RS59161B1 - Mikro-rnk biomarkeri za identifikovanje rizika i/ili dijagnostikovanje tumora pluća - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na metode identifikovanja i upotrebe, u predijagnostičkom i/ili dijagnostičkom stadijumu, specijalnih molekulskih biomarkera koji se mogu identifikovati u biološkim uzorcima, kao što su na primer cela krv, serum, plazma, prikupljenim od osoba.

[0002] Preciznije, pronalazak se odnosi na metode identifikovanja osoba koje su pod rizikom za tumor, posebno tumor pluća. Pronalazak se odnosi i na metode određivanja prisustva i/ili nivoa agresivnosti tumora, na primer tumora pluća, kod osoba.

OSNOV PRONALASKA

[0003] Kao što je poznato, tumori se ubrajaju u glavne uzroke smrti u svetu. Posebno, tumori pluća vodeći su u pogledu incidence, s obzirom na to da predstavljaju oko 12% svih novih slučajeva kancera, i glavni su uzrok smrti od kancera u svetu, i među muškaracima i među ženama.

[0004] U Evropi godišnje se dijagnostikuje oko 400.000 novih slučajeva (80% kod muškaraca, 20% kod žena). U Italiji je epidemiologija kancera pluća slična, sa incidencom od 34.000 slučajeva godišnje od kojih su 7.000 žene, a 27.000 muškarci.

[0005] Nažalost, incidenca i mortalitet su veoma slični zbog visoko letalne prirode tumora pluća: na svetskom nivou mortalitet iznosi 27.500, od čega su 22.000 muškarci, a 5.500 žene. Ovi epidemiološki podaci i nizak nivo izlečivosti bolesti naglašavaju značaj ustanovljavanja metoda kojima se mogu identifikovati, što je ranije moguće, svi subjekti koji bi mogli imati rizik da razviju kancer pluća. Pored toga, od velikog je značaja razvijanje postupaka koji bi mogli pomoći pri postavljanju tačne dijagnoze tumora, tačnije tumora pluća prisutnog kod svakog ispitivanog subjekata ponaosob.

[0006] Bez obzira na ove potrebe, danas raspoloživi tumorski markeri upotrebljavaju se u dijagnostici, tj. oni identifikuju pacijente kod kojih se bolest već razvila tako da se može identifikovati metodima vizuelizacije (spiralno CT skeniranje). Ovi markeri su, međutim, malobrojni i nisu specifični i suštinski uključuju biohemijske markere, na primer evaluiraju se protein CEA (karcinoembrionski antigen) i neki citokeratini kao što su TPA, TPS i Cyfra 21.1.

[0007] Poznat je i proteomski test (profil 5 proteina) seruma, trenutno predložen od strane Vermillion Inc. koji se koristi da ukaže na verovatnoću (skor od 1 do 10) da ovarijalne mase mogu biti maligne prirode. Ovaj test se koristi kod žena kod kojih su prisutne ovarijalne mase nedefinisane prirode.

[0008] Specifično u vezi sa tumorima pluća, iako su poslednjih godina ostvarena važna poboljšanja u lečenju onkoloških pacijenta, ipak postoji potreba za razvojem efikasnijih metoda koji mogu dovesti do brže terapijske intervencije u kliničkoj obradi mnogih tipova tumora.

[0009] Trenutno, većina tumora pluća dijagnostikuje se u kasnom stadijumu, kada su simptomi klinički evidentni i, na primer u vezi sa nesitnoćelijskim karcinomom pluća (nonsmall-cell lung carcinoma, NSCLC), samo trećina pacijenata sa NSCLC ispoljava bolest koja se može tretirati hirurškom resekcijom, što je pristup koji je i dalje najefikasniji način lečenja ovog tipa tumora.

[0010] Bez obzira na napredak koji je u poslednje vreme ostvaren u lečenju kancera pluća posle resekcije i upotrebe specifičnih tretmana usmerenih ka unapred određenim molekulskim ciljevima, stopa izlečenja nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) i dalje je niska zbog njegovog ponovnog pojavljivanja kod pacijenata koji su rezistentni na lekove ili koji imaju metastaze.

[0011] Efikasnost spiralnog CT skeniranja u identifikovanju kancera pluća kod teških pušača ispituje se u različitim randomizovanim kliničkim studijama u Evropi i Sjedinjenim Američkim Državama. Usled visokog nivoa senzitvnosti, još uvek postoje različite kritične tačke za njegovu upotrebu u savremenoj kliničkoj praksi, kao što je hiperdijagnostikovanje indolentnih nodula, sa posledičnom visokom učestalošću nepotrebnih tretmana i potvrdom efektivnog uticaja na mortalitet.

[0012] U tom kontekstu, poslednjih godina identifikovane su mikro-RNK (kasnije u ovom tekstu označene i kao MiRNK) kao nova klasa cirkulišućih biomarkera, za koje izgleda da su po prirodi vrlo stabilni i visoko specifični za tkivo (Chen X, Cell Res, 2008). MiRNK su mali nekodirajući RNK molekuli (dugi 19-25 nukleotida) koji imaju regulatornu funkciju i sposobni su da modulišu ekspresiju nekoliko ciljnih gena uključenih u različite molekulske mehanizme, među kojima su i oni uključeni u procese transformacije.

[0013] Razvoj visokopropusnih tehnologija omogućio je izučavanje ukupne ekspresije profila miRNK u kanceru (mikro-RNKom) (Cummins JM et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006), što je pokazalo da postoje stotine miRNK čija je ekspresija deregulisana u tumorima (Croce CM, Visone R, AJP, 2009; WO2009/070653, The Ohio State University Research Foundation).

[0014] Pored tkivne specifičnosti, miRNK poseduju visok stepen stabilnosti, lako se detektuju i udružene su sa poznatim kliničko-patološkim parametrima (Lu J et al., Nature, 2005).

[0015] Obavljani su testovi za određivanje da li su miRNK stabilne, detektabilne i da li se mogu kvantifikovati ne samo u tkivima (duboko zamrznutim ili fiksiranim u formalinu, ili u parafinu) nego i u telesnim tečnostima. Rezultati ovog istraživanja pokazali su da su miRNK prisutne i u krvotoku (celoj krvi, serumu i plazmi), gde se nalaze u stabilnoj formi, zaštićene endogenim RNKsi. Cirkulišuće miRNK mogu se detektovati i kvantifikovati, a studije u kojima se određuju njihovi nivoi u biološkim tečnostima ispitivanih onkoloških pacijenata saopštavaju da su nivoi nekih od njih deregulisani u poređenju sa zdravim osobama (Heneghan HM et al., Ann Surg, 2010; Mitchell PS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008; Chen X, Cell Res, 2008).

[0016] Nedavne publikacije saopštavaju profil miRNK koje cirkulišu u serumu i plazmi pacijenata sa tumorom pluća (Hu Z, Clin Oncol, 2010; Silva J, Eur Respir J, 2010 Shen J, Lab Invest, 2010). Posebno, Boeri et al., Proc Natl Acad Sci USA (2011) saopštavaju signaturu miRNK odnosa koja omogućava da se pacijenti klasifikuju prema prisustvu tumora pluća, riziku razvijanja tumora pluća, riziku razvijanja agresivnog tumora pluća i prisustvu agresivnog tumora pluća.

[0017] Bez obzira na postojanje dijagnostičkih sistema za vizuelizaciju i izučavanja u vezi sa mikroRNK, i dalje postoji potreba za ustanovljavanjem postupaka kojima se mogu identifikovati, sa određenim stepenom anticipacije, osobe sa rizikom da razviju kancer pluća i koji eventualno omogućavaju predikciju razvoja agresivnijih i letalnijih formi kancera, posebno tumora pluća. Postoji i potreba za poboljšanjem stepena pouzdanosti trenutno raspoloživih dijagnostičkih tehnika.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0018] U ovakvoj situaciji, cilj predmetnog pronalaska je otklanjanje jednog ili više ograničenja poznatih postupaka i proizvoda.

[0019] Prema tome, cilj pronalaska je obezbeđivanje postupaka za rano određivanje osoba koje imaju rizik da razviju tumor, posebno tumor pluća.

[0020] Još jedan cilj pronalaska je učiniti dostupnim postupke koji pomažu pri dijagnostikovanju tumora, posebno tumora pluća, kod ljudi.

[0021] Još jedan cilj pronalaska je učiniti dostupnim postupke koji se mogu lako izvoditi u laboratorijama, kojima se analiziraju biološki uzorci prikupljeni od osoba.

[0022] Još jedan cilj pronalaska je obezbeđivanje postupaka koji omogućavaju dobijanje zadovoljavajućih rezultata uz korišćenje uzoraka krvi, seruma ili plazme.

[0023] Jedan ili više postavljenih ciljeva suštinski se postiže metodom prema jednom ili većem broju pratećih patentnih zahteva.

[0024] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenja koja uobičajeno razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. U opisu, oblici u jednini uključuju i oblike u množini, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0025] Druge osobine i prednosti pronalaska biće očigledne iz detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0026]

Slika 1 je šematski prikaz kliničko-patoloških karakteristika pacijenata iz setova za obučavanje i validaciju odabranih za analizu ekspresije miRNK u uzorcima plazme. Slika 2 je grafikon koji prikazuje Kaplan-Meierovu krivu preživljavanja pacijenata sa ili bez signature rizika agresivne bolesti.

Slika 3 je grafikon koji prikazuje Kaplan-Meierovu krivu preživljavanja pacijenata sa ili bez signatura prisustva agresivne bolesti.

Slika 4 je niz odnosa i grafikona koji pokazuju analize ekspresije miRNK u uzorcima plazme prikupljenim pre pojave bolesti i u vreme bolesti. Signature odnosa miRNK i njihov smer u analizama navedeni su u tabelama. Panel A prikazuje miRNK signaturu rizika za razvijanje kancera pluća. Panel B prikazuje miRNK signaturu dijagnoze kancera pluća. Prikazane su ROC krive uzoraka koji pripadaju setu za validaciju. Panel C prikazuje Kaplan-Meierove krive preživljavanja pacijenata sa miRNK signaturama rizika agresivne bolesti (risk of aggressive disease, RAD) u uzorcima plazme prikupljenim 1-2 god. pre CT-detekcije kancera pluća. Panel D prikazuje Kaplan-Meierove krive preživljavanja pacijenata sa miRNK signaturama prisustva agresivne bolesti (presence of aggressive disease, PAD) u uzorcima plazme prikupljenim u vreme CT-detekcije kancera pluća. RAD- ili PAD-pozitivni pacijenti pokazuju značajno lošiju stopu preživljavanja nego RAD- ili PAD-negativni pacijenti (P = 0.0006, odnosno P = 0.0001).

Slika 5 predstavlja dva grafikona koja prikazuju rizik manifestovanja tumora pluća (set za validaciju). Levi panel prikazuje ROC krivu kada se 15 miRNK iz Tabele I koriste za kreiranje 30 odnosa iz Tabele III. Desni panel prikazuje ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele Ib koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele IIIb.

Slika 6 predstavlja dva grafikona koja prikazuju rizik manifestovanja agresivnog tumora pluća (set za validaciju). Levi panel prikazuje ROC krivu kada se 16 miRNK iz Tabele II koristi za kreiranje 28 odnosa iz Tabele IV. Desni panel prikazuje ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele IIb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele IVb. Slika 7 predstavlja dva grafikona koja prikazuju rizik manifestovanja agresivnog tumora pluća (set za validaciju). Levi panel prikazuje ROC krivu kada se 18 miRNK iz Tabele V koristi za kreiranje 36 odnosa iz Tabele VII. Desni panel prikazuje ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele Vb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele VIIb. Slika 8 predstavlja dva grafikona koja prikazuju rizik manifestovanja agresivnog tumora pluća (set za validaciju). Levi panel prikazuje ROC krivu kada se 10 miRNK iz Tabele VI koristi za kreiranje 16 odnosa iz Tabele VIII. Desni panel prikazuje ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele VIb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele VIIIb. Slika 9 je grafikon koji prikazuje nivoe ekspresije mir-486-5p i mir-660 u 20 uparenih uzoraka tumorskog i normalnog tkiva pluća istog pacijenta.

Slika 10 je grafikon koji prikazuje rezultate testa prolferacije izvedenog na A549-GFP ćelijama transfektovanim miRNK koja imitira mir-486-5p i mir-660.

Slika 11 je grafikon koji prikazuje rezultate testa migracije izvedenog na A549-GFP ćelijama transfektovanim miRNK koja imitira mir-486-5p i mir-660.

Slika 12 predstavlja dva grafikona koja prikazuju Kaplan-Meierove procene zapaženog petogodišnjeg preživljavanja u INT-IEO studiji CT skrininga. Panel A prikazuje podatke uređene prema obimu oboljenja: 92% za stadijum I (95% CI: 70.0-97.8) i 7% za stadijum II-IV (95% CI: 0.5-27.5, P < 0.001). Panel B prikazuje podatke uređene prema godini detekcije korišćenjem CT: 77% za kancere pluća detektovane u prve 2 godine studije (95% CI: 53.7-89.8) i 36% za kancere pluća dijagnostikovane od treće do pete godine (95% CI: 13.7-58.7, P = 0.005).

Slika 13 je ilustracija koja prikazuje analizu grupisanja podataka, na 24 uzorka normalnog plućnog tkiva uz korišćenje miRNK različito eksprimiranih između pacijenata sa tumorima detektovanim u prve 2 godine i detektovanim kasnijih godina skrininga. Klinički status pacijenta (0 = živ, 1 = mrtav), stadijum tumora i godina detekcije tumora navedeni su u kolonama A, B, odnosno C.

Slika 14A je dijagram koji prikazuje prikupljanje uzoraka i analizu u setu za obuku. Slika 14B je dijagram koji prikazuje prikupljanje uzoraka i analizu u setu za validaciju. Slika 14C je dijagram koji prikazuje prikupljanje uzoraka i analizu u povećanom setu podataka.

Slika 15 je niz grafikona koji prikazuju konzistentnost merenja ekspresije miRNK u uzorcima plazme pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu, kojim se razmatra samo 100 miRNK odabranih za analizu klasnog poređenja. Panel A prikazuje da su tehnički duplikati urađeni za dva uzorka uzeta od pacijenata (341 i 380) i za kontrolni pul (M2). Grafičko prikazivanje izvršeno je nanošenjem prvih dobijenih miRNK vrednosti na apscisu (duplikat A), a vrednosti dobijenih u drugoj evaluaciji na ordinatu (duplikat B). Vrednost linearne regresije pokazuje dobru reproducibilnost merenja. Panel B prikazuje korelaciju između dva različita kontrolna pula. Panel C je grafički prikaz prosečnih vrednosti svih Pearsonovih koeficijenata korelacije između kontrolnih pulova, tehničkih duplikata i između svih uzoraka uzetih od pacijenata (pre i u vreme bolesti).

Slika 16A je grafikon koji prikazuje broj miRNK i odnos miRNK za signaturu rizika. Slika 16B je grafikon koji prikazuje broj miRNK i odnos miRNK za signaturu rizika agresivnosti. Slika 16C je grafikon koji prikazuje broj miRNK i odnos miRNK za signaturu dijagnoze. Slika 16D je grafikon koji prikazuje broj miRNK i odnos miRNK za signaturu agresivne bolesti.

Slika 17 je dijagram toka koji ilustruje upotrebu miRNK i odnos miRNK pacijenta u signaturama rizika, rizika agresivnosti, dijagnoze i agresivne bolesti.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0027] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju određivanje nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, od miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka.

[0028] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju određivanje nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, od miRNK navedenih u Tabeli Ib ili Id, u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenute najmanje dve miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak identifikuje subjekta koji ima rizik manifestovanja tumora. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabeli Ie. Poželjno, tumor ne može biti detektovan spiralnim CT skeniranjem.

[0029] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju određivanje nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabeli IIb ili IId, u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenute najmanje dve miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak identifikuje subjekta koji ima rizik manifestovanja agresivnog tumora. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabelama IIe, IIf ili IIg.

[0030] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju određivanje nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabeli Vb ili Vd, u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenute najmanje dve miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak određuje prisustvo tumora kod pomenutog subjekta. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabelama Ve ili Vf. Poželjno, određivanje prisustva pomenutog tumora potvrđuje detekciju spiralnim CT skeniranjem.

[0031] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju određivanje nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabeli VIb ili VId, u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje u nivou ekspresije pomenute najmanje dve miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak određuje prisustvo agresivnog tumora kod pomenutog subjekta. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabelama VIe ili VIf. Poželjno, određivanje obezbeđuje prognozu preživljavanja bez bolesti posle hirurške intervencije.

[0032] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje 2 miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc; upoređivanje svakog od realnih količnika sa respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivnih kontrolnih vrednosti količnika.

[0033] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje 2 miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb ili VId; upoređivanje svakog od realnih količnika sa respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivnih kontrolnih vrednosti količnika. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabeli Ie, Ile, IIf, IIg, Ve, Vf, VIe ili VIf.

[0034] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i određivanje broja ili procenta realnih količnika koji odstupaju od respektivne kontrolne vrednosti.

[0035] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i definisanje kao osobe sa rizikom, one osobe kod koje najmanje unapred određeni broj ili unapred određeni procenat realnih količnika odstupa od respektivne kontrolne vrednosti količnika.

[0036] Svakom od izračunatih količnika pridružen je respektivni kontrolni količnik, predstavljen odnosom nivoa ekspresije miRNK u kontrolnom biološkom uzorku i biološkom uzorku istog tipa.

[0037] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i korelisanje odstupanja unapred određenog broja ili unapred određenog procenta nivoa ekspresije u odnosu na odgovarajuće kontrolne kriterijume i prisustva ili odsustva rizika da osoba može klinički ispoljiti tumor u unapred utvrđenom vremenu.

[0038] Osoba može klinički ispoljiti agrsivni tumor u unapred određenom vremenu. Unapred određeno vreme iznosi između jedne i tri godine. Poželjno, unapred određeno vreme iznosi ne više od 28 meseci.

[0039] Izračunavanje većeg broja realnih količnika uključuje upotrebu nivoa ekspresije najmanje dve miRNK, ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc. Izračunavanje većeg broja realnih količnika uključuje određivanje unapred određenog broja ili unapred određenog procenta količnika iz reda nivoa ekspresije, gde se količnici biraju između najmanje jednog količnika, najmanje dva količnika, najmanje šest količnika, kako je navedeno u Tabelama IIIa, IIIc, IVa, IVc, VIIa, VIIc, VIIIa, ili VIIIc. Može se odrediti najmanje 20%, 30%, 50% ili 100% realnih količnika navedenih u Tabelama IIIa, IIIc, IVa, IVc, VIIa, VIIc, VIIIa, ili VIIIc. Količnici se mogu birati između količnika navedenih u Tabelama IIIb, IIId, IVb, IVd, VIIb, VIId, VIIIb, ili VIIId.

[0040] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i definisanje kao osobe sa rizikom tumora, one osobe kod koje najmanje 20%, 30%, 50% ili 100% izračunatih realnih količnika odstupa od respektivne kontrolne vrednosti količnika. Osoba ima rizik da razvije tumor u roku od jedne do tri godine od uzimanja biološkog uzorka. Tumor može biti agresivan tumor.

[0041] Metodi predmetne objave mogu uključivati još i definisanje kao osobe koja ima tumor, one osobe kod koje najmanje 20%, 30%, 50%, 60% ili 100% izračunatih realnih količnika odstupa od respektivne kontrolne vrednosti količnika. Tumor može biti agresivan tumor.

[0042] Tumor je tumor pluća. Tumor pluća može biti sitnoćelijski kancer pluća (small-cell lung cancer, SCLC), nesitnoćelijski kancer pluća (non small-cell lung cancer, NSCLC), adenokarcinom pluća (adenocarcinoma, ADC), bronho-alveolarni karcinom (bronchioalveolar carcinoma, BAC), plućni karcinom skvamoznih ćelija (squamous-cell lung carcinoma, SCC) ili krupnoćelijski karcinom (large-cell carcinoma, LC).

[0043] Biološki uzorak je biološka tečnost. Biološka tečnost može biti cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum. Biološki uzorak je poreklom od osobe koja je pušač, koja u momentu uzimanja uzorka nije prikazivala tumor pluća kada je bila podvrgnuta dijagnostičkim metodima vizuelizacije, tačnije, osobe koja je pušač, koja nije prikazivala nodule dimenzija većih od 5 mm kada je bila podvrgnuta spiralnom CT skeniranju.

[0044] Kontrolni biološki uzorak je biološki uzorak uzet od subjekta koji nema bolest. Kontrolni biološki uzorak je biološki uzorak ranije uzet od pomenutog subjekta. Kontrolni biološki uzorak uzet je od pomenutog subjekta do tri godine pre postavljanja dijagnoze. Kontrolni biološki uzorak je biološki uzorak uzet iz različitih tkiva pomenutog subjekta.

[0045] Kako se koristi u ovom tekstu, "osoba", "subjekt", "pacijent" ili "subjekt kojem je to potrebno" je osoba koja ima rizik da razvije tumor ili agresivni tumor ili osoba koja može imati ili može oboleti od tumora ili agresivnog tumora. Ovi izrazi se mogu koristiti naizmenično. Poželjno, osoba je sisar. Sisar može biti, npr., bilo koji sisar, npr čovek, primat, ptica, miš, pacov, kokoška, pas, mačka, krava, konj, koza, kamila, ovca ili svinja. Poželjno, sisar je čovek.

[0046] Kako se koristi u ovom tekstu, mikroRNK ili miRNK je mali nekodirajući RNK molekul (dug 19-25 nukleotida). Posebno, izraz se odnosi na miRNK prisutnu u biološkim uzorcima humanog tkiva, na primer celoj krvi, plazmi, serumu, salivi ili bronhijalnom kondenzatu.

1

Signatura rizika

[0047] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju: određivanje nivoa ekspresije šest miRNK navedenih u Tabeli Ib ili Id u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenutih najmanje šest miRNK u pomenutom biološkom uzorku od pomenutog kontrolnog biološkog uzorka identifikuje subjekta sa rizikom manifestovanja tumora. Poželjno, tumor ne može biti detektovan spiralnim CT skeniranjem.

[0048] Metod uključuje još i: izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje šest miRNK navedenih u Tabeli Ib ili Id; upoređivanje svakog od realnih količnika sa respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivne kontrolne vrednosti količnika.

[0049] Predmetna specifikacija objavljuje miRNK, posebno one priložene u Tabeli Ia ili Ic, kao molekulske biomarkere za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti. Predmetni pronalazak obezbeđuje i to da su odnosi između vrednosti ekspresije miRNK idealni molekulski biomarkeri za ispitivanje u evaluaciji rizika za dobijanje tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti, na primer cele krvi, seruma, plazme, salive ili bronhijalnog kondenzata.

[0050] Kako se koristi u ovom tekstu, osoba sa rizikom za tumor (agresivni ili ne, zavisno od slučaja koji se izučava): osoba koja u referentnom vremenu (1-3 godine) posle prikupljanja biološkog uzorka ima rizik od preko 80% da razvije tumor, na primer tumor pluća, koji je detektabilan korišćenjem tehnika kao što je spiralna CT.

[0051] Korišćenjem nivoa ekspresije miRNK navedenih u Tabeli Ia ili Ic, identifikuju se odnosi između izmerenih vrednosti nivoa ekspresije u odnosu na parove mikroRNK navedene u Tabeli IIIa ili IIIc. Ovi odnosi se mogu upotrebiti za evaluaciju rizika za dobijanje tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti, pri čemu se dobijaju izuzetno pouzdani rezultati predikcije.

[0052] Preciznije, izračunavanjem dovoljnog broja realnih odnosa odabranih iz reda onih u Tabeli IIIa ili IIIc, na primer najmanje 20% njih, i opciono najmanje 50%, moguće je zapaziti kretanje u odnosu na kontrolne odnose. Kao osoba sa rizikom za tumor pluća detektabilan spiralnom CT, u periodu koji obuhvata jednu do tri godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti, definiše se ona osoba kod koje najmanje 30% izračunatih realnih odnosa odstupa od respektivne vrednosti kontrolnog odnosa.

Tabela Ia: Jedan set miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

[0053] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli Ia u uzorcima pacijenata pre bolesti, sa uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazuju senzitivnost od 83.3 (senzitivnost obučavanja od 85.0; senzitivnost validacije od 81.3) i specifičnost od 95.5 (specifičnost obučavanja od 85.7; specifičnost validacije od 100.0).

Tabela Ib: Jedan set poželjnih miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja

tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

[0054] Rezultati upoređivanja poželjnih miRNK navedenih u Tabeli Ib u uzorcima pacijenata pre bolesti, sa uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazuju senzitivnost od 80.6 (senzitivnost obučavanja od 80.0; senzitivnost validacije od 81.3) i specifičnost od 95.5 (specifičnost obučavanja od 85.7; specifičnost validacije 100.0).

Tabela Ic: Još jedan set miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela Id: Još jedan set poželjnih miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

1

Tabela Ie: Još jedan set poželjnih miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IIIa: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije parova miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IIIb: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

[0055] U vezi sa rizikom manifestovanja tumora pluća, Slika 5 prikazuje (levo) ROC krivu kada se 15 miRNK iz Tabele Ia koristi za kreiranje 30 odnosa iz Tabele IIIa i (desno) ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele Ib koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele IIIb.

Tabela IIIc: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije parova miRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

1

[0056] Redukovanjem broja mikroRNK i odnosa (od 27. do 1.), kraće signature testirane su na setu za validaciju, analizirajući njihovu snagu korišćenjem srednjeg procenta korektne klasifikacije između 6 različitih metoda analize klasne predikcije: Složeni kovarijantni

1

prediktor, Dijagonalna linearna diskriminaciona analiza, 1-najbliži sused, 3-najbliža suseda, Najbliži centroid i Metod potpornih vektora. Rezultati su prikazani na Slici 16a.

Tabela IIId: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

[0057] Kako se koristi u ovom tekstu, miRNK odnosi su realni odnosi određeni postavljanjem proporcije između izmerenih vrednosti nivoa ekspresije unapred određenih parova molekula mikroRNK.

Signatura rizika agresivne bolesti

[0058] Predmetna specifikacija objavljuje metode koji uključuju: određivanje nivoa ekspresije šest miRNK navedenih u Tabeli IIb ili IId u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenutih najmanje šest miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak identifikuje subjekta sa rizikom manifestovanja agresivnog tumora. Poželjno, tumor ne može biti detektovan spiralnim CT skeniranjem.

[0059] Metod može uključivati još i: izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje šest miRNK navedenih u Tabeli IIb ili IId; upoređivanje svakog od realnih količnika sa

1

respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivnih kontrolnih vrednosti količnika.

[0060] Predmetna specifikacija objavljuje miRNK, posebno one iz priložene Tabele IIa ili IIc, kao biomarkere za evaluaciju rizika za dobijanje agresivnog tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti. Pored toga, u ovom slučaju takođe, odnosi između vrednosti ekspresije miRNK specifično su identifikovani kao idealni molekulski biomarkeri koji se ispituju da bi se evaluirao rizik za dobijanje agresivnog tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti, koja može biti cela krv, serum, plazma, saliva ili bronhijalni kondenzat.

[0061] Pored toga, korišćenjem nivoa ekspresije miRNK iz Tabele IIa ili IIc, identifikovani su odnosi između merenih vrednosti nivoa ekspresije u odnosu na parove mikroRNK iz Tabele IVa ili IVc za evaluaciju rizika za dobijanje agresivnog tumora pluća u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti. Preciznije, izračunavanjem dovoljnog broja realnih odnosa odabranih između odnosa iz Tabele IVa ili IVc, na primer najmanje 30%, i opciono najmanje 50%, može se izučavati progresija odnosa prema kontrolnim odnosima.

[0062] Definiše se da osoba ima rizik za dobijanje agresivnog tumora pluća u periodu koji obuhvata jednu do tri godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti ako kod te osobe najmanje 50%, opciono najmanje 75% izračunatih realnih odnosa odstupa u odnosu na vrednost respektivnog kontrolnog odnosa.

[0063] Kako se koristi u ovom tekstu, agresivni tumor je tumor, na primer tumor pluća, sa letalnom prognozom ili koji može da prouzrokuje smrt kod 90% pacijenata u roku od pet godina od dijagnoze bolesti.

[0064] Upotreba odnosa miRNK omogućava i pouzdanu predikciju razvoja tumora pluća, posebno agresivnije forme, kod osoba sa visokim rizikom (preko 50 godina starosti i teški pušači) do dve godine pre nego što bolest bude u vidljivom stadijumu pomoću boljih danas raspoloživih tehnika vizuelizacije (spiralna CT). Napominje se takođe da metod u kojem se upotrebljava izračunavanje odnosa, ili odnosa miRNK, opisan gore, može da se aktivira jednostavnim prikupljanjem uzoraka krvi i prema tome, potpuno je neinvazivan i dopušta da se analiza izvrši brzo i ekonomično.

Tabela IIa: mikroRNK upotrebljene za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od prikupljanja uzorka biološke tečnosti).

1

[0065] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli IIa u uzorcima pre bolesti pacijenata sa agresivnim kancerom pluća sa uzorcima pre bolesti pacijenata sa indolentnim kancerom pluća i uzorcima zdravih osoba (kontrola) pokazali su senzitivnost od 94.5 (senzitivnost obučavanja 90.9; senzitivnost validacije 100.0) i specifičnost od 97.6 (specifičnost obučavanja 100.0; specifičnost validacije 96.0).

Tabela IIb: poželjne mikroRNK upotrebljene za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

[0066] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli IIb u uzorcima pre bolesti pacijenata sa agresivnim kancerom pluća sa uzorcima pre bolesti pacijenata sa indolentnim kancerom pluća i uzorcima zdravih osoba (kontrola) pokazali su senzitivnost od 94.5

1

(senzitivnost obučavanja 90.9; senzitivnost validacije 100.0) i specifičnost od 95.0 (specifičnost obučavanja 100.0; specifičnost validacije 92.0).

Tabela IIc: Još jedan set mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IId: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

2

Tabela IIe: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IIf: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IIg: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za evaluaciju rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IVa: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Tabela IVb: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

[0067] U vezi sa rizikom manifestovanja agresivnog tumora pluća, Slika 6 prikazuje (levo) ROC krivu kada se 16 miRNK iz Tabele IIa koristi za kreiranje 28 odnosa iz Tabele IVa i (desno) ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele IIb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele IVb.

Tabela IVc: Još jedan set odnosa između merenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

2

[0068] Redukovanjem broja mikroRNK i odnosa (od 33. do 1.), kraće signature testirane su na setu za validaciju, analizirajući njihovu snagu korišćenjem srednjeg procenta korektne klasifikacije između 6 različitih metoda analize klasne predikcije: Složeni kovarijantni prediktor, Dijagonalna linearna diskriminaciona analiza, 1-najbliži sused, 3-najbliža suseda, Najbliži centroid i Metod potpornih vektora. Rezultati su prikazani na Slici 16b.

Tabela IVd: Još jedan set odnosa između merenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje rizika manifestovanja agresivnog tumora pluća (u roku od 1 do 3 godine od uzimanja uzorka biološke tečnosti).

Signatura dijagnoze

[0069] Predmetna specifikacija objavljuje metod koji uključuje: određivanje nivoa ekspresije šest miRNK navedenih u Tabeli Vb ili Vd u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenutih najmanje šest miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak određuje prisustvo tumora kod pomenutog subjekta. Poželjno, određivanje prisustva pomenutog tumora potvrđuje detekciju spiralnim CT skeniranjem.

[0070] Metod uključuje još i: izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje šest miRNK navedenih u Tabeli Vb ili Vd; upoređivanje svakog od realnih količnika sa respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivne kontrolne vrednosti količnika.

[0071] Predmetna specifikacija objavljuje miRNK, i posebno one navedene u Tabeli Va ili Vc, koje imaju ulogu kao biomolekulski markeri za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe, u dijagnostičke svrhe.

[0072] Predmetna specifikacija objavljuje i to da odnosi između vrednosti nivoa ekspresije parova miRNK predstavljaju validne biomarkere sa dijagnostičkom i prognostičkom funkcijom. Preciznije, miRNK iz Tabele Va ili Vc upotrebljene su za određivanje odnosa iz Tabele VIIa ili VIIc koji predstavljaju odnose između izmerenih vrednosti nivoa ekspresije relativnih parova mikroRNK i koji se koriste za određivanje aktuelnog prosustva (dijagnostikovanje) tumora pluća kod osobe. Preciznije, izračunavanjem najmanje 20% realnih odnosa iz Tabele VIIa ili VIIc moguće je definisati osobu sa prisustvom tumora pluća ako najmanje 30% izračunatih realnih odnosa (kao u Tabeli VIIa ili VIIc) odstupa od respektivne kontrolne vrednosti.

Tabela Va: mikroRNK upotrebljene za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

2

[0073] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli Va u plazmi pacijenata prilikom operacije sa uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazali su senzitivnost od 80.5 (senzitivnost obučavanja 84.2; senzitivnost validacije 76.5) i specifičnost od 95.5 (specifičnost obučavanja 100.0; specifičnost validacije 93.3).

Tabela Vb: poželjne mikroRNK upotrebljene za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

2

[0074] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli Vb u plazmi pacijenata prilikom operacije sa uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazali su senzitivnost od 77.8 (senzitivnost obučavanja 84.2; senzitivnost validacije 70.6) i specifičnost od 90.9 (specifičnost obučavanja 85.7; specifičnost validacije 93.3).

Tabela Vc: Još jedan set mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

Tabela Vd: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

2

Tabela Ve: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

Tabela Vf: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

Tabela VIIa: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

2

Tabela VIIb: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

2

[0075] U vezi sa određivanjem aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe, Slika 7 prikazuje (levo) ROC krivu kada se 18 miRNK iz Tabele Va koristi za kreiranje 36 odnosa iz Tabele VIIa i (desno) ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele Vb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele VIIb.

Tabela VIIc: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

[0076] Redukovanjem broja mikroRNK i odnosa (od 27. do 1.), kraće signature testirane su na setu za validaciju, analizirajući njihovu snagu korišćenjem srednjeg procenta korektne klasifikacije među 6 različitih metoda analize klasne predikcije: Složeni kovarijantni prediktor, Dijagonalna linearna diskriminaciona analiza, 1-najbliži sused, 3-najbliža suseda, Najbliži centroid i Metod potpornih vektora. Rezultati su prikazani na Slici 16c.

Tabela VIId: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe.

Signatura prisustva agresivne bolesti

[0077] Predmetna specifikacija objavljuje metod koji uključuje: određivanje nivoa ekspresije šest miRNK navedenih u Tabeli VIb ili VId u biološkom uzorku uzetom od subjekta, i upoređivanje nivoa ekspresije pomenute miRNK iz pomenutog uzorka uzetog od pomenutog subjekta sa nivoom ekspresije pomenute miRNK iz kontrolnog biološkog uzorka, gde promena ili odstupanje nivoa ekspresije pomenutih najmanje šest miRNK u pomenutom biološkom uzorku u odnosu na pomenuti kontrolni biološki uzorak određuje prisustvo agresivnog tumora kod pomenutog subjekta. Poželjno, određivanje obezbeđuje prognozu preživljavanja bez bolesti posle hirurške intervencije.

1

[0078] Metod može uključivati još i: izračunavanje većeg broja realnih količnika određivanjem odnosa između nivoa ekspresije najmanje jednog para miRNK od najmanje šest miRNK navedenih u Tabeli VIb ili VId; upoređivanje svakog od realnih količnika sa respektivnom kontrolnom vrednošću; i određivanje realnih količnika koji odstupaju od respektivne kontrolne vrednosti količnika.

[0079] Predmetna specifikacija objavljuje miRNK, i posebno one navedene u Tabeli VIa ili VIc, koje se mogu koristiti kao biomolekulski markeri za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe (prognoza). Predmetna specifikacija prikazuje posebno da su odnosi između vrednosti nivoa ekspresije parova miRNK validni biomarkeri sa dijagnostičkom i prognostičkom funkcijom čak i u slučaju agresivnog tumora.

[0080] Preciznije, miRNK iz Tabele VIa i VIc upotrebljene su za određivanje odnosa iz Tabele VIIIa i VIIIc, gde se nalazi lista odnosa između izmerenih vrednosti nivoa ekspresije relativnih mikroRNK parova iz Tabele VIa i VIc upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod individue. Preciznije, detektovanjem najmanje 20% realnih odnosa iz Tabele VIIIa i VIIIc, moguće je definisati osobu koja ima agresivni tumor pluća kao onu kod koje najmanje 60% realnih izračunatih odnosa odstupa u odnosu na respektivnu kontrolnu vrednost.

[0081] Prema tome, upotreba opisanog postupka može pomoći i u rešavanju problema hiperdijagnostikovanja i hipertretmana pacijenata koji nemaju rizik.

[0082] Još preciznije, u kontekstu nadgledanja bolesti korišćenjem spiralne CT, upotreba testa baziranog na ovom metodu može omogućiti selektovanje samo podgrupe pacijenata sa visokim rizikom za razvijanje bolesti, koji će zatim biti pod strožom kontrolom. Pored toga, sposobnost testa za predikciju pacijenata koji će razviti agresivniji oblik bolesti, često nedijagnostikovan CT skeniranjem, omogućava usmeravanje ovih osoba direktno ka specifičnim farmakološkim programima (uključujući odvikavanje od pušenja) i/ili upotrebi specifičnijih dijagnostičkih pregleda baziranih na metaboličko-biološkim karakteristikama kao što su PET sa različitim traserima ili MRI tela, ili ka različitim lokalnim tretmanima kao što su stereotaksična radioterapija, ili drugi tretmani. Upotreba miRNK odnosa je lako primenljiv metod sa potencijalnom trenutnom kliničkom upotrebom, i kojim se izbegava upotreba temeljnije i složenije analize.

Tabela VIa: mikroRNK upotrebljene za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

2

[0083] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli VIa u uzorcima pacijenata sa agresivnim kancerom pluća sa uzorcima indolentnog kancera pluća pre bolesti i uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazali su senzitivnost od 86.7 (senzitivnost obučavanja 80.0; senzitivnost validacije 100.0) i specifičnost od 93.2 (specifičnost obučavanja 94.0; specifičnost validacije 92.6).

Tabela VIb: poželjne mikroRNK upotrebljene za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

[0084] Rezultati upoređivanja miRNK navedenih u Tabeli VIb u uzorcima pacijenata sa agresivnim kancerom pluća sa uzorcima indolentnog kancera pluća pre bolesti i uzorcima bez bolesti (kontrola) pokazali su senzitivnost od 80.0 (senzitivnost obučavanja 80.0; validaciona senzitivnost 80.0) i specifičnost od 93.2 (specifičnost obučavanja 94.0; validaciona specifičnost 92.6).

Tabela VIc: Još jedan set mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

Tabela VId: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

Tabela VIe: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

4

Tabela VIf: Još jedan set poželjnih mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

Tabela VIIIa: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

Tabela VIIIb: odnosi između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

[0085] U vezi sa određivanjem aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe, Slika 8 prikazuje (levo) ROC krivu kada se 10 miRNK iz Tabele VIa koristi za kreiranje 16 odnosa iz Tabele VIIIa i (desno) ROC krivu kada se 6 miRNK iz Tabele VIb koristi za kreiranje 9 odnosa iz Tabele VIIIb.

Tabela VIIIc: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

[0086] Redukovanjem broja mikroRNK i odnosa (od 32. do 1.), kraće signature testirane su na setu za validaciju, analizirajući njihovu snagu korišćenjem srednjeg procenta korektne klasifikacije među 6 različitih metoda analize klasne predikcije: Složeni kovarijantni prediktor, Dijagonalna linearna diskriminaciona analiza, 1-najbliži sused, 3-najbliža suseda, Najbliži centroid i Metod potpornih vektora. Rezultati su prikazani na Slici 16d.

Tabela VIIId: Još jedan set odnosa između izmerenih vrednosti ekspresije poželjnih parova mikroRNK upotrebljenih za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe.

[0087] Kada se dobije miRNK profil subjekta, potrebno je za svaki odnos odrediti da li vrednost prevazilazi unapred određenu graničnu vrednost. Rezultati iz seta za obučavanje i seta za validaciju pokazuju da za signature rizika i dijagnoze opisane gore u Tabelama IIIc, odnosno VIIc, najmanje 30% (npr., oko 10 od 27) odnosa mora prevazilaziti graničnu vrednost da bi se subjekat mogao smatrati pozitivnim u testu. Za dve signature agresivnosti, opisane gore u Tabelama IVc, odnosno VIIIc, najmanje 50% (npr., 17 od 33 i 17 od 32) odnosa mora prevazilaziti graničnu vrednost da bi se pacijent mogao smatrati pozitivnim za signaturu rizika agresivnosti, odnosno prisustvo agresivne bolesti. Kada se smanji broj miRNK koje čine signaturu, procenat pozitivnih odnosa mora biti isti. Granične vrednosti su dobijene setom za validaciju, od uzoraka uskladištenih tokom gotovo 3 godine, i vrednosti su prikazane u Tabelama IIIc, IVc, VIIc i VIIIc.

[0088] Ako se odredi da je subjekt pozitivan za više od jedne signature, najkritičnije se razmatraju ovim redom: rizik, dijagnoza (oba nizak rizik), rizik agresivne bolesti, prisustvo agresivne bolesti (oba visok rizik). Dijagram toka prikazan je na Slici 17.

Kompozicije i metodi lečenja

[0089] Metod može uključivati još i menjanje nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, za koje se nivo ekspresije menja ili odstupa, čime se smanjuje ili eliminiše rizik od razvijanja tumora kod pomenutog subjekta. Metod može uključivati još i menjanje nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, za koje se nivo ekspresije menja ili odstupa, čime se smanjuje ili eliminiše rizik od razvijanja agresivnog tumora kod pomenutog subjekta. Metod može uključivati još i menjanje nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, za koje se nivo ekspresije menja ili odstupa, čime se leči tumor kod pomenutog subjekta. Metod može uključivati još i menjanje nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, za koje se nivo ekspresije menja ili odstupa, čime se leči agresivni tumor kod pomenutog subjekta.

[0090] Poželjno, menjanje nivoa ekspresije pomenute najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, uključuje primenu kod pomenutog subjekta terapijski efikasne količine najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, ili hemijski sintetisanog miRNK mimetika ili rekombinanta istog, ako je nivo ekspresije pomenute najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK niži od kontrolnog nivoa ekspresije, ili primenu kod pomenutog subjekta terapijski efikasne količine jedinjenja sposobnog da inhibira ekspresiju najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, ako je nivo ekspresije pomenute najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK viši od kontrolnog nivoa ekspresije.

[0091] Metod može uključivati povećanje nivoa ekspresije pomenute najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, koje se eksprimiraju u manjoj meri u odnosu na kontrolni nivo ekspresije. Metod može uključivati primenu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži najmanje jednu miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, ili hemijski sintetisani miRNK mimetik ili rekombinant istog. Metod može uključivati primenu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži najmanje jednu miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb ili VId, ili hemijski sintetisani miRNK mimetik ili rekombinant istog. Metod može uključivati smanjivanje nivoa ekspresije pomenute najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, koje se eksprimiraju u povećanoj meri u odnosu na kontrolni nivo ekspresije. Metod može uključivati primenu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži inhibitor najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc. Metod može uključivati primenu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži inhibitor najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb ili VId. Inhibitor može uključivati dvolančanu RNK, kratku interferirajuću RNK (short interfering RNA, siRNK), antisense nukleinske kiseline, anti-miRNK oligonukleotide (anti-miRNA oligonucleotide, AMO), molekule enzimske RNK, ili ribozime.

[0092] Predmetna specifikacija objavljuje i farmaceutsko jedinjenje koje sadrži najmanje jednu miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, hemijski sintetisani miRNK mimetik ili rekombinant istog, ili inhibitor ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0093] Predmetna specifikacija objavljuje i farmaceutsko jedinjenje koje sadrži najmanje jednu miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb ili VId, hemijski sintetisani miRNK mimetik ili rekombinant istog, ili inhibitor ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb ili VId i farmaceutski prihvatljivi nosač. Poželjno, miRNK su miRNK navedene u Tabelama Ie, IIe, IIf, IIg, Ve, Vf, VIe ili VIf.

[0094] Predmetna specifikacija objavljuje metod lečenja osobe kod koje je dijagnostikovano prisustvo tumora pluća ili kod koje je dijagnostikovan rizik za razvijanje tumora pluća, respektivno za lečenje tumora pluća ili sa ciljem smanjenja i/ili eliminisanja rizika za razvijanje tumora pluća.

[0095] Metod uključuje korake merenja nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, prisutnih u uzorku biološke tečnosti prethodno prikupljene od osobe, i zatim određivanje miRNK čije izmerene vrednosti nivoa ekspresije odstupaju od unapred određenog i respektivnog kontrolnog kriterijuma. U evaluaciji odstupanja u odnosu na kontrolni kriterijum mogu se koristiti postupci miRNK odnosa opisani gore za različite slučajeve.

[0096] Kada se odrede miRNK koje se preterano eksprimiraju ili premalo eksprimiraju, metod uključuje menjanje nivoa ekspresije miRNK čiji nivoi ekspresije odstupaju u odnosu na respektivni kontrolni kriterijum.

[0097] Na primer, da bi se promenio nivo ekspresije miRNK, osoba može primiti farmaceutsko jedinjenje sa efikasnom količinom najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, ako je izmereni nivo ekspresije jedne ili više miRNK niži od respektivnog kontrolnog nivoa ekspresije.

[0098] Alternativno, ili kao dodatno gornjem, moguće je takođe kod osobe primeniti farmaceutsko jedinjenje koje sadrži efikasnu količinu bar onog jedinjenja koje inhibira ekspresiju najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc ako i za one miRNK čiji su izmereni nivoi ekspresije iznad kontrolnog nivoa ekspresije.

[0099] Na ovaj način, vrednosti nivoa ekspresije miRNK čija je ekspresija smanjena u odnosu na respektivni kontrolni nivo ekspresije, mogu se ponovo postaviti na kontrolni nivo ekspresije, i/ili može se redukovati nivo ekspresije miRNK koje se preterano eksprimiraju.

4

[0100] Sa ciljem ponovnog uspostavljanja nivoa miRNK sa sniženom ekspresijom, može se primeniti terapijski efikasna količina jedinjenja koje sadrži najmanje jednu miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, hemijski sintetisanu (miRNK mimetici) ili rekombinantnu.

[0101] Sa ciljem redukovanja vrednosti nivoa ekspresije na kontrolni nivo ekspresije, za miRNK koje se preterano eksprimiraju u odnosu na respektivni kontrolni nivo ekspresije, može se primeniti terapijski efikasna količina jedinjenja koje uključuje inhibitor najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od mikroRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc. Inhibitor uključuje, na primer, jedno ili više od sledećeg: dvolančanu RNK, opciono kratku interferirajuću RNK (siRNK), antisense nukleinske kiseline (anti-miRNK oligonukleotide (AMO), molekule enzimske RNK (ribozime). Inhibitor je usmeren ka specifičnom proizvodu mikroRNK i interferira sa ekspresijom (inhibirajući translaciju ili indukujući degradaciju) ciljnog gena mikroRNK.

[0102] Primena gornjih jedinjenja (sintetskih mikroRNK ili mimetičkih miRNK i inhibitora mikro-RNK) može se na primer obaviti putem virusnih sistema ili nanočestica koje sadrže mikroRNK ili mikroRNK inhibitor kovalentno povezane sa lipidima ili inkapsulirane u lipozome.

[0103] Jedinjenja se mogu primeniti bilo kojim načinom poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na intranazalnu instilaciju, inhalaciju (aerosol), sistemsku primenu (injekcija ili infuzija), direktnu inokulaciju u tumor (kada je prisutan i vidljiv), intrapleuralnu primenu, endopleuralnu primenu ili njihovu kombinaciju.

[0104] U vezi sa doziranjem, kontinuirano i produženo doziranje može se vršiti tokom vremena. Pošto su miRNK molekuli "prirodno" prisutni u organizmu, ne dolazi do relevantne toksičnosti.

Biomarkerski aparati i kitovi

[0105] Predmetna specifikacija objavljuje artikl koji uključuje podlogu sa velikim brojem mesta, gde svako mesto može da primi količinu biološkog uzorka, pri čemu svako mesto sadrži najmanje jedan reagens sposoban da se veže sa najmanje jednom miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc.

[0106] Reagens može da se bira iz grupe koja se sastoji od polinukleotida koji uključuje nukleotidnu sekvencu najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, od miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc; polinukleotida koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, od miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc; i molekulsku probu konfigurisanu tako da prepozna sekvencu najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, od miRNK navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc.

[0107] Predmetna specifikacija objavljuje i artikl koji uključuje podlogu sa velikim brojem mesta, gde svako mesto može da primi količinu biološkog uzorka, pri čemu svako mesto sadrži najmanje jedan reagens sposoban da se veže sa najmanje jednom miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ib, Id, IIb, IId, Vb, Vd, VIb, ili VId. Poželjno, miRNK može biti miRNK navedena u Tabelama Ie, IIe, IIf, IIg, Ve, Vf, VIe ili VIf.

[0108] Predmetna specifikacija objavljuje i aparat koji uključuje najmanje jednu jedinicu koja može da primi najmanje jedan od artikala predmetnog pronalaska; sredstva za određivanje nivoa ekspresije najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK, navedenih u Tabelama Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, i sredstva za izračunavanje realnih količnika, iz reda nivoa ekspresije najmanje jednog para, najmanje dva para ili najmanje šest parova miRNK od parova miRNK navedenih u Tabelama IIIa, IIIc, IVa, IVc, VIIa, VIIc, VIIIa, ili VIIIc.

[0109] Sredstva za određivanje vrednosti nivoa ekspresije mogu se birati iz grupe koja se sastoji od kvantitativne PCR u realnom vremenu, mikrofluidnih kartica, mikročipova, RT-PCR, kvantitativne ili semikvantitativne, Northern blota, hibridizacije u rastvoru, i sekvenciranja.

[0110] Predmetna specifikacija objavljuje medicinske kitove korisne za efikasnu i jednostavnu primenu gore opisanih metoda, za određivanje rizika dobijanja tumora ili za dijagnostikovanje tumora, na primer korišćenjem uzorka krvi uzetog od osobe.

[0111] U svojoj opštoj formi, kit sadrži platformu koja ima veliki broj mesta, od kojih je svako predodređeno da primi respektivnu određenu količinu uzorka biološke tečnosti (na primer cela krv, serum, plazma, saliva ili bronhijalni kondenzat). U strukturnom smislu platforma može biti podloga za mikrofluidnu karticu sa miRNK od interesa sa kanalićima za distribuciju do respektivnih mesta unapred određenog broja uzoraka biološke tečnosti. Svako mesto sadrži reagens sposoban da se veže sa najmanje jednom miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa ili IIc za određivanje rizika za dobijanje tumora ili reagens koji je sposoban da se veže sa najmanje jednom miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Va, Vc, VIa ili VIc za dijagnostikovanje tumora, na takav način da se omogući detektabilnost aparatom opisanim kasnije u ovom tekstu.

[0112] Na primer, on može uključiti najmanje jedno izabrano iz grupe koja sadrži: polinukleotid koji uključuje nukleotidnu sekvencu najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, polinukleotid koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc, molekulsku probu konfigurisanu tako da prepozna sekvencu najmanje jedne miRNK, najmanje dve miRNK ili najmanje šest miRNK od miRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc.

[0113] Opisani medicinski kit može da se koristi i sa medicinskim aparatom koji uključuje jedinicu koja definiše ležište za prihvatanje jednog ili više kitova i sredstva za određivanje vrednosti ekspresije mikroRNK iz Tabela Ia, Ic, IIa, IIc, Va, Vc, VIa, ili VIc. Određivanje vrednosti nivoa ekspresije može se izvesti na bilo koji način poznat u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na kvantitativni PCR u realnom vremenu, mikrofluidne kartice, mikročipove, kvantitativnu ili semikvantitativnu RT-PCR, Northern blot, hibridizaciju u rastvoru, i sekvenciranje, ili njihovu kombinaciju.

[0114] Aparat može sadržati i sredstva za izračunavanje vrednosti realnih odnosa između vrednosti nivoa ekspresije parova mikroRNK kao u Tabelama IIIa, IIIc, IVa, IVc, VIIa, VIIc, VIIIa, ili VIIIc. Ova sredstva mogu uključivati program i procesorsku jedinicu gde program sadrži instrukcije koje, kada ih izvodi procesor, omogućavaju izračunavanje odnosa. Alternativno, može se obezbediti analogni kružni put koji može da obavi izračunavanja.

miRNK

[0115] Ukupno, 24 miRNK sačinjava signaturu rizika (risk, R), signaturu agresivne bolesti (aggressive disease, AR), signaturu dijagnoze (diagnosis, D) i signaturu prisustva agresivne bolesti (aggressive disease, AD). U Tabeli IX navode se ove 24 miRNK i koliko često se pojavljuju kao deo odnosa za svaku signaturu.

Tabela IX

4

[0116] Predmetna specifikacija objavljuje aparate i kitove za detektovanje najmanje jedne, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje šest ili sve dvadeset četiri miRNK iz Tabele IX. Predmetni pronalazak obezbeđuje aparate i kitove za aktiviranje ili stimulisanje aktivnosti ili ekspresije najmanje jedne, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje šest ili sve dvadeset četiri miRNK iz Tabele IX. Predmetna specifikacija objavljuje aparate i kitove za smanjenje ili inhibiranje aktivnosti ili ekspresije najmanje jedne, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje šest ili sve dvadeset četiri miRNK iz Tabele IX. Predmetni pronalazak obezbeđuje i farmaceutske kompozicije za aktiviranje ili stimulisanje aktivnosti ili ekspresije najmanje jedne, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje šest ili sve dvadeset četiri miRNK iz Tabele IX. Predmetna specifikacija objavljuje i farmaceutske kompozicije za smanjenje ili inhibiranje aktivnosti ili ekspresije najmanje jedne, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje šest ili sve dvadeset četiri miRNK iz Tabele IX.

[0117] Tabela X zbirno prikazuje miRNK objavljene predmetnom specifikacijom.

Tabela X

4

4

4

4

4

1

2

[0118] Druge osobine i prednosti predmetne objave vidljive su iz različitih primera.

PRIMERI

Primer 1

Studije, materijali i metodi

[0119] U ovoj studiji ispitivan je profil ekspresije miRNK u plazmi osoba uključenih u protokole skrininga korišćenjem spiralne CT. Ovo ispitivanje obavljeno je sa ciljem da se verifikuje kapacitet miRNK kao nove klase biomolekulskih markera za: predikciju rizika razvijanja tumora, posebno tumora pluća, i dijagnostikovanje tumora, posebno tumora pluća, a time i kao pomoćnog prognostičkog sredstva za diskriminisanje pacijenata sa indolentnim ili agresivnim lezijama pluća.

[0120] Korišćeni su uzorci plazme uzeti od pušača, pri čemu su te osobe bile starije od 50 godina, a vremenski parametar je iznosio između jedne i dve godine pre detektovanja prisustva tumora pluća spiralnom CT, kod istih osoba. Isto tako, korišćeni su i uzorci plazme prikupljeni u momentu pojave bolesti (detektovanje korišćenjem spiralne CT). Uzorci plazme dobijeni su od pacijenata kod kojih se razvio tumor pluća sa različlitim karakteristikama u pogledu kliničke agresivnosti (indolentni noduli ili odmakli i metastatski tumori), kao i od osoba kod kojih se bolest nije pojavila tokom čitavog trajanja skrininga.

[0121] U prvom stupnju istraživanja, obavljena je identifikacija mikroRNK prisutnih u plazmi, korišćenjem mikrofluidnih kartica, model: TaqMan®, Applied Biosystems. Od 378 analiziranih mikroRNK, 100 je bilo stabilno prisutno u plazmi zdravih pušača korišćenih kao kontrolna grupa. Prema tome, uz veliku količinu početnih podataka, postojala je opšta saglasnost o mogućnosti normalizovanja nivoa ekspresije pojedinačnih mikroRNK prema srednjoj vrednost nivoa ekspresije 100 mikroRNK za svaku osobu (Mestdagh P et al. Genome Biol, 2009). Podaci dobijeni korišćenjem ovog tipa normalizacije upoređivani su sa onima koji su dobijeni normalizovanjem u odnosu na potencijalnu mikroRNK "housekeeping" (na primer mir-16, mammU6, RNU44 ili RNU48).

[0122] Izumitelji su tada odlučili da više ne koriste vrednosti nivoa ekspresije pojedinačnih mikroRNK, već umesto toga, odnose između njihovih parova. Vrednost praga ciklusa (cycle threshold, Ct) dobijena pomoću qReal-Time PCR sa SDS 2.2.2® softverom (Applied Biosystems) transformisana je u odgovarajuću ekspresionu vrednost (2<-Ct>). Zatim je izračunavan odnos između vrednosti nivoa ekspresije svakog mogućeg para mikroRNK, kako bi se dobilo ukupno 4950 odnosa: ukupno 4950 odnosa bilo je dato formulom 100 * 99/2 pošto odnos između dve miRNK i recipročni odnos sadrže iste podatke. Konačno, analizirana je varijacija ovih odnosa (nazvanih "miRNK odnosi") u plazmi različitih klasa pacijenata da bi se identifikovali biomarkeri plazme.

[0123] Rezultati su pokazali da su mikroRNK u najvećoj količini prisutne u odnosima koji vrše diskriminaciju između klasa pacijenata iste kao one koje se pojavljuju u analizama izvedenim normalizovanjem na srednju vrednost nivoa ekspresije 100 mikorRNK za svaku osobu, čime je izvršena validacija metoda baziranog na odnosima niRNK, za kvantifikovanje mikroRNK od interesa.

[0124] Preciznije, sa ciljem da u plazmi identifikuju biomarkere koji mogu da predvide pojavu tumora pluća, izumitelji su izučavali profil ekspresije mikroRNK koje cirkulišu u prikupljenim uzorcima do dve godine pre dijagnoze bolesti i u trenutku operacije, kod pacijenata iz dve nezavisne kliničke studije, kako je rečeno ranije u ovom tekstu, za rano dijagnostikovanje tumora pluća kod osoba sa visokim rizikom (starost >50 godina i pušači), korišćenjem spiralne CT. U prvom setu za obučavanje, napravljenom od 40 uzoraka plazme uzetih od 19 pacijenata i 27 uzoraka plazme zdravih kontrolnih osoba u 5 različitih pulova, analizirani su nivoi ekspresije miRNK korišćenjem TaqMan MicroRNA testova (Applied Biosystems) sa ciljem identifikovanja značajno različitih miRNK odnosa (p<0.05) između uzoraka plazme prikupljenih pre bolesti, u momentu operacije i od zdravih osoba.

[0125] Specifičnost i senzitivnost tako dobijenih signatura mikroRNK upoređivane su sa setom za validaciju sastavljenim, kako je opisano ranije u ovom tekstu, od 32 uzorka plazme uzetih od 22 pacijenta i 54 uzorka plazme zdravih osoba, grupisanih u 10 različitih pulova.

4

[0126] Za generalizaciju signatura upotrebljenih za predikciju agresivnosti bolesti, izumitelji su grupisali dva kohorta (set za obučavanje i set za validaciju) sa ciljem dobijanja dovoljnog broja za statističku analizu. Slučajevi sa nepovoljnom prognozom bili su prvo upoređivani sa respektivnim kontrolama i tako dobijene signature su testirane da bi se evaluirao njihov efektivni kapacitet za diskriminaciju pacijenata sa lošom prognozom od onih koji imaju dobru prognozu.

[0127] Kao što je već pomenuto, signature mikroRNK identifikovane u različitim analizama validirane su na dva nezavisna seta sačinjena od osoba sa visokim rizikom (pušači stariji od 50 godina) uključenih u dve različite kliničke strudije za rano identifikovanje tumora pluća korišćenjem niskodozne spiralne CT: prvi set, ili set za obučavanje, sačinjen od 40 uzoraka plazme od 19 pacijenata i 27 uzoraka plazme od zdravih kontrolnih osoba, grupisanih u 5 različitih pulova i drugi set ili set za validaciju (tj., drugi set osoba) sačinjen od 32 uzorka plazme od 22 pacijenta i 54 uzorka plazme od zdravih kontrolnih osoba, grupisanih u 10 različitih pulova.

[0128] Slika 1 sumira patološke kliničke karakteristike seta za obučavanje i seta za validaciju, odabranih za analizu nivoa ekspresije miRNK u uzorcima plazme.

[0129] Da bi se odredio profil mikroRNK u uzorcima plazme, ukupna RNK se ekstrahuje iz 200 μl plazme korišćenjem mirVana™ PARIS™ kita (Ambion), uz eluiranje u 50 μl pufera za eluiranje.

[0130] Nivoi ekspresije određeni su korišćenjem q-Real Time PCR (kvantitativna PCR u realnom vremenu) počevši od 3 μl eluata prvo korišćenjem Megaplex™ Pools protokola na mikrofluidnoj kartici, tip A (Applied Biosystems), zatim Multiplex™ Pools protokola (Applied Biosystems).

[0131] Svi podaci su ekstrapolirani korišćenjem Sequence Detection System softvera (SDS 2.2.2® Applied Biosystems), uz manuelno postavljanje praga na 0.2 i bazalne vrednosti između 3 i 18 ciklusa (na ukupno 40).

[0132] Pored standardne opreme za molekularnu biologiju, korišćeni su i Real-time quantitative PCR 7900-HT (Applied Biosystems) i GeneAmp© 9700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

[0133] Identifikacija signature bazirane na miRNK sposobne da identifikuje osobe sa rizikom da razviju tumor pluća

[0134] Uzorci plazme prikupljeni 1-2 godine ranije od pacijenata kod kojih je tumor kasnije dijagnostikovan korišćenjem spirlane CT, analizirani su i upoređeni sa kontrolnim pulom sastavljenim od zdravih osoba.

[0135] U obučavanju je identifikovana signatura koja sadrži 14 miRNK odnosa sačinjenih od 14 mikroRNK, sposobna za korektnu diskriminaciju 18 od 20 uzoraka pre bolesti od osoba koje će zatim razviti bolest (senzitivnost 90%), dok je samo jedan kontrolni pul bio pozitivan za ovu signaturu (specifičnost 80%). U setu za validaciju senzitivnost je bila 80%, dok je specifičnost bila 90% (AUC-ROC=0.85, p<0.001).

[0136] Odnosi miRNK iz prvog primera su potom navedeni i saopšteni i na Slici 4A.

[0137] Prediktivni kapacitet ove signature validiran je na uzorcima prikupljenim do 28 meseci pre dijagnoze bolesti korišćenjem spiralne CT i mikroRNK koje su najčešće bile deregulisane bile su: mir-660, mir-140-5p, mir-451, mir-28-3p, mir-30c i mir-92.

Identifikacija signature bazirane na miRNK sposobne da dijagnostičku vrednost

[0138] Uzorci plazme sakupljeni u trenutku operacije ili pri identifikaciji bolesti spiralnom CT upoređivani su sa kontrolnim pulovima. U setu za obučavanje, panel od 16 miRNK odnosa, napravljen od 13 mikroRNK, korektno klasifikuje 16 od 19 pacijenata sa senzitivnošću od 84% i specifičnošću od 80%. U setu za validaciju senzitivnost je 75% i specifičnost je 100% (AUC-ROC=0.88, p<0.0001).

[0139] Niža senzitivnost u setu za validaciju može da se korelira sa prisustvom većeg broja malih indolentnih nodula, kod dva pacijenta, čiji uzorci krvi nisu bili usklađeni ni po signaturi rizika u uzorcima pre pojave bolesti, ni po signaturi u uzorcima uzetim u prisustvu bolesti.

[0140] miRNK odnosi iz drugog primera navedeni su u nastavku i saopšteni na Slici 4B.

[0141] Ova dijagnostička signatura se zatim koristi za verifikovanje prisustva bolesti u uzorcima plazme prikupljenim pre identifikacije bolesti spiralnom CT. U setu za obučavanje, 11 od 20 (55%) slučajeva klasifikovano je kao prisustvo bolesti i, veoma interesantno, od ovih 11, 10 su bili ili slučajevi pesimističnih dijagnoza ili su pripadali pacijentima kod kojih je tumor identifikovan u kasnijim godinama skrininga, ili kod kojih su identifikovani agresivniji tumori sa gorom prognozom.

[0142] Veoma slični rezultati dobijeni su u setu za validaciju, pošto je u 10 od 15 (66.6%) uzoraka pre bolesti bila prisutna signatura prisustva bolesti. Bila su samo 4 miRNK odnosa zajednička za signature rizika i signature dijagnoze; delom su različite i uključene mikroRNK: mir-17, mir-660, mir-92a, mir-106a, mir-19b su najviše deregulisane mikroRNK u trenutku postavljanja dijagnoze tumora pluća.

Identifikacija signature bazirane na miRNK za rizik razvijanja agresivnog tumora pluća

[0143] Identifikovani su profili mikroRNK iz uzoraka pre bolesti sa nepovoljnom prognozom i identifikovano je 10 miRNK odnosa koji su mogli da prepoznaju 5 od 5 pacijenata u prvom setu, 4 od 5 u setu za validaciju i sa specifičnošću za oba od 100%. Napominje se da su mir-221, mir-660, mir-486-5p, mir-28-3p, mir-197, mir-106a, mir-451, mir-140-5p i mir-16 deregulisane mikroRNK.

[0144] Odnosi miRNK ovog trećeg primera navedeni su u nastavku i saopšteni na Slici 4C.

[0145] Ova signatura je zatim testirana na uzorcima pre bolesti pacijenata sa dobrom prognozom u setu za obučavanje i u setu za validaciju. Signatura klasifikuje, respektivno u dva seta, 33.3% i 45% uzoraka; Slika 2 prikazuje Kaplan-Meierovu krivu preživljavanja pacijenata sa ili bez signature rizika agresivne bolesti; kriva sa agresivnom signaturom predstavljena je kontinuiranom linijom i identifikovana sa RAD+ (rizik agresivne bolesti, risk of aggressive disease ) dok je kriva bez signature rizika agresivne bolesti predstavljena diskontinuiranom linijom i identifikovana kao RAD- (rizik agresivne bolesti -), u uzorcima plazme prikupljenim 1-2 godine pre identifikacije bolesti spiralnom CT.

[0146] Od značaja je činjenica da većina identifikovanih uzoraka pripada osobama koje su razvile tumor između III i V godine skrininga, nezavisno od stepena tumora. Ovo podržava ranije zapažanje o tumorskim i normalnim uzorcima plućnog tkiva, gde je različiti profil mikroRNK bio prisutan respektivno u tumorskom i normalnom tkivu istih pacijenata. Treba napomenuti da je među pacijentima sa tumorom dijagnostikovanim u drugoj godini skrininga (svi tumori u stadijumu Ia i Ib), samo jedan slučaj u stadijumu Ib ispoljio signaturu rizika agresivnosti.

Identifikacija signature bazirane na miRNK za prognozu pacijenata identifikovanih spiralnom CT

[0147] Analizirani su uzorci uzeti od pacijenata sa pesimističnom prognozom, prikupljeni u momentu dijagnoze bolesti, otkrivajući signaturu od 10 miRNK odnosa, svi sadrže mir-486-5p, koja identifikuje 7 od 8 pacijenata sa pesimističnom prognozom u setu za obučavanje, 2 od 3 u setu za validacijuog i bez kontrolnog pula u oba seta podataka.

[0148] Odnosi miRNK ovog četvrtog primera navedeni su u nastavku i saopšteni na Slici 4D.

[0149] Pored toga, samo 2 od 11 i 2 od 13 pacijenata sa dobrom prognozom, u prvom odnosno drugom setu, pozitivna su za ovu signaturu. Slika 3 saopštava Kaplan-Meierove krive preživljavanja pacijenata sa ili bez signatura prisustva agresivne bolesti (respektivno identifikovane kontinuiranom linijom PAD+, što znači prisustvo agresivne bolesti , i isprekidanom linijom PAD-, što znači prisustvo agresivne bolesti -) u uzorcima plazme prikupljenim u momentu identifikovanja bolesti spiralnom CT.

[0150] Pored toga, ova signatura je upotrebljena za klasifikovanje uzoraka pre bolesti u oba seta podataka. Polovina pacijenata sa pesimističnom prognozom takođe prikazuje ovu signaturu agresivnosti, dok je kod onih sa dobrom prognozom, od 6 pozitivnih za ovu signaturu, 5 tumora identifikovanom posle treće godine skrininga.

[0151] Treba napomenuti da je ekspresija mir-486-5p, u poređenju sa mir-21, mir-126, mir-15b, mir-148a, mir-142-3p, mir-17, mir-197, mir-221, mir-28-3p i mir-106a, uvek snižena u plazmi pacijenata sa pesimističnom prognozom.

[0152] Na osnovu gore saopštenih rezultata, izumitelji su zaključili da su mikroRNK prisutne u plazmi korisne za identifikovanje prisustva tumora pluća čak 1-2 godine pre detekcije spiralnom CT, kao i za predikciju razvijanja tipova agresivnijeg kancera pluća, što ukazuje da je na osnovu profila mikroRNK u cirkulaciji moguće selektovati osobe sa visokim rizikom.

Primer 2

miRNK lečenje

[0153] Ovaj primer prikazuje modifikovanje nivoa dve mikroRNK naših signatura plazme u ćelijskoj liniji kancera pluća (A549). Mir-486 i mir-660 su negativno modulisane u uzorcima plazme pacijenata sa kancerom pluća i posebno kod onih pacijenata kod kojih je razvijena agresivna forma bolesti. Na Slici 9, nivoi mikroRNK mereni su pomoću qReal-Time PCR, u 20 parova tumorskog i normalnog tkiva pluća istih pacijenata uključenih u studiju CT skrininga, upotrebljenih kao set za validaciju. Sirovi Ct podaci normalizovani su prema "housekeeping" miRNK RNU6B (DCt). Finalne vrednosti ekspresije dobijene su pomoću formule: 2^(-DCt tumorskog tkiva) / 2^(-DCt normalnih pluća). Vrednosti > 1 → pozitivno regulisano u tumorskom tkivu. Vrednosti < 1 → negativno regulisano u tumorskom tkivu. Rezultati na Slici 9 prikazuju da su ove dve miRNK negativno regulisane u tumorskom tkivu u poređenju sa normalnim tkivom pluća.

[0154] Na Slici 10 mirVana™ miRNA Mimic (Applied biosystem) upotrebljeni su za transfektovanje ćelijske linije kancera pluća koja konstitutivno eksprimira zeleni fluorescentni protein (A549-GFP), u skladu sa Lipofectamine2000 standardnim protokolom (Invitrogen). Dvadeset četiri sata posle transfekcije, ćelije se zaseju na ploče sa većim brojem bunarčića da bi se procenio proliferativni kapacitet. Merenja GFP signala u realnom vremenu vršena su svaka 24 h pomoću fluorescentnog čitača ploča (Tecan M1000) uz korišćenje talasnih dužina GFP. Na Slici 10, 549-GFP transfektovane sa miRNK mimetikom mir-486-5p i mir-660 pokazuju smanjeni proliferativni kapacitet u poređenju sa divljim tipom i miRNK mimetikskremblovanim (ktrl-) ćelijskim linijama.

[0155] Na Slici 11, 549-GFP ćelije su transfektovane miRNK mimeticima kako je saopšteno ranije. Dvadeset četiri sata posle transfekcije ćelije se zaseju na Falcon™ FluoroBlok™ Cell Culture Inserts 8.0 mm (BD biosciences) postavljene na ploču sa 24 bunarčića. Migratorni kapacitet ćelija procenjuje se merenjem GFP signala, uz korišćenje uređaja za čitanje dna Tecan M1000, na ovaj način moguće je očitati samo signal ćelija koje su prošle kroz membranu inserta. Migracija u realnom vremenu prati se 4 dana. Na Slici 11, 549-GFP transfektovane sa miRNK mimetikom mir-486-5p i mir-660 pokazuju redukovani migratorni potencijal u poređenju sa divljim tipom i miRNK mimetik-skremblovanim (ktrl-) ćelijskim linijama.

[0156] Prema tome, rezultati pokazuju da ako se ove dve miRNK obnove u kancerskim ćelijskim linijama, proliferativna (Slika 10) i migratorna (Slika 11) sposobnost kancerskih ćelija se značajno smanjuju. Ovi preliminarni rezultati podržavaju ideju upotrebe ovih miRNK u mogućem terapijskom pristupu.

Primer 3

Detekcija kancera pluća i preživljavanje

1

[0157] INT-IEO kohort (set za obučavanje). Kancer pluća dijagnostikovan je kod 38 subjekata, 22 u prve 2 god. i 16 od 3. do 5. god. skrininga, uključujući jedan intervalski kancer 4. god. Učestalost stadijuma I bila je 63% (77% u prve 2 god. u odnosu na 44% u poslednje 3 god.) i adenokarcinom je bio 71% (95% u prve 2 god. u odnosu na 63% u poslednje 3 god; Tabela XI).

Tabela XI

[0158] Medijana vremena praćenja zdravstvenog stanja za 38 slučajeva kancera pluća bila je 75 meseci, sa 60% 5-godišnjeg ukupnog preživljavanja (95% C.I.: 43-74%). Petogodišnje ukupno preživljavanje bilo je 92% za stadijum I i 7% za stadijume II-IV (P < 0.001; Slika 12A). Kada se razmatra godina detekcije, 5-godišnje ukupno preživljavanje je 77% za kancere dijagnostikovane u prve 2 godine u poređenju sa 36% za one koji su detektovani od 3. do 5. godine skrininga (P = 0.005; Slika 12B), što ukazuje da incidentni kanceri predstavljaju agresivniju bolest. Godina detekcije i stadijum tumora bili su značajno udruženi (χ2 test, P = 0.034). U podgrupi CT godina 1-2/stadijum I, 5-godišnje preživljavanje bilo je 94% (95% C.I.: 65.0-99.1). U celoj grupi stadijuma I, posle isključivanja jedne smrti od drugog primarnog kancera pluća i jedne od završnog stadijuma hroničnog opstruktivnog poremećaja pluća (chronic obstructive pulmonary disorder, COPD), 5-god. preživljavanje bilo je 100%.

[0159] Kohort Multicentrične italijanske studije za detekciju bolesti pluća (Multicentric Italian Lung Detection, MILD) (set za validaciju). Na kraju 4. godine skrininga u MILD studiji, kancer pluća je dijagnostikovan kod 53 subjekta, 24 u prve 2 god. i 23 u 3. i 4. godini. Dijagnostikovano je šest intervalskih kancera: jedan u 1. godini, dva u 2. godini, i tri u 3. godini. Rani stadijum bolesti (Ia-Ib) dijagnostikovan je kod 28 (53%) pacijenata, a

2

adenokarcinom je dijagnostikovan kod 30 (57%) pacijenata. Pošto je studija u toku, za sada nema završenih analiza. Međutim, iako je medijana perioda praćenja od 23 meseca relativno kratka, možemo podeliti 53 pacijenta u dve grupe razumne veličine: 14 pacijenata sa lošom prognozom (mrtvi ili živi sa neizlečivom bolešću) i 39 pacijenata sa dobrom prognozom (živi bez bolesti).

Profilisanje ekspresije miRNK u tumoru pluća i normalnim plućima

[0160] Profili miRNK 28 tumorskih i 24 uparena normalna plućna tkiva, analizirani su korišćenjem miRNK mikročip-platforme. Validacija različito eksprimiranih miRNK obavljena je korišćenjem qRT-PCR.

[0161] Prema analizama klasnog poređenja i klasne predikcije (uz korišćenje parnih i neparnih algoritama), ekspresija 56 miRNK bila je značajno različita, pri nominalnom nivou univarijantnog testa 0.001. Prvih 10 deregulisanih miRNK koje diskriminišu kancer pluća detektovan CT od normalnog plućnog tkiva bile su: mir-7, mir-21, mir-200b, mir-210, mir-219-1, miR-324 (pozitivno regulisane), mir-126, mir-451, mir-30a, i mir-486 (negativno regulisane; Tabela XII).

Tabela XII

[0162] Ova lista uključuje alteracije prethodno identifikovane kod simptomatskih pacijenata sa kancerom pluća (npr., mir-21 i mir-200 familija, za koje je poznato da su uključene u puteve kao što su preživljavanje, apoptoza, epitelno-mezenhimska tranzicija) i neke neidentifikovane promene (npr., negativna regulacija miR-486 i miR-451).

[0163] Da bi se validirali rezultati dobijeni mikročip-hibridizacijom, nivoi dve najregulisanje miRNK (mir-21 i mir-486) evaluirani su u tumorskim i normalnim uzorcima korišćenjem qRT-PCR, što je potvrdilo ranije zapažanje.

Ekspresija miRNK u tkivima udružena je sa kliničko-patološkim osobinama

[0164] Zatim je ispitivana moguća udruženost profila ekspresije miRNK sa kliničkopatološkim karakteristikama pacijenata (Tabela XIII). Dve miRNK (mir-205 i mir-21) značajno diskriminišu histotip adenokarcinoma i histotip karcinoma skvamoznih ćelija (P ≤ 0.001). Mir-518e i mir-144 su negativno regulisane u tumorima sa bržom stopom rasta, i viši nivoi mir-429, člana mir-200 familije, koreliraju sa lošijim preživljavanjem bez bolesti (disease-free survival, DFS).

Tabela XIII

[0165] Profil ekspresije miRNK tumora detektovanih u prve dve godine skrininga bio je značajno različit od profila tumora koji se pojavljuju posle druge godine, sa različitom ekspresijom osam miRNK (mir-128, mir-129, mir-369-3p, mir-193, mir-339-3p, mir-185, mir-346, i mir-340). Ovi rezultati ukazuju na to da ove grupe tumora pokazuju različite

4

miRNK profile udružene sa zasebnim osobinama agresivnosti, pri čemu incidentni tumori rastu brže.

[0166] Analiza ekspresije miRNK normalnog plućnog tkiva takođe diskriminiše subjekte identifikovane u prve 2 godine od onih iz kasnijih godina skrininga (miR-126*, mir-126, let-7c, mir-222, mir-30e, mir-1-2, mir-29b-1, mir-30d-prec, mir-15a, mir-16; Slika 13). Značajne asocijacije nađene su između ekspresije miRNK u normalnim plućima i redukcije forsiranog ekspiratornog volumena (forced expiratory volume, FEV; mir-379 i mir-29-1*), bržeg rasta tumora (mir-30d*), DFS pacijenata (mir-34b; Tabela XIII). Rezultati dobijeni mikročiphibridizacijom nezavisno su validirani korišćenjem qRT-PCR.

[0167] Iako nije bilo značajne razlike u navikama u vezi sa pušenjem (broj pakli po godini, vreme od prestanka pušenja), pacijenti detektovani u godinama 3-5 pokazali su višu proporciju jake COPD (GOLD kriterijumi ≥ 2, 33% prema 5%; χ2 test, P = 0.02).

[0168] Ovi podaci ukazuju na to su specifične miRNK signature u normalnoj plućnoj sredini udružene sa agresivnošću tumora i kliničkom istorijom pacijenata.

Analiza obogaćivanja puteva<(>Pathways enrichment analysis)

[0169] Za miRNK signaturu koja diskriminiše tumorske od normalnih uzoraka, izvedena je analiza obogaćivanja puta korišćenjem DIANA-mirPath softvera na genskim ciljevima predviđenim pomoću microT-4.0, Pic-Tar, i TargetScan-5. Ova analiza pokazala je da su mnogi od predviđenih miRNK ciljeva uključeni u kritičan put afektovan u kanceru, na primer preživljavanje, apoptozu, epitelno-mezenhimsku tranziciju i proliferaciju (XIV).

Tabela XIV.

Profilisanje ekspresije miRNK u uzorcima plazme: Dizajn studije

[0170] Validirani cirkulišući biomarkeri u plazmi/serumu mogu potencijalno predstavljati zlatni standard za neinvazivnu rutinsku kliničku primenu. Mi smo obrazložili da idealni miRNK biomarkeri treba da se identifikuju pre pojave tumora i da mogu da predvide razvoj agresivne u odnosu na indolentnu bolest.

[0171] Za određivanje da li su specifične miRNK signature već detektabilne u uzorcima plazme prikupljenim pre detektovanja bolesti, obavili smo visokopropusno profilisanje miRNK ekspresije uzoraka plazme korišćenjem TaqMan mikrofluidnih kartica (Applied Biosystems). Prvo smo analizirali uzorke plazme uzete >1 godine pre razvoja bolesti i u vreme detekcije bolesti (pozitivna CT/operacija) u setu za obučavanje (studija CT skrininga INT-IEO). Generisali smo signature miRNK koje su zatim validirane u uzorcima plazme (takođe pre bolesti i pri detekciji bolesti) seta za validaciju (kohort CT skrininga MILD). Kliničko-patološke karakteristike setova za obučavanje i validaciju prikazane su na Slici 1. Kao kontrolne grupe, testirali smo 15 pulova uzoraka plazme (5-7 osoba po pulu, 81 osoba ukupno) prikupljene od subjekata bez bolesti (negativna spiralna CT) iz obe studije, sa distribucijom starosti, pola, i pušačkih navika sličnom onoj u slučajevima.

[0172] Korišćenjem mikrofluidnih kartica, nađeno je da se 113 miRNK uvek eksprimira u svim uzorcima plazme, i nađeno je da se podgrupa od 100 miRNK konzistentno eksprimira u 15 kontrolnih pulova, sa dobrom reproducibilnošću među biološkim duplikatima (Slika 15). Ovih 100 miRNK zatim je upotrebljeno za identifikovanje cirkulišućih biomarkera rizika, dijagnoze, i prognoze u uzorcima plazme sakupljenim pre ili u prisustvu bolesti detektovane CT.

miRNK odnosi kao bioinformatički alati za analizu miRNK

[0173] Zbog toga što je normalizacija miRNK podataka u uzorcima plazme još uvek kontraverzno pitanje, izračunati su odnosi između vrednosti ekspresije svih miRNK koje se konzistentno eksprimiraju u plazmi. Vrednost svake pojedinačne miRNK upoređena je sa vrednostima svih drugih 99 miRNK, i 4950 dobijenih odnosa je zatim upotrebljeno za analizu razlika između klasa uzoraka, što je rezultovalo definisanjem klinički relevantnih odnosa. Kada se koriste mikrofluidne kartice, postoji opšta saglasnost o normalizaciji ekspresije pojedinačne miRNK korišćenjem srednjih vrednosti ekspresije svih miRNK svake kartice (13). Da bi se validirala robusnost metoda miRNK odnosa, uporedili smo rezultate dobijene nezavisno korišćenjem dva metoda u mikrofluidnim karticama. Rezultati su pokazali da su miRNK koje su uglavnom deregulisane u multiplim odnosima bile iste kao one koje su detektovane korišćenjem normalizacije prema srednjoj vrednosti ekspresije, čime se potvrđuje robusnost metode odnosa.

[0174] Upotreba odnosa miRNK izgleda da je lako primenljiv metod sa potencijalom za opštu kliničku upotrebu kojim se izbegava potreba za visokopropusnim analizama velikog opsega i koji se stoga koristi za razvijanje klinički korisnih signatura baziranih na cirkulišućim biomarkerima.

Identifikacija dijagnostičkih i prognostičkih profila cirkulišućih miRNK u uzorcima plazme sakupljenim pre i u vreme detektovanja bolesti

[0175] Analiza klasnog poređenja inicijalno je izvedena u setu za obučavanje da bi se identifikovala grupa miRNK odnosa koji pokazuju statistički značajne razlike između predijagnostičke plazme, dijagnostičke plazme i plazme bez bolesti (P < 0.05). Ovi odnosi se zatim tehnički validiraju, u podgrupi uzoraka, korišćenjem TaqMan MicroRNA testova.

[0176] Za procenjivanje konzistencije miRNK odnosa unutar kontrolnih pulova, upoređivali smo vrednost svakog odnosa u dva kontrolna pula sa srednjom vrednošću koja je rezultat analize pojedinačnih uzoraka koji čine pulove. Našli smo da su vrednosti bile konzistentne.

[0177] Međutim, zbog toga što su neki odnosi pokazali visoku individualnu varijabilnost u kontrolnim subjektima, moguće vodeći do visokog broja lažno pozitivnih, u obzir za dalje analize uzeli smo samo one odnose sa minimalnom varijabilnošću između pulova.

[0178] Dobijene signature su zatim upotrebljene za izračunavanje specifičnosti i senzitivnosti u nezavisnom setu za validaciju.

[0179] Zbog toga što je opseg nivoa ekspresije miRNK u dva seta podataka bio konzistentno različit, moguće zbog efekta skladištenja (14), pacijenti u svakom setu podataka upoređivani su sa respektivnim kontrolnim grupama.

[0180] Za generisanje signatura za predikciju kliničkog ishoda (pre i u prisustvu bolesti detektovane CT), zbog malog broja događaja, grupisali smo dva seta podataka. Slučajevi sa lošim ishodom upoređivani su sa respektivnim kontrolnim pulovima, i dobijene signature su onda testirane u pogledu snage za diskriminisanje pacijenata sa lošom prognozom (mrtvi i živi sa bolešću) ili dobrom prognozom (bez bolesti) u celom kohortu.

miRNK signatura identifikuje osobe sa rizikom da razviju kancer pluća

[0181] Da bi se ispitalo da li postoje molekulski markeri koji predviđaju razvoj kancera pluća, uzorci sakupljeni od pacijenata 1 i/ili 2 godine pre detektovanja bolesti korišćenjem CT analizirani su i upoređivani sa kontrolnim pulovima osoba koje su teški pušači (Slike 14A -14C).

[0182] Signatura 16 odnosa sačinjena korišćenjem 15 miRNK mogla je da pravilno diskriminiše 18 od 20 uzoraka od subjekata koji razvijaju kancer pluća u setu za obučavanje (senzitivnost 90%) i rezultovala je pozitivnošću kod samo 1 od 5 kontrolnih pulova (specifičnost 80%). U setu za validaciju, ova signatura identifikovala je 12 od 15 uzoraka sakupljenih pre detekcije kancera pluća spiralnom CT, sa senzitivnošću od 80% i specifičnošću od 90% (AUC-ROC = 0.85, P < 0.0001; Slika 4A). Evaluirano je da je prediktivna vrednost ove signature korisna do 28 meseci pre bolesti, a mir-660, mir-140-5p, mir-451, mir-28-3p, mir-30c, i mir-92a su najčešće deregulisane miRNK.

miRNK signatura sa dijagnostičkom vrednošću

[0183] Uzorci plazme prikupljeni u vreme operacije ili u vreme detekcije bolesti spiralnom CT upoređivani su sa pulovima zdravih osoba da bi se identifikovao profil miRNK udružen sa dijagnozom kancera pluća. U setu za obučavanje, panel od 16 odnosa koji uključuje 13 različitih miRNK klasifikovao je 16 od 19 pacijenata, sa senzitivnošću od 84% i specifičnošću od 80%. U setu za validaciju uzoraka plazme, 12 od 16 pacijenata bilo je ispravno diskriminisano, sa senzitivnošću od 75% i specifičnošću od 100% (AUC-ROC = 0.88, P < 0.0001; Slika 4B).

[0184] Zapažena niža senzitivnost može biti u vezi sa prisustvom većeg broja malih nodula na ranom stadijumu sa indolentnim ponašanjem u ovoj seriji i uključivanjem dva pacijenta koji su pogrešno klasifikovani prema signaturi dijagnoze i rizika.

[0185] Dijagnostička signatura je zatim upotrebljena za klasnu predikciju uzoraka plazme pre bolesti u istoj seriji. U setu za obučavanje, 11 od 20 (55%) slučajeva klasifikovano je kao osobe sa bolešću i, veoma interesantno, 10 od ovih 11 slučajeva karakterisalo se lošom prognozom (mrtvi ili živi sa bolešću) ili je pripadalo grupi pacijenata identifikovanih od 3. do 5. godine skrininga. U setu za validaciju, dobijeni su slični rezultati, sa prisustvom signature bolesti već u 10 od 15 (66.6%) uzoraka plazme pre bolesti. Štaviše, imajući u vidu tri uzorka pre bolesti slučajeva intervalskog kancera (pacijenti koji su razvili kancer pluća nekoliko meseci posle negativnog CT rezultata), samo 1 pacijent je bio klasifikovan po signaturi rizika. Umesto toga, 2 slučaja (uključujući 1 identifikovan signaturom rizika) su pokazivala dijagnostičku signaturu već 8-9 meseci pre detektovanja bolesti. Slučaj intervalskog kancera koji nije prepoznat nijednom signaturom bio je u stadijumu tumora Ia sa dobrim ishodom, što sugeriše prisustvo nodula niskog rizika.

[0186] Samo 4 odnosa bila su zajednička za signature rizika i dijagnoze, i uključene miRNK bile su delimično različite. mir-17, mir-660, mir-92a, mir-106a, i mir-19b bile su najčešće deregulisane u vreme dijagnostikovanja kancera pluća.

[0187] Ukupno uzevši, ovi nalazi podržavaju zapažanje da je cirkulišuća miRNK u plazmi detektabilna znatno pre kliničke detekcije bolesti spiralnom CT, što ukazuje na mogućnost selektovanja visokorizičnih grupa na osnovu profilisanja miRNK.

miRNK signatura rizika razvijanja agresivnog kancera pluća

[0188] Analizirali smo profile ekspresije miRNK u uzorcima plazme pre bolesti osoba sa lošim kliničkim ishodom da bismo definisali signaturu miRNK koja identifikuje osobe sa visokim rizikom razvijanja agresivne bolesti.

[0189] Signatura od 10 odnosa, sačinjena od 9 različitih miRNK, identifikovala je 5 od 5 pacijenata sa lošom prognozom (mrtvi ili sa progresivnom bolešću) u prvom setu (senzitivnost 100% i specifičnost 100%). U setu za validaciju, ispravno su klasifikovana 4 od 5 pacijenata sa lošom prognozom, uključujući pacijenta sa lošom prognozom koji je razvio intervalski kancer. Senzitivnost ove signature u setu za validaciju bila je 80% sa specifičnosšću od 100%.

[0190] mir-221, mir-660, mir-486-5p, mir-28-3p, mir-197, mir-106a, mir-451, mir-140-5p, i mir-16 su miRNK deregulisane u signaturi agresivne bolesti.

[0191] Signatura je zatim upotrebljena za klasnu predikciju uzoraka plazme pre bolesti pacijenata sa dobrom prognozom u setovima za obučavanje i validaciju. Signatura je identifikovala 5 od 15 (33.3%) pacijenata u setu za obučavanje i 5 od 11 (45%) pacijenata u setu za validaciju (Slika 4C). Interesantno, u oba seta podataka, većina ovih klasifikovanih uzoraka pripadala je pacijentima čiji su tumori detektovani posle 3. godine skrininga. Ovaj nalaz podržava naše ranije zapažanje o uzorcima tkiva, gde je različiti miRNK profil identifikovan u tumorskom i normalnom tkivu istih pacijenata. Primetno, među pacijentima sa tumorom dijagnostikovanim u 2. godini skrininga (svi tumori u stadijumu Ia i Ib), samo jedan slučaj sa stadijumom Ib imao je signaturu rizika agresivne bolesti.

[0192] Ovi rezultati sugerišu da miRNK profili u uzorcima plazme pre oboljevanja mogu da predvide razvoj tumora sa lošijom prognozom i da čak mogu pomoći pri ukazivanju na ove rane stadijume tumora sa visokim rizikom agresivnog razvoja.

miRNK ekspresija u uzorcima plazme u vreme detektovanja bolesti i prognoza

[0193] Zatim smo pogledali povezanost između miRNK ekspresije i prognoze u uzorcima plazme prikupljenim u vreme dijagnoze kancera pluća, generišući signaturu sastavljenu od 10 odnosa, koji su svi sadržavali mir-486-5p. Ova signatura identifikovala je 7 od 8 pacijenata sa lošom prognozom u setu za obučavanje (senzitivnost 88% i specifičnost 100%). Signatura agresivne bolesti bila je zapažena i u 2 od 10 uzoraka sa dobrom prognozom, jedan od njih imao je tumor u satdijumu Ib. U setu za validaciju, na raspolaganju su bila samo tri uzorka plazme prikupljena u prisustvu bolesti od pacijenata sa lošom prognozom, i 2 od njih imala su profil agresivne bolesti. Treći slučaj bio je pogrešno klasifikovan po svim obavljenim analizama u svim uzorcima plazme sakupljenim tokom evaluacija skrininga (Slika 4D).

[0194] Ponovo, ova signatura je upotrebljena za klasnu predikciju uzoraka plazme pre pojave bolesti pacijenata u setovima za obučavanje i validaciju. Polovina uzoraka pre bolesti pacijenata sa lošom prognozom bila je pozitivna za obe signature agresivne bolesti, dok su uzorci pre bolesti pacijenata sa dobrom prognozom koji su pokazivali signaturu agresivne bolesti pripadali uglavnom (5 od 6) pacijentima sa tumorima detektovanim posle 3. godine skrininga. Važno je napomenuti da, iako osobee u setu za obučavanje imaju produženi period praćenja zdravstvenog stanja i raspoloživi su podaci za ukupno petogodišnje preživljavanje, kraća medijana vremena praćenja zdravstvenog stanja (14 meseci) za pacijente u setu za validaciju može uticati na snagu prognostičkih signatura.

[0195] mir-486-5p, u poređenju sa mir-21, mir-126, mir-15b, mir-148a, mir-142-3p, mir-17, mir-197, mir-221, mir-28-3p, i mir-106a, izgleda da je uvek negativno regulisana u plazmi pacijenata sa lošim ishodom.

Analiza

[0196] Ispitivanje bioloških i molekulskih osobina indolentnog i agresivnog kancera pluća kritično je za identifikovanje specifičnih markera rizika za razvijanje kancera pluća, kako bi se postigla najranija moguća predikcija i intervencija i potencijalno, definisali novi terapijski ciljevi.

[0197] U ovoj studiji, fokusirali smo se na ulogu miRNK kao biomarkera bolesti pluća iskoristivši dostupnost uzoraka tkiva (tumori i normalna pluća) i višestrukih uzoraka plazme, sakupljenih pre i u vreme detekcije bolesti, od pacijenata uključenih u dve različite studije skrininga spiralnom CT uz produženi period praćenja zdravstvenog stanja. Ovi pacijenti razvili su tumore koji pokazuju različito agresivno ponašanje tokom trajanja studija.

[0198] Iako je u ranijim studijama saopšteno da profili ekspresije miRNK predviđaju povratak i prognozu samo u uzorcima tumora pluća sakupljenim u vreme operacije za simptomatski kancer, naša studija obezbeđuje jedinstvene rezultate o miRNK signaturama koje mogu da identifikuju prisustvo agresivnog kancera pluća ne samo u tumorskom nego i u normalnom plućnom tkivu i u uzorcima plazme pacijenata. Štaviše, miRNK deregulisane u uzorcima plazme sakupljenim pre kliničke pojave bolesti bile su snažni molekulski prediktori razvoja visoko rizične bolesti.

[0199] U uzorcima tumora, potvrdili smo pozitivnu regulaciju poznatih miRNK kao što je mir-21, miRNK sa proproliferativnom i antiapoptotskom funkcijom, za koju je saopšteno da cilja PTEN, i opisali smo negativnu regulaciju dve miRNK (mir-486 i mir-451) uključene u održavanje kapaciteta bronhoalveolarnih matičnih ćelija za samoobnavljanje. Analize asocijacije pokazale su da ekspresija mir-205 i mir-21 predstavlja markere povezane sa histologijom karcinoma skvamoznih ćelija (SCC) i adenokarcinoma (ADC), respektivno, što potvrđuje ranije studije o validnosti izučavanja ekspresije miRNK kao podrške histopatološkoj dijagnozi, za preciznu klasifikaciju histologije tumora. Interesantno, miRNK koje su bile deregulisane u agresivnijim tumorima identifikovanim u kasnijim godinama skrininga uključene su u puteve adhezije i invazije: saopšteno je da miR-339 negativno reguliše međućelijski adhezioni molekul (intercellular cell adhesion molecule, ICAM)-1, i mir-128a je uključena u TGFβ put promocije invazije tumorskih ćelija i metastaziranje. Ova miRNK specifično cilja FOXO1A, transkripcioni faktor uključen u AKT signalizaciju i inhibiciju apoptoze.

[0200] Pronalaženje profila ekspresije miRNK udruženih sa agresivnom bolešću i lošim preživljavanjem u normalnim tkivima pluća pacijenata, pojačava postojeće dokaze o kritičnom uticaju normalne plućne sredine na razviće tumora, i u ovoj studiji, na agresivnost tumora. Moguće je spekulisati da ovi markeri mogu predstavljati molekularne oznake "tla" koje, posle ekstenzivnog oštećenja prouzrokovanog pušenjem, postaje permisivno ili čak promoviše razviće kancera. Nekoliko miRNK deregulisanih u normalnom plućnom tkivu pacijenata koji su podvrgnuti operaciji uključeno je u glavne puteve povezane sa kancerom. Preciznije, poznato je da miR-126 promoviše angiogenezu represijom inhibitora VEGF signalizacije spred1 i pik3r2, a let-7 je uključena u proinflamatorne programe. Pored toga, AKT signalizacija je glavni put na koji utiče miR-222, miR-30 reguliše faktor rasta vezivnog tkiva, a mir-29b moduliše antiapoptotske i prometastatske matriksne molekule tako što vrši represiju Mcl-1. Isto tako, zanimljivo je pomenuti negativnu regulaciju mir-34b kod pacijenata sa lošijim DFS, zbog toga što je mir-34b dobro poznata kao cilj za p53, koji

1

kooperiše u kontroli ćelijske proliferacije i adhezivno-nezavisnog rasta. Uočavanje moguće prognostičke uloge nekoliko miRNK u normalnim plućima otvara mogućnost inovativnih terapijskih strategija koje su, umesto ka tumoru, uperene ka samom domaćinu.

[0201] Zbog toga što cirkulišuće miRNK u plazmi mogu biti više specifične za tkivo nego specifične za tumor, odlučili smo da izvedemo visokopropusno profilisanje ekspresije miRNK u plazmi, korišćenjem mikrofluidnih kartica. Zatim smo razvili multipleks testove PCR u realnom vremenu za validaciju, u pojedinačnim PCR testovima, onih miRNK signatura koje su značajno udružene sa kliničkim karakteristikama pacijenata. Optimizovali smo jednostavne i visoko reproducibilne miRNK testove i formulisali pogodan algoritam za qRT-PCR validaciju podataka u plazmi korišćenjem recipročnih odnosa miRNK. Naši nalazi sugerišu da je procena broja miRNK u plazmi pomoću qRT-PCR testova potencijalno korisna i klinički primenljiva procedura za poboljšanje upravljanja kancerom pluća.

[0202] miRNK deregulisane u uzorcima tkiva bile su retko detektovane u uzorcima plazme, što je dodatno pojačalo visoku tkivnu specifičnost miRNK i sugerisalo prediktivnu ulogu miRNK u plazmi nezavisno od uzoraka tkiva. Zapazili smo da je delimično različiti set miRNK bio deregulisan u plazmi pre i u vreme bolesti. Ovaj nalaz mogao bi da se objasni tumačenjem da su geni i putevi neophodni u ranijim fazama razvoja bolesti različiti od onih koji su potrebni za održavanje i progresiju tumora.

[0203] Ukupno uzevši, 21 miRNK koja čini signaturu rizika, dijagnoze, i prognoze u plazmi pripada glavnim putevima: ćelijskom starenju (mir-19b, mir-17, mir-106), obnavljanju bronhoalveolarnih i hematopoetskih matičnih ćelija (mir-486, mir-106a, 142-3p), recidivu tumora u stadijumu I NSCLC (mir-27b; mir-106a; mir-19b; mir-15b mir-16, mi-21), i agresivnosti kancera pluća (mir-221, mir-222). Preciznije mir-17, mir-92a, mir-19b, i mir-106a su "onkomiri" (oncomirs, mikroRNK udružene sa kancerom) koji pripadaju istoj familiji, odgovorni za povećanu proliferaciju, represiju apoptoze i indukciju angiogeneze. mir-197 reguliše ekspresiju tumor-supresor gena FUS1, čija se ekspresija gubi u velikoj proporciji tumora pluća. mir-28-3p je locirana na regionu hromozoma koji se često amplifikuje u kanceru pluća (3q28). mir-221 blokira PTEN ekspresiju dovodeći do aktivacije AKT puta, i sugerisano je da ima važnu ulogu u ćelijskom rastu i invazivnosti tako što cilja PTEN/AKT put. Promene ovih puteva predstavljaju dobro uspostavljene i značajne faktore rizika u kanceru pluća. Na kraju, u nedavnoj publikaciji u vezi sa cirkulišućim miRNK, mir-21, mir-126, i mir-486-5p identifikovane su i kao potencijalni krvni biomarkeri sa dijagnostičkom vrednošću kod NSCLC pacijenata.

2

[0204] Identifikacija miRNK signatura u uzorcima plazme prikupljenim 1-2 godine pre pojave bolesti, koje vrše predikciju razvoja kancera i prognoze, potencijalno je korisna za selektovanje osoba sa visokim rizikom, koje treba da budu podvrgnute nadzoru spiralnom CT. Treba napomenuti da specifične miRNK signature u uzorcima plazme pre pojave bolesti mogu da predvide i diskriminišu razvoj agresivnijih, rano metastazirajućih tumora koji se često ne mogu detektovati godišnjom spiralnom CT. Ova informacija može biti svakako od koristi za podsticanje ovih osoba da se uključe u programe farmakološkog odvikavanja od pušenja i moguće da predlože specifičnije metode vizuelizacije za detekciju okultne metastatske bolesti (npr., PET, MRI celog tela), kao i netoksične tretmane kao što je uključivanje u programe profilaktičke vakcinacije. Pored toga, signatura potencijalno agresivne bolesti može da pomogne u kliničkom postupanju sa čestim nodulima ranog stadijuma detektovanim tokom studija CT skrininga, poboljšavajući dijagnostičke algoritme.

[0205] U vezi sa neinvazivnim karakteristikama uzorkovanja plazme i reproducibilnom i lakom detekcijom miRNK markera, miRNK biomarkeri iz plazme mogu da se koriste u kliničkoj praksi i mogu pomoći da se izbegnu hiperdijagnostikovanje i hipertretman bolesti niskog rizika i kasna detekcija visoko rizične i rano metastazirajuće bolesti (Boeri et al., Proc Natl Acad Sci U S A.108(9):3713-8,2011)

Materijali i metodi

[0206] Protokoli CT skrininga. U INT/IEO skrining kohortu od 1035 visoko rizičnih teških pušača, medijana starosti bila je 58 godina (opseg 50-84), 739 (71%) bili su muškarci, prosečna konzumacija duvana iznosila je 26 cigareta na dan tokom 37 godina (medijana pakle/godini = 40), i 14% su bili bivši pušači.

[0207] Evaluirani su sledeći klinički parametri: starost, pol, indeks pakle/godinama, forsirana ekspiratorna ventilacija u 1 s (FEV1%), godišnja CT, patološki stadijum detektovanih kancera, histologija, veličina, stopa rasta, standardna vrednost preuzimanja (standard uptake value, SUV) pri PET. χ<2>test korišćen je za ispitivanje asocijacija između prediktorskih varijabli. Krive ukupnog preživljavanja (overall survival, OS) obolelih od kancera pluća procenjivane su Kaplan-Meierovim metodom i upoređivane sa log-rank testom, korišćenjem vremena od pojave kancera pluća do smrti ili cenzurisanjem prilikom poslednje provere zdravstvenog stanja pacijenta. Statističke analize obavljene su korišćenjem SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) i R softvera. Dvostrane P vrednosti < 0.05 smatrane su za statistički značajne.

[0208] Druga studija bila je prospektivna randomizovana studija pod nazivom Multicentric Italian Lung Detection trial (MILD) pokrenuta 2005. godine (MILD studija, set za validaciju). Sadašnji ili bivši pušači, stari najmanje 50 godina i bez istorije kancera u prethodnih 5 godina, bili su randomizovani u dve grupe studije: prva grupa koja je podvrgnuta programu primarne prevencije sa evaluacijom testa funkcije pluća i grupa rane detekcije, gde je periodična spiralna CT bila udružena sa primarnom prevencijom i evaluacijom testovima funkcije pluća. Grupa rane detekcije dodatno je randomizovana u dva ogranka: godišnja niskodozna spiralna CT i spiralna CT svake 2 godine. Randomizovano je 2352 subjekta u ograncima CT skrininga.

[0209] Prilikom uključivanja i godišnjeg pozivanja svih dobrovoljaca, sakupljana je cela krv u vakuumske epruvete sa EDTA i plazma je odmah izdvajana u dva koraka centrifugiranja pri relativnoj centrifugalnoj sili 1258 × g na 4 °C i skladištena u biološkoj banci, podržanoj bazom podataka u koju su unete sve kliničke i epidemiološke informacije. Uzorci tkiva tumora pluća i odgovarajućeg normalnog tkiva pluća (uzorkovanog na udaljenosti od kancerske lezije) takođe su sakupljani, kada su bili dostupni, od pacijenata podvrgnutih hirurškoj resekciji. Uzorci tkiva i plazme dobijeni su u skladu sa Unutrašnjim nadzornim i etičkim odborima Nacionalnog instituta za tumore iz Milana.

miRNK mikročip analiza u uzorcima tkiva

[0210] Za analize ekspresije, prvo smo koristili 28 brzo smrznutih, spiralnom CT detektovanih primarnih tumora pluća i 24 uparena uzoraka normalnog plućnog tkiva, sakupljena tokom INT/IEO studije. Obeležavanje i hibridizacija miRNK izvedeni su korišćenjem 5 μg ukupne TRIzol (Invitrogen) ekstrahovane RNK. Upotrebljeni miRNK mikročip (Ohio State University Comprehensive Cancer Center, verzija 2.0) sadržao je probe za 460 zrelih miRNK nanete u kvadriplikatima (235 Homo sapiens, 222 Mus musculus, i tri Arabidopsis thaliana) sa obeleženim aktivnim mestima odabranim za dizajn oligonukleotida. Hibridizacioni signali detektovani su pomoću streptavidin-Alexa-647 konjugata, i skenirane slike (Perkin-Elmer ScanArray XL5K Scanner) su kvantifikovane korišćenjem GeneSpring softvera verzija 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA).

Statističke i bioinformatičke analize tkivnih uzoraka

[0211] Na mikročipovima, posle oduzimanja pozadinskog signala i transformacije podataka (da se svaka negativna vrednost konvertuje u 0.01), prosečna vrednost za četiri tačke

4

normalizovana je korišćenjem metoda "per-chip 50th percentile" koji normalizuje svaki čip na njegovoj medijani.

[0212] Analize klasnog poređenja i klasne predikcije. Statističke analize izvedene su korišćenjem BRB ArrayTools 3.8.1 softvera koji je razvio Dr. Richard Simon na Nacionalnom institutu za kancer. MikroRNK diferencijalno eksprimirana između dve klase smatrana je značajnom pri nominalnom nivou 0.001-0.003 univarijantnog testa baziranog na 10.000 nasumičnih permutacija i korišćene su za analize klasne predikcije alatom višestrukih metoda.

miRNK profilisanje u uzorcima plazme

[0213] Profilisanje ekspresije miRNK obavljeno je na 40 uzoraka plazme, sakupljenih 12-28 meseci pre i u vreme detekcije bolesti, od 19 pacijenata u setu za obučavanje i u 34 uzorka plazme od 22 pacijenta iz seta za validaciju. Korišćenjem mirVana PARISKit (Ambion), ekstrahovana je ukupna RNK iz 200 μl-skih uzoraka plazme, i ekspresija miRNK određivana je korišćenjem Megaplex Pools protokola na mikrofluidnoj kartici tipa A (Applied Biosystems). Kontrolne grupe predstavljene su sa 15 pulova od 5-7 uzoraka plazme zdravih osoba uključenih u istu studiju i sparenih sa pacijentima prema polu, starosti, i pušačkim navikama. Za svaku mikrofluidnu karticu (uzorak), Ct svake miRNK određivan je korišćenjem programa SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) i podešavanjem praga od 0.2 i manuelnog bazalnog nivoa od 3 do 18 ciklusa.

Kvantitativna PCR u realnom vremenu. Tkiva

[0214] Počevši od 20 ng ukupne RNK u koraku reverzne transkripcije (RT), TaqMan MicroRNA testovi (Applied Biosystems) upotrebljeni su za kvantitativnu PCR u realnom vremenu, praćenjem standardnih postupaka. Relativna kvantifikacija obavljena je korišćenjem AACt metoda uz upotrebu miRNK RNU-6B kao "housekeeping".

[0215] Uzorci plazme. Počevši od 3 μl iste RNK slobodnocirkulišuće u plazmi upotrebljene za Megaplex Pools protokol (Applied Biosystems), odabrane miRNK validirane su korišćenjem Multiplex Pools protokola (Applied Biosystems).

Rezultati

[0216] Slika 15 pokazuje konzistenciju merenja ekspresije miRNK u uzorcima plazme kvantitativnom PCR u realnom vremenu, koja uzima u obzir samo 100 miRNK odabranih za analizu klasnog poređenja. (A) Tehnički duplikati izvedeni su za dva uzorka dobijena od pacijenata (341 i 380) i za kontrolni pul (M2). Grafičko prikazivanje obavljeno je nanošenjem prvih dobijenih miRNK vrednosti na apscisu (duplikat A) i vrednosti dobijenih u drugoj evaluaciji na ordinatu (duplikat B). Vrednost linearne regresije pokazuje dobru reproducibilnost merenja. (B) Korelacija između dva različita kontrolna pula. (C) Grafički prikaz prosečnih vrednosti svih Pearsonovih korelacionih koeficijenata između kontrolnih pulova, tehničkih duplikata i između svih uzoraka sakupljenih od pacijenata (pre i u vreme bolesti).

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Metod za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe ili subjekta koji ima rizik za tumor pluća, naznačen time, što uključuje:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-660, hsa-miR-197 i hsa-miR-92a u biološkom uzorku uzetom od subjekta, gde je biološki uzorak cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum;

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-197/hsa-miR-92a i hsa-miR-197/hsa-miR-660;

upoređivanje svakog od odnosa sa respektivnim kontrolnim odnosom predstavljenim odnosima nivoa ekspresije parova miRNK dobijenih iz kontrolnog biološkog uzorka uzetog od subjekta koji nema bolest, i određivanje koji od odnosa odstupa od respektivnih kontrolnih vrednosti; pri čemu se osoba definiše kao da ima tumor pluća ili ima rizik za tumor pluća ako 100% odnosa odstupa u odnosu na respektivne kontrolne vrednosti.

2. Metod prema patentnom zahtevu 1, metod za određivanje aktuelnog prisustva tumora pluća kod osobe, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-106a; i

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-106a/hsa-miR-92a, hsa-miR-106a/hsa-miR-660 i hsa-miR-106a/hsa-miR-197.

3. Metod prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-142-3p, hsa-miR-28-3 i hsamiR-140-5; i

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-140-5p/hsa-miR-197, hsa-miR-140-5p/hsa-miR-28-3p, hsa-miR-142-3p/hsa-miR-197, hsa-miR-142-3p/hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-3p/hsamiR-660 i hsa-miR-28-3p/hsa-miR-92a.

4. Metod prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-17, hsa-miR-19b, hsa-miR-101, hsa-miR-145, hsamiR-320, hsa-miR-126 i hsa-miR-148a; i

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-101/hsa-miR-660, hsa-miR-101/hsa-miR-92a, hsa-miR-106a/hsa-miR-320, hsa-miR-126/hsa-miR-660, hsa-miR-126/hsa-miR-92a, hsa-miR-142-3p/hsamiR-145, hsa-miR-145/hsa-miR-660, hsa-miR-145/hsa-miR-92a, hsa-miR-148a/hsa-miR-660, hsa-miR-148a/hsa-miR-92a, hsa-miR-17/hsa-miR-320, hsa-miR-17/hsa-miR-660, hsa-miR-17/hsa-miR-92a, hsa-miR-197/hsa-miR-320, hsa-miR-19b/hsa-miR-660, hsa-miR-19b/hsa-miR-92a.

5. Metod prema patentnom zahtevu 1, metod za određivanje subjekta koji ima rizik za tumor pluća, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-17, hsa-miR-451, hsa-miR-19b, hsa-miR-106a, hsamiR-101, hsa-miR-97, hsa-miR-133a, hsa-miR-16, hsamiR-140-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-126, hsa-miR-28-3p i hsa-miR-320; i

izračunavanje većeg broja odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsamiR-17/hsa-miR-660, hsa-miR-17/hsa-miR-92a, hsa-miR-197/hsa-miR-451, hsa-miR-17/hsa-miR-451, hsa-miR-19b/hsa-miR-660, hsa-miR-197/hsa-miR-19b, hsa-miR-19b/hsa-miR-451, hsa-miR-106a/hsa-miR-660, hsa-miR-106a/hsa-miR-451, hsa-miR-106a/hsa-miR-92a, hsa-miR-101/hsa-miR-97, hsa-miR-101/hsa-miR-17, hsa-miR-133a/hsamiR-660, hsa-miR-133a/hsa-miR-451, hsa-miR-101/hsa-miR-133a, hsa-miR-16/hsa-miR-660, hsa-miR-16/hsamiR-451, hsa-miR-140-3p/hsa-miR-660, hsa-miR-101/hsa-miR-140-3p, hsamiR-15b/hsa-miR-451, hsa-miR-15b/hsa-miR-660, hsa-miR-142-3p/hsa-miR-15b, hsa-miR-126/hsa-miR-660, hsa-miR-28-3p/hsamiR-660 i hsa-miR-320/hsa-miR-660.

6. Metod iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što pomenuti tumor ne može biti detektovan spiralnim CT skeniranjem ili gde pomenuto određivanje prisustva pomenutog tumora potvrđuje detekciju spiralnim CT skeniranjem.

7. Metod za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe, naznačen time, što uključuje:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-197, hsa-miR-451 i hsa-miR-486-5p u biološkom uzorku uzetom od subjekta, gde je biološki uzorak cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum;

izračunavanje većeg broja odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsamiR-197/hsa-miR-451 i hsa-miR-197/hsa-miR-486-5p;

upoređivanje svakog od odnosa sa respektivnim kontrolnim odnosom predstavljenim odnosima nivoa ekspresije parova miRNK dobijenih iz kontrolnog biološkog uzorka uzetog od subjekta koji nema bolest, i određivanje koji od odnosa odstupa od respektivnih kontrolnih vrednosti; pri čemu se osoba definiše kao da ima agresivni tumor pluća ako 100% odnosa odstupa u odnosu na respektivne kontrolne vrednosti.

8. Metod iz patentnog zahteva 6, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-106a, hsa-miR-17, hsa-miR-126, hsa-miR-660, hsamiR-28-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-16, hsa-miR-92a, hsa-miR-101, hsa-miR-145, hsa-miR-148a, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-15b, hsa-miR-30c i hsa-miR-21 u biološkom uzorku uzetom od subjekta, gde je biološki uzorak cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum;

izračunavanje većeg broja odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsamiR-106a/hsa-miR-197, hsa-miR-106a/hsa-miR-451, hsa-miR-106a/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-126/hsa-miR-197, hsa-miR-126/hsamiR-451, hsa-miR-126/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-17/ hsa-miR-197, hsa-miR-17/hsa-miR-451, hsa-miR-17/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-101/hsa-miR-197, hsa-miR-126/hsamiR-660, hsa-miR-140-5p/hsa-miR-197, hsamiR-140-5p/hsa-miR-28-3p, hsamiR-142-3p/hsa-miR-197, hsa-miR-145/hsa-miR-451, hsa-miR-148a/hsamiR-451, hsa-miR-15b/hsa-miR-451, hsa-miR-16/hsa-miR-197, hsa-miR-197/hsamiR-19b, hsa-miR-197/hsa-miR-21, hsa-miR-197/hsa-miR-660, hsa-miR-197/hsa-miR-92a, hsa-miR-19b/hsa-miR-451, hsa-miR-19b/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-19b/hsa-miR-660, hsa-miR-28-3p/hsa-miR-451, hsa-miR-28-3p/hsamiR-486-5p, hsa-miR-28-3p/hsa-miR-660, hsa-miR-30b/hsa-miR-451 i hsamiR-30c/ hsa-miR-451.

9. Metod za određivanje aktuelnog prisustva agresivnog tumora pluća kod osobe, naznačen time, što uključuje:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-660, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-21 i hsa-miR-221 u biološkom uzorku uzetom od subjekta, gde je biološki uzorak cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum; izračunavanje većeg broja odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsamiR-142-3p/hsa-miR-19b, hsa-miR-142-3p/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-19b/hsa-miR-21, hsa-miR-19b/hsa-miR-221, hsa-miR-21/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-21/hsa-miR-660, hsa-miR-221/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-221/hsamiR-660 i hsa-miR-142-3p/hsa-miR-660;

upoređivanje svakog od odnosa sa respektivnim kontrolnim odnosom predstavljenim odnosima nivoa ekspresije parova miRNK dobijenih iz kontrolnog biološkog uzorka uzetog od subjekta koji nema bolest, i određivanje koji od odnosa odstupa od respektivnih kontrolnih vrednosti; pri čemu se osoba definiše kao da ima agresivni tumor pluća ako 100% odnosa odstupa u odnosu na respektivne kontrolne vrednosti.

10. Metod prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-148a, hsa-miR-15b, hsa-miR-30b i hsa-miR-16; i

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-148a/hsa-miR-19b, hsa-miR-148a/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-15b/hsa-miR-19b, hsa-miR-15b/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-16/hsa-miR-486-5p, hsa-miR-19b/hsa-miR-30b i hsa-miR-30b/hsa-miR-486-5p.

11. Metod određivanja subjekta koji ima rizik za agresivni tumor pluća, naznačen time, što uključuje:

određivanje nivoa ekspresije miRNK miRNK hsa-miR-197, hsa-miR-101 i hsa-miR-451 u biološkom uzorku uzetom od subjekta, gde je biološki uzorak cela krv, frakcija krvi, plazma ili serum;

izračunavanje odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsa-miR-101/hsa-miR-197 i hsa-miR-197/hsa-miR-451;

upoređivanje svakog od odnosa sa respektivnim kontrolnim odnosom predstavljenim odnosima nivoa ekspresije parova miRNK dobijenih iz kontrolnog biološkog uzorka uzetog od subjekta koji nema bolest, i određivanje koji od odnosa odstupa od respektivnih kontrolnih vrednosti; pri čemu osoba ima rizik za agresivni tumor pluća ako 100% odnosa odstupa u odnosu na respektivne kontrolne vrednosti.

12. Metod iz patentnog zahteva 11, naznačen time, što uključuje još i:

određivanje nivoa ekspresije miRNK hsa-miR-28-3p, hsa-miR-21, hsa-miR-106a, hsa-miR-16, hsamiR-17, hsa-miR-92a, hsa-miR-30c, hsa-miR-320, hsamiR-221, hsa-miR-145, hsa-miR-30b, hsa-miR-19b, hsa-miR-126, hsa-miR-15b, hsa-miR-148a i hsa-miR-140-3p; i

izračunavanje većeg broja odnosa između nivoa ekspresije parova miRNK hsamiR-101/hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-3p/hsa-miR-451, hsa-miR-197/hsa-miR-21, hsa-miR-21/hsa-miR-28-3p, hsa-miR-101/hsa-miR-106a, hsa-miR-106a/hsa-miR-451, hsa-miR-106a/hsa-miR-21, hsa-miR-16/hsa-miR-28-3p, hsa-miR-16/hsamiR-197, hsa-miR-106a/hsa-miR-16, hsa-miR-101/hsa-miR-17, hsa-miR-17/hsa-miR-451, hsa-miR-17/hsamiR-21, hsa-miR-16/hsa-miR-17, hsa-miR-28-3p/hsa-miR-92a, hsa-miR-197/hsa-miR-92a, hsa-miR-197/hsamiR-30c, hsa-miR-28-3p/hsa-miR-30c, hsa-miR-320/hsa-miR-92a, hsa-miR-320/hsa-miR-451, hsa-miR-221/hsa-miR-451, hsa-miR-21/hsa-miR-221, hsa-miR-145/hsa-miR-197, hsa-miR-145/hsa-miR-28-3p, hsamiR-28-3p/hsa-miR-30b, hsa-miR-197/hsa-miR-30b, hsa-miR-19b/hsa-miR-451, hsamiR-126/hsa-miR-451, hsa-miR-15b/hsa-miR-451, hsa-miR-148a/hsa-miR-197 i hsa-miR-140-3p/hsa-miR-451.

13. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je tumor pluća sitnoćelijski kancer pluća (SCLC), nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), adenokarcinom pluća (ADC), bronhoalveolarni karcinom (BAC), plućni karcinom skvamoznih ćelija (SCC) ili krupnoćelijski karcinom (LC).

14. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je biološki uzorak poreklom od osobe koja je pušač, koja u momentu uzimanja uzorka ne prikazuje tumor pluća ako se podvrgne dijagnostičkim metodima vizuelizacije,

1

preciznije, osobe koja je pušač, koja ne prikazuje nodule dimenzija preko 5 mm ako se podvrgne spiralnom CT skeniranju.

15. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se pomenuti kontrolni biološki uzorak uzima od pomenutog subjekta do tri godine pre dijagnoze.

2