RS58461B1 - Mono- ili di-supstituisani derivati indola kao inhibitori replikacije virusa denge - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na mono- ili di-supstituisana indol jedinjenja i takođe se odnosi na navedena jedinjenja za upotrebu kao lek, poželjnije za upotrebu kao lek za tretiranje ili sprečavanje virusne infekcije denge. Predmetni pronalazak dalje se odnosi na farmaceutske sastave ili kombinovane preparate jedinjenja, na sastave ili preparate za upotrebu kao lek, još poželjnije za sprečavanje ili tretiranje virusne infekcije denge. Takođe su obelodanjeni postupci za pripremanje jedinjenja.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Flavivirusi, koji se prenose sa komarcima ili krpeljima, kod čoveka izazivaju infekcije opasne po život, kao što su encefalitis ili hemoragijska groznica. Četiri različita, ali blisko povezana serotipa flavivirusa denge su poznata, takozvani DENV-1, -2, -3 i -4.

Denga je endemska u većini tropskih i subtropskih regiona širom sveta, prevashodno u urbanim i polu urbanim oblastima. Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO), 2.5 milijarde ljudi od kojih su 1 milijarda deca je pri riziku od DENV infekcije (WHO, 2002). Procenjenih 50 do 100 miliona slučajeva denga groznice [DF], pola miliona slučajeva ozbiljne denga groznice (tj., denga hemoragijska groznica [DHF] i denga sindrom šoka [DSS]), i više od 20,000 smrtnih ishoda javlja se širom sveta svake godine. DHF je postala vodeći slučaj hospitalizacije i smrti kod dece u endemskim regionima. Kada se uzme zajedno, denga predstavlja najučestaliji uzrok arbovirusne bolesti. Usled nedavnih velikih izbijanja u zemljama koje se nalaze u Latinskoj Americi, Jugoistočnoj Aziji i Zapadnom Pacifiku (uključujući Brazil, Porto Riko, Venecuela, Kambodža, Indonezija, Vijetnam, Tajland), broj denga slučajeva je porastao drastično proteklih godina. Ne samo da se broj denga slučajeva povećava kako se bolest širi na nove oblasti, već izbijanja teže da budu ozbiljnija.

[0003] Za sprečavanje i/ili kontrolisanje bolesti povezane sa denga virusnom infekcijom, jedini dostupni postupci trenutno su strategije istrebljavanja komaraca radi kontrolisanja vektora. Iako se vrši napredak u razvijanju vakcina protiv denge, nailazi se na mnoge poteškoće. Ovo obuhvata postojanje fenomena koji se naziva poboljšanje zavisno od antitela (ADE). Oporavak od infekcije sa jednim serotipom pruža imunitet do kraja života protiv serotipa ali dodeljuje samo delimičnu ili prolaznu zaštitu protiv kasniji infekcija sa jednim od druga tri serotipa. Nakon infekcije sa drugim serotipom, hetorologna antitela koja već postoje formiraju komplekse sa novim serotipom infektivnog virusa denge ali ne neutrališu patogen. Umesto toga, ulazak virusa u ćelije veruje se da je olakšan, što se ispoljava u nekontrolisanoj replikaciji virusa i većem maksimumu virusnih titara. Kod obe, primarne i sekundarne infekcije, visoki virusni titri povezani su sa ozbiljnijom denga bolesti. Kako se majčinska antitela mogu lako preneti na novorođenče dojenjem, ovo može biti jedan od razloga zašto su deca više pogođena sa ozbiljnom denga bolesti od odraslih.

[0004] Kod lokacija u kojima dva ili više serotipa simultano cirkulišu, koji se takođe nazivaju hiper endemski regioni, rizik od ozbiljne denga bolesti značajno je veći usled povišenog rizika od dobijanja sekundarne, ozbiljnije infekcije. Pored toga, u situacijama hiper-endemičnosti, verovatnoća javljanja virusnih sojeva je povećana, što zauzvrat povećava verovatnoću denga hemoragijske groznice (DHF) ili denga sindroma šoka.

Komarci koji nose denga, uključujući Aedes aegypti i Aedes albopictus (tigrasti komarac), kreću se severno na planeti. Prema Centru za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) Sjedinjenih Država (US), oba komarca trenutno su sveprisutni u južnom Teksasu. Širenje na sever komaraca koji nose denga nije potvrđeno u US, ali je takođe primećeno u Evropi.

[0005] Uprkos velikim naporima u protekle 3 decenije, trenutno ne postoji vakcina dostupna za zaštitu ljudi protiv bolesti virusa denge. Glavni problem je da se razvije vakcina koja pruža zaštitu protiv sva četiri serotipa (tetravalentna vakcina) u istoj meri. U nastavku, danas, specifični antivirusni lekovi za tretiranje ili sprečavanje virusne infekcije denga groznice nisu dostupni. Jasno je, da postoji još uvek velika nezadovoljena medicinska potreba za terapeutskim sredstvima za sprečavanje ili tretiranje virusne infekcije kod životinja, naročito ljudi i naročito za virusne infekcije izazvane sa flavivirusima, naročito virusom denge. Jedinjenja sa dobrom anti-virusnom potentnosti, sa bez ili niskim nivoima neželjenih dejstava, širokim spektrom aktivnosti protiv više serotipova virusa denge, niskom toksičnošću i/ili dobrim farmakokinetičkim ili -dinamičkim svojstvima su veoma potrebna. WO2013/045516 obelodanjuje indol jedinjenja kao inhibitore virusne replikacije.

[0006] Predmetni pronalazak sad pruža jedinjenja, mono- ili di-supstituisane derivate indola, koji pokazuju visoku potentnu aktivnost protiv sva četiri (4) serotipa virusa denge. Takođe jedinjenja prema pronalasku pružaju dobar farmakokinetički profil i iznenađujuće ova specifična jedinjenja pokazuju poboljšanu hiralnu stabilnost.

REZIME PRONALASKA

[0007] Predmetni pronalazak zasnovan je na neočekivanom saznanju da se bar jedan od iznad navedenih problema može rešiti sa datim jedinjenjima prema pronalasku.

[0008] Predmetni pronalazak pruža jedinjenja koja su pokazala da poseduju potentnu antivirusnu aktivnost protiv sva četiri (4) trenutni poznata serotipa. Predmetni pronalazak u nastavku demonstrira da ova jedinjenja delotvorno suzbijaju proliferaciju virusa denge (DENV). Prema tome, ova jedinjenja predstavljaju korisnu klasu potentnih jedinjenja koja mogu biti korišćena pri tretiranju i/ili sprečavanju virusnih infekcija kod životinja, sisara i ljudi, preciznije za tretiranje i/ili sprečavanje infekcija sa virusima denge.

[0009] Predmetni pronalazak u nastavku se odnosi na takva jedinjenja za upotrebu kao lek i na njihovu upotrebu za proizvodnju medikamenata za tretiranje i/ili sprečavanje virusnih infekcija, naročito sa virusima koji pripadaju porodici virusa denge kod životinja ili sisara, naročito kod ljudi. Takođe su ovde obelodanjeni postupci za pripremanje svih takvih jedinjenja i farmaceutskih sastava koji ih sadrže u delotvornoj količini.

[0010] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na takva jedinjenja za upotrebu u postupku za tretiranje ili sprečavanje denga virusne infekcije kod ljudi davanjem delotvorne količine jednog ili više takvih jedinjenja, ili farmaceutski prihvatljive soli navedenog opciono u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova, kao to su druga antivirusna sredstva, pacijentu koji ima potrebu za time.

[0011] Jedan aspekt pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja formule (I)

stereoizomernog oblika, farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili polimorfa navedenog koji sadrži mono- ili di-supstituisanu indol grupu;

navedeno jedinjenje je izabrano iz grupe gde:

R1je H, R2je F i R3is H, F ili CH3;

R1je F ili CH3, R2je OCH3i R3is H;

R1je F, R2is H i R3je CH3;

R1je H, R2is OCH3i R3je H;

R1je H, R2is Cl i R3je H ili CH3;

R1je F, R2is F i R3je H ili

R1je CH3, R2is H i R3je F.

[0012] Naročito jedinjenja prema pronalasku ili njihov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf navedenog su izabrani iz grupe:

[0013] Deo predmetnog pronalaska je takođe farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje formule (I) ili stereo- izomerni oblik, farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorfa navedenog zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, razblaživača ili nosača.

[0014] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I) obuhvataju njegove kisele adicione i bazne soli. Pogodne kisele adicione soli formirane su iz kiselina koje formiraju soli koje nisu toksične. Pogodne bazne soli formirane su iz baza koje formiraju soli koje nisu toksične.

[0015] Jedinjenja prema pronalasku takođe mogu postojati u ne-solvatisanom i solvatisanom obliku. Termin „solvat“ ovde se koristi za opisivanje molekularnog kompleksa koji sadrži jedinjenje prema pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanol.

[0016] Termin „polimorf“ odnosi se na sposobnost jedinjenja prema pronalasku da postoji u više od jednog oblika ili u kristalnoj strukturi.

[0017] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti data kao kristalni ili amorfni proizvodi. Mogu biti dobijena na primer kao čvrsti čepovi, praškovi ili filmovi postupcima kao što su taloženje, kristalizacija, sušenje zaleđivanjem, sušenje raspršivanjem, ili evaporativno sušenje. Mogu biti data samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja prema pronalasku ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova. Uopšteno, biće data kao formulacija u vezi sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Termin „ekscipijens“ ovde se koristi za opisivanje bilo kog sastojka koji se razlikuje od jedinjenja prema pronalasku. Odabir ekscipijensa u velikom zavisi od faktora kao što su naročiti režim davanja, uticaj ekscipijensa na rastvorljivost i stabilnost i prirode oblika za doziranje.

[0018] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku ili bilo koja njihova pod grupa mogu biti formulisani u različite farmaceutske oblike za svrhe davanja. Kao odgovarajući sastavi mogu biti navedeni svi sastavi koji se obično koriste za sistemsko davanje lekova. Za pripremanje farmaceutskih sastava ovog pronalaska, delotvorna količina naročitog jedinjenja, opciono u obliku soli, kao aktivni sastojak kombinuje se u bliskoj mešavini sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, gde nosač može imati široki opseg oblika u zavisnosti od oblika preparata namenjenog za davanje. Ovi farmaceutski sastavi poželjno su u pojedinačnom obliku za doziranje pogodnom, na primer, za oralno ili rektalno davanje. Na primer, kod pripremanja sastava u oralnom obliku za doziranje, bilo koja od farmaceutskih podloga može se iskoristiti kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao to su suspenzije, sirupi, eliksiri, emulzije i rastvori; ili tečni nosači kao što su skrobovi, šećeri, kaolin, razblaživači, maziva, sredstva za vezivanje, sredstva za razlaganje i slično u slučaju praškova, pilula, kapsula i tableta. Zbog jednostavnosti davanja, tablete i kapsule predstavljaju najpogodnije jedinične oblike za doziranje u kojima se čvrsti farmaceutski nosači očigledno koriste. Takođe su uključeni čvrsti oblici preparata koji su namenjeni da budu pretvoreni, ukratko pre upotrebe, u tečne oblike.

[0019] Naročito je pogodno formulisati prethodno navedene farmaceutske sastave u jediničnim oblicima za doziranje radi jednostavnosti davanja i uniformnosti doziranja.

Jedinični oblik za doziranje ovde se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne za pojedinačna doziranja, gde svaka jedinice sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka izračunatu da proizvodi željeno terapeutsko dejstvo u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Primeri takvih jediničnih oblika za doziranje su tablete (uključujući tablete sa urezom ili obložene tablete), kapsule, pilule, pakete sa praškom, vafere, supozitorije, rastvore za ubrizgavanje ili suspenzije i slično, i odvojene sadržaje navedenog.

[0020] Stručni pri tretiranju infektivnih bolesti biće u stanju da odrede delotvornu količinu iz rezultata testa predstavljenog u daljem tekstu. Uopšteno razmatrano je da delotvorna dnevna količina bude od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg telesne mase, još poželjnije od 0.1 mg/kg do 10 mg/kg telesne mase. Može biti pogodno davati potrebnu dozu kao dve, tri, četiri ili više pod-doza pri odgovarajućim intervalima u toku dana. Navedene pod-doze mogu biti formulisane kao jedinični oblici za doziranje, na primer, koji sadrže 1 do 1000 mg, a naročito 5 do 200 mg aktivnog sastojka po jediničnom obliku za doziranje.

[0021] Tačna doza i učestalost davanja zavisi od naročitog jedinjenja formule (I) koje se koristi, naročitog stanja koje se tretira, ozbiljnosti stanja koje se tretira, starosti, težine i opšteg fizičkog stanja naročitog pacijenta kao i drugih lekova koje pacijent može uzimati, kao što je dobro poznato stručnjacima u ovoj oblasti. U nastavku, očigledno je da se navedena delotvorna količina može smanjiti ili povećati u zavisnosti od odgovora tretiranog ispitanika i/ili u zavisnosti od procene lekara koji propisuje jedinjenja trenutnog pronalaska. Iznad pomenuti opsezi delotvorne količine stoga su samo smernice i nisu namenjeni da ograniče okvir upotrebe pronalaska.

[0022] Predmetno obelodanjivanje takođe je namenjeno da obuhvati bilo koje izotope atoma prisutne u jedinjenjima prema pronalasku. Na primer, izotopi vodonika obuhvataju tricijum i deuterijum i izotopi ugljenika obuhvataju C-13 i C-14.

Predmetna jedinjenja korišćena u trenutnom pronalasku mogu takođe postojati u njihovom stereo-hemijskom izomernom obliku, definišući sva moguća jedinjenja napravljena od istih atoma vezanih sa istom sekvencom veza ali koja imaju različite trodimenzionalne strukture, koje nisu naizmenične. Ukoliko nije drugačije pomenuto ili naznačeno, hemijsko označavanje jedinjenja obuhvata smešu svih mogućih stereo-hemijski izomernih oblika, koje navedeno jedinjenje može posedovati.

Navedena smeša može sadržati sve dia-stereomere i/ili enantiomere osnovne molekularne strukture navedenog jedinjenja. Svi stereo-hemijski izomerni oblici jedinjenja korišćenog u predmetnom pronalasku ili u čistom obliku ili u međusobnoj smeši namenjeni su da budu obuhvaćeni okvirom predmetnog pronalaska uključujući bilo koje racemske smeše ili racemate.

[0023] Čisti izomerni oblici jedinjenja i međujedinjenja kao što je ovde pomenuto definisani su kao izomeri suštinski bez drugih enantiomernih ili diastereomernih oblika iste osnovne molekularne strukture navedenih jedinjenja ili međujedinjenja. Naročito, termin ‘stereoizomerno čisto’ odnosi se na jedinjenja ili međujedinjenja koja imaju stereoizomerni višak od bar 80% (tj., minimum 90% jednog izomera i maksimum 10% drugog mogućeg izomera) do stereoizomernog viška od 100% (tj., 100% jednog izomera i bez drugog), preciznije, jedinjenja ili međujedinjenja koja imaju stereoizomerni višak od 90% do 100%, čak preciznije koja imaju stereoizomerni višak od 94% do 100%, i najpreciznije koja imaju stereoizomerni višak od 97% do 100%. Termine‘enantiomerno čist’ i ‘diastereomerno čist’ bi trebalo shvatiti na sličan način, ali posmatranjem enantiomernog viška, respektivno diastereomernog viška smeše od značaja.

[0024] Čisti stereoizomerni oblici jedinjenja i međujedinjenja korišćenih u ovom pronalasku mogu biti dobijeni primenom postupaka poznatih u struci. Na primer, enantiomeri mogu biti odvojeni jedan od drugog ili selektivnom kristalizacijom ili sa njihovim diastereomernim solima sa optički aktivnim bazama.

[0025] Primeri toga su vinska kiselina, dibenzilvinska kiselina, ditoluoilvinska kiselina i kamfosulfonska kiselina. Alternativno, enantiomeri mogu biti odvojeni tehnikama hromatografije upotrebom hiralne stacionarne faze. Navedeni čisti stereohemijski izomerni oblici mogu takođe biti izvedeni iz odgovarajućih stereohemijskih izomernih oblika odgovarajućih početnih materijala, pod uslovom da se reakcija vrši sterospecifično.

Poželjno, ukoliko je specifični stereoizomer poželjan, navedeno jedinjenje će biti sintetisano stereospecifičnim postupcima pripremanja. Ovi postupci pogodno će koristiti enantiomerno čiste početne materijale.

Opšti pristupi sintetisanja

[0026] Sinteza jedinjenja opšte formule I može biti napravljeno kao što je naglašeno u Šemi 1: 2-(4-hloro-2-metoksifenil)sirćetna kiselina (II) može biti pretvorena u odgovarajući 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorid (III) sa reagensom za hlorinaciju kao što je na primer tionil hlorid. Friedel-Crafts reakcija kiselog hlorida III sa supstituisanim indolom opšte formule IV može biti napravljen upotrebom reagensa Luisove kiseline na primer Et2AlCl u pogodnom rastvaraču kao što je na primer CH2Cl2, i pod pogodnim uslovima reakcije koji obično obuhvataju hlađenje, za pružanje 3-acilovanog indola opšte formule V. Uvođenje anilin dela u alfa poziciji u karbonil deo jedinjenja opšte formule V može se ostvariti sa reagensom kao što je na primer feniltrimetilamonijum tribromid u pogodnom rastvaraču kao što je na primer THF, kako bi se dobila jedinjenja opšte formule VI, i sledeća reakcija jedinjenja opšte formule VI sa 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanolom (VII) u pogodnom rastvaraču kao što je na primer CH3CN, i obično upotrebom baze kao što je na primer TEA ili DIPEA, za pružanje jedinjenja opšte formule I kao racemske smeše. Hiralna separacija jedinjenja opšte formule I može biti izvršena na primer hiralnom hromatografijom za pružanje Enantiomera A i B opšte formule I.

[0027] Kao alternativni pristup, međujedinjenje opšte formule V može takođe biti pripremljeno kao što je naznačeno na Šemi 2: N-Boc-zaštićeni supstituisani indol-3-karbaldehid opšte formule VIII može biti pretvoren u odgovarajući Stricker-tip međujedinjenja opšte formule IX reakcijom sa morfolinom u prisustvu reagenasa kao što su na primer natrijum cijanid i natrijum bisulfit i u pogodnom rastvaraču kao što je na primer smeša vode i organskog rastvarača koji se može mešati sa vodom kao što je na primer dioksan. Alkilacija jedinjenja opšte formule IX sa 4-hloro-2-metoksi-benzilhloridom može biti ostvarena u prisustvu baze kao što je na primer kalijum heksametildisilizan i u pogodnom rastvaraču kao što je na primer DMF kako bi se pružilo jedinjenje opšte formule X. Postavljanje jedinjenja opšte formule X u pogodni vodeni kiseli hidrolitički uslov kao što je na primer tretiranje sa vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline pri povišenoj temperaturi, pruža međujedinjenja opšte formule V.

Primeri

LC/MS postupci

[0028] Merenja na tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) su izvršena upotrebom LC pumpe, diodnog rednog (DAD) ili UV detektora i kolone kao što je naznačeno u respektivnim postupcima. Ukoliko je neophodno, dodatni detektori su uključeni (videti tabelu postupaka ispod).

[0029] Protok iz kolone je doveden do masenog spektrometra (MS) koji je konfigurisan sa jonskim izvorom na atmosferskom pritisku. U okviru je znanja stručne osobe da se kalibrišu parametri (npr., opseg skeniranja, vreme zadržavanja...) u cilju dobijanja jona koji dopuštaju identifikaciju nominalne monoizotopske molekularne mase (MW). Sakupljanje podataka je izvršena sa odgovarajućim softverom.

[0030] Jedinjenja su opisana sa svojim eksperimentalnim vremenima zadržavanja (Rt) i jonima. Ukoliko nije drugačije naznačeno u tabelama podataka, zabeleženi molekularni joni odgovaraju [M+H]<+>(protonirani molekul) i/ili [M-H]<->(deprotonirani molekul). U slučaju da se jedinjenje ne može direktno jonizovati tip adukta se određuje (tj., [M+NH4]<+>, [M+HCOO]-, itd...). Za molekule sa više izotopskih parametara (Br, Cl), zabeležena vrednost je ona dobijena za najnižu izotopsku masu. Svi rezultati su dobijeni sa eksperimentalnim neizvesnostima koje su obično povezane sa korišćenim postupkom.

[0031] U daljem tekstu, „SQD“ označava pojedinačni četvorostruki detektor;

„MSD“ maseni selektivni detektor, „RT“ sobnu temperaturu, „BEH“ premošćeni etilsiloksan/silika hibrid, „DAD“ diodni redni detektor, „HSS“ silika visoke otpornosti.

[0032] Kodovi LC/MS postupka (Protok je izražen u mL/min; temperatura kolone (T) u °C; vreme trajanja u minutima)

SFC-MS postupci

[0033] SFC merenje izvršeno je upotrebom sistema analitičke superkritične tečne hromatografije (SFC) koji se sastoji od binarne pumpe za isporuku ugljen dioksida (CO2) i modifikatora, autosamplera, pećnice kolone, diodnog rednog detektora opremljenog sa ćelijom sa protokom pri visokom pritisku do 400 bara.

[0034] Ukoliko je opremljena sa masenim spektrometrom (MS) protok iz kolone je doveden do (MS). U okviru je znanja stručne osobe da se kalibrišu parametri (npr., opseg skeniranja, vreme zadržavanja...) u cilju dobijanja jona koji dopuštaju identifikaciju nominalne monoizotopske molekularne mase (MW). Sakupljanje podataka je izvršeno sa odgovarajućim softverom.

[0035] Analitički SFC-MS postupci (protok je izražen u mL/min; temperatura kolone (T) u °C; Vreme trajanja u minutima, povratni pritisak (BPR) u barima.

Tačke topljenja

[0036] Vrednosti su ili maksimalne vrednosti ili opsezi topljenja i dobijene su sa

eksperimentalnim neizvesnostima koje su obično povezane sa ovim analitičkim postupkom.

DSC823e (označeno kao DSC)

[0037] Za više jedinjenja, tačke topljenja su određene sa DSC823e (Mettler-Toledo). Tačke topljenja su merene sa gradijentom temperature od 10°C/minutu. Maksimalna temperatura je bila 300°C.

Optičke rotacije:

[0038] Optiče rotacije su merene na Perkin-Elmer 341 polarimetru sa natrijumskom lampom i zabeležene su kao što sledi: [α]° (λ, c g/100ml, rastvarač, T°C).

[0039] [α]λ<T>= (100α) / (l x c): gde je l dužina puta u dm i c je koncentracija u g/100 ml za uzorak na temperaturi T (°C) i talasnoj dužini λ (u nm). Ukoliko je korišćena talasna dužina 589 nm (natrijum D linija) onda se simbol D može koristiti umesto toga. Znak rotacije (+ ili -) bi trebalo da uvek bude dat. Kada se koristi ova jednačina koncentracija i rastvarač su uvek dati u zagradama nakon rotacije. Rotacija je zabeležena upotrebom stepena i nisu date jedinice koncentracije (pretpostavlja se da su g/100 ml).

Primer 1: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 1) i hiralna separacija u Enantiomere 1A i 1B.

[0040]

Sinteza međujedinjenja 1a:

[0041] 2-(4-Hloro-2-metoksifenol)sirćetna kiselina [CAS 170737-95-8] (5.8 g, 28.9 mmol) je dodata u malim delovima u tionil hlorid (50 mL) i dobijeni rastvor je mešan preko noći pri 60°C. Rastvarač je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i zajedno-isparen sa toluenom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorid 1a (6.5 g) kao uljani ostatak koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza međujedinjenja 1b:

[0042] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (37.1 mL, 37.14 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 6-fluoro-1H-indola [CAS 399-51-9] (3.34 g, 24.76 mmol) u CH2Cl2(100 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (6.3 g, 28.76 mmol) u CH2Cl2(100 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Ledena voda je dodata i talog je filtriran, ispran sa vodom i malom količinom CH2Cl2. Čvrste supstance su osušene pod vakuumom pri 70°C preko noći kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanon 1b (4.9 g).

Sinteza međujedinjenja 1c:

[0043] Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (5.8 g, 15.4 mmol) u THF (65 mL) je dodat u vidu kapi smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1b (4.9 g, 15.4 mmol) u THF (60 mL). Smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2.5 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa EtOAc i ispran sa vodom. Talog se pojavio u organskom sloju i filtriran je i osušen kako bi se dobila prva serija 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (4.6 g). Organski sloj je odvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je kristalizovan iz EtOAc, talog je filtriran, ispran sa Et2O i osušen pod vakuumom kako bi se dobila druga frakcija 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (1.6 g).

Sinteza Jedinjenja 1 i hiralna separacija u Enantiomere 1A i 1B:

[0044] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-etanona 1c (2.1 g, 5.3 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (924 mg, 5.05 mmol) i trietilamina (1.47 mL, 10.6 mmol) u CH3CN (16 mL) u zatvorenoj epruveti je zagrejana pri 100°C u trajanju od 30 min upotrebom mikrotalasnog Biotage® Initiator EXP 60 sa izlaznom snagom u opsegu od 0 do 400 W (fiksirano vreme zadržavanja). Reakcija je razblažena sa CH2Cl2i organski sloj je ispran sa vodom, osušen preko MgSO4, filtriran i Rastvarač je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (15-40 µm, 80 g) upotrebom heptan/EtOAc gradijenta od 50/50 do 0/100. Čiste frakcije su sakupljene i koncentrovane kako bi se dobilo 1.1 g Jedinjenja 1. Ova frakcija je kombinovana sa drugom seriju od 0.93 g Jedinjenja 1 i posle toga je prečišćena sa ahiralnom SFC (Stacionarna faza: CYANO 6 µm 150 x 21.2 mm, Mobilna faza: 75% CO2, 25% MeOH) kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 1, 1.36 g) kao racemska smeša.

[0045] Enantiomeri Jedinjenja 1 (1.36g) su odvojeni sa hiralnom SFC (Stacionarna faza: Chiracel® OJ 20 x 250 mm, Mobilna faza: 60% CO2, 40% MeOH) dajući 611 mg prvog eluiranog enantiomera i 586 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer je uzet sa CH3CN/diizopropileter/heptan. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio Enantiomer 1A (496 mg) kao amorfni prašak. Drugi eluirani enantiomer je uzet sa CH3CN/diizopropileter/heptan. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio Enantiomer 1B (458 mg) kao amorfni prašak.

Jedinjenje 1:

[0046]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.3 Hz, 2 H) 3.77 -3.88 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 -7.08 (m, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.27 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.13 (dd, J=8.8, 5.7 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 11.96 - 12.17 (m, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.95 min, MH<+>499

Enantiomer 1A:

[0047]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.57 - 3.68 (m, 5 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.73 - 4.87 (m, 1 H) 5.71 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 5.91 - 5.96 (m, 2 H) 6.15 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.01 - 7.11 (m, 2 H) 7.27 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.13 (dd, J=9.6, 5.7 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 11.45 - 12.31 (m, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.95, MH<+>499

[α]D<20>: 112.1° (c 0.281, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-C): Rt3.17 min, MH<+>499, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 1B:

[0048]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.57 - 3.67 (m, 5 H) 3.74 - 3.90 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (br. s., 1 H) 5.70 - 5.74 (m, 1 H) 5.93 (s, 2 H) 6.15 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.02 - 7.08 (m, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.27 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.13 (dd, J=9.6, 5.5 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 11.63 - 12.47 (m, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.95, MH<+>499

[α]D<20>: -113.9° (c 0.28, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-C): Rt4.12 min, MH<+>499, hiralna čistoća 100%.

Primer 1,1: Hiralna stabilnost Enantiomera 1A pri pH 7.4

[0049] Hiralna stabilnost Enantiomera 1A (R = OMe) je procenjena određivanjem enantiomernog viška (ee%) nakon inkubacije od 24 h i 28 h u puferisanom rastvoru pri pH 7.4 na 40°C i 60°C. Za procenjivanje uticaja metoksi-supstituenta Enantiomera 1A (R = OMe) na stabilnost protiv racemizacije, hiralna stabilnost Enantiomera 1'A (R = H) je testirana pod istim uslovima.

[0050] U tom cilju, 5 µM puferisanih (pH = 7.4) rastvora 1A i 1'Aje pripremljeno mešanjem 25 µL 100 µM rastvora 1A ili 1'A u DMSO sa 475 µL vodenog pufera pH 7.4. Uzorci su uzeti 24 h i 48 h nakon inkubacije pri 40°C i 60°C. Analitički uzorci analizirani su sa hiralnom SFC (MS detekcija) i hiralna čistoća je izražena kao enantiomerni višak (ee% = %enantiomera A - %enantiomera B). Oba Enantiomera 1A i 1'A imaju hiralnu čistoću od 100% pre njihove inkubacije.

Primer 2: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 2) i hiralna separacija u Enantiomere 2A i 2B.

[0051]

Sinteza međujedinjenja 2a:

[0052] Rastvor 6-fluoro-7-metil-1H-indol [CAS 57817-10-4] (1.10 g, 7.37 mmol) u CH2Cl2(40 mL) je ohlađen u ledenoj kupki pod N2-protokom. Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (10 mL, 10 mmol) je dodat u vidu kapi u trajanju od 15 min. Nakon dodatnog mešanja od 15 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (2.06 g, 9.42 mmol, sinteza: videti primer 1) u CH2Cl2(35 mL) je dodat u trajanju od 75 min pri 0°C. Reakcija je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i posle toga je ugašena sporim dodavanjem rastvora kalijum natrijum tartat tetrahidrata (Rochelle so) [CAS 6100-16-9] (4.24 g, 15 mmol) u vodi (10 mL), održavajući unutrašnju temperaturu smeše ispod 10°C. Ledena kupka je uklonjena, 2-metil-THF (160 mL) i Na2SO4(60 g) su dodati i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je filtrirana preko dicalite® i filterski kolač je ispran sa nekoliko delova THF. Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom i ostatak je trituiran sa malom količinom CH2Cl2. Čvrste supstance su izolovane filtracijom i osušene pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 2a (1.9 g) kao beli prašak.

Sinteza Jedinjenja 2 i hiralna separacija u Enantiomere 2A i 2B:

[0053] Rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-etanona 2a (1.9 g, 5.73 mol) u suvom THF (60 mL) je ohlađen na ledenoj kupci pod N2-protokom. Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.3 g, 5.91 mmol) u THF (50 mL) je dodat u vidu kapi u periodu od 1 h i smeša je mešana pri 0°C dodatnih 1.5 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak koji sadrži sirovo brominisano međujedinjenje 2b, je rastvoren u CH3CN (100 mL).2-(3-Amino-5-metoksifenoksi)etanol [CAS 725237-16-1] (2.11 g, 11.5 mmol) i diizopropiletilamin (2 mL, 11.6 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 dana. Voda (350 mL) je dodata i reakcioni proizvodi su izvađeni sa 2-metil-THF (3x 100 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa 0.5 M HCl (200 mL) i vodom (3x 300 mL), osušeni preko MgSO4i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak (2.48 g) je prečišćen hromatografijom na koloni (Stacionarna faza: Silica 40 g, HP-Spher® 40 µm; Mobilna faza: heptan/EtOAc gradijent 100/0 do 0/100). Frakcije koje sadrže reakcioni proizvod su kombinovane i isparene pod redukovanim pritiskom. Ostatak je trituiran sa malom količinom smeše EtOAc/heptan (1/1), čvrste supstance su filtrirane i osušene pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 2, 1.38 g) kao racemska smeša.

Enantiomeri Jedinjenja 2 (1.38 g) su odvojeni sa preparativnom SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® Diacel AS 20 x 250 mm, Mobilna faza: CO2, EtOH sa 0.4% iPrNH2). Prvi eluirani enantiomer je rastvoren u smeši MeOH (50 mL) i vode (20 mL) i smeša je isparena pod redukovanim pritiskom (200 mbar, vodena kupka 40°C) do preostale zapremine od 20 ml. Dobijena suspenzija je razblažena sa 20 ml vode i mešana je na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 h. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa vodom i osušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi kako bi se dobio Enantiomer 2A (631 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je rastvoren u smeši MeOH (50 mL) i vode (20 mL) i smeša je isparena pod redukovanim pritiskom (200 mbar, vodena kupka 40°C) do preostale zapremine od 20 ml. Dobijena suspenzija je razblažena sa 20 ml vode i mešana je na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 h. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa vodom i osušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi kako bi se dobio Enantiomer 2B (625 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 2:

[0054]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.37 (br s, 3 H) 3.60 (s, 3 H) 3.63 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.76 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.95 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.00 (dd, J=10.1, 8.8 Hz, 1 H) 7.08 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.95 (dd, J=8.7, 5.2 Hz, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 12.17 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.19 min, MH<+>513

Enantiomer 2A:

[0055]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.38 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.67 (m, 2 H) 3.82 (ddt, J=15.4, 10.2, 5.1, 5.1 Hz, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.81 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (br t, J=1.8 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=1.5 Hz, 2 H) 6.17 (br d, J=8.4 Hz, 1 H) 6.40 (br d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1 H) 7.02 (br dd, J=10.1, 9.0 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.6, 5.3 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.22 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.20, MH<+>513

[α]D<20>: 83.3° (c 0.36, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- F): Rt2.05 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Enantiomer 2B:

[0056]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.38 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.67 (m, 2 H) 3.83 (qt, J=10.2, 5.1 Hz, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.80 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (br t, J=2.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=1.8 Hz, 2 H) 6.17 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.1 Hz,

1 H) 6.96 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1 H) 7.02 (dd, J=10.2, 8.8 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.6, 5.3 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.21 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.20, MH<+>513

[α]D<20>: -81.9° (c 0.515, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- F): Rt3.28 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Primer 3: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 3) i hiralna separacija u Enantiomere 3A i 3B.

[0057]

Sinteza međujedinjenja 3a:

[0058] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (18.1 mL, 18.1 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 6-hloro-7-metil-1H-indola [CAS 57817-09-1] (2 g, 12.08 mmol) u CH2Cl2(60 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.21 g, 14.66 mmol, sinteza: videti primer 1) u CH2Cl2(60 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Ledena voda je dodata i talog je filtriran i ispran sa vodom. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 3a (3.2 g).

Sinteza međujedinjenja 3b:

[0059] Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3.63 g, 9.65 mmol u THF (85 mL) je dodat u vidu kapi smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3a (3.2 g, 9.2 mmol) u THF (85 mL). Smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2.5 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom CH3CN/diizopropiletera. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 3b (4.1 g).

Sinteza Jedinjenja 3 i hiralna separacija u Enantiomere 3A i 3B:

[0060] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3b (3.1 g, 7.26 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (1.33 g, 7.26 mmol) i diizopropiletilamina (1.9 mL, 10.9 mmol) u CH3CN/THF (1/1) (120 mL) je mešana pri 70°C u trajanju od 24 h. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen sa CH2Cl2i ispran sa 1N HCl. Organski sloj je odvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na koloni na silika gelu (15-40 µm, 80 g u CH2Cl2/MeOH (99.5/0.5)). Čiste frakcije su sakupljene i isparene pod redukovanim pritiskom (2.3 g). Mala količina je kristalizovana iz Et2O/CH3CN kako bi se dobio analitički uzorak 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 3) kao racemat.

[0061] Enantiomeri Jedinjenja 3 (2.2 g) su odvojeni sa preparativnom hiralnom SFC (Stacionarna faza: (S,S) Whelk-O 15 µm 250 x 21.1 mm, Mobilna faza: 45% CO2, 55% EtOH (+ 2% CH2Cl2)) kako bi se dobilo 11 g prvog eluiranog enantiomera i 1.07 g drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O/heptan kako bi se dobio Enantiomer 3A (461 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O/heptan kako bi se dobio Enantiomer 3B (872 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 3:

[0062]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.26 (d, J=2.8 Hz, 1 H) 8.46 (d, J=3.2 Hz, 1 H) 7.97 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.18 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 5.71 (t, J=2.2 Hz, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.96 (s, 3 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.58 - 3.67 (m, 5 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.28 min, MH<+>529

Tačka topljenja: 220°C

Enantiomer 3A:

[0063]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.26 (br. s., 1 H) 8.46 (s, 1 H) 7.97 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.21 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.18 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.97 (s, 3 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.59 -3.67 (m, 5 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.27 min, MH<+>529

[α]D<20>: 88.8° (c 0.2691, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3.40 min, MH<+>529, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 3B:

[0064]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.26 (br. s., 1 H) 8.45 (s, 1 H) 7.97 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.21 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.18 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.97 (s, 3 H) 3.76 - 3.90 (m, 2 H) 3.60-3.66 (m, 5 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.27 min, MH<+>529

[α]D<20>: -87.4° (c 0.2564, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4.19 min, MH<+>529, hiralna čistoća 100%.

Primer 4: sinteza 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 4) i hiralna separacija u Enantiomere 4A i 4B.

[0065]

Sinteza međujedinjenja 4a:

[0066] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (19.8 mL, 19.8 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 6-fluoro-1H-indola [CAS 17422-33-2] (2 g, 13.2 mmol) u CH2Cl2(45 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.36 g, 15.3 mmol, sinteza: videti primer 1) u CH2Cl2(45 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Ledena voda je dodata i talog je filtriran, ispran sa vodom i minimalnom količinom CH2Cl2. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)etanon 4a (2.68 g).

Sinteza međujedinjenja 4b:

[0067] Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3.165 g, 8.4 mmol) u THF (50 mL) je dodat u vidu kapi u rastvor 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)etanon 4a (2.68 g, 8 mmol) u THF (50 mL). Smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2.5 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen u EtOAc i ispran sa vodom. Talog se pojavio i čvrste supstance su filtrirane i osušene pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)etanon 4b (2.75 g).

Sinteza Jedinjenja 4 i hiralna separacija u Enantiomere 4A i 4B:

[0068] Smeša 2-bromo-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-etanona 4b (2.3 g, 5.6 mol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (1.53 g, 8.4 mmol) i diizopropiletilamina (2.4 mL, 13.9 mmol) u CH3CN/THF (1/1) (140 mL) je mešana pri 50°C u trajanju od 12 h. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen sa EtOAc, ispran sa 1N HCl i zatim sa vodom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na koloni na silika gelu (15-40 µm, 80 g u CH2Cl2/MeOH (99.5/0.5)). Čiste frakcije su sakupljene i isparene pod redukovanim pritiskom. Mala količina je kristalizovana iz Et2O/CH3CN kako bi se dobio analitički uzorak 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 4) kao racemska smeša. Preostala količina Jedinjenja 4 (2.1 g) je dalje prečišćena sa preparativnom LC (Stacionarna faza: neregularna samostalna silika 150 g, mobilna faza: toluen/iPrOH 95/5).

[0069] Enantiomeri Jedinjenja 4 (1.9 g) su odvojeni sa preparativnom hiralnom SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® IC 5 µm 250 x 30 mm, Mobilna faza: 60% CO2, 40% MeOH) dajući 870 mg prvog eluiranog enantiomera i 870 mg drugog eluiranog enantiomera. Dva enantiomera su prečišćena hromatografijom na fleš na silika gelu (15-40 µm, 24 g u CH2Cl2/MeOH (99.5/0.5)). Prvi eluirani enantiomer (800 mg) je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 4A (693 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 4B (619 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 4:

[0070]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.60 (s, 3 H) 3.64 (t, J=5.0 Hz, 2 H) 3.75 -3.88 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.38 - 5.09 (m, 1 H) 5.71 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.13 - 6.18 (m, 1 H) 6.35 - 6.46 (m, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.5, 1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.53 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.46 (d, J=2.8 Hz, 1 H) 12.13 (d, J=2.8 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.11 min, MH<+>515

Tačka topljenja: 154°C

Enantiomer 4A:

[0071]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.60 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.0 Hz, 2 H) 3.74 -3.88 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.0 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.41 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.5, 1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.53 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 12.12 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.13 min, MH<+>515

[α]D<20>: 111.6° (c 0.284, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-A): Rt3.68 min, MH<+>515, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 4B:

[0072]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.68 (m, 2 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.74 - 4.83 (m, 1 H) 5.72 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.42 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.5, 1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.53 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 12.13 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.14 min, MH<+>515

[α]D<20>: -113.9° (c 0.288, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-A): Rt5.04 min, MH<+>515, hiralna čistoća 100%.

Primer 5: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 5) i hiralna separacija u Enantiomere 5A i 5B.

[0073]

Sinteza međujedinjenja 5a:

[0074] Rastvor NaHSO3(5.7 g, 54.5 mmol) u vodi (45 mL) je dodat u mešani rastvor tercbutil 3-formil-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata [CAS 847448-73-1] (10 g, 36.3 mmol) u dioksanu (45 mL). Nakon 15 min, morfolin (4.8 mL, 54.5 mmol) je dodat i 35 min kasnije, natrijum cijanid (NaCN) (1.96 g, 40 mmol) je dodat. Dobijena suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 dana, do završetka reakcije. Proizvod je filtriran i ispran sa 1/1 smešom dioksan/voda (3x 35 mL) i posle toga sa vodom (3x 45 mL) i osušen pod vakuumom pri 60°C. Čvrste supstance su mešane u Et2O (125 mL), filtrirane, isprane sa Et2O (3x) i osušene pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio terc-butil 3-(cijano(morfolino)metil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilat 5a (12.3 g).

Sinteza međujedinjenja 5b:

[0075] Smeša terc-butil 3-(cijano(morfolino)metil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata 5a (6.0 g, 16.2 mmol) u suvom DMF (80 mL) je mešana pod N2-atmosferom dok se hladila u ledenoj kupki. Rastvor KHMDS 0.5 M u toluenu (35.5 mL, 17.8 mmol) je dodat u vidu kapi u trajanju od 10 min. Nakon mešanja dodatnih 10 min, 4-hloro-1-(hlorometil)-2-metoksibenzen [CAS 101079-84-9] (3.09 g, 16.2 mmol) je dodat i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 h. Reakciona smeša je sipana u ledeno hladnu vodu (400 mL) i proizvod je izvađen sa Et2O (2x). Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, ispareni pod redukovanim pritiskom i zajedno ispareni sa kiselinom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 120 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc gradijent 100/0 do 20/80). Željene frakcije su kombinovane, isparene pod redukovanim pritiskom i zajedno isparene sa dioksanom kako bi se dobio terc-butil 3-(2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-cijano-1-morfolinoetil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilat 5b (7.75 g).

Sinteza međujedinjenja 5c:

[0076] U mešanu suspenziju terc-butil 3-(2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-cijano-1-morfolinoetil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata 5b (7.75 g, 14.7 mol) u dioksanu (40 mL) i vodi (20 mL) je dodat rastvor HCl 6M u izopropanolu (36.8 mL, 220 mmol). Dobijena smeša je mešana pri 60°C u trajanju od 4 h i posle toga na 80°C u trajanju od 1 sata. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je ostavljena da stoji 20 h kako bi se omogućila kristalizacija reakcionog proizvoda. Proizvod je filtriran, ispran sa 1/1/1 rastvorom iPrOH/H2O/dioksan (2x 15 mL) i osušen pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 5c(3.67 g).

Sinteza Jedinjenja 5 i hiralna separacija u Enantiomere 5A i 5B:

[0077] Mešana smeša 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)-etanona 5c (2.35 g, 7.13 mmol) u THF (100 mL) je ohlađena na ledenoj kupci pod N2-atm. Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (2.81 g, 7.48 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i posle toga na sobnoj temperaturi u trajanju od 1.5 h.2-(3-Amino-5-metoksifenoksi)etanol [CAS 725237-16-1] (2.61 g, 14.3 mmol), diizopropiletilamin (2.46 mL, 14.3 mmol) i CH3CN (100 mL) su dodati i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 18 h pri 55°C u trajanju od 2 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom do 50% početne zapremine. 2-(3Amino-5-metoksifenoksi)etanol [CAS 725237-16-1] (1 g) i diizopropiletilamin (1.5 mL) su dodati i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 65 h. Reakciona smeša je sipana u vodu (400 mL) i proizvod je izvađen sa 2-MeTHF (2x). Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak (7 g) je prečišćen fleš hromatografijom (stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 120 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent 100/0/0 do 50/37/13). Željene frakcije su kombinovane i isparene pod redukovanim pritiskom. Ostatak (5.8 g) je dalje prečišćen preparativnom HPLC (Stacionarna faza:

Uptisphere® C18 ODB - 10 µm, 200 g, 5 cm, Mobilna faza: 0.25% NH4HCO3rastvor u vodi, CH3CN). Proizvedene frakcije su kombinovane i isparene pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u MeOH (20 mL) i ostavljen da stoji kako bi se kristalizovao 4 h. čvrste supstance su filtrirane, isprane sa MeOH (3x 5 mL) i osušene pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 5, 2.06 g) kao racemska smeša.

[0078] Hiralna separacija Jedinjenja 5 (2g) je izvršena sa hiralnom separacijom normalne faze (Stacionarna faza: AD-H, Mobilna faza: 50% metanol, 50% etanol). Proizvedene frakcije su kombinovane i isparene pod redukovanim pritiskom. Prvi eluirani enantiomer je kristalizovan iz mešanog rastvora MeOH (13 mL) dodavanjem vode (3 mL). Nakon mešanja preko noći, čvrste supstance su filtrirane, isprane sa 3/1 smešom MeOH/H2O (4x 3mL) i osušene pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio Enantiomer 5A (476 mg). Drugi eluirani enantiomer je kristalizovan iz mešanog rastvora MeOH (13 mL) dodavanjem vode (3 mL). Nakon mešanja preko noći, čvrste supstance su filtrirane, isprane sa 3/1 smešom MeOH/H2O (4x 3mL) i osušene pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio Enantiomer 5B (362 mg).

Jedinjenje 5:

[0079]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.65 (q, J=5.3 Hz, 2 H) 3.77 (s, 3 H) 3.78 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.83 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1 H) 6.92 - 7.00 (m, 2 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.29 (d, J=2.9 Hz, 1 H) 11.81 (br d, J=2.2 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt1.93, MH<+>511

Enantiomer 5A:

[0080]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.4 Hz, 2 H) 3.77 (s, 3 H) 3.78 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.83 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1 H) 6.92 - 6.99 (m, 2 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.29 (d, J=3.1 Hz, 1 H) 11.81 (br d, J=2.4 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.08, MH<+>511

[α]D<20>: 109.3° (c 0.61, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt1.78 min, MH<+>511, hiralna čistoća 100%

Enantiomer 5B:

[0081]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.77 (s, 3 H) 3.78 - 3.89 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.12 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.82 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1 H) 6.91 - 7.01 (m, 2 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=8.6 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.08, MH<+>511

[α]D<20>: -108.9° (c 0.52, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt2.19 min, MH<+>511, hiralna čistoća 100%

Primer 6: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 6) i hiralna separacija u Enantiomere 6A i 6B.

[0082]

Sinteza međujedinjenja 6a:

[0083] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (13.5 mL, 13.5 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 6-metoksi-5-metil-1H-indola [CAS 1071973-95-9] (1.45 g, 9 mmol) u CH2Cl2(45 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (2.4 g, 10.9 mmol, sinteza: videti primer 1) u CH2Cl2(45 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Ledena voda je dodata i talog je filtriran i ispran sa vodom. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6- metoksi -5-metil-1H-indol-3-il)etanon 6a (2.1 g).

Sinteza međujedinjenja 6b:

[0084] Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.4 g, 6.4 mmol u THF (65 mL) je dodat u vidu kapi smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6a (2.1 g, 6.1 mmol) u THF (60 mL). Smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2.5 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom diizopropiletra. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 6b (2.36 g).

Sinteza Jedinjenja 6 i hiralna separacija u Enantiomere 6A i 6B:

[0085] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-hloro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6b (1.35 g, 3.2 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (0.585 g, 3.2 mmol) i diizopropiletilamina (0.83 mL, 4.8 mmol) u CH3CN/THF (1/1) (80 mL) je mešana pri 70°C u trajanju od 24 h. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen sa CH2Cl2, ispran sa 1N HCl i vodom. Organski sloj je odvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na koloni na silika gelu (15-40 µm, 80 g u CH2Cl2/MeOH (99.5/0.5)). Mala količina je kristalizovana iz Et2O/CH3CN kako bi se dobio analitički uzorak 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 6) kao racemska smeša. Preostala količina sirovog Jedinjenja 6 je pomešana sa drugom serijom (ukupna količina 1.19 g) i dalje je prečišćena dva puta sa preparativnom LC (Stacionarna faza: neregularna samostalna silika 150 g, mobilna faza: CH2Cl2/MeOH (98/2), a zatim toluen/iPrOH (95/5).

[0086] Enantiomeri Jedinjenja 6 (950 mg) su odvojeni sa preparativnom hiralnom SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® IC 5 µm 250 x 30 mm, Mobilna faza: 50% CO2, 50% MeOH) dajući 485 mg prvog eluiranog enantiomera i 480 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer (800 mg) je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 6A (406 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 6B (436 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 6:

[0087]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.21 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.68 (m, 2 H) 3.74 - 3.90 (m, 5 H) 3.97 (s, 3 H) 4.76 (t, J=4.8 Hz, 1 H) 5.68 - 5.74 (m, 1 H) 5.93 (d, J=1.5 Hz, 2 H) 6.11 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.31 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.92 (s, 1 H) 6.95 (dd, J=8.3, 1.8 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 11.73 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.02 min, MH<+>525

Enantiomer 6A:

[0088]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.20 (s, 3 H) 3.60 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.3 Hz, 2 H) 3.75 - 3.88 (m, 5 H) 3.97 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.11 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.33 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.92 (s, 1 H) 6.95 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.88 (s, 1 H) 8.23 (s, 1 H) 11.75 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.04 min, MH<+>525

[α]D<20>: 116.8° (c 0.4536, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- B): Rt2.40 min, MH<+>525, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 6B:

[0089]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.20 (s, 3 H) 3.60 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.4 Hz, 2 H) 3.77 - 3.88 (m, 5 H) 3.97 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.11 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.33 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.92 (s, 1 H) 6.95 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.88 (s, 1 H) 8.23 (s, 1 H) 11.75 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.04 min, MH<+>525

[α]D<20>: -121.9° (c 0.3855, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- B): Rt3.75 min, MH<+>525, hiralna čistoća 99,86%.

Primer 7: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 7) i hiralna separacija u Enantiomere 7A i 7B.

[0090]

Sinteza međujedinjenja 7a:

[0091] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (15.7 mL, 15.7 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 5-fluoro-6-metoksi-1H-indola [CAS 1211595-72-0] (2 g, 12.1 mmol) u CH2Cl2(50 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.2 g, 14.6 mmol, sinteza: videti primer 1) u CH2Cl2(50 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Ledena voda je dodata i talog je filtriran, ispran sa vodom i minimalnom količinom CH2Cl2. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 7a (2.82 g).

Sinteza međujedinjenja 7b:

[0092] Pri 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3.5 g, 8.1 mmol u THF (20 mL) je dodat u vidu kapi smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanona 7a (2.82 g, 8.1 mmol) u THF (46 mL). Smeša je mešana pri 0°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen u EtOAc i ispran sa vodom. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom EtOAc. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 7b (2.5 g).

Sinteza Jedinjenja 7 i hiralna separacija u Enantiomere 7A i 7B:

[0093] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanona 7b (2.4 g, 5.6 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanol [CAS 725237-16-1] (1.5 g, 8.2 mmol) i diizopropiletilamina (1.45 mL, 8.4 mmol) u CH3CN/THF (1/1) (48 mL) je mešana pri 50°C u trajanju od 12 h. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je razblažen sa EtOAc, ispran sa 1N HCl i vodom. Organski sloj je odvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvor je isparen pod redukovanim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na koloni na silika gelu (15-40 µm, 80 g u CH2Cl2/MeOH (99.5/0.5)). Čiste frakcije su sakupljene i isparene pod redukovanim pritiskom. Mala količina je načinjena čvrstom iz Et2O/CH3CN kako bi se dobio analitički uzorak 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 7) kao racemska smeša.

[0094] Enantiomeri Jedinjenja 7 (1.6 g) su odvojeni sa preparativnom hiralnom SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® IC 5 µm 250 x 30 mm, Mobilna faza: 55% CO2, 45% MeOH) dajući 680 mg prvog eluiranog enantiomera i 720 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer (800 mg) je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 7A (603 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 7B (505 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 7:

[0095]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.60 (s, 3 H) 3.62 - 3.67 (m, 2 H) 3.74 - 3.88 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 5.66 - 5.75 (m, 1 H) 5.92 (d, J=1.8 Hz, 2 H) 6.12 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.1, 1.8 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=11.6 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 11.94 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.90 min, MH<+>529

Enantiomer 7A:

[0096]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.60 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.5 Hz, 2 H) 3.76 -3.88 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.12 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 2.0 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 11.95 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.90 min, MH<+>529

[α]D<20>: 86.2° (c 0.232, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- B): Rt2.28 min, MH<+>529, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 7B:

[0097]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.60 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.5 Hz, 2 H) 3.76 -3.88 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.12 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=12.0 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 11.95 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.90 min, MH<+>529

[α]D<20>: -88.7° (c 0.3, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- B): Rt4.04 min, MH<+>529, hiralna čistoća 100%.

Primer 8: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 8) i hiralna separacija u Enantiomere 8A i 8B.

[0098]

Sinteza međujedinjenja 8a:

[0099] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (15.0 mL, 15.0 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 5-fluoro-7-metoksi-1H-indola [CAS 1082041-52-8] (1.49 g, 10.0 mmol) u CH2Cl2(20 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.28 g, 15.0 mmol, sinteza: videti Primer 1) u CH2Cl2(10 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Rastvor 1M Rochelle soli je dodat i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 h. Formirane čvrste supstance su filtrirane i podeljene između EtOAc i 1N HCl. Faze su odvojene. Vodeni sloj je izvađen sa EtOAc. Organske faze su kombinovane, isprane sa slanim rastvorom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 8a (2.03 g).

Sinteza međujedinjenja 8b:

[0100] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.53 g, 6.72 mmol) u THF (10 mL) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 8a (2.03 g, 6.11 mmol) u THF (50 mL). Reakciona smeša je mešana na istoj temperaturi preko noći. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom acetonitrila. Talog je filtriran, ispran sa acetonitrilom i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 8b (2.00 g).

Sinteza Jedinjenja 8 i hiralna separacija u Enantiomere 8A i 8B:

[0101] Smeša 2-bromo-2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 8b (1.70 g, 4.14 mmol) i 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanol [CAS 725237-16-1] (2.28 g, 12.4 mmol) u THF (10 mL) i CH3CN (10 mL) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 dana. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podeljen između EtOAc i 1N HCl. Faze su odvojene. Organska faza je isprana dva puta sa 1N HCl, sa vodenim zasićenim NaHCO3rastvorom i slanim rastvorom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom acetonitrila. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etan-on (Jedinjenje 8, 1.23 g) kao racemska smeša.

[0102] Enantiomeri Jedinjenja 8 (1.17 g) su odvojeni hiralnom separacijom normalne faze (Stacionarna faza: Daicel Chiralpak® OD-H, Mobilna faza: 80% heptan, 20% etanol). Prvi eluirani proizvod je dalje prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent 100/0/0 do 40/45/15). Čiste frakcije su kombinovane i isparene. Proizvod je kristalizovan preko noći iz smeše MeOH (4 mL) i vode (1 mL), filtriran, ispran sa MeOH (3x) i osušen pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio Enantiomer 8A (37 mg). Drugi eluirani proizvod je dalje prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent 100/0/0 do 40/45/15). Čiste frakcije su kombinovane i isparene. Proizvod je kristalizovan preko iz smeše MeOH i H2O, filtriran, ispran sa MeOH i osušen pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio Enantiomer 8B (177 mg).

Jedinjenje 8:

[0103]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.48 (s, 3 H) 3.56 - 3.71 (m, 5 H) 3.74 - 3.92 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.72 (s, 1 H) 5.95 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.17 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 6.87 - 7.01 (m, 2 H) 7.10 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 7.65 (dd, J=9.8, 2.3 Hz, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 12.22 (br. s., 1 H) LC/MS (postupak LC-D): Rt1.52 min, MH<+>513

Enantiomer 8A:

[0104]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.77 (s, 3 H) 3.78 - 3.89 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.12 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.82 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1 H) 6.91 - 7.01 (m, 2 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.29 (d, J=2.9 Hz, 1 H) 11.81 (br d, J=2.4 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.12 min, MH<+>513

[α]D<20>: -83.8° (c 0.4725, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt2.32 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Enantiomer 8B:

[0105]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.47 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.65 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.77 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=10.1, 2.0 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.3, 1.9 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.65 (dd, J=9.7, 2.4 Hz, 1 H) 8.45 (d, J=3.5 Hz, 1 H) 12.20 (br d, J=2.9 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.14 min, MH<+>513

[α]D<20>: 86.6° (c 0.4805, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt1.44 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Primer 9: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 9) i hiralna separacija u Enantiomere 9A i 9B.

[0106]

Sinteza međujedinjenja 9a:

[0107] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (14.9 mL, 14.9 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 5,6-fluoro-1H-indola [CAS 169674-01-5] (1.50 g, 9.8 mmol) u CH2Cl2(20 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.22 g, 14.7 mmol, sinteza: videti Primer 1) u CH2Cl2(20 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 2 h. Rastvor 1M Rochelle soli je dodat i smeša je mešana je energično mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 h. Talog je filtriran i podeljen između EtOAc i 1N HCl. Faze su odvojene. Vodeni sloj je izvađen dva puta sa EtOAc. Organske faze su kombinovane, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom acetonitrila. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)etanon 9a (2.73 g).

Sinteza međujedinjenja 9b:

[0108] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3.36 g, 8.94 mmol) u THF (50 mL) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-hloro-2-metoksifenil)etanona 9a (2.73 g, 8.13 mmol) u THF (80 mL). Reakciona smeša je mešana na 0°C u trajanju od 15 min i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 h. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom acetonitrila. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)etanon 9b (3.00 g).

Sinteza Jedinjenja 9 i hiralna separacija u Enantiomere 9A i 9B:

[0109] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-fluoro-1H-indol-3-il)-etanona 9b (1.80 g, 4.34 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (2.39 g, 13.0 mmol) u THF (9 mL) i CH3CN (9 mL) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 65 h.1N HCL je dodata i reakciona smeša je izvađena sa EtOAc. Faze su odvojene. Organska faza je isprana sa 1N HCl, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom sa silika gelom upotrebom gradijenta od EtOAc (15% do 70%) u dihlorometanu. Čiste frakcije su kombinovane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 9, 1.20 g) kao racemska smeša. Nečiste frakcije su kombinovane i prečišćene fleš hromatografijom sa silika gelom upotrebom gradijenta etil acetata (15% do 70%) u dihlorometanu kako bi se dobila druga serija Jedinjenja 9 (0.290 g) kao racemska smeša.

[0110] Enantiomeri Jedinjenja 9 (1.4 g) su odvojeni hiralnom separacijom normalne faze (Stacionarna faza: Daicel Chiralpak® OD-H, Mobilna faza: 80% heptan, 20% etanol). Prvi eluirani proizvod je dalje prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 12 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH gradijent od 100/0 do 90/10). Čiste frakcije su kombinovane, isparene i zajedno isparene sa MeOH. Ostatak je liofilizovan iz smeše rastvarača CH3CN (4.5 mL) i vode (2.5 mL) i osušen pod vakuumom pri 45°C kako bi se dobio Enantiomer 9A (409 mg). Drugi eluirani proizvod je dalje prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 12 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH gradijent od 100/0 do 90/10). Čiste frakcije su kombinovane, isparene i zajedno isparene sa MeOH. Ostatak je liofilizovan iz smeše rastvarača CH3CN (5 mL) i vode (3 mL) i osušen pod vakuumom pri 45°C kako bi se dobio Enantiomer 9B (388 mg).

Jedinjenje 9:

[0111]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.70 (m, 2 H) 3.75 - 3.90 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.72 (t, J= 2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz,1 H) 6.15 (d, J=8.1 Hz,1 H) 6.42 (d, J=8.1 Hz,1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 2.2 Hz,1 H) 7.10 (d, J=2.0 Hz,1 H) 7.35 (d, J=8.3 Hz,1 H) 7.54 (dd, J=10.8, 7.0 Hz,1 H) 7.99 (dd, J=11.2, 8.2 Hz,1 H) 8.48 (s, 1 H) 12.19 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-D): Rt1.44 min, MH<+>517

Enantiomer 9A:

[0112]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.77 -3.89 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.09

(d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.53 (dd, J=10.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.99 (dd, J=11.2, 8.1 Hz, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 12.16 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.15 min, MH<+>517

[α]D<20>: -98.9° (c 0.445, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt1.92 min, MH<+>517, hiralna čistoća 100%

Enantiomer 9B:

[0113]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (q, J=5.2 Hz, 2 H) 3.75 -3.91 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.1, 2.0 Hz, 1 H) 7.09

(d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.53 (dd, J=10.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.99 (dd, J=11.1, 8.3 Hz, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 12.16 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.15 min, MH<+>517

[α]D<20>: 98.9° (c 0.555, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-G): Rt1.36 min, MH<+>517, hiralna čistoća 100%

Primer 10: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 10) i hiralna separacija u Enantiomere 10A i 10B.

[0114]

Sinteza međujedinjenja 10a:

[0115] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (16 mL, 16 mmol) je dodat u vidu kapi pri -15°C u rastvor 7-fluoro-5-metoksi-1H-indola [CAS 442910-91-0] (1.59 g, 10.7 mmol) u CH2Cl2(150 mL) pod N2protokom. Nakon 15 min pri -15°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.27 g, 14.9 mmol, sinteza: videti Primer 1) u CH2Cl2(50 mL) je dodat polako pri -15°C. Reakcija je mešana pri -15°C u trajanju od 1 h i na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 h. Reakciona smeša je sipana u mešani rastvor leda/Rochelle soli. Čvrste supstance su uklonjene iz reakcione smeše filtracijom preko kratke podloge od dicalite® i filterski kolač je ispran nekoliko puta sa THF. Organski slojevi su odvojeni i vodeni sloj je izvađen sa THF. Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom, vodom, osušeni na MgSO4, filtrirani, i ispareni pod redukovanim pritiskom. Čvrsi ostatak je suspendovan u CH2Cl2(10 mL). Čvrste supstance su filtrirane, isprane sa malom količinom CH2Cl2i osušene pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 10a (2.22 g).

Sinteza međujedinjenja 10b:

[0116] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.77 g, 7.36 mmol) u THF (50 mL) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 10a (2.22 g, 6.7 mmol) u THF (150 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 h. Talog je filtriran i ispran sa THF. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom CH2Cl2. Talog je filtriran, ispran sa CH2Cl2(2x) i osušen pod vakuumom pri 50°C kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 10b (2.55 g).

Sinteza Jedinjenja 10 i hiralna separacija u Enantiomere 10A i 10B:

[0117] Smeša 2-bromo-2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 10b (2 g, 4.87 mmol) i 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (1.6 g, 7.3 mmol) i diizopropiletilamina (1.26 mL, 7.3 mmol) u CH3CN (100 mL) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 h, pri 60°C u trajanju od 8 h i opet na sobnoj temperaturi u trajanju od 16 h. Rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2(50 mL), ispran sa 0.5 M HCl (50 mL) i vodom (50 mL), osušen preko MgSO4, filtriran i isparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 120 g, Mobilna faza: EtOAc/heptan gradijent od 0/100 do 60/40). Frakcije koje su sadržale proizvod su kombinovane, isparene i osušene pri 50°C pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 10, 1.3 g) kao bela čvrsta supstanca.

Enantiomeri Jedinjenja 10 (1.3 g) su odvojeni hiralnom separacijom normalne faze (Stacionarna faza: AD-H, Mobilna faza: 70% Etanol, 30% metanol) dajući 637 mg prvog eluiranog enantiomera i 628 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani proizvod je kristalizovan iz smeše MeOH/voda. Čvrste supstance su filtrirane i isprane sa smešom MeOH/voda (1/1) kako bi se dobio Enantiomer 10A (302 mg) kao beli amorfni prašak. Drugi eluirani proizvod je dalje prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® Grace Reveleris Silika 40 g, Mobilna faza: MeOH/CH2Cl2gradijent od 0/100 do 2/98). Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane i isparene kako bi se dobio Enantiomer 10B (335 mg) kao beli amorfni prašak.

Jedinjenje 10:

[0118]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.38 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.67 (m, 2 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.34 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.90 (d, J=12.1 Hz, 1 H) 6.96 (dd, J=8.1, 2.0 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.77 (s, 1 H) 8.38 (s, 1 H) 12.46 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.16 min, MH<+>513

Enantiomer 10A:

[0119]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.38 (s, 3 H) 3.62 (s, 3 H) 3.66 (br t, J=4.8 Hz, 2 H) 3.77 - 3.92 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (br s, 1 H) 5.73 (s, 1 H) 5.96 (s, 2 H) 6.17 (br d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (br d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.91 (d, J=12.1 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.3, 1.4 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.79 (s, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 12.47 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.15 min, MH<+>513

[α]D<20>: 132.3° (c 0.505, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- F): Rt2.13 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Enantiomer 10B:

[0120]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.38 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.63 - 3.68 (m, 2 H) 3.77 - 3.92 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.77 (br t, J=5.7 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.91 (d, J=12.1 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 7.09 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.78 (s, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 12.46 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.15 min, MH<+>513

[α]D<20>: -144.1° (c 0.4975, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC- F): Rt3.13 min, MH<+>513, hiralna čistoća 100%

Primer 11: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanona (Jedinjenje 11) i hiralna separacija u Enantiomere 11A i 11B.

[0121]

Sinteza međujedinjenja 11a:

[0122] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (15.0 mL, 15.0 mmol) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 6,7-fluoro-1H-indola [CAS 271780-84-8] (1.53 g, 10.0 mmol) u CH2Cl2(20 mL). Nakon 30 min pri 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3.28 g, 15.0 mmol, sinteza: videti Primer 1) u CH2Cl2(10 mL) je dodat polako pri 0°C. Reakcija je mešana pri oko 0°C u trajanju od 3 h. Rastvor 1M Rochelle soli je dodat i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 h. Čvrste supstance su filtrirane i podeljen između EtOAc i 1N HCl Faze su odvojene. Vodeni sloj je izvađen sa EtOAc. Organske faze su kombinovane, isprane sa slanim rastvorom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)etanon 11a (2.36 g).

Sinteza međujedinjenja 11b:

[0123] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.90 g, 7.02 mmol) u THF (10 mL) je dodat u vidu kapi pri 0°C u rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)etanone 11a (2.36 g, 7.02 mmol) u THF (50 mL). Reakciona smeša je mešana na istoj temperaturi preko noći. Talog je filtriran i ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimalnom količinom acetonitrila. Talog je filtriran, ispran sa acetonitrilom i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)etanone 11b (2.34 g).

Sinteza Jedinjenja 11 i hiralna separacija u Enantiomere 11A i 11B:

[0124] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-fluoro-1H-indol-3-il)-etanona 11b (1.70 g, 4.14 mmol), 2-(3-amino-5-metoksifenoksi)etanola [CAS 725237-16-1] (2.25 g, 12.3 mmol) u THF (10 mL) i CH3CN (10 mL) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 dana. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podeljen između EtOAc i 1N HCl Faze su odvojene. Organska faza je isprana dva puta sa 1N HCl, sa vodenim zasićenim NaHCO3rastvorom i slanim rastvorom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom sa silika gelom upotrebom gradijenta od EtOAc (20% do 100%) u heptanu. Frakcije koje su sadržale očekivano jedinjenje su kombinovane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom. Ostatak je kristalizovan iz smeše Et2O, acetonitrila i heptana kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroksietoksi)-5-metoksifenil)amino)etanon (Jedinjenje 11,1.54 g) kao racemska smeša.

[0125] Enantiomeri Jedinjenja 11 (1.22 g) su odvojeni sa preparativnom hiralnom SFC (Stacionarna faza: Chiralcel® OD-H 5 µm 250 x 30 mm, Mobilna faza: 55% CO2, 45% MeOH) dajući 550 mg prvog eluiranog enantiomera i 570 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/diizopropileter kako bi se dobio Enantiomer 11A (487 mg). Drugi eluirani enantiomer je načinjen čvrstim iz CH3CN/diizopropileter kako bi se dobio Enantiomer 11B (460 mg). Oba enantiomera su se pojavila kao amorfni praškovi.

Jedinjenje 11:

[0126]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.56 - 3.69 (m, 5 H) 3.75 - 3.90 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.73 (s, 1 H) 5.95 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.18 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 6.41 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.1, 1.7 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 7.16 - 7.30 (m, 1 H) 7.36 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=8.7, 4.5 Hz, 1 H) 8.50 (s, 1 H) 12.78 (br. s., 1 H) LC/MS (postupak LC-D): Rt1.52 min, MH<+>517

Enantiomer 11A:

[0127]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.79 (br. s., 1 H) 8.50 (s, 1 H) 7.92 (dd, J=8.7, 4.3 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.20 - 7.27 (m, 1 H) 7.10 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.4, 1.7 Hz, 1 H) 6.42 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.18 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 5.72 (s, 1 H) 4.79 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 3.78 - 3.89 (m, 2 H) 3.59 - 3.68 (m, 5 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.07 min, MH<+>517

[α]D<20>: -99.6° (c 0.2218, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-D): Rt1.80 min, MH<+>517, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 11B:

[0128]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.79 (br. s., 1 H) 8.50 (s, 1 H) 7.91 (dd, J=8.7, 4.3 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.17 - 7.28 (m, 1 H) 7.10 (d, J=1.9 Hz, 1 H) 6.97 (dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1 H) 6.41 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.18 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 5.72 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 3.77 - 3.88 (m, 2 H) 3.55 - 3.70 (m, 5 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.07 min, MH<+>517

[α]D<20>: 99.2° (c 0.2127, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-D): Rt3.38 min, MH<+>517, hiralna čistoća 100%.

ANTIVIRUSNA AKTIVNOST JEDINJENJA PREMA PRONALASKU DENV-2 antivirusna proba

[0129] Antivirusna aktivnost svih jedinjenja prema pronalasku testirana je protiv DENV-2 16681 soja koji je označen sa pojačanim zelenim fluorescentnim proteinom (eGPF).

Podloga za kultivisanje sadrži minimalnu esencijalnu podlogu dopunjenu sa 2% fetalnog seruma teleta deaktiviranog sa toplotom, 0.04% gentamicina (50mg/mL) i 2mM L-glutamina. Vero ćelije, dobijene od ECACC, suspendovane su u podlozi za kultivisanje i 25µL je dodato u ploče sa 384 udubljenja (2500 ćelija/otvoru), koje su već sadržale antivirusna jedinjenja. Obično, ove ploče sadrže 4 puta serijsko razblaženje sa 9 koraka razblaženja test jedinjenja pri 200 puta krajnjoj koncentraciji u 100% DMSO (200nL). Dodatno, svaka koncentracija jedinjenja testirana je u četiri kopije (krajnji opseg koncentracije: 25µM - 0.00038µM). Na kraju, svaka ploča sadrži udubljenja koja su postavljena kao virusne kontrole (sadrže ćelije i virus u odsustvu jedinjenja), ćelijske kontrole (sadrže ćelije u odsustvu virusa i jedinjenja) i kontrole za podlogu (sadrže podlogu u odsustvu ćelija, virusa i jedinjenja). Udubljenja koja su postavljena kao kontrola za podlogu, 25µL podloge za kultivisanje je dodato umesto Vero ćelija. Kada su ćelije dodate u ploče, ploče su inkubirane u trajanju od 30 min na sobnoj temperaturi kako bi se omogućilo ćelijama da se podjednako rasporede unutar udubljenja. Nakon toga, ploče su inkubirane u potpuno zasićenom sa vlagom inkubatoru (37°C, 5%CO2) do sledećeg dana. Zatim, DENV-2 soj 16681, označen sa eGFP, je dodat pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 0.5. Prema tome, 15 µL virusne suspenzije je dodato u sva udubljenja koja su sadržala test jedinjenje i u udubljenja postavljena kao virusne kontrole. Paralelno, 15 µL podloge za kultivisanje je dodat u podlogu i ćelijske kontrole. Nakon toga, ploče su inkubirane u trajanju od 3 dana u potpuno zasićenom sa vlagom inkubatoru (37°C, 5%CO2). Na dan očitavanja, eGFP fluorescencija je merena upotrebom automatizovanog fluorescentnog mikroskopa pri 488 nm (plavi laser). Upotrebom LIMS sistema u kućištu, krive suzbijanje odgovor na dozu za svako jedinjenje izračunate su i polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) je određena. Stoga, procenat suzbijanja (I) za svaku test koncentraciju izračunat je upotrebom sledeće formule: I = 100*(ST-SCC)/(SVC-SCC); ST, SCCi SVCsu količine eGFP signala u test jedinjenju, udubljenjima za ćelijsku kontrolu i virusnu kontrolu, respektivno.

EC50predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj je replikacija virusa suzbijena za 50%, kao što je mereno sa 50% redukcijom eGFP fluorescentnog intenziteta u poređenju sa virusnom kontrolom. EC50se računa upotrebom linearne interpolacije (Tabela 1).

Paralelno, toksičnost jedinjenja procenjena je na istim pločama. Kada je očitavanje eGFP signala završeno, 10µL resazurina, oznaka za ćelijsku održivost, je dodato u sva udubljenja ploča sa 384 udubljenja. Resazurin proba je zasnovana na redukciji plavog resazurina sa NADH proizvedenog od strane ćelija, u visoko fluorescentnom proizvodu, resofurinu. Formiranje roze fluorescentnog resofurina je neposredno povezano sa brojem održivih ćelija u udubljenju. Ploče su inkubirane u trajanju od dodatnih 5 sati u potpuno zasićenom sa vlagom inkubatoru (37°C, 5% CO2). Zatim, ploče su izmerene na Infinite reader (Tecan) upotrebom talasne dužine ekscitacije od 530nm. Polovina maksimalne citotoksične koncentracije (CC50) je takođe određena, definisana je kao koncentracija potrebna za redukovanje resazurin konverzije za 50 % u poređenju sa onom za udubljenja sa kontrolnim ćelijama (Tabela 1). Na kraju, indeks selektivnosti (SI) određen je za jedinjenja, koji je izračunat kao što sledi: SI = CC50/EC50.

Tabela 1: EC50, CC50, i SI za jedinjenja prema pronalasku u DENV-2 antivirusnoj probi

Proba kvantitativne-PCR tetravalentne reverzne transkriptaze (RT-qPCR): Protokol A.

[0130] Antivirusna aktivnost jedinjenja prema pronalasku testirana je protiv DENV-1 soja TC974#666 (NCPV), DENV-2 soja 16681, DENV-3 soja H87 (NCPV) i DENV-4 sojeva H241 (NCPV) i EDEN (SG/06K2270DK1/2005; ; GenBank pristupni broj QG398256) u RT-qPCR probi. Stoga, Vero ćelije su inficirane ili sa DENV-1, ili -2, ili -3, ili -4 u prisustvu ili odsustvu test jedinjenja. Na dan 3 nakon infekcije, ćelije su lizovane i ćelijski lizati su korišćeni za pripremanje cDNK oba virusna cilja (3'UTR od DENV; tabela 2) i ćelijskog referentnog gena (β-aktin, tabela 2). Posle toga, dvostruka PCR u realnom vremenu izvršena je na Lightcycler480 instrumentu. Stvorena Cp vrednost je inverzno proporcionalna sa količinom RNK ispoljavanjem ovih ciljeva. Suzbijanje DENV replikacije sa test jedinjenjem ispoljilo se u pomeranju Cp kod 3'UTR gena. Sa druge strane, ukoliko je test jedinjenje toksično za ćelije, sličan uticaj na β-aktinsko ispoljavanje će se primetiti. Komparativni ΔΔCp postupak je korišćen za računanje EC50, koji je zasnovan na relativnom ispoljavanju ciljanog gena (3'UTR) normalizovano sa ćelijskim genom (β-aktin) za održavanje. Dodatno, CC50vrednosti su određene na osnovu Cp vrednosti dobijenih za gen β-aktin za održavanje.

Tabela 2: Primeri i sonde korišćene za kvantitativnu RT-PCR u realnom vremenu .

[0131] Podloga za kultivisanje sadrži minimalnu esencijalnu podlogu dopunjenu sa 2% fetalnog seruma teleta deaktiviranog sa toplotom, 0.04% gentamicina (50mg/mL) i 2mM L-glutamina. Vero ćelije, dobijene od ECACC, suspendovane su u podlozi za kultivisanje i 75µL/udubljenju je dodato u ploče sa 96 udubljenja (10000 ćelija/otvoru), koje su već sadržale antivirusna jedinjenja. Obično, ove ploče sadrže 4 puta serijsko razblaženje sa 9 koraka razblaženja test jedinjenja pri 200 puta krajnjoj koncentraciji u 100% DMSO (500nL). krajnji opseg koncentrovanja: 25µM - 0.00038µM). Dodatno, svaka ploča sadrži udubljenja koja su postavljena kao virusne kontrole (koja sadrže ćelije i viruse u odsustvu jedinjenja) i ćelijske kontrole (koja sadrže ćelije u odsustvu virusa i jedinjenja). Kada su ćelije dodate u ploče, ploče su inkubirane u potpuno zasićenom sa vlagom inkubatoru (37°C, 5%CO2) do sledećeg dana. Zatim, DENV-1 soj TC974#666, DENV-2 soj 16681, DENV-3 soj H87 ili DENV-4 sojevi H241 ili EDEN su dodati. Prema tome, 25µL virusne suspenzije, gde je Cp od -22 postignuto u RTqPCR, je dodato u sva udubljenja koja su sadržala test jedinjenje i u udubljenja postavljena kao virusne kontrole. Paralelno, 15 µL podloge za kultivisanje je dodato u ćelijske kontrole. Nakon toga, ploče su inkubirane u trajanju od 3 dana u potpuno zasićenom sa vlagom inkubatoru (37°C, 5%CO2). Nakon 3 dana, supernatant je uklonjen iz udubljenja i ćelije su isprane dva puta sa ledeno hladnim PBS (∼100µL). Ćelijski peleti u pločama sa 96 udubljenja su skladišteni pri -80°C u trajanju od bar 1 dana. Zatim, RNK je izvađena upotrebom kompleta za lizu Cells-to-CT™, u skladu sa smernicama proizvođača (Applied Biosystems). Ćelijski lizati mogu biti skladišteni pri -80°C ili neposredno korišćeni u koraku reverzne transkripcije.

Pri pripremanju koraka reverzne transkripcije, mešavina A (tabela 3A) je pripremljena i 7.57µL/udubljenju je raspodeljeno u ploči sa 96 udubljenja. Nakon dodavanja 5µL ćelijskih lizata, petominutni korak denaturacije pri 75°C je izvršen (Tabela 3B). Posle toga, 7.43µL mešavine B je dodato (tabela 3C) i korak reverzne transkripcije je započet (tabela 3D) za stvaranje cDNK.

Na kraju, RT-qPCR mešavina je pripremljena, mešavina C (tabela 4A) raspodeljena u LightCycler qPCR pločama sa 96 otvora u koje je 3µL cDNK dodato i qPCR je izvršena u skladu sa uslovima u tabeli 4B na LightCycler 480.

Upotrebom LightCycler softvera i sistema LIMS u kućištu, krive odgovora na dozu za svako jedinjenje su izračunate i polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) i polovina maksimalne citotoksične koncentracije (CC50) su određene (Tabele 6-9).

Proba tetravalentne reverzne transkriptaze-PCR (RT-qPCR): Protokol B.

[0132] Vero ćelije (4 × 10<4>) posejane su u ploče sa 96 otvora. Nakon jednog dana, podloga za kultivisanje ćelija zamenjena je sa 100 µL podloge za probu koja je sadržala 2×, 3× or 5× serijsko razblaženje jedinjenja (opseg koncentrovanja: 50 µg/mL - 0.00038 µg/mL, 50 µg/mL - 0.0076 µg/mL, i 50 µg/mL - 0.00013 µg/mL, respektivno) i 100 µL razblaženja virusa denge, gde jeCt od -20 postignuto u RTqPCR. Nakon perioda inkubiranja od 2 h, ćelijski jednostruki sloj je ispran 3 puta sa podlogom za probu kako bi se uklonio preostali, virus koji se nije adsorbovao i kulture su dalje inkubirane ili 4 dana (DENV-2 NGC-Tongalike) ili 7 dana (DENV-1 Džibuti soj D1/H/IMTSSA/98/606, DENV-3 soj H87 prototip, DENV-4 soj H241) u prisustvu inhibitora. Supernatant je sakupljen i virusno DNK opterećenje je određeno kvantitativnom RT-PCR u realnom vremenu.50% efektivna koncentracija (EC50), koja je definisana kao koncentracija jedinjenja koja je potrebna za suzbijanje virusne RNK replikacije za 50% je određena upotrebom logaritamske interpolacije (Tabele 7 i 8).

[0133] RNK je izolovana iz 100 µL supernatanta sa NucleoSpin 96 virusnim kompletom (Filter Service, Düren, Germany) kao što je opisano od strane proizvođača. Sekvence TaqMan primera DENV-For, DENV-Rev; Tabela 5) i TaqMan soddi (DENV-Sonda Tabela 5) su izabrane iz ne-strukturnog gena 3 (NS3) ili NS5, respektivnih flavivirusa upotrebom Primer Express software (verzija 2.0; Applied Biosystems, Lennik, Belgium). TaqMan sonda je fluorescentno obeležena sa 6-karboksifluorescinom (FAM) na 5' kraju kao reporter boja, i sa manjim veznikom žleba (MGB) na 3’ kraju kao sredstvom za gašenje (Tabela 5). Kvantitativna RT-PCR sa jednim korakom, izvršena je u ukupnoj zapremini od 25 µL, koja sadrži 13.9375 µL H2O, 6.25 µL glavne mešavine (Eurogentec, Seraing, Belgium), 0.375 µL prednjeg primera, 0.375 µL reverznog primera, 1 µL sonde, 0.0625 µL reverzne transkriptaze (Eurogentec) i 3 µL sonde. RT-PCR je izvršena upotrebom ABI 7500 brzog PCR sistema u realnom vremenu (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, SAD) upotrebom sledećih uslova: 30 min pri 48 °C i 10 min pri 95 °C, što je praćeno sa 40 ciklusa od 15 s pri 95 °C i 1 min pri 60 °C. Podaci su analizirani upotrebom ABI PRISM 7500 SDS softvera (verzija 1.3.1; Applied Biosystems). Za apsolutnu kvantifikaciju, standardne krive su stvorene upotrebom razblaženja od 10 puta šablonskih preparata poznatih koncentracija.

Tabela 5: Primeri i sonde korišćene za kvantitativnu RT-PCR u realnom vremenu.

Proba citotoksičnosti (protokol B)

[0134] Potencijalni citotoksični uticaji na jedinjenja procenjeni su u unificiranim Vero ćelijama. Ćelije su posejane pri 4 × 10<4>ćelija/udubljenju u pločama sa 96 udubljenja u prisustvu serijskih razblaženja od dva-, tri- ili pet puta (u opsegu od 50 µg/mL - 0.0038 µg/mL, 50 µg/mL - 0.0076 µg/mL, i 50 µg/mL - 0.00013 µg/mL, respektivno) jedinjenja i inkubiranjem u trajanju od 4 do 7 dana. Podloge za kultivisanje je uklonjena i 100100 µL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum/fenazinmetosulfata (MTS/PMS; Promega, Leiden, The Netherlands) u PBS je dodato u svako udubljenje. Nakon perioda inkubacije od 2 sata pri 37°C, optička gustina je određena pri 498 nm. Citotoksična aktivnost je računata upotrebom sledeće formule: % ćelijska održivost = 100 × (ODJedinjenje/ODCC), gde ODJedinjenjei ODCCodgovaraju optičkoj gustini pri 498 nm neinficiranih ćelijskih kultura tretiranih sa jedinjenjem i onih neinficiranih, netretiranih ćelijskih kultura, respektivno. 50% citotoksična koncentracija (tj., koncentracija koja redukuje ukupni broj ćelija za 50%; CC50) je izračunata upotrebom linearne interpolacije (Tabele 7 i 8).

Tabela 6: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 1 u RT-qPCR probama

N= broj nezavisnih eksperimenata u kojima je jedinjenje testirano. Tabela 7: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 2 u RT-qPCR probama

N= broj nezavisnih eksperimenata u kojima je jedinjenje testirano. Tabela 8: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 3 u RT-qPCR probama

N= broj nezavisnih eksperimenata u kojima je jedinjenje testirano.

Tabela 9: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotip 4 sojeva H241 (A) i SG/06K2270DK1 /2005 (B) za RT-qPCR probe

N= broj nezavisnih eksperimenata u kojima je jedinjenje testirano.

SPISAK SEKVENCI

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I)
2. njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf koji sadrži mono- ili di-supstituisanu indol grupu; navedeno jedinjenje je izabrano iz grupe gde: R1je H, R2je F i R3je H, F ili CH3; R1je F ili CH3, R2je OCH3i R3je H; R1je F, R2je H i R3je CH3; R1je H, R2je OCH3i R3je H; R1je H, R2je Cl i R3je H ili CH3; R1je F, R2je F i R3je H ili R1je CH3, R2je H i R3je F. 2. Jedinjenje ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf prema patentnom zahtevu 1 gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe:
3. 3. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje formule (I) ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf prema patentnom zahtevu 1 ili 2 zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, razblaživača ili nosača.
4. 4. Jedinjenje formule (I) ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu kao medikament.
5. 5. Jedinjenje formule (I) ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu pri tretiranju denge.
6. 6. Jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom (I)

   njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf koji sadrži mono- ili di-supstituisanu indol grupu; navedeno jedinjenje je izabrano iz grupe gde: R1je H, R2je F i R3je H, F ili CH3; R1je F ili CH3, R2je OCH3i R3is H; R1je F, R2je H i R3je CH3; R1je H, R2je OCH3i R3is H; R1je H, R2je Cl i R3je H ili CH3; R1je F, R2je F i R3je H ili R1je CH3, R2je H i R3je F. za upotrebu u suzbijanju replikacije virusa denge u biološkom uzorku ili pacijentu.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 dalje obuhvata zajedničko davanje dodatnog terapeutskog sredstva.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 gde je dodatno terapeutsko sredstvo izabrano iz antivirusnog sredstva ili vakcine za denga, ili oba. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5