ES2993153T3

ES2993153T3 - Pan elr+ cxc chemokine antibodies

Info

Publication number: ES2993153T3
Application number: ES19190355T
Authority: ES
Inventors: Catherine Brautigam Beidler; Kristine Kay Kikly; Derrick Ryan Witcher; Beth Ann Strifler; Jeffrey Streetman Boyles
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2024-12-23
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: JP6105146B2; EP2970447A1; CN109134652A; EP3608336B1; IL241167A0; EP3608336A1; EP3348569A1; CL2015002531A1; IL269387A; NZ711704A; IL241167B; MX364831B; JP2016512026A; PH12015502090B1; LT2970447T; CN105143259B; HRP20181047T1; TR201807613T4; KR101745230B1; PT2970447T

Abstract

Se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a siete quimiocinas ELR + CXC humanas. Los anticuerpos de la invención son útiles para tratar diversas enfermedades inflamatorias/autoinmunes, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la psoriasis en placas y la pustulosis palmoplantar; y el cáncer, como el cáncer renal o el cáncer de ovario. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de quimiocinas CXC pan ELR+

La presente invención se relaciona con los anticuerpos contra las quimiocinas CXC ELR+ y su uso para tratar enfermedades donde la patogénesis es mediada por las quimiocinas<c>X<c>ELR+.

Las quimiocinas CXC ELR+ (llamadas así porque los miembros de la familia de quimiocinas todos poseen un motivo de aminoácidos E-L-R inmediatamente adyacente a su motivo CXC) desempeñan un papel importante en una variedad de mecanismos patógenos, incluyendo la migración de neutrófilos a sitios de inflamación y angiogénesis. Los neutrófilos contribuyen a la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias/autoinmunes agudas y crónicas, tal como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la psoriasis en placas y la pustulosis palmoplantar. Las quimiocinas CXC ELR+también desempeñan un papel fundamental en la tumorigénesis y la metástasis tumoral. Estas quimiocinas se expresan en gran medida en los tumores. Dentro del entorno tumoral, las quimiocinas CXC ELR+ se involucran en diversas vías, por ejemplo, la angiogénesis, la movilización e invasión de células endoteliales y leucocitos en los sitios tumorales, y la proliferación y supervivencia de las células tumorales.

Las quimiocinas se agrupan en cuatro subfamilias: CXC, CC, (X)C y CX3C. En las quimiocinas CXC, un aminoácido separa las primeras dos cisteínas (“el motivo CXC”). Las quimiocinas CXC ELR+ son ligandos para los receptores de quimiocinas CXCR1 y/o CXCR2, que son siete receptores tipo dominio transmembrana acoplados a la proteína G que se unen específicamente a las quimiocinas CXC ELR+. Las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas son Gro-alfa humana (también conocida como CXCL1), Gro-beta humana (también conocida como CXCL2), Gro-gamma humana (también conocida como CXCL3), ENA-78 humana (también conocida como CXCL5), GCP-2 humana (también conocida como CXCL6), NAP-2 humana (también conocida como CXCL7) e IL-8 humana (también conocida como CXCL8). Todas las quimiocinas CXC ELR+ se unen al receptor CXCR2; además, algunas quimiocinas CXC ELR+ se unen a los receptores tanto CXCR1 como CXCR2(es decir,CXCL6 y CXCL8), todos los cuales contribuyen a la redundancia en las vías de activación.

Los anticuerpos que se unen a las quimiocinas CXC ELR+ individuales se han descrito anteriormente. Chuntharapai, A., et al. (1994) Journal of Immunology 152.4 (1994): 1783-1789 se relaciona con anticuerpos monoclonales neutralizantes con el receptor A de IL-8 humana. Dos anticuerpos monoclonales se han evaluado contra CXCL8 (IL-8) en ensayos clínicos tempranos con eficacia en enfermedades inflamatorias. (J Leuk Biol 66:401-410; J Immunol 181:669-679.) Además, WO 2008/130969 describe un anticuerpo que se une a la IL-8 humana (CXCL8), Gro-alfa humana (CXCL1), Gro-beta humana (CXCL2), Gro-gamma humana (CXCL3) y ENA-78 humana (CXCL5). Sin embargo, la descripción no demuestra que el anticuerpo se une firmemente a<g>CP-2 (CXCL6) y no dice nada con respecto a la unión a NAP-2 (CXCL7).

Sin embargo, aún no se ha descrito un anticuerpo que pueda unirse y neutralizar todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas. Dirigirse a una o unas pocas quimiocinas CXC ELR+ humanas deja abierta la oportunidad para que otras quimiocinas CXC ELR+ provoquen múltiples funciones biológicas. Neutralizar todas las siete quimiocinas CXC ELR+ podría afectar la capacidad de las células CXCR1+ o CXCR2+ para migrar a los sitios de inflamación y podría inhibir la angiogénesis. Dada la redundancia significativa en las vías de activación de los receptores CXCR1 y CXCR2, todavía existe la necesidad de que un anticuerpo se una a todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas con especificidad y alta afinidad. Existe la necesidad de que un anticuerpo neutralice todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas. También existe la necesidad de que un anticuerpo sea físicamente estable. Por lo tanto, es deseable proporcionar un anticuerpo septa-específico que pueda unirse y neutralizar todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas, y que sea físicamente estable.

La presente invención proporciona un anticuerpo que neutraliza la Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanas. La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2, e IL-8 humanas, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la LCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (“Lc DR”) LCDR1, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (“HCDR”) HCDR1, HCDR2, HCDR3, en donde LCDR1 es RASQSISNNLH (id. de sec. n. 7), LCDR2 es YTSRSVS (id. de sec. n. 8), LCDR3 es GQNNEWPEV (id. de sec. n. 9), HCDR1 es GYEFTSYWIH (id. de sec. n. 10), HCDR2 es NISPNSGNSANYNEKFKS (id. de sec. n. 11), y HCDR3 es EGPYSYYPSREYYGSDL (id. de sec. n. 12). La presente descripción también proporciona un anticuerpo que neutraliza la Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanas, en donde el anticuerpo se une a la IL-8 (id. de sec. n. 27) en los siguientes aminoácidos: Arg 6, Ile 10, Ala 35, Ile 40. La presente descripción proporciona además un anticuerpo que neutraliza la Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2 e IL-8 humanas, en donde el anticuerpo se une a la IL-8 (id. de sec. n. 27) en los siguientes aminoácidos: Arg 6, Ile 10, Ala 35, Ile 40 y Leu 49.

La presente descripción proporciona un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la LCVR comprende LCDR<1>, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, en donde LCDR1 es RASQSISNNLH (id. de sec. n.7),LCDR2 es YTSRSVS (id. de sec. n.

8), LCDR3 es GQNNEWPEV (id. de sec. n. 9), HCDR1 es GYEFTSYWIH (id. de sec. n. 10), HCDR2 es NISPNSGSANYNEKFKS (id. de sec. n. 11) HCDR3 es EGPYSYYPSRXaaYYGSDL (id. de sec. n. 20) en donde Xaa es E o Q.

La presente invención proporciona en otro aspecto un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la HCVR es la id. de sec. n. 2. La presente descripción proporciona en otro aspecto un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la HCVR es la id. de sec. n. 14. La presente invención proporciona adem ás un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la LCVR es la id. de sec. n. 4. La presente descripción proporciona en otro aspecto un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la LCVR es la id. de sec. n. 16.

La presente invención proporciona un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de cadena pesada es la id. de sec. n. 1 o la presente descripción proporciona un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de cadena pesada es la id. de sec. n. 13. La presente invención también proporciona un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de cadena ligera es la id. de sec. n. 3. La presente descripción también proporciona un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de cadena ligera es la id. de sec. n. 15.

La presente descripción también proporciona una molécula de ADN que comprende una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 1 o 13; y que comprende una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 3 o 15.

La presente descripción proporciona una célula de mamífero que comprende las moléculas de ADN descritas anteriormente, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 1 o 13 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 3 o 15. Las células huésped de mamíferos que se sabe que son capaces de expresar inmunoglobulinas funcionales incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células COS y células NSO. Las células huésped preferidas para usar en la invención son células NS0.

La presente descripción proporciona además un proceso para producir un anticuerpo que comprende una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos es la id. de sec. n. 3 o 15 y una cadena pesada cuya secuencia de aminoácidos es la id. de sec. n. 1 o 13, que comprende cultivar una célula de mamífero descrita anteriormente bajo condiciones de tal manera que el anticuerpo se exprese y recuperar el anticuerpo expresado.

La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis ulcerosa, el cáncer renal o el cáncer de ovario, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la presente invención.

La presente invención proporciona además un anticuerpo de la presente invención para usar en el tratamiento del cáncer. La presente descripción proporciona además un anticuerpo de la presente invención para usar en terapia. Además, la presente descripción proporciona un anticuerpo de la presente invención para usar en el tratamiento de la colitis ulcerosa. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para usar en el tratamiento del cáncer renal o del cáncer de ovario. Adicionalmente, la presente descripción proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la colitis ulcerosa, el cáncer renal o el cáncer de ovario.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en la presente descripción, el término “quimiocinas CXC ELR+ humanas” pretende referirse a las siete quimiocinas CXC conocidas que tienen un motivo E-L-R y que se unen al receptor CXCR1 y/o CXCR2. Las quimiocinas CXC ELR+ humanas son Gro-alfa humana (también conocida como CXCL1) (id. de sec. n. 21), Gro-beta humana (también conocida como CXCL2) (id. de sec. n. 22), Gro-gamma humana (también conocida como CXCL3) (id. de sec. n. 23), ENA-78 humana (también conocida como CXCL5) (id. de sec. n. 24), GCP-2 humana (también conocida como CXCL6) (id. de sec. n. 25), NAP-2 humana (también conocida como CXCL7) (id. de sec. n. 26) e IL-8 humana (también conocida como CXCL8) (id. de sec. n. 27). Colectivamente, todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas se denominan “quimiocinas CXC pan-ELR+ humanas” en la presente descripción.

El término “anticuerpo”, como se usa en la presente descripción, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina monoclonales que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región constante de cadena ligera, CL. Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada HCVR y LCVR comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones CDR en la HCVR se denominan HCDR1, HCDR2 y HCDR3. Las regiones CDR en la LCVR se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. Actualmente existen tres sistemas de asignaciones de CDR para anticuerpos que se usan para la delineación de secuencias. La definición de CDR de Kabat (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest” , National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) se basa en la variabilidad de la secuencia de anticuerpos. La definición de CDR de Chothia (Chothia et al., “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins” , Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., “Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins” , Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) se basa en estructuras tridimensionales de anticuerpos y topologías de los bucles de CDR. Las definiciones de CDR de Chothia son idénticas a las definiciones de CDR de Kabat con la excepción de HCDR1 y HCDR2. Para los fines de la presente invención, un híbrido de las definiciones de Kabat y Chothia se usan para definir las CDR. La asignación de aminoácidos en las regiones HCVR y LCVR está de acuerdo con la convención de numeración de Kabat. Se entiende además que el término “anticuerpo” abarca cualquier modificación postraslacional celular al anticuerpo incluyendo, aunque no de forma limitativa, la acilación y glicosilación.

Como se usa en la presente descripción, el término “anticuerpo neutralizante” pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a una quimiocina CXC ELR+ da como resultado la inhibición de una actividad biológica inducida por esa quimiocina. Esta inhibición de una actividad biológica inducida por la quimiocina ELR+ se puede evaluar mediante uno o más de varios ensayos in vitro estándar conocidos en la técnica (véase los ejemplos). Se entiende además que los términos “ inhibir” o “neutralizar”, como se usan en la presente descripción con respecto a la actividad de un anticuerpo de la invención significan la capacidad de antagonizar, reducir o interrumpir la progresión, intensidad o gravedad de una actividad biológica inducida por una o más quimiocinas CXC ELR+.

Como se usa en la presente descripción, el término “anticuerpo septa-específico” pretende abarcar un anticuerpo que se une a las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas con alta afinidad (p. ej., con una afinidad de unión (K<d>) en el rango de aproximadamente 5 x 1 °'11 M a aproximadamente 1 x 1 °'9 M).

Como se usa en la presente descripción, un “paciente” se refiere a un mamífero, preferentemente un ser humano con una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de un nivel reducido de quimiocinas CXC ELR+ humanas o de una bioactividad reducida inducida por las quimiocinas CXC ELR+ humanas.

Como se usa en la presente descripción, “tratamiento” o “tratar” pretende referirse a todos los procesos en donde puede haber una ralentización, control, o detención de la progresión de los trastornos descritos en la presente descripción, pero no necesariamente indica una eliminación total de todos los síntomas del trastorno. El tratamiento incluye la administración de un anticuerpo de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente, particularmente en un ser humano.

Los anticuerpos de la presente invención se unen a las quimiocinas CXC pan-ELR+ humanas con alta afinidad. Por ejemplo, los presentes anticuerpos se unen a todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas con una afinidad de unión (K<d>) en el rango de aproximadamente 5 x 1 °'11 M a aproximadamente 1 x 1 °'9 M, por ejemplo, de aproximadamente 1,0 x 10'1° M a aproximadamente 8,6 x 10'1° M, medida por resonancia de plasmón superficial, cuando se expresa como un anticuerpo IgG4 de longitud completa. Los anticuerpos de la presente invención se caracterizan además porque, si bien se unen las quimiocinas CXC pan-ELR+ humanas con especificidad, no se unen específicamente a otras quimiocinas CXC, por ejemplo, el factor 1 alfa derivado de células estromales (SDF-1a, también conocido como CXCL12).

En una realización, los anticuerpos de la invención pueden tener una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: HCDR1 (id. de sec. n. 1°), HCDR2 (id. de sec. n. 11) y HCDR3 (id. de sec. n. 12); y en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: LCDR1 (id. de sec. n. 7), LCDR2 (id. de sec. n. 8) y LCDR3 (id. de sec. n. 9).

En otra realización de la descripción, los anticuerpos de la descripción pueden tener una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: HCDR1 (id. de sec. n. 1°), HCDR2 (id. de sec. n. 11) y HCDR3 (id. de sec. n. 19); y en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones CDR con las siguientes secuencias de aminoácidos: LCDR1 (id. de sec. n. 7), LCDR2 (id. de sec. n. 8) y LCDR3 (id. de sec. n. 9).

En otra realización, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 2, y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 4. En otra realización de la descripción, los anticuerpos de la descripción pueden comprender una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 14, y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 16.

En aun otra realización, los anticuerpos de la invención pueden comprender una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 1 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 3. En otra realización, los anticuerpos de la descripción pueden comprender una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 13, y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n.

15.

Preferentemente, los anticuerpos comprenden dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Preferentemente, la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la id. de sec. n. 3 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos que se muestra en la id. de sec. n. 6. Preferentemente, la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la id. de sec. n. 1 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos que se muestra en la id. de sec. n. 5. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de cadena ligera como se muestra en la id. de sec. n. 15 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos que se muestra en la id. de sec. n. 18. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de cadena ligera como se muestra en la id. de sec. n. 13 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos que se muestra en la id. de sec. n. 17.

La realización más preferida de la invención es un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas idénticas que tienen la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 1, y dos cadenas ligeras idénticas que tienen la secuencia de aminoácidos de la id. de sec. n. 3.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un paciente. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción, “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardadores isotónicos y de absorción, y lo similar que son fisiológicamente compatibles. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares que mejoran el período de validez o la efectividad del anticuerpo.

Las composiciones de esta invención pueden adoptar diversas formas. La forma preferida depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas se presentan en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos. El modo preferido de administración es parenteral(p. ej.,intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal o intramuscular). El anticuerpo se puede administrar mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. Sin embargo, como lo apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención se coformula con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los que la actividad de quimiocinas CXC ELR+ es perjudicial. En ciertas realizaciones de la descripción, un anticuerpo de la descripción se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los que la actividad de quimiocinas CXC ELR+ es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede coformularse con uno o más agentes de quimioterapia(p. ej.,sunitinib o cisplatino). En una realización de la descripción, un anticuerpo de la descripción se puede coadministrar con uno o más agentes de quimioterapia(p. ej.,sunitinib o cisplatino).

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un anticuerpo de la invención. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un único bolo se puede administrar, varias dosis divididas se pueden administrar a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

Los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se va a aliviar. Se entiende además que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.

La unión específica y la neutralización por parte de un anticuerpo de la presente invención a las quimiocinas CXC ELR+ humanas permiten que dicho anticuerpo se use como un agente terapéutico para enfermedades y trastornos que se benefician de la inhibición de la bioactividad de las quimiocinas CXC ELR+ humanas. Dada su capacidad para unir y neutralizar las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas, los anticuerpos de la presente invención ofrecen ventajas sobre las monoterapias dirigidas a quimiocinas CXC ELR+ humanas únicas y las terapias combinadas dirigidas a múltiples quimiocinas CXC ELR+ humanas.

En una realización, la descripción proporciona un método para tratar la colitis ulcerosa o el cáncer, tal como el cáncer renal o cáncer de ovario. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo a usar para tratar el cáncer, tal como el cáncer renal o cáncer de ovario. En una realización de la descripción, la descripción proporciona un anticuerpo a usar para tratar la colitis ulcerosa.

Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Expresión y producción de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar y purificar de la siguiente manera. Un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN de la id. de sec. n. 5 (que codifica un polipéptido de cadena pesada de la id. de sec. n. 1) y la id. de sec. n. 6 (que codifica un polipéptido de cadena ligera de la id. de sec. n. 3) se usa para transfectar las células NSO. Un anticuerpo resultante de este vector de expresión es el “Anticuerpo 1” .

Adicionalmente, un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN de la id. de sec. n. 17 (que codifica un polipéptido de cadena pesada de la id. de sec. n. 13) y la id. de sec. n. 18 (que codifica un polipéptido de cadena ligera de la id. de sec. n. 15) se usa para transfectar las células NS0. Un anticuerpo resultante de este vector de expresión es el “Anticuerpo 2” .

Para el Anticuerpo 1 o Anticuerpo 2, los grupos transfectados se colocan en placas a baja densidad para permitir un crecimiento casi clonal de células con expresión estable. Los pocillos maestros se examinan para determinar la expresión de anticuerpos y, después, se amplían en cultivos de suspensión libres de suero que se usarán para la producción. El medio clarificado, en el que el anticuerpo se ha secretado, se aplica a una columna de proteína A o G que se ha equilibrado con un regulador compatible, tal como la solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se lava para eliminar los componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido se eluye mediante un gradiente de pH (tal como un regulador de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,8, a un regulador de citrato de sodio 0,1 M, pH 2,5). Las fracciones de anticuerpos se detectan mediante SDS-PAGE y después se agrupan. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo puede concentrarse y/o filtrarse de forma estéril usando técnicas comunes. El agregado soluble y los multímeros pueden eliminarse efectivamente mediante técnicas comunes, lo que incluye exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, o cromatografía con hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía puede ser superior al 99 %. El producto se puede congelar inmediatamente a -70 °C o se puede liofilizar.

Afinidad de unión a las quimiocinas CXC ELR+ humanas

El instrumento Biacore 2000 y el software de evaluación Biacore 2000, versión 4.1, se usan para el análisis de resonancia de plasmón superficial. Un chip CM5 se prepara usando el método de acoplamiento de aminas EDC/NHS del fabricante. Brevemente, las superficies de todas las cuatro celdas de flujo se activan inyectando una mezcla 1:1 de EDC/NHS durante 7 minutos a 10 pl/min. La proteína A se diluye a 100 pg/ml en 10 mM de acetato, regulador de pH 4,5, y se inmoviliza para lograr aproximadamente 10.000 r U sobre todas las 4 celdas de flujo mediante una inyección de 7 minutos a una velocidad de flujo de 10 pl/minuto. Los sitios sin reaccionar se bloquean con una inyección de etanolamina de 7 minutos a 10 pl/minuto. Dos inyecciones de glicina (pH 1,5) se usan durante 30 segundos a 10 pl/minuto para eliminar cualquier proteína no covalentemente asociada. El regulador de ejecución es HBS-EP+.

El Anticuerpo 1 o el Anticuerpo 2 se diluye a 2 pg/ml en el regulador de ejecución y se capturan aproximadamente 400-600 r U en la celda de flujo (Fc). Los ligandos se diluyen de 100 pg/ml a 50 nM en el regulador de ejecución y después se diluyen dos veces en serie en el regulador de ejecución hasta 3.125 nM. Las inyecciones duplicadas de cada concentración de ligando se inyectan a 100 pl/min durante 150 segundos seguidas de una fase de disociación. La fase de disociación es de 1800 segundos para todos los ligandos. La regeneración se realiza inyectando 10 mM de glicina (pH 1,5) durante 60 segundos a 50 pl/min sobre todas las celdas de flujo. Los datos sustraídos de referencia se recopilan como Fc2-Fc1, Fc3-Fc1 y Fc4-Fc1. Las mediciones se obtienen a 25 °C. El índice de activación(kon)y el índice de desactivación(koff)de cada ligando se evalúan usando un modelo de unión “unión (transferencia de masa) 1:1” . La afinidad (K<d>) se calcula de la cinética de unión según la relación: K<d>=kornkon.

Las quimiocinas CXC ELR+ humanas producen una respuesta de unión dependiente de la concentración con el Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2. Las tablas 1 y 2 resumen los valores dekon, koffy K<d>para el Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2. Estos resultados demuestran que el Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2 se unen a las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas con alta afinidad.

Tabla 1 Afinidades de uniónin vitro alas quimiocinas CXC ELR+ humanas para el Anticuerpo 1

Tabla 2 Afinidades de uniónin vitroa las quimiocinas CXC ELR+ humanas para el Anticuerpo 2

Evaluación de estabilidad física

La agregación y autoasociación de proteínas es una propiedad indeseable en los anticuerpos ya que podría exacerbar potencialmente los efectos no deseados, tal como desencadenar una respuesta inmune. Por lo tanto, es muy deseable mantener el anticuerpo en un estado monomérico. El porcentaje de agregado de elevado peso molecular (% HMW) es un indicador de la agregación y autoasociación de proteínas. Un % mayor de agregado de HMW indica un aumento de la agregación/autoasociación de proteínas y un aumento de la inestabilidad física. La estabilidad física del Anticuerpo 1 y el Anticuerpo 2 se determina de la siguiente manera.

El anticuerpo se dializa durante la noche a 4 °C en 10 mM de citrato, pH 6 /-150 mM de NaCl. A la mañana siguiente, las muestras se concentran a 50 mg/ml, se filtran a través de filtros de 0,2 micrómetros y, después, se añade Tween-80 a una concentración final de 0,02 %. Cada muestra se incuba a 25 °C durante los tiempos especificados. La formación de agregados solubles es seguida por una SEC analítica usando una columna de 5 micrómetros TSK3000SWXL con dimensiones de 30 cm x 0,78 cm. La fase móvil es 50 mM de fosfato de sodio, pH 7, 175 mM de NaCl, a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Las muestras se aplican como inyecciones de 1 pl y se monitorean a 280 nm para determinar el % de aumento del agregado de HMW (Tabla 3).

Las formulaciones de 50 mg/ml se incuban durante 1 y 4 semanas a 25 °C para evaluar la estabilidad a largo plazo bajo condiciones de tensión. El % de agregado delta de HMW se determina sustrayendo el % de agregado de HMW en el momento cero (designado como 'inicial' en la Tabla 3) del % de HMW en el punto temporal de 1 semana o 4 semanas. Después de 1 y 4 sem anas, tanto el Anticuerpo 1 como el Anticuerpo 2 demostraron un % delta de HMW por debajo de 1 %, mostrando por lo tanto una buena estabilidad física.

Tabla 3 % de agregado de elevado peso molecular

Mapeo de epítopos de anticuerpos para el Anticuerpo 1

Múltiples enfoques se llevan a cabo para caracterizar el epítopo del Anticuerpo 1, incluyendo el análisis Western blot, la cocristalización del anticuerpo con varias quimiocinas CXC ELR+ y el análisis mutacional para la unión y neutralización.

Análisis de western blot

Para determinar si el Anticuerpo 1 puede unirse a un epítopo lineal o conformacional, el análisis Western blot se realiza usando condiciones reductoras y no reductoras. La electroforesis de las proteínas se realiza usando 4-12 % de geles bis-tris NuPAGE® premoldeados. El regulador de ejecución NuPAGE® MES SDS se añade tanto a las cámaras internas (200 ml) como externas (al menos 600 ml) de las minicélulas. Las diluciones seriadas de CXCL8 humana (400 ng, 100 ng o 25 ng por carril) se realizan en el regulador de muestra NuPAGE® LDS 4X con o sin el agente reductor de muestras NuPAGE® 10X. Las muestras se calientan a 95 °C durante 2 minutos. Los volúmenes de carga son de 10 pl por carril para las muestras y de 5 pl por carril para el marcador estándar preteñido SeeBlue Plus2. Los geles se ejecutan a 200 V durante 35 minutos a temperatura ambiente.

Las proteínas se transfieren a PVDF usando el sistema de transferencia en seco iBlot® con la pila de transferencia iBlot®, nitrocelulosa, mini. La membrana se bloquea en una solución de bloqueo (3 % de leche descremada en solución salina tamponada de fosfato) durante 1 hora a temperatura ambiente. El Anticuerpo 1 se añade a la solución de bloqueo hasta una concentración final de 1 pg/ml y después se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación primaria, la solución de anticuerpo/bloqueo y la membrana se lava 3 veces durante 15 minutos en regulador de lavado (solución salina tamponada de fosfato 0,05 % de Tween 20). Después, la membrana se incuba con un anticuerpo secundario IgG específico de Fc antihumano de burro conjugado con HRP (0,1 pg/ml en solución de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la eliminación del anticuerpo secundario, la membrana se lava 4 veces durante 10 minutos con regulador de lavado. Después, la membrana se incuba con una solución de trabajo de la solución de peróxido estable y la solución de luminol/potenciadora (sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico) durante 5 minutos. La membrana se coloca en un protector de membrana de plástico en un casete de película de rayos X con película CL-X Posure™ durante 30 segundos. La película se desarrolla usando un sistema SRX-101 de Konica.

Bajo condiciones no reductoras, en una concentración de CXCL8 de 400 ng, aparecieron dos bandas de aproximadamente 17 kDa y aproximadamente 10 kDa. En una concentración de CXCL8 de 100 ng, apareció una banda de aproximadamente 10 kDa. En una concentración de CXCL8 de 25 ng, no aparecieron bandas. Bajo condiciones reductoras, no aparecieron bandas en ninguna de las concentraciones evaluadas.

Los resultados demostraron que el Anticuerpo 1 puede unirse a CXCL8 humana desnaturalizada y no reducida, pero no puede unirse a CXCL8 humana desnaturalizada y reducida. Por lo tanto, los dos enlaces de disulfuro en CXCL8 son necesarios para mantener el epítopo del anticuerpo. Estos resultados demuestran un epítopo conformacional para el Anticuerpo 1.

Análisis de la estructura cristalina

Las estructuras cristalinas de los complejos de Fab/antígeno para la CXCL8 humana y la CXCL2, CXCL3 y CXCL7 del mono cynomolgus se obtienen para determinar la superficie de unión completa del Anticuerpo 1. La CXCL8 1-66 humana truncada silvestre, los mutantes puntuales de CXCL8 humana y la CXCL7 del mono cynomolgus se expresan todos enE. colicon etiquetas His-SUMO N-terminales. Estas proteínas se vuelven a plegar; las etiquetas se escinden; y las proteínas se purifican mediante técnicas de purificación estándar. La CXCL2 y CXCL3 del mono cynomolgus se expresan en las células HEK293 EBNA y se purifican mediante técnicas de purificación estándar. La formación de enlaces de disulfuro se confirma mediante digestión tríptica y análisis de huellas dactilares masivas, y la actividad se confirma mediante un ensayo de quimiotaxis de neutrófilos. Un Fab del Anticuerpo 1 se expresa en las células HEK293 EBNA y se purifica mediante técnicas de purificación estándar. Los complejos Fab/antígeno se forman añadiendo un ligero exceso molar de antígeno al Fab, seguido de una purificación por cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar el exceso de antígeno libre. Los complejos se cristalizan y las estructuras cristalinas se disuelven mediante reemplazo molecular usando Buster 2.9.5 (Global Phasing Ltd.).

Estas estructuras cristalinas confirmaron que el epítopo del Anticuerpo 1 incluía el terminal N de las quimiocinas CXC ELR+, pero también mostraron contactos entre el Fab y el bucle 131-132 y las cadenas 132 y 133 de las quimiocinas CXC ELR+. Las estructuras cristalinas también demuestran que el anticuerpo reconoce específicamente el pliegue de las quimiocinas CXC ELR+, ya que las estructuras cristalinas eran superponibles. También se observaron numerosos enlaces de hidrógeno e interacciones de Van der Waals. Más notablemente, la cadena lateral R6 conservada del motivo ELR se encontraba en un bolsillo de unión profundo formado por la cadena pesada de Fab en los residuos W33, Y102 e Y110, y la cadena ligera de Fab en el residuo W94. La quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre también mediante enlaces de hidrógeno tanto con la cadena pesada de Fab en el residuo E99 como con la cadena ligera de Fab en el carbonilo de cadena principal N91. Otros enlaces de hidrógeno observados fueron entre el carbonilo de cadena principal L5 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre y la amida de cadena ligera W94 de cadena ligera de Fab; el carbonilo de cadena principal I10 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre y la cadena lateral de cadena pesada de Fab S52; la cadena lateral K11 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre y las cadenas laterales T30 y S31 de cadena pesada de Fab; la cadena lateral H33 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre y el carbonilo de cadena principal W94 de cadena ligera Fab; la amida de cadena principal A35 y la cadena lateral N59 de cadena pesada de Fab; y la amida de cadena principal C50 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre y el carbonilo de cadena principal Y104 de cadena pesada de Fab. Además, los residuos N-terminal 5 a 13 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre hicieron numerosos contactos con la Fab ya que el terminal N se encontraba en una ranura entre la CDR2 y la CDR3 de cadena pesada de Fab. Adicionalmente, el bucle de CDR3 de cadena pesada de Fab se extendió lejos de esta ranura e interactuó con el residuo no N-terminal I40 en la cadena p2 y con los residuos Glu48, Leu49 y Cys50 en la cadena 33 de la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre. Finalmente, los residuos 33-36 del bucle p1-p2 en la quimiocina CXCL8 humana truncada silvestre se envasan contra el CDR2 de cadena pesada de Fab.

Análisis mutacional

Varios contactos clave entre el Fab de Anticuerpo 1 y la CXCL8 humana silvestre se observan en la estructura cristalina y se evalúan además mediante los estudios de cinética de unión y la neutralización del lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR) U937-huCXCR2 de mutantes puntuales de CXCL8 humana. Para estudiar estos contactos clave, se elaboran varios mutantes puntuales (R6A, l10A, A35P, I40A y L49A) basados en la secuencia de CXCL8 humana (id. de sec. n. 27). Los mutantes puntuales de CXCL8 humana, R6A, I10A, A35P, I40A, y L49A silvestre se expresan, se vuelven a plegar y se purifican según las técnicas estándar. La formación de enlaces de disulfuro se confirma mediante digestión tríptica y análisis de huellas dactilares masivas, y la actividad se confirma mediante un ensayo de quimiotaxis de neutrófilos.

La cinética de unión se evalúa en un instrumento Biacore 2000 con el software de evaluación Biacore 2000, versión 4.1, como se ha descrito anteriormente. La CXCL8 humana mutante y silvestre se evalúa por actividad biológica y por neutralización mediante el Anticuerpo 1 usando el ensayo U937-huCXCR2. U937-huCXCR2 es una línea celular monocítica transducida con retrovirus para la expresión de CXCR2 humana.

Los mutantes de CXCL8 se diluyen en serie en un regulador de ensayo que contiene 0,2 % de BSA en pocillos de placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V. Las concentraciones de ligando son 3 veces la concentración final de ensayo (las concentraciones finales de ensayo varían de 300 a 0,0051 nM). Una placa celular y una placa de ligando se cargan en un lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR-3, dispositivos moleculares) programado para transferir 50 pl de ligando a los pocillos de la placa celular. La fluorescencia se registra a intervalos de 1 segundo durante 90 segundos. El cambio en la fluorescencia [unidades de fluorescencia relativa delta (DRFU), RFU máx.-RFU mín.] se calcula de las imágenes 10 a 90. La DRFU frente al registro (concentración de ligando) se grafica y los valores de EC<50>se determinan mediante la regresión no lineal usando Graph Pad Prism. Los ensayos se realizan por triplicado sobre tres placas de ensayo.

El Anticuerpo 1 se diluye en serie en un regulador de ensayo que contiene 0,2%de BSA. Las concentraciones de anticuerpo son 3 veces la concentración final de ensayo (las concentraciones finales varían de 10 a 0,0195 |jg/ml). Las soluciones madre de mutantes de CXCL8 y CXCL8 humanas silvestre se preparan en regulador de ensayo 0,2 % de BSA en 240 nM (30x la concentración final de ensayo de 8 nM). 20 jl de ligando se mezclan con 180 jl de Anticuerpo 1 en pocillos de placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en v. El ligando y el anticuerpo se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una placa celular y una placa de ligando-anticuerpo se cargan en un lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR-3, dispositivos moleculares) programado para transferir 50 pl de ligando-anticuerpo a los pocillos de la placa celular. La fluorescencia se registra a intervalos de 1 segundo durante 90 segundos. El cambio en la fluorescencia (DRFU) se calcula de las imágenes 10 a 90. La DRFU frente al registro (concentración de anticuerpo) se grafica y los valores de IC<50>se determinan mediante la regresión no lineal usando Graph Pad Prism. Los ensayos se realizan por triplicado sobre tres placas de ensayo.

La cinética de unión, la actividad biológica y los resultados de neutralización se resumen en la Tabla 4. Las mediciones se obtienen a 25 °C. El índice de activación (k<on>) y el índice de desactivación(koff)de cada ligando se evalúan usando un modelo de unión “ unión (transferencia de masa) 1:1” . La afinidad (K<d>) se calcula de la cinética de unión según la relación: Kd =koff/kon.

Varias de las mutaciones desactivaron la actividad para el receptor (EC<50>) y, por lo tanto, no se pudo comprobar la neutralización. Se observa que la mutación A35P abolió completamente la actividad neutralizante a pesar de tener una actividad completa para el receptor. Estos resultados destacan los contactos clave (R6, I10, A35, I40 y L49) dentro de la interfaz de unión del antígeno de CXCL8 que son importantes para la unión de anticuerpos.

Tabla 4. Cinética de unión, actividad de FLIPR U937 (EC<50>) y neutralización de FLIPR U937 (IC<50>) de mutantes y CXCR8 humana silvestre.

En general, el análisis de mapeo de epítopos del Anticuerpo 1 demostró que la interfaz de unión del antígeno incluye el extremo N de las quimiocinas CXC ELR (aminoácidos 5-13), el bucle 131-132 (aminoácidos 33-36) y las cadenas 132 y 33 (aminoácidos 40, 48-50). Los contactos clave dentro de esta interfaz que son importantes para la unión de anticuerpos incluyen los aminoácidos R6, I10, A35, 140 y L49 en CXCL8 (id. de sec. n. 27).

Ensayos de neutralización

Neutralización in vitro de quimiocinas CXC ELR+ humanas usando células HMEC humanas transfectadas con CXCR2 Dado que todas las quimiocinas CXC ELR+ pueden unirse al receptor de CXCR2, se seleccionaron células que expresan CXCR2 para estudios in vitro. HMEC-huCXCR2 es una línea celular endotelial humana inmortalizada transducida con retrovirus para la expresión del receptor de CXCR2 humana. Las células de HMEC que expresan la CXCR2 humana pueden inducir el influjo de Ca2+ intracelular en respuesta a las quimiocinas CXC ELR+ humanas, de mono cynomolgus, ratas y ratones. El influjo de Ca2+ intracelular se puede detectar mediante un lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR). Por lo tanto, la neutralización de quimiocinas también debería neutralizar el influjo de Ca2+ intracelular inducido por estas quimiocinas.

HMEC-huCXCR2 se mantiene en el medio MCDB 31 suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 2x GlutaMax, 1x aminoácidos no esenciales, 1 jg/ml de hidrocortisona, 10ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano y 0,4 jg/ml de puromicina a 37 °C en 5 % de COz. Los cultivos se mantienen a densidades de subconfluentes (50-80 % de confluente). Las células se cosechan con TrypLE Express, la densidad celular se ajusta a 3 x 105 células/ml en el medio de cultivo completo y 100 ml de la suspensión celular se siembran en pocillos de placas de ensayo negras de fondo transparente. Las placas celulares se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se fijen en el fondo de los pocillos antes de que las placas se incuben durante la noche a 37 °C en 5 % de CO<2>. Para cada placa de ensayo, el contenido de un vial del reactivo Fluo-4NW se suspende en 10 ml de regulador de ensayo y 100 ml de probenecid para elaborar el reactivo 1x Fluo-4NW. Después de la incubación, el medio de cultivo se aspira y 100 ml de la solución 1x Fluo-4NW se añaden a cada pocilio de la placa de ensayo. Las placas se incuban durante 30 minutos a 37 °C, seguido de 30 minutos adicionales a temperatura ambiente y se protegen de la luz. El Anticuerpo 1 se diluye en serie en un regulador de ensayo que contiene 0,2 % de BSA. Las concentraciones de anticuerpo son 3x la concentración final de ensayo (las concentraciones finales varían de 10-0.0195 pg/ml). Las soluciones madre de ligandos se preparan en regulador de ensayo 0,2 % de BSA en 300 nM (30x la concentración final de ensayo de 10 nM). 20 pl de ligando se mezclan con 180 pl de anticuerpo en pocillos de placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en v. El ligando y el anticuerpo se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una placa celular y una placa de ligando-anticuerpo se cargan en un lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR-3, dispositivos moleculares) programado para transferir 50 pl de ligando-anticuerpo a los pocillos de la placa celular. La fluorescencia se registra cada segundo durante 90 segundos. El cambio en la fluorescencia (DRFU) se calcula de las imágenes 10 a 90. La DRFU frente al registro (concentración de anticuerpo) se grafica y los valores de IC<50>se determinan mediante la regresión no lineal usando Graph Pad Prism. Los ensayos se realizan por triplicado sobre tres placas de ensayo. Los datos se expresan como la media de las réplicas.

Los resultados se resumen en la Tabla 5. Estos resultados demuestran que el Anticuerpo 1 puede neutralizar todas las siete quimiocinas CXC ELR+ humanas. Los valores de IC<50>se expresan como pg/ml de anticuerpo (las desviaciones estándar están entre paréntesis). Se usaron tanto 72 formas de aminoácidos como 77 de aminoácidos de CXCL8. Los datos tienen un promedio de 2-5 réplicas.

Tabla 5: Estudio de FLIPR in vitro usando las células de HMEC que expresan CXCR2 humana

Neutralización in vitro de la quimiotaxis inducida por CXCL8 o CXCLL humana usando neutrófilos humanos primarios

Un ensayo de quimiotaxis que usa neutrófilos humanos se escogió para determinar la actividad neutralizante del Anticuerpo 1 en células que expresan naturalmente tanto CXCR1 como CXCR2. La sangre periférica de voluntarios sanos se obtiene en dos tubos de heparina sódica de 10 ml. Para aislar los neutrófilos, se estratifican 5 ml de sangre sobre 5 ml de Polymorphprep en cuatro tubos de 15 ml. Los tubos se centrifugan durante 30 minutos a 470xg, 18 °C. El plasma y la banda celular superior (células mononucleares) se eliminan y se desechan. La segunda banda (neutrófilos) se agrupa de los 4 tubos y se añade un volumen igual de PBS. El tubo se centrifuga durante 10 minutos a 400xg, 18 °C. El gránulo se lava con 12 ml de PBS, se centrifuga al igual que antes y el gránulo se resuspende con 11 ml de HBSS/BSA (7,5 mg/ml de BSA, HBSS). 60 x 106 células se suspenden en 12 ml de HBSS/BSA y 5 pM de CMFDA y se incuban durante 30 min a 37 °C. Después de la incubación, el tubo se centrifuga para granular las células, se lava una vez con 12 ml de HBSS/BSA y, después, las células se resuspenden en 12 ml de HBSS/BSA (5 x 106 células/ml).

El Anticuerpo 1 y el control de isotipo (anticuerpo IgG4 humano) se diluyen a 1495 nM usando HBSS/BSA (dilución 1) y, después, se diluyen en serie 1:5 con HBSS/B<s>A. La CXCL8 se diluye a 20 nM con HBSS/BSA. La CXCL1 se diluye a 10,1 nM con HBSS/BSA.

70 pl de Anticuerpo 1 o HBSS/BSA se mezclan con 70 pl de la solución de CXCL8 o CXCL1 y se incuban a temperatura ambiente durante ~30 minutos. 30 pl de la mezcla se dispensan en los pocillos de la cámara inferior de una placa ChemoTX por triplicado. Los pocillos que contienen solo HBSS/BSA (sin quimiocina ni anticuerpo) mostrarán la señal de fondo. El filtro ChemoTX se coloca sobre la cámara inferior y 50 pl (250.000 células) se dispensan por encima de cada pocillo. La placa ChemoTx se incuba durante 3 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Después de la incubación, las células se enjuagan de la superficie superior con PBS y se retira el filtro ChemoTX. La fluorescencia se lee (contador Wallac Victor3 1420) 485/535 usando solo el detector inferior. La fluorescencia media de los pocillos de fondo (solo HBSS/BSA) se sustrae de la fluorescencia del pocillo de prueba, y la media y las desviaciones estándar se calculan en Excel.

En una concentración de CXCL8 de 5 nM, el IC<50>para el Anticuerpo 1 (MW 150.000 kDa) fue 26,4 (± 0,236) nM. En una concentración de CXCL8 de 10 nM, el IC<50>para el Anticuerpo 1 fue 43,7 (± 0,086) nM. En una concentración de CXCL1 de 5 nM, el IC<50>para el Anticuerpo 10 fue 18,5 (± 0,158) nM. En una concentración de CXCL1 de 20 nM, el IC<50>para el Anticuerpo 1 fue 40,3 (± 0,112) nM. En todas las concentraciones evaluadas de CXCL1 y CXCL8, el anticuerpo de control de isotipo no afectó a la quimiotaxis. Los datos muestran que el Anticuerpo 1 puede bloquear la actividad quimiotáctica de CXCL8 o CXCL1 humana de una manera dependiente de la dosis mientras que la actividad quimiotáctica no se vio afectada por el anticuerpo de control de isotipo.

Modelo de colitis por DSS aguda in vivo en ratones

El sulfato de dextrano sódico (DSS) es el modelo más comúnmente de colitis ulcerosa (CU). En este modelo, el DSS es un irritante químico que se añade al agua potable para inducir una enfermedad que se aparece a la CU. La fase aguda de la colitis por DSS se caracteriza por el reclutamiento de neutrófilos en la mucosa y la submucosa y por el aumento de la expresión de las quimiocinas CXC ELR+. Sin embargo, la exposición crónica al DSS provoca un daño intestinal grave y una pérdida de peso significativa, que no es adecuado en un modelo de colitis. Para alojar la naturaleza aguda de este modelo, el Anticuerpo 1 se usó de manera profiláctica para evaluar su capacidad para inhibir el reclutamiento de neutrófilos y el desarrollo de colitis. Cabe destacar que en este modelo, la proteína CXCL5 (LIX) de ratón se aumenta significativamente en el tejido del colon (Kwon 2005); sin embargo, el Anticuerpo 1 no neutraliza esta quimiocina de ratón.

Se obtienen ratones C57BL/6, de 8-10 semanas de edad, que pesan entre 18 y 22 g. La sangre se extrae por punción cardíaca y se analiza para establecer un valor de referencia. Para inducir la colitis, los ratones reciben 2,5 % de DSS (MW = 36.000-50.000) en el agua potable durante 5 días (días 1-5), seguido de 6 días de agua sin DSS (reflejando una inflamación aguda). Los ratones sanos de control solo reciben agua (grupo “sin D SS” ). Los ratones que reciben DSS se dosifican mediante inyección subcutánea el día 0, 2, 4 y 8 con el anticuerpo de control IgG4 humano (25 mg/kg) o el Anticuerpo 1 (25 mg/kg). El peso corporal se registra diariamente. El número de ratones usados para cada tratamiento es 9 (excepto que se usan 5 ratones sanos en el grupo sano “sin DSS” ). El estudio se realiza por cuadruplicado.

Como se muestra en la Tabla 6, los ratones con DSS que recibieron el anticuerpo de control IgG4 humano perdieron peso drásticamente entre el día 5 y el día 8. Los ratones con DSS que recibieron el Anticuerpo 1 antes de la inducción de la colitis y durante la fase aguda de la enfermedad mostraron una pérdida de peso menor entre el día 5 y el día 8 que los ratones con DSS tratados con el anticuerpo de control IgG4 humano (94,0 % del peso corporal inicial del Anticuerpo 1 frente al 85,3 % del peso corporal inicial del control de IgG4 el día 8). Estos resultados demuestran que la administración sistémica de Anticuerpo 1 mitigó efectivamente la pérdida de peso en la colitis inducida por d S s , respaldando la conclusión de que el Anticuerpo 1 neutraliza la actividad de ciertas quimiocinas CXC ELR+ de ratón y disminuye el reclutamiento de neutrófilos en el colon.

Tabla 6

Neutralización in vivo en un modelo de xenoinjerto de células renales de células claras 786-O

Las células del carcinoma de células renales (RCC) 786-O se mezclan 1:1 con matrigel y se implantan por vía subcutánea en el flanco posterior derecho de ratones hembra desnudas atímicas en 3,0 x 106 células por inyección. A ratones portadores de xenoinjertos 786-O que tienen volúmenes tumorales que alcanzaron los 100 mm3 se les administraron por vía oral 10 mg/kg de sunitinib dos veces al día bajo un régimen de dosificación continua hasta que los ratones empezaron a progresar con el crecimiento tumoral incluso bajo tratamiento con sunitinib como los ratones tratados por control (IgG4 y 10 % de vehículo). Los ratones que estaban progresando con el crecimiento tumoral con la terapia con sunitinib se dividieron al azar en 2 grupos. Un grupo recibe sunitinib en 10 mg/kg dos veces al día más el anticuerpo IgG4 de control en 20 mg/kg una vez a la semana. El otro grupo recibe sunitinib en 10 mg/kg dos veces al día más el Anticuerpo 1 en 20 mg/kg una vez a la semana. Los volúmenes tumorales promedio (error estándar en paréntesis) se muestran en la Tabla 7. La adición del Anticuerpo 1 al tratamiento con sunitinib redujo significativamente el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo (p<0.0001), indicando que el Anticuerpo 1 resensibilizó los tumores de RCC de células claras para el tratamiento con sunitinib.

Tabla 7

Neutralización in vivo en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario SKOV3-Luc

SKOV3-Luc es una línea celular de cáncer de ovario humano que expresa el gen de luciferasa de la luciérnaga. Las células SKOV3-Luc se usan frecuentemente in vivo para establecer el crecimiento tumoral del adenocarcinoma de ovario humano.

Las células de cáncer de ovario SKOV3-Luc se mezclaron 1:1 con matrigel y se implantaron por vía subcutánea en el flanco posterior derecho de ratones hembra desnudas atímicas en 3,0 x 106 células por inyección. Los ratones se distribuyeron al azar en 4 grupos al valor de referencia según el volumen tumoral después de que los xenoinjertos crecieran hasta un volumen tumoral promedio de 200 mm3. Los ratones recibieron el anticuerpo IgG4 de control (2,5 mg/kg una vez a la semana), cisplatino (2,5 mg/kg una vez a la semana), Anticuerpo 1 (20 mg/kg una vez a la semana) o una combinación de cisplatino (2,5 mg/kg una vez a la semana) y Anticuerpo 1 (20 mg/kg una vez a la semana) mediante inyección intraperitoneal. El crecimiento tumoral se muestra en la Tabla 8. La monoterapia con cisplatino no mostró una inhibición del crecimiento tumoral estadísticamente significativa en comparación con el control de isotipos. Sin embargo, la combinación de cisplatino y el Anticuerpo 1 mostró una inhibición del crecimiento tumoral estadísticamente significativa (p<0,001) en comparación con el control de isotipos y la monoterapia con cisplatino, indicando que el Anticuerpo 1 aumenta sinérgicamente la quimioterapia en el modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario SKOV3-Luc.

Tabla 8

Secuencias

Anticuerpo 1 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada: Id. de sec. n.° 1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGNISP

NSGSANYTJEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPS

REYYGSDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVPPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP

VTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN

TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS

QEDPEVQFNWYVDGVEVH.NAKTK.PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DfAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSLG

Anticuerpo 1 Región variable de cadena pesada: Id. de sec. n.° 2

R E Y YGSDI.WGQGTL VTVS S

Anticuerpo 1 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera: Id. de sec. n.° 3

EiVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSÍSNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTSRSVS

GTPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGQNNEWPEVFGGGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Anticuerpo 1 Región variable de cadena ligera: Id. de sec. n.° 4

ElVLTQSP ATLSLSPGERAT LSCRASQSISNN LHWY QQKPGQ A PRLLtYYTSRS VS

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGQNNEWPEVFGGGTKVFJK

Anticuerpo 1 Secuencia de ADN de cadena pesada: Id. de sec. n.° 5

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG

TGAAGGTGTCCTGCAAGGCATCTGGCTACGAGTTCACCAGCTACTGGATTCAC

TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTTCTC

CTAATAGTGGTAGTGCTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCAT

GACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGA

TCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGÁGGGCCCTTACAGTTATTA

TCCGAGTAGGGAGTACTATGGCTCTGACCTCTGGGGGCAAGGGACCCTAGTC

ACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGCTCTTCCCGCTÁGCGCCCTG

CTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC

TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG

GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTC.GGCACGAAGACCTACACCTGCA

ACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCA

AATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCA

TCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGAC

CCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC

C'AGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC

C-GCGGG AGGAGCAGTT CA ACAGC ACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGT

CCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC

A A AGGCCTCCCGTCCTCC ATCG ACA A A ACCÁTCTCCA A AGCCA A AGGGCAGC

CCCGAGAGCCACAGGTGTACACC'CTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAA

GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATC

GCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG

CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC'TTCCTCTACAGCAGGCTAACCGT

GGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT

GAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

Anticuerpo 1 Secuencia de ADN de cadena ligera: Id. de sec. n.° 6

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCGTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAAAGTATCAGCAATAACCTACACTGG

t a c c a a c a g a a a c c t g g c c a g g c t c c c a g g c t c c t c a t c t a t t a t a c t t c c c g

GTCCGTCTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT

t c a c t c t c a c c a t c a g c a g c c t a g a g c c t g a a g a t t t t g c a g t t t a t t a c t g t g g a c a g a a t a a c g a g t g g c c t g a g g t g t t c g g c g g a g g g a c c a a g g t g g a g ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCrrTCATCTTCCCGCCATCTGATGA GCAGTT<g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c>c c a g á g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g c

Anticuerpo 1/Anticuerpo 2 LCDR1: Id. de sec. n.° 7

RASQSISNNLH

Anticuerpo 1/Anticuerpo 2 LCDR2: Id. de sec. n.° 8

YTSRSVS

Anticuerpo 1/Anticuerpo 2 LCDR3: Id. de sec. n.° 9

GQNNEWPEV

Anticuerpo 1/Anticuerpo 2 HCDR1: Id. de sec. n.° 10

GYEFTSYWIH

Anticuerpo 1/Anticuerpo 2 HCDR2: Id. de sec. n.° 11

NISPNSGSANYNEKFKS

Anticuerpo 1 HCDR3: Id. de sec. n.° 12

EGPYSYYPSREYYGSDL

Anticuerpo 2 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada: Id. de sec. n.° 13

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGNISP

NSGSANYINEKFKSRVTMTRDTSTSWYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPS

RQYYGSDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST.AALGCLVKDYFPEP

VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSSLGTK.TYTCNVDHKPSN

TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS

QEDPEVQFNWYVDGVEVRNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKGLPSSIEKTÍSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH

EALHNHYT QK.SLSLSLG

Anticuerpo 2 Región variable de cadena pesada: Id. de sec. n.° 14

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYEFTSYWIHWVRQAPGQGI.EWMGNISP

NSGSANYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPYSYYPS

RQYYGSDLWGQGTLVTVSS

Anticuerpo 2 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera: Id. de sec. n.° 15

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticuerpo 2 Región variable de cadena ligera: Id. de sec. n.° 16

FIVLTQSPATLSLSPGRRATLSCRASQSISNNl.HWYQQKPGQAPRl.LIYYTSRSVS GlPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCGQNNEWPEVFGGGTKVEjK Anticuerpo 2 Secuencia de ADN de cadena pesada: Id. de sec. n.° 17

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG

TGAAGGTGTCCTGCAAGGCATCTGGCTACGAG'iTCACCAGCTACTGGATTCAC TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATAnTCTC

CTAATAGTGGTAGTGCTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCAT

GACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGA

TCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCCTTACAGTTATTA

T CCG AGTAGGC AGT ACTATGGC’T CT GACCTCTGGGGGCAAGGGACCCT AGTC

ACAGTCT CCTCAGCCT CC ACC AAGGGCCCATCGGT UTTCCCGCT. AGCGCCCT G

CTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC

T ACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGG AACT CAGGCGCCCTGACCAGCG

GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCA

ACGTAG ATCA C AAGCCCAGCA AC ACCA AGGTGGACA AG AGAGTT G AGTCCA

AATATGGTCC'CCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCA

TCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGAC

CCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTC

CAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC

CGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT

CCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC

AAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCAICTCCAAAGCCAAAGGGCAGC

CCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTCjCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAA

GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATC

g c c g t g g a g t g g g a a a g c a a t g g g c a g c c g g a g a a c a a c t a c a a g a c c a c g

CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGT

g g a c a a g a g c a g g t c g c a g g a g g g g a a t g t c t t c t c a t g c t c c g t g a t g c a t g a g g c t c t g c a c a a c c a c t a c a c a c a g a a g a g c c t c t c c c t g t c t c t g g g t

Anticuerpo 2 Secuencia de ADN de cadena ligera: Id. de sec. n.° 18

g a a a t t ü t g t t g a c a c a g t c t c c a g c c a g c c t g t c t t t g t c t g c a g g g g a a a g a g c c a c c c t c t c c t g c a g g g c c a g t c a a a g t a t c a g c a a t a a c c t a c a c t g g

TACCAACAGAAACCTGGCX?-AGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATACTTCCCG

g t c c g t c t c t g g c a t c c c a g c c a g g t t c a c t g g c a g t g g g t c t g g g a c a g a c t

TCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGT

g g a c a g a a t a a c g a g t g g c c t g a g g t g t t c g g c g g a g g g a c c a a g g t g g a g ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCrrCCCGCCATCrGATGA

GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC

c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a

CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC.ACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC

g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a ACAGGGGAGAGTGC

Anticuerpo 2 HCDR3: Id. de sec. n.° 19

EGPYSYYPSRQYYGSDL

HCDR3 Secuencia de consenso: Id. de sec. n.° 20

EGPYSYYPSRXaaYYGSDL

en donde Xaa es E o Q

Gro-alfa humana (CXCL1): Id. de sec. n.° 21

a s v a t e l r c q c l q t l q g i h p k n i q s w v k s p g p h c a q t e v i a t l k n g r k a c l n p a SPI VKKlíEKMLN SDKSN

Gro-beta humana (CXCL2): Id. de sec. n.° 22

APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVIATLKNGQKACXNPA

SPMVKKUEKMLiCNGKSN

Gro-gamma humana (CXCL3): Id. de sec. n.° 23

ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEVIATLKNGKKACLNPA

SPM VQK ÍIEKILN1GGSTN

ENA-78 humana (CXCL5): Id. de sec. n.° 24

AAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMiSNLQVFAIGPQCSKVEVVASLKNGKEICLDPE APFLKKVI QK! I..DGGN KEN

GCP-2 humana (CXCL6): Id. de sec. n.° 25

VSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTiGKLQVFPAGPQCSKVEVVASLKNGKQVCLD PEAPFLKKVIQKILDSGNKKN

NAP-2 humana (CXCL7): Id. de sec. n.° 26

AELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEV1GKGTHCNQVEV1ATLKDGRKFCLDPDAPR1K

KIVQKKLAGDESAD

IL-8 humana (CXCL8): Id. de sec. n.° 27

SAKELRCQC1KTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEUVKLSDGRELCLDPKENW

VQ RV VEKFLK RAEN S

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2, e IL-8 humanas, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que la LCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera (“LCDR”) LCDR1, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada (“HCDR”) HCDR1, HCDR2, HCDR3, en el que la LCDR1 es RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 7), LCDR2 es YTSRSVS (SEQ ID NO: 8), LCDR3 es GQNNEWPEV (SEQ ID NO: 9), HCDR1 es GYEFTSYWIH (SEQ ID NO: 10), HCDR2 es NISPNSGNSANYNEKFKS (SEQ ID NO: 11), y HCDR3 es EGPYSYYPSREYYGSDL (SEQ ID NO: 12).

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una HCVR de SEQ ID NO: 2 y una LCVR de SEQ ID NO: 4.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 3.

4. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del cáncer.

5. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para neutralizar Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78, GCP-2, NAP-2, e IL-8 humanasin vitrooex vivo.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.