[go: up one dir, main page]

RS60434B1 - Proizvodi i postupci za tretman amiotrofične lateralne skleroze - Google Patents

Proizvodi i postupci za tretman amiotrofične lateralne skleroze

Info

Publication number
RS60434B1
RS60434B1 RS20200638A RSP20200638A RS60434B1 RS 60434 B1 RS60434 B1 RS 60434B1 RS 20200638 A RS20200638 A RS 20200638A RS P20200638 A RSP20200638 A RS P20200638A RS 60434 B1 RS60434 B1 RS 60434B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sod1
shrna
aav
aav9
mice
Prior art date
Application number
RS20200638A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian K Kaspar
Kevin Foust
Don W Cleveland
Original Assignee
Res Institute At Nationwide Children's Hospital
Ludwig Inst For Cancer Res Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Institute At Nationwide Children's Hospital, Ludwig Inst For Cancer Res Ltd filed Critical Res Institute At Nationwide Children's Hospital
Publication of RS60434B1 publication Critical patent/RS60434B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Izjava o interesu države
[0001] Predmetni pronalazak je napravljen uz podršku države SAD Nacionalnih instituta za zdravstvo R21-NS067238, NS027036, ROI NS064492 i RC2 NS69476-01. Vlada ima izvesna prava na pronalasku.
Materijal dostavljen elektronskim putem
[0002] Računarski čitljiv spisak nukleotidnih/aminokiselinskih sekvenci se podnosi istovremeno i identifikuje na naredni način: 14.350 bajta velika ACII (tekstualna) datoteka pod nazivom „47886PCT_SeqListing.txt“, kreirana 26. avgusta 2014.
Oblast pronalaska
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na RNK-bazirane postupke za inhibiranje eksprimiranja gena superoksid dismutaze 1 (SOD-1). Rekombinantni adeno-povezani virusi pronalaska isporučuju RNK-kodirajuće DNK koje obaraju eksprimiranje SOD-1. Postupci imaju primenu u tretmanu amiotrofične lateralne skleroze (ALS).
Stanje tehnike
[0004] ALS je brzo progresivna i fatalna neurodegenerativna bolest odraslih osoba, koju karakteriše selektivna degeneracija i gornjih i donjih motornih neurona. Prvi ju je okarakterisao Šarko 1869. godine, i ALS je odgovorna za jedan od 2000 smrtnih slučajeva, i pogađa gotovo 5 od 100,000 pojedinaca. ALS nastaje kada se degenerišu specifične nervne ćelije u mozgu i kičmenoj moždini koje kontrolišu dobrovoljno kretanje. U roku od dve do pet godina nakon kliničkog početka, gubitak ovih motoričkih neurona dovodi do progresivne atrofije skeletnih mišića, što rezultuje gubitkom mišićne funkcije što rezultuje paralizom, deficitom govora i smrću usled zatajenja disanja.
[0005] Većina ALS slučajeva nema jasnu genetsku povezanost i nazivaju se sporadični, ali u 10% slučajeva bolest je porodična sa dominantnim nasleđivanjem. Dvadeset odsto porodičnih slučajeva uzrokovano je mutacijama enzima superoksid dismutaze 1 (SOD1), i do sada je identifikovano preko 140 različitih mutacija<1, 2>. Mnogi napori da se identifikuje kako mutacije menjaju funkciju SOD1 proizveli su konsenzusno mišljenje da SOD1 mutanti stiču jednu ili više toksičnosti, čija priroda i dalje ostaje kontroverzna<3>, ali postoje jasni dokazi da je deo mutiranog SOD1 pogrešno savijen i zatim agregiran<4,5>. SOD1 agregati su u stvari jedna od histoloških karakteristika ALS slučajeva povezanih sa SOD1<4>.
[0006] U poslednjih 20 godina generisano je više životinjskih modela koji eksprimiranju mutirane oblike ljudskog SOD1. Ovi modeli rekapituliraju obeležje ALS, razvijajući degeneraciju motornih aksona zavisnu od uzrasta i prateću denervaciju mišića, glijalnu upalu i prateći gubitak motornog neurona. Eksperimenti selektivne ekscizije gena utvrdili su da eksprimiranje mutiranog SOD1 unutar samih motornih neurona doprinosi nastanku bolesti i ranom napredovanju bolesti<6>, kao što to čini i sinteza mutanta u NG2<+>ćelijama<7>koji su prekursori oligodendrocita. Međutim, eksprimiranje mutiranog SOD1 proteina u mikroglijama i astrocitima značajno pokreće brz napredak bolesti<6, 8,>što su nalazi koji su doveli do zaključka da je patofiziologija ALS nećelijska autonomna<3>.
[0007] Dalje, otkriveno je da su astrociti toksični za motorne neurone u više in vitro modela u kojima su mutirani oblici ljudskog SOD1 bili prekomerno eksprimirani<9-11>. Nedavno istraživanje dobilo je astrocite iz post-mortem kičmene moždine ALS pacijenata sa ili bez SOD1 mutacija. U svim slučajevima, astrociti sporadičnih ALS pacijenata bili su toksični za motorne neurone kao astrociti koji nose genetske mutacije kod SOD1<12>. Još upečatljivije, smanjenje SOD1 u astrocitima dobijenim od sporadičnih i porodičnih ALS pacijenata smanjilo je toksičnost dobijenu astrocitima i koja je selektivna za motorne, ali ne i GABA, neurone. Ovaj značajan nalaz, zajedno sa izveštajima da se pogrešno savijanje SOD1 uključenja nalazi u kičmeni kičmi porodičnih, kao i nekih sporadičnih ALS pacijenata<13,14, 15>, pružio je snažne dokaze za patogenu ulogu divljeg tipa SOD1 kod sporadične ALS.
[0008] Uprkos uvidima da su životinjski modeli koji eksprimiraju mutante omogućili razumevanje mehanizama koji su uključeni u degeneraciju motoričkih neurona, njihova korisnost za razvoj terapijskih pristupa je dovedena u pitanje<16>, jer nijedan lek koji ima prijavljenu korist za preživljavanje kod mutatntnih SOD1<G93A>miševa nije bio efikasan u kliničkim ispitivanjima sa sporadičnim ALS pacijentima. U svim osim u jednom slučaju, prijavljeno je da lekovi koji su uzeti na ljudskim ispitivanjima produžavaju preživljavanje mutantnih SOD1 miševa samo kada se primenjuju presimptomatski, a čak i tada pružaju korist za preživljavanje isključivo odlaganjem početka bolesti, bez koristi u usporavanju napredovanja bolesti. Jedini izuzetak od ovoga bio je riluzol, koji je poput ljudske situacije skromno produžio preživljavanje mutantnih SOD1<G93A>miševa, i to je učinio usporavanjem napredovanja bolesti<17>. Shvatajući da će uspeh ispitivanja na ljudima zahtevati usporavanje napredovanja bolesti, mutantni SOD1 miševi savršeno su predviđali uspeh riluzola i neuspeh efikasnosti svih drugih lekova sa kojima su pokušana ispitivanja na ljudima. Ono što nedostaje su dodatne terapije koje utiču na napredovanje bolesti kod ovih miševa.
[0009] Stoga je riluzol jedini lek koji trenutno odobren od strane FDA kao terapija za ALS, pružajući skromnu korist za preživljavanje<21>. Za 20% porodičnih slučajeva uzrokovanih mutacijom SOD1, pokušaji poboljšanja terapije smanjenjem sinteze SOD1 bili su fokus više terapijskih razvojnih pristupa. Antisens oligonukleotidi i virusne interferencije RNK (RNKi) testirani su na pacovskim<22>i mišjim<23-25>modelima koje razvijaju fatalnu paralizu prekomernog eksprimiranja ljudskog SOD1<G93A>. Antisens oligonukleotidi infuzirani na početku bolesti doveli su do smanjenja SOD1 i umerenog usporavanja napredovanja bolesti<22>. Direktna infuzija CSF antisens oligonukleotida testirana je klinički<26>, što dovodi do ohrabrujućih rezultata u smislu podnošljivosti i sigurnosti, ali bez značajnog smanjenja nivoa SOD1 pri korišćenim malim dozama. U svakom od prethodnih ispitivanja virusa<23-25>, obaranje SOD1 je postignuto pre pojave bolesti direktnom injekcijom u nervni sistem ili korišćenjem aksonalnog retrogradnog transporta kada je virus p intramuskularnom injekcijom<23, 24>. Ove studije dovele su do različitih stepena uspeha u produženju preživljavanja ili poboljšanju motoričkih performansi, u zavisnosti od vremena tretmana kao i nivoa obaranja SOD1 koji je postignut u kičmenoj moždini. Iako su ove studije pružile važan dokaz principa, pristupi nisu mogli lako da se prevedu u kliničke strategije. Zapravo, postoje kontroverzni izveštaji koji se tiču ovih početnih studija supresije SOD1 posredovanih virusima<23, 24, 27-29>.
[0010] Adeno-povezani virusni (AAV) vektori su korišćeni u brojnim nedavnim kliničkim ispitivanjima za tretman neuroloških poremećaja [Kaplitt i dr., Lancet 369: 2097-2105 (2007); Marks i dr., Lancet Neurol 7: 400-408 (2008); Worgall i dr., Hum Gene Ther (2008)].
[0011] AAV je parvovirus sa nedostatkom replikacije, čiji je jednolančani DNK genom dug oko 4,7 kb, uključujući 145 nukleotidno invertovano terminalno ponavljanje (ITR). Nukleotidna sekvenca genoma AAV serotipa 2 (AAV2) je prikazana kod Srivastava i dr., J Virol, 45: 555-564 (1983), i ispravljeno od strane Ruffing i dr., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Sekvence koje deluju na Cis koje usmeravaju replikaciju virusne DNK (rep), enkapsiduciju/pakovanje i integraciju hromozoma ćelije domaćina sadržane su u ITR. Tri AAV promotera (nazvani p5, p19 i p40 zbog svojih relativnih lokacija mapa) pokreću eksprimiranje dva AAV unutrašnja otvorena okvira za čitanje koji kodiraju rep i cap gene. Dva rep promotera (p5 i p19), zajedno sa diferencijalnim spajanjem pojedinačnog AAV introna (na nukleotidima 2107 i 2227), rezultuju proizvodnjom četiri rep proteina (rep 78, rep 68, rep 52, i rep 40) iz rep gena. Rep proteini poseduju više enzimskih svojstava koja su na kraju odgovorna za umnožavanje virusnog genoma. Kap gen se eksprimira iz p40 promotera i kodira tri kapsidna proteina VP1, VP2 i VP3. Alternativno spajanje i nekonsenzusna mesta početka translacije su odgovorna za proizvodnju tri povezana proteina kapsida. Jedno mesto konsenzusne poliadenilacije nalazi se na položaju mape 95 od AAV genoma. Životni ciklus i AAV genetika su pregledani kod Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
[0012] AAV poseduje jedinstvene karakteristike koje ga čine atraktivnim kao vektor za isporuku stranih DNK u ćelije, na primer, u genskoj terapiji. AAV infekcija ćelija u kulturi je necitopatska, i prirodna infekcija ljudi i drugih životinja je tiha i asimptomatska. Štaviše, AAV inficira mnoge sisarske ćelije što omogućava mogućnost ciljanja mnogih različitih tkiva in vivo. Štaviše, AAV transducira ćelije koje se polako dele i ćelije koje ne ne dele, i može uporno da opstaje tokom celog životnog veka tih ćelija kao transkripcioni aktivni nuklearni epizom (ekstrahromozomalni element). AAV provirusni genom je zarazan kao klonirana DNK u plazmidima što čini izgradnju rekombinantnih genoma izvodljivim. Dalje, zbog signala koji usmeravaju AAV replikaciju, enkapsidacija i integracija genoma su sadržani unutar ITR od AAV genoma, neki ili svi od unutrašnjih približno 4,3 kb genoma (koji kodiraju replikaciju i strukturni kapsidni protein, rep-cap) mogu biti zamenjeni sa stranom DNK, kao što je genska kaseta koja sadrži promoter, DNK od interesa i signal poliadenilacije. Mogu se dobiti rep i cap proteini in trans. Druga značajna karakteristika AAV je da je to izuzetno stabilan i srčan virus. Lako podnosi uslove korišćene za inaktiviranje adenovirusa (56°do 65°C tokom nekoliko sati), što čini da hladna očuvanost AAV bude manje kritična. AAV se čak može i liofilizovati. Konačno, ćelije inficirane sa AAV nisu otporne na superinfekciju.
[0013] Postoji više AAV serotipova, i nude raznovrstan tropsizam tkiva. Poznati serotipovi uključuju, na primer, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 i AAVrh74. Napredak u isporuci AAV6 i AAV8 omogućio je transdukciju skeletnog i srčanog mišića ovim serotipovima nakon jednostavnih sistemskih intravenskih ili intraperitonealnih injekcija. Pogledati Pacak i dr., Circ. Res., 99(4): 3-9 (1006) and Wang i dr, Nature Biotech., 23(3): 321-8 (2005). Upotreba AAV za ciljanje tipova ćelija u centralnom nervnom sistemu uključivala je hiruršku intraparenhimsku injekciju. Pogledati, Kaplitt et ah, supra; Marks et ah, supra i Worgall i dr., supra. Što se tiče upotrebe AAV za ciljanje ćelijskih vrsta u nervnom sistemu, pogledati Međunarodnu publikaciju br. WO 2010/071832. Međunarodne publikacije br. WO 2009/043936 i WO 2009/013290 navode da se odnose na isporuku gena u centralni nervni sistem. Međunarodna publikacija br. WO 2011/133890 navodi da se odnosi na rekombinantne adeno-povezane viruse korisne za ciljanje transgena na tkivo centralnog nervnog sistema.
[0014] Ding H i dr: „Selective silencing by RNAi of dominant allele that causes amyotrophic lateral sclerosis“, AGING CELL, BLACKWELL PUBLISHING, GB, vol. 2, 1. januar 2003 (2003-01-01), strane 209-217 identifikuje siRNK i shRNK sekvencu koja može selektivno da reguliše eksprimiranje mutiranog SOD1, ali ne i divljeg tipa.
[0015] Zbog toga u nauci ostaje potreba za postupcima i materijalima za tretman ALS.
Sažetak
[0016] U prvom aspektu predmetnog pronalaska pružen je rekombinantni adeno-povezani virus koji sadrži superoksid dismutazu 1 (SOD1) shRNK-kodirajuću DNK CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO:4), gde genomu rekombinantnog adeno-povezanog virusa nedostaju rep i cap geni.
[0017] U narednom aspektu predmetnog pronalaska pružen je i rekombinantni adeno-povezani virus predmetnog pronalaska za upotrebu u terapiji.
[0018] U narednom aspektu predmetnog pronalaska pružen je rekombinantni adeno-povezani virus predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu amiotrofične lateralne skleroze (ALS).
[0019] U narednom aspektu predmetnog pronalaska, pružen je sastav koji sadrži rekombinantni adenopovezani virus predmetnog pronalaska
[0020] Predmetni pronalazak pruža proizvode i njihovu upotrebu u postupcima korisnim za smanjenje nivoa proteina mutiranog SODI kod pacijenata koji imaju potrebu za tim. Pronalazak pruža AAV-posredovanu isporuku RNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na RNK kratke ukosnice, kako bi se smanjila sinteza ljudskih SODI mutanata koji uzrokuju ALS kod pacijenata kojima je to potrebno. Rekombinantni AAV (rAAV) koji se predviđaju pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, rAAV9, rAAV2 i rAAVrh74. Putevi isporuke predviđeni ovim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, sistemsku isporuku i intratekalnu isporuku. Upotreba proizvoda predmetnog pronalaska je naznačena, na primer, u tretmanu ALS.
[0021] U jednom aspektu, pronalazak pruža rAAV genome koji sadrže jedan ili više AAV ITR-ova koji okružuju polinukleotid koji kodira jednu ili više RNK (uključujući, ali ne ograničavajući se na, male RNK ukosnice, antisens RNK i/ili mikroRNK) koji ciljaju mutirane SODI polinukleotide. Primeri opisuju upotrebu primernih rAAV koji kodiraju male RNK ukosnice (shRNK). U rAAV genomima, polnukleotid koji kodira shRNK operativno je povezan sa transkripcionom kontrolnom DNK, tačnije promoterskom DNK koja je funkcionalna u ciljanim ćelijama. Komercijalni dobavljači kao što su Ambion Inc. (Austin, TX), Darmacon Inc. (Lafaiette, CO), InvivoGen (San Diego, CA) i Molecular Research Laboratories, LLC (Herndon, VA) generišu prilagođene inhibitorne RNK molekule. Pored toga, dostupni su komercijalni kompleti za proizvodnju prilagođenih siRNK molekula, kao što je SILENCER™ siRNK Construction Kit (Ambion Inc., Austin, TX) ili psiRNA System (InvivoGen, San Diego, CA). U otelotvorenju predmetnog pronalaska, rAAV genom sadrži DNK koja kodira SOD1 shRNK kao što je navedeno u SEQ ID NO:4 u nastavku. Predmetna prijava takođe obelodanjuje genom rAAV koji obuhvata DNK koja kodira SOD1 shRNK, kao što je navedeno u sekvencama u nastavku:
GCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAA (SEQ ID NO:I), GAAGCATTAAAGGACTGACTGAA (SEQ ID NO:2),
CTGACTGAAGGCCTGCATGGATT (SEQ ID NO:3),
CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO:4) (ovde je „shRNK 130“ ili „SODI shRNK“), GCATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 5),
GGTCTGGCCTATAAAGTAGTC (SEQ ID NO:6),
GGGCATCATCAATTTCGAGCA (SEQ ID NO:7),
GCATCATCAATTTCGAGCAGA (SEQ ID NO:8),
GCCTGCATGGATTCCATGTTC (SEQ ID NO:9),
GGAGGTCTGGCCTATAAAGTA (SEQ ID NO: 10),
GATTCCATGTTCATGAGTTTG (SEQ ID NO: 11),
GGAGATAATACAGCAGGCTGT (SEQ ID NO: 12),
GCTTTAAAGTACCTGTAGTGA (SEQ ID NO: 13),
GCATTAAAGGACTGACTGAAG (SEQ ID NO: 14),
TCATCAATTTCGAGCAGAA (SEQ ID NO:15),
TCGAGCAGAAGGAAAGTAA (SEQ ID NO:16),
GCCTGCATGGATTCCATGT (SEQ ID NO:17),
TCACTCTCAGGAGACCATT (SEQ ID NO:18), ili
GCTTTAAAGTACCTGTAGT (SEQ ID NO:19).
[0022] rAAV genomi predmetnog pronalaska nemaju AAV rep i cap DNK. AAV DNK u rAAV genomima (npr., ITR) mogu biti iz bilo kog AAV serotipa za koji može da se dobije rekombinantni virus, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 i AAV-11. Nukleotidne sekvence genoma AAV serotipa su poznate u struci. Na primer, potpuni AAV-1 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. NC_002077; potpuni AAV-2 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. NC_001401 i Srivastava i dr., J. Virol., 45: 555-564 {1983); potpuni AAV-3 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. NC_1829; potpuni AAV-4 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. NC_001829; AAV-5 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. AF085716; potpuni AAV-6 genom je pružen pod GenBank pristupnim br. NC_001862; najmanje delovi AAV-7 i AAV-8 genoma su pruženi pd GenBank pristupnim brx AX753246 i AX753249, respektivno; AAV-9 genom je pružen kod Gao i dr, J. Virol, 78: 6381-6388 (2004); AAV-10 genom je pružen kod Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); i AAV-11 genom je pružen u Virology, 330(2): 375-383 (2004). AAVrh74 genom je pružen u Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/078316.
[0023] U drugom aspektu, pronalazak pruža DNK plazmide koji sadrže rAAV genome pronalaska. DNK plazmidi se prenose u ćelije kojima je dozvoljena infekcija helper virusom AAV (npr. adenovirusom, adenovirusom sa EI brisanjem ili herpesvirusom) radi stavljanja rAAV genoma u infektivne virusne čestice. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima AAV genom pakuje, rep i cap geni i funkcije helper virusa su pruženi ćeliji u standardnom stanju tehnike. Proizvodnja rAAV zahteva da naredne komponente budu prisutne u jednoj ćeliji (koja je ovde označena kao ćelija za pakovanje): rAAV genom, AAV rep i cap gen odvojeni od (tj. ne uključeni u) rAAV genoma i funkcije helper virusa. AAV rep i cap geni mogu biti od bilo kog AAV serotipa za koji se može izvesti rekombinantni virus i mogu biti iz različitog AAV serotipa od ITR od rAAV genoma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 i AAV-11. Proizvodnja pseudotipizovanih RAAV obelodanjena je u, na primer, WO 01/83692 koji je ovde u celosti uključena referencom. U različitim otelotvorenjima, AAV kapsidni proteini mogu biti modifikovani tako da poboljšaju isporuku rekombinantnog vektora.
Modifikacije kapsidnih proteina su opšte poznate u struci. Pogledati, na primer, US 20050053922 i US 20090202490.
[0024] Postupak generisanja ćelije za pakovanje je stvaranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira sve potrebne komponente za proizvodnju AAV čestica. Na primer, plazmid (ili više plazmida) koji sadrži rAAV genom kom nedostaju AAV rep i cap geni, AAV rep i cap geni odvojeni od rAAV genoma, i selektabilni marker, kao što je gen neomicinske rezistentnosti, integrisani su u genom ćelije. AAV genomi su uvedeni u bakterijske plazmide postupcima kao što su GC tailing (Samulski i dr., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), dodavanje sintetičkih veznika koji sadrže mesta razdvajanja restrikcione endonukleza (Laughlin i dr., 1983, Gene, 23:65-73) ili direktnim, tupim ligacijama (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). Ćelijska linija za pakovanje je zatim zaraženke helper virusom, kao što je adenovirus. Prednosti ovog postupka su u tome što se ćelije mogu birati i pogodne su za proizvodnju rAAV u velikoj razmeri. Ostali primeri pogodnih postupaka koriste adenovirus ili bakulovirus umesto plazmida za uvođenje rAAV genoma i/ili rep i cap gena u ćelije za pakovanje.
[0025] Opšti principi proizvodnje rAAV razmatrani su, na primer, kod Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, i Immunol., 158:97-129).Različiti pristupi su opisani kod Ratschin i dr., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin i dr., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin i dr., J. Virol., 62: 1963 (1988); i Lebkowski i dr., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski i dr. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); SAD patentu br. 5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajućem SAD patentu br. 5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin i dr. (1995) Vaccine 13: 1244-1250; Paul i dr. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark i dr. (1996) Gene Therapy 3: 1124-1132; SAD patentu br. 5,786,211; SAD patentu br. 5,871,982; i SAD patentu br. 6,258,595. Posebno se razmatra jednolančani rAAV.
[0026] Obelodanjenje na taj način pruža ćelije za pakovanje koje proizvode zarazne rAAV. U jednom otelotvorenju ćelije za pakovanje mogu biti stabilno transformisane ćelije raka poput HeLa ćelija, 293 ćelija i PerC.6 ćelija (kognatna 293 linija). U drugom otelotvorenju, ćelije za pakovanje su ćelije koje nisu transformisane ćelije raka, kao što su 293 ćelije sa niskim prolazom (ćelije bubrega ljudskog fetusa transformisane sa EI od adenovirusa), MRC-5 ćelije (ljudski fetalni fibroblasti), WI-38 ćelije (ljudski fetalni fibroblasti), Vero ćelije (majmunske ćelije bubrega) i FRhL-2 ćelije(fetalne ćelije pluća rezus majmuna).
[0027] U još jednom aspektu, pronalazak pruža rAAV (tj. infektivno zatvorene rAAV čestice) koji sadrži rAAV genom predmetnog pronalaska. U nekim otelotvorenjima, rAAV genom je samo-komplementarni genom. Genomima od rAAV nedostaje AAV rep i cap DNK, to jest ne postoji AAV rep ili cap DNK između ITR gena. Otelotvorenja uključuju, ali nisu ograničena na, primerene rAAV koji uključuju genom koji kodira SOD1 shRNK nazvan „AAV-SOD1-shRNK.“ Sekvenca koja uključuje AAV-SOD1-shRNK genom je navedena u nastavku kao invertovana sekvenca iz plazmida koji se koristi u proizvodnji.
[0028] SOD shRNK nukleotidi 901-965 sadrže čitavu sekvencu ukosnice, uključujući sens i antisens krake, matičnu petlju i terminacionu sekvencu. Sekvenca u prednjoj orijentaciji (sa podvučenim ciljanim nizovima protiv SOD1) je:
[0029] rAAV pronalaska se može prečistiti standardnim postupcima, poput kolonske hromatografije ili gradijenata cezijum hlorida. Postupci za prečišćavanje rAAV vektora od helper virusa su poznati u struci i uključuju postupke obelodanjene kod, na primer, Clark i dr, Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp u Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); SAD patent br.6,566,118 i WO 98/09657.
[0030] U drugom aspektu, pronalazak razmatra smeše koje sadrže rAAV predmetnog pronalaska. Sastavi predmetnog pronalaska sadrže rAAV u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Sastavi mogu takođe da sadrže i druge sastojke, poput razređivača i adjuvansa. Prihvatljivi nosači, razblaživači i adjuvansi nisu toksični za primaoce i poželjno su inertni u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat ili druge organske kiseline; antioksidanse poput askorbinske kiseline; polipeptide male molekulske težine; proteine, kao što su albuminski serum, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorske agense kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; kontrajoni koji stvaraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, pluronici ili polietilen glikol (PEG).
[0031] Titri rAAV koji će se primeniti u upotrebi predmetnog pronalaska će varirati, na primer, od određenog rAAV, načina primene, cilja tretmana, pojedinca i vrste ćelija koje se ciljaju, i mogu se odrediti prema standardnim postupcima u struci. Titri rAAV mogu varirati od oko 1x10<2>, oko 1x10<3>, oko 1x10<4>, oko 1x10<5>, oko 1x10<6>, oko 1x10<7>, oko 1x10<8>, oko 1x10<9>, oko 1x10<10>, oko IxIO<11>, oko 1x10<12>, oko 1x10<13>do oko 1x10<14>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg). Doze mogu takođe da se razlikuju u zavisnosti od vremena primene čoveku. Ove rAAV doze mogu varirati 1x10<4>, oko 1x10<5>, oko 1x10<6>, oko 1x10<7>, oko 1x10<8>, oko 1Ix10<9>, oko 1Ix10<10>, oko 1x10<11>, oko 1x10<12>, oko 1x10<13>, oko 1x10<14>, oko 1x10<15>, oko 1xI10<16>ili više virusnih genoma po kilogramu telesne težine kod odrasle osobe. Za novorođenčad, rAAV doze mogu biti u rasponu od oko 1x10<4>, oko 3x10<4>, oko 1x10<5>, oko 3x10<5>, oko 1x10<6>, oko 3x10<6>, oko 1x10<7>, oko 3x10<7>, oko 1x10<8>, oko 3x10<8>, oko 1x10<9>, oko 3x10<9>, oko 1x10<10>, oko 3x10<10>, oko 1x10<11>, oko 3x10<11>, oko 1x10<12>, oko 3x10<12>, oko 1x10<13>, oko 3x10<13>, oko 1x10<14>, oko 3x10<14>, oko 1x10<15>, oko 3x10<15>, oko 1x10<16>, oko 3x10<16>ili više virusnih genoma po kilogramu telesne težine.
[0032] U drugom aspektu, pronalazak razmatra smeše koje sadrže rAAV predmetnog pronalaska. Sastavi predmetnog pronalaska sadrže rAAV u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Sastavi mogu takođe da sadrže i druge sastojke, poput razređivača i adjuvansa. Prihvatljivi nosači, razređivači i adjuvansi nisu toksični za primaoce i poželjno su inertni u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere poput fosfata, citrata ili drugih organskih kiselina; antioksidanse poput askorbinske kiseline; polipeptide male molekulske težine; proteine, kao što su albuminski serum, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharida, disaharida i drugih ugljenih hidrata uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorskih agenasa kao što je EDTA; šećernih alkohola kao što su manitol ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli, kao što je natrijum; i/ili nejonska surfaktante kao što su Tween, pluronici ili polietilen glikol (PEG).
[0033] U drugom aspektu, pronalazak pruža upotrebu rAAV pronalaska u postupcima transdukcije ciljane ćelije sa rAAV pronalaska, in vivo ili in vitro. In vivo postupci obuhvataju korak primene delotvorne doze ili efektivnih višestrukih doza sastava koji sadrži rAAV pronalaska pacijentu, pacijentu (uključujući čoveka), kom je to potrebno. Ako se doza primenjuje pre početka/razvoja poremećaja/bolesti, primena je profilaktička. Ako se doza primenjuje posle početka/razvoja poremećaja/bolesti, primena je terapeutska. U otelotvorenjima pronalaska, efikasna doza je doza koja ublažava (eliminiše ili smanjuje) najmanje jedan simptom povezan sa poremećajem/bolesti koje se tretira, i koja usporava ili sprečava napredovanje do poremećaja/bolesti, koja usporava ili sprečava napredovanje poremećaja/bolesti, koja umanjuje obim bolesti, koja rezultuje remisijom (delimičnom ili potpunom) bolesti i/ili produžava preživljavanje. Primer bolesti koja se predviđa za tretman postupcima predmetnog pronalaska je ALS. „Tretman“ prema pronalasku na taj način ublažava (eliminiše ili smanjuje) bar jedan simptom povezan sa poremećajem/bolesti koje se tretira (na primer, gubitak telesne težine se eliminiše ili smanjuje za najmanje 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više), usporava ili sprečava napredovanje (početak/razvoj) poremećaja/bolesti, usporava ili sprečava napredovanje poremećaja/bolesti, smanjuje obim bolesti, što rezultuje remisijom (delimičnom ili potpunom) bolesti i/ili produžava preživljavanje. U nekim otelotvorenjima preživljavanje se produžava za najmanje 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više.
[0034] Pronalazak takođe razmatra kombinacione terapije. Kombinacija, kako se ovde koristi, uključuje i istovremeni tretman i sekvencijalne tretmane. Kombinacije upotreba predmetnog pronalaska sa standardnim medicinskim tretmanima (npr. riluzolom) su posebno razmotrene, kao i kombinacije sa novim terapijama.
[0035] Primena delotvorne doze preparata može biti putevima standardnim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sistemske intramuskularne, parenteralne, intravenske, oralne, bukalne, nazalne, plućne, intrakranijalne, intratekalne, intraozne, intraokularne, rektalne ili vaginalne. Putevi primene i serotipovi AAV komponenti od rAAV (posebno, AAV ITR i kapsidni protein) predmetnog pronalaska mogu da se odaberu i/ili uklope od strane stručnjaka u oblasti uzimajući u obzir infekciju i/ili bolest koja se tretira i ciljanih ćelija/tkiva koja treba da eksprimiranju SOD1 shRNK. U nekim otelotvorenjima, put primene je sistemski. U nekim otelotvorenjima, put primene je intratekalni. U nekim otelotvorenjima, put primene je introcerebroventrikularni. U nekim otelotvorenjima, put primene je cisterna magna. U nekim otelotvorenjima, put primene je lumbalna punkcija.
[0036] Transdukcija ćelija sa rAAV predmetnog pronalaska rezultuje održanim eksprimiranjem SOD1 shRNK. U drugom aspektu, predmetni pronalazak omogućava postupke primene/isporuke pacijentu, po mogućnosti čoveku, rAAV koji eksprimira SOD1 shRNK. Izraz „transdukcija“ se koristi da označi primenu/isporuku SOD1 shRNK u ćeliju primaoca bilo in vivo ili in vitro, koristeći rAAV koji ima nedostatak replikacije predmetnog pronalaska, što rezultuje eksprimiranjem SOD1 shRNK od strane ćelije primaoca.
[0037] Prema tome, pronalazak pruža upotrebu rAAV predmetnog pronalaska u postupcima primene delotvorne doze (ili doza, suštinski primenjenih istovremeno ili doze primenjene u intervalima) rAAV koji kodiraju SOD1 shRNK, pacijentu koji ima potrebu za tim
[0038] U jednom aspektu, pronalazak pruža upotrebu rAAV predmetnog pronalaska u postupcima za isporuku polinukleotida koji kodira shRNK predmetnog pronalaska preko krvno-moždane barijere, koji uključuje sistemsku primenu pacijentu rAAV genoma koji uključujući polinukleotid. U nekim otelotvorenjima, rAAV genom je samo-komplementarni genom. U drugim otelotvorenjima, rAAV genom je jednolančani genom. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV9. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV2. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAVrh74.
[0039] U nekim otelotvorenjima, postupci sistemski isporučuju polinukleotide kroz BBB do centralnog i/ili perifernog nervnog sistema. Shodno tome, pružen je postupak isporuke polinukleotida u centralni nervni sistem, koji obuhvata sistemsku primenu pacijentu rAAV sa samo-komplementarnim genomom koji uključuje genom. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid se isporučuje mozgu. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid se isporučuje kičmenoj moždini. Takođe je pružen postupak isporuke polinukleotida u periferni nervni sistem koji obuhvata sistemsku primenu pacijentu rAAV sa samo-komplementarnim genomom uključujući polinukleotid. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid se isporučuje u niži motorni neuron. U nekim otelotvorenjima, rAAV genom je samo-komplementarni genom. U drugim otelotvorenjima, rAAV genom je jednolančani genom. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV9. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV2. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAVrh74.
[0040] U drugom aspektu, pronalazak pruža upotrebu rAAV predmetnog pronalaska u postupcima isporuke polinukleotida u centralni nervni sistem pacijenta koji ima potrebu za tim, gde postupak uključuje intratekalnu isporuku rAAV sa genomom koji uključuje polinukleotid. U nekim otelotvorenjima, rAAV genom je samo-komplementarni genom. U drugim otelotvorenjima, rAAV genom je jednolančani genom. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV9. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAV2. U nekim otelotvorenjima, rAAV je rAAVrh74. U nekim otelotvorenjima, nejonski nisko-molarni kontrastni agens se takođe isporučuje pacijentu, na primer jodbitridol, ioheksol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromid, ioversol ili ioksilan.
[0041] Otelotvorenja predmetnog pronalaska koriste rAAV za isporuku polinukleotida u nervne, glijalne i endotelne ćelije. U nekim otelotvorenjima, nervna ćelija je donji motorni neuron i/ili gornji motorni neuron. U nekim otelotvorenjima, glijalna ćelija je mikroglijalna ćelija, oligodendrocit i/ili astrocit. U drugim aspektima, rAAV se koristi za isporuku polinukleotida u Švanovu ćeliju.
Kratak opis crteža
[0042]
Slika 1. Obrazac AAV9 transdukcije i postojanost kod SOD1<G93A>miševa. SOD1<G93A>miševima je intravenski injektiran AAV9-CB-GFP na P1, P21 i eutanazirani su 21 dan posle injekcije (n=3 po vremenskoj tački). Kičmene moždine su ispitivane na eksprimiranje GFP, ChAT (marker motornog neurona) i GFAP (marker astrocita). Injekcija temporalne vene AAV9-CB-GFP na P1 rezultovala je efikasnom transdukcijom motornih neurona i glija kod SOD1<G93A>miševa (a, f, k, str). Injekcija u repnu u venu kod P21 (b, g, l, q) pretežno je ciljala astrociti sa malo GFP pozitivnih motornih neurona. Kako bi se testirala postojanost transduciranih ćelija, AAV9-CB-GFP je intravenski injektiran na P1 i P21 kod SOD1<G93A>životinja koje su žrtvovane u krajnjoj fazi (~P130).
1
Imunofluorescentna analiza lumbalnog ventralnog roga (c, d, h, i, m, n, r, s) pokazala je da se GFP eksprimiranje održalo u astrocitima tokom čitavog toka bolesti. Kako bismo utvrdili da li će upala i oštećenje posredovano sa SOD1 uticati na transdukciju AAV9, intravenski smo ubrizgali SOD1<G93A>miševe na P85 i uzeli su im kičmene moždine na kraju. Nije primećena razlika u uzorku transdukcije SOD1<G93A>miševa tretiranih na P21 ili P85. Setovi u (r-t) prikazuju ko-lokalizaciju između GFP i GFAP signala. (u) Kvantifikacija transduciranih ćelija u ALS kičmene moždine (za svaku grupu tkiva su analizirane od 3 životinje). GFP i ChAT kolone prikazuju broj prebrojanih ćelija. Trake = 100 µm. AAV, adeno-povezani virus; P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21; P85, postnatalni dan 85; GFP, zeleni fluorescentni protein; ChAT, holin acetiltransferaza; GFAP, glialni fibrilarni kiseli protein.
Slika 2. shRNK konstrukti pokazuju efikasno smanjenje ljudskog SOD1 proteina in vitro i in vivo. (a) Poravnavanje sekvenci između ljudskog i mišjeg SOD1 za regione na koje su ciljana 4 različita shRNK konstrukta. (b) sekvence shRNK su klonirane u H1 konstrukt eksprimiranja i prelazno su transficirane u 293 ćelije. Lizati su sakupljeni 72 sata posle transfekcije i analizirani su koristeći Western blot. (c) Kvantifikacija in vitro supresije ljudskog SOD1 iz tri odvojene prolazne transfekcije pokazala je> 50% smanjenje SOD1. (d) shRNK 130 je pakovana u AAV9 i injektirana kod SOD1<G93A>mišev na P1 ili P21. Kičmene moždine (n=3 po vremenskoj tački) prikupljene su tri nedelje posle injekcije i analizirane koristeći Western blot na nivo ljudskog SOD1 proteina. (e) Kvantifikacija in vivo supresije ljudskog SOD1 unutar kičmene moždine ALS miševa. P1 i P21 injektirane kičmene moždine pokazala su 60% i 45% smanjenje mutiranog SOD1 proteina, respektivno. hSOD1, ljudska superoksid dismutaza 1; mSOD1, mišja superoksid dismutaza 1; GAPDH, gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza.
Slika 3. Intravenska isporuka AAV9-SOD1-shRNK poboljšava preživljavanje i motoričke performanse kod SOD1<G93A>miševa. SOD1<G93A>miševi su primili jednu intravensku injekciju AAV9-SOD1-shRNK na P1 (n=6, zeleno), P21 (n=9, crveno) ili P85 (n=5, plavo). Tretirani miševi su praćeni do krajnjeg stadijuma i upoređeni sa ne-injektiranim kontrolnim SOD1<G93A>miševima (n=15, sivo). (a, c) AAV9-SOD1-shRNK injekcija P1 SOD1<G93A>miševima je značajno odložila medijanu nastanaka bolesti 39,5 dana u poređenju sa kontrolnim životinjama (ne-injektirane, 103d; P1, 142,5d; p <0,05). Injekcije P21 (crveno) ili P85 (plavo) ALS životinjama nisu uticale na pojavu bolesti (P21, 110d; P85, 105d). Međutim, AAV9-SOD1-shRNK primenjen na P1, P21 ili P85 je značajno produžio medijanu preživljavanja (b, e) (ne-injektirane, 132d; P1, 183.5d P21, 171d; P85, 162d; sve poređenja sa kontrolom p <0,001). P21 grupa je značajno produžila trajanje medijane (d) što ukazuje na usporavanje bolesti (ne-injektirane, 29,5d; P1, 41d; P21, 49d; P85, 40d; Vilkoksonov test ranga sa znakom p = 0,06, 0,01 i 0,12, respektivno). (f-h) Životinje koje su tretirane sa P1 i P21 održavale su težinu, imale su bolju čvrstoću zadnjih ekstremiteta i performanse rotaroda u poređenju sa kontrolama usklađenim po godinama, što ukazuje da su tretirane životinje zadržale mišićni tonus i motoričku funkciju tokom produženog preživljavanja. Linije između traka u (c-e) ukazuju na statistički značajne razlike. * p <0,05 P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21; P85, postnatalni dan 85.
Slika 4. Intravenska injekcija AAV9-SOD1-shRNK smanjuje mutirani protein u kičmenoj moždini SOD1<G93A>miševa. (a-d) Slike segmenata kičmene moždine od ne-injektiranih (a), P1 injektiranih (b), P21 injektiranih (c) i P85 injektiranih (d) miševa su napravljene sa identičnim podešavanjima mikroskopa kako bi kvalitativno pokazale SOD1 nivo u krajnjoj fazi. SOD1 nivoi su u obrnutoj korelaciji sa preživljavanjem. (e-t) Ko-označavanje za GFP, ChAT i SOD1 pokazuje da AAV9 transducirani motorni neuroni imaju smanjeno SOD1 eksprimiranje (strelice) dok ćelije kojima nedostaje GFP održavaju visok nivo mutantnog proteina (strelice). Kao što je opisano za Sliku 1u, primećena je veća transdukcija MN i odgovarajuće smanjenje SOD1 kod P1 injektiranih miševa(i-l) u poređenju sa P21 injektiranim (m-p) i P85 injektiranim (q-t) miševima. Bar = 100 µm. P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21; P85, postnatalni dan 85; SOD1, superoksid dismutaza 1; GFP, zeleni fluorescentni protein; ChAT, holin acetiltransferaza.
Slika 5. AAV9-SOD1-shRNK poboljšava preživljavanje i motoričke performanse kod SOD1<G37R>miševa tretiranih nakon pojave bolesti. (a) Nije bilo razlike u medijani nastanka bolesti između AAV9-SOD1-shRNK i miševa tretiranih kontrolom. (prosečna uzrast na tretmanu = 215d u poređenju sa medijanom početka od 194d za kontrole i 197d za tretiranje; Logaritamski test ranga p = 0,46). (b, f) Medijana preživljavanja AAV9-SOD1-shRNK tretiranih SOD1<G37R>miševa (n=25) je značajno prošireni u odnosu na kontrolne miševe (n=21). (kontrola, n=21, 392d; SOD1 shRNK, n=25, 478,5d; Logaritamski test ranga p <0,0001) (c-e) Rana faza bolesti je značajno usporena za 73 dana kod tretiranih miševa u poređenju sa kontrolnim miševima (kontrola, 89d; SOD1 shRNK, 162d; p <0,0001 Vilkoksonov test ranga sa znakom) dok je kasna faza bolesti pokazala neznatno usporavanje (kontrola, 63d; SOD1 shRNK, 81d; p = 0,14 Vilkoksonov test ranga sa znakom). Ovo je zajedno povećalo medijanu trajanja bolesti za 66 dana (kontrola, 173d; SOD1 shRNK, 239d; p <0,0001 Vilkoksonov test ranga sa znakom). (g) Trend poboljšanja snage zahvata zadnjih ekstremiteta pojavio se kod miševa tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa kontrolnim miševima.
Slika 6. Intravenska injekcija AAV9 kod odraslih SOD1<G37R>miševa cilja astrocite i motorne neurone unutar kičmene moždine. (Ah) Imunofluorescentna analiza otkrila je neuronalnu i glijalnu transdukciju i kod AAV9-CB-GFP (a-d) i kod AAV9-SOD1-shRNK (eh) tretiranih miševa. (i-p) Čini se da je ljudski SOD1 nivo smanjen kod miševa tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK (o) u poređenju sa miševima tretiranim sa AAV9-GFP (k). Bar = 100 µm. GFP, zeleni fluorescentni protein; ChAT, holin acetiltransferaza; GFAP, glialni fibrilarni kiseli protein; SOD1, superoksid dismutaza 1.
Slika 7. Intratekalna infuzija AAV9-SOD1-shRNK kod primata koji nisu čovek dovodi do efikasnog smanjenja SOD1 nivoa. (a) Mijelogram ubrzo nakon intratekalne infuzije AAV9-SOD1-shRNK pomešane sa kontrastom pokazuje pravilnu isporuku u subarahnoidni prostor od cynomolgus macaque. Strelice pokazuju difuziju kontrastnog agensa duž čitave kičmene moždine. (b) Lumbalni segmenti kičmene moždine kod tretiranih majmuna (n=3) su sabrane dve nedelje nakon injekcije i obojene za GFP korišćenjem DAB bojenja. Segmenti su imale široko izražen GFP u sivoj i beloj materiji. (c-e) Imunofluorescentna analiza lumbalnih segmenata kičmene moždine pokazala je robusno GFP (c) eksprimiranje unutar ChAT (d) pozitivnih ćelija koje ukazuju na transdukciju motornog neurona (e, spajanje), (f) Western blot analiza na lumbalnim kičmenim moždinama pokazala je značajno smanjenje SOD1 nivoa kod životinja kojima je injektiran AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa kontrolama. (g) In vivo kvantifikacija obaranja SOD1 u homogenatu lumbalne kičmene moždine majmuna (n=3) pokazao je 87% smanjenje kod životinja koje su primile AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa ne-injektiranim kontrolama. (h) Mikrorodisekcija laserskog hvatanja korišćena je za sakupljanje motornih neurona ili okolnih neuropila sa injektiranih i kontrolisanih segmenata kičme majmuna. Sakupljenim ćelijama je analiziran SOD1 nivo koristeći qRT-PCR. Motorni neuroni prikupljeni od AAV9-SOD1-shRNK životinja (n=3) imali su 95 ± 3% smanjenje SOD1 RNK. Neneuroni su imali 66 ± 9% smanjenje SOD1 RNK kod životinja tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK. Trake razmere: b = 100 µm; e = 50 µm. SOD1:Superoksid dismutaza 1.
Figura 8. Lumbalna intratekalna infuzija AAV9-SOD1-shRNK dovodi do efikasne transdukcije motornih neurona i ne-neuronskih ćelija u cervikalnoj, torakalnoj i lumbalnoj moždini što rezultuje smanjenjem SOD1. (a-c) Imunofluorescentna analiza tri segmenta kičmene moždine; cervikalni (a), torakalni (b) i lumbalni (c), pokazao je robusno GFP (zeleno) eksprimiranje unutar Chat (crveno) pozitivnih ćelija što ukazuje na transdukciju motornog neurona. (d) Broj GFP+/Chat+ ćelija pokazuje kaudalni i rostralni gradijent transdukcije motornog neurona u rasponu od 85% transduciranih ćelija u lumbalnom regionu do više od 50% u cervikalnom regionu. (e) SOD1 mRNK nivoi u homogenatima cervikalne, torakalne i lumbalni segmenti moždine analizirani pomoću qRT-PCR pokazuju značajno smanjenje SOD1 transkripta, u skladu sa transdukcijom motornog neurona. SOD1 nivoi su normalizovani za životinje kojima su injektirani β-aktin i AAV9-SOD1-shRNK i upoređene su sa kontrolnom injekcijom AAV9-CB-GFP. Trake razmere: (a-c) = 50 µm; Trake grešaka: (d-e) = SD.
Slika 9. Dizajn kliničkog SOD1 shRNK konstrukta. (a) Originalni AAV SOD1 shRNK konstrukt sadrži shRNK sekvencu protiv ljudskog SOD1 pod H1 promoterom, praćeno kasetom eksprimiranja za GFP koja uključuje CMV pojačivač, CBA promoter, modifikovani SV40 intron i GFP transgenu sekvencu praćenu bGH PolyA terminatorom. SOD1 shRNK kaseta eksprimiranja i GFP kaseta eksprimiranja su okružene sa AAV2 ITR koji omogućava pakovanje kompletne okružene sekvence u AAV9 kapsid. (b) U kliničkom SOD1 shRNK konstruktu, GFP kaseta eksprimiranja zamenjena je elementom koji sadrži tandem, ne-kodirajuće sekvence DNK vakcina odobrenih od strane FDA. ITR: invertovana terminalna ponavlja; shRNK, RNK male ukosnice; SOD1, superoksid dismutaza 1; CMV, pojačivač citomegalo virusa; CBA, promoter pilećeg β-aktina; GFP, zeleni fluorescentni protein; bGH pA, poli A terminator goveđeg hormona rasta.
Slika 10. Šematski prikaz kliničkog SOD1 shRNK konstrukta. U klinički SOD1 shRNK konstrukt su postavljena različita mesta restrikcije koja omogućavaju kloniranje više shRNK kaseta eksprimiranja uz održavanje ukupne udaljenosti između dva ITR.
Slika 11. In vitro transfekcija kliničkog SOD1 shRNK konstrukta efikasno smanjuje ljudski SOD1 protein u HEK293 ćelijama. Reprezentativna mikroskopska polja koja prikazuju svetle slike netransficirane kontrole (a), AAV SOD1 shRNK transficirane (b) i šatl vektor pJet SOD1 shRNK transficirane (c, d) HEK 293 ćelije, 72 sata nakon transfekcije. Odgovarajuće fluorescentne slike otkrivaju nedostatak GFP fluorescencije iz pJet SOD1 shRNK transficiranih HEK 293 ćelija (g, h) u poređenju sa ćelijama koje su transficirane sa AAV SOD1 shRNK (f). (i) Western blot analiza ćelijskih lizata potvrđuje efikasno obaranje ljudskog SOD1 proteina u pJet SOD1 shRNK transficiranim ćelijama u poređenju sa ne-transficiranim kontrolnim ćelijama. Imunoblotska analiza takođe potvrđuje uklanjanje GFP transgena iz pJet SOD1 shRNK konstrukta. (j) Kvantifikacija in vitro regulacije na dole SOD1 pomoću pJet SOD1 shRNK. pJet SOD1 shRNK smanjuje nivo proteina ljudskog SOD1 za skoro 50% u HEK293 ćelijama u poređenju sa kontrolom. Ovo smanjenje je slično onom ostvarenom sa AAV SOD1 shRNK konstruktom
Slika 12. Šematski prikaz strategije kloniranja za klinički AAV SOD1 shRNK vektor. Klinički SOD1 shRNK konstrukt je kloniran u AAV CB MCS vektor pomoću Kpn1/SPh1 mesta. Kpn1/SPh1 dvostruka digestija AAV CB MCS plazmida rezultuje oslobađanjem kompletne kasete za eksprimiranje transgena iz ovog vektora, koja je dalje zamenjena kliničkim SOD1 shRNK konstruktom koji nosi SOD1 shRNK kasetu eksprimiranja i sekvencu za punjenje.
Slika 13. Klinička AAV SOD1 shRNK efikasno smanjuje nivo ljudskog SOD1 in vitro. HEK293 ćelije su transficirane kliničkim AAV SOD1 shRNK plazmidom postupkom kalcijum fosfata. Reprezentativna mikroskopska polja koja prikazuju svetle slike ne-transficirane kontrole, AAV SOD1 shRNK i kliničkim AAV SOD1 shRNK transficirane ćelije, respektivno, 72 sata posle transfekcije (ac). Uspešno uklanjanje GFP od kliničke AAV SOD1 shRNK potvrđeno je nedostatkom GFP eksprimiranja u kliničkim AAV SOD1 shRNK transficiranim ćelijama (f, g). (g) Analiza Western blot ćelijskih lizata, prikupljenih je 72 sata posle transfekcije, potvrdila je efikasnu regulaciju na dole SOD1 u kliničkim AAV SOD1 shRNK transficiranim ćelijama u poređenju sa kontrolom. Kao pozitivna kontrola korišćena je AAV SOD1 shRNK. (h) Kvantifikacija in vitro obaranja SOD1 kliničkim AAV SOD1 shRNK.
Slika D1. AAV9-shRNK-SOD1 primena se dobro podnosi kod WT miševa. Ženkama i mužjacima WT životinjama injektiran je AAV9-SOD1-shRNK na P1 ili P21 i praćeni su do 6 meseci uzrasti. (a, b) I mužjaci i ženke tretiranih miševa pokazali su stabilan porastu telesne mase u poređenju sa kontrolnim životinjama. Na (c, d) Rotarod performanse i (e, f) čvrstoću zadnjih ekstremiteta nije uticao ni P1 ni P21 tretman u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. n=5 po grupi. WT, divlji tip; P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21.
Slika D2. Hematologija i hemija seruma WT životinja tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK. (a-m) Krv je uzeta od P1 (zeleno) ili P21 (crveno) tretiranih i kontrolnih (sivo) WT životinja pri uzrastu od 150 dana za hematološka ispitivanja. Nisu primećene značajne razlike između tretiranih i kontrolnih životinja. (n-w) Uzorci seruma prikupljeni pri uzrastu od 180 dana kod istih miševa nisu pokazali značajne razlike u profilu hemije seruma. Srednja vrednost ± SEM. n=5 po grupi. P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21.
Slika D3. AAV9-SOD1-shRNK tretman kod SOD 1<G93A>miševa smanjuje astrogliozu. Segmenti krajnjeg stadijuma kontrolnih životinja i životinja tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK prikupljeni su i obojeni za GFAP, marker aktivacije astrocita. P1 (b) i P85 (d) injektirani miševi pokazali su smanjene nivoe astroglioze u poređenju sa kontrolnim (a) miševima, dok su P21 (c) injektirani miševi pokazali su maksimalno smanjenje. To je bilo u skladu sa procentom transdukcije astrocita postignutim kod ovih miševa (Slika 1u). Međutim, nije primećen efekat na reaktivnost mikroglije (e-h). Bar = 100 µm. P1, postnatalni dan 1; P21, postnatalni dan 21; P85, postnatalni dan 85.
Slika D4. Intravenska injekcija AAV9-SOD1-shRNK efikasno smanjuje nivo mutiranih SOD1 proteina u kičmenoj moždini SOD1<G37R>miševa. (a) Nakon pojave bolesti, AAV9-CB-GFP ili AAV9-SOD1-shRNK su injektirani SOD1<G37R>miševima, i kičmene moždine su prikupljene u krajnjoj fazi i analizirane koristeći western blot za nivo ljudskog SOD1 proteina. (b) Kvantifikacija a) pokazuje supresiju ljudskog SOD1 unutar kičmene moždine SOD1<G37R>miševa (n=4 po grupi). hSOD1, ljudska superoksid dismutaza 1; GAPDH, gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza.
1
Slika D5. shRNK 130 efikasno smanjuje nivo majmunskog SOD1 in vitro. (a) Poravnanje sekvenci regiona ciljanog od strane SOD1 shRNK 130 i jedna neusklađenost sa majmunskom sekvencom. Majmunska sekvenca odgovara SOD1 sekvenci rezus majmuna (NM 001032804.1), cinomolgus majmuna (sekvencirana interno) i afričkog zelenog majmuna. (b) ShRNK 130 kaseta eksprimiranja je klonirana u lentivirusni vektor i korišćena je za inficiranje Cos-7 ćelija. Lizati su analizirani 72 sata posle infekcije koristeći qRT PCR za SOD1. shRNK 130 je smanjila nivoe transkripta SOD1 za 75% u Cos-7 ćelijama.
Primeri
[0043] Predmetni pronalazak je ilustrovan narednim primerima. Iako je predmetni pronalazak opisan u smislu različitih otelotvorenja i primera, razume se da će stručnjaci u oblasti moći da naprave varijacije i poboljšanja. Zbog toga se treba smatrati da je pronalazak ograničen samo patentnim zahtevima.
Primer 1
Obrazac transdukcije AAV9 i postojanost kod SOD1<G93A>miševa
[0044] Najpre smo ocenili efikasnost transdukcije AAV9 kod modela SOD1<G93A>miševa koji razvija fatalnu paraliznu bolest. Visoka kopija SOD1<G93A>miševi je dobijena od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i uzgajani su u Kaspar laboratoriji. Životinje su genotipizovane pre tretmana radi dobijanja miševa koji eksprimiraju SOD1<G93A>i njihovih srodnika divljeg tipa. Samo su ženke SOD1<G93A>uključene u eksperimente. Životinje su injektirane intravenozno postnatalnog dana 1 ili postnatalnog dana 21 (navode se kao P1 i P21, respektivno) sakomplementarnim AAV9 koji eksprimira GFP samo-od CMV pojačivača/promotera betaaktina (CB) (AAV9-CB-GFP) (n=3 po grupi). Tri nedelje posle injekcije, životinje su žrtvovane i kičmene moždine su ispitivane za GFP eksprimiranje (Slike 1a-u).
[0045] Svi ovde opisani postupci sa životinjama izvedeni su u skladu sa NIH smernicama i odobreni od strane Istraživačkog instituta u Research Institute at Nationwide Children's Hospital (Columbus, OH), University of California (San Diego, CA) ili Mannheimer Foundation (Homestead, FL) Institutional Animal Care and Use Committees.
[0046] Efikasnost transdukcije bila je visoka kod SOD1<G93A>astrociti sa GFP eksprimiranim kod u 34 ± 2% i 54 ± 3% respektivno, od P1 i P21 injektiranih astrocita spinalne sive materije (definisano imunoreaktivnošću za GFAP). Ova efikasnost je bila slična našem prethodnom izveštaju od 64 ± 1% kod P21 injektiranih divljih životinja<18>. Motorni neuroni su izraziti ćelijski tip transduciran na svim nivoima kičmene moždine P1 injektiranih SOD1<G93A>životinja (62 ± 1%), u poređenju sa značajno nižim ciljanjem na motorne neurone kod P21 injektiranih životinja (8 ± 1%).
[0047] Iako smo ranije izvestili da transducirani astrociti u kičmenim moždinama divljeg tipa i dalje postoje sa kontinuiranom GFP akumulacijom najmanje 7 nedelja nakon injekcije<18>, nije testirana dugotrajnost mutantnih SOD1 astrocita (i njihova kontinuirana sinteza gena kodiranih AAV9 epizomom) tokom aktivne bolesti slične ALS. Dakle, SOD1<G93A>miševi su injektirani na P1 i P21 sa AAV9-CB-GFP i praćeni do krajnjeg stadijuma (~P130, n=3 po grupi) (Slike 1c, d, h, i, m, n, r, s). Imunofluorescentno ispitivanje krajnjeg stadijuma SOD1<G93A>kičmene moždine kod životinja injektiranih na P1 i P21 pokazale su uporedivi broj astrocita koji eksprimiranju GFP kao što je pronađeno 21 dan nakon AAV9 injekcije (P1:42 ± 2%, P21:61 ± 2%). Ovi podaci su u skladu sa preživljavanjem transduciranih astrocita tokom trajanja bolesti (~110 dana nakon injekcije na P21) kod SOD1<G93A>miševa, i da se održava eksprimiranje AAV9-kodiranog gena.
[0048] Dalje, prepoznajući da se oštećenja posredovana mutiranim SOD1, uključujući astrocitnu i mikroglijsku aktivaciju i rane promene krvno moždane barijere, razvijaju tokom mišije bolesti kod SOD1 mutantnih miševa<20>, testirali smo da li ovo oštećenje utiče na AAV9 transdukciju. SOD1<G93A>miševi su injektirani na P85 sa AAV9-CB-GFP i žrtvovani na krajnjem stadijumu (n=3) (Slike 1e, j, o, t). Analiza kičmene moždine otkrila je da je obrazac transdukcije viđen kod P85 životinja sličan onim od P21 tretiranih životinja, uz astrocite kao preovlađujući ćelijski tip koji je transduciran na svim nivoima (51 ± 6% GFP+/GFAP+ ćelije u lumbalnoj sivoj materiji).
Primer 2
Razvoj shRNK sekvence specifične za ljudski SOD1
[0049] Kako bi se specifično ciljala ljudska SOD1 mRNK, četiri shRNK konstrukta koja ciljaju ljudski SOD1 su generisana i dobijena koristeći Life Technologies alat. Konstrukti koji su imali najmanje četiri bazne neusaglašenosti poređeni su sa mišjom mRNK sekvencom (Slika 2a). Osnovni brojevi za prikazane ljudske sekvence odgovaraju CCDS33536.1 broju zapisa u NCBI CCDS bazi podataka. Ovi konstrukti su klonirani u pSilencer 3.1 (Genscript) pod ljudskim H1 promoterom i testirani in vitro. shRNK 130 zajedno sa H1 promoterom dalje je klonirana u AAV vektor zajedno sa GFP reporterom pod promoterom pilećeg betaaktina kako bi se identifikovale transducirane ćelije. Ljudske 293 ćelije su transficirane sa svakom kasetom. HEK-293 ćelije su održavane u IMDM medijumu koji sadrži 10% FBS, 1% L-glutamina i 1% penicilina/streptomicina. Po dostizanju konfluencije od 60%, ćelije su transficirane koristeći pSilencer 3.1 koji sadrži shRNK koja se testira. Proteinski lizati su pripremljeni 72 sata posle transfekcije i analizirani za SOD1 nivo koristeći Western blot. Sve četiri sekvence smanjile su nivo SOD1 proteina za > 50% (Slike 2b, c).
[0050] shRNK130 je izabran za dalje eksperimente jer je proizveo najdoslednije obaranje u toku tri odvojena eksperimenta transfekcije. Kloniran je u samo-komplementarni AAV9 vektor koji je takođe sadržao GFP gen čija bi eksprimiranje identifikovala transducirane ćelije (koje se nazivaju AAV9-SOD1-shRNK). Samokomplementarna AAV9-SOD1-shRNK proizvedena je postupcima prolazne transfekcije korišćenjem dvolančanog AAV2-ITR zasnovanog CB-GFP vektora, sa plazmidom koji kodira Rep2Cap9 sekvencu kao što je prethodno opisano zajedno sa adenovirusnim pomoćnim plazmidom pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) u 293 ćelijama<18>.
[0051] Kako bi potvrdili da shRNK može da suzbije nagomilavanje ljudskog SOD1, SOD1<G93A>miševi (n=3) su intravenski injektirani sa AAV9-SOD1-shRNK, na P1 ili P21. Za neonatalne mišje injekcije, korišćeni su SOD1<G93A>štenci na postnatalni dan 1-2. Ukupna zapremina od 50 μl koja sadrži 5×10<11>DNKaza-otporne virusne čestice od AAV9-SOD1-shRNK (Virapur LLC, San Diego, CA) injektirana je kroz temporalnu venu kao što je prethodno opisano<18>. Ispravna injekcija potvrđena je primećivanjem da je vena izbledela. Nakon injektiranja, štenci su vraćeni u svoj kavez. Životinje su eutanazirane tri nedelje nakon injektiranja, i kičmene moždine su sakupljene i analizirani imunoblotiranjem i za ljudski (mutirani) i za mišji (divlji tip) SOD1 protein. P1 i P21 injektirane kičmene moždine pokazale su 60% i 45% smanjenje mutiranog SOD1 proteina, respektivno (Slike 2d, e). SOD1 nivo kod miševa ostao je nepromenjen kao odgovor na obaranje ljudskog SOD1.
Primer 3
AAV9-SOD1-shRNK je bezbedna i dobro se podnosi kod divljih miševa
[0052] Kako bi se utvrdilo da li bi visoka doza AAV9-SOD1-shRNK bila bezbedna, normalni miševi oba pola intravenski su injektirani na P1 ili P21 (PI = 5 mužjaka, 5 ženke pri 5x10<11>vg; P21 = 5 mužjaka, 5 ženki pri 2x10<12>vektorskih genoma (vg)), i zatim su praćeni do uzrasta od 6 meseci. I miševi injektirani P1, i oni sa P21, pokazali su stalni porast telesne mase sličan netretiranim miševima (Slika S1). Nedeljni testovi ponašanja nisu primetili značajne razlike između injektirane i kontrolne grupe u motoričkim veštinama (mereno rotarodom), kao ni u snazi držanja zadnjih ekstremiteta. U uzrastu od 150 i 180 dana uzimani su uzorci krvi. Kompletna i diferencijalna krvna slika i tretiranih i netretiranih grupa pokazala je slične parametre hemije krvi (Slika S2). Uzorci seruma iz obe grupe nisu pokazali značajne razlike u nivoima alkalne fosfataze, kreatinina, azota uree u krvi, kalijuma, natrijuma i hlorida. Konačno, sve životinje su žrtvovane u uzrastu od 180 dana. Histopatološke analize patologa slepog na grupe za tretman nisu pokazale značajne promene u životinjama tretiranim sa AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa ne-injektiranim kontrolama (podaci nisu prikazani). Zaključujemo da su i primena AAV9 i održano shRNK eksprimiranje izgledali sigurno, i da su dobro podnošeni.
Primer 4
Produženo preživljavanje SOD1<G93A>miševi iz AAV9 posredovanog smanjenja mutiranog SOD1 čak i kada je započeto usred bolesti
[0053] Kako bismo testirali efikasnost AAV9-posredovanog smanjenja SOD1, tretirali smo kohorte SOD1<G93A>miševa sa jednom intravenskom injekcijom AAV9-SOD1-shRNK pre (P1, Sx10<11>vg, n=6 i P21, 2x10<12>vg, n=9) ili posle (P85, 3x10<12>vg, n=5) početka, uz prihvatanje da će mnogi astrociti, ali malo motoričkih neurona, biti transducirani u dve kasnije vremenske tačke. Za injektiranje repnih vena odraslih, životinje su stavljene na držač koji postavlja rep miša u osvetljenu, zagrejanu brazdu. Rep je natopljen alkoholom i zatim injektiran intravenski sa AAV9-SOD1-shRNK.
[0054] Početak bolesti (mereno gubitkom težine od atrofije izazvane denervacijom) značajno je odložen za
1
srednju vrednost od 39,5 dana (Slika 3a, c; ne-injektirani, 103d; P1, 142,5d; p <0,05, Vilkoksonov test ranga sa znakom) u kohorti P1 injektiranih, ali nije bio pod uticajem nijedne od kasnijih injekcija (P21, 110d; P85, 105d). Životinje koje su tretirane na P1 i P21 održavale su težinu, imale su bolji rotarodni učinak i snagu zadnjih ekstremiteta u poređenju sa kontrolama sličnog uzrasta, pokazujući da su tretirane životinje održavale mišićni tonus i motoričku funkciju tokom svog dugotrajnog preživljavanja (Slike 3f-h). Preživljavanje je značajno produženo injektiranjem AAV9 u sva tri uzrasta, što je dovelo do preživljavanja za 30-51,5 dana duže od vremena ne-injektiranih SOD1<G93A>miševa (ne-injektirani, 132d; P1, 183,5d; P21, 171d; P85, 162d; Logaritamski test ranga p = <0,0001, 0,0003 i 0,001, respektivno) (Slika 3b, e). Definisanje trajanja bolesti kao vremena od početka do krajnjeg stadijuma pokazalo je da je P21 grupa za tretman imala znatno povećano trajanje, što ukazuje na usporeno napredovanje bolesti, u poređenju sa ne-injektiranim kontrolama (ne-injektirano, 29,5d; P21, 49d; Vilkoksonov test ranga sa znakom p = 0,01), sa trendovima ka usporenom napredovanju životinja koje su injektirane u druge dve uzrasta (P1, 41d; P85, 40d; p = 0,06 i 0,12, respektivno) (Slika 3d). Niži procenat ciljanih ne-neuronskih ćelija na P1 u odnosu na one ciljane na P21 (Slika 1u) ukazuje na to da minimalan broj ne-neuronskih ćelija mora biti ciljan kako bi se usporilo napredovanje bolesti u brzo progresivnom SOD1<G93A>modelu (Slika 1u).
Primer 5
Redukcija mutiranog SOD1 u ćelijama zaraženim sa AAV9 kod tretiranih SOD1<G93A>miševa
[0055] Indirektna imunofluorescencija sa antitelom koje prepoznaje ljudski, SOD1 ali ne i mišji, korišćena je za određivanje nivoa akumuliranog mutiranog SOD1 u kičmenoj moždini u završnom stadijumu tretiranih i kontrolnih miševa. Nivo ljudskog SOD1 u segmentima kičmene moždine krajnjeg stadijuma obrnuto je povezan sa povećanim preživljavanjem (Slika 4a-d). U krajnjem stadijumu, životinje kojima je injektirana AAV9-SOD1-shRNK imale su niže nivoe mutiranog SOD1 u poređenju sa ne-injektiranim SOD1<G93A>životinjama (Slika 4a). Eksprimiranje SOD1 unutar transduciranih motornih neurona (identifikovano koristeći ćelije koje eksprimiraju GFP i ChAT) je smanjeno u odnosu na okolne neurone koji nisu transducirani da eksprimiranju virusno kodirani GFP (Slike 4h, l, p, t; strelice u odnosu na glave strelica). Štaviše, imunofluorescentno snimanje kičmene moždine u završnom stadijumu pokazalo je odgovarajuće smanjenje astroglioze, ali nema razlike u mikrogliozi kod životinja tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK u odnosu na kontrole (Slika D3).
Primer 6
Terapijsko usporavanje napredovanja bolesti sa perifernom injekcijom AAV9 nakon pojave
[0056] Kako bi se utvrdilo da li bi AAV9 posredovano smanjenje mutiranog SOD1 usporilo napredovanje bolesti, kohorta SOD1<G37R>miševa<6>injektirana je intravenski sa AAV9-SOD1-shRNK nakon pojave bolesti (prosečan uzrast na tretmanu = 215d u odnosu na medijanu početka 197d kod tretiranih životinja; Logaritamski test ranka p = 0,46; Slika 5a). loxSOD1<G37R>ALS miševi, koji nose ljudski mutantni SOD1<G37R>transgen okružen sa lox p mestima pod svojim endogenim promoterom, održavani su kao što je ranije opisano<37>. Kombinacija AAV9-CB-GFP (n=9) i ne-injektiranih (n=12) srodnih miševa korišćeni su kao kontrola.
[0057] Post-hoc analiza nije pokazala razlike između GFP i ne-injektiranih životinja, pa su grupe sastavljene kao „kontrola“ na Slici 5. Životinje su svake nedelje procenjivane za telesnu težinu i snagu zadnjih ekstremiteta i praćene do krajnjeg stadijuma. Tretman AAV9-SOD1-shRNK nakon pojave bolesti značajno je produžio medijanu preživljavanja za 86,5 dana u odnosu na kontrolne životinje (kontrola, n=21, 392d; SOD1 shRNK, n=25, 478,5d; Logaritamski test ranga p <0,0001). Trajanje rane bolesti, definisano vremenom od maksimuma do 10% gubitka težine, značajno je usporeno (kontrola, 89d; miševi tretirani SOD1 shRNK, 162 dana; Vilkoksonov test ranga sa znakom p <0,01; Slika 5c). Takođe je primećen kontinuirani trend usporavanja kasne bolesti (gubitak težine od 10% do krajnjeg stadijuma) (kontrola, 63d; miševi tretirani sa SOD1 shRNK, 81d; Vilkoksonov test ranga sa znakom p = 0,1389; Slika 5d). Ukupno trajanje bolesti nakon AAV9-SOD1-shRNK terapije poraslo je na 239d nakon pojave bolesti u odnosu na 173d kod kontrolnih miševa (Vilkoksonov test ranga sa znakom p <0,0001; Slika 5e). U skladu sa usporenim napredovanjem bolesti, AAV9 terapija je održavala čvrstoću ekstremiteta u odnosu na kontrolne mutantne SOD1 životinje (Slika 5g). Produženje od 86,5 dana u preživljavanju nadmašilo je produženje od 62 dana koje je uočeno u transgenim studijama koje su koristile astrocitno-specifično eksprimiranje Cre da inaktiviraju mutantni SOD1<G37R>transgen<8>, što verovatno odražava efikasnu AAV9 transdukciju astrocita nakon periferne isporuke i moguću transdukciju drugih tipova ćelija (posebno mikroglije) čija sinteza mutiranog SOD1 ubrzava napredovanje bolesti.
1
[0058] Histološki pregled krajnjeg stadijuma SOD1<G37R>tretiranih životinje otkrio je slične nivoe intraspinalne ćelijske transdukcije kod životinja koje su tretirane sa AAV9-SOD1-shRNK ili sa AAV9-GFP (Slika 6). GFP eksprimiranje je pretežno primećeno unutar motornih neurona i astrocita obe grupe, dok se SOD1 eksprimiranje primetno smanjilo samo kod životinja koje su primale AAV9-SOD1-shRNK (Slike 6k, o). Imunobloting ekstrakata cele kičmene moždine iz SOD1<G37R>miševa krajnjeg stadijuma otkrio je 80% smanjenje nivoa hSOD1 proteina kod životinja tretiranih sa AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa kontrolama (Slika D4).
Primer 7
AAV9 posredovano suzbijanje SOD1 kod primata koji nisu ljudi
[0059] Kako bismo testirali da li se SOD1 nivoi mogu efikasno sniziti korišćenjem AAV9 u kičmenoj moždini primata koji nisu čovek, AAV9 se injektira intratekalno putem lumbalne punkcije. Ovaj postupak je odabrana tokom sistemske isporuke kako bi se smanjila potrebna količina virusa i minimizovali efekti smanjenja SOD1 u perifernim tkivima. Godinu dana stari cinomolgus makakiji (Macaca fascicularis) sa prosečnom telesnom težinom od 2 kg korišćeni su za ovo istraživanje u Mannheimer Foundation. Redovno praćenje ukupnog zdravlja i telesne težine sprovedeno je pre i nakon injekcija kako bi se procenila dobrobit životinja.
[0060] Sekvenciranje cDNK kopirane iz mRNK izolovane iz afričkog zelenog majmuna (COS ćelije) i Cynomolgus macaque potvrdili su da 130 shRNK ima neusklađenost jedne baze sa bilo kojom sekvencom (Slika S5). Kaseta eksprimiranja sa 130 shRNK je ubačena u lentivirusni vektor koji je zatim korišćen za transdukciju COS ćelija. Cos-7 ćelije su održavane u DMEM sa 10% FBS i 1% penicilinom/streptomicinom. Ćelije su inficirane lentivirusnim vektorom koji eksprimira SOD1 shRNK 130 pod H1 promoterom i RFP pod CMV promoterom. RNK je ekstrahovana iz zaraženih i nezaraženih ćelija 72 sata posle infekcije korišćenjem RNAeasy Kit (Kiagen). cDNK je pripremljena pomoću RT<2>First kompleta za sintezu lanaca (SABiosciences). Nivoi SOD1 transkripta analizirani su koristeći qRT-PCR koji je otkrio da je majmunska SOD1 mRNK smanjena za ∼75% kod 130 shRNK transduciranih ćelija u poređenju sa lažno transduciranim kontrolnim ćelijama (Slika S5).
[0061] AAV9-SOD1-shRNK virus (1x10<13>vg/kg) infuziran je zajedno sa kontrastnim agensom preko lumbalne punkcije u subarahnoidni prostor tri mužjaka cinomolgus makakija, i jedan kontrolni pacijent injektiran je se AAV9-CB-GFP (1x10<13>vg/kg) (Slika 7a). Svaka intratekalna injekcija izvedena je lumbalnom punkcijom u subarahnoidni prostor lumbalne vrećice. AAV9 je resuspendovan sa omnipakom (joheksol), jodovanim jedinjenjem koje se rutinski koristi u kliničkim uslovima. Joheksol se koristi za validaciju uspešne kabalacije subarahnoidnog prostora i primenjen je u dozi od 100 mg/kg. Pacijent je smešten u bočni dekubitusni položaj i identifikovano je zadnje središnje mesto injektiranja na nivou ∼L4/5 (ispod konusa kičmene moždine). U sterilnim uslovima ubačena je spinalna igla sa stiletom i subarahnoidna kanilacija je potvrđena protokom bistrog CSF iz igle. Kako bi se smanjio pritisak u subarahnoidnom prostoru, drenirano je 0,8 ml CSF, i zatim je usledila injekcija mešavinom koja sadrži 0,7 ml ioheksola (300 mg/ml formulacije) pomešanog sa 2,1 ml virusa (ukupno 2,8 ml).
[0062] Nisu utvrđene nuspojave tretmana. Dve nedelje nakon injekcije, kičmene moždine su prikupljeni za analizu GFP eksprimiranja i SOD1 RNK nivoa. GFP eksprimiranje široko je viđeno u neuronskim i astrocitnim ćelijama širom sive i bele materije lumbalne kičmene moždine, što je područje koje je najbliže mestu injektiranja (Slike 7b-e). Imunoblotingom ekstrakata lumbalne kičmene moždine otkriveno je 87% smanjenje nivoa SOD1 proteina kod majmuna (Slika 7f, g). Lasersko hvatanje mikrodisekcijom je zatim korišćeno za izolovanje ukupne RNK iz motornih neurona kao i iz glije u obližnjem neuropilu. Analiza kvantitativnom RT-PCR upotrebom prajmera specifičnih za majmunski SOD1 (i normalizovan za aktin) potvrdila je 95 ± 3% pad u grupi motornih neurona i 66 ± 9% pad u neuropil grupi u poređenju sa uzorcima kontrolne životinje (Slika 7h).
[0063] Zatim smo ispitali nivo ćelijske transdukcije u kičmenoj moždini, uključujući cervikalni, torakalni i lumbalni segment. Otkriveno je da je GFP široko eksprimiran u svim analiziranim segmentima (Slika 8a-c). Broj motornih neurona pokazao je kaudalni i rostralni gradijent u ćelijskoj transdukciji, gde cervikalna regija pokazuje više od 50% GFP/Chat+ motornih neurona, povećavajući se do 65% u torakalnoj regiji i dostižući neverovatnih 80% u lumbalnoj regiji (Slika 8d). Kako bi se odredio ukupni nivo obaranja SOD1 postignut ovim transdukcijskim uzorkom, qRT-PCR za SOD1 izveden je na homogenatima celog segmenta cerviksa, toraksa i lumbalne vrpce. Rezultati su potvrdili robusno smanjenje SOD1 na sva tri nivoa kičmene moždine,
1
u rasponu od 60% smanjenja cervikalnog segmenta, 70% smanjenja torakalne regije i 88% smanjenja lumbalne regije (Slika 8e), u skladu sa proporcijom ćelija transduciranih u svakoj regiji.
Diskusija
[0064] Gore navedeni primeri pokazuju da je intravenska primena AAV9-SOD1-shRNK sigurna i dobro se podnosi kod divljih miševa, sa nedostatkom štetnih efekata posle dugoročne procene. Ovakav pristup postigao je jedno od najdužih produženja preživljavanja ikad prijavljenih u brzo progresivnom ALS modelu SOD1<G93A>miševa (povećava preživljavanje za 39% kada se tretman započne po rođenju). Još više ohrabrujuće, primećeno je usporeno napredovanje bolesti čak i kada se primenjuje AAV9 terapija za smanjenje mutirane SOD1 sinteze nakon pojave bolesti kod SOD1<G37R>miševa, čime se značajno produžava preživljavanje. Dakle, paradigma vaskularne isporuke kod miševa predstavlja dokaz koncepta da obaranje mutiranog SOD1 nakon pojave bolesti može biti korisno i u brže i u sporije progresivnom modelu ALS na klinički relevantnim tačkama bolesti. Zajedno, ovi podaci pokazuju da je snažno ciljanje i suzbijanje SOD1 nivoa putem AAV9 posredovane isporuke shRNK efikasno u usporavanju napredovanja bolesti u mišjim modelima ALS, kritično čak i kada se tretman započne nakon pojave.
[0065] Više nedavnih studija iznelo je hipotezu da divlji tip SOD1 može doprineti pogrešnim savijanjem patogenih mehanizama koji su osnova sporadičnog ALS putem koji je sličan onome koji pokreće mutirani SOD1<14, 30-32>. U ovaj dokazni materijal uključena je i naša demonstracija da su astrociti proizvedeni od strane sporadičnih ALS pacijenata toksični za ko-kultivisane motorne neurone i da je toksičnost ublažena siRNK posredovanom redukcijom divljih vrsta SOD1<30>. Ovi dokazi stvaraju potencijal da bi deo sporadičnih ALS pacijenata takođe mogao imati koristi od pristupa AAV9 posredovanog smanjenja SOD1 za koji smo pokazali da deluje efikasno u usporavanju napredovanja bolesti kod miševa koji razviju fatalnu, ALS-sličnu bolest od eksprimiranja mutacija koje izazivaju ALS kod SOD1.
[0066] Konačno, za prevođenje AAV9 posredovane supresije sinteze SOD1 u ljudsko okruženje, ustanovili smo da infuzija direktno u CSF na lumbalnom nivou kod primata koji nije čovek proizvodi značajno smanjenje SOD1 usmeravajući se i na motorne neurone i na ne-neuronske ćelije. Ovaj ishod pruža snažnu podršku za širenje tih napora na odraslog čoveka direktnom injekcijom u CSF, kao što je ranije predloženo<33, 34>, kako bi se 1) ograničili troškovi proizvodnje virusa, 2) smanjila mogućnost da hronično suzbijanje SOD1 na periferiji može imati štetne posledice, i 3) smanjiti izloženost virusima perifernom imunom sistemu<33>. Ovi podaci snažno ukazuju na AAV9-SOD1-shRNK kao tretman za ALS.
Tehnike/postupci koji se koriste u Primerima 1-7
[0067] Perfuzija i obrada tkiva. Kontrolni i tretirani SOD1<G93A>miševi su žrtvovani za imunohistohemijsku analizu ili na dan 21 posle injekcije, ili na krajnjem stadijumu. Životinje su anestezirane sa ksilazin/ketamin koktelom, transkardijalno perfuzirane sa 0,9% fiziološkim rastvorom, i zatim sa 4% paraformaldehidom. Kičmene moždine su uzete, isečene na blokove tkiva dužine 5-6 mm, i zatim isečene na poprečne preseke debljine 40 μm na vibratomu (Leica, Bannockburn, IL). Serijski odseci su čuvani u pločici sa 96 komorica koja je sadržala 4% paraformaldehida, i čuvani su na 4°C. loxSOD1<G37R>miševi krajnjeg stadijuma su anestezirani korišćenjem izoflurana i perfuzirani sa 4% paraformaldehidom. Secirani su segmenti kičmene moždine, uključujući cervikalni, torakalni i lumbalni segment. Posle krioprotekcije sa 20% saharoze/4% paraformaldehida preko noći, kičmene moždine su zamrznuti u izopentanu na -65°C, i serijski 30µm koronalni odseci su sakupljeni slobodno plutajući koristeći klizni mikrotom.
[0068] Za studije sigurnosti, P1, P21 tretirani i kontrolisani miševa divljeg tipa žrtvovani su u uzrastu od 180 dana. Životinje su anestezirane koristeći ksilazin/ketamin koktel i perfuzirane sa 0,9% fiziološkim rastvorom. Uklonjena su različita tkiva i čuvana u 10% puferisanom formalinu. Ova tkiva su dalje obrađena, blokirana i montirana za bojenje hematoksilinom i eozinom koristeći Nationwide Children's Hospital Morphology Core.
[0069] Cinomolgus majmuni kojima je injektiran virus eutanazirani su 2 nedelje nakon injekcije. Životinjama je anesteziran natrijum pentobarbital u dozi od 80 do 100 mg/kg intravenski i perfuzirana fiziološkim rastvorom. Seciranje mozga i kičmene moždine obavljeni su odmah, i tkiva su obrađenaa bilo za izolaciju nukleinske kiseline (brzo zamrznuta) ili naknadno fiksirana u 4% paraformaldehidu i potom krioprotektovana sa 30% saharoze i smrznuta u izopentanu na -65°C. Sakupljeni su 12µm koronalni segmenti iz lumbalne vrpce korišćenjem kriostata za slobodno plutajuće imuno bojenje.
[0070] Imunohistohemija. Mišje kičmene moždine obojene su kao plutajući segmenti. Tkiva su isprana tri puta po 10 minuta u TBS, zatim blokirane u rastvoru koji je sadržao 10% magarećeg seruma, 1% Triton X-100 i 1% penicilina/streptomicina tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Sva antitela su razblažena sa
1
blokirajućim rastvorom. Primarna antitela koja su korišćena su naredna: zečje anti-GFP (1:400, Invitrogen, Carlsbad, CA), zečje anti-SOD1 (1:200, Cell signaling, Danvers, MA), kozje anti-ChAT (1:50 Millipore, Billerica, MA), mišje anti-GFAP (1:200, Millipore, Billerica, MA), pileće anti GFAP (1:400, Abcam, Cambridge, MA) i zečje anti-Iba1 (1:400, Wako, Richmond VA). Tkiva se inkubiraju u primarnom antitelu na 4°C tokom 48-72 sata, i zatim tri puta isperu sa TBS. Posle pranja, tkiva su inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi u odgovarajućim FITC-, Cy3- ili Cy5-konjugovanim sekundarnim antitelima (1:200 Jackson Immunoresearch, Westgrove, PA) i DAPI (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA). Zatim su tkiva isprana tri puta sa TBS, montirana na slajdove i poklopljena sa PVA-DABCO. Sve slike su snimljene na konfokalnom mikroskopu sa Zeiss-laserskim skeniranjem.
[0071] Za DAB bojenje, delovi majmunske kičmene moždine su isprani tri puta sa TBS, blokirani tokom 2 sata na RT u 10% magarećem serumu i 1% Triton X-100. Segmenti su zatim inkubirani preko noći na 4°C sa zečjim anti-GFP primarnim antitelom (1:1000 Invitrogen, Carlsbad, CA) razblaženim u blokirajućem puferu. Naredneg dana, tkiva su isprana 3 puta sa TBS, inkubirana sa biotiniliranim sekundarnim anti-zečjim antitelom (1:200 Jackson Immunoresearch, Westgrove, PA) u blokirajućem puferu 30 minuta na sobnoj temperaturi, isprana 3 puta sa TBS i inkubirana tokom 30 min na RT sa ABC (Vector, Burlingame, CA). Segmenti su zatim isprane 3 puta sa TBS i inkubirana tokom 2 minuta sa DAB rastvorom na sobnoj temperaturi i isprana destilovanom vodom. Zatim su montirani na slajdove i prekriveni poklopcima u medijumu za montiranje. Sve slike su snimljene koristeći Zeiss Axioscope.
[0072] Kvantifikacija motornog neurona i astrocita. Za MN kvantifikaciju, serijski 40 µm debeli segmenti lumbalne kičmene moždine, razdvojeni sa 480 µm, označeni su kao što je opisano za GFP i ChAT eksprimiranje. Obojeni segmenti su serijski montirani na dijapozitivima od rostralnih do kaudalnih, i zatim poklopljeni. Segmenti su procenjeni korišćenjem konfokalne mikroskopije (Zeiss) sa 40× objektivnom i istovremeno FITC i Cy3 filterima. Ukupan broj ChAT pozitivnih ćelija pronađenih u ventralnim rogovima sa definisanim somom talirani pažljivim pregledom kroz ceo z-obim segmenta. GFP obeležene ćelije kvantifikovane su na isti način, istovremeno proveravajući ko-lokalizaciju sa ChAT. Za kvantifikaciju astrocita, kao i kod MN, serijski segmenti su obojeni za GFP, GFAP i zatim montirani. Koristeći konfokalnu mikroskopiju sa 63× objektivom i istovremeno FITC i Cy5 filterima, odabrana su nasumična polja u ventralnim rogovima segmenta lumbalne kičmene moždine od životinja koje su injektirane u repnu venu. Ukupni broj GFP i GFAP pozitivnih ćelija izbrojan je od najmanje 24 polja po životinji, dok se fokusirao na ceo z obim segmenta. Segmenti kičmene moždine od 3 životinje u grupi ispitivani su na količinu MN i astrocite.
[0073] Imunoblotska analiza. Kičmene su uzete iz P1, P21 injektiranih i kontrolnih SOD1<G93A>miševa 21 dan posle injekcije i od tretiranih i kontrolnih majmuna 2 nedelje nakon AAV9-SOD1-shRNK injekcije. Kičmene moždine su homogenizovane i pripremljeni su lizati proteina korišćenjem T-Per (Pierce) sa koktelom inhibitora proteaze. Uzorci su rastvoreni na SDS-PAGE prema uputstvima proizvođača. Primarna antitela koja su korišćena su zečje anti-SOD1 (1:750, Cell signaling, Danvers, MA) mišje anti-SOD1 (1:750, Millipore, Billerica, MA), zečje anti-SOD1 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA), zečje anti-Actin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA) i mišje anti-GAPDH (1:1000, Millipore, Billerica, MA). Sekundarna antitela koja su korišćena su anti- zečje HRP (1:10000-1:50000) i anti- mišje HRP (1:10000). Densitometrijska analiza izvršena je korišćenjem Image J softvera.
[0074] Lasersko snimanje mikrodisekcije. 12□m smrznuti segmenti lumbalne kičmene moždine ili cele kičmene moždine sakupljeni su na PEN membrane slajdovima (Zeiss, Minhen, Nemačka) i obojeni sa 1% Cresyl ljubičastom (Sigma, St. Louis, MO) u metanolu. Segmenti su osušeni na vazduhu i čuvani na -80°C. Nakon odmrzavanja, motorni neuroni su sakupljeni u roku od 30 minuta od bojenja korišćenjem laserskog hvatanja mikrodisektora PALM Robo3 Zeiss) koristeći naredna podešavanja: Cut energy: 48, LPC energy: 20, Cut focus: 80/81, LPC focus: 1, Position speed: 100, Cut speed: 50. Prikupljeno je oko 500 MN po životinji. Ne-neuronske ćelije iz ventralnog roga prikupljene su iz istih segmenata nakon sakupljanja motornih neurona.
[0075] qRT-PCR. RNK iz lasterski zarobljenih ćelija ili celih segmenta kičmene moždine iz cervikalnog, torakalnog i lumbalnog segmenta izolovana je korišćenjem RNaqueous Micro Kit (Ambion, Grand Island, NY) prema uputstvima proizvođača. RNK je zatim reverzno transkribovana u cDNK koristeći RT<2>HT First Strand Kit (SABiosciences, Valencia, CA). 12,5 ng RNK korišćeno je u svakoj K-PCR reakciji koristeći SyBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA) da se uspostavi relativna količina endogenog transkripta SOD1 majmuna kod životinja koje su primile AAV9-SOD1-shRNK u poređenju sa životinjama koje su primile
1
samo AAV9 -GFP. Svaki uzorak izveden je u trostrukoj i relativnoj koncentraciji izračunatoj koristeći ddCt vrednosti normalizovane u transkriptu endogenog aktina.
[0076] Analiza ponašanja i preživljavanja. Tretirani i kontrolni SOD1<G93A>miševi su praćeni za promene telesne mase dva puta nedeljno. loxSOD1<G37R>miševi su mereni nedeljno. Motorna koordinacija zabeležena je pomoću rotarodnog instrumenta (Columbus Instruments, Columbus, OH). Svaka nedeljna sesija sastojala se od tri ispitivanja na ubrzavajućem rotarodu, počevši od 5 obrtaja u minuti. Registrovano je vreme tokom kog je svaki miš ostao na šipki. SOD1<G93A>i loxSOD1<G37R>miševi su podvrgnuti nedeljnoj proceni čvrstoće zahvata zadnjih ekstremiteta korišćenjem merača čvrstoće držanja (Columbus Instruments, Columbus, OH). Svaka nedeljna sesija sastojala se od 3 (SOD1<G93A>miševi) ili 5 (loxSOD1<G37R>miševi) testovi po životinji. Analiza preživljavanja izvedena je korišćenjem Kaplan-Meier analize preživljavanja. Krajnji stadijum je definisan kao veštačka tačka smrti kada životinje više nisu mogle da „isprave“ sebe u roku od 30 sekundi nakon što su postavljene na leđa. Pojava i progresija bolesti određeni su retrospektivnom analizom podataka. Pojava bolesti se definiše kao uzrast u kom je životinja dostigla svoju maksimalnu težinu. Trajanje bolesti je definisano kao vremenski period između pojave i krajnjeg stadijuma bolesti. Trajanje rane bolesti je period između vršne težine i gubitka 10% telesne težine, dok kasno trajanje bolesti je definisano kao period između 10% gubitka telesne težine do krajnjeg stadijuma bolesti. Zbog kraćeg životnog veka SOD1<G93A>životinje, nismo procenili razliku između rane i kasne progresije.
[0077] Za analizu toksičnosti nakon injektiranja na P1 ili P21, tretirani i kontrolni WT miševi podvrgnuti su analizi ponašanja počevši od uzrasta -30 dana i nadgledani su do 6 meseci. Telesna težina je beležena nedeljno, dok su se performanse rotaroda i čvrstoća zahvata zadnjih ekstremiteta beleženi svake dve nedelje.
[0078] Hematologija i ispitivanja seruma. Uzorci krvi su sakupljeni u (K2) EDTA mikrotainer epruvete (BD) od tretiranih i kontrolnih WT miševa starih 150 dana punkcijom mandibularne vene. Istim životinjama je izvađena krv posle 180 dana, i krv je sakupljena u mikrotainer epruvetama za odvajanje seruma. Krv je ostavljena da se zgruša sat vremena, i zatim je centrifugirana na 10,000 o/min tokom 5 minuta. Bistra gornja faza (serum) je sakupljena i zamrznuta na -80°C. Hematološku i serumsku analizu je uradila kompanija Ani Lytics Inc, Gaithersburg, MD.
[0079] Statistička analiza. Svi statistički testovi izvedeni su pomoću softverskog paketa GraphPad Prism (San Diego, CA). Kaplana Meiera analize preživljavanja sprovedene su testom rangiranja zapisa. Poređenja medijana trajanja bolesti i vremena preživljavanja analizirana su Vilkoksonovim testom ranga sa znakom.
Primer 8
Razvoj kliničkog SOD1 shRNK konstrukta
[0080] AAV SOD1 shRNK vektor opisan u Primeru 2 nosi shRNK protiv ljudske SOD1 sekvence pod H1 promoterom (Slika 9a). Isti vektor takođe sadrži GFP kasetu eksprimiranja koja eksprimira GFP pod CBA promoterom. Ostali regulatorni elementi prisutni u ovoj kaseti uključuju CMV pojačivač, SV40 intron i bGH PolyA terminatorsku sekvencu. Ovde pokazujemo da AAV9 SOD1 shRNK primena rezultuje efikasnom regulacijom SOD1 na dole, zajedno sa robusnim eksprimiranjem GFP in vitro, kao i in vivo. Nisu primećene značajne promene posle dugoročne procene miševa divljeg tipa kojima je primenjivan AAV9 SOD1 shRNK. Ovi rezultati sugerišu da nema očiglednih efekata van cilja uzrokovanih dugoročnim eksprimiranjem SOD1 shRNK, kao ni prekomernim eksprimiranjem GFP. Iako nismo otkrili toksičnost GFP kod naših miševa, nekoliko izveštaja je pokazalo štetne efekte prekomernog eksprimiranja GFP in vitro i in vivo. Stoga, kako bi se u potpunosti otklonila mogućnost GFP toksičnosti, SOD1 shRNK konstrukt iz Primera 2 modifikovan je zamenom GFP kasete eksprimiranja nekodirajućim sekvencama za punjenje, uz zadržavanje veličine ukupnog DNK konstrukta okruženog sa ITR (Slika 9b). Ovo je važno jer udaljenost između dve sekvence ITR u velikoj meri utiče na sposobnost pakovanja okruženog konstrukta u AAV9 kapsidima[321-324].
[0081] Do danas nijedna od FDA odobrenih sekvenci nije lako dostupna. Međutim, postoji nekoliko plazmidnih kičmi koje je FDA odobrila za ljudsku primenu. Iz tih plazmida odabrani su mali fragmenti DNK koji ne odgovaraju bilo kojoj esencijalnoj DNK sekvenci neophodnoj za selekciju i replikaciju plazmida ili elemenata transkripcionih jedinica. Plazmidne kičme navedene su u Tabeli 1. DNK elementi iz različitih plazmida raspoređeni su u tandemu kako bi se stvorila kompletna sekvenca punioc od 1607 bp (SEQ ID NO:22). Konačno, DNK konstrukt koji sadrži SOD1 shRNK kasetu eksprimiranja, praćen sekvencom puniocem, sintetisan je od strane Genescript.
Tabela 1
2
[0082] Klinički SOD1 shRNK konstrukcija ima shRNK protiv ljudskog SOD1 pod H1 promoterom, i zatim sledi nekodirajući niz sekvenci za punjenje. Ova konstrukcija je dizajnirana na takav način da se više shRNK kaseta eksprimiranja može dodati konačnom vektoru istovremenog uklanjanja sekvence pušača. Mesto ograničenja endonukleaze dodato je sekvenci za punjenje tako da se deo punila može ukloniti kada se doda druga shRNK kaseta eksprimiranja (Slika 10). Ovo istovremeno uklanjanje i dodavanje DNK sekvenci pomoglo bi održavanju optimalne veličine celog konstrukta između ITR (∼2,0kb) kako bi se postiglo efikasno pakovanje.
[0083] Klinički SOD1 shRNK konstrukt dobijen od Genscript kloniran je u pJet1.2 šatl vektor preko EcoRV. Ovaj roditeljski klon je pretražen korišćenjem različitih restrikcijskih endonukleaza dizajniranih unutar konstrukta da potvrde tačan klon. Kpn1/Sph1 dvostruka digestija pJet-a SOD1 shRNK potvrdila je prisustvo kompletne konstrukta (2023 bp) dok je Xbal varenje potvrdilo prisustvo kasete za eksprimiranje SOD1 shRNK (414 bp) i elementa za punjenje, zajedno sa pJet kičmom (0003000 bp). Dvostruka varenje EcoRV/Pme1 takođe je otkrila prisustvo elementa za punjenje.
Primer 9
Klinička SOD1 shRNK efikasno smanjuje nivo ljudskog SOD1 proteina in vitro
[0084] Kako bi se utvrdila efikasnost leka de novo sintetizovanog SOD1 shRNK konstrukta za smanjivanje nivoa SOD1, HEK293 ćelije su transficirane pJet SOD1 shRNK plazmidom postupkom kalcijum fosfata. AAV SOD1 shRNK plazmid korišćen je kao pozitivna kontrola. Imunofluorescentna analiza HEK293 ćelija, 72 sata posle transfekcije, otkrila je nedostatak nativne GFP fluorescencije iz transficiranih ćelija od pJet SOD1 shRNK u poređenju sa ćelijama koje su bile transficirane sa AAV9 SOD1 shRNK. Imunoblot analiza ćelijskih lizata iz ovih ćelija dalje je potvrdila uspešnu zamenu GFP od pJet SOD1 shRNK plazmidom. Važno je da je pJet SOD1 shRNK rezultovala efikasnim snižavanjem SOD1 nivoa proteina (> 50%), slično AAV SOD1 shRNK plazmidu. Pogledati Sliku 11.
Primer 10
Generisanje kliničke AAV SOD1 shRNK
[0085] Klinički SOD1 shRNK konstrukt je dalje kloniran u AAV.CB.MCS vektor pomoću Kpn1/Sph1 mesta za generisanje kliničkog AAV SOD1 shRNK plazmida (Slika 12). AAV.CB.MCS je generisan iz AAV.CB.GFP plazmida dobijenog od merion Scientific zamenom GFP sa višestrukim klonirajućim mestom (MCS). Kloniranje kliničkog SOD1 shRNK konstrukta na Kpn1/Sph1 mestima stavlja ga između dva AAV2 ITR što olakšava pakovanje konstrukta u AAV9 virusne kapside. Pogledati Sliku 12.
[0086] Klinički AAV SOD1 shRNK plazmid je ispitan restrikcionim endonukleazama kako bi se potvrdilo prisustvo SOD1 shRNK kasete eksprimiranja (Xbal varenje), sekvence punioca (EcoRV/Pme1 dvostruko varenje) i netaknutih ITR sekvenci (Sma1 varenje).
Primer 11
Klinička AAV SOD1 shRNK efikasno smanjuje nivo ljudskog SOD1 proteina in vitro
[0087] Klinički AAV SOD1 shRNK plazmid je transficiran u HEK293 ćelije kako bi se odredila njegova efikasnost obaranja. Slično kao pJet SOD1 shRNK plazmid, kliničke AAV SOD1 shRNK transficirane ćelije bile su lišene bilo kakvog GFP eksprimiranja, što je očigledno imunofluorescencijom (Slika 13a-f) i imunoblot testom (Slika 13g). Što je još važnije, klinička AAV SOD1 shRNK efikasno je smanjila nivo SOD1 proteina u HEK293 ćelijama za više od 50% (Slika 13g, h). Sve u svemu, ovi rezultati potvrdili su uspešno generisanje kliničkog AAV SOD1 shRNK vektora sa funkcionalnom SOD1 shRNK kasetom eksprimiranja i potpuno uklanjanje kasete eksprimiranje transgena.
Dokumenti na koje se poziva
[0088]
1. Da Cruz, S. & Cleveland, D.W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Curr Opin Neurobiol 21, 904-919 (2011).
2. Rosen, D.R. i dr. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 362, 59-62 (1993).
3. Ilieva, H., Polymenidou, M. & Cleveland, D.W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of cell biology 187, 761-772 (2009).
4. Chattopadhyay, M. & Valentine, J.S. Aggregation of copper-zinc superoxide dismutase in familial and sporadic ALS. Antioxidants & redox signaling 11, 1603-1614 (2009).
5. Prudencio, M., Hart, P.J., Borchelt, D.R. & Andersen, P.M. Variation in aggregation propensities among ALS-associated variants of SOD1: correlation do human disease. Human molecular genetics 18, 3217-3226 (2009).
6. Boillee, S. i dr. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science 312, 1389-1392 (2006).
7. Kang, S.H. i dr. Degeneration and impaired regeneration of gray matter oligodendrocytes in amyotrophic lateral sclerosis. Nature neuroscience 16, 571-579 (2013).
8. Yamanaka, K. i dr. Astrocytes as determinants of disease progression in inherited amyotrophic lateral sclerosis. Nature neuroscience 11, 251-253 (2008).
9. Di Giorgio, F.P., Boulting, G.L., Bobrowicz, S. & Eggan, K.C. Human embryonic stem cell-derived motor neurons are sensitive do the toxic effect of glial cells carrying an ALS-causing mutation. Cell Stem Cell 3, 637-648 (2008).
10. Di Giorgio, F.P., Carrasco, M.A., Siao, M.C., Maniatis, T. & Eggan, K. Non-cell autonomous effect of glia on motor neurons in an embryonic stem cell-based ALS model. Nature neuroscience 10, 608-614 (2007).
11. Marchetto, M.C. i dr. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 3, 649-657 (2008).
12. Haidet-Phillips, A.M. i dr. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic do motor neurons. Nat Biotechnol 29, 824-828 (2011).
13. Bosco, D.A. i dr. Wild-type and mutant SOD1 share an aberrant conformation and a common pathogenic pathway in ALS. Nature neuroscience 13, 1396-1403 (2010).
14. Pokrishevsky, E. i dr. Aberrant localization of FUS and TDP43 is associated with misfolding of SOD1 in amyotrophic lateral sclerosis. PloS one 7, e35050 (2012).
15. Forsberg, K. i dr. Novel antibodies reveal inclusions containing non-native SOD1 in sporadic ALS patients. PLoS One 5, e11552 (2010).
16. Aggarwal, S. & Cudkowicz, M. ALS drug development: reflections from the past and a way forward. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 5, 516-527 (2008).
17. Gurney, M.E. i dr. Benefit of vitamin E, riluzole, and gabapentin in a transgenic model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 39, 147-157 (1996).
18. Foust, K.D. i dr. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature biotechnology 27, 59-65 (2009).
19. Duque, S. i dr. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery do adult motor neurons. Mol Ther 17, 1187-1196 (2009).
20. Zhong, Z. i dr. ALS-causing SOD1 mutants generate vascular changes prior do motor neuron degeneration. Nature neuroscience 11, 420-422 (2008).
21. Miller, R.G., Mitchell, J.D. & Moore, D.H. Riluzole for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)/motor neuron disease (MND). Cochrane Database Syst Rev 3, CD001447 (2012).
22. Smith, R.A. i dr. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of clinical investigation 116, 2290-2296 (2006).
23. Raoul, C. i dr. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med 11, 423-428 (2005).
24. Ralph, G.S. i dr. Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model. Nat Med 11, 429-433 (2005).
25. Miller, T.M. i dr. Virus-delivered small RNA silencing sustains strength in amyotrophic lateral sclerosis. Annals of neurology 57, 773-776 (2005).
26. Miller, T.M. i dr. An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-in-man study. Lancet neurology 12, 435-442 (2013).
27. Towne, C., Raoul, C., Schneider, B.L. & Aebischer, P. Systemic AAV6 delivery mediating RNA interference against SOD1: neuromuscular transduction does not alter disease progression in fALS mice. Mol Ther 16, 1018-1025 (2008).
28. Towne, C., Setola, V., Schneider, B.L. & Aebischer, P. Neuroprotection by gene therapy targeting mutant SOD1 in individual pools of motor neurons does not translate into therapeutic benefit in fALS mice. Mol Ther 19, 274-283 (2011).
29. Mandel, R.J., Lowenstein, P.R. & Byrne, B.J. AAV6-mediated gene silencing fALS short. Mol Ther 19, 231-233 (2011).
30. Synofzik, M. i dr. Mutant superoxide dismutase-1 indistinguishable from wild-type causes ALS. Human molecular genetics 21, 3568-3574 (2012).
31. Guareschi, S. i dr. An over-oxidized form of superoxide dismutase found in sporadic amyotrophic lateral sclerosis with bulbar onset shares a toxic mechanism with mutant SOD1. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 5074-5079 (2012).
32. Haidet-Phillips, A.M. i dr. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic do motor neurons. Nat Biotechnol 29, 824-828 (2011).
33. Bevan, A.K. i dr. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther 19, 1971-1980 (2011).
34. Gray, S.J. i dr. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery do neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther 19, 1058-1069 (2011).
2
35. Lioy, D.T. i dr. A role for glia in the progression of Rett's syndrome. Nature 475, 497-500 (2011).
36. Miranda, C.J. i dr. Aging brain microenvironment decreases hippocampal neurogenesis through Wnt-mediated survivin signaling. Aging Cell 11, 542-552 (2012).
37. Yamanaka, K. i dr. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 7594-7599 (2008).
2
2
2
�
2

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni adeno-povezani virus, koji sadrži superoksid dismutaza 1 (SOD1) shRNK-kodirajuću DNK CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO:4), gde genomu rekombinantnog adenopovezanog virusa nedostaju rep i cap geni.
2. Sastav koji sadrži rekombinantni adeno-povezani virus prema patentnom zahtevu 1.
3. Rekombinantni adeno-povezani virus za upotrebu u terapiji, koji sadrži SOD1 shRNK-kodirajuću DNK CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO:4), gde genomu rekombinantnog adenopovezanog virusa nedostaju rep i cap geni.
4. Rekombinantni adeno-povezani virus za upotrebu u tretmanu amiotrofične lateralne skleroze (ALS), koji sadrži SOD1 shRNK-kodirajuću DNK CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO:4), gde genomu rekombinantnog adeno-povezanog virusa nedostaju rep i cap geni.
5. Rekombinantni adeno-povezani virus za upotrebu prema patentnim zahtevima 3 ili 4, gde je rekombinantni adeno-povezani virus za sistemsku primenu.
6. Rekombinantni adeno-povezani virus za upotrebu prema patentnim zahtevima 3 ili 4, gde je rekombinantni adeno-povezani virus za intratekalnu primenu.
RS20200638A 2013-08-27 2014-08-26 Proizvodi i postupci za tretman amiotrofične lateralne skleroze RS60434B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361870585P 2013-08-27 2013-08-27
PCT/US2014/052753 WO2015031392A1 (en) 2013-08-27 2014-08-26 Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP14761771.6A EP3039146B1 (en) 2013-08-27 2014-08-26 Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60434B1 true RS60434B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=51494538

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230086A RS63942B1 (sr) 2013-08-27 2014-08-26 Proizvodi i postupci za lečenje amiotrofične lateralne skleroze
RS20200638A RS60434B1 (sr) 2013-08-27 2014-08-26 Proizvodi i postupci za tretman amiotrofične lateralne skleroze

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230086A RS63942B1 (sr) 2013-08-27 2014-08-26 Proizvodi i postupci za lečenje amiotrofične lateralne skleroze

Country Status (15)

Country Link
US (5) US20160272976A1 (sr)
EP (3) EP3039146B1 (sr)
CA (1) CA2922500A1 (sr)
CY (1) CY1123272T1 (sr)
DK (2) DK3702466T5 (sr)
ES (2) ES2799437T3 (sr)
FI (1) FI3702466T3 (sr)
HR (2) HRP20200862T1 (sr)
HU (2) HUE050546T2 (sr)
LT (2) LT3702466T (sr)
PL (1) PL3702466T3 (sr)
PT (2) PT3039146T (sr)
RS (2) RS63942B1 (sr)
SI (2) SI3702466T1 (sr)
WO (1) WO2015031392A1 (sr)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102016036B (zh) 2008-02-11 2015-04-08 阿克赛医药公司 经修饰的RNAi多核苷酸及其用途
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
CN102405286A (zh) 2008-09-22 2012-04-04 阿克赛医药公司 减小大小的自递送RNAi化合物
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US9102949B2 (en) 2010-04-23 2015-08-11 University Of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
EP3318634A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating diseases involving dominant-negative or gain of function mutations
HK1222093A1 (zh) * 2013-05-15 2017-06-23 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
PT3039146T (pt) * 2013-08-27 2020-08-11 The Res Institute At Nationwide Childrens Hospital Produtos e métodos para tratamento de esclerose lateral amiotrófica
AU2014346987A1 (en) 2013-11-05 2016-06-23 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for inhibiting NF-kB and SOD-1 to treat amyotrophic lateral sclerosis
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
AU2015231294B2 (en) * 2014-03-18 2020-10-29 University Of Massachusetts rAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
SI3126499T1 (sl) 2014-04-01 2020-09-30 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
WO2016054554A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted aavs
CA2964272A1 (en) 2014-10-21 2016-04-28 Guangping Gao Recombinant aav variants and uses thereof
RU2716422C2 (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
CN112410339A (zh) 2014-11-14 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
US10584321B2 (en) 2015-02-13 2020-03-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
CA3021949C (en) 2015-04-24 2023-10-17 University Of Massachusetts Modified aav constructs and uses thereof
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
WO2017007813A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid molecules targeting superoxide dismutase 1 (sod1)
WO2017007825A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
WO2017005806A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for expressing a polynucleotide of interest in the peripheral nervous system of a subject
EP3121284A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-25 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Bicistronic aav vector for rna interference in als
DK3364997T5 (da) 2015-10-22 2024-09-30 Univ Massachusetts Aspartoacylase genterapi til behandling af canavans sygdom
CA3002980A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
WO2017139643A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US11207426B2 (en) 2016-04-05 2021-12-28 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
SG11201808176TA (en) 2016-04-15 2018-10-30 The Trustees Of The Univ Of Pennsyvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
CA3252099A1 (en) 2016-05-18 2025-06-05 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
JP7165410B2 (ja) 2016-08-19 2022-11-04 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド 組換え自己相補的アデノ随伴ウイルスを使用して疾患を治療するための方法及び組成物
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
WO2018071831A1 (en) 2016-10-13 2018-04-19 University Of Massachusetts Aav capsid designs
KR20190088561A (ko) 2016-12-07 2019-07-26 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 인터류킨-1 수용체 길항제(IL-1RA) cDNA
SG11201909136PA (en) * 2017-03-31 2019-10-30 Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd Shrna expression cassette, polynucleotide sequence carrying the same, and use thereof
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
CA3059213A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CA3076036A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
WO2019060686A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Massachusetts NEW DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND USES THEREOF
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN119242711A (zh) 2017-10-16 2025-01-03 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症（als）的治疗
EP3707264A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Avexis Inc. Means and method for preparing viral vectors and uses of same
EP3794125A4 (en) * 2018-05-15 2022-07-13 University of Massachusetts MODIFIED AAV CONSTRUCTS AND USES THEREOF
US12228571B2 (en) 2018-06-08 2025-02-18 Novartis Ag Cell-based assay for measuring drug product potency
US12163129B2 (en) 2018-06-08 2024-12-10 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
DK3850089T5 (da) 2019-02-04 2024-08-19 Freeline Therapeutics Ltd Polynukleotider
JP2024539123A (ja) 2021-10-25 2024-10-28 ノバルティス アーゲー アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）送達を改善する方法
EP4555097A2 (en) * 2022-07-12 2025-05-21 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus gene therapy products and methods

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5448517A (en) 1987-06-29 1995-09-05 Kabushiki Kaisha Toshiba Electrically programmable nonvolatile semiconductor memory device with NAND cell structure
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2216005T3 (es) 1993-11-09 2004-10-16 Targeted Genetics Corporation Produccion de titulos elevados de vectores de aav recombinantes.
EP0728214B1 (en) 1993-11-09 2004-07-28 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
AU707866B2 (en) 1994-12-06 1999-07-22 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
ES2317646T3 (es) 1995-09-08 2009-04-16 Genzyme Corporation Vectores aav mejorados para terapia genica.
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
ES2399232T3 (es) 1997-09-05 2013-03-26 Genzyme Corporation Procedimientos para la generación de preparaciones de vectores de AAV recombinantes de títulos altos exentas de auxiliares
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
AU2001255575B2 (en) 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US7498316B2 (en) * 2004-04-06 2009-03-03 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using RNA interference
US20060229268A1 (en) * 2004-12-16 2006-10-12 Alsgen, Llc Small interference RNA (siRNA) molecules for modulating superoxide dismutase (SOD)
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CN102016036B (zh) * 2008-02-11 2015-04-08 阿克赛医药公司 经修饰的RNAi多核苷酸及其用途
WO2010071832A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides across the blood brain barrier using recombinant aav9
US9102949B2 (en) 2010-04-23 2015-08-11 University Of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
AU2011320612A1 (en) * 2010-10-26 2013-06-13 University Of Massachusetts Anti-SOD1 antibodies and uses thereof
WO2013078316A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
KR102315098B1 (ko) * 2012-11-01 2021-10-21 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
PT3039146T (pt) * 2013-08-27 2020-08-11 The Res Institute At Nationwide Childrens Hospital Produtos e métodos para tratamento de esclerose lateral amiotrófica
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2799437T3 (es) 2020-12-17
US20240344071A1 (en) 2024-10-17
HRP20200862T1 (hr) 2020-08-21
PL3702466T3 (pl) 2023-04-24
RS63942B1 (sr) 2023-02-28
CY1123272T1 (el) 2021-12-31
EP3702466B1 (en) 2022-12-28
US20190144868A1 (en) 2019-05-16
PT3039146T (pt) 2020-08-11
EP3702466A1 (en) 2020-09-02
DK3039146T3 (da) 2020-08-10
US10793861B2 (en) 2020-10-06
WO2015031392A9 (en) 2015-06-18
SI3702466T1 (sl) 2023-04-28
US20210108209A1 (en) 2021-04-15
PT3702466T (pt) 2023-01-24
EP3039146B1 (en) 2020-05-27
DK3702466T3 (da) 2023-03-20
LT3039146T (lt) 2020-07-27
DK3702466T5 (da) 2024-08-26
US20160272976A1 (en) 2016-09-22
SI3039146T1 (sl) 2020-10-30
HUE061629T2 (hu) 2023-07-28
LT3702466T (lt) 2023-02-27
HRP20230015T1 (hr) 2023-02-17
US20250154511A1 (en) 2025-05-15
FI3702466T3 (fi) 2023-03-23
EP4219727A2 (en) 2023-08-02
EP3039146A1 (en) 2016-07-06
ES2936220T3 (es) 2023-03-15
EP4219727A3 (en) 2023-09-06
HUE050546T2 (hu) 2020-12-28
CA2922500A1 (en) 2015-03-05
WO2015031392A1 (en) 2015-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3039146B1 (en) Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP7504967B2 (ja) ＭｅＣＰ２発現カセット
US10369193B2 (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
US20240318172A1 (en) Products and methods for inhibition of expression of peripheral myelin protein-22
GB2574243A (en) Adeno-associated viral vector-mediated gene therapy for treating fragile X-associated disorders
JP6966463B2 (ja) 組換えウイルス産物及びｄｕｘ４エクソンスキッピングを誘導するための方法
JP7781057B2 (ja) Ｉｒｆ２ｂｐｌ遺伝子の変異に関連する障害の治療のための材料および方法
JP2024514160A (ja) ダイナミン１バリアントの発現の阻害のための産物及び方法
JP2024537167A (ja) ミエリンタンパク質ゼロサイレンシング及びｃｍｔ１ｂ疾患を治療するための生成物及び方法
HK40098369A (en) Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
HK40031811B (en) Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
HK40031811A (en) Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
HK1230232B (en) Products and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4555097A2 (en) Adeno-associated virus gene therapy products and methods
HK40073109A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
WO2023240177A1 (en) Products and methods for treating diseases or conditions associated with mutant or pathogenic kcnq3 expression
HK40073109B (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders