[go: up one dir, main page]

RS60418B1 - Anti-fcrh5 antitela - Google Patents

Anti-fcrh5 antitela

Info

Publication number
RS60418B1
RS60418B1 RS20200733A RSP20200733A RS60418B1 RS 60418 B1 RS60418 B1 RS 60418B1 RS 20200733 A RS20200733 A RS 20200733A RS P20200733 A RSP20200733 A RS P20200733A RS 60418 B1 RS60418 B1 RS 60418B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
fcrh5
seq
cell
amino acid
Prior art date
Application number
RS20200733A
Other languages
English (en)
Inventor
Allen J Ebens Jr
Meredith C Hazen
Jo-Anne Hongo
Jennifer W Johnston
Teemu T Junttila
Ji Li
Andrew G Polson
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS60418B1 publication Critical patent/RS60418B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovde su data anti-FcRH5 antitela (npr., bispecifična antitela) i imunokonjugati i metode za upotrebu istih.
POZADINA
[0002] Fc 5 nalik receptoru (FcRL5, takođe poznat kao FcRH5 i IRTA2) pripada porodici od 6 nedavno identifikovanih gena superfamilije imunoglobulina (IgSF). Ova familija gena usko je povezana sa Fc receptorima sa konzervisanom genomskom strukturom, sastavom vanćelijskog domena Ig i nalik ITIM i ITAM signalnim motivima (Davis RS i dr., Eur J Immunol (2005) 35:674-80). Članovi ove porodice takođe su nazvani IFGP (Ig super-familija, FcR, gp42) i SPAP (SH2 domeni koji sadrže proteine sa fosfatazama), opisano je šest članova familije receptora FcRH/IRTA: FeRH1/IRTA5, FcRH2/IRTA4, FcRH3/IRTA3, FcRH4/RTA1, FcRFISI1RTA2 i FcRH6 (Polson AG i i dr., Int. Immunol. (2006) 18(9):1363-1373). Svi FcRH/IRTA sadrže neku kombinaciju kanoničkih imunoreceptorskih inhibitornih motiva inhibitora baziranih na tirozinu i imunoreceptorskoj aktivaciji baziranoj na tirozinu signalizirajućih motiva. FcRH cDNK kodiraju transmembranske glikoproteine tipa I sa višestrukim domenima nalik Ig vanćelijskih domena i citoplazmatskim domenima koji sadrže konsenzusne imunoreceptorske aktivirajuće i/ili inhibitorne signalizirajuće motive bazirane na tirozinu. FcRH geni strukturno su povezani, a njihovi proteinski proizvodi dele između 28 i 60% vanćelijskog identiteta jedni sa drugima. Oni takođe dele 15-31% identiteta sa najbližom familijom FcR-a. Postoji visok stepen homologije između različitih FcRH.
[0003] Ligand(i) za FcRH5 su nepoznati, ali FcRH5 je impliciran u povećanoj proliferaciji i nizvodnom izotipskom izrazu tokom razvoja primarnog antigena B-ćelija (Demerit-Brown J. i dr. J Leukoc Biol (2012) 91:59-67). FeRH5 lokus ima tri glavne izoforme mRNK (FcRH5a, FcRH5b i FcRH5c). Glavne izoforme FcRH5 proteina koje su kodirane ovim transkriptima imaju zajedničku sekvencu aminokiselina sve do ostatka 560, koji sadrži zajednički signalizirajući peptid i šest vanćelijskih Igdomena. FcRH5a predstavlja glikoprotein koji se izlučuje iz aminokiselina sa osam domena u obliku Ig, praćeno sa 13 jedinstvenih, pretežno polarnih aminokiselina na svom C-terminusu. FcRH5b se razlikuje od FcRH5a na aminokiselinskom ostatku 560 i proteže se na kratak deo od 32 dodatna ostatka, čija je hidrofobnost kompatibilna sa njegovim priključenjem na plazmatsku membranu preko GPI sidra. FcRH5c je najduža izoforma čija sekvenca odstupa od FcRH5a kod aminokiseline 746. FcRH5c kodira transmembranski glikoprotein 977 aa tipa I sa devet vanćelijskih domena Ig-tipa, koji sadrže osam potencijalnih N-povezanih glikozilacionih mesta, 23 aminokiselinskih transmembrana i 104 aminokiselinskih citoplazmatskih domena sa tri konsenzusa SH2 vezujućih motiva sa ITIM konsenzusom.
[0004] FcRH geni su grupisani zajedno u sred klasičnih FcR gena, FciRI, FciRH, FcγRIII i FcεRI, u oblasti 1q21-23 hromozoma 1. Ova oblast sadrži 1 od najčešćih sekundarnih hromozomskih abnormalnosti povezanih sa malignim fenotipom kod hematopoetskih tumora, posebno kod višestrukog mijeloma (Hatzivassiliou G. i dr. Immunity (2001) 14:277-89). FcRH5 se izražava samo u liniji B-ćelija, počevši od pre-B-ćelija, ali ne postiže puni izraz do zrelog stadijuma B-ćelija. Za razliku od većine poznatih površinskih proteina specifičnih za B-ćeliju (npr., CD20, CD19 i CD22), FcRH5 se dalje izražava u ćelijama plazme, dok su drugi markeri specifični za B-ćeliju regulisani (Poison AG i dr., Int Immunol (2006) 18:1363-73). Pored toga, mRNK FCRH5 je prekomerno izražena u višestrukim ćelijskim linijama mijeloma sa 1q21 abnormalnostima koje su detektovane pomoću oligonukleotidnih nizova (Inoue J., Am J Pathol (2004) 165:71-81). Obrazac ekspresije ukazuje da FcRH5 može biti meta za terapije zasnovane na antitelima za tretiranje višestrukog mijeloma. Višestruki mijelom je malignitet ćelija plazme okarakterisanih skeletnim lezijama, bubrežnom insuficijencijom, anemijom i hiperkalcemijom. U suštini trenutno neizlečiva terapija. Aktuelni terapijski tretman za multipli mijelom uključuje kombinacije inhibitora proteozoma bortezomiba (Velcade), imunomodulatora lenalidomida (Revlimid) i steroidnog deksametazona. WO 2006/039238 obelodanjuje antitela koja se specifično vezuju za vanćelijski domen FcRH5 koja nisu sposobna da se specifično vezuju za izoformnu cspecifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5.
[0005] FcRH5c specifične terapije zasnovane na antitelima i metode detekcije mogu biti posebno efikasne jer specifično prepoznaju FcRH5 koji je vezan za membrane umesto antitela koja prepoznaje i rastvorljive i membranske izoforme FcRH5. Međutim, samo poslednji domen nalik Ig FcRH5 (Igdomen 9) jedinstvena je vanćelijska oblast koja razlikuje tri glavne izoforme FcRH5, a postoji značajna homologija između domena Ig kao što su FcRH5. Dalje, poslednji domen koji odgovara Ig je visoko konzervisan između FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH5. Bilo koja terapija zasnovana na antitelima koja je specifično usmerena na FcRH5 bi morala imati minimalnu unakrsnu reaktivnost sa drugim FcRH3 kako bi se izbegli nepovoljni učinci van ciljanja (npr., FcRH3 je izražen u normalnim NK ćelijama). Postoji potreba u struci za agensima koja pomažu u dijagnozi i tretiranju karcinoma, kao što je kancer koji je povezan sa FcRH5.
REZIME
[0006] Ovde su data anti-FcRH5 antitela uključujući bispecifična antitela, imunokonjugate i postupci za proizvodnju istih.
[0007] Ovde je dat postupak proizvodnje anti-FcRH5 antitela koje veže izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c i koji se ne vezuje značajno za još jedan Ig-sličan domen FcRH5, pri čemu navedeni postupak sadrži korake:
(a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo pod uslovima pogodnim za ekspresiju navedenog antitela; i opciono
(b) obnavljanje antitela anti-FcRH5 iz ćelije domaćina ili medijuma ćelija domaćina,
gde je izoformni c-specifičan region vanćelijskog domena FcRH5c izabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) aminokiseline 745-850 od SEK ID NO: 1;
(ii) aminokiseline 745-851 od SEK ID NO: 1;
(iii) aminokiseline 752-834 od SEK ID NO: 1; i
(iv) aminokiseline 754-835 od SEK ID NO: 1.
[0008] Dalje je ovde dato izolovano anti-FcRH5 antitelo, poželjno antitelo anti-FcRH5 prema pronalasku, proizvedeno postupkom, pri čemu anti-FcRH5 antitelo ima jednu ili više sledećih karakteristika:
(a) unakrsna reakcija sa humanim i cino FcRH5 pune dužine,
(b) ne ukrštaju se reakcije sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4,
(c)vezuju se za endogeni FcRH5, i (d) ne reaguju u unakrsnoj reakciji sa FcRH5a.
[0009] U jednom drugom aspektu pronalaska dat je imunokonjugat koji sadrži anti-FcRH5 antitelo pronalaska i citotoksično sredstvo, opciono gde imunokonjugat ima formulu Ab- (L-D) p, pri čemu:
(a) Ab je anti-FcRH5 antitelo pronalaska;
(b) L je veznik;
(c) D je lek izabran od majtansinoida, auristatina, kaliheamicina, pirolobenzodiazepina i derivata nemorubicina; i
(d) p je u opsegu od 1-8, a poželjno od 2-5.
[0010] Takođe je data farmaceutska formulacija koja sadrži anti-FcRH5 antitelo pronalaska i/ili imunokonjugat pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono dalje sadrži dodatno terapeutsko sredstvo.
[0011] Anti-FcRH5 antitelo i/ili imunokonjugat ovog pronalaska može se upotrebiti u postupku lečenja lica koji ima FcRH5-pozitivan karcinom, koji postupak uključuje davanje licu efikasne količine anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugata, pri čemu je FcRH5-pozitivni karcinom opciono B-ćelijski proliferativni poremećaj i gde postupak opciono dalje uključuje davanje dodatnog terapeutskog sredstva licu.
[0012] Anti-FcRH5 antitelo i/ili imunokonjugat ovog pronalaska može se upotrebiti u postupku inhibiranja proliferacije FcRH5-pozitivne ćelije, koji postupak uključuje izlaganje FcRH5-pozitivne ćelije anti-FcRH5 antitelu i/ili imunokonjugata pod uslovima dopuštenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugata na FcRH5 na površini FcRH5-pozitivne ćelije, čime inhibira proliferaciju FcRH5-pozitivne ćelije, pri čemu je opciono FcRH5-pozitivna ćelija B ćelija.
[0013] Anti-FcRH5 antitelo pronalaska može da se koristi u postupku detekcije humanog FcRH5 u biološkom uzorku, pri čemu postupak uključuje kontakt biološkog uzorka sa anti-FcRH5 antitelom pod uslovima dozvoljenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela na ljudski FcRH5 koji otkriva da li se formira kompleks između anti-FcRH5 antitela i ljudskog FcRH5 koji se prirodno pojavljuje u biološkom uzorku, pri čemu je opciono biološki uzorak uzorak krvi.
[0014] Anti-FcRH5 antitelo pronalaska može se upotrebiti u postupku detekcije FcRH5-pozitivnog karcinoma, pri čemu metoda uključuje (i) davanje anti-FcRH5 antitela subjektu koji ima ili uključuje kontakt biološkog uzorka sa anti-FcRH5 antitelom pod uslovima dozvoljenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela na ljudski FcRH5, i otkrivanje da li kompleksno anti-FcRH5 antitelo ukazuje na FcRH5-pozitivan karcinom kod subjekta, i gde je opciono obeleženo anti-FcRH5 antitelo sadrži anti-FcRH5 antitelo konjugovano na pozitronski emiter, a opciono je pozitronski emiter<89>Zr.
[0015] U nekim otelotvorenjima, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je deo antitela koji povezuje FcRH5. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG1, IgG2a ili IgG2b antitelo.
[0016] U nekim otelotvorenjima, antitelo ima jednu ili više sledećih karakteristika: a) unakrsno je reaktivno sa humanim i cino FcRH5 u celoj dužini, b) ne reaguje sa FcRH3, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4, c) vezuje se za endogeni FcRH5, d) ne reaguje unakrsno sa FcRH5a, i e) ne reaguje unakrsno sa drugim domenom nalik Ig FcRH5,
[0017] U nekim otelotvorenjima, antitelo je bispecifično antitelo. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo vezuje FcRH5 i CD3.
[0018] U nekim otelotvorenjima data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano antitelo. U nekim otelotvorenjima data je ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, dat je postupak za stvaranje ovde opisanog antitela. U nekim otelotvorenjima, dati su imunokonjugati. U nekim otelotvorenjima imunokonjugati se sastoje od anti-FcRH5 antitela i citotoksičnog agensa. U nekim otelotvorenjima anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat ima formulu Ab-(L-D)p, gde: (a) Ab je antitelo koje je ovde opisano; (b) L je veznik; (c) D je lek izabran iz maitanzinoida, auristatina, kalceheamicina, pirolobenzodiazepina i derivata nemorubicina; i (d) p je u opsegu od 1-8. U nekim otelotvorenjima D je auristatin. U nekim takvim otelotvorenjima, D ima formulu DE
gde su R<2>i R<6>svaki metil, R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<5>je H, R<7>ije sec-butil, svaki R<8>je nezavisno izabran od CH3, O-CH3, OH, i H; R<9>je H; i R<18>je -C(R<8>)2-C(R<8>)2-aril. U nekim otelotvorenjima, D je MMAE ima strukturu:
[0019] U nekim otelotvorenjima, D je pirolobenzodiazepin Formule A:
pri čemu tačkaste linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3; R<2>je nezavisno izabran od H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje izabran iz halo ili dihalo, pri čemu je R<D>nezavisno izabran iz R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo; R<6>i R<9>su nezavisno izabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR ‘, NO2, Me3Sn i halo; R<7>je nezavisno izabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn i halo; Q je nezavisno izabran iz O, S i NH; R je ili H, ili R ili, gde Q je O, SO3M, gde je M metalni katjon; R i R’ su svaki nezavisno izabrani iz opciono supstituisanih C1-8alkil, C2-12alkil, C3-8heterociklil, C3-20heterociklil i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR’, R i R’ zajedno sa atomom azota na koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten; R<12>, R<16>, R<19>i R<17>su kao što je definisano za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>, respektivno; R” je C3-12alkilenska grupa, čiji lanac može biti prekinut sa jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnih prstena koji su opciono supstituisani, a X i X’ su nezavisno izabrani iz O, S i N(H). U nekim takvim otelotvorenjima, D je
gde je n 0 ili 1.
[0020] U nekim otelotvorenjima, D je derivat nemorubicina. U nekim otelotvorenjima, D ima strukturu izabranu iz:
[0021] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži veznik koji se može ukloniti proteazom. U nekim otelotvorenjima, veznik sadrži val-cit dipeptid ili Phe-homoLis dipeptid. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži veznik koji je kiselinsko-labilan. U nekim takvim otelotvorenjima, veznik sadrži hidrazon.
[0022] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat ima formulu izabranu iz:
gde je S atom sumpora;
[0023] U nekim otelotvorenjima, p je u opsegu od 2-5.
[0024] U nekim otelotvorenjima date su farmaceutske formulacije kako je definisano u patentnim zahtevima. U nekim takvim otelotvorenjima farmaceutska formulacija sadrži imunokonjugat koji sadrži antitelo koje vezuje FcRH5, npr., kako je ovde opisano. Anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu cspecifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima farmaceutska formulacija dalje sadrži dodatni terapeutski agens.
[0025] U nekim otelotvorenjima data su anti-FcRh5 antitela i/ili imunokonjugati prema pronalasku za upotrebu u metodama tretiranja pojedinaca koji imaju FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivne karcinome kao što je definisano u patentnim zahtevima. U nekim takvim otelotvorenjima, postupak obuhvata davanje farmaceutske formulacije koja sadrži imunokonjugat koji sadrži antitelo koje vezuje FcRH5 i/ili FcRH5 bispecifično antitelo, npr., kako je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo FcRH5 sadrži FcRH5 vezujuću ruku i CD3 vezujuću ruku. Antitelo protiv FcR5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela vezuju se sa domenom 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je proliferativni poremećaj B-ćelija. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je neoplazma ćelija plazme. U nekim otelotvorenjima neoplazma ćelija plazme je višestruki mijelom. U nekim otelotvorenjima, metoda obuhvata davanje dodatnog terapeutskog agensa pojedincu.
[0026] U nekim otelotvorenjima data su anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugati pronalaska za upotrebu u metodama inhibiranja proliferacije FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivne ćelije kao što je definisano u patentnim zahtevima. U nekim otelotvorenjima metoda obuhvata izlaganje ćelije imunokonjugatu koji sadrži antitelo koje vezuje FcRH5 i/ili FcRH5 bispecifično antitelo pod uslovima dozvoljenim za vezivanje antitela na FcRH5 na površini ćelije. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo FcRH5 sadrži FcRH5 vezujuću ruku i CD3 vezujuću ruku. Antitelo protiv FcRH5 vezuje izoformnu cspecifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela vezuju se sa domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, antitelo koje vezuje FcRH5 je antitelo koje je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer je proliferativni poremećaj B-ćelija. U nekim otelotvorenjima, Fr-RH5-pozitivni kancer je neoplazma ćelija plazme. U nekim otelotvorenjima neoplazma ćelija plazme je višestruki mijelom. U nekim otelotvorenjima, metoda obuhvata davanje dodatnog terapeutskog agensa pojedincu.
[0027] Antitelo koje vezuje FcRH5 može biti konjugovano za oznaku. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 anti tela vezuju domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, antitelo koje vezuje FcRH5 je antitelo koje je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, oznaka je pozitronski emiter. U nekim otelotvorenjima pozitronski emiter je Zr.
[0028] U nekim otelotvorenjima, postupak detektovanja ljudskog FcRH5 u biološkom uzorku dat je kao što je definisano u patentnim zahtevima. U nekim otelotvorenjima postupak obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelom protiv FcRH5 pod uslovima dozvoljenim za vezivanje antitela protiv FcRH5 na prirodni FcRH5, i otkrivanje da li je formiran kompleks između anti-FcRH5 antitela i prirodno ljudskog FcRH5 u biološkom uzorku. Antitelo protiv FcRH5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je antitelo koje je ovde opisano.
[0029] U nekim otelotvorenjima, postupak za detekciju FcRH5-pozitivnog karcinoma dat je kao što je definisano u patentnim zahtevima. U nekim takvim otelotvorenjima, postupak obuhvata (i) davanje označenog anti-FcRH5 antitela subjektu koji ima ili se sumnja da ima FcRH5-pozitivni kancer, i (ii) detektuje označeno anti-FcRH5 antitelo u subjektu, pri čemu detekcija označenog anti-FcRH5 antitela ukazuje na FcRH5-pozitivni kancer u subjektu. Antitelo protiv FcRH5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju domen 9 nalik Ig FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo je antitelo koje je ovde opisano.
KRATAK OPIS SLIKA
[0030]
Sl. 1 (A) prikazuje tri glavne izoforme FcRH5, FcRH5a (IRTA2a, UniProt Identifier K96RD9-3), FcRH5b (IRTA2b, UniProt Identifier K96RD9-4) i FcRH5c (IRTA2c, UniProt Identifier K96RD9-1), domeni nalik Ig su numerisani i odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci UniProt Identifier K69RD9-1: domeni nalik Ig 1 (aa (“(aminokiselina”) 23-100), domeni nalik Ig 2 (aa 105-185), domeni nalik Ig 3 (aa 188-271), domeni nalik Ig 4 (287-373), domeni nalik Ig 5 (aa 380-466), domeni nalik Ig 6 (aa 490-555 ), domeni nalik Ig 7 (aa 568-652), domeni nalik Ig 8 (aa 658-731) i domeni nalik Ig 9 (aa 754-835). Slika 1 (B) prikazuje deo FcRH5 SEQ ID NO:136) i strukturu i homologiju FcRH5 aminokiselina 735 do 977 FcRH5c (SEQ ID NO:2).
Sl. 2 pokazuje vezivanje FcRH5 antitela na SVT2 ćelije transfektovane sa (A) ljudskim FcRH5 i (B) cino FcRH5, u različitim koncentracijama.
Sl. 3 pokazuje vezivanje FcRH5 antitela na (A) EJM ćelije ili (B) OPM2 ćelije transfektovane sa ljudskim FcRH5 i vezivanje subklona suprematanta (C) 5A10.1, (D) 5F1.1, (E) 3G7.1 i (F) 6D2.2 do MOLP2 ćelija koje ekspresivno izražavaju FcRH5.
Sl. 4 pokazuje (A) vezivanje supstanci FcRH5 subklona suprematanta na 293 ćelije transfektovane sa VT ili (B) mutiranim FcRH5 sa brisanjem 4 membranskih proksimalnih vanćelijskih domena.
Sl. 5 pokazuje vezivanje (A) FcRH5 antitela na FcRH5a pomoću ELISA, i (B) vezivanje subklona suprematanta na ljudske B ćelije.
Sl. 6 pokazuje vezivanje supernatanta FcRH5 subklona na SVT2 ćelije transfektovane sa (A) FcRH1, (B) FcRH2, (C) FcRH3 ili (D) FcRH4.
Sl. 7 pokazuje vezivanje suprematanta subklona FcRH5 antitela na NK ćelije.
Sl. 8 pokazuje (A) aktivnost ubijanja FcRH5 bisFabs, FcRH5-TDB (klon 10A8) i (B) HER2-TDB i (C) aktivnost ubijanja FcRH5-bisFabs i (D) FcRH5-TDBs na FcRH5 transfektovanih 293 ćelija.
Sl. 9 prikazuje aktivnosti ubijanja (A) i (B) T-ćelijsku aktivaciju FcRH5 bisFabs i FcRH5-TDBs na MOLP-2 ćelijama.
1
DETALJAN OPIS
I. DEFINICIJE
[0031] Izraz „FcRH5“, kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji prirodni, zreli FcRH5 koji proizlazi iz obrade prekursor proteina FcRH5 u ćeliji. Termin uključuje FcRH5 iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr., ljudi i cinomolgus majmuni) i glodare (npr., miševi i pacovi), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Takođe uključuju i varijante sa prirodnim pojavama FcRH5, npr., spojene varijante ili alelne varijante. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske sekvence ljudskih FcRH5 proteina su FcRH5a (IRTA2a; UniProt Identifier K96RD9-3; 759 aa), FcRH5b (IRTA2b; UniProt Identifier K96RD9-4; 592 aa), FcRH5c (IRTA2c; UniProt Identifier K96RD9-1; 977 aa (SEQ ID NO:1), UniProt Identifier K96RD9-2 (124 aa) i/ili FcRH5d (IRTA2d; UniProt Identifier K96RD9-5; 152 aa).
[0032] Izraz “glikozilovani oblici FcRH5” odnosi se na prirodne oblike FcRH5 koji se post-translatorno modifikuju dodavanjem ostataka ugljenih hidrata.
[0033] “Procenat (%) identiteta aminokiselinske sekvence” u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon usklađivanja sekvenci i uvođenja praznine, ukoliko je potrebno, da bi se postigao maksimalni identitet procentualne sekvence, a ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne zamene kao deo sekvencijalnog identiteta. Usaglašavanje u cilju određivanja procenta identiteta procenata aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su dati u struci, na primer, upotrebom javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softveri. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za usklađivanje sekvenci, uključujući bilo koji algoritam koji je potreban da se postigne maksimalno poravnanje duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju. Međutim, za date svrhe, vrednosti % identiteta aminokiselinske sekvence generišu se pomoću računarskog programa za poređenje sekvence ALIGN-2. Računarski program za poređenje ALIGN-2 je napravljen od strane Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovana pod US registracionim brojem autorskih prava TKSU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od strane Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili se može sastaviti iz izvornog koda. Program ALIGN-2 bi trebao biti sastavljen za upotrebu u operativnom sistemu UNIX, uključujući i digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri upoređivanja sekvence podešavaju se pomoću programa ALIGN-2 i ne razlikuju se.
[0034] U situacijama gde je ALIGN-2 korišćen za upoređivanje aminokiselinske sekvence, % identiteta aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A do, sa ili u poređenju sa datom aminokiselinskom sekvencom B (koja se alternativno može formulisati kao data aminokiselina sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence sa ili protiv date aminokiselinskom sekvencom B) računa se na sledeći način:
100 puta od frakcije X/Y gde je X broj ostataka aminokiselina zabeleženih kao identična podudaranja programom poravnanja sekvence ALIGN-2 u poravnanju A i B programa, a gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Biće prihvaćeno da tamo gde dužina sekvence aminokiseline A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identiteta aminokiselinske sekvence A do B neće izjednačiti % identiteta aminokiselinske sekvence B u A. Ukoliko nije drugačije naznačeno, sve vrednosti % identiteta aminokiselinskih sekvenci koje se ovde koriste se dobijaju kao što je opisano u prethodnom paragrafu koristeći računarski program ALIGN-2.
[0035] Izrazi “anti-FcRH5 antitelo” i “antitelo koje se vezuje za FcRH5” odnose se na antitelo koje je sposobno da veže FcRH5 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens pri ciljanju FcRH5. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja anti-FcRH5 antitela na nepovezani protein bez FcRH5 je manji od oko 10% vezivanja antitela prema FcRH5, kao što je mereno, npr., putem radioimunološkog testa (RIA). U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za FcRH5 ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1mM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM,, ≤ 5 Nm,, ≤ 4 nM,, ≤ 3 nM,, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 mM, ≤ 0.01 nM, ili ≤ 0.001 nM (npr., 10<-8>M ili manje, npr., Od 10<-8>M do 10 M, npr., Od 10 M do 10 M). U određenim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 se vezuje za epitop FcRH5 koji je konzervisan među FcRH5 iz različitih vrsta. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju domen 9 nalik Ig FcRH5c.
[0036] Termin “antitelo” ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok pokazuju željenu antigensku-vezujuću aktivnost.
[0037] “Fragment antitela” odnosi se na molekul koji nije nepromenjeno antitelo koje sadrži deo nepromenjenog antitela i koje se vezuje za antigen na koji se nepromenjeno antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diatela; linearna antitela; molekuli antitela od jednog lanca (npr., scFv); i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.
[0038] Pojam “epitop” odnosi se na određenu lokaciju na molekulu antigena na kojoj se antitelo vezuje.
[0039] “Antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela na njegov antigen u testu konkurencije za 50% ili više, i obratno, referentna antitela blokiraju vezivanje antitela na njegov antigen u testu konkurencije za 50% ili više. Ovde je dat primeren test konkurencije.
[0040] Termin “monoklonsko antitelo”, kao što se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije u suštinski homogenim antitelima, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, osim za moguća varijanta antitela, npr., prirodno nastale mutacije ili nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskih antitela, takve varijante su uglavnom prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo pripreme monoklonskih antitela usmereno je protiv jedne determinante na antigenu. Prema tome, modifikator “monoklonalno” označava karakter antitela kao dobijen od suštinski homogene populacije antitela i ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se izraditi različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na hibridnu metodu, metode rekombinantne DNK, metode faga-prikaza i metode koje koriste transgenske životinje koje sadrže ceo ili deo ljudskog imunoglobulinskog lokusa, takve metode i druge primerne metode za stvaranje monoklonskih antitela koje su ovde opisane.
[0041] Izrazi “antitela cele dužine”, “nepromenjeno antitelo” i “celo antitelo” ovde se koriste naizmenično da bi se odnosili na antitelo koje ima strukturu koja je u suštini slična izvornoj strukturi antitela ili koja ima teške lance koje sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
[0042] "Golo antitelo" se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterološkom delom (npr., Citotoksičnim delom) ili radio-obeležavanjem. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0043] “Izvorna antitela” odnose se na prirodne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, prirodna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su disulfidno vezani. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se naziva i varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, praćeno sa tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se naziva i varijabilni domen ili promenljivi domen lakog lanca, praćen konstantnim svetlosnim (CL) domenom. Laki lanac antitela može se dodeliti jednom od dva tipa, koja se zove kapa (κ) i lambda (λ), zasnovana na aminokiselinskoj sekvenci njenog konstantnog domena.
[0044] Termin “himerno” antitelo se odnosi na antitelo u kome deo teškog i/ili lakog lanca potiče iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
[0045] “Humano antitelo” je ono koje poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onom antitelu proizvedenom u čoveku ili ljudskoj ćeliji ili izvedena iz ne-ljudskog izvora koji koristi repertoare ljudskih antitela ili druge sekvence kodiranja ljudskih antitela. Ova definicija ljudskog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatak koji ne-ljudski antigen vezuju.
[0046] “Humanizovano” antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz ne-humanih HVR i ostataka aminokiselina iz humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jedanog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili u suštini svi HVR-ovi (npr., CDR-ovi) odgovaraju onima od ne-humanih antitela, a svi ili u suštini svi FR-ovi odgovaraju humanim antitelima. Humanizovano antitelo opciono može obuhvatati barem deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz humanog antitela. “Humanizovani oblik” ‘antitela, na primer, ne-humano antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.
[0047] “Klasa” antitela odnosi se na vrstu konstantnog domena ili konstantne oblasti posedovane od strane njegovog teškog lanca. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih se dalje mogu podeliti na podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2, teški konstantni domeni lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju α, δ, ε, γ, i m, redom.
[0048] Izraz “Fc oblast” ovde se koristi za definisanje C-terminalne oblasti teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar deo konstantne oblasti. Termin uključuje Fc oblasti prirodne sekvence i varijante Fc oblasti. U jednom otelotvorenju, Fc region za težak lanac IgG proteže se od Cys226 ili od Pro230 do karboksil-terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminal lizin (Lys447) regiona Fc može ili ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka u oblasti Fc ili konstantnoj oblasti je u skladu sa sistemom EU oznaka, koji se naziva i EU indeks, kao što je opisano u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0049] Termin “varijabilna oblast” ili “varijabilni domen” odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VI.., redom) imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri konzervisana okvirna područja (FR-ovi) i tri hipervarijabilne oblasti (HVR-ovi), (videti, npr., Kindt i dr. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).)) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da daje antigen vezujuću specifičnost, Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen može biti izolovan korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koji vezuje antigen za prikaz biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, redom. Videti, npr., Portolano i dr., J. Immunol, 150:880-887 (1993); Clarkson i dr., Nature 352:624-628 (1991).
[0050] “Okvir” ili “FR” se odnose na ostatke varijabilnog domena, osim ostatka hipervarijabilne oblasti (HVR). FR varijabilna oblast obično se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećem nizu u VH (ili VL):FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
1
[0051] “Ljudski konsenzusni okvir” je okvir koji predstavlja najčešće nastale aminokiselinske ostatke u selekciji humanih imunoglobulinskih VL ili VH okvira. Generalno, odabir humane imunoglobulinske VL ili VH sekvence je iz podgrupe varijabilnih domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. U jednom za VL, podgrupa je podgrupa kapa I kao u (Kabat i dr., supra, U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat i dr., supra,
[0052] Termin “hipervarijabilna oblast” ili “HVR”, kao što se ovde koristi, odnosi se na svaku od oblasti varijabilnog domena antitela koji su hipervariabilni u nizu i/ili formiraju strukturno definisane petlje (“hipervarijabilne petlje”). Uopšteno govoreći, izvorna četiri lanca antitela sadrže šest HVR-ova; tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR uglavnom obuhvataju ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz oblasti za određivanje komplementarnosti (CDR), a drugi su najvažnije varijabilnost sekvence i/ili uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji se javljaju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987).) Pojavljuju se primeri CDR-a (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) na aminokiselinskim ostacima 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3, 31-35B od H1, 50-65 od H2 i 95-102 od H3. ((Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR uglavnom sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervariable petlji. CDR takođe sadrže “specifičnost koja određuje ostatke” ili “SDR”, koji su ostaci koji kontaktiraju antigen. SDR su sadržane unutar regiona CDR-a koji se zovu skraćeni CDR-i ili a-CDR. Primeri a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) se javljaju u aminokiselinskim ostacima 31-34 od L1, 50-55 od L2, 89-96 od L3, 31-35B od H1, 50-58 od H2 i od 95-102 od H3. (videti Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008).) Osim ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i ostali ostaci u varijabilnom domenu (npr., FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat i dr., supra.
[0053] “Humani okvir akceptora” za svrhe u ovom smislu je okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu lanca varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvir varijabilnog domena teškog lanca (VH) izvedenog iz humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira, kako je definisano u nastavku. Prihvatljivi humani okvir “izveden iz” humanog imunoglobulinskog okvira ili ljudskog konsenzusnog okvira može sadržati istu njegovu sekvencu aminokiselina ili može sadržati promene aminokiselinske sekvence. U nekim otelotvorenjima broj promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, ljudski okvir VL akceptora je identičan po redosledu prema VL humanoj imunoglobulinskoj okvirnoj sekvenci ili sekvenci humanog konsenzusa.
[0054] “Afinitet” se odnosi na jačinu ukupnog skupa nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kao što se ovde koristi, “afinitet vezivanju” odnosi se na nasledni afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., antitela i antigena). Afinitet molekula X za svog partnera Y generalno može biti predstavljen konstantom disocijacije (Kd). Afinitet može se izmeriti zajedničkim metodama poznatim u struci, uključujući i one opisane ovde. Specifični ilustrativni i primeri otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja opisani su u nastavku.
[0055] Antitelo “zrelog afiniteta” odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednoj ili više hipervarijabilnih oblasti (HVR-ovi), u poređenju sa roditeljskim antitelom koji ne poseduje takve izmene, takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
[0056] “Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali ne ograničavajući se na citotoksični agens.
[0057] Izraz “citotoksični agensi” koji se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili uzrokuje smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne izotope (npr., At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivni izotop Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr., metotreksat, adriamicin, vinca alkaloidi (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiranje rasta; enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitski enzimi; antibiotici; toksini kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante; i razne antitumorne ili antikancerogene supstance koje su objavljene u nastavku.
[0058] “Efektivne funkcije” odnose se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati oblasti Fc antitela, koje se razlikuju od izotipa antitela. Primeri funkcija efektora antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisno od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; regulisanje nivoa receptora na površini ćelije (npr., receptor B-ćelija); i aktivacija B ćelija.
[0059] “Izolovano antitelo” je ono koje je odvojeno od komponente svoje prirodne sredine. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečisti do čistoće veće od 95% ili 99%, kao što je određeno, na primer, elektroforetikom (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografijom (npr., Razmena jona ili HPLC sa reverznom fazom). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, videti, npr., Flatman et a /., J. Chromatagr, B 848:79-87 (2007).
[0060] “Izolovana nukleinska kiselina” odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente njegove prirodne sredine. Izolovana nukleinska kiselina sadrži molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali molekul nukleinske kiseline je prisutan ekstrahromozomalno ili na mestu hromozoma koji se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0061] “Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo” odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinskih kiselina u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takvi molekuli nukleinske kiseline prisutni na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
[0062] Termin “vektori”, kao što se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban za razmnožavanje druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Termin uključuje vektor kao samostalno regulišuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koji je uveden. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina na koje su operativno povezane. Ovakvi vektori ovde se nazivaju “ekspresioni vektori”.
[0063] Izrazi “ćelija domaćina”, “ćelijska linija domaćina” i “kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćina uključuju “transformante” i “transformisane ćelije”, koje uključuju primarno transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje bez obzira na broj prolaza. Potomstvo možda nije potpuno identično u sadržaju nukleinskih kiselina kao u roditeljskoj ćeliji, ali može sadržati mutacije. Mutirano potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je prikazano ili izabrano za prvobitno transformisanu ćeliju je ovde uključeno.
[0064] Kao što se ovde koristi, “tretman” (i njegove gramatičke varijacije kao što je “tretirati” ili “tretiranje”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da promeni prirodni tok tretiranja koji se tretira, i može se izvesti ili za profilaksu ili tokom kursa kliničke patologije. Poželjni efekti tretiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovnog nastanka bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, smanjenje brzine progresije bolesti, poboljšanja ili palijacije bolesti, stanja bolesti i remisije
1
ili poboljšane prognoze. U nekim otelotvorenjima antitela koja se ovde nalažu koriste se za odlaganje razvoja bolesti ili za usporavanje progresije bolesti.
[0065] Izrazi “karcinom” i “kancerozni” odnose se na fiziološku bolest sisara koji opisuju fizički poremećaj ćelija ili proliferaciju ćelija. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom (npr., Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom), blastom, sarkom i leukemiju. Određeniji primeri takvih karcinoma su kancer skvamoznih ćelija, kancer malih ćelija pluća, karcinom ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, glioma, kancer grlića materice, kancer jetre, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, hepatom, karcinom dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, endometrijuma ili karcinom materice, karcinom pljuvačnih žlezda, karcinom bubrega, kancer jetre, kancer prostate, kancer tiroidne žlezde, hepatični karcinom, leukemija i drugi limfoproliferativni poremećaji i razne vrste karcinoma glave i vrata.
[0066] “Malignitet B-ćelija” ovde obuhvata ne-Hodgkinov limfom (NHL), uključujući NHL, mali limfocitni (SL) NHL, NHL međufazni/folikularni NHL, difuzni NHL srednjeg stepena, imunoblastni NHL visokog stepena, limfoblastni (NHL) visokog stepena, limfocit predominantna Hodgkinova bolest (LPHD), mali limfocitni limfom (SLL), limfocitni limfom (LPHD), limfocitni limfom (LLHD), hronična limfocitna leukemija (CLL), indolentni NHL, uključujući ponovljeni indolentni NHL i rituksimab-refraktorni indolentni NHL; leukemiju, uključujući akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), leukemiju vlasastih ćelija, hroničnu mijeloblastnu leukemiju; limfom limfnih ćelija; i druge hematološke malignitete. Takve maligne bolesti mogu se tretirati antitelima usmerenim na markere površine B-ćelija, kao što je FcRH5 (npr., FcRH5c). Takve bolesti su ovde predviđene da se tretiraju davanjem antitela usmerenog na površinski marker B ćelije, kao što je FcRH5 (npr., FcRH5c), i uključuje davanje nekonjugovanog (“golog”) antitela ili antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom kao što je ovde obelodanjeno. Ovakve bolesti su ovde razmatrane kako bi se lečile kombinovanom terapijom uključujući anti-FcRH5 antitelo (uključujući FcRH5 bispecifično antitelo) ili konjugat lekova anti-FcRH5 antitela u kombinaciji sa drugim antitelom ili konjugatom antitela, još jedan citotoksični agens, zračenje ili drugi tretman istovremeno ili u seriji.
[0067] Termin „ne-Hodgkin-ov limfom“ ili „NHL“, kao što se ovde koristi, odnosi se na kancer limfnog sistema koji ne pripada Hodgkin-ovim limfomima. Hodgkin-ovi limfomi generalno se mogu razlikovati od ne-Hodgkin-ovih limfoma na osnovu prisustva Reed-Stemberg ćelija u Hodgkin-ovim limfomima i na osnovu odsustva navedenih ćelija u ne-Hodgkin-ovim limfomima. Primeri ne-Hodgkin-ovih limfoma obuhvaćeni terminom kao što se ovde koristi obuhvataju bilo koje koji bi bili identifikovani kao takvi od strane stručnjaka u ovoj oblasti (npr., onkolog ili patolog) u skladu sa šemama klasifikacije poznatim u struci, kao što je Revised European-American Lymphoma (REAL) šema opisana u Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Videti, naročito, listu na SL. 11.57, 11.58 i 11.59. Određeniji primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, povratni i otporni NHL, prednji niskostepeni NHL, NHL stadijuma III/IV, NHL otporan na hemoterapiju, prekursor B limfoblastna leukemija i/ili limfom, mali limfocitni limfom, B-ćelijska hronična limfocitna leukemija i/ili prolimfocitna leukemija i/ili mali limfocitni limfom, B-ćelijski prolimfocitni limfom, imunocitom i/ili limfoplazmacitni limfom, limfoplazmacitni limfom, B-ćelijski limfom marginalne zone, limfom slezine marginalne zone, ekstranodalni marginalne zone—MALT limfom, nodalni limfom marginalne zone, leukemija vlasastih ćelija, plazmacitom i/ili mijelom ćelija plazme, niskostepeni/folikularni limfom, srednjestepeni/folikularni NHL, mantle-ćelijski limfom, limfom centra folikula
[0068] (folikularni), srednjestepeni difuzni NHL, difuzni limfom velikih B-ćelija, agresivni NHL, (uključujući agresivni prednji NHL i agresivni povratni NHL), NHL, koji se ponovo vraća ili otporni na autolognu transplantaciju matičnih ćelija, primarni medijastinalni limfom velikih B-ćelija, primarni
1
izlivni limfom, visokostepeni imunoblastni NHL, visokostepeni limfoblastni NHL, visokostepeni NHL malih neprobijenih ćelija, voluminozni NHL, Burkitt-ov limfom, prekursor (periferni) velika granularna limfocitna leukemija, mycosis fungoides i/ili Sezary sindrom, kožni (kutani) limfomi, anaplastični limfom velikih ćelija, angiocentrični limfom.
[0069] Poremećaji plazma ćelija rezultat su nekontrolisane podele ili množenja klona ćelijske plazme. Ćelije plazme nastaju iz aktiviranih B limfocita (tj. B-ćelija). Svaka B-ćelija proizvodi jedinstveni receptor, poznat kao B-ćelijski receptor, raspoređen na svojoj ćelijskoj površini koja je specifična za stranu supstancu, tj. antigen. Kada se receptor B-ćelija vezuje za svoji srodni antigen, ćelija koja vrši ekspresiju receptora aktivira se da ponovo uđe u ćelijski ciklus, stvarajući mnoge sopstvene klonirane kopije. Klonovi sazrevaju u ćelijama plazme koje se nalaze uglavnom u koštanoj srži i koje su specijalizovane za proizvodnju kopija B-ćelijskog receptora koji su pušteni u krvotok kao antitela. U ćeliji plazme. poremećaj, ćelija plazme ili roditeljska B-ćelija trpi genetsko oštećenje, što dovodi do supresije ili neosetljivosti prema normalnim ograničenjima na deljenje ćelija i/ili aktivnost. Ćerke ćelija plazme koje potiču iz takvih ćelija su maligne u tome što mogu nekontrolisano podeliti i/ili generisati višak istog imunoglobulina (antitela). Često proizvedeni imunoglobulin je nepotpun ili ima netačnu konformaciju koja može dovesti do akumulacije proteina (poznatog i kao monoklonski protein, M protein, paraprotein ili amiloidni protein, u zavisnosti od specifičnog poremećaja) u serumu, tkivu ili organima (naročito bubrezima), što dovodi do disfunkcije organa i/ili otkaza. Poremećaji ćelija plazme uključuju monoklonske gamopatije neodređenog značaja (MGUS), višestruki mijelom (MM), makroglobulinemiju, bolesti teškog lanca i amiloidozu sistemskog lakog lanca (AL), koji se razlikuju na osnovu proliferativne prirode klona, stepena učešća u srži, i izraženi tip M proteina. Dodatni poremećaji ćelija plazme su solitarni plazmacitom, ekstraramedularni plazmacitom, višestruki solitarni plazmacitom, leukemija ćelija plazme, Valdenstromova makroglobulinaemija, B-ćelijski ne-Hodgkinov limfom, B-ćelijska hronična limfocitna leukemija.
[0070] Izraz “FcRH5-pozitivan kancer” odnosi se na kancer koji sadrži ćelije koje vrše ekspresiju FcRH5 na svojoj površini. U svrhu utvrđivanja da li ćelija vrši ekspresiju FcRH5 na površini, smatra se da ekspresija FcRH5 mRNK korelira sa ekspresijom FcRH5 na površini ćelije. U nekim otelotvorenjima ekspresija mRNK FcRH5 određuje se metodom izabranom in situ hibridizacijom i RT-PCR (uključujući kvantitativni RT-PCR). Alternativno, ekspresija FcRH5 na površini ćelije može se odrediti, na primer, koristeći antitela na FcRH5 u postupku kao što su imunohistohemija, FACS itd. U nekim otelotvorenjima FcRH5 je jedan ili više od FcRH5a, FcRH5b, FcRH5c, UniProt identifikator Q96RD9-2, i/ili FcRH5d. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcRH5c.
[0071] Izraz “FcRH5-pozitivna ćelija” odnosi se na ćeliju koja izražava FcRH5 na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je jedan ili više od FcRH5a, FcRR5b, FcRH5c, UniProt identifikatora Q96RD9-2 i/ili FcRH5d. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcRH5c.
[0072] “Efikasna količina” nekog agensa, na primer, farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i za vremenske periode potrebne za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
[0073] “Pojedinac” ili “subjekt” je sisar. Sisari uključuju: ali bez ograničenja, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i primate koji nisu čovek kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili subjekt je čovek.
[0074] Termin “uputstvo” se koristi da se odnosi na smernice koje su uobičajeno uključena u komercijalne pakete terapeutskih proizvoda, koje sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda.
[0075] Termin “farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u obliku koji omogućava da
1
biološka aktivnost aktivnog sastojka sadržanog u njemu bude delotvorna i koja ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo otrovne za subjekt kojem bi formulacija bila davana.
[0076] “Farmaceutski prihvatljiv nosač” se odnosi na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za subjekt. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
[0077] „Alkil” je C1-C18ugljovodonik koji sadrži normalne, sekundarne, tercijarne ili ciklične atome ugljenika, Primeri su metil (Me, -CH3), etil (Et, -CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i- propil, -CH(CH3)2), 1butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1- propil (i-Bu, ibutil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH)CH(CH)), 3-metil-1-butil (-CHCHCH(CH)), 2-metil-1-butil (-CHCH(CH)CHCH), 1-heksil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3- heksil (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2pentil(-C(CH)CHCHCH), 3-metil-2-pentil (-CH(CH)CH(CH)CHCH), 4-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3. Izraz “ C1-C8alkil”, kao što se ovde koristi, odnosi se na pravi lanac ili razgranat, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik koji ima od 1 do 8 atoma ugljenika. Reprezentativne grupe “ C1-C8alkila” uključuju, ali se ne ograničavaju na, “metil, -etil, -n-propil,” n-butil, -n-pentil, -n-heksil, -neptit, -n-oktil, -n-nonil i -n-decil; dok razgranati C1-C8alkili uključuju: ali bez ograničenja, -izopropil, -sekbutil, -izobutil, -terc-butil, -izopentil, 2-metilbutil, nezasićeni C1-C8alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -1-pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1-butenil, -2-metil-2-butenil, -2,3-dihidro- dimetil-2-butenil, 1-heksil, 2-heksil, 3-heksil, -acetilenil, -propinil, -1-butinil, -2-butinil, -1- pentinil, -2- pentilil, -3-metilbutinil. C1-C8 alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali bez ograničenja, - C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’ -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; gde je svaki R‘ nezavisno izabran iz H, -C1-C8alkila i arila
[0078] Pojam “ C1-C12alkil”, kao što se ovde koristi, odnosi se na pravi lanac ili razgranat, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik koji ima od 1 do 12 atoma ugljenika. C1-C12alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali bez ograničenja, - C1-C8alkil, O-(C1-C8alkil),-aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -SO3R’,-S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; gde je svaki R‘ nezavisno izabran iz H, - C1-C8alkila i arila.
[0079] Pojam “ C1-C6alkil”, kao što se ovde koristi, odnosi se na pravi lanac ili razgranat, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika. Reprezentativne grupe “ C1-C6alkil” uključuju, ali se ne ograničavaju na, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil, -i n-heksil; dok razgranati C1-C6alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -izopropil, -sek-butil, -izobutil, -terc-butil, -izopentil i 2-metilbutil; nezasićeni C1-C6alkil uključuju, ali nisu ograničeni na, -vinil, -alil, - 1-butenil, -2-butenil i -izobutilenil, -1-pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1- butenil, - 2-metil-2-butenil, -2,3-dimetil-2-butenil, 1-
1
heksil, 2-heksil i 3-heksil. Grupa C1-C6alkil može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa, kao što je gore opisano za C1-C8alkil grupu.
[0080] Pojam “ C1-C4alkil”, kao što se ovde koristi, odnosi se na pravi lanac ili razgranat, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik koji ima od 1 do 4 atoma ugljenika. Reprezentativne “ C1-C4alkil” grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil; dok razgranati C1-C4alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -izopropil, -sek-butil, -izobutil, -terc-butil; nezasićeni C1-C4alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -vinil, -alil, -1-butenil, -2-butenil i -izobutilenil, C1-C4alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa, kao što je gore opisano za C1-C8alkil grupu.
[0081] “Alkoksi” je alkil grupa koja se pojedinačno vezuje za kiseonik. Primerne alkoksi grupe obuhvataju, ali bez ograničenja, metoksi (-OCH3) i etoksi (-OCH2CH3). alkoksi” je alkoksi grupa sa 1 do 5 atoma ugljenika, Alkoksi grupe mogu biti nesupstituisane ili supstituisane sa jednom ili više grupa, kao što je gore opisano za alkil grupe.
[0082] “Alkenil” je C2-C18ugljovodonik koji sadrži normalne, sekundarne, tercijarne ili ciklične atome ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenosti, tj. dvostruke veze ugljen-ugljenik, sp<2>. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na: etilen ili vinil (-CH=CH2), alil (-CH2CH=CH2), ciklopentenil (-C5H7) i 5-heksenil (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2). alkenil” je ugljovodonik koji sadrži 2 do 8 atoma normalnog, sekundarnog, tercijarnog ili cikličnog ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. dvostruke veze ugljenika-ugljenik, sp<2>.
[0083] “Alkinil” je C2-C18ugljovodonik koji sadrži atome normalnog, sekundarnog, tercijarnog ili cikličnog ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenosti, tj. trostrukom vezom ugljenik-ugljenik. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na; acetilenski (-C≡CH) i propargil (-CH2C≡CH). “C2-C8alkinil” je ugljovodonik koji sadrži 2 do 8 normalnih, sekundarnih, tercijarnih ili cikličnih atoma ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenosti, tj. trostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp.
[0084] “Alkilen” se odnosi na zasićeni, razgranati ili pravi lanac ili ciklični ugljovodonični radikal sa 1-18 atoma ugljenika i koji imaju dva monovalentna radikalna centra koja se dobijaju uklanjanjem dva atoma vodonika od istih ili dva različita atoma ugljenika od izvornog alkana. Tipični alkilenski radikali uključuju, ali se ne ograničavaju na: metilen (-CH2-) etil (-CH2CH2-), 1,3-propil (-CH2CH2CH2-, 1,4-butil (-CH2CH2CH2CH2-) i slično.
[0085] “ C1-C10alkilen” je pravi lanac, zasićena ugljovodonična grupa formule -(CH2)1-10-. Primeri C1-C10alkilena uključuju metilen, etilen, propilen, butilen, pentilen, heksilen, heptilen, otililen, nonilen i dekalen.
[0086] “Alkenilen” se odnosi na nezasićeni, razgranat ili pravi lanac ili ciklični ugljovodonični radikal sa 2-18 atoma ugljenika i koji imaju dva monovalentna radikalna centra izvedena uklanjanjem dva atoma vodonika iz istog ili dva različita atoma ugljenika izvornog alkena. Tipični alkenilenski radikali uključuju, ali nisu ograničeni na: 1,2-etilen (-CH=CH-).
[0087] “Alkinilen” se odnosi na nezasićeni, razgranat ili pravi lanca ili ciklični ugljovodonični radikal od 2-18 atoma ugljenika i koji imaju dva monovalentna radikalna centra izvedena uklanjanjem dva atoma vodonika od istih ili dva različita atoma ugljenika izvornog alkina. Tipični alkinilenski radikali uključuju, ali se ne ograničavaju na: acetilen (-C≡C-), propargil (-CH2C≡C-) i 4-pentilil (-CH2CH2CH2C≡C-).
[0088] “Aril” se odnosi na karbocikličnu aromatsku grupu. Primeri aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. Karbociklična aromatična grupa ili heterociklična aromatična grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali bez ograničenja,
1
--C1-C8alkil, -O- (C1-C8alkil,), -aril, -C(O)R ‘, -OC(O)R’, -C(O)OR ‘, -C (O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R ‘, -S(O)2R’, -S(O)R ‘, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; pri čemu je svaki R’ nezavisno izabran od H, -C1-C8alkila i arila.
[0089] aril” je aril grupa sa 5 do 20 atoma ugljenika u karbocikličnim aromatičnim prstenovima. Primeri C5-C20aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. C5-C20aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana kao što je opisano gore za aril grupe. “ C5-C14aril” je aril grupa sa 5 do 14 atoma ugljenika u karbocikličnim aromatičnim prstenovima. Primeri C5-C14aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. C5-C14aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana kao što je gore opisano za aril grupe.
[0090] “Arilen” je arilna grupa koja ima dve kovalentne veze i može biti u orto, meta ili para konfiguracijama kao što je prikazano u sledećim strukturama:
u kojoj fenil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa do četiri grupe, uključujući, ali bez ograničenja, -C1-C8alkile, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; pri čemu je svaki R‘ nezavisno izabran od H, -C1-C8alkila i arila.
[0091] “Arilalkil” se odnosi na aciklični alkil radikal u kome je jedan od atoma vodonika vezan za atom ugljenika, tipično terminalni ili sp ugljenikov atom, zamenjen sa aril radikalom. Tipične arilalkil grupe obuhvataju, ali bez ograničenja, benzil, 2-feniletan-1-il, 2-fenileten-1-il, naftilmetil, 2-naftiletan-1-il, 2-naftileten-1-il, naftobenzil, 2 -naftofeniletan-1-il i slično. Arilalkilna grupa sadrži 6 do 20 atoma ugljenika, npr., alkilni ostatak, uključujući alkanil, alkenil ili alkinil grupe, od arilalkilne grupe je od 1 do 6 atoma ugljenika i arilni ostatak je 5 do 14 atoma ugljenika.
[0092] “Heteroarilalkil” se odnosi na aciklični alkil radikal u kome je jedan od atoma vodonika vezan za atom ugljenika, tipično terminalni ili sp karbon atom, zamenjen sa heteroaril radikalom. Tipične heteroarilalkilne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, 2-benzimidazolilmetil, 2-furiletil i slično. Heteroarilalkil grupa sadrži 6 do 20 atoma ugljenika, npr., alkilni ostatak, uključujući alkanil, alkenil ili alkinil grupe, heteroarilalkil grupe je od 1 do 6 atoma ugljenika i heteroaril grupa je 5 do 14 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabrana od N, O, P i S. Heteroaril ostatak heteroarilalkil grupe može biti monocikl koji ima od 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika ili biciklični koji sadrži 7 do 10 prstenova (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabranih od N, O, P i S), na primer: biciklični [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem.
[0093] “Supstituisani alkil”, “supstituisani aril” i “supstituisani arilalkil” označava alkil, aril i arilalkil redom, u kojima je jedan ili više atoma vodonika svaki nezavisno zamenjen sa supstituentom. Tipični supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni na, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R,-C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, gde je svaki X nezavisno halogen: F, Cl, Br ili I; i svaki R je nezavisno -H, C2-C18alkil, C6-C20aril, C3-C14heterociklična, zaštitna grupa ili grupa proleka. Alkilenske, alkenilenske i alkinilenske grupe, kao što je gore opisano, takođe mogu biti podjednako supstituisane.
2
[0094] “Heteroaril” i “heterocikl” se odnose na sistem prstena u kome je jedan ili više atoma prstena heteroatom, npr., azot, kiseonik i sumpor. Heterociklični radikal sadrži 3 do 20 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabrana iz N, O, P i S. Heterocikl može biti monociklični koji ima od 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabrana iz N, O, P i S) ili biciklični koji sadrži 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabrana iz N, O, P i S), na primer: biciklični [4,5 ], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem.
[0095] Primeri heterocikla su opisani, npr., u Paquette, Leo A., “Principles of Modem Heterocyclic Chemistry” (W.A. Benjamin, New York, 1968), naročito poglavlja 1, 3,4, 6, 7, i 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), posebno Tomovi 13, 14, 16, 19, i 28; i J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
[0096] Primeri heterocikla uključuju u vidu primera ali bez ograničenja piridil, dihidropiridil, tetrahidropiridil (piperidil), tiazolil, tetrahidrotiofenil, oksidovani tetrahidrotiofenil, pirimidinil, furanil, tienil, pirolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil, tianaftalenil, indolil, indolenil, hinolinil, izohinolinil, benzimidazolil, piperidinil, 4-piperidonil, pirolidinil, 2-pirolidonil, pirolinil, tetrahidrofuranil, bis-tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, bis-tetrahidropiranil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil dekahidrohinolinil, oktahidroizohinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2, 5-tiadiazinil, 2H, 6H-1,5,2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, izobenzofuranil, hromenil, ksantenil, fenoksatinil, 2H-pirolil, izotiazolil, izoksazolil, pirazinil, piridazinil, indolizinil, izoindolil, 3H- 1H-indazolil, purinil, 4H-hinolizinil, ftalazinil, naftiridinil, kinoksalinil, kinazolinil, einolinil, pteridinil, 4aH-karb azolil, karbazolil, β-karbolinil, fenandridinil, akridinil, pirimidinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, furazanil, fenoksazinil, izohromanil, hromanil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, pirazolinil, piperazinil, benzizoksazolil, oksindolil, benzoksazolinil i izatinoil.
[0097] Kao primer i bez ograničenja, heterocikli vezani ugljenikom vezani su na položaju 2, 3, 4, 5 ili 6 piridina, položaju 3,4, 5 ili 6 piridazina, položaj 2, 4, 5 ili 6 pirimidina, položaj 2, 3, 5 ili 6 pirazina, položaj 2, 3, 4 ili 5 furana, tetrahidrofurana, tiofurana, tiofena, pirola ili tetrahidropirola, položaj 2, 4 ili 5 oksazol, imidazol ili tiazol, položaj 3,4 ili 5 izoksazola, pirazola ili izotiazola, položaj 2 ili 3 aziridina, položaj 2, 3 ili 4 azetidina, položaj 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 kinolina ili položaja 1, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 izokinolina. Još tipičnije, ugljenikom vezani heterocikli uključuju 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 5-piridil, 6-piridil, 3-piridazinil, 4-piridazinil, 5-piridazinil, 6-piridazinil, 2-pirimidinil, 4- pirimidinil, 5-pirimidinil, 6-pirimidinil, 2pirazinil, 3-pirazinil, 5-pirazinil, 6-pirazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil ili 5-tiazolil.
[0098] Kao primer i bez ograničenja, heterocikli vezani azotom vezani su na poziciji 1 aziridina, azetidina, pirola, pirolidina, 2-pirolina, 3-pirolina, imidazola, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazola, 2-pirazolin, 3-pirazolin, piperidin, piperazina, indola, indolina, lH-indazola, položaj 2 izoindola ili izoindolin, položaj 4 morfolina i položaj 9 karbazola ili β-karbolina. Tipičnije, heterocikli vezani za azot uključuju 1-aziridil, 1-azetil, 1-pirolil, 1-imidazolil, 1-pirazolil i 1-piperidinil.
[0099] “ C3-C8heterocikl” se odnosi na aromatični ili nearomatični C3-C8karbocikl, u kome jedan do četiri atoma ugljenika u prstenu budu nezavisno zamenjeni heteroatomom iz grupe koju čine O, S i N. Reprezentativni primeri C3-C8heterocikla uključuju, ali nisu ograničeni na, benzofuranil, benzotiofen, indolil, benzopirazolil, kumarinil, izokinolinil, pirolil, tiofenil, furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, izotiazolil, izoksazolil i tetrazolil. C3-C8heterocikl može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do sedam grupa, uključujući, ali bez ograničenja na, --C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), - aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’,-C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -S(O)2R’,-S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; pri čemu je svaki R‘ nezavisno izabran iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0100] “ C3-C8heterociklo” se odnosi na C3-C8heterocikličnu grupu definisanu gore, pri čemu je jedan od atoma vodonika grupe heterocikla zamenjen vezom. C3-C8heterocikl može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do šest grupa, uključujući, ali bez ograničenja, C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril,-C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; pri čemu je svaki R’ nezavisno izabran od H, -C1-C8alkila i arila.
[0101] “ C3-C20heterocikl” se odnosi na aromatični ili nearomatični C3-C8karbocikl, u kome jedan do četiri atoma ugljenika u prstenu budu nezavisno zamenjeni heteroatomom iz grupe koju čine O, S i N. A C3-C20heterocikl može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do sedam grupa, uključujući, ali bez ograničenja na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, - C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogen, -N3, -NH2, - NH(R’), -N(R’)2i -CN; pri čemu je svaki R’ nezavisno izabran iz H, -C1-Cs alkila i arila.
[0102] “ C3-C20heterociklo” se odnosi na C3-C20heterocikličnu grupu definisanu gore, pri čemu je jedna od atoma vodonika heterociklične grupe zamenjena vezom. “Karbocikl” označava zasićeni ili nezasićeni prsten koji ima 3 do 7 atoma ugljenika kao monocikl ili 7 do 12 atoma ugljenika kao bicikl. Monociklični karbocikli imaju 3 do 6 atoma prstena, još više tipični 5 ili 6 atoma prstena. Biciklični karbocikli imaju od 7 do 12 atoma prstena, npr., raspoređeni kao biciklični [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem ili 9 ili 10 atoma prstena raspoređeni kao biciklčni [5,6] ili [6,6] sistem. Primeri monocikličnog karbocikla uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, 1-ciklopent-1-enil, 1-ciklopent-2-enil, 1-ciklopent-3-enil, cikloheksil, 1-cikloheks-1-enil, 1-cikloheks-2 -enil, 1-cikloheks-3enil, cikloheptil i ciklooktil.
[0103] “ C3-C8karbocikl” je 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ili 8-člani zasićeni ili nezasićeni nearomatični karbociklični prsten. Reprezentativni C3-C8karbocikli uključuju, ali nisu ograničeni na, - ciklopropil, -ciklobutil, -ciklopentil, -ciklopentadienil, -cikloheksil, -cikloheksenil, -1,3-cikloheksadienil, -1,4-cikloheksadienil, -cikloheptil, -1, 3-cikloheptadienil, -1,3,5-cikloheptatrienil, -ciklooktil i -ciklooktadienil. C3-C8karbociklična grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R’,-OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2-NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, - halogen, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2i -CN; gde je svaki R’ nezavisno izabran iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0104] “ C3-C8karbocikl” odnosi se na C3-C8karbocikličnu grupu definisanu gore, pri čemu je jedan od atoma vodonika grupe karbocikla zamenjen vezom.
[0105] “Veznik” odnosi se na hemijsku grupu koja sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno pripisuju antitelo na deo leka. U različitim varijantama, veznici uključuju dvovalentni radikal kao što su alkildil, arildiil, heteroarildiil, ostaci kao što su:-(CR2)nO(CR2)n-, ponavljajući jedinice alkiloksi (npr., polietilenoksi, PEG, polimetilenoksi) i alkilamino npr., polietilenamino, Jeffamine™); i dijakiselinski ester i amidi uključujući sukcinat, sukcinamid, diglikolat, malonat i kaproamid. U različitim varijantama, veznici mogu da sadrže jedan ili više aminokiselinskih ostataka, kao što su valin, fenilalanin, lizin i homolizin.
[0106] Termin “hiralni” odnosi se na molekule koji imaju svojstvo ne-preklapanja odraznog partnera, dok se termin “ahiralni” odnosi na molekule koji se mogu preklapati na njihovom odraznom partneru.
[0107] Izraz “stereoizomeri” odnosi se na jedinjenja koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju u odnosu na uređenje atoma ili grupa u prostoru.
[0108] “Diastereomer” se odnosi na stereoizomer sa dva ili više centara hiralnosti i čiji molekuli odrazi jedni drugih. Diastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr., tačke topljenja, tačke ključanja, spektralne osobine i reaktivnosti. Mešavine diastereomera mogu se odvojiti pod analitičkim postupcima visoke rezolucije kao što su elektroforeza i hromatografija.
[0109] “Enantiomeri” odnose se na dva stereoizomera jedinjenja odraza koja se ne-preklapaju jedna preko drugih.
[0110] Stereohemijske definicije i konvencije koje se ovde koriste generalno prate S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; i Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, t.j., imaju mogućnost da rotiraju ravan ravno polarizovanog svetla. U opisu optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula o svom hiralnom središtu(ima). Prefiksi d i 1 ili (+) i (-) koriste se za označavanje znaka rotacije ravni-polarizovanog svetla pomoću jedinjenja, sa (-) ili 1 što znači da je jedinjenje levo-rotirajuće. Jedinjenje koje ima prefiks (+) ili d je desno-rotirajuće. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični, osim što su slike ogledala jedne od drugih. Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomerom, a smeša takvih izomera često se naziva enantiomerna smeša. Mešavina enantiomera 50:50 se naziva racemskom smešom ili racematom, što se može desiti tamo gde nije bilo stereosekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Izrazi “racemska smeša” i “racemat” odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste, bez optičke aktivnosti.
[0111] “Odlazeća grupa” se odnosi na funkcionalnu grupu koja može biti zamenjena drugom funkcionalnom grupom. Određene odlazeće grupe su dobro poznate u struci, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, halid (npr., hlorid, bromid, jodid), metansulfonil (mezil), p-toluensulfonil (tozil), trifluorometilsulfonil (triflat) i trifluorometilsulfonat.
[0112] Termin “zaštitna grupa” odnosi se na supstituent koji se najčešće koristi za blokiranje ili zaštitu određene funkcionalnosti dok reaguju druge funkcionalne grupe na jedinjenju. Na primer, “aminozaštitna grupa” je supstituent vezan za amino grupu koja blokira ili štiti amino funkcionalnost u jedinjenju. Pogodne amino zaštitne grupe obuhvataju, ali bez ograničenja, acetil, trifluoroacetil, tbutoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ) i 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Za opšti opis zaštitnih grupa i njihove upotrebe, videti T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991,ili kasnije izdanje.
[0113] Kao što je poznato stručnjacima, upućivanje na “oko” vrednost ili parametar u ovom tekstu uključuje (i opisuje) otelotvorenja koja su upućena na tu vrednost ili parametar sam po sebi. Na primer, opis koji se odnosi na “oko X” uključuje opis “X”.x
[0114] Razume se da aspekt i otelotvorenja koja su ovde opisana uključuju “sastoje se” i/ili “uglavnom sastoje od” aspekata i otelotvorenja. Kao što se ovde koristi, singularni oblik “a”, “an” i “the” uključuje više referenci, osim ako nije drugačije naznačeno.
II. SASTAVI I METODE
[0115] Ovde su navedena antitela kako su definisana patentnim zahtevima koja se vezuju FcRH5 uključujući bispecifična antitela i imunokonjugate koji sadrže takva antitela. Antitela i imunokonjugati mogu biti korisni, npr., za dijagnozu ili tretiranje FcRH5 pozitivnih kancera. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitela vezuju domen 9 nalik Ig FCRH5c.
[0116] Bez vezivanja za teoriju, odabir preciznog antigena za antitela prema predmetnom pronalasku dovela je do najmanje tri važna razmatranja. Prvo, postojala je potreba za malo ili bez unakrsne reaktivnosti sa FcRH5 izoformama osim za FcRH5c, kao što je izoforma a i izoforma b, kako bi se izbeglo dobijanje terapeutskog postupka od vezivanja do molekula koji nije bio cilj i time smanjenja njegove efikasnosti. Kao što je ilustrovano na slici 1, domen 9 FcRH5 je primer jedinstvene sekvence između tri izoforme. Zatim je postojala potreba za malo ili bez unakrsne reaktivnosti sa članovima porodice FcRH, osim FcRH5, kao što su FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH4. Ovo je teško zbog uglavnom veoma konzervisane prirode poslednjih domena nalik Ig-u u mnogim članovima porodice FcRH. Ali, zbog paralelne potrebe za specifičnom izoformom FcRH5, antitelo koje se vezuje za poslednji Ig-domen
2
dominira. Konačno, za antitela koja se koriste u terapeutskim molekulima koji rade na donošenju velikih struktura u neposrednoj blizini, kao što su T-ćelije i tumorske ćelije pomoću bispecifičnog formata antitela, poznato je da su tumorski epitopi bliži ćelijskoj membrani efikasniji (videti, npr., Bluemel i dr. Cancer Immunol Immunother. (2010) 59:11971209). Ponekad opisana kao teorija kinetičke segregacije, proksimalna lokacija ćelijske membrane domena 9 FcRH5 je poželjan antigen cilj u ovom kontekstu. Kako bi se zadovoljila te razmatranja i kako je detaljno opisano u nastavku, razvijena su određena otelotvorenja antitela prema predmetnom pronalasku.
[0117] Ovde su opisana izolovana anti-FcRH5 antitela koja vezuju izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast obuhvata domen nalik Ig 9. U nekim slučajevima, domen nalik Ig 9 se takođe naziva se i Ig nalik C2-tipa 8. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline 754-835 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline 752-834 od SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline 743-850 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline 745-851 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline oko bilo koje od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 iz N -terminal i/ili C-terminal granica. U nekim slučajevima oblast specifičnog izoforma sadrži aminokiseline od oko 750, 751, 752, 753 ili 754 do oko 830, 831, 832, 833, 834, 835 ili 836 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima antitela vezuju FcRH5c i/ili izoformnu c-specifičnu oblast sa afinitetom od 5 nM ili ≤ 4 nM ili ≤ 3 nM ili ≤ 2 nM ili ≤ 1 nM i opciono ≥ 0.0001 nM, ili ≥ 0.001 nM ili ≥ 0.01 nM.
[0118] U nekim otelotvorenjima bilo kog antitela, antitelo ima jednu ili više od sledećih karakteristika: a) unakrsno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine (tj., vezuje ljudsku FcRH5 celom dužinom i vezuje cino celom dužinom FcRH5), b ) ne reaguje značajno sa FcRH1 FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4 (tj. ne vezuje značajno FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4), c) se vezuje za endogeni FcRH5, d) ne reaguje sa FcRH5a (tj., ne vezuje značajno FcRH5a), i e) ne reaguje sa drugim Ig-nalik domenom FcRH5 (tj., ne značajno vezuje drugi Ig-nalik domen FcRH5). Metode određivanja sposobnosti vezivanja su poznate u struci i opisane su u nastavku.
[0119] Ovde su navedena antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No:62 i HVR -H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86; i/ili b) lak lanca koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:2, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26. U nekim slučajevima, teški lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:98. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:111 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:110. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:111 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:110. U nekim slučajevima bilo koje od antitela, antitelo sadrži šest HVR od 1C8.1. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 1C8.1. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., domen Ig 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno nije unakrsno reaktivno sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim otelotvorenjima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0120] Ovde su navedena antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.87; i/ili b) laki lanac koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID br.:27. U nekim slučajevima, teški lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:99. U nekim otelotvorenjima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:113 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:112. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO-135 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:134. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:113 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:112. U nekim otelotvorenjima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:135 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:134, U nekim otelotvorenjima bilo kog antitela, antitelo sadrži šest HVR-ova od 1G7.2. U nekim otelotvorenjima antitelo sadrži VH domen i VL domen 1G7.2, U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ova od 1G7.2 ‘, U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 1G7.2 ‘. U nekim slučajevima antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje sa FcRH1, FcR2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite. U nekim otelotvorenjima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH5a.
[0121] Ovde su navedeni i u nekim otelotvorenjima antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO-40, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK u NO:88 i/ili b) laki lanac koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16 i HVR-L3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:76 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom (SEQ ID NO:115 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% %, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:114. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:115 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:114 U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVRs od 2H7.3 U nekim slučajevima antitelo obuhvata VH domen i VL domen 2H7.3 U nekim slučajevima antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9).U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 u punoj dužini. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje sa FcRH1, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim otelotvorenjima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0122] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:89; i/ili b) lakog lanca koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID
2
NO:17 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID N0:29. U nekim slučajevima, težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO:101. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:117 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:116. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:117 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:116. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVRs od 3A4.2. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3A4.2. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje unakrsno sa FeRH1, FcR2, FcR3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0123] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:42, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66 i HVR- H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:90 i/ili b) laki lanac koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:18 i HVR-L3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78 i HVR-H3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:102. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence aminokiseline SEQ ID NO:119 i/ili VL sekvence koja ima najmanje oko 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:118. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:119 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:118. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVRs od 3B12.1.1. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3B12.1.1. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje unakrsno sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcR5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje unakrsno sa FeRH5a.
[0124] Ovde su data antitela sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:43, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67 i HVR- H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:91 i/ili b) laki lanac koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19 i HVR-L3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:31. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55, HVR-112 koja sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:79 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:103. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:121 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko bilo koje od 90 %, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvenci aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:120. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:121 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:120. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVRs od 3C10. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3C10. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast
2
vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH1, FeRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za B-ćelije, U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0125] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68 i HVR -H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:92; i/ili b) laki lanac koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO:32. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:80 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:123 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:122. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEK ID NO:123 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:122. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ovi od 3F10. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3F10. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRR1, FcRE2, FcRH3 i/ili FcR4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH5a.
[0126] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69 i HVR -H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93; i/ili b) lakog lanca koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Neo:21 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:105. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:125 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:124. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:125 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:124. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ova od 3G3. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3G3. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje unakrsno sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje INK ćelije i/ili monocite. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH5a.
[0127] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70 i HVR -H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94; i/ili b) lakog lanca koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK u
2
NO:22 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:106. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEK ID NO:127 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%. 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:126. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:127 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:126, U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ovi od 3G7.1.5. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 3G7.1.5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcR.H.1, FeRH2, FcR3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0128] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95; i/ili b) laki lanac koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID N0:35. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:83 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:107. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:129 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO:128. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:129 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:128. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ova iz 5A10.1.3. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 5A10.1.3. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRR5 u punoj dužini. U nekim slučajevima antitelo ne reaguje značajno sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FeRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0129] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži ITVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:96 i/ili b) laki lanac koji sadrži HVRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24, i HVR-L3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36. U nekim slučajevima, teški lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK U NO:108. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sekvence identitet sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:131 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:130. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:131 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:130. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR od 5F1.1.5. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen od 5F1.1.5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast
2
vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne reaguje unakrsno sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH5a.
[0130] Ovde su data antitela koja sadrže a) teški lanac koji sadrži HVRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; i/ili b) lakog lanca koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:13, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37. U nekim slučajevima težak lanac sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:85 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:109. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom (SEQ ID NO:133 i/ili VL sekvencom koja ima najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:132. U nekim slučajevima antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:133 i/ili VL sekvencu SEQ ID NO:132. U nekim slučajevima antitelo sadrži šest HVR-ova od 6D2. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen i VL domen 6D2. U nekim slučajevima, antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c (npr., Ig-nalik domenu 9). U nekim slučajevima, antitelo je reverzno reaktivno sa humanim i cino FcRH5 cele dužine. U nekim slučajevima, antitelo ne reaguje značajno sa FcRH1, FcRH2, FcR3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za endogeni FcRH5. U nekim slučajevima, antitelo vezuje B-ćelije. U nekim slučajevima, antitelo značajno ne vezuje NK ćelije i/ili monocite.
[0131] U dodatnom aspektu koji je ovde dat, anti-FcRH5 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-FcRH5 antitelo je fragment antitela, npr., fragmenti Fv, Fab, Fab ‘, scFv, diatela ili F (ab’)2. U još jednom slučaju, antitelo je antitelo u suštini punoj dužini, npr., IgG1 antitelo ili druga klasa klastera ili izotip, kako je ovde definisano.
[0132] U dodatnom aspektu otelotvorenje daje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo protiv FcRH5 koje je ovde dato. U određenim slučajevima, dato je antitelo koje vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c iz, unutar ili preklapajući aminokiseline 754-835 od SEQ ID NO:1.
[0133] FcRH5 antitelo, posebno FcRH5 bispecifično (npr., Anti-CD3/anti-FcRH5 bispecifično), može imati pojedinačne ili funkcije u kombinaciji, na osnovu HEK analize ćelijske linije (HEK ćelije rekonstituisane neophodnim signalizacionim komponentama za pokretanje TCR kao što je opisano u James and Valle, Nature 487:64-69 (2012). U nekim slučajevima karakteristike, pojedinačno ili u kombinaciji, mogu uključivati međufazne/imunološke sinapse tumorskih ćelija, Lck- posredovana TCR fosforilacija, aktivnost ZAP70 uključujući stanje fosforilacije i lokalizaciju, aktivnost CD58 uključujući lokalizaciju i vezivanje, aktivnost β2Ar uključujući lokalizaciju i vezivanje, aktivnost CAAX uključujući lokalizaciju i vezivanje CD45 aktivnosti uključujući lokalizaciju, pMHC aktivnost uključujući lokalizaciju i/ili TCR aktivnost i funkcije aktiviranja.
[0134] U sledećem aspektu, anti-FcRH5 antitelo može da sadrži bilo koju od osobina, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u (a)-(e) i/ili odeljcima 1-7 ispod.
(a) vezuje izoformu c-specifičnih regiona vanćelijskog domena FcRH5c
[0135] Metode određivanja da li se anti-FcRH5 antitelo vezuje za izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c su poznate u struci. U nekim slučajevima vezivanje anti-FcRH5 antitela za izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c može se odrediti ekspresijom FcRH5
2
polipeptida sa N i C-terminalnim uklanjanjem u 293 ćelijama i/ili SVT2 ćelijama i testiranjem pomoću FACS kao što je opisano u primerima vezivanja antitela na skraćene polipeptide. U nekim slučajevima značajno smanjenje (≥ 70% redukcija) ili eliminisanje vezivanja antitela na skraćene polipeptide u odnosu na vezivanje na FcRR5 u punoj dužini, izraženo u 293 ćelije, ukazuje na to da se antitelo ne vezuje za one skraćene polipeptide.
[0136] U nekim slučajevima, izoformna c-specifična oblast obuhvata Ig-nalik domen 9. U nekim slučajevima Ig-nalik domenu 9 koji se naziva i Ig-nalik C2-tip 8. U nekim slučajevima, izoformna cspecifična oblast sadrži aminokiseline 754-835 SEQ ID BR:1. U nekim slučajevima, izoformna cspecifična oblast sadrži aminokiseline 752-834 od SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna cspecifična oblast sadrži aminokiseline 743-850 od SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna cspecifična oblast sadrži aminokiseline 745-851 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, izoformna cspecifična oblast sadrži aminokiseline oko bilo koje od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 iz N- terminala i/ili C-terminala. U nekim slučajevima izoformna c-specifična oblast sadrži aminokiseline od oko 750, 751, 752, 753 ili 754 do oko 830, 831, 832, 833, 834, 835 ili 836 SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, FcH5 je ljudski FcRH5. U nekim slučajevima, FcRH5 je humani FcRH5 ili cinomolgus majmun FcRH5.
(b) unakrsno reaguje sa (vezuje) humanim i cino FcRH5 sa afinitetom od 5 nM ili ≤ 4 nM ili ≤ 3 nM ili ≤ 2 nM ili ≤ 1 nM i opciono ≥ 0.0001 nM ili ≥ 0.001 nM ili ≥ 0.01 nM
[0137] Metode određivanja afiniteta vezivanja poznate su u stanju tehnike. U nekim slučajevima afinitet vezivanja može se odrediti prema BIAcore® testu, ELISA, Facs i IHC, na primer, kao što je opisano u Primerima.
[0138] U nekim slučajevima antitelo FcRH5 vezuje humani i/ili FcRH35 sa afinitetom bilo kog od ≤ 5 nM ili ≤ 4 nM ili ≤ 3 nM ili ≤ 2 nM ili ≤ 1 nM. U nekim slučajevima antitelo FcRH5 vezuje humani i/ili cino FcRH5 sa afinitetom od oko 5. U nekim slučajevima antitelo FcRH5 vezuje humani i/ili cino FcRH5 sa afinitetom od oko ≤ 4 nM. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje humani i/ili cino FcRH5 sa afinitetom od oko 3 nM. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje humani i/ili cino FcRH5 sa afinitetom od oko ≤ 2 nM. U nekim slučajevima, FcRH5 je humani FcRH5, U nekim otelotvorenjima FcRH5 je cinomolgus majmun FcRH5.
(c) ne reaguje sa (ne vezuje) FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4
[0139] Metode određivanja vezivanja su poznate u struci. U nekim slučajevima afinitet vezivanja može se odrediti prema BIAcore® testu, Facs, ELISA i IHC, na primer, kao što je opisano u Primerima.
[0140] U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje FcRH5 sa afinitetom više od bilo koje od 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 ili 1000 puta veće od FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4. U nekim slučajevima, FcRR je humani FcRH.
(d) ne reaguje sa (ne vezuje) FcRH5a
[0141] Metode određivanja vezivanja su poznate u struci. U nekim otelotvorenjima afinitet vezivanja može se odrediti prema BIAcore® testu, Facs, ELISA i IHC, na primer, kao što je opisano u Primerima.
[0142] U nekim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 vezuje FcRH5c sa afinitetom više od bilo kog od 2, 5.
10, 20, 50, 100, 500 ili 1000% više od FcRE5a. U nekim slučajevima, FcRH je humani FcRH.
(e) ne reaguje unakrsno sa drugim Ig-nalik domenom (ne vezuje se) FcRH5
[0143] Metode određivanja vezivanja su poznate u struci. U nekim slučajevima afinitet vezivanja može se odrediti prema BIAcore® testu, Facs, ELISA,, i IHC, na primer, kao što je opisano u Primerima.
[0144] U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje Ig-nalik domen 9 FcRH5 sa afinitetom više od bilo koje od 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 ili 1000-puta veće od Ig-nalik domena 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i/ili 8 FcRH5. U nekim slučajevima, FcRH je humani FcRH. U nekim slučajevima Ig-nalik domen je Ig-nalik domen 1 (aa 23-100 SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 2 (aa 105-185 of SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 3 (aa 188-271 od SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 4 (287-373 od SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 5 (aa 380-466 SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 6 (aa 490-555 od SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 7 (aa 568-652 od SEQ ID NO:1), Ig-nalik domen 8 (aa 658-731 SEQ ID NO:1 )
Analize vezivanja i druge analize
[0145] U jednom aspektu, anti-FcRH5 antitelo se testira na aktivnost vezivanja antigena. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo FcRH5 testira se za njegovu sposobnost vezivanja za FcRH5 izraženu na površini ćelije. Za takvo testiranje se može koristiti FACS test.
[0146] U primerenom testu konkurencije, imobilizovani FcRH5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo koje se vezuje za FcRH5 i drugo neoznačeno antitelo koje se testira zbog njegove sposobnosti da bude u konkurenciji sa prvim antitelom za vezivanje za FcRH5. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani FcRH5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo, ali ne drugo neoznačeno antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela na FcRH5, uklanja se višak nevezanog antitela i meri se količina oznake povezane sa imobilizovanim FcRH5. Ako je količina oznake povezane sa imobilizovanim FcRH5 znatno smanjena u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje na to da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za FcRH5. U određenim slučajevima, imobilizovani FcRH5 je prisutan na površini ćelije ili u membranskom preparatu dobijenom od ćelije koja vrši ekspresiju FcRH5 na svojoj površini.
[0147] U jednom aspektu, prečišćena anti-FcRH5 antitela mogu se dalje okarakterisati serijom analiza uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-terminalno sekvencioniranje, analizu aminokiselina, isključivanje tečne hromatografije visokog pritiska (HPLC), ne-denaturisanje, masenu spektrometriju, hromatografiju jonske razmene i papain digestiju. U jednom slučaju, razmatrano je promenjeno antitelo koje poseduje neke, ali ne i sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za mnoge primene u kojima je poluvreme antitela in vivo važno, dok su određene efektorske funkcije (kao što je komplement i ADCC) su nepotrebne ili štetne. U određenim slučajevima, aktivnosti Fc antitela meri se kako bi se obezbedilo održavanje samo željenih osobina. In vitro i/ili in vivo analize citotoksičnosti mogu se provesti kako bi se potvrdilo smanjenje/trošenje aktivnosti CDC-a i/ili ADCC-a. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se osiguralo da antitelo nema vezu FcgR (zbog čega verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelija, izražavaju Fc (samo RIII, dok monociti izražavaju Fc (RI, Fc (RII i Fc (RIII. FcR izraz na hematopoetskim ćelijama su rezimirani u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu, Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). Primer in vitro analize za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa je opisan u patentu SAD br.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju periferne mononuklearne ćelije krvi (PBMC) i ćelije Natural Killer (NK). Alternativno ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je opisano u Clines i dr. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Ispitivanja vezivanja Clq takođe mogu biti izvedena kako bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da vezuje Clq i zato nema aktivnost CDC-a. Da bi se procenila aktivacija komplementa, CDC analiza, npr., kao što je opisano u Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), mogu se izvesti FcRn vezivanje i in vivo određivanje zazora/poluvremena se takođe može izvesti koristeći metode poznate u struci.
1. Afinitet antitela
[0148] Antitelo koje je ovde sadržano može da ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 mM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM ili ≤ 0.001 nM, a opciono je ≥ 10<-13>M. (npr., 10<-8>M ili manje,
1
npr., Od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., Od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0149] U nekim slučajevima, Kd može se izmeriti putem radioaktivno označene analize vezivanja antigena (RIA) izvedenog sa verzijom antitela od interesa i njegovog antigena kao što je opisano u sledećoj analizi. Afinitet vezivanja rastvora Fab-a za antigen može se izmeriti izjednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) označenog antigena u prisustvu titracione serije neoznačenog antigena, a zatim uzimanjem vezanog antigena sa pločama sa prevlakom anti-Fab antitela (videti, npr., Chen i dr., J. Mo Biol, 293:865-881(1999)). Da bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, MICROTITER® ploče sa više otvora (Thermo Scientific) mogu biti prekrivene preko noći sa 5 mg/ml zarobljenog anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9.6), a zatim blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS u trajanju od dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U neupijajućoj ploči (Nunc#269620), 100 pM ili 26 pM [<125>]-antigen se pomešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta i dr., Cancer Res 57:4593-4599(1997)). Fab ise z interesa onda inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti duži vremenski period (npr., oko 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga smeše se mogu preneti na ploču za hvatanje za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., na jedan sat). Rastvor se zatim može ukloniti i ploča se ispira osam puta sa 0.1% polisorbata 20 (TWEEN-20®) u PBS. Kada se ploče osuše, može se dodati 150 ml/otvoru scintilanta (MICROSCINT-20™; Packard), a ploče se mogu postaviti na TOPCOUNT™ gama brojač (Packard) na deset minuta. Koncentracije svakog Faba koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja mogu se izabrati za upotrebu u konkurentnim vezivnim analizama.
[0150] Kd može da se meri u analizi pomoću ispitivanja površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE® -2000 ili BIACORE®-1000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilizovanim antigenom CM5 čipovima u ∼10 odzivnim jedinicama (RU). Ukratko, karboksimetilirani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIACORE, Inc.) mogu se aktivirati sa N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se može razblažiti sa 10 mM natrijum acetatom, pH 4.8, do 5 mg/ml (~ 0.2 mM) pre injekcije sa brzinom protoka od 5 ml/min, kako bi se postiglo otprilike 10 reakcionih jedinica (RU) spojenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1 M etanolamina se može ubrizgati za blokiranje neizlečenih grupa. Za merenja kinetike, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) može se injektirati u PBS sa 0.05% polisorbat 20 (TWEEN-20 ™) surfaktantom (PBST) na 25°C sa brzinom protoka od približno 25 mL/min. Stopa asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) mogu se izračunati pomoću jednostavnog pojedinačnog modela vezivanja Langmuir (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) istovremenim usklađivanjem sindikata udruživanja i disocijacije. Konstanta ravnotežne disocijacije (Kd) se može izračunati kao odnos koff/koff, videti, npr., Chen i dr., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ukoliko brzina prekoračuje 10 M s pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa iznad, onda se brzina može odrediti korišćenjem fluorescentne metode gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (uzbuđenje = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C antitela od 20 nM protiv antigena (Fab oblika) u PBS, pH 7.2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena merenih u spektrometru, kao što je stopiranje protoka opremljen spektrofometar (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-AMINCO ™ serije 8000 (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.
2. Fragmenti antitela
[0151] Antitelo dato ovde može biti fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničene na, Fab, Fab ‘, Fab’-SH, F (ab’)2, Fv i scFv fragmente i druge fragmente opisane u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson i dr. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, pogledajte, videti, npr., Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Rosenburg and Moore eds., (SpringerVerlag, New York), pp. 269-315 (1994); videti takođe WO
2
93/16185; i patent SAD br.5,571,894 i 5,587,458. Za raspravu o Fab i F (ab ‘)2fragmentima koji sadrže ostatke vezujućeg receptora za vezivanje epitopa i koji imaju povišeni poluživot in vivo, videti patent SAD br.5,869,046.
[0152] Diatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koji mogu biti dvovalentni ili bispecifični. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i dr., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana u Hudson i dr., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0153] Jedno-domenska antitela su fragmenti antitela koji obuhvataju sve ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili sve ili deo varijabilnog domena laka lanca antitela. U određenim otelotvorenjima, jednodomensko antitelo je humano jedno-domensko antitelo (Domantis, Inc., Waltham, MA, videti, npr., Patent SAD br.6,248,516 B1).
[0154] Frakcije antitela mogu biti izvedene različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteolitičku digestiju nepromenjenog antitela, kao i na proizvodnju rekombinantnim ćelijama domaćina (npr., E. coll or phage), kako je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
[0155] Antitelo koje je ovde dato može biti himerno antitelo. Određena himerna antitela su opisana, npr., u patentu SAD br.4,816,567; i Morrison i dr., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr., varijabilni region izveden iz miša, pacova, hrčaka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i čoveka konstantnog regiona. U sledećem primeru, himerno antitelo je antitelo “promenjene klase” u kojem je klasa ili podklasa promenjena od onog od roditeljskog antitela. Himerna antitela uključuju fragmente koji se vezuju za antigen.
[0156] Antitelo koje je ovde dato može biti je humanizovano antitelo. Tipično, ne-humano antitelo je humanizovano da smanjuje imunogenost ljudi, zadržavajući specifičnost i afinitet roditeljskog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR-i, npr., CDR-i (ili njihovi delovi) izvedeni iz ne-humanog antitela, a FR (ili njegovi delovi) su izvedeni iz sekvencija humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono će obuhvatiti i barem deo humanog konstantnog regiona. Neki FR ostaci u humanizovanom antitelu mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (npr., antitelo iz koje je izvedeno HVR ostataka), npr., da se obnovi ili poboljša specifičnost ili afinitet antitela.
[0157] Humanizovana antitela i metode njihovog izrade su razmatrane, npr., u Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr., u Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); Queen i dr., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentu SAD br., 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri i sar., Metode 36:25-34 (2005) (opisujući SDR (a-CDR) kalemljenje); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (opisujući “osvežavanje”); Dall’Acqua i dr., Methods 36:43-60 (2005)(opisujući “FR mešanje”); i Osbourn i dr., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup “vođene selekcije” za FR mešanje).
[0158] Ljudski okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okružne oblasti izabrane metodom “najboljeg uklapanja” (videti, npr., Sims i dr. J. Immunol 151:2296 (1993)); okvirni regioni izvedeni iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter i dr., Proc. Nat., Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992) i Presta et al J. Immunol, 151:2623 (1993)); ljudski zreli (somatski mutirani) okvirni regioni ili okvirni regioni ljudskih germinalnih linija (videti, npr., Almagro and Fransson, Front. Biosci, 13:1619-1633 (2008)); i okvirnim regionima izvedenim iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca i dr., J. Biol Chem., 272:10678-10684 (1997) i Rosok i dr., J. Biol Chem. 271:22611-22618 ( 1996)).
4. Humana antitela
[0159] Antitelo koje je ovde dato može biti humano antitelo. Ljudska antitela mogu se proizvoditi koristeći različite tehnike poznate u struci. Humana antitela se generalno opisuju u van Dijk and van de Winkel, Curr, Opin. Pharmacol 5:368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
[0160] Ljudska antitela mogu se pripremiti davanjem imunogena transgenskoj životinji koja je modifikovana da bi proizvela nepromenjena humana antitela ili nepromenjena antitela sa ljudskim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže ceo ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse ili koji su prisutni ekstrahromozomalno ili integrirano nasumično u hromozome životinja. Kod takvih transgenskih miševa endogeni lokusi imunoglobulina su generalno neaktivirani. Za razmatranje metoda za dobijanje humanih antitela od transgenskih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). videti takođe, npr., patent SAD br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE ™ tehnologiju; patent SAD br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB® tehnologiju; patent SAD br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju i objava patente prijave SAD br. 2007/0061900, opisujući VELOCIMOUSE® tehnologiju. Humani varijabilni regioni iz nepromenjenih antitela generisanih takvim životinjama mogu se dalje modifikovati, npr., kombinovanjem sa drugim humanim konstantnim regionom.
[0161] Ljudska antitela takođe mogu biti izvedena metodom hibridoma. Opisani su humani mijelom i ćelijske linije mišiće-humane ćelije za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela. (Videti, npr., KozborJ. Immunol., 133:3001 (1984), Brodeur i dr., Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) i Boerner i dr., J. Immunol., 147:86 (1991)). Ljudska antitela generisana pomoću humanih hibridoma tehnologija B-ćelija takođe su opisana u Li i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci obuhvataju one opisane, na primer, u patentu SAD br. 7,189,826 (opisuju proizvodnju monoklonalnih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4):265-268 (2006) (opisujući čoveka hibridoma). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) takođe je opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
[0162] Ljudska antitela mogu takođe biti generisana izolovanjem Fv klonova varijabilnih domena izabranih iz biblioteka za prikazivanje faga. Takvi varijabilni domeni se zatim mogu kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. U nastavku su opisane tehnike izbora humanih antitela iz biblioteka antitela.
5. Antitela dobijena iz biblioteka
[0163] Antitela koja su ovde navedena mogu se izolovati skriningom kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci su poznate različite metode za generisanje biblioteka prikaza faga i skeniranje takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takve metode su preispitivane, npr., U Hoogenboom i dr. u metodama molekularne biologije 178:1-37 (O’Brien i sar., ed., Human Press, Totova, NJ, 2001) i dalje opisani, npr., u McCafferti i dr., Nature 348; 552-554; Clackson i dr., Nature 352:624-628 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol 222:581-597 (1992); Marks i Bradburi, u metodama molekularne biologije 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totova, NJ, 2003); Sidhu i sar., J. Mol. Biol.338 (2):299-310 (2004); Lee i dr., J. Mol. Biol. 340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 101 (34):12467-12472 (2004); i Lee i drugi, J. Immunol. Metode 284 (1-2):119-132 (2004).
[0164] U određenim metodama prikaza faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani
4
polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) i rekombinovani slučajno u bibliotekama faga, koji se zatim mogu prikazati na fagi vezujući za antigen, kao što je opisano u Winter i dr., Ann Rev. Immunol., 12:433-455 (1994), faga tipično prikazuje fragmente antitela, bilo kao pojedinačni lanac Fv (scFv) ili kao fragmente Fab-a. Biblioteke iz imuniziranih izvora pružaju antitela visokog afiniteta imunogenim bez potrebe za izgradnjom hibridoma. Alternativno, naivni repertoar se može klonirati (npr., iz čoveka) kako bi se obezbedio jedinstveni izvor antitela širokom spektru ne-samih, a i samih antigena bez imunizacije kao što je opisao Griffiths i dr., EMBO J. 12:725-734(1993). Najzad, naivne biblioteke takođe mogu biti sintetički izvedene kloniranjem neuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija i primenom PCR prajmera koji sadrže slučajni niz za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regija i za postizanje preuređivanja in vitro, kao što je opisano u Hoogenboom and Winter, J Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Patente publikacije koje opisuju fagne biblioteke ljudskih antitela uključuju, na primer: patent SAD br. 5,750,373 i objava patente prijave SAD br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
[0165] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka ljudskih antitela smatraju se ljudskim antitelima ili fragmentima ljudskih antitela.
6. Multispecifična antitela
[0166] Antitelo koje je ovde dato može biti multispecifično antitelo, npr., bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dve različite lokacije. U određenim slučajevima jedna od specifičnosti vezivanja je za FcRH5, a druga za bilo koji drugi antigen. U određenim slučajevima jedna od specifičnosti vezivanja je za FcRH5, a druga za CD3. Videti, npr., patent SAD br. 5,821,337. U određenim slučajevima, bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa FcRH5. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa za ćelije koje vrše ekspresiju FcRH5. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela u punoj dužini ili fragmenti antitela.
[0167] U nekim otelotvorenjima FcRH5 antitela su FcRH5 bispecifična antitela. Bispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Primerna bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa proteina FcRH5 kao što je ovde opisano. Druga takva antitela mogu kombinovati FcRH5 vezujuće mesto sa vezujućim mestom za još jedan protein. Alternativno, ruka anti-FcRH5 može se kombinovati sa rukom koja se vezuje za aktivirajući molekul na leukocitu kao što je molekul T-ćelijskog receptora (npr., CD3) ili Fc receptori za IgG (FcγR), kao što je FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16), kako bi se fokusirali i lokalizovali ćelijski odbrambeni mehanizmi u ćeliji koja vrši ekspresiju FcRH5. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa za ćelije koje vrše ekspresiju FcRH5. Ova antitela poseduju FcRH5 vezujuću ruku i ruku koja vezuje citotoksični agens (npr., saporin, antiinterferon α vinca alkaloid, ricin A lanac, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela mogu se dobiti kao antitela u punoj dužini ili fragmenti antitela (npr., F (ab ‘)2bispecifična antitela). U nekim slučajevima, FcRH5 bispecifično antitelo sadrži prvu ruku, pri čemu prva ruka vezuje FcRH5 i drugu ruku, pri čemu se druga ruka vezuje za Fc. Druga ruka fiksnog antitela FcRH5 može biti bilo koje anti-Fc antitelo poznato u struci. Na primer, WO 96/16673 opisuje bispecifično anti-ErbB2/anti- FcγRIII antitelo i patenta prijava SAD br. 5,837,234 obelodanjuje bispecifično anti-ErbB2/anti- FcγRI antitelo. Bispecifično anti-ErbB2/Fca antitelo je prikazano u WO98/02463. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitela se vezuju Ig-nalik domen 9 FcRH5c.
[0168] U nekim slučajevima, FcRH5 bispecifično antitelo sadrži prvu ruku, pri čemu prva ruka vezuje FcRH5 i drugu ruku, pri čemu druga ruka vezuje CD3. Druga ruka fiksnog antitela FcRH5 može biti bilo koje anti-CD3 antitelo poznato u struci. Patenta prijava SAD br.5,821,337 i 6,407,213 nam govori o bispecifičnim anti-ErbB2/anti-CD3 antitelima. Opisana su dodatna bispecifična antitela koja vezuju epitop na CD3 antigenu i drugi epitop. Videti, na primer, patentu prijavu SAD br. 5,078,998 (anti-CD3/antigen tumorskih ćelija); patentu prijavu SAD br. 5,601,819 (anti-CD3/IL2R; anti-CD3/CD28; anti-CD3/CD45); patentu prijavu SAD br. 6,129,914 (anti-CD3/maligni B-ćelijski antigen); patentu prijavu SAD br. 7,112,324 (anti-CD3/CD19); patentu prijavu SAD br. 6,723,538 (anti-CD3/CCR5); patentu prijavu SAD br. 7,235,641 (anti-CD3/EpCAM); patentu prijavu SAD br. 7,262,276 (anti-CD3/antigen tumora jajnika); i patentu prijavu SAD br. 5,731,168 (anti-CD3/CD4IgG). U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo druge ruke je antitelo opisano u bilo kom od WO 2005/118635, WO2007/042261, WO2008/119567, US5929212, US6750325, US6491916, US7994289, US7993641, US6706265, US5585097, US5968509, US5932448, US6129914, US7381803, US5834597 i US7862813. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim slučajevima, anti-FcRH5 antitela se vezuju Ig-nalik domen 9 FcRH5c.
[0169] Tehnike za izradu multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu ko-ekspresiju dva para imunoglobulina teških lanaca i lakih lanaca sa različitim specifičnostima (videti Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), WO 93/08829 i Traunecker i dr., EMBO J. 10:3655 (1991)), i inženjering “čvor u rupi” (videti, npr., patentu prijavu SAD br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe biti izvedena inženjerskim elektrostatičkim efektima upravljanja za stvaranje Fcheterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); unakrsno povezivanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., patenta prijava SAD br. 4,676,980 i Brennan i dr., Science, 229:81 (1985)); koristeći leucinske patent otvarače za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr., Kostelny i dr., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); koristeći tehnologiju “diatela” za pravljenje bispecifičnih fragmenata antitela (videti, npr., Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i koristeći jednolančane Fv (sFv) dimere (videti, npr., Gruber i dr., J. Immunol, 152:5368 (1994)); i pripremu trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr., u Tutt i dr. J. Immunol.147:60 (1991).
[0170] Projektovana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta za vezivanje antigena, uključujući “antitela oktopoda”, takođe su uključena (videti, npr., SAD 2006/0025576A1).
[0171] Antitelo ili fragment ovde uključuje i “Dual Acting FAb” ili “DAF” koji sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za FcRH5 kao i drugi, različiti antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
[0172] Prema drugačijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim vezivnim specifičnostima (mesta kombinovanja antiteloantigena) su spojeni sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Poželjno, spajanje je sa konstantnim domenom teškog lanca Ig, koja sadrži bar deo šarke, CH2i CH3regiona. Poželjno je da ima prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutno u najmanje jednoj od spajanja. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, ako je poželjno, laki lanac imunoglobulina, ubacuju se u odvojene vektore ekspresije i ko-transfektuju u pogodnu ćeliju domaćina. Ovo omogućava veću fleksibilnost prilikom prilagođavanja uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u otelotvorenjima kada nejednaki odnosi tri lanca polipeptida koji se koriste u konstrukciji pružaju optimalni prinos željenog bispecifičnog antitela. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan vektor ekspresije kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima dovodi do visokih prinosa ili kada su pokazatelji bez bitnog uticaja na prinos željene kombinacije lanca.
[0173] U nekim otelotvorenjima bispecifična antitela sastoje se od hibridnog imunoglobulinskog teškog lanca sa prvom vezivnom specifičnošću u jednoj ruci i parom teških lanaca imunoglobulina (koji obezbeđuje drugu vezujuću specifičnost) u drugoj ruci. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, pošto prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula omogućava lakši način odvajanja. Ovaj pristup je obelodanjen u WO 94/04690. Za dalje detalje o generisanju bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh i dr., Methods in Enzymology 121:210(1986).
[0174] Prema drugom pristupu koji je opisanom u patentnoj prijavi SAD br.5,731,168, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati kako bi se maksimizovao procenat heterodimera koji se regenerišu iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjni interfejs sadrži bar deo CH3domena. U ovom postupku, jedan ili više bočnih malih lanaca aminokiseline iz interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se većim bočnim lancima (npr., tirozinom ili triptofanom). Kompenzujuće “šupljine” identične ili slične veličine sa velikim bočnim lancem stvorene su na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih lanaca aminokiselina sa manjim (npr., alaninom ili treoninom). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje produkte, kao što su homodimeri, Bispecifična antitela proizvedena u skladu sa ovim pristupom ovde se ovde nazivaju antitela iz „protuberancijske šupljine”.
[0175] Bispecifična antitela uključuju unakrsna ili “heterokonjugatna” antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može se spojiti sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (patenta prijava SAD br.4,676,980) i za tretiranje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu se napraviti koristeći bilo koje pogodne metode unakrsnog povezivanja. Pogodni agensi za ukrštanje su dobro poznati u ovoj oblasti i opisani su u patentnoj prijavi SAD br. 4,676,980, uz brojne tehnike unakrsnog povezivanja.
[0176] Tehnike generisanja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu biti pripremljena korišćenjem hemijske veze, Brennan i dr., Science 229:81 (1985) opisuju postupak u kome se nepromenjena antitela proteolitički odvajaju kako bi se generisali F (ab ‘)2fragmente. Ovi fragmenti su smanjeni u prisustvu agensa za kompleksiranje ditiola, natrijum arsenita, za stabilizaciju vicinalnih ditiola i sprečavanje stvaranja intermolekularnih disulfida. Generisani fragmenti Fab’a pretvaraju se u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab’-TNB derivata se zatim pretvara u Fab’-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i pomeša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab’-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Bispecifična antitela proizvedena mogu se koristiti kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima.
[0177] Fab’-SH fragmenti iz E. coli mogu biti direktno obrađeni i hemijski spojeni da bi se formirala bispecifična antitela. Shalaby et al, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) opisuju proizvodnju potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab ‘)2molekula. Svaki Fab ‘fragment je zasebno izlučen iz coli i podvrgnut usmerenoj hemijskoj sprezi in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo moglo se vezati za ćelije koje prekomerno izražavaju ErbB2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i pokretanje liticke aktivnosti humanih citotoksičnih limfocita u odnosu na ciljeve tumora na grudima.
[0178] Takođe su opisane razne tehnike za izradu i izolaciju fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem leucinskih patentnih otvarača. Kostelny i dr., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Leucinski patent otvarači peptida iz proteina Fos i Jun su povezani sa delima Fab’ dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu šarke da bi se formirali monomeri i zatim ponovo oksidovani da bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj metod se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija “diaboda” koju su opisali Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) obezbedio je alterizvorni mehanizam za izradu fragmenata bispecifičnih antitela. Frakcije sadrže VH povezan sa VL pomoću veznika koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VH i VL domeni jednog fragmenta prisiljeni su da se uparuju sa komplementarnim VL i V domenima drugog fragmenta, čime formiraju dva antigen vezujuća mesta. Prijavljena je još jedna strategija za izradu bispecifičnih fragmenata antitela korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera. videti Gruber i dr., J. Immunol., 152:5368 (1994).
[0179] Antitela sa više od dve valencije su razmatrane. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr., J. Immunol.147:60 (1991)
8. Varijante antitela
[0180] U određenim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koje su ovde navedene. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselina mogu biti pripremljene uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnoj sekvenci koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje iz i/ili umetanje u i/ili supstituciju ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije može se napraviti da dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.
a) Supstitucije, unošenje, i uklanjanje varijanti
[0181] U određenim otelotvorenjima daju se varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR-ove. Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 1 pod naslovom “poželjne supstitucije”. Više su značajne promene date u tabeli 1 pod naslovom “primerne supstitucije”, kao što je dalje opisano u daljem tekstu u vezi sa klasama bočnih lanaca aminokiselina. Zamene aminokiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa i proizvodi koji su prikazani za željenu aktivnost, npr., zadržali/poboljšali vezivanje antigena, smanjili imunogenost ili poboljšali ADCC ili CDC.
TABELA 1
[0182] Aminokiseline mogu biti grupisane prema zajedničkim karakteristikama bočnog lanca;
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) osnovne: His, Lys, Erg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
[0183] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0184] Jedna vrsta supstitucionih varijanti podrazumeva zamenu jednog ili više hipervarijabilnih regiona ostataka roditeljskog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Generalno, rezultujuća varijanta (i) izabrana za dalje istraživanje će imati modifikacije (npr., poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr., povećan afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na roditeljsko antitelo i/ili će značajno zadržati određena biološka svojstva roditeljsko antitelo. Primerna varijanta supstitucije je zrelo srazmerno antitelo, koje se može pogodno generirati, npr., koristeći tehnike sazrevanja afiniteta zasnovane na fagnom prikazu, kao što su ovde opisani. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani i varijantna antitela prikazana na fagi i prikazana za određenu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja).
[0185] Izmene (npr., supstitucije) mogu se napraviti u HVR, npr., radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti u HVR “žarištima”, tj. ostaci kodirani kodonima koji se podvrgavaju mutaciji na visokoj frekvenciji tokom somatskog sazrevanja (videti npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol 207:179-196 (2008)), i/ili SDR (a-CDR), a dobijena varijanta VH ili VL se testira na afinitet vezivanja. Opis sazrevanja afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisan je npr., u Hoogenboom i dr. Hoogenboom et al in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim otelotvorenjima sazrevanja afiniteta, raznovrsnost se unosi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje pomoću bilo koje vrste različitih metoda (npr., PCR sklon greškama, zamenjivanje lanca ili mutageneza usmerena na oligonukleotid). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pregleda kako bi se identifikovale bilo koje varijante antitela sa željenim afinitetom. Druga metoda za uvođenje različitosti uključuje HVR-usmerene pristupe, u kojima su nekoliko HVR ostataka (npr., 4-6 ostataka u jednom trenutku) randomizovane. Ostaci HVR koji su uključeni u vezivanje antigena mogu biti posebno identifikovani, npr., koristeći alanin skeniranje mutagenezu ili modeliranje. Posebno često su ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
[0186] U određenim otelotvorenjima mogu se pojaviti supstitucije, unošenje ili uklanjanje unutar jednog ili više HVR-ova, sve dok takve promene u značajnoj meri ne smanjuju sposobnost antitela da se vezuje za antigen. Na primer, konzervativne promene (npr., konzervativne supstitucije koje su ovde navedene) koje značajno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu se napraviti u HVR-u. Takve izmene mogu biti izvan HVR “hotspotova” ili SDR-ova. U određenim otelotvorenjima varijantnih VH i VL sekvenci predviđenih gore, svaki HVR je ili neizmenjen ili ne sadrži više od jedne, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
[0187] Korisna metoda za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu naziva se “mutageneza skeniranja alanina”, kako su opisali Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku identifikovani su ostaci ili grupa ciljanih ostataka (npr., oštećeni ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuju se neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr., alaninom ili polialaninom) da bi se utvrdilo da li utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigena-antitela se koristi za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati kako bi se utvrdilo da li sadrže željene osobine.
[0188] Uključivanja aminokiselinske sekvence obuhvataju aminokiseline i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekventna unošenja pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih unošenja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom. Druge uvodne varijante molekula antitela uključuju fuziju na N- ili C-terminus antitela na enzim (npr., za ADEPT) ili polipeptid koji povećava polu-život antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
[0189] U određenim otelotvorenjima antitelo koje je ovde dato menja se da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilisano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije u antitelu može se pogodno izvršiti izmenjivanjem aminokiselinske sekvence tako da se kreira ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0190] Kada antitelo obuhvata Fc region, ugljovodonik koji je povezan sa njim može se izmeniti. Izvorna antitela proizvedena ćelijama sisara obično sadrže razgranat, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom do Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti, npr., Wright i dr. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može uključivati različite ugljene hidrate, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sialnu kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u “krutoj” biantenarnoj oligosaharidnoj strukturi. U nekim otelotvorenjima modifikacije oligosaharida u antitelu koje je ovde dato, mogu se napraviti da bi se kreirale varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0191] U jednom aspektu obezbeđuju se varijante antitela sa ugljovodoničnom strukturom koja nema fukozu (direktno ili indirektno) vezanu za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od. 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u lancu šećera kod Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura povezanih sa Asn 297 (npr., kompleksne, hibridne i visoke manozne strukture) merene pomoću MALDI-TOF masene spektrometrije, kao što je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi na približno 297. položaju u regionu Fc (Eu brojeva ostataka Fc regiona); Međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko 63 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od pozicije 297, tj. između pozicija 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvence u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu imati poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr., patenta prijava SAD br. Ups 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se odnose na “defukozilirane” ili “fukozom-deficijentne” varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO
4
2002/031140; Okazaki i dr. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane -Ohnuki i dr. Biotehnologija. Bioeng. 87:614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih za proizvodnju defukozilovanih antitela obuhvataju Lec13 CHO ćelije deficitne u fukozilaciji proteina (Ripka i dr. Arch. Biochem. Biophys.
249:533-545 (1986), patenta prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L i WO 2004/056312 A1, Adams i dr., naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijskih linija, kao što je gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr., Yamane -Ohnuki i dr. Biotech Bioeng, 87:614 (2004), Kanda, Y. i dr., Biotechnol Bioeng., 94 (4):680-688 (2006) i WO2003/085107).
[0192] Varijante antitela su dalje date sa prepolovljenim oligosaharidima, npr., u kojima prepolovljeni oligosaharid prikačen na Fc region antitela je podeljen pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr., u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i dr.); patent SAD 6,602,684 (Umana i dr.); i SAD 2005/0123546 (Umana i dr.). Takođe su date varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu imati poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr., u WO 1997/30087 (Patel i dr.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) varijante Fc regiona
[0193] U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u ovde dat Fc region antitela, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može sadržati humanu sekvencu regiona Fc (npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji sadrži modifikaciju aminokiselina (npr., supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina.
[0194] U određenim otelotvorenjima, pronalazak obuhvata varijantu antitela koja poseduje neke ali ne i sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluvreme antitela in vivo važno, dok neke efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC ) su nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo analize citotoksičnosti mogu se sprovesti kako bi se potvrdilo smanjenje/trošenje aktivnosti CDC-a i/ili ADCC-a. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se provesti kako bi se osiguralo da antitelo nema vezu FcγR (zbog čega verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelija, izražavaju Fc (samo RIII, dok monociti izražavaju Fc (RI, Fc (RII i Fc (RIII. FcR izraz na hematopoetskim ćelijama su rezimirani u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro analiza za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa opisani su u patentnoj prijavi SAD br. 5,500,362 (videti, npr., Hellstrom, I. i dr. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I i dr., Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. i dr., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, metode neradioaktivnih ispitivanja mogu biti korišćene (videti, na primer, ne-radioaktivne analize citotoksičnosti ACTI™ za protočnu citometriju (CellTechnologi, Inc. Mountain Viev, CA i CytoTox 96® neradioaktivna analiza citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju ćelije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) i ćelije Natural Killer (NK). Alternativno ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., kao što je to obelodanjeno u Clynes i dr. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ispitivanja C1q vezivanja takođe mogu biti izvedena kako bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da vezuje C1q i stoga nema CDC aktivnost videti, npr., C1q i C3c vezujući ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila odgovarajuća aktivacija, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol.202:163 (1996), Cragg, MS i dr., Blood 101:1045-1052 (2003), i Cragg, MS and M Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo zazor/polu-životne determinacije takođe mogu biti izvedene korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike (videti npr., Petkova, SB i dr., Int’l Immunol, 18 (12):1759-1769 (2006) ).
[0195] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (patenta prijava SAD br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više pozicija aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani mutant Fc “DANA” sa supstituisanjem ostataka 265 i 297 u alanin (patenta prijava SAD br.7.332.581).
[0196] Opisane su neke varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr., patenta prijava SAD br. 6,737,056, WO 2004/056312 i Shields i dr., J. Biol Chem. 9 (2):6591-6604 (2001).)
[0197] U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr., supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU broj ostataka).
[0198] U nekim otelotvorenjima se izvršavaju izmene u regionu Fc koje rezultiraju promenjenom (tj. ili poboljšanim ili smanjenim) vezivanjem C1q i/ili zavisnom citotoksičnom komprimiranjem (CDC), kao što je opisano u patentnoj prijava SAD br. 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i dr. J. Immunol.
164:4178-4184 (2000).
[0199] Antitela sa povećanim polu raspadom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol., 117:587 (1976) i Kim i dr., J. Immunol 24:249 (1994)), opisani su u US2005/0014934A1 (Hinton i dr.). Ova antitela sadrže Fc region sa jednim ili više supstitucija u njima koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona na FcRn. Takve Fc varijante obuhvataju one sa supstitucijama u jednom ili više regiona Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., zamena ostatka Fc regiona 434 (patent SAD br.7,371,826).
[0200] videti i Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patent SAD br.5,648,260; patent SAD br.
5,624,821; i WO 94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona.
d) Varijante antitela projektovane cisteinom
[0201] U određenim otelotvorenjima, može biti poželjno stvoriti antitela projektovana cisteinom, npr., „thioMAbs,“ u kojima je jedan ili više ostataka antitela supstituisan sa cistein ostacima. U posebnim otelotvorenjima, supstituisani ostaci nalaze se na pristupačnim mestima antitela. Supstituisannjem ovih ostataka sa cisteinom, reaktivne tiol grupe su time postavljene na pristupačna mesta antitela i mogu biti korišćene da konjuguju antitelo do drugih grupa, kao što su grupe lekova ili veznik-lek grupe, kako bi se stvorio imunokonjugat, kao što je ovde dalje objašnjeno. U određenim otelotvorenjima, bilo koji od sledećih ostataka može biti supstituisan sa cisteinom: V205 (Kabat označavanje) lakog lanca; A118 (EU označavanje) teškog lanca; i S400 (EU označavanje) teškog lanca Fc regiona. Antitela projektovana cisteinom mogu biti stvorena kao što je opisano, npr., u patentu SAD br.7,521,541.
e) Derivati antitela
[0202] U određenim otelotvorenjima antitelo koje je ovde dato može se dalje modifikovati kako bi sadržalo dodatne neproteinske čestice koje su poznate u struci i lako dostupne. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na polimere koji rastvorljivi u vodi. Neograničavajući primeri polimera koji su rastvorljivi u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, 1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (ili homopolimere ili nasumične kopolimere) i dekstran ili poli (n-vinil pirolidon) polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, ko-polimere prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilenglikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili ne mora. Broj polimera vezanih za antitelo može se razlikovati, a ako je vezano više polimera, mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja uključujući, ali ne ograničavajući se na određena svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li se derivat antitela koristi u terapiji pod definisani uslovi itd.
[0203] U još jednom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinastog dela koji se može selektivno zagrevati izlaganjem zračenju. U jednom aspektu, neproteinski ostatak je ugljenikove nanocevi (Kam el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Radijacija može biti od bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničena na, talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje zagrevaju neproteinsku grupu na temperaturu na kojoj se ubijaju ćelije proksimalne za antiteloneproteinski ostatak.
B. Rekombinantne metode i sastavi
[0204] Antitela mogu biti proizvedena korišćenjem rekombinantnih postupaka i sastava, npr., kao što je opisano u patentu SAD br. 4,816,567. U jednom otelotvorenju, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr., laki i/ili teški lanci antitela). U daljem otelotvorenju, dat je jedan ili više vektora (npr., ekspresioni vektori) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem otelotvorenju, daje se ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćina sadrži (npr., transformisana je): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćina je eukariotska, npr., ćelija kineskog hrčka (CHO) ili limfoidne ćelije (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju daje se postupak stvaranja anti-FcRH5 antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je navedeno gore, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela, i opciono obnavljanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za kulturu ćelija domaćina).
[0205] Za rekombinantnu proizvodnju anti-FcRH5 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr., kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliju domaćina. Takva nukleinska kiselina može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., koristeći oligonukleotidne sonde koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
[0206] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju vektora koje kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije su opisane ovde. Na primer, antitela mogu biti proizvedena u bakterijama, naročito kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu potrebni. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida kod bakterija, videti, npr., patent SAD br.5,648,237, 5,789,199 i 5,840,523. (videti takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str.245-254, opisujući ekspresiju fragmenata antitela u E. coli. Nakon ekspresije, antitelo može biti izolovano iz bakterijske ćelijske paste u rastvorljivoj frakciji i može se dalje prečišćavati. Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljivice ili kvasac su pogodni klonovi ili ekspresioni domaćini za vektore koji kodiraju antitela, uključujući gljivice i sojevi kvasca čiji su putevi glikozilacije “humanizovani”, što rezultira proizvodnjom antitela delimično ili potpuno ljudskog oblika glikozilacije. videti Gerngros, Nat. Biotehnologija.22:1409-1414 (2004), i Li i dr., Nat. Biotehnologija.
24:210-215 (2006).
[0207] Odgovarajuće ćelije domaćina za ekspresiju glikozilovog antitela takođe su izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije
4
biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr., patent SAD br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (opisujući PLANTIBODIES ™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
[0208] Ćelije kičmenjaka se takođe mogu koristiti kao domaćini. Na primer, ćelijske linije sisara koje su prilagođene da rastu u suspenziji mogu biti korisne. Drugi primeri korisnih linija ćelija domaćih sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana SV40 (COS-7); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije kao što je opisano, npr., u Graham et al, J. Gen Virol 36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčaka (BHK); mišje sertolijske ćelije (TM4 ćelije kao što je opisano, npr., u Mather, Biol Reprod 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); Afričke ćelije bubrega zelenih majmuna (VERO-76); ćelije karcinoma ljudskog grlića materice (HELA); pseće ćelije bubrega (MDCK, jetrene ćelije bivoljeg pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), ćelije ćelija jetre (Hep G2), tumor dojke miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano npr., u Mather i dr., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije sisarskih ćelija uključuju ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući ćelije DHFR-CHO (Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:4216 (1980)) i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih sisarskih ćelija domaćih ćelija pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biologi, Viol., 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totova, NJ), str.255-268 (2003).
C. Analize
[0209] Anti-FcRH5 antitela koja su ovde navedena, mogu biti identifikovana, prikazana ili okarakterisana po njihovim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkim aktivnostima različitim analizama poznatim u ovoj oblasti.
[0210] U jednom aspektu, ovde navedeno antitelo može biti testirano za aktivnost vezivanja antigena, npr., poznatim metodama kao što su ELISA, BIACore®. FACS ili Western blot.
[0211] U drugom aspektu, testovi konkurencije mogu se koristiti za identifikaciju antitela koje se takmiči sa bilo kojim antitelima koja su ovde opisana za vezivanje za FcRH5. U određenim otelotvorenjima takvo konkurentno antitelo se vezuje za isti epitop (npr., linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan antitelo koje je opisano ovde. Detaljne primerne metode za mapiranje epitopa na koje se vezuje antitelo u Morrisu (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0212] U primerenom testu konkurencije, imobilizovani FcRH5 inkubira se u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo koje se vezuje za FcRH5 (npr., bilo koje od antitela opisanih ovde) i drugo neoznačeno antitelo koje se testira na njegovu sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za FcRH5. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani FcRH5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo, ali ne i drugo neoznačeno antitelo. Posle inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela na FcRH5, uklanja se višak neobeleženog antitela, a količina oznake povezane sa imobilizovanim FcRH5 se meri. Ako je količina oznake povezane sa imobilizovanim FcRH5 znatno smanjena u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje na to da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za FcRH5. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcR-H5c. U nekim otelotvorenjima antitelo FcRH5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima antitela FcRH5 vezuju domen nalik Ig 9 koji se nalazi na FcRH5c.
D. Imunokonjugati
[0213] Takođe su ovde sadržani imunokonjugati koji sadrže antitelo protiv FcRH5 ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiranje rasta, toksini (npr., proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterija, gljivica, biljaka ili životinjskog porekla ili njihovih fragmenata) ili radioaktivnih izotopa (tj. radiokonjugata). U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju Ig-nalik domen 9 FcRH5c.
[0214] Imunokonjugati dozvoljavaju ciljanu isporuku leka tumoru, a u nekim otelotvorenjima intracelularnu akumulaciju tamo gde sistemsko primanje nekonjugovanih lekova može rezultirati neprihvatljivim nivoima toksičnosti za normalne ćelije (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
[0215] Konjugati antitela-lekovi (ADC) su ciljani hemoterapeutski molekuli koji kombinuju svojstva oba antitela i citotoksičnih lekova ciljanjem snažnih citotoksičnih lekova na tumorske ćelije koje vrše ekspresiju antigene (Teicher, BA, (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), čime se povećava terapeutski indeks tako što se maksimizira efikasnost i minimizira toksičnost van ciljanja (Carter, PJ. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
[0216] ADC jedinjenja koja su ovde navedena uključuju one sa anti-kancerogenom aktivnošću. U nekim otelotvorenjima, ADC jedinjenja uključuju antitelo konjugovano, tj. kovalentno vezano, na deo leka. U nekim otelotvorenjima, antitelo je kovalentno vezano za deo lekova kroz veznik. Konjugati antitela i lekova (ADC) koji se ovde nude selektivno daju efikasnu dozu leka tumorskom tkivu, pri čemu se može postići veća selektivnost, tj. niža efikasna doza, dok se povećava terapeutski indeks (“terapeutski prozor”).
[0217] Ostatak leka (D) konjugata antitela-lekova (ADC) može uključivati bilo koje jedinjenje, ostatak ili grupu koja ima citotoksični ili citostatski efekat. Ostali lekovi mogu preneti svoje citotoksične i citostatske efekte mehanizmima uključujući, ali bez ograničenja, vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili interkalaciju i inhibiranje RNK polimeraze, sinteze proteina i/ili topoizomeraze. Primeri lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, majtansinoid, dolastatin, auristatin, kalicheamicin, pirolobenzodiazepin (PBD), nemorubicin i njegove derivate, PNU-159682, antraciklin, duokarmicin, vinca alkaloid, taksan, trihotecen, CC1065, kamptotecin, elinafid, i stereoizomeri, izosteri, analoge i njihove derivati koji imaju citotoksičnu aktivnost. Neograničavajući primeri takvih imunokonjugata detaljno se razmatraju u daljem tekstu.
1. Primeri konjugata lekova antitela
[0218] Primerno otelotvorenje jedinjenja konjugata antitela i lekova (ADC) sadrži antitelo (Ab) koje cilja tumorsku ćeliju, deo leka (D) i vezni deo (L) koji pripada Ab do D. U nekim otelotvorenjima antitelo je vezano za vezni deo (L) kroz jedan ili više aminokiselinskih ostataka, kao što su lizin i/ili cistein.
[0219] Primerni ADC ima Formulu I:
Ab-(L-D)pI
gde je p od 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, broj lekova koji mogu biti konjugovani sa antitelom ograničen je brojem slobodnih ostataka cisteina. U nekim otelotvorenjima, slobodni ostaci cisteina se unose u aminokiselinsku sekvencu antitela metodama opisanim ovde. Primeri ADC Formule I uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja imaju 1, 2, 3 ili 4 inženjeringa cisteinskih aminokiselina (Lion, R. et al (2012) Methods in Enzym, 502:123-138). U nekim otelotvorenjima jedan ili više slobodnih cisteinskih ostataka već su prisutni u antitelu, bez upotrebe inženjeringa, u kom slučaju postojeći ostaci slobodnih cisteina mogu se koristiti za konjugovanje antitela na lek. U nekim otelotvorenjima, antitelo je izloženo na smanjenje stanja pre konjugacije antitela kako bi se generisao jedan ili više slobodnih
4
ostataka cisteina. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformni specifični region vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju Ig-u sličan domen 9 FcRH5c.
a) Primerni veznici
[0220] “Veznik” (L) je bifunkcionalni ili multifunkcionalni deo koji se može koristiti za povezivanje jedne ili više grupa lekova (D) sa antitelom (Ab) da bi se formirao konjugat antitela-lekova (ADC) Formule I. U nekim otelotvorenjima, konjugati antitela-lekovi (ADC) se mogu pripremiti koristeći veznik koji ima reaktivne funkcionalnosti za kovalentno vezivanje za lek i za antitelo. Na primer, u nekim otelotvorenjima, cistein tiol antitela (Ab) može da formira vezu sa reaktivnom funkcionalnom grupom veznika ili intermedijera leka-veznika da bi napravio ADC.
[0221] U jednom aspektu, veznik ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa slobodnim cisteinom prisutnim na antitelu da bi se formirala kovalentna veza. Neograničavajući primer ove reaktivne funkcionalnosti uključuju maleimid, haloacetamide, αhaloacetil, aktivirane estre kao što su sukcinimid estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, tetrafluorofenil estri, anhidridi, hloridi kiselina, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocianati. Videti, npr., metod konjugacije na strani 766. Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, i ovdašnje Primere.
[0222] U nekim otelotvorenjima, veznik ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa elektrofilnom grupom prisutnom na antitelu. Primeri takve elektrofilne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, aldehidne i ketonske karbonilne grupe. U nekim otelotvorenjima, heteroatom reaktivne funkcionalnosti veznika može reagovati sa elektrofilnom grupom na antitelu i formirati kovalentnu vezu u jedinicu antitela. Neograničavajuće primere takve reaktivne funkcionalnosti uključuju, ali se ne ograničavaju na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid.
[0223] Veznik može sadržati jednu ili više komponenti povezivanja. Primerne vezničke komponente obuhvataju 6-maleimidokaproil , maleimidopropanoil (“MP”), valin-citrulin (“val-cit” ili “vc”), alanin-fenilalanin (“ala-phe”), p-aminobenziloksikarbonil (“PAB”), N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat (“SPP”) i 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilat U struci su poznate razne komponente veznika, od kojih su neke opisane u nastavku.
[0224] Veznik može biti “razdvojivi veznik”, koji olakšava oslobađanje leka. Neograničavajući primerni razdvojivi veznici uključuju veznike sa kiselom labilnošću (npr., sastoje se od hidrazona), veznici proteaze-senzitivna (npr., osetljivi na peptidazu), fotolabilni veznici ili veznici koji sadrže disulfid (Chari et al, Cancer Research 52:127-131 (1992 ), US 5208020).
[0225] U određenim otelotvorenjima, veznik ima sledeću Formulu II:
-Aa-Ww-Yy- II
gde je A “jedinica nosača” i a je celi broj od 0 do 1; W je “jedinica aminokiselina”, a w je ceo broj od 0 do 12; Y je “ razdvajajuća jedinica”, a y je 0, 1 ili 2, ADC koji sadrži veznik Formule II ima Formulu I(A):Ab- (Aa-Ww-Yy-D)p, gde Ab, D i p su definisani kao gore za Formulu I. Primeri otelotvorenja takvih veznika su opisani u patentu SAD br.7,498,298.
[0226] U nekim otelotvorenjima komponenta veznika sadrži “nosač” (A) koji povezuje antitelo sa drugom vezivnom komponentom ili sa ostatkom lekova. Neograničavajuće uzorne jedinice za nosače su prikazane ispod (gde talasasta linija označava mesta kovalentnog vezivanja za antitelo, lek ili dodatne vezivne komponente):
4
[0227] U nekim otelotvorenjima, veznik komponenta sadrži “aminokiselinsku jedinicu” (W). U nekim takvim otelotvorenjima, aminokiselinska jedinica dozvoljava cepanje veznika proteazom, čime se olakšava oslobađanje leka iz imunokonjugata nakon izloženosti međućelijskim proteazama, kao što su lizozomalni enzimi (Doronina et al, (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Primeri aminokiselinske jedinice obuhvataju, ali bez ograničenja, dipeptidi, tripeptidi, tetrapeptidi i pentapeptidi. Primeri dipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, valin-citrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili alaphe); fenilalanin-lizin (fk ili phe- lys); fenilalanin-homolizin (phe-homolis); i N-metil-valin-citrulin (Me-val-cit). Primerni tripeptidi obuhvataju, ali bez ograničenja, glicin-valin-citrulin (gl-val-cit) i glicin-glicin-glicin (gly-gly-gly). Jedinica aminokiselina može sadržati ostatke aminokiselina koji se javljaju prirodnim i/ili manjim aminokiselinama i/ili analogijama koje se ne pojavljuju u prirodi, kao što je citrulin. Jedinice aminokiselina mogu se projektovati i optimizovati za enzimsko cepanje od strane određenog enzima, na primer, proteaze povezane sa tumorom, katepsina B, C i D ili plazmin proteaze.
[0228] Tipično, veznici peptidnog tipa mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, prema metodi sinteze tečne faze (npr., E. Schröder and K. Lübke (1965) “The Peptides”, tom 1, str 76-136, Academic Press).
[0229] U nekim otelotvorenjima, komponenta veznika sadrži “razdvojivu jedinicu” (Y) koja povezuje antitelo sa ostatkom lekova, bilo direktno ili preko jedinice za nošenje i/ili jedinice aminokiselina. Jedinica za razdvajanje može biti “samo-imobilizovana” ili “ne-samo-imobilizovana”. Jedinica za “ nesamo-imobilizovana” distancu je ona u kojoj deo ili celokupna razdvajajuća jedinica ostaje vezana za deo leka nakon cepanja ADC-a. Primeri ne-samo-imobilizovana razdvojivih jedinica obuhvataju, ali bez ograničenja na, jedinicu za glicinske razmake i glicin-glicin jedinicu za razdvajanje. U nekim otelotvorenjima, enzimsko cepanje ADC-a koji sadrži glicin-glicin jedinicu za razdvajanje pomoću proteaze povezane sa tumorskim ćelijama dovodi do oslobađanja dela glicin-glicin-leka ostatka ADC-a. U nekim takvim otelotvorenjima, glicin-glicin-lek podložan je stepenu hidrolize u tumorskoj ćeliji, čime se razdvaja jedinica za glicin-glicin razdvajanje iz ostatka leka.
[0230] “Samo-imobilizovana” razdvajajuća jedinica omogućava oslobađanje ostatka leka. U određenim otelotvorenjima, razdvajajuća jedinica veze za povezivanje sadrži p-aminobenzil jedinicu. U nekim
4
takvim otelotvorenjima, p-aminobenzil alkohol je povezan aminokiselinskom jedinicom preko amidne veze, a između benzil alkohola i leka napravljen je karbamat, metilkarbamat ili karbonat (Hamann et al (2005) Expert Opin, Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). U nekim otelotvorenjima, razdvajajuća jedinica sadrži p-aminobenziloksikarbonil (PAB). U nekim otelotvorenjima, ADC koji sadrži samoimobilizovani veznik ima strukturu:
gde Q je - C1-C8alkil, -O- (C1-C8alkil), -halogen, -vitro ili -cijano: m je celi broj u rasponu od 0 do 4; X može biti jedna ili više dodatnih razdvajajućih jedinica ili može biti odsutna; i p se kreće od 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, p se kreće od 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5, ili 1 do 4. Neograničavajuće uzorne X razdvajajuće jedinice uključuju:
gde su R1i R2nezavisno izabrani od H i C1-C6alkila. U nekim otelotvorenjima, R1i R2su svaki -CH3.
[0231] Drugi primeri samo-imobilizovanih razdvajajućih jedinica uključuju, ali se ne ograničavaju na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi, kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (patent SAD br.7,375,078; Hay i dr. (1999) Bioorg, Med. Chem., Let 9:2237) i orto- ili paraaminobenzilacetali. U nekim otelotvorenjima mogu se koristiti razdvajajuće jedinice koje se podvrgavaju ciklizaciji hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobutirne kiseline (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), adekvatno supstituisani biciklo [2.2.1] i bicikl [2.2.2] prstenasti sistemi (Storm et al (1972) J. Amer. Chem, Soc. 94:5815) i amidi 2 aminopenilpropionske kiseline (Amsberri, i dr., 1990. J. Org Chem, 55:5867). Povezivanje leka sa αugljenikom ostatka glicina je još jedan primer samo-imobilizovanih razdvajajućih jedinica koje mogu biti korisne u ADC (Kingsbury et al (1984) J, Med. Chem, 27:1447).
[0232] U nekim otelotvorenjima, veznik L može biti veznik dendritičnog tipa za kovalentno vezivanje više od jedne lekovite grupe na antitelo preko granularnog, multifunkcionalnog veznika (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768), dendritski veznici mogu povećati molarni odnos leka u antitelu, tj. opterećenje, što je povezano sa potencijom ADC-a. Stoga, gde antitelo nosi samo jednu reaktivnu cistein-tiol grupu, mnoštvo lekova može biti vezano preko dendritičkog veznika.
[0233] Neograničavajući uzorni veznici su prikazani ispod u kontekstu ADC Formule I:
4
val-cit
MC-al-cit
MC-val-cit-PAB
gde su R1i R2nezavisno izabrani od H i C1-C6alkila. U nekim otelotvorenjima, R1i R2su svaki - CH3.
Phe-homoLis-PAB-Ab;
gde je n 0 do 12, U nekim otelotvorenjima, n je 2 do 10. U nekim otelotvorenjima, n je 4 do 8.
[0234] Daljnji neograničavajući primeri ADC-a uključuju strukture:
4
gde je X:
Y je:
svaki R je nezavisno H ili C1-C6alkil; i n je 1 do 12,
[0235] U nekim otelotvorenjima, veznik je supstituisan sa grupama koje podešavaju rastvorljivost i/ili reaktivnost. Kao neograničavajući primer, dopunjeni supstituent kao što je sulfonat (-S03) ili amonijum može povećati rastvor u vodi vezivnog reagensa i olakšati reakciju povezivanja vezivnog reagensa sa antitelom i/ili ostatkom leka ili olakšati reakciju povezivanja Ab-L (antitelo-veznik posrednik) sa D ili D-L (intermedijer lek-veznik) sa Ab, u zavisnosti od sintetičke rute za pripremu ADC-a. U nekim otelotvorenjima deo veznika je spojen sa antitelom i deo veznika je spojen sa lekom, a onda je Ab-(vezujući deo)<s>povezan sa lekom-(vezivni deo) da bi se formirao ADC Formule L.
[0236] Jedinjenja koja su ovde navedena eksplicitno razmatraju, ali nisu ograničena na, ADC pripremljen sa sledećim reagensima vezivanja: bis-maleimido-trioksietilen glikol (BMPEO), N-( βmaleimidopropiloksi)-N-hidroksi sukcinimid estar (BMPS), N-( ε-maleimidokaproiloksi) sukcinimid estar (EMCS), N-[γ-maleimidobutiriloksi] sukcinimid estar (GMBS), 1,6-heksan-bis-vinilsulfon (HBVS), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksi (6-amidokaproat) sukcinimid estar (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), kiselinski hidrazid (MPBH), sukcinimidil 3-(bromacetamido)propionat (SBAP), sukcinimidil jodoacetat (SIA), sukcinimidil (4jodoacetil)aminobenzoat (SIAB), N-suk-cinimidil-3-(2- piridilditio)propionat (SPDP), N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP), sukcinimidil 4-(Nmaleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (SMPB), sukcinimidil 6-[(betamaleimidopropionamido)heksanoat] (SMPH), iminotiolan (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i sukcinimidil- (4-vinilsulfon) benzoat (SVSB), uključujući i bis-maleimidne reagense: ditiobismaleimidoetan (DTME), 1,4-bismaleimidobutan (BMB), 1,4 bismaleimidil-2, 3-dihidroksibutan (BMDB), bismaleimidoheksan (BMH), bismaleimidoetan (BMOE), BM (PEG) 2 (prikazano ispod) i BM (PEG)3(prikazano ispod); bifuzionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCI), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (pazidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazoniuma kao bis- (p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). U nekim otelotvorenjima, bis-maleimidni reagensi dozvoljavaju vezivanje tiolne grupe cisteina u antitelo u agens za tretiranje tiola, veznik ili intermedijer veznika. Ostale funkcionalne grupe koje su reaktivne sa tiolnim grupama uključuju, ali nisu ograničene na, jodoacetamid, bromoacetamid, vinil piridin, disulfid, piridil disulfid, izocijanat i izotiocianat.
[0237] Određeni korisni veznici reagensi mogu se dobiti iz različitih komercijalnih izvora, kao što su Pierce Biotechnologi, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) ili sintetisani u skladu sa postupcima opisanim u struci; na primer, u Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, i dr. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M. A. (1995) J. Org. Chem.60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; i WO 04/032828.
[0238] Karbon-14-označena 1-izotiocianatobenzil-3-metildtetilen triaminepentaocetna kiselina (MX-DTPA) je primerni helatni agens za konjugaciju radionukleotida u antitelo. Videti, npr., WO 94/11026.
b) Grupe leka
(1) Majtansin i majtansinoidi
[0239] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekulskih molekula. Majtansinoidi su derivati majtansina, i predstavljaju mitotične inhibitore koji deluju inhibiranjem polimerizacije tubulina. Majtansin je prvi put izolovan od istočno-afričkog grmlja Maytenus serrata (patent SAD br.3896111). Kasnije je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode majtansinoide, kao što su majtansinol i C-3 majtansinol estri (Patent SAD br.4,151,042). Sintetički majtansinoidi su obelodanjeni, na primer, u patentima SAD br.4,137,230; 4,248,870;
4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.
[0240] Ostaci majtansinoid lekova su atraktivni ostaci lekova u konjugatima antitelnih lekova, jer su: (i) relativno pristupačni za pripremu fermentacijom ili hemijskom modifikacijom ili derivatizacijom proizvoda fermentacije, (ii) podložni derivatizaciji sa funkcionalnim grupama koje su pogodne za konjugaciju kroz ne-disulfid veznike sa antitelima, (iii) stabilni u plazmi, i (iv) efikasni protiv različitih linija tumorskih ćelija.
1
[0241] Određeni majtansinoidi koji su pogodni za upotrebu kao delovi majtansinoid lekova su poznati u stanju tehnike i mogu biti izolovani iz prirodnih izvora prema poznatim metodama ili proizvedeni pomoću tehnika genetičkog inženjeringa (videti, npr., Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973). Majtansinoidi takođe mogu biti sintetički pripremljeni prema poznatim metodama.
[0242] Ostaci majtansinoid lekova uključuju, ali nisu ograničeni na one koji imaju modifikovani aromatični prsten, kao što su: C-19-dehloro (Patent SAD br. 4256746) (pripremljen, na primer, redukcijom litijum aluminijum hidrida ansamitocina P2); C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /- C-19-dehloro (Patent SAD br. 4361650 i 4307016) (pripremljen, na primer, demetilacijom koristeći Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinaciju koristeći LAH); i C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /- dehloro (Patent SAD 4,294,757) (pripremljen, na primer, acilacijom pomoću acil hlorida), a oni koji imaju modifikacije na drugim položajima aromatičnog prstena.
[0243] Ostaci majtansinoid lekova takođe uključuju one koji imaju modifikacije kao što su: C-9-SH (Patent SAD br. 4424219) (pripremljen, na primer, reakcijom majtansinola sa H2S ili P2S5); C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (US 4331598); C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (Patent SAD br.4450254) (pripremljen, na primer, iz Nocardia); C-15-hidroksi/aciloksi (US 4364866) (pripremljen, na primer, konverzijom majtansinola Streptomyces):C-15-metoksi (Patent SAD br. 4313946 i 4315929) (na primer, izolovan iz Trewia nudlflora) ; C-18-Ndemetil (Patenti SAD br.
4362663 i 4322348) (pripremljen, na primer, demetilacijom majtansinola Streptomyces); i 4,5-deoksi (US 4371533) (pripremljen, na primer, pomoću titanijum trihlorida/LAH redukcije majtansinola).
[0244] Mnoge pozicije na majtansinoid jedinicama su korisne kao mesto vezivanja. Na primer, estarska veza može se formirati reakcijom sa hidroksil grupom koristeći konvencionalne tehnike spajanja. U nekim otelotvorenjima, reakcija može da se pojavi na položaju C-3 koji ima hidroksilnu grupu, položaj C-14 modifikovan sa hidroksimetilom, C- 15 položaj modifikovan sa hidroksil grupom, i položaj C-20 koji ima hidroksilnu grupu. U nekim otelotvorenjima, veza se formira na položaju C-3 majtansinola ili analoga majtansinola.
[0245] Majtansinoid lekovi uključuju one koji imaju strukturu:
gde talasasta linija ukazuje na kovalentno vezivanje atoma sumpora ostatka majtansinoid leka sa veznikom ADC-a. Svaki R može nezavisno biti H ili C1-C6alkil. Alkilen lanac koji povezuje amidnu grupu sa atomom sumpora može biti metanil, etanil ili propil, tj. m je 1, 2 ili 3 (US 633410; US 5208020; Chari et al (1992) Cancer Res, 52:127- 131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
[0246] Svi stereoizomeri ostatka majtansinoid leka su predviđeni za ADC koji su ovde navedeni, tj. bilo koja kombinacija R i S konfiguracija na hiralnim ugljenicima (US 7276497, US 6913748, US 6441163, US 633410 (RE39151), US 5208020, Widdison et al ( 2006) J. Med. Chem., 49:4392-4408, koji su u celini uključeni u referencu). U nekim otelotvorenjima, ostatak majtansinoid leka ima sledeću
2
stereohemiju:
[0247] Primeri otelotvorenja ostataka majtansinoid lekova uključuju, ali bez ograničenja, DM1; DM.3; i DM4, koji imaju strukture:
pri čemu talasasta linija označava kovalentno vezivanje atoma sumpora leka za veznik (L) konjugata antitela,
[0248] Drugi primerni konjugati majtansinoid antitela i lekova imaju sledeće strukture i skraćenice (u kojima je Ab antitelo i p je od 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, p je od 1 do 10, p je od 1 do 7, p je od 1 do 5 ili
Ab -SPP-DM1
4
AB-SMCC-DM1
[0249] Primeri konjugata antitela i lekova u kojima je DM1 vezan preko veznika BMPEO sa tiol grupom antitela imaju strukturu i skraćenicu:
gde je Ab antitelo; n je 0, 1 ili 2; i p je od 1 do oko 20, U nekim otelotvorenjima p je od 1 do 10, p je od 1 do 7, p je od 1 do 5, ili p je od 1 do 4.
[0250] Imunokonjugati koji sadrže majtansinoide, metode njihove proizvodnje i njihova terapeutska upotreba otkriveni su, na primer, u patentima SAD br.5,208,020 i 5,416,064; US 2005/0276812 A1; i Evropski patent EP 0425235 B1. Videti i Liu i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 93:8618-8623 (1996); i Chari i dr. Cancer Research 52:127-131 (1992).
[0251] U nekim otelotvorenjima konjugati majtansinoid antitela mogu biti pripremljeni hemijskim povezivanjem antitela sa molekulom majtansinoida bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti bilo antitela ili molekula majtansinoida. Videti, npr., Patent SAD br. 5,208,020. U nekim otelotvorenjima, ADC sa prosekom od 3-4 majtansinoid molekula konjugovanih po molekulu antitela pokazala su efikasnost u povećanju citotoksičnosti ciljnih ćelija bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela. U nekim slučajevima, očekuje se da će čak i jedan molekul toksina/antitela povećati citotoksičnost u odnosu na upotrebu golih antitela.
[0252] Povezujuće grupe za izradu konjugata antitela-majtansinoida uključuju, na primer, one opisane ovde i one obelodanjene u patentu SAD br.5208020; Patent EP 0 425 235 B1; Chari i dr. Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; i US 2005/016993 A1.
(2) Auristatin i dolastatin
[0253] Ostali lekovi uključuju dolastatine, auristatine i analoge i njihove derivate (US 5635483, US 5780588, US 5767237, US 6124431). Auristatini su derivati jedinjenja dolastatin-10 morskog mekušca. Iako nije nameravano da se obavezuje određenom teorijom, dokazano je da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, GTP hidrolizu i nuklearnu i ćelijsku podelu (Woyke et al (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) i imaju antikancerogenu (US 5663149) i antifungalnu aktivnost (Pettit et al (1998) Antimicrob Agents Chemother 42:2961-2965). Dolastatinski/auristatinski ostatak leka može biti vezan za antitelo preko N (amino) terminusa ili C (karboksil) terminusa peptidnog ostatka leka (WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465).
[0254] Primeri otelotvorenja auristatina uključuju N-terminus vezan za ostatke lekova monometilaristatina DEi DF, objavljeni u US 7498298 i US 7659241:
pri čemu talasasta linija DEi DFoznačava kovalentno mesto vezivanja za antitelo ili komponentu antitela-veznika i nezavisno na svakoj lokaciji:
R<2>je izabran iz H i C1-C8alkila;
R<3>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila, C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-( C3-C8karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
R<4>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila. C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-(C3-C8karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
R<5>je izabran iz H i metila;
ili R<4>i R<5>zajedno formiraju karbociklični prsten i imaju formulu -(CRR)n- gde R<a>i R<b>su nezavisno izabrani iz H, C1-C8alkila i C3-C8karbocikla i n je izabran iz 2, 3, 4, 5 i 6;
R<6>je izabran iz H i C1-C8alkila;
R<7>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila, C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-(C3-C5karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
svaki R<8>is nezavisno izabran iz H, OH, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla i O-(C1-C8alkila);
R<9>je izabran iz H i C1-C8alkila;
R<10>je izabran iz arila ili C3-C8heterocikla;
Z je O, S, NH, ili NR<12>, gde R<12>je C1-C8alkil;
R<11>je izabran iz H, C1-C20alkila, arila, C3-C8heterocikla, -(R<13>O)m-R<14>, ili -(R<13>O)m-H(R<15>)2; m je ceo broj u opsegu od 1-1000;
R<13>je C2-C8alkil;
R<14>je H ili C1-C8alkil;
svaka pojava R<15>je nezavisno H, COOH, -(CH2)n-N(R)2, -(CH2)n-SO3H, ili -(CH2)n-SO3-C1-C8alkil;
svaka pojava R<16>je nezavisno H, C1-C8alkil, ili -(CH2)n-COOH;
R<18>je izabran iz -C(R<8>)2-C(R<8>)2-arila, -C(R<8>)2-C(R<8>)2-(C3-C8heterocikla), i
-C(R<8>)2-C(R<8>)2-(C3-C8karbocikla); i
n je ceo broj u opsegu od 0 to 6.
[0255] U jednom otelotvorenju, R<3>, R<4>i R<7>su nezavisno izopropil ili sek-butil i R<5>je -H ili metil. U primernom otelotvorenju, R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<5>je -H, a R7 je sek-butil
[0256] U još jednom otelotvorenju, R<2>i R<6>je svaki metil i R<9>je -H.
[0257] U još jednom otelotvorenju, svaka pojava R<8>je -OCH3.
[0258] U nekim otelotvorenjima R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<2>i R<6>su svaki metil, R<5>je -H, R<7>je sekbutil, svaka pojava R<8>je -OCH3, a R<9>je -H.
[0259] U jednom otelotvorenju, Z je -O- ili -NH-.
[0260] U jednom otelotvorenju R<10>je aril.
[0261] U primernom otelotvorenju R<10>je -fenil.
[0262] U primernom otelotvorenju kada je Z -O-, R<11>je -H. metil ili t-butil.
[0263] U jednom otelotvorenju, kada Z je -NH, R<11>je -CH(R<15>)2, gde R<15>je -(CH2)n-N(R<16>)2, i R<16>je -C1-C8alkyl ili -(CH2)n-COOH.
[0264] U drugom otelotvorenju, kada je Z -NH, R<11>je -CH(R<15>)2, pri čemu je R<15>-(CH2)n-SO3H.
[0265] Primer otelotvorenja auristatina formule DEje MMAE, pri čemu talasasta linija označava kovalentni priključak za veznik (L) konjugata antitela-leka:
[0266] Primer otelotvorenja auristatina formule DFje MMAF, pri čemu talasasta linija označava kovalentni priključak na veznik (L) konjugata antitela-leka:
[0267] Drugi primeri otelotvorenja uključuju monometilvalinska jedinjenja koja sadrže fenilalanin karboksi modifikacije na C-terminusu pentapeptidne auristatinske grupe (WO 2007/008848) i monometilvalinska jedinjenja koja imaju fenilalanin bočni lanac modifikacije na C-terminu pentapeptidne auristatinske grupe (WO 2007/008603 ).
[0268] Neograničavajući primeri otelotvorenja ADC Formule I koja sadrži MMAE ili MMAF i razne vezničke komponente imaju sledeće strukture i skraćenice (gde je “Ab” antitelo; p je od 1 do oko 8, “Val-Cit” je valin-citrulinski dipeptid; i “S” je atom sumpora:
Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-MC-MMAE
Ab-MC-MMAF
[0269] Neograničavajući primeri otelotvorenja ADC-ova Formule I koji sadrže MMAF i razne komponente veznika dalje uključuju Ab-MC-PAB-MMAF i Ab-PAB-MMAF. Imunokonjugati koji sadrže MMAF vezani za antitelo pomoću veznika koji nije proteolitički otkinut mogu pokazati da poseduju aktivnost koja se može uporediti sa imunokonjugatima koji sadrže MMAF vezan za antitelo pomoću proteolitički razdvojivog veznika (Doronina i dr., 2006) Bioconjugate Chem 17:114- 124). U nekim takvim otelotvorenjima veruje se da je otpuštanje lekova izvedeno degradacijom antitela u ćeliji.
[0270] Tipično, delovi zasnovani na peptidima mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se dobiti, na primer, prema metodi sinteze tečne faze (videti, npr., E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). Auristatin/dolastatinski lekovi mogu u nekim otelotvorenjima biti pripremljeni prema metodama:US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit i dr. (1989) J. Am, Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit i dr. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., i dr. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans.15:859-863; i Doronina (2003) Nat. Biotechnol.21(7):778-784.
[0271] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja za lek auristatin/dolastatin formule DE, kao što su MMAE i DF, kao što su MMAF, i intermedijeri za lek-veznik i njihovi derivati, kao što su MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, i MC-vc-PAB-MMAE, mogu se pripremiti koristeći metode opisane u US 7498298; Doronina i dr. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; i Doronina i dr. (2003) Nat. Biotech.21:778-784, a potom konjugovana sa antitelom od interesa.
(3) Kaliheamicin
[0272] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula kaliheamicina. Kaliheamicinova familija antibiotika i njihovi analogi su sposobni da proizvedu dvostruke prekide DNK u sub-pikomolarnim koncentracijama (Hinman i dr., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode i dr., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). Kaliheamicin ima intracelularne delove delovanja, ali u određenim slučajevima ne prelazi plazmatsku membranu. Stoga, mobilno uzimanje ovih agenasa posredstvom antitela posredovane intervalizacije može, u nekim otelotvorenjima, značajno poboljšati njihove citotoksične efekte. Neograničavajuće primerne metode pripreme konjugata antitela u dijagnostici sa kaliheamicinskim ostatkom leka su opisane, na primer, u US 5712374:US 5714586; US 5739116; i US 5767285.
(4) Pirolorobenzodiazepini
[0273] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži pirolobenzodiazepin (PBD). U nekim otelotvorenjima, PDB dimeri prepoznaju i vezuju se za specifične sekvence DNK, prirodni proizvod antramicin, PBD, prvi put je prijavljen 1965. godine (Leimgruber, i dr., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793- 5795; Leimgruber, i dr., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). Od tada je prijavljen veliki broj PBD-ova, kako prirodnih, tako i analognih (Thurston, i dr., (1994) Chem. Rev.1994, 433-465 uključujući dimere triciklične PBD skele (US 6884799, US 7049311 US 7067511, US 7265105, US 7511032, US 7528126, US 7557099). Bez namere da se vezuje za određenu teoriju, veruje se da dimerska struktura daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izohelicitet sa manjim žlebom B-forme DNK, što dovodi do toga da se postavlja na mesto vezivanja (Kohn, In Antibiotics III, Springer-Verlag, New York, pp.3-11 (1975), Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc, Chem. Res., 19:230-237). Dimeric PBD jedinjenja koja sadrže C2-aril supstituente pokazala su se korisnim kao citotoksični agensi (Hartley et al (2010) Cancer Res.70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem, 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
[0274] PBD dimeri su konjugovani sa antitelima i rezultujući ADC pokazuje da ima anti-kancerogene osobine. Neograničavajući primeri vezivanja na PBD dimeru uključuju petočlanski pirolo prsten, vezu između PBD jedinica i N10-C11 imin grupu (WO 2009/016516, SAD 2009/304710, US 2010/047257, SAD 2009/036431 ; US 2011/0256157; WO 2011/13 (598).
[0275] Neograničavajući primerne PBD dimer komponente ADC-a su Formule A:
i njihove soli i rastvori, gde
talasasta linija označava kovalentno mesto za povezivanje sa veznikom;
tačkaste linije ukazuju na opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3;
R<2>je nezavisno izabran iz H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R, =C(R)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje izabran iz halo ili dihalo, gde je R<D>nezavisno izabran iz R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo;
R<6>i R<9>su nezavisno izabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn i halo;
R<7>je nezavisno izabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn i halo;
Q je nezavisno izabran iz O, S i VH;
R<11>je ili H, ili R ili, gde Q je O, SO3M, gde M je metalni katjon;
R i R’ svaki je nezavisno izabran iz opciono supstituisanog C1-8alkil, C1-12alkil, C3-8heterocikla,
C3-20heterocikl, i C5-20aril grupe, i opciono u vezi sa grupom NRR’, R i R’ zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten;
R<12>, H<16>, R<19>i R<17>su definisani za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>respektivno;
R” je C3-12alkilenska grupa, gde lanac može biti prekinut sa jednim ili više heteroatoma, npr., O, S, N(H), NMe i/ili aromatični prstenovi, npr., benzen ili piridin, koji su prstenovi po izboru supstituisani; i
X i X’ su nezavisno izabrani iz O, S i N(H).
[0276] U nekim otelotvorenjima, R i R‘ su svaki nezavisno izabrani iz opciono supstituisanih C1-12alkila, C3-20heterocikla i C5-20aril grupa, a opciono u odnosu na grupu NRR’, R i R‘ zajedno sa atomom azota na koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten.
[0277] U nekim otelotvorenjima, R<9>i R<19>je H.
[0278] U nekim otelotvorenjima, R<6>i R<16>je H.
[0279] U nekim otelotvorenjima, R<7>su R<17>su oba OR<7A>, gde R<7A>je opciono supstituisani C1-4alkil. U nekim otelotvorenjima, R<7A>je Me, U nekim otelotvorenjima, R<7A>je Ch2Ph, gde Ph je fenilna grupa.
[0280] U nekim otelotvorenjima, X je O.
[0281] U nekim otelotvorenjima, R<11>je H.
[0282] U nekim otelotvorenjima, postoji dvostruka veza između C2 i C3 u svakoj monomernoj jedinici.
[0283] U nekim otelotvorenjima R2 i R12 su nezavisno izabrani iz H i R. U nekim otelotvorenjima R2 i R su nezavisno R. U nekim otelotvorenjima R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani C5-20aril ili C5-7aril ili C8-10aril. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani fenil, tienil, naftil, piridil, kinolinil ili izokinolinil. U nekim otelotvorenjima R<2>i R<12>su nezavisno izabrani iz = O, = CH2, = CHR, i =C(R)2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>svaki =CH2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su svaki H. U nekim otelotvorenjima R<2>i R<12>su svaki =O. U nekim otelotvorenjima R<2>i R<12>su svaki = CF2. U nekim otelotvorenjima R<2>i/ili R<12>su nezavisno =C(R)2. U nekim otelotvorenjima R<2>i/ili R<12>su nezavisno =CH-R.
[0284] U nekim otelotvorenjima, kada su R<2>i/ili R<12>=CH-R<D>, svaka grupa može nezavisno imati bilo koju konfiguraciju prikazanu ispod:
[0285] U nekim otelotvorenjima, =CH-R<D>je konfiguracija (I).
[0286] U nekim otelotvorenjima, R” je C3alkilenska grupa ili C5alkilenska grupa.
[0287] U nekim otelotvorenjima, primerna PBD komponenta dimera ADC ima strukturu Formule A(I):
gde n je 0 ili 1.
[0288] U nekim otelotvorenjima, Primerna PBD komponenta dimera ADC ima strukturu Formule A(II):
gde n je 0 ili 1.
[0289] U nekim otelotvorenjima, primerna PBD komponenta dimera ADC ima strukturu Formule
gde su R<E>and R<E">nezavisno izabrani iz H ili R<D>, gde R<D>jesu definisani iznad; i gde n je 0 ili 1.
[0290] U nekim otelotvorenjima n je 0, U nekim otelotvorenjima n je 1. U nekim otelotvorenjima R<E>i/ili R<E>”je H. U nekim otelotvorenjima R<E>i R<E>su H. U nekim otelotvorenjima R<E>i/ili R<E>” je R<D>, pri čemu je R<D>opciono supstituisan C1-12alkil. U nekim otelotvorenjima R<E>i/ili R<E>“su R<D>, gde je R<D>metil.
[0291] U nekim otelotvorenjima, primerna PBD dimer komponenta ADC ima strukturu Formule A (IV):
gde Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani C5-20aril; gde Ar<1>i Ar<2>mogu biti isti ili različiti; i gde je n 0 ili 1.
[0292] U nekim otelotvorenjima, primerna PBD dimer komponenta ADC ima strukturu Formule A (V):
1
gde Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani C5-20aril; gde Ar<1>i Ar<2>mogu biti isti ili različiti; i gde je n 0 ili 1.
[0293] U nekim otelotvorenjima Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno izabrani iz opciono supstituisanog fenila, furanila, tiofenila i piridila. U nekim otelotvorenjima Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani fenil. U nekim otelotvorenjima Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani tien-2-il ili tien-3-il. U nekim otelotvorenjima Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani hinolinil ili izokinolil. Kinolinil ili izokinolinil grupa može biti vezana za PBD jezgro kroz bilo koju raspoloživu poziciju prstena. Na primer, kinolinil može biti kinolin-2-il, kinolin-3-il, kinolin-4il, kinolin-5-il, kinolin-6-il, kinolin-7-il i kinolin-8-il. U nekim otelotvorenjima, kinolinil je izabran od kinolin-3-il i kinolin-6-il. Izokinolinil može biti izokinolin-1-il, izokinolin-3-il, izokinolin-4il, izokinolin-5-il, izokviiain-6-il, izohinolin-7-il i izokinolin-8-il. U nekim otelotvorenjima, izokinolinil je izabran iz izokinolin-3-il i izokinolin-6-il.
[0294] Dalje neograničavajuće primerne PBD dimer komponente ADC-a su Formule B:
i njihove soli i rastvori, gde:
talasasta linija označava kovalentno mesto za povezivanje sa veznikom;
talasasta linija povezana sa OH označava S ili R konfiguraciju;
R<V1>i R<V2>su nezavisno izabrani iz H, metila, etila i fenila (koji fenil može opciono biti supstituisan sa fluorom, posebno na položaju 4) i C5-6heterociklil; gde R<V1>i R<V2>mogu biti isti ili različiti; i n je 0 ili 1.
[0295] U nekim otelotvorenjima, R<V1>i R<V2>su nezavisno izabrani iz H, fenila i 4-fluorofenila.
[0296] U nekim otelotvorenjima, veznik se može pričvrstiti na jednom od različitih lokacija u okviru PBD dimer grupe, uključujući N10 imin B prstena, C-2 endo/ekso poziciju C prstena, ili povezujuću jedinicu koja povezuje A (videti strukture C(I) i C(II) dole).
[0297] Neograničavajuće primerne PBD dimer komponente ADC-a uključuju Formule C(I) i C(II):
2
[0298] Formule C(I) i C(II) su prikazane u njihovom N10-C11 iminskom obliku. Primeri PBD lekova takođe uključuju karbinolaminske i zaštićene karbinolaminske forme, kao što je prikazano u tabeli ispod;
gde:
X je CH2(n = 1 to 5), N, ili O;
Z i Z’ su nezavisno izabrani iz OR i NR2, gde je R primarni, sekundarni ili tercijarni alkilni lanac koji sadrži 1 do 5 atoma ugljenika;
R1, R’1, R2i R’2svaki je nezavisno izabran iz H, C1-C8alkil, C2-C8alkenil, C2-C8alkinil, C5-20aril (uključujući supstituisane arile), C5-20heteroarilne grupe, -NH2, -NHMe, -OH, i -SH, gde, u nekim otelotvorenjima, alkil, alkenil i alkinil lanci sadrže do 5 atoma ugljenika;
R3i R’3su nezavisno izabrani iz H, OR, NHR, i NR2, gde je R primarni, sekundarni ili tercijarni alkilni lanac koji sadrži 1 do 5 atoma ugljenika;
R4i R’4su nezavisno izabrani iz H, Me, i OMe;
R5je izabran iz C1-C8alkil, C2-C8alkenil, C2-C8alkinil, C5-20aril (uključujući supstituisane arile sa halo, nitro, cijano, aloksi, alkil, heterociklom) i C5-20heteroarilna grupa, gde, u nekim otelotvorenjima, alkil, alkenil i alkinil lanci sadrže do 5 atoma ugljenika;
R11je H, C1-C8alkil, ili zaštitna grupa (kao što su acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ), 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc) ili deo koji sadrži samoimotirajuću jedinicu kao što je valinecitrulin-PAB);
R12je H, C1-C8alkil, ili zaštitna grupa; pri čemu vodonik jedne od R1, R’1, R2, R’2, ili R12ili vodonik -OCH2CH2(X)aCH2CH2O- distancer između A prstenova zamenjen je vezom spojenim sa veznikom ADC-a.
[0299] Primeri PDB dimerskih delova ADC-a uključuju, ali nisu ograničeni na (talasasta linija označava mesto kovalentnog priključka na veznik):
PBD dimer;
[0300] Neograničavajuća primerna otelotvorenja ADC-a koji sadrži PBD dimere imaju sledeće strukture:
PBD dimer-val-cit-PAB-Ab:
PBD dimer-maleimid-acetal-Ab;
PBD dimer-Phe-homoLys-PAB-Ab, gde:
n je od 0 do 12. U nekim otelotvorenjima, n je 2 do 10. U nekim otelotvorenjima, n je od 4 do 8. U nekim otelotvorenjima n je izabran iz 4, 5, 6, 7 i 8.
4
[0301] Veznici PBD dimer-val-cit-PAB-Ab i PBD dimer-Phe-homoLys-PAB-Ab su proteazom razdvojivi, dok je veznik PBD dimer-maleimid-acetal kiselo-labilan.
[0302] PBD dimeri i ADC koji sadrže PBD dimere mogu se pripremiti prema postupcima poznatim u struci. Videti, npr., WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; SAD 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598.
(5) Antraciklini
[0303] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži antraciklin. Antraciklini su antibiotska jedinjenja koja pokazuju citotoksičnu aktivnost. Iako nije namera vezivanje za određenu teoriju, ispitivanja su pokazala da antraciklini mogu delovati kako bi ubijali ćelije pomoću različitih mehanizama, uključujući: 1) interkalaciju molekula lekova u DNK ćelija na taj način inhibira sintezu nukleinske kiseline zavisne od DNK; 2) proizvodnju slobodnih radikala pomoću leka koji zatim reaguju sa ćelijskim makromolekulima kako bi oštetili ćelije i/ili 3) interakcije molekula lekova sa ćelijskom membranom (videti npr., C. Peterson i dr., “Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia” in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R, Bachur, “Free Radical Damage” id. at pp.97-102). Zbog njihovog citotoksičnog potencijala antraciklini su korišćeni u tretiranju brojnih karcinoma kao što su leukemija, karcinom dojke, karcinom pluća, adenokarcinom jajnika i sarkomi (videti npr., P.H- Wiernik, in AnthracycliNO:Current Status And New Developments p 11).
[0304] Neograničavajući primeri antraciklina uključuju doksorubicin, epirubicin, idarubicin, daunomicin, nemorubicin i njihove derivate. Pripremljeni su i proučavani imunokonjugati i prolekovi daunorubicina i doksorubicina (Kratz et al (2006) Current Med. Chem.13:477-523; Jeffrey et al (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al (2005) Bioconj. Chem.16:717-721; Nagy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834; Dubowchik et al (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). Konjugat antitela-leka BR96-doksorubicin reaguje specifično sa tumorom povezanim antigenom Lewis-Y i procenjen je u studijama faza I i II (Saleh et al (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al (2000) Cancer Jour.6:78-81; Tolcher et al (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
[0305] PNU-159682 je snažan metabolit (ili derivat) nemorubicina (Quintieri, i dr. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). Nemorubicin je polisintetički analog doksorubicina sa 2-metoksimorfolino grupom na glikozidnom aminu od doksorubicina i bio je pod kliničkom procenom (Grandi et al (1990) Cancer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti et al (1992) Brit, J. Cancer 65:703;), uključujući ispitivanja faze II/III za hepatocelularni karcinom (Sun et al (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1st Ed, Abs 4649; Pacciarini et al (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116).
[0306] Neograničavajući primer ADC-a koji sadrži derivate nemorubicina ili nemorubicina prikazan je u Formuli Ia:
gde R1je atom vodonika, hidroksi ili metoksi grupa i R2je C1-C5alkoksi grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;
L1i Z zajedno su veznik (L) kao što je ovde opisano;
T je antitelo (Ab) kako je ovde opisano; i
m je 1 do oko 20, u nekim otelotvorenjima, m je 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5 ili 1 do 4,
[0307] U nekim otelotvorenjima, R1i R2su oba metoksi (-OMe),
[0308] Sledeći neograničavajući primer ADC-a koji sadrži derivate nemorubicina ili nemorubicina prikazan je u Formuli Ib:
gde R1je atom vodonika, hidroksi ili metoksi grupa i R2je C1-C5alkoksi grupa, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;
L2i Z zajedno su veznik (L) kao što je ovde opisano;
T je antitelo (Ab) kako je ovde opisano; i
m je 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, m je 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5, ili 1 do 4.
[0309] U nekim otelotvorenjima R1i R2su oba metoksi (-OMe).
[0310] U nekim otelotvorenjima nemorubicinska komponenta ADC koja sadrži nemorubicin je PNU-159682. U nekim takvim otelotvorenjima, deo lekova ADC-a može imati jednu od sledećih struktura:
ili
gde talasasta linija označava vezu sa veznikom (L),
[0311] Antraciklini, uključujući PNU-159682, mogu biti konjugovani antitelima preko nekoliko lokacija povezivanja i različitih veznika (SAD 2011/0076287, WO2009/099741, SAD 2010/0034837, WO 2010/009124), uključujući veznike opisane ovde.
[0312] Primeri ADC-a koji sadrže nemorubicin i veznik uključuju, ali se ne ograničavaju se na:
PNU-159682 maleimid acetal-Ab;
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab;
PNU-159682-val-cit-PAB-distancer(RR)-Ab, gde:R1i R2su nezavisno izabrani iz H and C1-C6alkil; i
PNU-159682-maleimid-Ab.
[0313] Veznik PNU-159682 maleimid acetal-Ab je kiselinsko-labilan, dok veznici PNU-159682-valcit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-distancer-Ab i PNU-159682- val-cit-PAB-distancer (RR) -Ab su proteazom-razgradivi.
(6) Drugi ostaci lekova
[0314] Ostaci lekova takođe uključuju geldanamicin (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst.
92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Biocanjugate Chem.13:786-791); i enzimski aktivne toksine i njihove fragmente, uključujući, ali ne ograničavajući se na, difteriju A lanac, nevezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, lanac abrin A, modekcin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, proteini Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAPS), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restocin, fenomicin, enomicin i trikothecene. Videti, npr., WO 93/21232.
[0315] Ostaci lekova takođe uključuju jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr., ribonukleazu ili DNK endonukleazu).
[0316] U određenim otelotvorenjima, imunokonjugat može sadržati visoko radioaktivni atom. Na raspolaganju su različiti radioaktivni izotopi za proizvodnju antitela radiokonjugiranih antitela. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. U nekim otelotvorenjima, kada se za detekciju koristi imunokonjugat, može sadržati radioaktivni atom za skintigrafska ispitivanja, na primer Tc<99>ili I<123>ili oznaku spina za nultu magnetnu rezonancu (poznatu kao nuklearno magnetno snimanje NMR), kao što su cirkonijum89, jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Cirkonijum-89 može biti složen sa različitim agensima za helatiranje metala i konjugovan sa antitelima, npr., za PET snimanje (WO 2011/056983).
[0317] Radio- ili druge oznake mogu biti inkorporirane u imunokonjugat na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintetisan ili hemijski sintetisan pomoću pogodnih prethodnih aminokiselina koji sadrže, na primer, jedan ili više atoma fluora-19 umesto jednog ili više vodonika. U nekim otelotvorenjima, oznake kao što su Tc<99>, I<123>, Re<186>, Re i In mogu se vezivati preko ostatka cisteina u antitelu. U nekim otelotvorenjima, ittrij-90 može biti vezan preko lizinskog ostatka antitela. U nekim otelotvorenjima, IODOGEN metoda (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 može biti korišćena za inkorporisanje joda-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) opisuje određene druge metode.
[0318] U određenim otelotvorenjima, imunokonjugat može sadržati antitelo konjugovano koji aktivira enzim proleka. U nekim takvim otelotvorenjima, enzim koji aktivira prolek pretvara prolek (npr., peptidil hemoterapeutski agens, videti WO 81/01145) u aktivni lek, kao što je lek protiv kancera. Takvi imunokonjugati su korisni, u nekim otelotvorenjima, u terapiji koja je zavisna od antitela sa enzimom posredovana terapija proleka (“ADEPT”), Enzimi koji mogu biti konjugovani antitelom uključuju, ali se ne ograničavaju na, alkalne fosfataze koji su korisni za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfat u slobodne lekove; arilsulfataze, koji su korisni za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminaza, koja je korisna za pretvaranje netoksičnih 5-fluorocitozina u lek protiv kancera, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su seratska proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze i katepsine (kao što su katepsini B i L), koji su korisni za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže supstituente D-aminokiselina; enzimi koji rastavljaju ugljene hidrate, kao što su βgalaktozidaza i neuraminidaza, koji su korisni za pretvaranje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove β-laktamaza, koja je korisna za pretvaranje lekova derivatizovanih sa β-laktama u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza i penicilin G amidaza, koji su korisni za pretvaranje lekova koji su derivirani na njihovim aminotrofenima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, u slobodne lekove. U nekim otelotvorenjima, enzimi mogu biti kovalentno vezani za antitela pomoću tehnika rekombinantne DNK koje su dobro poznate u struci. Videti, npr., Neuberger i dr., Nature 312:604-608 (1984).
c) Unošenje leka
[0319] Unošenje lekova predstavlja p, prosečan broj lekova po antitelu u molekulu Formule I. Unošenje lekova može biti od 1 do 20 lekova (D) po antitelu. ADC Formule I obuhvataju kolekcije antitela konjugovanih sa nizom lekova od 1 do 20. Prosečan broj lekova po antitelu u preparatima ADC od reakcija konjugacije može se karakterizirati konvencionalnim sredstvima kao što su masena spektroskopija, ELISA test, i HPLC. Kvantitativna distribucija ADC u smislu može takođe biti određena. U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenog ADC-a, gde je p određena vrednost ADC-a sa drugim opterećenjem lekova, može se postići pomoćima kao što je HPLC sa reverznom fazom ili elektroforeza.
[0320] Za neke konjugate antitela, p može biti ograničeno brojem mesta vezivanja na antitelo. Na primer, kada je prilog cistein tiol, kao u nekim primerima otelotvorenja gore, antitelo može imati samo jednu ili više cisteinskih tiol grupa, ili može imati samo jednu ili više dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se može povezati veznik. U određenim otelotvorenjima, veće opterećenje lekova, npr., p> 5, može izazvati agregaciju, netopljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih konjugata antitela i lekova. U određenim otelotvorenjima, prosečno opterećenje lekova za ADC se kreće od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; ili od oko 3 do oko 5. Zaista, pokazano je da za određene ADC optimalni odnos lekova po antitelima može biti manji od 8 i može biti od oko 2 do oko 5 (US 7498298).
[0321] U određenim otelotvorenjima, manje od teoretskog maksimuma ostataka lekova su konjugovani sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može sadržati, na primer, lizinove ostatke koji ne reaguju sa intermedijarnim agensom leka-veznika ili reagensom veznika, kao što je opisano u nastavku. Uopšteno govoreći, antitela ne sadrže mnoge slobodne i reaktivne cisteinske tiolne grupe koje mogu biti vezane za deo leka; zapravo većina ostataka cisteinskog tiola u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U određenim otelotvorenjima, antitelo može da se redukuje pomoću redukcionog sredstva kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimičnim ili ukupnim redukcijskim uslovima, da bi se generisali reaktivni cistein tiol grupe. U određenim otelotvorenjima, antitelo je podložno uslovima denaturacije da bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.
[0322] Uticaj (odnos leka/antitela) ADC-a može se kontrolisati na različite načine, i na primer, putem:(i) ograničavanjem molskog viška intermedijera ili veznika reagensa vezanog za antitelo, (ii) ograničavanjem reakcije konjugacije vremena ili temperature, i (iii) delimičnih ili ograničavajućih reduktivnih uslova za modifikaciju cistein tiola.
[0323] Treba se shvatiti da tamo gde više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa intermedijarnim ili veznik reagensom lek-veznik, onda je dobijeni proizvod mešavina ADC jedinjenja sa raspodelom jednog ili više delova leka prikačenih na antitelo. Prosečan broj lekova po antitelu može se izračunati iz smeše pomoću dvostrukog testa ELISA antitela, koji je specifičan za antitelo i specifičan za tretiranje. Pojedinačne ADC molekule mogu se identifikovati u smeši masovnom spektroskopijom i odvojiti HPLC, npr., hidrofobnom interakcionom hromatografijom (videti npr., McDonagh et al (2006) Prot, Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res, 10:7063-7070; Hamblett, K.J., i dr. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004, Alley, S.C., el al “controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No.627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). U određenim otelotvorenjima, homogeni ADC sa jednim opterećenjem može se izolovati iz smeše konjugacije elektroforezom ili hromatografijom.
d) Određene metode za pripremanje imunokonjugata
[0324] ADC Formule I se može pripremiti na nekoliko načina koji koriste reakcije organske hemije, uslove i reagense poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući:(1) reakciju nukleofilne grupe antitela sa dvovalentnim veznik reagensom da bi se formirao Ab-L preko kovalentne veze, nakon čega sledi reakcija sa ostatkom leka D grupe; i (2) reakciju nukleofilne grupe dela lekova sa dvovalentnim vezivnim reagensom, da se formira D-L, preko kovalentne veze, praćene reakcijom sa nukleofilnom grupom antitela. Primeri postupaka za pripremu ADC Formule I preko sledeće rute su opisani u US 7498298.
[0325] Nukleofilne grupe na antitelima uključuju, ali se ne ograničavaju na:(i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe sa bočnim lancem, npr., lizin, (iii) tiolne grupe bočnog lanca, npr., cistein i (iv) šećerne hidroksilne ili amino grupe gde je antitelo glikozilirano. Amine, tiol i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju u obliku kovalentnih veza sa elektrofilnim grupama na vezivačkim delima i veznik reagensima uključujući:(i) aktivne estre kao što su estri NHS, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiselina; (ii) alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; i (iii) aldehidne, ketonske, karboksilne i maleimidne grupe. Pojedina antitela imaju redukovane disulfide interchaina, tj. cisteinove mostove, antitela mogu biti reaktivna za konjugaciju sa veznik reagensom tretiranjem redukcijskog sredstva kao što je DTT (ditiotreitol) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), tako da se antitelo potpuno ili delimično smanjuje. Na taj način svaki cisteinski most formira, teoretski, dva reaktivna tiol nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela modifikacijom ostataka lizina, npr., reakcijom lizinskih ostataka sa 2-iminotiolana (Trautov reagens), što rezultira konverzijom amina u tiol. Reaktivne tiol grupe mogu takođe biti uvedene u antitelo uvođenjem jednog, dva, tri, četiri ili više ostataka cisteina (npr., pripremanjem varijantnih antitela koja sadrže jedan ili više neuronskih ostataka aminokiselina cisteina).
[0326] Konjugati antitela i lekovi koji su ovde navedeni, mogu se takođe dobiti reakcijom između elektrofilne grupe na antitelu, kao što je aldehidna ili keton karbonilna grupa, sa nukleofilnom grupom na veznik reagensu ili leku. Korisne nukleofilne grupe na veznik reagensu uključuju, ali bez ograničenja, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. U jednom otelotvorenju antitelo je modifikovano da uvodi elektrofilne delove koji su u stanju reagovati sa nukleofilnim supstituentima na veznik reagensu ili leku. U drugom otelotvorenju, šećeri glikozilovanih antitela mogu biti oksidovani, npr., sa perzistentnim oksidacionim reagensima, kako bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu reagovati sa amin grupom veznik reagensa ili grupom lekova. Dobijene iminove šifske baze mogu formirati stabilnu vezu ili se mogu smanjiti, npr., pomoću borohidridnih reagensa za stvaranje stabilnih veza amina. U jednom otelotvorenju, reakcija ugljičnog dela glikozilovog antitela sa ili galaktoznom oksidazom ili meta-periodatom natrijuma može dati karbonil (aldehidne i ketonske) grupe u antitelo koje može reagovati sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Bioconjugate Technikues) U drugom otelotvorenju, antitela koja sadrže ostatke N-terminalnog serina ili treonina mogu da reaguju sa natrijum-meta-periodatom, što dovodi do stvaranja aldehida umesto prve aminokiseline (Geoghegan & Stro, (1992) Bioconjugate Chem, 3:138-146; US 5362852). Ovakav aldehid može reagovati sa ostatkom leka ili nukleofilom veznika.
[0327] Primerne nukleofilne grupe na sastavu leka obuhvataju, ali se ne ograničavaju na:amin, tiol, hidroksil, hidrazid, oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i grupe arilhidrazida koji mogu reagovati u obliku kovalentnih veza sa elektrofilnim grupama na vezničkim delovima i reagensima veznika uključujući:(i) aktivne estre kao što su estri NHS, esteri HOBt, haloformati i halogenidi kiselina; (ii) alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe.
[0328] Neograničavajući primerni reagensi unakrsne linije koji se mogu koristiti za pripremu ADC-a opisani su u odjeljku pod naslovom “Primerni veznici”. Metode korišćenja takvih reagensa za unakrsno
1
za povezivanje dve grupe, uključujući proteinski deo i hemijsku grupu, poznate su u stanju tehnike. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein koji sadrži antitelo i citotoksični agens može se napraviti, na primer, rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Molekul rekombinantne DNK može da sadrži regione koji kodiraju antitelo i citotoksične delove konjugata ili međusobno ili jedan od drugog regionom koji kodira veznik peptid koji ne uništava željene osobine konjugata.
[0329] U još jednom otelotvorenju, antitelo može biti konjugovano sa “receptoriom” (kao što je streptavidin) za upotrebu u pred-ciljnom tumoru, pri čemu se konjugat receptora antitela daje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću agensa za čišćenje, a zatim davanje “liganda” (npr., avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr., lekom ili radionukteotidom).
E. Metode i sastavi za dijagnostiku i detekciju
[0330] U određenim otelotvorenjima, bilo koje od anti-FcRH5 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje prisustva FcRH5 (npr., FcRH5) u biološkom uzorku. Termin “detektovanje” kao što se ovde koristi obuhvata kvantitativno ili kvalitativno detektovanje. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo. U određenim otelotvorenjima takva tkiva uključuju normalna i/ili kancerozna tkiva koja vrše ekspresiju FcRH5 na višim nivoima u odnosu na druga tkiva, na primer, B-ćelije i/ili tkiva povezana sa B-ćelijama, u nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen Ig-nalik 9 FcRH5c.
[0331] U jednom aspektu, ovde su navedene metode detekcije prisustva FcRH5 u biološkom uzorku. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelo protiv FcRH5 pod uslovima koji su dozvoljeni za vezivanje anti-FcRH5 antitela na FcRH5 i otkrivanje da li se formira kompleks između antitela FcRH5 i FcRH5. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje metodu dijagnostikovanja poremećaja povezanog sa povećanom ekspresijom FcRE5. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontaktiranje testirane ćelije sa antitelo antiFcRH5; utvrđivanje nivoa ekspresije (bilo kvantitativno ili kvalitativno) FcRH5 testirane ćelije otkrivanjem vezivanja anti-FcRH5 antitela na FcRH5; i upoređivanje nivoa ekspresije FcRH5 testiranom ćelijom sa nivoom ekspresije FcRH5 kontrolnom ćelijom (npr., normalna ćelija istog porekla tkiva kao ćelija testa ili ćelija koja vrši ekspresiju FcRH5 na nivoima uporedivim sa takvim normalna ćelija), pri čemu viši nivo ekspresije FcRH5 testirane ćelije u poređenju sa kontrolnom ćelijom ukazuje na prisustvo poremećaja udruženog sa povećanom ekspresijom FcRH5. U određenim otelotvorenjima, testirana ćelija dobija se od osobe za koju se sumnja da ima poremećaj koji je povezan sa povećanom ekspresijom FcRH5. U određenim otelotvorenjima, poremećaj je poremećaj ćelijske proliferacije, kao što je kancer ili tumor. U nekim otelotvorenjima, FcRH5 je FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju domen Ig-nalik 9 FcRH5c.
[0332] Primeri proliferativnih poremećaja ćelija koje se mogu dijagnostikivati korišćenjem antitela ovde opisanih uključuju poremećaj B-ćelija i/ili proliferativni poremećaj B ćelije uključujući limfom, višestruki mijelom ne-Hodgkinov limfom (NHL), agresivni NHL, agresivni povratni NHL, povratni indolentni NHL, uporni NHL, refraktorni indolentni NHL, hroničnu limfocitnu leukemiju. (CLL), mali limfocitni limfom, leukemija, leukemija vlasastih ćelija (HCL), akutnu limfocitnu leukemiju (ALL) i limfom pokrivenih ćelija.
[0333] U jednom otelotvorenju, dato je anti-FcRH5 antitelo za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U sledećem aspektu dat je metod otkrivanja prisustva FcRH5 u biološkom uzorku. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelom FcRH5 kako je ovde opisano pod uslovima dozvoljenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela na FcRH5 i detekciju
2
toga da li je formiran kompleks između anti-FcRH5 antitela i FcRH5 u biološkom uzorku. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo metodom. U jednom aspektu, antitelo protiv FcRH5 se koristi za odabir subjekata podobnih za terapiju antitela protiv FcRH5, npr., gde je FcRH5 biomarker za selekciju pacijenata. U daljem otelotvorenju, biološki uzorak je ćelija ili tkivo (npr., biopsijski materijal). U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, antitela FcRH5 vezuju domen 9 Ig nalik FcRH5c.
[0334] U daljem otelotvorenju, antitelo protiv FcRH5 se koristi in vivo da bi se otkrio, na primer, in vivo ogledom, FcRH5 pozitivni kancer kod subjekta, npr., radi dijagnoze, prognoze ili određivanja faze kancera, određujući odgovarajući tok terapija ili praćenje odgovora kancera na terapiju. Jedna od tehnika poznatih u stanju tehnike za in vivo detekciju je imuno-pozitronska emisiona tomografija (imuno-PET). kao što je opisano, npr., u van Dongen et al, The Oncologist 12:1379-1389 (2007) and Verel el al, J. Nacl Med. 44:1271-1281 (2003). U takvim otelotvorenjima je data metoda za detekciju FcRH5-pozitivnog karcinoma kod subjekta, postupak obuhvata davanje označenog anti-FcRH5 antitela subjektu koji ima ili se sumnjiče da ima FcRH5-pozitivni kancer i otkrivanje označenog anti-FcRH5 antitela u subjektu, pri čemu detekcija označenog anti-FcRH5 antitela ukazuje na FcRH5-pozitivni kancer u subjektu. U određenim takvim otelotvorenjima, označeno anti-FcRH5 antitelo sadrži anti-FcRH5 antitelo konjugovano sa pozitronskim emiterom, kao što su<68>Ga,<18>F,<64>Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Z i<124>I. U određenom otelotvorenju, pozitronski emiter je<89>Zr. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH15 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c.
[0335] U daljem otelotvorenju, postupak dijagnoze ili otkrivanja obuhvata kontaktiranje prvog anti-FcRH5 antitela imobilizovanog na supstrat sa biološkim uzorkom koji se testira na prisustvo FcRH5, izlažući supstrat na drugo anti-FcRH5 antitelo i otkrivanje da li drugi anti-FcRH5 vezuje se za kompleks između prvog anti-FcRH5 antitela i FcRH5 u biološkom uzorku. Podloga može biti bilo koji medijum, npr., staklo, metal, keramika, polimerna zrna, slajdovi, čipovi i druge podloge. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju, krv ili tkivo (npr., biopsijski materijal)
[0336] Primeri poremećaja koji mogu biti dijagnostikovani ili detektovani prema bilo kojoj od gore navedenih varijanti uključuju FcRH5-pozitivne karcinome, kao što je FcRH5-pozitivna proliferativna bolest B-ćelija, FcRH5-pozitivna plazma ćelijska neoplazma i FcRH5-pozitivni multiple mijelom. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivan kancer se detektuje anti-FcRH5 imunohistohemijom (IHC) ili in situ hibridizacijom (ISH). U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivan kancer je kancer koji izražava FcRH5 prema testu PCR (RT-PCR) reverzne transkriptaze koji otkriva mRNK FcRH5. U nekim otelotvorenjima RT-PCR je kvantitativni RT-PCR.
[0337] U izvesnim otelotvorenjima, data su označena anti-FcRH5 antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c. Oznake uključuju, ali bez ograničenja, oznake ili grupe koje su direktno otkrivene (kao što su fluorescentne, hromoforične, elektronske gustine, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i delovi, kao što su enzimi ili ligandi, koji se indirektno detektuju, npr., putem enzimske reakcije ili molekularne interakcije. Primerne oznake uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioizotope P, C, I, H i I, fluorofora kao što su heliati retkog zemljišta ili fluorescein i njegovi derivati, rodinin i njegov derivat, dansil, umbeliferon, luciferaze, npr., i bakterijska luciferaza (patent SAD br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazinediones, peroksidaza konjske kiseline (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr., glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što su urikaza i ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što su HRP, laktoperokidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin nalepnice, oznake bakteriofaga, radikale i slično. U drugom otelotvorenju, oznaka je pozitronski emiter. Pozitron emiteri uključuju, ali nisu ograničeni na Ga, F, Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Zr, i<124>I. U konkretnom otelotvorenju, pozitronski emiter je<89>Zr.
F. Farmaceutske formulacije
[0338] Farmaceutske formulacije anti-FcRH5 antitela ili imunokonjugata kao što je ovde opisano, pripremaju se mešanjem takvog antitela ili imunokonjugata koji ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A, Ed, (1980)) u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askrobinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonski hlorid, beuzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni kao metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-kresol); niske molekulske mase (manje od 10 ostataka) polipeptide; proteine, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajuće agense kao što su EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; formirajuće soli kontra jona kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonske surfaktante kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivi nosači ovde dalje uključuju agense za disperziju međuprostornih lekova, kao što su rastvorljivi neutralni-aktivni hijaluronidazni glikoproteini (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi glikoproteini PH-20 hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Određeni primeri sHASEGPs i načini upotrebe, uključujući rHuPH20, opisani su u patentim objavama SAD br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza kao što su hondroitinaze. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, antitela FcRH5 vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c.
[0339] Primeri liofilizovanih antitela ili imunokonjugovanih formulacija opisani su u patentu SAD br.
6,267,958, formulacije sa vodenim antitelom ili imunokonjugate uključuju one opisane u patentu SAD br. 6,171,586 i WO2006/044908, a poslednje formulacije uključuju pufer histidin-acetat.
[0340] Predmetna formulacija može takođe sadržati više od jednog aktivnog sastojka po potrebi za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne negativno utiču jedna na drugu.
[0341] Aktivni sastojci se mogu uhvatiti u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatina i mikrokapsulama iz poli-(metilmetakilata), respektivno u koloidnim sistemima za davanje lekova (na primer, lipozoma, albumina mikrosfera, mikroemulzija, nano-čestica i nanokapsula) ili u makroemulzijama. Takve tehnike otkrivene su u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A, Ed, (1980).
[0342] Produženo oslobađanje može se pripremiti. Odgovarajući primeri preparata za produženo oslobađanje uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo i/ili imunokonjugat, koje su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr., filmove ili mikrokapsule,
[0343] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu su uglavnom sterilne, Sterilnost se lako može ostvariti, npr., filtrirajući kroz sterilne filtracione membrane.
G. Terapeutski sastavi i metode
[0344] Bilo koje od anti-FcRH5 antitela (npr., FcRH5 bispecifična antitela) i/ili imunokonjugati koji su
4
ovde navedeni, mogu se koristiti u postupcima, npr., terapeutskim postupcima. U nekim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c.
[0345] U jednom aspektu, anti-FcRH5 antitelo (npr., FcRH5 bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat koji je ovde dat koristi se u postupku inhibiranja proliferacije FcRH5-pozitivne ćelije, postupak koji obuhvata izlaganje ćelije anti-FcRH5 antitelu ( npr., FcRH5 bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugatu u uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-FcRH5 antitela (npr., FcRH5 bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugata sa FcRH5 (npr., FcRH5c) na površini ćelije, čime se inhibira proliferacija ćelije. U određenim otelotvorenjima, metoda je in vitro ili in vivo metoda. U daljem otelotvorenju, ćelija je proliferativni poremećaj B-ćelija. U određenim otelotvorenjima, proliferativni poremećaj ćelije je povezan sa povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću FcRH5 (npr., FcRH5c). Na primer, u nekim otelotvorenjima proliferativni poremećaj B ćelija je povezan sa povećanom ekspresijom FcRH5 na površini B-ćelije. U određenim otelotvorenjima, proliferativni poremećaj B-ćelija je tumor ili kancer. U nekim otelotvorenjima proliferativni poremećaj B ćelija je neoplazma ćelije plazme. U nekim otelotvorenjima neoplazma ćelije plazme je višestruki mijelom, plazmacitom i/ili MGUS. Primeri proliferativnih poremećaja B-ćelija koje treba tretirati sa antitelima i/ili imunokonjugatima prema predmetnom pronalasku uključuju, ali bez ograničenja, limfom, višestruki mijelom ne-Hodgkinov limfom (NHL), agresivni NHL, agresivni povratni NHL, povratni indolentni NHL, refraktorni NHL, refraktorni indolentni NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL), mali limfocitni limfom, leukemija, leukemija vlasastih ćelija (HCL), akutna limfocitna leukemija (ALL) i/ili mantle-ćelijski limfom.
[0346] Prisustvo različitih biomarkera u uzorku može se analizirati većim brojem metodologija, od kojih su mnoge poznati u struci i razumljive stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući, ali bez ograničenja, imunohistohemiju Western blot analizu, imunoprecipitaciju, analizu molekularnih vezivanja, ELISA, ELIFA, sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (“FACS”), MassARRAI, proteomiku, kvantitativne analize na bazi krvi (kao na primer serum ELISA), testove biohemijske enzimske aktivnosti, in situ hibridizaciju, sekvencioniranje celokupnog genoma, polimerazna lančana reakcija (“PCR”) uključujući kvantitativno PCR u realnom vremenu (“qRT-PCR”) i druge metode detekcije tipa amplifikacije, kao što su, na primer, razgranata DNK, SISBA, TMA i slično, RNK-Seq, FISH, analiza mikroorganizama, proliferacija ekspresije gena i/ili serijska analiza ekspresije gena (“SAGE”), kao i bilo koja od širokog spektra analiza koja se može izvršiti analizom proteina, gena i/ili tkiva. Tipični protokoli za procenu stanja gena i proizvoda gena nalaze se, na primer, u Ausubel et al, eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) i 18 (PCR Analysis). Može se koristiti i multipleksirani imunološki testovi kao što su oni koji se mogu dobiti na pravilima zasnovanim na medicini ili na Meso Scale Discovery (“MSD”).
[0347] Inhibicija proliferacije ćelija in vitro može se analizirati korišćenjem CellTiter-Glo™ Luminescent Cell Viability testa, koji je komercijalno dostupan od Promega (Madison, WI). Ovaj test određuje broj preživelih ćelija u kulturi zasnovanoj na kvantitativnom prikazu ATP prisutnosti, što ukazuje na metabolički aktivne ćelije. videti Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, SAD Pat. Br.6602677. Analiza može biti izvedena u formatu od 96 ili 384, što je omogućilo automatizovanu skrining sa visokim protokom (HTS). videti Cree i dr., (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. Postupak ispitivanja podrazumeva dodavanje jedinstvenog reagensa (CellTiter-Glo® Reagent) direktno u kultivisane ćelije. Ovo rezultira lizom ćelija i stvaranjem luminiscentnog signala proizvedenog reakcijom luciferaze. Luminiscentni signal je proporcionalan količini ATP prisutnog, što je direktno proporcionalno broju održivih ćelija prisutnih u kulturi. Podaci se mogu snimiti pomoću luminometra ili uređaja za snimanje CCD kamera. Izlaz luminiscencije izražava se kao relativna svetlosna jedinica (RLU).
[0348] U drugom aspektu, dato je anti-FcRH5 antitelo (npr., bispecifično antitelo FcRH5) i/ili imunokonjugat za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, dato je anti-FcRH5 antitelo (npr., bispecifično antitelo FcRH5) i/ili imunokonjugat za upotrebu u postupku tretiranja. U određenim otelotvorenjima, dato je anti-FcRH5 antitelo (npr., FcRH5 bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat za upotrebu u tretiranju FcRH5 (npr., FcRH5c)-političnog karcinoma. U nekim otelotvorenjima, dato je anti-FcRH5 antitelo (uključujući FcRH5 bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat za upotrebu u postupku tretiranja pojedinca koji ima FcRH5 (npr., FcRH5c)-politički kancer, postupak obuhvata davanje pojedincu efektivnu količinu antitela protiv FcRH5 i/ili imunokonjugata. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje obuhvata davanje pojedincima efikasnu količinu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr., kao što je opisano u nastavku.
[0349] U daljem aspektu, ovde su date upotrebe antitela protiv FcRH5 (npr., bispecifično antitelo FcRH5) i/ili imunokonjugata u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom aspektu, lek je za tretiranje FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivnog kancera. U daljem otelotvorenju, lek je namenjen za upotrebu u postupku tretiranja FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivnog karcinoma, postupak obuhvata primenu kod pojedinca koji ima FcRH5 (npr., ekspresivni kancer FcRH5 je efikasna količina leka. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje obuhvata davanje pojedincu efikasnu količinu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na primer, kao što je opisano u daljem tekstu. U nekim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 vezuje se izoformom c-specifične oblasti vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c,
[0350] U sledećem aspektu, ovde su dati postupci za tretiranje FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivnog karcinoma. U jednom otelotvorenju, postupak obuhvata primenu kod pojedinca koji ima takav FcRH5 (npr., FcRH5c)-pozitivni kancer efektivne količine antitela protiv FcRH5 (npr., bispecifično antitelo FcRH5) i/ili imunokonjugata. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje obuhvata davanje pojedincima efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je opisano u daljem tekstu. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c
[0351] FcRH5-pozitivni kancer prema bilo kom od otelotvorenja iznad može biti, npr., proliferativni poremećaj B-ćelija FcRH5, neoplazma ćelije plazme FcRH5 i/ili FcRH5-pozitivni multipli mijelom. U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivni kancer detektuje se anti-FcRH5 imuno-histo-hemijom (IHC) ili in situ hibridizacijom (ISH). U nekim otelotvorenjima, FcRH5-pozitivan kancer je kancer koji izražava FcRH5 prema testu PCR (RT-PCR) reverzne transkriptaze koji otkriva mRNK FcRH5. U nekim otelotvorenjima RT-PCR je kvantitativni RT-PCR.
[0352] U nekim otelotvorenjima bilo kog od gore navedenih otelotvorenjima, pojedinac može biti čovek.
[0353] U daljem aspektu, ovde su navedene farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koji od anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugata koji su ovde navedeni, npr., za upotrebu u bilo kom od gore navedenih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija obuhvata bilo koje anti- FcRH5 antitelo (npr., bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugate ovde navedeni i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju farmaceutska formulacija obuhvata bilo koje anti-FcRH5 antitelo (npr., bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugate koji su ovde navedeni i najmanje jedno dodatno terapeutski agens, npr., kao što je opisano u nastavku.
[0354] Antitela (npr., bispecifična antitela) i/ili imunokonjugati ovde navedeni mogu se koristiti ili sami ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Takve kombinovane terapije koje su pomenute iznad obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapijskih agenasa uključeni u istu ili odvojenu formulaciju) i odvojeno primanje, u kom slučaju, davanje antitela ili imunokonjugata koji je ovde predviđen, može se izvršiti pre, istovremeno i/ili posle, primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa. Antitela i/ili imunokonjugati ovde navedeni mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa radioterapijom.
[0355] Antitelo (uključujući bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat koji su ovde navedeni (i bilo koji dodatni terapeutski agens) mogu se primenjivati na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, intrapulmonarno i intranazalno, i, ako je poželjno lokalnim tretmanom, intralesionalno, Parenteralne infuzije uključuju intramuskularne, intravenozne, intraarterijalne, intraperitonealne ili subkutane primene. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, npr., injekcijama, kao što su intravenske ili subkutane injekcije, delimično zavisno od toga da li je administracija kratka ili hronična. Ovde su razmatrani različiti raspored doziranja, uključujući, ali bez ograničenja, pojedinačne ili višestruke administracije tokom različitih vremenskih tačaka, bolus administracije i pulsne infuzije.
[0356] Antitela (npr., bispecifična antitela) i/ili imunokonjugati koji su ovde navedeni, biće formulisani, dozirani i primenjeni na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju poseban poremećaj koji se tretira, određeni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način davanja, raspored administracije, i druge faktore poznate lekarima. Antitelo (npr., bispecifična antitela) i/ili imunokonjugat ne mora biti, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste da spreče ili tretiraju poremećaj u pitanju. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela ili imunokonjugata prisutnog u formulaciji, tipa poremećaja ili tretmana i drugih faktora koji su gore opisani. Ove se generalno koriste u istim dozama i sa uputstvima za administriranje kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doziranja opisanih ovde, ili u bilo kojoj dozaži i bilo kojoj ruti koja je empirijski/klinički određena da bude prikladna.
[0357] Za sprečavanje ili tretiranje bolesti, odgovarajuća doza antitela (npr., bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugata koji su ovde navedeni (kada se koriste sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapijskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti do da se leči, tipa antitela ili imunokonjugata, težine i toka bolesti, da li se antitelo (npr., bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat daju u preventivne ili terapeutske svrhe, kao prethodna terapija, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitela ili imunokonjugat i diskreciono pravo lekara Antitelo (npr., bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugat se pogodno primenjuju kod pacijenta jednom ili u nizu tretmana. U zavisnosti od vrste i jačine bolesti, oko 1 ug/kg do 15 mg/kg (npr., 0.1 mg/kg-10 mg/kg) antitela ili imunokonjugata može biti inicijalna doza kandidata za primenu kod pacijenta, na primer, jednim ili više odvojenih administracija, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 mg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman bi se generalno održavao dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Jedna primera doza antitela (npr., Bispecifično antitelo) i/ili imunokonjugata bi bila u opsegu od oko 0.05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Prema tome, jedna ili više doza od oko 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg or 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se davati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr., da pacijent prima od oko dva do oko dvadeset, ili na primer oko šest doza antitela). Inicijalna veća opterećena doza, praćena jednim ili više nižim dozama može se primenjivati. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije se lako prati kroz konvencionalne tehnike i analize.
[0358] Razumljivo je da se bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može izvesti koristeći ovde i imunokonjugat koji je ovde dat i anti-FcRH5 antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo FcRH5 vezuje izoformnu c-specifični oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c
H. Artikli za proizvodnju
[0359] U drugom aspektu koji je ovde naveden, dat je artikal za proizvodnju koji sadrži materijale koji su korisni za tretiranje, prevenciju i/ili dijagnozu poremećaja opisanih iznad. Artikal za proizvodnju sastoji se od kontejnera i oznake ili uputstva na ili unutar kontejnera. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, flaše, bočice, špriceve, vreće za rastvor itd. Kontejneri mogu biti formirani iz različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner drži sastav koji je sam po sebi ili kombinovan sa drugim sastavom koji je efikasan za tretiranje, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje poremećaja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, posuda može biti intravenozna vrećica za rastvor ili bočica koja ima zatvarač za zatvaranje pomoću subkutane injekcione igle). Najmanje jedan aktivni agens u sastavu je antitelo ili imunokonjugat koji je ovde dat. Oznaka ili uputstvo ukazuje na to da se sastav koristi za tretiranje stanja po izboru. Osim toga, artikal za proizvodnju može sadržati (a) prvi kontejner sa sadržajem koji sadrži u njemu, pri čemu sastav sadrži FcRH5 antitelo (npr., bispecifično antitelo ) i/ili FcRH5 imunokonjugate koji su ovde navedeni; i (b) drugi kontejner sa sadržajem u njemu, pri čemu sastav sadrži dalje citotoksično ili na drugi način terapeutski agens. Artikal za proizvodnju u datom otelotvorenju, koji je ovde predviđen, može dalje sadržati uputstvo koji ukazuje na to da se sastavi mogu koristiti za tretiranje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, artikal za proizvodnju može dalje sadržati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekciju (BVFI), fiziološki rastvor sa fosfatom, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. Dalje može sadržati i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući i druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitelo vezuje izoformnu c-specifičnu oblast vanćelijskog domena FcRH5c. U nekim otelotvorenjima, anti-FcRH5 antitela se vezuju za domen 9 Ig nalik FcRH5c
III. PRIMERI
[0360] Slede primeri metoda i sastava prema pronalasku. Podrazumeva se da se mogu primeniti različita druga otelotvorenja, uz generalni opis koji je dati iznad.
Materijali i metode
Imunogen (E11-oznaka)
[0361] Amino kiseline 745-850 ljudskog FcRH5c (SEQ ID NO.1) klonirane su u oznaku ekspresionog vektora pRK5.NT sisara upotrebom standardnih protokola i izražene su tranzitno u CHO ćelijama. Rekombinantni protein sa N-terminalnom ekspresionom oznakom prečišćen je upotrebom hromatografije za anti-oznaku i isključivanje veličine na S200 Superdex koloni.
Razvijanje i karakterizacija anti-FcRH5 E11 antitela kod miševa
[0362] Balb/c miševi (Charles River, Hollister, CA) imunizirani su sa 2 mg ljudskog FcRH5 E11 ECD proteina (ostaci aminokiselina 743-850 (SEQ ID NO: 1) pomešanog sa MPL+TDM (Ribi) adjuvansom putem injekcije u taban. Miševi su primili devet doza, što je praćeno sa pojačanjem pre fuzije samo u PBS preko tabana i IV rute tri dana pre fuzije.
[0363] Sakupljeni su potkoleni limfni čvorovi i limfociti iz ovih miševa, čiji su svi serumi pokazali jako vezujuće titere na imunizirajući protein preko ELISA i pokazali su veliku FACS reaktivnost na SVT2 ćelije transfektovane sa ljudskim FcRH5 E11 ECD, fuzionisani su sa X63-Ag8.653 ćelijama mijeloma miševa (American Type Culture Collection, Rockville, MD) preko elektrofuzije (Harvard Apparatus, Holliston, MA), fuzionisane ćelije su inkubirane pri 37°C, 7% CO2, preko noći u Medijumu C (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada), pre ponovne suspenzije u poču čvrstom Medijumu D (StemCell Technologies) koji sadrži 0,01 mg/ml FITC označenog anti-mišijeg IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) i stavljanja u Omniwell ploču (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY). Devet dana nakon postavljanja, fluorescentne kolonije su izabrane i prebačene u ploče sa 96 otvora koje su sadržale Medijum E (StemCell Technologies) upotrebom Clonepix FL (Genetix, New Milton, Hampshire, UK).
Supernatanti su provereni pomoću ELISA za anti-mišiji IgG (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) sedam dana nakon biranja,
[0364] Hibridomi koji su pokazali ekspresiju mišijeg IgG pomoću ELISA su prošireni i provereni preko FACS za SVT2 ćelije koje vrše prekomernu ekspresiju celokupnog ljudskog FcRH5, cino FcRH5 i ljudskog FcRH5 E11 ECD. Jakim FACS pozitivnim klonovima napravljeni su pod klonovi pomoću sortiranja pojedinačnih ćelija upotrebom FACSAria (BD, Franklin Lakes, NJ), krajnji klonovi koji su pokazali su najveće ELISA i FACS vezivanje od interesa nakon jedne ili dve serije subkloniranja prošireni su proizvodnju u velikoj razmeri u bioreaktoru (Integra Biosciences, Chur, Switzerland). Supernatanti su prečišćeni hromatografijom za Protein A afinitet kao što je prethodno opisano (Hongo et al, 2000).
Proizvodnja bis Fab
[0365] BisFab su stvoreni unakrsnim povezivanjem Fab’ anti-FcRH5 Mab za Fab’ anti-CD3 (UCHT1.v9) Mab na visećim ostacima cisteina. Za stvaranje Fab’ 2 fragmenata iz hibridoma Abs različiti uslovi digestiranja su korišćeni: Abs od mIgG1 izotip su digestirani sa 1:50 (w/w) pepsin pri pH 3.5 tokom 1-2 H na 37°C.; mišiji IgG2a Abs su digestirani sa lizin C endopeptidazom pri odnosu 1 1:500 (w/w), pH 8, u toku 2-4 h na 37°C; i mišiji IgG2b Abs su digestirani sa lizin C pri odnosu 1:100 (w/w) preko noći na 37°C. U svim slučajevima F(ab’)2fragment je izolovan iz reakcione smeše hvatanjem sa SP kolonom i eluiranjem sa 10 zapremina kolone linealnog gradijenta (0-100%) 1M natrijum hlorida. Pod uslovima digestiranja pomenutim iznad mIgG1 i mIgG2b su proizveli F(ab’)2fragment, koji je sadržao tri cisteine ostatka u visećem delu dok je F(ab’)2 od mIgG2a dva cisteinska ostatka u visećem delu. Za stvaranje Fab’ sa pojedinačnim reaktivim Cys korišćene su dve različite metode. Za fragmente koji su sadržali neparan (3) broj visećih cisteina (rnIgG1 i mIgG2b) izolovani F(ab’)2s su redukovani u 25 mM natrijum acetatu, pH 5, 150 mM natrijum hloridu, 2 mM EDTA, 2 mM TCEP u toku 2-6-H na RT. Nakon što je korak redukcije završen, uzorak je ispran sa 0.2 mg/ml, pH je podignuta na 7.5 dodavanjem Tris pH 8 i 5 mM dehidroaskorbinske kiseline (DHAA) dodato je za vođenje ponovne oksidacije cisteina. Nakon inkubacije prek noći na sobnoj temperaturi prisustvo redukovanih tiola je procenjeno ispitivanjem sa viškom NEM i analiziranjem NW pomeranja masenom spektometrijom. Nakon potvrđivanja prisustva samo jedan reaktivni cistein po molekulu, Fab’ je prečišćen filtracijom gela radi uklanjanja malih količina homodimera.
[0366] Za F(ab’)2fragmente izvedene iz mIgG2a i koji sadrže 2 cistein ostatka u visećem delu, pojedinačni reaktivni cistein je proizveden delimičnim blokiranjem sa N-etil malemidom (NEM) kao što je opisano Scheer et al (u presi). Ukratko, antitelo je digestirano sa pepsinom (1% w/w) tretiranjem sa puferom natrijum acetata pri pH 4.5. Nakon digestiranja u trajanju od jednog sata, F(ab’)2je izolovan iz smeše za digestiranje hvatanjem na SP-HP smoli za razmenu katjona i prečišćen je sa 10 CV soli gradijenta 0-1 M NaCl. F(ab’)2je zatim redukovan sa 1 mM TCEP u puferu koji sadrži 25 mm MES, pH 5.8, 2 mM EDTA, i 300 mM NaCl i Fabs su oksidovani dodavanjem 5 mM dehidroaskorbinske kiseline (DHAA) kako bi se ponovo formirala sulfonska veza između teškog lanca i lakog lanca
[0367] Efektorska ruka bisfabs (UCHT1 .v9) generisana je digestiranjem pepsina, delimičnim NEM blokiranjem i konjugovanjem sa bismaleimidom kao što je opisano ranije (Scheer et al; in press). Ukratko, dva tiola (cys ostaci) na visećem delu reaguju sa 1 ekvivalentom N-etilmaleimida (NEM) (Sigma Aldrich). Različiti anti-FCRH5 Fab’s koji su sadržali pojedinačni cistein inkubirani su sa anti-CD3 Fab’ konjugovanim do bismaleimidne unakrsne veze preko noći na sobnoj temperaturi. ∼100kDa međusobno vezanih Fabs je odvojeno iz nereagovanih vrsta pomoću filtracije na gelu i zatim je okarakterisano SDS-PAGE masenom spektometrijom i analitičnom hromatografijom sa isključivanjem vleičine.
TDB ekspresija i prečišćavanje
[0368] TDB su proizvedeni pomoću dva različita pristupa: ko-kulture bakterije koja vrši ekspresiju svake od dve ruke antitela ili ekspresiju svake ruke odvojeno i zatim prekaljivanjem istih in vitro. Strategije su opisane u Christoph Spiess i dr.2012 i opisane u PCT/US10/58958 podnetoj 31 Maja 2011. Ukratko za strategiju kokultura E. coli koje vrše ekspresiju anti-CD3 (rupa) i Ecoli koje vrše ekspresiju anti-tumor cilja (čvor) su uzgajane zajedno u flašama za potreskivanje pri prethodno određenom odnosu tako da su proizvele sličnu količinu hemimera. Kokultivisane bakterije obe su sakupljene, ćelije su prekinute u mirkofluidizeru i antitela su prečišćena afinitetom Proteina A. Uočeno je da u toku mikrofluidizacije i hvatanja proteina A da su dve ruke prekaljene i formirale viseći deo unutrašnjeg lanca disulfidnog mosta (Christoph Spiess et al, 2012). Alternativno, hemimeri antitela uzgajani su odvojeno pomoću fermentacije ćelija visoke gustine i nezavisno su izolovana hromatografijom Proteina A. Prečišćeni hemimeri su zatim kombinovani pri 1:1 molarnom odnosu i inkubirani u 50 mM Tris, pH 8.5 u prisustvu 2 mM DTT tokom 4 kako bi se omogućilo prekaljene i redukovanje disulfuda u visećoj oblasti. Dijaliza protiv istog pufera bez DTT u trajanju 24-48 sati ispoljila se u formaciji disulfidnih veza unutrašnjeg lanca. Za proizvodnju strategija biscpecifična antitela su prečišćena iz zagađivača pomoću hidrofobne interakcijske hromatografije (HIC) kao što je opisano u Christoph Spiess i dr.2012. Dobijeni materijal je analiziran za nivoe endotoksina upotrebom Endosafe prenosivog sistema za testiranje i kada je potrebno sadržaj endotoksina je smanjen ispiranjem proteina sa 0.1% Triton X-114,
TDB karakterizacija
[0369] Molekulska težina bispecifičnog antitela analizirana je masenom spektrometrijom (LC-ESI/TCF) kao što je prethodno opisano (Jackman et al, 2010). Antitela su takođe analizirana analitičkom hromatografijom za isključivanje veličine u koloni Zenix SEK-300 (Sepak Technologies URSA) pomoću Agilent 1:100 HPLC sistema. Prisustvo fragmenta rezidualnih antitela kvantifikovano je elektroforezom pomoću 2100 Bioanalizer i Protein 230 Chip.
Frakcionisanje ćelija krvi
[0370] PBMCs su odvojeni od krvi zdravih dobrovoljaca koristeći agens za separaciju limfocita (MP biomedicals, Solon, OH). CD8+ćelije su ekstrahovane iz PBMCS pomoću humanog CD8+izolacionog kompleta iz Miltenyi (# 130-094-156) negativnim odabirom.
In vitro citotoksični test (T cell killing)
[0371] Za testiranje citotoksičnosti in vitro, ciljne ćelije 1x10<4>su postavljene na ploče sa 96 otvora i inkubirane preko noći. 3x10<4>CD8+ T-ćelije su dodane sa ili bez TDB ili BisFab i inkubirane su za 48 sati na+37°C. T ćelije su uklonjene dvaput pranjem sa rastućim medijumom. Važnost ćelija je merena korišćenjem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI).
[0372] Alternativno, in vitro citotoksičnost je nadgledana protočnom citometrijom. Ciljne ćelije su označene sa karbokifluorescein succinimidil ester (CFSE) prema protokolu proizvođača (Invitrogen, # C34554), CFSE-označene ciljne ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije iz humanog PBMC-a su pomešane u odnosu 3:1 E:T i inkubirane sa TDB ili BisFab 48 sati. Na kraju inkubacije, ćelije su podignute pomoću tripsina i sakupljene sa ploče. Ćelije su resuspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jod (PI). Analiza protoka citometra izvršena je na FACSCalibur u formatu automatizacije. Broj ćelija ćelija u ćeliji prebrojan je od strane CFSE+/PI negativnih ćelija. Procenat citotoksičnosti izračunat je na sledeći način:% citotoksičnost (broj žive ćelije ćelija bez žižne daljine TDB - broj žive ćelije ciljane ćelije w/TDB)/(broj celih ćelija ćelija sa ciljem živog cilja w/o TBD) x 100.
Analiza aktivacije T ćelija
[0373] Ciljne ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su mešane u prisustvu ili odsustvu TDB, a T-ćelijska aktivacija je analizirana protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene CD8-FITC (BD Biosciences, 555634) i CD69-PE (BD Biosciences, 555531).
Vezivanje podklonova supernatanata, monoklonskih antitela, bisFabs i TDB-ova
[0374] Za testiranje vezivanja za endogene FcRH5 ćelije koje vrše ekspresiju kancera ili transfektovane FcRH5 ćelije kancera, ćelije su podignute upotrebom EDTA/PBS. 1x10 ćelija je suspendovano u 100 ul i inkubirano h sa primarnim antitelima (1 zapremina ne-IgG kvantifikovanog podklona supernatanta, 4 ug/ml IgG kvantifikovanog podklona supernatanta ili 2ug/ul prečišćenih monoklonalnih antitela). ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom (PBS 1%BSA 2mM EDTA) i inkubirane u 1:1000 sredstvu za razređivanje od kozijeg anti-mišijeg sekundarno obeleženog PE ili 1:100 kozijeg anti-mišijeg APC. Ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom ili je analiza protočne citometrije izvršena na FACSCalibur. Direktno Xenon-obeležavanje antitela je izvršeno u skladu sa protokolom proizvođača (Invitrogen), kada je to ukazano. Za analiziranje vezivanja za NK ili B ćelije, 1 milion ljudskih PBMC je inkubirano sa 4 ug/ml IgG kvantifikovanih podklonova supernatanta u trajanju od 60 min, isprano i inkubirano sa 1:100 sredstva za razređivanje kozijeg anti-mišijeg sekundarno obeleženog APC. Ćelije su zatim isprane dva puta i obeležene upotrebom anti-CD56 (PE; BD Biosciences #555516) i anti-CD19 (PE; BD Biosciences #340364) pre protočne citometrije i analize vezivanja za ljudske CD56+ i CD19+ ćelije.
Rezultati
[0375] Prvobitno za proizvodnju specifičnih antitela izoforme za membranski proksimalni Ig-domen. miševi su imunizirani sa rekombinantnim bakulovirusom proizvedeni E11 protein (aminokiseline 745-848 iz SEQ ID NO:1) humanog FcRH5c i Cterminal His-ekpression tag). Ova strategija imunizacije nije rezultirala značajnim imunološkim odgovorom na FcRH5 i nije uspela da proizvede monoklonska anti-FcRH5 antitela. Druga strategija imunizacije bila je imunizacija DNK sa plazmidom koji kodira aminokiseline 745-977 FcRH5c (kod SEQ ID NO:1) koji kodira membranski proksimalni Ig-domen, transmembranski domen i intracelularne domene humanog FcRH5. Ova strategija imunizacije nije rezultirala značajnim imunološkim odgovor na FcRH5 i nije uspio da proizvede monoklonska anti-FcRH5 antitela. U trećoj strategiji imunizacije korišćeni su peptidi koji odgovaraju membranskom proksimalnom Ig-domenu FcRH5, koji su homologni za cino FcRH5 i nehomološki za čoveka FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH4. Ova strategija imunizacije nije rezultirala značajni.
[0376] Za četvrtu strategiju imunizacije proizveden je E11 protein u ćelijama CHO, koji se sastoje od membranskog proksimalnog Ig-domena humanog FcRH5 (aminokiselinski ostaci 745-850 iz SEQ ID NO:1) sa ekspresionom oznakom N-terminalne zastave. Gornji rekombinantni protein je korišćen za imunizaciju miševa. Izvedeno je imunizacija, razvoj i karakterizacija antitela na anti-FcRH5 E11 mišu, kao što je već detaljno opisano.
[0377] Nakon 6 doza rekombinantnog E11 (aminokiselinskih ostataka 745-850 od SEQ ID NO:1), serum je analiziran za FcRH5 vezujuća antitela koristeći FACS. Značajna reaktivnost je otkrivena u SVT2 ćelijama koje izražavaju humanu dužu dužinu FcRH5, cino punu dužinu FcRH5 ili domen transmembranskog domena E11 domena i citoplazemske domene, ali ne i vektorske transfektovane SVT2 ćelije koje ukazuju da FeRH5 reaktivna antitela jesu prisutna u serumu svih 5 imunizovanih miševa.
[0378] Nakon 9 doza, limfociti iz imuniziranih miševa elektrofiziramo sa Ks63-Ag8.653 ćelijama mijeloma miševa. 323 IgG pozitivni hibridomi subkloni su izabrani za dalje skrining. Klonovi su testirani na vezivanje za rekombinanski E11 protein (aminokiselinski ostaci 745-850 SEQ ID NO:1) pomoću ELISA (nije prikazan) i vezivanje za SVT2 ćelije koje ekspresuju humanu punu dužinu FcRH5, cino punu dužinu FcRH5 ili transmembrane domena i citoplazmatskih domena FcRH5 od FACS-a. Identifikovano je ukupno 26 klonova koji su vezani za ćelije koje vrše ekspresiju čoveka FcRH5 i ćelije koje ekspresuju cino FcRH5, indikativno za reaktivnost unakrsnih vrsta (Tabela 2). Supernatanti subklona su dalje karakterisani za vezivanje A) multiple mikroelemskih ćelija transfektovanih sa
1
ljudskim FcRH5, B) ćelijama koje ekspresuju humani FcRH5 (ćelije MOLP-2 mijeloma, periferne ljudske CD19 B-ćelije od zdravih donora), C) SVT2 ćelije transfektovane ekspresivni humani FcRH1, FcRH2, FcRH3 ili FcRH4, D) 293 ćelije koje izražavaju skraćenu verziju humanog FcRH5 (bez 4 Igdomena uključujući E11, aminokiseline 464-850 SEQ ID NO:1) i E) NK-ćelije. Osim toga, ELISA je analizirala vezivanje supernatanta na rastvorljiv FcRH5a. Na osnovu ove analize izabrane su monoklonalna antitela za prečišćavanje.
Tabela 2.
[0379] Slika 2 prikazuje opseg doza vezivanja pet prečišćenih E11 antitela, neizoformnih selektivnih
2
anti-FcRH5 antitela 10A8 (koji vezuju Ig-nalik domene 4-5 od FcRH5c) i kontrolno antitelo specifično za N-terminalnu gD-oznaku na SVT2 ćelije izražavaju ili human FcR5 (Slika 2A) ili cino FcRH5 (Slika 2B). Antitela u ovom testu direktno su označena APC-fluoroforom u skladu sa protokolom proizvođača (Invitrogen # z25051, z25151, z25251). Utvrđeno je da je povezivanje reprezentativnih E11 antitela 5A10 sa humanim FeRH5 transfektovanim EJM (Slika 3A) i OPM2 (Slika 3B) sličnih ili mijelomskih ćelijskih linija slično ili bolje upoređivano ranije opisanim neizoformnim selektivnim FcRH5 antitelima 10A8 i 7D11 (oba vezuju Ig domeni 4-5 FcRH5c) (Elkins i dr., 2012; Polson i sar., 2006). MOLP-2 ćelije su jedna od retkih poznatih multiplih ćelijskih linija mijeloma koje endogeno izražavaju niske nivoe FeRH5. Supernatanti subklona 5A10, 5F1, 3G7 i 6D2 su obojili MOLP-2 ćelije sa intenzitetom sličnim 7D11 (Slika 3C-F).
[0380] Dva odvojena ispitivanja su dizajnirana da adresiraju zavisnost vezivanja za prisustvo membranskog proksimalnog Ig-domena 9 (E11). Prvo je proizveden skraćeni humani FcRH5c mutant koji nema Ig-domene 6-9 (aminokiseline 464-850 SEQ ID NO:1) uključujući očekivano mesto vezivanja za antitela izvedena iz imunizacije E11. Ovaj konstrukt sa N-terminalnom gD-oznakom je vrši ekspresiju u 293 ćelije i podvrgnut supernatantima subklona 2,5 ug/ml, nakon čega sledi PE-označeno kozje protiv mišje sekundarno antitelo (razblaživanje 1:1000). Nijedan od ispitanih subklona nije vezan za 293 ćelije koje izražavaju skraćeni humani FcRH5c (slika 4A). Za razliku od toga, vezivanje je otkriveno na 293 ćelije koje izražavaju humani FcRH5 divljeg tipa:5c. Vezivanje gD ili neizoformog klon selektivnog antitela (10A8) nije izmenjeno mutacijom. Ovaj rezultat pokazuje da je mesto vezivanja E11 antitela uključeno u Ig-domene 6-9.
[0381] Izoformna selektivnost je dodatno dokazana ispitivanjem vezivanja za izotopu FcRH5a koji je rastvorljiv. Za ovo, 293 ćelije su transfektovane da vrše ekspresiju rastvorljivu izoformu sa C-terminalnom HIS-ekspresionom oznakom. Ekspresija FcRH5a proteina je potvrđena uz pomoć Western blot analize pomoću anti-Hiss antitela. U uslovnim medijima iz FcRH5a otkriven je 65 kD opseg, ali ne i vektor transfektovanih ćelija (nije prikazano). Za ELISA ploče su obložene anti-HIS antitelom za zarobljavanje i inkubirane su 1 sat sa 1:10 razblaženim uslovljenim medijima uključujući HIS-označenu izotopu FcRH5a. Monoklonska antitela E11 korišćena su za detekciju u koncentraciji od 1-0.001 ug/ml, inkubirana tokom 1 sata, nakon čega se inkubira sa HRM antitelom protiv miševa i konačno sa TMB-supstratom. Dok klonovi 2H7 i 5A10 pokazuju značajnu reaktivnost na rastvorljiv FcRH5a, druga ispitana monoklonska antitela ne pokazuju nikakvo detektabilno vezivanje (Slika 5A). Ovaj rezultat potvrđuje da je Ig-domen 9 (E11) potreban za vezivanje antitela 1G7, 3A4, 3B12, 3G7 i 5F1, te stoga ova antitela su selektivna za potpunu dužinu FcRH5 izoforme (FcRH5c).
[0382] FcRH5 je endogeno izražen u B-ćelijama (Hatzivassilion i dr., 2001, Polson i dr., 2006). Da bi se procenilo vezivanje suplinatanata subklona na B-ćelije, PBMC su izvučeni iz krvi zdravih donatora.
1 milion humani PBMC je inkubiran sa supernatantima subklona 4 ug/ml u trajanju od 60 min, opran i inkubiran sa 1:100 razblaženjem kozjeg anti-miša sekundarnog sa oznakom APC-a. Ćelije su zatim opet oprane dvaput i obojane sa PE-označenom anti-CD19 (BD Biosciences # 340364) prethodnom protočnom citometrijom i analizom vezivanja za CD19+ ćelije. Većina supernatanta indukovalo je značajan pomak APC signala u CD19+ ćelijama (Slika 5B) preko kontrola (nema primarnog antitela, anti-gD) što ukazuje na vezivanje za B ćelije.
[0383] Fc receptor homo log (FcRH) molekuli porodice imaju visok stepen homologije jedna drugoj (Miller i dr., 2002). Homologija je posebno visoka između membranskih proksimalnih domena, kojima je ciljna grupa antitela E11 (Miller i dr., 2002). Da bi se istraživala unakrsna reaktivnost prema članovima porodice, FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH4 (sve uključujući N-terminalnu gD-izraz tag) vršena je ekspresija u SVT2 ćelijama, a ćelije su obojene suplanantima subklona i antitelima protiv miša-PE u kozi. Izraz transfektovanog FcRH potvrđen je signalom od anti-gD antitela u svim ćelijskim linijama. Nijedan supernatant značajno nije vezan za FcRH2 koji vrši ekspresiju ćelije u odnosu na bojenje sa antitelom gD (Slika 6B). 1B8, 1H11, 3C10, 4G8 i 6D2 pokazali su nizak nivo vezivanja za FcRH1 (Slika 6A) i 1F4 vezani za FcRH4 (Slika 6D). Sveukupno, signali iz FcRH3-vrše ekspresiju SVT2 ćelija su bili nizak, uključujući gD kontrolno antitelo, indikativni nivo niske ekspresije. Nizak nivo vezivanja za FcRH3-ekspresivnu SVT2 ćeliju je detektovan za supernatante 1F4 i 4H8 (Slika 6C).
[0384] S obzirom na to da je ukupni signal u FcRH3-ekspresivnim SVT2 ćelijama bio nizak, dodatno ispitivanje je izvršeno korišćenjem PBMC-a od zdravih donatora. PBMCs su obojeni kao što je prethodno opisano, ali umesto CD19, CD56 (BD Biosciences # 555516) je korišćen za uvođenje istražene ćelijske populacije u NK ćelije. NK-ćelije izražavaju endogeno FcRH3 (Poison et 2006), a kao što je i očekivano, oni su obojeni prethodno opisanim monoklonskim anti-FcRH3 antitelima (Polson i dr., 2006). FcRH1 ekspresija je takođe otkrivena u CD56+ ćelijama, ali nijedan od supernatantnih supklanata E11 nije značajno obojen NK ćelijama (Slika 7), što pokazuje nedostatak unakrsne reaktivnosti do endogeno izraženog FcRH3.
[0385] Unakrsna reaktivnost članova porodice je ponovo testirana korišćenjem identičnog protokola opisanog iznad u SVT2 ćelijama, ali koristeći sveže reagense i re-transfekciju SVT2 ćelija sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i FcRH4. Ponovno testiranje prečišćenih antitela, kao što je gore opisano, rezultiralo je značajno različitim rezultatima od prve serije eksperimenata. Ovi ažurirani rezultati su sumirani u Tabeli 4. Umesto da pokazuju malo reagovanja sa drugim članovima porodice FcRH, sve samo jedno antitelo (1G7) pokazalo je značajno vezivanje za FcRH5 i najmanje jedan ili više drugih članova porodice. Bez vezivanja teorijom, ova količina antitelske unakrsne reaktivnosti je ono što bi se očekivalo, s obzirom na sličnost sekvence poslednjeg Ig-nalik domena u različitim članovima porodice FcRH.
[0386] CD8+ T ćelije su među najpotpornijim imunim efektorskim ćelijama. Aktivnost T ćelija može biti regrutovana da bi se ubile tumorske ćelije pomoću bispecifičnih antitela (ili fragmenata antitela) koji istovremeno vezuju i T ćeliju i tumorski antigen. Dvostruko vezivanje može dovesti do poliklonalne aktivacije T ćelija i specifičnog ubijanja ćelija koje vrše ekspresiju tumorski antigen (Liu i dr., 1985; Shalabi i dr., 1992). Nekoliko tumorskih meta i nekoliko bispecifičnih platformi antitela pokazale su opštu fleksibilnost i pretkliničku izvodljivost ovakvog pristupa. Važno je pokazati obećavajuću kliničku aktivnost pomoću cilja CD19, bispecifičnog fragmenta blinatumomaba scFv antitela koji aktivira T ćelije, (MT103; MicroMet). Tretman sa dozama nižim od 60 ug/m2/dan dovodi do produženih odgovora u kliničkim ispitivanjima za tretiranje relapsed non-Hodgkinovog limfoma i akutne limfoblastne leukemije (Bargou i dr., 2008; Dreier i dr., 2002).
[0387] Sposobnost FcRH5 antitela da aktiviraju T ćeliju i posreduju ubijanjem u bispecificnom obliku antitela istraživana je stvaranjem bispecifičnih bisFab molekula. Ukratko, ovi bispecifični molekuli se generišu proteolitičkim cepanjem antitela, nakon čega sledi redukcija, reoksidacione reakcije i konjugacija Fab-fragmenata pomoću bismaleamida (Scheer i dr., 2012b i kao što je gore opisano). Anti-CD3 antitela klon UCHT1 se vezuje za human CD3 koji uključuje T-ćelijski receptor. UCHT1.v9 se prethodno pokazao kao efikasna ruka za vezivanje T ćelija (Junttila i i dr., 2012 i kao što je opisano iznad; Zhu et a /., 1995) i stoga je korišćen za FcRH5 bisFabs. Klonovi antitela protiv FcRH5 antitela (1G7, 2H7, 3G7, 5A10, 5F1, 6D2, 3B12, 3C10, 3F10) iz imunizacije E11 su izabrani za ciljnu ruku i konjugovani sa UCHT1.v9 da bi rezultirali bispecifičnim bisFab molekulima CD3-FcRH5.
[0388] Pored molekula bisFab-a, bispecifična antitela (T-ćelije zavisna bispecifična antitela; TDB-ovi) su proizvedena pomoću tehnologije “knobs-in-holes” (Merchant i sar., 1998), koja se oslanja na par komplementarnih Fc regiona koji voze heterodimerizacija hemimera antitela. Kao iu slučaju bisFabs, UCHT1.v9 (Zhu i dr., 1995) je korišćen kao anti-CD3 (rupa). Klinovi antitela iz FcRH5 E11 imunizacije, neizoformni selektivni anti-FcRH5 klon (10A8) (Elkins i sar., 2012) ili anti-HER2 klon 4D5 (trastuzumab) (Carter i dr., 1992 ) su korišćeni. Generisanje i prečišćavanje TDB-a detaljno je opisano (Junttila i dr., 2012; Scheer i dr., 2012a i kako je gore opisano).
4
[0389] Sposobnost bispecifnih molekula da posreduju ubijanjem 299 ciljanih ćelija transfektovanih FcFH5 ispitani su inkubiranjem meta sa CD8 T ćelijama (efektorske ćelije) tokom 48 sati i merenjem aktivnosti ubijanja koristeći analizu Cell Titer Glo ili FACS ubistvo (gore opisani postupci ). Svi devet bisFabs-ova koji su uključili anti-FcRH5 E11 ciljnu ruku bili su efikasni u posredovanju ubijanja ciljnih ćelija (slika 8A-B), aktivnost ubijanja je otkrivena u koncentracijama od 1-10 ng/ml i zasićena na 10-100 ng/ml koncentracija. Maksimalna aktivnost ubijanja je veća od 80% za većinu klonova. Aktivnost ubijanja bila je slična u odnosu na HER2-TDB (Slika 8A-B). Humani HER2 je izražen u 293 ćelijama na niskom nivou (podaci nisu prikazani). Nasuprot tome, aktivnost ubijanja daleko je prevazišla neizoformu selektivnu FcRH5-TDB (10A8), koja je uspela ubiti samo približno 20% mete (SLIKA 8A-B). Slična robusna aktivnost je detektovana korišćenjem TDB formata u punoj veličini koja sadrži klone 2H7, 3G7 i 5A10 FcRH5-E11 kao ciljne ruke (Slika 8C-D). Nije utvrđena nikakva značajna razlika između TDB i bisfab verzije 2H7 i 3G7 što ukazuje na to da Fc nije ni neophodan za aktivnost niti inhibira aktivnost ubijanja. FcRH5 bisFabs i TDB cele dužine, uključujući 2H7 i 3G7 kao ciljnu ruku, takođe su u mogućnosti da efikasno posreduju u ubijanju MOLP2 ćelija, koji izražavaju endogeno niske nivoe FcR-H5 (Slika 9A). Aktivacija T ćelija je praćena u reakcijama merenja proporcije CD8+ ćelija koje izražavaju CD69 na ćelijskoj membrani. Aktivacija T ćelija odgovara aktivnost ubijanja i bila je slična i za bisFabs i TDBs (Slika 9B). Pregled rezultata prikazan je u Tabeli 3.
Tabela 4
Reference
[0390]
Bargou, R. et al. (2008). Science 321, 974-977.
Carter, P. et al. (1992). Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4285-4289.
Dreier, T. et al. (2002). Int J Cancer 100, 690-697.
Elkins, K. et al. (2012). Mol Cancer Ther 11, 2222-2232.
Hatzivassiliou, G. et al. (2001). Immunity 14, 277-289.
Liu, M. A. et al. (1985). Proc Natl Acad Sci U S A 82, 8648-8652.
Merchant, A. M. et al. (1998). Nat Biotechnol 16, 677-681.
Miller, I et al. (2002). Blood 99, 2662-2669.
Polson, A. G. et al. (2006). Expression pattern of the human FcRH/IRTA receptors in normal tissue and in B-chronic lymphocytic leukemia. International immunology 18, 1363-1373.
Shalaby, M. R. et a/. (1992). J Exp Med 175, 217-225. Zhu, Z. et al. (1995). Int J Cancer 62, 319-324.
Promenljivi domen lakog lanca
1C8.1
Promenljivi domen teškog lanca [0399]
1C8.1
�
�
�
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
�

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Postupak proizvodnje anti-FcRH5 antitela koje vezuje izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c i koji se ne vezuje značajno još jedan Ig-sličan domen FcRH5, gde navedeni postupak sadrži korake:
(a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo pod uslovima pogodnim za ekspresiju navedenog antitela; i (b) obnavljanje anti-FcRH5 antitela iz ćelije domaćina ili medijuma ćelija domaćina, gde je izoformni c-specifičan region vanćelijskog domena FcRH5c izabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) aminokiseline 745-850 od SEK ID NO: 1;
(ii) aminokiseline 745-851 od SEK ID NO: 1;
(iii) aminokiseline 752-834 od SEK ID NO: 1; i
(iv) aminokiseline 754-835 od SEK ID NO: 1.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde sekvenca nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i sekvencu aminokiselina koja sadrži VH anti-FcRH5 antitela.
3. Postupak prema patentnim zahtevima 1 ili 2, gde nukleinska kiselina predstavlja deo jednog ili više ekspresijskih vektora.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde ćelija domaćin sadrži (1) vektor koji sadrži sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira sekvencu aminokiselina koja sadrži VL antitela anti-FcRH5 i sekvencu aminokiselina koja sadrži VH anti -FcRH5 antitelo ili (2) prvi vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu aminokiselina koja sadrži VL antitela anti-FcRH5 i drugi vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitelo protiv FcRH5.
5. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, gde je ćelija domaćin eukariotska ćelija ili limfoidna ćelija.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, gde je eukariotska ćelija ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
7. Postupak prema patentnom zahtevu 5, gde je limfoidna ćelija Y0, NS0 ili Sp20 ćelija.
8. Izolovano anti-FcRH5 antitelo proizvedeno postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
9. Izolovano anti-FcRH5 antitelo prema patentnom zahtevu 8, koje vezuje izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c prikazan kao aminokiseline 745-850 od SEK ID NO: 1.
10. Izolovano anti-FcRH5 antitelo prema patentnom zahtevu 8, koje vezuje izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c prikazano kao aminokiseline 745-851 SEK od ID NO: 1.
11. Izolovano anti-FcRH5 antitelo prema patentnom zahtevu 8, koje vezuje izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c prikazano kao aminokiseline 752-834 od SEK ID NO: 1.
12. Izolovano anti-FcRH5 antitelo prema patentnom zahtevu 8, koje vezuje izoformni c-specifični region vanćelijskog domena FcRH5c prikazano kao aminokiseline 754-835 od SEK ID NO: 1.
13. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 8-12, pri čemu je anti-FcRH5 antitelo:
(a) monoklonsko antitelo;
(b) humano, humanizovano ili himerno antitelo;
(c) fragment antitela koji veže FcRH5;
(d) antitelo IgGl, IgG2a ili IgG2b;
(e) bispecifično antitelo, opciono gde bispecifično antitelo vezuje FcRH5 i CD3; i/ili (f) konjugacijom za oznaku, pri čemu je opciono oznaka pozitronski odašiljač, a opciono emitori pozitrona su 89Zr.
14. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 8-13, pri čemu anti-FcRH5 antitelo ima jednu ili više sledećih karakteristika: (a) reaguje unakrsno celom dužinom sa ljudskim i cino FcRH5, (b) ne reaguje unakrsnim reakcijama sa FcRH1, FcRH2, FcRH3 i/ili FcRH4, (c) vezuje se za endogeni FcRH5, i (d) ne reagira unakrsno sa FcRH5a.
15. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 8-14.
16. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 15.
17. Imunokonjugat koji sadrži anti-FcRH5 antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 8-14 i citotoksično sredstvo, opciono gde imunokonjugat ima formulu Ab- (L-D) p, pri čemu: (a) Ab je antitelo protiv FcRH5 prema bilo kom od zahteva 8-14;
(b) L je veznik;
(c) D je lek izabran od majtansinoida, auristatina, kaliheamicina, pirolobenzodiazepina i derivata nemorubicina; i
(d) p se kreće od 1-8, a poželjno od 2-5.
18. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 17, gde se linker može podeliti proteazom ili je kiseo-labilan.
19. Farmaceutska formulacija koja sadrži anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 14 i/ili imunokonjugat prema patentnim zahtevima 17 ili 18 i farmaceutski prihvatljiv nosač, a opciono dalje sadrži dodatno terapeutsko sredstvo.
20. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 14 i/ili imunokonjugat prema patentnim zahtevima 17 ili 18, za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima FcRH5-pozitivan karcinom, gde postupak uključuje davanje pojedincu efikasne količine anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugata, gde je FcRH5-pozitivni karcinom opciono B-ćelijski proliferativni poremećaj, a postupak po potrebi dalje uključuje davanje dodatnog terapeutskog agensa pojedincu.
21. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem patentnih zahteva 8 do 14 i/ili imunokonjugat prema patentnim zahtevima 17 ili 18, za upotrebu u postupku inhibiranja proliferacije FcRH5-pozitivne ćelije, pri čemu postupak uključuje izlaganje FcRH5-pozitivne ćelije na anti-FcRH5 antitelo i/ili imunokonjugat pod uslovima dozvoljenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela i/ili imunokonjugata na FcRH5 na površini FcRH5-pozitivne ćelije, čime inhibira proliferaciju FcRH5-pozitivne ćelije, gde opciono FcRH5-pozitivna ćelija je B ćelija.
22. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 8 do 14 za upotrebu u postupku detekcije humanog FcRH5 u biološkom uzorku, gde postupak uključuje kontakt biološkog uzorka sa anti-FcRH5 antitelom pod uslovima dozvoljenim za vezivanje anti-FcRH5 antitela na ljudski FcRH5 za prirodni ljudski FcRH5 koji se javljaju u prirodi i otkrivanje da li se u biološkom uzorku formira kompleks između anti-FcRH5 antitela i ljudskog FcRH5, pri čemu je biološki uzorak uzorak krvi.
23. Anti-FcRH5 antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 14, za upotrebu u postupku detekcije FcRH5-pozitivnog karcinoma, gde se postupak sastoji od (i) davanja anti-FcRH5 antitela subjektu koji ima ili sumnja da ima FcRH5-pozitivan karcinom, pri čemu je anti-FcRH5 antitelo obeleženo anti-FcRH5 antitelom i (ii) detektovanje obeleženih anti-FcRH5 antitela kod subjekta, pri čemu detekcija obeleženih anti-FcRH5 antitela ukazuje na FcRH5-pozitivan karcinom u subjektu, i gde opciono obeleženo anti-FcRH5 antitelo sadrži anti-FcRH5 antitelo konjugovano na emiter pozitrona, i opciono pozitronski emiter je<89>Zr.
RS20200733A 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela RS60418B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361838534P 2013-06-24 2013-06-24
EP17198415.6A EP3336106B1 (en) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60418B1 true RS60418B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=51212984

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180149A RS56878B1 (sr) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela
RS20230745A RS64514B1 (sr) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela
RS20200733A RS60418B1 (sr) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180149A RS56878B1 (sr) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela
RS20230745A RS64514B1 (sr) 2013-06-24 2014-06-24 Anti-fcrh5 antitela

Country Status (29)

Country Link
US (3) US10435471B2 (sr)
EP (3) EP3336106B1 (sr)
JP (2) JP6684208B2 (sr)
KR (1) KR20160022912A (sr)
CN (2) CN105473618A (sr)
AR (1) AR096687A1 (sr)
AU (2) AU2014302617B2 (sr)
BR (1) BR112015032224B1 (sr)
CA (1) CA2915480C (sr)
DK (3) DK3336106T3 (sr)
ES (3) ES2962874T3 (sr)
FI (1) FI3736291T3 (sr)
HK (1) HK1222663A1 (sr)
HR (3) HRP20180352T1 (sr)
HU (3) HUE036581T2 (sr)
IL (2) IL243129B (sr)
LT (3) LT3336106T (sr)
MX (1) MX376663B (sr)
MY (2) MY176285A (sr)
NO (1) NO2955475T3 (sr)
PL (3) PL3013861T3 (sr)
PT (3) PT3736291T (sr)
RS (3) RS56878B1 (sr)
RU (2) RU2687132C2 (sr)
SG (2) SG11201510653YA (sr)
SI (3) SI3736291T1 (sr)
TW (1) TWI725931B (sr)
WO (1) WO2014210064A1 (sr)
ZA (2) ZA201509261B (sr)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
DK3160513T3 (da) 2014-06-30 2020-04-06 Glykos Finland Oy Saccharidderivat af en toksisk payload og antistofkonjugater deraf
MX2017000646A (es) 2014-07-15 2017-04-27 Juno Therapeutics Inc Celulas geneticamente modificadas para terapia celular adoptiva.
CR20170095A (es) 2014-09-12 2017-07-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados referencias recíprocas con solicitudes relacionadas
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
SG11201704550XA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting fc receptor-like 5 and uses thereof
JP6932649B2 (ja) * 2015-02-16 2021-09-08 ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｌ及び／又はｃｈ１が突然変異された薬剤コンジュゲーションのための抗体
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
EP3310814B1 (en) * 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
EP3383913A4 (en) 2015-12-04 2019-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center ANTIBODY AGAINST FC RECEPTOR LIKE 5 AND METHOD OF USE
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
BR112019011186A2 (pt) 2016-12-01 2019-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. conjugado de anticorpo radiomarcado, composto, e, métodos de imageamento e para tratamento de um tumor.
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN110650974B (zh) 2017-02-10 2024-04-19 瑞泽恩制药公司 用于免疫-pet成像的放射性标记的抗-lag3抗体
JP7304846B2 (ja) 2017-07-24 2023-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ８抗体およびその使用
US11564946B2 (en) 2017-11-01 2023-01-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
WO2019090003A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen (bcma)
WO2019089969A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
PL3704230T3 (pl) 2017-11-01 2025-02-24 Juno Therapeutics, Inc. Proces wytwarzania kompozycji terapeutycznych z komórek zmodyfikowanych genetycznie
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
CA3080509A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
SG11202005005YA (en) 2017-11-30 2020-06-29 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
JP2021505615A (ja) 2017-12-08 2021-02-18 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 細胞療法および関連方法のための表現型マーカー
EP3720949A1 (en) 2017-12-08 2020-10-14 Juno Therapeutics, Inc. Serum-free media formulation for culturing cells and methods of use thereof
WO2019113557A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a composition of engineered t cells
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP7398396B2 (ja) 2018-06-01 2023-12-14 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａに対する結合分子及びその使用
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
JP7538109B2 (ja) 2018-08-09 2024-08-21 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み込まれた核酸を評価するための方法
KR20210113169A (ko) 2018-11-01 2021-09-15 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Β세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 이용한 치료 방법
MA54079A (fr) 2018-11-01 2021-09-08 Juno Therapeutics Inc Récepteurs antigéniques chimériques spécifiques du gprc5d (élément d du groupe 5 de classe c des récepteurs couplés à la protéine g)
CN113271945A (zh) 2018-12-20 2021-08-17 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案和药物组合
EP3924055B1 (en) 2019-02-15 2024-04-03 Novartis AG Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
JP7483732B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-15 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CN114007640A (zh) 2019-05-01 2022-02-01 朱诺治疗学股份有限公司 从修饰的cd247基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
US20220184131A1 (en) 2019-05-01 2022-06-16 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified tgfbr2 locus, related polynucleotides and methods
TW202135859A (zh) 2019-12-20 2021-10-01 瑞士商諾華公司 組合療法
JP2023509708A (ja) 2020-01-03 2023-03-09 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
AU2021251265A1 (en) 2020-04-10 2022-11-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to cell therapy engineered with a chimeric antigen receptor targeting B-cell maturation antigen
KR20230024283A (ko) 2020-05-13 2023-02-20 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 임상 반응과 관련된 특징을 식별하는 방법 및 이의 용도
KR20230027056A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법
KR20230042283A (ko) 2020-06-26 2023-03-28 주노 테라퓨틱스 게엠베하 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 ｔ 세포, 관련된 폴리뉴클레오티드 및 방법
US20230271940A1 (en) 2020-08-03 2023-08-31 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
IL302396A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
IL302569A (en) 2020-11-06 2023-07-01 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
PE20231561A1 (es) 2020-12-23 2023-10-03 Sotio Biotech A S Conjugados anticuerpo-farmaco especificos para tumores con claudina 18.2
KR20230165771A (ko) 2021-03-03 2023-12-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법 및 dgk 억제제의 조합
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
EP4330381A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Novartis AG Viral vector production system
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
AU2022273541A1 (en) 2021-05-14 2023-11-30 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
JP2025504002A (ja) 2022-01-28 2025-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 細胞組成物を製造する方法
WO2023159182A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Rakuten Medical, Inc. Anti-programmed death-ligand 1 (pd-l1) antibody molecules, encoding polynucleotides, and methods of use
AU2023253705A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
CN120152717A (zh) 2022-09-08 2025-06-13 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和连续或间歇dgk抑制剂给药的组合
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
CN117384299B (zh) * 2022-11-01 2024-04-30 邦恩泰(山东)生物医药科技集团股份有限公司 靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体、car-t细胞及其应用
EP4615960A1 (en) 2022-11-09 2025-09-17 C3S2 GmbH Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
KR20250121074A (ko) 2022-12-09 2025-08-11 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 홀로그래픽 이미징을 사용하여 세포 표현형을 예측하기 위한 기계 학습 방법
CN121002052A (zh) 2023-02-03 2025-11-21 C3S2 有限公司 用于非病毒生产工程化免疫细胞的方法
CN116789849B (zh) * 2023-04-12 2024-03-08 南京紫珑生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2025032254A1 (en) * 2023-08-10 2025-02-13 Astrazeneca Ab Anthracycline derivatives and conjugates and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5767237A (en) 1993-10-01 1998-06-16 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Peptide derivatives
US20030068623A1 (en) 1997-06-16 2003-04-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
US7105149B1 (en) 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
EP1235847B1 (en) 1999-11-29 2016-01-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York ISOLATION OF FIVE NOVEL GENES CODING FOR NEW Fc RECEPTORS-TYPE MELANOMA INVOLVED IN THE PATHOGENESIS OF LYMPHOMA/MELANOMA
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
AU2002314495A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
US20050226869A1 (en) 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7888478B2 (en) 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005063299A2 (en) 2003-12-24 2005-07-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
AU2005216251B2 (en) * 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
BRPI0510883B8 (pt) * 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
WO2006039238A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Irta2 antibodies and methods of use
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20080247944A1 (en) 2005-01-12 2008-10-09 Robert Graziano Irta-2 Antibodies and Their Uses
ES2373080T3 (es) 2005-06-20 2012-01-31 Genentech, Inc. Anticuerpos que se unen al antígeno tat10772 asociado a tumores para el diagnóstico y tratamiento de un tumor.
WO2008109533A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
US8742076B2 (en) * 2008-02-01 2014-06-03 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
AR072804A1 (es) 2008-07-15 2010-09-22 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina,proceso para su preparacion,composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso como agentes antitumorales.
CA2756988A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates
EP2414399A1 (en) 2009-04-01 2012-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
MX2012002766A (es) 2009-09-03 2012-04-02 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
BR112012026213B1 (pt) * 2010-04-15 2021-12-28 Medimmune Limited Compostos de pirrolobenzodiazepinas, conjugado das mesmas, composição farmacêutica compreendendo o conjugado e uso do mesmo para o tratamento de uma doença proliferativa
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
EP3310814B1 (en) 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
HK1222663A1 (zh) 2017-07-07
RU2687132C2 (ru) 2019-05-07
PL3736291T3 (pl) 2024-02-05
IL269528A (en) 2019-11-28
MX376663B (es) 2025-03-07
LT3336106T (lt) 2020-08-10
MX2015017331A (es) 2016-06-24
EP3013861A1 (en) 2016-05-04
AR096687A1 (es) 2016-01-27
CA2915480C (en) 2023-01-03
EP3013861B1 (en) 2017-11-29
PL3336106T3 (pl) 2020-11-16
ZA201808451B (en) 2021-04-28
MY191169A (en) 2022-06-03
JP6684208B2 (ja) 2020-04-22
ZA201509261B (en) 2019-03-27
DK3736291T5 (da) 2024-08-26
HK1224313A1 (en) 2017-08-18
TW201508008A (zh) 2015-03-01
JP2020048559A (ja) 2020-04-02
HRP20231323T1 (hr) 2024-02-16
HUE049446T2 (hu) 2020-09-28
RS56878B1 (sr) 2018-04-30
HUE063910T2 (hu) 2024-02-28
JP2016528882A (ja) 2016-09-23
SI3336106T1 (sl) 2020-09-30
PT3013861T (pt) 2018-02-21
FI3736291T3 (fi) 2023-09-25
AU2014302617B2 (en) 2019-12-19
US20150098900A1 (en) 2015-04-09
SI3736291T1 (sl) 2023-12-29
EP3336106A1 (en) 2018-06-20
SG10201804338PA (en) 2018-06-28
US20230096941A1 (en) 2023-03-30
ES2659229T3 (es) 2018-03-14
RU2019109452A (ru) 2019-05-29
US20200190185A1 (en) 2020-06-18
US11352431B2 (en) 2022-06-07
AU2014302617A1 (en) 2016-01-21
EP3736291A1 (en) 2020-11-11
AU2020201918A1 (en) 2020-04-02
LT3736291T (lt) 2023-10-25
EP3736291B1 (en) 2023-08-16
ES2962874T3 (es) 2024-03-21
DK3336106T3 (da) 2020-07-13
BR112015032224B1 (pt) 2024-01-02
EP3336106B1 (en) 2020-05-27
PT3736291T (pt) 2023-11-08
HK1257261A1 (en) 2019-10-18
DK3736291T3 (en) 2023-09-25
MY176285A (en) 2020-07-27
NO2955475T3 (sr) 2018-02-17
IL243129B (en) 2019-09-26
SG11201510653YA (en) 2016-01-28
SI3013861T1 (en) 2018-04-30
RS64514B1 (sr) 2023-09-29
HRP20180352T1 (hr) 2018-04-06
US10435471B2 (en) 2019-10-08
PL3013861T3 (pl) 2018-05-30
NZ715125A (en) 2021-08-27
DK3013861T3 (da) 2018-01-22
LT3013861T (lt) 2018-02-12
CN116063515A (zh) 2023-05-05
RU2016101965A (ru) 2017-07-28
BR112015032224A2 (pt) 2017-11-07
KR20160022912A (ko) 2016-03-02
WO2014210064A1 (en) 2014-12-31
CN105473618A (zh) 2016-04-06
ES2812243T3 (es) 2021-03-16
HRP20201111T1 (hr) 2020-10-30
CA2915480A1 (en) 2014-12-31
HUE036581T2 (hu) 2018-07-30
TWI725931B (zh) 2021-05-01
PT3336106T (pt) 2020-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230096941A1 (en) Anti-fcrh5 antibodies
US10653792B2 (en) Anti-Ly6E antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP3461845B1 (en) Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
JP2017505305A (ja) 抗ｓｔｅａｐ１抗体及びイムノコンジュゲートを使用する方法
HK1257261B (en) Anti-fcrh5 antibodies
HK1224313B (en) Anti-fcrh5 antibodies
NZ715125B2 (en) Anti-fcrh5 antibodies
HK1208167B (en) Anti-ly6e antibodies and immunoconjugates and methods of use