenta, stručnjak sa iskustvom u praksi razmatra brojne faktore, uključujući, ali bez ograničenja na: veličinu pacijenta, godine starosti i opšte stanje; uključene specifične bolesti ili poremećaje; stepen ili prisustvo ili ozbiljnost bolesti ili poremećaja; odgovor pojedinačnog pacijenta; primenu određenog jedinjenja; način primene; karakteristike bioraspoloživosti primenjenog preparata; izabran režim doziranja; upotrebu pridruženih lekova; i druge relevantne okolnosti.

[0016] Jedinjenje Formule I je generalno efikasno u širokom opsegu doze. Na primer, dnevne doze su normalno u rasponu od približno 0.01 do približno 20 mg/kg telesne težine. U nekim slučajevima, vrednosti doze ispod donje granice prethodno pomenutog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima mogu da se primene čak veće doze sa prihvatljivim neželjenim efektima, pa stoga prethodno dati opseg doza ne treba da ograniči okvir pronalaska na bilo koji način.

[0017] Jedinjenja iz pronalaska su preferirano formulisana kao farmaceutske kompozicije za primenu bilo kojim načinom koji omogućava bioraspoloživost jedinjenja, uključujući oralni i parenteralni način. Najpoželjnije, ovakve kompozicije su za oralnu primenu. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. (Videti, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. L.V. Allen, Editor, 22nd Edition.

Pharmaceutical Press, 2012).

[0018] Farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja iz pronalaska može da se formira na primer, reakcijom odgovarajuće slobodne baze jedinjenja iz pronalaska i odgovarajuće farmaceutski prihvatljive kiseline u pogodnom rastvaraču pod standardnim uslovima dobro poznatim u tehnici. Formiranje ovakvih soli je dobro poznato i prihvaćeno u tehnici. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., i saradnici. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i Berge, S.M., i saradnici., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977).

[0019] Neke skraćenice su definisane na sledeći način: "ACN" se odnosi na acetonitril;

"AcOH" se odnosi na glacijalnu sirćetnu kiselinu; "DBU" se odnosi na 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-en; "DCM" se odnosi na dihlormetan ili metilen hlorid; "DIPEA" se odnosi na N,N-diizopropiletilamin; "DMF" se odnosi na N,N-dimetilformamid; "DMSO" se odnosi na dimetilsulfoksid; "ED-CI" se odnosi na 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid; "ES/MS" se odnosi na elektrosprej masenu spektrometriju; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "Et2O" se odnosi na dietil etar; "EtOH" se odnosi na etanol; "HMDS" se odnosi na hezametildisilazan; "HOBT" se odnosi na hidroksibenzotriazol: "h" se odnosi na sat ili sate; " IC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja dovodi do 50% maksimalnog mogućeg inhibitornog odgovora za to sredstvo; "µmol" se odnosi na mikromol ili mikromole; "min" se odnosi na minut ili minute; "MeOH" se odnosi na metanol ili metil alkohol; "MTBE" se odnosi na metil-terc-butil etar; "NiNTA" se odnosi na hromatografiju sa agaroza stacionarnom fazom funkcionalizovanom sa nitrilotriacetatnom kiselinom kao helatorom; "POCl3" se odnosi na fosfor oksihlorid; "RT" se odnosi na sobnu temperaturu; "SNAr" se odnosi na nukleofilnu aromatičnu supstituciju; "TEA" se odnosi na trietilamin; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran; "Tris" se odnosi na 2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol; "U/ml" se odnosi na jedinice po mililitru; "mt" se odnosi na težinu.

[0020] Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se izrade različitim procedurama poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici, od kojih su neke ilustrovane u niže datim šemama, izradama i primerima. Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će da prepozna da specifične faze sinteze za svaki opisani način mogu da se kombinuju na različite načine ili u konjukciji sa fazama iz različitih šema, da se izrade jedinjenja iz pronalaska. Produkti svake faze u niže datim šemama mogu da se vrate u prethodno stanje uobičajenim postupcima dobro poznatim u tehnici, uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. U niže datim šemama, svi supstituenti, ukoliko nije drugačije navedeno, su kako je prethodno definisano. Reagensi i početni materijali su lako raspoloživi stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici. Bez ograničavanja okvira pronalaska, naredne šeme, izrade i primeri su dati da dalje ilustruju pronalazak.

Šema 1

Formula I

[0021] Šema 1 opisuje sintezu jedinjenja Formule I. U Šemi 1 faza A SNAr reakcija 3-fluoro-2-nitropiridina, izvedena sa različitim nukleofilima, je dobro poznata u tehnici. Na primer, približno 1 ekvivalent 3-fluoro-2-nitropiridina reaguje sa približno 3 ekvivalenta butan-1-amina u odgovarajućem polarnom rastvaraču kao što je EtOH. Nastali produkt može nakon toga da se izoluje pomoću dobro poznatih tehnika, kao što je ekstrakcija. Na primer, reaktivna smeša može da se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa odgovarajućim polarnim organskim rastvaračem kao što je EtOAc. Organski ekstrakti mogu da se kombinuju, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije Nbutil-2-nitro-piridin-3-amin, produkt faze A, dovoljene čistoće da se koristi u narednoj fazi bez dodatnog prečišćavanja.

[0022] Redukcija nitro grupe koja sledi je dobro poznata u tehnici. U Šemi 1, faza B, na primer, približno 1 ekvivalent N-butil-2-nitro-piridin-3-amina, produkt faze A, može da se hidrogenizuje u prisustvu odgovarajućeg prolaznog metalnog katalizatora, kao što je paladijum na ugljeniku, u različitim organskim rastvaračima kao što je MeOH. Redukovani produkt može nakon toga da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što je filtracija i evaporacija. Na primer, sirova reaktivna smeša može da se filtrira kroz ploču diatomejske zemlje a filtrat može da se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije N3-butilpiridin-2,3-diamin, produkt Šeme 1, faza B, dovoljne čistoće za upotrebu u narednoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

[0023] Ciklizacija u dion produkt Šeme 1, faza C, može da se izvrši pod uslovima termalne acilacije sa dietil oksalatom u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što je EtOH. Na primer, približno 1 ekvivalent N3-butilpiridin-2,3-diamina može da se tretira sa približno 5 ekvivalenata dietil oksalata u odgovarajućem polarnom organskom rastvaraču kao što je EtOH u zatvorenoj epruveti na približno 100 °C. Produkt ciklizacije može nakon toga da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su precipitacija i filtracija. Na primer, reaktivna smeša može da se ohladi na približno -10 do 0 °C a dobijeni pricepitat može da se sakupi filtriranjem a ispiranjem sa dietil etrom se dobija 1-butil-4H-pirido[2,3-b] pirazin-2,3-dion, produkt Šeme 1, faza C, dovoljne čistoće za upotrebu u narednoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

[0024] Dehidratacija aktiviranog karbonila sa nukleofilom kao što je hidrazin je dobro poznata u tehnici. Na primer, približno 1 ekvivalent 1-butil-4H-pirido[2,3-b]pirazin-2,3-diona, produkt Šeme 1, faza C, može da se tretira sa priblžno 5 ekvivalenata hidrazin monohidrata na približno 100 °C, u epruveti pod pritiskom. Nakon toga produkt može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su precipitacija i filtracija. Na primer, sirova reaktivna smeša može da se ohladi na približno 0 °C a dobijeni precipitat može da se sakupi filtriranjem i ispere sa dietil etrom da se dobije 1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-on, produkt Šeme 1, faza D, dovoljne čistoće za upotrebu u narednoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

[0025] Dalja alkilacija hidrazina, produkt faze D, može da se izvrši različitim tehnikama reduktivne aminacije dobro poznatim u praksi. Na primer, približno 1 ekvivalent 1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-ona, produkt Šeme 1, faza D, može da se tretira sa približno 2 ekvivalenta odgovarajuće supstituisanog alkil aldehida, kao što je 1metilciklopropankarbaldehid (CAS # 4515-89-3, Enamin LLC, USA), u odgovarajućem alkoholnom rastvaraču kao što je MeOH koji sadrži katalitičku količinu odgovarajuće kiseline, kao što je AcOH, na približno RT do refluksa. Nakon toga produkt može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su kristalizacija i filtracija. Na primer, sirova reaktivna smeša može da se koncentruje pod sniženim pritiskom a produkt može da se dobije kristalizacijom sa odgovarajućim organskim rastvaračem kao što su heksani, a nakon toga filtracijom da se izdvoji 1-butil-3-[2-[(1-metilciklopropil)metilen]hidrazino]pirido[2,3-b]pirazin-2-on, produkt Šeme 1, faza E.

[0026] Izrada jedinjenja Formule I može da se izvede oksidativnom ciklizacijom posredstvom hipervalentnog joda (R. Aggarwal & G. Sumran, Synthetic Communications, 36: 1873-1876, 2006) na supstituisanom imin 1-butil-3-[2-[(1-metilciklopropil)metilen]hidrazino]pirido[2,3-b]pirazin-2-onu u odgovarajućem organskom rastvaraču, kao što je DCM, na temperaturi u rasponu od 0 °C do RT. Na primer, približno 1 ekvivalent 1-butil-3-[2-[(1-metilciklopropil)metilen]hidrazino]pirido[2,3-b]pirazin-2-ona, produkt Šeme 1, faza E, može da se rastvori u DCM i tretira sa približno 2 ekvivalenta jodosobenzen diacetata (CAS # 3240-34-4) na približno 0 °C do RT. Nakon toga produkt može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su ekstrakcija i hromatografija. Na primer, reaktivna smeša može da se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa DCM. Slojevi mogu da se razdvoje i organski sloj se po redu ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak može da se prečisti hromatografijom na silika gelu, koristeći kao gradijent odgovarajuće smeše rastvarača kao što su EtOAc i heksani, da se dobije jedinjenje Formule I, produkt Šeme I, faza F.

Šema 2

faza D

Formula I

[0027] Šema 2 opisuje alternativnu sintezu jedinjenja Formule I. U Šemi 2, faza A, 1-butil-4H-pirido[2,3-b]pirazin-2,3-dion, produkt Šeme 1, faza C, može da se konvertuje u hloro jedinjenje, kako je dobro poznato u praksi, upotrebom odgovarajućeg sredstva za hlorinaciju, kao što su POCl3, SOCl2, oksalil hlorid, ili PCl5, u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što su DCM ili ACN koji sadrži katalitičku količinu DMF na temperaturi u rasponu od RT do refluksa. Na primer, približno 1 ekvivalent 1-butil-4H-pirido[2,3-b]pirazin-2,3-diona, produkt Šeme 1, faza C, može da se rastvori u ACN koji sadrži DMF i dobijena reaktivna smeša može da se tretira sa približno 3 ekvivalenta tionil hlorida i zagreva približno 3 sata na refluksu. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije produkt Šeme 2, faza A, 1-butil-3-hlor-pirido[2,3-b]pirazin-2-on, pogodan za narednu upotrebu bez naknadnog prečišćavanja.

[0028] U Šemi 2, faza B, izmeštanje hlorida može da se postigne tretiranjem približno 1 ekvivalenta 1-butil-3-hlor- pirido[2,3-b]pirazin-2-ona, produkta Šeme 2, faza A, sa vodenim rastvorom približno 4 ekvivalenta hidrazin monohidrata u polarnom aprotičnom rastvaraču kao što je THF na RT u toku približno 8-24 h. Nakon toga produkt može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su ekstrakcija i azeotropna destilacija. Na primer, reaktivna smeša može da se razblaži sa vodom i filtrira a filter pogača može da se ispere sa pogodnim organskim rastvaračem visoke tačke ključanja kao što su toluen ili MTBE a nastala voda može da se ukloni iz dvofazne smeše jednostavnom azeotropnom destilacijom na rotacionom evaporatoru pod sniženim pritiskom sa odgovarajućim rastvaračem visoke tačke ključanja, kao što je 2-metil-tetrahidrofuran, da se dobije 1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-on, produkt Šeme 2, faza B.

[0029] Acilacija produkta faze B može da se izvrši sa odgovarajućom karboksilnom kiselinom koristeći različite tehnike udvajanja amida dobro poznate u praksi. Na primer, približno I ekvivalent 1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-ona, produkta Šeme 2, faza B, može da se udvoji sa približno 1.5 ekvivalenata 1-etilciklopropankarboksilne kiseline u odgovarajućem organskom rastvaraču, kao što su THF, DMF ili DMSO, koji sadrži približno 1.5 ekvivalenata EDCl i 1.5 ekvivalenata HOBT sa naknadnim dodavanjem približno 3-5 ekvivalenata ne-nukleofilne organske baze kao što su DIPEA ili TEA. Nakon toga produkt može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što je ekstrakcija. Na primer, reaktivna smeša može da se neutrališe sa odgovarajućom mineralnom kiselinom kao što je razblaženi vodeni rastvor HCl i ispere sa odgovarajućim organskim rastvaračem kao što su DCM, EtOAc, MTBE ili Et2O. Slojevi mogu da se razdvoje a dobijeni vodeni sloj može da se zaalkališe do pH ~ 7-8 sa odgovarajućom čvrstom bazom, kao što su K2CO3, NaHCO3ili Na2SO3, a nakon toga ekstrakcijom sa odgovarajućim organskim rastvaračem kao što su DCM, EtOAc ili Et2O. Organski slojevi mogu po redu da se isperu sa vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije N’-(1-butil-2-okso-pirido[2,3-b]pirazin-3-il)-1-metilciklopropankarbohidrazid, produkt Šeme 2, faza C.

[0030] U Šemi 2, faza D, jedinjenje Formule I može da se dobije ciklizacijom pod uslovima zagrevanja ili mikrotalasa, dobro poznatim u praksi. Na primer, približno 1 ekvivalent N’-(1-butil-2-okso-pirido[2,3-b]pirazin-3-il)-1-metil-ciklopropankarbohidrazida može da se zagreva približno 2-12 h pod refluksom u odgovarajućem rastvaraču kao što je heksametildisilazan koji sadrži približno 0.2 ekvivalenta odgovarajuće ne-nukleofilne organske baze kao što je 1,8-diazabiciklo[5.4,0] undek-7-en. Produkt nakon toga može da se izoluje tehnikama dobro poznatim u praksi, kao što su razblaživanje, filtracija, trituracija i hromatografija. Na primer, reaktivna smeša može da se sipa u vodu a dobijeni precipitat može da se sakupi filtracijom, a nakon toga sakupljena čvrsta supstanca podeli između pogodne odgovarajuće smeše organskog rastvarača, kao što je DCM i vode, koji se ne mešaju. Organski sloj može da se odvoji, po redu ispere sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak može da se triturira sa

1

odgovarajućim toplim ili ključajućim organskim rastvaračem, kao što je EtOAc, u toku približno 1 h, a nakon hlađenja dobijena čvrsta supstanca može da se izdvoji filtracijom. Čvrsta supstanca može dalje da se prečisti hromatografijom na silika gelu, koristeći kao gradijent odgovarajuću smešu rastvarača kao što su EtOAc i DCM, da se dobije jedinjenje Formule I, produkt Šeme 2, faza D.

Izrada 1

N-butil-2-nitro-piridin-3-amin

[0031]

[0032] Šema 1, faza A: 3-fluoro-2-nitropiridin (5.0 g, 35.2 mmol) se rastvori u EtOH (30 mL) i smeša ohladi na 0 °C u ledenom kupatilu. U smešu se doda butan-1-amin (7.7 g, 105.6 mmol), smeša ostavi da se zagreje na RT i meša 2 h na RT. Smeša se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa EtOAc. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (6.2 g, 90% prinos) kao žuto ulje, pogodno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 196.1 (M+1).

Alternativni postupak za Izradu 1

[0033] 3-fluoro-2-nitropiridin (92 g, 0.65 mol) se doda u EtOH (552 mL) na ~20-25 °C. Smeša se ohladi na 0 °C u ledenom kupatilu. Dodaje se butan-1-amin (118.4 g, 1.6187 mol) na ~ 0-5 °C u kapima u toku 40 min. Zagreje na ~ 20-25 °C i meša 16 h. U reaktivnu smešu se doda voda (800 mL), ekstrahuje sa EtOAc (2 x 600 mL), slojevi se razdvoje i kombinovani organski slojevi isperu sa vodom (2 x 1L), zasićenim vodenim rastvorom NaCl (2 x 500 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom na 35 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (120.00 g, 95% prinos) kao tamno žuto ulje, pogodno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 196.1 (M+1).

Izrada 2

N3-butilpiridin-2,3-diamin

[0034]

[0035] Šema 1, faza B: 5% Pd/C (3.0 g, 1.4 mmol) se doda u rastvor N-butil-2-nitro-piridin-3-amina (6.0 g, 30.7 mmol) rastvorenog u MeOH (50 mL) u atmosferi N2. Smeša se meša 8 h na RT u balonu H2. Smeša se filtrira kroz ploču diatomejske zemlje, ispere sa MeOH i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (5.0 g, 98% prinos) kao crna čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 166.1 (M+1).

Alternativni postupak za Izradu 2

[0036] N-butil-2-nitro-piridin-3-amin (128.0 g, 0.7 mol) se doda u MeOH (1024 mL) na ~ 20-25 °C. Doda se 5 % ovlaženi Pd/C (64 g, 50% loading) na ~ 20-25 °C. Dobijena smeša se meša pod pritiskom H2od 3 atm na ~ 20-25 °C u toku 3 h. Reaktivna smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju, filter pogača se ispere sa MeOH (5 x 500 mL) i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (101.9 g, 94% prinos) kao crna čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 166.1 (M+1).

Izrada 3

1-butil-4H-pirido[2,3-b]pirazin-2,3-dion

[0037]

[0038] Šema 1, faza C: dietil oksalat (20.1 mL, 148.3 mmol) se doda u smešu N3-butilpiridin-2,3-diamina (4.9 g, 29.65 mmol) u EtOH (30 mL). Smeša se zagreva u zatvorenoj epruveti na 100 °C u toku 14 h. Reaktivna smeša se ohladi na 0 °C i dobijena čvrsta supstanca izdvoji filtriranjem. Čvrsta supstanca se ispere sa Et2O i suši pod vakuumom na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (3.3 g, 51% prinos) kao zeleno obojena čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 219.8 (M+1).

Alternativni postupak za Izradu 3

[0039] N3-butilpiridin-2,3-diamin (81.4g, 0.5 mol) se doda u EtOH (550 mL) na ~ 20-25 °C. U jednoj porciji se doda 30 mt% NaOEt u EtOH (427.4 g, 1.0 mol) na ~ 20-25 °C. Doda se dietil oksalat (87.1g, 0.6 mol) u kapima na ~ 20-30 °C i meša na RT u toku 2.5 h. Reaktivna smeša se sipa u smešu 0.5 M vodenog rastvora HCl/DCM (1600 mL/1200mL) na ~ 0-10 °C uz mešanje. Dva sloja se razdvoje, vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (2 x 800 mL), ispere sa vodom (2 x 1600 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaCl (1600 mL) i suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni čvrsti ostatak se prevede u žitku masu u ACN (200 mL) na ~20-25 °C u toku 30 min i dobijena čvrsta supstanca izdvoji filtriranjem da se dobije naslovljeno jedinjenje (70.0g, 65% prinos) kao zelena čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 220.1 (M+1).

Izrada 4

1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-on

[0040]

1

[0041] Šema 1, faza D: hidrazin monohidrat (3.55 mL, 73.0 mmol) se doda u smešu 1-butil-4H-pirido[2,3-b] pirazin-2,3-diona (3.2 g, 14.6 mmol) u EtOH (20 mL). Smeša se zagreva 14 h u zatvorenoj epruveti na 100 °C. Reaktivna smeša se ohladi na 0 °C i čvrsta supstanca izdvoji filtriranjem. Čvrsta supstanca se ispere sa Et2O i suši pod vakuumom na 45 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.8 g, 82% prinos) kao zeleno obojena čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja.

ES/MS m/z 234.2 (M+1).

Izrada 5

1-butil-3-[2-[(1-metilciklopropil)metilen]hidrazino]pirido[2,3-b]pirazin-2-on

[0042]

[0043] Šema 1, faza E: 1-metilciklopropankarbaldehid (1.15 mL, 13.7 mmol) i AcOH (39.3 µL) se dodaju u smešu 1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-ona (1.6 g, 6.9 mmol) u MeOH (20 mL). Smeša se meša 1 h na RT. Smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom a produkt rekristališe iz heksana (50 mL). Čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem i ispere sa heksanom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.30 g, 63% prinos) kao crna čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 300.2 (M+1).

Izrada 6

1-butil-3-hlor-pirido[2,3-b]pirazin-2-on

[0044]

[0045] Šema 2, faza A: 1-butil-4H-pirido[2,3-b]pirazin-2,3-dion (60.8 g, 0.3 mol) se rastvori u ACN (10 mL/g, 600 mL) na ~ 20-25 °C. Doda se DMF (4.2 mL) i doda se SOCl2(99.0g, 0.8 mol) u jednoj porciji. Dobijena smeša se zagreva 2.5 h pod refluksom na ~ 75-80 °C. Reaktivna smeša se koncentruje do sušenja pod sniženim pritiskom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (93.0g, >99% prinos) kao crna čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 238.1 (M+1).

Izrada 7

1-butil-3-hidrazino-pirido[2,3-b]pirazin-2-on

[0046]

[0047] Šema 2, faza B: THF (900 mL) se na RT doda u 85% (mt/mt%) vodeni rastvor hidrazin monohidrata (48 g.1.5 mol,). Doda se 1-butil-3-hlor-pirido[2,3-b]pirazin-2-on (90.0 g, 0.4 mol) da se formira žitka masa i meša 16 h na RT. U reaktivnu smešu se doda voda (100 mL) i meša 20 min. Filtrira i filter pogača ispere sa vodom (2 x 400 mL) a zatim sa MTBE (2 x 400 mL). Voda se ukloni azeotropiranjem sa 2-metil-THF (3 x 600 mL) pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (50.0g, 75% prinos) kao zelena čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 234.1 (M+1).

1

Izrada 8

N’-(1-butil-2-okso-pirido[2,3-b]pirazin-3-il)-1-metil-ciklopropankarbohidrazid

[0048]

[0049] Šema 2, faza C: 1-metilciklopropankarboksilna kiselina (30.9 g, 0.3 mol) se doda u DMF (350 mL) na RT i smeša ohladi na 0 °C. Na ~ -5-0 °C, doda se EDCl (61.0 g, 0.3 mol) a zatim HOBT (41.75 g, 0.3 mol). Na ~ -10-0 °C, dodaje se TEA (62.47 g, 0.6 mol) u kapima u toku 40 min i dobijena smeša meša 20 min na ~ -5-0 °C. Doda se 1-butil-3- hidrazinopirido[2,3-b]pirazin-2-on (48.0 g, 0.2 mol.) na ~ 0-5 °C u jednoj porciji, zagreje na RT i dobijena žitka masa meša 16 h. Reaktivna smeša se sipa u 0.6 M vodeni rastvor HCl (1600 mL) i ispere sa MTBE (3 x 500 mL); slojevi se razdvoje, MTBE sloj se odbaci i u vodeni sloj doda DCM (1000 mL). pH se podesi na ~ 7-8 sa čvrstim NaHCO3(140 g), slojevi se razdvoje, vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (3 x 600 mL) i kombinovani organski slojevi isperu po redu sa vodom (3 x 1000 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (2 x 1000 mL). Upare se pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (45.0 g, 69% prinos) kao crna čvrsta supstanca, pogodna za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS m/z 316.2 (M+1).

Primer 1

5-butil-9-(1-metilciklopropil)pirido[3,2-e][1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-6(5H)-on

[0050]

1

[0051] Šema 1, faza F: 1-butil-3-[2-[(1-metilciklopropil)metilen]-hidrazino]pirido[2,3-b]pirazin-2-on (1.3 g, 4.3 mmol) se doda u DCM (15 mL) i rastvor ohladi na 0 °C u ledenom kupatilu. U rastvor se doda jodobenzen diacetat (2.9 g, 8.7 mmol) i smeša meša 1 h na RT. Reaktivna smeša se neutrališe sa vodom i ekstrahuje sa DCM. Organski sloj se ispere sa zasićenim rastvorom NaHCO3, suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom a dobijeni ostatak prečisti hromatografijom na silika gelu, uz eluiranje sa smešom EtOAc:heksani (3:1), da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.1 g, 85% prinos) kao beličasta čvrsta supstanca. ES/MS m/z 298.2 (M+1).

Alternativni postupak za Primer 1

[0052] Šema 2. faza D: N’-(1-butil-2-okso-pirido[2,3-b]pirazin-3-il)-1-metilciklopropankarbohidrazid (45.0 g, 0.1 mol) se prevede u žitku masu u HMDS (360 mL) na RT. Doda se DBU (4.34 g, 28.5 mmol) i zagreje na 125 °C. Dobijeni rastvor se meša 6 h pod refluksom. Reaktivna smeša se ohladi na RT, smeša sipa u vodu (800 mL), filtrira i dobijena čvrsta supstanca se sakupi. Čvrsta supstanca se rastvori u DCM (400 mL) / H2O (100 mL), dobijeni slojevi razdvoje i organska faza ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL), suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak. Triturira se 1 h sa EtOAc (200 mL) na 40-50 °C i dobijena čvrsta supstanca izdvoji (22.0 g, 98% čistoće kako se utvrdi sa LCMS) filtriranjem. Kombinuje se 22.0 g serija sa drugom serijom materijala (10.0 g, 100% čistoće kako se utvrdi sa LCMS) i dalje prečisti hromatografijom preko silika gela, eluira sa smešom DCM:EtOAc (1:1), da se nakon uparavanja rastvarača dobije ostatak. Dobijeni ostatak se triturira sa vrućim EtOAc u toku 30 min i dobijena čvrsta supstanca izdvoji filtriranjem da se dobije naslovljeno jedinjenje (25.70 g. 42% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS m/z 298.2 (M+1).

Generisanje PDE proteina

1

[0053] Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE1A (NP_001003683.1), PDE1C (NP_005011.1), PDE5A (NP_001074.2), PDE7B (NP_061818.1) i PDE9A (NP_002597.1) su umetnute u pFastBac1 (Invitrogen) vektor sa N terminusom HIS repića. Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE4D (NP_006194.2) i katalitički domen (ostatak 641-1141) PDE3A (NP_000912.3) su umetnute u pFastBac 1 (Invitrogen) vektor sa C terminusom HIS repića. Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE8A (NP_002596.1) i PDE11A (AAI12394.1) su umetnute u pFastBac1 (Invitrogen) vektor sa N terminusom Flag repića. Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE10A (AAD32595.1) su umetnute u pFastBac1 (Invitrogen) vektor sa C terminusom Flag-His repića. Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE6A (NP_000431.2) i PDE6B (AAH00249.1) su umetnute u pFastBacDual (Invitrogen) vektor sa N-terminusom HIS repića i N-terminusom Flag repića, tim redom, za produkciju PDE6A/6B dimera. Generisanje bakulovirusa i ekspresija proteina u Sf9 ćelijama se izvodi u skladu sa protokolom za Bac-to-Bac Baculovirus sistem ekspresije (Invitrogen). Sekvence nukleotida koje enkodiraju celu dužinu humane PDE1B (NP_000915.1) i PDE2A (NP_002590.1) su umetnute u pIEX4 (Novagen) sa C-terminusom HIS repića a produkcija oba proteina u Sf9 ćelijama se izvodi u skladu sa protokolom dobavljača (Novagen). PDE proteini sa His repićima se prečiste pomoću Ni-NTA agaroze (Qiagen) a nakon toga hromatografijom izdvajanja po veličini na SUPERDEX® 200 koloni (GE Healthcare) u puferu za čuvanje (20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerol). PDE proteini sa Flag repićima, uključujući PDE6A/6B, se prečiste pomoću anti-Flag M2-agaroze (Sigma), nakon prečišćavanja hromatografijom kroz NiNTA kolonu uz eluiranje sa puferom za čuvanje (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 10% Glicerol 0.1 mg/ml Flag peptid). Svi prečišćeni proteini se čuvaju na -80°C u malim alikvotama.

Ispitivanje enzima fosfodiesteraze

[0054] Sve aktivnosti enzima 3’, 5’ ciklične nukleotid fosfodiesteraze (PDE) se mere radiometrijskim ispitivanjem enzima zasnovanom na sistemu detekcije SPA (test blizine scintilacije). Jedinjenja koja se testiraju se razblaže u čistom dimetil sulfoksidu (DMSO) koristeći deset tačaka koncentracije za krive odgovora. Maksimalna koncentracija jedinjenja u reaktivnoj smeši je ili 10 ili 100 µM. Jedinjenja odgovarajuće koncentracije se preinkubiraju

1

ili sa PDE enzimima u toku 30 minuta pre početka reakcije dodavanjem supstrata. Reakcije se ostave da teku 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, reakcije se prekidaju dodavanjem SPA perlica. Uzorci se očitavaju 12 sati kasnije u MICROBETA™ TRILUX® brojaču. "IC50" označava koncentraciju jedinjenja koja produkuje 50% maksimalno mogućeg inhibitornog odgovora za to jedinjenje. IC50vrednosti se izračunavaju nanošenjem normalizovanih rezultata u odnosu na log [jedinjenje] i unošenjem rezultata koristeći četvoroparametarsku logističku jednačinu.

Ispitivanje Ca<2+>-kalmodulin zavisnih PDE enzima

[0055] PDE1B, PDE1A i PDE1C se kloniraju i prečiste po standardnim procedurama za generisanje proteina. Izradi se pufer za analizu da se dobije finalna koncentracija u analizi od 50 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 4 mM CaCl2, 0.1% albumina seruma govečeta i 6 U/ml kalmodulina u vodi, pri pH 7.5. Finalna koncentracija enzima je 0.25, 0.074 i 0.0012 nM, za PDE1A, PDE1B i PDE1C, tim redom. Reakcije se započinju dodavanjem supstrata, [3H] cAMP, da se dobije finalna koncentracija od 47 nM.

Tabela 1: In vitro potencija Primera 1 na humani PDE1A, PDE1B i PDE1C.

[0056] Rezultati u Tabeli 1 pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira aktivnost humanih PDE1A, PDE1B i PDE1C enzima in vitro.

Ispitivanje PDE enzima koristeći [3H]cAMP kao supstrat

[0057] Aktivnosti niže datih fosfodiesteraza se mere korišćenjem [3H]cAMP kao reaktivnog supstrata: humana PDE3A (katalitički domen), humana PDE4D, humana PDE7B i humana PDE8A. Svi ovi enzimi su klonirani i prečišćeni po standardnim procedurama. Izradi se pufer za analizu da se dobije finalna koncentracija u analizi od 50 mM Tris-HCl, 8.3 mM MgCl2, 1.7 mM etilendiamintetraacetna kiselina (EDTA) i 0.1% albumin seruma goverčeta pri pH

1

7.5. Finalne koncentracije enzima su 0.008, 0.021, 0.5 i 0.06 nM za PDE3A, PDE4D, PDE7B i PDE8A, tim redom. Reakcije se započinju dodavanjem supstrata, [3H]cAMP, da se dobije finalna koncentracija od 47 nM.

Tabela 2: In vitro potencija Primera 1 za humane PDE3A (katalitički domen), PDE4D, PDE7B i PDE8A.

Ispitivanje PDE enzima koristeći kao supstrat [3H]cGMP

[0058] Aktivnosti narednih fosfodiesteraza se mere korišćenjem [3H]cGMP kao reaktivnog supstrata: humana PDE2A, humana PDE5A, humana PDE6A/6B, humana PDE9A, humana PDE10A i humana PDE11A. Katalitički aktivni oblik humane PDE6 je dimer sastavljen od α (humana PDE6A) i β podjedinica (humana PDE6B). Dimer humane PDE6A/6B se produkuje postupkom ekspresije i prečišćavanja, korišćenjem dve faze prečišćavanja, to jest, NiNTA i anti-FLAG Sepharose hromatografije. Ostatak enzima se klonira i prečisti na licu mesta po standardnim procedurama. Izradi se pufer za analizu da se dobije finalna koncentracija u analizi od 50 mM Tris-HCl, 8.3 mM MgCl2, 1.7 mM EDTA i 0.1 % albumin seruma govečeta na pH 7.5. Finalne koncentracije enzima su 0.2, 0.002, 5, 1, 0.03 i 0.03 nM za humanu PDE2A, humanu PDE5A, humanu PDE6AB, humanu PDE9A, humanu PDE10A i humanu PDE11A, tim redom. Reakcije se započinju dodavanjem supstrata, [3H]cGMP, da se dobije finalna koncentracija od 80 nM u slučaju analiza humane PDE2A, humane PDE10A, humane PDE5A, humane PDE6AB i humane PDE11A, dok se za humanu PDE9A koristi 20 nM [3H]cGMP.

2

Tabela 3: In vitro potencija Primera 1 za PDE2A, PDE5A, PDE6AB, PDE9A, PDE10A i PDE11A.

[0059] Rezultati u Tabelama 1, 2 i 3 pokazuju da je jedinjenje iz Primera 1 selektivni inhibitor humane PDE1A, PDE1B i PDE1C u odnosu na humane PDE2A, PDE3A, PDE4D, PDE5A, PDE6AB, PDE7B, PDE8A, PDE9A, PDE10A i PDE11A in vitro.

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:
2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to:
3. 3. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
4. 4. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu hronične bolesti bubrega.
5. 5. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu dijabetične bolesti bubrega.
6. 6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u skladu sa patentnim zahtevom 1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga.
7. 7. Proces za izradu farmaceutske kompozicije, naznačen time što uključuje mešanje jedinjenja u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga.
8. 8. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu hronične bolesti bubrega.
9. 9. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu dijabetične bolesti bubrega.
10. 10. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5