RS59770B1

RS59770B1 - Modulatori receptora estrogena

Info

Publication number: RS59770B1
Application number: RS20200018A
Authority: RS
Inventors: James Stewart Scott; Thomas Andrew MOSS; Samantha Jayne HUGHES; Johannes Wilhelmus Maria Nissink; Bernard Christophe Barlaam; Bin Yang
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2020-02-28
Also published as: SI3494116T1; KR102246668B1; MX2019008438A; LT3494116T; UA125043C2; JP6951451B2; SG11201906767XA; PL3494116T3; CL2019001991A1; EP3689873B1; PT3494116T; US20180282325A1; PE20191500A1; SMT202000010T1; CO2019008941A2; JOP20190183A1; CR20190379A; US10590132B2; WO2018138303A1; AU2018211495A1

Description

Opis

[0001] Ovaj opis se odnosi na određena jedinjenja indola i njihove farmaceutski prihvatljive soli koji selektivno regulišu na dole receptor estrogena i poseduju aktivnost protiv raka. Ovaj opis se takođe odnosi na upotrebu navedenih jedinjenja indola i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli u postupcima tretmana ljudskog ili životinjskog tela, na primer u prevenciji ili tretmanu raka. Ovaj opis se takođe odnosi na procese i jedinjenja međuproizvode koji su uključeni u dobijanje navedenih jedinjenja indola i na farmaceutske sastave koji ih sadrže.

[0002] Receptor estrogena alfa (ERα, ESR1, NR3A) i receptor estrogena beta (ERβ, ESR2, NR3b) su steroidni hormonski receptori koji su članovi velike porodice jedarnih receptora. Strukturiran nalik svim jedarnim receptorima, ERa se sastoji od šest funkcionalnih domena (nazvanih A-F) (Dahlman-Wright, i dr., Pharmacol. Rev., 2006, 58:773-781) i klasifikovan je kao faktor transkripcije zavisan od liganda, jer se nakon povezanosti sa specifičnim ligandom (ženski polni steroidni hormon 17b estradiol (E2)), kompleks vezuje za genomske sekvence, nazvane elementi receptora estrogena (ERE) i interaguje sa ko-regulatorima za modulaciju transkripcije ciljanih gena. ERa gen je smešten na 6q25.1 i kodira 595AA protein i višestruki izoformi se mogu proizvesti usled alternativnog spajanja i translacionih početnih mesta. Pored domena koji vezuje DNK (Domen C) i domena koji vezuje ligand (domen E) receptor sadrži N-terminalni (A/B) domen, zglobni (D) domen koji povezuje C i E domene i C-terminalnu ekstenziju (F domen). Dok su C i E domeni ERa i ERβ prilično konzervirani (96% i 55% identičnosti aminokiselina respektivno), konzervacija domena A/B, D i F je slabo (ispod 30% identičnosti aminokiselina). Oba receptora su uključena u regulaciju i razvoj ženskog reproduktivnog trakta, i osim toga igraju ulogu u centralnom nervnom sistemu, kardiovaskularnom sistemu i u koštanom metabolizmu. Genomsko dejstvo ER javlja se u jedru ćelije kada receptor vezuje ERE direktno (direktno aktiviranje ili klasičan put) ili indirektno (indirektno aktiviranje ili neklasičan put). U nedostatku liganda, ER se povezuju sa proteinima toplotnog udara, Hsp90 i Hsp70, i pripadajuća mašina kapelena stabilizuje domen koji vezuje ligand (LBD) čineći ga dostupnim ligandu. Ligandirani ER se odvaja od proteina toplotnog udara što dovodi do konformacione promene receptora što omogućava dimerizaciju, vezivanje DNK, interakciju sa ko-aktivatorima ili ko-represorom i modulaciju eksprimiranja ciljanog gena. Na neklasičnom putu, AP-1 i Sp-1 su alternativne regulatorne DNK sekvence koje koriste oba izoforma receptora za modulaciju eksprimiranja gena. U ovom primeru, ER ne komunicira direktno sa DNK, nego preko povezanosti sa drugim faktorima transkripcije vezanim za DNK, npr. c-Jun ili c-Fos (Kushner i dr., Pure Applied Chemistry 2003, 75:1757-1769). Precizan mehanizam kojim ER utiče na transkripciju gena je slabo shvaćen, ali čini se da ga posreduju brojni jedarni faktori koji regrutuju receptor vezan za DNK. Regrutovanje regulatora primarno posreduju dve proteinske površine, AF2 i AF1 koje se nalaze u E-domenu i A/B domenu. AF1 je regulisan faktorima rasta i njegova aktivnost zavisi od ćelijskog i promoterskog okruženja dok aktivnost AF2 u potpunosti zavisi od vezivanja liganda. Iako dva domena mogu delovati nezavisno, maksimalna aktivnost ER transkripcije postiže se sinergijskim interakcijama preko dva domena (Tzukerman, i dr., Mol. Endocrinology, 1994, 8:21-30). Iako se ER smatraju faktorima transkripcije, oni takođe mogu delovati preko ne-genskih mehanizama, što dokazuju brzi efekti ER u tkivima nakon primene E2 u vremenskom intervalu koji se smatra prebrzim za gensko delovanje. Još uvek nije jasno da li su receptori odgovorni za brzo delovanje estrogena isti jedarni ER ili različiti steroidni receptori povezani sa G-proteinom (Warner, i dr., Steroids 200671:91-95) ali je identifikovan sve veći broj puteva indukovanih od strane E2, npr. MAPK/ERK put i aktivacija endotelne sinteze azot oksida i PI3K/Akt put. Pored puta zavisnog od liganda, pokazalo se da ERa ima nezavisnu aktivnost liganda kroz AF-1 koji je povezan sa MAPK stimulacijom kroz signalizaciju faktora rasta, npr. insulinu sličan faktora rasta 1 (IGF-1) i epidermalni faktora rasta (EGF). Aktivnost AF-1 zavisi od fosforilacije Ser118, i primer unakrsne komunikacije između ER i signalizacije faktora rasta je fosforilacija Ser 118 od strane MAPK kao odgovor na faktore rasta kao što su IGF-1 i EGF (Kato, i dr., Science, 1995, 270:1491-1494).

[0003] Pokazano je da se veliki broj strukturno različitih jedinjenja vezuje za ER. Neka jedinjenja, kao što je endogeni ligand E2, deluju kao agonisti receptora, dok druga konkurentno inhibiraju vezivanje E2 i deluju kao antagonisti receptora. Ova jedinjenja se mogu podeliti u 2 klase u zavisnosti od svojih funkcionalnih efekata. Selektivni modulatori receptora estrogena (SERM), kao što je tamoksifen, imaju mogućnost da deluju i kao agonisti receptora i kao antagonisti, u zavisnosti od ćelijskog i promoterskog konteksta, kao i od ciljanog ER izoforma. Na primer, tamoksifen deluje kao antagonist u dojci, ali deluje kao delimični agonist u kostima, kardiovaskularnom sistemu i materici. Čini se da svi SERM deluju kao antagonisti AF2 i dobijaju svoje delimične karakteristike agonista kroz AF1. Druga grupa, čiji je primer fulvestrant, klasifikovana je kao potpuni antagonisti i sposobna je da blokira aktivnost estrogena potpunom inhibicijom domena AF1 i AF2 indukcijom jedinstvene promene konformacije u domenu vezivanja liganda (LBD) na vezivanje jedinjenja što rezultuje u potpunom prekidu interakcije između spirale 12 i ostatka LBD, blokirajući regrutaciju kofaktora (Wakeling, i dr., Cancer Res., 1991, 51:3867-3873; Pike, i dr., Structure, 2001, 9:145-153).

[0004] Intraćelijski nivoi ERa su regulisani na dole u prisustvu E2 putem ubikvitin/proteazom (Ub/26S) puta. Polibikvitinilacija ligandiranog ERa katalizuje najmanje tri enzima; ubikvitin aktivirajući enzim E1 ubikvitin se konjuguje pomoću E2 sa ostacima lizina preko izopeptidne veze pomoću E3 ubikvitin ligaze, i poliubikvitiniran ERa se zatim usmerava u proteazom za razgradnju. Iako su regulacija transkripcije zavisna od ER i degradacija ER posredovana proteazomom povezani (Lonard, i dr., Mol. Cell, 20005:939-948), transkripcija sama po sebi nije potrebna za degradaciju ERa, i sastavljanje kompleksa za inicijaciju transkripcije je dovoljno za ciljanje ERa za jedarnu proteazomalnu degradaciju. Veruje se da je ovaj proces razgradnje izazvan E2 neophodan za njegovu sposobnost brzog aktiviranja transkripcije kao odgovora na zahteve za ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i metabolizam (Stenoien, i dr., Mol. Cell Biol., 2001, 21:4404-4412). Fulvestrant je takođe klasifikovan kao selektivni regulator na dole receptora estrogena (SERD), podskupa antagonista koji takođe mogu indukovati brzu regulaciju ERa na dole kroz 26S proteazomalni put. Suprotno tome, SERM kao što je tamoksifen može povećati nivo Era, iako je efekat na transkripciju sličan onome koji se pogledati kod SERD.

[0005] Otprilike 70% raka dojke eksprimira ER i/ili receptore progesterona što implicira hormonsku zavisnost ovih tumorskih ćelija za rast. Smatra se da i drugi rakovi, poput raka jajnika i endometrijuma, za rast zavise od signalizacije ERa. Terapije za takve pacijente mogu inhibirati ER signalizaciju antagonizovanjem vezanja liganda na ER, npr. tamoksifen koji se koristi za tretman ranog i uznapredovalog ER-pozitivnog raka dojke pre i posle menopauze; antagonizovanje i regulisanje na dole ERA, npr. fulvestrant koji se koristi za tretman raka dojke kod žena, koji su napredovao uprkos terapiji inhibitorima tamoksifena ili aromataze; ili blokiranje sinteze estrogena, npr. inhibitori aromataze koji se koriste za tretman ranog i uznapredovalog ER-pozitivnog raka dojke. Iako su ove terapije imale izuzetno pozitivan uticaj na tretman raka dojke, značajan broj pacijenata čiji tumori eksprimiraju ER pokazuje de novo rezistenciju na postojeće ER terapije, ili tokom vremena razvijaju otpornost na te terapije. Nekoliko različitih mehanizama je opisano kako bi se objasnila rezistenciju na prvu terapiju taksiksifenom koja uglavnom uključuje prelazak sa tamoksifena koji deluje kao antagonist na agonist, bilo kroz niži afinitet određenih ko-faktora koji se vezuju za tamoksifen-Era kompleks, čija protivteža je prekomerno eksprimiranje ovih ko-faktora, ili formiranjem sekundarnih mesta koja olakšavaju interakciju tamoksifen-ERa kompleksa sa ko-faktorima koji se normalno ne vezuju za kompleks. Otpor bi, prema tome, mogao nastati kao rezultat porasta ćelija koje eksprimiraju specifične ko-faktore koji pokreću tamoksifen-ERa aktivnost. Takođe postoji mogućnost da drugi signalni putevi faktora rasta direktno aktiviraju ER receptor ili ko-aktivatore kako bi pokrenuli ćelijsku proliferaciju nezavisno od signalizacije liganda.

[0006] U novije vreme, mutacije u ESR1 identifikovane su kao mogući mehanizam rezistencije u metastatskim ER-pozitivnim uzorcima tumora dobijenih od pacijenta i ksenograft modelima (PDX) dobijenim od pacijenta, na frekvencijama koje variraju od 17-25%. Ove mutacije su pretežno, ali ne isključivo, u domenu koji vezuje ligande, i vode do mutiranih funkcionalnih proteina; primeri promena aminokiselina uključuju Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn i Asp538Gly, i promene u aminokiselinama 537 i 538 čine većinu opisanih promena. Ove mutacije prethodno su bile neprimećene u genomima iz primarnih uzoraka dojke koji su okarakterisani u Cancer Genome Atlas bazi podataka. Od 390 primarnih uzoraka raka dojke pozitivnih na eksprimiranje ER, u ESR1 nije primećena nijedna mutacija (Cancer Genome Atlas Network, 2012 Nature 490: 61-70).

Smatra se da su mutacije domena koji vezuje ligand razvijene kao otpornost na endokrine terapije inhibitora aromataze, pošto ovi mutirani receptori pokazuju baznu transkripcijsku aktivnost u odsustvu estradiola. Kristalna struktura ER, mutirana na aminokiselinama 537 i 538, pokazala je da oba mutanata pogoduju agonističkoj konformaciji ER pomeranjem položaja spirale 12 kako bi omogućili regrutaciju ko-aktivatora i na taj način oponašajući aktivirani divlji tip ER agonista. Objavljeni podaci su pokazali da se endokrine terapije, kao što su tamoksifen i fulvestrant, još uvek mogu vezati za mutant ER i do određene mere inhibirati transkripcijsku aktivaciju, i da je fulvestrant u stanju da razgradi Try537Ser, ali da će biti potrebne veće doze za potpunu inhibiciju receptora (Toy i dr., Nat. Genetics 2013, 45: 1439-1445; Robinson i dr., Nat. Genetics 2013, 45: 144601451; Li, S. i dr. Cell Rep.4, 1116-1130 (2013). Stoga je izgledno da će jedinjenje Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli (kao što je opisano u daljem tekstu) biti sposobno da reguliše na dole i antagonizuje mutantni ER, iako u ovoj fazi nije poznato da li su mutacije ESR1 povezane sa izmenjenim kliničkim ishodom.

[0007] Bez obzira na mehanizam rezistencije ili kombinaciju mehanizama, mnogi se još uvek oslanjaju na ER-zavisne aktivnosti i uklanjanje receptora preko SERD mehanizma nudi najbolji način uklanjanja ERα receptora iz ćelije. Fulvestrant je trenutno jedini SERD odobren za kliničku upotrebu, ali uprkos svojim mehaničkim svojstvima, farmakološka svojstva leka su ograničila njegovu efikasnost zbog trenutnog ograničenja mesečne doze od 500 mg što rezultuje sa manje od 50% obrta receptora u uzorcima pacijenta u poređenju sa potpunom redukcijom receptora u in vitro eksperimentima ćelijskih linija dojke (Wardell, i dr., Biochem. Pharm., 2011, 82:122-130). Otuda postoji potreba za novim agensima za ciljanje ER koja poseduju tražena farmaceutska svojstva i SERD mehanizam kako bi se postigla veća korist u okolnostima rane, metastatske i stečene rezistencije.

[0008] US2016/175289 A1 obelodanjuje određene tetrahidro-1H-pirido[3,4-b] indole kao modulatore receptora estrogena.

[0009] Otkriveno je da jedinjenja iz ovog opisa poseduju moćnu anti-tumorsku aktivnost, korisna su u inhibiranju nekontrolisane ćelijske proliferacije koja proizilazi iz maligne bolesti. Jedinjenja iz ovog opisa primenjuju anti-tumorski efekat, minimalno, delujući kao SERD. Na primer, jedinjenja iz ovog opisa mogu da pokazuju anti-tumorsku aktivnost preko sposobnosti da regulišu receptor estrogena u velikom broju različitih ćelijskih linija raka dojke, na primer protiv MCF-7, CAMA-1, BT474 i/ili MDA-MB-134 ćelijskih linija raka dojke. Za takva jedinjenja može se očekivati da su pogodnija kao terapeutski agensi, posebno za tretman raka.

[0010] Jedinjenja iz ovog opisa mogu takođe da pokazuju povoljna fizička svojstva (na primer, nižu lipofilnost, veću rastvorljivost u vodi, veću propusnost, niže vezivanje proteina u plazmi i/ili veću hemijsku stabilnost) i/ili povoljne profile toksičnosti (na primer, smanjena aktivnost na hERG) i/ili povoljne metaboličke ili farmakokinetičke profile, u poređenju sa drugim poznatim SERD. Ovakva jedinjenja mogu biti posebno pogodna kao terapeutski agensi, posebno za tretman raka.

[0011] Ovde su opisana jedinjenja Formule (I):

gde:

A je CR<11>ili N;

G je CR<12>ili N;

D je CR<13>ili N;

E je CR<14>ili N;

J je CR<19>ili N;

Q je O, NH ili NMe;

R<1>je CH2F, CHF2ili CF3;

R<2>je H, Me, CH2F, CHF2ili CF3;

R<3>je H ili Me;

R<4>je C1-3alkil, CH2F, CHF2, CF3, CH2CH=CH2, ciklopropil ili ciklobutil;

R<5>je H, Me, CH2F, CHF2, CF3, CN, CH2CN, CH2OMe, CH2OH, COOH ili CH2SO2Me;

R<6>je H, Me, F, CH2F, CHF2, CF3, CN, CH2CN, CH2OMe, CH2OH, COOH ili SO2Me;

R<7>je H, Me ili F;

R<8>je H, Me ili F; ili

R<7>i R<8>uzeti zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju ciklopropil prsten, ciklobutil prsten, ili oksetan prsten;

R<9>je H, Me, CH2OH, CH2OMe ili F;

R<10>je H, Me, CH2OH, CH2OMe ili F;

R<11>je H, F, Cl, CN, C1-3alkil ili O-C1-3alkil (gde su navedene C1-3alkil grupe opciono supstituisane sa daljom grupom odabranom od OMe, OH, F i CN); R<12>je H, F, Cl, CN, Me, OMe ili CHF2;

R<13>je H, F, Cl, CN, Me ili OMe;

R<14>je H, F, Cl, CN, Me ili OMe;

R<15>je H, F, Cl ili Me;

R<17>je H, F, Cl ili Me;

R<18>je H, F, Cl ili Me;

R<19>je H ili F; i

R<20>je H ili Me;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0012] Prema jednom aspektu opisa dato je jedinjenje Formule (I) koje je (R)-3-((1R,3R)-1-(5-Fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina,

ili njena farmaceutski prihvatljiva so.

[0013] Kako bi se otklonila sumnja, u svim otelotvorenjima i aspektima opisa koji se odnose na jedinjenje Formule (I) ovde, jedinjenje Formule (I) je (R)-3-((1R,3R)-1-(5-Fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina. Razumeće se da su dodatni ovde opisani primeri jedinjenja Formule (I) referentni primeri.

[0014] Ovaj opis takođe opisuje farmaceutske sastave koji sadrže jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0015] Ovaj opis takođe opisuje jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu kao lek.

[0016] Ovaj opis takođe opisuje jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu raka.

[0017] Ovaj opis takođe opisuje kombinacije jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa drugim anti-tumorskim agensom, za upotrebu u tretmanu raka.

[0018] Jedinjenje Formule (I) ima tri hiralna centra i biće prepoznato da jedinjenje Formule (I) može biti pripremljeno, izolovano i/ili isporučeno sa ili bez prisustva, pored njega, još jednog ili više od drugi mogući enantiomernih i/ili dijastereomernih izomera jedinjenja Formule (I), u bilo kojim relativnim proporcijama. Priprema enantio-obogaćenih/enantiočistih i/ili dijastereo-obogaćenih/dijastereo-čistih jedinjenja može se izvesti standardnim tehnikama organske hemije koje su dobro poznate u struci, na primer sintezom iz enantioobogaćenih ili enantio-čistih polaznih materijala, upotrebom odgovarajućeg enantioobogaćenog ili enantio-čistog katalizatora tokom sinteze i/ili razdvajanjem racemične ili delimično obogaćene smeše stereoizomera, na primer hiralnom hromatografijom.

[0019] Za upotrebu u farmaceutskom kontekstu može biti poželjno pružiti jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, bez velike količine ostalih stereoizomernih oblika.

[0020] Shodno tome, u jednom otelotvorenju je pružen sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u smeši sa dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90%.

[0021] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0022] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0023] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0024] U narednom otelotvorenju pružen je sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) od> 90%.

[0025] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0026] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0027] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0028] U narednom otelotvorenju pružen je sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) od> 90% i dijastereomernim viškom (%de) od> 90%.

[0029] U daljim otelotvorenjima gore navedenih sastava, %ee I %de mogu uzeti bilo koju kombinaciju vrednosti kako je navedeno u nastavku:

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 80%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 90%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 95%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≥ 98%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 99%, i %de je ≥ 99%.

[0030] U narednom otelotvorenju je pružen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0031] U jednom otelotvorenju je pružen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) od ≥ 90%.

1

[0032] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0033] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0034] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0035] U jednom otelotvorenju je pružen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa dijastereomernim viškom (%de) ≥ 90%.

[0036] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0037] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0038] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0039] U jednom otelotvorenju je pružen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) od ≥ 90% i dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90%.

[0040] U daljim otelotvorenjima gore navedenog farmaceutskog preparata, %ee i %de mogu uzeti bilo koju kombinaciju vrednosti kao što je navedeno u nastavku:

• %ee je ≥ 95%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≥ 98%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 99%, i %de je ≥ 99%.

[0041] Jedinjenje Formule (I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se pripremiti, koristiti ili isporučiti u amorfnom obliku, kristalnom obliku ili polukristalnom obliku, i jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti sposobni da se formiraju u više od jednog kristalnog/polimorfnog oblika, uključujući hidrirane (npr. hemihidrat, monohidrat, dihidrat, trihidrat ili drugu stehiometriju hidrata) i/ili solvatirane oblike. Treba shvatiti da predmetni opis obuhvata sve takve čvrste oblike jedinjenja Formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0042] U daljim otelotvorenjima pruženo je jedinjenje Formule (I), koje se može dobiti postupcima opisanim u odeljku „Primeri“ u daljem tekstu.

[0043] Predmetni opis je namenjena da obuhvati sve izotope atoma koji se javljaju u ovim jedinjenjima. Za izotope se podrazumeva da uključuju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različit maseni broj. Na primer, izotopi vodonika uključuju tritijum i deuterijum. Izotopi ugljenika uključuju<13>C i<14>C. Izotopi azota uključuju<15>N.

[0044] Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) je, na primer, kisela adiciona so. Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I), može biti, na primer, kisela adiciona so jedinjenja Formule (I), na primer kisela adiciona so sa neorganskom ili organskom kiselinom, kao što je sirćetna kiselina, adipinska kiselina, benzen sulfonska kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, D,L-mlečna kiselina, etan disulfonska kiselina, etan sulfonska kiselina, fumarna kiselina, hlorovodonična kiselina, L-vinska kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, metan sulfonska kiselina, napadisilna kiselina, fosforna kiselina, saharin, sukcinska kiselina, sumporna kiselina, p-toluensulfonska kiselina, toluen sulfonska kiselina ili trifluorosirćetna kiselina.

[0045] Naredna pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) je, na primer, so koja se formira u ljudskom ili životinjskom telu posle primene jedinjenja Formule (I) navedenom ljudskom ili životinjskom telu.

[0046] Jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu se dobiti u obliku ko-kristalnog čvrstog oblika. Treba razumeti da farmaceutski prihvatljiv ko-kristal jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, čine aspekt ovog opisa.

[0047] In vivo efekti jedinjenja Formule (I), mogu delom da budu ispoljeni od strane jednog ili više metabolita koji se formiraju u ljudskom ili životinjskom telu nakon primene jedinjenja Formule (I).

[0048] Ovde je opisan postupak za dobijanje jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Pogodan postupak ilustruju sledeće reprezentativne varijante procesa u kojima, ako nije drugačije navedeno, A, D, E, G, x i R<1>do R<10>imaju bilo koje od ranije definisanih značenja. Potrebni početni materijali mogu se dobiti standardnim postupcima organske hemije. Priprema takvih polaznih materijala je opisana zajedno sa narednim reprezentativnim varijantama procesa, i u pratećim primerima. Alternativno, potrebni polazni materijali mogu se dobiti analognim postupcima onima koji su ilustrovani, i koji su unutar uobičajene veštine organskog hemičara.

[0049] Jedinjenje Formule (I) može da se dobije, na primer:

a) Reakcijom jedinjenja Formule (II) sa jedinjenjem Formule (III) pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Pictet-Spengler-ove reakcije (kao što je u prisustvu kiseline (kao što je sirćetna kiselina) i u pogodnom rastvaraču (na primer toluen) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 80-100°C), sa ili bez zaštitne grupe (P) na azotu, koja se može ukloniti pod uslovima poznatim u struci.

b) Gde Q je O, NH ili NMe, eterifikacijom ili aminacijom pogodnog aril halogenida Formule (IV), gde je L na primer halogen (kao što je Br) ili trifluorometansulfonil (triflat) grupa ili borova kiselina ili boronat estar, sa alkoholom ili aminom Formule (V) korišćenjem pogodnog metalnog katalizatora (na primer RockPhos predkatalizator treće generacije ili BrettPhos pred-katalizator treće generacije) u pogodnom rastvaraču (na primer toluenu, THF ili DME) u prisustvu pogodne baze (na primer cezijum karbonat ili kalijum karbonat), i na pogodnoj temperaturi (kao što je

1

90-120°C) sa ili bez zaštitne grupe (P) na azotu, koja se može ukloniti pod uslovima poznatim u struci.

c) Gde Q je O, alkilacijom pogodnog fenola ili hidroksil hetaroaril jedinjenja Formule (VI) alkoholom Formule (V) putem Mitsunobu reakcije upotrebom odgovarajućih reagensa (kao što su trifenilfosfin i diizopropil (E)-dijazen-1,2-dikarboksilat) u pogodnom rastvaraču (poput DCM) sa ili bez zaštitne grupe (P) na azotu, koja se može ukloniti pod uslovima poznatim u struci.

d) Alkilacijom pogodnog jedinjenja Formule (VII), gde je LG odlazeća grupa poznata u struci, na primer halogenid (kao što je Br), trifluorometansulfonat (triflat) ili metansulfonat (mezilat), sa aminom Formule (VIII) u pogodnom rastvaraču (na primer acetonitrilu) u prisustvu pogodne baze (na primer kalijum karbonata) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 80-90°C), sa ili bez zaštitne grupe (P) na azotu, koja se može ukloniti pod uslovima poznatim u struci.

[0050] Jedinjenja Formule (II) mogu se dobiti, na primer:

a) Reakcijom jedinjenja Formule (IX) sa aldehidom Formule (X), u pogodnom rastvaraču (na primer THF) u prisustvu pogodnog redukcionog agensa (kao što je natrijum triacetoksiborohidrid) i na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 20-30°C);

b) (i) reakcijom jedinjenja Formule (IX) sa kiselinom Formule (XI) pod standardnim uslovima formiranja amidne veze (na primer u prisustvu reagensa za spajanje amida (kao što je HATU) i odgovarajuće baze (kao što je kao trietilamin) u pogodnom rastvaraču (kao što je DMF)), nakon čega sledi (ii) redukcija rezultujuće amidne veze korišćenjem odgovarajućeg redukcionog agensa (poput borana) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF), na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 60-70°C); c) reakcijom jedinjenja Formule (IX) sa jedinjenjem Formule (XII), gde je LG pogodna odlazeća grupa (na primer atom halogena (kao što je brom ili hloro) ili trifluorometansulfonat), u prisustvu pogodne baze (kao što je diizopropiletilamin) u pogodnom rastvaraču (na primer DCM ili dioksan) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 20-85°C).

[0051] Jedinjenja Formule (III) mogu se pripremiti reakcijom jedinjenja Formule (XIII) sa alkoholom Formule (V) pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Mitsunobu reakcije (kao što je u prisustvu azodikarboksilatnog reagensa (kao što je DEAD) i trifenilfosfina, i u pogodnom rastvaraču (kao što je THF) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 20-30°C).

[0052] Jedinjenja Formule (IV) mogu se dobiti reakcijom jedinjenja Formule (II) sa jedinjenjem Formule (XIV), gde je L pogodna funkcionalna grupa poput halogenida (na primer bromida ili hlorida), triflata, borne kiseline ili boronski estar, pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Pictet-Spengler-ove reakcije, kao što je u prisustvu kiseline (poput

1

sirćetne kiseline) i u pogodnom rastvaraču (na primer toluenu) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 80- 100°C).

[0053] Jedinjenja Formule (VI) mogu se dobiti reakcijom jedinjenja Formule (II) sa jedinjenjem Formule (XV), pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Pictet-Spengler-ove reakcije (kao što je u prisustvu kiseline (kao što je sirćetna kiselina) i u pogodnom rastvaraču (na primer toluenu) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 80-100°C). U određenim aspektima X je jednak OH (opciono sa zaštitnom grupom) ili X je jednako boronskoj kiselini ili boronskom estru koji se mogu pretvoriti u OH korišćenjem pogodnog oksidansa (poput vodonik-peroksida) u prisustvu pogodne baze (poput natrijum-hidroksida) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF).

[0054] Jedinjenja Formule (VII) mogu se pripremiti reakcijom jedinjenja Formule (VI) korišćenjem standardnih manipulacija funkcionalnom grupom, na primer, Mitsunobu reakcijom koristeći odgovarajuće reagense (kao što su trifenilfosfin i diizopropil (E)-dijazen-1,2-dikarboksilat) sa 2-haloetanolom (kao što je 2-bromoetan-1-ol) u pogodnom rastvaraču (kao što je DCM).

[0055] Alternativno, jedinjenja Formule (VII) mogu se dobiti reakcijom jedinjenja Formule (IV) korišćenjem standardnih manipulacija funkcionalnom grupom, na primer, eterifikacijom, gde je L na primer halogen (kao što je Br) ili trifluorometansulfonil (triflat) grupa ili estar boronske kiseline ili boronske estra, sa odgovarajućim diolom (sa opcionom mono-zaštitom) korišćenjem pogodnog metalnog katalizatora (na primer, RockPhos pred-katalizator treće

1

generacije) u pogodnom rastvaraču (na primer toluenu ili DME) u prisustvu pogodne baze (na primer cezijum karbonat). Nakon toga (uz uklanjanje zaštite ako je potrebno) alkohol se može pretvoriti u odgovarajuću odlazeću grupu (na primer halogenid (kao što je Br), trifluorometansulfonat (triflat) ili metansulfonat (mezilat)) u standardnim uslovima.

[0056] Treba shvatiti da su moguće i druge permutacije koraka procesa u gore opisanim varijantama procesa.

[0057] Kada je potrebna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I), ona se može dobiti, na primer, reakcijom navedenog jedinjenja sa odgovarajućom kiselinom ili odgovarajućom bazom.

[0058] Takođe će se primetiti da će u nekim reakcijama koje su navedene ranije biti neophodno ili poželjno zaštititi bilo koje osetljive funkcionalnosti u jedinjenjima. Primeri u kojima je zaštita potrebna ili poželjna, i pogodni postupci zaštite su poznati stručnjacima u oblasti. Konvencionalne zaštitne grupe mogu se koristiti u skladu sa standardnom praksom (za ilustraciju pogledati T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991). Stoga, ako reaktanti uključuju grupe kao što su amino, karboksi ili hidroksi, možda bi bilo poželjno zaštititi grupu u nekim od ovde navedenih reakcija.

[0059] Pogodna zaštitna grupa za amino ili alkilamino grupu je, na primer, acil grupa, na primer alkanoil grupa kao što je acetil, alkoksikarbonil grupa, na primer metoksikarbonil, etoksikarbonil ili t-butoksikarbonilna grupa, arilmetoksikarbonilna grupa, na primer benziloksikarbonilna grupa, ili aroilna grupa, na primer benzoil. Uslovi uklanjanja zaštite za gore navedene zaštitne grupe nužno variraju u zavisnosti od izbora zaštitne grupe. Tako, na primer, acil grupa kao što je alkanoil ili alkoksikarbonil grupa ili aroil grupa mogu biti uklonjene, na primer, hidrolizom sa pogodnom bazom, kao što je hidroksid alkalnog metala, na primer litijum ili natrijum hidroksid. Alternativno alkoksikarbonilna grupa poput t-

1

butoksikarbonilne grupe može biti uklonjena, na primer, tretiranjem pogodnom kiselinom kao što je hlorovodonična, sumporna, mravlja, fosforna ili trifluorosirćetna kiselina, i arilmetoksikarbonilna grupa poput benziloksikarbonilne grupe može se ukloniti, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku, ili tretmanom Lewisove kiseline, kao što je bor tris(trifluoroacetat). Pogodna alternativna zaštitna grupa za primarnu amino grupu je, na primer, ftaloil grupa, koja se može ukloniti tretmanom alkilaminom, na primer dimetilaminopropilaminom ili hidrazinom.

[0060] Pogodna zaštitna grupa za hidroksi grupu je, na primer, acil grupa, na primer alkanoil grupa kao što je acetil, aroil grupa, na primer benzoil, arilmetil grupa, na primer benzil, ili trialkil ili diarilalkil silan, kao što su TBDMS ili TBDPS. Uslovi uklanjanja zaštite za gore navedene zaštitne grupe će nužno varirati u zavisnosti od izbora zaštitne grupe. Tako, na primer, acil grupa kao što je alkanoil ili aroil grupa može biti uklonjena, na primer, hidrolizom sa pogodnom bazom, kao što je hidroksid alkalnog metala, na primer litijum ili natrijum hidroksid. Alternativno, arilmetil grupa kao što je benzil grupa može biti uklonjena, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku.

[0061] Pogodna zaštitna grupa za karboksi grupu je, na primer, estarifikaciona grupa, na primer metil ili etil grupa koja se može ukloniti, na primer, hidrolizom sa bazom kao što je natrijum hidroksid, ili na primer t-butil grupa koja se može ukloniti, na primer, tretiranjem sa kiselinom, kao što je trifluorosirćetna kiselina, ili na primer benzil grupa koja se može ukloniti, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora, kao što je paladijum-na-ugljeniku.

[0062] Zaštitne grupe mogu se ukloniti u bilo kom pogodnom stadijumu sinteze koristeći konvencionalne tehnike dobro poznate u hemijskoj struci.

Biološka ispitivanja

[0063] Naredna ispitivanja su korišćena za merenje efekata jedinjenja ovog opisa. Kako bi se izbegle sumnje, jedinjenje Formule (I), (R)-3-((1R,3R)-1-(5-Fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina, ovde je Primer 127, i ostali primeri su referentni primeri dati kao ilustracija kvalifikovanom čitaocu.

ERα test vezivanja

1

[0064] Sposobnost jedinjenja da se vezuje za izolovani domen vezivanja alfa liganda receptora estrogena (ER alfa - LBD (GST)) procenjena je u testovima nadmetanja korišćenjem LanthaScreen Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer (TR-FRET) krajnje tačke detektovanja. Za LanthaScreen TR-FRET krajnju tačku, pogodni fluorofor (Fluormone ES2, ThermoFisher, šifra proizvoda P2645) i rekombinantni ljudski domen vezivanja alfa liganda receptora estrogena, ostaci 307-554 (eksprimirani i prečišćeni interno) korišćeni su za merenje vezivanja jedinjenja. Princip ispitivanja je da se ER alfa-LBD (GST) dodaje fluorescentnom ligandu kako bi se formirao receptor/fluorofor kompleks. Terbijum-obeleženo anti-GST antitelo (šifra proizvoda PV3551) koristi se za indirektno obeležavanje receptora vezivanjem na njegovu GST oznaku, i kompetitivno vezivanje detektuje se sposobnošću test jedinjenja da pomera fluorescentni ligand, što rezultuje gubitkom TR- FRET signala između Tb-anti-GST antitela i tragača. Ispitivanje je izvedeno na naredni način, gde su sva dodavanja reagensa izvršena korišćenjem mikrofluidne radne stanice Beckman Coulter BioRAPTR FRD:

1. Akustično doziranje 120 nL test jedinjenja u crne niskozapreminske 384-komorične ploče za ispitivanje.

2. Priprema 1x ER alfa -LBD/Tb-antiGST Ab u ES2 skrining puferu i inkubiranje tokom 15 minuta.

3. Doziranje 6 µL 1x AR-LBD/Tb-anti-GST Ab reagensa u svaku komoricu ploče za ispitivanje, nakon čega sledi 6 µL fluorofornog reagensa u svaku komoricu ploče za ispitivanje.

4. Pokrivanje ploču za ispitivanje kako bi reagensi zaštitili od svetlosti i isparavanja, i inkubiranje na sobnoj temperaturi tokom 4 sata.

5. Pobuđivanje na 337 nm i merenje fluorescentnog emisionog signala svake komorice na 490 nm i 520 nm koristeći BMG PheraSTAR.

[0065] Jedinjenja su dozirana direktno iz mikroploče koja izvor jedinjenja, koja sadrži serijski razblaženo jedinjenje (4 komorice koje sadrže 10 mM, 0,1 mM, 1 µM i 10 nM konačnog jedinjenja) na mikroploču za ispitivanje pomoću Labcyte Echo 550. Echo 550 je tečni agens koji koristi akustičku tehnologiju za izvođenje direktnih prenosa rastvora jedinjenja DMSO sa mikroploče na mikroploču, i sistem se može programirati tako da prenosi više manjih zapremina nL jedinjenja iz različitih komorica izvorne ploče kako bi se dobilo željeno serijsko razblaživanje jedinjenja u testu koji je tada ponovo napunjen kako bi se normalizovala koncentracija DMSO u rasponu razblaženja.

1

[0066] Ukupno 120 nL jedinjenja plus DMSO je dodato u svaku komoricu i jedinjenja su testirana u formatu odgovora koncentracije sa 12 tačaka preko konačnomg raspona koncentracije od 10, 2,917, 1,042, 0,2083, 0,1, 0,0292, 0,0104, 0,002083, 0,001, 0,0002917, 0,0001042, i 0,00001 µM, respektivno. TR-FRET podaci odgovora na dozu dobijeni sa svakim jedinjenjem su izvedeni u odgovarajući softverski paket (kao što su Origin ili Genedata) za obavljanje analize podešavanja krive. Konkurentno vezanje ER alfa je izraženo kao IC50vrednost. Ovo je utvrđeno izračunavanjem koncentracije jedinjenja koja je bila potrebna kako bi se dobilo 50% smanjenja vezivanja tragača za ER alfa-LBD.

Test regulisanja na dole MCF-7 ER

[0067] Sposobnost jedinjenja da reguliše na dole brojeve receptora estrogena (ER) procenjena je u imuno-fluorescentnom testu zasnovanom na ćelijama koristeći MCF-7 liniju ćelija dojke ljudskog duktalnog raka. MCF-7 ćelije su oživljene direktno iz krio-bočice (približno 5 × 10<6>ćelija u medijumu za analizu (Dulbecco-v modifikovan Eagle-ov medijum (DMEM); Sigma D5921) koji sadrži 2 mM L-glutamina i 5% (v/v) fetalnog telećeg seruma sa ugljenikom/dekstranom. Ćelije su jednom ubrizgane pomoću sterilne 18G x 1,5 inča (1,2 × 40 mm) široke igle i gustina ćelija je izmerena korišćenjem Coulter Counter (Beckman). Ćelije su dalje razblažene u medijumu za ispitivanje do gustine 3,75 × 10<4>ćelija po mL i 40 µL po komorici dodato je na crne ploče 384-komorične ploče sa providnim dnom, koje su tretirane kulturom tkiva (Costar, br.3712) koristeći Thermo Scientific Matrix WellMate ili Thermo Multidrop. Posle sejanja ćelija, ploče su inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO2(Liconic inkubator karusela). Podaci testova generisani su korišćenjem LabCyte Echomodel 555 reformatora jedinjenja, koji je deo automatizovane radne stanice (Integrated Echo 2 radna stanica). Osnovni rastvori jedinjenja (10 mM) ispitivanih jedinjenja korišćeni su za generisanje384-komorične ploče za doziranje jedinjenja (Labcyte P-05525-CV1).40 µL svakog od 10 mM matičnih rastvora jedinjenja se rasprši u komoricu prvog kvadranta, i zatim se 1:100 stepenasta serijska razblaženja u DMSO izvrše pomoću Hydra II (MATRIX UK) tečne jedinice kako bi se dobilo 40 µL razblaženog jedinjenja u komorice 2 (0,1 mM), 3 (1 µM) i 4 (0,01 µM), respektivno, u kvadrantu.40 µL DMSO dodatog u komorice u redu P na izvornoj ploči omogućilo je normalizaciju DMSO u čitavom rasponu doza. Za doziranje kontrolnih komorica dodato je 40 µL DMSO u red O1, i 40 µL 100 µM fulvestranta u DMSO je dodato u red O3 na ploči izvornog jedinjenja.

2

[0068] Echo koristi akustičku tehnologiju za izvođenje direktnih prenosa DMSO jedinjenja sa mikroploče na test ploče. Sistem se može programirati tako da čak i male zapremine od 2,5 nL iz više koraka prenese između mikroploča, i na taj način generiše serijsko razblaživanje jedinjenja na ploči za ispitivanje koja se zatim ponovo puni kako bi se normalizovala koncentracija DMSO kroz raspon razblaženja. Jedinjenja su raspoređena na ploče sa ćelijama sa pripremljenom pločom sa izvornim jedinjenjem, koja je pripremljena kao iznad, stvarajući duplikat od 12 tačaka od 3 µM do 3 pM sa 3-ostrukim razblaživanjem, i jednim konačnim 10-ostrukim razblaženjem pomoću Echo 2 integrisane radne stanice. Maksimalni kontrolni otvori za signal su dozirani sa DMSO kako bi se dobila konačna koncentracija od 0,3%, i minimalni kontrolni otvori za doziranje su dozirani sa fulvestrantom kako bi se u skladu sa tim dobila konačna koncentracija od 100 nM. Ploče su dalje inkubirane 18-22 sata na 37°C, 5% CO2, i zatim su fiksirane dodatkom 20 µL 11,1% (v/v) rastvora formaldehida (u fiziološkom rastvoru sa fosfatom (PBS)) dajući krajnju koncentraciju formaldehida od 3,7% (v/v). Ćelije su fiksirane na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta pre nego što su dva puta isprane sa 250 µL PBS/Proclin (PBS sa biocidnim konzervansom) koristeći BioTek mašinu za pranje posuda, zatim je dodato 40 µL PBS/Proclin u sve komorice, i ploče su čuvane na 4°C. Gore opisan postupak fiksiranja izvedena je na Echo 2 integrisanoj radnoj stanici.

Imuno-bojenje je izvedeno pomoću AutoElisa automatizovane radne stanice. PBS/Proclin je aspiriran iz svih komorica i ćelije su prožimane sa 40 µL PBS koji je sadržao 0,5% Tween™ 20 (v/v) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta u 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween 20 sa Proclinom (PBST sa Biocide konzervansom), i zatim je dodato 20 µL ERa (SP1) zečjeg monoklonskog antitelom (Thermofisher) 1:1000 u PBS/Tween™/3% (w/v) goveđem serumskom albuminu. Ploče su inkubirane preko noći na 4°C (Liconic inkubator karusela) i zatim tri puta isprane sa 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween™ 20 sa Proclinom (PBST). Ploče su zatim inkubirane sa 20 µL/komorica kozjeg anti-zečjeg IgG AlexaFluor 594 ili kozjeg anti-zečjeg AlexaFluor 488 antitela (Molecular Probes) sa Hoechst pri 1:5000 u PBS/Tween™/3% (w/v) goveđeg serumskog albumina u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane tri puta sa 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween™ 20 sa Proclinom (PBST sa Biocide konzervansom). U svaku komoricu je dodato 20 µL PBS, i ploče su prekrivene crnim zatvaračem i čuvane na 4°C pre nego što su očitane. Ploče su očitane pomoću Cellomics Arrayscan očitavanja pri fluorescenciji od 594 nm (vremenska tačka od 24 sata) ili 488 nm (5 sati vremenske tačke) za merenje nivoa ERa receptora u svakoj komorici. Srednji ukupni intenzitet je normalizovan za broj ćelija, dajući ukupan intenzitet po ćeliji. Podaci su izvedeni u odgovarajući softverski paket (kao što je Origin) za analizu uklapanja krive. Regulacija na dole ERa receptora izražena je kao IC50vrednost, i određena je izračunavanjem koncentracije jedinjenja koja je bila potrebna kako bi se dobilo 50% smanjenje prosečnog signala maksimalnog ukupnog intenziteta.

[0069] Generisani su podaci prikazani u Tabeli A (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili proseka dva ili više eksperimenata):

Tabela A

2

<1>Jedinjenja testirana u testu regulisanja ER na dole pokazuju vrednosti regulisanja na dole (> 90%) u testu, osim ako nije drugačije navedeno, u kom slučaju je % regulisanja na dole prikazan u zagradama. (NT = nije testirano).

Western blotting test

[0070] Sposobnost jedinjenja da regulišu receptor estrogena (ER) procenjena je Western blotting-om primenom ćelijskih linija ljudskog raka dojke (MCF-7 i CAMA-1). Ćelije su podeljene u 12-komorične ploče sa tretirane kulturom pri 0,5x10<6>/komorica u RPMI bez fenol crvene, koji sadrži 2 mM L-glutamina i 5% (v/v) fetalnog telećeg seruma tretiranog ugljenikom (F6765, Sigma). Ćelije su inkubirane sa jedinjenjima (100 nM) ili sa nosačem (0,1% DMSO) tokom 48 sati na 37°C, 5% CO2pre pranja jednom sa PBS i liziranja sa 80 µl pufera za lizu (25 mM Tris/HCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 50 mM NaF, 2 mM natrijum ortovanadata, 0,27 M saharoze, 10 mM β-glicerofosfata, 5 mM natrijum pirofosfata, 0,5% TritonX-100, pH 6,8) na ledu.

[0071] Ćelije su strugane, sonikovane i centrifugirane pre obavljanja ispitivanja proteina (DC Bio-Rad Protein komplet, 500-0116) i pravljenja uzoraka do koncentracije proteina od 1-2 mg/mL u puferu za liziranje koji sadrži 1xLDS pufera za uzorke (NP0007, Invitrogen) i 1x NuPAGE agens za redukovanje uzorka (NP0009, Invitrogen). Uzorci su proključali tokom 10 min na 95°C, i zatim zamrznuti na -20°C dok nisu spremni za upotrebu.

2

[0072] 10-20 pg proteina je naneseno na 26-komorične Criterion gelove (BioRad 345-0034). Gelovi su obrađeni na 125 V tokom 1 sata i 25 minuta u puferu (24 mM Tris Base Sigma, 192 mM Glicin, 3,5 mM SDS, obrađeno u destilovanoj vodi). Zatim su gelovi preneseni na 30 V tokom 2 sata u puferu za prenos (25 mM Tris, 192 mM glicin, 20% (v/v) metanol, pH 8,3, obrađeno u destilovanoj vodi) na nitroceluloznu membranu. Blot je obojena s Ponceau S (P7170, Sigma) i isečena u skladu sa odgovarajućim markerima molekulske težine.

[0073] Membrane su blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u 5% Marvel (w/v) u fiziološkom rastvoru sa fosfatom koji sadrži 0,05% Tween™ 20 (PBS/Tween). Blotovi su zatim inkubirani sa anti-ERa (SP1) zečjim monoklonskim antitelom (Thermofisher) razblaženim 1:1000 na 4°C tokom noći (uz lagano mućkanje) nakon čega je usledilo nekoliko ispiranja sa PBS/Tween. Sekundarno anti-zečje HRP antitelo (7074, CST) razblaženo 1:2000 inkubira se tokom 2 sata na sobnoj temperaturi (uz lagano mućkanje) nakon čega sledi nekoliko ispiranja sa PBS/Tween. Sva antitela su obrađena u 5% Marvel (w/v) u PBS/Tween.

[0074] Imunoblotovi su razvijeni korišćenjem Pierce WestDura hemiluminescentnih reagensa (Thermo Scientific 34076) i razvijeni/kvantifikovani na G-kutiji koristeći Syngene softver. Regulacija na dole ERa receptora je normalizovana na kontrolu nosača (0% regulacije na dole) i 100 nM fulvestrant kontrola (100% regulacije na dole) se odvija unutar istog gela.

[0075] Tabela B prikazuje podatke dobijene za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela B

2

Test ljudskih hepatocita

[0076] Metabolička stabilnost jedinjenja u ljudskim hepatocitima je procenjena korišćenjem narednog protokola:

1. Priprema 10 mM osnovnih rastvora jedinjenja i kontrolnih jedinjenja u odgovarajućem rastvaraču (DMSO). Inkubacioni medijum (L-15Medium) je postavljen u vodenu kadu na 37°C i ostavljen da se zagreva najmanje 15 minuta pre upotrebe.

2. Dodato je 80 µL acetonitrila u svaki otvor 96-komorične duboke ploče (ploča za gašenje).

3. U novoj 96-komoričnoj ploči razblaženo 10 mM test jedinjenja i kontrolnih jedinjenja do 100 µM kombinujući 198 µL acetonitrila i 2 µL 10 mM osnovnog rastvora.

4. Izvađena je bočica krio konzerviranih (na niže od -150°C) ljudskih hepatocita (LiverPool 10 donorski ljudski hepatociti dobijeni od Celsis IVT. Chicago, IL (proizvod br. S01205)) iz skladišta, osiguravajući da bočice ostanu na kriogenim temperaturama dok ne nastupi proces otapanja. Što je brže moguće, ćelije su odmrznute tako što se bočica stavlja u vodenu kadu na 37°C i bočice se lagano tresu. Bočice treba da ostanu u vodenoj kadi sve dok se svi kristali leda ne otope i više ne budu vidljivi. Po završetku odmrzavanja, bočicu su poprskane sa 70% etanolom, bočica je prenesena u bio-bezbedan orman.

5. Bočica je otvorena i sadržaj je stavljen u kupastu epruvetu od 50 ml u kojoj se nalazi agens za odmrzavanje. 50 ml kupasta epruveta je stavljena u centrifugu i centrifugirano je na 100 g tokom 10 minuta. Po završetku centrifugiranja, medijum za odmrzavanje je aspiriran i hepatociti su resuspendovani u dovoljno inkubacionog medijuma da se dobije ~1,5 × 10<6>ćelija/mL.

6. Pomoću Cellometar Vision, prebrojane su ćelije i određena je gustina živih ćelija. Ćelije slabe vitalnosti (<80% održivosti) nisu prihvatljive za upotrebu. Ćelije se razblažuju sa inkubacionim medijumom do gustine radnih ćelija od 1,0 × 10<6>održivih ćelija/mL.

7. 247,5 µL hepatocita je preneseno u svaku komoricu 96-komoričnoj ploči sa kulturom ćelija. Postavite ploču na tresalicu pločice Eppendorf Thermomiker Comfort da se hepatociti zagreju 10 minuta.

8. Dodato je 2,5 µL od 100 µM test jedinjenja ili kontrolnih jedinjenja u inkubacionu komoricu koja sadrži ćelije, mešano je kako bi se postigla homogena suspenzija pri 0,5 minuta, koja će, kada se postigne, definisati vremensku tačku od 0,5 minuta. U vremenu od 0,5 minuta, 20 µL inkubirane smeše je preneseno u komorice u „ploči za gašenje“ nakon čega sledi mešanje.

9. Ploča je inkubirana na 37°C pri 900 obrtaja u minuti na Eppendorf Thermomixer Comfort mešalici ploča. Pri 5, 15, 30, 45, 60, 80, 100 i 120 minuta, sistem inkubacije je mešan, i uzorci od 20 µL inkubirane smeše na svakoj vremenskoj tačci su preneseni u komorice u posebnoj „ploči za gašenje“, praćeno mešanjem.

10. Ploče za gašenje su centrifugirane tokom 20 minuta pri 4.000 o/min.4 različita jedinjenja su spojena u jednu kasetu, i koriste se za LC/MS/MS analizu.

[0077] Sva izračunavanja su izvršena koristeći Microsoft Excel. Površine vrhova su određene iz ekstrahovanih jonskih hromatograma. In vitro unutrašnji klirens (in vitro Clint, u L/min/10<6>ćelija) matičnog jedinjenja određeno je regresionom analizom nestajanja Ln matičnog procenta u odnosu na vremensku krivu. In vitro unutrašnji klirens (in vitro Clint, u L/min/10<6>ćelija) određen je iz vrednosti nagiba korišćenjem sledeće jednačine, i prikazan je u Tabeli C:

V = inkubaciona zapremina (0,25 mL);

N = broj hepatocita po komorici (0,25 × 10<6>ćelija).

1

Tabela C

Fizička svojstva

logD

[0078] Lipofilnost leka je važno fizičko svojstvo koje može uticati na mnoga biološka i metabolička svojstva jedinjenja, na primer, na profile apsorpcije, distribucije, metabolizma, izlučivanja i toksičnosti jedinjenja. Koeficijent distribucije između 1-oktanola i vodenog pufera, LogDO/W, pri pH 7,4, najčešća je mera lipofilnosti jedinjenja. Trenutni postupak za merenje LogDO/W zasniva se na tradicionalnoj tehnici mućkanja, ali sa modifikacijom merenih jedinjenja u mešavinama od deset istovremeno, koristeći UPLC sa kvantitativnom masenom spektrometrijom (MS) kao postupak za merenje relativnog oktanola i vodene koncentracije. Maksimalni kapacitet je 379 projektnih jedinjenja (48 komorice sa 10 jedinjenja uključujući tri QC jedinjenja) po eksperimentu. 2 uzorka za kontrolu kvaliteta (QC), ciklobenzaprin sa umerenim LogD i nikardipin sa visokim LogD, koriste se u svim komoricama kako bi se osigurao dobar kvalitet. Dodatni QC uzorak Kofeina, sa niskim LogD, koristi se i nasumično postavlja u svim ponavljanjima. Postupak je temeljno potvrđen u odnosu na prethodne metodologije mešanja bočica.

2

Rastvorljivost

[0079] Kako bi oralno jedinjenje stiglo na mesto dejstva, i kako bi došlo do oralne apsorpcije iz creva, to jedinjenje mora da bude u rastvoru, i stoga jedinjenja koja poseduju visoku sopstvenu rastvorljivost mogu biti pogodnija za farmaceutsku upotrebu. Termodinamička rastvorljivost jedinjenja za istraživanje se meri u standardnim uslovima. To je pristup mešanja bočica koji koristi 10 mM DMSO rastvore koji se isporučuju od strane Compound Managements skladišta tečnosti i to je postupak velike propusnosti. Osušena jedinjenja se uravnotežuju u vodenom fosfatnom puferu (pH 7,4) tokom 24 sata na 25°C, deo sa rastvorenim jedinjenjem se odvaja od ostataka. Rastvori su analizirani i kvantifikovani korišćenjem UPLC/MS/MS, QC uzorci su ugrađeni u svako ispitivanje kako bi se osigurao kvalitet testa.

Vezivanje proteina ljudske plazme

[0080] Vezanje ljudskih proteina u plazmi je ključni faktor u kontroli količine slobodnog (nevezanog) leka koji je na raspolaganju za vezivanje za ciljani faktor i zato igra važnu ulogu u uočenoj efikasnosti lekova in vivo. Zbog toga, jedinjenja koja poseduju visoki slobodan fragment (nizak nivo vezivanja na proteine u plazmi) mogu da pokazuju povećanu efikasnost u odnosu na jedinjenja sa sličnom potencijom i nivoom izloženosti. Automatizovan test za ravnotežnu dijalizu u ljudskoj plazmi koristi RED (Rapid Equilibrium Dialysis) uređaj i rukovanje uzorcima. Analiza obično traje preko dva do tri dana, uključujući isporuku rezultata. Nakon dijalize tokom 18 sati, uzorci plazme i pufera se pripremaju za analizu tečnom hromatografijom i masenom spektrometrijom. Uzorci se generalno testiraju iz jednog puta i kvantifikuju sa LC/MSMS korišćenjem kalibracione krive u plazmi sa 7 tačaka.

Jedinjenja su skupljena u grupama plazme do 10 jedinjenja. U svakom ponavljanju se koriste tri referentna jedinjenja, Propranolol, Metoprolol i Varfarin. Varfarin se koristi kao kontrola u svakoj grupi, i Propranolol i Metoprolol se postavljaju nasumično u svakom ponavljanju. Interni Excel makro koristi se za pripremu datoteka za robota i za maseni spektrometar, i koristi se i za izračunavanje nevezanog fragmenta (fu%) u plazmi.

[0081] Tabela D prikazuje podatke za logD, rastvorljivost i vezivanje proteina plazme za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela D

4

hERG test vezivanja

[0082] hERG (ljudski etar, go go-povezani geni) kalijumski kanali su neophodni za normalnu električnu aktivnost u srcu. Aritmija se može izazvati blokadom hERG kanala različitom grupom lekova. Ova nuspojava je čest razlog neuspeha lekova u pretkliničkim ispitivanjima sigurnosti [Sanguinetti i dr., Nature., 2006, 440, 463-469.] i stoga minimizovanje aktivnosti blokiranja hERG kanala može biti poželjno svojstvo kandidata za lek.

[0083] Svrha hERG testa vezivanja je da se proceni uticaj test jedinjenja na naponski-zavisni kalijumski kanal koji je kodiran genom povezanim sa ljudskim etrom (hERG) koristeći konstitutivno eksprimirajuću CHO ćelijsku liniju na Nanion Syncropatch 384PE automatizovanoom sistemu stegi.

[0084] Ispitivanje je sprovedeno na naredni način, i svi reagensi su korišćeni na sobnoj temperaturi, osim ako nije drugačije navedeno.

Sastavi reagensa uključuju:

[0085]

1. Interni „IC700“ rastvor korišćen za perfuziju donje strane čipa (u mM), KF 130, KCl 20, MgCl2, EGTA 10 i HEPES 10, (svi Sigma-Aldrich; pH 7,2-7,3 koristeći 10 M KOH, 320 mOsm) i dopunjeno sa 25 µM eskina.

2. Spoljni i ćelijski pufer (u mM), NaCl 137, KCl 4, HEPES 10, D-glukoza 10, CaCl22, MgCl2 1 (pH 7,4, NaOH)

3. NMDG „referentni“ pufer korišćen za uspostavljanje stabilne osnovice pre dodavanja test jedinjenja, NaCl 80, KCl4, CaCl22, MgCl2, NMDG Cl 60, D-glukoza monohidrat 5, HEPES 10 (pH 7,4 NaOH 298 mOsm)

4. Pojačivač plombe koristi se za poboljšanje kvaliteta ćelija, NaCl 80, KCl3, CaCl210, HEPES 10, MgCl2 1 (pH 7,4 NaOH)

Priprema ćelija:

[0086]

1. Ako se koristi ćelijska kultura; ćelije se inkubiraju na 30°C tokom približno 4-6 dana pre upotrebe. Na dan ispitivanja podići ćelije koristeći aktazu i ponovo se suspenduju u 20 ml ćelijskog pufera do gustine od 0,8 do 1e6 ćelija/ml.

2. Ako koristite krio-bočice spremne za ispitivanje; brzo se odmrzavaju dve krio-bočice na 37°C i polako se pipetira u 23 ml spoljne rastvore

3. Svi preparati ćelije inkubiraju se tokom 15 minuta na kućištu za ćelije koje se meša, koje je podešeno na 10°C pre početka ispitivanja

Priprema jedinjenja:

[0087] Sva jedinjenja su akustično dispergovana u četiri primerka koristeći Labcyte Echo.10 mM osnovni rastvor se koristi za generisanje 6 ploča sa izvornim jedinjenjem u različitim koncentracijama, kako bi se omogućilo kumulativno doziranje na ćelije (0,03167 mM, zatim 0,1 mM, zatim 0,3167 mM, 1 mM, 3,167 mM, 10 mM,). 90 µL referentnog pufera je dodato u svaku komoricu izvornih ploča koje sadrže 600 nl jedinjenja za krajnju koncentraciju jedinjenja od 0,1 µM, 0,39 µM, 1,2 µM, 3,9 µM, 12,5 µM i 39,6 µM, respektivno.

[0088] hERG test (svi koraci doziranja se izvode pomoću rukovanja sa tečnošću koja je podešena na Nanion syncropatch)

1. 384 komorica medijuma za rezistenciju od čipa sa 4 otvora napunjeno je sa 40 µl eksternog pufera i unutrašnji pufer je stavljen na donju stranu ploče.

2. 20 µl ćelija je raspoređeno u svaku komoricu čipa, i praćeno sa 20 µl agensa za amplifikacija zatvaranja.

3. Uklonjeno je 40 µl reagensa iz svake komorice do stanice za pranje, ostavljajući preostalu zapreminu od 40 µl

4. 40 µl referentnog pufera raspoređeno je sa korakom uklanjanja od 40 µl nakon 3 minuta, i ovaj korak je ponovljen.

5. 40 µl ploče sa jedinjenjem 1 (0,03167 mM) je raspoređeno, napravljeni su snimci u „realnom vremenu“ tokom 3 min izlaganja pre uklanjanja 40 µl. Ovaj korak se ponavlja za 5 naredne ploče jedinjenja u povećanim koncentracijama kako bi se stvorila kumulativna kriva koncentracija-efekat u svakoj komorici Syncropatch čipa.

4

[0089] hERG-posredovane struje izazvane su korišćenjem protokola koraka napona koji se sastojao od neprekidnog napona držanja od -80 mV, sa korakom od 500 ms do 60 mV, i zatim korakom od 500 ms do -40 mV svakih 15 sekundi. Jačina hERG struje merena je automatski iz tragova sa oduzetim propuštanjem pomoću Nanion softvera, tako što je vršna vrednost hERG „repne“ struje bila na -40 mV svakih 15 sekundi, i uzeta su poslednja tri od tih odgovora za svaku koncentraciju kako bi se generisala koncentracija-efekat kriva

[0090] Proračun rezultata se vrši pomoću APC paketa u okviru Genedata. Za rutinsku normalizaciju podataka iz komorice sa neutrlanim i inhibitorskim referentnim grupama kao referentnim, GeneData test analizator koristi narednu jednačinu za normalizaciju vrednosti signala u željeni raspon signala:

x je izmerena vrednost sirovog signala komorice

<cr> je srednja vrednost izmerenih vrednosti signala za centralnu referentnu vrednost (neutralne) komorice na ploči

<sr> je srednja vrednost izmerenih vrednosti signala za skaliranu referentnu vrednost (inhibitorske) komorice na ploči

CR je željena srednja normalizovana vrednost za centralnu referentnu vrednost (neutralna)

SR je željena srednja normalizovana vrednost za skaliranu referentnu vrednost (inhibitorska)

[0091] Tabela E prikazuje podatke vezane za hERG za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela E

Propustljivosti

[0092] Kako bi se maksimizovala oralna apsorpcija, lek mora da ima dovoljan transmembranski protok, kao i da izbegava izliv P-glikoproteina. Najrašireniji sistem za

4

predviđanje oralne apsorpcije je određivanje brzine propustljivosti jedinjenja pomoću monoslojeva ćelijske linije adenokarcinoma ljudskog creva Caco-2.

Dvosmerna propustljivost ljudskih Caco-2 od A do B i B do A

[0093] Automatizovani test korišćen za određivanje dvosmerne propustljivosti (isticanje i unos) jedinjenja u Caco-2 ćelije sproveden je tokom 2 sata pri pH 7,4. Uzorci su analizirani pomoću LC/MS/MS kako bi se procenio očigledni koeficijent propusnosti (Papp) jedinjenja duž Calo-2 ćelijskih monoplasta, i rezultati su navedeni u jedinicama x10<-6>cm/s.

[0094] Odnos isticanja (ER) može se odrediti pomoću sledeće jednačine:

Gde Papp(B-A)označava očigledni koeficijent propustljivosti u bazolateralnom do apikalnom pravcu, dok i Papp(A-B)označava očigledni koeficijent propustljivosti u apikalnom do bazolateralnom pravcu.

Pasivna propustljivost od A do B Papp od ljudskog Caco-2

[0095] Automatizovani test korišćen za određivanje pasivne propustljivosti jedinjenja u monoslojnim ćelija Caco-2 sproveden je tokom 2 sata sa apikalnim pH od 6,5 i bazolateralnim pH od 7,4. Test inhibicije Caco-2 AB se izvodi hemijskom inhibicijom tri glavna transportera za ispuštanje ABCB1 (P-gp), ABCG2 (BCRP) i ABCC2 (MRP2) u Caco-2 ćelijama. Inkubacija apikalne i bazolateralne grupe je izvedena sa koktelom inhibitora (50 µM kinidina, 20 µM sulfasalazina i 100 µM benzbromarona). Uzorci su analizirani pomoću LC/MS/MS kako bi se procenio očigledni koeficijent propustljivosti (Papp) jedinjenja duž Calo-2 monoslojne ćelije, i rezultati su navedeni u jedinicama x10<-6>cm/s.

[0096] Tabela F prikazuje podatke propustljivosti koji su generisani za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela F

4

[0097] Prema narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav, koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao što je prethodno definisano u vezi sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0098] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi za formulaciju tableta uključuju, na primer, inertne razblaživače, agense za granulaciju i dezintegraciju, veznike, lubrikante, konzervanse i antioksidanse. Dalji pogodan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može biti helatni agens. Formulacije tableta mogu biti ne-obložene ili obložene, bilo da se modifikuje njihova dezintegracija i posledična apsorpcija aktivnog sastojka u gastrointestinalnom traktu, ili da se poboljša njihova stabilnost i/ili izgled, u oba slučaja, koristeći konvencionalne agense za oblaganje i postupke dobro poznate u struci.

[0099] Sastavi za oralnu upotrebu mogu alternativno da budu u obliku tvrdih želatinskih kapsula u kojima je aktivni sastojak pomešan sa inertnim čvrstim razblaživačem, ili kao meke želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljem.

[0100] Vodene suspenzije uglavnom sadrže aktivni sastojak u obliku finog praška zajedno sa jednim ili više agenasa za suspendovanje, agenasa za disperziju ili vlaženja. Vodene suspenzije takođe mogu da sadrže jedan ili više konzervansa, anti-oksidansa, agenasa za bojenje, arome i/ili zaslađivače.

[0101] Uljane suspenzije se mogu formulisati suspenzijom aktivnog sastojka u biljnom ili mineralnom ulju. Uljane suspenzije takođe mogu da sadrže agens za zgušnjavanje.

Zaslađivači kao što su navedeni iznad i arome mogu se dodati kako bi se dobio oralni sastav koji ima prihvatljiv ukus. Ovi sastavi mogu se konzervirati dodavanjem anti-oksidansa.

[0102] Prašci i granule koje se mogu dispergovati pogodni za pripremu vodene suspenzije dodatkom vode obično sadrže aktivni sastojak zajedno sa agensom za disperziju ili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervansa. Takođe mogu biti prisutni dodatni pomoćni sastojci poput zaslađivača, aroma i boja.

4

[0103] Farmaceutski sastavi iz ovog opisa mogu takođe biti u obliku emulzija ulje-u-vodi. Uljana faza može biti biljno ulje ili mineralno ulje ili mešavina bilo čega od navedenog. Emulzije mogu takođe da sadrže zaslađivače, arome i konzervanse.

[0104] Sirupi i eliksiri mogu se formulisati sa zaslađivačima, i mogu takođe da sadrže i agens za uklanjanje vlage, konzervans, arome i/ili boje.

[0105] Farmaceutski sastavi mogu takođe biti u obliku sterilne vodene ili uljne suspenzije za injekcije, koja se može formulisati prema poznatim postupcima koristeći jedan ili više odgovarajućih agenasa za disperziju ili vlaženje, i agenasa za suspendovanje, koji su gore navedeni. Sterilni preparat za injekcije takođe može biti sterilni rastvor ili suspenzija za injekcije u netoksičnom, parenteralno prihvatljivom razblaživaču, ili sistemu rastvarača.

[0106] Sastavi za primenu inhalacijom mogu biti u obliku konvencionalnog aerosola pod pritiskom, koji je podešen tako da dozira aktivni sastojak, kao aerosol koji sadrži sitno podeljene čvrste ili tečne kapljice. Uobičajena aerosolna potisna goriva kao što su volatilni fluorisani ugljovodonici ili ugljovodonici mogu se upotrebiti, i aerosolni uređaj je pogodno postavljen da dozira odmerenu količinu aktivnog sastojka. Takođe mogu biti pogodni inhalatori suvog praha.

[0107] Za dalje informacije o formulaciji, čitalac se upućuje na Chapter 25.2 u Volume 5 od Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

[0108] Količina aktivnog sastojka koja je kombinovana sa jednim ili više ekscipijenasa za dobijanje jednog oblika doziranja će nužno varirati u zavisnosti od tretiranog domaćina i određenog puta primene. Na primer, za oralnu primenu ljudima obično treba, na primer, od 1 mg do 2 g aktivnog agensa (pogodnije od 100 mg do 2 g, na primer, od 250 mg do 1,8 g, kao što je od 500 mg do 1,8 g, posebno od 500 mg do 1.5 g, pogodno od 500 mg do 1 g) koji se primenjuje u kombinaciji sa odgovarajućom i pogodnom količinom ekscipijenasa koja može varirati od oko 3 do oko 98 procenata ukupne težine sastava. Razumeće se da, ako je potrebna velika doza, može biti potrebno više doznih oblika, na primer dve ili više tableta ili kapsula, gde se doza aktivnog sastojka pogodno podeli između njih. Tipično, jedinični dozni oblici sadrže oko 10 mg do 0,5 g jedinjenja ovog opisa, mada jedinični dozni oblik može sadržati i

4

do 1 g. Pogodno, jedan čvrsti dozni oblik može da sadrži između 1 i 300 mg aktivnog sastojka.

[0109] Veličina doze u terapeutske ili profilaktičke svrhe jedinjenja ovog opisa će se, naravno, razlikovati u skladu sa prirodom i težinom bolesnog stanja, starosti i pola životinje ili pacijenta i načina primene, u skladu sa dobro poznatim principima medicine.

[0110] Kada se koriste jedinjenja ovog opisa u terapeutske ili profilaktičke svrhe, ona će se generalno primenjivati tako da se primi dnevna doza u rasponu, na primer, 1 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine, koja se primenjuje ako je potrebno u podeljenim dozama. Generalno, niže doze će se primenjivati kada se koristi parenteralni put. Tako, na primer, za intravensku primenu, obično se koristi doza u rasponu, na primer, 1 mg/kg do 25 mg/kg telesne težine. Slično, za primenu inhalacijom, koristiće se doza u rasponu, na primer, 1 mg/kg do 25 mg/kg telesne težine. Ipak je poželjna oralna primena, posebno u obliku tableta.

[0111] U jednom aspektu opisa, jedinjenja ovog opisa ili njihove farmaceutski prihvatljive soli primenjuju se u obliku tableta koje sadrže 10 mg do 100 mg jedinjenja iz ovog opisa (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli), gde se jedna ili više tableta primenjuje po potrebi kako bi se postigla željena doza.

[0112] Kao što je gore navedeno, poznato je da signalizacija putem ERa uzrokuje tumorogeneze putem jednog ili više efekata posredovanja proliferacije raka i drugih ćelija, posredovanjem angiogenih događaja i posredovanjem pokretljivosti, migracije i invazivnosti ćelija raka. Otkrili smo da jedinjenja ovog opisa poseduju moćnu anti-tumorsku aktivnost za koju se veruje da je dobijena antagonizmom i redukcijom ERa koji je uključena u korake transdukcije signala koji dovode do proliferacije i opstanka tumorskih ćelija i invazivnosti i migracione sposobnosti metastaziranja tumorskih ćelija.

[0113] Prema tome, jedinjenja ovog opisa mogu biti vredna kao anti-tumorski agensi, naročito kao selektivni inhibitori proliferacije, preživljavanja, pokretljivosti, diseminacije i invazivnosti ćelija raka sisara koji dovode do inhibicije rasta i preživljavanja tumora i do inhibicije metastatskog rasta tumora. Posebno, jedinjenja ovog opisa mogu biti vredna kao antiproliferativni i antiinvazivni agensi u zadržavanju i/ili tretmanu oboljenja čvrstog tumora. Posebno, jedinjenja ovog opisa mogu biti korisna u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji

4

su osetljivi na inhibiciju ERa i koji su uključeni u korake transdukcije signala koji dovode do proliferacije i preživljavanja tumorskih ćelija i migratornih sposobnosti i invazivnost metastazirajućih ćelija tumora. Dalje, jedinjenja ovog opisa mogu biti korisna u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji su posredovani u potpunosti ili delimično antagonizmom i regulacijom na dole ERa, tj. jedinjenja se mogu koristiti za stvaranje inhibicionog efekta ERa kod toplokrvne životinja kojoj je potreban takav tretman.

[0114] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano za upotrebu kao lek kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0115] Prema narednom aspektu opisa, pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano za upotrebu u proizvodnji antiproliferativnog efekta kod toplokrvne životinje, kao što je čovek.

[0116] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano za upotrebu kod toplokrvne životinje, kao što je čovek, kao antiinvazivni agens u zadržavanju i/ili tretmanu oboljenja čvrstog tumora.

[0117] Prema narednom aspektu opisa, pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu raka kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0118] Prema narednom aspektu opisa, pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano za upotrebu u prevenciji ili tretmanu oboljenja čvrstog tumora kod toplokrvne životinje, kao što je čovek.

[0119] Prema dodatnom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji su osetljivi na inhibiciju ERa koji su uključeni u koracima transdukcije signala koji dovode do proliferacije, preživljavanja, invazivnosti i migracione sposobnosti tumorskih ćelija.

4

[0120] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano za upotrebu u pružanju inhibitorskog efekta na ERα.

[0121] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u pružanju selektivnog inhibitorskog efekta na ERα.

[0122] Ovde su opisana jedinjenja koja se mogu vezati za domen vezivanja ERa liganda i selektivni su degradatori receptora estrogena. U biohemijskim ispitivanjima i ćelijskim ispitivanjima, pokazano je da jedinjenja ovog opisa predstavljaju snažne vezivne agense za receptore estrogena i smanjuju ćelijski nivo ERa, i mogu biti korisni u tretmanu bolesti ili stanja osetljivih na estrogen (uključujući bolesti koje su razvila otpornost na endokrine terapije), tj. za upotrebu u tretmanu raka dojke i ginekoloških rakova (uključujući rak endometrijuma, jajnika i grlića materice) i rakova koji eksprimiraju ERa mutirane proteine koji mogu biti de novo mutacije, ili su nastali kao rezultat tretmana prethodnom endokrinom terapijom, kao inhibitor aromataze.

[0123] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekoloških bolesti.

[0124] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice.

[0125] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke.

[0126] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke, gde je rak razvio rezistenciju na jednu ili više drugih endokrinih terapija.

[0127] U jednoj od karakteristika opisa, rak koji se tretira je rak dojke. U narednom aspektu ove karakteristike, rak dojke je receptor estrogena ve (ER+ve). U jednom otelotvorenju ovog aspekta, jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so dozira se u kombinaciji sa drugim agensom protiv raka, kao što je anti-hormonski agens kao što je ovde definisano.

[0128] Prema narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je ovde ranije definisano, za upotrebu u tretmanu ER+ve raka dojke.

[0129] Ovde definisan lek protiv raka može se primeniti kao jedina terapija ili može uključivati, pored jedinjenja iz opisa, konvencionalnu hirurgiju ili radioterapiju ili hemoterapiju. Takva hemoterapija može da obuhvata jednu ili više narednih kategorija agenasa protiv tumora: -(i) drugi antiproliferativni/antineoplastični lekovi i njihove kombinacije, kao što se koriste u medicinskoj onkologiji, kao što su alkilacioni agensi (na primer cis-platin, oksaliplatin, karboplatin, ciklofosfamid, azotni ipirit, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolomid i nitrozouree); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati, kao što su fluoropirimidini poput 5-fluorouracila i tegafura, raltitreksed, metotreksat, citozin arabinozid i hidroksiurea); anti-tumorski antibiotici (na primer antraciklini kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mitramicin); antimitotički agensi (na primer vinka alkaloidi kao što su vinkristin, vinblastin, vindesin i vinorelbin i taksidoidi kao što su taksol i taksoter i inhibitori polokinaze); i inhibitori topoizomeraze (na primer epipodofilotoksini kao što su etopozid i teniposid, amsakrin, topotekan i kamptotecin);

(ii) anti-hormonalni agensi kao što su anti-estrogeni (na primer tamoksifen, fulvestrant, toremifen, raloksifen, droloksifen i idoksifen), progestogeni (na primer megestrol acetat), inhibitori aromataze (na primer kao anastrozol, letrozol, vorozol i egsestan);

(iii) inhibitori funkcije faktora rasta i njegovih nizvodnih signalnih puteva: uključeni su Ab modulatori bilo kog faktora rasta ili ciljevi receptora faktora rasta, pregled kod Stern i dr. Critical Reviews in Oncology/Haematology, 2005, 54, pp11-29); takođe su uključeni inhibitori malih molekula takvih ciljeva, na primer inhibitori kinaze -primeri uključuju anti-erbB2 antitelo trastuzumab [Herceptin™], anti-EGFR antitelo

1

panitumumab, anti-EGFR antitelo cetuksimab [Erbitux, C225] i inhibitore tirozin kinaze uključujući inhibitore porodice erbB receptora, kao što su inhibitori porodice faktora rasta faktora rasta (EGFR/erbB1) inhibitori tirozin kinaze, kao što su gefitinib ili erlotinib, inhibitori erbB2 tirozin kinaze, kao što je lapatinib, i mešani inhibitori erb1/2, kao što je afatanib; slične strategije su dostupne za druge klase faktora rasta i njihove receptore, na primer inhibitori porodice faktora rasta hepatocita ili njihove receptore, uključujući c-met i ron; inhibitori porodice insulina i porodice faktora rasta insulina ili njihovih receptora (IGFR, IR) inhibitore porodice faktora rasta trombocita ili njihovih receptora (PDGFR), i inhibitore signalizacije posredovane drugim receptorima tirozin kinaza, kao što su c-kit, AnLK i CSF-1R; takođe su uključeni modulatori koji ciljaju signalne proteine na signalnom putu PI3-kinaze, na primer, inhibitori izoforma PI3-kinaze kao što su PI3K-α/β/γ i ser/thr kinaze kao što su AKT, mTOR (kao što je AZD2014), PDK, SGK, PI4K ili PIP5K; takođe su obuhvaćeni inhibitori serin/treonin kinaza koji nisu gore navedeni, na primer raf inhibitori kao što su vemurafenib, MEK inhibitori poput selumetiniba (AZD6244), Abl inhibitori kao su imatinib ili nilotinib, Btk inhibitori kao što je ibrutinib, Sik inhibitori kao što je fostamatinib, inhibitori aurora kinaze (na primer AZD1152), inhibitori drugih ser/thr kinaza kao što su JAX, STAT i IRAK4, i inhibitori kinaza zavisnih od ciklina, na primer inhibitori CDK1, CDK7, CDK9 i CDK4/6, kao što je palbociklib;

iv) modulatori signalnih puteva oštećenja DNK, na primer PARP inhibitori (npr. Olaparib), ATR inhibitori ili ATM inhibitori;

v) modulatori apoptotskih i puteva ćelijske smrti kao što su moduli porodice Bcl (npr. ABT-263/Navitoclax, ABT-199);

(vi) antiangiogeni agensi kao što su oni koji inhibiraju efekte vaskularnog endotelnog faktora rasta, [na primer, antitelo protiv vaskularnog endotelnog faktora rasta ćelija bevacizumab (Avastin™) i na primer, inhibitor VEGF receptora tirozin kinaze, kao što su sorafenib, aksitinib, pazopanib, sunitinib i vandetanib (i jedinjenja koja deluju drugim mehanizmima (na primer linomid, inhibitori integrin αvβ3 funkcije i angiostatin)];

(vii) agensi za vaskularno oštećenje, kao što je Combretastatin A4;

(viii) agensi protiv invazije, na primer inhibitori porodice c-Src kinaza kao što su (dasatinib, J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661) i bosutinib (SKI-606), i inhibitori metaloproteinaze kao što je marimastat, inhibitori funkcije receptora urokinaza plazminogena ili antitela za heparanazu];

2

(ix) imunoterapijski pristupi, uključujući na primer ex-vivo i in vivo pristupe za povećanje imunogenosti pacijentovih ćelija tumora, poput transfekcije citokinima kao što su interleukin 2, interleukin 4 ili faktor koji stimuliše koloniju granulocita i makrofaga, pristupi za smanjenje T-ćelijske anergije, pristupi koji koriste transficirane ćelije imunog sistema kao što su dendritične ćelije koje su transficirane citokinima, pristupi koji koriste ćelije linije tumora transficirane citokinima i pristupi koji koriste anti-idiotipska antitela. Specifični primeri uključuju monoklonska antitela koja ciljaju PD-1 (npr. BMS-936558) ili CTLA4 (npr. ipilimumab i tremelimumab); (x) Antisens ili RNKi terapije, na primer one koje su usmerene na navedene ciljeve. (xi) pristupi genske terapije, uključujući na primer pristupe zamene aberantnih gena kao što su aberantni p53 ili aberantni BRCA1 ili BRCA2, GDEPT (gensko-usmerena enzimska terapija pro-lekom), kao što su oni koji koriste citozin deaminazu, timidin kinazu ili enzim bakterijske nitroreduktaze, i pristupi za povećanje tolerancije pacijenata na hemoterapiju ili radioterapiju, kao što je genska terapija za rezistenciju na više lekova.

[0130] Shodno tome, u jednom otelotvorenju je pruženo jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i dodatna anti-tumorska supstanca za zajednički tretman raka.

[0131] U skladu sa ovim aspektom opisa, pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i drugi agens protiv tumora, naročito bilo koji od anti-tumorskih agenasa navedenih pod (i)-(xi) iznad. Naročito, anti-tumorski agens naveden pod (i)-(xi) gore predstavlja standard nege za specifični rak koji se tretira; stručnjak u oblasti razumeće značenje „standarda nege“.

[0132] Zbog toga je u narednom aspektu opisa pruženo jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim anti-tumorskim agensom, posebno antitumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i)-(xi) iznad.

[0133] U narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim anti-tumorskim agensom, posebno anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i) iznad.

[0134] U narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i bilo koji od anti-tumorskih agenasa navedenih pod (i) iznad.

[0135] U narednom aspektu ovog opisa pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i taksoid, kao što su na primer taksol ili taksoter, pogodno taksoter.

[0136] U narednom aspektu opisa pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim anti-tumorskim agensom, posebno anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (ii) iznad.

[0137] U narednom aspektu opisa pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i bilo koji od anti-hormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer bilo koji od anti-estrogena navedenih pod (ii) iznad, ili na primer inhibitor aromataze naveden pod (ii) iznad.

[0138] U narednom aspektu opisa pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014.

[0139] U narednom aspektu opisa pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor PI3Kα, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0140] U narednom aspektu ovog opisa pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i CDK4/6 inhibitor, poput palbocikliba.

[0141] U jednom aspektu, gore navedena kombinacija jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa anti-tumorskim agensom navedenim pod (ii) iznad, ili mTOR inhibitorom (poput AZD2014), ili PI3K-α inhibitorom (kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-

4

il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on) ili CDK4/6 inhibitorom (kao što je palbociklib), pogodna je za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekološkog raka, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0142] Ovde, kada se koristi izraz „kombinacija“, treba razumeti da se to odnosi na istovremenu, odvojenu ili sekvencijalno primenu. U jednom aspektu opisa „kombinacija“ se odnosi na istovremenu primenu. U drugom aspektu opisa, „kombinacija“ se odnosi na odvojenu primenu. U narednom aspektu opisa, „kombinacija“ se odnosi na sekvencijalnu primenu. Ako je primena sekvencijalna ili odvojena, kašnjenje u primeni druge komponente ne bi trebalo da bude takvo da se izgubi korisni efekat kombinacije. Kada se kombinacija dve ili više komponenti primenjuje odvojeno ili sekvencijalno, razumeće se da režim doziranja za svaku komponentu može biti različit i nezavisan od ostalih komponenti. Pogodno je da se jedinjenja iz ovog opisa doziraju jednom dnevno.

[0143] Prema narednom aspektu opisa, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i)-(xi) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0144] Prema narednom aspektu opisa, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa bilo kojim od antihormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer bilo kojim od anti-estrogena navedeni pod (ii) iznad, ili na primer inhibitorom aromataze navedenim pod (ii) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0145] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0146] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i PI3Kα-inhibitor, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0147] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i CDK4/6 inhibitor (kao što je palbociklib) u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0148] Prema dodatnom aspektu opisa, pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i)-(xi) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0149] Prema narednom aspektu opisa, pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa bilo kojim od antihormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer sa bilo kojim anti-estrogenom navedenim pod (ii) iznad, ili na primer, inhibitorom aromataze navedenim pod (ii) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0150] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0151] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i PI3Kα-inhibitor, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim pomoćnim agensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0152] U narednom aspektu opisa pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i CDK4/6 inhibitor (kao što je palbociklib) u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0153] U jednom aspektu, gore navedeni farmaceutski sastavi jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa anti-tumorskim agensom navedenim pod (ii) iznad, ili mTOR inhibitorom (poput AZD2014), ili PI3K-α inhibitorom (kao što je jedinjenje 1-(4(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on) ili CDK4/6 inhibitorom (kao što je palbociklib), pogodni su za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekološkog raka, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0154] U jednom aspektu, gore navedene kombinacije, farmaceutski sastavi i upotrebe za tretman raka, su za tretman raka dojke ili ginekološkog raka, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0155] Prema narednom aspektu ovog opisa, pružen je komplet koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i)-(xi) iznad.

[0156] Prema dodatnom aspektu ovog opisa, predviđen je komplet koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom odabranim od onih navedenih pod (i) ili (ii) iznad.

[0157] Prema dodatnom aspektu ovog opisa, predviđen je komplet koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u prvom jediničnom doznom obliku;

b) anti-tumorski agens odabran od onih navedenih pod (i)-(xi) iznad u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejnerske agense koji sadrže navedene prve i druge oblike doziranja.

[0158] Prema dodatnom aspektu ovog opisa, predviđen je komplet koji sadrži:

b) anti-tumorski agens odabrano od onih navedenih gore pod (i)-(ii) u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejnerske agense koji sadrže navedene prve i druge oblike doziranja.

[0159] Prema dodatnom aspektu ovog opisa, predviđen je komplet koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljiva so, u prvom jediničnom doznom obliku;

b) anti-tumorski agens odabran od anti-tumorskog agensa navedenog pod (ii) iznad, mTOR inhibitor (poput AZD2014), PI3Kα-inhibitor, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on i CDK4/6 inhibitor, kao što je palbociklib, u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejnerske agense koji sadrže navedene prve i druge oblike doziranja.

[0160] Kombinovana terapija kao što je gore opisano može se dodati iznad standardne terapije nege koja se obično sprovodi u skladu sa svojim uobičajenim rasporedom prepisivanja.

[0161] Iako je jedinjenje Formule (I) prvenstveno od vrednosti kao terapeutski agens za upotrebu kod toplokrvnih životinja (uključujući čoveka), takođe je korisno kad god je potrebno inhibirati ER-α. Zbog toga je korisno kao farmakološki standard za upotrebu u razvoju novih bioloških testova i u potrazi za novim farmakološkim agensima.

Personalizovana zdravstvena zaštita

[0162] Drugo obelodanjenje ovog opisa zasniva se na utvrđivanju veze između statusa gena koji kodira ERα i potencijalne osetljivosti na tretman jedinjenjem Formule (I). Naročito, status ERα gena može ukazivati na to da pacijent ima manju verovatnoću da reaguje na postojeću hormonsku terapiju (poput inhibitora aromataze), delom barem zato što se neke ERα mutacije ipak javljaju kao mehanizmi rezistencije na postojeće tretmane. SERD, posebno SERD koji se može primenjivati oralno u potencijalno većim dozama bez prekomerne nelagodnosti, može se tada pogodno koristiti za tretman pacijenata sa ERα mutacijama koji mogu biti otporni na druge terapije. Ovo pruža mogućnosti, postupke i alate za izbor pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I), posebno pacijente obolele od raka. Ovaj opis se odnosi na alate i postupke odabira pacijenta (uključujući personalizovani lek). Izbor se zasniva na tome da li ćelije tumora koje se tretiraju poseduju divlji tip ili mutirani ERα gen. Status ERα gena, prema tome, može se koristiti kao biomarker za indikaciju da odabir tretmana SERD može biti koristan. Kako bi se izbegla sumnja, smatra se da je jedinjenje Formule (I), kao što je ovde opisano, slično aktivno protiv divljih vrsta i mutiranih ERα gena, bar onih mutacija ERα gena identifikovanih na dan podnošenja ove prijave.

[0163] Postoji jasna potreba za biomarkerima koji će obogatiti ili odabrati pacijente čiji će tumori odgovoriti na tretman SERD, kao što je jedinjenje Formule (I). Biomarkeri za odabir pacijenata koji identifikuju pacijente koji najbrže reaguju na jedni agens u odnosu na drugi, idealni su za tretman raka, jer smanjuju nepotreban tretman pacijenata sa tumorima koji ne reaguju na potencijalne nuspojave takvih agenasa.

[0164] Biomarker se može opisati kao „karakteristika koja se objektivno meri i procenjuje kao pokazatelj normalnih bioloških procesa, patogenih procesa ili farmakoloških odgovora na terapijsku intervenciju“. Biomarker je bilo koji prepoznatljiv i merljiv indikator povezan sa određenim stanjem ili bolesti, gde postoji povezanost između prisustva ili nivoa biomarkera i nekog aspekta stanja ili bolesti (uključujući prisustvo, nivo ili nivo promene, tip, stadijum, osetljivost na stanje ili bolest, ili osetljivost na lek koji se koristi za tretman stanja ili bolesti). Korelacija može biti kvalitativna, kvantitativna ili i kvalitativna i kvantitativna. Obično je biomarker jedinjenje, fragment jedinjenja ili grupa jedinjenja. Takva jedinjenja mogu biti bilo koja jedinjenja koja se nalaze u organizmu ili ih on proizvodi, uključujući proteine (i peptide), nukleinske kiseline i druga jedinjenja.

[0165] Biomarkeri mogu imati prediktivnu moć i kao takvi se mogu koristiti za predviđanje ili detektovanje prisustva, nivoa, tipa ili stadijuma određenih stanja ili bolesti (uključujući prisustvo ili nivo određenih mikroorganizama ili toksina), osetljivost (uključujući genetsku osetljivost) na određena stanja ili bolesti ili odgovor na određeni tretman (uključujući tretman lekovima). Smatra se da će biomarkeri igrati sve važniju ulogu u budućnosti otkrivanja i razvoja lekova, poboljšavajući efikasnost programa istraživanja i razvoja. Biomarkeri se mogu koristiti kao dijagnostički agensi, sredstva za praćenje napredovanja bolesti i praćenje tretmana i prediktori kliničkog ishoda. Na primer, razni istraživački projekti za biomarkere pokušavaju da identifikuju markere specifičnih rakova i specifičnih kardiovaskularnih i imunih bolesti. Veruje se da će razvoj novih potvrđenih biomarkera dovesti do značajnih smanjenja troškova zdravstvene zaštite i razvoja lekova, i do značajnih poboljšanja u tretmanu za širok spektar bolesti i stanja.

[0166] Kako bi se optimalno dizajnirala klinička ispitivanja i od njih dobilo što je više moguće informacija, može biti potreban biomarker. Marker se može meriti u surogatima i tumorskim tkivima. U idealnom slučaju ovi markeri će takođe biti u korelaciji sa efikasnošću, i na taj način bi se na kraju mogli koristiti za odabir pacijenta.

[0167] Smatra se da su tumori koji sadrže divlji tip ERα podložni tretmanu jedinjenjem Formule (I), na primer kao tretman prve linije. Tumori mogu takođe da reaguju na tretman jedinjenjem Formule (I), kao druga linija, treća linija ili naknadna terapija, i ovo može biti korisno, naročito kada tumori sadrže mutantni ERα, i mogu biti rezistentni na postojeće terapije kao što su AI. Veća doza jedinjenja Formule (I) može biti potrebna u rezistentnom okruženju nego kod tumora divljeg tipa).

[0168] Opis pruža postupak za određivanje osetljivosti ćelija na jedinjenje Formule (I). Postupak uključuje utvrđivanje statusa ERα gena u navedenim ćelijama. Ćelija je definisana kao osetljiva na jedinjenje Formule (I), ako inhibira povećanje broja ćelija u testu rasta ćelije (bilo putem inhibicije ćelijske proliferacije i/ili povećanjem ćelijske smrti). Postupci opisa su korisni za predviđanje koje ćelije imaju verovatniju reakciju na jedinjenje Formule (I), inhibicijom rasta.

[0169] Uzorak „reprezentativan za tumor“ može biti izolovan stvarni uzorak tumora, ili može biti uzorak koji je dalje obrađen, npr. uzorak PCR amplifikovane nukleinske kiseline iz uzorka tumora.

Definicije:

[0170] U ovom odeljku o personalizovanoj zdravstvenoj zaštiti:

„Alel“ se odnosi na određeni oblik genetskog lokusa, koji se od ostalih oblika razlikuje po svojoj posebnoj nukleotidnoj ili aminokiselinskoj sekvenci.

„Reakcije amplifikacije“ su reakcije nukleinske kiseline koje rezultuju specifičnim amplifikacijama ciljanih nukleinskih kiselina preko nukleinskih kiselina koje nisu ciljane. Lančana reakcija polimeraze (PCR) je dobro poznata reakcija amplifikacije. „Rak“ se ovde koristi za označavanje neoplastičnog rasta koji potiče od ćelijske transformacije u neoplastični fenotip. Takva ćelijska transformacija često uključuje genetsku mutaciju.

„Gen“ je segment DNK koji sadrži sve informacije za regulisanu biosintezu RNK proizvoda, uključujući promoter, eksone, introne i druge elemente sekvence koji se mogu nalaziti unutar 5' ili 3' bočnih regiona (ne unutar transkribovanih delova gena) koji kontrolišu eksprimiranje.

„Status gena“ odnosi se na to da li je gen divljeg tipa ili ne (tj. mutant).

„Oznaka“ se odnosi na sastav koji može da proizvede detektabilni signal koji ukazuje na prisustvo ciljanog polinukleotida u uzorku testa. Pogodne oznake uključuju radioizotope, nukleotidne hromofore, enzime, supstrate, fluorescentne molekule, hemiluminescentne delove, magnetne čestice, bioluminescentne delove i slično. Kao takva, oznaka je bilo koji sastav koji se može otkriti spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, električnim, optičkim ili hemijskim putevima.

„Ne-sinonimna varijacija“ odnosi se na varijaciju (varijansu) kodirajuće sekvence gena (ili preklapanja) koja rezultuje proizvodnjom različite (izmenjene) polipeptidne sekvence. Ove varijacije mogu ali ne moraju da utiču na funkciju proteina i uključuju mis-sens varijante (što rezultuje zamenom jedne aminokiseline za drugu), ne-sens varijante (što rezultuje skraćenim polipeptidom usled stvaranja preuranjenog zaustavnog kodona) i varijante ubacivanja/brisanja.

„Sinonimna varijacija“ odnosi se na varijaciju (varijansu) kodirajuće sekvence gena koja ne utiče na sekvencu kodiranog polipeptida. Ove varijacije mogu indirektno uticati na funkciju proteina (na primer, promenom eksprimiranja gena), ali, u nedostatku dokaza za suprotno, obično se pretpostavlja da su neškodljive.

„Nukleinska kiselina“ se odnosi na jednolančane ili dvolančane molekule DNK i RNK, uključujući prirodne nukleinske kiseline koje se nalaze u prirodi i/ili modifikovane, veštačke nukleinske kiseline koje imaju modifikovane kičme ili baze, kao što je poznato u struci.

„Prajmer“ se odnosi na jednolančani DNK oligonukleotidni niz koji može delovati kao tačka inicijacije za sintezu proizvoda produžavanja prajmera koji je komplementaran u lancu nukleinske kiseline koji treba kopirati. Dužina i redosled prajmera moraju biti takvi da su u stanju da prajmuju sintezu proizvoda produžavanja. Tipični prajmer sadrži najmanje oko 7 nukleotida dužine sekvence koja je bitno komplementarna ciljanoj sekvenci, ali poželjni su nešto duži prajmeri. Obično prajmeri sadrže oko 15-26 nukleotida, ali mogu se koristiti i duži ili kraći prajmeri. „Polimorfno mesto“ je položaj unutar lokusa u kom su u populaciji pronađene najmanje dve alternativne sekvence.

„Polimorfizam“ se odnosi na promenu sekvenci primećenu kod pojedinca na polimorfnom mestu. Polimorfizmi uključuju nukleotidne supstitucije, umetanja, brisanja i mikrosatelite i mogu, ali ne moraju, da rezultuju uočljivim razlikama u eksprimiranju gena ili funkciji proteina. U nedostatku dokaza o uticaju na eksprimiranje ili funkciju proteina, za polimorfizme, uključujući ne-sinonimne

1

varijante, obično se smatra da su uključeni u definiciju gena sekvence divljeg tipa. NCBI vodi katalog ljudskih polimorfizama i pridružene napomene, uključujući validaciju, uočene frekvencije i povezanost sa bolestima ((dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Treba voditi računa da se izraz „polimorfizam“, kada se koristi u kontekstu genske sekvence, ne treba mešati sa izrazom „polimorfizam“ kada se koristi u kontekstu čvrstog stanja jedinjenja koje je kristalne ili amorfne prirode jedinjenja. Kvalifikovana osoba će razumeti predviđeno značenje u kontekstu.

„Sonda“ se odnosi na jednolančane specifične oligonukleotide koji imaju sekvencu koja je u potpunosti komplementarna ciljanoj sekvenci alela koji treba da bude otkriven.

„Odgovor“ se definiše merenjima urađenim prema kriterijumima za procenu odgovora u čvrstim tumorima (Response Evaluation Criteria in Solid Tumours -RECIST) koji uključuju klasifikaciju pacijenata u dve glavne grupe: one koji pokazuju parcijalni odgovor ili stabilnu bolest, i one koji pokazuju znake progresivne bolesti.

„Strogi uslovi hibridizacije“ odnosi se na inkubaciju preko noći na 42°C u rastvoru koji sadrži 50% formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trinatrijum-citrata), 50 mM natrijum-fosfata (pH 7,6), 5x rastvor Denhardta, 10% dekstran sulfata i 20 pg/mL denaturisane DNK sperme lososa, praćeno filtriranjem u 0,1x SSC na oko 65°C. „Preživljavanje“ obuhvata opšti opstanak i preživljavanje bez progresije.

„Opšte preživljavanje“ (OS) definiše se kao vreme od započinjanja primene lekova do smrti od bilo kog uzroka. „Preživljavanje bez progresije“ (PFS) definiše se kao vreme od početka primene lekova do prve pojave progresivne bolesti ili smrti od bilo kog uzroka.

[0171] Ovde je opisan postupak odabira pacijenta za tretman jedinjenjem Formule (I), gde postupak sadrži pružanje tumorske ćelije koja sadrži uzorak od pacijenta; određivanje da li je gen ERα u pacijentovom uzorku tumorske ćelije divljeg tipa ili mutant; i odabir pacijenta za tretman jedinjenjem Formule (I), zasnovan na njemu.

[0172] Postupak može obuhvatati ili isključivati stvarni korak izolacije uzorka pacijenta. Prema tome, prema jednom aspektu opisa pružen je postupak odabira pacijenta za tretman jedinjenjem Formule (I), gde postupak uključuje utvrđivanje da li je ERα gen u tumorskoj

2

ćeliji koji sadrži uzorak prethodno izolovan od pacijenta divlji tip ili mutant; i odabir pacijenta za tretman jedinjenjem Formule (I), zasnovan na njemu.

[0173] Pacijent može biti odabran za tretman jedinjenjem Formule (I), ako DNK tumorskih ćelija ima mutirani ERα gen. Pacijent čija DNK tumorskih ćelija poseduje divlji tip ERa gena takođe može biti odabran za tretman jedinjenjem Formule (I).

[0174] U svrhu ovog opisa, status gena divljeg tipa podrazumeva normalno ili odgovarajuće eksprimiranje gena i normalnu funkciju kodiranog proteina. Suprotno tome, status mutanata podrazumeva eksprimiranje proteina sa izmenjenom funkcijom, u skladu sa poznatim ulogama mutiranih ERα gena u karcinomu (kao što je ovde opisano). Bilo koji broj genetskih ili epigenetskih promena, uključujući mutaciju, amplifikacija, brisanje, genomsko preuređivanje ili promene profila metilacije, može rezultovati mutantnim statusom. Međutim, ako takve promene ipak rezultuju odgovarajućim eksprimiranjem normalnog proteina ili funkcionalno ekvivalentnom varijantom, tada se status gena smatra divljim tipom. Primeri varijanti koje obično ne bi rezultovale funkcionalnim mutantnim statusom gena uključuju varijante sinonimnog kodiranja i uobičajene polimorfizme (sinonimne ili ne-sinonimne). Kao što je razmatrano u nastavku, status gena može se proceniti funkcionalnim testom, ili se može zaključiti iz prirode detektovanih odstupanja od referentne sekvence.

[0175] Status divljih vrsta ili mutanatnih ERα gena određuje se prisustvom ili odsustvom nesinonimnih varijacija nukleinskih kiselina u genima. Posmatrane ne-sinonimne varijacije koje odgovaraju poznatim uobičajenim polimorfizmima bez naznačenih funkcionalnih efekata ne doprinose statusu gena mutanta.

[0176] Ostale varijacije ERα gena koje označavaju status mutanta uključuju varijacije mesta spajanja koje smanjuju prepoznavanje intron/egzon veze tokom obrade pre-mRNK do mRNK. To može rezultovati preskakanjem egzona ili uključivanjem normalno intronske sekvence u splajsovanu mRNK (zadržavanje introna ili korišćenje kriptičnih spojeva splajsovanja). Ovo zauzvrat može rezultovati proizvodnjom aberantnog proteina sa ubacivanjem i/ili brisanjem u odnosu na normalan protein. Stoga, u određenim slučajevima, gen ima status mutanta ako postoji varijanta koja menja sekvencu prepoznavanja mesta splajsovanja na intron/egzon spoju.

[0177] Za ESR1, referentne sekvence su dostupne za gen (GenBank pristupni broj:

NG_008493), mRNK (GenBank pristupni broj: NM_000125) i protein (GenBank pristupni broj: NP_000116 ili Swiss-Prot pristupni broj: P03372). Stručnjak u oblasti će moći da odredi status ESR1 gena, tj. da li je određeni gen ESR1 divljeg tipa ili mutant, na osnovu poređenja DNK ili proteinske sekvence sa divljim tipom.

[0178] Biće očigledno da su sekvence gena i mRNK obelodanjene za ERa gen reprezentativne sekvence. Kod normalnih pojedinaca postoje dve kopije svakog gena, majčinska i očinska kopija, koje će verovatno imati neke razlike u sekvenci, štaviše, u populaciji će postojati brojne alelne varijante genske sekvence. Ostale sekvence koje se smatraju divljim tipom uključuju one koji poseduju jednu ili više sinonimnih promena u sekvenci nukleinske kiseline (gde promene ne menjaju kodiranu sekvencu proteina), nesinonimne uobičajene polimorfizme (npr. polimorfizmi germlinija) koji menjaju sekvencu proteina, ali ne utiču na funkciju proteina i promene intronskih sekvenci koje nisu mesta splajsovanja.

[0179] Brojne tehnike su dostupne stručnjaku da utvrdi status gena ERa. Status gena može se odrediti određivanjem nukleinske kiseline. To se može desiti direktnim sekvenciranjem gena pune dužine ili analizom određenih mesta unutar gena, npr. uobičajeno mutirana mesta.

Uzorci

[0180] Uzorak pacijenta koji se testira na status gena može biti bilo koje tumorsko tkivo ili uzorak koji sadrži tumorske ćelije koji je dobijen ili se može dobiti od pojedinca. Test uzorak je pogodno uzorak krvi, brisa iz usta, biopsije ili druge telesne tečnosti ili tkiva dobijenih od pojedinca. Posebni primeri uključuju: ćelije tumora koje u cirkulaciji, DNK koja cirkuliše u plazmi ili serumu, ćelije izolovane iz tečnosti ascitesa kod pacijenata sa rakom jajnika, plućni ispljuvak za pacijente sa tumorima u plućima, aspirat sitnom iglom pacijenta sa rakom dojke, uzorak urina, periferne krvi, struganje ćelija, folikule dlake, probiranje kože ili bukalni uzorak.

[0181] Biće poznato da test uzorak može podjednako biti sekvenca nukleinske kiseline koja odgovara sekvenci u ispitnom uzorku, to jest da se ceo ili deo regiona u uzorku nukleinska kiselina može prvo amplifikovati upotrebom bilo koje pogodne tehnike, npr. lančana reakcija polimeraze (PCR), pre analize. Nukleinska kiselina može biti genomska DNK ili

4

fragmentisana ili RNK cele ćelije. Na primer, RNK je RNK cele ćelije i koristi se direktno kao obrazac za obeležavanje prvog lanca cDNK pomoću nasumičnih prajmera ili poli A prajmera. Nukleinska kiselina ili protein iz test uzorka mogu se izvući iz uzorka prema standardnim metodologijama (pogledati Green & Sambrook, Eds.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol.1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)

[0182] Opisani dijagnostički postupci mogu se preduzeti korišćenjem uzorka prethodno uzetog od pojedinca ili pacijenta. Takvi uzorci se mogu sačuvati zamrzavanjem ili fiksirati i ugraditi u formalin-parafin ili druge medijume. Alternativno, može se dobiti i koristiti sveža tumorska ćelija koja sadrži uzorak.

[0183] Opisani postupci se mogu primeniti pomoću ćelija bilo kog tumora. Pogodni tumori za tretman jedinjenjem Formule (I) su prethodno opisani.

Postupci detektovanja nukleinskih kiselina

[0184] Detektovanje mutantnih nukleinskih kiselina ERα može se koristiti, u kontekstu ovog opisa, za izbor tretmana lekom. Pošto se mutacije u tim genima dešavaju na nivou DNK, postupci opisa mogu se zasnivati na detektovanju mutacija ili varijacija genomske DNK, kao i na transkriptima i samim proteinima. Može biti poželjno da se mutacije genomske DNK potvrde analizom transkripata i/ili polipeptida, kako bi se osiguralo da je otkrivena mutacija zaista eksprimirana kod pacijenta.

[0185] Stručnjaku će biti očigledno da postoji veliki broj analitičkih postupaka koji se mogu koristiti za detektovanje prisustva ili odsustva varijantnih nukleotida na jednom ili više položaja u genu. Uopšte, detektovanje alelnih varijacija zahteva tehniku diskriminacije mutacija, opciono reakciju amplifikacije (kao što je ona zasnovana na lančanoj reakciji polimeraze) i opciono sistem za generisanje signala. U struci je dostupno mnoštvo tehnika detektovanja mutacija, i one se mogu koristiti u kombinaciji sa sistemom generisanja signala, od kojih su u struci dostupni brojni. Mnoge postupci za detektovanje varijacija alela su obrađene kod Nollau i dr., Clin. Chem., 1997, 43, 1114-1120; Anderson SM. Expert Rev Mol Diagn., 2011, 11, 635-642; Meyerson M. i dr., Nat Rev Genet., 2010, 11, 685-696; and in standard textbooks, for example „Laboratory Protocols for Mutation Detection“, Ed. by U.

Landegren, Oxford University Press, 1996 i „PCR“, 2nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.

[0186] Kao što je gore napomenuto, određivanje prisustva ili odsustva određene varijacije ili mnoštva varijacija ERα gena kod pacijenta sa rakom može se izvesti na različite načine. Takvi testovi se obično izvode korišćenjem DNK ili RNK prikupljenih iz bioloških uzoraka, npr. biopsije tkiva, urina, stolice, ispljuvka, krvi, ćelija, struganog tkiva, aspirata dojke ili drugih ćelijskih materijala, i mogu se izvesti raznim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na PCR, hibridizaciju sondama specifičnim za alele, detektovanje enzimatskih mutacija, hemijsko cepanje neusklađenosti, masenu spektrometriju ili sekvenciranje DNK, uključujući mini-sekvenciranje.

[0187] Odgovarajuće tehnike detektovanja mutacija uključuju amplifikacioni refraktorni mutacioni sistem (ARMS), linearni nastavak amplifikacionog refraktornog mutacionog sistema (ALEX), sistem kompetitivnog prajmovanja oligonukleotidna (COPS), Taqman, Molecular Beacons, polimorfizam restrikcione dužine fragmenta (RFLP) i PCR baziran na restrikcionom mestu i tehnike fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET).

[0188] Kao što je ovde opisano, postupak koja se koristi za određivanje nukleotida (gena) u biomarker genu odabran je iz grupe koju čine: alelno-specifična amplifikacija (alelno specifični PCR) - kao što je amplifikacioni refraktorni mutacioni sistem (ARMS), sekvenciranje, test alelne diskriminacije, hibridizacija, polimorfizam restrikcione dužine fragmenta (RFLP) ili test oligonukleotidne ligacije (OLA).

[0189] Kao što je ovde opisano, hibridizacija sa alelno specifičnim sondama može se izvesti: (1) alelno specifičnim oligonukleotidima vezanim na čvrstu fazu (npr. staklene, silikonske, najlonske membrane) sa obeleženim uzorkom u rastvoru, na primer kao u mnogim aplikacijama DNK čipova; ili (2) vezani uzorak (često klonirana DNK ili PCR amplifikovana DNK) i obeleženi oligonukleotidi u rastvoru (bilo alelno specifični ili kratki da bi omogućili sekvenciranje hibridizacijom). Dijagnostički testovi mogu uključivati panel varijacija, često na čvrstoj podlozi, što omogućava istovremeno određivanje više od jedne varijacije. Takve hibridizacione sonde su dobro poznate u struci (pogledati, npr., Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol.1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) i može da obuhvata dva ili više mesta varijanse.

[0190] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva najmanje jedne mutacije omogućava dovođenje u dodir ERα nukleinske kiseline koja sadrži pretpostavljeno mesto mutacije sa najmanje jednom sondom nukleinske kiseline. Sonda poželjno hibridizuje sa sekvencom nukleinske kiseline koja uključuje mesto varijacije i sadrži komplementarne nukleotidne baze na mestu varijacije pod uslovima selektivne hibridizacije. Hibridizacija se može detektovati pomoću detektabilne oznake upotrebom oznaka poznatih stručnjaku. Takve oznake uključuju, ali nisu ograničene na radioaktivne, fluorescentne, boje i enzimske oznake.

[0191] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva bar jedne mutacije omogućava dovođenje u dodir ERα nukleinske kiseline koja sadrži pretpostavljeno mesto mutacije sa najmanje jednim prajmerom nukleinske kiseline. Prajmer se poželjno hibridizuje sa sekvencom nukleinske kiseline koja uključuje mesto varijacije i sadrži komplementarne nukleotidne baze na mestu varijacije pod uslovima selektivne hibridizacije.

[0192] Oligonukleotidi koji se koriste kao prajmeri za specifičnu amplifikaciju mogu nositi komplementarnu nukleotidnu bazu do mutacije od interesa u centru molekula (tako da amplifikacija zavisi od diferencijalne hibridizacije; pogledati, npr. Gibbs, i dr., 1989. Nucl. Acids Res., 17, 2437-248) ili na krajnjem 3'-terminusu jednog prajmera gde, pod odgovarajućim uslovima, neusklađenost može sprečiti ili smanjiti ekstenziju polimeraze (pogledati npr. Prossner, 1993, Tibtech, 11238).

[0193] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva najmanje jedne mutacije uključuje sekvencioniranje najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline i upoređivanje dobijene sekvence sa poznatom sekvencom nukleinske kiseline divljeg tipa.

[0194] Alternativno, prisustvo ili odsustvo najmanje jedne mutacije obuhvata određivanje masenom spektrometrijom najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline.

[0195] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva bar jedne varijacije nukleinske kiseline obuhvata izvođenje lančane reakcije polimeraze (PCR). Cljana sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži hipotetičku varijansu je amplifikovana i utvrđena je nukleotidna sekvenca amplifikovane nukleinske kiseline. Određivanje nukleotidne sekvence amplifikovane nukleinske kiseline sadrži sekvencioniranje najmanje jednog segmenta nukleinske kiseline. Alternativno, proizvodi za amplifikaciju mogu biti analizirani bilo kojim postupkom koja je sposoban da razdvoji proizvode amplifikacije prema njihovoj veličini, uključujući automatizovanu i ručnu elektroforezu gela i slično.

[0196] Mutacije genomske nukleinske kiseline pogodno su detektovane tehnikama zasnovanim na pomaku mobilnosti u amplifikovanim fragmentima nukleinske kiseline. Na primer, Chen i dr., Anal Biochem 1996, 239, 61-9, opisuju detektovanja jedno-baznih mutacija kompetitivnim testom pomaka mobilnosti. Štaviše, analize zasnovane na tehnici od Marcelino i dr., BioTechniques 1999, 26, 1134-1148 dostupni su na komercijalnoj osnovi.

[0197] U posebnom primeru, kapilarna hetarodupleks analiza može se koristiti za detektovanje prisustva mutacija na osnovu pomeranja pokretljivosti dupleksnih nukleinskih kiselina u kapilarnim sistemima kao rezultat prisustva neusklađenosti.

[0198] Generisanje nukleinskih kiselina za analizu iz uzoraka generalno zahteva amplifikaciju nukleinske kiseline. Mnogi postupci amplifikacije oslanjaju se na enzimsku lančanu reakciju (kao što je lančana reakcija polimeraze, lančana reakcija ligaze ili samoodrživa replikacije sekvence) ili na replikaciju celog ili dela vektora u koji je klonirana. Na primer, amplifikacija prema opisu je eksponencijalna amplifikacija, kao što je pokazano na primer lančanom reakcijom polimeraze.

[0199] Mnogi postupci amplifikacije cilja i signala su opisani u literaturi, na primer, opšti pregledi tih postupaka kod Landegren, U. , i dr., Science, 1988242, 229-237 and Lewis, R., Genetic Engineering News 1990, 10, 54-55. Ovi postupci amplifikacije mogu se koristiti u postupcima našeg opisa, i uključuju lančanu reakciju polimeraze (PCR), PCR in situ, reakciju amplifikacije ligaze (LAR), hibridizaciju ligaze, Qβ bakteriofagnu replikazu, sistem za amplifikacija na bazi transkripcije (TAS), genomsku amplifikaciju sekvenciranjem transkripata (GAWTS), amplifikaciju zasnovanu na sekvenci nukleinskih kiselina (NASBA) i in situ hibridizaciju. Prajmeri pogodni za upotrebu u različitim tehnikama amplifikacije mogu se pripremiti prema postupcima poznatim u struci.

[0200] Lančana reakcija polimeraze (PCR) PCR je postupak amplifikacije nukleinske kiseline opisan između ostalog u U.S. Pat. Nos.4,683,195 i 4,683,202. PCR se sastoji od ponavljanih ciklusa reakcija produženja prajmera nastalih DNK polimerazom. Ciljana DNK je toplotno denaturisana, i hibridizovana su dva oligonukleotida koja vezuju ciljanu sekvencu na suprotnim lancima DNK koja treba da se amplifikuje. Ovi oligonukleotidi postaju prajmeri za upotrebu sa DNK polimerazom. DNK se kopira ekstenzijom prajmera kako bi se napravila druga kopija oba lanca. Ponavljanjem ciklusa toplotne denaturacije, hibridizacije i ekstenzije prajmera, ciljani DNK se može povećati milion puta ili više za oko dva do četiri sata. PCR je molekularno biološki alat koji se mora koristiti zajedno sa tehnikom detektovanja kako bi se odredili rezultati amplifikacije. Prednost PCR je što povećava osetljivost povećanjem količine ciljane DNK za milion do milijardu puta u približno 4 sata. PCR se može koristiti za amplifikaciju bilo koje poznate nukleinske kiseline u dijagnostičkom kontekstu (Mok i dr., Gynaecologic Oncology, 1994, 52: 247-252,).

[0201] Tehnika amplifikacije specifična za alele kao što je Amplification Refractory Mutation System (ARMS™) (Newton i dr., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2503-2516) takođe se može koristiti za detektovanje pojedinačnih mutacija baze. Pod odgovarajućim PCR amplifikacionim uslovima, jedna bazna neusklađenost smeštena na 3'-terminusu prajmera je dovoljna za preferencijalnu amplifikacija savršeno podudarnog alela (Newton i dr., 1989, supra), omogućavajući diskriminaciju blisko srodnih vrsta. Osnova sistema amplifikacije pomoću prethodno opisanih prajmera je da oligonukleotidi sa neusklađenim 3'-ostatkom neće funkcionisati kao prajmeri u PCR pod odgovarajućim uslovima. Ovaj sistem amplifikacije omogućava genotipizaciju isključivo pregledom reakcionih smeša nakon elektroforeze agaroznog gela.

[0202] Analiza proizvoda amplifikacije može se izvršiti bilo kojim postupkom koji je sposoban da odvoji proizvode amplifikacije prema njihovoj veličini, uključujući automatizovanu i ručnu elektroforezu gela, masnu spektrometriju i slično.

[0203] Postupci izolacije, amplifikacije i analize nukleinskih kiselina su rutinski za stručnjake i primeri protokola se mogu naći, na primer, kod Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol.1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Posebno koristan izvor protokola za postupke koje se koriste u PCR amplifikaciji je PCR (Basics: From Background to Bench) by M. J. McPherson, S. G. Mailer, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; 1st edition (October 15, 2000), ISBN: 0387916008.

[0204] Predmetni opis takođe opisuje prediktivne i dijagnostičke komplete koji sadrže degenerisane prajmere za amplifikaciju ciljane nukleinske kiseline u ERα genu i uputstva koja sadrže; protokol amplifikacije i analizu rezultata. Komplet može alternativno takođe da sadrži pufere, enzime i posude za obavljanje amplifikacije i analizu proizvoda amplifikacije. Komplet takođe može biti komponenta skrininga ili dijagnostičkog kompleta koji sadrži druge alate kao što su DNK mikronizovi ili drugi nosači. Kao što je ovde opisano, komplet takođe pruža jedan ili više kontrolnih šablona, kao što su nukleinske kiseline izolovane iz normalnog uzorka tkiva, i/ili niz uzoraka koji predstavljaju različite varijacije u referentnim genima.

[0205] Kao što je ovde opisano, komplet pruža dva ili više prajmerskih parova, od kojih svaki par može da amplifikuje različito područje referentnog (ERα) gena (svaki region mesto potencijalne varijacije) i na taj način pruži komplet za analizu eksprimiranja više genskih varijacija u biološkom uzorku u jednoj ili više paralelnih reakcija.

[0206] Prajmeri u setovima mogu biti obeleženi, na primer fluorescentno, kako bi se olakšalo detektovanje proizvoda amplifikacije i posledična analiza varijacija nukleinskih kiselina. Komplet takođe može omogućiti detektovanje više varijacija u jednoj analizi. Kombinovani komplet će se, dakle, sastojati od prajmera koji mogu da amplifikuju različite segmente referentnog gena. Prajmeri mogu biti različito obeleženi, na primer korišćenjem različitih fluorescentnih oznaka, tako da se razlikuju varijacije.

[0207] Kako se ovde koristi, izrazi „efikasnost“ i „delotvornost“ uključuju i farmakološku efikasnost i fiziološku sigurnost. Farmakološka efikasnost odnosi se na sposobnost tretmana da rezultuje željenim biološkim efektom kod pacijenta. Fiziološka sigurnost odnosi se na nivo toksičnosti ili druge štetne fiziološke efekte na nivou ćelije, organa i/ili organizma (koji se često nazivaju nuspojave) koji su posledica primene tretmana. „Manje efikasno“ znači da tretman dovodi do terapeutski značajnog nižeg nivoa farmakološke efikasnosti i/ili terapeutski većeg nivoa štetnih fizioloških efekata.

[0208] Ovde je takođe opisana upotreba jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za tretman pacijenta obolelog od raka čije su tumorske ćelije identifikovane kao da poseduju mutantni ERα gen.

[0209] Ovde je takođe opisan farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), za upotrebu u prevenciji i tretmanu raka sa ćelijama tumora za koje je identifikovano da sadrže mutantni ERα gen.

[0210] Mutirani oblici ERa su utvrđeni/identifikovani na svim položajima gena.

[0211] Koristeći tumore kao što je rak dojke kao primer, određeni/identifikovani specifični mutantni oblici ERa su oni na položajima Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn i Asp538Gly.

Primeri

[0212] Kao što je gore navedeno, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje iz Primera 127, dalji primeri su referentni primeri dati u korist kvalifikovanog čitaoca.

[0213] Opis će sada biti ilustrovana u narednim primerima u kojima, uglavnom:

(i) operacije su izvedene na sobnoj temperaturi, tj. u rasponu od 17 do 25°C i u atmosferi inertnog gasa, kao što je azot, osim ako nije drugačije navedeno;

(ii) isparavanje je izvršeno rotacionim isparavanjem ili korišćenjem Genevac opreme ili Biotage v10 isparivača u vakuumu, i postupci obrade su izvršeni nakon uklanjanja zaostalih čvrstih materija filtracijom;

(iii) pročišćavanje fleš hromatografije izvršeno je na automatizovanom Teledyne Isco CombiFlash Rf ili Teledyne Isco CombiFlash Companion koristeći unapred pripremljene RediSep Rf Gold Silica Columns (20-40 µm, sferne čestice), GraceResolv Cartridges (Davisil silicijum dioksid) ili Silicycle patrone (40 - 63 µm).

(iv) preparativna hromatografija izvedena je na Gilson prep HPLC instrumentu sa UV sakupljanjem ili preko superkritične tečnosti hromatografijom izvedenom na Waters Prep 100 SFC-MS instrumentu sa MS- ili UV-izazvanim sakupljanjem ili Thar MultiGram III SFC instrumentom sa UV sakupljanjem;

(v) hiralna preparativna hromatografija izvedena je na Gilson instrumentu sa UV sakupljanjem (233 injektor/sakupljač fragmenata, 333 i 334 pumpe, 155 UV detektora) ili

1

Varian Prep Star instrumentu (2 x pumpe SD1, 325 UV detektor, 701 sakupljač fragmenata) pumpi koja radi sa Gilson 305 injekcijom;

(vi) prinosi, ako su prisutni, nisu nužno maksimalni ostvarivi;

(vii) uopšteno, strukture krajnjih proizvoda Formule (I) su potvrđene spektroskopijom nuklearne magnetne rezonance (NMR); vrednosti NMR hemijskog pomaka su merene na delta skali [spektri protonske magnetne rezonance su određeni korišćenjem Bruker Avance 500 (500 MHz) ili Bruker Avance 400 (400 MHz) instrumenta]; merenja su vršena na sobnoj temperaturi, osim ako nije drugačije određeno; korišćene su sledeće skraćenice: s, singlet; d, dublet; t, triplet; k, kvartet; m, multiplet; dd, dublet dubleta; ddd, dublet dubleta dubleta; dt, dublet tripleta; bs, široki signal

(viii) uopšteno, krajnji proizvodi Formule (I) su takođe karakterisani masenom spektroskopijom praćenom tečnom hromatografijom (LCMS ili UPLC); UPLC je izveden koristeći Waters UPLC opremljen sa Waters SQ masenim spektrometrom (temperatura kolone 40, UV = 220-300 nm, maseni spektar = ESI sa pozitivnim/negativnim prebacivanjem) pri brzini protoka od 1 ml/min koristeći sistem rastvarača od 97% A 3% B do 3% A do 97% B tokom 1,50 minuta (ukupno vreme izvođenja sa ravnotežom do početnih uslova itd.1,70min), gde je A = 0,1% mravlje kiseline u vodi (za kiselu obradu) ili 0,1% amonijaka u vodi (za baznu obradu) B = acetonitril. Za kiselu analizu korišćena je kolona Waters Acquity HSS T31,8 µm 2,1 x 50 mm, i za baznu analizu korišćena je kolona Waters Acquity BEH 1,7 µm 2,1 x 50 mm; LCMS je izveden upotrebom Waters Alliance HT (2795) opremljenog sa Waters ZQ ESCi masenim spektrometrom i Phenomenex Gemini -NX (50x2,1mm 5 µm) kolonom pri protoku od 1,1 ml/min 95% A do 95% B tokom 4 minuta sa zadržavanjem 0,5 minuta. Modifikator se drži na konstantnih 5% C (50:50 acetonitril:voda 0,1% mravlje kiseline) ili D (50:50 acetonitril:voda 0,1% amonijum hidroksid (0,88 SG), u zavisnosti od toga da li je kiseli ili bazni postupak.

(ix) prečišćavanje jonske razmene obično se obavlja pomoću SCX-2 (Biotage, propilsulfonskom kiselinom funkcionalizovani silicijum dioksid. Proizveden je pomoću trifunkcionalnog silana, bez zatvarača) patrone.

(x) čistoća međuproizvoda je procenjena tankoslojnom hromatografijom, masenim spektrom, HPLC (tečna hromatografija visokih performansi) i/ili NMR analizom;

(xi) RockPhos pred-katalizator treće generacije nabavljen je od kompanije Strem Chemicals Inc. i kompanije Sigma-Aldrich.

2

(xii) korišćene su naredne skraćenice:

AcOH sirćetna kiselina

Aq vodeni

Brettphos pred-katalizator treće generacije

[(2-Di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metanesulfonat Cbz Benziloksikarbamat

CDCl3deutero-hloroform

Konc. koncentrisan

DCM dihlorometan

DIPEA diizopropiletilamin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetil sulfoksid

EtOAc etil acetat

HPLC tečna hromatografija visokih performansi

MeCN acetonitril

MeOH metanol

RockPhos pred-katalizator treće generacije

[(2-Di-terc-butilfosfino-3-metoksi-6-metil-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2-aminobifenil)]paladijum(II) metanesulfonat

rt/RT sobna temperatura

zas. zasićen

ras. Rastvor

TBAF Tetra-N-butilamonijum fluorid

TBDMS terc-butil-dimetilsilil

TFA trifluorosirćetna kiselina

THF tetrahidrofuran

XPhota pred-katalizator druge generacije

hloro(2-dicikloheksilfosfino-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II)

Primer 1

3-Fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin

[0215] 2,2,2-Trifluorosirćetna kiselina (0,33 mL, 4,35 mmol) je dodata mešanom rastvoru terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (67 mg, 0,12 mmol) u DCM (3,3 mL) na -5 °C pod azotom. Rezultujuća smeša je mešana na -5 °C tokom 1 sata. Zasićen NaHCO3(5 mL) je dodat pažljivo i smeša je ekstrahovana sa DCM (3 x 10 mL).

Kombinovana organska materija je osušena i koncentrovana kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenja su ispareni do suvoće kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin (35 mg, 63%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 22°C): 1,16 (3H, d), 1,83 - 1,95 (2H, m), 2,60 (1H, dd), 2,77 - 2,86 (3H, m), 2,88 - 3 (3H, m), 3,10 - 3,21 (1H, m), 3,29 - 3,39 (1H, m), 3,98 - 4,05 (2H, m), 4,40 (1H, dd), 4,48 (1H, t), 4,58 (1H, t), 4,59 - 4,74 (2H, m), 4,82 (1H, dd), 4,97 (1H, s), 6,78 - 6,83 (2H, m), 6,87 (1H, d), 7,10 - 7,23 (3H, m), 7,27 - 7,30 (1H, m), 7,54 (1H, d), 7,61 (1H, s). m/z: ES+ [M+H]+ 470.

[0216] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat koji je korišćen kao početni materijal pripremljen je kako sledi:

Priprema (3-fluorooksetan-3-il)metil trifluorometansulfonata

[0217]

4

[0218] 2,6-Lutidin (0,441 mL, 3,79 mmol) je dodat mešanom rastvoru (3-fluorooksetan-3-il)metanola (335 mg, 3,16 mmol) u nevodenom DCM (15 mL) na -10 °C.

Trifluorometansulfonski anhidrid (0,560 mL, 3,32 mmol) je zatim dodat kapanjem špricem tokom 3 minuta, i reakciji je omogućeno da se meša na -10 °C tokom 40 minuta. Kada za hlađenje je uklonjena, i rastvor je opran sukcesivno sa hladnim vodenim HCl (1 N; 2 x 5 mL) i zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 5 mL), zatim osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Sušenje pod vakuumom dalo je (3-fluorooksetan-3-il)metil trifluorometansulfonat (431 mg, 57%) kao bledo žuto ulje, koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27 °C) 4,53 - 4,67 (2H, m), 4,79 - 4,95 (4H, m).

Priprema (R)-N-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina [0219]

[0220] Rastvor (3-fluorooksetan-3-il)metil trifluorometansulfonata (431 mg, 1,81 mmol) u DCM (3 mL) je dodat kapanjem mešanom rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (287 mg, 1,65 mmol) i diizopropiletilamina (0,345 mL, 1,97 mmol) u DCM (7 mL) na temperaturi okruženja. Reakcija je mešana tokom 8 sati i zatim razređena sa DCM i oprana sa vodom. Faze su razdvojene, i organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 100% EtOAc u heksanima. proizvod fragmenti su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (R)-N-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (384 mg, 89%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,12 (3H, d), 2,82 (2H, dd), 2,95 - 3,07 (3H, m), 3,12 (1H, t), 4,49 (2H, ddd), 4,67 (1H, dd), 4,70 - 4,78 (1H, m), 6,92 (1H, d), 7,05 - 7,14 (1H, m), 7,18 (1H, td), 7,29 (1H, d), 7,59 (1H, d), 8,34 (1H, br s). m/z: ES+ [M+H]+ 263.

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0221]

[0222] Sirćetna kiselina (1,0 mL) je dodata mešanom rastvoru (R)-N-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (700 mg, 2,67 mmol) i 3-bromobenzaldehida (311 µL, 2,67 mmol) u toluenu (9,3 mL). Rezultujuća smeša je zagrejana do 90 °C i mešana tokom 16 sati. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak je podeljen između DCM (50 mL) od 1M NaOH (25 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (50 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL), osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (809 mg, 71%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,18 (3H, d), 2,60 (1H, dd), 2,79 (1H, dd), 2,92 (1H, t), 3,18 (1H, dd), 3,23 - 3,30 (1H, m), 4,37 (1H, dd), 4,69 (2H, ddd), 4,86 (1H, dd), 5,02 (1H, s), 7,11 - 7,23 (4H, m), 7,31 (1H, d), 7,35 (1H, s), 7,40 (1H, dd), 7,55 (1H, d), 7,64 (1H, s). m/z: ES+ [M+H]+ 429.

Priprema terc-butil 3-fluoropropil(2-hidroksietil)karbamata

[0223]

[0224] Rastvor 1-jodo-3-fluoropropana (7,0 g, 37 mmol) u acetonitrilu (10 mL) je dodat suspenziji etanolamina (4,50 mL, 74,5 mmol) i kalijum karbonata (25,7 g, 186 mmol) u acetonitrilu (60 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati i zatim razređena sa DCM (20 ml). Smeša je ohlađena do 0 °C i di-terc-butil dikarbonat (19,0 mL, 81,9 mmol) je dodat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i filtrirana je. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 4% metanola u DCM kako bi se dobio terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (3,82 g, 46%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 1,4 (9H, s), 1,70 - 2,00 (2H, m), 3,10 - 3,20 (2H, m), 3,30 (2H, d), 3,50 (2H, d), 4,30 - 4,60 (2H, m), 4,60 (1H, br t). m/z: ES+ [M+Na]+ 244.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0225]

[0226] (1R,3R)-1-(3-bromofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (100 mg, 0,23 mmol), cezijum karbonat (190 mg, 0,58 mmol) i RockPhos treće generacije (19,75 mg, 0,02 mmol) su sipani u bocu i boca je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom 3 puta. Rastvor terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (103 mg, 0,47 mmol) u degaziranom toluenu (0,78 mL) je dodat i reakcija je zagrejana do 90 °C tokom 16 sati. Nakon hlađenja, reakcija je podeljena između vode (20 mL) i EtOAc (20 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 20 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (20 mL), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je prečišćen hromatografijom silika gel kolone eluiranjem sa 0-50% etil acetata u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su kombinovani i koncentrovani u vakuumu kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (77 mg, 58%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C): 1,16 (3H, d), 1,35 - 1,51 (9H, m), 1,97 (2H, s), 2,52 - 2,65 (1H, m), 2,84 (1H, dd), 2,88 - 2,98 (1H, m), 3,15 (1H, dd), 3,32 - 3,44 (3H, m), 3,49 - 3,60 (2H, m), 3,97 - 4,09 (2H, m), 4,40 (2H, dd), 4,50 (1H, s), 4,57 - 4,66 (1H, m), 4,65 - 4,73 (1H, m), 4,75 - 4,84 (1H, m), 4,95 (1H, s), 6,76 - 6,84 (2H, m), 6,86 (1H, d), 7,09 - 7,18 (2H, m), 7,20 (1H, t), 7,28 (1H, d), 7,53 (1H, d), 7,66 (1H, s). m/z: ES+ [M+H]+ 570.

Primer 2

N-1-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)-N-2-(3-fluoropropil)etan-1,2-diamin

[0227]

[0228] Benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat (55 mg, 0,09 mmol) i 10% paladijum na ugljeniku (19,4 mg, 0,02 mmol) u etanolu (1 mL) su mešani pod atmosferom vodonika na 21 °C tokom 30 minuta. Smeša je razređena sa DCM (20 mL) i čvrste supstance su filtrirane kroz celit, uz pranje filter kolača sa DCM (10 mL). Kombinovana organska materija je kombinovana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenja su ispareni do suvoće kako bi se dobio N1-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)-N2-(3-fluoropropil)etan-1,2-diamin (25 mg, 59%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,15 (3H, d), 1,79 - 1,92 (2H, m), 2,59 (1H, dd), 2,75 (2H, t), 2,82 - 3,00 (4H, m), 3,06 - 3,20 (3H, m), 3,36 - 3,45 (1H, m), 4,05 (1H, s), 4,39 - 4,49 (2H, m), 4,54 - 4,64 (2H, m), 4,69 (1H, dd), 4,78 (1H, dd), 4,88 (1H, s), 6,51 - 6,57 (2H, m), 6,62 (1H, d), 7,08 - 7,18 (3H, m), 7,26 (1H, s), 7,53 (1H, d), 7,57 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 469.

[0229] Benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema benzil (2-((terc-butoksikarbonil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0231] Rastvor 1-jodo-3-fluoropropana (3,52 g, 18,7 mmol) u acetonitrilu (5 mL) je dodat suspenziji terc-butil (2-aminoetil)karbamata (5,0 g, 31 mmol) i kalijum karbonata (8,63 g, 62,4 mmol) u acetonitrilu (30 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i zatim filtrirana. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i zatim je dodat DCM (50 mL). Rastvor je ohlađen do 0 °C, i DIPEA (7,10 mL, 40,7 mmol) je dodat praćeno sporim dodavanjem kapanjem benzil hloroformata (4,56 mL, 32,0 mmol). Nakon što je dodavanje završeno, ledena kada je uklonjena, i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 6 sati. Reakcija je razređena sa vodom i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 80% etil acetata u heksanu, kako bi se dobio benzil (2-((terc-butoksikarbonil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat (2,1 g, 21%) kao ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C): 1,37 (9H, s), 1,74 - 1,98 (2H, m), 3,01 - 3,13 (2H, m), 3,19 - 3,41 (4H, m), 4,29 - 4,63 (2H, m), 5,07 (2H, s), 6,88 (1H, br. S), 7,30 - 7,39 (5H, m).

Priprema benzil (2-aminoetil)(3-fluoropropil)karbamata

[0232]

[0233] Trifluorosirćetna kiselina (3,48 mL, 45,1 mmol) je dodata rastvoru benzil (2-((tercbutoksikarbonil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamata (1,6 g, 4,5 mmol) u DCM (16 mL) i mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, razređena sa etil acetatom, i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i, koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio benzil (2-aminoetil)(3-fluoropropil)karbamat (1,1 g, 98%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C): 1,73 - 1,98 (2H, m), 2,88 (2H, br. S), 3,37 (4H, q), 4,45 (2H, dt), 5,09 (2H, s), 6,43 (2H, br. S), 7,25 -7,49 (5H, m).

Priprema benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0234]

[0235] BrettPhos Pd G3 (42,2 mg, 0,05 mmol) je dodat degaziranoj smeši (1R,3R)-1-(3-bromofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (200 mg, 0,47 mmol), benzil (2-aminoetil)(3-fluoropropil)karbamata (154 mg, 0,61 mmol) i kalijum karbonata (129 mg, 0,93 mmol) u THF (4,3 mL) na 21 °C. Rezultujuća smeša je zagrejana do 70 °C i mešana na 70 °C tokom 16 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, koncentrovana je pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 80% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat (110 mg, 39%) kao žuto ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,15 (3H, d), 1,90 (2H, s), 2,59 (1H, dd), 2,81 - 2,99 (2H, m), 3,04 - 3,17 (1H, m), 3,19 - 3,61 (8H, m), 4,33 - 4,62 (4H, m), 4,66 - 4,91 (3H, m), 5,14 (2H, d), 6,32 -6,70 (3H, m), 7,07 - 7,15 (2H, m), 7,23 (1H, d), 7,28 - 7,39 (6H, m), 7,49 - 7,56 (1H, m), 7,66 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 603.

Primer 3

N-1-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)-N-2-(3-fluoropropil)-N-1-metiletan-1,2-diamin

[0236]

[0237] Rastvor benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)(metil)amino)etil)(3 - fluoropropil)karbamata (55,5 mg, 0,09 mmol) u etanolu (2 mL) je hidrogenizovan u H-Cube ćeliji za hidrogenaciju koristeći 30 mm 10% paladijum na patroni ugljenika, na 21 °C, 30 bara i stopi protoka od 1 ml/minut tokom 30 minuta. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenja su ispareni do suvoće kako bi se dobio N1-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)-N2-(3-fluoropropil)-N1-metiletan-1,2-diamin (1,5 mg, 3%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,16 (3H, d), 1,74 - 1,88 (2H, m), 2,60 (1H, dd), 2,70 (2H, t), 2,78 (2H, t), 2,87 (1H, dd), 2,91 (3H, s), 2,92 - 2,99 (1H, m), 3,06 - 3,18 (1H, m), 3,35 - 3,45 (3H, m), 4,40 - 4,49 (2H, m), 4,53 (1H, t), 4,60 (1H, dd), 4,69 (1H, dd), 4,78 (1H, dd), 4,90 (1H, s), 6,56 (1H, d), 6,67 (1H, dd), 6,75 (1H, s), 7,07 - 7,17 (3H, m), 7,26 (1H, s), 7,52 (1H, d), 7,61 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 483.

[0238] Benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)(metil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)(metil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0239]

1

[0240] Jodometan (6,25 µL, 0,10 mmol) je dodat suspenziji kalijum karbonata (18,9 mg, 0,14 mmol) u rastvoru benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamata (55 mg, 0,09 mmol) u DMF (1 mL). Rezultujuća smeša je zagrejana na 50 °C tokom 3 sata. Dalji jodometan (6,25 µL, 0,10 mmol) je dodat i smeša je mešana na 50 °C tokom 16 sati. Smeša je razređena sa EtOAc (20 mL) i voda (10 mL). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa vodom (2 x 10 mL) i zasićenim vodenim natrijum hloridom (10 mL). Organski sloj je osušen i koncentrovan kako bi se dobio benzil (2-((3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenil)(metil)amino)etil)(3-fluoropropil)karbamat (56 mg, 100%) kao narandžasto ulje, koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja. M/z: ES+ [M+H]+ 617.

Primer 4

3-Fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)propan-1-amin

[0241]

[0242] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3 ,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (220 mg, 0,37 mmol) je rastvoren u DCM (3,5 mL) i tretiran sa TFA (0,28 mL, 3,7 mmol) kapanjem.

2

Reakciji je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 5 sati i zatim je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc, opran sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen sa HPLC (Xbridge C18 kolona, 5 µm silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina, 20 mL/minut) eluiranjem sa 50 do 80% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,2% NH4OH (pH 10) tokom 6 minuta. Fragmenti proizvoda su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)propan-1-amin (183 mg, 60%) kao bela pena.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,07 (3H, d), 1,53 - 1,79 (3H, m), 2,52 - 2,60 (2H, m), 2,62 - 2,89 (4H, m), 3,03 - 3,36 (3H, m), 3,75 (2H, t), 3,80 (3H, s), 4,38 - 4,74 (4H, m), 4,42 (2H, dt), 5,36 (1H, s), 6,13 (1H, d), 6,82 (1H, dd), 6,94 (3H, s), 7,16 - 7,23 (1H, m), 7,43 (1H, d), 10,50 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 500.

[0243] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1Hpirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0244]

[0245] (R)-N-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (346 mg, 1,32 mmol; pripremljen prema proceduri Primera 1) i 5-bromo-2-metoksibenzaldehid (265 mg, 1,23 mmol) su rastvoreni u toluenu (6,0 mL). Sirćetna kiselina (0,67 mL) je dodata, i reakcija je zagrejana na 80 °C tokom 18 sati. Reakcija je zatim razređena sa EtOAc i neutralizovana sa zasićenim vodenim NaHCO3. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (513 mg, 91%) kao svetlo žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,09 (3H, d), 2,52 - 2,61 (1H, m) 2,62 - 2,88 (2H, m), 3,06 - 3,29 (2H, m), 3,87 (3H, s), 4,34 - 4,79 (4H, m), 5,38 (1H, s), 6,61 (1H, d), 6,94 - 7,09 (3H, m), 7,19 - 7,27 (1H, m), 7,39 - 7,51 (2H, m), 10,56 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 459.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0246]

[0247] (1R,3R)-1-(5-Bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (250 mg, 0,54 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (181 mg, 0,82 mmol), i cezijum karbonat (355 mg, 1,09 mmol) su suspendovani u toluenu (3 mL) u 25 mL boci u obliku kruške osušenoj u rerni. Suspenzija je degazirana (evakuisana i ponovo napunjena sa azotom), i zatim je dodat RockPhos predkatalizator treće generacije (18 mg, 0,02 mmol). Reakcija je opremljena za kondenzatorom i zagrejana je na 90 °C tokom 3 sata. Smeša je razređena sa vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (220 mg, 67%) kao žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,08 (3H, d) 1,17 - 1,39 (9H, m), 1,61 - 1,86 (2H, m), 2,53 - 2,63 (1H, m), 2,65 - 2,90 (2H, m), 3,06 - 3,30 (4H, m), 3,32 - 3,45 (2H, m), 3,75 - 3,90 (5H, m), 4,31 (2H, dt), 4,42 - 4,76 (4H, m), 5,37 (1H, s), 6,13 (1H, d), 6,72 - 6,91 (1H, m), 6,91 - 7,10 (3H, m), 7,13 - 7,28 (1H, m), 7,44 (1H, d), 10,50 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 600.

4

Primer 5

3-fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)propan-1-amin

[0248]

[0249] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (168 mg, 0,28 mmol) je rastvoren u DCM (2,5 mL) i tretiran sa TFA (0,22 mL, 2,8 mmol) kapanjem.

Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc, opran sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen sa obrnutom fazom HPLC (Xbridge C18 kolona, 5 µm silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina, 20 mL/minut), eluiranjem sa 50 do 80% acetonitrila u vodi koja sadrži 0,2% NH4OH (pH 10) tokom 6 minuta. Fragmenti proizvoda su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)propan-1-amin (63 mg, 45%) kao bela pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,08 (3H, d), 1,67 - 1,92 (3H, m), 2,52 - 2,63 (1H, m), 2,63 - 2,88 (4H, m), 2,91 - 2,99 (2H, br m), 3,07 - 3,35 (2H, m), 3,85 (3H, s), 3,97 - 4,12 (2H, m), 4,30 - 4,70 (6H, m), 5,32 (1H, s), 6,21 (1H, dd), 6,86 (1H, t), 6,91 - 7,07 (3H, m), 7,17 - 7,26 (1H, m), 7,42 (1H, d), 10,50 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 500.

[0250] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1Hpirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0251]

[0252] (R)-N-((3-Fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (345 mg, 1,32 mmol) i 3-bromo-2-metoksibenzaldehid (297 mg, 1,38 mmol) su rastvoreni u toluenu (6 mL) i tretirani sa AcOH (0,67 mL). Reakcija je zagrejana na 80 °C tokom 18 sati i zatim razređena sa etil acetatom. Smeša je oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, slojevi su razdvojeni, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (438 mg, 73%) kao žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,11 (3 H, d) 2,53 - 2,66 (1 H, m) 2,70 - 2,93 (2 H, m) 3,16 - 3,35 (2 H, m) 3,91 (3 H, s) 4,33-4,75 (4 H, m) 5,36 (1 H, s) 6,63 (1 H, dd) 6,89 - 7,09 (3 H, m) 7,20 - 7,28 (1 H, m) 7,46 (1 H, d) 7,56 (1 H, dd) 10,59 (1 H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 459.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0253]

[0254] (1R,3R)-1-(3-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (240 mg, 0,52 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (173 mg, 0,78 mmol; pripremljen prema proceduri Primera 1), i cezijum karbonat (340 mg, 1,04 mmol) su suspendovani u toluenu (3 mL) u 25 mL boci u obliku kruške osušenoj u rerni. Suspenzija je degazirana (evakuisana i ponovo napunjena sa azotom) i zatim tretirana sa RockPhos pred-katalizatorom treće generacije (18 mg, 0,02 mmol). Reakciona boca je opremljena za kondenzatorom i zagrejana je na 90°C tokom 3 sata. Smeša je zatim razređena sa vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (168 mg, 54%) kao žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C): 1,09 (3H, d), 1,41 (9H, s), 1,80 - 1,99 (2H, m), 2,53 - 2,65 (1H, m), 2,66 - 2,90 (2H, m), 3,10 - 3,36 (2H, m), 3,42 (2H, t), 3,53 - 3,70 (2H, m), 3,84 (3H, s), 4,06 - 4,20 (2H, br m), 4,31 - 4,72 (6H, m), 5,33 (1H, s), 6,23 (1H, dd), 6,86 (1H, t), 6,92 - 7,09 (3H, m), 7,17 - 7,28 (1H, m), 7,39 - 7,49 (1H, m), 10,52 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 600.

Primer 6

N-(2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amin

[0255]

[0256] 2,2,2-Trifluorosirćetna kiselina (0,5 mL, 0,13 mmol) je dodata rastvoru terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (76 mg, 0,13 mmol) u DCM (5 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Reakcija je koncentrovana pod vakuumom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (30 mL). Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amin (5,0 mg, 8%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,16 (3H, d), 1,77 - 1,91 (2H, m), 2,55 - 2,64 (2H, m), 2,69 - 2,8 (3H, m), 2,88 (2H, dd), 2,92 - 2,98 (1H, m), 2,98 - 3,09 (1H, m), 3,45 - 3,53 (1H, m), 3,89 (2H, t), 3,92 (3H, s), 4,44 (1H, t), 4,53 (1H, t), 5,29 (1H, s), 5,86 (1H, tdd), 6,67 (1H, d), 6,78 (1H, dd), 6,89 (1H, d), 7,07 - 7,16 (2H, m), 7,23 (1H, ddd), 7,49 - 7,54 (1H, m), 7,69 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 476.

[0257] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonata

[0258]

[0259] Trifluorometansulfonski anhidrid (3,97 ml, 23,5 mmol) je dodat kapanjem rastvoru 2,2-difluoroetan-1-ola (1,75 g, 21,3 mmol) u DCM (40 mL at) na -10 °C (so/ledena kada). Lutidin (2,98 ml, 25,6 mmol) je zatim dodat, i reakcija je mešana tokom 1 sata na -10 °C. Reakcija je zatim ugašena sa vodom, i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je opran sa vodom i zatim osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonat (3,10 g, 67,9%) kao bezbojna tečnost.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 4,57 (2H, td), 6,03 (1H, tt).

Priprema (R)-N-(2,2-difluoroetil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina

[0260]

[0261] (R)-1-(1H-Indol-3-il)propan-2-amin (5 g, 28,69 mmol) je dodat rastvoru 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonata (7,07 g, 33,00 mmol) i DIPEA (7,44 mL, 43,04 mmol) u hloroformu (100 mL) i reakcija je mešana na 60 °C tokom 16 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi i koncentrovana je u vakuumu. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (R)-N-(2,2-difluoroetil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (4,22 g, 62%) kao žuto ulje.

<1>H NMR (500 MHz, CDC13, 27 °C): 1,12 (3H, d), 2,73 - 3,17 (5H, m), 3,47 (1H, s), 5,77 (1H, tt), 7,01 (1H, d), 7,06 - 7,17 (1H, m), 7,17 - 7,23 (1H, m), 7,3 - 7,42 (1H, m), 7,59 (1H, d), 8,11 (1H, s). M/z: ES- [M-H]- 237.

Priprema (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0262]

[0263] Sirćetna kiselina (1,23 mL) je dodata mešanom rastvoru (R)-N-(2,2-difluoroetil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (730 mg, 3,06 mmol) i 5-bromo-2-metoksibenzaldehida (659 mg, 3,06 mmol) u toluenu (11 mL). Rezultujuća smeša je zagrejana na 90 °C tokom 16 sati. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, koncentrovana pod redukovanim pritiskom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (50 mL). Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u heptanu. Fragmenti proizvoda su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (429 mg, 32%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C): 1,13 (3H, d), 2,56 (1H, ddd), 2,61 - 2,75 (1H, m), 2,89 (1H, ddd), 3,02 (1H, qd), 3,33 - 3,47 (1H, m), 3,90 (3H, s), 5,25 (1H, s), 5,88 (1H, tdd), 6,81 (1H, d), 7,05 - 7,15 (3H, m), 7,16 - 7,22 (1H, m), 7,33 (1H, dd), 7,51 (1H, dd), 7,57 (1H, s). M/z: ES- [M-H]- 433.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0264]

[0265] RockPhos Pd G3 (11,6 mg, 0,01 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (120 mg, 0,28 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (122 mg, 0,55 mmol) i cezijum karbonata (225 mg, 0,69 mmol) u nevodenom toluenu (2,76 mL) i reakcija je zagrejana do 90 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i ugašena sa vodom (5 mL), razređena sa EtOAc (5 mL) i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 5 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni sa MgSO4, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoroetil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (82 mg, 52%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,15 (3H, d), 1,38 (9H, s), 1,79 - 1,99 (2H, m), 2,58 (1H, dd), 2,65 - 2,82 (1H, m), 2,89 - 3,11 (2H, m), 3,32 (2H, t), 3,4 - 3,53 (3H, m), 3,84 - 3,95 (5H, m), 4,22 - 4,50 (2H, m), 5,27 (1H, s), 5,70 - 6,01 (1H, m), 6,66 (1H, d), 6,76 (1H, dd), 6,88 (1H, d), 7,09 (2H, pd), 7,20 (1H, dd), 7,50 (1H, d), 7,80 (1H, s). M/z: ES- [M-H]- 574

Primer 7

3-Fluoro-N-(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin

[0266]

[0267] Rastvoru terc-butil (3-fluoropropil)(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)karbamata (62 mg, 0,10 mmol) u DCM (4 mL) je dodata trifluorosirćetna kiselina (0,5 mL, 0,10 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Reakcija je koncentrovana pod vakuumom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu (5 g). Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (30 mL). Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin (17 mg, 33%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,18 (3H, d), 1,77 - 1,89 (2H, m), 2,60 (1H, ddd), 2,73 (2H, t), 2,86 - 2,9 (2H, m), 2,92 - 3,02 (2H, m), 3,24 (1H, dq), 3,61 (1H, td), 3,90 (6H, m), 4,48 (2H, dt), 5,36 (1H, s), 6,76 - 6,81 (2H, m), 6,87 - 6,92 (1H, m), 7,06 - 7,15 (2H, m), 7,22 (1H, ddd), 7,48 - 7,54 (1H, m), 7,83 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 494.

[0268] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonata

[0269]

[0270] Trifluorometansulfonski anhidrid (3,14 mL, 18,6 mmol) je dodata kapanjem špricem tokom 5 minuta mešanom rastvoru 2,2,2-trifluoroetan-1-ola (1,23 mL, 16,9 mmol) i 2,6-dimetilpiridina (2,36 mL, 20,3 mmol) u DCM (50 mL) na -10 °C. Nakon 2 sata reakcija je oprana sukcesivno sa vodenim HCl (IN; 2 x 30 mL) i zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Organski sloj je zatim osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonat (0,92 g, 23%) kao crveno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27 °C): 4,69 (2H, q).

Priprema (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina

1

[0272] 2,2,2-Trifluoroetil trifluorometansulfonat (1,91 g, 13,29 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (2,32 g, 13,29 mmol) i DIPEA (3,44 ml, 19,93 mmol) u 1,4-dioksanu (30 ml) i reakcija je mešana na 85 °C tokom 4 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi i koncentrovana je u vakuumu. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (2,81 g, 83%) kao bezbojno ulje.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C): 1,14 (3H, d), 2,81 - 2,88 (2H, m), 3,11 - 3,22 (3H, m), 7,06 (1H, d), 7,12 (1H, ddd), 7,21 (1H, ddd), 7,37 (1H, dt), 7,60 (1H, ddd), 8,01 (1H, s). M/z: ES-[M-H]- 255.

Priprema (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0273]

[0274] Sirćetna kiselina (1,06 mL) je dodata mešanom rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (680 mg, 2,65 mmol) i 5-bromo-2-metoksibenzaldehida (571 mg, 2,65 mmol) u toluenu (9,55 mL). Rezultujuća smeša je zagrejana na 90 °C tokom 16 sati. Reakcija je koncentrovana pod vakuumom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu (5 g). Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (50 mL). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-

2

b]indol (681 mg, 57%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,17 (3H, d), 2,58 (1H, ddd), 2,82 - 3,01 (2H, m), 3,23 (1H, dq), 3,52 (1H, td), 3,92 (3H, s), 5,36 (1H, s), 6,83 (1H, d), 7,07 - 7,17 (3H, m), 7,19 - 7,24 (1H, m), 7,34 (1H, dd), 7,49 - 7,55 (1H, m), 7,68 (1H, s). M/z: ES- [M+H]+ 453

Priprema terc-butil (3-fluoropropil)(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)karbamata [0275]

[0276] RockPhos Pd G3 (11,57 mg, 0,01 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (125 mg, 0,28 mmol), terc-butila (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (122 mg, 0,55 mmol) i cezijum karbonata (225 mg, 0,69 mmol) u toluenu (2,76 mL), i reakcija je zagrejana do 90 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i ugašena sa vodom (5 mL), razređena sa EtOAc (5 mL) i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 5 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (3-fluoropropil)(2-(4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)karbamat (69,0 mg, 42%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,19 (3H, d), 1,40 (9H, s), 1,81 - 1,99 (2H, m), 2,61 (1H, dd), 2,89 - 3,07 (2H, m), 3,24 (1H, dq), 3,32 - 3,39 (2H, m), 3,41 - 3,57 (2H, m), 3,63 (1H, h), 3,85 - 3,97 (5H, m), 4,39 (2H, d), 5,35 (1H, s), 6,72 - 6,83 (2H, m), 6,90 (1H, d), 7,04 - 7,16 (2H, m), 7,2 - 7,24 (1H, m), 7,46 - 7,55 (1H, m), 7,83 (1H, s). M/z: ES- [M-H]- 592.

Primer 8

2,2-Difluoro-3-((1R,3R)-1-(5-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metoksifenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propan-1-ol

[0278] Rastvoru terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (152 mg, 0,25 mmol) u DCM (4 mL) je dodata trifluorosirćetna kiselina (0,5 mL, 0,25 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Reakcija je koncentrovana pod vakuumom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (50 mL). Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-((1R,3R)-1-(5-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metoksifenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propan-1-ol (62 mg, 49%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,18 (3H, d), 1,74 - 1,88 (2H, m), 2,58 - 2,67 (1H, m), 2,70 (2H, t), 2,79 - 3 (4H, m), 3,08 - 3,23 (1H, m), 3,57 - 3,81 (3H, m), 3,82 - 3,91 (6H, m), 4,04 (1H, s), 4,41 (1H, t), 4,50 (1H, t), 5,35 (1H, s), 6,60 (1H, d), 6,79 (1H, dd), 6,86 (1H, d), 7,06 - 7,15 (2H, m), 7,15 - 7,22 (1H, m), 7,45 - 7,58 (1H, m), 7,87 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 506.

[0279] Terc-butil(2-(4-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-3,5-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ola

[0280]

4

[0281] NaH u mineralnom ulju (60% težine; 343 mg, 8,58 mmol) je dodat iz jednog dela mešanom rastvoru 2,2-difluoropropan-1,3-diola (874 mg, 7,80 mmol) u THF (32 mL) na 0 °C. Reakciji je omogućeno da se zagreje do sobne temperature, i mešana je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je ponovo ohlađena do 0 °C, i tercbutildifenilhlorosilan (2,0 mL, 7,8 mmol) je dodat kapanjem špricem. Reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature tokom 1 sata i zatim je ugašena sa vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen sa Na2SO4, filtriran, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa izokratskim uslovima 5% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio 3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ol (1,94, 71%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C): 1,03 - 1,14 (9H, s), 3,87 - 3,93 (4H, m), 7,37 - 7,44 (6H, m), 7,64 - 7,66 (4H, m).

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonata [0282]

[0283] Rastvor 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ola (1,94 g, 5,55 mmol) i 2,6-dimetilpiridina (1,94 ml, 16,6 mmol) u DCM (18 ml) je ohlađen do -10 °C (so/ledena kada). Trifluorometansulfonski anhidrid (1,88 ml, 11,1 mmol) je dodata polako kapanjem tokom 10 minuta. Reakcija je održana pod ovim uslovima tokom 2 sata. Reakcija je zatim oprana sa vodom, vodenim HCl (1N, 100 mL), i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (2,68 g, 100%) kao crveno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27 °C): 1,03 - 1,14 (9H, s), 3,90 (2H, t), 4,76 (2H, t), 7,39 - 7,56 (6H, m), 7,59 - 7,75 (4H, m).

Priprema (R)-N-(1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amina

[0285] 3-((Terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (481 mg, 1,00 mmol) je dodat mešanom rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (174 mg, 1,00 mmol) u 1,4-dioksanu (3 mL), praćeno sa DIPEA (0,244 mL, 1,40 mmol). Reakcija je mešana na 85 °C tokom 5 sati. Reakcija je sipana u smešu DCM i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 35% etil acetata u heksanima, dajući kao prinos (R)-N-(1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)-3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amin (465 mg, 92%). M/z: ES+ [M+H]+ 507.

Priprema (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0286]

[0287] Sirćetna kiselina (545 µL) je dodata mešanom rastvoru (R)-N-(1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amina (690 mg, 1,36 mmol) i 5-bromo-2-metoksibenzaldehida (293 mg, 1,36 mmol) u toluenu (4,90 mL).

Reakciona smeša je zagrejana do 90 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i koncentrovana pod vakuumom, ponovo rastvorena u MeOH i primenjena na unapred ovlaženu (MeOH) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa MeOH (50 mL) i proizvod je eluiran sa 1M NH3u MeOH rastvoru (50 mL). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (395 mg, 41%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 0,96 (9H, s), 1,12 (3H, d), 2,50 (1H, ddd), 2,67 - 2,79 (2H, m), 3,16 (1H, ddd), 3,38 - 3,47 (1H, m), 3,61 - 3,71 (4H, m), 3,96 (1H, dt), 5,33 (1H, s), 6,66 (1H, d), 6,99 - 7,07 (2H, m), 7,08 (1H, d), 7,14 (1H, dt), 7,25 (5H, tt), 7,29 - 7,35 (2H, m), 7,4 - 7,46 (1H, m), 7,52 - 7,59 (4H, m), 7,73 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 703.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0288]

[0289] RockPhos Pd G3 (22,66 mg, 0,03 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji (1R,3R)-1-(5-bromo-2-metoksifenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (380 mg, 0,54 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (239 mg, 1,08 mmol) i cezijum karbonata (440 mg, 1,35 mmol) u toluenu (5,4 mL) i reakcija je zagrejana do 90 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i ugašena sa vodom (5 mL), razređena sa EtOAc (5 mL) i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 5 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovan pod vakuumom. Rastvor 1,0 M TBAF u THF (10 mL) je dodata i ostavljen da se meša tokom 30 minuta. Reakciona smeša je ugašena sa vodom (10 mL), razređena sa EtOAc (10 mL) i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 10 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovan pod vakuumom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-4-metoksifenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (160 mg, 49%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C): 1,21 (3H, d), 1,39 (9H, s), 1,8 - 1,99 (2H, m), 2,65 (1H, dd), 2,86 - 3,03 (2H, m), 3,12 - 3,25 (1H, m), 3,3 - 3,37 (2H, m), 3,42 - 3,57 (2H, m), 3,62 - 3,83 (4H, m), 3,84 - 4,03 (5H, m), 4,34 (1H, s), 4,44 (1H, s), 5,35 (1H, s), 6,62 (1H, d), 6,81 (1H, dd), 6,90 (1H, d), 7,07 - 7,17 (2H, m), 7,21 - 7,25 (1H, m), 7,5 - 7,54 (1H, m), 7,68 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 606.

Primer 9

Priprema N-(2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amina

[0290]

[0291] Rastvor terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (0,30 g, 0,50 mmol) u mravljoj kiselini (4 mL, 104 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 24 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je uzet u dihlorometanu i opran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% metanola u dihlorometanu. Fragmenti proizvoda su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila žuta penasta čvrsta supstanca (131 mg). Materijal je dalje prečišćen preparativnom SFC (kolona: CHIRALPAK IG, 5 µm, 21,2 mm prečnik, 250 mm dužina, 5 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa izokratskim uslovima 20% metanola (sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobio N-(2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amin (0,080 g, 32%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,13 (3H, d), 1,67 - 1,84 (3H, m), 2,57 - 2,70 (3H, m), 2,74 - 2,79 (3H, m), 2,92 - 3,11 (1H, m), 3,35 - 3,67 (2H, m), 4,03 (2H, t), 4,47 (2H, dt), 5,31 (1H, s), 6,93 - 7,05 (3H, m), 7,14 - 7,23 (2H, m), 7,42 (1H, d), 10,64 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 500.

[0292] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata su opisane u nastavku.

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0293]

[0294] Smeša (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (0,50 g, 1,95 mmol) i 3-bromo-2,6-difluorobenzaldehida (0,453 g, 2,05 mmol) u toluenu (10 mL) i sirćetnoj kiselini (1 mL) je mešana na 100 °C tokom 5 sati. Reakciji zatim je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je tretiran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom i ekstrahovan sa etil acetatom. Organski sloj je osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b)]indol (0,85 g, 95%) kao bela penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,13 (3H, d), 2,65 (1H, dd), 2,88 (1H, br dd), 2,93 - 3,12 (1H, m), 3,35 - 3,47 (1H, m), 3,47 - 3,67 (1H, m), 5,35 (1H, s), 6,92 - 7,15 (3H, m), 7,22 (1H, d), 7,44 (1H, d), 7,68 - 7,78 (1H, m), 10,66 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 459.

Priprema terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0295]

[0296] Smeša (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (0,30 g, 0,65 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,289 g, 1,31 mmol), RockPhos pred-katalizatora treće generacije (0,027 g, 0,03 mmol) i cezijum karbonata (0,532 g, 1,63 mmol) je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). Toluen (3,5 mL) je dodat, i smeša je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (2x). Rezultujuća suspenzija je mešana na 90 °C tokom 2,3 sata i zatim je ohlađena do sobne temperature. Smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,30 g, 77%) kao bledo žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,03 - 1,19 (3H, d), 1,34 - 1,40 (9H, m), 1,71 - 1,97 (2H, m), 2,63 (1H, dd), 2,70 - 3,13 (2H, m), 3,36 - 3,63 (4H, m), 4,09 (2H, br t), 4,41 (2H, dt), 5,31 (1H, s), 6,88 - 7,08 (3H, m), 7,13 - 7,31 (2H, m), 7,42 (1H, d), 10,63 (1H, s). (Dva multipleta vodonika su zaklonjena vrhom vode). M/z: ES+ [M+H]+ 600.

Primer 10

Priprema 3-fluoro-N-(2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amina

[0297]

[0298] Rastvor terc-butil (2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,59 g, 1,01 mmol) u mravljoj kiselini (4 mL, 104 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 24 sata i zatim je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je uzet u dihlorometanu i opran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% metanola u dihlorometanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila bledo žuta penasta čvrsta supstanca (425 mg). Ovaj materijal je dalje prečišćen preparativnom SFC (kolona: CHIRALPAK IG, 5 µm, 21,2 mm prečnik, 250 mm dužina, 4

1

mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa izokratskim uslovima 15% metanola (sadrži 0,2% NH4OH) u CO2preko, kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin (0,35 g, 71%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,53 - 1,83 (3H, m), 2,56 - 2,83 (4H, m), 2,88 - 3,13 (1H, m), 3,14 - 3,30 (1H, m), 3,44 - 3,61 (1H, m), 3,81 (2H, br t), 4,42 (2H, dt), 5,28 (1H, s), 6,16 (1H, dd), 6,91 (1H, dt), 6,96 - 7,04 (1H, m), 7,07 (1H, td), 7,17 (1H, t), 7,27 (1H, d), 7,47 (1H, d), 10,70 (1H, s). (Dva multipleta vodonika su zaklonjena od strane DMSO). M/z: ES+, [M H] 482.

[0299] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil (2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata su opisane u nastavku.

Priprema (1R,3R)-1-(5-bromo-2-fluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0300]

[0301] Smeša (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (0,30 g, 1,17 mmol) i 5-bromo-2-fluorobenzaldehida (0,250 g, 1,23 mmol) u toluenu (6 mL) i sirćetnoj kiselini (0,67 mL) je mešana na 100 °C tokom 5 sati. Reakciji je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i zatim je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je bazifikovan sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom i ekstrahovan sa etil acetatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1R,3R)-1-(5-bromo-2-fluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (0,51 g, 99%) kao bela penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 2,60 (1H, dd), 2,77 (1H, dd), 3,97 - 3,08 (1H, m), 3,13 - 3,28 (1H, m), 3,40 - 3,69 (1H, m), 5,31 (1H, s), 6,73 (1H, dd), 6,97 - 7,04 (1H, m), 7,09 (1H, td), 7,29 (2H, d), 7,49 (1H, d), 7,57 (1H, ddd), 10,71 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 441.

1 1

Priprema terc-butil (2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0302]

[0303] Boca koja sadrži smešu (1R,3R)-1-(5-bromo-2-fluorofenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (0,510 g, 1,16 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,511 g, 2,31 mmol), RockPhos pred-katalizatora treće generacije (48 mg, 0,060 mmol) i cezijum karbonata (0,941 g, 2,89 mmol) je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). Toluen (6 mL) je dodat, i reakciona boca je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (2x). Rezultujuća suspenzija je mešana na 90 °C tokom 2,3 sata i zatim joj je omogućeno da se ohladi do sobne temperature. Smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil (2-(4-fluoro-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,595 g, 89%) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,09 (3H, d), 1,16 - 1,42 (9H, m), 1,60 - 1,90 (2H, m), 2,57 - 2,82 (1H, m), 3,01 (1H, br dd), 3,19 (2H, t), 3,22 - 3,28 (1H, m), 3,34 - 3,64 (3H, m), 3,87 (2H, br t), 4,32 (2H, dt), 5,28 (1H, s), 6,14 (1H, dd), 6,86 - 6,96 (1H, br m), 6,96 - 7,02 (1H, m), 7,06 (1H, td), 7,17 (1H, t), 7,26 (1H, d), 7,47 (1H, d), 10,67 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 582.

Primer 11

Priprema 3-fluoro-N-(2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amina

[0304]

1 2

[0305] Rastvor terc-butil (2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (0,21 g, 0,34 mmol) u mravljoj kiselini (4,0 mL, 104 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 20 sati i zatim koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je uzet u dihlorometanu i opran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% metanola u dihlorometanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila žuta penasta čvrsta supstanca (120 mg). Ova čvrsta supstanca je dalje prečišćena preparativnom SFC ((S,S) Whelk-O1 kolona, 5 µm, 21,2 mm prečnik, 250 mm dužina, 4,0 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa izokratskim uslovima 25% metanola (sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)propan-1-amin (0,10 g, 57%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,61 - 1,81 (3H, m), 2,54 - 2,67 (3H, m), 2,76 (2H, br t) 2,86 - 3,03 (2H, m), 3,35 -3,52 (2H, m), 3,79 (3H, s), 3,85 - 3,98 (2H, m), 4,44 (2H, dt), 5,41 (1H, s), 6,83 (1H, dd), 6,96 (2H, quind), 7,11 (1H, t), 7,15 - 7,20 (1H, m), 7,35 - 7,43 (1H, m), 10,45 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 512.

[0306] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil (2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata su opisane u nastavku.

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromo-2-fluoro-6-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0307]

1

[0308] Smeša (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (0,20 g, 0,78 mmol) i 3-bromo-2-fluoro-6-metoksibenzaldehida (0,191 g, 0,820 mmol) u toluenu (4 mL) i sirćetnoj kiselini (0,44 mL) je mešana na 100 °C tokom 5 sati. Reakciji zatim je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je bazifikovan sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom i ekstrahovan sa etil acetatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2-fluoro-6-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (0,32 g, 87%) kao bela penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 2,62 (1H, dd), 2,72 - 2,99 (2H, m), 3,38 - 3,57 (2H, m), 3,86 (3H, s), 5,45 (1H, s), 6,92 - 7,03 (3H, m), 7,15 - 7,23 (1H, m), 7,37 - 7,44 (1H, m), 7,64 (1H, dd), 10,48 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 471.

Priprema terc-butil (2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido [3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0309]

[0310] Boca koja sadrži smešu (1R,3R)-1-(3-bromo-2-fluoro-6-metoksifenil)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b)]indola (0,32 g, 0,68 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,225 g, 1,02 mmol), RockPhos pred-katalizatora treće generacije (28 mg, 0,030 mmol) i cezijum karbonata (0,553 g, 1,70 mmol) je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). Toluen (3,5 mL) je dodat, i boca je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (2x). Rezultujuća suspenzija je mešana na 90 °C tokom 2,3 sata i zatim joj je omogućeno da se ohladi do sobne temperature. Smeša je

1 4

filtrirana, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil (2-(2-fluoro-4-metoksi-3-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,22 g, 52%) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,34 (9H, br s), 1,63 - 1,96 (3H, m), 2,54 - 2,69 (1H, m), 2,87 - 2,97 (1H, m), 3,18 -3,28 (2H, m), 3,46 - 3,49 (4H, m), 3,78 (3H, s), 3,89 - 4,03 (2H, m), 4,35 (2H, dt), 5,41 (1H, br d), 6,82 (1H, dd), 6,96 (2H, quin), 7,12 (1H, t), 7,18 (1H, dd), 7,37 - 7,41 (1H, m), 10,43 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 612.

Primer 12

Priprema 3-fluoro-N-(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)propan-1-amina

[0311]

[0312] Trifluorosirćetna kiselina (0,96 mL, 12 mmol) je dodata rastvoru terc-butil (3-fluoropropil)(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)karbamata (370 mg, 0,62 mmol) u DCM (5,2 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Zasićen vodeni NaHCO3(25 mL) je dodat pažljivo, i nakon što je dodavanje završeno, smeša je ekstrahovana sa DCM (3 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom SFC (kolona: (S,S) Whelk-O1, 5 µm, 21,2 mm prečnik, 250 mm dužina, 70 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa izokratskim uslovima 25% metanola (sadrži 0,2% NH4OH) u CO2. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)propan-1-amin (109 mg, 35%) kao žuta penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,64 - 1,79 (3H, m), 2,52 -2,64 (3H, m), 2,71 - 2,78 (3H, m), 2,93 - 3,08 (1H, m), 3,22 - 3,28 (1H, m), 3,44 - 3,60 (1H, m), 3,90 (3H, s), 4,13 (2H, br t), 4,43 (2H, dt), 5,31 (1H, s), 5,92 (1H, s), 6,96 - 7,03 (1H, m),

1

7,03 - 7,10 (1H, m), 7,24 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,92 (1H, s), 10,61 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 495.

[0313] Priprema početnog materijala terc-butil (3-fluoropropil)(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)karbamata je opisana u nastavku.

Priprema (1R,3R)-1-(2-hloro-5-metoksipiridin-4-il)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0314]

[0315] Sirćetna kiselina (1,33 mL) je dodata mešanom rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (855 mg, 3,34 mmol) i 2-hloro-5-metoksiizonikotinaldehida (572 mg, 3,34 mmol) u toluenu (11,6 mL). Rezultujuća smeša je zagrejana na 90 °C tokom 5 sati. Reakcija je zatim koncentrovana pod vakuumom, i rezultujući ostatak je ponovo rastvoren u dihlorometanu. Ovaj rastvor je opran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom i zasićenim vodenim natrijum hloridom i zatim osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa 0 do 75% etil acetata u heksanima.

Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (1R,3R)-1-(2-hloro-5-metoksipiridin-4-il)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (1,28 g, 97%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,09 (3H, d), 2,60 (1H, dd), 2,80 (1H, dd), 2,90 - 3,08 (1H, m), 3,19 - 3,28 (1H, m), 3,38 -3,63 (1H, m), 3,99 (3H, s), 5,33 (1H, s), 6,54 (1H, s), 6,97 - 7,04 (1H, m) 7,05 - 7,11 (1H, m), 7,24 - 7,29 (1H, m), 7,48 (1H, d), 8,27 (1H, s), 10,59 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 410.

Priprema terc-butil (3-fluoropropil)(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)karbamata

1

[0317] RockPhos pred-katalizator treće generacije (64,6 mg, 0,08 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji (1R,3R)-1-(2-bromo-5-metoksipiridin-4-il)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (350 mg, 0,77 mmol) i cezijum karbonata (628 mg, 1,93 mmol) u toluenu (7,7 mL) i reakcija je zagrejana na 90 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature i ugašena sa vodom (15 mL). Smeša je razređena sa EtOAc (15 mL), i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 15 mL), i kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio terc-butil (3-fluoropropil)(2-((5-metoksi-4-((1R,3R)-3-metil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)piridin-2-il)oksi)etil)karbamat (370 mg, 81%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C): 1,09 (3H, d), 1,14 - 1,35 (9H, m), 1,67 - 1,85 (2H, m), 2,54 - 2,61 (1H, m), 2,69 -2,76 (1H, m), 2,96 - 3,04 (1H, m), 3,17 - 3,29 (3H, m), 3,35 - 3,57 (3H, m), 3,90 (3H, s), 4,09 - 4,25 (2H, m), 4,33 (2H, dt), 5,31 (1H, s), 5,90 (1H, s), 6,93 - 7,09 (2H, m), 7,22 - 7,26 (1H, m), 7,46 (1H, d), 7,91 (1H, s), 10,58 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 595.

Primer 13

Priprema N-(2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amina

[0318]

1

[0319] Mravlja kiselina (5 mL) je dodata terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamatu (0,15 g, 0,25 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen jonoizmenjivačkom hromatografijom koristeći SCX-2 patronu i eluiranjem sa amonijakom u metanolu (3N). Fragmenti proizvoda su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je dalje prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 10% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)-3-fluoropropan-1-amin (84 mg, 67%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,65 - 1,83 (2H, m), 2,58 - 2,65 (3H, m), 2,70 -2,88 (4H, m), 3,17 - 3,27 (1H, m), 3,33 - 3,42 (1H, m), 4,01 (2H, t), 4,27 (1H, dd), 4,40 (1H, t), 4,42 - 4,60 (4H, m), 5,27 (1H, s), 6,87 - 7,03 (3H, m), 7,10 - 7,22 (2H, m), 7,40 (1H, d), 10,60 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 506.

[0320] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata su opisane u nastavku.

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0321]

[0322] 3-Bromo-2,6-difluorobenzaldehid (0,973 g, 4,40 mmol) je dodata rastvoru (R)-N-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (1,1 g, 4,2 mmol) u toluenu (18 mL) i sirćetnoj kiselini (2 mL), i reakcija je zagrejana na 80 °C tokom 18 sati. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata,

1

filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 50% EtOAc u heksanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (1,4 g, 72%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,11 (3H, d), 2,59 (1H, dd), 2,71 - 2,85 (2H, m), 3,20 - 3,29 (1H, m), 3,32 - 3,39 (1H, m), 4,28 (1H, dd), 4,44 - 4,61 (3H, m), 5,30 (1H, s), 6,93 - 6,98 (1H, m), 6,99 - 7,04 (1H, m), 7,05 - 7,12 (1H, m), 7,20 (1H, d), 7,41 (1H, d), 7,74 (1H, td), 10,64 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 465.

Priprema terc-butil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata [0323]

[0324] Toluen (4,5 mL) je dodat smeši (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (0,25 g, 0,54 mmol) i terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,238 g, 1,07 mmol). Reakciona boca je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom. Cezijum karbonat (0,438 g, 1,34 mmol) i RockPhos pred-katalizator treće generacije (0,046 g, 0,05 mmol) su dodati, i reakciona smeša je ponovo podvrgnuta vakuumu i zatim ponovo napunjena sa azotom. Reakcija je zagrejana na 100 °C tokom 1 sata pre nego što je ohlađena do sobne temperature i filtrirana kroz celit koristeći DCM pranje. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 2 do 10% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio tercbutil (2-(2,4-difluoro-3-((1R,3R)-2-((3-fluorooksetan-3-il)metil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)fenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (151 mg, 46%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,33 - 1,39 (9H, m), 1,78 -1,89 (2H, m), 2,58 (1H, br dd), 2,72 - 2,84 (2H, m), 3,18 - 3,30 (3H, m), 3,34 - 3,40 (2H, m), 3,45 - 3,53 (2H, m), 4,07 (2H, br t), 4,28 (1H, br dd), 4,35 (1H, t), 4,42 - 4,58 (3H, m), 5,27

1

(1H, s), 6,91 - 6,97 (2H, m), 6,97 - 7,02 (1H, m), 7,13 - 7,21 (2H, m), 7,40 (1H, d), 10,60 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 606.

Primer 14

3-((1R,3R)-1-(2,6-difluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2,2-difluoropropan-1-ol

[0325]

Terc-Butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,55 g, 0,90 mmol) je rastvoren u mravljoj kiselini (5 mL). Reakciona smeša je zagrejana do 40 °C tokom 1 sata i reakciona smeša je isparena. Sirov proizvod je prečišćen sa obrnutom fazom fleš silika hromatografije (Puriflash HP C18, 30µ silicijum dioksid, 120 g), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente kako bi se dobio 3-((1R,3R)-1-(2,6-difluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2,2-difluoropropan-1-ol kao pena (0,230 g, 50%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,18 (3H, d), 1,82 - 1,93 (2H, m), 2,68 (1H, ddd), 2,80 (2H, t), 2,83 - 2,93 (1H, m), 2,96 - 3,01 (2H, m), 3,11 (1H, ddd), 3,25 (1H, dt), 3,61 - 3,78 (3H, m), 4,06 - 4,12 (2H, m), 4,52 (2H, dt), 5,29 (1H, s), 6,84 (1H, td), 6,96 (1H, td), 7,09 - 7,16 (2H, m), 7,21 - 7,24 (1H, m), 7,45 (1H, s), 7,50 - 7,54 (1H, m) (2 H not observed). M/z: ES- [M-H]- 510.

[0326] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat pripremljen je kako sledi:

Priprema (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola

[0327]

11

[0328] Rastvoru (R)-N-(1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amina (1,12 g, 2,21 mmol) u toluenu (15 mL) i sirćetnoj kiselini (1,67 mL) je dodat 3-bromo-2,6-difluorobenzaldehid (0,624 g, 2,82 mmol). Rastvor je zagrejana do 90 °C i mešan tokom 16 sati. Reakciona smeša je isparena i ostatak je podeljen između DCM i 2M NaOH (50 mL svaki). Organska faza je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 25% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (1,070 g, 68%) kao bela pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,05 (9H, s), 1,16 (3H, d), 2,61 (1H, ddd), 2,71 - 2,81 (1H, m), 2,99 (1H, ddd), 3,25 - 3,38 (1H, m), 3,57 - 3,69 (2H, m), 3,91 - 4,01 (1H, m), 5,36 (1H, s), 6,65 - 6,71 (1H, m), 7,08 - 7,16 (2H, m), 7,21 - 7,25 (1H, m), 7,36 - 7,44 (8H, m), 7,51 - 7,55 (1H, m), 7,60 -7,66 (4H, m).

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0329]

[0330] RockPhos Pd G3 (0,063 g, 0,08 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indola (1,07 g, 1,51 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,667 g, 3,02 mmol) i cezijum karbonata (1,23 g, 3,77 mmol) u toluenu (15 mL) i reakcija je zagrejana do 90 °C tokom 5 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i razređena je sa vodom (15 mL). DCM (30 mL) je dodat i organska faza je razdvojena i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,850 g, 66%) kao mrka pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,04 (9H, s), 1,15 (3H, d), 1,43 (9H, s), 1,84 - 1,99 (2H, m), 2,60 (1H, dd), 2,74 - 2,85 (1H, m), 3,00 (1H, ddd), 3,23 -3,34 (1H, m), 3,35 - 3,41 (2H, m), 3,45 - 3,62 (3H, m), 3,65 - 3,72 (1H, m), 3,93 - 4,09 (3H, m), 4,33 - 4,49 (2H, m), 5,33 (1H, s), 6,62 (1H, s), 6,77 - 6,85 (1H, m), 7,07 - 7,14 (2H, m), 7,20 - 7,23 (1H, m), 7,33 - 7,44 (6H, m), 7,49 - 7,52 (1H, m), 7,56 (1H, s), 7,58 - 7,66 (4H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 850.

Priprema terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata

[0331]

[0332] Tetrabutilamonijum fluorid (1,0 M u THF) (1,50 mL, 1,50 mmol) je dodat rastvoru terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamata (0,850 g, 1,00 mmol) u tetrahidrofuranu (10 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 90 minuta i zatim je reakciona smeša isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 80% EtOAc u heptanu. Proizvod koja sadrži fragmente je isparen do suvoće kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(2,2-difluoro-3-hidroksipropil)-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (0,550 g, 90%) kao bezbojna pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,18 (3H, d), 1,44 (9H, s), 1,88 - 2,02 (2H, m), 2,69 (1H, ddd), 2,83 - 2,93 (1H, m), 3,13 (1H, dd), 3,21 - 3,32 (2H, m), 3,39 - 3,44 (2H, m), 3,47 - 3,79 (6H, m), 4,16 (1H, s), 4,45 (2H, dt), 5,28 (1H, s), 6,82 (1H, td), 6,96 (1H, s), 7,08 - 7,15 (2H, m), 7,23 (1H, d), 7,49 - 7,65 (2H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 612.

Primer 15

3-((1R,3R)-1-(2,6-difluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)fenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2,2-difluoropropan-1-ol

[0333]

[0334] TBAF rastvor (1M u THF) (1,58 mL, 1,58 mmol) je dodat do terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamatu (275 mg, 0,32 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcija je razređena sa DCM (10 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (10 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (10 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je provučen kroz čep od silika gela, eluiranje sa 1:1 EtOAc/heptanom. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova kao bledo žuta guma (∼200mg). Ostatak je rastvoren u mravljoj kiselini (2 mL) i mešan na 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće.

11

Uzorak je rastvoren u MeOH i dalje prečišćen koristeći SFC: Kolona: fenomeneks A1, 30 x 250 mm, 5 mikron; Mobilna faza: 20% MeOH 0,1% NH3/ 80% sc CO2; stopa protoka: 100 ml/minut; Temperatura: 40 °C; BPR: 120 bar, kako bi se dobio 3-((1R,3R)-1-(2,6-difluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)fenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2,2-difluoropropan-1-ol (72,6 mg, 77%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,18 (3H, d), 1,82 - 1,95 (2H, m), 2,62 (1H, dd), 2,80 (2H, t), 2,87 (1H, dd), 2,97 - 3,01 (2H, m), 3,07 (1H, dd), 3,19 - 3,28 (1H, m), 3,56 - 3,82 (2H, m), 4,04 - 4,17 (2H, m), 4,52 (3H, dt), 5,28 (1H, s), 6,82 - 6,91 (2H, m), 6,97 (1H, td), 7,14 (2H, td), 7,43 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 530.

[0335] Terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Terc-butil(R)-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)karbamat

[0336]

[0337] 5-fluoro-1H-indol (9,34 g, 69,11 mmol) je rastvoren u DCM (470 ml) i ohlađen do -78 °C. Rastvor metilmagenzijum bromida (23,50 mL, 70,50 mmol) je dodat kapanjem tokom 10 minuta, zatim je terc-butil (R)-4-metil-1,2,3-oksathiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksid (6,56 g, 27,65 mmol) u DCM (15 mL) dodat kapanjem. Reakcija je mešana na - 78 °C tokom 30 minuta, zatim joj je omogućeno da se zagreje do 0 °C tokom 2 sata. Ledeno hladni 1M rastvor vodene limunske kiseline je dodat (80 mL) i bifazna smeša je mešana tokom 10 minuta. Slojevi su razdvojeni, zatim je vodeni sloj ekstrahovan sa DCM (2 x 100 mL).

Kombinovana organska materija je oprana sa H2O (50 mL), zasićenim vodeni natrijum hloridom (50 mL) zatim je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (R)-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)karbamat (5,56 g, 69%) kao braon čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,12 (3H, d), 1,43 (9H, s), 2,87 (2H, td), 3,93 - 4,08 (1H, m), 4,36 - 4,51 (1H, m), 6,93 (1H, td), 7,05 (1H, d), 7,23 - 7,29 (2H, m), 8,11 (1H, s); m/z: ES-[M+H]+ 291.

(R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amin

[0338]

[0339] Rastvoru terc-butil (R)-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)karbamata (5,5 g, 18,81 mmol) u DCM (40 ml) je dodata trifluorosirćetna kiselina (1,45 mL, 18,81 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Reakcija je koncentrovana u vakuumu, ponovo rastvorena u metanolu i primenjena na unapred ovlaženu (metanol) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa metanolom (250 mL), proizvod je eluiran sa 1M NH3u rastvoru metanola (250 mL) i koncentrovana u vakuumu kako bi se dobio (R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amin (3,56 g, 98%) kao žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,16 (3H, d), 2,62 (1H, dd), 2,82 (1H, dd), 3,27 (1H, ddt), 6,9 - 7,01 (1H, m), 7,09 (1H, s), 7,22 - 7,32 (2H, m), 8,16 (1H, s); m/z: ES+ [M-H]- 191.

(R)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoro-N-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)propan-1-amin

[0340]

[0341] 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (1,44 g, 2,99 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amina (0,500 g, 2,6 mmol) i DIPEA (0,674 ml, 3,90 mmol) u 1,4-dioksanu (9,73 ml). Reakcija je zagrejana do 80 °C tokom 6 sati. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent

11

eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoro-N-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)propan-1-amin (1,13 g, 83%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,04 (9H, s), 1,11 (3H, d), 2,68 - 2,77 (1H, m), 2,81 (1H, dd), 3,02 - 3,26 (3H, m), 3,74 - 3,88 (2H, m), 6,93 (1H, td), 7,03 (1H, d), 7,18 - 7,25 (2H, m), 7,38 (4H, ddd), 7,4 - 7,49 (2H, m), 7,65 (4H, dq), 7,85 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 525.

(1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol

[0342]

[0343] (R)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoro-N-(1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)propan-1-amin (352 mg, 0,67 mmol) i 3-bromo-2,6-difluorobenzaldehid (155 mg, 0,70 mmol) su zagrejani u toluenu (3,02 mL) / sirćetnoj kiselini (0,33 mL) do 80 °C tokom 4 sata. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim rastvorom NaHCO3(25 mL), zatim osušen preko Na2SO4i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 25% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (483 mg, 99%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,05 (9H, s), 1,16 (3H, d), 2,54 (1H, dd), 2,76 (1H, td), 2,89 - 2,98 (1H, m), 3,29 (1H, ddd), 3,56 - 3,69 (2H, m), 3,95 (1H, ddd), 5,35 (1H, s), 6,70 (1H, td), 6,88 (1H, td), 7,11 - 7,18 (2H, m), 7,34 - 7,47 (8H, m), 7,6 - 7,67 (4H, m); m/z: ES+ [M+H]+ 727.

terc-butil(2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat

[0344]

11

[0345] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (137 mg, 0,62 mmol) u toluenu je dodat (2,06 mL) boci koja sadrži (1R,3R)-1-(3-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (300 mg, 0,41 mmol), cezijum karbonat (268 mg, 0,82 mmol) i Rockphos predkatalizator treće generacije (18,65 mg, 0,02 mmol). Reakcija je degazirana, zatim je zagrejana do 90 °C tokom 2 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razređena sa EtOAc (25 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4i je isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (2-(3-((1R,3R)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-6-fluoro-3-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-1-il)-2,4-difluorofenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,04 (9H, s), 1,15 (3H, d), 1,43 (9H, s), 1,91 (2H, d), 2,53 (1H, dd), 2,79 (1H, q), 2,92 - 3 (1H, m), 3,21 - 3,35 (1H, m), 3,35 - 3,4 (1H, m), 3,41 - 3,54 (2H, m), 3,53 - 3,63 (2H, m), 3,63 - 3,74 (1H, m), 3,89 - 4,01 (1H, m), 4,03 (1H, s), 4,09 (1H, d), 4,37 (1H, d), 4,46 (1H, s), 5,31 (1H, s), 6,63 (1H, s), 6,76 - 6,89 (2H, m), 7,06 - 7,12 (1H, m), 7,14 (1H, dd), 7,33 - 7,47 (6H, m), 7,60 (3H, ddd), 7,63 - 7,68 (2H, m).

Primer 55

(S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0346]

11

[0347] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (235 mg, 1,06 mmol) je dodat u nevodenom toluenu (4,25 mL) boci koja sadrži metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (402 mg, 0,85 mmol), cezijum karbonat (553 mg, 1,70 mmol) i Rockphos pred-katalizator treće generacije (38,5 mg, 0,04 mmol). Reakcija je degazirana, zatim je zagrejana do 90 °C tokom 4 sata. Dodatni deo terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (235 mg, 1,06 mmol) i Rockphos pred-katalizatora treće generacije (38,5 mg, 0,04 mmol) su dodati i reakcija je zagrejana do 90 °C preko noći. Ostatak je rastvoren u THF (3 mL) / MeOH (3 mL) i zatim je dodat 2N NaOH rastvor (1,5 mL). Reakcija je mešana tokom 3 sata, zatim razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL). pH je prilagođen do ∼6 dodavanjem 2N HCl rastvora i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL), zatim je isparena kombinovana organska materija. Ostatak je rastvoren u mravljoj kiselini (2 mL) i mešan na 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je ostatak podeljen između DCM (20 mL) i vode (20 mL). Željeni proizvod je primećen samo u vodenoj fazi. Vodena faza je isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (83 mg, 20%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,86 (3H, d), 1,20 (3H, d), 1,82 - 1,97 (5H, m), 2,68 - 2,80 (3H, m), 2,83 (3H, t), 2,94 - 3,07 (2H, m), 3,21 (1H, dd), 3,42 (2H, s), 3,54 - 3,65 (1H, m), 4,02 (1H, q), 4,40 (1H, t), 4,50 (1H, t), 5,47 (1H, s), 6,18 (1H, s), 6,77 (1H, dd), 6,89 (1H, t), 7,09 (2H, td), 7,14 - 7,22 (1H, m), 7,48 -7,52 (1H, m), 7,82 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]<+>500.

[0348] Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Metil(S)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat

[0349]

11

[0350] Trifluorometansulfonski anhidrid (3,53 mL, 21,00 mmol), praćen sa 2,6-dimetilpiridinom (2,56 mL, 22,00 mmol), dodati je rastvoru metil (S)-3-hidroksi-2-metilpropanoata (2,36 g, 20,0 mmol) u DCM (74 mL) na 5 °C. Reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je oprana sa 2N HCl rastvorom (50 mL). Organska faza je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (50 mL), zatim osušena preko Na2SO4i isparena je kako bi se dobio metil (S)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat (5,46 g, >100%) kao crveno ulje koje je direktno korišćeno.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,31 (3H, d), 2,96 (1H, pd), 3,75 (3H, s), 4,56 (1H, dd), 4,69 (1H, dd).

Metil(S)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat

[0351]

[0352] Metil (S)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat (4,60 g, 18,40 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (2,79 g, 16 mmol) i DIPEA (3,59 mL, 20,80 mmol) u 1,4-dioksanu (42,1 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je razređena sa EtOAc (100 mL) i oprana sa vodom (100 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (50 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (3,71 g, 85%) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,11 (3H, d), 1,21 - 1,25 (3H, m), 2,72 (1H, ddd), 2,79 (1H, dd), 2,86 (1H, dd), 2,93 (2H, d), 3,13 (1H, q), 3,50 (3H, s), 7,08 - 7,15 (2H, m), 7,20 (1H, ddd), 7,38 (1H, dt), 7,49 - 7,69 (1H, m), 8,23 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 275.

3-Bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid

[0353]

11

[0354] N-bromo sukcinimid (2,99 g, 16,80 mmol) je dodat 2-fluoro-6-metilbenzaldehidu (2,21 g, 16,0 mmol) u H2SO4(16,00 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Smeša je sipana u ledenu vodu (150 mL). Talog je prikupljen filtracijom i osušen kako bi se dobio 3-bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid (3,14 g, 90%) kao bež, sporo-topljiva čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 2,70 (3H, s), 6,94 (1H, ddd), 7,74 (1H, dd), 10,46 (1H, s).

Metil(S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0355]

[0356] Metil (S)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (549 mg, 2,0 mmol) i 3-bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid (456 mg, 2,10 mmol) su zagrejani u toluenu (9,0 mL) / sirćetnoj kiselini (1,0 mL) do 80 °C preko noći. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Sirov proizvod je prečišćen sa jonoizmenjivačkom hromatografijom, koristeći SCX kolonu. Željeni proizvod je eluiran od kolone koristeći MeOH, zatim 1M NH3/MeOH kako bi se eluirao proizvod. Bazni filtrat je isparen, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (421 mg, 44%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,85 - 0,89 (3H, m), 1,11 (3H, d), 2,10

12

[0357] (3H, s), 2,18 (1H, p), 2,36 (1H, ddd), 2,67 - 2,72 (1H, m), 2,95 (1H, dd), 3,10 (1H, ddd), 3,52 - 3,59 (1H, m), 3,64 (3H, s), 5,39 (1H, s), 6,89 (1H, t), 7,07 - 7,14 (2H, m), 7,19 -7,22 (1H, m), 7,22 (1H, s), 7,47 - 7,51 (1H, m), 7,54 (1H, dd). M/z: ES- [M-H]- 471.

Primer 57

(S)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0358]

[0359] 2N NaOH rastvor (1,19 mL, 2,37 mmol) je dodat rastvoru metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,300 g, 0,47 mmol) u THF (2,37 mL) / MeOH (1,19 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Reakcija je razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL), zatim je pH prilagođen do ∼6 dodavanjem 2N HCl rastvora. Slojevi su razdvojeni i vodeni je ekstrahovan sa EtOAc (10 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i isparena je. Ostatak je rastvoren u mravljoj kiselini (2 mL) i zagrejan do 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (0,147 g, 60%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,84 (3H, d), 1,17 (3H, d), 1,83 - 1,89 (4H, m), 1,92 (2H, dd), 2,65 (2H, dd), 2,80 (1H, dd), 2,86 (2H, t), 3 - 3,1 (2H, m), 3,1 - 3,2 (1H, m), 3,55 - 3,65 (1H, m), 4,03 (2H, dq), 4,38 (1H, t), 4,48 (1H, t), 5,42 (1H, s), 6,73 (1H, dd), 6,78 - 6,83 (1H, m), 6,83 - 6,89 (1H, m), 7,07 (1H, dd), 7,11 (1H, dd), 7,54 (1H, s), 8,00 (1H, s).1 zamenljiv nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 518.

[0360] Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Metil (S)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat [0361]

[0362] Ohlađenom rastvoru (R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amina (1,105 g, 5,75 mmol) i DIPEA (0,993 mL, 5,75 mmol) u dioksanu (15 mL) na 0 °C je dodat metil (S)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat (1,44 g, 5,75 mmol). Reakciji je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana preko noći. Reakcija je razređena sa EtOAc (50 mL) i oprana sa vodom (50 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (1,520 g, 90%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,13 (3H, d), 1,26 - 1,29 (3H, m), 2,67 - 2,85 (2H, m), 2,86 -2,98 (3H, m), 3,14 (1H, h), 3,53 (3H, s), 6,95 (1H, td), 7,17 - 7,23 (2H, m), 7,30 (1H, dd), 8,37 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 293.

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0363]

[0364] Metil (S)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (439 mg, 1,5 mmol) i 3-bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid (326 mg, 1,50 mmol) su zagrejani u toluenu (6,75 mL) / sirćetnoj kiselini (0,75 mL) do 110 °C preko noći. Isparljive materije su isparene, zatim je ostatak rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim NaHCO3rastvorom (25 mL). Organska materija je osušen apreko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (204 mg, 28%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,87 (3H, d), 1,11 (3H, d), 2,10 (3H, s), 2,16 (1H, q), 2,35 (1H, ddd), 2,63 (1H, d), 2,95 (1H, dd), 3,07 (1H, ddd), 3,52 - 3,59 (1H, m), 3,64 (3H, s), 5,37 (1H, s), 6,84 (1H, td), 6,90 (1H, t), 7,08 -7,15 (2H, m), 7,20 (1H, s), 7,55 (1H, dd). M/z: ES+ [M+H]+ 491.

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0365]

[0366] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (342 mg, 1,55 mmol) u toluenu je dodat (6,18 mL) boci koja sadrži metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (380 mg, 0,77 mmol), cezijum karbonat (628 mg, 1,93 mmol) i Rockphos pred-katalizator treće generacije (70,0 mg, 0,08 mmol). Reakcija je degazirana, zatim je zagrejana do 105 °C tokom 3 sata. Reakcija je razređena sa DCM (25 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4i isparen je, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (321 mg, 66%) kao bež čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 632.

Primer 117

12

(R)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0367]

[0368] (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (200 mg, 0,33 mmol) je mešan u mravljoj kiselini (2,0 mL) na 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (120 mg, 72%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,80 (3H, s), 1,88 (2H, dq), 2,56 (1H, t), 2,71 - 2,90 (5H, m), 2,95 (1H, s), 2,99 - 3,07 (1H, m), 3,22 - 3,32 (1H, m), 3,85 (1H, p), 4,06 (2H, t), 4,45 (1H, t), 4,55 (1H, t), 5,35 (1H, s), 6,84 (1H, dd), 6,93 (1H, d), 7,08 - 7,17 (2H, m), 7,19 - 7,23 (1H, m), 7,38 (1H, s), 7,51 (1H, dd). (2 x zamenljivi nisu primećeni.); m/z: ES+ [M+H]+ 500.

[0369] (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina, koja je korišćena kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Metil (R)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat

[0370]

[0371] Trifluorometansulfonski anhidrid (7,48 mL, 44,44 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-hidroksi-2-metilpropanoata (5,00 g, 42,3 mmol) u DCM (128 mL) na 5 °C, praćeno sa dodavanjem 2,6-dimetilpiridina (5,42 mL, 46,6 mmol). Reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je oprana sa 2N HCl rastvor (100 mL), osušena preko MgSO4i isparena kako bi se dobio metil (R)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat (11,64 g, >100%) kao crveno ulje koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,31 (3H, d), 2,91 - 3,03 (1H, m), 3,75 (3H, s), 4,56 (1H, dd), 4,69 (1H, dd).

Metil (R)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat

[0372]

[0373] Metil (R)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoat (10,46 g, 41,80 mmol) je dodat u DCM (20 mL) rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (6,62 g, 38,0 mmol) i DIPEA (8,21 mL, 47,5 mmol) u DCM (107 mL) na 5 °C. Reakcija je zagrejana do sobne temperature i mešana preko noći. Reakcija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (50 mL), zatim osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (8,45 g, 81%) kao narandžasta tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,12 (3H, d), 2,53 - 2,71 (2H, m), 2,74 - 2,89 (2H, m), 2,94 (1H, dd), 3,05 (1H, h), 3,48 (3H, s), 7,04 (1H, d), 7,11 (1H, ddd), 7,18 (1H, ddd), 7,35 (1H, dt), 7,53 - 7,64 (1H, m), 8,12 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen); m/z: ES+ [M+H]+ 275.

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0374]

12

[0375] Metil (R)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (686 mg, 2,50 mmol) i 3-bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid (570 mg, 2,63 mmol) su zagrejani u toluenu (9,0 mL) / sirćetnoj kiselini (1,0 mL) do 90 °C tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakciona smeša je isparena. Ostatak je rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (795 mg, 67%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,01 - 1,05 (3H, m), 1,09 (3H, d), 2,03 (3H, s), 2,57 - 2,64 (3H, m), 2,69 - 2,75 (1H, m), 3,08 - 3,14 (1H, m), 3,52 (3H, s), 3,66 - 3,74 (1H, m), 5,31 (1H, s), 6,90 (1H, t), 7,05 - 7,14 (2H, m), 7,18 - 7,22 (2H, m), 7,49 (1H, dd), 7,54 (1H, dd); m/z: ES+ [M+H]+ 473.

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0376]

[0377] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (351 mg, 1,58 mmol) u toluenu je dodat (5,0 mL) boci koja sadrži metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (500 mg, 1,06 mmol), cezijum karbonat (858 mg, 2,64 mmol) i rockphos pred-katalizator treće generacije (45,1 mg, 0,05 mmol) pod azotom. Reakcija je degazirana, zatim je zagrejana do 90 °C tokom 4 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razređena sa DCM (25 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu.

12

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (425 mg, 66%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,03 (3H, d), 1,09 (3H, d), 1,43 (9H, s), 1,82 (3H, s), 1,85 - 1,97 (2H, m), 2,53 - 2,61 (1H, m), 2,61 - 2,68 (1H, m), 2,70 (1H, d), 3,12 (1H, ddd), 3,39 (2H, t), 3,49 (3H, s), 3,52 - 3,59 (3H, m), 3,64 - 3,73 (1H, m), 4,01 (2H, d), 4,36 (1H, s), 4,45 (1H, s), 5,27 (1H, s), 6,79 (1H, dd), 6,91 (1H, t), 7,01 - 7,12 (2H, m), 7,16 - 7,21 (1H, m), 7,23 - 7,26 (1H, m), 7,47 - 7,52 (1H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 614.

(R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0378]

[0379] 2N NaOH rastvor (2,00 mL, 4,00 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (400 mg, 0,65 mmol) u THF (2,5 mL) / MeOH (2,5 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcija je razređena sa EtOAc (25 mL) i vodom (25 mL) zatim je pH prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N HCl rastvora. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (25 mL).

Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (225 mg, 58%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,13 (3H, d), 1,24 (3H, d), 1,41 - 1,47 (9H, m), 1,76 (3H, s), 1,88 (2H, d), 2,57 (1H, t), 2,75 (1H, s), 2,87 (2H, d), 3,29 (1H, d), 3,39 (2H, s), 3,58 (2H, s), 3,82 - 3,96 (1H, m), 4,10 (2H, d), 4,38

12

(1H, s), 4,47 (1H, s), 5,39 (1H, s), 6,84 (1H, s), 6,95 (1H, s), 7,08 - 7,19 (2H, m), 7,23 (1H, d), 7,40 (1H, d), 7,50 - 7,57 (1H, m). (1 x zamenljiv nije primećen.); m/z: ES+ [M+H]+ 600.

Primer 121

(R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0380]

[0381] Vodeni natrijum hidroksid (2N, 0,45 mL, 0,90 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,11 g, 0,18 mmol) u THF (0,54 mL) i MeOH (0,27 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 21 sata. Reakcija je zatim razređena sa vodom, acidifikovana do pH 6 dodavanjem vodenog HCl (2N), i ekstrahovana sa etil acetatom (2x). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (0,095 g, 85%) kao narandžasta guma. Ovaj guma je rastvorena u mravljoj kiselini (1 mL) i mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom SFC (Chiralpak IC, 5 µm, 21,2 mm prečnik, 250 mm dužina, 75 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa izokratskim uslovima (25% MeOH koja sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobio (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (0,034 g, 42%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,88 (3H, d), 0,99 (3H, d), 1,63 - 1,95 (6H, m), 2,52 - 2,65 (4H, m), 2,77 - 2,85 (2H, m), 2,95 (1H, br dd), 3,84 - 4,00 (2H, m), 4,44 (2H, dt), 5,17 (1H, s), 6,77 (1H, td), 6,87 - 6,93 (1H, m), 6,93 - 7,01 (1H, m), 7,08 - 7,15 (2H, m), 10,29 (1H, s). Dva multipleta vodonika su zaklonjena od strane vode; još dva vodonika nisu primećena. M/z: ES+ [M+H]+ 518. Takođe

12

je izolovana (R)-3-((1S,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (0,015 g, 19%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,88 (3H, d), 0,99 (3H, d), 1,63 - 1,95 (6H, m), 2,52 - 2,65 (4H, m), 2,77 - 2,85 (2H, m), 2,95 (1H, br dd), 3,84 - 4,00 (2H, m), 4,44 (2H, dt), 5,17 (1H, s), 6,77 (1H, td), 6,87 - 6,93 (1H, m), 6,93 -7,01 (1H, m), 7,08 - 7,15 (2H, m), 10,29 (1H, s). Dva multipleta vodonika su zaklonjena od strane vode; još dva vodonika nisu primećena. M/z: ES+ [M+H]+ 518.

[0382] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata su opisane u nastavku. Metil (R)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat [0383]

[0384] Rastvor sirovog metil (R)-2-metil-3-(((trifluorometil)sulfonil)oksi)propanoata (0,456 g, 1,82 mmol) u DCM (1 mL) je dodat rastvoru (R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amina (0,35 g, 1,8 mmol) i DIPEA (0,32 mL, 1,8 mmol) u 1,4-dioksanu (7,0 mL) na 0 °C. Reakciji je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je pod ovim uslovima tokom 18 sati. Reakcija je razređena sa etil acetatom i oprana sa vodom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heksanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio metil (R)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (0,33 g, 62%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,96 (3H, d), 1,05 (3H, d), 2,53 - 3,03 (6H, m), 3,52 (3H, s), 6,88 (1H, td), 7,21 (1H, d), 7,24 (1H, dd), 7,31 (1H, dd), 10,92 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 292.

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0385]

12

[0386] Rastvor metil (R)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoata (0,332 g, 1,14 mmol) i 3-bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehida (0,259 g, 1,19 mmol) u toluenu (6,5 mL) i sirćetnoj kiselini (0,72 mL) je zagrejan na 80 °C tokom 24 sata. Temperatura reakcije je povećana do 90 °C, i reakcija je održana pod ovim uslovima tokom 24 sata. Temperatura reakcije je zatim povećana do 100 °C, i reakcija je održana pod ovim uslovima tokom 24 sata. Reakcija je zatim ohlađena, koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u DCM i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heksanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,170 g, 30%) kao bledo žuto čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 491.

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0387]

[0388] Rastvor terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (0,15 g, 0,69 mmol) u toluenu (2,77 mL) je dodat boci koja sadrži metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,17 g, 0,35 mmol), cezijum karbonat (0,28 g, 0,87 mmol) i RockPhos pred-katalizator treće

1

generacije (0,03 g, 0,03 mmol). Rezultujuća smeša je degazirana i zatim je zagrejana na 100 °C tokom 3 sata. Dodatni RockPhos pred-katalizator treće generacije (64 mg) je dodat, i reakcija je održana pod ovim uslovima još jedan sat. Reakciji zatim je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, razređena je sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heksanu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2 metilpropanoat (0,11 g, 52%) kao bež čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 632.

Primer 124

(S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-Difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0389]

[0390] 2M natrijum hidroksid (0,020 mL, 0,04 mmol) je dodat rastvoru metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,007 g, 0,01 mmol) u metanolu (0,2 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim je isparena. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (3,0 mg, 44%) kao suv film.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,91 (3H, d), 1,26 (3H, d), 1,53 - 2,07 (6H, m), 2,71 - 2,87 (4H, m), 2,89 -3,04 (3H, m), 3,29 (1H, d), 3,57 - 3,67 (1H, m), 3,95 - 4,05 (2H, m), 5,54 (1H, s), 5,91 (1H,

1 1

tt), 6,83 (1H, dd), 6,96 (1H, t), 7,10 - 7,17 (2H, m), 7,21 - 7,24 (1H, m), 7,40 (1H, s), 7,49 -7,54 (1H, m). (2 zamenljiva nisu primećena). M/z: ES+ [M+H]+ 518.

[0391] Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butildimetilsilil)oksi)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0392]

[0393] RockPhos pred-katalizator treće generacije (0,018 g, 0,02 mmol) je dodat degaziranoj suspenziji metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,200 g, 0,42 mmol), 2-((tercbutildimetilsilil)oksi)etan-1-ola (0,089 g, 0,51 mmol) i cezijum karbonata (0,344 g, 1,06 mmol) u toluenu (3 mL). Reakcija je zagrejana do 90 °C preko noći i reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi. Reakciona smeša je razređena sa vodom (20 mL) i DCM (50 mL). Organska faza je razdvojena i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu kako bi se dobio nečisti metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butildimetilsilil)oksi)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,038 g, 17%). M/z: ES+ [M+H]+ 569.

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0394]

1 2

[0395] Rastvoru metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butildimetilsilil)oksi)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,038 g, 0,07 mmol) u tetrahidrofuranu (1 mL) je dodat tetrabutilamonijum fluorid (1,0 M u THF, 0,134 mL, 0,13 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata i zatim je isparena do gume koja je rastvorena u dihlorometanu (2 mL) i kojoj je DIPEA (0,035 mL, 0,20 mmol) dodat. Metansulfonil hlorid (8,0 µl, 0,10 mmol) je dodat ovom rastvoru i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je razređena sa DCM (5 mL), oprana sa vodom i organska faza je isparena kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,028 g, 0,05 mmol). M/z: ES+ [M+H]+ 569.

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0396]

[0397] 3,3-Difluoro-1-aminopropan hidrohlorid (8 mg, 0,06 mmol), metil (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,028 g, 0,05 mmol), kalijum karbonat (0,036 g, 0,26 mmol) i natrijum jodid (0,016 g, 0,11 mmol) u acetonitrilu (0,5 mL) su zagrejani do 85 °C pod mikrotalasnim zračenjem tokom 4 sata. Reakciona smeša je podeljena između vode (5 mL) i DCM (5 mL) i organska faza je isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika

1

hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (7,0 mg, 25%) kao čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,87 (3H, d), 1,11 (3H, d), 1,88 (3H, s), 1,93 - 2,04 (2H, m), 2,21 (1H, h), 2,40 (1H, dd), 2,68 (1H, d), 2,82 (2H, t), 2,91 - 3,03 (3H, m), 3,10 (1H, ddd), 3,50 - 3,58 (1H, m), 3,63 (3H, s), 3,90-4,00 (2H, m), 5,34 (1H, s), 5,90 (1H, tt), 6,80 (1H, dd), 6,91 (1H, t), 7,03 - 7,13 (2H, m), 7,15 - 7,22 (1H, m), 7,42 - 7,54 (1H, m). (2 zamenljiva nisu primećena). M/z: ES+ [M+H]+ 532.

Primer 126

(S)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0398]

[0399] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (212 mg, 0,96 mmol) u toluenu je dodat (3,20 mL) boci koja sadrži metil (S)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (275 mg, 0,64 mmol), cezijum karbonat (416 mg, 1,28 mmol) i Rockphos pred-katalizator treće generacije (29,0 mg, 0,03 mmol). Reakcija je degazirana, zatim je zagrejana do 90 °C tokom 4 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razređena sa DCM (20 mL) i zasićenim vodenim natrijum hloridom (20 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL).

Kombinovana organska materija je isparena. Sirov proizvod je rastvoren u THF (2,5 mL) i MeOH (2,5 mL), zatim 2N rastvor NaOH (2,5 mL) je dodat i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom dodatna 2 sata. Reakcija je razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL) i pH je prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N rastvora HCl. Slojevi su razdvojeni, zatim je vodeni sloj ekstrahovan sa EtOAc (2 x 15 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-

1 4

fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (350 mg), koja je nečista. Ostatak je rastvoren u mravljoj kiselini (2 mL) i zagrejan do 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters SunFire kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (65,0 mg, 20%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,96 (3H, d), 1,19 (3H, d), 1,87 (3H, s), 1,90 - 2,05 (3H, m), 2,68 - 2,79 (2H, m), 2,88 (1H, dd), 3,04 (2H, t), 3,19 (1H, d), 3,24 (2H, s), 3,61 (1H, d), 4,44 (2H, dt), 4,52 (1H, t), 4,57 - 4,69 (1H, m), 5,40 (1H, s), 7,07 - 7,17 (2H, m), 7,21 (1H, d), 7,44 - 7,55 (1H, m), 7,84 (1H, s), 8,25 (1H, s), 8,34 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 501.

[0400] Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

2-hloro-5-fluoro-3-metilizonikotinaldehid

[0401]

[0402] LDA rastvor (2M, 3,85 mL, 7,70 mmol) je dodat ohlađenom rastvoru 2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridina (1,02 g, 7,00 mmol) u THF (22,9 mL) na -78 °C. Reakcija je mešana tokom 30 minuta, zatim je metil format (1,30 mL, 21,0 mmol) dodat i reakcija je mešana tokom dodatnih 30 minuta. Reakcija je ugašena dodavanjem 1N rastvora HCl (20 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (40 mL). Organska faza je opran sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2-hloro-5-fluoro-3-metilizonikotinaldehid (754 mg, 62%) kao tečnost boje slame.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 2,65 (3H, s), 8,33 (1H, s), 10,51 (1H, s).

1

Metil (S)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0403]

[0404] Metil (S)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (439 mg, 1,60 mmol) i 2-hloro-5-fluoro-3-metilizonikotinaldehid (292 mg, 1,68 mmol) su zagrejani u toluenu (7,20 mL) / sirćetnoj kiselini (0,80 mL) do 90 °C tokom 5 sati. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Slojevi su razdvojeni, zatim je organska faza osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (S)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (283 mg, 41%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,91 (3H, d), 1,11 (3H, d), 2,10 (3H, s), 2,27 (2H, ddd), 2,72 (1H, d), 3,02 (1H, dd), 3,11 (1H, ddd), 3,53 - 3,60 (1H, m), 3,65 (3H, s), 5,37 (1H, s), 7,09 - 7,17 (2H, m), 7,24 (1H, dd), 7,30 (1H, s), 7,51 (1H, d), 8,20 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 430.

Primer 127

(R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0405]

1

[0406] (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (450 mg, 0,75 mmol) je mešana u mravljoj kiselini (4,0 mL) na 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (302 mg, 81%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,01 (3H, d), 1,12 (3H, d), 1,85 (3H, s), 1,87 -1,98 (2H, m), 2,45 - 2,52 (1H, m), 2,57 (1H, ddd), 2,63 (1H, dd), 2,75 (1H, d), 2,81 (2H, t), 2,89 (1H, ddd), 3,12 (1H, ddd), 3,17 (1H, ddd), 3,73 (1H, q), 4,23 (1H, ddd), 4,40 (1H, t), 4,50 (1H, t), 4,69 (1H, ddd), 5,25 (1H, s), 7,01 - 7,16 (2H, m), 7,20 (1H, dd), 7,41 (1H, s), 7,50 (1H, dd), 7,86 (1H, s). (2 x zamenljivi nisu primećeni); m/z: ES+ [M+H]+ 501.

[0407] (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina, koja je korišćena kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0408]

[0409] Metil (R)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (741 mg, 2,7 mmol) i 2-hloro-5-fluoro-3-metilizonikotinaldehid (492 mg, 2,84 mmol) su zagrejani u toluenu (9,72 mL) / sirćetnoj kiselini (1,08 mL) do 90 °C tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakciona smeša je isparena. Ostatak je rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je

1

prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (950 mg, 82%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,04 (3H, d), 1,09 (3H, d), 2,01 (3H, s), 2,46 - 2,57 (1H, m), 2,62 - 2,70 (2H, m), 2,75 (1H, d), 3,11 (1H, ddd), 3,53 (3H, s), 3,68 - 3,78 (1H, m), 5,30 (1H, s), 7,08 - 7,18 (2H, m), 7,21 - 7,26 (1H, m), 7,46 - 7,52 (1H, m), 7,53 (1H, s), 8,15 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 430.

Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0410]

[0411] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (581 mg, 2,63 mmol) je dodat suspenziji metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (752 mg, 1,75 mmol), cezijum karbonata (1,42 g, 4,38 mmol) i rockphos pred-katalizatora treće generacije (74,7 mg, 0,09 mmol) u degaziranom toluenu (8,75 mL). Reakcija je zagrejana do 90 °C i mešana tokom 4 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razređena sa DCM (25 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (571 mg, 53%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,04 (3H, d), 1,08 (3H, d), 1,42 (9H, d), 1,82 (3H, s), 1,84 - 2,00 (2H, m), 2,50 - 2,60 (1H, m), 2,60 - 2,77 (3H, m), 3,10 (1H, ddd), 3,30 - 3,41 (2H, m), 3,51 (3H, s), 3,53 - 3,61 (2H, m), 3,65 - 3,73 (1H, m), 4,31 - 4,44 (3H,

1

m), 4,46 (1H, t), 5,22 (1H, s), 7,10 (2H, dqt), 7,20 (1H, dd), 7,27 - 7,40 (1H, m), 7,49 (1H, dd), 7,88 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 615.

(R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0412]

[0413] 2N rastvor NaOH (2,68 mL, 5,37 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (550 mg, 0,89 mmol) u THF (3,1 mL) / MeOH (3,1 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim je razređena sa EtOAc (25 mL) i voda (25 mL). pH je prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N rastvora HCl i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (25 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je provučen kroz čep od silika gela, eluiranjem sa EtOAc. Filtrat je isparen kako bi se dobila (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-5-fluoro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (492 mg, 92%) kao bež čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 601.

Primer 143

(S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0414]

1

[0415] Jodometan (6,85 µl, 0,11 mmol) je dodat rastvoru (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanske kiseline (50 mg, 0,10 mmol) i DIPEA (51,9 µl, 0,30 mmol) u acetonitrilu (0,95 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (14,4 mg, 28%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,90 (3H, d), 1,27 (3H, d), 1,70 - 1,90 (5H, m), 2,32 (3H, s), 2,57 (2H, t), 2,67 - 2,77 (1H, m), 2,77 - 2,82 (4H, m), 2,96 (1H, dd), 3,29 (1H, d), 3,55 - 3,68 (1H, m), 4,00 (2H, t), 4,42 (1H, t), 4,51 (1H, t), 5,55 (1H, s), 6,83 (1H, dd), 6,95 (1H, t), 7,13 (2H, dtd), 7,22 (1H, dd), 7,46 (1H, s), 7,48 - 7,58 (1H, m). (1 x zamenljiv nije primećen). M/z: ES+ [M+H]+ 514.

Primer 145

(S)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0416]

[0417] Metil (S)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoat (151 mg, 0,55 mmol) i 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid (300 mg, 50% težine, 0,55 mmol) su zagrejani u toluenu (2,50 mL) / sirćetnoj kiselini (0,278 mL) do 90 °C tokom 4 sata. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvor (20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent

14

eluiranja 100% EtOAc. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobila žuta guma (300 mg). Ostatak je rastvoren u THF (2 mL) i metanol (2 mL), zatim je dodat 2N rastvor NaOH (2 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata.

Reakcija je razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL). pH je prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N rastvora HCl, zatim su slojevi razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL), zatim su kombinovani organski slojevi osušeni preko Na2SO4i ispareni do suvoće. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (S)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (98 mg, 35%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,99 (3H, d), 1,23 (3H, d), 1,77 - 1,86 (2H, m), 1,87 (3H, d), 2,32 (3H, s), 2,59 (2H, t), 2,72 - 2,90 (6H, m), 3,21 (1H, d), 3,54 - 3,64 (1H, m), 4,36 (1H, ddd), 4,40 (1H, t), 4,43 - 4,48 (1H, m), 4,50 (1H, t), 5,43 (1H, s), 7,14 (2H, dtd), 7,24 (1H, d), 7,52 (2H, d), 7,90 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 515.

[0418] 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid, koji je korišćen kao početni materijal, pripremljen je kako sledi:

2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etan-1-ol

[0419]

[0420] 1-Fluoro-3-jodopropan (5,64 g, 30,0 mmol) je dodat suspenziji 2-(metilamino)etan-1-ola (2,65 mL, 33,0 mmol) i kalijum karbonata (8,28 g, 60,0 mmol) u acetonitrilu (88 mL). Reakcija je zagrejana do 50 °C tokom 2 sata, zatim ohlađena i mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Isparljive materije su isparene, zatim je ostatak podeljen između EtOAc (80 mL) i voda (80 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (4 x 50 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena je kako bi se dobio 2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etan-1-ol (3,95 g, 97%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,88 (2H, ddd), 2,27 (3H, s), 2,51 - 2,62 (4H, m), 3,55 - 3,65 (2H, m), 4,47 (1H, t), 4,56 (1H, t).

N-(2-((3-hloro-5-fluoropiridin-2-il)oksi)etil)-3-fluoro-N-metilpropan-1-amin

[0421]

[0422] Natrijum hidrid (0,308 g, 7,69 mmol) je dodat rastvoru 2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etan-1-ola (1,040 g, 7,69 mmol) u THF (26,8 mL). Nakon mešanja tokom 10 minuta, 3-hloro-2,5-difluoropiridin (1,00 g, 6,69 mmol) je dodat i mešanje je nastavljeno tokom 1 sata. Reakcija je ugašena dodavanjem voda (50 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (2 x 50 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko MgSO4, filtrirana i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(2-((3-hloro-5-fluoropiridin-2-il)oksi)etil)-3-fluoro-N-metilpropan-1-amin (1,630 g, 92%) kao bezbojna tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,81 - 1,95 (2H, m), 2,36 (3H, s), 2,57 - 2,64 (2H, m), 2,83 (2H, t), 4,44 (2H, t), 4,47 (1H, t), 4,57 (1H, t), 7,46 (1H, dd), 7,90 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 265.

3-fluoro-N-(2-((5-fluoro-3-metilpiridin-2-il)oksi)etil)-N-metilpropan-1-amin

[0423]

[0424] XPhos pred-katalizator druge generacije (0,122 g, 0,16 mmol) i kalijum karbonat (1,720 g, 12,47 mmol) su dodati rastvoru N-(2-((3-hloro-5-fluoropiridin-2-il)oksi)etil)-3-fluoro-N-metilpropan-1-amina (1,65 g, 6,23 mmol) i 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioksatriborinana (0,436 mL, 3,12 mmol) u 1,4-dioksanu (25,6 mL) / vodi (5,1 mL). Reakcija je degazirana i zagrejana je do 90 °C tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razređena sa EtOAc (50 mL) i vodom (50 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni je ekstrahovan sa EtOAc (25 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 3-fluoro-N-(2-((5-fluoro-3-metilpiridin-2-il)oksi)etil)-N-metilpropan-1-amin (1,50 g, 99%) kao svetlo braon tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,82 - 1,94 (2H, m), 2,19 (3H, t), 2,35 (3H, s), 2,58 - 2,63 (2H, m), 2,81 (2H, t), 4,38 (2H, t), 4,47 (1H, t), 4,56 (1H, t), 7,15 - 7,19 (1H, m), 7,78 - 7,82 (1H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 245.

5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid

[0425]

[0426] LDA rastvor (2M, 3,84 mL, 7,68 mmol) je dodat boci osušenoj u rerni koja sadrži 3-fluoro-N-(2-((5-fluoro-3-metilpiridin-2-il)oksi)etil)-N-metilpropan-1-amin (1,5 g, 6,14 mmol) u THF (20,0 mL). Reakcija je mešana tokom 30 minuta, zatim je metil format (0,946 mL, 15,4 mmol) dodat i reakcija je mešana tokom dodatnih 30 minuta. Reakcija je ugašena dodavanjem vode (25 mL) i ekstrahovana je sa EtOAc (2 x 40 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko MgSO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid kao bledo žuta tečnost, koji je zagađen sa nereagovanim početnim materijalom u odnosu 1:1. M/z: ES+ [M+H]+ 273.

Primer 152

(R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina [0427]

[0428] Rastvor formaldehida (37% vol, 0,021 mL, 0,29 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-

14

tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanske kiseline (90 mg, 0,18 mmol) u DCM (1,5 mL). Nakon mešanja tokom 5 minuta, natrijum triacetoksihidroborat (61,0 mg, 0,29 mmol) je dodat i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcija je razređena sa DCM (10 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (10 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni je ekstrahovan sa DCM (2 x 10 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (63,0 mg, 68%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,03 (3H, d), 1,13 (3H, d), 1,70 - 1,96 (5H, m), 2,32 (3H, s), 2,46 - 2,55 (1H, m), 2,55 - 2,60 (1H, m), 2,60 - 2,65 (2H, m), 2,68 (2H, dt), 2,77 (1H, d), 2,96 (1H, ddd), 3,12 - 3,24 (1H, m), 3,64 - 3,79 (1H, m), 4,25 (1H, ddd), 4,37 (1H, t), 4,47 (1H, t), 4,64 (1H, dt), 5,25 (1H, s), 7,02 - 7,17 (2H, m), 7,19 (1H, dd), 7,50 (1H, dd), 7,58 (1H, s), 7,86 (1H, s), 9,62 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 515.

Primer 155

(2R)-3-[(1R,3R)-6-fluoro-1-[5-fluoro-2-[2-[3-fluoropropil(metil)amino]etoksi]-3-metil-4-piridil]-3-metil-1,3,4,9-tetrahidropirido[3,4-b]indol-2-il]-2-metil-propanska kiselina [0429]

[0430] 2M rastvor natrijum hidroksida (1,17 mL, 2,34 mmol) je dodat mešanom rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (426 mg, 0,47 mmol) u THF (4 mL) i MeOH (2 mL) na 21 °C. Rezultujuća smeša je mešana na 21 °C tokom 16 sati. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Voda (5 mL) i AcOH (1 mL) su dodati i rezultujuća smeša je ekstrahovana sa DCM (3 x 15 mL).

Kombinovana organska materija je osušena (patrona za fazno razdvajanje) i koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod koji je prečišćen sukcesivno preparativnom HPLC (Puriflash C18 , 15µ silicijum dioksid, 35g), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% mravlja kiselina) i MeCN kao eluente praćeno preparativnom HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila (2R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (45,0 mg, 18%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27 °C) 0,94 (3H, d), 1,01 (3H, d), 1,69 - 1,86 (5H, m), 2,22 (3H, s), 2,40 - 2,49 (4H, m), 2,56 - 2,71 (5H, m), 2,95 (1H, dd), 3,59 - 3,70 (1H, m), 4,25 - 4,31 (2H, m), 4,43 (2H, dt), 5,13 (1H, s), 6,83 (1H, td), 7,12 - 7,20 (2H, m), 8,00 (1H, s), 10,49 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 533.

[0431] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata su opisane u nastavku.

Metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0432]

[0433] Rastvor metil (R)-3-(((R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoata (200 mg, 0,68 mmol) i 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehida (484 mg, 0,89 mmol) u toluenu (3 mL) i sirćetnoj kiselini (0,33 mL) je zagrejan na 95 °C tokom 16 sati. Rezultujuća smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak je rastvoren u EtOAc (50 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(25 mL). Vodeni faza je ekstrahovana sa EtOAc (50 mL) i kombinovana organska

14

materija je osušena preko Na2SO4i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je delimično prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa EtOAc. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (426 mg, >100%) kao žuta guma. Uzeta je u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

Primer 156

Priprema 3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanske kiseline

[0434]

[0435] 2N rastvor NaOH (0,563 mL, 1,13 mmol) je dodat rastvoru metil 3-((1R,3R)-6-fluoro-1 -(5 -fluoro-2-(2-((3 -fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3 -metilpiridin-4-il)-3 – metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata (120 mg, 0,23 mmol) u THF (1,0 mL) / MeOH (1,0 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim je razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL). pH je prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N rastvora HCl i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 10 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobila 3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanska kiselina (82 mg, 70%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,10 (3H, d), 1,88 (3H, s), 1,89 - 1,93 (2H, m), 2,10 - 2,38 (2H, m), 2,43 (3H, s), 2,66 (2H, d), 2,76 (2H, s), 2,81 - 2,93 (2H, m), 2,98 - 3,07 (1H, m), 3,11 (1H, d), 3,63 (1H, s), 4,22 - 4,36 (1H, m), 4,36 - 4,41 (1H, m), 4,47 (1H, s), 4,57 - 4,69 (1H, m), 5,29 (1H, s), 6,83 (1H, t), 7,11 (2H, t), 7,81 (1H, s), 11,71 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 519.

14

[0436] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil 3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata su opisane u nastavku.

Metil (R)-3-((1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat

[0437]

[0438] Metil akrilat (95 µl, 1,05 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-amina (192 mg, 1,0 mmol) u MeOH (0,40 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u DCM. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat (270 mg, 97%) kao bledo žuta tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,10 (3H, d), 2,36 - 2,53 (2H, m), 2,70 - 2,80 (2H, m), 2,80 - 2,90 (1H, m), 2,91 - 3,06 (2H, m), 3,57 (3H, s), 6,93 (1H, td), 7,09 (1H, d), 7,23 (1H, dd), 7,25 - 7,30 (1H, m), 8,04 (1H, s). (x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 279.

Metil 3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat [0439]

[0440] Metil (R)-3-((1-(5-fluoro-1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat (139 mg, 0,50 mmol) i 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid (65% težine, 209 mg, 0,50 mmol) su zagrejani do 90 °C u toluenu (2,25 mL) / sirćetnoj kiselini (0,25 mL) preko noći. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena

14

je. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil 3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat (134 mg, 50%) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,09 (3H, d), 1,74 - 1,87 (2H, m), 1,88 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,30 - 2,40 (2H, m), 2,53 (2H, t), 2,64 (1H, d), 2,67 - 2,73 (1H, m), 2,73 - 2,77 (2H, m), 2,91 (1H, dt), 3,08 (1H, ddd), 3,56 (3H, s), 3,59 - 3,67 (1H, m), 4,33 (2H, t), 4,39 (1H, t), 4,49 (1H, t), 5,27 (1H, s), 6,84 (1H, td), 7,09 (1H, dd), 7,12 (1H, dd), 7,51 (1H, s), 7,85 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 533.

Primer 157

Priprema 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanske kiseline

[0441]

[0442] 2N rastvor NaOH (0,729 mL, 1,46 mmol) je dodat rastvoru metil 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata (150 mg, 0,29 mmol) u THF (1,0 mL) / MeOH (1,0 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim je razređena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL). pH je prilagođen do ∼5 dodavanjem 2N rastvora HCl i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 10 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanska kiselina (128 mg, 88%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,14 (3H, d), 1,81 - 1,95 (5H, m), 2,18 (1H,

14

dt), 2,35 (3H, s), 2,43 (1H, ddd), 2,63 - 2,74 (4H, m), 2,77 (1H, d), 2,87 (1H, dt), 3,00 (1H, ddd), 3,19 (1H, ddd), 3,65 (1H, p), 4,26 (1H, ddd), 4,40 (1H, t), 4,49 (1H, t), 4,75 (1H, dt), 5,31 (1H, s), 7,09 - 7,16 (2H, m), 7,23 (1H, dd), 7,43 (1H, s), 7,49 - 7,53 (1H, m), 7,89 (1H, s). (2 x zamenljivi nisu primećeni.) m/z: ES+ [M+H]+ 501.

[0443] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata su opisane u nastavku.

Metil (R)-3-((1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat

[0444]

[0445] Metil akrilat (0,284 mL, 3,15 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amina (523 mg, 3,00 mmol) u MeOH (0,92 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u DCM. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat (755 mg, 97%) kao bledo žuta tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,12 (3H, d), 2,34 - 2,53 (2H, m), 2,68 - 2,91 (3H, m), 2,96 (1H, dt), 3,04 (1H, h), 3,55 (3H, s), 7,05 (1H, d), 7,11 (1H, ddd), 7,19 (1H, ddd), 7,36 (1H, dt), 7,59 - 7,66 (1H, m), 8,02 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 261.

Metil 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat

[0446]

14

[0447] Metil (R)-3-((1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat (156 mg, 0,60 mmol) i 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid (65% težine, 251 mg, 0,60 mmol) su zagrejani u toluenu (4,50 mL) / sirćetnoj kiselini (0,50 mL) do 90 °C preko noći. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i oprana sa rastvorom zasićenog vodenog NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat (164 mg, 53%) kao bež guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,09 (3H, d), 1,72 - 1,86 (2H, m), 1,88 (3H, s), 2,29 (3H, s), 2,30 - 2,40 (2H, m), 2,53 (2H, t), 2,63 - 2,73 (2H, m), 2,74 (2H, td), 2,92 (1H, dt), 3,11 (1H, ddd), 3,56 (3H, s), 3,59 -3,67 (1H, m), 4,32 (2H, t), 4,39 (1H, t), 4,48 (1H, t), 5,28 (1H, s), 7,00 - 7,15 (2H, m), 7,15 -7,21 (1H, m), 7,49 (1H, dd), 7,55 (1H, s), 7,84 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 514.

Primer 158 & 159

Priprema 3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)butanonske kiseline

[0448]

[0449] Etil 3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)butanoat (216 mg, 0,75 mmol) i 5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilizonikotinaldehid (314 mg, 0,75 mmol) su zagrejani u toluenu (3,375 mL) / sirćetnoj kiselini (0,375 mL) do 100 °C preko noći. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u EtOAc. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobilo bledo žuto ulje (∼250 mg) koje je

1

zagađeno sa nereagovanim početnim materijalom. Ostatak je rastvoren u THF (1 mL) i MeOH (1 mL), zatim je dodat 2N rastvor NaOH (1 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, zatim je razređena sa EtOAc (10 mL) i voda (10 mL). Vodeni sloj je prilagođen do pH 5 dodavanjem 2N HCl i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 10 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena je. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silicijum dioksid, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobila dva izomera, (3R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino) etoksi)-3-metil piridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)butanonska kiselina i (3S)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino) etoksi)-3-metil piridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)butanonska kiselina:

Primer 158; Izomer 1: 15,0 mg, 4% (as bezbojna čvrsta supstanca).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,21 (3H, d), 1,25 (3H, d), 1,82 (3H, s), 1,85 - 1,93 (2H, m), 2,26 (1H, dd), 2,33 (3H, s), 2,57 - 2,63 (2H, m), 2,67 (1H, d), 2,73 - 2,82 (2H, m), 2,86 (1H, ddd), 3,12 - 3,19 (2H, m), 3,84 - 3,92 (1H, m), 4,27 - 4,36 (1H, m), 4,39 (1H, t), 4,43 - 4,54 (2H, m), 5,73 (1H, s), 7,01 - 7,16 (2H, m), 7,16 - 7,25 (1H, m), 7,42 - 7,55 (1H, m), 7,65 (1H, s), 7,88 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 515.

Primer 159; Izomer 2: 35,0 mg, 9% (as bezbojna čvrsta supstanca).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,17 (3H, d), 1,19 (3H, d), 1,79 - 1,91 (2H, m), 1,92 (3H, s), 2,12 (1H, dd), 2,37 (3H, s), 2,63 - 2,79 (4H, m), 2,81 - 2,91 (2H, m), 3,05 - 3,14 (1H, m), 3,26 (1H, d), 3,83 (1H, dq), 4,32 - 4,41 (3H, m), 4,47 (1H, q), 5,68 (1H, s), 7,10 (2H, tdt), 7,20 (1H, dd), 7,48 (1H, dd), 7,73 (1H, s), 7,86 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 515.

[0450] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala etil 3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)butanoata su opisane u nastavku.

Etil 3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)butanoat

[0451]

1 1

[0452] (R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-amin (0,871 g, 5 mmol) i etil (E)-but-2-enoat (0,777 mL, 6,25 mmol) su mešani u MeOH (2,50 mL) na 50 °C tokom 1 sata, zatim su dalje zagrejani do refluksa i mešanje je nastavljeno preko noći. Nakon hlađenja isparljive materije su isparene. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 25 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio etil 3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)butanoat (1,310 g, 91%) kao bledo žuta guma, kao 1:1 smeša dijastereoizomera.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 0,99 - 1,27 (9H, m), 2,18 (0,5H, dd), 2,30 (0,5H, dd), 2,41 (1H, ddd), 2,75 (1H, dddd), 2,81 - 2,94 (1H, m), 3,12 (1H, hd), 3,25 (1H, dq), 4,11 (2H, p), 7,04 (1H, dd), 7,11 (1H, ddt), 7,18 (1H, tt), 7,35 (1H, d), 7,52 - 7,70 (1H, m), 8,02 (1H, s). (1 x zamenljiv nije primećen.) m/z: ES+ [M+H]+ 289.

Primer 160

(R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina

[0453]

[0454] 2M natrijum hidroksid (1 mL, 2,00 mmol) je dodat mešanom rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (87 mg, 0,16 mmol) u THF (2 mL) i MeOH (1 mL). Rezultujuća smeša je mešana na 21 °C tokom 16 sati. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, zatim su voda (5 mL) i AcOH (1 mL) dodati i

1 2

vodena smeša je ekstrahovana sa DCM (4 x 15 mL). Kombinovana organska materija je osušena (patrona za fazno razdvajanje) i koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod kao žuta guma koja je prečišćena preparativnom HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% mravlja kiselina) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni pod redukovanim pritiskom, ponovo rastvoreni u 1M amonijaka u MeOH (1 mL) i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (32,0 mg, 38%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27 °C) 0,99 (3H, d), 1,07 (3H, d), 1,72 - 1,95 (5H, m), 2,27 (3H, s), 2,30 - 2,38 (1H, m), 2,51 (2H, t), 2,64 - 2,72 (1H, m), 2,73 (2H, t), 3,02 (1H, dd), 3,23 (3H, s), 3,64 - 3,73 (1H, m), 4,03 (2H, ddt), 4,49 (2H, dt), 5,24 (1H, s), 6,86 (1H, td), 6,97 - 7,14 (2H, m), 7,14 - 7,25 (2H, m), 10,40 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 532.

[0455] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata su opisane u nastavku. Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0456]

[0457] RockPhos katalizator treće generacije (31,2 mg, 0,04 mmol) je dodat degaziranoj smeši metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (181 mg, 0,37 mmol), terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (163 mg, 0,74 mmol) i cezijum karbonata (360 mg, 1,11 mmol) u toluenu (2 mL) na 21 °C. Rezultujuća smeša je zagrejana na 90 °C tokom 6

1

sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i razređena je sa EtOAc (25 mL) i vodom (25 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 25 mL). Kombinovana organska materija je osušena (patrona za fazno razdvajanje) i koncentrovana kako bi se dobio sirov proizvod kao braon guma koja je prečišćena fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((tercbutoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (108 mg, 46%) kao bledo žuta pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,02 (3H, d), 1,09 (3H, d), 1,40 - 1,48 (9H, m), 1,81 (3H, s), 1,84 - 1,94 (2H, m), 2,52 - 2,67 (4H, m), 3,04 - 3,12 (1H, m), 3,35 - 3,46 (2H, m), 3,50 (3H, s), 3,52 - 3,59 (2H, m), 3,64 - 3,72 (1H, m), 4,03 (2H, s), 4,41 (2H, d), 5,26 (1H, s), 6,73 - 6,86 (2H, m), 6,91 (1H, t), 7,04 - 7,13 (2H, m), 7,23 (1H, s); ES+ [M+H]+ 632.

Metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat [0458]

[0459] Rastvor metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (100 mg, 0,16 mmol) u mravljoj kiselini (610 µL) je mešan na 40 °C tokom 1 sata. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i rezultujući ostatak je rastvoren u DCM (25 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL) i kombinovana organska materija je isparena do ∼10 mL zapremine. Ovom rastvoru je dodat 37% w/w rastvor vodenog formaldehida (23,55 µL, 0,24 mmol), praćen sa natrijum triacetoksiborohidridom (51,8 mg, 0,24 mmol). Rezultujuća smeša je mešana na 21 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je razređena sa DCM (10 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je

1 4

ekstrahovan sa DCM (20 mL) i kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je uzet odmah za sledeći korak.

Primer 161

Priprema (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanske kiseline [0460]

[0461] Litijum hidroksid monohidrat (9,0 mg, 0,22 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,011 g, 0,020 mmol) u tetrahidrofuranu (0,2 mL), metanolu (0,2 mL) i vodu (0,2 mL). Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati i zatim neutralizovana sa vodenom hlorovodoničnom kiselinom (1N; 0,21 mL, 0,21 mmol). Smeša je ekstrahovana sa etil acetatom, i ekstrakt je osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 70% MeOH u DCM, kako bi se dobio (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (7,6 mg, 71%) kao bledo žuto čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,03 (3H, d), 1,05 (3H, d), 1,72 - 1,88 (2H, m), 2,14 - 2,33 (6H, m), 2,55 - 2,63 (5H, m), 2,75 (2H, br t), 2,83 (1H, br dd), 4,29 - 4,40 (2H, m), 4,49 (2H, dt), 4,98 (1H, br s), 6,40 (1H, br d), 6,94 - 6,99 (1H, m), 7,00 - 7,05 (1H, m), 7,22 (1H, d), 7,43 (1H, d), 7,82 (1H, br d), 10,39 (1H, br s), 11,93 - 12,45 (1H, br s). (Dva vodonika nisu primećena.) m/z: ES+ [M+H]+ 497. Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata su opisane u nastavku.

1

Priprema Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0462]

[0463] Smeša metil (R)-3-(((R)-1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)-2-metilpropanoata (0,85 g, 3,1 mmol), 2-hloro-3-metilizonikotinaldehida (0,50 g, 3,2 mmol) u toluenu (10 mL) i sirćetnoj kiselini (1,0 mL) je mešana na 90 °C tokom 8 sati. Reakciji je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i zatim je koncentrovana pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,75 g, 59%) kao bledo žuta pena.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 1,03 (6H, d), 2,33 (3H, br s), 2,40 -2,48 (1H, m), 2,56 - 2,80 (3H, m), 2,81 - 2,93 (1H, m), 3,35 - 3,48 (1H, m), 3,52 (3H, s), 4,98 (1H, s), 6,82 - 7,09 (3H, m), 7,13 - 7,30 (1H, m), 7,44 (1H, d), 8,15 (1H, d), 10,34 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 412.

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0464]

[0465] Smeša metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-hloro-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,30 g, 0,73 mmol), terc-butil (3-

1

fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamata (0,209 g, 0,95 mmol), RockPhos pred-katalizatora treće generacije (0,031 g, 0,04 mmol) i cezijum karbonata (0,593 g, 1,82 mmol) je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). Toluen (3,5 mL) je dodat, i smeša je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (2x). Rezultujuća suspenzija je mešana na 90 °C tokom 24 sata, omogućeno joj je da se ohladi do sobne temperature, i filtrirana je. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio sirov proizvod koji je dalje prečišćen pomoću SFC (Chialpak IB kolona, 250 mm dužina, 21,2 mm prečnik, 5 µm, 75 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa 10% (0,2% NH4OH metanol) u CO2tokom 10 minuta, kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,041 g, 9%) kao bledo ćilibarna pena.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,97 - 1,10 (6H, m), 1,30 - 1,47 (9H, m), 1,81 - 1,97 (2H, m), 2,19 (3H, br s), 2,54 - 2,66 (3H, m), 2,68 - 2,79 (1H, br m), 2,84 (1H, br d), 3,35 - 3,44 (3H, m), 3,45 -3,75 (2H, m), 3,51 (3H, s), 4,24 - 4,34 (1H, m), 4,34 - 4,47 (1H, m), 4,46 (2H, dt), 4,93 (1H, br s), 6,45 (1H, br s), 6,93 - 6,99 (1H, m), 6,99 - 7,04 (1H, m), 7,21 (1H, d), 7,43 (1H, d), 7,84 (1H, br d), 10,33 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 597.

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0466]

[0467] Rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (0,04 g, 0,07 mmol) u mravljoj kiselini (1 mL, 26,07 mmol) je omogućeno da stoji na sobnoj temperaturi tokom 18 sati i zatim je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je bazifikovan sa zasićenim vodenim natrijum hidrogen karbonatom, i ekstrahovana sa etil acetatom. Organski sloj je osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je

1

prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u DCM, kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (0,030 g, 90%) kao bistar film.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,97 - 1,10 (6H, m), 1,74 - 1,86 (2H, m), 2,08 - 2,29 (3H, m), 2,57 - 2,64 (2H, m), 2,69 (2H, t), 2,71 - 2,78 (1H, m), 2,85 (1H, br dd), 2,90 (2H, t), 3,39 - 3,47 (1H, m), 3,51 (3H, s), 4,25 - 4,34 (2H, m), 4,50 (2H, dt), 4,91 (1H, s), 6,37 - 6,52 (1H, m), 6,93 - 6,98 (1H, m), 6,99 - 7,05 (1H, m), 7,21 (1H, d), 7,42 (1H, d), 7,84 (1H, br d), 10,34 (1H, s). (Dva vodonika nisu primećena.); m/z: ES+ [M+H]+ 497.

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0468]

[0469] Rastvor formaldehida u vodi (37% težine; 7,8 µL, 0,10 mmol) je dodat mešanom rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (26 mg, 0,05 mmol) u dihlorometanu (1 mL). Natrijum triacetoksiborohidrid (22 mg, 0,10 mmol) je zatim dodat i rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, i zatim je tretirana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Organski sloj je osušen preko nevodenog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u DCM, kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(2-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (14 mg, 52%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,98 - 1,07 (6H, m), 1,74 - 1,88 (2H, m), 2,18 (3H, br s), 2,28 (3H, s), 2,56 - 2,68 (3H, m), 2,68 - 2,78 (3H, m), 2,85 (1H, br dd), 3,39 - 3,47 (1H, m), 3,51 (3H, s), 4,29 - 4,40 (2H, m), 4,49 (2H, dt), 4,92 (1H, br s), 6,45 (1H, br d), 6,93 - 6,98 (1H,

1

m), 6,99 - 7,04 (1H, m), 7,21 (1H, d), 7,42 (1H, d), 7,84 (1H, br d), 10,32 (1H, s). (Dva vodonika nisu primećena.); m/z: ES+ [M+H]+ 511.

Primer 162

Priprema (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanske kiseline

[0470]

[0471] Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (115 mg, 0,21 mmol) je rastvoren u THF (0,8 mL)/MeOH (0,8 mL) i tretiran sa rastvorom litijum hidroksid monohidrata (88 mg, 2,1 mmol) u vodi (0,8 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4,5 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je neutralizovan pažljivo sa vodenim HCl (1N) do pH 7, i rezultujuća smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2x). Kombinovani ekstrakti su osušeni preko natrijum sulfat, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom SFC (Chiralpak IC kolona, 5µm, 21 mm prečnik, 250 mm dužina, 75 mL/minut stopa protoka), eluiranjem sa 20% (0,2% NH4OH u MeOH) u CO2, kako bi se dobio (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina (41 mg, 37%) kao bež suv film.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,91 (3H, d), 0,99 (3H, d), 1,63 - 2,04 (5H, m), 2,17 - 2,33 (1H, m), 2,51 - 2,57 (2H, m), 2,62 (br 1H, d), 2,67 (2H, t), 2,72 - 2,89 (2H, m), 2,92 - 3,00 (1H, m), 3,53 - 3,70 (1H, m), 3,78 - 3,93 (1H, m), 3,93 - 4,04 (1H, m), 5,16 (1H, s), 6,07 (1H, tt), 6,78 (1H, td), 6,87 - 6,98 (1H, m), 6,99 - 7,07 (1H, m), 7,07 - 7,23 (2H, m), 10,34 (1H, s). (Dva vodonika nisu primećena.); m/z: ES+ [M+H]+ 536.

1

[0472] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata su opisane u nastavku.

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-hidroksietoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0473]

[0474] Metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (330 mg, 0,67 mmol), cezijum karbonat (547 mg, 1,68 mmol), i 2-((terc-butildimetilsilil)oksi)etan-1-ol (178 mg, 1,01 mmol) su suspendovani u toluenu (3,5 mL). Reakciona boca je zatim evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x) pre dodavanja RockPhos pred-katalizatora treće generacije (30 mg, 0,03 mmol). Reakciona boca je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x) pre nego što je zagrejana na 90 °C tokom 2 sata. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, razređena sa DCM (25 mL), i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (25 mL), i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u THF (3,5 mL) i tretiran sa TBAF (1,0 M u THF; 2 mL). Nakon 30 minuta, reakcija je razređena sa EtOAc (25 mL), oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL), i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 80% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-hidroksietoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (130 mg, 39%) kao braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27 °C) 0,91 (3H, d), 0,98 (3H, d), 1,55 - 1,91 (3H, m), 2,42 - 2,65 (4H, m), 2,85 - 2,98 (1H, m), 3,41 (3H, s), 3,57 - 3,71 (3H, m), 3,77 - 3,99 (2H, m), 4,76 (1H, t), 5,11 (1H, s), 6,72 -6,83 (1H, m), 6,89 - 7,06 (2H, m), 7,07 - 7,19 (2H, m), 10,33 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 473.

1

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0475]

[0476] Metansulfonil hlorid (0,022 mL, 0,28 mmol) je dodat rastvoru metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-3-(2-hidroksietoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata (121 mg, 0,26 mmol), DIPEA (0,056 mL, 0,32 mmol), i DCM (2,5 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta i zatim je razređena sa DCM (10 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (141 mg, 100%) kao žuta pena. M/z: ES+ [M+H]+ 551.

Priprema metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoata

[0477]

[0478] Metil (R)-3-((1R,3R)-6-fluoro-1-(6-fluoro-2-metil-3-(2-((metilsulfonil)oksi)etoksi)fenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (141 mg, 0,26 mmol), 3,3-difluoropropan-1-amin hidrohlorid (67 mg, 0,51

1 1

mmol), kalijum karbonat (106 mg, 0,77 mmol), i kalijum jodid (42,5 mg, 0,26 mmol) su suspendovani u acetonitrilu (2,5 mL) i zagrejani na 80 °C tokom 17 sati. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, razređena sa EtOAc, i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc, i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio metil (R)-3-((1R,3R)-1-(3-(2-((3,3-difluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-6-fluoro-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanoat (119 mg, 85%) kao bež pena. M/z: ES+ [M+H]+ 550.

Primer 163

Priprema 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanske kiseline [0479]

[0480] NaOH rastvor (0,82 mL, 1,65 mmol) je dodat rastvoru metil 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata (170 mg, 0,33 mmol) u THF (1,24 mL) / MeOH (1,24 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim je neutralizovana dodavanjem 2N rastvora HCl. Isparljive materije su isparene, zatim je sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 ODB kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanska kiselina (145 mg, 88%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,23 (3H, d), 1,85 (2H, ddt), 1,87 (3H, s), 2,16 (1H, d), 2,32 (3H, s), 2,48 - 2,56 (1H, m), 2,58 (2H, t), 2,66 -2,88 (3H, m), 2,89 - 2,96 (2H, m), 3,27 (1H, ddd), 3,76 (1H, p), 4,03 (2H, dp), 4,42 (1H, t),

1 2

4,52 (1H, t), 5,40 (1H, s), 6,83 (1H, dd), 6,94 (1H, t), 7,09 - 7,19 (2H, m), 7,22 (1H, dd), 7,38 (1H, s), 7,51 (1H, dd). (1 x zamenljiv nije primećen.); m/z: ES+ [M+H]+ 500.

[0481] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala metil 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoata su opisane u nastavku.

2-(3-Bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-1,3-dioksolan

[0482]

[0483] 3-Bromo-6-fluoro-2-metilbenzaldehid (4,8 g, 22,12 mmol) je dodat etan-1,2-diol (4,12 g, 66,35 mmol) i 4-metilbenzensulfonskoj kiselini (0,381 g, 2,21 mmol) u toluenu (100 mL). Rezultujuća smeša je mešana na 100 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je sipana u zasićen rastvor NaHCO3(50 mL), ekstrahovana sa EtOAc (2 x 50 mL), zatim osušen organski sloj je preko Na2SO4, filtriran i isparen kako bi se dobila žuta guma koja je prečišćena fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u petrolej etru. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-1,3-dioksolan (5,00 g, 87%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 2,50 (3H, s), 3,94 - 4,14 (2H, m), 4,10 - 4,30 (2H, m), 6,16 (1H, s), 6,74 - 6,87 (1H, m), 7,47 - 7,58 (1H, m).

Terc-butil (2-(3-(1,3-dioksolan-2-il)-4-fluoro-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat

[0484]

[0485] Terc-butil (3-fluoropropil)(2-hidroksietil)karbamat (5,08 g, 23,0 mmol) je dodat 2-(3-bromo-6-fluoro-2-metilfenil)-1,3-dioksolanu (5,00 g, 19,2 mmol), Cs2CO3(18,72 g, 57,45

1

mmol) i rockphos pred-katalizatoru treće generacije (0,801 g, 0,96 mmol) u toluenu (12 mL) pod azotom. Rezultujuća smeša je mešana na 80 °C tokom 16 sati. Rastvarač je uklonjen pod redukovanim pritiskom, zatim je reakciona smeša razređena sa EtOAc (50 mL), i oprana sekvencijalno sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 20 mL), vodom (20 mL), i zasićenim vodenim natrijum hloridom (20 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i isparen. Sirov proizvod je prečišćen sa fleš C18-fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 80% MeCN u vodi. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (2-(3-(1,3-dioksolan-2-il)-4-fluoro-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (4,80 g, 62%) kao žuta guma.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,45 (9H, s), 1,85 - 2,11 (2H, m), 2,29 (3H, s), 3,46 (2H, t), 3,57 - 3,64 (2H, m), 3,94 - 4,09 (4H, m), 4,17 - 4,29 (2H, m), 4,40 (1H, t), 4,55 (1H, t), 6,15 (1H, s), 6,70 - 6,90 (2H, m). M/z (ES+), [M-tBu]+ = 346.

Terc-butil (2-(4-fluoro-3-formil-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat [0486]

[0487] 4-Metilbenzensulfonska kiselina (0,244 g, 1,42 mmol) je dodata terc-butil (2-(3-(1,3-dioksolan-2-il)-4-fluoro-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamatu (5,70 g, 14,2 mmol) u acetonu (80 mL). Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati.

Reakciona smeša je sipana u zasićen vodeni NaHCO3(50 mL), ekstrahovana sa EtOAc (2 x 50 mL), zatim organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i isparen je kako bi se dobila žuta guma koja je prečišćena fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u petrolej etru. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio tercbutil (2-(4-fluoro-3-formil-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (3,40 g, 67%) kao žuta guma, koja je tokom stajanja očvrsnula.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,47 (9H, s), 1,86 - 2,10 (2H, m), 2,50 (3H, s), 3,48 (2H, t), 3,60 - 3,74 (2H, m), 3,99 - 4,15 (2H, m), 4,44 (1H, t), 4,55 (1H, t), 6,81 - 7,16 (2H, m), 10,51 (1H, s). M/z (ES+), [M-Boc] = 258.

Metil 3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat

1 4

[0489] Metil (R)-3-((1-(1H-indol-3-il)propan-2-il)amino)propanoat (260 mg, 1,0 mmol) i terc-butil (2-(4-fluoro-3-formil-2-metilfenoksi)etil)(3-fluoropropil)karbamat (357 mg, 1,00 mmol) su zagrejani u toluenu (3,60 mL) / sirćetnoj kiselini (0,40 mL) do 100 °C tokom 6 sati. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene i ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil 3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat (301 mg, 50%) kao bež čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 600.

Metil 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat

[0490]

[0491] Metil 3-((1R,3R)-1-(3-(2-((terc-butoksikarbonil)(3-fluoropropil)amino)etoksi)-6-fluoro-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat (280 mg, 0,47 mmol) je mešan u mravljoj kiselini (2,33 mL) na 40 °C tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene, zatim je ostatak rastvoren u DCM (20 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (10 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena do zapremine od ∼10 mL. Ovom rastvoru je dodat rastvor 37% formaldehida (71,9 mg, 0,70 mmol), praćen sa natrijum

1

triacetoksiborohidridom (97 mg, 0,70 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim je razređena sa DCM (10 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom (20 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 ODB kolona, 5µ silicijum dioksid, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio metil 3-((1R,3R)-1-(6-fluoro-3-(2-((3-fluoropropil)(metil)amino)etoksi)-2-metilfenil)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)propanoat (180 mg, 75%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27 °C) 1,00 (3H, d), 1,72 (2H, ddd), 1,78 (3H, s), 2,11 - 2,19 (2H, m), 2,19 (3H, s), 2,44 (2H, t), 2,59 (1H, d), 2,61 - 2,68 (3H, m), 2,79 (1H, dt), 3,02 (1H, ddd), 3,44 (3H, s), 3,49 - 3,56 (1H, m), 3,87 (2H, tt), 4,30 (1H, t), 4,39 (1H, t), 5,24 (1H, s), 6,68 (1H, dd), 6,80 (1H, t), 6,91 - 7,00 (2H, m), 7,00 - 7,07 (1H, m), 7,23 (1H, s), 7,38 (1H, dd). M/z: ES+ [M+H]+ 514.

[0492] Primeri 16-56, 58-116, 118-120, 122-123, 125, 128-142, 144, 146-151 i 153-154 (Tabela G ispod) pripremljeni su koristeći metode analogne onima gore opisanim.

Tabela G

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

Claims

Patentni zahtevi 1. (R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina,
ili njena farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje patentnog zahteva 1, koje je (R)-3-((1R,3R)-1-(5-fluoro-2-(2-((3-fluoropropil)amino)etoksi)-3-metilpiridin-4-il)-3-metil-1,3,4,9-tetrahidro-2H-pirido[3,4-b]indol-2-il)-2-metilpropanska kiselina,
3. Farmaceutski sastav koji obuhvata jedinjenje patentnog zahteva 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
4. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prema patentnom zahtevu 1, za primenu kao lek.
5. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, prema patentnom zahtevu 1, za primenu u prevenciji ili tretmanu raka kod toplokrvne životinje.
6. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde je rak u pitanju ginekološki rak ili rak dojke. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5