RS58094B1

RS58094B1 - Aminopiridiloksipirazolova jedinjenja

Info

Publication number: RS58094B1
Application number: RS20181372A
Authority: RS
Inventors: Douglas W Beight; David A Coates; Sajan Joseph; William T Mcmillen; Saravanan Parthasarathy; Huaxing Pei; Jason Scott Sawyer; Craig D Wolfangel; Gaiying Zhao
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2019-02-28
Also published as: DK3204377T3; PL3204377T3; CR20170072A; TR201816415T4; PT3204377T; CA2961262C; CN106795139B; UA118807C2; LT3204377T; US9617243B2; MX2017004457A; KR101921847B1; JP2016535745A; JP6043894B2; PH12017500635B1; SV2017005411A; AU2015328553B2; CN106795139A; EA201790476A1; EP3204377A1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na nova aminopiridiloksipirazolova jedinjenja koja inhibiraju aktivnost transformišućeg faktora rasta beta receptora 1 (TGFβR1), farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja, i upotrebu ovih jedinjenja u lečenju raka, pogotovu raka debelog creva, melanoma, hepatocelularnog karcinoma (HCC), raka bubrega, glioblastome (GBM), raka pankreasa, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), raka pluća, i raka želuca, i/ili fibroze, poželjno fibroze jetre i hroničnog oboljenja bubrega.

[0002] Transformišući faktor rasta beta (TGF-beta ili TGFβ) je multifunkcionalni citokin koji se vezuje za heteromerne komplekse TGF-beta tipa I i tipa II serin/treonin kinaza receptore i aktivira TGF-beta receptorski kompleks, koji fosforiluje i aktivira SMAD2 i SMAD3, koji potom vezuju SMAD4 i migriraju u jezgro i regulišu ekspresiju različitih ciljnih gena. Glavni učesnici transduckionih puteva TGF-beta receptorskog signala uključuju TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβR1, TGFβR2, SMADs, SnoN, SARA, SKI, DAB, TRAP, TAK1, SMIF, E2F4, E2F5, RBL1, RBL2, RB1, TFDP1, TFDP2, SMURF1, SMURF2, P300, CBP, i JUN. SMAD posredovani TGF-beta receptorski put reguliše različite ćelijske i fiziološke procese kao što je proliferacija, diferencijacija, rast, migracija, mijelinacija, zaustavljanje ćelijskog ciklusa, apoptozu i razviće.

[0003] Već su poznati u oblasti mali molekuli koji inhibiraju TGFβR1 i koriste se u tretmanu raka i/ili fibroze. Videti na primer, WO2012/002680, WO2009/022171, WO2004/048382, i WO2002/094833. Na nesreću, ne postoje postupci za lečenje mnogih vrsta kancera ili fibroze. Bilo bi poželjno da postoje dodatni mali molekuli inhibitori TGFβR1 za tretman raka, poželjno raka debelog creva, melanoma, hepatocelularnog karcinoma (HCC), raka bubrega, glioblastoma (GBM), raka pankreasa, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), raka pankreasa, i raka želuca, i/ili fibroze, poželjno fibroze jetre i hroničnog oboljenja bubrega, posebno jedinjenja koja su selektivnija prema TGFβR1.

[0004] Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenje formule:

gde :

R1 predstavlja vodonik, izopropil, difluormetil, difluoretil, ili ciklopropil;

R2 predstavlja etil, terc-butil, piridin-2-il, tetrahidropiran-4-il, tetrahidrofuran-3-il, ciklopropil, ili ciklobutil; i

R3 predstavlja karbamoilfenil, piridin-2-il, (1-hidroksi-1-metiletil)piridinil, 1-metil-2-okso-1H-piridin-4-il, 1-metil-pirazolil, pirazin-2-il, 2-metoksipirimidin-4-il, 1-metil-2-okso-1H-pirimidin-4-il, piridazin-3-il, 6-hlorpiridazin-3-il, 6-metilpiridazin-3-il, ili 6-metoksipiridazin-3-il;

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0005] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0006] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol-4-metilbenzensulfonat.

[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kristalni 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol 4-metilbenzensulfonat. Ovaj pronalazak nadalje omogućava kristalni 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-yl}propan-2-ol 4-metilbenzen sulfonat okarakterisan izgledom difrakcije praha X-zracima (Cu ozračivanje, λ-1.54060 Å) uključujući signal na 17.8° sa jednim ili više signala odabranih od grupe koja se sastoji od 19.7°, 18.4°, i 22.0° (2θ±0.2°).

[0008] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje ili njegovu so ovog pronalaska, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, nosača, ili diluenata.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje ili njegovu so ovog pronalaska za upotrebu u terapiji. Dodatno, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje ili njegovu so ovog pronalaska za upotrebu u lečenju raka, poželjno raka debelog creva, melanoma, hepatocelularnog karcinoma (HCC), raka bubrega, glioblastoma (GBM), raka pankreasa, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), raka pankreasa, i raka želucai/ili fibroze, poželjno fibroze jetre i hroničnog oboljenja bubrega. Nadalje, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja ili soli ovog pronalaska za proizvodnju leka za lečenje raka, poželjno raka debelog creva, melanoma, hepatocelularnog karcinoma (HCC), raka bubrega, glioblastoma (GBM), raka pankreasa, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), raka pankreasa, i raka želucai/ili fibroze, poželjno fibroze jetre i hroničnog oboljenja bubrega. Sledeći paragrafi opisuju poželjne klase jedinjenja ovog pronalaska:

a) R1 predstavlja difluormetil, difluoretil, ili ciklopropil grupu;

b) R2 predstavlja piridin-2-il, tetrahidropiran-4-il, ili ciklopropil grupu;

c) R3 predstavlja karbamoilfenil ili (1-hidroksi-1-metiletil)piridinil grupu;

d) R1 predstavlja ciklopropil i R2 predstavlja tetrahidropiran-4-il grupu;

e) R1 predstavlja ciklopropil i R2 predstavlja ciklopropil grupu;

f) R1 predstavlja difluoretil i R2 predstavlja tetrahidropiran-4-il grupu;

g) R1 predstavlja difluormetil i R2 predstavlja piridin-2-il grupu;

h) R1 predstavlja ciklopropil, R2 i predstavlja tetrahidropiran-4-il, i R3 predstavlja (1-hidroksi-1-metiletil)piridinil grupu;

i) R1 predstavlja ciklopropil, R2 predstavlja ciklopropil, i R3 predstavlja (1-hidroksi-1-metiletil)piridinil grupu;

j) R1 predstavlja difluoretil, R2 predstavlja tetrahidropiran-4-il, i R3 predstavlja

(1-hidroksi-1-metiletil)piridinil grupu; i

k) R1 predstavlja difluormetil grupu, R2 predstavlja piridin-2-il, i R3 predstavlja karbamoilfenil grupu.

[0010] Osobi obučenoj u oblasti biće poznato da jedinjenja ovog pronalaska u formi slobodne baze mogu graditi soli i takve soli se smatraju delom ovog pronalaska. Bazni oblici jedinjenja ovog pronalaska su amini, i shodno tome oni reaguju sa bilo kojim brojem neorganskih i organskih kiselina pri čemu nastaju farmaceutski prihvatljive adicione soli kiselina. Takve farmaceutski prihvatljive adicione soli kiselina i uobičajena metodologija za njihovo dobijanje dobro su poznate u oblasti. Videti npr., P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION i USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, Januar 1977.

Podrazumeva se da obučen u oblasti može lako odrediti stehiometriju za dobivanje soli. Videti na primer, D. Risley, et al., Simultaneous Determination of Positive and Negative Counterions Using a Hidrophilic Interaction Chromatography Method, LCGC NORTH AMERICA, Vol 24, No. 8, Avgust 2006 strane 776-785.

[0011] Neka jedinjenja ovog pronalaska nalaze se u kristalnom obliku. Dobro je poznato u oblasti kristalografije da kod bilo koje kristalne forme, relativni intenziteti difrakcije signala mogu varirati u zavisnosti od zastupljene orijentacije kao posledice činioca kao što je morfologija kristala kao i njegovo stanje. Kada su prisutni efekti poželjne orijentacije, dolazi do promene intenziteta signala, ali ne dolazi do promene pozicija karakterističnih signala kod polimorfa. Videti npr., The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, strane 1843-1844, 1995. Nadalje, takođe je vrlo dobro poznato u oblasti kristalografije da kod bilo koje kristalne forme angularne pozicije signala mogu malo varirati. Na primer, pozicije signala mogu se pomeriti zbog varijacije u temperaturi ili vlažnosti na kojoj se uzorak analizira, pomeraj uzorka, ili prisustvo ili nedostatak internog standarda. U slučajevima ovog pronalaska, varijabilnost pozicije signala od σ 0.2 u 2θ uzeće u obzir ove potencijalne varijacije bez sprečavanja ometanja nedvosmislene identifikacije naznačene forme kristala. Potvrda kristalne forme može se zasnivati na bilo kojoj jedinstvenoj kombinaciji karakterističnih signala (u jedinicama ° 2θ), i to je obično više istaknutih signala. Izgled difrakcije kristalne forme, sakupljene na sobnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti, usklađeni su na osnovu NIST 675 standarda signala na 8.853 i 26.774 stepeni 2-teta.

[0012] Jedinjenja ovog pronalaska mogu se sintetisati prema dole navedenim sintetičkim shemama metodama dobro poznatim i prihvaćenim u oblasti. Pogodni reakcioni uslovi koji opisuju sintetičke korake u ovim shemama dobro su poznati u oblasti i odgovarajuće zamene nekih rastvarača i reagenasa drugima dobro su poznati obučenom u oblasti. Isto tako, biće prihvaćeno sa zahvalnošću od strane onih obučenih u oblasti da se sintetički intermedijeri mogu izolovati i/ili prečistiti pomoću različitih dobro poznatih tehnika prema potrebi ili želji, i da će često, biti moguće koristiti različite intermedijere direktno u sledećim sintetičkim koracima uz malo ili bez prečišćavanja. Nadalje, onaj obučen u oblasti sa zahvalnošću će primiti činjenicu da u nekim situacijama, redosled upotrebe strukturnih komponenti nije kritičan. Poseban redosled reakcionih koraka neophodan za sintezu jedinjenja ovog pronalaska zavisi od postupka za dobijanje svakog posebnog jedinjenja, polaznog jedinjenja, i relativnoj mogućnosti raspolaganja supstituisanih komponenata, što je dobro poznato obučenom hemičaru. Svi supstituenti su ranije definisani, ukoliko nije drugačije naznačeno, i svi reagensi su dobro poznati i prihvaćeni u oblasti.

[0013] Neki intermedijeri ili jedinjenja ovog pronalaska mogu imati jedan ili više centara hiralnosti. Ovaj pronalazak uzima u obzir sve pojedinačne enantiomere ili diastereomere, kao i smese enantiomera i diastereomera datih jedinjenja uključujući racemate. Poželjno je da jedinjenja ovog pronalaska koji sadrže najmanje jedan centar hiralnosti postoje kao jedan enantiomer ili diastereomer. Pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu se dobiti polazeći od hiranih reagenasa ili steroselektivnom ili stereospecifičnom sintetičkom tehnikom. Alternativno, pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu se izolovati iz smese standardnom hiralnom hromatografijom ili pomoću tehnika kristalizacije. Onaj obučen u oblasti shvatiće da u nekim okolnostima redosled eluiranja enantiomera ili diastereomera može biti različit zbog upotrebe različitih hromatografskih kolona i mobilnih faza.

[0014] Oznaka "izomer 1" u imenu jedinjenje označava da se odgovarajući intermedijer ili jedinjenja ovog pronalaska pri eluiranju pojavljuje prvi od dva eluirajuća enantiomera kada se smesa parova enantiomera razdvaja koristeći hiralnu hromatografiju. Oznaka "izomer 2" u imenu jedinjenje označava da se odgovarajući intermedijer ili jedinjenje ovog pronalaska pojavljuje drugi od dva eluirajuća enantiomera kada se smesa parova enantiomera razdvaja koristeći hiralnu hromatografiju.

[0015] dinjenja ovog pronalaska mogu se sintetisati kako je to prikazano na sledećim shemama, pri čemu su R1, R2, i R3 prethodno definisani.

Shema 1: sinteza jedinjenja Formule I

[0016] Na shemi 1 prikazan je opšti postupak sinteze jedinjenja formule I. Jedinjenje 1 reaguje sa 2-hlor-piridin-4-olom u pogodnom rastvaraču kao što je dimetilformamid (DMF) ili aceton sa pogodnom bazom kao što je cezijum karbonat ili kalijum karbonat na sobnoj temperaturi, ili povišenoj temperaturi, pri čemu se dobija jedinjenje 2. Jedinjenje 2 reaguje sa 1,1-dimetoksi-N,N-dimetil-metanaminom na povišenoj temperaturi pri čemu nastaje jedinjenje 3. Jedinjenje 3 se može prečistiti ili koristiti bez daljeg prečišćavanja u reakciji sa hidrazinom u sirćetnoj kiselini pri čemu se dobija jedinjenje 4. Jedinjenje 4 može reagovati sa pogodnim alkilujućim reagensom kao što je kalijum alkiltrifluoroborat ili alkilboronska kiselina pod Chan-Lam uslovima kuplovanja pri čemu nastaje jedinjenje 5. Specifičnije, prvo se zagreje suspenzija 2,2’-bipiridina i bakar(II)acetata u pogodnom rastvaraču kao što je 1,2-dihloretan do povišene temperature i zasiti azotom, a zatim filtruje reakciona smesa i filtrat doda smesi jedinjenja 4, sa pogodnim boronatom kao što je kalijum alkiltrifluoroborat ili alkilboronska kiselina, i pogodnom bazom kao što je natrijum karbonat u pogodnom rastvaraču kao što je 1,2-dihloretan. Reakcionasmesa se zagreje do povišene temperature čime se dobiva jedinjenje 5. Jedinjenje 4 takođe može reagovati sa pogodnim alkil halogenidom kao što je alkil jodid, alkil bromid ili alkil hlorid sa pogodnom bazom kao što je natrijum hidrid u pogodnom rastvaraču kao što je DMF ili tetrahidrofuran (THF) pri čemu se dobija jedinjenje 5. Jedinjenje 5 reaguje sa pogodnim aminom pod dobro poznatim Buchwald-ovim uslovima kuplovanja pri čemu se dobiva jedinjenje formule I. Specifičnije, jedinjenje 5 reaguje sa pogodnim aminom na povišenoj temperaturi u prisustvu pogodne baze kao što je cezijum karbonat, u prisustvu pogodnog ligirajućeg reagensa kao što je 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten, i pogodnog katalizatora kao što je paladijum(II)acetat u pogodnom rastvaraču kao što je 1,4-dioksan pri čemu se dobiva jedinjenje formule I.

Shema 2: sinteza jedinjenja Formule I gde R<1>predstavlja H

[0017] Shemom 2 predstavljena je opšta sinteza jedinjenja formule I kada R<1>predstavlja H. Kako je prikazano u koraku 4 sheme 1, kada je alkilujući reagens 2-(trimetilsilil)etoksimetil hlorid, jedinjenje 6 se može dobiti alkilovanjem u koraku 4 i Buchwald-ovom reakcijom kuplovanja u koraku 5. Jedinjenje 6 može reagovati sa trietilsilanom u trifuorsirćetnoj kiselini pri čemu se dobiva jedinjenje formule I gde R1 predstavlja H. Kada R1 predstavlja H, poznato je obučenom u oblasti da jedinjenje formule I može postojati kao par tautomera gde vodonik može migrirati sa jednog na drugi azot pirazolovog prstena.

R<3>je (karbamoil)fenil

Shema 3: sinteza jedinjenja Formule I gde R<3>predstavlja (karbamoil)fenil grupu

[0018] Na shemi 3 predstavljena je opšta sinteza jedinjenja formule I kada R<3>predstavlja (karbamoil)fenil grupu. Jedinjenje 7 se može dobiti postupkom predstavljenim u koraku 5 sheme 1 kada R<3>predstavlja pogodno supstituisani benzonitril. Jedinjene 7 reaguje sa vodonik peroksidom i pogodnom bazom kao što je kalijum karbonat u dimetil sulfoksidu (DMSO) pri čemu se dobiva jedinjenje formule I kada R3 predstavlja (karbamoil)fenil grupu.

[0019] Kako se ovde koristi, sledeći izrazi imaju navedeno značenje: "ACN" odnosi se na acetonitril; "BSA" odnosi se na serum albumin govečeta ; "DCM" odnosi se na dihlormetan; "DMF" predstavlja N,N-dimetilformamid; "DMSO" odnosi se na dimetil sulfoksid; "DTT" odnosi se na dithiothreitol; "EDTA" odnosi se na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu ; "EGTA" odnosi se na etilen glikol tetrasirćetnu kiselinu (egtazinsku kiselinu); "ELISA" odnosi se na enzim-vezani immunosorbent test; "EtOAc" odnosi se na etil acetat; "EtOH" odnosi se na etanol; "FBS" odnosi se na fetalni serum govečeta; "HEC" odnosi se na hidroksietilcelulozu; "HPLC" odnosi se na tečnu hromatografiju visokih performansi (visokog pritiska); "IVTI" odnosi se na in vivo inhibiciju mete; "MS" odnosi se na masenu spektroskopiju; "MeOH" odnosi se na metanol; "NMR" odnosi se na nuklearnu magnetnu rezonanciju; "THF" odnosi se na tetrahidrofuran; "TBS" odnosi se na tris slani rastvor; "TED" odnosi se na minimalna (granična) efektivna doza; "UVW" odnosi se na talasnu dužinu u ultraljubičastoj oblasti, i "XRD" odnosi se na difrakciju X-zraka.

[0020] Ukoliko nije drugačije navedeno, jedinjenja koja su ovde predstavljena numerišu se i imenuju koristeći ACDLABS ili Accelrys Draw 4.1 sisteme.

Sinteza 1

2-(4-Brom-2-piridil)propan-2-ol

[0021

[0022] Opremiti trogrli balon sa okruglim dnom od tri litre sa kapalicom, efluks kondenzatorom, uvodnikom za azot, i uređajem za merenje temperature. Dodati metilmagnezijum bromid (3.2M u 2-metiltetrahidrofuranu, 239.07 ml, 765.01 mmol) i ohladiti u ledenom kupatilu. U kapalicu dodati rastvor etil 4-brompiridin-2-karboksilata (80.0 g, 347.73 mmol) u THF (800.0 ml). Dodati navedeni rastvor ukapavanjem rastvoru metilmagnezijum bromida pri čemu se unutrašnja temperatura smese održava ispod ispod 25°C. Potom ukloniti ledeno kupatilo i mešati sledećih 30 minuta na 25°C. Reakciona smesa se ohladi na spoljnu temperaturu na 5°C i pažljjivo prekunuti reakciju ukapavanjem vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (1M) pri čemu se unutrašnja temperatura održava ispod 30°C. Dodati novu količinu vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (1M) sve dok pH smese ne dostigne vrednost od oko 7. Potom se ukloni ledeno kupatilo i razblaži etil acetatom (EtOAc; 200 ml). Odvoji se organski sloj, suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtruje kroz mali sloj celita (CELITE®) i ispere pomoću EtOAc. Filtrat se koncentruje pri čemu se dobiva narandžasto ulje. Prečišćavanje se vrši koristeći mali sloj slika gela eluiranjem pomoću smese heksan/EtOAc (3/1) pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (63.15 g; 84.0% prinos) kao bezbojno ulje. MS (m/z): 216/218 (M+1/M+3).

[0023] Sledeće jedinjenje se dobija u osnovi istim postupkom kao u Sintezi 1.

Tabela 1:

Sinteza 3

2-(4-Amino-2-piridil)propan-2-ol

[0024]

[0025] U dvolitarski Parr-ov reaktor opremljen magnetom, dodati bakar (prah, 12.6 g, 198.6 mmol), 2-(4-brom-2- piridil) propan-2-ol (63.1 g, 292.0 mmol) i amonijum hidroksid (28 wt/wt% u vodi, 757.2 ml). Reakciona smesa se meša na otvorenom tokom 30 minuta sve dok ne postane tamno plava. Potom se ukloni magnet za mešanje, postavi vođica mehaničke mešalice na vrh balona, dihtung, i postavi štap mešalice. Smesa se zagreje na 100°C (unutrašnja temperatura, spoljno zagrevanje na 120°C) i meša se preko noći. Reakciona smesa se ohladi na sobnu temperaturu i doda se 2-metiltetrahidrofuran (600 ml). Filtrovanje izvršiti kroz mali sloj celita (CELITE®) i isprati 2-metiltetrahidrofuranom. Odvoji se organski sloj i vodeni sloj se ektrahuje 2-metiltetrahidrofuranom (200 ml). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvor reakcione smese se filtruje, koncentruje i suši u vakuumu preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (31.3 g; 70.4% prinos) kao žuto ulje. MS (m/z): 153 (M+1).

[0026] Sledeće jedinjenje se dobija u osnovi istim postupkom kao u Sintezi 3.

Tabela 2:

Sinteza 5

2-Brom-1-tetrahidropiran-4-il-etanon

[0027]

Metod 1:

[0028] Dodati oksalil hlorid (28.69 ml, 330.73 mmol) ukapavanjem u smesu tetrahidropiran-4-karboksilne kiseline (39.13 g, 300.67 mmol) u DCM (250 ml) i DMF (15 kapi). Smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom 2.5 sata pod azotom. Koncentruje se pod sniženim pritiskom i ostatak rastvori u DCM (250 ml). Dobijeni rastvor se dodaje ukapavanjem (trimetilsilil)diazometanu (2M u heksanima, 450 ml, 900.00 mmol) na -10°C i smesa se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se ohladi na 0°C i ukapavanjem doda bromovodonična kiselina (48 wt/wt% u vodi, 52 ml, 462.73 mmol). Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Reakciona smesa se ohladi na 0°C i doda bromovodonična kiselina (48 wt/wt% u vodi, 26 ml, 231.36 mmol) ukapavanjem. Smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Doda se voda (250 ml), DCM (250 ml) i odvoji se organski sloj. Vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (2 x 250 ml).

1

Kombinovani organski slojevi isperu se zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida. Rastvor se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (58.2 g; 93.48% prinos) kao smeđa čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.00 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.45 (m, 2H), 2.98 (m, 1H), 1.78 (m, 4H).

Metod 2:

[0029] Ohladiti rastvor 1-tetrahidropiran-4-iletanona (10 g, 78.02 mmol) u metanolu (MeOH; 50 ml) to -10°C. Dodati brom (4.01 ml, 78.02 mmol) ukapavanjem. Smesa se meša na 0°C tokom 45 minuta a zatim na 10°C tokom 45 minuta. Potom se doda vodeni rastvor sumporne kiseline (11M, 27.5 ml, 302.50 mmol) i nastala smesa se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Potom dodati vodu i tri puta ekstrahovati dietil etrom. Kombinovani organski slojevi se potom isperu vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i vodom. Organski sloj se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruje pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (12 g; 74.28% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400.13 MHz, CDCl3) δ 4.00 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.45 (m, 2H), 2.98 (m, 1H), 1.78 (m, 4H).

Sinteza 6

2- [(2-Hlor-4-piridil)oksi] -1 -tetrahidropiran-4-il-etanon.

[0030]

Metod 1:

[0031] Dodati rastvor 2-brom-1-tetrahidropiran-4-il-etanona (24.35 g, 117.60 mmol) u DMF (50 ml) ukapavanjem uz mešanje smesi 2-hlorpiridin-4-ola (13.85 g, 106.91 mmol) i cezijum karbonata (69.67 g, 213.82 mmol) u DMF (380 ml) na sobnoj temperaturi. Nastala smesa meša se na 90°C tokom 2.5 sata. Reakciona smesa se ohladi do sobne temperature pri čemu se dobiva sirova smesa. Dobijena smesa se kombinuje sa drugom reakcijom na skali od 2.85 g (2-hlorpiridin-4-ol) kako je gore navedeno. Kombinovane smese se rastvore u vodi (200 ml) i EtOAc (300 ml). Organski sloj se odvoji a vodeni sloj se ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 250 ml). Kombinovani organski slojevi se isperu vodom (100 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (100 ml). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtruju i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (29.32 g; 88.96% prinos) kao mrko ulje. MS (m/z): 256 (M+1).

Metod 2:

[0032] Dodati 2-brom-1-tetrahidropiran-4-il-etanon (10.03 g, 48.42 mmol) i kalijum karbonat (10.14 g, 72.62 mmol) rastvoru 2-hlorpiridin-4-ola (6.40 g, 48.42 mmol) u acetonu (150 ml) i dobivenu smesu mešati na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se filtruje da se ukloni čvrsta supstanca i čvrsta supstanca se ispere pomoću DCM. Koncentruje se filtrat pod sniženim pritiskom pri čemu se kvantitativno dobiva navedeno jedinjenje. MS (m/z): 256 (M+1).

[0033] Sledeće jedinjenje se dobija u osnovi istim postupkom kao u Metodu 2 Sinteze 6.

Tabela 3:

(nastavak)

Sinteza 13

2-Hlor-4- [(3 -tetrahidropiran-4-il-1H-pirazol-4-il)oksi]piridin

[0034]

[0035] Smesu 2-[(2-hlor-4-piridil)oksi]-1-tetrahidropiran-4-il-etanona (29.3 g, 114.59 mmol) i 1,1-dimetoksi-N,N-dimetil-metanamina (65 ml, 486.83 mmol) mešati tokom dva sata na 100°C. Reakciona smesa se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje pod sniženim pritiskom i ostatak rastvoriti u EtOAc (400 ml). Isprati dobro vodom (100 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (100 ml). Sušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovati pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva smeđa čvrsta supstanca. Dobivena smeđa čvrsta supstanca se rastvori u sirćetnoj kiselini (350 ml) i reakciona smesa se ohladi do na 0°C. Dodati potom hidrazin monohidrat (16.8 ml, 345.66 mmol) i mešati na sobnoj temperaturi preko noći pod azotom. Reakcionu smesu sipati na smesu led/voda (250 ml) i ekstrahovati pomoću EtOAc (4 x 200 ml). Kombinovani organski slojevi se isperu vodom (200 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (100 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (100 ml). Sušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata, potom filtrovati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva mrko ulje. Dobiveno mrko ulje prečistiti koristeći mali stub silika gela eluiranjem pomoću EtOAc. Odgovarajuće frakcije kombinovati i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Dobivenu supstancu sušiti u vakuumu pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (24.43 g; 76.22% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (m/z): 280 (M+1).

1

[0036] Sledeća jedinjenje se dobivaju u osnovi istim postupkom kao u Sintezi 13.

Tabela 4:

(nastavak)

Sinteza 20

2-Hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksi-piridin

Metod 1:

[0038] Refluktovati smesu 2,2’-bipiridina (13.73 g, 87.90 mmol) i bakar(II)acetata (15.97 g, 87.90 mmol) u 1,2-dihloretanu (244.3 ml) na 75°C tokom 25 minuta i zatim reakcionu smesu ohladiti na sobnu temperaturu. Potom dodati rastvor 2-hlor-4-[(3- tetrahidropiran-4-il-1H-pirazol-4-il)oksi]piridina (24.43 g, 79.91 mmol) u 1,2-dihloretanu (335.30 ml), a zatim dodati ciklopropilboronsku kiselinu (13.73 g, 159.82 mmol) i natrijum karbonat (16.94 g, 159.82 mmol). Reakciona smesa se zagrevа na 75°C tokom dva sata u atmosferi kiseonika, potom se reakciona smesa ohladi na sobnu temperaturu. Reakciona smesa se razblaži pomoću EtOAc (200 ml), filtruje kroz mali stub silika gela i ispere pomoću EtOAc (250 ml). Filtrat se ispere vodom (200 ml) i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (200 ml). Rastvor se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtruje i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom a ostatak se suši u vakuumu preko noći na sobnoj temperaturi. Prečišćavanje se vrši hromatografijom na koloni silika gela pomoću smese 6-27% EtOAc u DCM pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (20.75 g; 81.2% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (m/z): 320 (M+1).

Metod 2:

[0039] Zagrejati suspenziju 2,2’-bipiridina (28.8 g, 56.5 mmol) i bakar(II)acetata (8.2 g, 45.2 mmol) u 1,2- dihloretanu (50 ml) do 70°C i provoditi azot tokom 3 minuta. Reakciona smesa se filtruje i filtrat doda a smesi of 2-hlor-4-[(3-tetrahidropiran-4-il-1H-pirazol-4-il)oksi]piridina (8 g, 22.6 mmol), kalijum ciklopropil(trifluoro)borata (6.7 g, 45.2 mmol) i natrijum karbonata (4.8 g, 45.2 mmol) u 1,2-dihloretanu (50 ml). Reakcionu smesu potom zagrevati na 70°C tokom četiri dana. Reakcionu smesu ohladiti na sobnu temperaturu, zatim filtrovati i isprati pomoću DCM. Filtrat se zatim ispere zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Rastvor se suši preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtruje i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje se vrši hromatografijom na koloni silika gela pomoću 1-10% MeOH u DCM pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (6.0 g; 82.2% prinos). MS (m/z): 320 (M+1).

1

[0040] Sledeća jedinjenja dobivaju se u suštini pomoću Metoda 1 Sinteze 20. Naglašene su promene u postupku obrade reakcije.

Tabela 5:

[0041] Sledeća jedinjenja dobivaju u suštini pomoću Metode 2 Sinteze 20.

Tabela 6:

1

(nastavak)

Sinteza 27

2-Hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidrofuran-3-il-pirazol-4-il)oksi-piridin, izomer 1

[0042]

[0043] Racemska smesa 2-hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidrofuran-3-il-pirazol-4-il)oksi-piridina (Sinteza 25) se prečišćava hiralnom hromatografijom pri čemu se dobiva enantiomer koji se prvi eluira jeste traženo jedinjenja. MS (m/z): 306 (M+1).

[0044] Uslovi prečišćavanja: CHIRALPAK® IC; mobilna faza : 20% etanol (EtOH) u ugljen dioksidu; brzina protoka: 300 g/min; UVW: 240 nm; retenciono vreme: 2.44 minuta.

Sinteza 28

2-Hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidrofuran-3-il-pirazol-4-il)oksi-piridin, izomer 2

[0045]

[0046] Racemska smesa 2-hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidrofuran-3-il-pirazol-4-il)oksi-piridin (Sinteza 25) se prečišćava hiralnom hromatografijom pri čemu se dobiva enantiomer koji se drugi eluira jeste

1

traženo jedinjenja. MS (m/z): 306 (M+1).

[0047] Uslovi prečišćavanja: CHIRALPAK® IC; mobilna faza : 20% EtOH u ugljen dioksidu; brzina protoka: 300 g/minut; UVW: 240 nm; retenciono vreme: 2.93 minuta.

Sinteza 29

2-Hlor-4-[1-(difluormetil)-3-(2-piridil)pirazol-4-il]oksi-piridin

[0048]

[0049] Ohladiti rastvor 2-hlor-4-[[3-(2-piridil)-1H-pirazol-4-il]oksi]piridina (2.0 g, 7.33 mmol) u DMF (73.34 ml) u ledenom kupatilu i dodati u porcijama natrijum hidrid (60% u mineralnom ulju, 880.02 mg, 22.00 mmol). Smesa se meša na 0°C tokom 10 minuta, zatim se ostavi da se ugreje do sobne temperature i meša se tokom 10 minuta. Potom se doda difluorjodmetan (10 wt% u THF, 27.19 ml, 36.67 mmol) i reakciona smesa se meša na 45°C preko noći. Reakciona smesa se ohladi do do sobne temperature i razblaži pomoću EtOAc. Isprati prvo 5% vodenim rastvorom litijum hlorida a zatim isprati zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida. Potom sušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata, rastvor se filtruje i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečišćava hromatografijom na koloni silika gela pomoću 0-50% EtOAc u DCM. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i koncentruju pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečišćava hromatografijom na koloni silika gela pomoću 0-10% EtOAc u DCM pri čemu se dobiva željeno jedinjenja (1.56 g; 65.9% prinos). MS (m/z): 323 (M+1).

[0050] Sledeća jedinjenja dobivaju u suštini pomoću Sinteze 29. Naglašene su promene u upotrebljenoj bazi, i/ili reakcionoj temperaturi.

1

Tabela 7:

1 (nastavak)

45 50

55

2

(nastavak)

Sinteza 41

2-Hlor-4-{[3-(piridin-2-il)-1-{[2-(trimetilsilil)etoksi]metil}-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin [0051]

[0052] Dodati natrijum hidrid (60% suspenzija u mineralnom ulju, 484 mg, 12.10 mmol) rastvoru 2-hlor-4-[[3-(2- piridil)-1H-pirazol-4-il]oksi]piridina (3.0 g, 11.00 mmol) u THF (110 ml) na 0°C. Potom se rastvor meša tokom 15 minuta na 0°C i doda se 2-(trimetilsilil)etoksimetil hlorid (2.02 g, 12.10 mmol). Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se potom koncentruje. Ostatak se particioniše između DCM i vode. Odvoji se organski sloj i suši preko natrijum sulfata. Reakciona smesa se filtruje i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečišćava hromatografijom na koloni silika gela pomoću 0-30% EtOAc u heksanu pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (3.64 g; 82.1% prinos). MS (m/z): 403 (M+1).

Sinteza 42

4-[[4-(1-Ciklopropil-3-tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksi-2-piridil]amino]benzonitril

[0053]

[0054] Rastvor 2-hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksi-piridina (400 mg, 1.2 mmol), p-aminobenzonitrila (219.9 mg, 1.9 mmol), cezijum karbonata (568.5 mg, 1.7 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)- 9,9-dimetilksantena (134.6 mg, 0.23 mmol) u 1,4-dioksanu (15 ml) zasititi azotom tokom pet minuta. Dobivenu smesu tretirati paladijum(II)acetatom (26.1 mg, 0.12 mmol) i provoditi azot tokom 5 minuta. Zatvoriti vialu i mešati na 100°C tokom dva sata a zatim na 80°C preko vikenda. Reakcionu smesu ohladiti na sobnu temperaturu, filtrovati kroz mali sloj CELITE® i isprati pomoću 5% MeOH u DCM. Filtrat se potom koncentruje pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (467 mg; 100% prinos). MS (m/z): 402 (M+1).

[0055] Sledeće jedinjenje se dobija u osnovi istim postupkom kao u Sintezi 42. Naglašene su promene u vrsti katalizatora, i/ili rastvaraču.

Tabela 8:

2 (nastavak)

Primer 1

2-{4-[(4-{[1-Ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol

[0056]

Metod 1:

[0057] Rastvor 2-hlor-4-(1-ciklopropil-3-tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksi-piridina (45.6 g, 142.6 mmol), 2-(4-amino-2-piridil)propan-2-ola (26.0 g, 171.1 mmol) i natrijum fenata (natrijum fenoksid, 26.5 g, 228.2 mmol) u 1,4-dioksanu (456 ml) dobro zasititi azotom tokom 20 minuta. Nastalu smesu tretirati 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantenom (8.25 g, 14.3 mmol) i bis(dibenzilidenaceton)paladijumom (4.10 g, 7.13 mmol). Refluktovati tokom 21 sata a potom se reakciona smesa ohladi do sobne temperature i meša preko noći. Reakciona smesa se filtruje kroz mali sloj celita (CELITE®) i ispere pomoću DCM (500 ml). Koncentrovati filtrat na slika gelu. Prečišćavanje se vrši hromatografijom na koloni silika gela pomoću 0-10% MeOH u EtOAc. Zatim se odgovarajuće frakcije koncentruju i suše u vakuumu preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (58.7 g; 91.7% prinos). MS (m/z): 436 (M+1). Nekoliko šarži proizvoda se dobije koristeći gornju metodu. Kombinovane šarže navedenog jedinjenja se rastvore (92.4 g) u EtOH (1 L). Rastvor se tretira pomoću QUADRASIL® MP (100 g, 1.0-1.5 mmol/g) i mućka na 60°C tokom jednog sata. Reakciona smesa se polako ohladi do sobne temperature i filtruje da se ukloni čvrsta supstanca. Zatim se filtrat koncentruje da se ukloni rastvarač. Rastvoriti ostatak u EtOH (500 ml) pri uz zagrevanje na 100°C. Zatim smesu polako ohladiti do sobne temperature i polako dodati vodu (500 ml). Reakciona smesa se ohladi na 5°C uz mešanje. Čvrsta supstanca se sakupi filtrovanjem i suši u vakuumu na 45°C preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (81.8 g). MS (m/z): 436 (M+1).

Metod 2:

[0058] Rastvoriti 2-hlor-4-(1 -ciklopropil-3 -tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksipiridin (400 mg, 1.2 mmol) u 1,4- dioksanu (15 ml) u viali. Dodati 2-(4-amino-2-piridil)propan-2-ol (266.5 mg, 1.6 mmol), cezijum karbonat (568.5 mg, 1.7 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten (134.6 mg, 0.23 mmol) i i provođenjem dobro zasitii azotom tokom 5 minuta. Dodati paladijum(II)acetat (26.1 mg, 0.12 mmol) i provoditi azot 5 minuta. Zatopiti vialu i mešati na 100°C preko noći. “Reakciona smesa se ohladi na sobnu temperaturu, filtruje kroz mali sloj celita (CELITE®) i ispere 5% MeOH u DCM. Koncentruje se potom i prečišćavanje se vrši reversno faznom hromatografijom (Redisep Rf Gold Visokom Performance C18 Reversno fazna kolona, 0-100% mravlja kiselina/acetonitril (ACN) u mravlja kiselina/voda). Koncentruju se odgovarajuće frakcije i ostatak se suši u vakuumu pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (341 mg; 67.3% prinos). MS (m/z): 436 (M+1).

[0059] Sledeća jedinjenja dobivaju u suštini pomoću Metoda 2 iz Primera 1. Naglašene su promene u vezi baze, katalizatora, liganda, i/ili rastvarača.

2

Tabela 9:

2 (nastavak)

(nastavak)

1 (nastavak)

2 (nastavak)

(nastavak)

4 nastavak

Primer 62

4-[(4-{[1-Ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]benzamid

[0060]

[0061] Dodati kalijum karbonat (80.4 mg, 0.58 mmol) rastvoru 4-[[4-(1-ciklopropil-3-tetrahidropiran-4-il-pirazol-4-il)oksi-2-piridil]amino]benzonitrila (467 mg, 1.16 mmol) u DMSO (5 ml). Dodati 30% vodonik peroksid (1.77 ml, 17.45 mmol) i reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smesa se razblaži vodom i ekstrahuje četiri puta pomoću DCM. Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida. Suše se preko ahidrovanog natrijum sulfata. Smesa se potom filtruje i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečišćava reversno faznom hromatografijom (Redisep Rf Gold Visokom Performance C18 Reversno fazna kolona, 0-100% mravlja kiselina/ACN u smesi mravlja kiselina/voda) pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (220 mg; 45.9% prinos). MS (m/z): 420 (M+1).

[0062] Sledeća jedinjenja se dobivaju u osnovi istim postupkom kao u sintezi iz Primera 62.

T l 1

(nastavak)

Primer 70

2-{4-[(4-{[3-Ciklopropil-1-(propan-2-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol

[0063]

[0064] Dobro zasititi produvavanjem azota rastvor metil 4-[[4-(3-ciklopropil-1-izopropil-pirazol-4-il)oksi-2-piridil]amino]piridin-2-karboksilata (298 mg, 0.76 mmol) u THF (6 ml) u zatopljenoj viali. Ukapavanjem dodati metilmagnezijum bromid (3M u dietil etru, 1.01 ml, 3.03 mmol) i smesu mešati na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Koncentrovati smesu pod sniženim pritiskom i razblažiti ostatak pomoću DCM i zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata. Organski sloj se potom odvoji i vodeni sloj se ekstrahuje pomoću DCM. Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida. Organski sloj se potom suši preko natrijum sulfata, filtruje i filtrat koncentruje. Prečišćavanje se vrši hromatografijom na koloni silika gela pomoću 5-10% MeOH u DCM pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (160 mg; 53.69% prinos). MS (m/z): 394 (M+1).

Primer 71

2-{5-[(4-{[3-(Piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol [0065]

[0066] Ohladiti rastvor of 2-[5-[[4-[3-(2-piridil)-1-(2-trimetilsililetoksimetil)pirazol-4-il]oksi-2-piridil]amino]-2-piridil]propan-2-ol (500 mg, 0.96 mmol) u trifluorosirćetnoj kiselini (3 ml) to 0°C u ledenom kupatilu. Dodati trietilsilan (1 ml, 6.24 mmol). Reakciona smesa se zatim meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smesa se koncentruje i ostatak se prečišćava reversno faznom hromatografijom (Redisep Rf Gold Visokom Performance C18 Reverse Phase Column, 0-100% 10 mM amonijum bikarbonat u ACN). Zatim se koncentruju odgovarajuće frakcije da bi se uklonio ACN. Preostala vodena smesa se ekstrahuje pomoću DCM, izoluje se organski sloj, i suši preko natrijum sulfata. Potom se smesa filtruje i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (168 mg; 44.9% prinos). MS (m/z): 389 (M+1).

Primer 72

N-[4-({1-(Difluormetil)-3-(tetrahidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4-il}oksi)piridin-2-il]piridazin-3-amin, izomer 1

[0068] Racemska smesa se N-[4-[1-(difluormetil)-3-tetrahidrofuran-3-il-pirazol-4-il]oksi-2-piridil]piridazin-3-amina (Sinteza 49) se prečišćava hiralnom hromatografijom pri čemu se dobiva enantiomer navedenog jedinjenja koji se prvo eluira. MS (m/z): 375 (M+1).

[0069] Uslovi prečišćavanja: CHIRALPAK® IC; mobilna faza : 30% izopropanol koji sadrži 0.2% izopropil amina u ugljen dioksidu; brzina protoka: 70 g/minut; UVW: 280 nm; retenciono vreme: 3.93 minuta.

[0070] Sledeće jedinjenje se dobija u osnovi istim postupkom kao u sintezi iz Primera 72. Naznačeni su alternativni uslovi prečišćavanja.

Tabela 11:

Postupak za sakupljanje difraktovanih X-zraka u primerima 77-79

[0071] Sakupiti XRD signale kristalne čvrste supstance na difraktometru X-zraka za praškaste supstance Bruker D4 Endeavor, opremljenim izvorom CuKa (λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak se skenira između 4 i 40° u 2θ, sa korakom od 0.009° u 2θ i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/korak, i sa divergencijom od 0.6 mm, 5.28 fiksirani anti-sketer, i 9.5 mm detektorskim prorezom. Suvi prah se postavi na kvarcni nosač uzorka i pripravi se glatka površina koristeći stakleni slajd. Difrakcioni signali se sakupe na sobnoj temperaturi i sobnoj relativnoj vlažnosti.

Primer 77

2-{4-[(4-{[1-Ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol, (2Z)-but-2-endioat (1:1)

[0072]

[0073] Dodati 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (142 mg) u ACN (2 ml). Čvrsta supstanca se potpuno rastvori uz mešanje na 80°C/1000 rpm. Potom se nastalom rastvoru doda maleinska kiselina (48 mg, 1.20 ekvivalenata, u 1 ml ACN na 80°C). Smesa je u početku zamagljena ali ubrzo rastvor postaje providan. Tada zaustaviti zagrevanje i mešanje. Rastvor potom ohladiti na sobnu temperaturu. Dodati drugih 2 ml ACN da bi se suspendovala čvrsta supstanca. Bela čvrsta supstanca se izoluje vakuum filtrovanjem i sušiti čvrstu supstancu na filtru tokom 15 minuta strujom vazduha. Sušiti potom čvrstu supstancu na 65°C u vakuumu preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (132 mg, 73.4% prinos). Teoretski procenat jona maleinske kiseline nastale soli za mono so je 21.0 %. Analizom suprotnog jona pomoću HPLC određeno je da je stvarni procenat jona maleinske kiseline u nastaloj soli iznosi 17.2 %. Analiza suprotnog jona ukazuje da je dobijena mono so. Difrakcija X-zraka praha iz Primera 77

[0074] Dobijeni uzorak iz Primera 77 okarakterisan je na osnovu izgleda XRD spektra koristeći CuKa ozračivanje koji imaju difrakcione signale (2-teta vrednosti) kao što je opisano u Tabeli 13 dole niže, i posebno postojanjem signala na 9.6° u kombinaciji sa jednim ili više signala odabranih od grupe koja se sastoji od 12.5°, 17.5°, i 16.9°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 12: izgled difrakcije X-zraka praha iz Primera 77

Primer 78

2-{4-[(4-{[1-Ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol, metansulfonat (1:1)

[0075]

[0076] Dodati 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (113 mg) u aceton (2 ml). Čvrsta supstanca se potpuno rastvori uz mešanje na 60°C/1000 rpm. Potom nastalom rastvoru dodati metansulfonsku kiselinu (21 µL, 1.24 ekvivalenata). Tada zaustaviti zagrevanje i mešanje. Rastvor potom ohladiti na sobnu temperaturu. Dodati drugih 3 ml acetona da bi se suspendovala čvrsta supstanca. Bela čvrsta supstanca se izoluje vakuum filtrovanjem; sušiti čvrstu supstancu na filtru tokom 15 minuta strujom vazduha. Sušiti čvrstu supstancu na 65°C u vakuumu preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (87 mg, 63.08% prinos). Teoretski procenat jona metansulfonske kiseline nastale soli za mono so je 18.1%. Analiza suprotnog jona pomoću HPLC određeno je da je stvarni procenat jona metansulfonske kiseline u nastaloj soli iznosi 16.2 %. Analiza suprotnog jona ukazuje da je dobijena mono so.

4

Difrakcija X-zraka praha iz Primera 78

[0077] Dobijeni uzorak iz Primera 78 okarakterisan je na osnovu izgleda XRD spektra koristeći CuKa ozračivanje koji imaju difrakcione signale (2-teta vrednosti) kao što je opisano u Tabeli 14 dole niže i posebno postojanjem signala na 7.0° u kombinaciji sa jednim ili više of the signala odabranih od grupe koja se sastoji od 14.1°, 10.8°, i 18.6°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 13: izgled difrakcije X-zraka praha iz Primera 78

Primer 79

2-{4-[(4-{[1-Ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol 4- metilbenzensulfonat (1:1)

[0078]

[0079] Dodati 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol (122 mg) u EtOAc (2 ml). Čvrsta supstanca se potpuno rastvori uz mešanje na 80°C/1000 rpm. Potom dodati nastalom rastvoru p-toluensulfonsku kiselinu monohidrat (1.23 ekvivalenata, u 1 ml of EtOAc na 80°C). Mešati gustu smesu na 80°C/1000 rpm tokom 30 minuta. Tada zaustaviti zagrevanje i nastaviti mešanje reakcione smese pri 1000 rpm uy njeno hlađenje na sobnu temperaturu. Bela čvrsta supstanca se izoluje vakuum filtrovanjem; sušiti čvrstu supstancu na filtru tokom 15 minuta strujom vazduha. Sušiti potom čvrstu supstancu na 65°C u vakuumu preko noći pri čemu se dobiva navedeno jedinjenje (159 mg, 93.40% prinos). Teoretski procenat jona p-toluenesulfonske kiseline nastale soli za mono so je 29.3%. Analiza suprotnog jona pomoću HPLC određeno je da je stvarni procenat jona metansulfonske kiseline u nastaloj soli iznosi 28.3%. Analiza suprotnog jona ukazuje da je dobijena mono so.

Difrakcija X-zraka praha iz

Primera 79

[0080] Dobijeni uzorak iz Primera 79 okarakterisan je na osnovu izgleda XRD spektra koristeći CuKa ozračivanje koji imaju difrakcione signale (2-teta vrednosti) kao što je opisano u Tabeli 15 dole niže i posebno postojanjem signala na 17.8° u kombinaciji sa jednim ili više of the signala odabranih od grupe koja se sastoji od 19.7°, 18.4°, i 22.0°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 14: izgled difrakcije X-zraka praha iz

Primera 79

[0081] Prenošenje TGFβ signala bilo je povezano sa rakom i progresijom tumora u nekoliko indikacija (Elliott et. al. (2005) J Clin Oncol 23:2078; Levy et. al. (2006) Cytokine & Rast Factor Rev 17:41-58). Postoji nekoliko tipova raka gde TGFβ ligandi proizvedeni od strane tumora ili od strane strome u mikrookruženju tumore mogu učestvovati u progresiji tumora. Ćelije raka prostate pacova MATLyLu (Steiner i Barrack (1992) Mol. Endocrinol 6:15-25) i MCF-7 humane ćelije raka dojke (Arteaga, et al. (1993) Ćelija Rast i Differ. 4:193-201) postale su više tumorogenične i metastatičke posle transfekcije sa vektorom koji ekspresuje miša TGFβ1. TGF-β1 je bio povezan sa angiogenezom, metastazom i slabom prognozom humane prostate i napredovanog raka želuca (Wikstrom, P., et al. (1998) Prostate 37: 19-29; Saito, H. et al. (1999) Cancer 86: 1455-1462). Kod raka dojke, loša prognoza je povezana sa povišenim TGF-β (Dickson, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:837-841; Kasid, et al. (1987) Rakom Res.47:5733-5738; Daly, et al. (1990) J. Cell Biochem. 43:199-211; Barrett-Lee,

et al. (1990) Br. J Cancer 61:612-617; King, et al. (1989) J. Steroid Biochem.34:133-138; Welch, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7678-7682; Walker, etal. (1992) Eur. J. Cancer 238:641-644) a indukcija TGF-β1 tretmanom tamoksifenom (Butta, et al. (1992) Rakom Res.

52:4261- 4264) bila je povezana sa neuspehom tretmana tamoksifenom raka dojke (Thompson, et al. (1991) Br. J. Cancer 63:609-614). Anti TGFβ1 antitela inhibiraju rast MDA-231 humanih ćelija raka dojke kod atimičnih miševa (Arteaga, et al. (1993) J. Clin. Invest. 92:2569-2576), što je tretman koji koreliše sa povećanjem prirodne aktivnosti ubijanja (umorstva) ćeija u slezini. CHO ćelije transfektovane latentnim TGFβ1 takođe su iskazale sniženu NK aktivnost i povećani rast tumora u miševima bez timusa (Nude mice, Wallick, et al. (1990) J. Exp. Med.172:1777-1784). Tako, TGF-β sekretovan iz tumora dojke može prouzrokovati endokrinu imunu supresiju. Pokazalo se da visoke koncentracije TGFβ1 u plazmi ukazuju na lošu prognozu kod pacijenata sa odmaklim rakom dojke (Anscher, et al. (1993) N. Engl. J. Med. 328:1592-1598). Pacijenti sa visokom koncentracijom TGFβ u cirkulaciji pre visoke doze hemoterapije i autologne transplatacije koštane srži su pod visokim rizikom za dobijanje hepatičke veno-okluzovne bolesti (15-50% od svih pacijenata gde se mortalitet kreće do 50%) i od idiopatskog intersticijalnog pneumonitisa (40-60% od svih pacijenata). Implikacije ovih nalaza uključuju 1) da se povišeni nivoi TGFβ u plazmi mogu upotrebiti identifikaciju pacijenata pod rizikom i 2) da redukcija (snižavanje) signalizacije TGFβ može uticati na snižavanje morbiditeta i mortaliteta ovim standardnim tretmanima kod pacijenata obolelih od raka dojke.

[0082] U novijim publikacijama takođe je predloženo da TGFβ signaliranje može imati važan uzročni uticaj u pojavi rezistencije tumora na standardne terapije lečenja, uključujući hemoterapije i receptorske tirozin kinaze lečenja, uključujući hemoterapije i receptorske tirozin kinaze (WO2012138783). Specifično, kod raka debelog creva, pokazano je da specifična signatura genske ekspresije da izoluje grupu pacijenata rezistentnih na uobičajene tretmane prvo linije odbrane. Ove tumorske ćelije ponovo zadobijaju osetljivost na terapiju kada je TGFβ signalni put blokiran pomoću malog molekula specifičnog inhibitora TGFβRI (Huang, et. al. (2012) Ćelija 151:937-950; Sadanandam et. al. (2013) Nat Med 19:619-625; Vermeulen et. al. (2013) Nat Ned 19:614-618; Roepman et. al. (2014) 134:552-562).

[0083] Mijelodisplastični sindromi (MDS) su oboljenja hematopoetičkog sistema u mijeolidnom odeljku i karakterisane su neefektivnom proizvodnjom mijeolidnih ćelija. MDS je povezan sa izmenama TGFβ puta predstavljenim sniženim nivoima SMAD7. SMAD7 je inhibitorni SMAD koji tako deluje da inhibira TGFβ uslovljenu signalizaciju SMAD i nalazi se niže od ligandom aktiviranih signalizacija preko TGFβRI i TGFβRII. Za prekomernu ekspresiju SMAD7 se misli da

4

dovodi do prekomerne aktivacije TGFβ signalizajie u MDS, i ovaj fenotip može preusmeriti delovanjem inhibitorima TGFβRI malim molekulima (Zhou et. al. (2011) Rakom Res. 71:955-963). Slično tome, kod glioblastome (GBM), nivoi TGFβ liganda su povišeni i povezani sa progresijom oboljenja. Za antisensni nukleotidni terapeutik, AP1002, pokazano je da je potencijalno aktivan u setu GBM pacijenata (Bogdahn et. al. (2011). Curr Pharm Biotechnol). Kod melanoma, signalni TGFβ put aktivacije takođe je povezan sa rezistencijom na BRAF i MEK inhibitore (Sun et. al. (2014) Nature.508:118-122).

[0084] Mnoge maligne ćelije luče transformišući faktor-β rasta (TGF-β), koji je snažni imunosupresant, što ukazuje da produkcija TGFβ može predstavljati značajan mehanizam za izbegavanje tumora od strane imunokontrole domaćina (Flavell et. al. (2010) Nat Rev Immunol 10:554-567; Kast et. al. (1999) Leukemia 13:1188-1199). Uspostavljanje leukocitne subpopulacije prekinutom signalizacijom TGFβ u domaćinu tumora iskazuje se kao potencijalno sredstvo za samostalnu imunoterapiju raka ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih imunoterapija, na primer u kombinaciji sa jednim ili više PD-1 inhibitora kao što je nivolumab, pembrolizumab, PD-L1 inhbitori, vakcine protiv raka, i bi specifični imunski angažovani molekuli kao što je IMCgp100. Za TGFβ ligand što proizvode limfociti preklinički je pokazano da antagonizuju tumor imuni nadzor (Donkor et. al. (2012) Development. Oncoimmunology 1:162-171, Donkor et. al. (2011) Cytokine Immunity 35:123-134); prekidajući ovu osu preklinički je pokazano pri čemu se dobiva anti-tumorska korist u mišjim modelima i in vitro (Zhong et. al. (2010) Rakom Res 16:1191-1205; Petrausch et. al. (2009) J Immunol 183:3682-3689); Wakefield et. al. (2013) Nat. Rev Rakom 13:328-341). Transgenski životinjski model sa prekinutom TGFβ signalizacijom u T ćelije je sposoban da vrši eradikaciju uobičajeno letalni TGFβ previše ekspresujući limfoma tumor, EL4 (Gorelik i Flavell, (2001) Nature Medicine 7(10): 1118-1122). Regulacija nadole sekrecije TGFβ u tumorske ćelije rezultuje u obnovi imunogenosti kod domaćina, pri čemu T-ćelijska neosetljivost na TGFβ rezultuje u ubrzanoj diferencijaciji i autoimunosti, elementi koji mogu biti potrebni u cilju borbe protiv samo-antigenski-ekspresovanih tumora u domaćinu. Imunosupresivni efekti TGFβ takođe su obuhvaćeni subpopulacijom HIV pacijenata sa nižim imunim odgovorom od predviđenog zasnovanom na njihovom broju CD4/CD8 T ćelija (Garba, et al. J. Immunology (2002) 168: 2247-2254). TGFβ neutrališuće antitelo bilo je sposobno da preusmeri efekat u ćelijskoj kulturi, što ukazuje da inhibitori TGFβ signalizacije mogu imati upotrebu u preusmeravanju imune supresije prisutne u ovoj podgrupi HIV pacijenata.

[0085] Za vreme najranije faze karcinogeneze, TGFβ1 može delovati kao potentni supresor tumora i može posredovati u delovanju nekih hemopreventivnih agenasa. Međutim, u jednoj tački razvoja i progresije malignih neoplazmi, tumorske ćelije izgleda da izbegavaju inhibiciju TGFβ-zavisnog rasta paralelno sa pojavom bioaktivnog TGFβ u mikrookruženju. Dvostruko delovanje tumor supresivno/tumor promotivno TGFβ najdetaljnije su razjašnjeno u transgenskom sistemu koji overekspresuje TGFβ u keratinocitima. Dok su transgeni miševi bili rezistentniji na formiranje benignih lezija na koži, brzina metastatske konverzije kod transgenih miševa su povećane (Cui, et al (1996) Ćelija 86(4):531-42). Proizvodnja TGFβ1 od strane malignih ćelija kod primarnih tumora izgleda da se povećava sa napredovanjem faza tumorske progresije. Proučavanja mnogih važnih epitelijalnih tipova raka sugeriše da do povećane proizvodnje TGFβ od strane humanih kancera dolazi u relativno kasnoj fazi tumorske progresije. Nadalje, ovaj sa kancerom povezani TGFβ obezbeđuje tumorskim ćelijama selektivnu prednost i promoviše progresiju tumora. Uticaj TGFβ na interakcije ćelija/ćelija i ćelija/stroma rezultuje u većoj sklonosti na napad i metastazu. Sa tumorom asocirani TGFβ može dozvoliti tumorskim ćelijama da izbegnu nadgledanje imunog sistema jer je snažni inhibitor klonalne ekspanzije aktiviranih limfocita. Za TGFβ takođe je pokazano da inhibiraju proizvodnju angiostatina. Terapeutski modaliteti za rak kao što je terapija zračenjem i hemoterapija indukuju proizvodnju aktiviranih TGFβ u tumoru, time vršeći selekciju rasta malignih ćelija rezistentnih na inhibitorne efekte TGFβ rasta. Tako, ovi tretmani protiv raka povećavaju rizik i ubrzavaju razvoj tumora sa unapređenim rastom i invazivnošću. U toj situaciji, upotreba agenasa koji ciljaju TGFβ-posredovanu transdukciju signala može biti vrlo efikasna terapeutska strategija. Rezistencija tumorskih ćelija prema TGFβ pokazano je na poništavaju značajan deo citotoksičnih efekata terapija zračenjem i hemoterapije i od tretmana zavisne aktivacije TGFβ u stromi može čak biti štetno jer može učiniti mikrookruženje pogodnije za progresiju tumora i doprinosi oštećenju tkiva što dovodi do fibroze. Razvoj inhibitora TGFβ signalne transdukcije verovatno je da će povoljno uticati na tretman samog kancera u progresiji i u kombinaciji sa drugim terapijama.

[0086] Dodatno, poznato je u oblasti da je TGFβ signalizacija uključena u fibroznim uslovima kao što je fibroza jetre i kod hroničnog oboljenja bubrega. Videti na primer, Ueha S, et. al.2012. Front Immunol. 3:71. Ćelijski i molekulski mehanizmi hronične sa inflamacijom povezane fibroze organa; Bottinger et al.2002. J Amer Soc Nephrol. 13:2600. TGF-β Signaling in Renal Disease; Trachtman H., et al. 2011. Kidney International 79:1236. Faza 1, jednodozna studija fresolimumaba, koji je anti-TGF-β antitelo, u rezistentnoj primarnoj fokalnoj segmentnoj glomerulosklerozi; i Rosenbloom J, et. al.2010. Narativni pregled: fibrotička oboljenja: ćelijski i molekulski mehanizmi i nove terapije . Ann Intern Med 152: 159-166.

[0087] Sledeći testovi dokazuju da jedinjenja iz primera inhibiraju TGFβR1 u biohemijskom testu, na ćelijskom nivou, i u životinjskom modelu.

Biohemijski test na TGFβR1 aktivnost

[0088] Namena ovog in vitro testa je identifikacija jedinjenja koja inhibiraju TGFβR1.

4

Ekspresija proteina i prečišćavanje

[0089] Umetni nukleotidnu sekvencu koja kodira amino kiseline 200-503 humanog TGFβR1 (NM 004612.2) sa amino kiselinom Thr na mestu 204 promenjenom u Asp kôd PFASTBAC™1 (Invitrogen, Cat# 10360-014) vektor sa N-terminalnim HIS oznakom. Generisati potom bakulovirus prema protokolu BAC-TO-BAC® Bakulovirus Expression Systems (Invitrogen, Cat# 10359-016). Inficirati Sf9 ćelije sa 1.5 x 10<6>ćelija/ml koristeći 15 ml P1 virus na litar kulture i inkubirati na 28°C tokom 48 sata. Požnjeti ćelije i čuvati na -80°C za potonje prečišćavanje proteina. Izvršiti prečišćavanje proteina na 4°C. Suspendovati kuglice od 2L kulture u 100 ml pufera A (50 mM Tris-HCl, pH8, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 5mM imidazol, 10% glicerol) koji sadrže 0.2% Triton X-100 i Roche koktel proteaznog inhibitora potpuno bez EDTA i homogenizuj. Pročistiti ćelijske lizate centrifugiranjem u Bechman JA-18 rotoru tokom 45 minuta na 16,500 rpm. Inkubirati supernatant sa 5 ml smole sa afinitetom za metal Ni-NTA (Qiagen) tokom tri sata. Nanesite smolu na kolonu i isprati puferom A. Eluirati HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) protein pomoću 0-400 mM imidazolskog gradijenta u puferu A. Koncentrovati HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) frakcije i nanesite na HiLoad 16.600 Superdex 200 kolonu (GE Healthcare Bioscience). Eluirati kolonu puferom (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1mM DTT). Koncentrovati HIS-TGFβR1(200-503)(T204D) frakcije. Odrediti koncentraciju proteina pomoću UV280. Alikvot proteina čuvajte na -80 °C.

Uslovi TR-FRET testa

[0090] Pre-inkubirati jedinjenja sa rekombinantnim His-TGFβR1(200-503)(T204D), i Eu-anti-HIS antitelima za detekciju (InVitrogen, Cat# PV5597) u crne reakcione ploče. Pripremiti serijska razblaženja jedinjenja od 1mM zalihe test jedinjenja u DMSO. Serijski razblažiti rastvor sa zalihe 3-struko u DMSO pri čemu se dobiva kriva razblaženja od deset tačaka krajnje koncentracije jedinjenja u opsegu od 2 µM do 0.1 nM. Krajnja DMSO koncentracija u testu je 4%. Inicirati reakciju dodavanjem kinaznog obeleživača (Kinase Tracer 178, Life Technologies PR9080A, InVitrogen). Posle 45-60 minuta, pročitati fluorescenciju na čitaču.

[0091] Izračunati procenat inhibicije jedinjenja tretiranih grupa u odnosu na grupu sa minimumom inhibicije (samo DMSO, kontrolni). Izračunati apsolutne IC50 vrednosti koristeći nelinearnu logičku jednačinu od 4 parametra gde je apsolutna IC50 = koncentracija ona koja uzrokuje 50% inhibicije koristeći ActivityBase softver za analizu podataka. Rezultati ovih testova dokazuju da su jedinjenja iz datih primera efikasni inhibitori TGFβR1. Na primer, sve jedinjenja iz primera iskazuju IC50 vrednosti manje od 1 µM. Specifično, IC50 iz Primera 1 iznosi 0.027 µM.

4

Ćelijski Luciferaza reporter test za TGFβR1 aktivnost

[0092] Namena ovog testa je identifikacija jedinjenja koja selektivno ometaju SMAD 2,3-zavisnu gensku ekspresiju u ćelijskim testovima pokazujujući da oni inhibiraju TGFβR1 na ćelijskom nivou.

[0093] Pripremiti HEK293 ćelije (ATCC, CRL-1573) da ekspresuju luciferazu svitaca od SMAD 2,3-promotera koji odgovara na TGFβ stimulaciju. Takva ćelijska linija može se generisati inficiranjem sa lentiviralnim česticama (SA Biosciences) i selekcijom na puromicin rezistenciju. Nanesite na ploču HEK293_SMAD 2/3 ćelija od za test pripremljenih zamrznutih zaliha u obimu od 15,000 ćelija na bunarčić na ploči od 96 bunarčića u OPTI-MEM® medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Posle 72 sata, zameniti medijum za OPTI-MEM® koji sadrži 0.1% serum albumina govečeta. Pripremiti jedinjenja koja se testiraju u DMSO tako da se dobije 10 mM rastvora u zalihi. Serijski razblažiti rastvor sa zalihe trostruko u DMSO da bi se dobila finalna kriva koncentracija jedinjenja od deset tačaka u opsegu od 20 µM do 1 nM sa finalnom koncentracijom u DMSO od 0.5% u eseju. Dodati jedinjenja koja se testiraju i posle ekvilibracije tokom jednog sata, dodati TGFβ (krajnja koncentracija = 2 nM, R&D Systems).

[0094] Posle 24 sata, dodati svakom bunarčiću pufer za lizu [Glo Puferu za liziranje (Cat #E2661)] i luciferzni reagensa [Promega Bright Glo Luciferase Reagensa (Cat #E2620)] da se udvostruči zapremna u bunarčiću. Prebaciti alikvote (80 µL) u ploče sa bunarčićima sa belim dnom radi čitanja luminiscencije na čitaču za ploče sa bunarčićima (Emission filter: Luminiscencije 700, čitanje 1 sekund). Izračunati procenat inhibicije jedinjenja tretiranih grupa u odnosu na grupu sa minimalnom inhibicijom (samo DMSO, kontrola). Izračunati relativne IC50 za svako jedinjenje iz studije o doznoj zavisnosti i to je koncentracija neophodna da se dostigne inhibicija od 50%. Fitovati generisane podatke iz proučavanja dozne zavisnosti‚ u logičku jednačinu od 4 parametra koristeći ActivityBase softver za analizu podataka. Rezultati ovih testova dokazuju da su jedinjenja iz datih primera efikasni inhibitori aktivnosti luciferaznog reportera za TGFβ-stimulisane HEK293_SMAD2/3 ćelije. Na primer, sve jedinjenja iz primera iskazuju IC50 vrednosti manje od 1 µM. Specifično, IC50 iz Primera 1 iznosi 0.0824 µM (±0.005, n=2).

IVTI

Test

[0095] Namena ovog testa je merenje sposobnosti testiranih jedinjenja da inhibiraju pSMAD2 ekspresiju kod tumora u EMT6-LM2 singeneskom životinjskom modelu, drugim rečima, testom se određuje sposobnost jedinjenja koje se testira da inhibira TGFβRI signalizaciju u životinjskom modelu čvrstog tumora.

4

Generisanje EMT6-LM2 ćelija

[0096] Supkutano implantirati EMT-6 ćelije (ATCC, CRL-2755) (5 x 10<5>/životinja) u slabinu imuno kompetentnih BALB/cAnNHsd miševa (Harlan Laboritories). Kada tumori dostignu veličinu od približno 3000 mm<3>, žrtvujte životinje ugušenjem pomoću CO2. Izolujte pluća životinje koja nosi tumor i stavite u ćelijsku kulturu. Nežno homogenizujte pluća do nastanka jednoćelijske suspenzije. Ćelije uzgajiti u ćelijskom medijumu (IMDM, 10% FBS) i izolujte tumorske ćelije pri čemu se dobija EMT6-LM1ćelija. Ponoviti gornji postupak koristeći EMT6-LM1 ćelije za implantaciju radi generisanja EMT-LM2 ćelija.

Prečišćeni fosfo HIS-SMAD2

(pSMAD2)

[0097] Umetni nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SMAD2 (NM_005901.5) cele dužine u PFASTBACHTA™ (Invitrogen, Cat # 10584-027) vektor, pri čemu nastaje bakulovirus konstrukt za ekspresovanje HIS-SMAD2 proteina. Umetni nukleotidnu sekvencu koja kodira amino kiseline 148-503 humanog TGFβR1 (NM_004612.2) sa amino kiselinom Thr na mestu 204 promenjenim u Asp u PFASTBACHTA™ (Invitrogen, Cat # 10584-027) vektor, pri čemu nastaje bakulovirus konstrukt za ekspresovanje HIS-TGFβR1(148-503)(T204D) proteina. Generisati bakulovirus prema protokolu BAC-TO-BAC® Bakulovirus Expression System (Invitrogen). Inficirati Sf9 ćelije pri 1.5 x 10<6>ćelija/ml koristeći 10 ml P1 virus od HIS-SMAD2 i P1 virus od HIS-TGFβR1(148-503)(T204D) na litar kulture i inkubirati na 28°C tokom 45 sati. Dodati okadaičnu kiselinu do krajnje koncentracije od 0.1 µM. Posle inkubiranja od dodatna tri sata, žanjite ćelije i čuvajte na -80°C za kasnije prečišćavanje proteina. Izvršiti prečišćavanje proteina na 4°C. Lizirati kuglice zamrznutih ćelija od 6 L kulture inkubiranjem uz mešanje u 300 ml hladnog pufera A (50 mM natrijum fosfat, pH7.5, 300 mM NaCl, 2mM β- mercaptoetanol, 5 mM imidazol, 10% glicerol, 0.1 µM okadaična kiselina) koji sadrži 0.1% TRITON® X-100 i Roche koktel proteaznog inhibitora potpuno bez EDTA i homogenizuj. Pročistiti ćelijske lizate centrifugiranjem u Bechman JA-18 rotoru tokom 45 minuta na 16,500 rpm. Inkubirati supernatant sa 10 ml smole sa afinitetom za metal TALON (Clontech, Cat# 635504) tokom dva sata. Isprati šaržu sa 100 ml pufera A koji sadrži 0.1% TRITON® X-100. Nanesite smolu na kolonu i isprati puferom A. Eluirati frakcije HIS-SMAD2 proteina gradijentom 0-100 mM imidazola u puferu A. Sakupite frakcije koje sadrže fosfo HIS-SMAD2 i dopunite 0.1 µM okadiačnom kiselinom i 5 mM EDTA. Odrediti koncentraciju proteina pomoću BioRad proteinskog testa (BioRad DC Protein Test kit #500-0116) koristeći BSA kao standard. Uzmite alikvot proteina i čuvajte na -80°C.

Živa faza

[0098] Uzgajite EMT6-LM2 ćelije u mediju Iscoves Modified Dulbecco’s Media (MDM)

4

dopunjenim sa 10% FBS, 2 mM Glutamax i 0.1 mM ne-esencijalnih amino kiselina i inkubirajte na 37°C u 5% CO2. Tripnizujte i izolujte ćelije iz ćelijske kulture. Ponovo suspendujte ćelije u Hankov uravnoteženi rastvor soli (HBSS), zatim pomešajte sa MATRIGEL® (1:1). Potom supkutano implantirajte ćelije (5 x 10<5>/životinja) u zadnju slabinu miša (ženke BALB/c miševa, Harlan). Zapreminu tumora izmeriti pomoću kalipera (šestara) i kao i težinu životinje dva puta nedeljno. Kada zapremina tumora dostigne približno 200-250 mm<3>, izmešajte životinje i grupišite u kontrolnu koja se dozira samo nosačem (rastvaračem) i grupe koja se doziraju jedinjenjima. Primenite jedinjenja (formulisana u 1% hidroksietilcelulozi (HEC) i 0.25% TWEEN® 80 i 0.05% Antifoam) i kontrolni rastvor (1% HEC i 0.25% TWEEN® 80 i 0.05% Antifoam) koristeći oralnu gavažu. Generisati doznu zavisnost testiranjem jedinjenja u pojedinačnim vremenskim tačkama (2 sata) sledeći pojedinačna doziranja od: 2.7, 8.3, 25, 75, ili 150 mg/kg. Izvršite proveru vremenskog kursa na izračunatim (detalji metode dati dole niže) TED50 ili TED80 dozama studije o doznoj zavisnosti žrtvujući miševe na većem broju vremenskih tačaka između 1 sata i 16 sati posle jedne doze.

Obrada tkiva

[0099] Žanjite tumosko tkivo i homogenizujte kao što je opisano dole niže. Zamrznite tumosko tkivo (∼100 mg šarža) u tečnom azotu i pulverizujte tučkom. Stavite pulverizovano tkivo u epruveticu (Lysing Matrix A epruveta, MPBio # 6910-100) na suvi led i homogenizujte u puferu za liziranje (0.6 ml svaka) (150 mM NaCl; 20 mM Tris, pH 7.5; 1 mM etilendiamin-tetrasirćetna kiselina (EDTA); 1 mM etilen glikol tetrasirćetna kiselina (EGTA); 1% TRITON® X-100; Proteazni inhibitorski koktel (Sigma P8340); Fosfatazni inhibitorski koktel II (Sigma P5726); Fosfatazni inhibitorski koktel III (Sigma P0044)) tokom 25 sekundi koristeći Bio101 FASTPREP® FP120 homogenizator (namešten na 4.5). Peletirajte ćelijski debris i kuglice centrifugiranjem na 14,000 x g tokom 10 minuta na 4°C. Prenesite lizate u novu epruvetu za mikrocentrifugiranje i ponovo centrifugirajte, na 14,000 x g tokom 10 minuta na 4°C. Prenesite centrifugirane lizate na ploču od dubokih 96 bunarčića i čuvajte na ledu. Potom odrediti koncentraciju proteina u svakom lizatu koristeći BioRad proteinski test (BioRad DC Protein Test kit #500-0116) prema sledećem uputstvu: pripremiti reagens za rad dodavanjem reagensa iz kompleta S (20 μL) svakom 1ml reagensa iz kompleta A potrebnom za test. Pripremiti 3-5 razblaženja standarda od 0.2 mg/ml do 1.5 mg/ml proteina i generisati standardnu krivu. Pipetirajte 5 μL standarda i uzorka u čistu, suvu mikrolitarsku ploču. Dodati 25 μL reagensa za rad u svaki bunarčić. Potom dodati 200 μL reagensa B u svaki bunarčić i mućkajte 5 sekundi. Posle 15 minuta, očitajte apsorbancu svakog bunarčića na 750 nM. Nivo proteina svakog bunarčića određeni su upoređivanjem apsorbance bunarčića sa uzorcima sa standardnom krivom izvedenom od bunarčića

4

sa standardom. Normalizujte tumorske lizate na 10 mg/ml pomoću pufera za liziranje prilikom pripreme za analizu pSMAD2 i totalnog SMAD2/3 pomoću ELISA-e kao metode opisane dole niže.

SMAD ELISA

[0100] Tumorski lizati se testiraju koristeći nezavisne ELISA ploče, gde se jedna ploča koristi za određivanje ukupnog SMAD 2/3 nivoa a druga ploča se koristi za određivanje fosfo SMAD 2 nivoa. Dok je antitelo za premaz (coating) isto za obe ploče, sekundarno antitelo je specifično za ukupni SMAD 2/3 ili fosfo SMAD 2. Ove ploče se kolektivno nazivaju "ELISA ploče" a odvojeno kao "Total ELISA ploča" ili "fosfo ELISA ploča", redom. Pripremiti antitelo za premaz (coating) na 2.5 µg/ml u BupH Karbonat-Bikarbonat puferu (anti-SMAD 2/3 monoklonalno antitelo, BD Biosciences #610843; BupH Karbonat-Bikarbonat od Pierce #28382) i dodati 100 µL po bunarčiću u imunoploče od 96-bunarčića (Thermo Scientific #439454) i inkubirati preko noći na 4°C na platformi mućkalice radi generisanja ELISA ploča. Potom, isprati ELISA ploče četiri puta puferom za ispiranje (0.5% TWEEN® 20 u tris puferovanom zasićenom rastvoru natrijum hlorida (TBS), pH 8.0 od Sigma #T-9039) i zatim blokirati pomoću 200 µL na bunarčić blokirajućeg pufera (1% serum albumin govečeta (BSA) u 1x TBS) na sobnoj temperaturi na platformi mućkalice tokom dva sata. Isprati četiri puta puferom. Fosfo SMAD ELISA ploči dodati 100 µL na bunarčić tumorskog lizata ili nosećeg lizata pri 10 mg/ml, odgovarajućim bunarčićima. Total ELISA ploči dodati 98 µL na bunarčić pufera za liziranje i 2 µl na bunarčić 10 mg/ml tumorskog lizata ili nosećeg lizata odgovarajućim bunarčićima (finalna količina 0.02 mg proteinskog lizata). Standardna kriva je takođe dodata svakoj ELISA ploči (obe, fosfo i total) koristeći prečišćen pSMAD2. Inkubirati preko noći. Isprati ELISA ploče ponovo četiri puta sa puferom za ispiranje. Pripremiti sekundarna antitela (Millipore anti-fosfo SMAD2 zečije monoklonalno antitelo #04-953; Millipore anti-SMAD2/3 zečije poliklonalno antitelo #07-408) u razblaženju od 1:500 u puferu za liziranje sa dodatim1% BSA i zatim dodati 100 µL na bunarčić na odgovarajućoj ploči. Inkubirati ploče na sobnoj temperaturi tokom dva do tri sata. Isprati četiri puta sa puferom za ispiranje i dodati 100 µL na bunarčić antitelo reporter (anti-rabbit HRP, GE Healthcare #NAV934V, razblaženo 1:10,000 u puferu za blokiranje) u pločama. Inkubirati tokom jednog sata na sobnoj temperaturi i finalno isprati ploče četiri puta puferom za ispiranje i dodati 100 µL na bunarčić na sobnoj temperaturi 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbenzidina (TMB; Surmodics/BioFX #TMBW-0100-01). Inkubirati potom ploče na 37°C do trideset minuta. Zaustaviti reakciju dodavanjem 100 µL Stop rastvora (1N H2SO4). Očitati apsorbancu (OD) na 450 nm na čitaču za ploče.

[0101] Koristite odnos ukupnog SMAD (tSMAD) prema fosfo SMAD (pSMAD) kao noseću grupu za određivanje minimuma inhibicije (0%) pSMAD signala. Izračunati procenat inhibicije za jedinjenja tretiranih grupa u odnosu na minimum pSMAD inhibicije noseće grupe. Izračunati TED50 i TED80 iz dozne zavisnosti (neophodna doza da se postigne 50% i 80% inhibicije u datoj vremenskoj tački, redom) koristeći NLIN procedure u SAS (Version 9.3, Cary, NC). Ovim testom pokazuje se da Primer 1 ima TED50 vrednost od 10.8 mg/kg 2 sata posle 1 doze, a TED80 od 24.1 mg/kg. Studijom vremenske zavisnosti (time course study) na TED50 dozi (11 pmk), Primer 1 pokazuje 48% inhibicije na jedan sat i 39% inhibicije na dva sata posle doziranja. Studijom vremenske zavisnosti (time course study) na (25 mpk), Primer 1 pokazuje 71% inhibicije na jedan sat i 70% inhibicije na dva sata posle doziranja.

[0102] Jedinjenja ovog pronalaska su obično efikasna u širokom opsegu primenjenih doza. Na primer, dnevne doze obično fluktuiraju oko 1-2000 mg. Poželjno je da se takva doza nalazi u dnevnom opsegu od 10-1000 mg. Poželjnije je da se takve doze nalaze u dnevnom opsegu od 10-100 mg. Čak je više poželjno da se takve doze nalaze u dnevnom opsegu od 10-80 mg. Najpoželjnije je da se takve doze nalaze u dnevnom opsegu od 10-50 mg. U nekim slučajevima nivo doziranja ispod najniže granice gore spomenutih opsega mogu biti i više nego adekvatne, dok je u drugim slučajevima ipak potrebno upotrebiti veće doze, i stoga gore pomenuti opsezi doziranja nia na koji način nisu namenjeni ograničavanju opsega ovog pronalaska. Podrazumevaće se da će količina jedinjenja koja se stvarno administrira biti određena od strane lekara, koji će imati u vidu relevantne činjenice, uključujući stepen oboljenja, odabrani put administracije, stvarnu strukturu jedinjenja ili jedinjenjâ koja se administriraju, godište, težinu, i pojedinačni odgovor pacijenta koji se leči, i ozbiljnosti simptoma pacijenta.

1

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

gde : R1 predstavlja vodonik, izopropil, difluormetil, difluoretil, ili ciklopropil; R2 predstavlja etil, terc-butil, piridin-2-il, tetrahidropiran-4-il, tetrahidrofuran-3-il, ciklopropil, ili ciklobutil; a R3 predstavlja karbamoilfenil, piridin-2-il, (1-hidroksi-1-metiletil)piridinil, 1-metil-2-okso-1H-piridin-4-il, 1-metil pirazolil, pirazin-2-il, 2-metoksipirimidin-4-il, 1-metil-2-okso-1H-pirimidin-4-il, piridazin-3-il, 6-hlorpiridazin-3-il, 6-metilpiridazin-3-il, ili 6-metoksipiridazin-3-il; ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
2. Jedinjenje prema Zahtevu 1 koje je 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4- il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol ili njegova farmaceutski prihvatljuva so.
3. Jedinjenje ili njegova so prema Zahtevima 1 ili 2 koji je 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H- pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol 4-metilbenzensulfonat.
4. Jedinjenje ili njegova so prema bilo kom od Zahteva 1-3 koje je kristalni 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro- 2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol 4-metilbenzensulfonat.
5. Jedinjenje ili njegova so prema bilo kom od Zahteva 1-4 koje je kristalni 2-{4-[(4-{[1-ciklopropil-3-(tetrahidro-2H-piran-4--il)-1H-pirazol-4-il]oksi}piridin-2-il)amino]piridin-2-il}propan-2-ol 4-metilbenzensulfonat okarakterisan izgledom difrakcije praha X-zraka (Cu ozračivanje, λ-1.54060 Å ) koja uključuje signal na 17.8° sa jednim ili više signala odabranih od grupe koja se sastoji od 19.7°, 18.4°, i 22.0° (2θ±0.2°). 2
6. Farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje ili njegovu so prema bilo kom od Zahteva 1-5 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, nosača, ili diluenata.
7. Jedinjenje ili njegovu so prema bilo kom od Zahteva 1-5 za upotrebu u terapijske svrhe.
8. Jedinjenje ili njegovu so prema bilo kom od Zahteva 1-5 za upotrebu u lečenju raka.
9. Jedinjenje ili njegovu so za upotrebu prema Zahtevu 8 gde je rak odabran od grupe koja se sastoji od raka debelog creva, melanoma, hepatocelularnog karcinoma, raka bubrega, glioblastoma, raka pankreasa, mijelodisplastičnog sindroma, raka pankreasa, i kancer želuca.
10. Jedinjenje ili njegovu so prema bilo kom od Zahteva 1-5 za upotrebu u lečenju of fibroze.
11. Jedinjenje ili njegovu so za upotrebu prema Zahtevu 10 gde je fibroza odabrana od grupe koja se sastoji od fibroze jetre i hroničnog oboljenja bubrega. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5