RS57291B1 - Pan-elr+cxc hemokin antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela protiv ELR+ CXC hemokina, i njihovu upotrebu u tretiranju bolesti gde je patogeneza posredovana sa ELR+ CXC hemokinima.

[0002] ELR+ CXC hemokini (tako nazvani jer svi članovi porodice hemokina poseduju E-L-R aminokiselinski motiv u neposrednom susedstvu sa njihvoim CXC motivom) igraju zanačajnu ulogu u mnogim patogenim mehanizmima, uključujući migraciju neutrofila u mesta zapaljenja i angiogeneze. Neutrofili doprinose patogenezi nekoliko akutnih i hroničnih inflamatornih/autoimunih bolesti, kao što je inflamatorna bolest creva (IBD), psorijaza sa plakom, i palmoplantarna pustuloza. ELR+ CXC hemokini takođe igraju kritičnu ulogu u tumorigenezi i metastazi tumora. Ovi hemokini su visoko eksprimirani u tumorima. Unutar tumorskog okruženja, ELR+ CXC hemokini su uključeni u različite puteve, na primer angiogenezu, mobilizaciju i invaziju endotelnih ćelija i leukocita na mestima tumora, i proliferaciju i preživljavanje tumorskih ćelija.

[0003] Hemokini su grupisani u četiri potfamilije: CXC, CC, (X)C, i CX3C. Kod CXC hemokina, jedna aminokiselina razdvaja prva dva cisteina ("CXC motiv"). ELR+ CXC hemokini su ligandi za CXCR1 i/ili CXCR2 hemokin receptore, koji su G-protein kuplovani sedam transmembranskih receptora domenskog tipa koji specifično vezuju ELR+ CXC hemokine. Sedam humanih ELR+ CXC hemokina su humani Gro-alfa (takođe poznat kao CXCL1), humani Gro-beta (takođe poznat kao CXCL2), humani Gro-gama (takođe poznat kao CXCL3), humani ENA-78 (takođe poznat kao CXCL5), humani GCP-2 (takođe poznat kao CXCL6), humani NAP-2 (takođe poznat kao CXCL7), i humani IL-8 (takođe poznat kao CXCL8). Svi ELR+ CXC hemokini vezuju CXCR2 receptor; dodatno, neki ELR+ CXC hemokini vezuju i CXCR1 i CXCR2 receptore (tj., CXCL6 i CXCL8), od kojih svi doprinose redundantnosti u aktivacionim putevima.

[0004] Antitela koja se vezuju za pojedinačne ELR+ CXC hemokine opisana su prethodno. Dva monoklonska antitela protiv CXCL8 (IL-8) su procenjivana u ranim kliničkim studijama sa efikasnošću u inflamatornim bolestima. (J Leuk Biol 66:401-410; J Immunol 181:669-679.) Dodatno, WO 2008/130969 otkriva antitelo koje se vezuje za humani IL-8 (CXCL8), humani Gro-alfa (CXCL1), humani Gro-beta (CXCL2), humani Gro-gama (CXCL3), i humani ENA- 78 (CXCL5). Međutim, otkriće ne pokazuje da se antitela snažno vezuju za GCP-2 (CXCL6), i da nema vezivanja sa NAP-2 (CXCL7).

[0005] Međutim, antitelo koje je sposobno da se vezuje i neutralizuje svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina još uvek nije otkriveno. Ciljno dejstvo na jedan ili nekoliko humanih ELR+ CXC hemokina ostavlja otvorenu mogućnost za druge ELR+ CXC hemokine da ispolje višestruke biološke funkcije. Neutralizacija svih sedam ELR+ CXC hemokina može uticati na sposobnost CXCR1+ ili CXCR2+ ćelija da migriraju u mesta inflamacije i mogu inhibirati angiogenezu. Uzimajući u obzir značajnu redundantnost u CXCR1 i CXCR2 receptor aktivacionim putevima, i dalje postoji potreba za antitelom koje se vezuje za svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina sa specifičnošću i visokim afinitetom. Postoji potreba za antitelom koje neutralizuje svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina. Takođe postoji potreba za antitelom koje je fizički stabilno. Stoga je poželjno obezbediti septa-specifično antitelo koje je sposobno da se vezuje i neutralizuje svih sedam humanih ELR CXC hemokina, i fizički je stabilno.

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje neutralizuje humane Gro-alfa, Grobeta, Gro-gama, ENA- 78, GCP-2, NAP-2, i IL-8. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje neutralizuje humane Gro-alfa, Grobeta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2, i IL-8, gde se antitelo vezuje za IL-8 (SEQ ID NO: 27) na sledećim aminokiselinama: Arg 6, Ile 10, Ala 35, Ile 40. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo koje neutralizuje humani Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2, i IL-8, gde se antitelo vezuje za IL-8 (SEQ ID NO: 27) na sledećim aminokiselinama: Arg 6, Ile 10, Ala 35, Ile 40, i Leu 49.

[0007] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđeno je antitelo koje vezuje humani Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2, i IL-8, gde antitelo sadrži laki lanac i teški lanac, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži LCDR1, LCDR2, LCDR3 i HCVR sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, gde LCDR1 je RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7), LCDR2 je YTSRSVS (SEQ ID NO: 8), LCDR3 je GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9), HCDR1 je GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10), HCDR2 je NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11), i HCDR3 je EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (SEQ ID NO: 20) gde Xaa je E ili Q.

[0008] Poželjno, aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 2 i aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 4.

[0009] Prema poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđeno je antitelo, gde aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 2 i aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 4.

[0010] Poželjno, aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 1 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 3.

[0011] Poželjnije, antitelo sadrži dva teška lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 i dva laka lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3.

[0012] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je DNK molekul koji sadrži prvu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1; i koji sadrži drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

[0013] Prema trećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je ćelija sisara koja sadrži prethodno opisani DNK molekul, gde je ćelija sposobna da eksprimira antitelo prema predmetnom pronalasku.

[0014] Prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela prema predmetnom pronalasku, gde postupak sadrži kultivisanje prethodno opisane sisarske ćelije pod takvim uslovima da je antitelo eksprimirano, i rekuperovanje eksprimiranog antitela.

[0015] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na antitelo proizvedeno prethodno opisanim postupkom.

[0016] Prema dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je antitelo prema predmetnom pronalasku za upotrebu u terapiji. poželjno, antitelo je za upotrebu u tretmanu ulcerativnog kolitisa, kancera bubrega, ili kancera jajnika.

[0017] Predmetno otkriće obezbeđuje u sledećem aspektu antitelo gde aminoksielinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 14. Predmetno otkriće dodatno obezbeđuje antitelo gde aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 16.

[0018] Predmetno otkriće obezbeđuje antitelo gde aminoksielinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 1 ili 13. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje antitelo gde aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 3 ili 15.

[0019] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje DNK molekul koji sadrži prvu polinukelotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 13; i sadrži drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3 ili 15.

[0020] Predmetno otkriće obezbeđuje sisarsku ćeliju koja sadrži DNK molekule opisane prethodno, gde je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži težak lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 13 i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili 15. Sisarska ćelija domaćin za koju se zna da je sposobna da eksprimira funkcionalne imunoglobuline uključuje ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS ćelije, i NS0 ćelije. Poželjne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku su NS0 ćelije.

[0021] Predmetno otkriće dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koje sadrži laki lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 3 ili 15 i teški lanac čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 1 ili 13, koji sadrži kultivisanje prethodno opisane sisarske ćelije pod uslovima takvim da se je antitelo eksprimirano, i rekuperovanje eksprimiranog antitela.

[0022] Predmetno otkriće obezbeđuje postupak za tretiranje ulcerativnog kolitisa, kancera bubrega, ili kancera jajnika, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine antitela prema predmetnom pronalasku.

[0023] Predmetno otkriće dalje obezbeđuje antitelo prema predmetnom pronalasku za uportebu u terapiji. Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tretmanu ulcerativnog kolitisa, kancera bubrega, ili kancera jajnika. Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretman ulcerativnog kolitisa, kancera bubrega, ili kancera jajnika.

[0024] Predmetno otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema predmetnom pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ili ekscipijenasa.

[0025] Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "humani ELR+ CXC hemokini" označava sedam poznatih CXC hemokina koji imaju E-L-R motiv i koji se vezuju za CXCR1 i/ili CXCR2 receptor. Humani ELR+ CXC hemokini su humani Gro-alfa (takođe poznat kao CXCL1) (SEQ ID NO: 21), humani Gro-beta (takođe poznat kao CXCL2) (SEQ ID NO: 22), humani Gro-gama (takođe poznat kao CXCL3) (SEQ ID NO: 23), humani ENA-78 (takođe poznat kao CXCL5) (SEQ ID NO: 24), humani GCP-2 (takođe poznat kao CXCL6) (SEQ ID NO: 25), humani NAP-2 (takođe poznat kao CXCL7) (SEQ ID NO: 26), i humani IL-8 (takođe poznat kao CXCL8) (SEQ ID NO: 27). Zajedno, svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina ovde se nazivaju "humani pan-ELR+ CXC hemokini".

[0026] Namera je da termin "antitelo," kao što je ovde korišćeno, označava monoklonske imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezma. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) i konstantnog regiona lakog lanca, CL. HCVR i LCVR regioni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), pomešani sa regionima koji su konzervativniji, označeni okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR regioni u HCVR su označeni HCDR1, HCDR2, i HCDR3. CDR regioni u LCVR su označeni LCDR1, LCDR2, i LCDR3. CDRs sadrži većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Trenutno postoje tri sistema označavanja CDR za antitela koja se koriste za razgraničavanje sekvenci. Kabat CDR definicija (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) je zasnovana na varijabilnosti sekvence antitela. Chothia CDR definicija (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) je zasnovana na trodimenzionalnim strukturama antitela i topologijama CDR petlji. Chothia CDR definicije su identične Kabat CDR definicijama sa izuzetkom HCDR1 i HCDR2. Za svrhe predmetnog pronalaska, hibrid Kabat i Chothia definicija je korišćen za definisanje CDRs. Označavanje aminokiseilina u HCVR i LCVR regionima je u skladu sa Kabat konvencijom numerisanja. Dodatno se podrazumeva da termin "antitelo" obuhvata bilo koje ćelijske post-translacione modifikacije antitela uključujući, ali ne ograničavajući se na, acilaciju i glikozilaciju.

[0027] Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "neutralizujuće antitelo" označava antitelo čije vezivanje za ELR+ CXC hemokin rezultuje u inhibiciji biološke aktivnosti indukovane tim hemokinom. Ova inhibicija ELR+ hemokin-indukovane biološke aktivnosti može se proceniti sa jednom ili više standardnih in vitro analiza poznatih u tehnici (videti Primere). Dodatno se podrazumeva da termini "inhibira" ili "neutralizuje" kao što su ovde korišćeni u odnosu na aktivnost antitela prema pronalasku označava sposobnost da antagonizuje, smanji, ili poremeti progresiju, intenzitet, ili težinu biološke aktivnosti indukovane sa jednim ili više ELR+ CXC hemokina.

[0028] Kao što je ovde korišćeno, namera je da termin "septa-specifično antitelo" obuhvata antitelo koje vezuje svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina sa visokim afinitetom (npr., sa afinitetom vezivanja (KD) u opsegu od oko 5 x 10<-11>M do oko 1 x 10<-9>M).

[0029] Kao što je ovde korišćeno, "pacijent" se odnosi na sisara, poželjno čoveka sa bolešću, poremećajem, ili stanjem koje bi imalo koristi od smanjenog nivoa humanih ELR+ CXC hemokina ili smanjene bioaktivnosti indukovane humanim ELR+ CXC hemokinima.

[0030] Kao što je ovde korišćeno, namera je da "tretman" ili "tretiranje" označava sve postupke gde može biti usporenja, kontrolisanja, ili zaustavljanja progresije poremećaja opisanih ovde, ali ne ukazuje obavezno na potpunu eliminaciju svih simptoma poremećaja. Tretman uključuje primenu antitela prema predmetnom pronalasku za tretman bolesti ili stanja kod pacijenta, naročito kod čoveka.

[0031] Antitela prema predmetnom pronalasku vezuju humani pan-ELR+ CXC hemokine sa visokim afinitetom. Na primer, predmetna antitela vezuju svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina sa afinitetom vezivanja (KD) u opsegu od oko 5 x 10<-11>M do oko 1 x 10<-9>M, na primer od oko 1.0 x 10<-10>M do oko 8.6 x 10<-10>M, kao što je mereno površinskom plazmon rezonancom, kada je eksprimirano kao IgG4 antitelo pune dužine. Antitela prema predmetnom pronalasku su dodatno karakterizovana po tome što iako vezuju humane pan-ELR+ CXC hemokine sa specifičnošću, ona se ne vezuju specifično za druge CXC hemokine, na primer stromalni ćelijski-izvedeni faktor -1 alfa (SDF-1α, takođe poznat kao CXCL12).

[0032] U primeru izvođenja, antitela prema pronalasku mogu imati varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde varijabilni region teškog lanca sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: HCDR1 (SEQ ID NO: 10), HCDR2 (SEQ ID NO: 11), i HCDR3 (SEQ ID NO: 12); i gde varijabilni region lakog lanca sadrži CDR regione sa sledećeim aminokiselinskim sekvencama: LCDR1 (SEQ ID NO: 7), LCDR2 (SEQ ID NO: 8) i LCDR3 (SEQ ID NO: 9).

[0033] U sledećem primeru izvođenja, antitela prema pronalasku mogu imati varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde varijabilni region teškog lanca sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: HCDR1 (SEQ ID NO: 10), HCDR2 (SEQ ID NO: 11), i HCDR3 (SEQ ID NO: 19); i gde varijabilni region lakog lanca sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: LCDR1 (SEQ ID NO: 7), LCDR2 (SEQ ID NO: 8) i LCDR3 (SEQ ID NO: 9).

[0034] U sledećem primeru izvođenja, antitela prema pronalasku mogu sadržati varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili 14, varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili 16.

[0035] U sledećem primeru izvođenja, antitela prema pronalasku mogu sadržati težak lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 13, i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili 15.

[0036] Poželjno, antitela sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Poželjno, laki lanac sa aminoksielinskom sekvencom kao što je prikazana u SEQ ID NO: 3 je kodiran od strane nukleinske kiseline koja sadrži polinukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6. Poželjno, teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 kodiran je od strane nukelinske kiseline koja sadrži polinukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5. Poželjno, aminokiselinska sekvenca lakog lanca kao što je prikazana u SEQ ID NO: 15 je kodirana od strane nukleinske kiseline koja sadrži polinukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18. Poželjno, aminokiselinska sekvenca teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 kodirana je od strane nukleinske kiseline koja sadrži polinukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17.

[0037] Najpoželjniji primer izvođenja prema pronalasku je antitelo koje sadrži dva identična teška lanca koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, i dva identična laka lanca koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

[0038] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu se inkorporisati u farmaceutske kompozicije za primenu na pacijenta. Tipično farmaceutska kompozicija sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji ili sve rastvarače, disperzioni medijum, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva koja odlažu apsorpciju, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dodatno sadržati manje količine pomoćnih supstanci koje poboljšavaju rok trajanja ili efikasnost antitela.

[0039] Kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti u različitim oblicima. Poželjni oblik zavisi od nameravanog načina primene i terapeutske primene. Tipične poželjne kompozicije su u obliku rastvora koji se mogu primeniti injekcijom ili infuzijom, kao što su kompozicije slične onima korišćenim za pasivnu imunizaciju ljudi. Poželjan način primene je parenteralni (npr., intravenski, potkožni, intraperitonealni, ili intramuskularni). U primeru izvođenja, antitelo je primenjeno intraperitonealnom ili potkožnom injekcijom. Međutim, kao što će stručnjaku biti jasno, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata.

[0040] Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u farmaceutske kompozicije. U određenim primerima izvođenja, antitelo prema pronalasku je ko-formulisano sa i/ili koprimenjeno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava koja su korisna za tretiranje poremećaja kod kojih je aktivnost ELR+ CXC hemokina štetna. Na primer, antitelo prema pronalasku može biti ko-formulisano i/ili ko-primenjeno sa jednim ili više hemoterapijskih sredstava (npr., sunitinib ili cisplatin).

[0041] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu uključivati "terapeutski efikasnu količinu" antitela prema pronalasku. "Terapeutski efikasna količina" označava količinu koja je efikasna, na potrebnim dozama i vremenskim periodima, da se postigne željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina antitela može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona kod koje su toksični ili štetni efekti antitela nadmašeni terapeutski korisnim efektima.

[0042] Dozni režimi se mogu podesiti da bi se obezbedio optimum željenog odgovora (npr., terapeutski odgovor). Na primer, pojedinačni bolus se može primeniti, nekoliko podeljenih doza se može primeniti tokom vremena, ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati kao što je naznačeno hitnošću terapeutske situacije.

[0043] Vrednosti doze mogu varirati sa tipom i težinom stanja koje treba ublažiti. Dodatno se podrazumeva za bilo kog određenog subjekta, specifične dozne režime treba podesiti tokom vremena u skladu sa potrebom pojedinca i profesionalnom procenom osobe koja primenjuje ili kontroliše primenu kompozicija.

[0044] Specifično vezivanje i neutralizacija od strane antitela prema predmetnom pronalasku sa humanim ELR+ CXC hemokinima omogućava da se pomenuto antitelo koristi kao terapeutik za bolesti i stanja koja bi imala korist od inhibicije bioaktivnosti humanog ELR+ CXC hemokina. Uzimajući u obzir njihovu sposobnost da se vezuju i neutralizuju svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina, antitela prema predmetnom pronalasku nude prednosti u odnosu na monoterapije koje ciljno deluju na pojedinačne humane ELR+ CXC hemokine i kombinovane terapije koje ciljno deluju na više humanih ELR+ CXC hemokina.

[0045] U primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za tretman ulcerativnog kolitisa ili kancera, kao što je kancer bubrega ili kancer jajnika. U drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo za upotrebu u tretiranju ulcerativnog kolitisa ili kancera, kao što je kancer bubrega ili kancer jajanika.

[0046] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima.

PRIMERI

Ekspresija i proizvodnja antitela

[0047] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu se eksprimirati i prečistiti kao što sledi. Ekspresioni vektor koji sadrži DNK sekvencu prema SEQ ID NO: 5 (koja kodira polipeptid teškog lanca prema SEQ ID NO: 1) i SEQ ID NO: 6 (koja kodira polipeptid lakog lanca prema SEQ ID NO: 3) korišćen je za transfektovanje NS0 ćelija. Antitelo koje je rezultat iz ovog ekspresionog vektora je "Antitelo 1".

[0048] Dodatno, ekspresioni vektor koji sadrži DNK sekvencu prema SEQ ID NO: 17 (koja kodira polipeptid teškog lanca prema SEQ ID NO: 13) i SEQ ID NO: 18 (koja kodira polipeptid lakog lanca prema SEQ ID NO: 15) korišćen je za transfektovanje NS0 ćelija. Antitelo koje je rezultat iz ovog ekspresionog vektora je "Antitelo 2".

[0049] Za bilo koje od Antitela 1 ili Antitela 2, transfektovani pulovi su postavljeni na ploče sa niskom gustinom da bi se omogućio rast ćelija sa stabilnom ekspresijom koji je blizak klonskom. Izvršen je skrining master bunarčića u odnosu na ekspresiju antitela i zatim je povećan u suspenzijama kultura bez seruma za korišćenje u proizvodnji. Izbistreni medijum, u koje je izlučeno antitelo, primenjen je na Protein A ili G kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferovan fiziološki rastvor (pH 7.4). Kolona je isprana da bi se uklonile komponente koje se nespecifično vezuju. Vezano antitelo je eluirano pH gradijentom (kao što je 0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 2.5). Frakcije antitela su detektovane sa SDS-PAGE i zatim su pulovane. Dodatno pečišćavanje je izborno, u zavisnosti od nameravane upotrebe. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregat i multimeri se mogu efikasno ukloniti uobičajenim tehnikama, uključujući ekskluzionu, sa hidrofobnom interakcijom, jono-izmenjivačku, ili hidroksiapatitnu hromatografiju. Čistoća antitela nakon ovih koraka hromatografije može biti veća od 99%. Proizvod može biti odmah zamrznut na -70°C ili može biti liofilizovan.

Afinitet vezivanja za humane ELR+ CXC hemokine

[0050] Biacore 2000 instrument i Biacore 2000 Evaluation Software Version 4.1 su korišćeni za analizu površinske plazmon rezonance. CM5 čip je pripremljen korišćenjem postupka proizvođača za EDC/NHS amin kuplovanje. Ukratko, površine sve četiri protočne ćelije su aktivirane injekcijom 1:1 smeše EDC/NHS 7 minuta na 10 µL/min. Protein A je razblažen 100 µg/mL u 10 mM acetatu, pH 4.5 puferu, i imobilisan da bi se postiglo približno 10,000 RU na sve 4 protočne ćelije sa 7-minuta injekcije na stopi protoka od 10 µL/minutu. Nereagovana mesta su blokirana sa 7-minuta injekcijom etanolamina na 10 µL/minutu. Dve injekcije glicina (pH 1.5) 30 sekundi na 10 mL/minutu su korišćene da uklone bilo koji nekovalentno vezani protein. Tekući pufer je HBS-EP+.

[0051] Antitelo 1 ili Antitelo 2 je razblaženo do 2 mg/mL u tekućem puferu, i približno 400-600 RU je zarobljeno u protočnoj ćeliji (Fc). Ligandi su razblaženi od 100 µg/mL do 50 nM u tekućem puferu i zatim su dvostruko serijski razblaženi u tekućem puferu do 3.125 nM. Duplikati injekcija svake koncentracije liganda su injektirani sa 100 µL/min 150 sekundi nakon čega je sledeća faza disocijacije. Faza disocijacije je 1800 sekundi za sve ligande. Regeneracija je izvedena injektiranjem 10 mM glicina (pH 1.5) 60 sekundi na 50µL/min preko svih protočnih ćelija. Podaci oduzeti od referentnih su sakupljeni kao Fc2- Fc1, Fc3-Fc1, i Fc4-Fc1. Merenja su dobijena na 25°C. Konstanta asocijacije (kon) i disocijacije (koff) za svaki ligand su procenjene korišćenjem "1:1 (transfer mase) vezivanje" modela vezivanja. Afinitet (KD) je izračunat iz kinetike vezivanja prema odnosu: KD= koff/kon.

[0052] Humani ELR+ CXC hemokini proizvode vezujući odgovor zavisan od koncentracije sa Antitelom 1 i Antitelom 2. Tabele 1 i 2 rezimiraju kon, koff, i KDvrednosti za Antitelo 1 i Antitelo 2. Ovi rezultati pokazuju da Antitelo 1 i Antitelo 2 vezuju svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina sa visokim afinitetom.

Tabela 1 In vitro afiniteti vezivanja sa humanim ELR CXC hemokinima za Antitelo 1

Tabela 2 In vitro afiniteti vezivanja sa humanim ELR CXC hemokinima za Antitelo 2

Procena fizičke stabilnosti

[0053] Agregacija i samo-asocijacija proteina je nepoželjna osobina kod antitela jer potencijalno može pogoršati neželjene efekte, kao što je iniciranje imunog odgovora. Stoga, održavanje antitela u monomernom stanju je veoma poželjno. Procenat agregata sa velikom molekulskom težinom (%HMW) je indikator agregacije i samo-asocijacije proteina. Viši %HMW agregata ukazuje na povećanu agregaciju/samo-asocijaciju proteina i povećanu fizičku nestabilnost. Fizička stabilnost Antitela 1 i Antitela 2 su određene kao što sledi.

[0054] Antitelo je dijalizirano preko noći na 4°C u 10 mM citratu, pH 6 /- 150 mM NaCl. Sledećeg jutra, uzorci su koncentrovani do 50 mg/mL, filtrirani preko 0.2 mikronskih filtera, i zatim je dodat Tween-80 do finalne koncentracije od 0.02%. Svaki uzorak je inkubiran na 25°C za naznačena vremena. Formiranje rastvorljivog agregata je praćeno sa analitičkom SEC korišćenjem TSK3000SWXL, 5 mikronske kolone sa dimenzijama 30 cm x 0.78 cm. Mobilna faza je 50 mM natrijum fosfat, pH 7, 175 mM NaCl, na stopi protoka od 0.5 mL/min. Uzorci su primenjeni kao 1 µL injekcije i praćeni na 280 nm da bi se odredilo povećanje % HMW agregata (Tabela 3).

[0055] 50 mg/mL formulacije su inkubirane 1 i 4 nedelje na 25°C da bi se procenila dugoročna stabilnost pod stresnim uslovima. Delta %HMW agregata je određen oduzimanjem %HMW agregata u nultoj vremenskoj tački (označena kao ’Inicijalno’ u Tabeli 3) od %HMW u vremenskoj tački 1 nedelje ili 4 nedelje. Nakon 1 i 4 nedelje, i Antitelo 1 i Antitelo 2 pokazivali su delta %HMW ispod 1%, čime su pokazali dobru fizičku stabilnost.

Tabela 3 % Agregat velike molekulske težine

Mapiranje epitopa antitela za Antitelo 1

[0056] Preduzeti su višestruki pristupi da bi se karakterizovao epitop za Antitelo 1, uključujući Western blot analizu, ko-kristalizaciju antitela sa nekoliko ELR+ CXC hemokina, i mutaciona analiza za vezivanje i neutralizaciju.

Western Blot analiza

[0057] Da bi se odredilo da li je Antitelo 1 sposobno da se vezuje za linearni ili konformacioni epitop, Western blot analiza je izvedena korišćenjem redukujućih i neredukujkućih uslova. Elektroforeza proteina je izvedena korišćenjem pre-cast NuPAGE® 4-12% Bis-Tris gelova. NuPAGE® MES SDS tekući pufer je dodat i u unutrašnju (200 mL) i u spoljašnju (najmanje 600 mL) komoru mini ćelija. Serijska razblaženja humanog CXCL8 (400 ng, 100 ng, ili 25 ng po stazi) su napravljeni u NuPAGE® LDS 4X puferu za uzorke sa ili bez NuPAGE® 10X sredstva za redukciju uzroka. Uzorci su zagrevani na 95°C 2 minuta. Napunjene zapremine su 10 µL po stazi za uzorke, i 5 µL po stazi za SeeBlue Plus2 prethodno obojeni standardni marker. Gelovi su pušteni na 200V 35 minuta na sobnoj temperaturi.

[0058] Proteini su preneti na PVDF korišćenjem iBlot® Dry Blotting System sa iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose, Mini. Membrana je blokirana u blokirajućem rastvoru (3% nemasnog mleka u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru) 1 čas na sobnoj temperaturi. Antitelo 1 je dodato blokirajućem rastvoru do finalne koncentracije od 1 µg/mL i zatim je inkubirano 2 časa na sobnoj temperaturi. Nakon primarne inkubacije, antitelo/blokirajući rastvor je uklonjen, i membrana je isprana 3 puta tokom 15 minuta u puferu za ispiranje (fosfatno puferovani fiziološki rastvor 0.05% Tween 20). Membrana je zatim inkubirana sa HRP konjugovanim magarećim anti-humanim Fc specifičnim IgG sekundarnim antitelom (0.1 µg/mL u blokirajućem rastvoru) 1 čas na sobnoj temperaturi. Nakon uklanjanja sekundarnog antitela, membrana je isprana 4 puta tokom 10 minuta sa puferom za ispiranje. Membrana je zatim inkubirana sa radnim rastvorom Stable Peroxide Solution i Luminol/ Enhancer Solution (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate) 5 minuta. Membrana je postavljena u plastični zaštitnik membrane u kasetu za rentgenski film sa CL-X Posure™ Film u toku 30 sekundi. Film je razvijen korišćenjem Konica SRX-101 sistema.

[0059] Pod neredukujućim uslovima, na CXCL8 koncentraciji od 400 ng, pojavile su se dve trake na oko 17 kDa i oko 10 kDa. Na CXCL8 koncentraciji od 100 ng, pojavila se jedna traka na oko 10 kDa. Na CXCL8 koncentraciji od 25 ng, trake se nisu pojavile. Pod redukujućim uslovima, trake se nisu pojavile na na jednoj od testiranih koncentracija.

[0060] Podaci su pokazali da je Antitelo 1 sposobno da vezuje neredukovane, denaturisane humane CXCL8, ali nije sposobno da veže redukovano, denaturisano humano CXCL8. Stoga, dve disulfidne veze u CXCL8 su potrebne da bi se održao epitop antitela. Ovi rezultati pokazuju konformacioni epitop za Antitelo 1.

Analiza kristalne strukture

[0061] Kristalne strukture Fab/antigen kompleksa za humani CXCL8, i CXCL2, CXCL3 i CXCL7 makaki majmuna uzeti su da bi se odredila kompletna vezujuća površina Antitela 1. Humani isečeni CXCL81-66 divljeg tipa, humani CXCL8 mutanti sa tačkastim mutacijama, i CXCL7 makaki majmuna su eksprimirani u E. coli sa N-terminalnim His- SUMO tagovima. Ovi proteini su ponovo savijeni; isečeni su tagovi; i proteini su prečišćeni standardnim tehnikama prečišćavanja. CXCL2 i CXCL3 makaki majmuna su eksprimirani u HEK293 EBNA ćelijama i prečišćeni su standardnim tehnikama prečišćavanja. Formiranje disulfidnih veza je potvrđeno digestijom sa tripsinom i analizom masenog otiska, i aktivnost je potvrđena analizom hemotaksije neutrofila. Fab Antitela 1 je eksprimiran u HEK293 EBNA ćelijama i prečišćen je standardnim tehnikama za prečišćavanje. Fab/antigen kompleksi su formirani dodavanjem blagog molarnog viška antigena za Fab, nakon čega je usledilo prečišćavanje ekskluzionom hromatografijom da bi se uklonio višak slobodnog antigena. Kompleksi su kristalizovani, i kristalne strukture su rešene molekulskom zamenom korišćenjem Buster 2.9.5 (Global Phasing Ltd.).

[0062] Ove kristalne strukture su potvrdile da je epitop za Antitelo 1 uključen u N-terminus ELR+ CXC hemokina, ali su takođe pokazale kontakte između Fab i β1-β2 petlje i β2 i β3 lanaca ELR+ CXC hemokina. Kristalne strukture su takođe pokazale da antitelo specifično prepoznaje savijanje ELR+ CXC hemokina, jer su se kristalne strukture poklapale. Brojne vodonične veze i Van der Waals interakcije su takođe uočene. Najvažnije, konzervativni R6 bočni lanac ELR motiva nalazio se u dobokom džepu za vezivanje formiranom od strane Fab teškog lanca na ostacima W33, Y102, i Y110, i Fab lakog lanca na ostatku W94. Humani isečeni CXCL8 hemokin divljeg tipa takođe ima vodonične veze sa oba Fab teška lanca na ostatku E99 i Fab lakom lancu na N91 karbonil kičmi. Druge vodonične veze su uočene između L5 karbonil kičme humanog isečenog CXCL8 hemokin divljeg tipa i W94 amidne kičme Fab lakog lanca; I10 karbonil kičmi humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa i S52 bočnog lanca Fab teškog lanca; K11 bočnog lanca humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa i T30 i S31 bočnih lanaca Fab teškog lanca; H33 bočnog lanca humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa i W94 karbonil kičme Fab lakog lanca; A35 amidne kičme i N59 bočnog lanca Fab teškog lanca; i C50 amidne kičme humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa i Y104 karbonil kičme Fab teškog lanca. Dodatno, N-terminalni ostaci 5 do 13 humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa stvarali su brojne kontakte sa Fab jer se N-terminus nalazio u brazdi između CDR2 i CDR3 Fab teškog lanca. Dodatno, CDR3 petlja Fab teškog lanca pružala se van ove brazde i interagovala sa ne-N-terminalnim ostatkom 140 na β2 lancu, i ostaci Glu48, Leu49, i Cys50 na β3 lancu humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa. Konačno, ostaci 33-36 β1-β2 petlje kod humanog isečenog CXCL8 hemokina divljeg tipa pakuju se nasuprot CDR2 Fab teškog lanca.

Mutaciona analiza

[0063] Nekoliko ključnih kontakata između Fab Antitela 1 i humanog CXCL8 divljeg tipa uočeni su u kristalnoj strukturi i dodatno su testirani preko studija kinetike vezivanja i U937-huCXCR2 fluorescent imaging plate reader (FLIPR) neutralizacije humanih CXCL8 tačkastih mutanata. Da bi se proučili ovi ključni kontakti, nekoliko tačkastih mutanata (R6A, I10A, A35P, I40A, i L49A) napravljeni su na osnovu sekvence humanog CXCL8 (SEQ ID NO: 27). Divljeg tipa, R6A, I10A, A35P, I40A, i L49A humani CXCL8 tačkasti mutanti su eksprimirani, ponovo savijeni, i prečišćeni prema standardnim tehnikama. Formiranje disulfidnih veza je potvrđeno digestijom tripsinom i analizom masenog otiska, i aktivnost je potvrđena analizom hemotaksije neutrofila.

[0064] Kinetike vezivanja su testirane na Biacore 2000 instrumentu sa 2000 Evaluation Software Version 4.1 kao što je opisano prethodno. Divlji tip i mutantni humani CXCL8 su testirani u odnosu na biološku aktivnost i u odnosu na neutralizaciju sa Antitelom 1 korišćenjem U937-huCXCR2 analize. U937-huCXCR2 je linija monocita transdukovana sa retrovirusom za ekspresiju humanog CXCR2.

[0065] CXCL8 mutanti su serijski razblaženi u test puferu koji sadrži 0.2% BSA u bunarčićima sa v-dnom polipropilenskih ploča sa 96-bunarčića. Koncentracije liganada su 3 puta finalna test koncentracija (finalne koncentracije testa su u opsegu od 300 do 0.0051 nM). Ploča sa ćelijama i ploča sa ligandom su ubačene u Fluorescent Imaging Plate Reader (FLIPR-3, Molecular Devices) programiran da prenese 50 µL liganda u bunarčiće ploče sa ćelijama. Fluorescencija je zabeležena u intervalima od 1 sekunde tokom 90 sekundi. Promena u fluorescenciji [delta relativne fluorescentne jedinice (DRFU), Maks RFU-Min RFU] je izračunata iz slika 10 do 90. DRFU nasuprot log (koncentracija liganda) je plotovana i EC50vrednosti su određene preko nelinearne regresije korišćenjem Graph Pad Prism. Testovi su izvedeni u triplikatu na tri test ploče.

[0066] Antitelo 1 je serijski razblaženo u test puferu koji sadrži 0.2% BSA. Koncentracije Antitela su 3 puta finalna test koncentracija (finalne koncentracije su u opsegu od 10 do 0.0195 µg/ml). Stok rastvori humanih CXCL8 divljeg tipa i CXCL8 mutanata su pripremljeni u test puferu 0.2% BSA na 240 nM (30x finalna test koncentracija od 8nM).20 µL liganda je pomešano sa 180 µL Antitela 1 u bunarčićima sa v-dnom polipropilenskih ploča sa 96-bunarčića. Ligand i antitelo su inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Ploča sa ćelijama i ploča sa ligandom-antitelom su ubačene u Fluorescent Imaging Plate Reader (FLIPR-3, Molecular Devices) programiran da prenese 50 µL liganda-antitela u bunarčiće ploče sa ćelijama. Fluorescencija je zabeležena u intervalima od 1 sekunde tokom 90 sekundi. Promena u fluorescenciji (DRFU) je izračunata iz slika 10 do 90. DRFU nasuprot log (koncentracija antitela) je plotovana i IC50vrednosti su određene preko nelinearne regresije korišćenjem Graph Pad Prism. Testovi su izvedeni u triplikatu na tri test ploče.

[0067] Kinetike vezivanja, biološka aktivnost, i rezultati neutralizacije su rezimirani u Tabeli 4. Merenja su dobijena na 25°C. Konstanta asocijacije (kon) i disocijacije (koff) za svaki ligand su procenjene korišćenjem "1:1 (transfer mase) vezivanje" modela vezivanja. Afinitet (KD) je izračunat iz kinetike vezivanja prema odnosu: KD= koff/kon.

[0068] Nekoliko mutacija je ukinulo aktivnost na receptoru (EC50) i, stoga, nije moglo biti testirano u odnosu na neutralizaciju. Zabeleženo je da je A35P mutacija potpuno ukinula neutrališuću aktivnost uprkos tome što je imala potpunu aktivnost u odnosu na receptor. Ovi rezultati naglašavaju ključne kontakte (R6, I10, A35, 140, i L49) unutar vezujućeg interfejsa CXCL8 antigena koji su važni za vezivanje antitela.

Tabela 4. Kinetike vezivanja, U937 FLIPR akivnost (EC50), i U937 FLIPR neutralizacija (IC 50 ) humanog CXCR8 divljeg tipa i mutanata.

[0069] Sveukupno, analiza mapiranja epitopa za Antitelo 1 demonstrirala je da vezujući interfejs antigena uključuje N-terminus ELR+ CXC hemokina (aminokiseline 5-13), β1-β2 petlja (aminokiseline 33-36), i β2 i β3 lanci (aminokiseline 40, 48-50). Ključni kontakti unutar interfejsa koji su važni za vezivanje antitela uključuju aminokiseline R6, I10, A35, I40, i L49 u CXCL8 (SEQ ID NO: 27).

Analize neutralizacije

In Vitro neutralizacija humanih ELR+ CXC hemokina korišćenjem humanih CXCR2-transfektovanih HMEC ćelija

[0070] Kako svi ELR+ CXC hemokini mogu vezati CXCR2 receptor, ćelije koje eksprimiraju CXCR2 su izabrane za in vitro studije. HMEC-huCXCR2 je imortalizovana humana endotelna ćelijska linija transdukovana sa retrovirusom za ekspesiju humanog CXCR2 receptora. HMEC ćelije koje eksprimiraju humani CXCR2 su sposobne da indukuju intracelularni Ca<2+>influks kao odgovor na ELR+ CXC hemokine ljudi, makaki majmuna, pacova i miša. Intracelularni Ca<2+>influks se može detektovati sa Fluorescent Imagine Plate Reader (FLIPR). Neutralizacija hemokina bi stoga trebalo da takođe neutralizuje intracelularni Ca<2+>influks indukovan ovim hemokinima.

[0071] HMEC-huCXCR2 je održavana u MCDB 31 medijumu sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 2x GlutaMax, 1x neesencijalnih aminokiselina, 1 µg/mL hidrokortizona, 10 ng/mL humanog epidermalnog faktora rasta, i 0.4 µg/mL puromicina na 37°C u 5% CO2. Kulture su održavane na sub-konfluentnim gustinama (50-80% konfluentne). Ćelije su sakupljene sa TrypLE Express, gustina ćelija je podešena na 3x10<5>ćelija/mL u kompletnom medijumu kulture, i 100 µL ćelijske suspenzije je zasejano u banrčiće crnih test ploča sa providnim dnom. Ploće sa ćelijama su inkubirane na sobnoj temperaturi 30 minuta da bi se omogućilo da se ćelije smeste na dnu bunarčića pre nego što su ploče inkubirane preko noći na 37°C u 5% CO2. Za svaku test ploču, sadržaj jedne vijalice Fluo-4NW reagensa je suspendovan u 10 mL test pufera i 100 µL probenecida da bi se napravio 1x Fluo-4NW reagens. Nakon inkubacije, medijum kulture je aspiriran i 100 µL 1x Fluo-4NW rastvora je dodato svakom bunarčiću test ploče. Ploče su inkubirane 30 minuta na 37°C, nakon čega još dodatnih 30 minuta na sobnoj temepraturi i zaštićene od svetlosti. Antitelo 1 je serijski razblaženo u test puferu koji sadrži 0.2% BSA. Koncentracije Antitela su 3x finalna koncentracija testa (finalne koncentracije u opsegu od 10-0.0195 µg/mL). Stok rastvori liganada pripremljeni su u test puferu 0.2% BSA na 300 nM (30x finalna koncentracija testa od 10 nM). 20 µL liganda je pomešano sa 180 µL antitela u bunarčićima sa v-dnom polipropilenskih ploča ploče sa 96 bunarčića. Ligand i antitelo su inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Ploča sa ćelijama i ploča sa ligand-antitelom stavljene su u Fluorescent Imagine Plate Reader (FLIPR-3, Molecular Devices) programiran da prenese 50 µL ligand-antitela u bunarčiće ploče sa ćelijama. Fluorescencija je zabeležena svaki sekund 90 sekundi. Promena u fluorescenciji (DRFU) je izračunata iz slika 10 do 90. DRFU nasuprot log (koncentracija antitela) je plotovana i IC50vrednosti su određene nelinearnom regresijom korišćenjem Graph Pad Prism. Testovi su izvedeni u triplikatu na tri test ploče. Podaci su izraženi kao srednja vrednost replikata.

[0072] Rezultati su rezimirani u Tabeli 5. Ovi rezultati pokazuju da je Antitelo 1 bilo sposobno da neutralizuje svih sedam humanih ELR+ CXC hemokina. IC50vrednosti su izražene kao µg/mL antitela (standardne devijacije su u zagradama). Korišćeni su i oblik od 72 aminokiseline i 77 oblik od aminoaminokiselina CXCL8. Podaci su prosečno od 2-5 replikata.

Tabela 5: In vitro FLIPR studija korišćenjem HMEC ćelija koje eksprimiraju humani CXCR2

In Vitro neutralizacija hemotaksije indukovane humanim CXCL8 ili CXCL1 korišćenjem primarnih humanih neutrofila

[0073] Analiza hemotaksije korišćenjem humanih neutrofila je izabrana da bi se odredila neutralizaciona aktivnost Antitela 1 u ćelijama koje prirodno eksprimiraju i CXCR1 i CXCR2. Periferna krv od zdravih dobrovoljaca uzeta je u dve epruvete sa 10 mL natrijum heparina. Da bi se izolovali neutrofili, 5 mL krvi je postavljeno preko 5 mL Polymorphprep u epruvetama od 15 mL. Epruvete su centrifugirane 30 minuta na 470xg, 18°C. Plazma i gornja traka ćelija (mononuklearne ćelije) su uklonjene i odbačene. Druga traka (neutrofili) je pulovana iz 4 epruvete i dodata je jednaka zapremina PBS. Epruveta je centrifugirana 10 minutes na 400xg, 18°C. Pelet je ispran sa 12 mL PBS, centrifugiran kao prethodno, i pelet je resuspendovan sa 11 mL HBSS/BSA (7.5 mg/mL BSA, HBSS). 60x10<6>ćelija je supsendovano u 12 mL HBSS/BSA i 5 µM CMFDA i inkubirano 30 min na 37°C. Nakon inkubacije, epruveta je centrfiugirana do peleta ćelija, isprana jednom sa 12 mL HBSS/BSA, i zatim su ćelije resupsendovane u 12 mL HBSS/BSA (5x10<6>ćelija/mL).

[0074] Antitelo 1 i izotip kontrola (humano IgG4 antitelo) su razblaženi do 1495 nM korišćenjem HBSS/BSA (Razblaženje 1) i zatim serijski razblaženi 1:5 sa HBSS/BSA. CXCL8 je razblažen do 20 nM sa HBSS/BSA. CXCL1 je razblažen do 10.1 nM sa HBSS/BSA.

[0075] 70 μL Antitela 1 ili HBSS/BSA je pomešano sa 70 µL ili CXCL8 ili CXCL1 rastvorom i inkubirano na sobnoj temperaturi ∼30 minuta. 30 µL smeše je ubačeno u bunarčiće donje komore ChemoTx ploče u triplikatu. Bunarčići koji sadrže samo HBSS/BSA (bez hemokina ili antitela) pokazivaće referentni signal. ChemoTx filter je postavljen preko donje komore i 50 μL (250,000 ćelija) je ubačeno iznad svakog bunarčića. ChemoTx ploča je inkubirana 3 časa na 37°C, 5% CO2. Nakon inkubacije, ćelije su isprane sa gornje površine sa PBS i uklonjenjim ChemoTx filterom. Fluorescencija je očitana (Wallac Victor3 1420 counter) 485/535 korišćenjem samo donjeg detektora. Srednja vrednost fluorescencije referentnih bunarčića (samo HBSS/BSA) oduzeta je od fluorescencije test bunarčića, i srednja vrednost i standardne devijacije su izračunate u Excel-u.

[0076] Na koncentraciji CXCL8 od 5 nM, IC50za Antitelo 1 (MW 150,000 kDa) bila je 26.4 (60.236) nM. Na koncentraciji CXCL8 od 10 nM, IC50za Antitelo 1 bila je 43.7 (60.086) nM. Na koncentraciji CXCL1 od 5 nM, IC50za Antitelo 1 bila je 18.5 (60.158) nM. Na koncentraciji CXCL1 od 20 nM, IC50za Antitelo 1 bila je 40.3 (60.112) nM. Na svim testiranim koncentracijama CXCL1 i CXCL8, kontrolno izotipsko antitelo nije uticalo na hemotaksiju. Podaci pokazuju da Antitelo 1 može blokirati aktivnost hemotaksije humanih CXCL8 ili CXCL1 na dozno zavisni način dok je aktivnost hemotaksije bila nenarušena sa kontrolnim izotipskim antitelom.

Model in vivo akutnog DSS kolitisa kod miševa

[0077] Dekstran sulfat natrijum (DSS) je najčešće korišćeni model ulcerativnog kolitisa (UC). U ovom modelu, DSS je hemijski iritans koji je dodat u vodu za piće za indukciju akutne bolesti koja podseća na UC. Akutna faza DSS kolitisa se karakteriše regrutovanjem neutrofila u mukozi i submukozi, i povećanom ekspresijom ELR+ CXC hemokina. Međutim, hronično izlaganje DSS izaziva teškuo oštećenje creva i zančajan gubitak težine, koji nije pogodan za model kolitisa. Da bi se prilagodilo akutnoj prirodi ovog modela, Antitelo 1 je korišćeno na profilaktički način da bi se testirala njegova sposobnost da inhibira regrutovanje neutrofila i razvoj kolitisa. Od značaja za ovaj model, mišji CXCL5 (LIX) protein je značajno povećan u tkivu debelog creva (Kwon 2005); međutim, Antitelo 1 ne neutralizuje ovaj mišji hemokin.

[0078] Dobijeni su C57BL/6 miševi, 8-10 nedelja starosti, težine 18-22 g. Krv je sakupljena kardijačnom punkturom i analizirana da bi se dobila referentna vrednost. Da bi se indukovao kolitis, miševi primaju 2.5% DSS (MW=36,000-50,000) u vodi za piće 5 dana (Dani 1-5) nakon čega 6 dana mena DSS u vodi (odražavanje akutne inflamacije). Kontrolni zdravi miševi primaju samo vodu ("nema DSS" grupe). Miševi koji primaju DSS dozirani su sa subkutanom injekcijom na Dan 0, 2, 4, i 8 sa humanim IgG4 kontrolnim antitelom (25 mg/kg) ili Antitelom 1 (25 mg/kg). Telesna težina je beležena dnevno. Broj miševa korišćenih za svaki tretman je 9 (izuzev što je 5 zdravih miševa korišćeno u zdravoj "bez DSS" grupi.) Studija je izvedena u kvadruplikatu.

[0079] Kao što je prikazano u Tabeli 6, DSS miševi koji su primili humano IgG4 kontrolno antitelo dramatično su izgubili težinu između Dana 5 i Dana 8. DSS miševi koji su primili Antitelo 1 pre indukcije kolitisa i tokom akutne faze bolesti pokazivali su manji gubitak telesne težine između Dana 5 i Dana 8 od onih DSS miševa tretiranih sa humanim IgG4 kontrolnim antitelom (94.0% inicijalne telesne težine za Antitelo 1 nasuprot 85.3% inicijalne telesne težine za IgG4 kontrolu na Dan 8). Ovi rezultati pokazuju da je sistemska primena Antitela 1 efikasno ublažila gubitak težine u DSS-indukovanom kolitisu, što podržacva zaključak da Antitelo 1 neutralizuje aktivnost određenih mišjih ELR+ CXC hemokina i smanjuje regrutovanje neutrofila u debelom crevu.

Tabela 6

In Vivo neutralizacija u modelu 786-O bistrih ćelija ćelijskog ksenografta

[0080] Ćelije 786-O karcinoma ćelija bubrega (RCC) su pomešane 1:1 sa matrigelom i implantirane potkožno u zadnji deo desnog boka atimičnih golih ženki miševa sa 3.0 x 10<6>ćelija po injekciji. Miševima sa 786-O ksenograftom sa zapreminom tumora koja je dostigla 100 mm<3>urađena je oralna gavaža sa 10 mg/kg sunitiniba dva puta dnevno pod neprekidnim doznim režimom dok kod miševa nije počelo napredovanje rasta tumora čak i pod tretmanom sa sunitinibom kao i kod kontrolnih miševa (IgG4 i 10% nosač). Miševi koji su imali rast tumora na terapiji sunitinibom po principu slučajnosti su podeljeni u 2 grupe. Jedna grupa prima sunitinib sa 10 mg/kg dva puta dnevno plus kontrolno IgG4 antitelo sa 20 mg/kg jednom nedeljno. Druga grupa prima suninitib sa 10 mg/kg dva puta na dan plus Antitelo 1 sa 20 mg/kg jednom nedeljno. Prosečne zapremine tumora (standardna greška u zagradama) su prikazani u Tabeli 7. Dodavanje Antitela 1 sunitinib tretmanu značajno je smanjilo rast tumora tokom vremena (p<0.0001), ukazujući da je Antitelo 1 resenzitizovalo bistre ćelije RCC tumora na tretman sunitinibom.

Tabela 7

In Vivo neutralizacija u modelu ksenografta SKOV3-Luc kancera jajnika

[0081] SKOV3-Luc je humana ćelijska linija kancera jajnika koja eksprimira gen luciferaze svica. SKOV3-Luc ćelije su često korišćene in vivo da bi se ustanovio rast tumora humanog adenokarcinoma jajnika.

[0082] SKOV3-Luc ćelije kancera jajnika su pomešane 1:1 sa matrigelom i implantirane potkožno u zadnji deo desnog boka atimičnih golih ženki miševa sa 3.0 x 10<6>ćelija po injekciji. Miševi su randomizovani u 4 grupe na referentnoj vrednosti prema zapremini tumora nakon što su ksenografti porasli do prosečne zapremine tumora od 200 mm<3>. Miševi su primili ili kontrolno IgG4 antitelo (2.5 mg/kg jednom nedeljno), cisplatin (2.5 mg/kg jednom nedeljno), Antitelo 1 (20 mg/kg jednom nedeljno), ili kombinaciju cisplatina (2.5 mg.kg jednom nedeljno) i Antitela 1 (20 mg/kg jednom nedeljno) intraperitonealnom injekcijom. Rast tumora je prikazan na Tabeli 8. Cisplatin monoterapija nije pokazala statistički značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa izotipskom kontrolom. Međutim, kombinacija cisplatina i Antitela 1 pokazala je statistički značajnu inhibicijhu rasta tumora (p≤0.001) u poređenju sa izotipskom kontrolom i cisplatin monoterapijom, ukazujući da Antitelo 1 sinergistički poboljšava hemoterapiju kod modela ksenografta SKOV3-Luc kancera jajnika.

Tabela 8

Sekvence

[0083] Antitelo 1 Aminokiselinska sekvenca teškog lanca: SEQ ID NO: 1

Antitelo 1 Varijabilni region teškog lanca: SEQ ID NO: 2

Antitelo 1 Aminokiselinska sekvenca lakog lanca: SEQ ID NO: 3

Antitelo 1 Varijabilni region lakog lanca: SEQ ID NO: 4

Antitelo 1 DNK sekvenca teškog lanca: SEQ ID NO: 5

Antitelo 1 DNK sekvenca lakog lanca: SEQ ID NO: 6

Antitelo 1/Antitelo 2 LCDR1: SEQ ID NO: 7

Antitelo 1/Antitelo 2 LCDR2: SEQ ID NO: 8

Antitelo 1/Antitelo 2 LCDR3: SEQ ID NO: 9

Antitelo 1/Antitelo 2 HCDR1: SEQ ID NO: 10

G

Antitelo 1/Antitelo 2 HCDR2: SEQ ID NO: 11

Antitelo 1 HCDR3: SEQ ID NO: 12

E

Antitelo 2 Aminokiselinska sekvenca teškog lanca: SEQ ID NO: 13

Antitelo 2 Varijabilni region teškog lanca: SEQ ID NO: 14

Antitelo 2 Aminokiselinska sekvenca lakog lanca: SEQ ID NO: 15

Antitelo 2 Varijabilni region lakog lanca: SEQ ID NO: 16

Antitelo 2 DNK sekvenca teškog lanca: SEQ ID NO: 17

Antitelo 2 DNK sekvenca lakog lanca: SEQ ID NO: 18

Antitelo 2 HCDR3: SEQ ID NO: 19

HCDR3 konsenzus sekvenca: SEQ ID NO: 20

gde Xaa je E ili Q

Humani Gro-alfa (CXCL1): SEQ ID NO: 21

Humani Gro-beta (CXCL2): SEQ ID NO: 22

Humani Gro-gama (CXCL3): SEQ ID NO: 23

Humani ENA-78 (CXCL5): SEQ ID NO: 24

Humani GCP-2 (CXCL6): SEQ ID NO: 25

Humani NAP-2 (CXCL7): SEQ ID NO: 26

Humani IL-8 (CXCL8): SEQ ID NO: 27

LISTING SEKVENCI

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje vezuje humani Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gama, ENA-78, GCP-2, NAP-2, i IL-8, gde antitelo sadrži laki lanac i teški lanac, naznačeno time da laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), naznačeno time da LCVR sadrži LCDR1, LCDR2, LCDR3 i HCVR sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, naznačeno time da LCDR1 je RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7), LCDR2 je YTSRSVS (SEQ ID NO: 8), LCDR3 je GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9), HCDR1 je GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10), HCDR2 je NISPNSGSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11), i HCDR3 je EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (SEQ ID NO: 20) gde Xaa je E ili Q.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 2.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 4.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 2 i aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 4.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 1 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 3.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo poseduje dva teška lanca koja imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i dva laka lanca koja imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

7. DNK molekul koji sadrži prvu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; i sadrži drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

8. Ćelija sisara koja sadrži DNK molekul prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da je ćelija sposobna da eksprimira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 6.

9. Proces za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde proces sadrži kultivisanje ćelije sisara prema patentnom zahtevu 8 pod uslovima takvim da je antitelo eksprimirano, i rekuperovanje eksprimiranog antitela.

10. Antitelo proizvedeno procesom prema patentnom zahtevu 9.

11. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 i 10 za upotrebu u terapiji.

12. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 i 10 za upotrebu u tretmanu ulcerativnog kolitisa, kancera bubrega, ili kancera jajnika.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5