[go: up one dir, main page]

RS59166B1 - Proizvodnja heterodimernih proteina - Google Patents

Proizvodnja heterodimernih proteina

Info

Publication number
RS59166B1
RS59166B1 RSP20191077A RS59166B1 RS 59166 B1 RS59166 B1 RS 59166B1 RS P20191077 A RSP20191077 A RS P20191077A RS 59166 B1 RS59166 B1 RS 59166B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
homodimeric
antibody
igg1
exemplary embodiment
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Gramer
Amitava Kundu
Den Bremer Ewald T J Van
Kampen Muriel Van
Patrick Priem
Aran Frank Labrijn
Joyce I Meesters
Joost J Neijssen
Janine Schuurman
Paul Parren
Berkel Patrick Van
Werner L Vos
Arnout Gerritsen
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS59166B1 publication Critical patent/RS59166B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na in vitro postupak proizvodnje bispecifičnog antitela pune dužine koji obuhvata prvi korak inkubacije prvog i drugog antitela pune dužine u redukujućim uslovima i drugi korak podvrgavanja kompozicije dobijene u prvom koraku uslovima oksidacije. Postupak predmetnog pronalaska je posebno pogodan za proizvodnju velikog obima bispecifičnih antitela pune dužine.
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Monoklonska antitela su poslednjih godina postala uspešni terapijski molekuli, prevashodno za lečenje kancera. Bispecifična antitela mogu dodatno biti u stanju da povećaju potenciju i efikasnost terapija monoklonskim antitelima, npr. ona mogu biti upotrebljena za usmeravanje leka ili toksičnog jedinjenja ka ciljnim ćelijama, za preusmeravanje efektorskih mehanizama ka mestima koja su pogođena bolešću ili za povećanje specifičnosti za tumorske ćelije, na primer, vezivanjem za kombinaciju cilјnih molekula koja se nalazi isklјučivo na tumorskim ćelijama. Štaviše, upravo kombinovanjem specifičnosti dva monoklonska antitela u jednom, bispecifična antitela potencijalno mogu uklјučiti veći niz mehanizama dejstva c.q. njihove kombinovane mehanizme dejstva.
[0003] Nedavno je publikovan revijski pregled različitih formata i upotreba bispecifičnih antitela -Chames i Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276. Jedna od glavnih prepreka u razvoju bispecifičnih antitela je bila poteškoća proizvodnje materijala koji je dovoljno dobrog kvaliteta i kvantiteta, upotrebom tradicionalnih tehnologija kao što su hibridni hibridomi i postupci hemijske konjugacije (Marvin i Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649). U ćeliji domaćinu, istovremena ekspresija (koekspresija) dva antitela koje čine različiti teški i laki lanci, pored želјenog bispecifičnog antitela, dovodi do nastanka smeše mogućih proizvoda antitela.
[0004] Opisano je nekoliko strategija koje favorizuju obrazovanje heterodimernog, tj. bispecifičnog proizvoda nakon koekspresije različitih konstrukata antitela.
[0005] Lindhofer i saradnici (1995 J Immunol 155:219) opisuju preferencijalno uparivanje teških/lakih lanaca koje je ograničeno na vrstu, u kvadromima pacova/miša.
[0006] Tehnika obrazovanja bispecifičnih antitela je takozvana strategija "dugme-u-rupicu" (engl. "knob-into-hole", US patent 5,731,168). EP1870459 (Chugai) i WO 2009089004 (Amgen) opisuju druge strategije za favorizovanje obrazovanja heterodimera nakon koekspresije različitih domena antitela u ćeliji domaćinu. U ovim postupcima, jedan ili više ostataka koji čine konstantni domen 3 (CH3) teškog lanca, odnosno tzv. CH3-CH3 površinu kontakta (interfejs), se zamenjuju sa naelektrisanom aminokiselinom u oba CH3 domena, tako da je obrazovanje homodimera elektrostatički nepovolјno, dok je heterodimerizacija elektrostatički povolјnija. WO2007110205 (Merck) opisuje još jednu strategiju u kojoj se koriste razlike između CH3 domena IgA i IgG u cilju podsticanja heterodimerizacije.
[0007] Dall'Acqua i saradnici (1998 Biochemistry 37:9266) su identifikovali pet energetski klјučnih aminokiselinskih ostataka (366, 368, 405, 407 i 409) koji su uklјučeni u CH3-CH3 kontakt i unutar su površine kontakta CH3 homodimera.
[0008] WO 2008119353 (Genmab) opisuje ex vivo postupak generisanja antitela.
[0009] WO 11/131746 (Genmab) opisuje proteine koji sadrže Fc regione heterodimernih antitela i postupke njihove proizvodnje.
[0010] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje bispecifičnih antitela pune dužine, kao što su stabilna IgG1 bispecifična antitela, pri čemu je navedeni postupak posebno pogodan za proizvodnju velikog obima stabilnih bispecifičnih antitela pune dužine u kojima su disulfidne veze reoksidovane. Uvođenjem asimetričnih mutacija u CH3 domene homodimera se može osigurati da reakcija razmene Fab kraka postane usmerena usled komplementarnosti CH3 domena, čime se mogu dobiti visoko stabilna bispecifična antitela pune dužine.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0011] Predmetni pronalazak se odnosi na in vitro postupak proizvodnje bispecifičnog antitela pune dužine koji obuhvata sledeće korake:
a) inkubiranje prvog antitela pune dužine sa drugim antitelom pune dužine u redukujućim uslovima dovoljnim da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu, pri čemu CH3 region navedenog prvog antitela pune dužine predstavlja prvi CH3 region i sadrži Arg na poziciji 409, dok CH3 region navedenog drugog antitela pune dužine predstavlja drugi CH3 region i sadrži:
(i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368
(ii) Phe, His, Lys, Arg ili Tyr na poziciji 399;
(iii) Gly, Leu, Met ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409, pri čemu prvi CH3 dodatno sadrži Tyr na poziciji 407; ili
(iv) aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405 i sadrži Lys na poziciji 409, pri čemu prvi CH3 dodatno sadrži Phe na poziciji 405,
tako da su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da je heterodimerna interakcija između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jača od svake homodimerne interakcije navedenih prvih i drugih CH3 regiona, pri čemu su pozicije aminokiselina numerisane prema EU-indeksu, kao što je opisano u publikaciji Kabat-a, pri čemu navedena prva i druga antitela pune dužine vezuju različite epitope i pri čemu od navedenih prvih i drugih antitela pune dužine:
1) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG1 izotipa;
2) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG2 izotipa;
3) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG3 izotipa; ili
4) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG4 izotipa; i
pri čemu su navedena prva i druga antitela humanizovana antitela ili pri čemu svako od navedenih prvih i drugih antitela sadrži teški lanac pune dužine humanog antitela; i dalјe, gde korak a) uključuje inkubaciju od najmanje 90 minuta na temperaturi od najmanje 20°C, u prisustvu 2-merkaptoetilamina u koncentraciji od najmanje 25 mM;
b) podvrgavanje najmanje 10 mL kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se omogući oksidacija cisteina u bispecifičnom antitelu pune dužine do međulančanih disulfidnih veza, i
c) dobijanje bispecifičnog antitela pune dužine.
[0012] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, korak a) može uključivati dodavanje agensa za helaciju metala, kao što je EDTA, EGTA ili limunska kiselina.
[0013] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, korak a) može biti izveden pod redukujućim uslovima sa redoks potencijalom između -150 i -600 mV, kao što je između -350 i -450 mV.
[0014] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, prva i druga antitela pune dužine mogu biti u puferu koji sadrži fosfat u opsegu od 1-100 mM, kao što je 1-50 mM fosfat ili opseg od 1-25 mM ili opseg od 5-20 mM. Pufer može biti sa pH opsega od 4,5-8,5, kao što je opseg od 6,5 do 7,5.
[0015] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, pufer može biti izabran iz grupe koju čine a) 8,1 mM natrijum fosfat (Na2HPO4-7H2O), 1,5 mM kalijum fosfat (KH2PO4), 138 mM natrijum hlorid (NaCl), 2,7 mM kalijum hlorid (KCl) pH 5,0; b) 8,1 mM natrijum fosfat (Na2HPO4-7H2O), 1,5 mM kalijum fosfat (KH2PO4), 138 mM natrijum hlorid (NaCl), 2,7 mM kalijum hlorid (KCI) pH 7,0; 3) 20 mM Tris-HCl, pH 7,8
[0016] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, korak b) se može odvijati na pH u opsegu od 6-8,5.
[0017] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, korak b) se može odvijati uz redoks potencijal od najmanje -300 mV.
[0018] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, uslovi oksidacije u koraku b) mogu podrazumevati prisustvo najmanje 0,05 mM kiseonika.
[0019] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, uslovi oksidacije u koraku b) mogu obuhvatati dodavanje kiseonika, pri čemu se dodavanje kiseonika vrši postupcima koji obuhvataju: mehaničko dodavanje, npr. mućkanjem, mešanjem, povećanjem pritiska ili stvaranjem protoka ili pak produvavanje kiseonikom ili vazduhom.
[0020] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, uslovi oksidacije u koraku b) mogu uključivati oksidujući agens, kao što je npr. dehidroaskorbinska kiselina (dhAA).
[0021] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, korak b) može uključivati podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) hromatografiji, kao što je npr. hromatografija na koloni, ili filtraciji, poželјno dijafiltraciji, kao što je tangencijalna protočna filtracija (TFF) ili filtracija normalnim protokom (NFF).
[0022] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, dijafiltracija može biti izvedena cirkulisanjem kompozicije kroz patronu sa šupljim vlaknima čija je donja granična vrednost opsega 10-50 kDa i koja je sa površinom u opsegu 0,05-1 m<2>, kao i sa ulaznim pritiskom u patronu opsega 70-280 kPa, a dok ne dođe do izmene od jedne do segam zapremina pufera.
[0023] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, koncentracija bispecifičnog antitela pune dužine u kompoziciji dobijenoj u koraku a) može biti u opsegu od 1-100 g/L.
[0024] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, uslovi oksidacije u koraku b) uključuju dodavanje jona metala, poželјno jona metala izabranog iz grupe koja se sastoji od: bakra, mangana, magnezijuma, gvožđa, nikla i kobalta, pri čemu je poželјno da koncentracija jona metala bude u opsegu od 0,1 do 100 µM.
[0025] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, odnos prvog i drugog antitela pune dužine u koraku a) može biti opsega od 1:1,01 do 1:2.
[0026] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, moguće je da bilo prvo antitelo pune dužine ili drugo antitelo pune dužine neće biti u stanju da vezuje Protein A i/ili Protein G.
[0027] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, prva i druga antitela pune dužine mogu sadržavati različite lake lance.
[0028] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, ukupna koncentracija prvog antitela pune dužine i drugog antitela pune dužine u koraku a) je najmanje 0,25 mg/mL.
[0029] U bilo kojim in vitro postupcima pronalaska, navedeno prvo antitelo pune dužine može sadržavati Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, dok navedeno drugo antitelo pune dužine može sadržavati Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
KRATAK OPIS NACRTA
[0030]
Slika 1: Generisanje bispecifičnih antitela razmenom Fab kraka među vrstama. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa GSH, između naznačenih anti-EGFR (2F8) i CD20 (7D8) IgG4 antitela, je određivano ELISA testom. Serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-1 µg/mL je analizirana ELISA testom. Bispecifično vezivanje je bilo veće nakon razmene Fab kraka između rezus (Rh) i humanih (Hu) IgG4 antitela nego između dva antitela iste vrste.
Slika 2: Poravnate aminokiselinske sekvence središnjeg segmenta zglobnog regiona (tj. CPPC sekvence humanog IgG1 sa dva cisteinska ostatka koji potencijalno obrazuju disulfidne veze između teških lanaca i odgovarajućih ostataka u drugim humanim i izotipovima rezus majmuna) i CH3-CH3 površine kontakta humanih i izotipova antitela rezus majmuna.
Slika 3: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom mutiranog humanog IgG1 uključenog u razmenu Fab kraka. Generisanje bispecifičnih antitela in vitro razmenom Fab kraka koja je indukovana sa GSH, između humanog CD20 (7D8) IgG4 antitela i naznačenih humanih EGFR (2F8) IgG1 antitela, određivano je ELISA testom. Prikazani grafik pokazuje srednje vrednosti brojeva iz tri nezavisna eksperimenta razmene Fab kraka u kojima je za ELISA test upotrebljena koncentracija ukupnog antitela od 1 µg/mL. Bispecifično vezivanje je bilo veće nakon razmene Fab kraka između IgG1-2F8-CPSC-ITL i IgG4-7D8 nego između dva IgG4 antitela. U navedenim uslovima, kombinovanje IgG4-7D8 sa IgG1-2F8, IgG1-2F8-CPSC ili IgG1-2F8-ITL nije dovelo do obrazovanja bispecifičnih antitela.
Slika 4: Generisanje bispecifičnih antitela in vivo razmenom Fab kraka humanih IgG4 i mutiranih IgG1 antitela. Generisanje bispecifičnih antitela in vivo razmenom Fab kraka u imunodeficijentnim miševima, između humanog CD20 (7D8) IgG4 i naznačenih humanih EGFR (2F8) IgG1 i IgG4 mutiranih antitela, je određivano ELISA testom. Prikazani grafik pokazuje srednje vrednosti brojeva (n=4). Bispecifična reaktivnost je predstavlјena kao koncentracija bispecifičnog antitela u odnosu na koncentraciju ukupnog IgG-a (procenat). Humani IgG4 sa stabilizovanim zglobnim regionom (CPPC) ili sa R409K mutacijom u CH3 domenu nije bio u stanju da učestvuje u razmeni Fab kraka. IgG1 sa oba, CPSC sekvencom u zglobnom regionu i K409R mutacijom u CH3 domenu, učestvuje u razmeni Fab kraka. (*) Bispecifično vezivanje za smeše koje su sadržavale bilo IgG1-2F8, IgG4-2F8-CPPC ili IgG4-2F8-R409K je bilo ispod granice detekcije i stoga mu je proizvolјno dodeljena vrednost nula.
Slika 5: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom razmene Fab kraka između humanih IgG1 i IgG4 antitela koja je indukovana sa 2-merkapto-etilamin•HCl-(2-MEA). Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-merkapto-etilamin•HCl-(2-MEA), između naznačenih humanih EGFR (2F8) i CD20 (7D8) antitela, određivano je ELISA testom. Ispitane su serije koncentracija od 0-40 mM 2-MEA. Prikazani grafik pokazuje rezultate ELISA analize u kojoj je upotrebljena koncentracija ukupnog antitela od 20 µg/mL. 2-MEA efikasno indukuje razmenu Fab kraka, i između antitela koja sadrže stabilizovani zglobni region (CPPC). U kontekstu CH3 domena, rezultat kombinacije humanog IgG4 sa humanim IgG1 koji je sadržavao trostruku mutaciju T350I-K370T-F405L je bio viši nivo bispecifične reaktivnosti u poređenju sa dva IgG4 antitela divlјeg tipa.
Slika 6: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA, između humanih IgG1 i IgG4 antitela.
Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA, između naznačenih humanih EGFR (2F8) i CD20 (7D8) antitela, određivano je masenom spektrometrijom za sve uzorke serija koncentracija od 0-40 mM 2-MEA. (A) Prikazani su reprezentativni primeri profila masene spektrometrije za uzorke iz reakcija razmene Fab kraka između IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC sa 0 mM, 7 mM i 40 mM 2-MEA. (B) Nakon kvantifikacije podataka masene spektrometrije, izračunat je procenat bispecifičnog antitela i u grafik su unete vrednosti u odnosu na koncentraciju 2-MEA u reakciji razmene Fab kraka. Rezultat IgG4-2F8 x IgG4-7D8 je bio maksimum od približno 50% bispecifičnog antitela. Rezultat IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC je bio maksimum od približno 95% bispecifičnog antitela.
Slika 7: Analiza stabilnosti heterodimernih bispecifičnih antitela dobijenih razmenom Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA. Stabilnost bispecifičnih uzoraka generisanih razmenom Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA, kombinovanjem bilo IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC (A) ili IgG4-2F8 x IgG4-7D8 (B), je ispitana merenjem bispecifičnog vezivanja EGFR/CD20 upotrebom ELISA testa nakon reakcije razmene Fab kraka indukovane sa GSH u prisustvu naznačenih koncentracija irelevantnog IgG4. Bispecifično vezivanje je predstavlјeno u odnosu na bispecifično vezivanje polaznog materijala (kontrola), kome je dodeljena vrednost 100%. (A) Bispecifično vezivanje za bispecifičan proizvod koji je izveden iz IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC uz indukovanje razmene sa 2-MEA je očuvano, što ukazuje na stabilan proizvod koji nije učestvovao u razmeni Fab kraka u uslovima u kojima je prisutan GSH. (B) Bispecifično EGFR/CD20 vezivanje bispecifičnog proizvoda izvedenog iz IgG4-2F8 x IgG4-7D8 indukovanjem sa 2-MEA je smanjeno, što ukazuje da je proizvod učestvovao u razmeni Fab kraka sa irelevantnim IgG4 u prisustvu GSH.
Figura 8: Stopa klirensa iz plazme za heterodimerno bispecifično antitelo generisano razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA. Tri grupe miševa (3 miša po grupi) su injecirane sa naznačenim antitelima: (1) 100 µg bispecifičnog antitela generisanog in vitro razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC; (2) 100 µg bispecifičnog antitela 1,000 µg irelevantnog IgG4; (3) 50 µg IgG1-2F8-ITL 50 µg IgG4-7D8-CPPC. (A) Koncentracija ukupnog antitela tokom vremena je određena ELISA testom. Krive koncentracija ukupnih antitela u plazmi su bile iste za sva antitela. (B) Koncentracija bispecifičnog antitela je određena ELISA testom. Bispecifičnost injeciranog antitela je bila ista sa i bez dodavanja irelevantnog IgG4 u višku. (*) Bispecifično vezivanje IgG1-2F8-ITL IgG4-7D8-CPPC smeše je bilo ispod granice detekcije i stoga odgovarajući simboli nisu mogli biti uneti u ovoj grafik. Prikazane su srednje vrednosti iz dva ELISA eksperimenta.
Slika 9: Čistoća bispecifičnog antitela generisanog razmenom Fab kraka između humanog IgG1-2F8 i IgG4-7D8-CPPC. (A) Redukujući SDS-PAGE (a) pokazuje trake teških i lakih lanaca i za bispecifičan uzorak i za IgG1 kontrolni uzorak. Neredukujući SDS-PAGE (b) pokazuje intaktni IgG. (B) Rezultati maksimalnih vrednosti (pikova) HP-SEC analize pokazuju da je >98% bispecifičnog uzorka homogeno i da praktično nisu detektovani agregati antitela. (C) Masena spektrometrija pokazuje da je rezultat razmene Fab kraka približno 100% bispecifičnog proizvoda.
Slika 10: Poređenje između trostrukog mutanta (ITL), dvostrukih mutanata (IT, IL, TL) i jednostrukog mutanta (L) humanog IgG1-2F8 u generisanju bispecifičnih antitela razmenom Fab kraka sa humanim IgG4-7D8. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između trostrukih i duplih mutanata humanog IgG1-2F8 i IgG4-7D8 divlјeg tipa sa CPSC zglobnim regionom (A) ili sa mutiranim IgG4-7D8-CPPC sa stabilizovanim zglobnim regionom (B) ili jednostrukog mutanta IgG1-2F8- F405L i IgG4-7D8 sa CPSC divlјeg tipa ili sa stabilizovanim CPPC zglobnim regionom (C), određivano je ELISA testom. Serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL ili 0-10 µg/mL je analizirana ELISA testom u eksperimentima koji su uključivali dvostruke i pojedinačne mutante, tim redom. Kombinacije IgG4 sa dvostrukim mutantima IgG1-2F8-IL i -TL dovode do bispecifičnog EGFR/CD20 vezivanja sličnog vezivanju trostrukog mutanta IgG1-ITL. Kombinacije sa IgG1-2F8-IT ne rezultuju u bispecifičnom proizvodu. Kombinacije i IgG4 divlјeg tipa i IgG4 sa stabilizovanim zglobni regionom sa jednostruko mutiranim IgG1-2F8-F405L su rezultovale bispecifičnim EGFR/CD20 vezivanjem.
Slika 11: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA na različitim temperaturama. Generisanje bispecifičnih antitela kombinovanjem naznačenih humanih EGFR (2F8) i CD20 (7D8) antitela u in vitro reakcijama razmene Fab kraka indukovanim sa 2-MEA na 0°C, 20°C i 37°C je praćeno ELISA testom tokom vremena. Indukcija bispecifičnog vezivanja je bila najefikasnija na 37°C, a sporija na 20°C. Na 0°C nije izmereno generisanje bispecifičnog vezivanja.
Slika 12: Generisanje bispecifičnih antitela in vitro razmenom Fab kraka koja je indukovana različitim redukujućim agensima. ELISA test je upotrebljen za merenje generisanja bispecifičnih antitela kombinovanjem humanog IgG1-2F8-ITL i IgG4-7D8-CPPC u reakciji redukcije sa serijom koncentracija redukujućih agenasa koje su naznačene. Bispecifično vezivanje je mereno nakon reakcija sa DTT-om (maksimum je dobijen sa 2,5 mM DTT) i 2-MEA (maksimum je dobijen sa 25 mM 2-MEA), ali ne i sa GSH. (*) Podaci za koncentracije GSH >10 mM su bile isklјučene zbog obrazovanja agregata antitela.
Slika 13: Razmena Fab kraka između IgG1-2F8-ITL i IgG1-7D8-K409X mutanata koja je indukovana sa 2-MEA. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA, između IgG1-2F8-ITL i naznačenih IgG1-7D8-K409X mutanata, je određivano ELISA testom.
(A) Analizirane su serije koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL. Pozitivna kontrola je prečišćena serija bispecifičnog antitela izvedenog iz IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC. (B) Razmena je predstavlјena kao bispecifično vezivanje za 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje između IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8), negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R) i između IgG1-2F8-ITL i IgG4-7D8-CPPC. Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate simultano izvedenih reakcija razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-7D8-K409X mutanata i IgG1-2F8-ITL.
Slika 14: Deglikozilacija antitela ne utiče na generisanje bispecifičnih antitela nakon razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA, između naznačenih EGFR (2F8) i CD20 (7D8) antitela, je određivano ELISA testom. Razmena sa 7D8 antitelima je upoređena sa njihovim enzimski deglikozilovanim varijantama. Serije koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL su analizirana ELISA testom. Reakcije razmene Fab kraka koje su uklјučivale deglikozilovana (deglik) antitela su pokazale identične krive bispecifičnog vezivanja kao glikozilovane varijante iz kojih su izvedene.
Slika 15: Sposobnost učestvovanja u razmeni Fab kraka je bila u korelaciji sa jačinom CH3-CH3 interakcije. (A), (B) i (C) Generisanje bispecifičnih antitela razmenom Fab kraka indukovanom sa GSH, između IgG1-2F8 i IgG1-7D8 (A) ili IgG4-2F8 i IgG4-7D8 (B i C) konstrukata sa naznačenim mutacijama, predstavlјeno je kao bispecifično vezivanje izmereno ELISA testom tokom vremena. Bispecifičnost je predstavlјena u odnosu na IgG4-2F8 x IgG4-7D8 kontrolu, nakon 24 h. (D) i (E) Odnos između očigledne KD(Tabela 2) i generisanja bispecifičnih antitela nakon 24 sata (Slike 15A/B/C) za molekule zasnovane na IgG1 (D) ili IgG4 (E).
Slika 16: Poravnate sekvence anti-EGFr antitela 2F8 i okosnica IgG1, IgG4 i IgG3 (parcijalna).
Prikazana je numeracija aminokiselina po Kabatu i ona koja je u skladu sa EU indeksom (obe su opisane u Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).2F8-G1 je naveden u SEQ ID NO: 10, 2F8-G3 (parcijalna sekvenca) je naveden u SEQ ID NO: 11, dok je 2F8-G4 naveden u SEQ ID NO: 12.
Slika 17: Generisanje bispecifičnih antitela in vitro razmenom Fab kraka koja je indukovana sa različitim redukujućim agensima. ELISA je upotrebljena za merenje generisanja bispecifičnih antitela kombinovanjem humanih IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R u reakciji redukcije sa serijom koncentracija naznačenih redukujućih agenasa. Izmerene OD vrednosti su normalizovane u odnosu na signal bispecifičnog kontrolnog uzorka izvedenog iz razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC, kome je dodeljena vrednost od 100%. Maksimalno bispecifično vezivanje je izmereno nakon reakcije sa DTT-om u opsegu koncentracija od 0,5-50 mM, sa 2-MEA u opsegu koncentracija od 25-50 mM i sa tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) u opsegu koncentracija od 0,5-5,0 mM, ali ne i sa GSH. (*) Podaci dobijeni za koncentracije GSH ≥ 25 mM su isklјučeni zbog obrazovanja agregata antitela.
Slika 18: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između humanih IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R.
(A) Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA je određivano ELISA testom. Prikazani grafik pokazuje rezultate ELISA testa u kome je upotrebljena koncentracija ukupnog antitela od 20 µg/mL. 2-MEA je efikasno indukovao razmenu Fab kraka između humanih IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R. (B) Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA je određivano masenom spektrometrijom za sve uzorke serija koncentracija 2-MEA od 0-40 mM. Nakon kvantifikacije podataka masene spektrometrije, izračunat je procenat bispecifičnog antitela i podaci su uneti u grafik u odnosu na koncentraciju 2-MEA u reakciji razmene Fab kraka. Rezultat razmene Fab kraka između IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R je bio ∼100% bispecifičnog antitela pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji 2-MEA, a što je potvrdilo podatke dobijene ELISA testom.
Slika 19: Čistoća bispecifičnog antitela generisanog razmenom Fab kraka između humanog IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. Masena spektrometrija pokazuje da je rezultat razmene Fab kraka približno 100% bispecifičnog proizvoda.
Slika 20: Klirens iz plazme za bispecifično antitelo generisano razmenom Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA. Dve grupe miševa (3 miša po grupi) su injecirane sa naznačenim antitelima: (1) 100 µg bispecifičnog antitela, generisanog in vitro razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA, između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R; (2) 100 µg bispecifičnog antitela 1000 µg irelevantnog IgG4 (10 x IgG4). (A) Koncentracije ukupnih antitela tokom vremena su određene ELISA testom. Krive koncentracija ukupnog antitela u plazmi su bile iste za sva antitela. (B) Koncentracija bispecifičnog antitela je određena ELISA testom. Bispecifičnost injeciranog antitela je bila ista sa i bez dodavanja irelevantnog IgG4 u višku.
Slika 21: Ćelijsko ubijanje posredovano sa CDC u ćelijama koje eksprimiraju CD-20, bispecifičnim antitelom koje je generisano razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. Serije koncentracija naznačenih antitela su upotrebljene za ispitivanje njihove sposobnosti da posreduju u CDC, u Daudi (A) i Raji (B) ćelijama. Obe ćelijske linije eksprimiraju CD20, ali ne i EGFR. Uvođenje K409R u IgG1-7D8 nije uticalo na njegov kapacitet indukcije CDC. Bispecifično antitelo, dobijeno razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R, je još uvek bilo u stanju da indukuje CDC.
Slika 22: Ćelijsko ubijanje posredovano ADCC u ćelijama koje eksprimiraju EGFR, sa bispecifičnim antitelom koje je generisano razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. Serije koncentracija naznačenih antitela su upotrebljene za ispitivanje njihove sposobnosti da posreduju ADCC u A431 ćelijama. IgG1-7D8 ne može da vezuje CD20-negativne A431 ćelije i posledično nije indukovao ADCC. ADCC je indukovan sa EGFR antitelom IgG1-2F8, i nakon uvođenja mutacija tipa F405L u CH3 domen. ADCC efektorska funkcija IgG1-2F8-F405L je zadržana u bispecifičnom formatu dobijenom razmenom Fab kraka između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R.
Slika 23: Razmena Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405X mutanata i IgG1-7D8-K409R. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA, između naznačenih IgG1-2F8-F405X mutanata i IgG1-7D8-K409R, je određivano ELISA testom. (A) Serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL je analizirana ELISA testom. Pozitivna kontrola je prečišćena serija bispecifičnog antitela, izvedena iz IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. (B) Razmena je predstavlјena kao bispecifično vezivanje pri koncentraciji antitela od 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje između IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate simultano izvedenih reakcija razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-F405X mutanata i IgG1-7D8-K409R ili kontrola.
Slika 24: Razmena Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA između IgG1-2F8-Y407X mutanata i IgG1-7D8-K409R. Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA, između naznačenih IgG1-2F8-Y407X mutanata i IgG1-7D8-K409R, je određivano ELISA testom. (A) Serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL je analizirana ELISA testom. Pozitivna kontrola je prečišćena serija bispecifičnog antitela, izvedena iz IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. (B) Razmena je predstavlјena kao bispecifično vezivanje pri koncentraciji antitela od 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje za IgG4 kontrolu (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativnu kontrolu (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate simultano izvedenih reakcija razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-Y407X mutanata i IgG1-7D8-K409R ili kontrola.
Slika 25: Analiza bispecifičnog antitela generisanog razmenom Fab kraka koja je indukovana sa 2-MEA, SDS-PAGE analizom u neredukujućim (Slika 25(A)) i redukujućim (Slika 25(B)) uslovima.
Slika 26: HP-SEC profili homodimernog polaznog materijala IgG1-2F8-F405L (Slika 26(B)), homodimernog polaznog materijala IgG1-7D8-K409R (Slika 26(A)), smeše (1:1) oba homodimera (Slika 26(C)) i bispecifičnog proizvoda generisanog razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (Slika 26(D)).
Slika 27: Masena spektrometrija (ESI-MS) homodimernog polaznog materijala IgG1-2F8-F405L (Slika 27(B)), homodimernog polaznog materijala IgG1-7D8-K409R (Slika 27(A)), smeše (1:1) oba homodimera (Slika 27(C)) i bispecifičnog proizvoda generisanog razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (Slika 27(D)).
Slika 28: Profili kapilarnog izoelektrofokusiranja (cIEF) za homodimerni polazni materijal IgG1-2F8-F405L (Slika 28(A)), homodimerni polazni materijal IgG1-7D8-K409R (Slika 28(B)), smešu (1:1) oba homodimera (Slika 28(C)) i bispecifičan proizvod generisan razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (Slika 28(D)).
Slika 29: HPLC-CIEX profili za homodimerni polazni materijal IgG1-2F8-F405L (Slika 29(A)), homodimerni polazni materijal IgG1-7D8-K409R (Slika 29(B)), smešu (1:1) oba homodimera (Slika 29(C)) i bispecifičan proizvod generisan razmenom Fab kraka indukovanom sa 2-MEA između IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (Slika 29(D)).
Slika 30: Reakcija razmene homodimera IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R, praćena katjonskom jonoizmenjivačkom tečnom hromatografijom pod visokimg pritiskom (HPLC-CIEX) nakon injeciranja u različitim vremenskim tačkama.
Slika 31: Preostali homodimeri nakon reakcije razmene, detektovani CIEX postupakom (označeni strelicama).
Slika 32: Uticaj koncentracija IgG-a, koncentracija 2-MEA, temperatura inkubacije i vremena inkubacije na generisanje bispecifičnih antitela, određen ELISA testom.
Slika 33: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom raznih koncentracija IgG-a, koncentracija 2-MEA, temperatura inkubacije i vremena - određeno ELISA testom i upoređeno sa kontrolom kojoj je proizvoljno dodeljena vrednost 100%.
Slika 34: Generisanje bispecifičnih antitela upotrebom raznih koncentracija IgG-a, koncentracija 2-MEA, temperatura inkubacije i vremena - analizirano HPLC-CIEX postupkom.
Slika 35: Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između naznačenih IgG1-2F8-L368X mutanata i IgG1-7D8-K409R, određivano je ELISA testom, upotrebom serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL (Slika 35(A)). Pozitivna kontrola je prečišćena serija bispecifičnog antitela, izvedena iz IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. Slika 35(B) prikazuje bispecifično vezivanje za 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate dobijene u simultano izvedenim reakcijama razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-L368X mutanata i IgG1-7D8-K409R.
Slika 36: Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između naznačenih IgG1-2F8-K370X mutanata i IgG1-7D8-K409R, određivano je ELISA testom, upotrebom serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL (Slika 36(A)). Pozitivna kontrola je prečišćena serija bispecifičnog antitela, izvedena iz IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R. Slika 36(B) prikazuje bispecifično vezivanje za 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate dobijene u simultano izvedenim reakcijama razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-D370X mutanata i IgG1-7D8-K409R.
Slika 37: Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između naznačenih IgG1-2F8-D399X mutanata i IgG1-7D8-K409R, određivano je ELISA testom, upotrebom serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL (Slika 37(A)). Slika 37(B) prikazuje bispecifično vezivanje za koncentraciju antitela od 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate dobijene u simultano izvedenim reakcijama razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-D399X mutanata i IgG1-7D8-K409R.
Slika 38: Generisanje bispecifičnih antitela nakon in vitro razmene Fab kraka indukovane sa 2-MEA između naznačenih IgG1-2F8-T366X mutanata i IgG1-7D8-K409R, određivano je ELISA testom, upotrebom serija koncentracija (ukupnog antitela) od 0-20 µg/mL (Slika 38(A)). Slika 38(B) pokazuje bispecifično vezivanje za koncentraciju antitela od 20 µg/mL u odnosu na pozitivnu kontrolu (crni stubić). Tamno sivi stubići predstavlјaju bispecifično vezivanje IgG4 kontrole (IgG4-7D8 x IgG4-2F8) i negativne kontrole (IgG1-2F8 x IgG1-7D8-K409R). Svetlo sivi stubići predstavlјaju rezultate dobijene u simultano izvedenim reakcijama razmene Fab kraka između naznačenih IgG1-2F8-T366X mutanata i IgG1-7D8-K409R.
Slika 39: Razmena Fab kraka indukovana sa 2-MEA, između četiri različite kombinacije mutiranog IgG1 (kao što je naznačeno), na 15°C nakon 0, 30, 60, 105 i 200 minuta inkubacije - određeno „sendvič” ELISA testom.
Slika 40: Razmena Fab kraka indukovana sa 2-MEA, između različitih kombinacija mutiranog IgG1, nakon inkubacije antitela na 15°C tokom 90 min - određeno sendvič ELISA testom.
Slika 41: Bispecifična antitela su analizirana analitičkim CIEX postupkom, a procenat obrazovanih heterodimera tokom vremena u različitim puferima (kao što je naznačeno u legendi) je izračunat na sledeći način: Heterodimer (%) = 100% - [površina pika % IgG1-2F8-F405L površina pika % IgG1-7D8-K409R].
Slika 42: Serija bispecifičnih antitela zapremine 40 ml, proizvedena upotrebom smeše koja je sadržavala 10 mg/mL svakog antitela, ispitana je neredukujućom (A, C) i redukujućom SDS-PAGE analizom (B, D), nakon čuvanja na 0°C preko noći (A, B) ili na 4°C tokom šest dana (C, D). Traka 1 svakog gela sadrži marker molekulskih težina, traka 2 sadrži IgG1 internu kontrolu analize. A, B: traka 3: serija bispecifičnih proizvoda zampremine 40 mL koja je proizvedena upotrebom smeše koja je sadržavala 10 mg/mL svakog antitela; C, D: traka 4: serija od 40 mL, proizvedena upotrebom smeše koja je sadržavala 10 mg/mL svakog antitela.
Za neredukujuće uslove, naznačene su različite kombinacije teškog lanca (H) i lakog lanca (L): 148 kDa (LHHL), 125 kDa (HHL), 99 kDa (HH), 67 kDa (HL), 51 kDa (H) i 25 kDa (L).
Slika 43: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y-osa i puna linija pokazuju redoks-potencijal; desna y-osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom, izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 44: HP-SEC analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani HP-SEC postupkom. Uzorak 2 (S0002): anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; uzorak 3 do 8: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 1, 2, 3, 4, 41⁄2, 5 h); uzorak 9 do 12: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 1, 2, 3, 4 h); uzorak 13: anti-CD38 antitelo nakon inkubacije preko noći; uzorak 14: anti-CD38 antitelo nakon dodavanja CuSO4u rastvor. Radi poređenja, HP-SEC profili za sam 2-MEA i 2-MEA sa 2-jodoacetamidom (IAA) su prikazani podeblјanim linijama. Pikovi na 7,715 i 9,193 predstavlјaju dimerni i monomerni IgG1. Priroda pika na 11,073 nije poznata.
Slika 45: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera u PBS; traka 3 do 8: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije su naznačena iznad slike); traka 9 do 12: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije; traka 13: anti-CD38 antitelo nakon inkubacije preko noći; traka 14: anti-CD38 antitelo nakon dodavanja CuSO4u rastvor.
Slika 46: ESI-MS analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela. U uzorcima uzetim tokom redukcije i reoksidacije anti-CD38 antitela, najpre je zaustavljena reakcija, pa su uzorci analizirani ESI-MS analizom. Uzorak 1 (S0001): anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; uzorak 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera u PBS; uzorak 3 do 8: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 1, 2, 3, 4, 41⁄2, 5 h); uzorak 9 do 12: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 1, 2, 3, 4 h); uzorak 13: anti-CD38 antitelo nakon inkubacije preko noći; uzorak 14: anti-CD38 antitelo nakon dodavanja CuSO4u rastvor. Treba zapaziti da LC-MS olakšava proces reoksidacije, bilo uklanjanjem redukujućeg agensa iz LC sistema ili tokom procesa elektroraspršivanja, kada je uzorak izložen vazduhu, tj. kiseoniku. Uzorci mogu izgubiti kovalentno vezane molekule redukujućeg agensa koji nisu bili zaštićeni sa IAA tokom koraka zaustavljanja reakcije. Na ovaj način je kovalentno intaktan reoksidovan IgG dodatno izmeren sa ESI-MS, pored SDS-PAGE analize. Označene su različite kombinacije teškog lanca (H) i lakog lanca (L): LHHL, HHL, HH, HL, H i L. Na slici su navedeni samo detalјi mase za laki lanac (L); 2-MEA = 75 Da; 2-jodoacetamid = 57 Da.
Slika 47: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i drugi korak dijafiltracije. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 48: HP-SEC analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i drugi korak dijafiltracije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani HP-SEC postupkom. Uzorak 1 (S0001): anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje, uzorak 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; uzorak 3 do 9: anti CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije 5, 10, 15, 30 i 60 min i 2 i 3 h); uzorak 10 do 15: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 20, 30, 40, 50 i 60 min); uzorak 16 do 18: anti-CD38 antitelo 1, 2 i 25 sati nakon dijafiltracije; uzorak 19: anti-CD38 antitelo 1 sat nakon druge dijafiltracije.
Slika 49: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i drugi korak dijafiltracije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera u PBS; traka 3 do 9: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije 5, 10, 15, 30 i 60 min i 2 i 3 h); traka 10 do 15: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 20, 30, 40, 50 i 60 min); traka 16 do 18: anti-CD38 antitelo 1, 2 i 25 sati nakon dijafiltracije; traka 19: anti-CD38 antitelo 1 sat nakon druge dijafiltracije.
Slika 50: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i niža koncentracija 2-MEA. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 51: HP-SEC analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i niža koncentracija 2-MEA. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani HP-SEC postupkom. Uzorak 1 (S0001): anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; uzorak 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; uzorak 3 do 6: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 20 i 60 min i 3 i 4 sata); uzorak 7 do 10: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 20, 40 i 60 min); uzorak 11 do 14: anti-CD38 antitelo 1, 2, 3 i 24 sata nakon zaustavlјanja dijafiltracije.
Slika 52: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i niža koncentracija 2-MEA. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; traka 3 do 6: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 20 i 60 min i 3 i 4 sata); traka 7 do 10: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 20, 40 i 60 min); traka 11 do 14: anti-CD38 antitelo 1, 2, 3 i 24 sata nakon zaustavlјanja dijafiltracije.
Slika 53: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo EDTA tokom faze redukcije. (A) Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama). (B) Poređenje pada DO u prisustvu i odsustvu EDTA (uzeto iz primera 46 [bez EDTA] i 47 [sa EDTA]).
Slika 54: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo EDTA tokom faze redukcije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; traka 3 do 7: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 10 min i 1, 2, 3 i 4 sata); traka 8 do 11: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 30, 40 i 60 min od početka dijafiltracije); traka 12 do 14: anti-CD38 antitelo 1 i 24 sata i 6 dana nakon zaustavlјanja dijafiltracije.
Slika 55: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo N2 nakon faze redukcije. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 56: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo N2nakon faze redukcije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; traka 3 do 7: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 10 min i 1, 2, 3 i 4 sata); traka 8 do 10: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 30 i 60 min od početka dijafiltracije); traka 11: anti-CD38 antitelo 24 sata nakon zaustavlјanja dijafiltracije; traka 12 i 13: anti-CD38 antitelo 1 i 24 sata nakon što je zaustavlјena aeracija azotom i započeta je aeracija kiseonikom.
Slika 57: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo EDTA nakon faze redukcije. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 58: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo EDTA nakon faze redukcije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; traka 3 do 6: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 10 min i 2, 3 i 4 sata); traka 7 do 9: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10, 30 i 60 min od početka dijafiltracije); traka 10: anti-CD38 antitelo 24 sata nakon zaustavlјanja dijafiltracije; traka 11: anti-CD38 antitelo 30 min nakon dodavanja bakar sulfata.
Slika 59: Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom redukcije i oksidacije IgG1 anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo bakar sulfata nakon faze redukcije. Redoks potencijal i zasićenje kiseonikom tokom faze redukcije i oksidacije su praćeni upotrebom redoks senzora i senzora za rastvoreni kiseonik (DO). Leva y osa i puna linija pokazuju redoks potencijal; desna y osa i isprekidana linija pokazuju zasićenje kiseonikom izmereno u rastvoru tokom različitih faza procesa (naznačeno strelicama).
Slika 60: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela - brža dijafiltracija i prisustvo bakar sulfata nakon faze redukcije. Uzorci uzeti tokom redukcije i oksidacije anti-CD38 antitela su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. Traka 1: anti-CD38 antitelo u puferu za formulisanje; traka 2: anti-CD38 antitelo nakon izmene pufera iz pufera za formulisanje u PBS; traka 3 do 7: anti-CD38 antitelo tokom faze redukcije (vremena inkubacije: 10 min i 1, 2, 3 i 4 sata); traka 8 i 9: anti-CD38 antitelo tokom procesa dijafiltracije (uzorci uzeti nakon 10 i 60 min od početka dijafiltracije); traka 10: anti-CD38 antitelo 24 sata nakon zaustavlјanja dijafiltracije; traka M: marker molekulskih težina.
Slika 61: SDS-PAGE analiza tokom procesa reoksidacije. Uzorci su uzeti nakon različitih vremena inkubacije u PBS-u koji je sadržavao EDTA ili Cu<2+>i analizirani su sa SDS-PAGE u neredukujućim (A, C) i redukujućim (B, D) uslovima. Traka 1: IgG1, interna kontrola analize, traka 2: uzorak 0 h, traka 3: uzorak 1 h, traka 4: uzorak 2 h, traka 5: uzorak 3 h, traka 6: uzorak 4 h, traka 7: uzorak 24 h, traka 8: marker molekulskih težina.
Slika 62: Relativna količina kombinacija teških i lakih lanaca nakon različitih vremena inkubacije u prisustvu Cu<2+>. Pojedinačne molekulske vrste su kvantifikovane denzitometrijski, sa SDS-PAGE gelova. Ukupan intenzitet svih skeniranih traka je uzet kao 100%.
Slika 63: Put protoka u reaktoru, spisak materijala i proces. Put protoka je dezinfikovan upotrebom 0,2 N NaOH, pa je ispran sa WFI. Na jutro reakcije razmene, u sistem je dodata odgovarajuća količina PBS-a iz spremnika za pufer. Homodimeri su nanošeni dejstvom sile gravitacije, a cirkulacija sistema je podešena na 7 L/min da bi se promešao sadržaj. Reakcija je započeta dodavanjem osnovnog rastvora 2-MEA, dejstvom gravitacije. Ventili za permeat su zatvoreni i, za proces redukcije, pumpa za napajanje je podešena na 30 o/min (7 L/min). Nakon pet sati, ventili za permeat su otvoreni i brzina rada pumpe je povećana da bi se postigao potreban pritisak unošenja uzorka za dijafiltraciju od 70 kPa. Za uslov uvođenja uzorka od 1 g/L, pumpa je podešena na 165 o/min (31 L/min). Za uslov od 20 g/L, pumpa je podešena na 140 o/min (26 L/min). Put dodavanja PBS-a je otvoren i brzina pumpe za dijafiltraciju je kontrolisana, da bi se održala konstantna težina u reakcionoj kesi. Navedena procedura je rezultovala brzinom dijafiltracije od 250 L/h za prvi uslov od 1 g/L i 125 L/h za drugi uslov od 20 g/L. Kada je željena zapremina dijafiltracije prikuplјena u kesu za otpad od 500 L, ventili permeata su zatvoreni i zaustavlјena je pumpa za dijafiltraciju. Pumpa za napajanje je vraćena na režim rada od 30 o/min (7 L/min) tokom vremena oksidacije. Nakon inkubacije preko noći, urađena je i druga dijafiltracija (tri dijazapremine za uslov 1 g/L i 4 dijazapremine za uslov 20 g/L). Svi procesi su izvedeni na ambijentalnoj temperaturi (22-25°C). Uzorci su uklonjeni iz kese bilo direktno ili preko ventila 1 (Slika 1). Spisak materijala
1) nulti-statični t-membranski ventil od 1⁄2 inča, SED, 316L SS
2) kesa od 50 L, Sartoruis Stedim, model FFB207004, na mikseru za zapreminu od 50 L firme Wave, model EHT rev A
3) dvostruki nosač, Intercomp, model TB830
4) crevo prečnika 1/2 inča, platinum silikon, Masterflex 96410-82
5) crevo prečnika 3/8 inča, platinum silikon, Tygon 3350
6) stezaljaka za crevo
7) crevo za visok pritisak prečnika 1 inč, ojačani platinum silikon, 316L SS TC krajevi, Page International, model SWPV
8) manometer, 0-30 psig, Anderson, model EM066010041025A
9) t-ventil od 1 inča, 316L SS
10) t-ventil od 1⁄2', 316L SS
11) TC reduktor 1⁄2 x 1 inča, 316L SS
12) Peristaltićka pumpa za napajanje, Watson Marlow, model 720 DUN/RE, firme element za cevi Stapure, model 960.0254.PFT, 0-33 L/min
13) Senzor za rastvoreni kiseonik i tabla za očitavanje, Metter-Toledo, model 4100e i Inpro element za cevčice 6800/12/120 (senzor)
14) Senzor za redoks potencijal i tabla za očitavanje, Mettler Toledo, model 2100e i 3250SG (senzor)
15) protočna ćelija tipa Wedgewood od 1 inča, 316L SS
16) t-venitl od 1⁄2 inča, Kynar, Cole-Parmer, model EW-30703-78
17) membranski ventil od 1⁄2 inča, SED, 316L SS
18) postolje za UF membranu firme Millipore sa Pall polipropilenskim umetcima za jednokratnu upotrebu i Pall Omega 30kD PES membranom, model OS030F26
19) muški konektor tipa Kleenpak HT, Pall, model KPCHT02M6
20) ženski konektor tipa Kleenpak HT, Pall, model KPCHT02F6
21) peristaltička pumpa za dijafiltraciju, Watson Marlow, model 620 Di/R, element za cevi firme Stapure, model 960.0170.PFT, 0-9 L/min
22) 0,2 mikronski filter, Pall, model KA3NFP1
23) kesa zapremine 500 L, Sartoruis Stedim, model FXB211905
24) kesa zapremine 200 L, Sartoruis Stedim, model PDL200LWS
25) kesa zapremine 20 L, Sartoruis Stedim, model FFB208721
26) kesa zapremine 5 L, Sartoruis Stedim, model FFB208723
* Sve TC zaptivke su bile od platinum silikona.
* Sve kese zapremine 5/20/50 L firme Sartorius Stedim su prevučene višeslojnim filmom sa EVA (etilen vinil acetat) koji je u kontaktu sa proizvodom i sa EVOH (etilen vinil alkohol) su slojevima kao barijerom za gas.
* Sve kese zapremine 200/500 L firme Sartorius Stedim su prevučene višeslojnim filmom sa ULDPE (polietilen ultra niske gustine) koji je u kontaktu sa proizvodom i sa EVOH slojevima su kao barijerom za gas.
Slika 64: CIEX profili početnog i finalnog proizvoda za tri različita uslova.
Slika 65: Redukujuća (levo) i neredukujuća (desno) SDS-PAGE analiza početnog i finalnog proizvoda. Traka 1: IgG1-b12 kontrola analize. Traka 2: početni IgG1-F405L-2F8. Traka 3: početni IgG1-K409R-7D8. Traka 4: konačni proizvod nakon protoka od 25-L uz 1 g/L. Traka 5: konačni proizvod nakon protoka od 25-L uz 20 g/L.
Slika 66: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost i DO i redoks potencijala. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom DO i redoks potencijala na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 67: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) je meren pH senzorom. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu pH vrednost. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom pH na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 68: Stopa potrošnja kiseonika (OCR [mM/h]), ukupan potrošen O2(mM) i DO (%) tokom faze redukcije. Stopa potrošnje kiseonika i ukupan potrošen O2su izračunati, DO je meren. Vertikalne tačkaste linije predstavlјaju početak i kraj redukcije.
Slika 69: SDS-PAGE (neredukujuća) analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6, 7, 8, 9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7 L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: inkubacija nakon dijafiltracije od 1 sata i preko noći. Mase markera molekulske težine su naznačene na levoj strani. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 70: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci su uzeti i brzo zamrznuti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u naznačenim vremenskim tačkama, pa su analizirani analitičkim CIEX postupkom.
Slika 71: HP-SEC analiza krajnjeg uzorka nakon inkubacije preko noći. Uzorak uzet posle inkubacije preko noći nakon dijafiltracije, analiziran je HP-SEC postupkom. Pikovi na 7,599 i 10,792 predstavlјaju dimerni i monomerni IgG, tim redom.
Slika 72: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu 2 mM EDTA su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost i redoks potencijala i DO. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom DO i redoks potencijala na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije. Porast redoks potencijala i pad DO u kasnijoj fazi protoka (t = 24 h) se podudara sa dodavanjem CuSO4.
Slika 73: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu 2 mM EDTA je praćen upotrebom pH senzora. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu pH vrednost. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom pH na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 74: SDS-PAGE analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i ponovne oksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu 2 mM EDTA su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6,7,8,9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7 L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: inkubacija nakon dijafiltracije od 1 sata i preko noći, traka 13: 10 min nakon dodavanja CuSO4. Mase markera molekulske težine su naznačene sa leve strane. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 75: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu 2 mM EDTA su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u vremenskim tačkama koje su naznačene i trenutno zamrznuti do CIEX analize.
Slika 76: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom DO i redoks potencijala na početku protoka. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost i redoks potencijala i DO. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 77: Brzina mućkanja tokom redukcije i reoksidacije. Dodavanje 2-MEA (naznačeno strelicom) se poklopilo sa velikim porastom u stopi mućkanja ubrzo nakon početka protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 78: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) je meren pH senzorom. Dodavanje 2-MEA (naznačeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom pH na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 79: SDS-PAGE (neredukujuća) analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6, 7, 8, 9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7 L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: inkubacija nakon dijafiltracije od 1 sata i preko noći. Mase markera molekulske težine su naznačene sa leve strane. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 80: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama i brzo zamrznuti do CIEX analize.
Slika 81: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početne vrednosti i za redoks potencijal i za DO. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom DO i redoks potencijala na početku protoka. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost i redoks potencijala i DO. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 82: Brzina mešanja tokom redukcije i reoksidacije. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim povećanjem brzine mućkanja ubrzo nakon početka protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 83: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) je meren pH senzorom. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost. Dodavanje 2-MEA (označeno strelicom) se poklopilo sa velikim padom pH na početku protoka. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu pH vrednost. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 84: SDS-PAGE (neredukujuća) analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6, 7, 8, 9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7 L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: inkubacija nakon dijafiltracije od 1 sata i preko noći. Mase markera molekulske težine su naznačene sa leve strane. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 85: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama i brzo zamrznuti do CIEX analize.
Slika 86: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu azota su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Dodavanje 2-MEA u vremenu 0 se poklopio sa velikim padom redoks potencijala na početku protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak dijafiltracije, kraj dijafiltracije, tačku uzorkovanja nakon dijafiltracije od 1 sata i tačku uzorkovanja nakon dijafiltracije od 3 sata. Prostor gasne faze je na kraju dijafiltracije ispran vazduhom.
Slika 87: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i oksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu azota je meren pH senzorom. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu pH vrednost. Dodavanje 2-MEA u vremenu 0 se poklopio sa velikim padom pH na početku ciklusa protoka. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije.
Slika 88: SDS-PAGE (neredukujuća) analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu azota su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6, 7, 8, 9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: 1 i 3 sata nakon dijafiltracije, traka 13: inkubacija preko noći nakon dijafiltracije. Mase markera molekulske težine su naznačene sa leve strane. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 89: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) u prisustvu azota su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama i brzo zamrznuti do CIEX analize.
Slika 90: Potrošnja kiseonika nakon uvođenja vazduha. Grafikon prikazuje vrednosti dobijene od trenutka neposredno nakon dijafiltracije do trenutka dodavanja vazduha. Stvarni DO je DO koji je izmeren u sistemu. DO (bez potrošnje) je vrednost izračunata uz pretpostavku odsustva potrošnje kiseonika. Utrošeni O2je količina potrošenog kiseonika koja je izračunata upotrebom prethodno određenog kla i uz pretpostavku da zasićenje kiseonika u sistemu iznosi 0,2 mM.
Slika 91: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su praćeni upotrebom redoks i DO senzora. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početne vrednosti za redoks potencijal i DO. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije. Dodavanje 2-MEA se poklopilo sa velikim padom DO i redoks potencijala na početku protoka. pH je podešen na 5,0 neposredno pre dijafiltracije. Nakon inkubacije preko noći, pH je vraćen na 7,4.
Slika 92: pH profil tokom redukcije i reoksidacije. pH tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) je meren pH senzorom. Horizontalna isprekidana linija pokazuje početnu vrednost. Vertikalne isprekidane linije pokazuju početak i zaustavlјanje dijafiltracije. Dodavanje 2-MEA se poklopio sa padom pH na početku ciklusa protoka. pH je podešen do 5,0 neposredno pre dijafiltracije, puferom sa pH 5,0. Nakon inkubacije preko noći, pH je vraćen na 7,4.
Slika 93: SDS-PAGE (neredukujuća) analiza tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani neredukujućom SDS-PAGE analizom. M: marker molekulskih težina; C: IgG1 kontrola; traka 1: pre dodavanja 2-MEA; trake 2, 3, 4 i 5: nakon redukcije od 30 min, 1 sata, 2 sata i 3 sata, trake 6, 7, 8, 9 i 10: rezultati dijafiltracije nakon 1, 2, 3, 5 i 7 L dijafiltriracionog pufera, trake 11 i 12: inkubacija nakon dijafiltracije od 1 sata i preko noći, trake 13, 14 i 15: rezultati odmah po, kao i 1 i 2 sata nakon dodavanja Tris-a. Mase markera molekulske težine su naznačene sa leve strane. Redukovane/reoksidovane IgG vrste su označene sa H (teški lanac) i/ili L (laki lanac) i njihovim kombinacijama.
Slika 94: CIEX profili tokom redukcije i reoksidacije. Uzorci uzeti tokom redukcije i reoksidacije IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R (smeša 1:1) su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama i brzo zamrznuti do CIEX analize.
Slika 95: Rastvoreni kiseonik i redoks potencijal nakon dodavanja cistamina. Zasićenje kiseonikom i redoks potencijal nakon dodavanja cistamina u smešu (1:1) IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R su praćeni upotrebom redoks i DO senzora.
Slika 96: CIEX profili nakon dodavanja cistamina. Uzorci uzeti nakon dodavanja cistamina u IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R su analizirani analitičkim CIEX postupkom. Uzorci su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama.
Slika 97: CIEX profili redukcije upotrebom 10 mM cisteina. Uzorci su nanošeni na kolonu svakih 55 min i dalje analizirani analitičkim CIEX postupkom. Prikazani su izabrani profili i naznačena su vremena inkubacije.
Slika 98: CIEX profili redukcije sa 25 mM cisteinom. Uzorci su nanošeni na kolonu svakih 55 min i dalje analizirani analitičkim CIEX postupkom. Prikazani su izabrani profili i naznačena su vremena inkubacije.
Slika 99: CIEX profili redukcije sa 50 mM cisteinom. Uzorci su nanošeni na kolonu svakih 55 min i dalje analizirani analitičkim CIEX postupkom. Prikazani su izabrani profili i naznačena su vremena inkubacije.
Slika 100: CIEX profil redukcije sa 75 mM cisteinom. Uzorci su nanošeni na kolonu svakih 55 min i dalje analizirani analitičkim CIEX postupkom. Prikazani su izabrani profili i naznačena su vremena inkubacije.
Slika 101: CIEX profil redukcije sa 100 mM cisteinom. Uzorci su nanošeni na kolonu svakih 55 min i dalje analizirani analitičkim CIEX postupkom. Prikazani su izabrani profili i naznačena su vremena inkubacije.
Slika 102: CIEX profil nakon redukcije upotrebom cisteina, uklanjanja cisteina i inkubacije.
Prikazan je CIEX profil nakon redukcije tokom 385 minuta u 50 mM cisteinu na 30°C, nakon čega su sledili uklanjanje cisteina upotrebom kolone za desalinizaciju i naknadna inkubacija tokom 2 sata i 18 sati.
Slika 103: CIEX profil preostalih homodimera i novoobrazovanog bispecifičnog antitela nakon elucije sa kolone sa imobilisanim redukujućim agensom. Smeša homodimera IgG1-2F8-F405L i IgG1-7D8-K409R je dodata u kolonu sa imobilisanim redukujućim agensom, nakon čega su sledile inkubacija i elucija. Obrazovanje bispecifičnih antitela je analizirano analitičkim CIEX postupkom.
Slika 104: Alotipska ELISA za detekciju bispecifičnih antitela. Smeša IgG1m(f)-K409R-CD20 i IgG1m(za)-F405L-EGFR je inkubirana sa 25 mM 2-MEA na 37°C tokom 90 min. Obrazovanje bispecifičnih antitela je mereno „sendvič” ELISA testom. Optička gustina na 405 nm je uneta na Y osu grafika kao mera obrazovanja bispecifičnih IgG1m(f,za)-CD20xEGFR antitela. IgG1m(fa)antitelo je uklјučeno kao pozitivna kontrola.
Slika 105: CIEX analiza nakon SNEEP postupka. CIEX analiza je urađena nakon SNEEP postupka u kome je u višku dodavan IgG1-7D8-AAA-K409R. Kvantifikacija je pokazala da je nakon reakcije razmene bilo prisutno 11,4% IgG1-7D8-AAA-K409R (*), 88,5% bispecifičnog antitela i samo 0,1% IgG1-2F8-F405L (+) homodimera.
Slika 106: CIEX analiza nakon SNEEP postupka. CIEX analiza je urađena nakon SNEEP postupka u kome je u višku upotrebljen IgG1-2F8-F405R. Kvantifikacija je pokazala da je nakon reakcije razmene bilo prisutno 0,4% IgG1-7D8-K409R (*), 88,4% bispecifičnog antitela i 11,2% IgG1-2F8-F405L (+).
Slika 107: CIEX analiza nakon SNEEP postupka. CIEX analiza je urađena nakon SNEEP postupka u kome je u višku upotrebljen IgG1-7D8-AAA-K409R. Kvantifikacija je ukazala da je nakon reakcije razmene bilo prisutno 25,5% IgG1-7D8-AAA-K409R (*), 73,3% bispecifičnog antitela i 1,2% IgG1-2F8-F405L (+). Potrebno je naglasiti da je pod optimalnim uslovima razmene procenat IgG1-2F8-F405L homogimera bio dodatno smanjen (Slika 105).
Slika 108: Profil brze proteinske tečne hromatografije (FPLC) za Protein A. FPLC profil sa Proteinom A za bispecifično antitelo proizvedeno nakon razmene upotrebom viška IgG1-7D8-AAA-K409R homodimera od 50%. Na levoj osi je prikazan A280signal u mAU (crni trag), na desnoj osi pH (sivi trag). Pik između dva označena pika predstavlјa mehur vazduha na početku frakcionacije.
Slika 109: CIEX analiza protočne frakcije (pik označen sa * na Slici 108. Nije detektovano nijedno bispecifično antitelo (vreme retencije ∼16,4 minuta), kao ni IgG1-2F8-F405L (vreme retencije ∼19,2 minuta); pik na 13,6 minuta odgovara (nevezujućem) IgG1-7D8-AAA-K409R homodimeru.
Slika 110: CIEX analiza eluiranog proizvoda (pik označen sa na Slici 108). Pik na 16,4 minuta odgovara bispecifičnom antitelu, dok pik nije detektovan na 13,6 (IgG1-7D8-AAA-K409R); detektovan je mali pik na 19,2 minuta (IgG1-2F8-F405L) (1,4%). Navedeno je pokazalo da se SNEEP u kombinaciji sa finalnim („polirajućim”) prečišćavanjem sa Proteinom A može upotrebljavati za uklanjanje rezidualnog homodimera.
Slika 111: Zajednički FPLC hromatogram smeše Proteina A i prečišćenih IgG1-b12-F405L i IgG1-058-K409R. Trag prikazuje signal na A280. Nanošnje uzorka se uočava kao povećanje signala na A280 nakon ∼5 mL. Početak koraka ispiranja i elucije je označen strelicom. Pik nakon elucije sa 100 mL se uočava tokom prve faze regenerisanja sa niskim pH. Ovaj pik nije analiziran, ali ukazuje na manje proteinske nečistoće.
Slika 112: Zajednički CIEX profil smeše Proteina A i prečišćenih IgG1-058-K409R (*) i IgG1-b12-F405L (+).
Slika 113: HP-SEC profil bispecifičnog antitela proizvedenog iz smeše proteina A i prečišćenih IgG1-b12-F405L i IgG1-058-K409R. Pik na 7,5 minuta (*) odgovara dimernim vrstama, a pik na 9,0 minuta monomernim vrstama (+).
Slika 114: CIEX profil bispecifičnog antitela proizvedenog iz smeše proteina A i prečišćenog IgG1-b12-F405L i IgG1-058-K409R. Pik na 26 minuta (*) odgovara bispecifičnom antitelu; pik na 36 minuta odgovara IgG-b12-F405L homodimeru (+). Nije detektovan IgG1-058-K409R.
Slika 115: FPLC profil smeše bispecifičnog antitela i homodimera u odnosu 1:1:1. FPLC profil smeše IgG1-7D8-K409R (*), bispecifičnog antitela (+) i IgG1-2F8-F405L (#) u odnosu 1:1:1 dobijen razdvajanjem na WCIEX koloni u uslovima bliskim izokratičnim (samo eluiranje IgG1-2F8-F405L je blago ubrzano slabim gradijentom).
Slika 116: Izračunata rezolucija. Izračunata rezolucija (R, izračunata upotrebom Jednačine 5) je prikazana za citratne i fosfatne pufere. Utvrđena je i optimalna rezolucija za citrat od 20 mM, pH 6,4. Rezolucija od 1,75-2,00 je uzeta kao prihvatljiva mera zadovolјavajućeg razdvajanja (John W. Dolan, Peak Tailing and Resolution, LC Resources Inc., Walnut Creek, California, USA).
Slika 117: FPLC profil. FPLC profil IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R (*) bispecifičnog antitela spajkovanog sa 10% IgG1-2F8-F405L homodimera (+) u prisustvu 20 mM citrate, pH 6,4,. Nanošenje je podrazumevalo 4,4 mg/mL smole.
Slika 118: CIEX profil IgG1-2F8-F405L x IgG17D8-K409R bispecifičnog antitela. Prikazan je CIEX profil IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R koji je označen zvezdicom (*) na Slici 117. Procenti IgG17D8-K409R homodimera (*), bispecifičnog antitela i IgG1-2F8-F405L homodimera (+) su iznosili 4,3; 94,8 i 0,9. IgG1-7D8-K409R homodimer je bio rezidualni homodimer iz originalne serije koja je spajkovana sa IgG1-2F8-F405L.
Slika 119: FPLC hromatogram. A) Profil elucije sa kolone sa Proteinom A za 20 mg bispecifičnog antitela u PBS-u uz 75 mM 2-MEA (ukupna zapremina 3 mL). Puna linija je signal na A254(leva osa), isprekidana linija je signal na A280(leva osa), dugačka isprekidana linija je pH (vrednosti nisu prikazane, pH je pao sa 7,4 na 3,0 sa ∼ 65 mL i naznačen je samo kao referentna vrednost). B) PBS sa 75 mM 2-MEA (ukupna zapremina 3 mL) je nanet na kolonu sa Proteinom A. Puna linija je signal na A254(leva osa), isprekidana linija je signal na A280(leva osa), duga isprekidana linija je pH (vrednosti nisu prikazane, pH je pao sa 7,4 na 3,0 sa ∼40 mL i naznačen je samo kao referentna vrednost).
Slika 120: Tačka proboja. A) Tačka proboja (označena na slici strelicom) je određena pre (levi panel) i nakon (desni panel) izlaganja kolone sa proteinom A dejstvu 2-MEA. IgG1-7D8-K409R (5 mg/mL) je nanet uz vremena zadržavanja od 1 minuta. I pre i nakon izlaganja 75 mM 2-MEA, tačka proboja je iznosila ∼15 mL, što ukazuje da performanse kolone nisu bile pod snažnim uticajem prisustva 2-MEA. Prikazani podaci su vrednosti na A280 (mAU). B) Uveličan A) sa oba superponirana traga.
Slika 121: Redukujuća SDS-PAGE analiza eluiranog proteina nakon uklanjanja 2-MEA. Trake sadrže marker, kontrolno antitelo (IgG1-b12), bispecifičnu reakcionu smešu u prisustvu 2-MEA pre nanošenja na kolonu, kao i krajnji proizvod nakon uklanjanja 2-MEA. Nije detektovan Protein A, što ukazuje da je kolona ostala intaktna. Teški i laki lanci su označeni strelicama, a očekivana molekulska težina Proteina A (45 kDa) je označena zvezdicom (*).
Slika 122: CIEX profil bispecifičnog lambda-kapa antitela. Mesto gde je očekivano BMA 031-K409R antitelo koje sadrži λ laki lanac je naznačeno znakom plusa (+), a gde nije detektovan pik, dok je pik IgG12F8-F405L antitela sa κ lakim lancem označen zvezdicom (*). Bispecifično antitelo je u sredini. Procenti BMA 031-K409R, bispecifičnog antitela i IgG12F8-F405L su iznosili 11,2; 88,8 i 0, tim redom.
Slika 123: A280 podaci za bispecifično antitelo (crni), IgG1-7D8-K409R (sivi) i IgG1-2F8-F405L (beli stubići) nakon skladištenja tokom različitih vremenskih perioda i na različitim temperaturama.
A280 merenja su urađena upotrebom Nanodrop-a, a rezultati su prikazani kao A280 (AU) - dužina puta snopa svetlosti je 1 mm.
Slika 124: Neredukujuća SDS-PAGE analiza bispecifičnog antitela (D), IgG1-7D8-K409R (1) i IgG1-2F8-F405L (2) za t = 0 i t = 12 meseci na 2 - 8°C i na 25°C. C = interna IgG1 kontrola analize.
Slika 125: Redukujuća SDS-PAGE analiza bispecifičnog antitela (D), IgG1-7D8-K409R (1) i IgG1-2F8-F405L (2) za t = 0 i t = 12 meseci na 2-8°C i na 25°C. C = interna IgG1 kontrola analize.
Slika 126: Neredukujuća SDS-PAGE analiza bispecifičnog (D), IgG1-7D8-K409R (1) i IgG1-2F8-F405L (2) za t = 0 i t = 3 meseci na 40°C. C = interna IgG1 kontrola analize.
Slika 127: Redukujuća SDS-PAGE analiza bispecifičnog antitela (D), IgG1-7D8-K409R (1) i IgG1-2F8-F405L (2) za t = 0 i t = 3 meseci na 40°C. C = interna IgG1 kontrola analize.
Slika 128: HP-SEC hromatogrami bispecifičnog antitela (puna), IgG1-7D8-K409R (isprekidana) i IgG1-2F8-F405L (tačkasa linija). Uslovi skladištenja su bili A: t = 0; B: t = 12 meseci na 2 - 8°C; C: t = 12 meseci na 25°C i D: t = 3 meseca na 40°C.
Slika 129: CIEX hromatogrami bispecifičnog antitela (puna), IgG1-7D8-K409R (isprekidana) i IgG1-2F8-F405L (tačkasta linija). Uslovi skladištenja su bili A: t = 0; B: t = 12 meseci na 2 - 8°C; C: t = 12 meseci na 25°C. (Napomena: razlika u retencionom vremenu materijala za t = 0 u poređenju sa t = 12 meseci može biti posledica malih promena u sastavu pufera i/ili upotrebe različitih serija kolona. Analiza interne IgG1 kontrole u svakom ciklusu je takođe pokazala pomak od 1.64 min za t = 12 meseci u poređenju sa t = 0, podaci nisu prikazani).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
[0031] Termin "imunoglobulin" se odnosi na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, pri čemu su sva četiri međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana. Pogledati za primer Fundamental Immunology, poglavlje 7 (Paul W., ur., 2. Izdanje, Raven Press, N.Y. (1989)). Ukratko, svaki teški lanac se uobičajeno sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Teški lanci su međusobno povezani preko disulfidnih veza u takozvanom "zglobnom regionu". Svaki laki lanac se uobičajeno sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. Uobičajeno je da se aminokiselinski ostaci u konstantnom regionu numerišu u skladu sa EU-indeksom, kao što je opisano u publikaciji Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Slika 16 daje pregled EU i Kabat numeracije za različite izotipske oblike antitela 2F8 (WO 02/100348). VH i VL regioni mogu biti dalјe podelјeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili po obliku strukturno definisanih petlјi), koji se takođe označavaju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL je obično sastavlјen od tri CDR i četiri FR sekvence koje su raspoređene, polazeći od amino kraja ka karboksilnom kraju, sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (pogledati takođe Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196, 901917 (1987)).
[0032] Kada se ovde upotrebljava, termin "Fab krak" se odnosi na jedan par teškog lanca i lakog lanca antitela.
[0033] Kada se ovde upotrebljava, termin "Fc region" ili "Fc domen" se odnosi na region antitela koji sadrži najmanje zglobni region, CH2 domen i CH3 domen (pogledati npr. Kabat EA, u US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, izd. 5. izdanje 662, 680, 689 (1991). Fc region može biti generisan digestijom antitela sa papainom, pri čemu je Fc region fragment koji se time dobija i koji uklјučuje dva CH2-CH3 regiona imunoglobulina i zglobni region. Konstantni domen teškog lanca antitela definiše izotip antitela, npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE. Fc-domen posreduje u efektorskim funkcijama antitela sa receptorima na površini ćelija koji se označavaju kao Fc receptori i sa proteinima sistema komplementa.
[0034] Predviđeno je da se termin "CH2 region" ili "CH2 domen", kako se ovde upotrebljava, odnosi na CH2 region imunoglobulina. Tako, na primer, CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 228-340 prema EU sistemu numeracije. Međutim, CH2 region takođe može biti bilo koji iz drugih izotipova antitela, kao što je ovde opisano.
[0035] Predviđeno je da se termin "CH3 region" ili "CH3 domen", kako se ovde upotrebljava, odnosi na CH3 region imunoglobulina. Tako, na primer, CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema EU sistemu numeracije. Međutim, CH3 region može takođe biti bilo koji iz drugih izotipova antitela, kao što je ovde opisano.
[0036] Termin "antitelo" (Ab) se, u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi na molekul imunoglobulina, fragment imunoglobulinskog molekula, ili derivat bilo kojeg od njih, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen u uobičajenim fiziološkim uslovima, sa poluživotom koji je tipa značajnih vremenskih perioda, kao što je najmanje oko 30 min, najmanje oko 45 min, najmanje oko jednog sata (h), najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko osam sati, najmanje oko 12 sati (h), oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko tri, četiri, pet, šest, sedam ili više dana itd. ili koji predstavlja bilo koji drugi relevantan, funkcionalno definisan period (kao što je vreme dovolјno da se indukuje, podstakne, pojača i/ili moduliše fiziološki odgovor koji prati vezivanje antitela za antigen, kao i/ili vreme dovolјno da antitelo regrutuje efektorsku aktivnost). Varijabilni regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela (At) mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući razne ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplementa kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije komplemenata. Antitelo može takođe biti bispecifično antitelo, dimerno antitelo ili sličan molekul. Termin "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje karakteriše specifičnost vezivanja za najmanje dva različita epitopa, obično epitope koji se ne preklapaju, ili antitelo koje sadrži dva različita mesta za vezivanje antigena. Kao što je prethodno naznačeno, termin antitelo ovde, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom, uklјučuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Takvi fragmenti mogu biti obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su enzimsko cepanje, sinteza peptida i tehnike rekombinantne ekspresije. Pokazano je da se funkcija vezivanja antigena u antitelu može vršiti fragmentima antitela pune dužine, npr. sa Fab ili F(ab')2 fragmentima. Takođe se podrazumeva da termin antitelo, ukoliko nije drugačije naznačeno, uklјučuje i poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAt), polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela. Antitelo koje je tako generisano može biti bilo kog izotipa.
[0037] Termin "antitelo pune dužine", kada se ovde upotrebljava, se odnosi na antitelo koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teških i lakih lanaca koji se normalno nalaze u antitelu tog izotipa.
[0038] Kako se ovde upotrebljava, "izotip" se odnosi na klasu imunoglobulina (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0039] Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela sa varijabilnim i konstantnim regionima izvedenim iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela pronalaska mogu uklјučivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. sadrže mutacije uvedene nasumučnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Ipak, nije predviđeno da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih vrsta sisara, poput miša, koje su ugrađene u humane uokvirujuće sekvence.
[0040] Kada se ovde upotrebljava, termin "antitelo tipa teškog lanca" ili "antitelo teškog lanca" se odnosi na antitelo koje se sastoji samo od teških lanaca i kome nedostaju laki lanci koji se uobičajeno nalaze u antitelima. Antitela teškog lanca, koja se prirodno javlјaju kod npr. kamila, mogu vezivati antigene uprkos tome što sadrže samo VH domene.
[0041] Termin "epitop" označava proteinsku determinantu koja je sposobna da se specifično veže za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i obično sadrže specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za drugonavedene, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može sadržavati aminokiselinske ostatke koji su direktno uklјučeni u vezivanje, ali i druge aminokiselinske ostatke koji nisu direktno uklјučeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani peptidom koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar površine preko koje se peptid vezuje za antigen).
[0042] Kako se ovde upotrebljava, termin "vezivanje", u kontekstu vezivanja antitela za predodređen antigen, obično podrazumeva vezivanje sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, npr.
10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje ili oko 10<-11>M ili čak manje, kada se ista određuje, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonancije (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu, upotrebom antigena kao liganda i antitela kao analita, pri čemu se antitelo vezuje za predodređen antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoja je najmanje deset puta niža, kao što je najmanje 100 puta niža, na primer najmanje 1000 puta niža, kao što je najmanje 10.000 puta niža, na primer najmanje 100.000 puta niža od njegovog afiniteta vezivanja za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein) koji je različit od predodređenog antigena ili blisko srodnog antigena. Količina za koju je afinitet niži zavisi od KDantitela, tako da kada je KDantitela veoma nizak (to jest, antitelo je visoko specifično), količina za koju je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifičan antigen može iznositi najmanje 10,000-puta. Termin "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena.
[0043] Kada se ovde upotrebljava, termin "heterodimerna interakcija između prvog i drugog CH3 regiona" se odnosi na interakciju između prvog CH3 regiona i drugog CH3 regiona u heterodimernom proteinu sa prvim CH3 i drugim CH3.
[0044] Kada se ovde upotrebljava, termin "homodimerne interakcije prvog i drugog CH3 regiona" se odnosi na interakciju između prvog CH3 regiona i drugog prvog CH3 regiona u homodimernom proteinu tipa prvi-CH3/prvi-CH3, kao i na interakciju između drugog CH3 regiona i još jednog drugog CH3 region u homodimernom proteinu tipa drugi-CH3/drugi-CH3.
[0045] "Izolovano antitelo", kako se ovde upotrebljava, označava da je materijal uklonjen iz svoje originalne sredine (npr. prirodne sredine, ukoliko se javlja u prirodi, ili iz ćelije domaćina, ukoliko je rekombinantno eksprimirano). Takođe je poželјno da su antitela u prečišćenom obliku. Termin "prečišćen" ne zahteva apsolutnu čistoću; prevashodno je predviđeno da termin podrazumeva relativnu definiciju, ukazujući na povećanje koncentracije antitela u odnosu na koncentraciju kontaminirajućih supstanci u kompoziciji kada se isti uporedi sa koncentracijom u polaznom materijalu.
[0046] Predviđeno je da se termin "ćelija domaćin", kako se ovde upotrebljava, odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor, npr. ekspresioni vektor koji kodira antitelo pronalaska. Rekombinantne ćelije domaćini uklјučuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, HEK293 ćelije, NS/0 ćelije i limfocitne ćelije.
[0047] Kada se ovde upotrebljava, termin "koekspresija" dva ili više konstrukata nukleinskih kiselina se odnosi na ekspresiju ova dva konstrukta u jednoj ćeliji domaćinu.
[0048] Termin "protein tumorske ćelije", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na protein koji se nalazi na ćelijskoj površini tumorske ćelije.
[0049] Kako se ovde upotrebljava, termin "efektorska ćelija" se odnosi na imunsku ćeliju koja je uklјučena u efektorsku fazu imunog odgovora, nasuprot fazama prepoznavanja i aktivacije imunog odgovora. Primeri imunskih ćelija uklјučuju ćelije mijeloidnog ili limfoidnog porekla, na primer limfocite (kao što su B ćelije i T ćelije, uklјučujući citolitičke T ćelije (CTL)), ćelije ubice, prirodne ćelije ubice, makrofage, monocite, eozinofile, polimorfonuklearne ćelije, kao što su neutrofili, granulociti, mastociti i bazofili. Pojedine efektorske ćelije eksprimiraju specifične Fc receptore i obavlјaju specifične imunske funkcije. U pojedinim primerima izvođenja, efektorska ćelija je sposobna da indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), kao što je prirodna ćelija ubica. U pojedinim primerima izvođenja, efektorska ćelija može fagocitirati cilјni antigen ili cilјnu ćeliju.
[0050] Termin "redukujući uslovi" ili "redukujuća sredina" se odnose na uslove koji su dovolјni da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu antitela.
[0051] Pozivanje na pozicije aminokiselina u predmetnom pronalasku je, ukoliko nije u suprotnosti sa kontekstom, u skladu sa EU-indeksom opisanim u publikaciji Kabata i saradnika, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
[0052] Termin "o/min" ili "obrt./min" se odnosi na obrtaje po minutu i može biti, u kontekstu predmetnog pronalaska, naznačen i kao o/min ili obrt./min.
[0053] Područje pronalaska je definisano u patentnim zahtevima.
Postupak predmetnog pronalaska i opisa
[0054] Predmetni opis se odnosi na in vitro postupak proizvodnje heterodimernog proteina koji obuhvata korake:
a) inkubiranje prvog homodimernog proteina sa drugim homodimernim proteinom u redukujućim uslovima koji su dovoljni da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu, a
gde navedeni prvi homodimerni protein sadrži Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni Fc region sadrži prvi CH3 region, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni Fc region sadrži drugi CH3 region i pri čemu su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da je heterodimerna interakcija između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jača od svake homodimerne interakcije navedenih prvih i drugih CH3 regiona,
b) podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza
Korak a) predmetnog opisa može alternativno obuhvatati korake:
z) obezbeđivanja prvog konstrukta nukleinske kiseline koji kodira prvi polipeptid koji sadrži prvi Fc region imunoglobulina, pri čemu prvi Fc region sadrži prvi CH3 region,
y) obezbeđivanja drugog konstrukta nukleinske kiseline koji kodira drugi polipeptid koji sadrži drugi Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni drugi Fc region sadrži prvi CH3 region,
pri čemu su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da su heterodimerne interakcije između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jače od svake od homodimernih interakcija navedenih prvih i drugih CH3 regiona, i
pri čemu navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i navedeni drugi homodimerni protein sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405 i 407.
i/ili
pri čemu su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona takve da su konstante disocijacije homodimernih interakcija svakog od CH3 regiona između 0,01 i 10 mikromola, kao što je između 0,05 i 10 mikromola, poželјnije između 0,01 i 5, kao što je između 0,05 i 5 mikromola, još poželјnije između 0,01 i 1 mikromola, kao što je između 0,05 i 1 mikromola, između 0,01 i 0,5 ili između 0,01 i 0,1, kada se ista određuje kao što je opisano u Primeru 21.
z) koekspresiju navedenog prvog i drugog konstrukta nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu.
[0055] U dodatnom primeru izvođenja, korak z) dalјe obuhvata koekspresiju jednog ili više konstrukata nukleinske kiseline koji kodiraju laki lanac u navedenoj ćeliji domaćinu.
[0056] Postupak predmetnog pronalaska je naročito pogodan kada se proizvode veće zapremine heterodimernog proteina.
[0057] Dakle, u određenom primeru izvođenja, korak b) može obuhvatati:
b) podvrgavanje najmanje 10 mL kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se omogući oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza.
[0058] U jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog opisa dalјe obuhvata korak dobijanja heterodimernog proteina, npr. postupak predmetnog opisa može sadržavati korak c):
c) dobijanje heterodimernog proteina.
[0059] U sledećem primeru izvođenja, korak a) predmetnog opisa može uključivati korake:
i) obezbeđivanje prvog homodimernog proteina koji sadrži Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni Fc region sadrži prvi CH3 region,
ii) obezbeđivanje drugog homodimernog proteina koji sadrži Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni Fc region sadrži drugi CH3 region,
pri čemu su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da su heterodimerne interakcije između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jače od svake homodimerne interakcije navedenih prvih i drugih CH3 regiona,
iii) inkubiranje navedenog prvog proteina zajedno sa navedenim drugim proteinom u redukujućim uslovima dovolјnim da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu.
[0060] Prvi i drugi homodimerni proteini mogu biti proizvedeni i/ili prečišćeni zajedno ili odvojeno. Na primer, ukoliko su prvi i drugi homodimerni protein proizvedeni ekspresijom u ćeliji domaćinu, prvi i drugi homodimerni protein mogu biti proizvedeni u istoj reakcionoj posudi, npr. istom bioreaktoru. Ukoliko se prvi i drugi homodimerni protein proizvodeni u istoj reakcionoj posudi, navedeni prvi i drugi homodimerni protein mogu biti proizvedeni u istoj ćeliji domaćinu ili u različitim ćelijama domaćinima. Alternativno, prvi i drugi homodimerni protein može biti proizveden u dve odvojene reakcione posude, npr. u dva odvojena bioreaktora. Ukoliko su prvi i drugi homodimerni proteini proizvedeni od strane različitih ćelija domaćina, takve ćelije domaćini mogu biti izvedene iz istih ili iz različitih tipova ćelija. Prednost proizvodnje u istoj reakcionoj posudi su ušteda troškova ili vremena ili iskorišćavanje prednosti upotrebe redoks enzima, kao što su citosolni tioredoksin 1 i 2 (TXN1 i TXN2), koji se oslobađaju iz ćelija domaćina koje eksprimiraju prvi i/ili drugi homodimerni protein pod određenim uslovima. Tako se, na primer, lizom velikog broja živih ćelija oslobađaju enzimi i kofaktori koji su potrebni za redukciju u kombinaciji sa veoma niskom koncentracijom kiseonika, odnosno koji dalje katalizuju redukciju disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu prvog i drugog homodimera proteina i na taj način olakšavaju razmenu teškog lanca u bioreaktoru ili u narednom koraku prikuplјanja proizvoda (Kao i saradnici, 2010, Biotechnol. Bioeng 107; 622-632). Stoga, u dodatnom primeru izvođenja, korak a) predmetnog pronalaska može biti izveden u istoj reakcionoj posudi u kojoj se odvija i proizvodnja prvog i/ili drugog homodimernog proteina. U sledećem primeru izvođenja, korak b) takođe može biti izveden u istom reakcionom sudu kao korak a) ili u istoj reakcionoj posudi kao i korak a) i proizvodnja prvog i/ili drugog homodimernog proteina. U ovom slučaju, kiseonik i dvovalentni joni metala koji su već prisutni u reakciji, takođe mogu stimulisati proces reoksidacije u koraku b).
[0061] Dodatno, uslovi proizvodnje prvog i/ili drugog homodimernog proteina mogu uključivati bilo koje od onih koji su ovde opisani u vezi sa korakom a). Proizvodnja prvog i drugog homodimernog proteina u odvojenim serijama može imati prednosti u pogledu kontrole (lakše se reprodukuje i/ili određuje kvalitet svakog homodimera) ili u situacijama kada se jedan od homodimera upotrebljava za stvaranje više različitih bispecifičnih antitela, kombinovanjem sa brojnim drugim homodimerima.
[0062] U daljem primeru izvođenja, prvi i/ili drugi homodimerni protein mogu biti prečišćeni pre inkubacije u koraku a). Postupci prečišćavanja homodimernih proteina uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hromatografiju sa proteinom A i proteinom G (ili druge načine afinitetne hromatografije), afinitetnu hromatografiju zasnovanu na npr. antitelima koja vezuju antigen ili na anti-idiotipskim antitelima, jonoizmenjivačku hromatografiju, hromatografiju zasnovanu na hidrofobnim interakcijama, kapa ili lambda selekciji, tioafinitetnu i hidroksiapatitnu hromatografiju i upotrebu drugih multimodalnih smola. Drugi postupci prečišćavanja uklјučuju, ali nisu ograničeni na, precipitaciju sa, na primer, solima ili polietilen glikolom da bi se dobio prečišćeni protein. Predviđena je i kombinacija različitih postupaka prečišćavanja.
[0063] Ukoliko se prvi i drugi homodimerni proteini proizvode odvojeno, prvi i drugi homodimerni proteini mogu takođe biti prečišćeni odvojeno.
[0064] U alternativnom primeru izvođenja, ukoliko se prvi i drugi homodimerni protein proizvode odvojeno, oni mogu biti prečišćeni zajedno, npr. prečišćavanjem uz upotrebu Proteina A. Prečišćavanje prvog i drugog homodimernog proteina zajedno, može obezbediti određenu operativnu i/ili ekonomičnu efikasnost.
[0065] Ukoliko se prvi i drugi homodimerni proteini proizvode zajedno, prvi i drugi homodimerni proteini mogu takođe biti prečišćeni zajedno, npr. prečišćavanjem sa Proteinom A.
[0066] Prečišćavanjem prvog i/ili drugog homodimernog proteina pre koraka a) je moguće ukloniti komponente koje mogu uticati na stopu ili obim jednog ili više koraka postupka; kao što je postupak redukcije i/ili razmene u koraku a) i/ili proces oksidacije u koraku b), ili postupaka koji mogu dodatno ili alternativno uticati na kvalitet heterodimernog proteina. Kao što je prethodno opisano, prvi i drugi homodimerni protein mogu biti proizvedeni odvojeno ili zajedno. Prema tome, ukoliko se prvi i drugi homodimerni proteini proizvode zajedno, navedeni prvi i drugi homodimerni protein mogu biti prevashodno prečišćeni zajedno. Ukoliko se prvi i drugi homodimerni protein proizvode odvojeno, prvi i/ili drugi homodimerni protein mogu biti prečišćen odvojeno ili zajedno, npr. kombinovanjem prvog i drugog homodimernog proteina i zatim njihovim prečišćavanjem.
[0067] U sledećem primeru izvođenja, prvi i/ili drugi homodimerni protein mogu biti prisutni u rastvoru ili puferu. Ukoliko, na primer, ovakav pufer nije optimalan za izvođenje procesa redukcije i razmene koji se odvijaju u koraku a), pufer može biti zamenjen drugim rastvorom ili puferom. Tako, u sledećem primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska može dalјe sadržavati korak zamene rastvora ili pufera tako da će prvi i/ili drugi homodimerni protein biti u drugačijem rastvoru ili puferu pre koraka a).
[0068] U sledećem primeru izvođenja, heterodimerni protein može biti prečišćen. Postupci prečišćavanja heterodimernog proteina mogu uklјučivati, ali nisu ograničeni na, bilo koji od onih koji su ovde opisani. Postupci koji su relevantni za prečišćavanje heterodimernog proteina uklјučuju, ali nisu ograničene na, hromatografiju sa Proteinom A i Proteinom G (ili druge načine afinitetne hromatografije), afinitetnu hromatografiju zasnovanu na npr. antitelima koja vezuju antigen ili na antiidiotipskim antitelima, jonoizmenjivačku hromatografiju, hromatografiju zasnovanu na hidrofobnim interakcijama, kapa ili lambda selekciji, tioafinitetnu i hidroksiapatitnu hromatografiju i upotrebu drugih mulitmodularnih smola. U drugim postupcima se tako, da bi se dobio prečišćeni protein, radije upotrebljava taloženje sa, na primer, solima ili polietilen glikolom, nego hromatografija.
[0069] Shodno navedenom, postupak predmetnog pronalaska može dalјe obuhvatati korak prečišćavanja heterodimernog proteina. Prečišćavanjem heterodimernog proteina je moguće ukloniti višak reagenasa poput redukujućeg agensa, kao i nečistoće. Prečišćavanje heterodimernog proteina može takođe uklјučivati uklanjanje prvog i/ili drugog rezidualnog homodimernog proteina. Kao što je opisano u nastavku teksta, višak bilo prvog ili drugog homodimernog proteina može biti upotrebljen u koraku a) da bi se olakšalo uklanjanje rezidualnog prvog i/ili drugog homodimernog proteina.
[0070] Korak prečišćavanja heterodimernog proteina može biti i između koraka a) i b), ali za većinu namena je uobičajeno da se on uvede nakon koraka b).
[0071] Ukoliko je prvi ili drugi homodimerni protein modifikovan, npr. prvi ili drugi CH3 region je modifikovan tako da se smanji ili eminiše vezivanje za Protein A ili Protein G, heterodimerni protein predmetnog pronalaska može biti specifično prečišćen hromatografijom sa Proteinom A ili Proteinom G. Mogu biti upotrebljeni i drugi postupci prečišćavanja, npr. u kombinaciji sa hromatografijom sa proteinom A i/ili proteinom G, pri čemu takvi drugi postupci uklјučuju, ali nisu ograničeni na, ili druge načine afinitetne hromatografije, afinitetnu hromatografiju zasnovanu na npr. antitelima koja vezuju antigen ili na anti-idiotipskim antitelima, kapa ili lambda selekciji, tioafinitetnu i hidroksiapatitnu hromatografiju i upotrebu multimodularnih smola. U drugim postupcima se tako, da bi se dobio prečišćeni protein, radije upotrebljava taloženje sa, na primer, solima ili polietilen glikolom, nego hromatografija.
[0072] Heterodimerni protein može, prečišćavanjem ili nakon prečišćavanja, biti formulisan tako da bude pogodan za skladištenje heterodimernog proteina, npr. u uslovima koja osiguravaju stabilnost heterodimernog proteina. Za heterodimerna antitela takva formulacija je uobičajeno tipa rastvora ili pufera. Alternativno, heterodimerni protein može biti osušen smrzavanjem.
[0073] Oprema koja je pogodna za proces postupka predmetnog pronalaska je dobro poznata stručnjaku. Ekspresija homodimernih antitela od strane ćelije domaćina može, na primer, uobičajeno biti izvedena u reakcionoj posudi kao što je bioreaktor. Koraci redukcije i oksidacije a) i b) se mogu, kao što je prethodno opisano, odvijati u istom bioreaktoru kao ekspresija prvog i/ili drugog homodimernog proteina ili se mogu odvijati u odvojenoj reakcionoj posudi. Slično tome, koraci redukcije i oksidacije a) i b) se mogu odvijati i u istoj reakcionoj posudi ili se mogu izvoditi u odvojenim reakcionim posudama. Ukoliko se koraci redukcije i oksidacije a) i b) odvijaju u istoj reakcionoj posudi, uslovi od koraka a) do koraka b) mogu biti promenjeni, kao što je ovde opisano. Reakcioni sud i sistem cevi koji je bitan za snabdevanje procesa mogu biti jednokratni ili se ponovo koristiti i napravlјeni od standardnih materijala (plastika, staklo, nerđajući čelik itd.). Reakciona posuda može biti opremlјena sa dodacima za mešanje, uduvavanje gasa u rastvor, uvođenje gasa u prostor gasne faze, dodacima za kontrolu temperature i/ili proces unutar posude može biti praćen upotrebom senzora (sondi) za merenje temperature, težine/zapremine, pH, rastvorenog kiseonika (DO) i redoks potencijala. Sve navedene tehnike su uobičajene u standardnim operativnim sistemima proizvodnog pogona i dobro su poznate stručnjacima.
[0074] Pojedinačni koraci postupka predmetnog pronalaska mogu biti izvedeni kao što je ovde opisano.
[0075] U jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska je postupak koji se odvija van ćelije. Kao što je prethodno opisano, može biti pogodno se proizvodnja prvog i drugog homodimernog proteina izvede ekspresijom u ćeliji domaćinu. Tako, koraci a), b) i c) mogu, u određenom primeru izvođenja, biti izvedeni van ćelije. U sledećem primeru izvođenja, korak a), korak b), korak c) i bilo koji koraci između bilo kog od koraka a), b) i c), kao i bilo koji naredni koraci mogu takođe biti izvedeni van ćelije.
Prvi i drugi homodimerni protein
[0076] Postupak predmetnog pronalaska može biti upotrebljen na mnogo načina, da bi se generisale želјene kombinacije heterodimernih proteina, a posebno je pogodan za proizvodnju bispecifičnih antitela u velikom obimu. Pored toga što je u stanju da kombinuje antitela koja cilјano deluju na različite antigene da bi se dobilo selektivno vezivanje, postupak može biti upotrebljen da se promeni želјena osobina antitela, npr. da se poveća CDC, kombinovanjem dva različita antitela koja cilјano deluju na isti antigen. Štaviše, postupak može biti upotrebljen za uklanjanje delimične agonističke aktivnosti antagonističkog antitela ili za konverziju agonističkog antitela u antagonističko antitelo, pripremom njegovog asimetričnog antitela sa irelevantnim (neaktivnim) antitelom.
[0077] U jednom primeru izvođenja, homodimerni proteini su izabrani iz grupe koja se sastoji od (i) Fc regiona, (ii) antitela, (iii) fuzionog proteina koji sadrži Fc region, kao što je Fc region fuzionisan sa receptorom, citokinom ili hormonom i (iv) Fc regiona koji je konjugovan sa prolekom, peptidom, lekom ili toksinom.
[0078] U pojedinim primerima izvođenja, navedeni prvi i/ili drugi homodimerni protein sadrže, pored Fc regiona, jedan ili više ili sve druge regione antitela, tj. CH1 region, VH region, CL region i/ili VL region. Tako, u jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein je antitelo pune dužine. U još jednom primeru izvođenja, navedeni drugi homodimerni protein je antitelo pune dužine.
[0079] U važnom primeru izvođenja, oba od navedenog prvog i drugog homodimernog proteina su antitela, poželјno antitela pune dužine koja vezuju različite epitope. U takvom primeru izvođenja, heterodimerni protein koji se proizvodi je bispecifično antitelo. Navedeni epitopi se mogu nalaziti na različitim antigenima ili na istom antigenu.
[0080] U drugim primerima izvođenja, međutim, samo jedan od homodimernih proteina je antitelo pune dužine, dok drugi homodimerni protein nije antitelo pune dužine, već npr. Fc region koji je eksprimiran zajedno sa drugom proteinskom ili peptidnom sekvencom poput receptora, citokina ili hormona, ili koji je konjugovan sa prolekom, peptidom, lekom ili toksinom. Ukoliko je prvi i/ili drugi homodimerni protein anantitelo, npr. antitelo pune dužine, ono može, u jednom primeru izvođenja, biti konjugovano sa prolekom, peptidom, lekom ili toksinom ili sadržavati akceptorsku grupu za iste. U sledećem primeru izvođenja, nijedan od homodimernih proteina nije antitelo pune dužine. Na primer, oba homodimerna proteina mogu biti Fc regioni koji su fuzionisani sa drugom proteinskom ili peptidnom sekvencom poput receptora, citokina ili hormona ili koji su konjugovani sa prolekom, peptidom, lekom ili toksinom. Navedeno može, na primer, biti upotrebljeno za proizvodnju heterodimernog proteina koji je konjugovan sa dva različita jedinjenja; npr. prolekovima, peptidima, lekovima ili toksinima, upotrebom u postupku predmetnog opisa prvog i drugog homodimernog proteina koji su konjugovani sa dva različita jedinjenja; npr. prolekovima, peptidima, lekovima ili toksinima. Navedeno takođe može biti relevantno u slučaju da proces ili hemija dodavanja leka nije kompatibilna sa dodavanjem drugog leka, kada se proces dodavanja svakog od dva leka prvom i drugom homodimernom proteinu, tim redom, može izvesti odvojeno, a pre postupka predmetnog opisa.
[0081] U jednom primeru izvođenja, Fc region prvog homodimernog proteina je sličan ili identičan sa Fc regionom koji je izveden iz ili koji je izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (sa izuzetkom barem mutacije/mutacija koje su ovde naznačene), dok je Fc region drugog homodimernog proteina takođe sličan ili identičan sa Fc regionom koji je izveden iz ili koji je izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (sa izuzetkom barem mutacije/mutacija koje su ovde naznačene). U poželјnom primeru izvođenja, Fc regioni i navedenog prvog i navedenog drugog homodimernog proteina su slični ili identični sa Fc regionom koji je izveden iz ili koji je IgG1 izotipa (sa izuzetkom barem mutacije/mutacija koje su ovde naznačene). U drugom poželјnom primeru izvođenja, jedan od Fc regiona navedenih homodimernih proteina je sličan ili identičan sa Fc regionom koji je izveden iz ili koji je izotipa IgG1, dok je drugi sličan ili identičan sa Fc regionom koji je izveden iz ili koji je IgG4 izotipa (sa izuzetkom barem mutacije/mutacija koje su ovde naznačene). U drugonavedenom primeru izvođenja, dobijeni heterodimerni protein sadrži Fc region IgG1 i Fc region IgG4 i stoga može imati interesantne intermedijerne karakteristike u pogledu aktivacije efektorskih funkcija. Sličan proizvod se može dobiti ukoliko navedeni prvi i/ili navedeni drugi homodimerni protein sadrži mutaciju koja uklanja akceptorsko mesto za glikozilaciju povezanu sa Asn ili je protein na drugi način izmenjen tako da su mu izmenjene osobine glikozilacije.
[0082] U sledećem primeru izvođenja, jedan ili oba homodimerna proteina su konstruisani tako da im se izmeni glikozilacija i time redukcija fukoze, odnosno da bi se pojačao ADCC, npr. dodavanjem jedinjenja u medijum kulture ćelija tokom proizvodnje homodimernog proteina, npr. antitela, kao što je opisano u US2009317869 ili kao što je opisano u van Berkel i saradnici (2010) Biotechnol. Bioeng.
105:350 ili upotrebom ćelija sa potpunom delecijom (enlg. knockout) FUT8, npr. kao što je opisano u Yamane-Ohnuki i saradnici (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. ADCC može alternativno biti optimizovan upotrebom postupka opisanog u Umaña i saradnici (1999) Nature Biotechnol 17:176. Alternativno, prvi i/ili drugi homodimerni protein mogu biti eksprimirani u ćeliji domaćinu koja ne vrši dodavanje fukoze, npr. Biowa/KHK.
[0083] U sledećem primeru izvođenja, jedan ili oba homodimerna proteina su konstruisani ili modifikovani tako da se pobolјša aktivacija komplemenata, npr. kao što je opisano u Natsume i saradnici (2009) Cancer Sci.100:2411.
[0084] U sledećem primeru izvođenja, jedan ili oba homodimerna proteina su genetički izmenjena tako da se smanji ili poveća vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn), a da bi se manipulisalo poluživotom heterodimernog proteina u serumu.
[0085] U sledećem primeru izvođenja, jedan od homodimernih polaznih proteina je genetički konstruisan ili modifikovan tako da se ne vezuje za Protein A ili Protein G ili kombinaciju Proteina A i G, čime se omogućava razdvajanje heterodimernog proteina od navedenog početnog homodimernog proteina, propuštanjem proizvoda kroz kolonu sa Proteinom A ili Proteinom G. Ovo može biti posebno korisno za primere izvođenja u kojima se kao početni materijal upotrebljava višak jednog homodimernog proteina u odnosu na drugi homodimerni protein. U takvim primerima izvođenja, može biti korisno konstruisati ili modifikovati mesto vezivanja za Protein A ili Protein G u homodimernom proteinu koji će biti upotrebljen u višku, tako da se poremeti njegova sposobnost da se vezuje za takve smole. Ovakav tip modifikacije uklјučuje, ali nije ograničen na, modifikacije u CH3 domenu koje su opisane u WO 2010/151792 koji je ovde naveden u listi referenci. Stoga, prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska može sadržavati jednu ili više modifikacija u CH3 domenu koje su opisane WO 2010/151792 i koje smanjuju ili eliminišu vezivanje IgG-a za Protein A. Tako, u posebnom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska može sadržavati modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od, ali nije ograničena na, a) 435R i b) 435R i 436F. U drugom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein može sadržavati sledeće mutacije: I253A, H310A i H435A (AAA), koje takođe eliminišu vezivanje za Protein A. Nakon reakcije heterodimerizacije, heterodimerni protein zatim može biti razdvojen od viška neizmenjenog homodimernog proteina propuštanjem kroz kolonu sa Proteinom A. Ukoliko se Protein G koristi za prečišćavanje heterodimernog proteina, prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska može sadržavati modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od, ali bez ograničenja na, I253, S254, H433 i N434 (Sloan D. i saradnici, Prot.Sci.1999; 8:1643-1648; Sauer-Eriksson E. i saradnici, Structure 1995; 3:265-278). Nakon reakcije heterodimerizacije, heterodimerni protein može potom biti razdvojen od viška neizmenjenog homodimernog proteina propuštanjem kroz kolonu sa Proteinom G. Drugi postupci prečišćavanja uklјučuju bilo koje od postupaka koji su ovde opisani. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, prvi i drugi homodimerni proteini mogu sadržavati različite lake lance, kao što su kapa i lambda laki lanci, ili prvi i drugi homodimerni proteini mogu biti različitih alotipova, kao što je ovde opisano.
[0086] U daljem primeru izvođenja, jedan od homodimernih proteina je (1) Fc region ili (2) antitelo pune dužine koje prepoznaje epitop koji nije relevantan.
[0087] Varijabilni regioni koji će biti upotrebljeni za homodimerni početni materijal predmetnog pronalaska mogu npr. biti proizvedeni postupkom hibridoma koga su prvi opisali Kohler i saradnici, Nature 256, 495 (1975), ili mogu biti proizvedeni postupcima rekombinantne DNK. Varijabilni regioni mogu takođe biti izolovani iz fagnih biblioteka antitela, upotrebom tehnike opisane u, na primer, Clackson i saradnici, Nature 352, 624628 (1991) i Marks i saradnici, J. Mol. Biol.222, 581597 (1991). Varijabilni regioni mogu biti dobijeni iz bilo kog pogodnog izvora. Tako, na primer, varijabilni regioni mogu biti dobijeni iz monoklonskih antitela hibridoma pripremlјenih od mišjih B ćelija slezine koje su dobijene iz miševa imunizovanih sa antigenom od interesa, na primer, u vidu ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja kodira antigen od interesa. Varijabilni regioni se takođe mogu dobiti iz monoklonskih antitela hibridoma izvedenih iz ćelija koje eksprimiraju antitela u imunizovanim ljudima i sisarima različitim od čoveka kao što su pacovi, psi, primati itd.
[0088] Prvi i/ili drugi homodimerni protein može biti npr. himerno antitelo ili humanizovano antitelo. U drugom primeru izvođenja, jedan ili oba polazna homodimerna proteina su, osim ukoliko je prisutna bilo koja specifična mutacija, humana antitela. Humana monoklonska antitela mogu biti generisana upotrebom transgenih ili transhromozomskih miševa, npr. HuMAb miševa ili TC miševa koji nose minihromozom koji kodira kompletan ili deo repertoara humanih teških i lakih lanaca. HuMAb miš sadrži humani imunoglobulinski genski minilokus koji kodira nerearanžirane humane imunoglobulinske sekvence teških (µ i y) i κ lakih lanaca, zajedno sa cilјanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanaca (Lonberg N. i saradnici, Nature 368, 856859 (1994)). Stoga, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjih IgM ili κ lakih lanaca, a uvedeni humani transgeni teških i lakih lanaca prolaze kroz promenu klase i somatske mutacije kako bi se generisalo humano IgG,κ monoklonsko antitelo visokog afiniteta kao odgovor na imunizaciju (Lonberg N. i saradnici (1994), navedeno prethodno; revijski pregled u Lonberg N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994), Lonberg N. i Huszar D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 136593 (1995) i Harding F. i Lonberg N., Ann. N.Y. Acad. Sci 764536546 (1995)). Priprema HuMAb miševa je detalјno opisana u Taylor L. i saradnici, Nucleic Acids Research 20, 62876295 (1992), Chen J. i saradnici, International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon i saradnici, J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor L. i saradnici, International Immunology 6, 579591 (1994), Fishwild D. i saradnici, Nature Biotechnology 14, 845851 (1996). Pogledati takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187. Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu biti upotrebljeni za generisanje hibridoma koji izlučuju humana monoklonska antitela u skladu sa dobro poznatim tehnikama.
[0089] Dalјe, humana antitela predmetnog opisa ili antitela predmetnog opisa iz drugih vrsta mogu biti identifikovana preko tehnologija direktnog kloniranja ili pripreme biblioteka, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kloniranje faga ili fagnu biblioteku, retrovirusnu biblioteku, ribozomsku biblioteku, sisarsku biblioteku i druge tehnike, a upotrebom postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike, pri čemu dobijeni molekuli mogu biti podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je afinitetno sazrevanje, pošto su takve tehnike takođe dobro poznate u oblasti tehnike.
[0090] U sledećem primeru izvođenja opisa, antitelo ili njegov deo, npr. jedan ili više do CDR segmenata se izvode iz vrste u okviru familije Camelidae, pogledati WO2010001251, ili iz vrste hrskavičavih riba, kao što je Ginglymostoma cirratum (engl. “nurse” ajkula) ili je antitelo tipa teškog lanca ili domena.
[0091] U jednom primeru izvođenja postupka opisa, navedeni prvi i drugi homodimerni proteini u koraku a) ili koji su obezbeđeni u koraku a) su prečišćeni. Postupci prečišćavanja homodimera mogu biti bilo koji od ovde opisanih, npr. bilo koji od onih koji su opisani u nastavku teksta.
[0092] U jednom primeru izvođenja, prvi i/ili drugi homodimerni protein je konjugovan sa lekom, prolekom ili toksinom ili sadrži akceptorsku grupu za iste. Takva akceptorska grupa može npr. biti aminokiselina koja se ne javlja u prirodi. U posebnom primeru izvođenja, prvi i drugi homodimerni protein mogu biti konjugovani sa različitim jedinjenjima ili sadržavati različite modifikacije, a rezultat je proizvodnja heterodimernog proteina koji sadrži oba jedinjenja ili modifikacije.
[0093] Kao što je prethodno opisano, sekvence prvog i drugog CH3 regiona polaznih homodimernih proteina su različite i takve da je heterodimerna interakcija između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jača od svake homodimerne interakcije navedenih prvih i drugih CH3 regiona.
[0094] U jednom primeru izvođenja, povećana jačina heterodimerne interakcije u poređenju sa svakom od homodimernih interakcija je posledica modifikacija CH3 drugačijih od uvođenja kovalentnih veza, cisteinskih ostataka ili naelektrisanih ostataka.
[0095] U većini primera izvođenja, proizvod opisa, heterodimerni protein, je visoko stabilan i ne podleže razmeni Fab kraka pod blago redukujućim uslovima in vitro ili, što je važnije, in vivo, nakon primene ljudskom biću ili životinji. Tako, u jednom primeru izvođenja, heterodimerna interakcija između navedenog prvog i drugog proteina u dobijenom heterodimernom proteinu je takva da se ne može desiti razmena Fab kraka sa 0,5 mM GSH u uslovima koji su opisani u Primeru 13.
[0096] U drugom primeru izvođenja, heterodimerna interakcija između navedenog prvog i drugog proteina u rezultujućem heterodimernom proteinu je takva da se ne odvija razmena Fab kraka in vivo, kod miševa, u uslovima koji su opisani u Primeru 14.
[0097] U drugom primeru izvođenja, heterodimerna interakcija između navedenog prvog i drugog proteina u rezultujućem heterodimernom proteinu je više od dva puta jača, kao što je više od tri puta jača, npr. više od pet puta jača od najjačih od dve homodimerne interakcije, npr. kada je isto određeno kao što je opisano u Primeru 30.
[0098] U sledećem primeru izvođenja, sekvence navedenog prvog i drugog CH3 regiona su takve da je konstanta disocijacije heterodimerne interakcije između navedenog prvog i drugog proteina u dobijenom heterodimernom proteinu ispod 0,05 mikromola (µM), pri čemu je ista ispitana kao što je opisano u Primeru 30.
[0099] U sledećem primeru izvođenja, sekvence navedenog prvog i drugog CH3 regiona su takve da su konstante disocijacije obe homodimerne interakcije iznad 0,01 µM, kao što je iznad 0,05 µM, poželјno između 0,01 i 10 µM, kao što je između 0,05 i 10 µM, još poželјnije između 0,01 i 5 µM, kao što je između 0,05 i 5 µM, još poželјnije između 0,01 i 1 µM, kao što je između 0,05 i 1 µM ili između 0,01 i 0,5 µM ili između 0,01 i 0,1 µM, kada su iste ispitane kao što je opisano u Primeru 21. Primeri izvođenja u kojima su početni homodimerni proteini relativno stabilni, mogu biti sa prednošću lakše proizvodnje velike količine polaznog proteina i npr. izbegavanja agregacije ili pogrešnog uvijanja.
[0100] U pojedinim primerima izvođenja, stabilan heterodimerni protein može biti dobijen uz visok prinos upotrebom postupka opisa koji se zasniva na dva polazna homodimerna proteina koji sadrže samo nekoliko, prilično evolutivno očuvanih, asimetričnih mutacija u CH3 regionima.
[0101] Dakle, u jednom primeru izvođenja, sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje nisu identične.
[0102] Aminokiselinski supstituenti mogu biti prirodne aminokiseline ili aminokiseline koje nisu prirodne. Primeri aminokiselina koje nisu prirodne su npr. opisani u Xie J i Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9:548-554 i Wang K. i saradnici, Chemistry & Biology (2009), 16: 323-336.
[0103] U jednom primeru izvođenja, aminokiseline su prirodne aminokiseline.
[0104] U jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein ne sadrži više od jedne aminokiselinske supstitucije u CH3 regionu i drugi homodimerni protein ne sadrži više od jedne aminokiselinske supstitucije u CH3 regionu u odnosu na protein divlјeg tipa, npr. u odnosu na CH3 region humanog IgG-a, kao što je humani IgG1.
[0105] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405, 407 i 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405, 407 i 409, pri čemu navedeni prvi homodimerni protein i navedeni drugi homodimerni protein nisu supstituisani na istim pozicijama.
[0106] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 366 i navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 368, 370, 399, 405, 407 i 409. U jednom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji 366 je izabrana od Arg, Lys, Asn, Gin, Tyr, Glu i Gly.
[0107] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 368, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 370, 399, 405, 407 i 409.
[0108] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 370, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 399, 405, 407 i 409.
[0109] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 399, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 405, 407 i 409.
[0110] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 405, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 407 i 409.
[0111] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 407, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405 i 409.
[0112] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405 i 407.
[0113] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona sadrže asimetrične mutacije, tj. mutacije na različitim pozicijama u dva CH3 regiona, npr. mutaciju na poziciji 405 u jednom od CH3 regiona i mutacija na poziciji 409 u drugom CH3 regionu.
[0114] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409. U sledećem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 409. U još dalјem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, Gly, His, Val i Ile na poziciji 409. U još dalјem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, His, Ile i Val na poziciji 409. U još dalјem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409.
[0115] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405. U sledećem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405.
[0116] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Arg, Ser, Thr ili Trp na poziciji 366. U sledećem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp ili Tyr na poziciji 366. U još daljem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ile i Val na poziciji 366.
[0117] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Leu ili Met na poziciji 368. U sledećem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Leu, Lys ili Met at položaj 368. U još daljem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val i Trp na poziciji 368. U još daljem primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Asp i Glu na poziciji 368.
[0118] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405 i 407.
[0119] U jednoj takvom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405. U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405. U dalјem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, Gly, His, Val i Ile na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, His, Ile i Val na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405.
[0120] U drugom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Arg, Ser, Thr ili Trp na poziciji 366, a drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405. U daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselina drugačija od Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp ili Tyr na poziciji 366, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ile i Val na poziciji 366, a drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 405. U još daljem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ile i Val na položaj 366, a drugi homodimerni protein sadrži Leu u poziciji 405.
[0121] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405 i Lys na poziciji 409. U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0122] U drugom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409. U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0123] U drugom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0124] U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409, Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0125] U dalјem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409, Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0126] U još daljem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409, Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0127] U drugom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0128] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0129] U drugom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Lys na poziciji 409 i: a) lie na poziciju 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0130] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Ile na poziciji 350, Thr na poziciji 370, Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0131] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407.
[0132] U drugom izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407.
[0133] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Gly, Leu, Met, Asn ili Trp na poziciji 407.
[0134] U drugom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln Arg, Ser ili Thr na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0135] U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu različitu od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0136] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Gly, Leu, Met, Asn ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0137] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0138] U drugom izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0139] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži Gly, Leu, Met, Asn ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0140] U još jednom primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Arg, Ser, Thr ili Trp na poziciji 366. U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Trp ili Tyr na poziciji 366.
[0141] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Leu ili Met na poziciji 368. U sledećem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe, Leu, Lys ili Met na poziciji 368. U još daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselina odabrana iz grupe koju čine Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp i Tyr na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži izabranu aminokiselinu iz grupe koju čine Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val i Trp na poziciji 368. U još daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, Gly, His, Val i Ile na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val i Trp na poziciji 368. U još daljem primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Arg, His, Val i Ile na poziciji 409, a navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Asp i Glu na poziciji 368. U još daljem primeru izvođenja, navedeni prvi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409 i navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Asp i Glu na poziciji 368.
[0142] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok drugi homodimerni protein sadrži
(i) aminokiselinu različitu od Phe, Leu i Met na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) aminokiselinu različitu od Asp, Cys, Pro, Glu ili Gln na poziciji 399.
[0143] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži Arg, Ala, His ili Gly na poziciji 409, dok drugi homodimerni protein sadrži
(i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg ili Tyr na poziciji 399.
[0144] U jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein sadrži Arg na poziciji 409, dok drugi homodimerni protein sadrži
(i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) Phe, His, Lys, Arg ili Tyr na poziciji 399.
[0145] Pored prethodno definisanih aminokiselinskih supstitucija, navedeni prvi i drugi homodimerni protein može sadržavati dodatne aminokiselinske supstitucije, delecije ili insercije u odnosu na protein divljeg tipa, npr. humane IgG, Fc sekvence.
[0146] U daljem primeru izvođenja, navedeni prvi i drugi CH3 regioni, osim ukoliko su prisutne definisane mutacije, sadrže sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 1 (IgG1m(a)):
SEQ ID NO: 1:
[0147] U daljem primeru izvođenja, navedeni prvi i drugi CH3 regioni, osim ukoliko su pristune definisane mutacije, sadrže sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 2 (IgG1m(f)):
SEQ ID NO: 2:
[0148] U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi i drugi CH3 regioni, osim ukoliko su prisutne definisane mutacije, sadrže sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 3 (IgG1m(ax)):
SEQ ID NO: 3:
[0149] Proizvodnja heterodimernih proteina predmetnim opisom podrazumeva da je heterodimerna interakcija između CH3 regiona prvog i drugog homodimernog proteina jača od svake homodimerne interakcije između navedenih prvih i drugih CH3 regiona. Ovaj efekat može prevashodno, kao što je prethodno opisano, biti dobijen primerima CH3 modifikacija prvog i/ili drugog homodimernog proteina koji su prethodno navedeni. Ipak, predviđeno je da prvi i/ili drugi homodimerni proteini koji sadrže mutacije drugačije od onih koji su ovde opisane takođe mogu biti upotrebljeni u postupku predmetnog pronalaska. Na primer, prvi i drugi homodimerni proteini mogu predstavljati pacovsko antitelo i mišje antitelo, kao što je opisano u Lindhofer i saradnici (1995) J Immunol 155:219 (pogledati iznad) ili takozvanu varijantu antitela sa strukturom “dugme-u-rupici”, kao što je opisano u US patentu 5,731,168 (pogledati iznad). Tako, u jednom primeru izvođenja predmetnog opisa, prvi i drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska mogu sadržavati pojedinačne ili dvostruke modifikacije tipa “dugme-u-rupici” koje su opisane u US 5,731,168.
[0150] Postupak predmetnog pronalaska takođe može biti upotrebljen za proizvodnju bispecifičnih antitela kao što je opisano u WO2011/143545.
[0151] Drugi pogodan primer prvog i drugog homodimernog proteina koji su korisni u predmetnom opisu uključuje one koji se zasnivaju na elektrostatičkim interakcijama između CH3 regiona prvog i drugog homodimernog proteina, kao što su oni opisani u WO 2009/089004. Ovakva tehnika se takođe može označiti kao elektrostatičko usmeravanje.
[0152] U pojedinim slučajevima, međutim, moguće je da je drugonavedene polazne homodimerne proteine teže proizvesti, zbog previše slabih homodimernih CH3-CH3 interakcija. Tako, mogu biti poželјne varijante koje su ovde opisane i sadrže mutacije na jednoj ili na više od pozicija 366, 368, 370, 399, 405, 407 i 409. Mogu biti poželјne i varijante koje su ovde opisane, a koje sadrže mutacije na jednoj ili na više od pozicija 350, 370, 405 i 409.
[0153] Sekvenca zglobnog regiona homodimernih polaznih proteina može varirati. Ipak, rezultujući heterodimerni protein može biti stabilniji u određenim uslovima ukoliko zglobni region nije sličan IgG4 i, poželјno, kada je sličan IgG1.
[0154] Tako, u jednom primeru izvođenja, ni navedeni prvi niti navedeni drugi homodimerni protein ne sadrži Cys-Pro-Ser-Cys sekvencu u zglobnom regionu (središnjem segmentu).
[0155] U daljem primeru izvođenja, oba od navedenog prvog i navedenog drugog homodimernog proteina sadrže Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu u zglobnog regiona (središnjem segmentu).
[0156] U mnogim primerima izvođenja, gde su prvi i navedeni drugi homodimerni proteini antitela, navedena antitela dalјe sadrže laki lanac. Kao što je prethodno objašnjeno, navedeni laki lanci mogu biti različiti, npr. mogu se razlikovati u sekvenci i svaki moće obrazovati funkcionalan domen za vezivanje antigena sa samo jednim od teških lanaca. U drugom primeru izvođenja, međutim, navedeni prvi i drugi homodimerni proteini su antitela tipa teškog lanca, kojima nije potreban laki lanac za vezivanje antigena, pogledati npr. Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446.
Korak a)
[0157] Kao što je prethodno opisano, korak a) postupka predmetnog pronalaska obuhvata inkubiranje navedenog prvog homodimernog proteina zajedno sa navedenim drugim homodimernim proteinom u redukujućim uslovima dovolјnim da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu. Termin "dovolјan" u kontekstu "redukujućih uslova dovolјnih da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu" može prevashodno biti u kontekstu omogućavanja odvijanja reakcije razmene Fab kraka. Prema tome, u posebnom primeru izvođenja, "redukujući uslovi dovolјni da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu" su uslovi koji rezultuju proizvodnjom više od 50% heterodimernog proteina, kao što je više od 60% heterodimernog proteina ili više od 70 % heterodimernog proteina ili više od 80% heterodimernog proteina ili više od 90% heterodimernog proteina ili više od 95% heterodimernog proteina ili više od 99% heterodimernog proteina ili više od 99,5% heterodimernog proteina, kao što je 100% heterodimernog proteina. Procenat heterodimernog proteina je u ovom kontekstu u vezi sa ukupnom količinom prvog homodimernog proteina, drugog homodimernog proteina i heterodimernog proteina. Količina ili procenat heterodimernog proteina može, na primer, biti izmeren upotrebom CIEX postupka, kao što je ovde opisano u primerima.
[0158] U kontekstu predmetnog pronalaska, predviđeno je da se navođenje "redukujućih uslova koraka a)" odnosi na "redukujuće uslove koji su dovolјni da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu". Primeri pogodnih uslova su ovde dati. Minimalni zahtevi za redukciju disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu se mogu razlikovati i zavise od početnih homodimernih proteina, prevashodno od tačne sekvence u zglobnom regionu. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, ostaci cisteina u zglobnom regionu mogu, nakon redukcije disulfidnih veza, postati npr. vezani za redukujući agens, kao što je 2-MEA, ili obrazovati disulfidne veze unutar lanca ili reagovati sa nevezanim cisteinskim ostacima.
[0159] Obrazovanje heterodimernog proteina u koraku a) se zasniva na redukciji disulfidnih veza u zglobnom regionu prvog i drugog homodimernog proteina i na razmeni Fc regiona navedenog prvog i drugog homodimernog proteina.
[0160] Stoga redukujući uslovi u koraku a) mogu dalјe omogućiti razmenu Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina, čime se proizvodi heterodimerni protein. Razmena Fc regiona dva prva ili dva druga homodimerna proteina se takođe može odvijati u koraku a) što će rezultovati obrazovanjem prvog ili drugog homodimernog proteina. Heterodimerna interakcija između CH3 regiona prvog i drugog homodimernog proteina je jača od svake homodimerne interakcije navedenih CH3 regiona. Bez da bude vezano za bilo koju teoriju, razmena Fc regiona heterodimernog proteina može time biti nefavorizovana u odnosu na razmenu Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina. Tako, korak a) može generalno rezultovati proizvodnjom više heterodimernog proteina nego bilo kog od prvog i drugog homodimernog proteina. Prema tome, rezultat postupka predmetnog pronalaska je u principu više od 50%, kao što je više od 60% ili više od 70% ili više od 80% ili više od 90% ili više od 95% ili više od 99% dobijenog proizvoda, tj. većinu ukupne količine prvog i drugog homodimernog proteina i heterodimernog proteina čini heterodimerni protein.
[0161] Prvi i drugi homodimerni protein mogu biti proizvedeni zajedno ili odvojeno, kao što je takođe prethodno opisano. Ukoliko su prvi i drugi homodimerni protein proizvedeni zajedno, korak a) se može odvijati u istom spremniku, npr. bioreaktoru, kao i proizvodnja prvog i drugog homodimernog proteina. Postupci proizvodnje prvog i drugog homodimernog proteina, kao što su antitela, su dobro poznati stručnjaku.
[0162] Koncentracija prvog homodimernog i drugog homodimernog proteina u koraku a) ne mora biti ista. U principu, nema ograničenja u pogledu koncentracije prvog i drugog homodimernog proteina, ali za većinu praktičnih primena, koncentracija svakog od prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) uobičajeno može biti u opsegu od 0,1 mg/mL do 100 mg/mL, kao što je opsega od 0,5-100 mg/mL ili opsega od 1-75 mg/mL ili opsega od 1-50 mg/mL. Ukupna koncentracija prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) može biti najmanje 0,25 mg/mL. Gornja granica je uglavnom posledica činjenice da u koncentracijama iznad 200 mg/mL proteina, rastvor može biti toliko viskozan da je njime teško manipulisati, ali i što se na ovaj način može dostići granica rastvorljivosti ili da stopa agregacije proteina bude previsoka. Stoga, ukupna koncentracija prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) uobičajeno može biti u opsegu od 0,2 mg/mL do 200 mg/mL, kao što je opsega od 0,5-100 mg/mL ili opsega od 1-50 mg/mL.
[0163] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, u koraku a) postupka može biti upotrebljen višak bilo prvog ili drugog homodimernog proteina. Ovo posebno može biti relevantno ukoliko, na primer, prvi homodimerni protein ima jak uticaj na bezbednost ili efikasnost proizvoda ili je teže razdvajanje od heterodimernog proteina nego od drugog homodimernog proteina ili obrnuto, ili je pak teže pojednostaviti ili olakšati prečišćavanje heterodimernog proteina koji je proizveden postupkom. Upotreba viška jednog od homodimernih proteina; tj. prvog ili drugog homodimernog proteina, može olakšati naknadno prečišćavanje heterodimernog proteina kao što je ovde opisano, pošto će to pokrenuti da se proces razmene u koraku a) približi kraju reakcije zbog ograničavajuće količine manje zastupljenog proteina. Stoga, kada prvi ili drugi homodimerni protein postane ograničenje, njegova većina će biti upotrebljena u koraku a), pa će naknadno prečišćavanje uglavnom podrazumevati razdvajanje heterodimernog proteina od homodimernog proteina koji je upotrebljen u višku, a ne razdvajanje od prvog i drugog homodimernog proteina. Dakle, upotreba viška prvog ili drugog homodimernog proteina u koraku a) se može prevashodno kombinovati sa upotrebom prvog i drugog homodimernog proteina koga karakterišu razlike koje olakšavaju prečišćavanje. Takve razlike uklјučuju one koje su ovde opisane, npr. nevezivanje za Protein A ili Protein G, različite lake lance i/ili različite alotipove. Upotreba količina prvog i drugog homodimernog proteina koje nisu ekvimolarne može biti poznata kao kontrolisan ne-ekvimolarni proces razmene (SNEEP) i može npr. biti izveden kao što je ovde opisano u Primeru 64.
[0164] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, odnos prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) može biti različit od 1:1, npr. odnos prvog i drugog homodimernog proteina može biti u opsegu od 1:1,03 do 1:2; kao što je opseg od 1:1,05 do 1:1,5 ili opseg od 1:1,1 do 1:1,5 ili opseg od 1:1,1 do 1:1,4; ili opseg od 1:1,15 do 1:1,35 ili opseg od 1:1,2 do 1:1,3.
[0165] Tako, u jednom primeru izvođenja, prvi i drugi homodimerni protein u koraku a) mogu biti upotrebljeni u višku od 5%-60% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina, kao što je višak od 15%-55% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina, npr. višak od 20%-55% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina ili višak od 30-50% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina ili, određenije, višak od 15%-35% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina, kao što je višak od 20%-30% bilo prvog ili drugog homodimernog proteina.
[0166] Prvi i drugi homodimerni proteini u koraku a) prevshodno mogu biti prisutni u rastvoru, kao što je pufer. Tako, u jednom primeru izvođenja, korak a) se izvodi u rastvoru kao što je pufer. Rastvor može biti pre svega vodeni rastvor. Pogodan pufer može biti onaj koji olakšava proces redukcije i razmene i koji ne utiče štetno na prvi i drugi homodimerni protein ili heterodimerni protein, npr. pufer u kome su prvi i drugi homodimerni proteini i heterodimerni protein stabilni. Pufer upotrebljen u koraku a) može biti isti kao pufer u kome su prvi i/ili drugi homodimerni proteini prisutni kao rezultat prethodnog koraka obrade, a da bi se manipulacija u procesu svela na minimum. Alternativno, to može biti različit pufer koji omogućava standardizovane uslove ili optimalnu redukciju. Na primer, prvi i/ili drugi homodimerni protein može biti prečišćen pre koraka a), a pufer ili rastvor može biti promenjen tokom prečišćavanja.
[0167] Primeri pogodnih pufera za korak a) uklјučuju, ali nisu ograničeni na, PBS (fosfatom puferisan fiziološki rastvor), DPBS (Dulbecco-ov fosfatom puferisani fiziološki rastvor), PBS Braun (primer 44), citratni pufer, acetatni pufer, histidinski pufer, fosfatni pufer ili Tris pufer. Specifični primeri takvih pufera obuhvataju one koji su opisani u primerima predmetnog pronalaska. Kao što je takođe pokazano u Primeru 43, izbor pufera može uticati na kinetiku obrazovanja heterodimernog proteina. Tako, u posebnom primeru izvođenja, Tris ili fosfatni pufer mogu biti upotrebljeni u koraku a) predmetnog pronalaska. Pufer upotrebljen u koraku a) može, na primer, biti fosfatni ili Tris pufer koji je ovde opisan u Primeru 43 ili može biti PBS pufer koji je ovde opisan u Primeru 53.
[0168] U jednom primeru izvođenja, pufer u koraku a) može biti pufer opsega od 1-100 mM, kao što je 1-50 mM pufer, ili pufer opsega od 1-25 mM ili opsega od 5-20 mM.
[0169] U jednom primeru izvođenja, pufer u koraku a) može sadržavati fosfat u opsegu od 1-100 mM, kao što je 1-50 mM fosfat, ili fosfat u opsegu od 1-25 mM ili u opsegu od 5-20 mM.
[0170] Vrednost pH u redukujućim uslovima koraka a) može biti u opsegu od pH 3-10, kao što je pH opsega 4-9 ili opsega pH 4,5-8,5. Kao što se može videti u Primeru 43, pH vrednost može uticati na kinetiku obrazovanja heterodimernog proteina. Tako, u posebnom primeru izvođenja, pH redukujućih uslova u koraku a) može biti u opsegu od pH 5-8, kao što je između pH 6-8 ili između pH 6,5-7,5, npr. pH može prevashodno biti oko 5,5 ili 6 ili 6,5 ili 7 ili 7,5 ili 7,8 ili 8.
[0171] Primeri pogodnih pufera uklјučuju one iz Primera 43, posebno one izabrane iz grupe koja se sastoji od 1) 1 x Dulbecco-ovog fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora (DPBS) sa: 8,1 mM natrijum fosfata (Na2HPO4-7H2O), 1,5 mM kalijum fosfata (KH2PO4), 138 mM natrijum hlorida (NaCl), 2,7 mM kalijum hlorida (KCl) pH 5,0; 2) 1 x DPBS pH 7,0; 3) 20 mM Tris-HCl, pH 7,8
[0172] U alternativnom primeru izvođenja, pufer u koraku a) može biti izabran iz grupe koju čine, ali bez ograničenja, a) 10 mM natrijum fosfat, 2 mM kalijum fosfat, 137 mM NaCl, pH 5,0; b) 10 mM natrijum fosfat, 2 mM kalijum fosfat, 137 mM NaCI, pH 7,0; c) 20 mM natrijum citrat, pH 4,9; d) 20 mM natrijum citrat, pH 6,0; i e) 20 mM Tris-HCI, 20 mM NaCl, pH 7,8,
[0173] U jednom primeru izvođenja, redukujući uslovi u koraku a) uključuju redukujući agens, npr. sulfhidrilni redukujući agens. Termini "redukujući agens" i "reduktans" mogu biti upotrebljavani naizmenično u kontekstu predmetnog pronalaska. Obično, redukujući uslovi u koraku a) uključuju dodavanje redukujućeg agensa, npr. sulfhidrilnog redukujućeg agensa. Redukujući agens može, na primer, biti izabran iz grupe koja se sastoji od, ali nije ograničen na: 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutation, tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein, D-cistein, beta-merkapto-etanol i njihove hemijske derivate, pri čemu je poželјno da je redukujući agens izabran iz grupe koju čine: 2-merkaptoetilamin, ditiotreitol, L-cistein, D-cistein i tris(2-karboksietil)fosfin. Stoga, redukujući agens može, u jednom primeru izvođenja, biti izabran iz grupe koju čine: 2-merkaptoetilamin (2-MEA), hemijski derivat 2-merkaptoetilamina (2-MEA), L-cistein i D-cistein. Preciznije, redukujući agens je 2-merkaptoetilamin (2-MEA) ili L-cistein ili D-cistein. Redukujući agens 2-merkaptoetilamin ima druga hemijska imena kao što je 2-MEA, dok cisteamin i takvi termini mogu biti upotrebljeni naizmenično u kontekstu predmetnog pronalaska. Termin 2-MEA se takođe koristi za označavanje 2-merkaptoetilamina-HCl koji se npr. koristi u primerima predmetnog pronalaska.
[0174] Izbor redukujućeg agensa, njegove koncentracije, kao i vremena inkubacije u koraku a) treba da budu takvi da se međulančane disulfidne veze u zglobnom regionu redukuju i da se omogući razmena Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina. Međutim, u isto vreme može biti prednost da se izbegne upotreba previše jakih uslova kao što su previsoke koncentracije redukujućeg agensa ili predugo vreme inkubacije npr. pošto isti mogu biti nepotrebni, a previše jaki uslovi mogu oštetiti prvi i/ili drugi homodimerni protein ili heterodimerni protein. Na optimalne uslove mogu uticati različiti parametri, kao što su temperatura, pH, koncentracija rastvorenog kiseonika, koncentracije homodimera, izbor pufera, prisustvo metala u tragovima i helatora, kao i izbor i koncentracija redukujućeg agensa.
[0175] Pogodna koncentracija redukujućeg agensa može biti u opsegu od 0,1 mM do 1 M. Ukoliko je redukujući agens 2-MEA, koncentracija obično može biti u opsegu od 10-500 mM, kao što je u opsegu od 25- 500 mM ili u opsegu od 40-350 mM ili u opsegu od 10-100 mM, npr. u opsegu od 25-100 mM ili u opsegu od 10-75 mM, npr. u opsegu od 25-75 mM ili u opsegu od 10-60 mM, npr. u opsegu od 25-60 mM ili u opsegu od 10-50 mM, npr. u opsegu od 25-50 mM, kao što je oko 10 mM ili oko 25 mM ili oko 30 mM ili oko 40 mM ili oko 50 mM. Ukoliko je redukujući agens L-cistein ili D-cistein, koncentracija obično može biti u opsegu od 10-500 mM, kao što je u opsegu od 10-400 mM ili u opsegu od 10-300 mM ili u opsegu od 10-200 mM ili u opsegu od 20-150 mM ili u opsegu od 20-125 mM ili u opsegu od 25-100 mM, kao što je oko 25 mM ili oko 50 mM ili oko 75 mM ili oko 100 mM.
[0176] U sledećem primeru izvođenja, korak a) podrazumeva inkubaciju tokom najmanje 15 minuta, kao što je najmanje 20 minuta ili najmanje 30 minuta ili najmanje 60 minuta ili najmanje 90 minuta, kao što je tokom od 15 minuta do 10 sati ili od 15 minuta do 6 sati ili od 15 minuta do 5 sati ili od 15 minuta do 4,5 sata ili od 15 minuta do 4 sata ili od 30 minuta do 10 sati ili od 30 minuta do 6 sati ili od 30 minuta do 5 sati ili 30 minuta do 4,5 sata ili od 320 minuta do 4 sata ili od 90 minuta do 10 sati ili od 90 minuta do 6 sati ili od 90 minuta do 5 sati ili od 90 minuta do 4,5 sata ili od 90 minuta do 4 sata, kao što je tokom 2-5 sati ili tokom 2-4,5 sati ili tokom 2-4 sata ili tokom 3-5 sati ili tokom 3-4,5 sati ili tokom 3-4 sata ili tokom 3,5-5 sati ili tokom 3,5-4,5 sati, npr. tokom približno 2 sata, 3 sata, 4 sata ili 5 sati. Kao što je prikazano u Primeru 45 i Primeru 53, redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu i razmena Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina, a da bi se proizveo heterodimerni protein, u datim uslovima su bili završeni u okviru 4 sata.
[0177] Optimalna temperatura u koraku a) može zavisiti od izbora redukujućeg agensa. Obično, temperatura može biti u opsegu od 2-45°C, kao što je opsega 2-10°C ili opsega 15-45°C ili opsega 20-40°C ili opsega 20-30°C ili opsega 30-40°C ili opsega tipa 22-39°C, kao što je opsega tipa 21-26°C ili 22-25°C, kao što je oko 25°C ili oko 37°C. U jednom primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju tokom najmanje 30 minuta na temperaturi od najmanje 20°C u prisustvu najmanje 25 mM redukujućeg agensa koji je izabran iz grupe koja se sastoji od 2-merkaptoetilamina, L-cisteina i D-cisteina. U jednom primeru izvođenja, redukujući uslovi koji omogućavaju kontrolisanu razmenu Fab kraka, tj. redukciju disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu prvog i drugog homodimernog proteina i naknadnu razmenu Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina, su opisani u kontekstu potrebnog redoks potencijala. Tripeptid glutation (GSH) je glavni tiol niske molekulske težine u ćelijama, a koji kontroliše redoks stanje tiol-disulfida koje je neophodno za normalnu redoks signalizaciju in vivo. Dinamika ćelijske redoks ravnoteže se postiže održavanjem tiol-disulfidnog statusa redukovanog GSH i njegovog oksidovanog oblika GSSG. Vrednosti redukcionog potencijala mogu biti izmerene kao što je opisano u Rost i Rapoport, Nature 201:185 (1964)) i Aslund i saradnici, J. Biol. Chem.272:30780-30786 (1997). Redoks potencijal Eh, koji uzima u obzir stehiometriju dva oksidovana GSH po GSSG, je kvantitativna mera redoks stanja. Ehse izračunava Nernstovom jednačinom (Jednačina 1): Eh= E0+ (RT/nF)ln ([GSSG (ox)]/[GSH (red)]<2>). E0je standardan potencijal za redoks par na definisanom pH, R je gasna konstanta, T je apsolutna temperatura, F je Faradejeva konstanta i n je broj pobuđenih elektrona. In vivo određen Eh za GSH/GSSG par je opsega od -260 do -200 mV (Aw T., News Physiol. Sci.18: 201-204 (2003)). Terminalno diferencirane ćelije tako održavaju Eh reda veličine od -200 mV, dok aktivne proliferišuće ćelije održavaju više redukovan Eh od približno -260 mV.
[0178] Standardni redoks potencijal za DTT je -330 mV (Cleland i saradnici, Biochemistry 3: 480-482 (1964)). Pokazano je da TCEP redukuje DTT u rastvoru i stoga ima negativniji redoks potencijal nego DTT. Precizna vrednost, međutim, nije prijavlјena. Redukujući uslovi koji su pogodni za korak a) predmetnog pronalaska mogu dakle biti opisani u kontekstu potrebnog redoks potencijala Eh, koji je optimalno ispod vrednosti koja se postiže u normalnim uslovima plazme in vivo i koji je iznad redoks potencijala koji redukuje disulfidne veze antitela izvan onih koje se nalaze u zglobnom regionu i koje su uklјučene u stvaranje disulfidnih veza između lanaca ili su uklјučene u disulfidne veze između lakog i teškog lanca.
[0179] Shodno navedenom, u jednom ili dodatnom primeru izvođenja, korak a) se izvodi u redukujućim uslovima sa redoks potencijalom koji se kreće ispod -50 mV, kao što je ispod -150 mV, poželјno između -150 i -600 mV, kao što je između -200 i -500 mV, poželјnije između -250 i -450 mV, kao što je između -250 i -400 mV, još poželјnije između -350 i -450 mV.
[0180] U jednom ili dodatnom primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju tokom najmanje 30 minuta, npr. 90 minuta, na temperaturi od najmanje 20°C u prisustvu najmanje 25 mM 2-merkaptoetilamina ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola ili u prisustvu najmanje 25 mM L- ili D-cisteina.
[0181] U jednom ili dodatnom primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju od najmanje 30 minuta, npr.90 minuta, na temperaturi od najmanje 20°C, pri pH od 5 do 8, kao što je na pH 7,0 ili pH 7,4, u prisustvu najmanje 25 mM 2-merkaptoetilamina ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola ili u prisustvu najmanje 25 mM L- ili D-cisteina.
[0182] U drugom ili dodatnom primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju od najmanje 30 minuta, npr. 90 minuta, na temperaturi od najmanje 20°C u prisustvu najmanje 25 mM 2-merkaptoetilamina ili u prisustvu najmanje 25 mM L- ili D-cisteina. Inkubacija može biti izvedena na pH od 6 do 8, kao što je na pH 7-8.
[0183] U sledećem primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju tokom 4-6 sati na temperaturi od 20-30°C u prisustvu 25-75 mM 2-merkaptoetilamina ili u prisustvu 25-100 mM L- ili D-cisteina. Inkubacija može biti izvedena na pH od 6 do 8, kao što je na pH 7-8.
[0184] U još dalјem primeru izvođenja, korak a) obuhvata inkubaciju tokom 5 sati na temperaturi od 25°C u prisustvu 50 mM 2-merkaptoetilamina ili u prisustvu 25-100 mM L- ili D-cisteina. Inkubacija može biti izvedena na pH od 6 do 8, kao što je na pH 7-8.
[0185] U jednom ili daljem primeru izvođenja, korak a) obuhvata dodavanje helatornog agensa metala, kao što je EDTA, EGTA ili limunska kiselina. Pronalazači predmetnog pronalaska su pokazali da kada se u koraku a) predmetnog pronalaska kao redukujući agens upotrebljava 2-MEA, dodavanje ili uklјučivanje EDTA u korak a) smanjuje stopu auto-oksidacije 2-MEA u ovom koraku, što se uočava kao smanjenje stope oksidacije (pogledati npr. primer 47 i 54). Bez vezivanja za bilo koju teoriju, navedeno može biti posledica prisustva jona metala u koraku a) koji se heliraju sa EDTA, a što može umanjiti auto-oksidaciju 2-MEA jonima metala. U principu, auto-oksidacija redukujućeg agensa troši redukujući agens što rezultuje efektivno nižom koncentracijom redukujućeg agensa. Tako se dodavanjem agensa za helaciju metala može povećati stopa redukcije disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu i/ili može biti potrebno manje redukujućeg agensa da bi se redukovale međulančane disulfidne veze u zglobnom regionu. Joni metala mogu npr. biti prisutni u rastvorima ili puferima upotrebljenim u reakciji i/ili oni mogu biti isprani sa opreme koja je upotrebljena za reakciju.
[0186] Primeri pogodnih agensa za helaciju metala koji se mogu biti dodati ili uklјučeni u korak a) uklјučuju, ali nisu ograničeni na, EDTA, EGTA i limunsku kiselinu.
[0187] Koncentracija agensa za helaciju metala zavisi od koncentracije jona metala u kompoziciji u koraku a) i na koje mogu npr. uticati komponente upotrebljene u koraku a). Međutim, relevantne koncentracije EDTA ili EGTA mogu biti u opsegu od 0,01 mM do 10 mM, kao što je opseg od 0,1 mM do 10 mM, kao što je opseg od 0,5 mM do 5 mM ili opseg od 1 mM do 5 mM, kao što je oko 1 mM ili oko 2 mM ili oko 3 mM ili oko 4 mM ili oko 5 mM.
[0188] Koncentracija kiseonika, npr. rastvorenog kiseonika, u koraku a) može takođe uticati na redukciju disulfidnih veza između lanaca i/ili razmenu Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina. Tako, u sledećem primeru izvođenja, redukujući uslovi u koraku a) podrazumevaju smanjenje količine kiseonika, npr. rastvorenog kiseonika koji je prisutan u koraku a), npr. količine kiseonika koji je rastvoren u kompoziciji koraka a).
[0189] Prisustvo kiseonika ili količine kiseonika, npr. rastvorenog kiseonika ili oksidansa, u kompoziciji u koraku a) može biti pod uticajem različitih faktora, kao što su prisustvo različitih jedinjenja ili mehaničkih efekata koji mogu smanjiti ili povećati prenos kiseonika iz vazduha u rastvor. Tako, u dalјem primeru izvođenja, korak a) predmetnog pronalaska uključuje ograničavanje brzine mešanja, ograničavanje procesa uduvavanja kiseonika, svođenje prenosa kiseonika iz prostora gasne faze komore na minimum ili bilo koju od njihovih kombinacija. U jednom primeru izvođenja, stopa mešanja može, na primer, biti između 50-200 o/min, kao što je između 75-150 o/min ili između 75-125 o/min, npr. oko 100 o/min. Stopa uvođenja gasa u isparljivu fazu prilikom direktnog uzorkovanja može, na primer, biti opsega od 5-25 mL/min, npr. opsega od 10-20 mL/min, npr. oko 15 mL/min.
[0190] Stopa prenosa kiseonika može biti određena Jednačinom 2 koja sledi:
gde,
OTR = stopa prenosa kiseonika (mM/h)
kla = koeficijent prenosa kiseonika (1/sat)
DO* = ravnotežna DO koncentracija (azot = 0%, vazduh = 100%, kiseonik = 500%)
DO = stvarna koncentracija rastvorenog kiseonika
s = rastvorlјivost kiseonika (približno 0,2 mM/100%)
[0191] Optimalan opseg prenosa kiseonika zavisi od tipa i koncentracije redukujućeg agensa.
[0192] U primeru 57, kao gas je upotrebljen azot i sistem DO je doveden na 0% pre reakcije razmene. Prema jednačini 2 sa DO* = 0 i DO = 0, OTR = 0 mM/h. Rezultat ovakvog stanja je odgovarajuća razmena.
[0193] U primeru 53, kao gasna faza je upotrebljen vazduh, tako da je DO* = 100%. U primeru 53 (uz mućkanje od 100 o/min) kla je iznosio 0,76/h. DO sistema je pao sa vrednosti zasićenja od 100% na vrednost stabilnog stanja od 0,2%. Stopa prenosa kiseonika ovog stanja prema jednačini 2 je tada iznosilo 0,15 mM/h. Rezultat ovakvog stanja je odgovarajuća razmena.
[0194] U primeru 55, kao gasna faza je upotrebljen vazduh, tako da je DO* = 100%. U primeru 55 (uz mućkanje od 400 o/min) kla je iznosio 4,0/h. DO sistema je pao sa vrednosti zasićenja od 100% na vrednost stabilnog stanja od 3%. Stopa prenosa kiseonika ovog stanja prema jednačini 2 je tada iznosila 0,78 mM/h. Rezultat ovakvog stanja je nekompletna redukcija i niska konverzija u heterodimerni proizvod.
[0195] Navedeni rezultati pokazuju da OTR od 0-0,15 mM/h obezbeđuje pogodne rezultate, dok OTR od 0,78 mM/h ili više obezbeđuje suboptimalne rezultate, a kada je kao redukujući agens upotrebljen 50 mM 2-MEA.
[0196] Ukoliko se za prenos kiseonika koristi vazduh, koeficijent prenosa kiseonika (kla) u koraku a) može biti manji od npr. 3/sat, kao što je manje od 2/sat ili manje od 1/sat ili manje od 0,90/sat ili manje od 0,80/sat, npr. manje od 0,76/sat, kao što je oko 0,76/sat.
[0197] Drugi način ograničavanja ili prečišćavanja od količine rastvorenog kiseonika u kompoziciji u koraku a), uklјučuje dodavanje inertnog gasa u korak a), kao što je azot, da bi se u kompoziciji zamenio kiseonik.
[0198] Tako, u dodatnom primeru izvođenja, redukujući uslovi u koraku a) uključuju premeštanje, prečišćavanje ili zamenu rastvorenog kiseonika u kompoziciji u koraku a) sa inertnim gasom, npr. azotom. Ovo može, na primer, biti postignuto uvođenjem azota u gasnu fazu i/ili uduvavanjem uz dovoljno mešanje.
[0199] Napredovanje redukcije disulfidnih veza u zglobnom regionu prvog i drugog homodimernog proteina može biti praćeno na osnovu redoks potencijala i/ili praćenjem koncentracije rastvorenog kiseonika. Načini ovakvog praćenja su dobro poznati stručnjaku iz ove oblasti i uklјučuju npr. različite tipove senzora, kao što su bilo koji od onih koji su ovde opisani ili upotrebljeni.
[0200] U alternativnom primeru izvođenja, korak a) može biti izveden prolaskom prvog i drugog heterodimernog proteina preko materijala koji sadrži redukujući agens. Primer takvog postupka može biti kolona koja sadrži redukujući agens, npr. kolona na kojoj je imobilisan redukujući agens npr. redukujući agens koji je ovde opisan, kao što je onaj opisan u Primeru 61.
[0201] Heterodimerni protein može zatim biti dobijen sa materijala, npr. elucijom sa kolone. Heterodimerni protein koji je dobijen ovim postupkom ne može sadržavati ili može sadržavati samo tragove redukujućeg agensa pošto je on vezan za materijal, npr. u koloni. Temperatura, koncentracija rastvorenog kiseonika, koncentracija prvog i drugog homodimernog proteina, redoks potencijal i pH mogu biti slični onima koji su prethodno opisani.
Korak b)
[0202] Postupak predmetnog pronalaska dalјe obuhvata korak:
b) podvrgavanja kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza.
[0203] U posebnom primeru izvođenja, korak b) predmetnog opisa obuhvata:
b) podvrgavanje najmanje 10 mL kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se omogući oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu i obrazovanje disulfidnih veza između lanaca.
[0204] Redukujući uslovi koraka a) su uzrok redukcije disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu prvog i drugog homodimernog proteina. Pored disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu, mogu postojati i druge disulfidne veze u prvom i/ili drugom homodimernom proteinu, kao što su disulfidne veze između teškog i lakog lanca antitela ili disulfidne veze unutar lanaca. Redukujući uslovi koraka a) mogu takođe prouzrokovati redukciju takvih drugih disulfidnih veza između i unutar lanaca u prvom i/ili drugom homodimernom proteinu.
[0205] Nakon razmene Fc regiona prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a), može biti korisno da se disulfidne veze u zglobnom regionu između prvog i drugog Fc regiona heterodimernog proteina i opciono drugih disulfidnih veza, ponovo obrazuju. Na taj način se dobija heterodimerni protein koji sadrži barem disulfidne veze u zglobnom regionu, a opciono i druge disulfidne veze na mestima sličnim onima koje postoje u prvom i/ili drugom homodimernom proteinu. Prisustvo takvih disulfidnih veza povećava stabilnost heterodimernog proteina.
[0206] Primer 41 pokazuje da je, nakon izmene pufera bispecifičnog antitela proizvedenog u koraku a) predmetnog pronalaska, bispecifično antitelo samo delimično reoksidovano. Tako, primer 41 ukazuje da uslovi u koraku a) u tom primeru nisu bili dovolјni za reoksidaciju disulfidnih veza u zglobnom regionu bispecifičnog antitela. Štaviše, primer 48 i primer 57 takođe pokazuju da, kada je koncentracija rastvorenog kiseonika smanjena njegovom zamenom putem dodavanja azota, je inhibirana i reoksidacija cisteina u antitelu do disulfidnih veza. Za oksidaciju cisteina u disulfidne veze, dva cisteina bi trebala da budu dovolјno blizu jedan drugome. Proces predmetnog pronalaska generalno rezultuje ponovnim prirodnim udruživanjem heterodimernog proteina. Tako, cisteini u npr. bispecifičnom antitelu koje je proizvedeno predmetnim postupkom mogu biti generalno pozicionirani kao u prvom i drugom antitelu (prvom i drugom homodimernom proteinu), tako da se disulfidne veze koje su prisutne u antitelima takođe obrazuju u bispecifičnim antitelima. U kontekstu predmetnog pronalaska, predviđeno je da se navođenje "uslova oksidacije u koraku b)" odnosi na "uslove oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu u disulfidne veze između lanaca". U dodatnom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) su dovolјni za obrazovanje svih relevantnih disulfidnih veza u heterodimernom proteinu; npr. i disulfidnih veza između i unutar lanaca.
[0207] U kontekstu predmetnog pronalaska, uslovi dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do disifidnih veza između lanaca označava da je obrazovano najmanje 80%, kao što je najmanje 85% ili najmanje 90% ili najmanje 95% ili najmanje 99% ili 100% disulfidnih veza između lanaca. Kao što je ovde opisano na drugom mestu, heterodimerni protein može sadržavati cisteinske ostatke sposobne da obrazuju disulfidne veze kako između tako i unutar lanca. Relevantan vremenski okvir za oksidaciju cisteina u disulfidne veze zavisi od npr. uslova proizvodnje i obično može biti u okviru od 48 sati, kao što je u okviru od 24 sata ili u okviru od 15 sati ili u okviru od 10 sati ili u okviru od 5 sati ili u okviru od 4 sata ili u okviru od 3 sata ili u okviru od 2 sata.
[0208] U svrhe industrijske proizvodnje, generalno se podrazumeva da je prednost povećati brzinu proizvodnje, ali uz izbegavanje nepovolјnog uticaja na proizvod. Primeri 55 i 56 ukazuju da povećanje količine kiseonika povećava stopu reoksidacije disulfidnih veza. Navedeno može biti posebno relevantno za proizvodnju većih zapremina heterodimernog proteina. Tako, postupak predmetnog pronalaska obuhvata korak b), odnosno podvrgavanje najmanje 10 mL kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza.
[0209] U sledećem primeru izvođenja, zapremina kompozicije dobijene u koraku a) koja se upotrebljava u koraku b) može iznositi najmanje 15 mL, kao što je najmanje 20 mL ili najmanje 25 mL ili najmanje 30 mL ili na najmanje 40 mL ili najmanje 50 mL ili najmanje 75 mL ili najmanje 100 mL ili najmanje 125 mL ili najmanje 150 mL ili najmanje 200 mL ili najmanje 250 mL ili najmanje 300 ili najmanje 350 mL ili najmanje 400 mL ili najmanje 450 mL ili najmanje 500 mL ili najmanje 550 mL ili najmanje 600 mL ili najmanje 650 mL ili najmanje 700 mL ili najmanje 750 mL ili najmanje 800 mL ili najmanje 850 mL ili najmanje 900 mL ili najmanje 950 mL ili najmanje 1 L ili najmanje 2 L ili najmanje 3 L ili na najmanje 4 L ili najmanje 5 L ili najmanje 10 L. U principu, ne postoji gornja granica, posebno ukoliko se proces odvija kao kontinuirani proces. Ipak, za mnoge uslove procesa, odgovarajuća reakciona posuda za ovu vrstu proizvodnje može biti veličine od 1 L do 10.000 L.
[0210] U jednom ili dodatnom primeru izvođenja, koncentracija heterodimernog proteina u kompoziciji dobijenoj u koraku a), npr. koja se upotrebljava u koraku b), može iznositi najmanje 0,1 mg/mL, kao što je najmanje 0,2 mg/mL ili najmanje 0,3 mg/mL ili najmanje 0,4 mg/mL ili najmanje 0,5 mg/mL ili najmanje 0,75 mg/mL ili najmanje 1 mg/mL ili najmanje 1,5 mg/mL ili najmanje 2 mg/mL ili najmanje 3 mg/mL ili najmanje 4 mg/mL ili na najmanje 5 mg/mL ili najmanje 10 mg/mL ili najmanje 15 mg/mL ili najmanje 16 mg/mL ili najmanje 20 mg/mL. Gornja granica koncentracije heterodimernog proteina može biti između 100-200 mg/mL, kao što je oko 100 mg/mL ili oko 150 mg/mL ili oko 200 mg/mL. Tako, koncentracija heterodimernog proteina u kompoziciji dobijenoj u koraku a) može u jednom primeru izvođenja biti opsega od 0,1-200 g/L, kao što je opseg od 1-100 g/L. Predmetni opis nije ograničen na određene koncentracije heterodimernog proteina, međutim, kada je koncentracija proteina (bilo da je to prvi ili drugi homodimerni protein ili heterodimerni protein) previsoka, kompozicija može postati nestabilna ili previše viskozna, što otežava rad sa njom i/ili može doći do obrazovanja agregata. Nasuprot tome, previše niske koncentracije heterodimernog proteina mogu biti ekonomski neizvodlјive.
[0211] Količina kiseonika koja je neophodna, npr. snabdevanja u koraku b), a da bi se dobili uslovi oksidacije dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu u disulfidne veze između lanaca, zavisi od različitih faktora. Takvi faktori uklјučuju npr. zapreminu kompozicije koja je dobijena u koraku a), koncentraciju heterodimernog proteina, broj disulfidnih veza koje zahtevaju oksidaciju i koncentraciju kiseonika u kompoziciji koja je dobijena u koraku a), a koja može zavisiti od npr. rastvorlјivost kiseonika u puferu, specifičnog rastvora ili pufera koji se koristi, pH, jonske snage, temperature, pritiska i koncentracije kiseonika u okruženju. Podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije koraka b) predmetnog opisa može povećati stopu oksidacije cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca. U principu, količina kiseonika u koraku b) koja je dovolјna ili neophodna za oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca može biti ili je približno 0,5 molova kiseonika (O2) po molu disulfidne veze, npr. u opsegu je od 0,25-0,75 molova kiseonika (O2) po molu disulfidne veze, kao što je 0,3-0,7 molova kiseonika (O2) po molu disulfidne veze. Navedeno odgovara jednom molu kiseonika (O2) na dva mola cisteina, kao što je opseg 0,6-1,4 molova kiseonika (O2) na dva mola cisteina. Tako, u jednom primeru izvođenja, "oksidujući uslovi" u koraku b) obuhvataju 0,3-0,7 molova kiseonika po molu disulfidne veze, kao što je 0,5 mola prisutnog kiseonika po molu disulfidne veze ili opseg od 0,6-1,4 molova kiseonika na dva mola cisteina, npr.1 mol kiseonika na dva mola cisteina.
[0212] Otuda relevantna koncentracija kiseonika za dobijanje navedenog odnosa kiseonika i disulfidnih veza ili cisteina zavisi od koncentracije heterodimernog proteina u kompoziciji dobijenoj u koraku a).
[0213] U jednom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) mogu podrazumevati koncentraciju od najmanje 0,05 mM kiseonika, kao što je najmanje 0,075 mM kiseonika ili najmanje 0,1 mM kiseonika ili najmanje 0,125 mM kiseonika ili najmanje 0,15 mM kiseonika ili najmanje 0,175 mM kiseonika ili najmanje 0,2 mM kiseonika.
[0214] Molekulska rastvorlјivost kiseonika je 0,206 mM u morskoj vodi, na 1 atm, 25°C. Međutim, u uslovima predmetnog postupka, npr. u odgovarajućim puferima, na određenoj temperaturi itd., koncentracija kiseonika u kompoziciji dobijenoj u koraku a) može biti manja od 0,2 mM.
[0215] Pošto rastvorlјivost kiseonika zavisi od parcijalnog pritiska kiseonika u gasnoj fazi, povećanje prenosa kiseonika se može postići povećanjem pritiska vazduha u sistemu. Na primer, dvostruko povećanje pritiska dovodi do dvostrukog povećanja ravnotežne koncentracije rastvorenog kiseonika i povećane stope prenosa kiseonika. Alternativno, parcijalni pritisak kiseonika u gasnoj fazi može biti povećan upotrebom kiseonika umesto vazduha. Pošto vazduh sadrži približno 21% kiseonika, upotreba čistog kiseonika obezbeđuje približno pet puta veću ravnotežnu koncentraciju rastvorenog kiseonika i povećanu stopu prenosa kiseonika. Pritisak i čisti kiseonik se mogu kombinovati da bi se povećala rastvorlјivost kiseonika i stopa prenosa.
[0216] U jednom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) uključuju zasićenje kompozicije dobijene u koraku a) sa kiseonikom.
[0217] Kompozicija dobijena u koraku a) u principu sadrži male količine kiseonika, da bi se obezbedila pravilna redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu. Prema tome, može biti neophodno snabdevanje kiseonikom u koraku b) postupka predmetnog pronalaska.
[0218] U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi homodimerni protein mogu, kao što je prethodno opisano, biti prisutni u rastvoru, kao što je pufer. Tako, kompozicija dobijena u koraku a) može, u posebnom primeru izvođenja, biti rastvor, npr. pufer. U ovom primeru izvođenja, količina kiseonika koja je rastvorena u rastvoru, tj. koncentracija rastvorenog kiseonika, je važna za oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu.
[0219] Stoga, u jednom primeru izvođenja, "uslovi oksidacije u koraku b)" se odnose na kontrolu nivoa rastvorenog kiseonika, koja može npr. obuhvatati povećanje količine ili koncentracije rastvorenog kiseonika u kompoziciji dobijenoj u koraku a).
[0220] Različiti načini dobijanja ili stvaranje uslova oksidacije u koraku b) mogu biti upotrebljeni u postupku predmetnog pronalaska i uklјučuju, ali nisu ograničeni na, one koji su ovde opisani.
[0221] U jednom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) predmetnog pronalaska obuhvataju dodavanje kiseonika. Termin "dodavanje kiseonika", u kontekstu predmetnog pronalaska, treba shvatiti kao povećanje količine kiseonika, npr. rastvorenog kiseonika, u kompoziciji dobijenoj u koraku a), tako da je dovolјna da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Načini ili postupci dodavanja kiseonika uklјučuju, ali nisu ograničeni na, mehaničke načine, promenu rastvora ili pufera kompozicije dobijene u koraku a) u rastvor pufera koji sadrži veću količinu kiseonika, kao što je jedan od pufera koji se upotrebljava za dijafiltraciju koja je ovde opisana ili razblaživanje rastvora ili pufera kompozicije dobijene u koraku a) sa rastvorom ili puferom koji sadrži dovolјno kiseonika, kao i dodavanje jedinjenja sposobnih da proizvode kiseonik, povećavanje pritiska ili direktno dodavanje ili uključivanje kiseonika, npr. gasa kiseonika. Kombinacije takvih postupaka takođe mogu biti upotrebljene.
[0222] Količina ili koncentracija kiseonika u koraku b) može biti merena, npr. kontinuirano, kako bi se osiguralo da ima dovolјno kiseonika u svakom trenutku tokom koraka b). Postupci ili oprema za merenje kiseonika su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti i mogu, na primer, uklјučivati bilo koje od onih koji su ovde opisani kao što su senzori opisani u Primeru 44.
[0223] Kiseonik može biti dodati u korak b), na primer, uduvavanjem kiseonika ili vazduha ili povećanjem pritiska. Drugi postupak može biti povećanje prenosa kiseonika iz okoline, npr. iz vazduha. Navedeno može, na primer, biti urađeno mehaničkim putem, npr. mešanjem, mućkanjem, povećanjem pritiska ili stvaranjem protoka. Na primer, ukoliko je kompozicija u koraku b) prisutna u spremniku, kao što je posuda, kiseonik može npr. biti prenet u kompoziciju iz koraka b) iz npr. prostora gasne faze ili mogu biti primenjeni načini mućkanje ili mešanje kompozicije koraka b). Kontrolom stope mućkanja ili mešanja kompozicije u koraku b), stopa prenosa kiseonika iz okoline može biti takođe kontrolisana, tj. što je veća stopa mućkanja ili mešanja ili protok, više kiseonika može biti preneto u kompoziciju dobijenu u koraku a). Može se primeniti i način koji podrazumeva povećanje pritiska. Dodavanje kiseonika u korak b) može takođe biti izvedeno kombinacijom različitih načina uvođenja kiseonika, na primer, mućkanje i/ili mešanje se može kombinovati sa uduvavanjem i/ili povećanjem pritiska kiseonika ili vazduha kompozicije u koraku b).
[0224] U drugom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) predmetnog pronalaska uključuju oksidujući agens. Oksidujući agens je poželјno onaj koji je u stanju da obezbedi oksidaciju disulfidnih veza između lanaca u heterodimernom proteinu, ali i onaj kojim se istovremeno izbegava oksidacija drugih delova heterodimernog proteina, kao što su aminokiseline poput metionina i triptofana, za koje je poznato da su osetljive na oksidaciju. Primer pogodnog oksidujućeg agensa je dehidroaskorbinska kiselina (dhAA). Ukoliko se dhAA koristi za oksidaciju redukujućeg agensa prisutnog u koraku a), uobičajene koncentracije dhAA mogu biti opsega od 1-2 puta u odnosu na koncentracije redukujućeg agensa, npr. opsega od 50-100 mM. Ukoliko se redukujući agens koji je prisutan u koraku a) ukloni pre dodavanja dhAA, količina oksidujućeg agensa koja je dovolјna da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca može biti niža, kao što je u opsegu od 0,01-1 mM, npr. 0,1-1 mM. Ukoliko se oksidujući agens, kao što je dhAA, dodaje u koraku b) predmetnog pronalaska, on može biti naknadno uklonjen upotrebom standardnih tehnika filtriranja i/ili hromatografije.
[0225] Različiti načini ili postupci dodavanja ili povećanja kiseonika u koraku b) mogu biti upotrebljeni u kombinaciji.
[0226] Na primer, nezavisno od toga kako se dodaje kiseonik, npr. produvavanjem sa kiseonikom, mešanjem, mućkanjem ili stvaranjem protoka, on može, u jednom primeru izvođenja, biti kombinovan sa dodavanjem oksidujućeg agensa.
[0227] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, redukujući uslovi u koraku a) podrazumevaju redukujući agens, koji takođe može biti prisutan u kompoziciji dobijenoj u koraku a) i time podvrgnut uslovima oksidacije u koraku b). Prisustvo redukujućeg agensa u koraku b) može biti štetno za uslove oksidacije u koraku b). Prema tome, u jednom primeru izvođenja, heterodimerni protein može biti razdvojen od redukujućeg agensa. Kao što je opisano u nastavku teksta, pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da određeni postupci razdvajanja redukujućeg agensa od heterodimernog proteina rezultuju ili stvaraju uslove za oksidaciju koji su dovoljni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu u disulfidne veze između lanaca.
[0228] Uklanjanje redukujućeg agensa ili razdvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa, ne mora nužno biti dovolјno, u zavisnosti od postupka, da bi se omogućila oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca, naročito ne kada se velike količine heterodimernog proteina tj. visoke koncentracije i/ili velike zapremine heterodimernog proteina, proizvode u koraku a) (pogledati npr. primere 41, 52 i 53). Međutim, može biti korisno iz drugih razloga da se heterodimerni protein razdvoji od redukujućeg agensa. Postupak predmetnog opisa može stoga dalјe sadržavati korak razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa. Primeri izvođenja za razdvajanje redukujućeg agensa od heterodimernog proteina su dalje opisani u tekstu koji sledi.
[0229] Drugi postupak za smanjenje količine redukujućeg agensa u kompoziciji dobijenoj u koraku a) je da se poveća zapremina navedene kompozicije, čime se smanjuje koncentracija redukujućeg agensa u kompoziciji koja je dobijena u koraku a). Tako se, u dalјem primeru izvođenja, zapremina kompozicije koja je dobijena u koraku a) može povećati, npr. dodavanjem istog pufera kao što je pufer u kome se nalazi kompozicija dobijena u koraku a), s time da on ne sadrži redukujući agens iz koraka a), ili dodavanjem pufera različitog od pufera kompozicije koja je dobijena u koraku a), a koji ne sadrži redukujući agens iz koraka a). Povećanje zapremine kompozicije dobijene u koraku a) može biti upotrebljeno u kombinaciji sa drugim primerima izvođenja koji su ovde opisani, uklјučujući postupke za razdvajanje redukujućeg agensa i heterodimernog proteina.
[0230] Dodavanje kiseonika i/ili oksidansa u kompoziciju u koraku b), kao što je prethodno opisano, može biti dovolјno da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Štaviše, ukoliko korak a) sadrži redukujući agens, ovi uslovi mogu takođe biti dovolјni za oksidaciju redukujućeg agensa, tako da on ne može dalјe redukovati međulančane disulfidne veze heterodimernog proteina. Prema tome, u dalјem primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) su dovolјni da se omogući oksidacija redukujućeg agensa u koraku a). Na primer, ukoliko se kao redukujući agens u koraku a) koristi 2-MEA, uslovi oksidacije u koraku b) mogu biti takvi da se 2-MEA auto-oksiduje, tako da ne može redukovati nikakve disulfidne veze (pogledati npr. Primer 59). Nezavisno od toga da li je redukujući agens oksidovan ili ne, može biti od značaja da se naknadno heterodimerni protein razdvoji od redukujućeg agensa. Tako, u sledećem primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska može takođe uklјučivati odvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa. Postupci razdvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa uklјučuju bilo koje od onih koji su ovde opisani, npr. u nastavku teksta. Razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa može biti deo koraka b) ili može biti poseban korak.
[0231] Prema tome, u jednom primeru izvođenja, korak b) uklјučuje dodavanje kiseonika ili oksidujućeg agensa i opciono, naknadno odvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa. Odvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa može takođe biti izvedeno kao poseban korak, nakon koraka b).
[0232] Dodavanje kiseonika i/ili oksidujućeg agensa u koraku b) može takođe dovesti do oksidacije redukujućeg agensa, dok cisteini u heterodimernom proteinu nisu potpuno oksidovani u disulfidne veze. U ovom slučaju, heterodimerni protein može biti odvojen od redukujućeg agensa, a zatim cisteini heterodimernog proteina mogu biti naknadno oksidovani do međulančanih disulfidnih veza, npr. kao što je prethodno opisano, dodavanjem kiseonika i/ili oksidujućeg agensa. Tako, korak b) može, u jednom primeru izvođenja, obuhvatiti podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se oksiduje redukujući agens i, dalje, razdvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa i podvrgavanje heterodimernog proteina uslovima dovolјnim da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Oksidacija redukujućeg agensa i cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza, se može uraditi ili izvesti na sličan način, npr. kao što je prethodno opisano, dodavanjem kiseonika i/ili oksidujućeg agensa. Međutim, mogu postojati neke razlike u pogledu količine potrebnog kiseonika, vremena inkubacije itd. za oksidaciju redukujućeg agensa i oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Postupci razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa uklјučuju, ali nisu ograničeni na, bilo koje od onih koji su opisani u nastavku teksta, npr. dijalizu, taloženje, hromatografiju ili filtraciju. Stoga, u jednom primeru izvođenja, korak b) može obuhvatiti podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) hromatografiji, npr. hromatografiji na koloni ili filtraciji, npr. dijafiltraciji, kao što je tangenciijalna protočna filtracija ili filtracija normalnim protokom. Postupci izvođenja hromatografije ili filtracije uklјučuju, ali nisu ograničeni na, bilo koje od onih koje su opisane u nastavku teksta.
[0233] U još jednom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) mogu biti takvi da se cisteini heterodimernog proteina oksiduju u međulančane disulfidne veze istovremeno sa razdvajanjem heterodimernog proteina i redukujućeg agensa. U ovom slučaju, korak b) predmetnog pronalaska može obuhvatati dodavanje kiseonika i/ili oksidujućeg agensa, kao što je prethodno opisano, istovremeno sa razdvajanjem heterodimernog proteina i redukujućeg agensa. Stoga, u jednom primeru izvođenja, postupak ili uslovi razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa mogu dovesti do ili omogućiti oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Tako, korak b) može, u jednom primeru izvođenja, obuhvatati razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa. Postupci razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa uklјučuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od onih koji su opisani u nastavku teksta, npr. dijalizu, taloženje, hromatografiju ili filtraciju. Stoga, u jednom primeru izvođenja, korak b) može obuhvatati podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) hromatografiji, npr. hromatografiji na koloni, ili filtraciji, npr. dijafiltraciji, kao što je tangencijalna protočna filtracija ili filtracija normalnim protokom. Postupci izvođenja hromatografije ili filtracije uklјučuju, ali nisu ograničeni na, bilo koje od onih koji su opisani u nastavku teksta.
[0234] U još jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog opisa može obuhvatiti razdvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa i naknadno podvrgavanje heterodimernog proteina uslovima oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina do disulfidnih veza između lanaca u heterodimernom proteinu. U ovom primeru izvođenja, korak razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa se može smatrati posebnim korakom pre koraka b) ili se može smatrati delom koraka b). Postupci razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa uklјučuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od onih koji su opisani u nastavku teskta, npr. dijalizu, taloženje, hromatografiju ili filtriranje. Uslovi oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina do disulfidnih veza između lanaca u heterodimernom proteinu, se mogu postići kao što je prethodno opisano, npr. dodavanjem kiseonika i/ili oksidujućeg agensa u kompoziciju koja sadrži heterodimerni protein.
[0235] Postupci razdvajanja heterodimernog proteina od redukujućeg agensa mogu u principu biti bilo koji postupci koji vode ili su u stanju da razdvoje ova dva bez oštećenja heterodimernog proteina. Takvi postupci uklјučuju, ali nisu ograničeni na, dijalizu, taloženje, hromatografiju ili filtraciju. Razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa može biti izvedeno kao kontinuiran proces ili može biti izvedeno kao serijski proces.
[0236] Kompozicija dobijena u koraku a) koja sadrži heterodimerni protein može pre svega biti rastvor, kao što je pufer. Razdvajanje heterodimernog proteina od redukujućeg agensa može takođe biti urađeno zamenom pufera ili rastvora kompozicije dobijene u koraku a), sa drugim puferom ili rastvorom bez redukujućeg agensa. Sa izuzetkom prisustva redukujućeg agensa, pufer ili rastvor može biti zamenjen istim puferom ili rastvorom kao što je onaj u kome je kompozicija dobijena iz koraka a) ili može biti zamenjen sa drugim puferom ili rastvorom, kao što je pufer ili rastvor koji je pogodan za naredne korake ili za konačno formulisanje heterodimernog proteina. Rastvor ili pufer koji se izmenjuje sa rastvorom ili puferom u kome je kompozicija dobijena u koraku a), može, u jednom primeru izvođenja, takođe sadržavati kiseonik, npr. rastvoren kiseonik ili oksidujući agens. Stoga, razmena ili razblaživanje rastvora ili pufera kompozicije dobijene u koraku a), u koraku b), može stvoriti "uslove oksidacije koji su dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza". Uslovi oksidacije u koraku b) se mogu, kao što je prethodno opisano, postići na različite načine; npr. dodavanjem kiseonika ili oksidujućeg agensa, uklanjanjem redukujućeg agensa (razdvajanjem heterodimernog proteina i redukujućeg agensa), mehaničkim načinima, npr. hromatografijom ili filtracijom, i/ili zamenom pufera ili rastvora kompozicije dobijene u koraku a) u pufer ili rastvor koji sadrži veće količine kiseonika ili oksidujućeg agensa. "Veće količine kiseonika" u ovom kontekstu podrazumevaju one koje se porede sa količinom kiseonika koja je prisutna u puferu ili rastvoru kompozicije dobijene u koraku a). Zamena pufera ili rastvora kompozicije dobijene u koraku a) se može, na primer, izvesti hromatografijom ili filtracijom. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska obuhvata korak zamene rastvora, npr. pufera, kompozicije dobijene u koraku a) hromatografijom ili filtracijom.
[0237] Zamena rastvora ili pufera kompozicije dobijene u koraku a) može npr. biti urađena sa najmanje 3 (tri) zapremine pufera ili rastvora bez redukujućeg agensa. U principu, ne postoji gornja granica za broj zapremina koje mogu biti zamenjene, ali za većinu praktičnih namena može biti zamenjeno 3-12 zapremina pufera ili rastvora, kao što je opseg od 4-11 zapremina ili opseg od 4-10 zapremina ili opseg od 5-10 zapremina, npr.5, 6, 7, 8, 9 ili 10 zapremina koje mogu biti dovolјne za adekvatno smanjenje koncentracije redukujućeg agensa ili uklanjanja redukujućeg agensa iz kompozicije dobijene u koraku a).
[0238] Razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa hromatografijom ili filtracijom može uklјučivati zamenu rastvora ili pufera, tj. zamenu pufera ili rastvora koja je prethodno opisana.
[0239] Pogodan primer hromatografskog postupka razdvajanja heterodimernog proteina i redukujućeg agensa može, u posebnom primeru izvođenja, biti hromatografski postupak zasnovan na vezivanju i eluciji. Termin "vezivanje i eluiranje" ili "vezivanje i elucija" se zasniva na vezivanju bilo redukujućeg agensa ili heterodimernog proteina za hromatografski materijal, pri čemu se druga komponenta ne vezuje. Komponenta koja se ne vezuje za hromatografski materijal može biti prikupljena tokom protoka i koraka ispiranja, dok se vezani materijal može prikupiti odvojeno nakon promene uslova pufera tako da se eluira komponenta sa kolone. Postoje različiti hromatografski postupci, a najpogodniji od njih zavisi od izbora redukujućeg agensa i heterodimernog proteina. Pogodni primeri uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hromatografiju sa Proteinom A i Proteinom G (ili druge načine afinitetne hromatografije), afinitetnu hromatografiju zasnovanu na npr. antitelima koja vezuju antigen ili na anti-idiotipskim antitelima, kapa ili lambda selekciji, kao i katjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, multimodalnu hromatografiju, npr. hidroksiapatitnu, jonoizmenjivačku, na bazi hidrofobnih interakcija, afinitetnu hromatografiju sa imobilisanim metalom i tiofilnu apsorpcionu hromatografiju.
[0240] U jednom primeru izvođenja, hromatografija može biti hromatografija na koloni. Hromatografija može, kao što je prethodno opisano, uklјučiti zamenu pufera ili rastvora kompozicije dobijene u koraku a) sa drugim puferom ili rastvorom bez redukujućeg agensa. Navedeno može, na primer, uključivati zamenu pufera ili rastvora u opsegu od 3-12 zapremina. Postupci hromatografije se često izvode kao serijski procesi, tako da, ukoliko se heterodimerni protein i redukujući agens razdvajaju hromatografijom, u jednom primeru izvođenja, isti se može izvesti kao serijski proces.
[0241] Kao što je prethodno opisano, heterodimerni protein i redukujući agens mogu takođe biti razdvojeni filtracijom. Pogodan primer postupka filtracije je dijafiltracija. Pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da uslovi dijafiltracije mogu biti dovolјni da se omogući oksidacija cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca, čak i kada se koriste velike zapremine kompozicije dobijene u koraku a) (pogledati npr. Primer 41). Prema tome, razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa dijafiltracijom može biti izvedeno istovremeno sa oksidacijom cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza. Tako, korak b) predmetnog pronalaska može, u posebnom primeru izvođenja, obuhvatati dijafiltraciju kompozicije dobijene u koraku a). Dijafiltracija može uklјučivati najmanje tri zapremine zamene pufera ili rastvora, kao što je prethodno opisano. Postupci dijafiltracije uklјučuju tangencijalnu protočnu filtraciju (TFF) i filtraciju normalnim protokom (NFF), od kojih obe mogu biti upotrebljene u postupku predmetnog pronalaska. I TFF i NFF mogu biti izvedene kao kontinuirani procesi ili kao serijski procesi. Tako, u jednom primeru izvođenja, korak b) predmetnog pronalaska obuhvata podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) jednom od sledećih postupaka: kontinualnoj TFF, serijskoj TFF, kontinualnoj NFF ili serijskoj NFF.
[0242] Različiti postupci dijafiltracije su poznati stručnjaku. Za potrebe predmetnog pronalaska, dijafiltracija može biti npr. izvedena upotrebom membrane sa graničnom vrednošću opsega od 10-50 kDa, npr.20-40 kDa, kao što je oko 30 kDa. Membrana može, na primer, biti napravlјena od materijala kao što su polietarsulfon (PES), modifikovani polietarsulfon (mPES), regenerisana celuloza (RC), triacetat celuloze (CTA), hidrofilizovani poliviniliden difluorid (PVDF), nitroceluloza ili najlon. Konfiguracija membrane može npr. biti tipa šupljih vlakana, ravnog lista ili namotane spirale.
[0243] U jednom primeru izvođenja, za dijafiltraciju može biti upotrebljena patrona sa šupljinama, kao što je patrona sa vlaknima. Površina patrone sa šupljinama utiče na stopu dijafiltracije, tj. što je veća površina veća je i stopa dijafiltracije. Stopa dijafiltracije se može npr. izmeriti kao L/sat. Površina može biti opsega od 0,05-1 m<2>, npr. opsega od 0,05-0,5 m<2>, kao što je oko 0,1 m<2>ili oko 0,16 m<2>ili oko 0,4 m<2>.
[0244] Ulazni pritisak u patronu može biti opsega od 10-40 psig (70-280 kPa), a poželјno je opsega od 20-30 psig (140-210 kPa).
[0245] Termin "psig" se odnosi na funte po kvadratnom inču iznad atmosferskog pritiska, a korelacija sa jedinicom Pa (Paskal) je 101,325 Pa = 14,7 psig.
[0246] Termin "PSI" se odnosi na funte po kvadratnom inču.
[0247] Dijafiltracija može biti izvedena u vremenskom periodu potrebnom za izvođenje zamena relevantnog broja zapremina pufera/rastvora. Pogodan vremenski period u procesu dijafiltracije zavisi od npr. površine membrane, tipa membrane, koncentracije heterodimernog proteina, pritiska sistema, stope cirkulisanja, geometrije patrone sa filterom, temperature, viskoznosti rastvora, zapremine koja se filtrira i količine taloženja na filteru koje je prouzrokovano rastvorom. Obično, dijafiltracija može biti izvedena tokom između 30 minuta i 20 sati.
[0248] U jednom primeru izvođenja, dijafiltracija može biti izvedena kruženjem kompozicije kroz patronu sa šupljim vlaknima koja je sa graničnom vrednošču opsega od 10-50 kDa, kao i sa površinom koja je u opsegu od 0,05-1 m<2>i sa ulaznim pritiskom u patronu opsega od 70-280 kPa, dok se ne izvrši zamena od jedne do sedam, kao što je od tri do sedam ili od pet do sedam ili sedam zapremina pufera.
[0249] U jednom primeru izvođenja, dijafiltracija može biti izvedena cirkulisanjem kompozicije kroz modifikovanu polietarsulfonsku patronu sa šupljim vlaknim od 30 kDa, površine 0,1 m<2>, sa ulaznim pritiskom u patronu od 25 PSI (170 kPa), što rezultuje protokom permeata od 25 mL/min dok se ne izvrši zamena pet do sedam, kao što je sedam (7) zapremina pufera.
[0250] U jednom primeru izvođenja, dijafiltracija može biti izvedena cirkulisanjem kompozicije kroz modifikovanu polietarsulfonsku patronu sa šupljim vlaknima od 30 kDa, površine 0,4 m<2>, sa ulaznim pritiskom u patronu od 25 PSI (170 kPa), što rezultuje protokom permeata od 100 mL/min dok se ne izvrši zamena pet do sedam, kao što je sedam (7) zapremina pufera.
[0251] U jednom primeru izvođenja, dijafiltracija može biti izvedena cirkulisanjem kompozicije kroz modifikovanu polietarsulfonsku patronu sa šupljim vlaknima od 30 kDa, površine od 0,16 m<2>, sa ulaznim pritiskom u patronu od 25 PSI (170 kPa), što rezultuje protokom permeata od 100 mL/min dok se ne izvrši zamena pet do sedam, kao što je sedam (7) zapremina pufera.
[0252] Vršenje filtracije kao kontinuiranog procesa u principu podrazumeva dodavanje pufera ili rastvora u sistem istom brzinom kao i uklanjanja permeata, čime se količina rastvora/pufera u sistemu održava konstantnom. Prema tome, u kontekstu predmetnog pronalaska, navedeno bi podrazumevalo da se u koraku b), pufer/rastvor dodaje kompoziciji koja je dobijena u koraku a) sa istom brzinom kao što se uklanja permeat. Heterodimerni protein može biti prikupljen iz rententata. Izvođenje hromatografije ili filtracije kao serijskih procesa u postupku predmetnog pronalaska, može, s druge strane, uobičajeno uključivati koncentrovanje heterodimernog proteina koji je prisutan u kompoziciji dobijenoj u koraku a) uz uklanjanje rastvora kompozicije dobijene u koraku a). Alternativno, kompozicija dobijena u koraku a), koja sadrži heterodimerni protein, može biti razblažena i zatim koncentrovana hromatografijom ili filtracijom. Koncentrovani heterodimerni protein može, ukoliko se proces ponovi više od jednog puta, naknadno biti ponovo razblažen u puferu ili rastvoru pre ponavlјanja koraka hromatografije ili filtracije.
[0253] U jednom primeru izvođenja, kompozicija dobijena u koraku a) može biti razblažena pre razdvajanja redukujućeg agensa i heterodimernog proteina.
[0254] U jednom primeru izvođenja, razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa hromatografijom ili filtracijom, npr. dijafiltracijom se može izvesti jednom.
[0255] U pojedinim primerima izvođenja, razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa hromatografijom ili filtracijom može biti ponovljeno dva ili više puta, npr. sa različitim korakom između. Tako, u jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska može sadržavati korake I)-III). U posebnom primeru izvođenja, korak b) predmetnog opisa može obuhvatati korake I)-III):
I) razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa kompozicije dobijene u koraku a),
II) inkubiranje kompozicije dobijene u koraku I) koja sadrži heterodimerni protein,
III) razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa kompozicije dobijene u koraku II).
[0256] Razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa ne mora biti potpuno u koraku I), tako da kompozicija koja sadrži heterodimerni protein dobijen u koraku I) može još uvek sadržavati redukujući agens.
[0257] Razdvajanje heterodimernog proteina i redukujućeg agensa u koracima I) i III) se može izvesti postupkom koji je ovde opisan, kao što je prethodno opisano. Navedeno se može prevashodno izvesti dijafiltracijom. Uslovi hromatografije i filtracije koji su prethodno opisani takođe mogu biti primenjeni na korak I) i III). Inkubacija heterodimernog proteina dobijenog u koraku I), u koraku II), može npr. biti urađena tokom perioda od 1 sata do 10 dana ili od 1 sata do 5 dana ili od 1 sata do 3 dana ili od 1 sata do 48 sati, kao što je period od 5-24 sata ili 8-18 sati, a na temperaturi opsega od 10-45°C, npr. u opsegu 15-40°C ili u opsegu 15-35°C ili u opsegu 20-40°C ili u opsegu 20-35°C. U daljem primeru izvođenja, inkubacija heterodimernog proteina koji je dobijen u koraku I) u koraku II) može biti izveden tokom perioda od 1 do 24 sata i na temperaturi u opsegu od 15-40°C.
[0258] U daljem primeru izvođenja, korak I) može obuhvatati dijafiltraciju kompozicije dobijene u koraku a). Tako, u još dalјem primeru izvođenja, koraci I), II) i III) mogu obuhvatati:
I) dijafiltraciju kompozicije dobijene u koraku a)
II) inkubaciju retentata dobijenog u koraku I)
III) dijafiltraciju kompozicije dobijene u koraku II).
[0259] U sledećem primeru izvođenja, dijafiltracija u koracima I) i/ili III) može obuhvatati i zamenu pufera, kao što je zamena u odsegu 3-12 zapremina pufera.
[0260] U još dalјem primeru izvođenja, korak II) uključuje inkubaciju na temperaturi u opsegu 15-35°C tokom perioda od 12-48 sati.
[0261] Kao što je prikazano u Primeru 45, ponavlјanje razdvajanja heterodimernog proteina i redukujućeg agensa može, u pojedinim uslovima, npr. u zavisnosti od uslova redukcije u koraku a), pomoći u obezbeđivanju potpune reoksidacije cisteina u heterodimernom proteinu do disulfidnih veza između lanaca i/ili dalјe svođenju količinu redukujućeg agensa u kompoziciji koja sadrži heterodimerni protein na minimum.
[0262] Pronalazači predmetnog pronalaska su dalјe otkrili da prisustvo EDTA, helatornog agensa metala (pogledati Primere 49), dovodi do smanjenja stope oksidacije cisteina u homodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza, pri čemu se u primeru zapravo homodimerni protein upotrebljava kao primer heterodimernog proteina. Slično je naime uočeno i za heterodimerni protein (Primer 54). Navedeno tako ukazuje da prisustvo jona metala u koraku b) povećava stopu oksidacije cisteina u heterodimernom proteinu do međulančanih disulfidnih veza, barem u poređenju sa situacijom u kojoj nema prisutnih jona metala. Tako, u dalјem primeru izvođenja, korak b), npr. uslovi oksidacije u koraku b), mogu podrazumevati jon metala. Jon metala može biti dodat kompoziciji dobijenoj u koraku a), u koraku b), ili može biti prisutan u kompoziciji dobijenoj u koraku a), npr. izborom pufera ili rastvora u koraku a). Prema tome, u jednom primeru izvođenja, uslovi oksidacije u koraku b) obuhvataju dodavanje jona metala. Čak i ukoliko je jon metala već prisutan u kompoziciji dobijenoj u koraku a), mogu biti dalje dodati joni metala u ili tokom koraka b), naročito ukoliko je koncentracija jona metala tako niska da može biti ograničavajuća za stopu oksidacije cisteina u heterodimernom proteinu u međulančane disulfidne veze ili ukoliko je prisutan agens helacije metala. Primeri pogodnih jona metala su pre svega dvovalentni joni prelaznih metala, kao što je bakar, npr. u obliku bakar sulfata, mangan, gvožđe, nikl, magnezijum i kobalt. Pogodno je da joni metala budu prisutni u ili dodati u koncentraciji opsega od 0,01-100 ppm ili 0,1-100 µM. Bakar može biti dodat u korak b) kao npr. bakar sulfat.
[0263] Dodavanje dvovalentnog prelaznog metala, npr. bakra, npr. u obliku bakar sulfata, može posebno biti dodato ukoliko je agens helacije metala prisutan u koraku a) postupka. Bakar sulfat može funkcionisati kao katalizator oksidacije sa kiseonikom.
[0264] Pronalazači predmetnog pronalaska su takođe otkrili da redoks potencijal u koraku b) utiče, pre svega, na stopu, ali i donekle na obim prinosa, reoksidacije cisteina u heterodimernom proteinu u međulančane disulfidne veze. Pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da ponovna oksidacija međulančanih disulfidnih veza između teških lanaca počinje na približno -350 mV, dok se veze između teških i lakih lanaca obrazuju na približno -280 mV. Potpuno obrazovanje svih disulfidnih veza u heterodimernom proteinu se generalno dešava kada je redoks potencijal veći od -50 mV, dok je za optimalnu robusnost procesa poželјno da redoks potencijal bude najmanje 50 mV. Tako, u dalјem primeru izvođenja, redoks potencijal u koraku b) može biti veći od -300 mV, kao što je veći od -280 mV ili veći od -75 mV ili veći od -50 mV ili veći od 0 mV ili veći od 25 mV ili veći od 50 mV. Za oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu u disulfidne veze, relevantna je donja granica redoks potencijala. Gornja granica redoks potencijala u koraku b) može biti oko 100-300 mV, npr.100-200 mV, kao što je oko 100 mV ili oko 200 mV ili oko 250 mV ili oko 300 mV. Stoga, redoks potencijal koraka b) može biti u opsegu od -300 mV do 300 mV ili -300 mV do 200 mV ili u opsegu od -280 mV do 300 mV ili -280 mV do 200 mV ili u opsegu od -75 mV do 300 mV ili -75 mV do 200 mV ili u opsegu od -50 mV do 300 mV ili -50 mV do 200 mV ili u opsegu od 0 mV do 300 mV ili 0 mV do 200 mV ili u opsegu od 25 mV do 300 mV ili 25 mV do 200 mV ili u opsegu od 50 mV do 300 mV ili 50 mV do 200 mV.
[0265] Pronalazači predmetnog pronalaska su štaviše otkrili da u primeru izvođenja u kome je kompozicija dobijena u koraku a) rastvor, pH u koraku b) takođe utiče na oksidaciju cisteina u heterodimernom proteinu u disulfidne veze. Stoga, u dalјem primeru izvođenja, pH u koraku b) može, u posebnom primeru izvođenja, biti u opsegu pH 6-8,5, kao što je pH opsega 6,5-8 ili pH opsega 6,5-8,5 ili pH opsega 6-8 ili pH opsega 6,5-7,5 ili pH opsega 7-7,5, npr. oko pH 7,4.
[0266] Da bi se osiguralo da je pH kompozicije u koraku b) unutar određenog opsega, npr. pH 6-8,5, može se, na primer, izabrati rastvor ili pufer u koraku a) koji je odovarajućeg pH ili može biti dodata komponenta koja je sposobna da podesi pH kompozicije u koraku b), na primer, koncentrovan rastvor za podešavanje pH. Obezbeđivanje da pH kompozicije u koraku b) bude unutar određenog opsega se takođe može izvesti upotrebom jednog od prethodno opisanih postupaka koji uključuje zamenu pufera, tako da pufer ili rastvor koji se zamenjuje bude sa pH unutar odgovarajućeg opsega.
[0267] Pufer ili rastvor u koraku b), npr. onaj koji je zamenjen u kompoziciji dobijenoj u koraku a), npr. dijafiltracijom, može uklјučivati, ali nije ograničen na, bilo koji od onih koji su ovde opisani, kao što su bilo koji od onih koji su opisani u primerima. Primeri takvih pufera uklјučuju npr. PBS (fosfatom puferisan fiziološki rastvor), PBS, pH 7,4.
[0268] Napredovanje redukcije disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu prvog i drugog homodimernog proteina može biti praćeno merenjem redoks potencijala i/ili praćenjem koncentracije rastvorenog kiseonika. Načini takvog praćenje su dobro poznati stručnjaku u oblasti tehnike i uklјučuju npr. upotrebu različitih tipova senzora, npr. jedan od senzora koji je opisan u Primeru 44.
[0269] U pojedinim primerima izvođenja, postupak predmetnog pronalaska daje proizvod antitela gde više od 80%, kao što je više od 90%, npr. više od 95%, kao što je više od 99% molekula antitela predstavlja želјena bispecifična antitela.
[0270] Proces nakon proizvodnje koja je ovde opisana, je znatno fleksibilniji i lakši za kontrolu u poređenju sa postupcima koji se zasnivaju na koekspresiji.
Prečišćavanje
[0271] Iako je rezultata postupka predmetnog opisa često visok prinos heterodimernog proteina, rezidualne količine prvog i/ili drugog homodimernog proteina takođe mogu biti prisutne u proizvodu ili kompoziciji koja je dobijena postupkom predmetnog opisa.
[0272] Štaviše, proizvod dobijen postupkom predmetnog pronalaska može takođe sadržavati redukujući agens i/ili druge komponente kao što su puferi ili soli koji su bile prisutni tokom postupka. U određenim slučajevima, može biti poželјno da se takve komponente uklone da ne bi bile prisutne u konačnom proizvodu.
[0273] Kao što je prethodno opisano, redukujući agens, komponente pufera ili soli mogu, u pojedinim primerima izvođenja, biti uklonjeni u koraku b) predmetnog pronalaska. Uklanjanje ovih komponenti može biti urađeno kao poseban postupak u okviru premetnog postupka ili istovremeno sa uklanjanjem redukujućeg agensa, npr. bilo kojim od prethodno opisanih postupaka, kao što je bilo koji od postupaka koji uklјučuje zamenu pufera u kompoziciji dobijenoj u koraku a).
[0274] Stoga, u sledećem primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska može dalјe sadržavati korak prečišćavanja heterodimernog proteina. Prečišćavanje heterodimernog proteina se može smatrati korakom c) u dobijanju heterodimernog proteina. Tako, u jednom primeru izvođenja, korak c) obuhvata podvrgavanje kompozicije koja je dobijena korakom b) postupku prečišćavanja.
[0275] Primeri pogodnih postupaka prečišćavanja uklјučuju, ali nisu ograničeni na, postupak izabran iz grupe koja se sastoji od hromatografije sa Proteinom A ili Proteinom G (ili drugog načina afinitetne hromatografije), afinitetne hromatografije zasnovane na npr. antitelima koja vezuju antigen ili antiidiotipskim antitelima, kao i jonoizmenjivačke hormatografije, hormatografije hidrofobnim interakcijama, kapa ili lambda selekcijom, i dalje tioafinitetne, multimodalne hromatografije, npr. hidroksiapatitne, kao i afinitetne hromatografije sa imobilisanim metalom ili tiofilne apsorpcione hromatografija. Ostali postupci prečišćavanja uklјučuju, ali nisu ograničeni na, precipitaciju sa, na primer, solima ili polietilen glikolom da bi se dobio prečišćeni protein. Predviđena je i kombinacija različitih postupaka prečišćavanja.
[0276] Podvrgavanje heterodimernog proteina koraku prečišćavanja ili postupku prečišćavanja, se odnosi na bilo koju vrstu prečišćavanja heterodimernog proteina; kao što je razdvajanje heterodimernog proteina od rezidualnih količina prvog i/ili drugog homodimernog proteina ili razdvajanje heterodimernog proteina od drugih komponenti, npr. redukujućeg agensa, soli ili pufera ili drugih nečistoća koje se javljaju u proizvodu ili tokom procesa.
[0277] Prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina od rezidualnih količina prvog i/ili drugog homodimernog proteina može biti komplikovano, pošto je heterodimerni protein veoma sličan prvom i drugom homodimernom proteinu. Stoga, razdvajanje heterodimernog proteina od rezidualnih količina prvog i/ili drugog homodimernog proteina može biti teže nego razdvajanje heterodimernog proteina od drugih komponenti koje su prisutne, npr. od redukujućeg agensa, pufera ili soli.
[0278] Kao što je ovde opisano na drugom mestu, postupak predmetnog opisa može biti izveden tako da je količina bilo prvog ili drugog homodimernog proteina ograničavajuća u podledu obrazovanja heterodimernog proteina. Primer takvog postupka je poznat kao kontrolisan neekvimolarni proces razmene (SNEEP). Tako, bilo prvi ili drugi homodimerni protein može biti prisutan u koraku a) u višku drugog homodimernog proteina. Odnos prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) može biti posebno prilagođen, uklјučivanjem viška ili ograničene količine jednog homodimernog proteina u odnosu na drugi, da bi se postiglo ograničavanje homodimernim proteinom koji če se u potpunosti upotrebrebiti u koraku a). Navedeno rezultuje proizvodnjom kompozicije, tj. kompozicije dobijene u koraku a), koja sadrži heterodimerni protein zajedno sa rezidualnim količinama samo jednog od prvog i drugog homodimernog proteina, pre nego sa i prvim i drugim homodimernim proteinom. Naknadno prečišćavanje heterodimernog proteina od rezidualnog homodimernog proteina je time olakšano, pošto se samo heterodimerni protein mora odvojiti od bilo prvog ili drugog homodimernog proteina, a ne od oba.
[0279] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, prvi homodimerni protein je prisutan u koraku a) u višku drugog homodimernog proteina ili obrnuto. Odnos prvog i drugog homodimernog proteina može prevashodno biti kao što je ovde opisano.
[0280] U daljem primeru izvođenja, izvođenje postupka sa viškom bilo prvog ili drugog homodimernog proteina se može kombinovati sa korakom prečišćavanja izokratskom elucijom.
[0281] U jednom primeru izvođenja, odvijanje postupka sa viškom bilo prvog ili drugog homodimernog proteina se može kombinovati sa korakom prečišćavanja koji se zasniva na vezivanju antitela koja vezuju antigen ili anti-idiotipskih antitela za homodimer koji se upotrebljava u višku.
[0282] U jednom primeru izvođenja, prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina od prvog i/ili drugog homodimernog proteina može biti izvedeno postupkom koji se zasniva na razlikama u prvom i drugom homodimernom proteinu. Takvi postupci mogu olakšati razdvajanje prvog i drugog homodimernog proteina jednog od drugoga i, u zavisnosti od postupka, takođe razdvajanje homodimernih proteina od heterodimernog proteina. Primeri takvih postupaka prečišćavanja ili razdvajanja koji se zasnivaju na razlikama u prvom i drugom homodimernom proteinu uklјučuju, ali nisu ograničeni na, postupke u kojima se ili prvi ili drugi homodimerni protein ne vezuje za Protein A ili Protein G ili u kojima prvi i drugi homodimerni protein sadrži različite lake lance, npr. kapa i lambda lake lance ili u kojima Fc regioni prvog i drugog homodimernog proteina sadrže različite alotipove. Takvi postupci mogu olakšati razdvajanje bilo prvog ili drugog homodimernog proteina od heterodimernog proteina. Navedeno se može, u daljem primeru izvođenja, kombinovati sa korakom prečišćavanja izokratskom elucijom.
[0283] U jednom primeru izvođenja, postupak prečišćavanja ili razdvajanja koji se zasniva na razlikama u prvom i drugom homodimernom proteinu, se može kombinovati sa upotrebom viška prvog ili drugog homodimernog proteina, kao što je prethodno opisano. Naknadno prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina od rezidualnog homodimera može zatim koristiti razlike prvog i drugog homodimernog proteina, pošto se heterodimerni protein razlikuje od rezidualnog homodimera po tome što sadrži Fc region iz homodimera koji je upotrebljen u ograničavajućim količinama.
[0284] U jednom primeru izvođenja, bilo prvi ili drugi homodimerni protein može biti konstruisan ili modifikovan tako da se ne vezuje za Protein A ili Protein G ili kombinacije Proteina A i G. Prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina od najmanje jednog od prvog i drugog homodimernog proteina se zatim može izvesti njegovim propuštanjem kroz kolonu sa Proteinom A ili Proteinom G, za koju će se vezati samo heterodimerni protein i homodimerni protein koji nije modifikovan u pogledu vezivanja Proteina A ili Proteina G. Navedeno olakšava razdvajanje homodimernog proteina koji se ne vezuje za Protein A ili Protein G od heterodimernog proteina. Ukoliko se prvi homodimerni protein ne vezuje za Protein A i drugi homodimerni protein se ne vezuje za Protein G ili obrnuto; heterodimerni protein može biti razdvojen od prvog i drugog homodimernog proteina, prolaskom kompozicije koja sadrži heterodimerni protein preko materijala sa Proteinom A i Proteinom G. Prvi i drugi homodimerni proteini mogu biti modifikovani tako da ne vezuju Protein A i/ili Protein G kao što je ovde opisano. Navedeno se takođe može upotrebiti za razdvajanja redukujućeg agensa od heterodimernog proteina. Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0285] Upotreba prvog ili drugog homodimernog proteina iz koraka a) koji je modifikovan tako da se ne vezuje za Protein A ili Protein G, ili Protein A i Protein G, može biti posebno korisna za primere izvođenja u kojima se višak bilo prvog ili drugog homodimernog proteina upotrebljava relativno u odnosu na drugi homodimerni protein u koraku a). U takvim primerima izvođenja, može biti korisno da se konstruiše ili modifikuje mesto vezivanja homodimernog proteina koji će biti upotrebljen u višku za Protein A ili Protein G, tako da se poremeti njegova sposobnost da se vezuje za ovakve smole. Navedeni tip modifikacije uklјučuje, ali nije ograničen na, modifikacije CH3 domena koje su opisane u WO 2010/151792 koji je ovde naveden kao referenca. Prema tome, prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska može sadržavati jednu ili više modifikacija u CH3 domenu koje su opisane u WO 2010/151792 i koje smanjuju ili eliminišu vezivanje IgG-a za Protein A. Tako, u posebnom primeru izvođenja, prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa može sadržavati modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od, ali nije ograničena na, a) 435R i b) 435R i 436F. Alternativno, prvi ili drugi homodimerni protein može sadržavati sledeće mutacije: I253A, H310A i H435A koje eliminišu vezivanje za Protein A. Heterodimerni protein može zatim biti razdvojen od viška neizmenjenog homodimernog proteina propuštanjem kroz kolonu sa Proteinom A. Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0286] U drugom primeru izvođenja, u kome prvi i drugi homodimerni protein sadrže laki lanac, laki lanci prvog i drugog homodimernog proteina u koraku a) mogu biti različiti. Na primer, prvi homodimerni protein može sadržavati kapa laki lanac, dok drugi homodimerni protein može sadržavati lambda laki lanac ili obrnuto. Materijali ili smole koji su pogodni za hromatografiju na koloni, a za koje se mogu vezati samo kapa ili lambda laki lanvi, mogu zatim biti upotrebljeni za prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina od prvog i/ili drugog homodimernog proteina. Primeri takvih materijala ili smola uklјučuju npr. afinitetni medijum poznat kao KappaSelect i LambdaFabSelect firme GE Healthcare Life Sciences. Upotreba prvog i drugog homodimernog proteina koji sadrži različite lake lance, npr. kapa i lambda laki lanac, se može kombinovani sa upotrebom jednog od homodimernih proteina u višku u koraku a). Na primer, korak a) može biti izveden sa prvim homodimernim proteinom koji sadrži kapa laki lanac i drugim homodimernim proteinom koji sadrži lambda laki lanac, pri čemu je prvi homodimerni protein prisutan u višku u odnosu na drugi homodimerni protein, ili obrnuto, a shodno tome da li je to homodimerni protein koji sadrži kapa ili lambda laki lanac koji je upotrebljen u višku. Korak c) može tada uključivati propuštanje heterodimernog proteina kroz kolonu za koju se mogu vezati samo lambda laki lanci. Rezultatk korak c) je stoga razdvajanje heterodimernog proteina od preostalog prvog homodimernog proteina koji sadrži kapa laki lanac. Slično navedenom, korak c) može uključivati propuštanje heterodimernog proteina kroz kolonu za koju se mogu vezati samo kapa laki lanci, ukoliko je to homodimer koji sadrži lambda laki lanac koji se koristi u višku u koraku a). Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0287] Alternativno, prečišćavanje ili razdvajanje heterodimernog proteina koje se zasniva na razlikama u vezivanju kapa lambda lakih lanaca za različite materijale, može takođe biti izvedeno bez upotrebe jednog od homodimernih proteina u višku. U ovom primeru izvođenja, korak c) može obuhvatati propuštanje heterodimernog proteina preko materijala za koji se vezuju kapa laki lanci, a zatim preko materijala za koji se vezuje lambda laki lanac ili obrnuto. Kako heterodimerni protein sadrži i kapa i lambda laki lanac, dok prvi i drugi homodimerni protein sadrže samo bilo kapa ili lambda laki lanac, time se može razdvojiti heterodimerni protein i od prvog i drugog homodimernog proteina. Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0288] Prečišćavanje heterodimernog proteina koji je proizveden postupkom u kome prvi i drugi homodimerni protein sadrže različite lake lance, npr. kapa i lambda lake lance, i gde se jedan od homodimernih proteina koristi u višku, njegovim propuštanjem preko materijala za koji se vezuju laki lanci homodimernog proteina koji se ne koristi u višku, može biti primenjljivo i u drugim postupcima proizvodnje heterodimernih proteina koji su drugačiji od onih iz predmetnog opisa. Na primer, to mogu biti postupci zasnovani na koekspresiji teških i lakih lanaca u ćelijama domaćinima ili drugi postupci.
[0289] U drugom primeru izvođenja, konstantan region prvog i drugog homodimernog proteina može biti različitih alotipova. Allotipovi su varijacije u aminokiselinskoj sekvenci koje se prirodno javljaju unutar populacije. Na primer, poznati su različiti alotipovi teškog lanca humanog IgG1, tzv. G1m(f) [naziva se i G1m(3)], G1m(z) [naziva se i G1m(17)], G1m(a) [naziva se i G1m(1)] i G1m(×) [naziva se i G1m(2)] (Jefferis R., mAbs 2009; 1:4, 1-7). Tako, u jednom primeru izvođenja, konstantni region prvog i drugog homodimernog proteina može biti različitih alotipova; npr. oni mogu biti IgG1 izotipa, dok konstantni region prvog homodimernog proteina može biti npr. IgG1m(za) [=IgG1m(1,17)] ili IgG1m(zax) [=IgG1m(1,2,17)] alotipa, dok konstantni region drugog homodimernog proteina može biti npr. IgG1m(f)[=IgG1m(3)] ili IgG1m(fa) [=IgG1m(1,3)] alotipa. Slično primeru izvođenja koji je prethodno opisan, u kome se upotrebljavaju kapa i lambda laki lanci, upotreba prvog i drugog homodimernog proteina koji sadrže konstantne regione različitih alotipova, se može kombinovati sa upotrebom bilo prvog ili drugog homodimernog proteina u višku u koraku a). U ovom primeru izvođenja, korak c) može tada obuhvatiti propuštanje heterodimernog proteina preko materijala, npr. smola obloženih antitelom koje je specifično za alotip, a za koje se vezuje alotip koji je prisutan u homodimernom proteinu koji nije korišćen u višku. Time se heterodimerni protein može prečistiti iz homodimernog proteina koji je upotrebljen u višku u koraku a). Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0290] U alternativnom primeru izvođenja, odnos prvog ili drugog homodimernog proteina nije podešen u koraku a), tako da ni prvi ni drugi homodimerni protein nisu u potpunosti upotrebljeni u koraku a), što rezultuje proizvodnjom kompozicije koja sadrži oba heterodimerna proteina, kao i prvi i drugi homodimerni protein. U ovom primeru izvođenja, korak c) može obuhvatati propuštanje heterodimernog proteina preko materijala za koji se vezuje jedan od alotipova i zatim nakandno propuštanje preko drugog materijala za koji se vezuje drugi alotip. Navedeno se može kombinovati sa drugim postupcima prečišćavanja, kao što je ovde opisano.
[0291] Upotreba prvog i drugog homodimernog proteina koji sadrže Fc regione različitih alotipova u kombinaciji sa razdvajanjem heterodimernog proteina od homodimernih proteina može takođe biti primenjena na druge postupke proizvodnje heterodimernih proteina od onih iz predmetnog opisa. Takvi postupci mogu dalјe uklјučivati upotrebu bilo prvog ili drugog homodimernog proteina u višku. Primeri takvih postupaka uklјučuju one koji se zasnivaju na koekspresiji prvog i drugog homodimernog proteina u istoj ćeliji domaćinu.
C-terminalni lizin
[0292] Uklanjanje C-terminalnih lizina iz teškog lanca karboksipeptidazom je modfikacija antitela koja se uobičajno uočava kako nakon rekombinantne ekspresije antitela u ćelijama sisara, tako i in vivo, u humanom serumu (Cai i saradnici (2010) Biotechnol. Bioeng. Sep 9). Uklanjanje je često parcijalno, što rezultuje mešanom populacijom antitela sa nula (K0), jednim (K1) ili dva (K2) C-terminalna lizina. Preciznije, B-ćelijski hibridomi proizvode smeše K0, K1 i K2 molekula (Dick i saradnici (2008) Biotech. Bioeng.100:1132).
[0293] U jednom primeru izvođenja, C-terminalni lizin heterodimernog proteina, npr. bispecifičnog antitela koje je proizvedeno postupkom predmetnog pronalaska, može biti uklonjen. Termin "C-terminalni lizinski ostatak" se odnosi na lizinski ostatak na C-kraju CH3 regiona, npr. C-kraju teškog lanca antitela, koji je na poziciji 447 u IgG1.
[0294] Pored raznih efekata koje C-terminalni lizin može imati, uklanjanje C-terminalnog lizina rezultuje u heterodimernom proteinu, npr. kompoziciji ili populaciji koja sadrži više od jednog molekula heterodimernog proteina i koji je više homogen u pogledu prisustva C-terminalnih lizina.
[0295] Stoga, u sledećem primeru izvođenja, prvi i/ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin.
[0296] C-terminalni lizin može biti uklonjen genetičkim inženjeringom prvog i/ili drugog homodimernog proteina tako da ne sadrže C-terminalni lizin ili uklanjanjem, npr. enzimskom katalizom, C-terminalnog lizina iz prvog i/ili drugog homodimernog proteina ili uklanjanjem, kao što je enzimska kataliza, C-terminalnih lizina iz heterodimernog proteina.
[0297] Tako, u dalјem primeru izvođenja, prvi i/ili drugi homodimerni proteini su genetički modifikovani tako da ne sadrže C-terminalni lizin, npr. u teškom lancu.
[0298] U drugom primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska dalјe obuhvata korak uklanjanja c-terminalnog lizina, npr. iz teškog lanca, npr. inkubacijom sa karboksipeptidazom.
[0299] Ukoliko je prvi i/ili drugi homodimerni protein konstruisan tako da ne sadrži C-terminalni lizin, prvi i/ili drugi homodimerni protein može biti proizveden:
i) obezbeđivanjem nukleotidnog konstrukta koji kodira Fc region imunoglobulina, gde navedeni Fc region sadrži prvi CH3 region i/ili sadrži Fc region imunoglobulina i gde navedeni Fc region sadrži drugi CH3 region, pri čemu navedeni konstrukt ne kodira lizinski ostatak na C-kraju navedenog prvog i/ili drugog CH3 regiona,
ii) ekspresijom navedenog nukleotidnog konstrukta u ćeliji domaćinu,
i
iii) izdvajanjem navedenog prvog i/ili drugog homodimernog proteina iz ćelijske kulture navedene ćelije domaćina.
[0300] Prvi i/ili drugi homodimerni protein može, u jednom primeru izvođenja, biti antitelo, koje može, u većini primera izvođenja, takođe sadržavati laki lanac, a stoga navedena ćelija domaćin može dalјe eksprimirati konstrukt koji kodira laki lanac, bilo na istom ili na različitom vektoru.
[0301] Postupci pripreme nukleotidnih konstrukata su dobro poznati stručnjacima.
[0302] Slično navedenom, postupci ekspresije nukleotidnih konstrukata u ćeliji domaćinu su takođe dobro poznati stručnjacima.
[0303] U sledećem primeru izvođenja prethodno opisanog postupka opisa, nukleotidni konstrukt koji je obezbeđen u koraku i) je izveden iz, ili je dizajniran na osnovu, originalne sekvence teškog lanca koja sadrži kodon za C-terminalni lizinski ostatak. Prema tome, navedeni nukleotidni konstrukt može sadržavati deleciju kodona za C-terminalni lizinski ostatak u poređenju sa navedenom originalnom sekvencom teškog lanca.
[0304] U drugom primeru izvođenja, C-terminalni lizinski ostatak može biti uklonjen iz prvog i/ili drugog homodimernog proteina, npr. enzimskim cepanjem. Prema tome, C-terminalni lizin može biti uklonjen iz prvog i/ili drugog homodimernog proteina nakon što su oni proizvedeni. Postupci enzimskog uklanjanja C-terminalnog lizina uklјučuju, ali nisu ograničeni na, podvrgavanje prvog i/ili drugog homodimernog proteina inkubaciji sa karboksipeptidazom. Tako, korak uklanjanja C-terminalnog lizina, npr. iz teškog lanca, može biti izveden pre koraka a). Stoga, postupak predmetnog pronalaska može, u jednom primeru izvođenja, obuhvatati dodatni korak podvrgavanja prvog i/ili drugog homodimernog proteina karboksipeptidazi, pre koraka a).
[0305] Slično navedenom, C-terminalni lizin može biti uklonjen iz heterodimernog proteina. Tako, u jednom primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska može, nakon koraka a), obuhvatati dodatni korak podvrgavanja heterodimernog proteina karboksipeptidazi. Navedeni korak može biti uveden između koraka a) i koraka b) ili može biti nakon koraka b). Tako, u jednom primeru izvođenja, korak uklanjanja C-terminalnog lizina, npr. iz teškog lanca, može biti izveden nakon koraka a). U drugom primeru izvođenja, korak uklanjanja C-terminalnog lizina, npr. iz teškog lanca, može biti izveden nakon koraka b). U principu, postupak predmetnog opisa može sadržavati podvrgavanje i prvog i/ili drugog homodimernog proteina i heterodimernog proteina karboksipeptidazi. Međutim, za većinu namena bi trebalo da bude dovolјno da se uklјuči jedan od prethodno navedenih koraka za uklanjanje C-terminalnih lizina. Primeri pogodnih karboksipeptidaza uklјučuju, ali nisu ograničeni na, karboksipeptidazu B ili karboksipeptidazu N (Cai i saradnici Biotechnol. Bioeng. Sep 9 (2010) navedeno prethodno). Pogodni uslovi za tretman sa karboksipeptidazom su dobro poznati stručnjaku. Drugi postupak uklanjanja C-terminalnih lizina bi bio ekspresija prvog i/ili drugog homodimernog proteina u ćeliji domaćinu koja eksprimira karboksipeptidazu. Ostavlјanje prvog i/ili drugog homodimernog proteina u medijumu kulture ćelija domaćina, na temperaturi na kojoj je karboksipeptidaza aktivna i u dovolјnom vremenskom periodu, takođe bi dovelo do uklanjanja C-terminalnog lizina (Luo JL, Ahang J, Ren D, Tsai W-L, Li F (2102) Probing of C-Terminal Lysine Variation in a Recombinant Monoclonal Antibody Production Using Chinese Hamster Ovary Cells with Chemically Defined Media. Biotechnol. Bioeng.109:2306-2315).
Sekvence nukleinskih kiselina
[0306] Prema daljem aspektu, predmetni opis se takođe odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin. Prvi i drugi homodimerni protein mogu biti bilo koji od prethodno opisanih proteina koji su u vezi sa postupkom.
[0307] Prema sledećem aspektu, predmetni opis se takođe odnosi na ekspresioni vektor koji kodira prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrže C-terminalni lizin.
[0308] U još dalјem primeru izvođenja, predmetni opis se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji kodira prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrže C-terminalni lizin.
[0309] Ekspresioni vektor, u kontekstu predmentog opisa, može biti bilo koji pogodan vektor, uklјučujući hromozomske, nehromozomske i sintetske vektore nukleinskih kiselina (sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže odgovarajući skup elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uklјučuju derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK faga, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i DNK faga i vektore virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline kodira Fc region prvog ili drugog homodimernog proteina predmetnog pronalaska, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrže C-terminalni lizin i može biti sadržan u golom DNK ili RNK vektoru uklјučujući, na primer, element linearne ekspresije (kao što je opisano u, na primer, Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u, na primer, US 6,077, 835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor, kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, vektor nukleinske kiseline minimalne veličine tipa "mušice" (engl. midge, kao što je opisano u, na primer, Schakowski i saradnici, Mol Ther 3, 793-800 (2001)) ili kao precipitirana vektorska konstrukcija nukleinske kiseline, kao što je CaP04-precipitiran konstrukt (kao što je opisano u, na primer, WO 00/46147, Benvenisty i Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler i saradnici, Cell 14, 725 (1978) i Coraro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Navedenii vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati na primer US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0310] U jednom primeru izvođenja, vektor je pogodan za ekspresiju u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora uklјučuju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke i Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vektori (Novagen, Madison WI) i slični).
[0311] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Može biti upotrebljen bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Pogodni vektori uklјučuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što su za alfa faktor, alkoholnu oksidazu i PGH (revijski pregled u: F. Ausubel i saradnici, izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience, New York (1987) i Grant i saradnici, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[0312] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u ćelijama sisara, npr. vektor koji sadrži glutamin sintetazu kao selektivni marker, kao što su vektori opisani u Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175.
[0313] Nukleinska kiselina i/ili vektor mogu takođe sadržavati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, a koja može usmeriti polipeptid, kao što je nascentni polipeptidni lanac, ka periplazmatskom prostoru ili u medijum ćelijske kulture. Navedene sekvence su poznate u oblasti tehnike i uklјučuju vodeće ili signalne peptide sekrecije.
[0314] U ekspresionom vektoru opisa, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog pronalaska, gde navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin, može sadržavati ili biti povezana sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem i drugim elemenatima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uklјučuju snažne promotore ekspresije (npr. humani CMV IE promotor/pojačivač, kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotore), efektivne poli(A) terminalne sekvence, mesta početka replikacije za plazmidni proizvod u E. coli, gen rezistencije na antibiotike kao selektivni marker i/ili mesto pogodno za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline mogu takođe sadržavati inducibilni promotor za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE.
[0315] U jednom primeru izvođenja, ekspresioni vektor može biti pozicioniran u i/ili isporučen u ćeliju domaćina ili životinju domaćina putem virusnog vektora.
[0316] Prema još dalјem aspektu, opis se odnosi na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina, kao što je transfektoma, koja proizvodi prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin, kao što je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina uklјučuju ćelije kvasca, bakterija i sisara, kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, u jednom primeru izvođenja, predmetni opis obezbeđuje ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja je stabilno integrisana u ćelijski genom i koja sadrži sekvencu koja kodira ekspresiju Fc regiona prvog ili drugog homodimernog proteina predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi protein homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin. U drugom primeru izvođenja, predmetni opis obezbeđuje ćelije koje sadrže neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagemid ili element linearne ekspresije, koji sadrži sekvencu koja kodira ekspresiju prvog ili drugog homodimernog proteina predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin.
[0317] Prema dodatnom aspektu, opis se odnosi na hibridom koji proizvodi prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin. Prema još dalјem aspektu, opis se odnosi na transgenu životinju različitu od čoveka ili bilјku koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, pri čemu navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin i pri čemu životinja ili bilјka proizvodi prvi ili drugi homodimerni protein predmetnog opisa, a gde navedeni prvi ili drugi homodimerni protein ne sadrži C-terminalni lizin.
Heterodimerni proteini
[0318] Predmetni opis se takođe odnosi na heterodimerni protein koji je dobijen postupkom predmetnog pronalaska.
[0319] Postupak opisa omogućava obrazovanje asimetričnih molekula, molekula sa različitim karakteristikama na svakom od Fab kraka ili na svakom od CH3 domena ili molekula sa jasno različitim modifikacijama duž molekula, npr. molekula sa aminokiselinskom supstitucijom/supstitucijama za konjugaciju koja se ne javlja u prirodi. Ovakvi asimetrični molekuli mogu biti generisani u bilo kojoj pogodnoj kombinaciji. Navedeno je dalјe ilustrovano pojedinim neograničavajućim primerima u tekstu koji sledi.
[0320] Bispecifična antitela mogu biti upotrebljena za isporuku agensa za medicinska snimanja ili imunoterapijskog agensa cilјnoj ćeliji od interesa, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, tumorsku ćeliju.
[0321] U primeru izvođenja postupka pronalaska, prvi Fab krak bispecifičnog antitela se vezuje za tumorsku ćeliju, kao što je protein na površini tumorske ćelije ili uglјeni hidrat na površini tumorske ćelije, a kao što je jedan od proteina na površini tumorske ćelije koji je ovde naveden, dok drugi Fab krak prepoznaje radioaktivni efektorski molekul uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, radioaktivni obeleživač kuplovan ili povezan (preko helatora) sa peptidom ili haptenom. Primer takvog radioaktivno obeleženog peptida je dietilentriaminpentasirćetna kiselina obeležena indijumom (anti-DTPA(In) van Schaijk i saradnici Clin. Cancer Res.2005; 11:7230s-7126s). Drugi primer je upotreba koloidnih čestica obeleženih haptenom kao što su lipozomi, nanočestice polimernih micela koje nose radionuklide poput npr. tehnecijuma-99 (Jestin i saradnici, Q J Nucl Med Mol Imaging 2007; 51:51-60).
[0322] U drugom primeru izvođenja, alternativni citostatski molekul kuplovan sa haptenom, kao što je toksin, se upotrebljava kao efektorski molekul koga prepoznaje drugi Fab krak.
[0323] U sledećem primeru izvođenja postupka pronalaska, prvi Fab krak bispecifičnog antitela je glikozilovan na poziciji N297 (EU numeracija), dok drugi Fab krak bispecifičnog antitela nije glikozilovan (neglikozilovan je, na primer, uvođenjem mutacije N297 tipa Q ili A ili E mutacije (Bolt S i saradnici, Eur J Immunol 1993, 23:403-411)). Asimetrična glikozilacija u Fc-regionu utiče na interakciju sa Fcyreceptorima i ima uticaja na efekat ćelijske citotoksičnosti antitela koja je zavisna od antitela (Ha i saradnici, Glycobiology 2011, 21(8):1087-1096), kao i na interakciju sa drugim molekulima sa efektorskom funkcijom kao što je C1q.
[0324] U drugom primeru izvođenja postupka pronalaska, prvi Fab krak bispecifičnog molekula interaguje sa FcRn, neonatalnim Fc receptorom (Roopenian DC i saradnici, Nat. Rev. Immunol.2007, 7:715-725), dok je drugi Fab krak sa poremećajem u vezivanju za FcRn koji je dobijen uvođenjem mutacije u mesto interakcije sa FcRn u molekulima, na primer, uvođenjem H435A mutacije (Shields R.L. i saradnici, J Biol Chem, 2001, Firan M. i saradnici, Int Immunol, 2001).
[0325] U drugom primeru izvođenja, pobolјšava se ili smanjuje vezivanje za C1q jednog od dva Fab kraka bispecifičnog molekula.
[0326] U još jednom primeru izvođenja, protein je konstruisan tako da se pobolјša aktivacija komplementa jednog ili oba od dva Fab kraka molekula.
[0327] U sledećem primeru izvođenja, svaki od Fab kraka koji su prisutni u bispecifičnom molekulu je izveden iz različite IgG subklase.
[0328] U drugom primeru izvođenja, svaki od Fab kraka koji su prisutni u bispecifičnom molekulu nosi različite alotipske mutacije (Jefferis i Lefranc, 2009, MABs 1:332-8).
[0329] U sledećem primeru izvođenja, druga kategorija asimetričnih imunoterapijskih molekula je generisana zamenom Fab jednog od Fab kraka bispecifičnog molekula sa imuno-aktivnim, -stimulišućim ili -inhibirajućim citokinom. Neograničavajući primeri takvih citokina su IL-2, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6, IL-13. Alternativno, u molekule je uklјučen agens stimulacije ili inhibicije faktor (rasta) ili hormona.
[0330] U drugom primeru izvođenja, Fab jednog od Fab kraka je zamenjen sa litičkim peptidom, tj. peptidom koji su u stanju da lizira tumorske ćelije, bakterije, glјivice itd., uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, antimikrobne peptide kao što su magainin, melitin, cekropin, KLAKKLAK i njihove varijante (Schweizer i saradnici, Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194, Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107-3113, Marks i saradnici, Cancer Res 2005; 65:2373-2377, Rege i saradnici, Cancer Res.
2007; 67:6368-6375) ili katjonski litički peptidi (CLYP tehnologija, US2009/0269341).
[0331] U sledećem primeru izvođenja, jedan ili oba Fab fragmenta iz Fab kraka su zamenjeni receptorom za citokine i/ili faktore rasta, čime se kreiraju tzv. receptori mamci, od kojih su dobro poznati primeri Enbrel® (etanercept) koji cilјano deluje na TNF-α, dok VEGF-trap ciljano deluje na VEGF. Kombinovanje ova dva receptora mamca u jedan molekul je pokazalo superiornu aktivnost u odnosu na pojedinačne receptore mamce (Jung, J.Biol. Chem.2011; 286: 14410-14418).
[0332] U sledećem primeru izvođenja, druga kategorija asimetričnih imunoterapijskih molekula je generisana fuzijom imuno-aktivnih, -stimulišućih ili -inhibirajućih citokina sa N-krajem ili C-krajem jednog ili oba od Fab kraka koji su prisutni u bispecifičnim molekulima. Navedeno može pozitivno uticati na anti-tumorsku aktivnost bispecifičnog molekula. Primeri takvih molekula, međutim, nisu ograničeni na listu koja je navedena u nastavku teksta, a uključuju IL-2 (Fournier i saradnici, 2011, Int. J. Oncology, doi: 10.3892/ijo.2011.976), IFN-α, IFN-β ili IFN-y (Huan i saradnici, 2007; J.Immunol.
179:6881-6888, Rossie i saradnici, 2009; Blood 114: 3864-3871), TNF-α. Alternativno, N-terminalna ili C-terminalna fuzija citokina, kao što su, na primer, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6 ili IL-13 može pozitivno uticati na efektorsku funkciju molekula bispecifičnog antitela. Alternativno, agens stimulacije ili inhibicije faktor rasta ili hormona je uklјučen u molekule na N-kraju ili C-kraju.
[0333] U sledećem primeru izvođenja, N-terminalna ili C-terminalna fuzija litičkog peptida, kao što su, na primer, antimikrobni peptidi poput magainina, melitina, cekropina, KLAKKLAK i njihovih varijanti (Schweizer i saradnici Eur. J. Pharmacology 2009; 625: 190-194, Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107-3113, Marks i saradnici, Cancer Res 2005; 65:2373-2377, Rege i saradnici, Cancer Res. 2007; 67:6368-6375) ili katjonski litički peptidi (CLYP tehnologija, US2009/0269341), na jednom ili oba Fab kraka, može pojačati aktivnost molekula.
[0334] U daljem primeru izvođenja, sledeća kategorija asimetričnih imunoterapijskih molekula su monovalentna antitela, molekuli koji interaguju jednim Fab krakom sa ciljnim molekulom od izbora. U takvom molekulu, jedan od Fab kraka koji je prisutan u bispecifičnom molekulu je usmeren na ciljni molekul od izbora, dok drugi Fab krak molekula ne nosi Fab ili ima Fab koji se ne vezuje/nije funkcionalan, kao što je opisano za MetMab (Genentech; WO 96/38557). Alternativno, mogu biti generisani monomerni Fc fuzioni proteini, kao što su oni opisani za faktor VIII i IX (Peters i saradnici, Blood 2010; 115: 2057-2064).
[0335] Alternativno, kombinacije bilo kojih od prethodno navedenih asimetričnih molekula mogu biti generisane postupkom pronalaska.
[0336] Heterodimerni protein proizveden postupkom predmetnog opisa može sadržavati prvi polipeptid koji sadrži prvi Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni prvi Fc region sadrži prvi CH3 region, i drugi polipeptid koji sadrži drugi Fc region imunoglobulina, pri čemu navedeni drugi Fc region sadrži drugi CH3 region, gde su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da su heterodimerne interakcije između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jače od svake od homodimernih interakcija navedenih prvih i drugih CH3 regiona, i
gde navedeni prvi homodimerni protein sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi homodimerni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 366, 368, 370, 399, 405 i 407
i/ili
gde su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona takve da su konstante disocijacije homodimernih interakcija svakog od CH3 regiona između 0,01 i 10 mikromola, kao što je između 0,05 i 10 mikromola, poželјnije između 0,01 i 5, kao što je između 0,05 i 5 mikromola, još poželјnije između 0,01 i 1 mikromola, kao što je između 0,05 i 1 mikromola, između 0,01 i 0,5 ili između 0,01 i 0,1, a kada se ista određuje kao što je opisano u Primeru 21.
[0337] U jednom primeru izvođenja, navedeni prvi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405
i/ili
sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona su takve da su konstante disocijacije homodimernih interakcija svakog od CH3 regiona između 0,01 i 10 mikromola, kao što je između 0,05 i 10 mikromola, poželјnije između 0,01 i 5, kao što je između 0,05 i 5 mikromola, još poželјnije između 0,01 i 1 mikromola, kao što je između 0,05 i 1 mikromola, između 0,01 i 0,5 ili između 0,01 i 0,1 mikromola, kada se iste određuju kao što je opisano u Primeru 21.
[0338] U dalјem primeru izvođenja heterodimernog proteina,
navedeni prvi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i navedeni drugi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405, kao što je drugačija od Phe, Arg ili Gly, na poziciji 405
ili
navedeni prvi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407.
[0339] U dalјim primerima izvođenja, heterodimerni protein prema opisu sadrži bilo koju od dodatnih karakteristika koje su prethodno opisane za postupke proizvodnje.
[0340] Tako, u dalјem primeru izvođenja heterodimernog proteina pronalaska, navedeni prvi polipeptid je teški lanac antitela pune dužine, poželјno humano antitelo.
[0341] U drugom primeru izvođenja heterodimernog proteina pronalaska, navedeni drugi polipeptid je teški lanac antitela pune dužine, poželјno humano antitelo.
[0342] U dalјem primeru izvođenja heterodimernog proteina pronalaska, navedeni prvi i drugi polipeptidi su oba teški lanci dva antitela pune dužine i poželјno je da su oba humana antitela koja vezuju različite epitope, tako da je rezultujući heterodimerni protein bispecifično antitelo. Ovo bispecifično antitelo može biti antitelo tipa teškog lanca ili antitelo koje pored teških lanaca sadrži dva laka lanca pune dužine koji mogu biti identični ili različiti.
[0343] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, Fc region prvog polipeptida je sličan ili identičan sa Fc regionom koji je izveden iz izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (izuzetak su oni sa definisanim mutacijama), dok je Fc region drugog polipeptida izotipa izabranog iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (izuzetak su oni sa definisanim mutacijama).
[0344] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi CH region sadrži aminokiselinu drugačiju od Phe na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0345] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, dok navedeni drugi CH region sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0346] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi CH3 region sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0347] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži aminokiselinu drugačiju od Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi CH region sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0348] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409 i: a) lie na poziciji 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0349] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, dok navedeni drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405 ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0350] U dalјem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi CH3 region sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a navedeni drugi CH3 region sadrži Ile na poziciji 350, Thr na poziciji 370, Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0351] U dalјem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, nijedan od navedenog prvog niti navedenog drugog polipeptida ne sadrži Cys-Pro-Ser-Cys sekvencu u zglobnom regionu.
[0352] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, i navedeni prvi i navedeni drugi polipeptid sadrže sekvencu Cys-Pro-Pro-Cys u zglobnom regionu.
[0353] U sledećem primeru izvođenja heterodimernog proteina opisa, navedeni prvi i/ili navedeni drugi polipeptid sadrži mutaciju koja uklanja akceptorsko mesto za glikozilaciju povezanu sa Asn.
Cilјni antigeni
[0354] Kao što je prethodno objašnjeno, u važnom primeru izvođenja opisa, heterodimerni protein je bispecifično antitelo koje sadrži dva varijabilna regiona koji se razlikuju po specifičnosti vezivanja, tj. koji vezuju različite epitope.
[0355] U principu, moguća je bilo koja kombinacija specifičnosti. Kao što je prethodno pomenuto, bispecifična antitela se mogu potencijalno koristiti za dodatno povećanje potencije i efikasnosti terapija monoklonskim antitelima. Jedno moguće ograničenje monospecifičnog antitela je nedostatak specifičnosti za želјene cilјne ćelije usled ekspresije cilјnog antigena na drugim tipovima ćelija za koje nije poželјno vezivanje antitela. Na primer, cilјni antigen koji je prekomerno eksprimiran na tumorskim ćelijama može takođe biti eksprimiran u zdravim tkivima, što može dovesti do neželјenih sporednih efekata nakon tretmana sa antitelom koje je usmereno na taj antigen. Bispecifično antitelo koje karakteriše dodatna specifičnost za protein koji je isklјučivo eksprimiran na određenom tipu cilјne ćelije može stoga potencijalno pobolјšati specifično vezivanje za tumorske ćelije.
[0356] Tako, u jednom primeru izvođenja, oba homodimerna proteina su antitela, pri čemu se prvo antitelo i drugo antitelo vezuju za različite epitope na istoj tumorskoj ćeliji.
[0357] U još jednom primeru izvođenja, oba homodimerna proteina su antitela, pri čemu se prvo antitelo vezuje za epitop na tumorskoj ćeliji, a drugo antitelo je irelevantno ili neaktivno antitelo bez bilo kakve relevantne in vivo aktivnosti vezivanja prilikom primene koja se planira.
[0358] Tako, u jednom primeru izvođenja pronalaska, navedeni prvi i drugi epitop su locirani na istoj ćeliji, npr. tumorskoj ćeliji. Pogodna cilјna mesta na tumorskim ćelijama obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sledeće: erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV protein omotača, periodstin, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFRvIII, L1-CAM, AXL, tkivni faktor (TF), CD74, EpCAM i MRP3. Moguće kombinacije tumorskih ćelija na koje se ciljano deluje uklјučuju tako, ali nisu ograničene na: erbB1 erbB2, erbB2 erbB3, erbB1 erbB3, CD19 CD20, CD38 CD34, CD4 CXCR5, CD38 RANKL, CD38 CXCR4, CD20 CXCR4, CD20 CCR7, CD20 CXCR5, CD20 RANKL, erbB2 AXL, erbB1 cMet, erbB2 c-Met, erbB2 EpCAM, c-Met AXL, c-Met TF, CD38 CD20, CD38 CD138.
[0359] U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi i drugi epitopi mogu biti locirani na istom cilјnom antigenu, pri čemu je lokacija dva epitopa na cilјnom antigenu takva da vezivanje antitela za jedan epitop ne interferira sa vezivanjem antitela za drugi epitop. U sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi i drugi homodimerni proteini su antitela koja se vezuju za dva različita epitopa locirana na istom cilјnom antigenu, ali imaju različit način delovanja za ubijanje cilјne ćelije, npr. tumorske ćelije. Na primer, u jednom primeru izvođenja, cilјni antigen je erbB2 (HER2), a bispecifično antitelo kombinuje mesta za vezivanje antigena za pertuzumab i trastuzumab. U još jednom primeru izvođenja, cilјni antigen je erbB1 (EGFr) i bispecifično antitelo kombinuje mesta vezivanja antigena za zalutumumab i nimotuzumab.
[0360] Bispecifična antitela takođe mogu biti upotrebljena kao medijatori za ponovno usmeravanje efektorskih mehanizama ka tkivu koje je pogođeno bolešću, npr. tumorima. Tako, u sledećem primeru izvođenja, navedeni prvi ili navedeni drugi epitop se nalazi na tumorskoj ćeliji, kao što je protein tumorske ćelije ili uglјeni hidrat tumorske ćelije, dok je drugi epitop lociran na efektorskoj ćeliji.
[0361] U jednom primeru izvođenja, efektorska ćelija je T ćelija.
[0362] Moguća mesta ciljanog dejstva na efektorskim ćelijama uklјučuju sledeće: FcγRI (CD64): eksprimiran na monocitima i makrofagima kao i aktiviranim neutrofilima; FcγRIII (CD16): eksprimiran na ćelijama prirodnim ubicama i makrofagima; CD3: eksprimiran na cirkulišućim T ćelijama; CD89: eksprimiran na PMN (polimorfonuklearnim neutrofilima), eozinofilima, monocitima i makrofagima; CD32a: eksprimiran na makrofagima, neutrofilima, eozinofilima; FsεRI eksprimiran na bazofilima i mast ćelijama. U jednom primeru izvođenja, epitop se nalazi na CD3 koji je eksprimiran u T ćelijama.
[0363] U drugom primeru izvođenja, prvo antitelo karakteriše specifičnost vezivanja za patogeni mikroorganizam, dok se drugo antitelo specifično vezuje za efektorski ćelijski protein, kao što je CD3, CD4, CD8, CD40, CD25, CD28, CD16, CD89, CD32, CD64, FcεRI ili CD1.
[0364] Štaviše, bispecifična antitela mogu biti upotrebljena za specifičnije usmeravanje hemioterapijskog agensa ka ćelijama na koje bi agens trebao da deluje. Tako, u jednom primeru izvođenja, jedan od homodimernih proteina je antitelo koje prepoznaje mali molekul ili peptid ili je u stanju da obrazuje kovalentnu vezu sa takvim molekulom, npr. u skladu sa principom koji je opisan u Rader i saradnici (2003) PNAS 100:5396. U dalјem primeru izvođenja postupka pronalaska, prvo antitelo se specifično vezuje za tumorske ćelije (tj. vezuje epitop na njima) ili za protein na površini tumorske ćelije, kao što je erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, EGFR3vIII, CEA, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, EpCAM, c-Met, AXL, L1-CAM, tkivni faktor, CD74 ili CXCR5, dok drugo antitelo karakteriše specifičnost vezivanja za hemioterapijski agens, kao što je toksin (uklјučujući radioaktivno obeležen peptid), radioizotip, lek ili prolek koji opciono može biti kuploan ili povezan sa peptidom ili haptenom.
[0365] Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za ciljano usmeravanje vezikule, npr. elektronski guste vezikule, ili minićelije koja sadrži toksin, lek ili prolek u tumor. Pogledajte npr. MacDiarmid i saradnici (2009) Nature Biotech 27:643. Minićelije su ahromozomske ćelije koje su proizvodi aberantne ćelijske deobe i koje ne sadrže hromozomsku DNK. Tako, u drugom primeru izvođenja, navedeni prvi ili navedeni drugi epitop se nalazi na tumorskoj ćeliji, kao što je protein tumorskih ćelija ili uglјeni hidrat ćelija tumora, dok se drugi epitop nalazi na elektronski gustoj vezikuli ili minićeliji.
[0366] Štaviše, poluživot antitela u serumu može biti promenjen uklјučivanjem u bispecifično antitelo specifičnosti vezivanja za serumski protein. Na primer, poluživot u serumu može biti produžen uklјučivanjem u bispecifično antitelo specifičnosti vezivanja za serumski albumin. Tako, u dalјem primeru izvođenja postupka pronalaska, prvo antitelo karakteriše specifičnost vezivanja za tumorsku ćeliju ili protein tumorske ćelije, kao što je erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV protein omotača, periostin, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFRvIII, L1-CAM, AXL, tkivni faktor (TF), CD74, EpCAM ili MRP3, CEA, dok drugo antitelo karakteriše specifičnost vezivanja za protein krvi, kao što je serumski albumin. Druga specifičnost vezivanja takođe može biti upotrebljena za ciljano usmeravanje antitela u specifično tkivo, kao što je tkivo centralnog nervnog sistema ili mozga (preko krvno-moždane barijere). Tako, u dalјem primeru izvođenja postupka pronalaska, prvo antitelo specifično vezuje ciljni molekul specifičan za mozak, kao što je amiloid-beta (npr. u cilju lečenja Alchajmerove bolesti), Her-2 (npr. u cilju lečenja metastaza kancera dojke u mozgu), EGFR (npr. za lečenje primarnog raka mozga), Nogo A (npr. za lečenje povreda mozga), TRAIL (npr. za lečenje HIV-a), alfa-sinuklein (npr. za lečenje Parkinsona), Htt (npr. za lečenje Hantingtona), prion (npr. za lečenje bolesti ludih krava), protein virusa Zapadnog Nila, dok se drugo antitelo specifilno vezuje za protein krvno-moždane barijere kao što je receptor transferina (TfR), insulinski receptor, receptor melanotransferina (MTfR), receptor laktoferina (LfR), receptor Apolipoproteina E 2 (ApoER2), protein srodan LDL receptoru tipa 1 i 2 (LRP1 i LRP2), receptor za kasne krajnje proizvode glikozilacije (RAGE), receptor difterijskog toksina = faktor rasta sličan epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin (DTR = HB-EGF), gp190 (Abbott i saradnici, Neurobiology of Disease, 37 (2010) 13-25).
[0367] Specifičnost vezivanja za protein krvno-moždane barijere takođe može biti upotrebljena za ciljano usmeravanje drugog molekula koje nije antitelo, ka specifičnom tkivu, kao što je tkivo centralnog nervnog sistema ili mozga (preko krvno-moždane barijere). Tako, u sledećem primeru izvođenja, jedan od homodimernih proteina je antitelo pune dužine koje se specifično vezuje za protein krvno-moždane barijere (kao što je TfR, receptor za insulin, MTfR, LfR, ApoER2, LRP1, LRP2, RAGE, DTR (= HB-EGF) ili gp190), dok je drugi homodimerni protein Fc region koji je preko N- ili C-kraja povezan sa drugim proteinom kao što je citokin, solubilni receptor ili drugi protein, npr. VIP (vazoaktivni intestinalni peptid), BDNF (neurotrofni faktor poreklom iz mozga), FGF (faktor rasta fibroblasta), višestruki FGF-ovi, EGF (epidermalni faktor rasta), PNA (peptidna nukleinska kiselina), NGF (nervni faktor rasta), neurotrofin (NT)-3, NT-4/5, neurotrofni faktor poreklom iz glije, cilijarni neurotrofni faktor, neurturin, ili su neuregulini, interleukini, transformišući faktor rasta (TGF)-alfa, TGF-beta, eritropoetin, faktor rasta hepatocita, faktor rasta izveden iz trombocita, artemin, persefin, netrini, kardiotrofin-1, faktor matičnih ćelija, midkin, plejotrofin, morfogeni protein kostiju, sapozini, semaforini, leukocitni faktor inhibicije, alfa-L-iduronidaza, iduronat-2-sulfataza, N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza, arilsulfataza B, kisela alfa-glukozidaza ili sfingomijelinaza (Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting 2010, 1-11; Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry 2008, 19: 1327-1338).
[0368] U dalјem primeru izvođenja postupka pronalaska, prvo antitelo se specifično vezuje za tumorsku ćeliju ili protein tumorske ćelije, kao što je erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4 ili CXCR5, dok drugo antitelo karakteriše specifičnost vezivanja za protein uklјučen u zgrušavanje krvi, kao što je tkivni faktor.
[0369] Sledeće posebno interesantne kombinacije specifičnih vezivanja uklјučuju: CD3 HER2, CD3 CD20, IL-12 IL18, IL-1a IL-1b, VEGF EGFR, EpCAM CD3, GD2 CD3, GD3 CD3, HER2 CD64, EGFR CD64, CD30 CD16, NG2 CD28, HER2 HER3, CD20 CD28, HER2 CD16, Bcl2 CD3, CD19 CD3, CEA CD3, EGFR CD3, IgE CD3, EphA2 CD3, CD33 CD3, MCSP CD3, PSMA CD3, TF CD3, CD19 CD16, CD19 CD16a, CD30 CD16a, CEA HSG, CD20 HSG, MUC1 HSG, CD20 CD22, HLA-DR CD79, PDGFR VEGF, IL17a IL23, CD32b CD25, CD20 CD38, HER2 AXL, CD89 HLA klase II, CD38 CD138, TF c-Met, Her2 EpCAM, HER2 HER2, EGFR EGFR, EGFR c-Met, c-Met nevezujući krak, kao i kombinacije receptora kuplovanih sa G-proteinom.
[0370] U dalјem primeru izvođenja, bispecifična antitela pronalaska mogu biti upotrebljena za čišćenje patogena, patogenih autoantitela ili štetnih jedinjenja kao što su venomi i toksini iz cirkulacije, cilјanim dejstvom na eritrocite, suštinski kao što je opisano u Taylor i saradnici, J. Immunol. 158: 842-850 (1997) i Taylor i Ferguson, J. Hematother.4:357-362, 1995. Navedeni prvi epitop je lociran na proteinu eritrocita (crvene krvne ćelije), uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, receptor komplementa tipa 1 eritrocita, dok se navedeni drugi epitop nalazi na jedinjenju ili organizmu na koji se ciljano deluje u cilju klirensa.
[0371] U sledećem primeru izvođenja, drugi Fab krak sadrži fuzioni protein koji predstavlјa autoantigen ili mesto konjugacije za vezivanje autoantigena, kao što je dsDNK. Cilјano dejstvo na patogene, autoantitela ili štetna jedinjenja preko bispecifičnih antitela pronalaska koje je praćeno klirensom posredovanim sa eritrocitima može stoga imati terapijsku primenu u lečenju raznih oboljenja i sindroma.
Konjugacija
[0372] U sledećim primerima izvođenja opisa, prvi i/ili drugi homodimerni protein je povezan sa jedinjenjem koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od: toksina (uklјučujući radioizotop), proleka ili leka. Takvo jedinjenje može učiniti ubijanje cilјnih ćelija efikasnijim, npr. u terapiji kancera. Rezultujući heterodimerni protein je stoga imunokonjugat. Jedinjenje se alternativno može kuplovati sa dobijenim heterodimernim proteinom, tj. nakon što je došlo do razmene Fab kraka.
[0373] Tako, u daljem primeru izvođenja, postupak predmetnog pronalaska dodatno obuhvata korak povezivanja ili konjugacije prvog i/ili drugog homodimernog proteina sa drugim jedinjenjem; npr. toksinom, prolekom ili lekom.
[0374] Alternativno, postupak predmetnog pronalaska dalјe obuhvata korak povezivanja ili konjugacije heterodimernog proteina sa drugim jedinjenjem; npr. toksinom, prolekom ili lekom.
[0375] Kao što je ovde opisano na drugom mestu, prvi i drugi homodimerni protein mogu biti konjugovani sa različitim jedinjenjima, što dovodi do proizvodnje heterodimernog proteina koji je konjugovan sa dva različita jedinjenja; npr. toksinom, prolekom i/ili lekom. Navedeno može biti naročito korisno ukoliko postupak konjugacije sa prvim jedinjenjem nije kompatibilan sa postupkom konjugacije sa drugim jedinjenjem. Različita jedinjenja mogu, na primer, biti dva različita toksina ili dva različita proleka ili dva različita leka ili jedno jedinjenje može biti toksin, dok je drugo prolek ili lek, ili jedno jedinjenje može biti prolek, dok je drugo lek. Može biti upotrebljena bilo koja odgovarajuća kombinacija.
[0376] Alternativno, postupak predmetnog pronalaska obuhvata kombinovanje obrazovanja heterodimernog proteina sa konjugovanjem toksinom, upotrebom redukcije-oksidacije.
[0377] Pogodna jedinjenja za obrazovanje imunokonjugata predmetnog pronalaska uklјučuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidro-testosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, antimetabolite (kao što su metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin, kladribin), alkilirajuće agense (kao što su mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatin), antibiotike (kao što su daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (ranije daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC)), difterijski toksin i srodni molekuli (kao što su difterijski lanac A i njegovi aktivni fragmenti i hibridni molekuli), ricinski toksin (kao što je ricin A ili toksin deglikozilovanog lanca ricina A), toksin kolere, toksin sličan Shiga toksinu (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Shiga toksin, toksin pertusisa, toksin tetanusa, inhibitor Bowman-Birk proteaznog inhibitora soje, egzotoksin Pseudomonas-a, alorin, saporin, modekin, gelanin, lanac abrina A, lanac modekina A, alfa-sarkin, proteini Aleurites fordii, proteini diantina, proteini Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurkin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelina, restrikocin, fenomicin i enomicinski toksini. Drugi pogodni konjugovani molekuli uključuju ribonukleazu (RNazu), DNazu I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, difterinski toksin, endotoksin Pseudomonasa, majtanzinoide, auristatine (MMAE, MMAF), analoge kalihemicina i duokarmicina (Ducry i Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21:5-13), Dolostatin-10, Dolostatin-15, Irinotekan ili njegov aktivni metabolit SN38, pirolobenzodiazepine (PBD).
[0378] U sledećem primeru izvođenja opisa, prvi i/ili drugi homodimerni protein je povezan sa alfa emiterom, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, torijum-227, radijum-223, bizmut-212 i aktinijum-225.
[0379] U dalјem primeru izvođenja opisa, prvi i/ili drugi homodimerni protein je povezan sa beta emitujućim radionuklidom, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, jodijum-313, itrijum-90, fluorin-18, renijum-186, galijum-68, tehnecijum-99, indijum-111 i lutecijum-177.
[0380] U drugom primeru izvođenja, jedinjenje koje treba konjugovati sadrži nukleinsku kiselinu ili molekul povezan sa nukleinskom kiselinom. Prema jednom takvom aspektu predmetnog opisa, konjugovana nukleinska kiselina je citotoksična ribonukleaza, antisens nukleinska kiselina, inhibitorni RNK molekul (npr. siRNK molekul) ili imunostimulišuća nukleinska kiselina (npr. DNK molekul koji sadrži imunostimulišući CpG motiv).
[0381] Može biti upotrebljen bilo koji postupak konjugacije koji je poznat u oblasti tehnike, uklјučujući postupke koji su opisani u Hunter i saradnici, Nature 144, 945 (1962), David i saradnici, Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain i saradnici, J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) i Nygren, J. Histochem. and Citochem.30, 407 (1982). Konjugati se mogu proizvesti hemijskom konjugacijom druge grupe na N-terminalnoj strani ili C-terminalnoj strani proteina (pogledati npr. Antibody Engineering Handbook, ur. Osamu Kanemitsu, objavljenu od strane Chijin Shokan (1994)). Takvi konjugovani derivati antitela mogu takođe biti generisani konjugacijom internih ostataka ili šećera, kada je to pogodno. Agensi mogu biti direktno ili indirektno kuplovani sa proteinom predmetnog opisa. Jedan primer indirektnog kuplovanja drugog agensa je kuplovanje sa spejserskom strukturom. Tehnologije povezivanja za konjugate lekova su nedavno sumirane u Ducry i Stump (2010) Bioconjugate Chem.21:5.
Kompozicije i upotrebe
[0382] Heterodimerni proteini proizvedeni postupkom predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni u farmaceutskoj kompoziciji sa farmaceutski prihvatlјivim nosačem.
[0383] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, Gennaro, ur., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Farmaceutska kompozicija predmetnog opisa može npr.
uklјučivati razblaživače, ispunjivače, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline oslobođene proteina), konzervanse, fiksative tkiva, rastvarače i/ili druge materijale koji su pogodni za uklјučivanje u farmaceutsku kompoziciju.
[0384] Farmaceutski prihvatlјivi nosači uklјučuju bilo koji i sve pogodne rastvarače, medijume za dispergovanje, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonične agense, antioksidanse i agensa za odlaganje apsorpcije i slične koji su fiziološki kompatibilni sa jedinjenjem predmetnog opisa. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu biti upotrebljeni u farmaceutskim kompozicijama predmetnog opisa uklјučuju vodu, fiziološki rastvor, fosfatom puferisan fiziološki rastvor, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol). Farmaceutski prihvatlјivi nosači uklјučuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija koja prethodi primeni. Odgovarajuća fluidnost može biti zadržana, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, kao i održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0385] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati farmaceutski prihvatlјive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slični; (2) antioksidanse rastvorlјive u ulјu, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i (3) agense helacije metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slični.
[0386] Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa mogu takođe sadržavati izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, glicerola, ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0387] Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa mogu takođe sadržavati jedan ili više adjuvanasa koji su pogodni za izabrani način primene, kao što su konzervansi, agensa za vlaženje, emulgatori, dispergujuća sredstva, konzervansi ili puferi, a koji mogu poboljšati rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja predmetnog opisa mogu biti pripremlјena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uklјučujući implantate, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme isporuke. Takvi nosači mogu uklјučivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoesteri i polilaktična kiselina i to samostalno ili sa voskom ili drugim materijalima koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Postupci pripreme takvih formulacija su opšte poznati stručnjacima.
[0388] Sterilni rastvori za injekcije mogu biti pripremljeni uklјučivanjem aktivnog jedinjenja, u potrebnoj količini, u odgovarajući rastvarač sa jednom ili sa kombinacijom sastojaka, npr. kao što je prethodno navedeno i kao što je neophodno, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom.
[0389] Stvarni nivoi doza aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efektivna za postizanje želјenog terapijskog odgovora kod određenog pacijenta, za određenu kompoziciju i način primene i bez toksičnosti za pacijenta. Izabrani nivo doze će zavisiti od raznih farmakokinetičkih faktora uklјučujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog opisa, put primene, vreme primene, stopu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje tretmana, upotrebu drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotreblјenim kompozicijama, kao i starost, poli, težinu, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči i slične faktore koji su dobro poznati u oblasti medicine.
[0390] Farmaceutska kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem i načinom. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog opisa se primenjuje parenteralno. "Parenteralna primena", kako se ovde upotrebljava, označava načine primene koji je drugačiji od enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, a koji uključuje epidermalnu, intravensku, intramuskularnu, intra-arterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratendinsku, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorakalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0391] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenskom ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.
[0392] Prema glavnom aspektu, opis se odnosi na heterodimerni protein u skladu sa opisom, kao što je bispecifično antitelo pronalaska, za upotrebu u vidu medikamenta. Heterodimerni protein opisa može biti upotrebljen u brojne svrhe. Preciznije, kao što je prethodno objašnjeno, heterodimerni proteini opisa mogu biti upotrebljeni za lečenje raznih oblika kancera, uklјučujući metastatski kancer i refraktorni kancer.
[0393] Stoga, prema jednom aspektu, opis se odnosi na postupak inhibicije rasta i/ili proliferacije i/ili ubijanje tumorskih ćelija, postupak koji obuhvata primenu heterodimernog proteina opisa koji je ovde opisan, pojedincu kome je to potrebno.
[0394] U drugom primeru izvođenja, heterodimerni proteini opisa se koriste za lečenje imunih i autoimunih oboljenja, inflamatornih bolesti, infektivnih bolesti, kardiovaskularnih bolesti, oboljenja CNS-a i mišićno-koštanog sistema.
[0395] Režimi doziranja u prethodno navedenim postupcima lečenja, kao i upotrebe, su prilagođeni tako da se obezbedi optimalni želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može biti primenjena jednokratna bolusna doza, može biti primenjeno nekoliko podelјenih doza tokom vremena ili se doza može srazmerno smanjiti ili povećati ukoliko za to postoji indikacija u datoj terapijskoj situaciji.
[0396] Efikasne doze i režimi doziranja za heterodimerne proteine zavise od oboljenja ili stanja koga je potrebno lečiti i isti mogu biti određeni od strane stručnjaka. Primera radi, neograničavajući opseg za terapijski efektivnu količinu bispecifičnog antitela predmetnog pronalaska je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao što je kao oko 0,1-10 mg/kg, na primer, oko 0,5, oko 0,3, oko 1, oko 3, oko 5 ili oko 8 mg/kg.
[0397] Lekar ili veterinar sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike, lako može odrediti i propisati efektivnu količinu farmaceutske kompozicije koja jej potrebna. Na primer, lekar ili veterinar može započeti sa dozom heterodimernog proteina u farmaceutskoj kompoziciji koja je sa nivoom nižim od onih koji su potrebni za postizanje želјenog terapijskog efekta i zatim istu postepeno povećavati dok se ne postigne želјeni efekat. U principu, pogodna doza kompozicije predmetnog opisa će biti ona količina jedinjenja koja predstavlja najnižu doza koja je efektivna u proizvodnji terapijskog efekta. Primena može npr. biti parenteralna, kao što je intravenska, intramuskularna ili subkutana.
[0398] Heterodimerni protein opisa može takođe biti primenjen profilaktički, da bi se smanjio rizik razvoja oboljenja poput kancera, odložio početak pojave nekog događaja u progresiji oboljenja i/ili smanjio rizik recidiva kada je bolest, kao što je kancer, u remisiji.
[0399] Heterodimerni proteini, kao što su bispecifična antitela predmetnog pronalaska, mogu takođe biti primenjeni u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima koji su relevantni za bolest ili stanje koje se leči. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, medikament koji sadrži heterodimerni protein je pripremljen kao kombinacija sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa poput citotoksičnih, hemoterapijskih ili anti-angiogenih agenasa. Ovakva kombinovana primena može biti istovremena, razdvojena ili sekvencijalna. U dalјem primeru izvođenja, predmetni opis obezbeđuje postupak lečenja oboljenja poput kancera, pri čemu postupak obuhvata primenu terapijski efektivne količine heterodimernog proteina, kao što je bispecifično antitelo predmetnog pronalaska, subjektu kome je to potrebno, u kombinacija sa radioterapijom i/ili hirurškom intervencijom.
[0400] Heterodimerni proteini, kao što su bispecifična antitela predmetnog pronalaska, mogu takođe biti upotrebljeni u dijagnostičke svrhe.
PRIMERI
Primer 1: Ekspresioni vektori za ekspresiju humanih IgG1-2F8 i IgG1-7D8
[0401] VH i VL kodirajući regioni HuMab 2F8 (WO 02/100348) i HuMab 7D8 (WO 04/035607) su klonirani u ekspresioni vektor pConGlf (koji sadrži genomsku sekvencu humanog IgG1m(f) alotipskog konstantnog regiona (Lonza Biologics)) u cilju proizvodnje humanog IgG1 teškog lanca i, dalje, pConKappa (koji sadrži konstantni region humanog kapa lakog lanca, Lonza Biologics) u cilju proizvodnje lakog lanca kapa. Za IgG4 antitela, VH regioni su insertovani u pTomG4 vektor (koji sadrži genomsku sekvencu konstantnog regiona humanog IgG4 u pEE12.4 vektoru (Lonza Biologics)). Alternativno, u naknadnim konstruktima, upotrebljeni su vektori koji sadrže kodirajuće regione teškog lanca koji su u potpunosti optimizovanih kodona (IgG1 ili IgG4) u pEE12.4 vektoru ili humani kapa laki lanac HuMab 2F8 ili HuMab 7D8 u pEE6.4 vektoru (Lonza Biologics). Dodatno, VH kodirajući region HuMab-2F8 optimizovanih kodona, zajedno sa sekvencom humanog IgG1m(za) alotipskog konstantnog regiona koja je optimizovanih kodona i sadrži F405L mutaciju, su klonirani u pcDNK3.3 vektor (Invitrogen), čime je dobijen ekspresioni vektor p33G1za-2F8-F405L.

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. In vitro postupak proizvodnje bispecifičnog antitela pune dužine koji obuhvata sledeće korake:
a) inkubiranje prvog antitela pune dužine sa drugim antitelom pune dužine u redukujućim uslovima dovolјnim da se omogući redukcija disulfidnih veza između lanaca u zglobnom regionu, pri čemu je CH3 region navedenog prvog antitela pune dužine prvi CH3 region i sadrži Arg na poziciji 409, dok je CH3 region navedenog drugog antitela pune dužine drugi CH3 region i sadrži:
i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368;
ii) Phe, His, Lys, Arg ili Tyr na poziciji 399;
iii) Gly, Leu, Met ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409, pri čemu prvi CH3 dodatno sadrži Tyr na poziciji 407; ili
iv) aminokiselinu drugačiju od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405 i sadrži Lys na poziciji 409, pri čemu prvi CH3 dodatno sadrži Phe na poziciji 405,
tako da su sekvence navedenih prvih i drugih CH3 regiona različite i takve da je heterodimerna interakcija između navedenih prvih i drugih CH3 regiona jača od svake homodimerne interakcije navedenih prvih i drugih CH3 regiona, pri čemu su pozicije aminokiselina numerisane prema EU-indeksu, kao što je opisano u publikaciji Kabat-a, pri čemu navedena prva i druga antitela pune dužine vezuju različite epitope i pri čemu od navedenih prvih i drugih antitela pune dužine:
1) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG1 izotipa;
2) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG2 izotipa;
3) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG3 izotipa; ili
4) svako sadrži Fc region sa aminokiselinskom sekvencom koja je IgG4 izotipa; i
pri čemu su navedena prva i druga antitela humanizovana antitela ili pri čemu navedena prva i druga antitela sadrže teški lanac pune dužine humanog antitela; i dalјe, pri čemu korak a) podrazumeva inkubaciju tokom najmanje 90 minuta na temperaturi od najmanje 20°C, u prisustvu 2-merkaptoetilamina u koncentraciji od najmanje 25 mM;
b) podvrgavanje najmanje 10 mL kompozicije dobijene u koraku a) uslovima oksidacije dovolјnim da se omogući oksidacija cisteina u bispecifičnom antitelu pune dužine do međulančanih disulfidnih veza, i
c) dobijanje bispecifičnog antitela pune dužine.
2. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu prva i druga antitela pune dužine sadrže Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu u zglobnom regionu.
3. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde korak a) uključuje dodavanje helatornog agensa metala, kao što je EDTA, EGTA ili limunska kiselina.
4. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se korak a) izvodi u redukujućim uslovima sa redoks potencijalom između -150 i -600 mV, kao što je između -350 i -450 mV.
5. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su prvo i drugo antitelo pune dužine u puferu koji sadrži fosfat u opsegu od 1-100 mM, kao što je 1-50 mM fosfat, ili opseg od 1-25 mM ili opseg od 5-20 mM.
6. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 5, gde je pH vrednost pufera opsega 4,5-8,5, kao što je opseg od 6,5 do 7,5.
7. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 5, gde je pufer izabran iz grupe koju čine a) 8,1 mM natrijum fosfat (Na2HPO4-7H2O), 1,5 mM kalijum fosfat (KH2PO4), 138 mM natrijum hlorid (NaCl), 2,7 mM kalijum hlorid (KCl) pH 5,0; b) 8,1 mM natrijum fosfat (Na2HPO4-7H2O), 1,5 mM kalijum fosfat (KH2PO4), 138 mM natrijum hlorid (NaCl), 2,7 mM kalijum hlorid (KCl) pH 7,0; 3) 20 mM Tris-HCl, pH 7,8
8. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je u koraku b) pH u opsegu od 6-8,5.
9. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je u koraku b) redoks potencijal od najmanje -300 mV.
10. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde uslovi oksidacije u koraku b) obuhvataju prisustvo najmanje 0,05 mM kiseonika.
11. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde uslovi oksidacije u koraku b) obuhvataju dodavanje kiseonika, pri čemu se dodavanje kiseonika vrši postupcima koji obuhvataju: mehaničko dodavanje, npr. mućkanjem, mešanjem, povećanjem pritiska ili stvaranjem protoka, ili produvavanje kiseonikom ili vazduhom.
12. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih koraka, gde uslovi oksidacije u koraku b) uključuju oksidujući agens, kao što je npr. dehidroaskorbinska kiselina (dhAA).
13. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde korak b) obuhvata podvrgavanje kompozicije dobijene u koraku a) hromatografiji, kao što je npr. hromatografija na koloni, ili filtraciji, poželјno dijafiltraciji, kao što je tangencijalna protočna filtracija (TFF) ili filtracija normalnim protokom (NFF).
14. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 13, gde se dijafiltracija vrši cirkulisanjem kompozicije kroz patronu sa šupljim vlaknima čija je granična vrednost opsega 10-50 kDa i koja je sa površinom opsega 0,05-1 m<2>, kao i sa ulaznim pritiskom u patronu opsega od 70-280 kPa, dok se ne izvrši zamena od jedne do sedam zapremina pufera.
15. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je koncentracija bispecifičnog antitela pune dužine u kompoziciji koja je dobijena u koraku a) u opsegu od 1-100 g/L.
16. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde uslovi oksidacije u koraku b) uključuju dodavanje jona metala, poželјno jona metala izbranog iz grupe koju čine: bakar, mangan, magnezijum, gvožđe, nikal i kobalt, pri čemu je koncentracija jona metala poželјno opsega od 0,1 do 100 µM.
17. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je odnos prvog i drugog antitela pune dužine u koraku a) u opsegu od 1:1,01 do 1:2.
18. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu bilo prvo antitelo pune dužine ili drugo antitelo pune dužine nije u stanju da se veže za Protein A i/ili Protein G.
19. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prva i druga antitela pune dužine sadrže različite lake lance.
20. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ukupna koncentracija prvog antitela pune dužine i drugog antitela pune dužine u koraku a) iznosi najmanje 0,25 mg/mL.
21. In vitro postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno prvo antitelo pune dužine sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, dok navedeno drugo antitelo pune dužine sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
RSP20191077 2011-10-27 2012-10-26 Proizvodnja heterodimernih proteina RS59166B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161552272P 2011-10-27 2011-10-27
DKPA201100826 2011-10-27
PCT/EP2012/071294 WO2013060867A2 (en) 2011-10-27 2012-10-26 Production of heterodimeric proteins
EP12783931.4A EP2771364B1 (en) 2011-10-27 2012-10-26 Production of heterodimeric proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59166B1 true RS59166B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=48168683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191077 RS59166B1 (sr) 2011-10-27 2012-10-26 Proizvodnja heterodimernih proteina

Country Status (20)

Country Link
US (3) US10344050B2 (sr)
EP (2) EP2771364B1 (sr)
JP (2) JP6475017B2 (sr)
KR (1) KR102049803B1 (sr)
CN (3) CN110964115B (sr)
AU (3) AU2012328322A1 (sr)
BR (1) BR112014010023B1 (sr)
DK (1) DK2771364T3 (sr)
ES (1) ES2739808T3 (sr)
HR (1) HRP20191337T1 (sr)
HU (1) HUE044633T2 (sr)
IL (2) IL232022B (sr)
IN (1) IN2014CN03887A (sr)
LT (1) LT2771364T (sr)
PL (1) PL2771364T3 (sr)
PT (1) PT2771364T (sr)
RS (1) RS59166B1 (sr)
SG (2) SG10201805291TA (sr)
SI (1) SI2771364T1 (sr)
WO (1) WO2013060867A2 (sr)

Families Citing this family (283)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
CA2647846C (en) 2006-03-31 2016-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
PL2202245T3 (pl) 2007-09-26 2017-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sposób modyfikowania punktu izoelektrycznego przeciwciała poprzez podstawienie aminokwasu w cdr
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
US20120071634A1 (en) 2009-03-19 2012-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody Constant Region Variant
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
CA2796181C (en) 2010-04-20 2023-01-03 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
CN107253992B (zh) 2010-05-27 2022-03-11 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
CN103298937B (zh) 2010-11-17 2016-05-25 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
EP2729496B8 (en) 2011-07-06 2017-10-18 Genmab A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the c-terminus of antibody heavy chains
WO2013060867A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
CN109111524B (zh) 2011-10-31 2022-10-28 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
WO2013063702A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
WO2013189516A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Apeiron Biologics Ag Method for treating a gd2 positive cancer
AU2013322710A1 (en) * 2012-09-25 2015-04-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2023-06-20 자임워크스 비씨 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
CN105164157B (zh) * 2013-04-29 2024-05-28 豪夫迈·罗氏有限公司 Fc-受体结合的修饰的非对称抗体及使用方法
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
IL311371B2 (en) 2013-07-05 2024-09-01 Genmab As CD3 antibodies of human origin or chimeras
CN105764922B (zh) * 2013-09-27 2020-07-17 中外制药株式会社 多肽异源多聚体的制备方法
EP3176185A1 (en) 2013-11-04 2017-06-07 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
US9840566B2 (en) 2013-11-21 2017-12-12 Apeiron Biologics Ag Preparations and methods for treating a GD2 positive cancer
LT3071220T (lt) 2013-11-21 2020-02-25 Apeiron Biologics Ag Preparatai, skirti gydyti gd2 gerybinį vėžį
CN110981957B (zh) 2014-01-15 2024-12-24 豪夫迈·罗氏有限公司 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
KR102442436B1 (ko) 2014-03-14 2022-09-15 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
BR112016027888A2 (pt) 2014-05-28 2017-10-24 Zymeworks Inc construto de polipeptídeo de ligação ao antígeno isolado, polinucleotídeo isolado ou um conjunto de polinucleotídeos isolados, vetor ou conjunto de vetores, célula isolada, composição farmacêutica, uso do construto, método para tratar um sujeito com uma doença ou distúrbio, método para obter um construto, método para preparar um construto, meio de armazenamento legível por computador, método para produzir um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno bi-específico e método para preparar um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno isolado
US10647777B2 (en) * 2014-05-28 2020-05-12 Genzyme Corporation Methods of controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US10174095B2 (en) 2014-07-21 2019-01-08 Novartis Ag Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
CN106536540A (zh) 2014-07-24 2017-03-22 基因泰克公司 将试剂缀合至含有至少一个三硫键的蛋白质中的巯基部分的方法
US10329323B2 (en) 2014-07-25 2019-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Method for purifying antibodies using PBS
EP3174546B1 (en) 2014-07-31 2019-10-30 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
DK3183268T3 (da) 2014-08-19 2020-05-11 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af en cd123-kimær antigenreceptor
KR20210149228A (ko) 2014-09-17 2021-12-08 노파르티스 아게 입양 면역요법을 위한 키메라 수용체에 의한 세포독성 세포의 표적화
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EA201790834A1 (ru) 2014-10-14 2018-01-31 Новартис Аг Молекулы антител к pd-l1 и их применение
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
EP3233910B1 (en) 2014-12-19 2019-12-11 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers
US10865253B2 (en) 2014-12-19 2020-12-15 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
AR103172A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novartis Ag Reducción selectiva de residuos de cisteina en anticuerpos il-17
HK1249528A1 (zh) 2015-02-05 2018-11-02 Ablynx N.V. 通过c-末端合成半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
HUE059218T2 (hu) 2015-04-08 2022-11-28 Novartis Ag CD20-terápiák, CD22-terápiák és kombinációs terápiák CD19 kiméra antigénreceptort (CAR-t) expresszáló sejttel
EP3280444B1 (en) * 2015-04-10 2024-05-08 Adimab, LLC Methods for purifying heterodimeric multispecific antibodies from parental homodimeric antibody species
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
KR20240093883A (ko) * 2015-04-28 2024-06-24 자임워크스 비씨 인코포레이티드 변형된 항원 결합 폴리펩티드 작제물 및 이의 용도
BR112018000696A2 (pt) 2015-07-15 2018-09-18 Genmab As ?anticorpo, métodos para reduzir e para aumentar a afinidade de ligação de um anticorpo que se liga ao cd3 humano, para tratar e para diagnosticar uma doença, para produzir um anticorpo e para detectar a presença de antígeno de cd3, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, e, kit?
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
ES2878188T3 (es) 2015-07-29 2021-11-18 Novartis Ag Terapias de combinación que comprenden moléculas de anticuerpos contra LAG-3
US20180222982A1 (en) 2015-07-29 2018-08-09 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
ES2898958T3 (es) 2015-07-30 2022-03-09 Macrogenics Inc Moléculas de unión a PD-1 y LAG-3 y métodos de uso de las mismas
WO2017027861A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MA44082A (fr) 2015-12-14 2018-10-24 Macrogenics Inc Molécules bispécifiques présentant une immunoréactivité par rapport à pd-1 et à ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
WO2017106656A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
CN108697794A (zh) 2015-12-17 2018-10-23 诺华股份有限公司 C-met抑制剂和抗pd-1抗体分子的组合及其用途
EP4643874A2 (en) 2015-12-22 2025-11-05 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
CN105420209A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 海口奇力制药股份有限公司 一种制备rhCNB二聚体的方法
EP3405492B1 (en) 2016-01-21 2020-10-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
US20200281973A1 (en) 2016-03-04 2020-09-10 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
MX2018010988A (es) 2016-03-14 2019-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmaco terapeutico que induce lesion celular para usarse en terapia de cancer.
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
SI3443096T1 (sl) 2016-04-15 2023-07-31 Novartis Ag Sestavki in postopki za selektivno izražanje himerni antigenskih receptorjev
MX2018012648A (es) 2016-04-28 2019-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparaciones que contienen anticuerpos.
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
WO2017194593A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
JP7031934B2 (ja) 2016-05-11 2022-03-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックス
CN109475627B (zh) 2016-05-26 2023-01-06 齐鲁普吉湾生物治疗公司 抗体混合物
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
KR102499718B1 (ko) 2016-06-10 2023-02-13 론자 리미티드 단백질을 안정화시키는 방법
CN119120423A (zh) 2016-07-01 2024-12-13 分解治疗有限责任公司 优化的二核酸酶融合体和方法
MA45672A (fr) 2016-07-14 2019-05-22 Biontech Ag Anticorps multispécifiques dirigés contre cd40 et cd137
US20190336504A1 (en) 2016-07-15 2019-11-07 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN109476763B (zh) * 2016-07-19 2023-11-07 伊班绰斯有限责任公司 双特异性蛋白质及其制备方法
CN110214150A (zh) 2016-07-28 2019-09-06 诺华股份有限公司 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
JP2019527696A (ja) 2016-08-01 2019-10-03 ノバルティス アーゲー プロｍ２マクロファージ分子の阻害剤と組み合わせてキメラ抗原受容体を用いる癌の処置
EP3504234A4 (en) * 2016-09-29 2020-12-02 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. CONSTRUCTIONS OF HETERODIMERIC IMMUNOGLOBULINS AND THEIR PREPARATION PROCESSES
US12448411B2 (en) 2016-09-30 2025-10-21 Cytiva Bioprocess R&D Ab Separation method
CA3039646A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
SG10201913260VA (en) 2016-11-18 2020-03-30 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anti-pd-1/anti-her2 natural antibody structural heterodimeric bispecific antibody and method of preparing the same
EP3544724A4 (en) 2016-11-22 2020-10-14 Elektrofi, Inc PARTICLES INCLUDING A THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC AGENT AND SUSPENSIONS AND THEIR METHODS OF USE
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
EP3589650A1 (en) 2017-03-02 2020-01-08 Novartis AG Engineered heterodimeric proteins
LT3592769T (lt) 2017-03-09 2024-08-26 Genmab A/S Antikūnai, atpažįstantys pd-l1
WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
SG11201909156RA (en) * 2017-04-01 2019-10-30 Beijing hanmi pharm co ltd Anti-pd-l1/anti-pd-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof
EP3606960A1 (en) 2017-04-03 2020-02-12 Oncologie, Inc. Methods for treating cancer using ps-targeting antibodies with immuno-oncology agents
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
AU2018290228B2 (en) 2017-06-21 2021-07-01 Gilead Sciences, Inc. Multispecific antibodies that target HIV gp120 and CD3
CN110785187B (zh) 2017-06-22 2024-04-05 诺华股份有限公司 针对cd73的抗体分子及其用途
US20200223924A1 (en) 2017-06-27 2020-07-16 Novartis Ag Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
MX2020000342A (es) 2017-07-11 2020-08-17 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos.
IL319798A (en) 2017-07-20 2025-05-01 Novartis Ag ANTI-LAG-3 Antibody Dosage Regimens and Their Uses
WO2019023392A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Elektrofi, Inc. FORMATION OF PARTICLES COMPRISING AGENTS
CN111406067B (zh) 2017-08-04 2022-11-08 健玛保 与pd-l1和cd137结合的结合剂及其用途
EP3672986A1 (en) 2017-08-22 2020-07-01 Sanabio, LLC Soluble interferon receptors and uses thereof
JP7450535B2 (ja) 2017-10-20 2024-03-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 単一特異性抗体から多重特異性抗体を生成させるための方法
TWI832824B (zh) 2017-10-30 2024-02-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 自單特異性抗體於活體內產生多特異性抗體之方法
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
SG11202003833TA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody variant and isoform with lowered biological activity
MX2020004756A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Novartis Ag Terapias de combinacion.
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
AU2019215031B2 (en) 2018-01-31 2025-10-09 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019153200A1 (zh) * 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
JP2021512624A (ja) * 2018-02-11 2021-05-20 ベイジン・ハンミ・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッドＢｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 抗ｐｄ−１／抗ｖｅｇｆ天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造
CR20250348A (es) 2018-03-12 2025-09-23 Genmab As ANTICUERPOS QUE SE UNEN A 5T4 (Divisional 2020-463)
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
CN120285175A (zh) 2018-05-16 2025-07-11 詹森生物科技公司 治疗癌症并增强t细胞重定向治疗剂的功效的方法
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
CN112384534A (zh) 2018-05-21 2021-02-19 指南针制药有限责任公司 用于增强nk细胞对靶细胞的杀死的组合物和方法
CN108640997A (zh) * 2018-05-22 2018-10-12 蔡毓旻 一种双特异性抗体
US12115262B2 (en) 2018-05-24 2024-10-15 Elektrofi, Inc. Particles comprising a therapeutic or diagnostic agent and suspensions and methods of use thereof
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
BR112020024351A2 (pt) 2018-06-01 2021-02-23 Novartis Ag moléculas de ligação contra bcma e usos das mesmas
TWI848953B (zh) 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
MY208825A (en) 2018-06-13 2025-05-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3810269A2 (en) 2018-06-19 2021-04-28 Atarga, LLC Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
WO2020070313A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
WO2020094744A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
CN113166269B (zh) 2018-11-13 2025-01-07 指南针制药有限责任公司 对抗检查点分子的多特异性结合构建体及其用途
TWI874341B (zh) * 2018-12-18 2025-03-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
KR20210106484A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 Hdm2-p53 상호작용 억제제와 bcl2 억제제의 조합 및 암 치료를 위한 이의 용도
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN113329759A (zh) * 2019-01-07 2021-08-31 沙塔克实验室有限公司 用于调节γδT细胞的异二聚体蛋白
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
AU2020214626B2 (en) 2019-01-31 2025-10-16 Elektrofi, Inc. Particle formation and morphology
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
AU2020222346B2 (en) 2019-02-15 2021-12-09 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
SG11202108955QA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
CN119661722A (zh) 2019-02-21 2025-03-21 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
US20220088075A1 (en) 2019-02-22 2022-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
PH12021552414A1 (en) 2019-03-29 2022-07-25 Atarga Llc Anti fgf23 antibody
US12466851B2 (en) 2019-04-16 2025-11-11 Bachem Holding Ag Manufacture of disulfide bonded peptides
JP7664183B2 (ja) 2019-05-21 2025-04-17 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａに対する三重特異性結合分子及びその使用
KR102878895B1 (ko) 2019-05-21 2025-10-31 노파르티스 아게 Cd19 결합 분자 및 이의 용도
WO2020236797A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
EA202193322A1 (ru) 2019-05-30 2022-03-10 Эмджен Инк. Конструирование шарнирной области для управления димеризацией антител
MX2022001049A (es) 2019-07-26 2022-05-03 Janssen Biotech Inc Proteínas que comprenden dominios de unión al antígeno de la peptidasa 2 relacionada con la calicreína y sus usos.
GB201910900D0 (en) * 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
WO2021030488A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Bienvenue David Leonard 4-1bb and ox40 binding proteins and related compositions and methods, antibodies against 4-1bb, antibodies against ox40
US11787875B2 (en) 2019-08-15 2023-10-17 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for improved single chain variable fragments
EP4028424A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
AU2020344675A1 (en) 2019-09-13 2022-03-31 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
JP2022553306A (ja) 2019-10-21 2022-12-22 ノバルティス アーゲー Ｔｉｍ－３阻害剤およびその使用
PH12022551291A1 (en) 2019-11-26 2023-11-20 Novartis Ag Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
KR20220128389A (ko) 2020-01-17 2022-09-20 노파르티스 아게 골수이형성 증후군 또는 만성 골수단핵구성 백혈병을 치료하는데 사용하기 위한 tim-3 억제제 및 저메틸화제를 포함하는 조합물
US20210222244A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for single cell secretomics
KR20220145833A (ko) * 2020-01-23 2022-10-31 아다젠 아게 Fc 돌연변이를 갖는 이형이량체 단백질
IL295129A (en) 2020-01-30 2022-09-01 Umoja Biopharma Inc Bispecific transduction enhancer
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
EP4100417A2 (en) 2020-02-05 2022-12-14 Eli Lilly and Company Resin reactors in series peptide synthesizer
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
AU2021225949A1 (en) 2020-02-27 2022-09-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
UY40280A (es) 2020-03-13 2023-07-31 Janssen Biotech Inc Dominios de unión a antígeno que se unen a la proteina cd33 de la superficie de células mieloides
CN115298221A (zh) 2020-03-18 2022-11-04 健玛保 结合b7h4的抗体
CN116249549A (zh) 2020-03-27 2023-06-09 诺华股份有限公司 用于治疗增殖性疾病和自身免疫病症的双特异性组合疗法
KR20230020394A (ko) 2020-04-15 2023-02-10 보이저 테라퓨틱스, 인크. Tau 결합 화합물
JP2023522627A (ja) 2020-04-17 2023-05-31 エレクトロフィ，インコーポレイテッド 連続的な液滴形成及び脱水によって粒子を形成する方法
CN115916166A (zh) 2020-05-08 2023-04-04 健玛保 针对cd3和cd20的双特异性抗体
CN116249714A (zh) 2020-05-27 2023-06-09 詹森生物科技公司 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
CA3182346A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
MX2023000547A (es) 2020-07-16 2023-02-13 Novartis Ag Anticuerpos anti-betacelulina, fragmentos de los mismos, y moleculas de union multiespecificas.
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
JP2023536818A (ja) 2020-07-29 2023-08-30 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｈｌａ－ｇ抗原結合ドメインを含むタンパク質及びそれらの使用
US20230271940A1 (en) 2020-08-03 2023-08-31 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
AU2021322046A1 (en) 2020-08-06 2023-02-02 BioNTech SE Binding agents for coronavirus S protein
US20230322955A1 (en) 2020-08-20 2023-10-12 Amgen Inc. Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region
US20230321285A1 (en) 2020-08-31 2023-10-12 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
CA3192251A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
CN116782933A (zh) 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
BR112023004351A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
JP2023542092A (ja) 2020-09-10 2023-10-05 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
CN116406293A (zh) 2020-09-10 2023-07-07 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
JP2023542924A (ja) * 2020-09-22 2023-10-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 治療タンパク質を生産するための方法
IL301513A (en) 2020-10-02 2023-05-01 Genmab As Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
EP4225786A2 (en) 2020-10-07 2023-08-16 Amgen Inc. Rational selection of building blocks for the assembly of multispecific antibodies
US11926667B2 (en) 2020-10-13 2024-03-12 Janssen Biotech, Inc. Bioengineered T cell mediated immunity, materials and other methods for modulating cluster of differentiation IV and/or VIII
WO2022079199A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 UCB Biopharma SRL Binding molecules that multimerise cd45
JP2023548034A (ja) 2020-10-22 2023-11-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド デルタ様リガンド３（ｄｌｌ３）抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用
CA3199839A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
US20240025993A1 (en) 2020-11-06 2024-01-25 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
JP2023547499A (ja) 2020-11-06 2023-11-10 ノバルティス アーゲー 抗体Ｆｃ変異体
WO2022103773A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Novel linkers of multispecific antigen binding domains
CN116635062A (zh) 2020-11-13 2023-08-22 诺华股份有限公司 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法
IL303328A (en) 2020-12-01 2023-07-01 Aptevo Res & Development Llc Heterodimeric psma and cd3-binding bispecific antibodies
JP2024505049A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ７３及び抗ｅｎｔｐｄ２抗体のための投与方式並びにその使用
TW202304986A (zh) 2021-03-24 2023-02-01 美商健生生物科技公司 靶向cd22及cd79b的抗體
US12084501B2 (en) 2021-03-24 2024-09-10 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising CD3 antigen binding domains and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
MX2023012351A (es) 2021-05-07 2023-10-31 Genmab As Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos biespecificos que se unen al inhibidor de la activacion de celulas t que contiene un dominio v-set 1 (b7h4) y cumulo de diferenciacion 3 (cd3).
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
UY39798A (es) 2021-06-04 2022-12-30 Amgen Inc Anticuerpos anti-ccr8 y usos de los mismos
CA3218481A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 argenx BV Anti-il-9 antibodies and methods of use thereof
IL309319A (en) 2021-06-21 2024-02-01 Genmab As Combined dosage regimen CD137 and PD-L1 binding agents
TW202328193A (zh) 2021-09-13 2023-07-16 美商健生生物科技公司 用於治療癌症的CD33 x Vδ2多特異性抗體
EP4405396A2 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
US20250019455A1 (en) 2021-09-24 2025-01-16 Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
IL311805A (en) 2021-10-08 2024-05-01 Genmab As Antibodies that bind to CD30 and CD3
AU2022380722A1 (en) 2021-11-03 2024-06-20 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of bcmaxcd3 bispecific antibodies
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
EP4436669A1 (en) 2021-11-22 2024-10-02 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
WO2023144290A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2025503177A (ja) 2022-01-28 2025-01-30 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
JP2025505650A (ja) 2022-02-07 2025-02-28 ビステラ， インコーポレイテッド 抗イディオタイプ抗体分子及びその使用
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
AU2023240297A1 (en) 2022-03-22 2024-10-03 Morphosys Ag Deimmunized antibodies specific for cd3
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
AR129136A1 (es) 2022-04-26 2024-07-17 Novartis Ag Anticuerpos multiespecíficos que se dirigen a il-13 e il-18
EP4522757A2 (en) 2022-05-13 2025-03-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
TW202435912A (zh) 2022-08-03 2024-09-16 美商航海家醫療公司 用於穿過血腦屏障之組合物及方法
JP2025535203A (ja) 2022-09-15 2025-10-23 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド タウ結合化合物
EP4612179A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
KR20250097946A (ko) 2022-11-02 2025-06-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 암을 치료하는 방법
AU2023418349A1 (en) * 2022-12-27 2025-07-03 Merus N.V. Method for generating bispecific proteins
WO2024168061A2 (en) 2023-02-07 2024-08-15 Ayan Therapeutics Inc. Antibody molecules binding to sars-cov-2
WO2024194686A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Oxitope Pharma B.V. Anti-phosphocholine antibodies and methods of use thereof
WO2024194685A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Oxitope Pharma B.V. Anti-phosphocholine antibodies and methods of use thereof
TW202506178A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物
TW202506702A (zh) * 2023-04-07 2025-02-16 美商輝瑞股份有限公司 自同源二聚體抗體形成多特異性抗體之方法和包括自該方法得到的多特異性抗體之醫藥產物
KR20250169618A (ko) 2023-04-13 2025-12-03 젠맵 에이/에스 Cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체를 사용하여 림프종을 치료하는 방법
JP2025530208A (ja) 2023-06-30 2025-09-11 ジェンマブ エー／エス 線維芽細胞活性化タンパク質アルファおよびデスレセプター４に結合する抗体
US12319747B2 (en) 2023-07-03 2025-06-03 Medicovestor, Inc. Methods of using anti-SP17 immunotherapeutics
US20250066510A1 (en) 2023-08-07 2025-02-27 Janssen Biotech, Inc. Gucy2c antibodies and uses thereof
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025056180A1 (en) 2023-09-15 2025-03-20 BioNTech SE Methods of treatment using agents binding to epcam and cd137 in combination with pd-1 axis binding antagonists
US12364777B2 (en) 2023-10-20 2025-07-22 Medicovestor, Inc. Homodimeric antibodies for use in treating cancers and methods of use
WO2025122634A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2025133707A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Vectory Therapeutics B.V. Anti-tdp-43 antibodies and uses thereof
US12121587B1 (en) 2023-12-26 2024-10-22 Medicovestor, Inc. Dimeric antibodies
US12116410B1 (en) * 2023-12-26 2024-10-15 Medicovestor, Inc. Methods of manufacturing dimeric antibodies
US20250206816A1 (en) * 2023-12-26 2025-06-26 Medicovestor, Inc. METHODS OF CROSSLINKING IgG
US12240900B1 (en) 2024-02-02 2025-03-04 Medicovestor, Inc. Nucleic acids, vectors, and cells that encode antibodies and other proteins that bind folate receptor alpha
US12378314B1 (en) 2024-02-02 2025-08-05 Medicovestor, Inc. Proteins that bind folate receptor alpha including fully-human antibodies
US12258396B1 (en) 2024-02-02 2025-03-25 Medicovestor, Inc. Methods of using immunotherapeutics that bind folate receptor alpha
WO2025231372A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025231408A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2592668A (en) 1948-09-08 1952-04-15 Dufour Leon Locking mechanism for a differential
US5292668A (en) * 1981-12-21 1994-03-08 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
SE9201331D0 (sv) * 1992-04-28 1992-04-28 Hightech Receptor C O Active Protein l och hybridproteiner daerav
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DE59610754D1 (de) 1996-07-25 2003-11-06 Gsf Forschungszentrum Umwelt Vereinfachte herstellung bispezifischer antikörperfragmente
US20040038894A1 (en) 1996-12-31 2004-02-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (I.N.S.E.R.M.) Compounds for modulating cell negative regulations and biological applications thereof
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
EP1073464B1 (en) 1998-04-28 2004-10-06 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
DE19859115A1 (de) 1998-09-25 2000-03-30 Horst Lindhofer Verwendung von Tumorzellen zeitversetzt in Kombination mit intakten Antikörpern zur Immunisierung
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
IL144084A0 (en) 1999-02-03 2002-05-23 Biosante Pharmaceuticals Inc Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
EP1944317A3 (en) * 2000-09-01 2008-09-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR100945108B1 (ko) 2001-06-13 2010-03-02 젠맵 에이/에스 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간모노클로날 항체
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
PT1558648E (pt) 2002-10-17 2012-04-23 Genmab As Anticorpos monoclonais humanos contra cd20
CN1751236A (zh) * 2002-12-16 2006-03-22 健泰科生物技术公司 表达人cd20的转基因小鼠
WO2005042582A1 (ja) 2003-11-04 2005-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
AU2004252170B2 (en) 2003-06-27 2011-01-27 Biogen Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
WO2005062916A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Centocor, Inc. Methods for generating multimeric molecules
US8772013B2 (en) 2004-02-02 2014-07-08 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells
US7537930B2 (en) * 2004-07-23 2009-05-26 Immunomedics, Inc. Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture
WO2006031994A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
US8911726B2 (en) 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies
SG156672A1 (en) 2004-10-22 2009-11-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
NZ586780A (en) 2005-03-23 2012-02-24 Genmab As Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
EP1960431B1 (en) 2005-12-15 2014-10-01 Genmab A/S Use of effector-function-deficient antibodies for treatment of auto-immune diseases
GB0601513D0 (en) * 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
JP5504390B2 (ja) 2006-03-03 2014-05-28 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド ナタリズマブを用いて炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療する方法
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
JP2009541275A (ja) * 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CL2008001334A1 (es) * 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
AU2008255350B2 (en) 2007-05-31 2014-07-10 Genmab A/S Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals
AU2008255352B2 (en) 2007-05-31 2014-05-22 Genmab A/S Stable IgG4 antibodies
WO2009023562A2 (en) * 2007-08-09 2009-02-19 Wyeth Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
PT2252627T (pt) 2008-01-24 2017-07-24 Esperance Pharmaceuticals Constructos de fusão de domínio lítico e métodos para produzir e utilizar os mesmos
TWI472339B (zh) * 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
EP2282773B2 (en) 2008-05-02 2025-03-05 Seagen Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
GB2461546B (en) 2008-07-02 2010-07-07 Argen X Bv Antigen binding polypeptides
EP3153524B1 (en) * 2008-12-03 2025-04-23 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
US8865648B2 (en) * 2009-04-23 2014-10-21 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Monomeric and dimeric forms of adiponectin receptor fragments and methods of use
CA2759233C (en) 2009-04-27 2019-07-16 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
KR20120027055A (ko) 2009-06-26 2012-03-20 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
WO2011047180A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
CA2796181C (en) * 2010-04-20 2023-01-03 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
RU2624027C2 (ru) * 2010-04-23 2017-06-30 Дженентек, Инк. Получение гетеромультимерных белков
JP6022444B2 (ja) * 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
CN103649117B (zh) * 2011-02-04 2016-09-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Fc变体及其生成方法
DK2681245T3 (en) 2011-03-03 2018-08-13 Zymeworks Inc MULTIVALENT HEAT-MULTIMED SCAFFOLD DESIGN AND CONSTRUCTIONS
CN103796677B (zh) 2011-04-20 2019-08-16 健玛保 针对her2和cd3的双特异性抗体
US20140170148A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
WO2013060867A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
HUE041499T2 (hu) 2012-11-21 2019-05-28 Janssen Biotech Inc Bispecifikus EGFR/C-MET-ellenanyagok
US20150353636A1 (en) 2013-01-10 2015-12-10 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017261467A1 (en) 2017-11-30
IL232022B (en) 2021-05-31
WO2013060867A2 (en) 2013-05-02
AU2017261467B2 (en) 2019-10-24
IL232022A0 (en) 2014-05-28
BR112014010023B1 (pt) 2023-11-21
AU2020200496B2 (en) 2021-12-09
AU2012328322A1 (en) 2014-06-12
AU2020200496A1 (en) 2020-02-13
IN2014CN03887A (sr) 2015-10-16
ES2739808T3 (es) 2020-02-04
CN118290588A (zh) 2024-07-05
JP6797169B2 (ja) 2020-12-09
KR20140091014A (ko) 2014-07-18
US20200048304A1 (en) 2020-02-13
SI2771364T1 (sl) 2019-10-30
HUE044633T2 (hu) 2019-11-28
AU2017261467B9 (en) 2019-11-14
DK2771364T3 (da) 2019-08-19
JP6475017B2 (ja) 2019-02-27
US10344050B2 (en) 2019-07-09
CN110964115B (zh) 2024-03-12
HRP20191337T1 (hr) 2019-10-18
IL282393B (en) 2022-02-01
US11492371B2 (en) 2022-11-08
EP2771364A2 (en) 2014-09-03
PT2771364T (pt) 2019-09-10
CN104114579B (zh) 2020-01-24
EP2771364B1 (en) 2019-05-22
LT2771364T (lt) 2019-09-10
SG11201401422VA (en) 2014-09-26
EP3674320A2 (en) 2020-07-01
US20230227495A1 (en) 2023-07-20
SG10201805291TA (en) 2018-08-30
EP3674320A3 (en) 2020-08-12
IL282393A (en) 2021-06-30
HK1201540A1 (en) 2015-09-04
PL2771364T3 (pl) 2020-01-31
WO2013060867A3 (en) 2013-06-20
US20140303356A1 (en) 2014-10-09
CN104114579A (zh) 2014-10-22
KR102049803B1 (ko) 2019-11-29
JP2019065014A (ja) 2019-04-25
CN110964115A (zh) 2020-04-07
BR112014010023A2 (pt) 2017-04-25
JP2014530891A (ja) 2014-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6797169B2 (ja) ヘテロ二量体タンパク質の作出
JP7623325B2 (ja) ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
JP2019048814A (ja) ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
HK1201540B (en) Production of heterodimeric proteins
HK40027825B (zh) 异二聚体蛋白的生成
HK40121264A (en) Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
HK40027825A (en) Production of heterodimeric proteins
AU2018201503A1 (en) Heterodimeric antibody FC-containing proteins and methods for production thereof
EA043819B1 (ru) Гетеродимерные антитело-fc-содержащие белки и способы их получения