[go: up one dir, main page]

TWI626314B - 評估罹患大腸直腸癌風險的方法 - Google Patents

評估罹患大腸直腸癌風險的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI626314B
TWI626314B TW104100830A TW104100830A TWI626314B TW I626314 B TWI626314 B TW I626314B TW 104100830 A TW104100830 A TW 104100830A TW 104100830 A TW104100830 A TW 104100830A TW I626314 B TWI626314 B TW I626314B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mir
ratio
microribonucleic acid
risk
microrna
Prior art date
Application number
TW104100830A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201625796A (zh
Inventor
陳進勛
張玉生
詹爾昌
陳嘉君
張璧月
Original Assignee
長庚大學
長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 長庚大學, 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 filed Critical 長庚大學
Priority to TW104100830A priority Critical patent/TWI626314B/zh
Priority to CN201510703647.5A priority patent/CN105779579A/zh
Priority to US14/928,387 priority patent/US20160201138A1/en
Publication of TW201625796A publication Critical patent/TW201625796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI626314B publication Critical patent/TWI626314B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本發明揭示一種自人類個體所取得之糞便檢體中評估罹患大腸直腸癌風險的方法以及標誌物。評估方法包括以下步驟：由糞便檢體中檢測第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸之表現量；以及根據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。其中，第一微核醣核酸是miR-223、miR-25或miR-93，第二微核醣核酸是miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b或miR-18a。當第一微核醣核酸為miR-93時，第二微核糖核酸為miR-17、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-155、miR-24、miR-19b、或miR-18a。

Description

評估罹患大腸直腸癌風險的方法
本案係關於一種評估個體罹患大腸直腸癌風險的方法及標誌物。
微核醣核酸(micro-ribonucleic acid,microRNA)，又稱miRNA、mi-RNA、微RNA或微小RNA。微核醣核酸主要藉由降解訊息核醣核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)或抑制轉譯的機制，以調控生物體內的基因表現。其在動植物的生長發育、細胞的分化凋亡、及人類疾病(如腫瘤)等過程中皆發揮重要的調控作用。而微核醣核酸的特殊功能與腫瘤發病機制密切相關，使其在腫瘤分類和預測方面皆具有重要的價值。透過測定miRNA除了可以實現精確的腫瘤分型以外，亦可掌握腫瘤個體差異，進而準確且有效地用藥。
大腸直腸癌(Colorectal cancer,CRC)，是前四大致命癌症。全球各地每年大約有70萬人死於這種癌症。癌症初期(尚未轉移前)較可能透過手術切除而治癒。然而，大腸直腸癌的症狀常常因不明顯而被忽略，例如血便或排便異常等，大腸直腸癌病患經常在癌症末期(已轉移)才被診斷出來。因此，大腸直腸癌的早期診斷相當重要，若能及早發現罹患大腸直腸癌，則接受治療後痊癒的機會將遠高於癌症已蔓延的末期。
目前評估罹患大腸直腸癌之風險常見的方法是利用各類內視鏡或斷層掃描的儀器進行檢查，或是糞便檢體潛血反應(Fecal occult blood test,FOBT)等。其中斷層掃描較易因影像解析度的問題導致結果不精確，而內視鏡為一項侵入式檢查，仍有其風險，而以糞便潛血檢查而言，雖然成本低廉且操作容易，但準確性(accuracy)卻不高。目前已有搭配免疫化 學法的糞便潛血檢查，可避免因病患飲食的原因而造成的偽陰性、偽陽性誤差，但其準確性仍有相當大的改善空間。因此，目前在評估罹患大腸直腸癌之風險的方法，其評估結果不是準確性低，就是需以侵入性的方式檢查，亟需有新穎的評估罹患大腸直腸癌之風險的方法，以達到可藉由非侵入性的方式檢測，並達到高靈敏度的目的。
有鑑於先前技術之不足，發明人經研發後得本發明。本發明之目的概略為提供一種自人類個體之糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法以及標誌物，以達到可藉由非侵入性的方式檢測，並可達到高靈敏度的目的。其中，該標誌物係為糞便檢體中的特定之微核醣核酸的組合，藉由檢測特定組合之微核醣核酸的表現量，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
本發明提供一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌(CRC)風險的方法，包括以下步驟：由該糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸(miRNA)以及一第二微核醣核酸之表現量；以及根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
在本說明書中所使用之「微核醣核酸(microRNA)」一詞意指生物體(本實施例以人類個體為例)內可自行合成的小片段核醣核酸，長度約為22鹼基對(base pairs)。微核醣核酸屬於非蛋白編碼核醣核酸(non-coding RNA)，亦即，微核醣核酸不會續行轉譯(translation)作用而產生對應之蛋白質(protein)。然而，微核醣核酸仍具有調控基因表現的功能，例如調控生物體的細胞生長、細胞分化、細胞凋亡、癌症形成等。
而微核醣核酸調控基因表現的方式通常透過與訊息核醣核酸(messenger RNA，或稱mRNA)互補(complementary)結合(binding)，進而導致訊息核醣核酸的降解或抑制轉譯作用。另外，微核醣核酸的相關研究亦指出微核醣核酸與人類癌症病理機制有關，例如特定的微核醣核酸可調控與特定癌症相關的基因表現。因此，在不同癌症病患的體內，其所 對應之微核醣核酸的表現量亦不相同。而本實施例即利用核醣核酸之特性，進而發展出一種評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險的方法，即藉由量測人類個體內特定微核醣核酸之表現量，並據此評估該人類個體罹患大腸直腸癌的風險，其具體實施方式於後詳述之。
在本說明書中所使用之「微核醣核酸之表現量」一詞意指人類個體內該微核醣核酸的含量，且本實施例係指「糞便檢體」中該微核醣核酸的含量。
本發明另提供一種用於自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物，標誌物包括一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸，且第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例在至少一罹患大腸直腸癌之患者所取得之糞便檢體中與一對照糞便檢體中具有顯著差異。
在本說明書中所使用之「標誌物」一詞意指可作為評估人類個體罹患大腸直腸癌風險的生物標的(Biomarker)。而在本說明書中，則是指特定微核醣核酸的組合，亦即第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的組合。具體而言，第一微核醣核酸係選自由miR-223、miR-25及miR-93所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b，以及miR-18a所組成之群組，並且，當第一微核醣核酸為miR-93時，第二微核糖核酸為miR-17、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-155、miR-24、miR-19b、或miR-18a。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-223，且第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21，或miR-93。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-25，且第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c或miR-191。
在本發明之一實施例中，當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
本發明又提供一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量；當第一微核醣核酸的表現量大於一濃度閾值評估為高風險；以及當第一微核醣核酸小於濃度閾值，則依據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
其中，第一微核醣核酸及一第二微核醣核酸的類型可參考前述。而在本說明書中所使用之「濃度閾值」一詞意指從評估對象的糞便檢體中評估該些第一核醣核酸或第二微核醣核酸表現量的參考值。具體而言，藉由量測糞便檢體中的第一核醣核酸或第二微核醣核酸的含量，若其濃度大於一參考值，即本發明所稱之濃度閾值，即評估為高風險。本評估方法即是藉由大腸直腸癌患者與健康的個體中的微核醣核酸表現量的差異，以建立出本評估方法。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸之表現量為上調。
在本說明書中所使用之「上調(up-regulated)」一詞意指在罹患大腸直腸癌的病患之糞便檢體中，其第一微核醣核酸之表現量大於正常人類個體之糞便檢體中的第一微核醣核酸之表現量。
本發明又提供一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：檢測糞便檢體之潛血反應以及檢測miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量；選取有潛血反應的該糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222之表現量的第三比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，當第一比例、第二比例或第三比例大於對應之一檢測閾值，評估為高風險；以及選取無潛血反應的糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，以及miR-223與miR-222之表現量的第三比例之表現量，當第一比例、第二比例以及第三比例均大於對應之各檢測閾值，評估為高風險。
綜上所述，依據本發明之評估方法及標誌物，其係根據第一 微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，對於非侵入性的檢測方式、高靈敏度及高準確性的評估結果，提供了顯著的功效。
S10~S66‧‧‧步驟
圖1為本發明一實施例之評估方法的流程示意圖。
圖2為本發明另一實施例之評估方法的流程示意圖。
圖3為本發明又一實施例之評估方法的流程示意圖。
圖4為本發明第三實驗例之各評估方法之實驗結果圖。
以下將配合圖式說明本發明之實施例與實驗例，惟相關文義說明可參照前述，於此不再贅述。
本發明提供一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌(CRC)風險的方法，在本實施例中，將前述方法簡稱為評估方法，並將接受評估測試的人類個體稱為評估對象。本發明之評估方法是透過檢測評估對象的糞便檢體，以評估罹患大腸直腸癌的風險。
本實施例可透過收取評估對象的糞便檢體，並以棉棒(swab)或採便器沾取糞便檢體後，置入緩衝保存試劑中。接著，透過震盪的方式，將附著於棉棒或採便器上的糞便檢體均勻的溶入緩衝保存試劑，並將緩衝保存試劑的液體部分取出。而採樣所使用的試劑可直接比照糞便潛血檢查(FOBT)採樣所使用的採樣試劑，例如OC-Sensor Diana Latex Reagent(Eiken Chemical,Tokyo,Japan)，當然亦可以為其它廠牌的採樣試劑，本發明不以此為限。
圖1為本發明第一實施例之評估方法的流程示意圖，請參考圖1所示。本實施例之評估方法包括以下步驟：由糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量(步驟S10)；以及根據第一微 核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險(步驟S20)。
其中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸可以分別為多個微核醣核酸所組合成的群組，例如第一微核醣核酸係選自由miR-223、miR-25及miR-93所組成之群組，而第二微核醣核酸係選自由miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b及miR-18a所組成之群組。整理如表一所示：
需註明的是，當第一微核醣核酸為miR-93時，第二微核糖核酸限定為miR-17、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-155、miR-24、miR-19b、或miR-18a。因此，本實施例所述之評估方法並不包含第一微核醣核酸與第二微核醣核酸同時為miR-93的情況。
於步驟S10中，係透過檢測糞便檢體中上述第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的表現量。較佳的，可藉由微陣列生物晶片(microarray)或定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)的技術以檢測第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的表現量。以微陣列生物晶片而言，可透過於一微陣列生物晶片區分為二區域，分別設置可對應於上表之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸的核酸探針(nucleotide probe)。抑或是，於一微陣列生物晶片設置可對應於上表之第一微核醣核酸群組的核酸探針，並於另一微陣列生物晶片設置可對應於上表之第二微核醣核酸群組的核酸探針，以二片微陣列生物晶片進行檢測。以定量聚合酶鏈鎖反應而言，則可透過設計出可偵測前述之各第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的引子(primer)及核酸探針，並透過定量聚合酶鏈 鎖反應以檢測各個第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的表現量。
另外，第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組所包含的各個微核醣核酸的序列，可於miRBase的線上資料庫已公開的微核醣核酸序列中查詢，並可依據該些序列設計對應之引子(primer)及核酸探針，對應之引子(primer)及核酸探針亦可直接自美商應用生命系統(Applied Biosystem)公司之網站輸入對應之索引編號(Accession No.)後購得，如後實驗例一中所說明的。
本實施例之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸表現量是以經由定量聚合酶鏈鎖反應所得到Cq值換算為核酸片段濃度(以copies/μl為單位)為例說明。Cq值(quantification cycle，亦稱threshold cycle)即指在定量聚合酶鏈鎖反應的過程中，核酸片段的生成量大於閾值門檻(threshold value)時所對應的循環數值(cycle number)。而本發明所屬技術領域具有通常知識之人均可明瞭，在定量聚合酶鏈鎖反應中核酸片段的起始濃度的對數值與其Cq值為線性關係，故由未知樣本中所測得之Cq值，與由標準樣本所建立之樣本濃度-Cq值曲線(copy number-Cq value standard curve)比對後，即可推算出該未知樣本中待測核酸片段的濃度。因此，將兩個待測核酸片段miRNAX以及miRNAY樣本經定量聚合酶鏈鎖反應所得的CqX、CqY值相減後取以二為底的指數運算，亦可換算出這兩個待測核酸片段樣本的起始濃度的比例，換算公式則如下所示：
其中，miRX代表miRNAX的起始濃度，miRY代表miRNAY的起始濃度，CqX為miRNAX經定量聚合酶鏈鎖反應所測得的Cq值，CqY為miRNAY經定量聚合酶鏈鎖反應所測得的Cq值。
另外，本實施例中進行的定量聚合酶鏈鎖反應係以兩階段(two-step)定量聚合酶鏈鎖反應為例說明，即先將總RNA(total RNA)反轉錄(reverse transcription)成互補去氧核醣核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)後，再以互補去氧核醣核酸為模板(template)進行定量聚合酶鏈鎖反應。詳細而言，將自前述評估對象所取得之溶於緩衝保存試劑中的糞便檢體經高速離心後，取其上清液以進行總RNA的萃 取。接著，將萃取出的總RNA以前述之第一核醣核酸群組及第二核醣核酸群組所對應之引子的混合物進行反轉錄反應，以取得互補去氧核醣核酸。再以互補去氧核醣核酸為模板，並分別以前述之第一核醣核酸群組及第二核醣核酸群組所對應之引子，進行定量聚合酶鏈鎖反應，以取得前述各個第一核醣核酸及各個第二核醣核酸的Cq值後以前述公式進行換算，以作為本實施例之表現量的比例。
而本發明所述技術領域具有通常知識者均應明瞭，目前定量聚合酶鏈鎖反應的偵測係將超過40個循環(cycles)的訊號(Cq>40)均認定為低可信度。因此本實施例依TaqMan® MicroRNA Assays Protocol，將定量聚合酶鏈鎖反應的循環數設定為40，故Cq值最大為40。
透過定量聚合酶鏈鎖反應以檢測各個第一微核醣核酸及各個第二微核醣核酸的表現量後，於步驟S20中，根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。需說明的是，本實施例所述第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例可以為第一核醣核酸的表現量與第二核醣核酸的表現量相除所得比值(以下以「第一核醣核酸/第二核醣核酸」稱之)，例如miR-223/miR-221之比值；或是第二核醣核酸的表現量與第一核醣核酸的表現量相除所得比值(以下以「第二核醣核酸/第一核醣核酸」稱之)，例如miR-221/miR-223之比值，本發明並不限制。而針對不同第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的比例組合所對應之檢測閾值範圍，及其適用之比例組合方式為第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸，皆記載於表二。因此，可以依據表二記載之內容以評估該評估對象罹患大腸直腸癌的風險程度。在本說明書中所使用之「檢測閾值(threshold)」一詞意指評估人類個體罹患大腸直腸癌的參考值。檢測閾值位於一較佳的數值範圍內，換言之，其非為一定值，隨著檢測閾值改變，其檢測敏感度與特異性會隨之改變。本發明所屬技術領域具有通常知識者亦可明瞭不同第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的搭配組合所對應之檢測閾值會有所變化。以下將具體說明各種第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的組合所適用 之檢測閾值及其較佳範圍。
如表二所示，於本實施例中，當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於該檢測閾值者評估為高風險，小於該檢測閾值者評估為低風險。或者，當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於該檢測閾值範圍者評估為高風險，落於該檢測閾值範圍內者評估為中風險，小於該檢測閾值範圍者評估為低風險。
舉例而言，在定量聚合酶鏈鎖反應後，將miR-223(第一微核醣核酸)的濃度與miR-221(第二微核醣核酸)的濃度相除後(分母為miR-221)可得到一比值，或是將miR-223及miR-221經定量聚合酶鏈鎖反應所得之Cq值以前述公式(1)換算為比值，並將比值與表二進行比對。若比值大於9.563，會評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值小於9.563，則評估為低風險者。而若是使用檢測閾值範圍的方式進行評估，則若比值大於13.92，評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在4.143~13.92之間(包含等於4.143、13.92)，則評估為中風險者；若比值小於4.143，則評估為低風險者。
需說明的是，雖然上述實施例係以當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於表二所列出之對應檢測閾值評 估為高風險；然本領域具有通常知識者亦當明瞭，若將分子分母互換後之比值與互換前之比值兩者間僅為倒數關係，而以此進行評估時所使用的對應檢測閾值則可將原本之檢測閾值進行倒數換算而得出，且此時評估方式則轉換為將小於該對應之檢測閾值之評估對象評估為高風險。並且，其檢驗效果(受試者操作曲線下面積、敏感度及特異性)均不因此而發生變化。
舉例而言，若以miR-223/miR-221之比值進行評估，則如上表二中所顯示的係當miR-223/miR-221之比值大於13.92則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在4.143~13.92之間(包含等於4.143、13.92)，則評估為中風險者；若比值小於4.143，則評估為低風險者。而若以miR-221/miR-223之比值進行評估，則對應之檢測閾值範圍轉換為0.072(約是13.92之倒數)至0.241(約是4.143之倒數)，且當miR-221/miR-223之比值小於0.072則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在0.072~0.241之間(包含等於0.072、0.241)，則評估為中風險者；若比值大於0.241，則評估為低風險者。同樣地，若以miR-25/miR-24之比值進行評估，則如上表二中所顯示的係當miR-25/miR-24之比值大於2.376則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在0.996~2.376之間(包含等於0.996、2.376)，則評估為中風險者；若比值小於0.996，則評估為低風險者。而若以miR-24/miR-25之比值進行評估，則對應之檢測閾值範圍轉換為0.421(約是2.376之倒數)至1.005(約是0.996之倒數)，且當miR-24/miR-25之比值小於0.421則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在0.421~1.005之間(包含等於0.421、1.005)，則評估為中風險者；若比值大於1.005，則評估為低風險者。
本實施例之評估方法，包括表一所示之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組的微核醣核酸種類，以及表二所示之閾值範圍，是分別收集144位確診罹患大腸直腸癌及390位健康之人類個體的糞便檢體，並由其糞便檢體中微核醣核酸的含量，經發明人費心計算歸納出表示中之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組的微核醣核酸種類，以及取得相對應之檢測閾值範圍。而本實施例之評估方法可達到的檢驗效果(敏感度及特異性)，以下係實驗例二呈現。
由於在糞便檢體中的總核醣核酸含量極低，絕對定量模板(template)濃度並不準確。而一般微核醣核酸的偵測方法皆須透過聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大微核醣核酸的濃度後，再續行定量的試驗。但其仍存在的問題是，糞便檢體中的核酸片段濃度，即用於聚合酶鏈鎖反應的模板(template)濃度，會因採樣時間不同、是否震盪均勻等因素而有很大的誤差，故難以控制每一批次的糞便檢體皆在相同的基準。因此，僅使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)相關的測量方法所建立的評估方法，亦有相當大的誤差。
為了解決上述缺點，本發明第一實施例所示之評估方法係透過第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例計算，在第一微核醣核酸之表現量與第二微核醣核酸之表現量相除的計算過程中，即可排除模板(template)濃度不同所導致的差異，故所建立之評估方法可降低因每次糞便檢體採樣的差異進而造成檢測誤差的問題。
於第一實施例所示的評估方法中，較佳的，若係於第一微核醣核酸群組中，選取miR-223作為檢測標的，且於第二微核醣核酸群組中選取miR-221、miR-222、miR-21，或miR-93作為檢測標的，並比對第一微核醣核酸與第二微核醣核酸表現量之比例，亦即比對miR-223/miR-221、miR-223/miR-222、miR-223/miR-21、miR-223/miR-93的比值，可具有較佳的評估效果。在本實施例中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例所得之診斷準確度(area under curve，AUC)大於單獨使用第一微核醣核酸或單獨使用第二微核醣核酸之診斷準確度。
此外，若係於第一微核醣核酸群組中，選取miR-25作為檢測標的，且於第二微核醣核酸群組選取miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c或miR-191作為標的物，並比對第一微核醣核酸與第二微核醣核酸表現量之比例，亦即比對miR-25/miR-221、miR-25/miR-222、miR-25/miR-21、miR-25/miR-93、miR-25/miR-141、miR-25/miR-200c、或miR-25/miR-191的比值，同樣可具有較佳的評估效果。同樣的，此時使用第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例所得之診斷準確度(AUC)大於單獨使用第一微核醣核酸或單獨使用第二微核醣核酸之診斷準確度。
圖2為本發明第二實施例之評估方法的流程示意圖，請參考圖2所示。本實施例之評估方法包括以下步驟：由糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量(步驟S10)；判斷第一微核醣核酸的表現量是否大於一濃度閾值(步驟S30)。若為「是」，亦即當第一微核醣核酸的表現量大於一濃度閾值，則評估為高風險(步驟S32)；若為「否」，亦即當第一微核醣核酸小於濃度閾值，則根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險(步驟S34)。其中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸皆為多個微核醣核酸所組合成的群組，而其詳細內容可參考表一所列之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組。
在本實施例中，亦先檢測微核醣核酸的表現量(步驟S10)，接著，判斷第一微核醣核酸的表現量是否大於一濃度閾值(步驟S30)。當第一微核醣核酸的表現量大於一濃度閾值時，則評估為高風險。具體而言，在第一微核醣核酸群組中，若有其中一第一微核醣核酸(miR-223、miR-25或miR-93)的表現量大於一濃度閾值，則可評估為罹患大腸直腸癌的高風險者(步驟S32)。而本實施例所稱之「濃度閾值」是核酸片段的濃度(copies/μl)是否大於一參考值，若大於此一參考值則評估為高風險。本實施例中第一微核醣核酸miR-223、miR-25及miR-93所使用之對應的預設值如下表三所示。需說明的是，表三所列之評估的參考值係以較佳的濃度閾值(例如550.6copies/μl)為例說明，當然，在其他實施例中，亦可於濃度閾值範圍(例如226.4~804.8copies/μl)中選取適合的濃度閾值作為評估的參考值，本發明不以此為限。當然，在其他實施例中，使用其他第一微核醣核酸時，其對應之濃度閾值自為不同，故本發明不以此為限。步驟S30係利用第一微核醣核酸的表現量是否大於對應的濃度閾值來評估個體罹患大腸直腸癌的風險程度。
當第一微核醣核酸的表現量小於濃度閾值，則進入步驟S34，依據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。舉例而言，於步驟S10中以miR-223、miR-25及miR-93所對應之引子進行定量聚合酶鏈鎖反應，若其結果為miR-223的濃度為34copies/μl、miR-25的濃度為6copies/μl、miR-93的濃度為5copies/μl，其皆小於濃度閾值，故進一步進行步驟S34的評估步驟。亦即，分別計算miR-223、miR-25、miR-93之表現量與miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b，及miR-18a(第二微核醣核酸)之表現量比例後，再與表二所示閾值範圍進行比對，以評估罹患大腸直腸癌的風險。而步驟S34的細節內容，可參考第一實施例之步驟S20，於此不加贅述。
另外，本實施例選用miR-223、miR-25及miR-93作為第一微核醣核酸群組，由於miR-223、miR-25及miR-93之表現量為上調，亦即指在罹患大腸直腸癌的病患之糞便檢體中，其第一微核醣核酸之表現量大於正常人類個體之糞便檢體中的第一微核醣核酸之表現量，可作為評估罹患大腸直腸之風險的基準。因此，本實施例先於步驟S30將第一微核醣核酸之表現量大於等於濃度閾值者(即一般醫療檢驗領域所稱之「陽性(positive)」者)，評估為高風險。接著，再於步驟S40，將第一微核醣核酸之表現量小於濃度閾值者(即一般醫療檢驗領域所稱之「陰性(negative)」者)，以比例計算及其對應之評估方式進行二次評估，可避免僅以第一微核醣核酸進行評估所可能存在的「偽陰性(false negative)」的情形。其中，「偽陰性」係指罹患有大腸直腸癌卻未被檢測出來的情形，此為醫療檢驗單位所極力避免的情形。
圖3為本發明第三實施例之評估方法的流程示意圖，請參考圖3所示。在一實施例中，評估方法更可與糞便潛血檢測(FOBT)搭配使用，具體實施步驟如下：檢測糞便檢體之潛血反應以及檢測miR-93、 miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量，並評估糞便檢體是否有潛血反應(步驟S40)。
若於步驟S40評估為「是」，亦即選取有潛血反應的該糞便檢體，並進一步計算miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222之表現量的第三比例(步驟S50)；接著，判斷第一比例、第二比例或第三比例是否大於對應之檢測閾值(步驟S52)；若步驟S52判斷為「是」，亦即當第一比例、第二比例或第三比例中任何一者大於其對應之檢測閾值，評估為高風險(步驟S54)，反之，評估為低風險(步驟S56)。
而若於步驟S40評估為「否」，亦即選取無潛血反應的該糞便檢體，並同樣進一步計算miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222之表現量的第三比例(步驟S60)；接著，判斷第一比例、第二比例及第三比例是否大於對應之檢測閾值(步驟S62)；若步驟S62判斷為「是」，亦即當第一比例、第二比例與第三比例均大於其對應之檢測閾值，才評估為高風險(步驟S64)，反之，評估為低風險(步驟S66)。
承上，第三實施例之評估方法，係於步驟S40先進行糞便檢體之潛血反應及檢測miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量，而潛血反應與檢測表現量可同時進行，分開進行，本發明不以此為限。其中，檢測miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量的方法可參考第一實施例之步驟S10，於此不加贅述。而步驟S40更依據糞便檢體之潛血反應以評估糞便檢體是否有潛血反應。接著，選取有潛血反應(即一般醫療檢驗領域所稱之「陽性」者)進行步驟S50~S56；並選取無潛血反應(即一般醫療檢驗領域所稱之「陰性」者)進行步驟S60~S66。換言之，步驟S50~S56與步驟S60~S66的評估步驟流程實質上相同，僅檢測對象(有潛血反應或無潛血反應的糞便檢體)及評估標準略有不同。因此，以下係以步驟S50~S56為例說明。
在步驟S50中，先計算miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222 之表現量的第三比例。在本實施例中，即是依據表二所示之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的比例組合以及步驟S40所取得之miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量，計算出miR-155/miR-93的比值(第一比例)、miR-223/miR-221的比值(第二比例)、以及miR-223/miR-222的比值(第三比例)。接著，續於步驟S52將前述所取得第一比例、第二比例或第三比例與表二所示之檢測閾值比對，以判斷其是否大於對應的檢測閾值。具體而言，即判斷第一比例是否大於0.0051，第二比例是否大於9.563，以及第三比例是否大於8.846，若其中之一大於對應之檢測閾值，則可評估為高風險(步驟S54)。反之，若第一比例、第二比例及第三比例皆小於對應之檢測閾值，則可評估為低風險(步驟S56)
換言之，步驟S50~S56即為選取有潛血反應的糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222之表現量的第三比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，當第一比例、第二比例或第三比例任何一者大於其所對應之檢測閾值，則評估為高風險。相對應的，步驟S60~S66即為選取無潛血反應的糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，以及miR-223與miR-222之表現量的第三比例，當第一比例、第二比例以及第三比例均大於對應之各檢測閾值，評估為高風險；反之，若第一比例、第二比例及第三比例任何一者小於對應之檢測閾值，則可評估為低風險。
因此，第三實施例係依據糞便檢體之潛血反應的初步結果，將評估為有潛血反應者(陽性)，再進一步以miR-155/miR-93(第一比例)、miR-223/miR-221(第二比例)、以及miR-223/miR-222(第三比例)進行二次評估，以進一步確認有潛血反應者(陽性)同時具有罹患大腸直腸癌的高風險者，並可同時排除「偽陽性(false positive)」者。具體而言，糞便檢體之潛血反應常因月經出血、痔瘡或便秘出血、或血尿等原因而造成產生「偽陽性」的檢測結果，而第三實施例之評估方法續以三種微核醣核酸的比例進行二次評估，可進一步排除偽陽性的結果，使檢測結果更為精確。
另外，第三實施例針對無潛血反應者(陰性)，同樣進一步 以miR-155/miR-93(第一比例)、miR-223/miR-221(第二比例)、以及miR-223/miR-222(第三比例)進行二次評估，亦即步驟S62~S66，以進一步確認無潛血反應者(陰性)具有罹患大腸直腸癌的高風險者，亦即可找出「偽陰性(false negative)」者。
較佳的，具體而言，糞便檢體之潛血反應亦可能因大腸直腸癌患者無血便的情形，而無法藉由糞便檢體之潛血反應評估，進而有「偽陰性」的情況發生，而續以三種微核醣核酸的比例進行二次評估，可進一步找出偽陰性的結果，使檢測結果更為精確。
此外，本發明的第四實施例亦同時提供一種用於自人類個體所取得之糞便檢體中評估個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物。該標誌物包括：第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸，且第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例在罹患大腸直腸癌之患者所取得之糞便檢體中與對照糞便檢體中具有顯著差異。本實施例中的第一微核醣核酸群組與第二微核醣核酸群組與第一實施例中相同，如表一中所示。
本發明第四實施例之標誌物，用於評估個體罹患大腸直腸癌之風險，其操作步驟及效果與第一實施例相同，藉由採檢罹患大腸直腸癌患者的糞便檢體與健康人類個體的糞便檢體，並檢測該些糞便檢體中如表一所示之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，其細節步驟可參考第一實施例，在此不再贅述。而由檢測結果可發現罹患大腸直腸癌患者相較於健康人類個體的糞便檢體，具有至少一種第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例具有顯著差異。亦即，本實施例所稱之「對照糞便檢體」係指健康人類個體的糞便檢體，作為與罹患大腸直腸癌之患者的比對基礎。
承上所述，依據本發明之評估方法及標誌物，其係根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，對於非入侵性、及高準確性的目的，提供了顯著的功效。
本評估方法是透過收集144位罹患大腸直腸癌病患及390位健康之人類個體的糞便檢體，並分析其各種微核醣核酸表現量，以找出可作為評估罹患大腸直腸癌的標誌物(如表一所列之微核醣核酸)，或稱生 物標的，以及該些標誌物所對應的檢測閾值(如表二所示)。換言之，藉由該些標誌物及其對應之檢測閾值以建立出本評估方法。以下先以實驗例一係確認本評估方法可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險，而並於後續實驗例證實其具有較佳的評估效果。
實驗例一：本評估方法可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險
評估對象與糞便檢體
本實驗例係自台灣長庚醫院(Chang Gung Memorial Hospital in Taiwan)收集144位罹患大腸直腸癌病患及390位健康之人類個體的糞便檢體，並分析如表一所示之各種微核醣核酸表現量。癌症是根據2009年美國癌症聯合委員會分期標準第7版(2009 American Joint Committee on Cancer staging criteria，7th edition)進行判定，同時記錄其臨床病理因子，包括年齡，性別和免疫糞便潛血試驗(iFOBT)結果。對於樣品的採集，則收取大腸直腸癌病患所捐贈之糞便樣本，該糞便樣本為經由常規iFOBT檢測所殘留之剩餘樣本，且採集該些糞便樣本前該些病患並未進行任何治療。針對健康對照組，則均從桃園長庚醫院之健康檢查中心所取得。參加者接受了大腸鏡(colonoscopy)檢查，並且鏡檢結果均為無瘤、良性病理增生(pathologically approved hyperplasia)或小於10毫米之管狀腺瘤(tubular adenoma)等陰性結果，同時亦記錄其免疫糞便潛血試驗(iFOBT)結果。所有的病患和健康者均以書面方式提供告知同意，且本研究係經長庚醫院的審查委員會審核通過。
本實驗例係使用免疫糞便檢體潛血反應(iFOBT)的採檢容器及套組，如OC-Sensor Diana Latex Reagent(Eiken Chemical,Tokyo,Japan)套組。具體而言，透過棉棒(swab)或採便器沾取糞便檢體後，置入緩衝保存試劑中，並透過震盪的方式，將附著於棉棒或採便器上的糞便檢體均勻的溶入緩衝保存試劑，並將經震盪後具有糞便檢體的緩衝保存試劑取出而至於微量離心管(eppendrof)或其他容器中，以供後續實驗。而在實驗尚未進行的期間，可將處理後的糞便檢體保存於-80℃備用。
萃取微核醣核酸(Extraction of microRNA)
在本實驗例中，係以核醣核酸萃取套組miRNeasy Mini Kit(QIAGEN,CA,USA)萃取糞便檢體中的總核醣核酸(Total RNA)，其包括微核醣核酸(microRNA)。首先，將前述處理後的糞便檢體以高速離心去除雜質，並取300μL的上清液置入miRNeasy Mini Kit所附的收集管中。並依據miRNeasy Mini Kit所檢附的操作方法添加緩衝液，最後以30μL的去RNA酶水(RNase-free water)流洗，以取得約30μL的總核醣核酸及微核醣核酸溶液，並可將其置於-80℃備用。
反轉錄反應(Reverse transcription PCR,RT-PCR)
接著，本實驗例係以TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)。以前述萃取之總核醣核酸及微核醣核酸為模板(template)，並反轉錄形成互補去氧核醣核酸(cDNA)。本實驗例於反轉錄聚合酶連鎖反應中所使用的引子(primer)與後續定量聚合酶連鎖反應所使用的引子與探針(probe)均由美商應用生命系統(Applied Biosystem)公司之網站(http：//bioinfo.appliedbiosystems.com/genome-database/mirna.html)輸入對應之索引編號(Accession No.)後購得。本實驗例中所使用之第一與第二微核醣核酸的反轉錄聚合酶連鎖反應中所使用的引子與定量聚合酶連鎖反應所使用的引子與探針所對應之索引編號如下表四所示：
接著，再依據TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit所提供的操作方法，將由上述方式購得之引子與總核醣核酸及微核醣核酸(模板)及其他反應試劑混合後，進行反轉錄反應。其中，反轉錄的反應步驟：以16℃處理30分鐘；再以20℃處理30秒，42℃處理30秒，50℃處理1秒，並重複50個循環；最後，再以70℃處理10分鐘，以取得互補去氧核醣核酸(cDNA)。
定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-PCR)
本實驗例係以TaqMan Human MiRNA Assay(Applied Biosystems,Foster City,CA)套組進行定量聚合酶連鎖反應(qPCR)。首先，將前述取得之互補去氧核醣核酸(cDNA)作為定量聚合酶鏈鎖反應的模板，並分別依據表四所示之索引編號至美商應用生命系統公司之網站所購得之引子添加對應的引子及探針，並依TaqMan® MicroRNA Assays Protocol(2006年版，型號(Part Number)4364031，Rev.B)設定定量聚合酶連鎖反應所需各項參數，以檢測對應之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸，進而取得對應之微核醣核酸於評估對象的糞便檢體中的濃度(copies/μl)或Cq值。
表五顯示本實驗例中所收集之6位確診罹患大腸直腸癌及6位健康之人類個體的糞便檢體的檢測結果。其中，「樣本編號」欄位中，「N」表示為正常組，即健康之人類個體的糞便檢體的檢測結果；「CRC」表示為大腸直腸癌組，即確診罹患大腸直腸癌之病患的糞便檢體的檢測結果。而本實驗例各取6位作為正常組或大腸直腸癌組，分別1~6表示之。本實驗例依據前述步驟分別取得評估對象(N1~N6及CRC1~CRC6)之糞便檢體中的第一微核醣核酸(miR-223)及第二微核醣核酸(miR-221)的濃度後，便可根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
依據表二所示可知，當第一微核醣核酸為miR-223，而第二微核醣核酸為miR-221時，其檢測閾值為9.563，故若miR-223/miR-221的比值大於9.563則可評估為高風險，一般臨床檢測可稱為陽性。若miR-223/miR-221的比值小於9.563則可評估為低風險，一般臨床檢測可稱為陰性。而由表四可知，正常組(N1~N6)之miR-223/miR-221的比值皆小於3，評估為低風險，且大腸直腸癌組(CRC1~CRC6)之miR-223/miR-221的比值皆大於19，可評估為高風險。因此，由實驗例一所示之結果可證實本評估方法確實可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險。
實驗例二：本評估方法與免疫糞便潛血試驗進行評估的效果比較
在實驗例二中，係以實驗例一中所收集的390位健康之人類 個體及144位確診罹患大腸直腸癌的糞便檢體，並依據實驗例一的採樣方法及表現量的測量方法，檢測糞便檢體中如表一所列之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的濃度(表現量)。
接著，依據表二以第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的組合比例，以及各糞便樣本來源所代表之個體是健康對照組或是大腸直腸癌患者以PASW Statistics 18.0軟體繪製接受者操作特徵曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC curve)並計算出接受者操作特徵曲線下的面積(Area Under the ROC curve，AUC)，以取得對應之Youden Index做為檢測閾值，而該點係代表其特異性(specificity)及敏感度(sensitivity)之和為最大值。ROC曲線下的面積(Area Under the ROC curve,AUC)，其可用於衡量所用之評估方法正確鑑定的概率，而可用來確定檢驗的有效性，故亦可稱為診斷準確度，以下係以AUC值稱之。實驗例二之信賴區間(confidence interval)設定在95%，而所得之p值小於0.05代表統計上有顯著差異。
同樣的，以相同的數據處理方法，直接將第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的濃度以PASW Statistics 18.0軟體計算接受者操作特徵曲線(ROC curve)，並取得對應之AUC值，並藉由比對AUC值，以評估本評估方法的有效性。於本實驗例以及後續之實驗例中，除有特別說明者外，其所顯示的AUC值之p值均小於0.05。
此外，本實驗例中亦計算大腸直腸癌患者糞便檢體中，表二所示的各個第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，與健康正常組的糞便檢體中各個第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，兩者之間的倍數，並同時進行曼一惠特尼U檢定(Mann-Whitney U test)，若所得之p值(p-value)小於0.05則定義為有統計上顯著差異。
在本實驗例中，以表二所示之檢測閾值為基準，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於檢測閾值者則判定為陽性(positive,P)，而小於檢測閾值的最高值者則判定為陰性(negative,N)。舉例而言，miR-223/miR-221的比值大於9.563者，判定為陽性，而小於9.563者，則判定為陰性。接著，在判定陽性的糞便檢體中，若來自於「144位確診罹患大腸直腸癌」的糞便檢體，則為「真陽性(true positive,TP)」，若來 自於「390位健康之人類個體」的糞便檢體，則為「偽陽性(false positive,FP)」。同理，在判定陰性的糞便檢體中，若來自於「390位健康之人類個體」的糞便檢體，則為「真陰性(true negative,TN)」，若來自於「144位確診罹患大腸直腸癌」的糞便檢體，則為「偽陰性(false negative,FN)」。將前述「真陽性(TP)」、「偽陽性(FP)」、「真陰性(TN)」、「偽陰性(FN)」的數量，計算出如表六所示之各個第一微核醣核酸及第二微核醣核酸之組合的敏感度(sensitivity)及特異性(specificity)。其中，敏感度係指「TP/(TP+FP)」，即判定為陽性(P)的樣本中，已確診為大腸直腸癌的真陽性(TP)，而特異性係指「TN/(TN+FN)」，即判定為陰性(N)的樣本中，來自於健康的人類個體樣本的真陰性(TN)。
依據本實驗例之上述實驗方法使用表二中所示第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例進行評估之AUC值、檢測閾值、敏感度及特異性如下所示。表中所列之AUC值均有統計上顯著意義(p<0.05)。同時，表六中所列之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，在大腸直腸癌患者的糞便檢體與健康正常組的糞便檢體之比例(癌症患者/健康者之倍數)經統計後其p值均小於0.05，故顯示表六中所列之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，在大腸直腸癌患者的糞便檢體與健康正常組的糞便檢體中具有顯著差異。
此外，將實驗例一所收集之糞便樣本進行免疫糞便潛血測試發現，免疫糞便潛血測試的敏感度及特異性分別為55.2%及66.2%。因此，由上表可得知，不論是使用miR-223與miR-221、miR-223與miR-222、miR-223與miR-93、miR-223與miR-141、miR-223與miR-148a、miR-223與miR-106a、miR-223與miR-20a、miR-223與miR-181b、miR-223與miR-155、miR-223與miR-106b、miR-223與miR-24、miR-223與miR-18a、miR-25與miR-222、miR-25與miR-21、miR-25與miR-200c、miR-25與miR-191、miR-25與miR-106a、miR-25與miR-181b、miR-25與miR-155、miR-25與miR-106b等組別之比例評估個體罹患大腸直腸癌的風險，相較於使用免疫糞便潛血試驗方法，均有較高的敏感度及特異性。故第一實施例之評估方法相較於免疫糞便潛血試驗方法，亦能更為有效地評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
實驗例三：本評估方法與使用單一微核醣核酸進行評估的效果比較
在實驗例三中，其實驗流程與數據計算整理皆可參照前述實驗例二。在本實驗例中，相較於使用單一微核醣核酸(第一微核醣核酸或第二微核醣核酸)的表現量進行評估，使用表二中所示之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例會有較為良好的效果。舉例而言，如表七所示的，miR-223/miR-221、miR-223/miR-222、miR-223/miR-21、miR-223/miR-93、miR-25/miR-221、miR-25/miR-222、miR-25/miR-21、miR-25/miR-93、miR-25/miR-141、miR-25/miR-200c、及miR-25/miR-191所得之AUC值(診斷準確度)大於單獨使用第一微核醣核酸(miR-223、miR-25)或單獨使用第二微核醣核酸(miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191)的AUC值(診斷準確度)，顯示使用前述這些第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例來評估人類個體罹患直腸大腸癌風險，相較於單獨使用對應之第一微核醣核酸(miR-223、miR-25)或單獨使用對應之第二微核醣核酸(miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191)，來得更為有效。
實驗例四：表一所示之第一及第二微核醣核酸在不同檢體之表現變化量之比較
實驗例四係比較表一所示之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸分別在糞便檢體、組織檢體及血液檢體中的表現改變程度。本實驗例同樣是以實驗例一中所收集的144位確診罹患大腸直腸癌者(大腸直腸癌組)及390位健康之人類個體(正常組)的糞便檢體進行分析。而組織檢體部分，則是收集81位確診罹患大腸直腸癌者(大腸直腸癌組)的經手術癌化組織檢體及同一患者非病灶組織(正常組)的大腸組織檢體進行分析。血液檢體部分，則是抽取215位確診罹患大腸直腸癌者(大腸直腸癌組)的血液檢體及173位健康之人類個體(正常組)的血液檢體進行分析。並將所收集到的檢體依據實驗例一的操作步驟，進行微核醣核酸萃取、反轉錄反應及定量聚合酶連鎖反應，以取得糞便檢體、組織檢體及血液檢體中的各第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的表現量。
接著，分別計算不同檢體中，同一微核醣核酸(如miR-223)於大腸直腸癌組與正常組之表現量的比值，並以正常組作為分母，以取得相較於正常組的倍數(Fold)，同時進行曼-惠特尼U檢定(Mann-Whitney U test)，若所得之p值(p-value)小於0.05則定義為有統計上顯著差異。因此，若大腸直腸癌組與正常組的表現量相同，則比值為1；若大腸直腸癌 組的表現量較高，比值大於1；或正常組的表現量較高，則比值介於0~1之間。其他細節操作步驟可參考前述，於此不加贅述。
由表八可知，表一所示的第一與第二微核醣核酸，在不同的組織檢體中，其表現改變程度不一樣，且於某一種檢體中其改變倍數有統計上差異者，亦不必然在其他種檢體中有統計上之差異(例如miR-155、miR-181b、miR-24)。因此，適用於針對組織檢體或血液檢體來評估個體罹患大腸直腸癌風險的微核醣核酸，不必然就適用於糞便檢體中。
此外，若將表一中所示之各微核醣核酸，即便於糞便檢體中，其表現改變程度亦非均有統計上差異。所以若是僅用表一中所列之各微核醣核酸的的表現改變程度，亦非均能有效評估個體罹患大腸直腸癌的 風險。相較之下，如表六所示，本發明第一實施例之評估方式，利用第一微核醣核酸及第二微核醣核酸表現量之比例的方法，即能將原本無法單一適用於糞便檢體中的微核醣核酸，轉化為能夠作為有效評估之標的。
實驗例五：第二實施例之評估方法可減少偽陰性的錯誤評估
以第二實施例的評估方法來評估個體罹患大腸直腸癌的風險時，即先以第一微核醣核酸的表現量評估後，再以比例計算的方式評估罹患大腸直腸癌的風險，相較於直接使用對應之第一微核醣核酸來評估(即表九「第一微核醣核酸/第二微核醣核酸」欄位未顯示內容者)，可降低其偽陰性。其結果如下表九所示。
由上表可知，以第二實施例的評估方法來評估個體罹患大腸直腸癌的風險時，其敏感度相較於直接使用對應之第一微核醣核酸來得高，故顯示其可有效降低單純使用第一微核醣核酸所產生之偽陰性。
實驗例六：第一實施例及第三實施例之評估方法與免疫糞便潛血試驗之比較
本實驗例中所使用的糞便檢體之收集與採樣、免疫糞便潛血試驗、各微核醣核酸之萃取、反轉錄反應及定量聚合酶連鎖反應、各微核醣核酸表現量比例之計算，其所使用之材料及實驗方式如同實驗例一中所述。此外，由於進行性息肉(advanced polyps)亦有相當風險發展為大腸直 腸癌，故本實驗例中亦自經大腸鏡檢(colonoscopy)後判定為進行性息肉(advanced polyps)的27位個體採集其糞便檢體，一併納入分析。
其實驗結果如圖4所示，圖4為本發明第三實驗例之各評估方法之實驗結果圖。同前所述，免疫糞便潛血試驗的對大腸直腸癌的敏感度及特異性分別為55.2%及66.2%。由圖中可知而第三實施例中所述(使用miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，及/或miR-223與miR-222之表現量的第三比例進行評估)的評估方法，其特異性為70.51%，而其對於大腸直腸癌樣本之敏感度則為70.14%，對於進行性息肉樣本之敏感度則為70.37%。因此，以前述第三實施例中所述的評估方法，評估個體罹患大腸直腸癌的風險時，可同時減少由免疫糞便潛血試驗所造成的偽陽性及偽陰性的錯誤評估。
再者，若與僅使用單一比例進行評估相較，使用miR-223/miR-221或miR-223/miR-222進行評估，其對進行性息肉樣本的敏感度分別僅為18.52%及29.63%，均低於第三實施例之評估方法對於進行性息肉樣本的敏感度(70.37%)。相對的，使用miR-155/miR-93進行評估，其特異性僅為45.13%，低於第三實施例之評估方法之特異性(70.51%)。因此，相較之下，第三實施例之評估方法可以在維持其特異性的情況下，同時保持對進行性息肉樣本與大腸直腸癌樣本的良好敏感度。故第三實施例之評估方法，更能有效地評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包括於後附之申請專利範圍中。

Claims (9)

  1. 一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由該糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量；以及根據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險，其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-223及miR-25所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c及miR-191所組成之群組，其中當該第一微核醣核酸為miR-223時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21或miR-93；及其中當該第一微核醣核酸為miR-25時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c或miR-191。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險的步驟為當該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸之表現量為上調。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中當該第一微核醣核酸為miR-223時，該第二微核醣核酸為miR-221或miR-93；當該第一微核醣核酸為miR-25時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-93、或miR-191。
  5. 一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由該糞便檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量；當該第一微核醣核酸的表現量大於一濃度閾值評估為高風險；以及當該第一微核醣核酸小於該濃度閾值，則依據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之 風險，其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-223及miR-25所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c及miR-191所組成之群組，其中當該第一微核醣核酸為miR-223時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21或miR-93；及其中當該第一微核醣核酸為miR-25時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c或miR-191。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險的步驟為該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該第一微核醣核酸之表現量為上調。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中當該第一微核醣核酸為miR-223時，該第二微核醣核酸為miR-221或miR-93；當該第一微核醣核酸為miR-25時，該第二微核醣核酸為miR-221、miR-93、或miR-191。
  9. 一種自一人類個體所取得之一糞便檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：檢測該糞便檢體之潛血反應以及檢測miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222之表現量；選取有潛血反應的該糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，或miR-223與miR-222之表現量的第三比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險，當該第一比例、第二比例或第三比例大於對應之一檢測閾值，評估為高風險；以及選取無潛血反應的該糞便檢體，並根據miR-93與miR-155之表現量的第一比例、miR-223與miR-221之表現量的第二比例，以及miR-223與miR-222之表現量的第三比例，當第一比例、第二比例以及第三比例均大於對應之各該檢測閾值，評估為高風險。
TW104100830A 2015-01-09 2015-01-09 評估罹患大腸直腸癌風險的方法 TWI626314B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104100830A TWI626314B (zh) 2015-01-09 2015-01-09 評估罹患大腸直腸癌風險的方法
CN201510703647.5A CN105779579A (zh) 2015-01-09 2015-10-27 评估罹患结肠直肠癌风险的方法及标志物
US14/928,387 US20160201138A1 (en) 2015-01-09 2015-10-30 Method and markers for assessing the risk of having colorectal cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104100830A TWI626314B (zh) 2015-01-09 2015-01-09 評估罹患大腸直腸癌風險的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201625796A TW201625796A (zh) 2016-07-16
TWI626314B true TWI626314B (zh) 2018-06-11

Family

ID=56367111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104100830A TWI626314B (zh) 2015-01-09 2015-01-09 評估罹患大腸直腸癌風險的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20160201138A1 (zh)
CN (1) CN105779579A (zh)
TW (1) TWI626314B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107099593B (zh) * 2017-05-09 2020-01-14 上海汇真生物科技有限公司 一种对ncRNA检测结果进行标准化的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100203513A1 (en) * 2006-10-30 2010-08-12 Research Foundation Of State University Of New York Microrna as biomarker in cancer
CN102439169A (zh) * 2008-11-13 2012-05-02 复旦大学 用于结肠直肠癌的微rna表达谱分析的组合物和方法
US20120225925A1 (en) * 2011-02-07 2012-09-06 Biomirna Holdings Ltd. Micro-RNA Biomarkers and Methods of Using Same
TW201303026A (zh) * 2010-10-08 2013-01-16 Baylor Res Inst 作為鑑別家族性及非家族性結腸直腸癌生物標記之微型核糖核酸（ｍｉＲＮＡ）
CN103667516A (zh) * 2014-01-07 2014-03-26 山东大学齐鲁医院 早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱及诊断模型

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2536423T3 (es) * 2006-01-05 2015-05-25 The Ohio State University Research Foundation Métodos basados en microARN para el diagnóstico de cáncer de próstata
US7993831B2 (en) * 2007-09-14 2011-08-09 Asuragen, Inc. Methods of normalization in microRNA detection assays

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100203513A1 (en) * 2006-10-30 2010-08-12 Research Foundation Of State University Of New York Microrna as biomarker in cancer
CN102439169A (zh) * 2008-11-13 2012-05-02 复旦大学 用于结肠直肠癌的微rna表达谱分析的组合物和方法
TW201303026A (zh) * 2010-10-08 2013-01-16 Baylor Res Inst 作為鑑別家族性及非家族性結腸直腸癌生物標記之微型核糖核酸（ｍｉＲＮＡ）
US20120225925A1 (en) * 2011-02-07 2012-09-06 Biomirna Holdings Ltd. Micro-RNA Biomarkers and Methods of Using Same
CN103667516A (zh) * 2014-01-07 2014-03-26 山东大学齐鲁医院 早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱及诊断模型

Also Published As

Publication number Publication date
TW201625796A (zh) 2016-07-16
US20160201138A1 (en) 2016-07-14
CN105779579A (zh) 2016-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2020141684A (ja) 胃がん診断用のマイクロｒｎａバイオマーカー
RU2014120427A (ru) Определение микрорнк в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака
JP2019527544A (ja) 分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法
WO2020220994A1 (zh) 一种检测胃癌的miRNA标志物组合及试剂盒
CN105603101B (zh) 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用
CN104651513B (zh) 一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法
TW201636429A (zh) 用於檢測川崎病的方法及套組
CN108728525B (zh) 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用
TWI571514B (zh) 評估罹患大腸直腸癌風險的方法
CN111286538B (zh) 一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用
CN114457160A (zh) miRNA分子作为早期肺癌检测标志物的应用
JP7345860B2 (ja) 胃癌バイオマーカー及びその用途
CN110592223B (zh) 一种NSCLC的诊断和预后标记物hsa_circRNA_012515的应用
TWI626314B (zh) 評估罹患大腸直腸癌風險的方法
JP6612509B2 (ja) 大腸癌の予後診断を補助する方法、記録媒体および判定装置
JP2024035040A (ja) 分析方法、キット及び検出用デバイス
JP7299765B2 (ja) マイクロｒｎａ測定方法およびキット
JP6103866B2 (ja) 大腸ガン検出方法、診断用キット及びｄｎａチップ
WO2022170133A1 (en) Micro rna liver cancer markers and uses thereof
JP5586164B2 (ja) 潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法
CN114746551A (zh) 大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法
CN116987787B (zh) 检测膀胱癌是否复发的装置和计算机可读存储介质
ES2856232A1 (es) Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos
US20240150849A1 (en) MicroRNAs AS BIOMAKERS FOR THE IN VITRO DIAGNOSIS OF GLIOMA
TWI718474B (zh) 評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees