[go: up one dir, main page]

RS57087B1 - Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40 - Google Patents

Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40

Info

Publication number
RS57087B1
RS57087B1 RS20180346A RSP20180346A RS57087B1 RS 57087 B1 RS57087 B1 RS 57087B1 RS 20180346 A RS20180346 A RS 20180346A RS P20180346 A RSP20180346 A RS P20180346A RS 57087 B1 RS57087 B1 RS 57087B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
bms3h
seq
human
antibody
dat
Prior art date
Application number
RS20180346A
Other languages
English (en)
Inventor
Anish Suri
Steven Sheriff
Suzanne Suchard
Aaron Yamniuk
Stanley Krystek
James Tamura
James Bryson
Steven Grant
Philip Drew
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Domantis Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46000407&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57087(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co, Domantis Ltd filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS57087B1 publication Critical patent/RS57087B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6895—Rescue therapy; Agonist-antagonist; Antidotes; Targeted rescue or protection, e.g. by folic acid-folinic acid or conjugated to antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/36—Opioid-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Antitela i njihovi fragmenti koji ciljaju CD40, i ne pokazuju CD40 agonističku aktivnost, kompozicije koje sadrže iste, i metode primene istih za lečenje bolesti koje uključuju CD40 aktivnost su obezbeđeni.
UPUĆIVANJE NA SRODNE PRIJAVE
[0002] Predmetna prijava zahteva korist od američke privremene prijave sa brojem 61/477,904, podnete 21. aprila 2011.
STANJE TEHNIKE
[0003] CD40 je ko-stimulatorni molekul koji pripada superfamiliji receptora faktora nekroze tumora (tumor necrosis factor - TNF) koja je prisutna na antigen prezentujućim ćelijama (antigen presenting cells-APC), uključujući dendritične ćelije, B ćelije, i makrofage. APC-e se aktiviraju kada CD40 veže svoj ligand, CD 154 (CD40L), na THćelijama. CD40-posredovana APC aktivacija je uključena u razne imunološke odgovore, uključujući proizvodnju citokina, stimulaciju ko-stimulatornih molekula (kao što je CD86), i povećanu antigen prezentaciju i B ćelijsku proliferaciju. CD40 se može takođe eksprimirati od strane endotelijalnih ćelija, ćelija glatkih mišića, fibroblasta, i epitelijalnih ćelija.
[0004] CD40 aktivacija je takođe uključena u razne nepoželjne T ćelijske odgovore povezane sa autoimunošću, odbacivanjem transplantata, ili alergijskim odgovorima, na primer. Jedna strategija za kontrolisanje neželjenih T ćelijskih odgovora je da se cilja CD40 sa antagonističkim antitelom. Na primer, monoklonsko antitelo HCD122 (Lucatumumab), ranije poznato kao Chiron 1212, je trenutno u kliničkim ispitivanjima za lečenje određenih CD40-posredovanih inflamatornih bolesti. Videti "Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma," Clinical Trials Feeds, na internetu na protokolu za prenos hiperteksta: clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209 (poslednji obnovljen 11.januara, 2011). Monoklonska antitela, ipak, mogu pokazati agonističku aktivnost. Na primer, korist anti-CD40 antitela Chi220 je ograničena njegovim slabim stimulativnim potencijalom. Videti Adams, et al., "Development of a chimeric anti-CD40 Monoclonal Antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival," J. Immunol. 174: 542-50 (2005).
REZIME
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptide antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0006] Antagonisti anti-CD40 antitela koji ne poseduju parcijalnu agonističku aktivnost su i još uvek potrebni u kliničkoj postavci. Novi polipeptidi antitela koji specifično vezuju nove epitope humanog CD40 su obezbeđeni. CD40 epitop ne preklapa Chi220 epitop, kao što je pokazano kompetitivnom analizom i strukturom izvedenom iz ko-kristalizacije polipeptida antitela sa CD40. Polipeptidi antitela povoljno ne pokazuju CD40 agonističku aktivnost. Polipeptidi antitela su korisni u lečenju bolesti koje uključuju CD40 aktivaciju, uključujući autoimune bolesti, odbacivanje transplantata, i alergijske odgovore. Polipeptidi antitela predmetnog pronalaska sadrže varijabilni domen koji je pojedinačni varijabilni domen sposoban za specifično i monovalentno vezivanje CD40. U jednom tehničkom rešenju, polipeptidi antitela su u obliku domena antitela (dAt) koje sadrži pojedinačni varijabilni domen. U drugom tehničkom rešenju, dAt-a su bi-specifični reagensi koji sadrže drugi varijabilni domen koji može da veže humani serumski albumin (HSA), na primer.
[0007] Obezbeđen je polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji je pojedinačni varijabilni domen, gde navedeni polipeptid antitela specifično vezuje epitop humanog CD40, gde epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu sa identifikacionim brojem (SEQ ID NO): 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem domena antitela (dAt) BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417), i gde epitop sadrži najmanje jedan CD40 aminokiselinski ostatak odabran iz grupe koja se sastoji od Trp109, Leu121, His122, Ser124, Ser156, Ala157, Phe158, Glu159, i His162.
[0008] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde prvi varijabilni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu jednog od polipeptida antitela odabranu iz grupe zajedničkog porekla koja se sastoji od BMS3h-37, BMS3h-38, BMS3h-56, i BMS3h-198, i gde prvi varijabilni domen ima evidentnu vezujuću konstantu od 1 pM do 100 nM. Dodatno je obezbeđen polipeptid antitela gde prvi varijabilni domen ima evidentnu vezujuću konstantu od 1 pM do 10 nM.
[0009] Takođe ovde opisan je polipeptid antitela gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena sadrži (a) CDR1 region koji se razlikuje od CDR1 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (b) CDR2 region koji se razlikuje od CDR2 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (c) CDR3 region koji se razlikuje od CDR3 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (d) FR1 region koji se razlikuje od FR1 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (e) FR2 region koji se razlikuje od FR2 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (f) FR3 region koji se razlikuje od FR3 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, i (g) FR4 region koji se razlikuje od FR4 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline.
[0010] Takođe ovde je opisan polipeptid antitela gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena sadrži (a) CDR1 region koji se razlikuje od CDR1 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (b) CDR2 regiona koji se razlikuje od CDR2 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline, (c) CDR3 regiona koji se razlikuje od CDR3 regiona BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do dve aminokiseline.
[0011] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde se aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena razlikuje od aminokiselinske sekvence BMS3h-56-258 (SEQ ID NO: 10) ili BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do 10 aminokiselina.
[0012] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde se aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena razlikuje od aminokiselinske sekvence BMS3h-56-258 (SEQ ID NO: 10) ili BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po do 5 aminokiselina.
[0013] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde se aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena razlikuje od aminokiselinske sekvence BMS3h-56-258 (SEQ ID NO: 10) ili BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po dve aminokiseline.
[0014] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde se aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena razlikuje od aminokiselinske sekvence BMS3h-56-258 (SEQ ID NO: 10) ili BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) po jednoj aminokiselini.
[0015] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde je polipeptid antitela odabran iz grupe BMS3h-56 zajedničkog porekla, i gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena dalje sadrži: (a) CDR1 region koji ima sekvencu X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (SEQ ID NO: 1274), gde X1je Asp ili Gly, i Y1je Met ili Leu; (b) CDR2 region koji ima sekvencu Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (SEQ ID NO: 1275), gde X2je Gln, Tyr, Pro, Trp, ili Ala, Y2je Thr, Ser, Asn, Gly, Met, ili Gln, Z2je Arg, Leu, Tyr, His, ili Phe, i A2je Lys ili Met; i (c) CDR3 region koji ima sekvencu X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3(SEQ ID NO: 1276), gde X3je Leu ili Pro, Y3je Phe, Gln, Thr, ili Met, Z3je Tyr, Pro, Leu, Thr, Ile, Phe, ili Met, A3je Gln, His, Asp, Ser, Lys, Glu, ili Gly, i B3je Glu, Asp, ili Tyr.
[0016] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena sadrži: (a) FR1 region koji ima sekvencu Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly--Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1(SEQ ID NO: 1277), gde X1je Leu ili Arg, i Y1je Arg ili Ala; (b) FR2 region koji ima sekvencu Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser (SEQ ID NO: 1278), gde X2je Gln ili Arg, Y2je Lys ili Arg, i Z2je Gly ili Val; (c) FR3 region koji ima sekvencu Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys (SEQ ID NO: 1279), gde X3je Thr ili Met, Y3je Glu ili Asp, Z3je Ala ili Ser, A3je Tyr ili His, i B3je Ala ili Thr; i (d) FR4 region koji ima sekvencu X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4(SEQ ID NO: 1280), gde X4je Trp ili Arg, Y4je Gln ili Pro, i Z4je Ser ili Asn.
[0017] Dodatno obezbeđen je polipeptid antitela gde prvi varijabilni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu od BMS3h-56-258 (SEQ ID NO: 10) ili BMS3h-56-269 (SEQ ID NO:417).
[0018] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela gde je polipeptid antitela odabran iz grupe BMS3h-37 zajedničkog porekla, gde prvi varijabilni domen sadrži sekvencu Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-X1-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQ ID NO: 1281); i gde X1je Gln ili Arg; Y1je Glu ili Gly; Z1je Ala, Leu, ili Glu; A1je Phe ili Tyr; i B1je Trp ili Arg.
[0019] Takođe ovde opisan je polipeptid antitela gde je polipeptid antitela odabran iz grupe BMS3h-38 zajedničkog porekla, gde prvi varijabilni domen sadrži sekvencu Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-AlaAla-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-GIu-Glu-Glu-Glu-Met-Ile-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-Ile-Ser-Z1-A1-Gly-B1-C1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQ ID NO: 1282); i gde X1je Thr ili Pro; Y1je Ala ili Ser; Z1je Arg ili Gly; A1je Arg, Ser, Asn, Gln, Gly, His, ili Leu; B1je Tyr, Phe, Trp, ili Gly; C1je Ser ili Gly; i D1je Arg, Met, ili Pro.
[0020] Takođe ovde opisan je polipeptid antitela gde je polipeptid antitela odabran iz grupe BMS3h-198 zajedničkog porekla, gde prvi varijabilni domen sadrži sekvencu Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y1-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-Cys-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQ ID NO: 1283); i gde X1je Met ili Leu; Y1je Val ili Phe; Z1je Asp ili Asn; A1je Ser ili Thr; B1je Tyr ili His; C1je Lys ili Arg; D1je Asp ili Glu; E1je Tyr ili Phe; F1je Trp ili Arg; G1je Gly ili Arg; i H1je Gln ili His.
[0021] Further provided is an polipeptid antitela gde je polipeptid antitela domen antitela (dAb).
[0022] Dodatno obezbeđen je polipeptid antitela gde je varijabilni domen fuzionisan za Fc domen.
[0023] Dodatno obezbeđen je polipeptid antitela gde polipeptid antitela dodatno sadrži drugi varijabilni domen koji specifično vezuje drugi antigen, gde drugi antigen je antigen drugačiji od humanog CD40.
[0024] Takođe obezbeđen je polipeptid antitela gde je drugi antigen molekul klaster diferencijacije (CD) ili molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (Major Histocompatibility Complex - MHC) klase II.
[0025] Takođe je obezbeđen polipeptid antitela gde je drugi antigen serumski albumin (SA).
[0026] Obezbeđena je nukleinska kiselina koja kodira polipeptid antitela stavljen ovde na uvid javnosti.
[0027] Takođe je obezbeđen vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu stavljenu ovde na uvid javnosti.
[0028] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži vektor stavljen ovde na uvid javnosti.
[0029] Obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efikasnu količinu polipeptida antitela stavljenog ovde na uvid javnosti i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja dodatno sadrži imunosupresivni/imunomodulatorni i/ili anti-inflamatorni agens.
[0030] Obezbeđena je farmaceutska kompozicija stavljena ovde na uvid javnosti za primenu u metodi lečenja imune bolesti kod pacijenta kod koga postoji potreba za ovakvim lečenjem, pri čemu metoda obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine farmaceutske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti. Farmaceutska kompozicija može biti administrirana u kombinaciji sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili antiinflamatornim agensom.
[0031] Imuna bolest može biti autoimuna bolest ili bolest povezana sa graftom. Imuna bolest može biti odabrana iz grupe koja se sastoji od odabranih iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uha, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 dijabetes, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenijske purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na rekombinantne proizvode leka, sistemskog eritemskog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, miastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tireoiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-a, atopijske alergije, bronhijalne astme, ekcema, lepre, šizofrenije, nasledne depresije, transplantacije tkiva i organa, sindroma hroničnog umora, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, moždanog udara, autizma, epilepsije, Arthus-ovog fenomena, anafilakse, zavisnosti od alkohola, i zavisnosti od lekova.
[0032] Takođe ovde opisana je metoda ciljanja CD40 primenom prvog varijabilnog domena koji specifično vezuje epitop humanog CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem domena antitela (dAt) BMS3h-56-269 (SEQ ID NO:417).
[0033] Dodatno ovde opisana je primena u medicini polipeptida antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje epitop humanog CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem domena antitela (dAt) BMS3h-56-201 (SEQ ID NO: 9), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
[0034] Dodatno ovde opisana je primena polipeptida antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje epitop humanog CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem domena antitela (dAt) BMS3h-56-201 (SEQ ID NO: 9), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u pripremi leka za lečenje imune bolesti. Farmaceutska kompozicija može biti administrirana u kombinaciji sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili anti-inflamatornim agensom. Imuna bolest može biti autoimuna bolest ili bolest povezana sa graftom. Imuna bolest može biti odabrana iz grupe koja se sastoji od odabranih iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uha, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenijske purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na rekombinantne proizvode leka, sistemskog eritemskog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, miastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tireoiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-a, atopijske alergije, bronhijalne astme, ekcema, lepre, šizofrenije, nasledne depresije, transplantacije tkiva i organa, sindroma hroničnog umora, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, moždanog udara, autizma, epilepsije, Arthus-ovog fenomena, anafilakse, zavisnosti od alkohola, i zavisnosti od lekova.
[0035] Dodatno ovde opisan je polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje epitop humanog CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem domen atitela (dAt) BMS3h-56-201 (SEQ ID NO: 9), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za primenu u pripremi leka za lečenje imune bolesti. Lek može, na primer, biti administriran u kombinaciji sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili anti-inflamatornim agensom. Imuna bolest može biti, na primer, autoimuna bolest ili bolest povezana sa graftom. Imuna bolest može takođe biti odabrana iz grupe koja se sastoji od odabranih iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uha, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 dijabetes, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenijske purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na rekombinantne proizvode leka, sistemskog eritemskog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, miastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tireoiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-A, atopijske alergije, bronhijalne astme, ekcema, lepre, šizofrenije, nasledne depresije, transplantacije tkiva i organa, sindroma hroničnog umora, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, moždanog udara, autizma, epilepsije, Arthus-ovog fenomena, anafilakse, zavisnosti od alkohola, and zavisnosti od lekova.
KRATAK OPIS SLIKA
[0036] Patent ili prijava sadrži najmanje jednu sliku u boji. Kopije ovog patenta ili objava patentne prijave sa slikom(slikama) u boji će biti obezbeđene od strane Zavoda nakon zahteva i plaćanja obavezne takse.
SL. 1 prikazuje načine vezivanja dve različite ko-kristalne strukture humanog CD40 (SEQ ID NO: 1), jedne sa dAt BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) i jedne sa Fab' od Chi220 antitela. BMS3h-56-5 i Chi 220 Fab' molekuli su prikazani kao skice sa βlancem (predstavljenim strelicama u dAt-u) i neponavljajućom sekundarnom strukturom (predstavljenim petljama u dAt-u). Regioni određivanja komplementarnosti (CDR-i) su takođe prikazani CD40 je takođe prikazan kao skica sa ostacima BMS3h-56-5 epitopa humanog CD40. Ostaci Chi220 epitopa su takođe prikazani. Disulfidne veze su takođe prikazane N-terminalni kraj (N) i C-terminalni kraj (C) od CD40 su obeleženi.
SL. 2 prikazuje “space filling” model od BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) koji je u dodiru sa humanim CD40 (SEQ ID NO: 1), što je prikazano kao skica. Površinski ostaci dAt-a BMS3h-56-5 koji su u dodiru sa CD40 su prikazani. BMS3h-56-5 CDR3 region i FR-2 ostaci Leu45, Arg47, Arg56 i Phe99 su označeni. Numerisanje po Kabatu (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izdanje, U.S. Dept. Health & Human Services, Vašington, D.C. (1991)) je primenjeno u ovom dijagramu i razlikuje se od sekvencijalnog numerisanja po tome što su umetnuti ostaci primenjeni da bi se zadržalo numerisanje ostataka β-nizova identičnim. Prema tome za BMS3h-56-5, sekvencijalni ostatak 53 postaje ostatak 52A, sekvencijalni ostaci 84, 85, i 86 postaju, redom, 82A, 82B, 82C i Kabat broj 100 ostatka nedostaje (on bi bio između sekvencijalnih ostataka 103 i 104); CD40 je takođe predstavljen kao skica sa neponavljajućom sekundarnom strukturom i BMS3h-56-5 epitopom. CD40 ostaci koji se razlikuju između ljudi i Macaca fascicularis (cinomolgus majmuna), Ala115, Phe99, Ser126, His162, Leu121, i Trp109, su prikazani u vidu štapića. CD40 ostaci koji se razlikuju između ljudi i cinomolgus majmuna koji su deo BMS3h-56-5 epitopa su Trp109, Leu121, i His162. CD40 ostaci Trp109 i Leu121 leže u brazdi između BMS3h-56-5 CDR3 i FR-2. Mutacija Trp109 ili u velikoj meri smanjuje ili uklanja BMS3h-56-5 aktivnost.
SL. 3 prikazuje vezivanje PEGilovanog anti-humanog CD40 dAt-a, BMS3h38-2C-P40Br, na uzorcima krvi ljudi i vrsta primata. SL.3A prikazuje BMS3h38-2C-P40Br vezivanje za humane i B ćelije cinomolgusa; SL. 3B prikazuje BMS3h38-2C-P40Br vezivanje za humane, B ćelije rezusa, i šimpanzi.
SL. 4, SL. 5, SL. 6, i SL. 7 prikazuju ClustalW2 poravnanje reprezentativnih polipeptida domen antitela iz loza BMS3h-56, BMS3h-37, BMS3h-38, i BMS3h-198, redom.
DETALJAN OPIS
[0037] Polipeptidi antitela koji se specifično vezuju za humani CD40 su obezbeđeni. Polipeptidi antitela ne poklazuju CD40 agonističku aktivnost, i polipeptidi antitela su korisni u lečenju bolesti koje uključuju CD40 aktivaciju, kao kod autoimunih bolesti. Polipeptidi antitela mogu biti odabrani primenom primarnog skrininga korišćenjem testova ćelijskog vezivanja, nakon čega sledi jedan ili više krugova sazrevanja afiniteta koji su skloni grešci ili vođeni degeneracijom oligonukleotida. Kao rezultat, vrsta polipeptida antitela koji specifično vezuju jedan CD40 epitop je obezbeđena.
[0038] "Loza" je skup povezanih polipeptida antitela koji su pripremljeni od zajedničkog prekursora pomoću sazrevanja afiniteta koje je sklono grešci ili vođeno degeneracijom
1
oligonukleotida, kao što je stavljeno na uvid javnosti u primerima ispod, i za koje se očekuje da vezuju isti CD40 epitop. Nomenklatura polipeptida antitela se primenjuje da označi razne loze. Nomenklatura "BMS3h-56," na primer, se odnosi na polipeptide antitela loze 56, koji su odgajani protiv humanog CD40. "Loza BMS3h-56" polipeptida antitela uključuje BMS3h-56-1 do BMS3h-56-33, i BMS3h-56-202 do BMS3h-56-288.
[0039] Dodatno, u jednom aspektu, polipeptid antitela sadrži varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem bilo kog domena antitela (dAt-a) navedenog u TABELI 3. Na primer, dAt može pripadati lozi odabranoj iz grupe koja se sastoji od BMS3h-37, BMS3h-38, BMS3h-41, BMS3h-43, BMS3h-56, BMS3h-131, BMS3h-198, i BMS3h-202, kao što je dAt BMS3h-56-5, BMS3h-56-201, ili BMS3h-56-258, na primer. U drugom aspektu, polipeptid antitela specifično vezuje isti humani CD40 epitop kao bilo koji od dAt-a navedenih u TABELI 3. Na primer, polipeptid antitela može sadržati varijabilni domen koji specifično vezuje isti humani CD40 epitop kao dAt BMS3h-56-5, BMS3h-56-201, ili BMS3h-56-258, na primer. Kao što je dole stavljeno na uvid javnosti, humani CD40 epitop može sadržati aminokiselinsku sekvencu Trp109 SEQ ID NO: 1, na primer.
[0040] Polipeptidi antitela predmetnog pronalaska su domeni antitela koja sadrže prvi varijabilni domen koji je pojedinačni varijabilni domen sposoban za specifično i monovalentno vezivanje CD40. Polipeptidi antitela takođe mogu sadržati dodatne domene, kao što je Fc domen. Na primer, polipeptid antitela može sadržati sekundarni varijabilni domen koji specifično vezuje humani serumski albumin (HSA). Ovakvi dualno specifični polipeptidi antitela mogu imati produženi polu-život, na primer.
[0041] U listi sekvenci, SEQ ID NO: 1 je aminokiselinska sekvenca humanog CD40; SEQ ID NO: 2 je aminokiselinska sekvenca za Macaca fascicularis CD40. Aminokiselinska sekvenca domena antitela BMS3h-56-5 je SEQ ID NO: 321.
[0042] Kao što je ovde primenjeno, "specifično vezivanje" se odnosi na vezivanje antigena pomoću polipeptida antitela sa konstantom disocijacije (Kd) od oko 1 µM ili nižom kao što je izmereno, na primer, površinskom plazmonskom rezonancom. Pogodni sistemi testova uključuju BIAcore™ sistem površinske plazmonske rezonance i BIAcore™ program kinetičke evaluacije (npr., verzija 2.1). Afinitet ili Kdza specifičnu interakciju vezivanja može biti oko 500 nM ili niže ili oko 300 nM ili niže.
[0043] Termin "oko" će biti shvaćen od strane prosečno obučenih u oblasti i variraće do neke mere od konteksta u kome je upotrebljen. Generalno, oko obuhvata opseg vrednosti koje su plus/minus 10% od navedene vrednosti.
[0044] U skladu sa ovim detaljnim opisom, sledeće skraćenice i definicije se primenjuju. Mora se napomenuti da kao što je ovde primenjeno, oblici jednine "a", "an", i "the" uključuju i množinu osim ukoliko kontekst jasno nalaže drugačije. Prema tome, na primer, "antitelo" uključuje množinu takvih antitela a "doza" uključuje jednu ili više doza i njihovih ekvivalenata poznatih prosečnim poznavaocima oblasti, i tako dalje.
1. CD40 i CD40 aktivnosti
[0045] Obezbeđeni su polipeptidi antitela koji vezuju humani CD40. CD40 je takođe poznat kao antigen CD40 površine B ćelija, Bp50, CD40L receptor, CDw40, CDW40, MGC9013, p50, TNFRSF5, i član 5 superfamilije receptora faktora nekroze tumora. Relevantne strukturne informacije za humani CD40 se mogu pronaći, na primer, u UniProt Pristupnim Brojevima P25942, Q9BYU0, i Q53GN5. "Humani CD40" se odnosi na CD40 koji sadrži sledeću aminokiselinsku sekvancu:
CD40 je takođe sekvenciran u Mus musculus, Sus scrofa, Bos taurus, Gallus gallus, Canis familiaris, Macaca fascicularis (cinomolgusni majmun), Ovis aries, Equus caballus, i Rattus norvegicus.
[0046] Vezivanje prisutnih polipeptida antitela za CD40 antagonizuje CD40 aktivnost. "CD40 aktivnosti" uključuju, ali nisu ograničene na, T ćelijsku aktivaciju (npr, indukciju proliferacije T ćelija ili sekreciju citokina), aktivaciju makrofaga (npr, indukciju reaktivnih vrsta kiseonika i azot oksida u makrofagama), i aktivaciju B ćelija (npr, B ćelijska proliferacija, zamena izotipa antitela, ili diferencijacija u plazma ćelije). CD40 aktivnosti mogu biti posredovane interakcijom sa drugim molekulima. "CD40 aktivnosti" uključuju funkcionalnu interakciju između CD40 i sledećih molekula, koji su identifikovani po njihovom Uniprot Pristupnom Broju u zagradama:
Na primer, CD40 "aktivnost" uključuje interakciju sa TRAF2. CD40/TRAF2 interakcija aktivira NF-κB i JNK. Videti Davies et al., Mol. Cell Biol. 25: 9806-19 (2005). Ova CD40 aktivnost tako može biti određena pomoću CD40-zavisne celularne NF-κB i JNK aktivacije, u odnosu na referencu.
[0047] Kao što je ovde primenjeno, termini "aktiviraju," "aktivira," i "aktiviran" se odnose na povećanje u datoj merljivoj CD40 aktivnosti za najmanje 10% u odnosu na referencu, na primer, najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, ili čak 100%, ili više. CD40 aktivnost je "antagonizovana" ukoliko je aktivnost smanjena za najmanje 10%, i u tipičnom primeru tehničkog rešenja, najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, ili čak 100% (tj., nedetektabilna aktivnost), u odnosu na odsustvo antagonista. Na primer, polipeptid antitela može antagonizovati neku ili sve CD40 aktivnosti, pri čemu ne aktivira
1
CD40. U jednom tehničkom rešenju, polipeptid antitela ne aktivira B ćelijsku proliferaciju. U drugom tehničkom rešenju, polipeptid antitela ne aktivira sekreciju citokina od strane T ćelija, gde je citokin najmanje jedan citokin odabran iz grupe koja se sastoji od IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ.
2. CD40 Epitop
[0048] Rendgenska kristalografija kompleksa između humanog CD40 (SEQ ID NO: 1) i dAta BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) je primenjena da se otkrije epitop prepoznat od strane polipeptida antitela objave. Strukturni modeli za CD40 i BMS3h-56-5 su podešeni na podatke gustine elektrona da se dobije sedam modela ili verzija kompleksa CD40/BMS3h-56-5, koji proizilaze iz tri kristalografski nezavisna kompleksa u jednom kristalnom obliku i četiri kristalografski nezavisnih kompleksa u drugom kristalnom obliku. Verzije imaju koeficijente korelacije realnog prostora od oko 0.92 za atome glavnog lanca i 0.80 za atome bočnog lanca. CD40 molekul ima određen nivo fleksibilnosti u sedam verzija, ali opšta priroda CD40/BMS3h-56-5 interakcije je zadržana u svim verzijama. Verzije se razlikuju u interakciji između CD40 ostatka Trp109 i BMS3h-56-5 Trp103 (numerisanje po Kabatu, videti ispod). BMS3h-56-5 Trp103 formira ivica-prema-licu interakciju sa CD40 Trp109 u jednoj verziji, dok formira smaknutu steking (tj., lice-prema-licu) interakciju u drugim verzijama.
[0049] Statistika komplementarnosti oblika, Sc, za sedam verzija se kreće u opsegu od 0.70 -0.77, što pokazuje viši stepen komplementarnosti oblika nego za tipične antitelo/antigen komplekse. Na primer, ove vrednosti se upoređuju sa opsegom od 0.71 - 0.76 za četiri kompleksa proteaza/inhibitor proteina, 0.70 - 0.74 za pet oligomernih mesta interakcije, i 0.64 - 0.68 za šest antitelo/antigen kompleksa. Videti Lawrence et al., "Shape Complementarity at Protein/Protein Interfaces," J. Mol. Biol.234: 946-950 (1993).
[0050] Model humanog CD40/BMS3H-56-5 kompleksa je prikazan na SL.1. Jedno BMS3h-56-5 dAt se vezuje za jedan CD40 molekul. BMS3h-56-5 epitop ne preklapa epitop Chi220 Fab' fragmenta. Sve verzije kompleksa definišu skup CD40 ostataka koji kontaktiraju BMS3h-56-5: Trp109, Leu121, His122, Ser124, Ser156, Ala157, Phel58, Glu159, i His162 (sa referencom SEQ ID NO: 1). CD40 ostaci koji su u kontaktu sa BMS3h-56-5 u nekim verzijama kompleksa su Pro85, Asn86, Leu87, Gly88, Glu106, Glu107, Gly108, His110, Thr112, Cys119, Val120, Gln133, Ile134, Ala135, Thr136, Ser155, i Lys160. Val154 je prekriven CD40 ostatak u svim verzijama. Drugi CD40 ostaci prekriveni u nekim verzijama su Ser118, Arg123, Thr141, Phe151, Asp153, Cys161, i Pro163.
[0051] Kao što je ovde primenjeno, termin "u kontaktu" se odnosi na međuatomsko rastojanje čiji maksimum je određen pomoću zavisnosti rastojanja od tipa atoma kao što je definisano od strane Sheriff et al., J. Mol. Biol. 197: 273-296 (1987) and Sheriff, Immunomethods 3: 191-196 (1993).
[0052] Kao što je ovde primenjeno, termin "prekriven" se odnosi na ostatak koji ima najmanje jedan atom sa površinom definisanom pomoću programa MS (Connolly, J. Appl. Crystallogr. 16: 548-558 (1983)), sfernu probu od 1.7Å, i Van der Valsovim radijusima zavisnim od tipa atoma kao što je definisano od strane Sheriff, Immunomethods 3: 191-196 (1993).
[0053] SL. 2 prikazuje površinu BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) uključujući kontaktirajuće ostatke i prekrivene ostatke. CD40 (SEQ ID NO: 1) je predstavljen kao dijagram u vidu trake sa narandžasto predstavljenom neponavljajućom sekundarnom strukturom i purpurno-crveno predstavljenim ostacima epitopa. CD40 ostaci Trp109, Ala115, Leu121, Ser126, i His162, koji su prikazani, se razlikuju u raznim ne-humanim sekvencama primata. CD40 ostaci Ala115 i Ser126 su na suprotnoj strani BMS3h-56-5 vezujućeg mesta. Trpl09 i Leu121 se vezuju u brazdi koja leži između CDR3 i FR-2 (ostaci Leu45 i Arg47) u BMS3h-56-5. His162 interaguje sa ostacima u CDR2 od BMS3h-56-5, naročito Lys 56. Ukratko, CD40 epitop sadrži jedan ili više ostataka navedenih u TABELI 1, pozivajući se na numerisanje primenjeno u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1.
TABELA 1
[0054] BMS3h-56-5, kao ostala dAt-a navedena u TABELI 3, je pripremljen ispitivanjem i metodom sazrevanja afiniteta detaljnije opisanom niže, primenom humanog CD40 kao antigena. Očekuje se da će dAt-a kreirana sazrevanjem afiniteta iz zajedničkog prekursora dAt vezivati isti humani CD40 epitop. Studije kompeticije opisane ispod, na primer, ukazuju da se dAt-a stvorena od zajedničkog prekursora dAt-a pomoću sazrevanja afiniteta takmiče
1
jedni sa drugima za vezivanje za humani CD40. Iste studije kompeticije, međutim, prikazuju se dAt-a ne takmiče sa najmanje Chi220 ili G28-5 antitelima.
3. Polipeptidi antitela
[0055] Polipeptidi antitela predmetnog pronalaska sadrže varijabilni domen koji je pojedinačni varijabilni domen sposoban za specifično i monovalentno vezivanje CD40. U jednom tehničkom rešenju, polipeptidi antitela su u obliku dAt-a koje sadrži pojedinačni varijabilni domen. Kompletni molekuli imunoglobulina sadrže dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani pomoću disulfidnih veza. Amino terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni domen (VLili VH) od oko 100-110 aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena preko regiona koji određuju komplementarnost (CDR-i) koji su tamo sadržani. Karboksi-terminalna "polovina" svakog teškog lanca definiše konstantni region (Fc) primarno odgovoran za efektorsku funkciju.
[0056] Termin "polipeptidi antitela" uključuju polipeptide stvorene pomoću rekombinantnog inženjeringa i eksprimiranja, kao i monoklonska antitela proizvedena prirodnom rekombinacijom i sekrecijom od strane klonova hibridoma ćelija.
[0057] Laki lanci su klasifikovani kao kapa (κ) ili lambda (λ), i odlikuje ih poseban konstantni region, CL, kao što je poznato u oblasti. Teški lanci su klasifikovani kao γ, µ, α, δ, ili ε , i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE, redom. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i četiri domena (CH1, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE. Anti-CD40 antitela mogu imati konstantni region teškog lanca odabran iz bilo koje klase imunoglobulina (IgA, IgD, IgG, IgM, i IgE).
[0058] Svaki varijabilni domen lakog lanca (VL) i varijabilni domen teškog lanca (VH) se sastoji od tri CDR-a i četiri okvirna regiona (framework regions - FR-a), raspoređenih od amino-terminalnog dela do karboksi-terminalnog dela sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Tri CDR-a lakog lanca su naznačeni kao "LCDR1, LCDR2, i LCDR3" i tri CDR-a teškog lanca su naznačeni kao "HCDR1, HCDR2, i HCDR3."
[0059] Kao što je ovde primenjeno, termin "Fc domen" se odnosi na sekvence konstantnog regiona antitela koji sadrži CH2 i CH3 konstantne domene kao što je definisano u skladu sa Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izdanje, U.S. Dept. Health & Human Services, Vašington, D.C. (1991). Fc region može biti izveden iz IgG1 ili IgG4 Fc regiona, na primer. Varijabilni domen može biti fuzionisan sa Fc domen. U ovom slučaju, karboksil
1
terminalni deo varijabilnog domena (bilo VLili VHdomen, uključujući dAt-a) može biti vezan ili fuzionisan za amino terminalni deo Fc CH2 domena. Alternativno, karboksil terminalni deo varijabilnog domena može biti vezan ili fuzionisan sa amino terminalnim delom CH1 domena, koji je sam fuzionisan sa Fc CH2 domenom. Protein može sadržati zglobni region između CH1 i CH2 domena u celini ili delimično.
[0060] CDR-i sadrže većinu ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Kao što je prikazano na SL. 2, na primer, CDR2 i CDR3, plus FR4 ostatak Trp103, formiraju većinu kontakata između CD40 i dAt-a BMS3h-56-5. Na primer, varijabilni domen polipeptida antitela sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 regione koji imaju istu aminokiselinsku sekvencu kao CDR1, CDR2, i CDR3 regioni jednog od dAt-a navedenih u TABELI 3 ili koji se svaki razlikuje od CDR1, CDR2, i CDR3 regiona po jednoj ili dve aminokiseline. Na primer, polipeptid antitela može sadržati CDR1, CDR2, i CDR3 regione koji imaju istu aminokiselinsku sekvencu kao CDR1, CDR2, i CDR3 regioni u BMS3h-56-5, BMS3h-56-258, ili BMS3h-56-201, na primer.
[0061] "Domen antitelo" (dAt) sadrži pojedinačni varijabilni (VLili VH) domen koji je sposoban za specifično i monovalentno vezivanje antigena, kao CD40. Na primer, dAt može imati VHHstrukturu, karakterističnu za kamilje dAt. "VHdomen" kao što je ovde primenjeno treba da uključi VHHstrukturu. dAt-a mogu formirati homo- ili heterodimere u rastvoru. Veruje se da bivalentna anti-CD40 antitela ispoljavaju agonističku aktivnost zbog sposobnosti da unakrsno vezuju CD40 molekule na površini ćelije. Iako nije ograničena bilo kojom posebnom teorijom, veruje se da monovalentna dAt-a ne aktiviraju CD40, jer dAt-a ukršteno ne vezuju CD40.
[0062] Kao što je ovde primenjeno, termin "varijabilni domen" se odnosi na varijabilne domene imunoglobulina koje su definisali Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izdanje, U.S. Dept. Health & Human Services, Vašington, D.C. (1991). Numerisanje i pozicioniranje CDR aminokiselinskih ostataka u okviru varijabilnih domena je u skladu sa dobro poznatom konvencijom numerisanja po Kabatu. Na primer, numerisanje po Kabatu za BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) je poređeno u TABELI 2 sa istom sekvencom numerisanom sekvencijalno. U numerisanju po Kabatu, BMS3h-56-5 ima insercione ostatke 52A, 82A, 82B, 82C, a nedostaje ostatak 100. U oba sistema numerisanja, Ser i Thr na N-terminalnom delu koji su deo eksprimirajućeg konstrukta su dobili negativne brojeve.
1
[0063] Termin "humani," kada je primenjen za polipeptide antitela, znači da polipeptid antitela ima sekvencu, npr., FR i/ili CH domene, izvedene iz humanog imunoglobulina. Sekvenca je "izvedena iz" kodirajuće sekvence humanog imunoglobulina kada je sekvenca bilo: (a) izolovana iz humanog pojedinca ili iz ćelije ili ćelijske linije iz humanog pojedinca; (b) izolovana iz bibioteke kloniranih sekvenci gena humanog antitela ili sekvenci varijabilnog domena humanog antitela; bilo (c) preinačena pomoću mutacije i odabira od jednog ili više polypeptida gore pomenutih. "Izolovano" jedinjenje kao što je ovde primenjeno znači da je jedinjenje uklonjeno od najmanje jedne komponente sa kojom je jedinjenje prirodno povezano u prirodi.
[0064] Polipeptidi antitela mogu biti administrirani humanim pacijentima pri čemu se u velikoj meri izbegava anti-antitelo imuni odgovor često izazvan administracijom antitela iz drugih vrsta, npr., mišije. Na primer, mišija antitela mogu biti "humanizovana" graftovanjem mišijih CDR-a na humani varijabilni domen FR, u skladu sa procedurama dobro poznatim u oblasti. Humana antitela kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti, ipak, mogu biti proizvedena bez potrebe za genetskom manipulacijom sekvence mišijeg antitela.
[0065] Varijabilni domeni mogu sadržati jedan ili više okvirnih regiona (FR) sa istom aminokiselinskom sekvencom kao odgovarajući okvirni region kodiran genskim segmentom humanog “germline” antitela. Na primer, domen antitelo može sadržati VH“germline” genske segmente DP47, DP45, ili DP38, Vκ“germline” genski segment DPK9, JHsegment JH4b, ili Jκsegment Jκ1.
[0066] Promene mogu biti napravljene na polipeptidnim sekvencama antitela pri čemu se zadržava sposobnost da se specifično veže CD40. Specifično, polipeptidi antitela (npr., dAt)
1
mogu sadržati varijantu varijabilnog domena koja zadržava funkciju specifičnog vezivanja istog CD40 epitopa kao dAt-o BMS3h-56-5. Videti TABELU 1. To jest, varijanta varijabilnog domena može vezati humani CD40 epitop koji sadrži najmanje jednu od Trp109, Leu121, His122, Ser124, Ser156, Ala157, Phe158, Glu159, i His162 SEKVENCE SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1. Varijanta varijabilnog domena epitopa može sadržati Trp109, Leu121, His122, Ser124, Ser156, Ala157, Phe158, Glu159, i His162. Alternativno, varijanta varijabilnog domena može specifično vezivati CD40 epitop koji sadrži CD40 ostatak Trp109. Varijanta varijabilnog domena se može takmičiti sa BMS3h-56-5 za specifično vezivanje za CD40. Grešci-sklono sazrevanje afiniteta, kao što je u primerima ispod stavljeno na uvid javnosti, obezbeđuje jednu metodu kao tipičan primer za pravljenje i identifikaciju polipeptida antitela sa raznim sekvencama koje specifično vezuju isti CD40 epitop.
[0067] Na primer, varijanta varijabilnog domena može se razlikovati od jednog od varijabilnih domena navedenih u TABELI 3 po do 10 aminokiselina ili bilo kojoj integralnoj vrednosti između, gde varijanta varijabilnog domena specifično vezuje CD40. Alternativno, varijanta varijabilnog domena može imati najmanje 90% identiteta sekvence (npr., najmanje 92%, 95%, ili 98% identiteta sekvence) u odnosu na sekvencu navedenu u prisutnoj sekvencionoj listi. Neidentični aminokiselinski ostaci ili aminokiseline koje se razlikuju između dve sekvence mogu predstavljati aminokiselinske supstitucije, adicije, ili brisanja. Ostaci koji se razlikuju između dve sekvence se pojavljuju kao neidentične pozicije, kada su dve sekvence poravnane bilo kojim podesnim algoritmom za poravnanje aminokiselinskih sekvenci, kao što je BLAST.
[0068] Obezbeđeno je da aminokiselinske supstitucije mogu biti izvršene na pojedinačnim FR regionima, takvim da jedan ili više FR sadrži do dve aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg FR kodiranog genskim segmentom humanog “germline” antitela. Dodatno je obezbeđeno da varijanta varijabilnog domena može sadržati jednu ili dve aminokiselinske zamene u jednom ili više CDR. Reprezentativni varijabilni domeni koji specifično vezuju CD40 su navedeni u TABELI 3.
[0069] ClustalW2 poravnanja između reprezentativnih varijabilnih domena polipeptida antitela iz loza BMS3h-56, BMS3h-37, BMS3h-38, i BMS3h-198 su prikazanog na SL. 4, SL. 5, SL.6, i SL.7, redom. Kao opšte pravilo, stepen do koga je aminokiselina sačuvana u poravnanju povezanih proteinskih sekvenci je proporcionalan odgovarajućem značaju
1
pozicije aminokiseline pozicije prema funkciji proteina. To jest, aminokiseline koje su zajedničke u svim povezanim sekvencama verovatno igraju važnu ulogu i ne mogu biti lako supstituisane. S druge strane, pozicije koje variraju između sekvenci verovatno mogu biti supstituisane sa drugim aminokiselinama ili drugačije modifikovane, pri čemu se zadržava aktivnost proteina. Poravnanja prikazanog na SL. 4, SL. 5, SL. 6, i SL. 7 i strukturne veze utvrđene iz SL. 1 i SL. 2, na primer, mogu voditi građenje raznih polipeptida antitela koji specifično vezuju epitop humanog CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, gde se polipeptid antitela takmiči sa vezivanjem dAt-a BMS3h-56-201 (SEQ ID NO: 9). Ovako različiti polipeptidi antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, one sa modifikacijom aminokiseline koja odgovara supstituciji, umetanju, ili brisanju u odnosu na bilo koji od varijabilnih domena navedenih u TABELI 3. Različiti polipeptidi antitela takođe uključuju one sa aminokiselinskom modifikacijom koja odgovara aminokiselinskoj modifikaciji sačuvanoj između sekvenci navedenih u TABELI 3.
[0070] Informacije u vezi granica VLili VHdomena gena teškog i lakog lanca mogu biti upotrebljene da se dizajniraju PCR (Polimerazna lančana reakcija) prajmeri kako bi se amplifikovao varijabilni domen iz klonirane kodirajuće sekvence teškog ili lakog lanca koja kodira polipeptid antitela za koji se zna da vezuje CD40. Prošireni varijabilni domen može biti umetnut u pogodan ekspresioni vektor, npr., pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137) i eksprimiran, bilo zasebno ili kao fuzija sa drugom polipeptidnom sekvencom, primenjujući tehnike dobro poznate u oblasti. Na osnovu aminokiselinskih i polinukleotidnih sekvenci stavljenih na uvid javnosti, fuzioni protein može biti proizveden i prečišćen primenom samo obične veštine u bilo kojoj pogodnoj ćelijskoj liniji domaćina sisara, kao što su CHO, 293, COS, NSO, i slično, followed by prečišćavanje primenom jedne ili kombinacije metoda, uključujući protein A afinitetnu hromatografiju, izmenu jona, tehnike reverznih faza, ili slično.
[0071] U jednom aspektu, polipeptid antitela je "dvojno specifičan" polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji specifično vezuje humani CD40 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1. Dvojno specifični polipeptidi antitela sadrže drugi varijabilni domen koji specifično vezuje drugi antigen koji nije humani CD40.
[0072] U drugom tehničkom rešenju, drugi antigen može biti molekul ćelijske površine ćelije imunog efektora ili rastvorljiv molekul kao što je citokin, na primer. Vezivanje polipeptida antitela dvojne specifičnosti može biti upotrebljeno da se antagonizuje CD40 i antagonizuje
2
biološka aktivnost drugog antigena. Molekuli ćelijske površine ćelija imunog efektora uključuju molekule klaster diferencijacije (CD). Reprezentativni CD markeri su navedeni na internetu u protokolu za prenos hiperteksta en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters of _differentiation (poslednji modifikovan 22. februara 2012). Molekuli ćelijske površine ćelija imunog efektora takođe uključuje molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II. Antitela na ove molekula ćelijske površine su poznata u oblasti i mogu biti upotrebljena kao izvor varijabilnog domena da se konstruiše dvojno specifični polipeptid antitela.
[0073] U jednom tehničkom rešenju, polipeptidi antitela dvojno specifičnog liganda mogu biti vezani pomoću "aminkiselinskog veznika" ili "veznika." Na primer, dAt-o može biti fuzionisano za N-terminalni deo aminokiselinskog veznika, i drugo dAt-o može biti fuzionisano za C-terminalni deo veznika. Iako aminokiselinski veznici mogu biti bilo koje dužine i sastojati se od bilo koje kombinacije aminokiselina, dužina veznika može biti relativno mala (npr., pet ili manje aminokiselina) da smanji interakcije između povezanih domena. Aminokiselinska kompozicija veznika takođe može biti podešena da smanji broj aminokiselina sa krupnim bočnim lancima ili aminokiselina koje će verovatno uvesti sekundarnu strukturu. Pogodni aminokiselinski veznici uključuju, ali nisu ograničeni na, one sa dužinom do 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, ili 25 aminokiselina. Representativne sekvence aminokiselinskog veznika uključuju (GGGGS)n(SEQ ID NO: 4), gde n može biti bilo koji ceo broj između 1 i 5. Druge pogodne sekvence veznika mogu biti odabrane iz grupe koja se sastoji od AST (SEQ ID NO: 5), TVAAPS (SEQ ID NO: 6), TVA (SEQ ID NO: 7), i ASTSGPS (SEQ ID NO: 8).
[0074] Vezivanje drugog antigena može povećati in vivo polu-život polipeptida antitela. Na primer, drugi varijabilni domen dvojno specifičnog polipeptida antitela može specifično vezivati serumski albumin (SA), npr., humani serumski albumin (HSA). Polipeptid antitela formatiran da vezuje HSA može imati povećani in vivo t-α ("alpha polu-život") ili t-β ("beta polu-život") polu-život u odnosu na isti neformatirani polipeptid antitela. Polu-životi t-α i t-β mere koliko brzo se supstanca distribuira unutar i eliminiše iz tela. Veza sa HSA može biti postignuta fuzijom polipeptida antitela sa drugim varijabilnim domenom sposobnim za specifično vezivanje HSA, na primer. Antitela anti-humanog serumskog albumina su dobro poznata u oblasti. Videti, npr., Abeam®, Human Serum Albumin Antitela ab10241, ab2406, and ab8940, dostupno na internetu u protokolu transfera hiperteksta www.abcam.com/index.html, ili GenWay, ALB antibody, dostupno na internetu u protokolu transfera hiperteksta www.genwaybio.com. Varijabilni domeni koji specifično vezuju HSA mogu biti dobijeni iz bilo kojeg od ovih antitela, i potom fuzionisani za polipeptid antitela objave primenom rekombinantnih tehnika koje su dobro poznate u oblasti.
[0075] Alternativno, vezivanje polipeptida antitela za HSA može biti postignuto direktno fuzijom sekvence polipeptida antitela za HSA kodirajuću sekvencu primenom tehnika dobro poznatih obučenom poznavaocu oblasti. HSA kodirajuće sekvence mogu biti dobijene pomoću PCR koja primenjuje prajmere izvedene iz kDNK sekvence dostupne u GenBank sa pristupnim brojem NM000477, na primer.
[0076] U jednom tehničkom rešenju, tα-polu-život kompozicije HSA-vezanog domena antitela je povećan za 10% ili više. U drugom tehničkom rešenju, tα-polu-život kompozicije HSA-vezani domen antitela je u opsegu od 0.25 sati do 6 sati. U drugom tehničkom rešenju, tβ-polu-život kompozicije HSA-vezanog domena antitela je povećan za 10% ili više. U drugom tehničkom rešenju, tβ-polu-život kompozicije HSA-vezanog domena antitela je u opsegu od 12 do 48 sati.
[0077] U drugom tehničkom rešenju, polipeptid antitela može biti formatiran da se poveća njegov in vivo polu-život pomoću PEGilacije. U jednom tehničkom rešenju, PEG je kovalentno vezan. U drugom tehničkom rešenju, PEG je vezan za polipeptid antitela na cistein ili lizin ostatku. U još jednom tehničkom rešenju, PEG-vezani polipeptid antitela ima hidrodinamičku veličinu od najmanje 24 kD. U još jednom tehničkom rešenju, ukupna veličina PEG-a je od 20 do 60 kD, zaključno. U još jednom tehničkom rešenju, PEG-vezani domen antitela ima hidrodinamičku veličinu od najmanje 200 kD.
[0078] PEGilacija može biti postignuta primenom nekoliko PEG veznih delova uključujući, ali bez ograničenja na N-hidroksilsukcinimid aktivni estar, sukcinimidil propionat, maleimid, vinil sulfon, ili tiol. PEG polimer može biti vezan za polipeptid antitela na bilo prethodno određenoj poziciji, ili može biti nasumično vezan za molekul domen antitela. PEGilacija može takođe biti posredovana preko peptidnog veznika vezanog za domen antitelo. To jest, PEG deo može biti vezan za peptidni veznik fuzionisan na polipeptid antitela, gde veznik obezbeđuje mesto (npr., slobodan cistein ili lizin) za PEG vezivanje. Metode PEGilacije antitela su dobro poznate u oblasti, kao što je stavljeno na uvid javnosti u Chapman, et al., "PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review," Adv. Drug Deliv. Rev.54(4):531-45 (2002), na primer.
[0079] Polipeptidi antitela takođe mogu biti dizajnirani da formiraju dimer, trimer, tetramer, ili drugi multimer. Polipeptidi antitela, npr., dAt-a, mogu biti vezani da formiraju multimer pomoću nekoliko metoda poznatih u oblasti, uključujući, ali bez ograničenja na, eksprimiranje monomera kao fuzionog proteina, vezivanje dva ili više monomera putem peptidnog veznika između monomera, ili putem hemijskog udruživanja monomera nakon translacije, bilo direktno među sobom, ili preko veznika pomoću disulfidnih veza, ili vezivanjem za di-, tri- ili multivalentni vezujući deo (npr., PEG sa više lanaca). U jednom tehničkom rešenju, multimer može vezati pojedinačni molekul CD40.
4. Farmaceutske kompozicije i metode lečenja
[0080] Farmaceutska kompozicija sadrži terapijski-efikasnu količinu jednog ili više polipeptida antitela i po izboru farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, fosfatom puferovan fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol i slično, kao i njihove kombinacije. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dodatno sadržavati manje količine pomoćnih supstanci, kao što su vlažeći ili emulgujući agensi, konzervansi, ili puferi koji povećavaju polu-život ili efikasnost fuzionisanog proteina. Kompozicije mogu biti formulisane da obezbede brzo, produženo, ili odloženo oslobađanje aktivnog sastojka (aktivnih sastojaka) nakon administracije. Pogodne farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu pripremu su dobro poznati u oblasti. Videti, npr., Remington, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds., 21. izdanje, Mack Publishing Co. (2005).
[0081] Farmaceutska kompozicija dalje može sadržati imunosupresivni/imunomodulatorni i/ili anti-inflamatorni agens. Metoda lečenja imune bolesti kod pacijenta kod koga postoji potreba za ovakvim lečenjem može obuhvatiti administriranje pacijentu terapijski efikasne količine farmaceutske kompozicije. Antagonizovanje T ćelijske aktivacije posredovane pomoću CD40 moglo bi inhibirati neželjene T ćelijske odgovore koji se javljaju tokom autoimunosti, odbacivanja transplantata, ili alergijskih odgovora, na primer. Inhibiranje T ćelijske aktivacije posredovane pomoću CD40 bi moglo ublažiti progresiju i/ili ozbiljnost ovih bolesti.
[0082] Kao što je ovde primenjeno, "pacijent" podrazumeva životinju, npr. sisara, uključujući ljude. Kod pacijenata može biti dijagnostifikovana imuna bolest. "Tretman" ili "lečiti" ili "lečenje" se odnosi na proces koji uključuje ublažavanje progresije ili ozbiljnosti simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti. "Imuna bolest" se odnosi na bilo koju bolest povezanu sa
2
razvojem imune reakcije kod pojedinca, uključujući ćelijsku i/ili humoralnu imunu reakciju. Primeri imunih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, inflamaciju, alergiju, autoimunu bolest, ili bolest povezanu sa graftom. Autoimuna bolest može biti odabrana od grupe koja se sastoji od sistemskog eritemskog lupusa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, dijabetesa, psorijaze, skleroderme, ateroskleroze, inflamatorne bolesti creva, i ulcerativnog kolitisa.
[0083] Bolesti koje mogu biti lečene administracijom farmaceutske kompozicije mogu biti odabrane iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimune bolesti uha, autoimune bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 dijabetes, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenijske purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na rekombinantne proizvode leka (npr., Faktor VII kod hemofiličara), sistemskog eritemskog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, miastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tireoiditisa, odbacivanja transplantata, i vaskulitisa. Autoimuno-posredovana stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, stanja u kojima je pogođeno tkivo primarni cilj, i u nekim slučajevima, sekundarni cilj. Ovakva stanja uključuju, ali nisu ograničena na, AIDS, atopijsku alergiju, bronhijalnu astmu, ekcem, lepru, šizofreniju, naslednu depresiju, transplantaciju tkiva i organa, sindrom hroničnog umora, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, infarkt miokarda, moždani udar, autizam, epilepsiju, Arthus-ov fenomen, anafilaksu, zavisnost od alkohola, i zavisnost od lekova.
[0084] Farmaceutska kompozicija može biti administrirana zasebno ili u kombinovanoj terapiji, (tj, istovremeno ili redom) sa imunosupresivnim/imunomodulatornim i/ili antiinflamatornim agensom. Različite imune bolesti mogu zahtevati primenu specifičnih pomoćnih jedinjenja korisnih za lečenje imunih bolesti, koja se mogu odrediti na bazi “pacijent-pacijentu”. Na primer, farmaceutska kompozicija može biti administrirana u kombinaciji sa jednim ili više pogodnih ađuvanasa, npr., citokina (IL-10 i IL-13, na primer) ili drugih imunih stimulatora, npr., hemokina, antigena u vezi sa tumorom, i peptida. Pogodni ađuvansi su poznati u oblasti.
[0085] Bilo koja pogodna metoda ili put se mogu primeniti za administraciju polipeptida antitela ili farmaceutske kompozicije. Putevi administracije uključuju, na primer, oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, ili intramuskularnu administraciju. Terapijski efikasna doza administriranog(administriranih) polipeptida antitela zavisi od brojnih faktora, uključujući, na primer, tip i ozbiljnost tretirane imune bolesti, primenu kombinovane terapije, put administracije polipeptida antitela ili farmaceutsku kompoziciju, i masu pacijenta. Neograničavajući opseg za terapijski efikasnu količinu domen antitela je 0.1-20 mg/kg, i u jednom aspektu, 1-10 mg/kg, u odnosu na telesnu masu pacijenta. Doza polipeptida antitela može dodatno biti određena količinom polipeptida antitela potrebnog(ih) za CD40 antagonizam u in vitro i/ili in vivo modelima stanja bolesti. Reprezentativni modeli su opisani ispod i u primerima.
5. In Vitro i In Vivo Modeli
[0086] Sposobnost polipeptida antitela predmetne objave da antagonizuju CD40 može biti ispitana u jednom od nekoliko dostupnih in vitro ili in vivo modela sistema. Prikladni životinjski i ćelijski modeli sistema su opisani ispod. Dodatni sistemi ćelijskog testiranja su opisani u primerima.
5.1. Modeli inflamatorne bolesti creva (Inflammatory bowel disease - IBD):
[0087] IBD je multifaktorijalni imuni poremećaj nesigurne etiologije. Nekoliko mišijih modela inflamacije mukoze koji podsećaju na IBD su obezbedili uvid u mehanizme koji upravljaju i normalnom i patološkom imunom funkcijom mukoze. IBD modeli uključuju primenu sistema mukoznog imuniteta i inflamacije po De Winter et al., Am. J. Physiol. 276: G1317-1321 (1999). U jednom aspektu, injektiranje podskupa CD4(+) T limfocita, CD4(+)CD45RBhigh ćelija, u imunodeficijentne miševe, dovodi do inflamacije creva. Patogeneza je delimično posledica sekrecije proinflamatornih citokina. Indukcija kolitisa može biti sprečena ko-transferom druge CD4(+) podpopulacije, CD4(+)CD45RBlow T ćelija. Ova populacija se ponaša analogno CD4(+)CD45RBhigh populaciji u pogledu sticanja markera aktivacije i vraćanja u creva domaćina. Međutim, njihov profil limfokina kada su aktivirane je različit, i anti-inflamatorni citokini koje sekretuju i/ili indukuju CD4(+)CD45RBlow T ćelije sprečavaju kolitis. De Winter et al. obezbeđuju opis modela adoptivnog transfera i faktore koji promovišu i sprečavaju patogenezu kolitisa.
5.2. Modeli spontanog artritisa:
[0088] Model organ-specifične bolesti izazvane sistemskom autoimunošću su obezbedili Kouskoff et al., Cell 87: 811-822 (1996). Reumatoidni artritis (RA) je hronična bolest
2
zglobova okarakterisana invazijom leukocita i aktivacijom sinoviocita što je praćeno razaranjem hrskavice i kostiju. Kouskoff et al. stavljaju na uvid javnosti spontani mišiji model RA, generisan ukrštanjem transgene linije T ćelijskih receptora (T cell receptor - TCR) sa NOD lozom. Svi potomci razvijaju bolest zglobova koja veoma podseća na RA kod čoveka. Okidač za poremećaj kod miševa je slučajno prepoznavanje NOD-izvedenog molekula glavnog histokompatibilnog kompleksa (major histocompatibility complex - MHC) klase II transgenim TCR-om; progresija do artritisa uključuje CD4+ T, B, i verovatno mijeloidne ćelije.
5.3. Model artritisa koji je indukovan kolagenom (Collagen Induced Arthritis - CIA):
[0089] Mišiji model artritisa koji je indukovan kolagenom su obezbedili Brand et al., Methods Mol. Med. 102: 295-312 (2004). Kolagenom indukovan artritis (CIA) je autoimuna bolest koja može biti izazvana u osetljivim lozama glodara (pacov i miš) i ne-humanih primata imunizacijom sa kolagenom tipa II (CII), glavnim proteinskim sastojkom zglobne hrskavice. Nakon imunizacije, kod životinja se razvija autoimuni poliartritis koji deli nekoliko kliničkih i histoloških osobina sa RA. Osetljivost na CIA kod glodara je povezana sa molekulima klase II glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC), i imuni odgovor na CII je okarakterisan i stimulacijom kolagen-specifičnih T ćelija i proizvodnjom visokih titara antitela specifičnog i za imunogen (heterologni CII) i autoantigen (mišiji CII). Histološki, mišiji CIA je okarakterisan jakim sinovitisom koji odgovara kliničkom početku artritisa. Ovi eksperimentalni podaci su korisni za procenu CIA zbog patoloških sličnosti između CIA i RA.
5.4. In Vivo model antigenom indukovane proliferacije T ćelija:
[0090] Primena adoptivnog transfera T ćelijski receptor (TCR)-transgene T ćelije obezbeđuje in vivo model za T ćelijsku proliferaciju indukovanu antigenom. Pape et al., Immunol. Rev.
156: 67-78 (1997) stavlja na uvid javnosti adoptivni transfer TCR-transgene T ćelije koji uniformno eksprimira prepoznatljiv TCR poznate peptid/MHC specifičnosti. Model može biti primenjen da se prati in vivo ponašanje antigen-specifičnih T ćelija. Naivne T ćelije su inicijalno aktivirane u T-ćelijskim zonama sekundarnog limfoidnog tkiva da bi proliferisale na B7-zavisan način. Ukoliko su ađuvansi ili inflamatorni citokini prisutni tokom ovog perioda, povećani broj T ćelija se akumulira, migrira u folikule bogate B-ćelijama, i stiču kapacitet da se proizvodi IFN-γ i pomažu B ćelijama da proizvode IgG2a. Ukoliko je
2
inflamacija efikasno antagonizovana, većina inicijalno aktiviranih antigen-specifičnih T ćelija nestaje bez ulaska u folikule, i preostale su slabi proizvođači IL-2 i IFN-γ.
PRIMERI
[0091] TABELA 3 navodi reprezentativne aminokiselinske sekvence varijabilnog domena anti-humanog CD40 korisne za polipeptide antitela predmetne objave. TABELA 4 stavlja na uvid javnosti reprezentativne nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence varijabilnog domena navedene u TABELI 3. Kao što je dobro poznato u oblasti, više kodona može kodirati istu aminokiselinu. Nukleinske kiseline koje kodiraju proteinsku sekvencu prema tome uključuju nukleinske kiseline koje imaju degeneraciju kodona. Polipeptidi antitela stavljeni na uvid javnosti u TABELI 3 specifično vezuju CD40 i napravljeni su primenom ponavljajućih metodologija inicijalnih/primarnih skrininga i sazrevanja afiniteta opisanih u primerima koji slede.
TABELA 3
2
2
2
1
2
4
4
4
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
TABELA 4
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 2
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 4
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 2
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 4
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 2
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 4
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 2
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 4
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 2
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1 4
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
1
Kodirajuće nukleotidne sekvence humanog anti-CD40 varijabilnog domena
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
Primer 1
Stvaranje varijabilnih domena humanog anti-CD40
BMS3h-1 do BMS3h-225
[0092] Sledeći primer opisuje stvaranje serija varijabilnih domena anti-humanog CD40, naznačenih BMS3h-1 do BMS3h-225. Nakon rekombinantnog eksprimiranja repertoara varijabilnih domena pojedinačnog imunoglobulina na površini faga, odabir je izvršen kontaktom repertoara faga imobilisanim ciljnim antigenom, ispiranjem da se ukloni nevezani fag, i propagiranjem vezanog faga. Ovaj proces se često naziva "paning." Primenljiv je za ispitivanje varijabilnih domena pojedinačnog imunoglobulina, kao i drugih fragmenata antitela koji mogu biti eksprimirani na prikazu biblioteke, npr., scFv, Fab, i Fab'. Alternativno, fag može biti unapred izabran za eksprimiranje ispravno preklopljenih varijanti članova pomoću paninga protiv imobilizovanog generičkog liganda (npr., protein A ili protein L) koji je samo vezan preklopljenim članovima. Ovo ima prednost smanjenja udela nefunkcionalnih članova, čime se povećava udeo članova koji će verovatno vezati ciljni antigen. Prethodni odabir sa generičkim ligandima je razmatran u WO 99/20749, na primer. Ispitivanje biblioteka antitela faga je uopšteno opisano, na primer, od strane Harrison et al., Meth. Enzymol. 267: 83-109 (1996).
[0093] Ispitivanje se obično izvodi primenom prečišćenog antigena imobilizovanog na čvrstoj podlozi, na primer, plastičnim epruvetama ili bunarićima, ili na hromatografskom matriksu, na primer Sepharose™ (Pharmacia). Ispitivanje ili odabir može biti takođe izveden na složenim antigenima, kao što je površina ćelija (Marks et al., BioTechnology 11: 1145
21
(1993); Kruif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 92: 3938 (1995)). Druga mogućnost uključuje odabir vezivanjem biotinilovanog antigena u rastvoru, nakon čega sledi hvatanje na zrncima premazanim streptavidinom.
Klonovi BMS3h-1 do BMS3h-69:
[0094] Tri kruga odabira koji primenjuju opadajuće koncentracije antigena (100 nM u prvom krugu; 10 nM u drugom krugu; 1 nM u trećem krugu) su izvedena paralelno na biotinilovani humani CD40 monomer (snabdeven BMS-om, 1.5 mola biotina / mol CD40) i biotinilovani humani CD40-Ig (snabdeven BMS-om, 3.3 mola biotina / mol CD40-Ig). Fagi iz naivnih 4G i 6G Domantis biblioteka dAt-a su kombinovani kao što sledi pre iniciranja odabira:
1) 4G 6G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina.
2) 4G 6G VH CDR3 dužine između 10 - 12 aminokiselina.
3) 4G 6G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina.
4) 4GVK
5) 6GVK
[0095] Svaki krug odabira uključuje dodavanje željene koncentracije antigena u smešu od 750 µl faga iz jednog od rezervoara naivne biblioteke ili sledstvenog odabira izlaznog faga i 750 µl PBS-a+2% Marvel-a (fosfatom puferovani fiziološki rastvor koji sadrži 2% (m/v) Marvel [Premier Foods, Ujedinjeno Kraljevstvo]) i inkubaciju na sobnoj temperaturi tokom 1 sata uz mešanje rotacijom. Kompleks biotinilovanog antigena faga je potom uhvaćen dodavanjem 100 µl resuspendovanog Dynabeads® M-280 Streptavidin-a [Invitrogen, Ujedinjeno Kraljevstvo] i inkubiran 5 minuta uz mešanje s kraja na kraj na sobnoj temperaturi. Dynabeads® su potom obnovljene primenom KingFisher magnetnog separatora [Thermo Fisher Scientific, Ujedinjeno Kraljevstvo] i isprane 7 x 1 ml PBS-a 0.1% Tween 20 (PBS koji sadrži 0.1% (v/v) polioksietilensorbitan monolaurata [Sigma-Aldrich, Ujedinjeno Kraljevstvo], PBST) što je praćeno 1 x 1 ml PBS-om. Vezani fagi zadržani na ispranim Dynabeads® su eluirani inkubacijom sa 500 µl tripsin-PBS-a (50 µl 10 mg/ml tripsina [Sigma-Aldrich, Ujedinjeno Kraljevstvo] rastvorenog u 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM CaCl2dodatog u 450 µl PBS-a). Rastvor koji sadrži fage je obnovljen i 250 µl je primenjeno da se zarazi 1.75 ml E. coli TG1 logaritamske faze rasta ( pri OD600od 0.4) tokom 30 minuta na 37°C. E. coli TG1 kultura zaražena fagama je centrifugirana na 11,600 g u mikro centrifugi tokom 1 minuta. Dobijen ćelijski pelet je resuspendovan u 1 ml 2xTY (16
21
g Triptona, 10 g Ekstrakt kvasca i 5 g NaCl u 1 litru, autoklaviran tokom 15 minuta na 121°C) i postavljen u Petri šolju od 9 cm koja sadrži TY dopunjen sa 15 µg/ml tetraciklina. Ploče su inkubirane preko noći na 37°C. Potom je 2 ml 2xTY-a dopunjenog sa 15% glicerola dodato na svaku ploču, i ćelije su razdvojene od podloge staklenim štapićem i dobro promešane. Pedeset mikrolitara ostruganih bakterija je upotrebljeno da se inokulira 50 ml 2xTY-a dopunjenog sa 15 µg/ml tetraciklina i koji je rastao preko noći na 37°C uz mućkanje na 250 rpm. Kultura je nakon noći centrifugirana pri 3,300 g tokom 15 min da se istalože bakterije. Da bi se istaložile fage, 10 ml PEG/NaCl (20% Polietilen glikol 8000, 2.5 M NaCl) je dodato u 40 ml supernatanta. Fage/PEG rastvor je mešan i ostavljen na ledu tokom 1 h, potom obrtan na 3,300 g tokom 30 min na 4°C, i supernatant odbačen. Talog je resuspendovan u 2 ml PBS-a i obrtan pri 11,600 g tokom 10 min u mikro cenrifugi da bi se uklonili preostali bakterijski ostaci. Dobijeni supernatant koji sadrži fage je potom upotrebljen za sledeći krug odabira protiv pogodnog biotinilovanog CD40 antigena.
[0096] ELISA-e monoklonskih faga su sprovedene nakon drugog i trećeg kruga odabira. Sva ispiranja su izvedena primenom 3 ispiranja sa 250 µl PBST-a što je ptaćeno sa 3 ispiranja sa 250 µl PBS-a. Ploče su bile premazane tokom noći na 4°C sa 50 µl/bunariću 1 µg/ml NeutrAvidin-a (Thermo Scientific, Ujedinjeno Kraljevstvo) u 0.2 M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4. Ploče su isprane i potom blokirane sa 2% MPBS-om (2% m/v Marvel obrano mleko u prahu [Premier Foods] u PBS-u) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su potom isprane i inkubirane sa 50 µl/bunariću 0.7 µg/ml biotinilovanog humanog CD40 u 2% MPBS-u. Ploče su isprane, i supernatanti faga su dodati jednakoj zapremini 2% MPBS-a. Ploče su potom inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i vezani fag otkriven sa anti-M13-HRP konjugatom (GE Healthcare, Ujedinjeno Kraljevstvo) razblaženim 1:5000 u 2% MPBS-u i inkubiranom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, i ELISA je razvijena primenom rastvora SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase (KPL Inc, Sjedinjene Američke Države). Specifične fage su identifikovane poređenjem sa pločama premazanim sa NeutrAvidin-om ali bez biotinilovanog CD40. MidiPrep je primenjen da se izoluju V-geni dAt-a iz pDOM4 (Domantis) rezultata drugog kruga i trećeg kruga i kloniraju u pDOM5 (Domantis). pDOM4, stavljen na uvid javnosti u WO 2007/085815, je derivat Fd fag vektora u kojem je sekvenca gena III signalnog peptida zamenjena sa prinosom signalnog peptida glikolipid vezanog površinskog proteina (glycolipid anchored surface protein - GAS)
21
(WO 2005/093074). pDOM4 takođe sadrži c-myc oznaku između vodeće sekvence i gena III, što vraća gen III u okvir.
[0097] Vezivanje dAt-a je identifikovano kao što sledi. Devedeset šest pojedinačnih kolonija (u pDOM5) je izabrano iz svakog izlaza u 200 µL Terrific Broth-a koji sadrži OnEx Autoinduction medijum (Novagen, Ujedinjeno Kraljevstvo) preko noći na 37° C uz mućkanje pri 250 rpm u Costar 96 Well Cell Culture Clusters (Corning Incorporated, SAD). Kulture su centrifugirane da bi se ćelije istaložile, i supernatanti su ispitani pomoću antigen vezujuće ELISA za CD40 vezujuća dAt-a. MaxiSorp imunoploče sa 96 bunarića (Nunc, SAD) su bile preko noći na 4°C premazane sa 50 µl/bunariću 1 µg/ml NeutrAvidin-a u 0.2 M karbonatbikarbonatnom puferu, pH 9.4. Sva ispiranja su bila kao što je opisano za ELISA faga. Ploče su bile blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 200 µl PBS-a koji sadrži 1% Tween 20. Ploča je potom isprana i inkubirana sa 50 µl/bunariću 0.7 µg/ml biotinilovanog humanog CD40 u 0.1% PBST-u. Izbistren supernatant kulture koji sadrži dAt je dodat na ELISA ploču sa jednakom zapreminom 0.1% PBST-a. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i potom isprane. Vezano dAt je detektovano primenom dvostepenog procesa: prvo 9E10 (anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, UK) razblažen 1:2000 u 0.1 % PBST-u je dodavan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi potom ispran, nakon čega anti-mišijim Fc-HRP-om (Sigma-Aldrich, UK) razblaženim 1:2000 u 0.1% PBST-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, i ELISA je razvijen primenom SureBlue 1-komponentnog TMB MicroWell rastvora peroksidaze (KPL Inc, USA). Dopušteno je da se razvije boja, i kolorimetrijska reakcija je zaustavljena dodatkom jednake zapremine 1 M HCl. ELISA ploča je očitana na 450 nm. Specifične fage su identifikovane poređenjem sa pločama premazanim sa NeutrAvidin-om ali bez biotinilovanog CD40.
[0098] Klonovi specifični za CD40 su ispitani u testu vezivanja receptora (receptor-binding assay - RBA) bilo zasnovanom na zrncima bilo na ELISA da bi se procenila inhibicija CD40 ligand vezivanja. Domen antitela koja su pokazala inhibiciju u RBA su ispitana u testu B-ćelijske proliferacije i potom u raznim drugim in vitro ćelijskim testovima. Ovi testovi su opisani detaljnije ispod.
BMS3h-106 do -225:
[0099] BMS3h-106 do -225 su izolovani od odabira protiv biotinilovanog CD40 ili biotinilovanog CD40-Fc kao što je opisano za BMS3h-1 do BMS3h-69, ali sa sledećim
21
modifikacijama. Fagi iz naivnih 4G i 6G biblioteka su kombinovani kao što sledi pre započinjanja odabira:
6) 4G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina.
7) 4G VH CDR3 dužine između 10 - 12 aminokiselina.
8) 4G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina.
9) 6G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina.
10) 6G VH CDR3 dužine između 10 - 12 aminokiselina.
11) 6G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina.
12) 4G VK
13) 6G VK
Prvi krug je izveden pri koncenraciji antigena od 160 nM za CD40-Fc i 100 nM za CD40. Izlazni titri su bili u opsegu 2.0×10<4>do 9.0×10<7>TU/ml (funkcionalni virusni titar).
[0100] Za drugi krug, obogaćeni fagi iz prvog kruga su kombinovani u parovima pre primene u odabirima:
1) 4G 6G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina (rezervoari 1 4 iz prvog kruga).
2) 4G 6G VH CDR3 dužine između 10- 12 aminokiselina (rezervoari 2 5 iz prvog kruga).
3) 4G 6G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina (rezervoari 3+6 iz prvog kruga).
4) 4G 6G VK (rezervoari 7+8 iz prvog kruga)
Odabiri su izvedeni pri koncentraciji antigena od 100 nM, i antigen-fag kompleksi su uhvaćen primenom M-280 tozil-aktiviranog Dynabeads® (Invitrogen) koji je spojen sa NeutrAvidin-om (Thermo Fisher Scientific, UK). Izlazni titri su u opsegu 6.5×10<7>do 7.5×10<8>TU/ml.
[0101] Treći krug je izveden pri koncentraciji antigena od 20 nM i, u slučaju CD40-Fc odabira, u prisustvu 6.7 µM slobodnog humanog Fc kraja (BMS). Izlazni titri su bili u opsegu 4.3×10<7>do 1.6×10<9>TU/ml.
21
[0102] Četvrti krug je izveden kao što je opisano za drugi krug ali pri koncentraciji antigena od 2 nM i u prisustvu i odsustvu 500-strukog viška neobeleženog CD40-Fc. Dodatak ovog konkurenta je učinjen nakon inicijalne jednočasovne inkubacije faga sa biotinilovanim antigenom, i smeša je potom inkubirana preko noći, kao i pre. Ovaj kompetitivni korak je uključen u cilju poboljšanja odabira dAt-a sa sporijom “off-rate”. Izlazni titri su bili u opsegu 1.8×10<7>do 4.4×10<7>bez kompeticije i 1.8×10<6>do 2.3×10<7>TU/ml sa kompeticijom.
[0103] Da bi se pratio napredak odabira, ELISA testovi monoklonskih faga su izvedeni nakon drugog i trećeg kruga. Oni su izvedeni kao što je opisano za BMS3h-1 do BMS3h-69. Vezujuća dAt-a su identifikovana kao što je opisano za BMS3h-1 do BMS3h-69 izuzev što, u slučaju ispitivanja VK biblioteke, protein L je uključen u konačnoj koncentraciji od 8 µg/ml. Dodavanje proteina L je povećalo snagu signala unakrsnim povezivanjem dAt-a.
BMS3h-70 do -105:
[0104] BMS3h-70 do -105 su izolovani od odabira protiv antigena koji je bio pasivno adsorbovan na epruvete za imunoloska ispitivanja. Fagi iz naivnih 4G i 6G Domantis biblioteka dAt-a su kombinovani kao što sledi pre započinjanja odabira:
1) 4G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina.
2) 4G VH CDR3 dužine između 10 - 12 aminokiselina.
3) 4G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina.
4) 6G VH CDR3 dužine između 7 - 9 aminokiselina.
5) 6G VH CDR3 dužine između 10 - 12 aminokiselina.
6) 6G VH CDR3 dužine između 13 - 15 aminokiselina.
7) 4G VK
8) 6G VK
[0105] Za prvi krug odabira, 1 ml 10 µg/ml humane CD40-Fc fuzije (BMS) u 0.2 M karbonatnog-bikarbonatnog pufera, pH 9.4, je dodato u Nunc MaxiSorp epruvetu za imunoloska ispitivanja i potom inkubirano preko noći na 4°C sa talasanjem. Epruveta je potom ispražnjena i tri puta isprana sa fosfatom puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS-om). Epruveta je potom blokirana punjenjem MPBS-om do oboda i inkubirana tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Epruveta je potom ispražnjena i tri puta isprana sa PBS-om. Fag
22
biblioteke u 4 ml MPBS-a su dodati u epruvetu i inkubirani tokom 1 sata sa rotacijom s kraja na kraj na sobnoj temperaturi.
[0106] Epruveta je ispražnjena i isprana 10 puta sa PBST-om (PBS sa 0.1% (v/v) Tween 20). Vezani fagi zadržani na ispranoj epruveti su eluirani pomoću inkubacije sa 500 µl tripsin-PBS-a (50 µl 10 mg/ml tripsina [Sigma-Aldrich, UK] rastvorenog u 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM CaCl2dodatog u 450 µl PBS-a) sa rotacijom s kraja na kraj tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Rastvor koji sadrži fage je obnovljen, i 250 µl je upotrebljno da se zarazi 1.75 ml E. coli TG1 logaritamske faze rasta (pri OD600od 0.4) tokom 30 minuta na 37°C. Kultura E. coli TG1 zaražena fagama je centrifugirana pri 11,600 g u mikrocentrifugi tokom 1 min, i dobijeni ćelijski pelet je resuspendovan u 1 ml 2xTY (16 g Triptona, 10 g Ekstrakta kvasca, i 5 g NaCl u 1 litru. Suspenzija je autoklavirana tokom 15 minuta na 121°C) i postavljena u Petri šolju od 9 cm koja sadrži LB agar dopunjen sa 15 µg/ml tetraciklina. Ploče su inkubirane preko noći na 37°C. Dva mililitra 2xTY dopunjenog sa 15% glicerolom je potom dodato svakoj ploči, i ćelije su odvojene od podloge staklenim štapićem i detaljno promešane.
[0107] Pedeset mikrolitara ostruganih bakterija je upotrebljeno da se inokulira 50 ml 2xTY-a dopunjenog sa 15 µg/ml tetraciklina i koji je rastao preko noći na 37°C uz mućkanje na 250 rpm. Kultura je nakon noći centrifugirana pri 3,300 g tokom 15 min da se istaloži bakterija. Da bi se istaložile fage, 10 ml PEG/NaCl (20% Polietilen glikol 8000, 2.5 M NaCl) je dodato u 40 ml supernatanta. Fage/PEG rastvor je mešan i ostavljen na ledu tokom 1 h. Rastvor je potom obrtan na 3,300 g tokom 30 min na 4°C, i supernatant odbačen. Talog je resuspendovan u 2 ml PBS-a i obrtan pri 11,600 g tokom 10 min u mikro cenrifugi da bi se uklonili preostali bakterijski ostaci. Dobijeni supernatant koji sadrži fage je potom upotrebljen za sledeći krug odabira protiv CD40-Fc antigena. Izlazni titri iz prvog kruga su bili u opsegu 7.5×10<4>do 1.5×10<7>TU/ml (transformacionih jedinica po per ml).
[0108] Drugi krug odabira je izveden primenom obogaćenih faga obnovljenih iz prvog kruga odabira. Ovo je izvedeno tačno kao što je opisano iznad i izlazni titri su bili u opsegu 2.5×10<7>do 1.2×10<8>TU/ml.
[0109] Treći krug odabira je izveden primenom obogaćenih faga obnovljenih iz drugog kruga odabira. Ovo je izvedeno kao što je iznad opisano ali sa koncentracijom antigena od 1 µg/ml. Izlazni titri su bili u opsegu 5.1×10<7>do 7.5×10<8>TU/ml.
[0110] Da bi se pratio napredak odabira, ELISA testovi monoklonskih faga su izvedeni nakon drugog i trećeg kruga. Uzorak pojedinačnih kolonija je unešen u 200 µL 2xTY dopunjenog sa 15 µg/ml tetraciklina i inkubiran preko noci na 37°C sa mućkanjem pri 250 rpm u Costar 96 Well Cell Culture Clusters (Coming Incorporated, SAD). Kulture su centrifugirane da se ćelije peletiraju, i supernatanti su ispitani pomoću antigen vezujuće ELISA za dAt-a CD40-vezjućih faga. Sva ispiranja su izvedena primenom 3 ispiranja sa 250 µl PBST-a nakon čega sledi pomoću 3 ispiranja sa 250 µl PBS-a. MaxiSorp imuno-ploče sa 96 bunarića (Nunc, SAD) su bile premazane preko noći na 4°C sa 50 µl/bunariću 0.5 µg/ml CD40-Fc (BMS-a) u 0.2 M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4. Ploče su isprane i potom blokirane sa 250 µl 2% MPBS-a tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, i supernatanti faga su dodati jednakoj zapremini 2% MPBS-a i inkubirani tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, i vezani fagi su detektovani sa anti-M13-HRP konjugatom (GE Healthcare, UK) razblaženim 1:5000 u 2% MPBS-u i inkubirani tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, i ELISA je razvijen primenom SureBlue 1 -komponentnog TMB MicroWell rastvora peroksidaze (KPL Inc, SAD). Specifična dAt-a faga su identifikovana poređenjem sa pločama premazanim sa slobodnim Fc.
[0111] Geni dAt-a iz svakog od gornjih izlaza odabira drugog i trećeg kruga su pod-klonirani, kao rezervoar, unutar rastvorljivog vektora eksprimiranja pDOM5 u E. coli lozi HB2151. Ovaj vektor je dozvolio eksprimiranje slobodnog dAt-a sa c-myc oznakom (Roche Diagnostics GmbH) u E. coli i sekreciju u supernatant.
[0112] CD40-vezujuća dAt-a iz pasivnih odabira su identifikovana kao što sledi. Devedeset šest pojedinačnih kolonija (u pDOM5) je izabrano iz svakog izlaza u 200 µL Terrific Broth koji sadrži OnEx Autoinduction medijum (Novagen, UK) preko noći na 37°C sa mućkanjem na 250 rpm u Costar 96 Well Cell Culture Clusters (Corning Incorporated, SAD). Kulture su centrifugirane da se ćelije peletiraju, i supernatanti su ispitani pomoću antigen vezujuće ELISA za CD40 vezujuća dAt-a. MaxiSorp imuno-ploče sa 96 bunarića (Nunc, SAD) su bile premazane preko noći na 4°C sa 50 µl/bunariću 0.5 µg/ml CD40-Fc (BMS-a) u 0.2 M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4. Sva ispiranja su opisana za fagnu ELISA. Ploče su blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 250 µl PBS-a koji sadrži 1% Tween 20 (PBST). Izbistren supernatant kulture koji sadrži dAt je dodat na ELISA ploču sa jednakom zapreminom 0.1% PBST-a. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i potom isprane. Vezano dAt-o je detektovano primenom dvostepenog procesa: prvo je biotinilovan 9E10 (anti-myc IgG, Sigma-Aldrich, UK) razblažen 1:2000 u 0.1% PBST-u dodavan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi potom ispran, nakon čega streptavidin-HRP-om (Bender MedSystems, Austrija) razblaženim 1:5000 u 0.1% PBST-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i ELISA je razvijena primenom SureBlue 1-komponentnog TMB. Specifična dAt-a su identifikovana poređenjem sa pločama premazanim sa slobodnim Fc.
[0113] Klonovi specifični za CD40 su ispitani u testu vezivanja receptora (receptor-binding assay - RBA) bilo zasnovanom na zrncima bilo na ELISA da bi se procenila inhibicija CD40 ligand vezivanja. Merenja potentnosti dobijena iz RBA su data u Tabeli 5 (Rezultat primarnog skrininga). Domen antitela koja su pokazala inhibiciju u RBA su ispitana u testu B-ćelijske proliferacije i potom u raznim drugim in vitro ćelijskim testovima.
BMS3h-210 do -225
[0114] BMS3h-210 do -225 su izolovani od odabira na cele ćelije. Fagi iz naivnih 4G i 6G Domantis biblioteka dAt-a su kombinovani kao što sledi pre započinjanja odabira:
1) 4G 6G VH CDR3 dužina između 7 - 9 aminokiselina.
2) 4G 6G VH CDR3 dužina između 10 - 12 aminokiselina.
3) 4G 6G VH CDR3 dužina između 13 - 15 aminokiselina.
4) 4G i 6G VK
[0115] Za prvi krug DG44 CHO ćelijska linija stabilno transfektovana sa humanim CD40 eksprimiranim na površini ćelije (snabdevenim BMS-om) je primenjena kao antigen. Pre odabira na ove ćelije, rezervoari biblioteke naznačeni iznad su inkubirani sa netransfektovanim CHO (Chinese Hamster Ovary-ovarijum kineskog hrčka) ćelijama kako bi se iskoristila dAt-a koja prikazuju fage specifične za antigene ćelijske površine drugačije od CD40. Oba tipa ćelija su sakupljena pomoću inkubacije sa Versene-om (Invitrogen) pre procene održivosti. Šest miliona održivih ne-transfektovanih CHO ćelija je resuspendovano u 4 ml PBS-a sa 2% (m/v) BSA (PBS/BSA) i rotirano s kraja na kraj na 4°C tokom 1 sata da se blokiraju. Svi naredni koraci su izvedeni na 4°C sem ako nije drugačije navedeno. Ćelije su centrifugovane pri 185 g tokom 5 min i supernatant, koji sadrži osiromašenu biblioteku faga, je prebačen u svežu epruvetu. Ovome su dodate 6×10<6>održive CHO-CD40 ćelije u 1 ml PBS/BSA i smeša je rotirana tokom 1 sata. Ćelije su potom isprane pet puta centrifugiranjem na 185 g tokom 5 min i re-suspendovane u 10 ml PBS/BSA. Nakon završnog ispiranja, ćelije
22
su peletirane kao i ranije i potom su re-suspendovane u 0.5 ml 1 mg/ml tripsina tipa XIII iz goveđeg pankreasa (Sigma Aldrich, UK) u PBS-u dopunjenom sa 5 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1 mM CaCl2i prebačene u epruvetu za mikrocentrifugiranje. Ćelije su rotirane na sobnoj temperaturi tokom 10 min pre centrifugiranja na 16000 g tokom 5 min. Eluirani fagi u supernatantu su upotrebljeni da se zarazi E. coli i izlazni titri faga su određeni da su između 5.1×10<5>i 2.7×10<6>TU/ml (transformacione jedinica po ml).
[0116] Drugi krug odabira je izveden primenom obogaćenog faga obnovljenog iz prvog kruga odabira. Ovo je izvedeno kao navedeno iznad ali bez početnog koraka iscrpljivanja (deselekcije) i primenom RAMOS humanih B ćelija (ATCC) umesto CHO-CD40. Izlazni titri su bili u opsegu 2.3×10<5>do 7.5×10<5>TU/ml.
[0117] Treći krug odabira je izveden kao za drugi krug. Izlazni titri su bili u opsegu 1.9×10<8>do 3.5×10<8>TU/ml.
[0118] Geni dAt-a iz svakog izlaza odabira gornjeg drugog i trećeg kruga su podklonirani, kao rezervoar, u rastvorljiv eksprimirajući vektor pDOM5 u E. coli loze HB2151. Ovaj vektor dozvoljava eksprimiranje slobodnog dAt-a sa c-myc oznakom u E. coli i sekreciju u supernatant.
[0119] Klonovi specifični za CD40 su ispitani u bilo kojem testu vezivanja CHO ćelijskog receptora (RBA) da se proceni inhibicija CD40 ligand vezivanja. Domen antitela koja su pokazala inhibiciju u RBA su ispitana u testu B-ćelijske proliferacije i potom u raznim drugim in vitro ćelijskim testovima.
Sazrevanje afiniteta pomoću PCR koja je sklona grešci
[0120] Biblioteke faga sklone grešci su konstruisane za 13 BMS3h dAt-a koja su pokazala neutrališuću aktivnost u testu B-ćelijske proliferacije opisanom ispod u Primeru 6 (Videti TABELU 17). Ovo je izvedeno primenom Mutazyme II Polimerase (deo GeneMorph II kita iz Agilent Technologies) da se nasumično uvedu greške u gene dAt-a tokom amplifikacije pomoću polimerazne lančane reakcije (PCR). Mutirani geni dAt-a su klonirani kao genetska fuzija sa fd fag gen III proteinom pod kontrolom GAS1 vodeće sekvence u pDOM4 vektoru, koji je sadržao sve fd gene neophodne za generisanje infektivnih čestica faga. Veličina ovih biblioteka je bila približno 1×10<8>CFU (jedinaca koje formiraju koloniju), sa stopom greške od 2-5 aminokiselina po genu dAt-a.
[0121] Fagi generisani iz ovih biblioteka su podvrgnuti odabiru u tri kruga protiv rastvorljivog biotinilovanog humanog CD40. Prvi krug selekcije faga je izvršen prethodnim mešanjem biblioteke faga sa 2% MPBS-om (fosfatom puferovani fiziološki rastvor dopunjen sa 2% (m/v) Marvel osušenim obranim mlekom u prahu) i dodavanjem biotinilovanog humanog CD40 (BMS) konačnoj koncentraciji od 20 nM u konačnoj zapremini od 1 ml. Smeša je inkubirana tokom najmanje jednog sata na sobnoj temperaturi sa mešanjem s kraja na kraj. Antigen-fag kompleksi su potom uhvaćeni primenom 50 µl M-280 streptavidin Dynabeads® (Invitrogen) i isprani 7 puta sa 1 ml PBST nakon čega sledi pojedinačno ispiranje u 1 ml PBS-a. Isprani fagi su eluirani iz antigen/zrno kompleksa inkubacijom sa 0.5 ml 1 mg/ml tripsina tipa XIII iz goveđeg pankreasa (Sigma Aldrich, UK) u PBS-u dopunjenom sa 5 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1 mM CaCl2. Eluirani fagi su upotrebljeni da se zarazi E. coli i izlazni titri faga su određeni da su između 2×10<5>i 9×10<7>TU/ml (transformacione jedinice po ml).
[0122] Drugi krug odabira je izveden primenom obogaćenog faga obnovljenog iz prvog kruga odabira, sa konačnom koncentracijom od 2 nM biotinilovanog CD40 nakon čega sledi hvatanje primenom streptavidin zrnaca kao što je iznad opisano. Izlazni titri su bili u opsegu 3×10<4>do 5×10<6>TU/ml.
[0123] Izveden je treći krug odabira primenom 2 nM biotinilovanog CD40 nakon čega sledi hvatanje primenom streptavidin zrnaca. Titri eluiranih faga su bili u opsegu 8×10<4>do 4×10<6>TU/ml.
BIAcore™ ispitivanje
[0124] Geni dAt-a iz svakog od gornjih izlaza odabira trećeg kruga su pod-klonirani, kao rezervoar, u rastvorljiv eksprimirajući vektor pDOM13 (Domantis) u E. coli HB2151. pDOM13 vektor je takođe poznat kao pDOM33 i stavljen je na uvid javnosti u WO/2008/149143. Ovaj vektor dozvoljava eksprimiranje slobodnog dAt-a u E. coli i sekreciju u supernatant. Četrdeset sedam pojedinačnih kolonija je izabrano iz svakog izlaza i eksprimirano u 200 µl Terrific Broth-a (TB) koji sadrži Novagen Overnight Express Autoinduction media (Merck Chemicals, UK) preko noći na 37°C sa mućkanjem na 250 rpm u Costar 96 Well Cell Culture Clusters (Corning Incorporated, SAD). Na istoj ploči, pojedinačni bunarić je inokuliran sa E. coli koja eksprimira odgovarajuće matično (“wild type”) dAt-o. Kulture su centrifugirane da bi se ćelije peletirale i supernatanti ispitani na
22
BIAcore™ 3000 instrumentu (GE Healthcare) na poboljšanje u "off-rate" (tj. konstanti brzine disocijacije, kd) u poređenju sa matičnim dAt-om.
[0125] Približno 1600 jedinica odgovora (response units - RU) biotinilovanog humanog CD40 (BMS-a) su imobilisani na jednoj protočnoj ćeliji streptavidin (SA) BIAcore™ čipa. Druga protočna ćelija bez bilo kakvog imobilisanog liganda služi kao referentna protočna ćelija za linijsko referenciranje. Svaki supernatant dAt-a za analizu je razblažen 1:3 u HBS-EP puferu (0.01 M HEPES pH 7.4 sa 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0.005% v/v Surfaktant P20, GE Healthcare). Deset mikrolitara svakog supernatanta dAt-a je injektirano, primenom funkcije instrumenta KINJECT, preko CD40-imobilisanih i referentnih protočnih ćelija u serijama, sa linijskim oduzimanjem signala od referentne ćelije. Eksperiment je izveden na 25°C i sa brzinom protoka HBS-EP-a od 10 µl/min. Nakon što je završeno svako injektiranje, dAt-u je dozvoljeno da disocira od liganda u puferu tokom 120 s pre regeneracije sa injekcijom od 5 µl 10 mM glicina pH 2.0. BIAevaluacioni 4.1 kompjuterski program (GE Healthcare) je primenjen da se oduzme trag referentne protočne ćelije od traga svakog analita. Isti kompjuterski program je upotrebljen da se izvede približno prilagođavanje 1:1 (Langmuir) kinetičkog modela sa fazom disocijacije tragova analita. Ovaj model daje približne konstante brzine disocijacije ("off-rate" ili kd) za svaki klon i dozvoljava da se izvrše relativna poređenja sa “wild type” dAt-om.
[0126] Klonovi sa poboljšanim “off-rates” su identifikovani za sve loze izuzev BMS3h-129 i -197. Klonovi sa poboljšanim “off-rates” su ispitani u testu vezivanja receptora (RBA) bilo baziranom na zrncima ili na ELISA da bi se procenila povećana potentnost kao što je iznad opisano. Merenja potentnosti dobijena iz RBA su data u Tabelama označenim "Klonovi sazreli uz sklonost ka grešci." Klonovi koji su bili potentniji u RBA su naknadno ispitani u testu B-ćelijske proliferacije da bi se ispitala povećana biološka potentnost i ova dobijena merenja su data u TABELI 17. Domen antitela koja su povećala potentnost u testu B-ćelijske proliferacije su takođe testirana u raznim drugim in vitro ćelijskim testovima.
Sazrevanje afiniteta pomoću trostruke diversifikacije ispitivanja
[0127] Pet dAt-a povećane potentnosti koja su izolovana iz sazrevanja koje je sklono grešci, BMS3h-37-2, - 38-2, -56-2, -193-25 i -217-23, su odabrani da im afinitet dodatno sazri pomoću trostruke diversifikacije ispitivanja. Biblioteke faga su izgrađene na osnovu ovih matičnih kao što je gore opisano za biblioteke koje su sklone grešci izuzev što, umesto primene PCR sklone grešci, serije preklapajućih denerisanih triplet nukleotida su primenjeni
22
da se diversifikuju regioni određivanja komplementarnosti (CDR) od svakog dAt-a. Za svako dAt-o čiji afinitet treba da sazri, oligonukleotidi koji sadrže NNS kodon triplete (videti Arkin et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:7811-7815) su primenjeni da se naprave brojne biblioteke za svaki CDR “splajsovanjem” pomoću preklapajuće ekstenzije (splicing by overlap extension - SOE) PCR-a. Tripleti modifikovani oligonukleotidima za dati CDR preklapaju pomoću dva kodona, što daje dve do četiri biblioteke po CDR-u. Aminokiselinski ostaci modifikovani u BMS3h-37-2 bibliotekama su bili na pozicijama 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 55, 56, 95, 96, 97, i 98 (numerisanje po Kabatu). Ostaci modifikovani u BMS3h-38-2 bibliotekama su bili kao za 37-2, ali sa dodatkom pozicije 100. Ostaci modifikovani u BMS3h-56-2 bibliotekama su bili kao za 37-2, ali sa dodatkom pozicija 100 i 101. Ostaci modifikovani u BMS3h-193-25 i -217-23 bibliotekama su bili na pozicijama 27, 28, 30, 31, 32, 34, 49, 50, 51, 53, 89, 91, 92, 93, 94, i 96.
[0128] Fagi generisani iz ovih biblioteka su bili udruženi pomoću CDR-a i odabira izvedenih kao što je iznad opisano, izuzev što su, za BMS3h-37-2, -38-2, -56-2 i -193-25, primenjene koncentracije antigena bile 10, 1 i 0.1 nM za prvi, drugi i treći krug, redom. Za BMS3h-217-23 primenjene koncentracije antigena su bile 20, 2 i 0.2 nM za prvi, drugi i treći krug, redom. Za BMS3h-193-25, koji je ukršteno-reaktivan za cinomolgusni CD40, odabiri su takođe izvedeni protiv cino CD40 paralelno. Dodatno, drugi i treći krug odabira su izvedeni u prisustvu i odsustvu 100- ili 1000-strukog viška neobeleženog CD40, redom. Dodatak ovog konkurenta je učinjen nakon inicijalnog sata inkubacije faga sa biotinilovanim antigenom i smeša je potom inkubirana, kao i ranije, još jedan sat. Ovaj kompetitivni korak je uključen u cilju poboljšanja odabira dAt-a sa sporijom “off-rate”. Titri prvog odabira su bili u opsegu 1.4×10<6>do 1.4×10<9>. Titri u drugom krugu su bili 1.3×10<5>do 4.0×10<8>bez kompeticije i 8.6×10<4>do 1.3×10<8>sa kompeticijom. Titri u trećem krugu su bili 1.2×10<5>do 1.9×10<8>bez kompeticije i 6.0×10<5>do 1.2×10<8>sa kompeticijom.
[0129] Ovi izlazi odabira su pod-klonirani i ispitani kao što je opisano za sazrevanje afiniteta sklono grešci. Klonovi sa poboljšanim “off-rates” su identifikovani za sve loze izuzev BMS3h-193-25. Klonovi sa poboljšanim “off-rates” su ispitani u ELISA testu vezivanja receptora (RBA) da se testira poboljšana potentnost. Merenja potentnosti dobijena iz RBA su data u Tabelama označenim "Dodatno sazreli klonovi." Klonovi koji su bili potentniji u RBA su naknadno ispitani u testu B-ćelijske proliferacije da se testira povećana biološka potentnost i ova dobijena merenja su data u TABELI 17. Domen antitela koja su imala povećanu
22
potentnost u testu B-ćelijske proliferacije su takođe bila ispitana u raznim drugim in vitro ćelijskim testovima.
Primer 2
Ispitivanje primenom testova vezivanja receptora (RBA)
[0130] Nekoliko in vitro testova vezivanja receptora (RBA) je primenjeno da se odredi CD40 afinitet aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena anti-humanog CD40 generisanih u Primeru 1. Primenjena su tri RBA formata: (1) RBA na zrnima, (2) ELISA RBA, i (3) RBA na CHO ćelijama.
RBA na zrnima:
[0131] Fosfatom puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS-om) isprane Sphero streptavidin polistiren čestice (Saxon Europe, UK) su premazane sa 0.5µg/ml biotinilovanog humanog IZ-CD40L (BMS). Nakon premazivanja, biotinilovane CD40L čestice su isprane u PBS-u i razblažene 1:10 u 0.1% (m/v) goveđem serumskom albuminu (BSA) (Sigma-Aldrich, UK) u PBS test puferu. U ploči sa crnim zidovima, sa 384-bunarića providnog dna (Applied Biosystems) raspon razblaženja prečišćenog dAt-a, 0.25 µg/ml humani CD40 (BMS, CY24FEB06-01), 1 u 5000 mišiji anti-humani IgG (Fc) mAt klon GG-7 (Sigma-Aldrich, UK), 0.25 µg/ml kozijeg anti-mišijeg ALEXA Fluor 647 (Invitrogen, Molecular probes, UK) i biotinilovane CD40L polistirenske čestice su kombinovane podjednako i dozvoljena je inkubacija na sobnoj temperaturi tokom 6 sati u odsustvu svetla. Nakon inkubacije, kompetitivno vezivanje dAt-a naspram humanog CD40 za biotinilovane CD40L čestice je procenjeno primenom relativne fluorescencije sa AB8200 mehanizmom ćelijske detekcije (Applied Biosystems).
ELISA RBA:
[0132] High Bind ploče providnih zidova, sa 384-bunarića (Corning, UK) su bile premazane sa 25 µl 1 µg/ml Neutravidin-a u 0.2 M karbonat-bikarbonatnom puferu, pH 9.4 preko noći na 4°C. Sledećeg dana, test ploče su isprane sa 0.1% (v/v) Tween PBS puferom, blokirane sa 1% (m/v) BSA u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i ponovo isprane. Nakon uklanjanja viška pufera za ispiranje, 25 µl 1 µg/ml biotinilovanog humanog IZ-CD40L (BMS) je inkubirano sa test pločama tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Istovremeno, raspon razblaženja prečišćenog dAt-a i 1 µg/ml humanog CD40 (BMS, CY24FEB06-01) je kompleksirano u odnos 1:1. Nakon ispiranja test ploče, dAt:humani CD40 kompleks je
22
inkubiran u test ploči na sobnoj temperaturi tokom 2 sata sa blagom agitacijom. Kompetitivno vezivanje dAt-a naspram humanog CD40 za biotinilovan CD40L je detektovano sa sekvencijalnim inkubacijama 1 u 5000 mišijeg anti-humanog IgG (Fc) mAt klona GG-7 (Sigma-Aldrich, UK) što je praćeno sa 1 u 10,000 kozijim anti-mišijim IgG (Fc) (Sigma-Aldrich, UK) konjugovanim ren peroksidazom (horse radish peroxidase - HRP) sekundarnim detektujućim antitelom. Apsorbancija signala je merena primenom SpectraMax M5<e>čitača ploče (Molecular Devices) pri 450 nm nakon neutralizacije sa 1M HCl rastvorom.
Ćelijski testovi: RBA na ćelijama CD40 CHO:
[0133] CHO-DG44 ćelije ili izvorne CHO-DG44 ćelije (obe BMS) koje eksprimira stabilno transfektovan humani CD40 su odvojene od posuda ćelijske kulture primenom Versene (Invitrogen). Četrdeset hiljada ćelija po bunariću je zasejano u 96-bunarića High Bind, ploča crnih zidova, providnog dna (Corning, UK) u 0.1% (m/v) BSA PBS test puferu sa rasponom razblaženja dAt-a, 0.25 µg/ml biotinilovanog humanog IZ-CD40L (BMS), i 0.25 µg/ml streptavidina Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Molecular probes, UK). Smeša je inkubirana u odsustvu svetla tokom 6 sati. Nakon inkubacije, kompetitivno vezivanje dAt-a prema humanim CD40 CHO ćelijama za rastvorljiv biotinilovan IZ-CD40L je procenjeno primenom relativne fluorescencije sa AB8200 mehanizmom ćelijske detekcije (Applied Biosystems).
[0134] TABELE 5-7 redom prikazuju rezultate iz primarnog ispitivanja ("naivi klonovi") i narednih krugova sazrevanja afiniteta ("klonovi sazreli uz sklonost ka grešci" i "dodatno sazreli klonovi") za ispitivana anti-humana CD40 dAt-a.
TABELA 5
22
2
TABELA 6
Sazreli klonovi skloni grešci:
21
Sazreli klonovi skloni grešci:
Klon EC50 ELISA RBA (nM) EC50 RBA na ćelijama (CHO-CD40) (nM)
2 2
Sazreli klonovi skloni grešci:
2
24
TABELA 7
Klon EC50 ELISA EC50 ICAM1 ćelijski EC50 RBA na ćelijama RBA (nM) test (nM) (CHO-CD40) (nM)
2
2
2
2
Primer 3
Kinetike CD40 vezivanja
[0135] Kinetike vezivanja su određene za anti-humana CD40 dAt-a identifikovana u primarnom skriningu ("naivni klonovi") i narednim krugovima sazrevanja afiniteta ("klonovi sazreli uz sklonost ka grešci"). Primenjene metode direktno mere afinitet dAt-a za CD40.
[0136] BIAcore™ 3000 instrument (GE Healthcare) je primenjen da analizira kinetike vezivanja CD40-specifičnih dAt-a za CD40. Približno 600 jedinica odgovora (RU) biotinilovanog humanog CD40 (BMS) je imobilisano na jednu protočnu ćeliju streptavidin (SA) BIAcore™ čipa. Druga protočna ćelija bez bilo kakvog imobilisanog liganda služi kao referentna protočna ćelija za linijsko referenciranje. Odgovarajuće serije duplih razblaženja svakog dAt-a za analizu su pripremljene u HBS-EP puferu (0.01 M HEPES pH 7.4 sa 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0.005% v/v Surfactant P20, GE Healthcare). Sto osamdeset mikrolitara svakog dAt-a je injektirano u dva primerka primenom funkcije KINJECT instrumenta. Svako dAt je injektirano preko CD40-imobilisanih i referentnih protočnih ćelija u serijama sa linijskim oduzimanjem signala referentne ćelije. Eksperiment je izveden na 25°C i brzini protoka od 30 µl/min HBS-EP-a. Nakon završetka svakog injektiranja, dAt-u je dozvoljeno da disocira od liganda u puferu tokom 300 s pre regeneracije sa 10 µl injekcijom 10 mM glicina pH 2.0. Referentna injekcija HBS-EP praznog pufera (koji ne sadrži analit) je takođe injektirana pod istim uslovima, kako bi služila kao druga referenca za oduzimanje od traga svakog analita. BIAevaluacioni 4.1 kompjuterski program (GE Healthcare) je primenjen da se oduzme i trag referentne protočne ćelije i trag praznog pufera iz traga svakog analita. Isti kompjuterski program je primenjen da bi se izvelo istovremeno, globalno prilagođavanje 1:1 (Langmuir) kinetičkog modela fazama asocijacije i disocijacije tragova serije razblaženja analita. Ovaj model daje konstante brzine asocijacije i disocijacije (kai kd, redom) i ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) interakcije; ovo je detaljno navedeno u TABELAMA 8 i 9.
TABELA 8
2
TABELA 9
24
Primer 4
Biofizička karakterizacija
[0137] Anti-humana CD40 dAt-a identifikovana u primarnom ispitivanju ("naivni klonovi") i naredni krugovi sazrevanja afiniteta ("klonovi sazreli uz sklonost grešci" i "dodatno sazreli klonovi") su dalje okarakterisani pomoću analize biofizičkih parametara. Da bi se izmerila relativna stabilnost dAt-a, njihova tačka topljenja je određena pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (differential scanning calorimetry - DSC). dAt-a sa višom temperaturom topljenja su stabilnija. Da bi se odredilo da li dAt-a formiraju multimerne agregate u rastvoru, dAt-a su testirana pomoću ekskluzione hromatografije/višeugaonog laserskog rasejanja svetlosti (size exclusion chromatography/multiangle laser light scattering - SEC-MALLS). Rezultati su prikazani u TABELAMA 10-12.
TABELA 10
TABELA 11
24
24
TABELA 12
24
Primer 5
Analiza kompeticije
[0138] BIAcore™ 3000 instrument (GE Healthcare) je primenjen da se analizira da li CD40-specifična dAt-a vezuju isti CD40 epitop. Približno 600 jedinica odgovora (RU)
24
biotinilovanog humanog CD40 (BMS) je imobilisano na jednoj protočnoj ćeliji streptavidin (SA) BIAcore™ čipa. Druga protočna ćelija bez bilo kakvog imobilisanog liganda je služila kao referentna protočna ćelija za linijsko referenciranje. Određeno razblaženje svakog dAt-a ili Fab-a za analizu je pripremljeno u HBS-EP puferu (0.01 M HEPES pH 7.4 sa 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0.005% v/v Surfactant P20, GE Healthcare). Izabrano razblaženje je bilo ono koje kada je injektirano kao što je ispod opisano je dalo >80% maksimalne moguće vezane RU za poseban inhibitor, tipično 1 - 10 µM. Dalje, smeša istog dAt-a ili Fab-a kao iznad (pri istoj konačnoj koncentraciji) je pripremljena sa drugim dAt-om ili Fab-om da bude analizirana za kompeticiju. COINJECT funkcija instrumenta je primenjena da se injektira 60 µl rastvora pojedinačnog inhibitora u CD40-imobilisane i referentne protočne ćelije u serijama, nakon čega odmah sledi injekcija od 60 µl smeše dva inhibitora. Linijsko oduzimanje signala od referentne ćelije je izvedeno pomoću kontrolnog kompjuterskog programa instrumenta. Eksperiment je izveden na 25°C i protočnoj brzini od 30 µl/min HBS-EP-a. Nakon što je svaka uporedeno injkcioniranje završeno, dozvoljeno je da inhibitori disociraju od liganda u puferu tokom 60 s pre regeneracije sa 10 µl injekcijom od 10 mM glicina pH 2.0. Maksimalna RU dobijena za drugu injekciju (smeša dva inhibitora) je uočena i iskazana kao procenat RU dobijene za isti inhibitor kad se injektira sam.
[0139] Ukoliko je drugi inhibitor zadržao najmanje 100% uobičajeno vezane RU kada se injektira sam, onda ovo podrazumeva da se dva inhibitora vezuju za odvojene epitope. Ukoliko je primećeno manje od 100% vezivanja drugog inhibitora, onda ovo ukazuje na kompeticiju između dva inhibitora za vezivanje za CD40. Postoji nekoliko mogućih razloga za ovu kompeticiju: dva inhibitora se mogu vezati za iste ili preklapajuće epitope, može postojati prostorna inhibicija vezivanja, ili vezivanje prvog inhibitora može izazvati konformacionu promenu u antigenu koji sprečava ili smanjuje vezivanje drugog inhibitora.
[0140] Primer klona iz svake loze (izuzev BMS3h-217) je ispitan na kompeticiju sa drugim dAt-ima u preklapajućim grupama. Sva ispitana dAt-a izgleda da se takmiče jedno sa drugima za vezivanje za CD40, kao što je prikazano u TABELAMA 13 i 14. Ovi podaci ukazuju da svi polipeptidi antitela odabrani iz grupe koja se sastoji od loze BMS3h-37, BMS3h-38, BMS3h-41, BMS3h-43, BMS3h-56, BMS3h-131, BMS3h-198, i BMS3h-202 treba da se takmiče sa vezivanjem dAt-a iz bilo koje od ovih loza za humani CD40.
TABELA 13
24
Kompeticija BIAcore™:
Druga Injekcija (% RU pojedinačnog dAt-a)
Prva injekcija dAt-a
BMS3h- BMS3h- BMS3h- BMS3h- BMS3h-
TABELA 14
[0141] Slično, razna dAt-a su ispitana na kompeticiju sa Chi220 Fab', kao što je prikazano u TABELAMA 15 i 16. U ovom slučaju, sva dAt-a se ne takmiče sa Chi220 Fab', izuzev
24
BMS3h-217, koje pokazuje kompeticiju. BMS3h-56-5 i BMS3h-193-12 dAt-a se vezuju sa najmanje 100% RU pojedinačnog dAt-a u prisustvu vezanog Chi220 ili G28-5 Fab', ukazujući da Fab'-i vezuju različit(e) epitop(e) nego dAt-a. Chi220 Fab' je pokazao smanjenje vezane RU u prisustvu G28-5. Isti rezultat je primećen u suprotnom redosledu vezivanja. Ovo ukazuje da G28-5 Fab' vezuje isti epitop kao Chi220 Fab'.
TABELA 15
TABELA 16
2
Primer 6
Testovi CD40 aktivnosti
[0142] Anti-humana CD40 dAt-a su funkcionalno testirana na njihovu sposobnost da antagonizuju CD40 aktivnosti. Testirane CD40 aktivnosti su bile B ćelijska proliferacija i proizvodnja citokina pomoću hCD40L-vođene aktivacije primarnih humanih dendritičnih ćelija (dendritic cells - DCs) koje su derivati monocita. Ukoliko ako nije drugačije navedeno, svi testovi se izvode u RPMI medijumima dopunjenim sa 10% fetalnim telećim serumom (fetal calf serum - FCS). U TABELI 17 su prikazani rezultati primenom raznih testova.
Proliferacija primarnih humanih B ćelija vođena rastvorljivim IZ-hCD40L-om:
[0143] 1x10<5>tonzilarnih humanih B ćelija je inkubirano sa 0.6 µg/ml IZ-hCD40L-a uporedo sa različitim titracijama polipeptida antitela u konačnoj zapremini od 200 µl/bunariću u ploči sa 96-bunarića sa okruglim dnom. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata, potom je timidin (<3>H; 0.5 µci/bunariću) dodavan tokom 6 sati. B ćelijska proliferacija je kvatifikovana na osnovu inkorporacije timidina.
Proliferacija primarnih humanih B ćelija vođena CHO-hCD40L-om:
[0144] CHO ćelije su transfektovane sa humanim CD40L da se generiše stabilna ćelijska linija koja eksprimira visoke nivoe CD40L-a na ćelijskoj površini. CHO-CD40L ćelije su ozračene na 10,000 Rada pre inkubacije sa humanim B ćelijama. 1x10<5>tonzilarnih humanih B ćelija je inkubirano sa 1x10<3>CHO-CD40L ćelija (1:100 odnos CHO-CD40L: humane B ćelije) uporedo sa različitim titracijama polipeptida antitela u konačnoj zapremini od 200 µl/bunariću u ploči sa 96-bunarića sa okruglim dnom. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72
2 1
sata nakon čega je usledilo dodavanje<3>H-timidina (0.5 µci/bunariću) tokom 6 sati. B ćelijska proliferacija je kvantifikovana na osnovu inkorporacije timidina.
Proliferacija humanih B ćelija slezine cinomolgusa vođena rastvorljivim IZ-hCD40L-om:
[0145] 1x10<5>B ćelija slezine cinomolgusa je inkubirano sa 0.5 µg/ml IZ-hCD40L-a uporedo sa različitim titracijama polipeptida antitela u konačnoj zapremini od 200µl/bunariću u ploči sa 96-bunarića sa okruglim dnom. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata nakon čega je usledilo dodavanje<3>H-timidina (0.5 µci/bunariću) tokom 6 sati. B ćelijska proliferacija je kvantifikovana na osnovu inkorporacije timidina.
Proliferacija humanih B ćelija vođena primarnim T ćelijama:
[0146] T ćelije su izolovane iz humanih mononuklearnih ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells - PBMC) i obogaćene primenom resetovanja ovčijih crvenih krvnih zrnaca (sheep red blood cell - SRBC). Humane B ćelije tonzila su izolovane pomoću homogenizacije tkiva tonzila u suspenziju pojedinačne ćelije. Leukociti su dobijeni separacijom fikola, potom su B ćelije negativno odabrane primenom SRBC resetovanja i obogaćene odbacivanjem ćelija u obliku rozeta.
[0147] Obogaćene humane T ćelije su kultivisane sa PM-LCL-ima (B ćelijska linija transformisana EBV-om; ozračena pri 10,000 Rada) u odnosu 5:1 (T:LCL) tokom 6 dana na 37°C da se generiše populacija alogenih T ćelija. Šestog dana, proširene T ćelije su izolovane i ozračene pri 3000 Rada, i potom kultivisane (5x10<4>T ćelija/bunariću) sa primarnim humanim B ćelijama tonzila (1x10<5>B ćelija/bunariću) pri odnosu 1:2 u ploči sa 96-bunarića ravnog dna premazanim sa anti-CD3 mAt-om (OKT3). Različite titracije polipeptida antitela su dodate u svaki bunarić; konačna zapremina u svakom bunariću je bila 200 µl. Test ploče su inkubirane na 37°C tokom 3 dana. Proliferacija humanih B ćelija je određena putem dodatka<3>H-timidina (0.5 µci/bunariću) kulturama tokom poslednjih 18 sati.
Aktivacija primarnih humanih dendritičnih ćelija (DC) derivata monocita vođena CHO-hCD40L-om:
[0148] Humane PBMC su obogaćene za monocite smanjenjem T ćelija putem SRBC raspoređivanja u obliku cveta. Monocitima obogaćene PBMC su kultivisane sa 10ng/ml GM-CSF i 5 ng/ml IL-4 u pločama sa 6-bunarića tokom 6 dana na 37°C. Kultivisane ploče su dopunjene sa svežim medijumima (sa GM-CSF i IL-4) drugog i petog dana. Nezrele dendritične ćelije (DC) su primenjene u ćelijskim testovima šestog dana.8x10<4>nezrelih DC-a
2 2
je kultivisano sa 4x10<3>CHO-hCD40L ćelija (ozračenih pri 10,000 Rada) uporedo sa različitim titracijama polipeptida antitela u ploči sa 96-bunarića ravnog dna. Nakon 24 sata, supernatanti su prikupljeni i ispitani na prisustvo raznih citokina (IL-12, TNF, IL-23). DC aktivacija je određena nivoima proizvodnje citokina.
TABELA 17
2
24
2
2
2
2 )
2
-)
2
21
22
Primer 7
Dvojno specifično vezivanje dAt-e za CD40 i serumski albumin
[0149] Dvojno specifična dAt-a koja specifično vezuju CD40 i humani serumski albumin (HSA) ili serumski albumin cinomolgusa (CSA) su konstruisana i ispitana na aktivnost u testovima baziranim na ćelijama. Specifična dAt-a za albumin se zovu "AlbudAt-a." U ovom primeru, fuzije AlbudAt-a sadrže BMS3h dAt-o koje vezuje CD40 i drugo domen antitelo, DOM7h, koje prepoznaje HSA. Dva dAt-a su fuzionisana u okviru prema amino i karboksil terminalnim delovima aminokiselinskog veznika da bi se formirao linijski fuzioni (inline fusion - ILF) polipeptid. ILF polipeptid je rekombinantno eksprimiran kao pojedinačni fuzioni protein. RBA-i koji demonstriraju aktivnost ILF-a AlbudAt-a su opisani ispod, i rezultati su prikazani u TABELI 18. TABELA 19 rezimira sekvence veznika primenjene u testiranim ILF-ama AlbudAt-a. Podaci kinetičkog vezivanja određeni pomoću BIAcore™ testa su prikazani u TABELI 20.
ELISA humanih CD40 CHO ćelija za detekciju dAt-a u supernatantu:
[0150] Stabilno transfektovane CHO-DG44 ćelije ili neizmenjene CHO-DG44 ćelije (obe BMS) koje eksprimiraju humani CD40 su odvojene iz posuda sa ćelijskim kulturama primenom 0.25% tripsin EDTA, i 100,000 ćelija po bunariću je zasejano u medijume za rast u 96 bunarića ploča tretiranih tkivnom kulturom (NUNC). Ćelijama je dopušteno da adheriraju preko noći u vlažnoj atmosferi na 37°C, 5% CO2. Na dan testa, sloj ćelija je ispran sa PBS-om pre nego što je fiksiran sa 2% paraformaldehidom (Sigma-Aldrich) tokom 20 minuta. Nakon fiksiranja, sloj ćelija je ponovo ispran u PBS-u pre jedočasovnog blokiranja sa 15%
2
fetalnim goveđim serumom (FBS, PAA) u PBS-u. Ploče su isprane još jednom pre dodatka 100 µl/bunariću supernatanta dAt-a i inkubirane tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije supernatanata dAt-a sa ćelijama, ploče su isprane i vezivanje dAt-a je detektovano inkubacijom konjugata peroksidaze rena (horse radish peroxidase - HRP) anti-proteina A ili L, zavisno od toka da li su dAt-a VHili VLdomeni. Signal apsorpcije je meren primenom SpectraMax M5<e>čitača ploče (Molecular Devices) pri 450 nm nakon neutralizacije sa 1 M HCl.
Ćelijski test povećanja ICAM-1:
[0151] Stabilno transfektovane COS ćelije koje eksprimiraju humani CD40L su odvojene od posuda sa ćelijskim kulturama primenom Versene (Invitrogen). 20,000 ćelija po bunariću je zasejano u Highbind pločama sa 96 bunarića, crnih zidova, providnog dna (Coming, UK) u test puferu (RPMI 1640 bez fenol crvene (Sigma-Aldrich, UK) 1% penicilin/streptomicin 10% FBS Gold (oba PAA Laboratories, UK). Ćelije su ostavljene da adheriraju preko noći u vlažnoj atmosferi na 37°C sa 5% CO2. Sledećeg dana, iscrpljen pufer koji sadrži ćelije koje nisu pripojene je dopunjen sa 100µl svežeg test pufera. Ovome, 20,000 RAMOS ćelija/bunarić su dodate u test puferu dodatno opsegu razblaženja dAt-a. Test ploča je vraćena u vlažnu atmosferu na 37°C sa 5% CO2tokom naredna 24 sata. Za bunariće sa negativnom kontrolok, RAMOS ćelije nisu dodate. Sposobnost dAt-a da inhibira povećanje ICAM-1 na ćelijskoj površini RAMOS ćelija kao odgovor na kao odgovor na izlaganje CD40L-u na ćelijskoj površini COS ćelija je ispitana dodatkom 0.5µg/ml mišijeg anti humanog ICAM-1 antitela (R&D systems) i 02µg/ml kozjeg anti mišijeg ALEXA Fluor 647(Invitrogen, Molecular probes, UK). Nakon tročasovnog perioda inkubacije u odsustvu svetla, relativna fluorescencija je detektovana kao što je izmereno pomoću platforme AB8200 ćelijske detekcije (Applied Biosystems).
Analize kinetika linijske fuzije (ILF) vezivanja za serumski albumin:
[0152] Instrument BIAcore™ 3000 (GE Healthcare) je primenjen da se analiziraju kinetike vezivanja ILF-a anti-CD40-AlbudAt-a za humani i cinomolgusni serumski albumin. Približno 400 jedinica odgovora (RU) humanog serumskog albumina (HSA) ili serumskog albumina cinomolgusa (CSA) je imobilisano na protočnoj ćeliji CM5 BIAcore™ čipa primenom Amine Coupling Kit-a (GE Healthcare). Druga protočna ćelija bez ikakvog imobilisanog liganda služi kao referentna protočna ćelija za linijsko referenciranje. Odgovarajuće dvostruke serije razblaženja svakog dAt-a za analizu su pripremljene u HBS-EP puferu (0.01
2 4
M HEPES pH 7.4 sa 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA i 0.005% v/v Surfactant P20, GE Healthcare). Dvesta mikrolitara svake ILF je injektirano u dva primerka primenom funkcije KINJECT instrumenta. Injekcije su date u serijama preko serumskim albuminom imobilisanih i referentnih protočnih ćelija, sa linijskim oduzimanjem signala od referentne ćelije. Eksperiment je izveden na 25°C i pri protočnoj brzini od 40 µl/min HBS-EP-a. Nakon što je završena svaka injekcija, dAt-o je ostavljeno da disocira od liganda u puferu tokom 120 s pre regeneracije sa injekcijom od 10 µl 10 mM glicina pH 2.0. Referentna injekcija HBS-EP kontrolnog pufera (koji ne sadrži analit) je takođe injektirana pod istim uslovima da bi služila kao druga referenca za oduzimanje od putanje svakog analita. Kompjuterski program BIAevaluacija 4.1 (GE Healthcare) je primenjen da se oduzme i referentna putanja protočne ćelije i putanja kontrolnog pufera od putanje svakog analita. Isti kompjuterski program je primenjen da se izvede istovremeno, globalno prilagođavanje 1:1 (Langmuir) kinetičkog modela fazama asocijacije i disocijacije putanjama serijskih razblaženja analita. Ovaj model je dao konstante brzine asocijacije i disocijacije (kai kd, redom) i ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) interakcije. Vrednosti parametara su prikazane u TABELI 20.
2
TABELA 18
2
TABELA 19
2
TABELA 20
[0153] TABELA 21 navodi sekvence aminokisleina representativnih ILF-a AlbudAt-a koja mogu specifično vezati CD40 i HSA ili CSA. Oznaka svake ILF identifikuje posebnu sekvencu veznika: "GxS" znači da veznik ima "x" ostatke glicina praćenog serinom, i "(GxS)y" znači da veznik ima y ponavljajućih jedinica GxS. TABELA 22 stavlja na uvid javnosti reprezentativne nukleinske kiseline koje kodiraju ILF sekvence navedene u TABELI 21. Kao što je poznato u oblasti, više kodona može kodirati istu aminokiselinu. Nukleinske
2
kiseline koje kodiraju proteinsku sekvencu tako uključuju nukleinske kiseline koje imaju degeneraciju kodona.
TABELA 21
2
2
21
22
2
24
2
TABELA 22
Polinukleotidi koji kodiraju dvojno specifična dAt-a
(Tabela 22 stavlja na uvid javnosti "AST," "TVAAPS," "TVA," "G4S," "(G4S)3," "(G4S)5," i "ASTSGPS" koji su stavljeni na uvid javnosti kao SEKVENCE SA ID BROJEVIMA 5-7, 1207-1209 i 8, redom)
2
2
2
2
2
21
22
2
24
Primer 8
Anti-Cinomolgusna CD40 dAt-a
[0154] Metode stavljene ovde na uvid javnosti za generisanje polipeptida antitela koji specifično vezuju humani CD40 mogu biti primenjene za generisanje polipeptida antitela koji specifično vezuju CD40 drugih vrsta. Na primer, anti-cinomolgusni (anti-cino) CD40 polipeptidi antitela mogu biti proizvedeni primenom metoda sada stavljenih na uvid javnosti. Anti-cinoCD40 polipeptidi antitela mogu biti generisani primenom iste sheme inicijalnog/primarnog ispitivanja i sazrevanja afiniteta kao anti-humana CD40 dAt-a, na primer. Metode za dobijanje anti-cinoCD40 dAt-a su stavljene na uvid javnosti, i reprezentativni primeri anti-cinoCD40 dAt-a su obezbeđeni ispod u TABELI 23.
ELISA RBA:
[0155] Ploče Highbind, sa providnim zidovima i 384 bunarića (Coming, UK) su bile premazane sa 25µl 1 µg/ml neutravidina u karbonatnom puferu preko noći na 4°C. Sledećeg dana, test ploče su isprane sa 0.1% Tween PBS puferom, blokirane sa 1% BSA u PBS-u tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, i ponovo isprane. Nakon uklanjanja viška pufera za ispiranje, 25 µl 1 µg/ml biotinilovanog humanog IZ-CD40L (BMS, 1.2 mg/ml koncentracija u rastvoru za čuvanje) je inkubirano sa test pločama tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Istovremeno, opseg razblaženja prečišćenog dAt-a i 1 µg/ml cinoCD40 (BMS) se kompleksira u odnosu 1:1. Nakon ispiranja test ploče, dAt:cino CD40 kompleks je inkubiran
2
u test ploči na sobnoj temperaturi tokom 2 sata uz blagu agitation. Kompetitivno vezivanje dAt-a naspram cinoCD40 za biotinilovan CD40L je detektovano sa anti humanim (Fc) sekundarnim antitelom (Sigma-Aldrich, UK) konjugovanim ren peroksidazom. Signal apsorbcije je meren primenom Spectromax M5e čitača ploče (Molecular Devices) pri 450 nm nakon neutralizacije sa 1M HCl.
cinoCD40 CHO ćelijski RBA koji primenjuje AB8200 FMAT:
[0156] Stabilno transfektovane CHO-DG44 ćelije ili neizmenjene CHO-DG44 ćelije (BMS) koje eksprimiraju cinoCD40 su odvojene od posuda ćelijske kulture primenom Versene (Invitrogen). 40,000 ćelija po bunariću je zasejano u Highbind ploče sa 96 bunarića, crnih zidova, providnog dna (Corning, UK) u 0.1% BSA PBS test puferu sa opsegom razblaženja dAt-a, 0.25 µg/ml biotinilovanog humanog IZ-CD40L (BMS, 1.2 mg/ml koncentracija u rastvoru za čuvanje), i 0.25 µg/ml streptavidin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Molecular probes, UK). Smeša je inkubirana u odsustvu svetla tokom 6 sati. Nakon inkubacije, kompetitivno vezivanje dAt-a naspram cinoCD40 CHO ćelija za rastvorljiv biotinilovani IZ-CD40L je procenjeno primenom relativne fluorescencije kao što je izmereno pomoću platforme AB8200 ćelijske detekcije (Applied Biosystems).
Proliferacija primarnih humanih B ćelija vođena CHO-hCD40L-om:
[0157] CHO ćelije (ATCC) su transfektovane sa humanim CD40L da se generiše stabilna ćelijska linija koja eksprimira visoke nivoe CD40L-a na ćelijskoj površini. CHO-CD40L ćelije su ozračene pri 10,000 Rada pre inkubacije sa humanim B ćelijama. 1x10<5>humanih B ćelija tonzila je inkubirano sa 1x10<3>CHO-CD40L ćelija (1:100 odnos CHO-CD40L: humane B ćelije) uporedo sa različitom titracijom dAt-a ili monoklonskog antitela u konačnoj zapremini od 200µl/bunarić u ploči sa 96-bunarića okruglog dna. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata, nakon čega je dodavan timidin (<3>H; 0.5µci/bunarić) tokom 6 sati. B ćelijska proliferacija je kvantifikovana na osnovu inkorporacije timidina. Svi testovi, sem ako nije drugačije naznačeno, su izvedeni u RPMI medijumima dopunjenim sa 10% fetalnim telećim serumom (FCS).
Proliferacija B ćelija slezine cinomolgusa vođena rastvorljivim IZ-hCD40L-om:
[0158] 1x10<5>B ćelija izolovanih iz slezina cinomolgus majmuna je inkubirano sa 0.5 µg/ml IZ-hCD40L uporedo sa različitom titracijom dAt-a ili mAt-a u konačnoj zapremini od 200 µl/bunarić u ploči sa 96-bunarića okruglog dna. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 72 sata,
2
nakon čega je dodavan<3>H-timidin (µci/bunarić) tokom 6 sati. B ćelijska proliferacija je kvantifikovana na osnovu inkorporacije timidina. Svi testovi, sem ukoliko nije drugačije navedeno, su izvedeni u RPMI medijumima dopunjenim sa 10% fetalnim telećim serumom (FCS).
TABELA 23
2
2
Primer 9
Anti-humana CD40 dAt-a ne vezuju CinoCD40
[0159] CinoCD40 ima Leu109 ostatak umesto Trp109, kao u humanom CD40. Aminokiselinska sekvenca Macaca fascicularis CD40 je ispod reprodukovana:
[0160] Anti-humana CD40 dAt-a su ispitana na unakrsnu reaktivnost B ćelija u krvi cinomolgus majmuna, rezus makaka i šimpanzi, i limfocita iz majmunske krvi primenom metoda protočne citometrije. Ispod detaljno opisane procedure rezimiraju metode primenjene za detekciju CD40 dAt-a preko više eksperimenata. Rezultati, prikazani u TABELI 24, ukazuju da anti-humana CD40 dAt-a ne vezuju cinoCD40. Ovo je u skladu sa dokazom stavljenim iznad na uvid javnosti (videti SL.1 i 2) da je Trp109 u humanom CD40 (koji nema cino CD40 - cynoCD40) važan za formiranje kompleksa između dAt-a i humanog CD40. Metode:
[0161] PEGilovana anti-humana CD40 dAt-a (BMS3h-56-5C-40L i BMS3h38-2C-P40Br) ili biotin-konjugovano dAt (BMS3h38-2-biotin) su inkubirani sa humanim i krvnim uzorcima primata na rotatoru tokom 1 sata na 37°C. 100 µl svakog uzorka krvi je alikvotirano u 12 x 75mm epruvete i isprano 3 puta sa FACS puferom (0.5% FBS/PBS/0.1% natrijum azid). Epruvete su centrifugirane tokom 5 minuta na 1500 rpm, i supernatanti su dekantovani između ispiranja. Nakon ispiranja, epruvete su stavljene na led i inkubirane sa humanim IgG tokom 5 minuta da se blokira ne-specifično vezivanje preko Fc receptora.
[0162] Za detekciju PEGilovanog dAt, anti-PEG antitela (klon CH-2074, Silver Lake Research ili klon 2-2, Open Biosystems) su dodata u epruvete i inkubirana tokom 30 minuta. Uzorci su isprani jednom u FACS puferu, potom inkubirani sa APC-označenim CD20
2
antitelom (klon 2H7, BD Biosciences) i PE označenim-anti-mišijim IgG-om (Fcyl specific; Calbiochem) tokom dodatnih 30 minuta na ledu.
[0163] Za detekciju biotin-konjugovanog dAt, PE-označen streptavidin (Invitrogen) i APC-označeno CD20 antitelo (klon 2H7, BD Biosciences) su dodati u epruvete i inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi.
[0164] Dodatno, da bi se izmerili nivoi CD40 u humanoj i krvi primata, alikvot svakog uzorka krvi je inkubiran sa APC-obeleženim CD20 antitelom (klon 2H7, BD Biosciences) i PE-obeleženim anti-humanim CD40 antitelom koje ukršteno reaguje sa vrstama primata (klon 5C3, BD Biosciences) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.
[0165] Da bi se lizirala crvena krvna zrnca i fiksirala bela krvna zrnca nakon inkubacije za detekciju antitela, FACS Lysing Solution (BD Biosciences) je dodat u sve epruvete, i uzorci su inkubirani tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su centrifugirani i resuspendovani u FACS Lysing Solution, i analizirani pomoću protočne citometrije na BD FACSCanto™, sa “gejtom” za CD20+ B ćelije za analizu. Za uzorke kod majmuna, CD20 antitelo nije bilo ukršteno reaktivno; stoga je analiza izvedena na svim limfocitima kao što je identifikovano pomoću karakteristika prednjeg i bočnog rasipanja (veličina).
Rezultati:
[0166] Vezivanje PEGilovanih i biotinilovanih anti-humanih CD40 dAt-a je ispitano u humanim i uzorcima krvi primata u skladu sa iznad pomenutom metodom. Detektovano je anti-humano CD40 dAt koje se vezuje za CD20+ B ćelije u uzorcima humane krvi. Nasuprot tome, vezivanje PEGilovanih i biotinilovanih CD40 dAt-a nije detektovano na CD20+ B ćelijama u uzorcima krvi cinomolgusa, rezusa, ili šimpanzi ili na limfocitima u uzorcima krvi majmuna. Rezultati za BMS3h-38-2C-P40Br dAt su prikazani na SL. 3, Paneli A i B. Slični rezultati su dobijeni za druga dAt-a. Uporedivi nivoi CD40 na B ćelijama humanih i primatskih vrsta su potvrđeni primenom anti-humanog CD40 antitela koje ukršteno reaguje sa CD40 primata. Ovi podaci ukazuju da su humana CD40 dAt-a iz BMS3h-56 i BMS3h-38 loza nesposobna da vežu CD40 u primatskim vrstama. Podaci su u skladu sa važnošću Trp109 ostatka u formiranju kompleksa između CD40 i anti-CD40 dAt-a, kao što je prikazano na SLIKAMA 1 i 2.
Primer 10
Rendgenska kristalografija kompleksa između CD40 i BMS3h-56-5 dAt
2
Prikupljanje i obrada podataka:
[0167] Dve različita kristalna oblika se analiziraju tokom određivanja strukture humani CD40 (SEQ ID NO: 1)/BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321) kompleksa. Podaci su prikupljeni od kristala CD40/BMS3h56-5 kompleksa, kratko-ohlađenog na i održavanog na 100 K, i montiranog na Rigaku AFC-9 goniometar. Izvor X-zraka je Rigaku FR-E koji primenjuje bakarnu metu sa MicroMax™ konfokalnom optikom i Saturn 92 detektorom. Podaci su prikupljeni u ekstremno visokoj suvišnosti da se poboljša anomalni difrakcioni signal sumpora u nadi da će taj signal koristiti u faziranju podataka. Podaci su obrađeni sa HKL2000 (HKL Research; Otwinowski et al., In Methods Enzymol. Macromolecular Crystallography part A, Carter et al., eds., tom 276, p. 307-326, Academic Press, Inc., Nju Jork, NY (1997)). Prikupljeni statistički podaci za ovaj kristal su rezimirani ispod i u Tabeli 24:
Prostorna grupa: 1222;
Jedinična ćelija: a = 156.6 Å; b = 158.3 Å; c = 200.7 Å;
Mozaičnost 0.59-0.84; Odbijena zapažanja: 1028; 0.06%.
TABELA 24
[0168] Drugi kristalni oblik je prikupljen iz kristala kratko-ohlađenog do 100 K i montiranog na Rayonix MX-225 detektor na Canadian Light Source beamline CMCF1 (08-ID-1) i talasna
2 1
dužina je bila 0.9793 Å. Ovi podaci su prikupljeni pomoću Shamrock Structures (R. Walter i G. Ranieri) i obrađeni su sa HKL2000. Prikupljeni statistički podaci za ovaj kristal su rezimirani ispod i u Tabeli 25:
Prostorna grupa: C2;
Jedinična ćelija: a = 199.3 Å; b = 48.7 Å; c = 138.8 Å; β = 118.2°;
Mozaičnost 0.62-0.71; Odbijena zapažanja: 70; 0.08%.
TABELA 25
Modeli molekulske zamene:
[0169] Model dAt-a, BMS3h-56-5, je izveden iz PDB ID 2VYR lanca E ostataka 1-124 sa sekvencijalnim ostacima koji odgovaraju CDR-ima 31-35, 50-57, i 99-111 uklonjenim pomoću SPLIT_PDB (što odgovara numerisanju po Kabatu 31-35, 50-56, i 95-100G) i potom propuštenim kroz MUTATE i konačno ponovo numerisani pomoću RENUMBER. MUTATE menja ne-identične ostatke u minimalno identične, tj., normalno Ala ili Gly, ali, na primer Tyr→Phe i Phe→Tyr bi rezultiralo u Phe. Ne stvaraju se nikakvi atomi, iako za Thr→Val, Val→Thr, Cys→Ser, i Ser→Cys, će supstituisati odgovarajuće ime atoma, ali ne menja poziciju. RENUMBER je promenio numerisanje u numerisanje po Kabatu (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5. izdanje, U.S. Dept. Health & Human Services, Vašington, D.C. (1991)), koje je standardni sistem numerisanja za antitela koji olakšava opis CDR-a i okvirnog regiona ostataka.
2 2
[0170] CD40 model je konstruisan iz PDB IDs 1JMA (lanac B), 1NCF (lanac A), 1TNR (lanac R), 2HEV (lanac R), 2HEY (lanci R, T), i 2UWI (lanci A, B) primenom phenix.ensembler (University of Cambridge, UK) da bi se kreirao komplet struktura. N-terminalni delovi (ostaci 24-78) plus šest segmenata ostatka (ostaci 95-100) ovih molekula su preklopivi sa prihvatljivim korenom srednjeg kvadrata rastojanja za Cα atome, i to je primenjeno kao model za CD40 N-terminalni region.
Metode molekulske zamene:
[0171] Program PHASER (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40: 658-674 (2007)) je primenjen za molekulsku zamenu. Translaciona funkcija Z-score (TFZ) i porast u logverovatnoće dobitka “log-likelihood gain” su praćeni da bi se odlučilo da li su prava rešenja pronađena. TFZ rezultati od 8 i iznad generalno predstavljaju rešenje. Manji TFZ rezultati praćeni značajnim porastom (>50) u log-likelihood gain takođe su prihvatljivi pokazatelji.
Metode građenja modela, meodifikacije gustine, i kristalografskog prečišćenja:
[0172] Sredstva za izradu modela za molekulske grafike uključuju COOT program (Emsley et al., Acta Crystallogr Sect. D 60: 2126-2132 (2004); Emsley et al., "Features and Development of Coot," Acta Crystallogr Sect. D 66: 486-501 (2010)). Modifikacija gustine korišćenjem mape nekristalografske simetrije za dobijanje proseka je izvedena primenom poznatih programa modifikacije gustine i drugih programa da bi se izračunali Ojlerovi uglovi i translacije između molekula. Prečišćenje se obavlja primenom autoBUSTER (GlobalPhasing,Ltd.: Bricogne et al., Acta Crystallogr. Sect. D 60: 2210-2221 (2004); Tronrud et al., Acta Crystallogr. Sect. A 43: 489-501 (1987)).
Sistem numerisanja domen antitela:
[0173] Sistem numerisanja ostataka za domen antitelo prati onaj po Kabatu. Numerisanje po Kabatu se poredi sa jednostavnim sekvencijalnim numerisanjem ispod za BMS3h-56-5:
2
U numerisanju po Kabatu BMS3h-56-5 ima umetnute ostatke 52A, 82A, 82B, 82C i nedostaje mu ostatak 100. U oba sistema numerisanja Ser i Thr na N-terminalnom delu koji su deo eksprimirajućeg konstrukta su sa dodeljenim negativnim brojevima.
Određivanje strukture CD40/BMS3h-56-5 kompleksa:
[0174] PHASER je sposoban da locira četiri BMS3h-56-5 dAb molekula u 1222 kristalnom obliku i tri molekula BMS3h-56-5 dAt-a u C2 kristalnom obliku. U I222 kristalnom obliku TFZ rezultati se kreću od 7.6 do 41.0, i porast u “log-likelihood gain” se kreće od 77 do 446. Ova rešenja za molekule BMS3h-56-5 dAt-a formiraju spiralne kolone molekula dAt-a kroz I222 kristal koje su odvojene od drugih kolona velikim kanalima. U C2 kristalu TFZ rezultati se kreću od 7.7 do 16.5, i porast u “log-likelihood gain” se kreće od 110 do 150. Pakovanje dAt-a u ovom kristalnom obliku nije ponavljano niti simetrično.
[0175] Primenom sastvljenog modela za N-terminalni domen kod CD40, četiri molekula N-terminalnog domena iz CD40 se mogu postaviti u 1222 kristalni oblik sa TFZ rezultatima koji se kreću od 5.7 do 8.5, i porastom u “log-likelihood gain” koji se kreće od 83 do 389. Četiri N-terminalna domena iz CD40 u 1222 kristalnom obliku formiraju grupu jednako centriran između četiri kolone molekula dAt-a. Ipak, oni ne dodiruju molekul BMS3h-56-5 dAt-a. U C2 kristalnom obliku se mogu postaviti tri molekula N-terminalnog domena iz CD40 sa TFZ rezultatima koji se kreću od 5.8 do 12.1, i porastom u “log-likelihood gain” koji se kreće od 100 do 198. U ovom kristalnom obliku, N-terminalni domeni takođe ne dodiruju molekule BMS3h-56-5 dAt-a.
2 4
[0176] U 1222 kristalnom obliku, N-terminalni domen od CD40 iz CD40/Chi220 Fab kompleksa i N-terminalni domen iz 2UWI su preklopljeni na CD40 N-terminalni domen. Sposobnost da se poveže N-terminalni deo sa posebnim BMS3h-56-5 dAt-om je dozvolila primenu mape nekristalografske simetrije (NCS) za dobijanje proseka. Polazni koeficijenti korelacije za NCS uprosečivanje su dali vrednosti van dijagonale od 0.71-0.81. Konačne vrednosti van dijagonale su bile 0.88-0.92. Gustina elektrona u blizini N-terminalnog regiona je jasna, i put se može pratiti za CDR3 iz BMS3h-56-5 dAt-a. Ostaci 82-94 i 101-121 iz CD40/Chi220 Fab' kompleksa su preklopljeni na odgovarajuće ostatke na 2UWI i potom je primenjen COOT da se ručno poveća uklapanje. Ova pozicija za drugi domen (ostaci 82-94 i 101-121) iz CD40 je potom transformisana na ostala tri N-terminalna domena.
[0177] Ciklus prečišćavanja je obavljen sa R-free smanjenjem od 0.437 do 0.380 i R-work od 0.447 do 0.381 sa poboljšanjem devijacija korena srednjih kvadrata veze i ugla od idealnih vrednosti. Dobijena mapa gustine elektrona je pokazala da ostatak 109 ima bočni lanac koji odgovara Trp-u i da gustina postoji za barem neke ostatke od 70 ostataka C-terminalnog CD40.
[0178] S obzirom da CD40 ima malu sekundarnu strukturu, uklapanje C-terminalnih ∼70 ostataka elektronu je dokazano kao teško, pa je Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Base tražio pogodan model da se pomogne praćenje vođenja lanca. Najbolja dva pogotka sa 16 od 44 identiteta i 24 od 44 podudaranja bila su 2AW2 i 1JMA, koji imaju istu sekvencu:
Identični ostaci su navedeni odgovarajućim kodom sa jednim slovom na konsenzus liniji i slični ostaci su navedeni na konsenzus liniji kao zvezdice. Ovo su bili ostatci kao za ostatke 41-84 N-terminalnog domena iz CD40:
2
Identični ostaci su navedeni odgovarajućim kodom sa jednim slovom na konsenzus liniji i slični ostaci su navedeni na konsenzus liniji kao zvezdice.
Podudaranje disulfidnih veza:
Upoređivanje disulfidnih veza u ostacima 41-84 i 125-168 u CD40
[0179]
Ostaci u zagradama ostaju van opsega ostataka pri ponavljanju sekvence.
[0180] Sa 1JMA/2AW2 modelom kao primerom, COOT program je primenjen za uklapanje jednog od CD40 lanaca. Ovaj model uklapanja je potom preklopljen na jedan od ostala tri CD40 lanca. Ipak, činilo se da je pozicija ovog novog dela ostataka različito orjentisana u druga dva CD40 lanca, i oni se nisu uklapali ovog puta. Ciklus prečišćavanja je obavljen sa R-free smanjenjem od 0.393 do 0.366 i R-work od 0.400 do 0.349 sa značajnim poboljšanjem devijacija korena srednjih kvadrata veze i ugla od idealnih vrednosti.
[0181] BMS3h-56-5 dAt iz jednog od molekula u 1222 kristalnom obliku je preklopljeno na svako od tri dAt-a u C2 kristalnom obliku. Ta transformaciona matrica je primenjena da se orjentiše drugi i C-terminalni domeni 1222 kristalnog oblika. Model je obnovljen primenom COOT programa. Ciklus prečišćavanja je obavljen sa R-free smanjenjem od 0.361 do 0.334 i R-work od 0.375 do 0.306 sa poboljšanjem devijacija korena srednjih kvadrata veze i ugla od idealnih vrednosti. Dobijena mapa gustine elektrona je obezbedila uputstvo za postavljanje mnogo više CD40 ostataka. Drugi ciklus prečišćavanja je obavljen sa R-free smanjenjem od 0.302 do 0.287 i R-work od 0.299 do 0.270 sa poboljšanjem devijacija korena srednjih kvadrata veze i ugla od idealnih vrednosti.
[0182] Konvencionalni model izgradnje i prečišćavanja su potom upotrebljeni da se kompletira strukturna odrednica. Nekoliko dodatnih krugova optimizacije je dovelo do konačnog prečišćenja sa sledećim statističkim podacima: R-free 0.260, R-work 0.228, koren
2
srednjih kvadrata veza 0.010 Å, koren srednjih kvadrata uglova 1.4°. Stvarni prostorni koeficijenti korelacije su 0.92 za atome glavnog lanca i 0.80 za atome bočnog lanca. Konačni model ima 13 molekula vode.
[0183] Primenom modela C-terminalnog domena iz C2 kristalnog oblika kao primer, CD40 modeli u 1222 kristalnom obliku su dodatno prečišćeni. Nekoliko dodatnih krugova modela izgradnje koji primenjuju COOT program i prečišćavanje sa autoBUSTER programom vode do sledećih statističkih podataka: R-free 0.323, R-work 0.292, koren srednjih kvadrata veza 0.011 Å, koren srednjih kvadrata uglova 1.5°. Stvarni prostorni koeficijenti korelacije su 0.91 za atome glavnog lanca i 0.80 za atome bočnog lanca. Model nije sadržao molekule vode. Celokupna struktura CD40/BMS3h-56-5 kompleksa:
[0184] Jedno BMS3h-56-5 dAt se vezuje za jedan CD40 molekul. Kao što je prikazano na SL.1, BMS3h-56-5 se vezuje za epitop koji je različit od onog od antitela Chi220, koji se vezuje u N-terminalnom regionu. CD40 ostaci (SEQ ID NO: 1) su prikazani zelenom bojom, izuzev za epitop ostatke. CD40 epitop ostaci za Chi220 su prikazani plavom bojom; epitop ostaci BMS3h-56-5 dAt-a su prikazani zelenom bojom. Chi220 Fab i BMS3h-56-5 β-nizovi su prikazani crvenom bojom, CDR ostaci su prikazani purpurno-crvenom bojom, i ostale petlje su prikazane narandžastom bojom. Disulfidne veze su prikazane za CD40, Chi220, i BMS3h-56-5 molekule sa atomima sumpora u žutoj boji.
[0185] 1222 kristalni oblik sadrži četiri kristalografski nezavisna CD40/BMS3h-56-5 kompleksa, i C2 kristalni oblik sadrži tri kristalografski nezavisna CD40/BMS3h-56-5 kompleksa. CD40 molekul ima određenu količinu fleksibilnosti, i domeni su različito raspoređeni u sedam jedinstvenih verzija kompleksa, ali celokupna priroda interakcije je zadržana u svim slučajevima.
Epitop ostaci BMS3h-S6-S dAt-a:
[0186] Minimalni CD40 epitop za BMS3h-56-5 je definisan kao CD40 ostaci koji sadrže najmanje jedan atom u kontaktu preko van der Valsove ili vodonične veze sa BMS3h-56-5 atomom. Minimalni epitop u svim kompleksima sadrži sledeće CD40 ostatke pozivajući se na SEKVENCU SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1: Trp109, Leu121, His122, Ser124, Ser156, Ala157, Phe158, Glu159, i His162. Sledeći dodatni ostaci su u kontaktu preko van der Valsove ili vodonične veze u nekim kompleksima: Pro85, Asn86, Leu87, Gly88, Glu106,
2
Glu107, Gly108, His110, Thr112, Cys119, Va1120, Gln133, Ile134, Ala135, Thr136, Ser155, Lys160.
[0187] Maksimalni CD40 epitop je definisan kao ostaci koji sadrže atome koji su prekriveni pomoću 1.7 Å sferne probe. Ovi ostaci uključuju sve iznad pomenute ostatke, plus Val 154 u svim kompleksima. U nekim kompleksima, dodatni prekriveni ostaci su: Ser118, Arg123, Thr141, Phe151, Asp153, Cys161, i Pro163.
[0188] Opis površine BMS3h-56-5 sa kontaktnim ostacima je prikazan na SL. 2. Kontaktni BMS3h-56-5 ostaci su prikazani. Prekriveni ostaci su takođe prikazani. CD40 je predstavljen kao skica sa narandžastom bojom koja predstavlja ne-ponavljajuću sekundarnu strukturu i purpurno-crvenom bojom koja predstavlja epitop ostatke. Takođe prikazani kao stapici (atomi ugljenika u zelenoj boji) su CD40 ostaci Trp109, Ala115, Leu121, Ser126, i His162, koji su pet od sedam ostataka koji se razlikuju između ljudi i cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis). Ala115 i Ser126 su na suprotnim stranama CD40 iz BMS3h-56-5 vezujućeg mesta. Trp109 i Leu121 se vezuju u brazdi BMS-h-56-5 koji se nalazi između CDR-3 i FR-2 (BMS-3h-56-5 ostaci Leu45 i Arg47). His162 od CD40 intaguje sa Arg56 iz CDR-2 od BMS3h-56-5 dAt-a. Mutacija Trp109 značajno smanjuje ili ukida BMS3h-56-5 ativnost.
[0189] Zavisno od kristalografski nezavisnog kompleksa, 660-740 Å<2>od CD40 površine je prekriveno sa između 16-21 kontaktnih ostataka predstavljenih na finijem nivou sa 46-67 kontaktna atoma. Za BMS3h-56-5, 660-780 Å<2>površine je prekriveno sa kontaktnih 14-17 ostataka predstavljenih na finijem nivou sa 48-62 kontaktna atoma. Ovi kontakti daju 3-7 vodoničnih veza i 111-142 van der Valsovih interakcija, zavisno od kristalografski nezavisnog kompleksa.
Primer 11
Identifikujući vezujući epitopi dAt-a na CD40
[0190] Da bi se identifikovali vezujući epitopi dAt-a na CD40, vezivanje dAt-a je ispitano na sedam CD40-Fc fuziona proteina koji sadrže specifične zamene aminokiselinskog ostatka na ostacima 76, 109, ili 121. Ovi CD40-Fc fuzioni proteini uključuju humani CD40 prisutan u prirodi (wild type human CD40 - wt-hCD40), CD40 cinomolgus majmuna prisutan u prirodi (wild type cynomolgus monkey CD40 - wt-cCD40), i pet mutiranih humanih CD40 proteina (M1-M5) sa specifičnim aminokiselinskim ostacima mutiranim do odgovarajućeg ostatka iz
2
sekvence CD40 cinomolgus majmuna (M1, M2, M4, M5) ili CD40 šimpanze (M3). Supstitucije aminokiselina su navedene u Tabeli 26.
[0191] Sekvenca vanćelijskog domena (1-193) humanog CD40 prisutnog u prirodi je iz REFSEQ:pristup NM_001250.3. Cinomolgus i mutantni konstrukti su generisani primenom ciljane mutageneze sekvence tipa prisutnog u prirodi na pozicijama prikazanim u Tabeli 26. Vanćelijski domeni su fuzionisani sa trombin-cepajućim veznikom DPGGGGGRLVPRGFGTGDP (SEQ ID NO: 1273), koji je fuzionisan sa humanim IgG1 Fc. Proteini su eksprimirani u HEK-293-6E ćelijama transfektovanim sa TIG-pYD7-GATE Durocher ekspresionim vektorima. Supernatanti su prikupljeni nakon pet dana. Svaki CD40 protein je prečišćen od prikupljenog medijuma primenom using protein A brze protočne hromatografije. Kolona je isprana sa PBS-om (20 mM natrijum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 7.2) i potom eluiran primenom 80 mM natrijum acetata, pH 3, u 1/5 zapremine 1 M Tris-HCl, pH 8. Eluat je pušten na Superdex-200 kolonu u PBS-u.
TABELA 26
[0192] Reprezentativna dAt'-a iz 3h217, 3h37, 3h38, i 3h56 loza su testirana na njihovo vezivanje za CD40-Fc fuzionisane proteine navedene u Tabeli 26. Testovi su izvedeni na
2
BioRad ProteOn XPR36 SPR instrumentu. SPR površine su pripremljene imobilizacijom 8 µg/ml anti-humanog IgG(Fc) antitela (Biacore/GE Healthcare) u 10 mM natrijum acetata pH 4.5 na BioRad GLC senzor čipu primenom standardne etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukcinimid (NHS) hemije, sa blokiranjem etanolaminom. Radni pufer (running buffer) za imobilizaciju i testove kinetičkog vezivanja je 10 mM natrijum fosfat, 130 mM natrijum hlorid, 0.05% tween 20, pH 7.1. CD40-Fc fuzija proteina pri koncentracijama od 20 µg/ml su uhvaćeni u vertikalnoj orjentaciji na ovim površinama preko Fc repa, i referentne površine bez CD40-Fc proteina su primenjene za referentno oduzimanje. Kinetički eksperimenti su izvedeni pomoću 405, 135, 45, 15, i 5nM dAt analita koji protiču u horizontalnoj orjentaciji preko uhvaćenih CD40-Fc površina na 25°C, primenom 240 s vremena asocijacije, i 420 s vremena disocijsacije, pri brzini protoka od 30 µl/min. Površine su regenerisane i u horizontalnoj i vertikalnoj orjentaciji sa 30 s pulseva 3 M MgCl2nakon čega sledi radni pufer pri 60 µl/min. Senzogram podaci su dvostruko-provereni i potom podešeni sa 1:1 Langmuir modelom primenom BioRad ProteOn Manager V.2.1.0.38 kompjuterskog programa, da bi se odredila konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd), i ravnotežna konstanta disocijacije (KD).
[0193] Za sva dAt-a 3h-37, 3h-38, i 3h-56 loza je utvrđeno da se vezuju sa visokim afinitetom (KD<10<-8>M) za CD40-Fc fuzione proteine koji sadrže humane CD40 ostatke W109 i L121, ali je vezivanje značajno smanjeno ili neuočljivo za CD40-Fc fuzione proteine sa odgovarajućim ostacima iz CD40 cinomolgus majmuna (L109, P121) ili CD40 šimpanzi (R109). Ovo ukazuje da se dAt-a iz svake od 3h37, 3h38--, i 3h56- loza vezuju specifično za epitop koji uključuje ostatke 109 i 121 humanog CD40. Nasuprot tome, svi ispitani članovi 3h-217 loze se vezuju sa sličnim afinitetom za sve ispitane CD40-Fc fuzione proteine, ukazujući da se članovi 3h-217 loze vezuju za mesto na CD40 koje ne uključuje ostatke 76, 109, ili 121. Prema tome, 3h-217 loza se vezuje za drugačiji epitop nego 3h-37, 3h-38, i 3h-56 loze. Tabela 27 rezimira KDvrednosti određene za vezivanje dAt-a za CD40-Fc fuzione proteine primenom SPR na ProteOn XPR36 instrumentu. "X" u Tabeli 27 znači da nije pronađen dokaz za vezivanje pod ovim uslovima.
TABELA 27
1
[0194] Tabela 28 prikazuje konstantu brzine asocijacije (ka), konstantu brzine disocijacije (kd), i ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) određene za vezivanje dAt-a za CD40-Fc fuzione proteine primenom SPR na ProteOn XPR36 instrumentu. "X" u Tabeli 28 znači da nije pronađen dokaz za vezivanje pod ovim uslovima.
TABELA 28
2
4
Primer 12
Konstrukcije Fc fuzionih polipeptida
[0195] Polipeptidi antitela koji sadrže dAt-a mogu biti konstruisani u raznim konfiguracijama, kao što je stavljeno ovde na uvid javnosti. U ovom primeru, razna dAt-a su fuzionosana sa Fc domenom da bi se generisli Fc fuzioni polipeptidi konstrukata varijabilnog domena anti-humanog CD40 kao što su 3h37-202, 3h37-235, 3h37-258, i 3h37-202.
[0196] U jednom reprezentativnom primeru, dAt BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) je fuzionisano sa modifikovanim IgG1 (IgG1*) Fc domenom (SEQ ID NO: 1284). U dAt-IgG1* Fc domen fuzionom polipeptidu, C-terminalni deo dAt-a BMS3h-56-269 je fuzionisan za veznik tripeptid koji ima sekvencu Ala-Ser-Thr, koja je potom fuzionisana sa IgG1* Fc domenom (SEQ ID NO: 1284). IgG1* Fc domen sadrži modifikaciju C5S, koja se odnosi na numerisanje pozicija u SEKVENCI SA ID BROJEM: 1284. C5 iz IgG1 Fc domena normalno formira disulfidnu vezu sa Cys ostatkom u lakom lancu IgG molekulae. IgG1* Fc domen takođe sadrži C11S i C14S mutacije da bi eliminisao međulančane disulfidne veze u IgG1 zglobnom regionu. Konačno, IgG1* Fc domen sadrži P23S mutaciju kako bi se smanjila efektorska funkcija Fc domena. dAt-IgG1* Fc fuzioni polipeptid ima sledeću sekvencu, gde je Ala-Ser-Thr veznik označen podebljanim slovima i modifikacije na Fc domenu su označene podebljanim kosim slovima:
dAt-IgG1* Fc fuzioni polipeptid prikazan u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1286 je monomer koji ima izračunatu molekulsku masu od 39,127 Da. Može formirati dimer koji ima izračunatu molekulsku masu od 78,254 Da.
[0197] dAt BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417) je alternativno fuzionisano sa humanim IgG4Fc domenom (SEQ ID NO: 1285). C-terminalni deo dAt-a BMS3h-56-269 je ponovo fuzionisan za Ala-Ser-Thr veznik, koji je fuzionisan sa IgG4Fc domenom (SEQ ID NO: 1285). IgG4Fc domen sadrži modifikaciju S10P, koja se odnosi na numerisanje pozicija u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1285. BMS3h-56-269-IgG4Fc fuzioni polipeptid ima sledeću sekvencu, gde je Ala-Ser-Thr veznik označen podebljanim slovima i S10P modifikacija je označena podebljanim kosim slovima:
BMS3h-56-269-IgG4Fc fuzioni polipeptid prikazan u SEKVENCI SA ID BROJEM: 1287 je monomer koji ima izračunatu molekulsku masu od 38,867 Da. Može formirati dimer koji ima izračunatu molekulsku masu od 77,734 Da.
[0198] Sekvence BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417), BMS3h-56-269-IgG1* Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 1286), i BMS3h-56-269-IgG4Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 1287) su poravnani ispod, gde je početak Fc domena označen strelicom:
[0199] Fc fuzioni polipeptidi su eksprimirani primenom metoda ćelijske kulture stavljenih na uvid javnosti u primeru 11. Kolona je isprana sa PBS-om (20 mM natrijum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 7.2) i potom eluirana primenom 80 mM natrijum acetata, pH 3, u 1/5 zapremine 1 M Tris-HCl, pH 8. Eluat je pušten kroz Superdex-200 kolonu u PBS-u.
Primer 13
Testovi aktivnosti CD40 Fc fuzionog polipeptida
[0200] Anti-humani CD40 Fc fuzioni polipeptidi su funkcionalno testirani na njihovu sposobnost da antagonizuju CD40 aktivnosti. Ispitane CD40 aktivnosti su B ćelijska proliferacija i proizvodnja citokina pomoću hCD40L-vođene aktivacije primarnih humanih dendritičnih ćelija (dendritic cells - DCs) koje su derivati monocita. B ćelijska proliferacija i proizvodnja citokina su merene primenom testova stavljenih na uvid javnosti u primeru 6. Ukoliko nije drugačije navedeno, svi testovi su izvedeni u RPMI medijumima dopunjenim sa 10% fetalnim telećim serumom (FCS). dAt-Fc domen fuzioni polipeptidi su pokazali snažnu inhibiciju (tj., antagonizam) CD40-zavisne aktivacije. Nije bilo primećenih agonističkih karakteristika među bilo kojim od humaniCD40-specifično dAt-Fc domen fuzionih polipeptida. Rezultati primene raznih testova su prikazani u TABELI 29. 3h56-269-IgG4 je testiran na njegovo vezivanje za imobilisan humani-CD40 primenom testova stavljenih na uvid javnosti u primeru 11. Za 3h56-269-IgG4, očigledni aviditet koji utiče na Kd vrednost za vezivanje imobilisanog humanog-CD40 je izmeren na 30 pM pri 25C i 40 pM pri 37C.
TABELA 29
1
11 LISTA SEKVENCI
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
11
111
112
11
114
11
11
11
11
11
12
121
122
12
124
12
12
12
12
12
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
14
141
142
14
144
14
14
14
14
14
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
1
1 1
1 2
1
1 4
1
1
1
1
1
11
111
112
11
114
11
11
11
11
11
111
111
111
111
111
111
111
112

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid antitela koji sadrži prvi varijabilni domen koji je pojedinačni varijabilni domen, gde je aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena odabrana od aminokiselinskih sekvenci BMS3h-56-201 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 9 (SEQ ID NO: 9), BMS3h-56-202 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 350, BMS3h-56-203 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 351, BMS3h-56-206 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 354, BMS3h-56-215 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 363, BMS3h-56-217 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 365, BMS3h-56-224 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 372, BMS3h-56-232 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 380, BMS3h-56-239 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 387, BMS3h-56-243 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 391, BMS3h-56-244 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 392, BMS3h-56-246 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 394, BMS3h-56-248 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 396, BMS3h-56-253 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 401, BMS3h-56-258 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 10, BMS3h-56-261 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 409, BMS3h-56-262 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 410, BMS3h-56-265 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 413, BMS3h-56-266 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 414, BMS3h-56-269 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 417 i BMS3h-56-270 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 418,
gde se polipeptid antitela vezuje za CD40, i
gde vezivanje polipeptida antitela za CD40 antagonizuje CD40 aktivnost.
2. Polipeptid antitela prema patentnom zahtevu 1, gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena je aminokiselinska sekvenca BMS3h-56-269 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 417.
3. Polipeptid antitela prema patentnom zahtevu 1, gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena je aminokiselinska sekvenca BMS3h-56-258 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 10.
4. Polipeptid antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde polipeptid antitela je fuzioni polipeptid koji sadrži prvi varijabilni domen i Fc domen.
5. Polipeptid antitela prema patentnom zahtevu 4, gde polipeptid antitela sadrži BMS3h-56-269-IgG1* Fc fuzioni polipeptid SEKVENCE SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1286.
6. Polipeptid antitela prema patentnom zahtevu 4, gde polipeptid antitela sadrži BMS3h-56-269-IgG4 Fc fuzioni polipeptid SEKVENCE SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1287.
7. Polipeptid antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde polipeptid antitela dodatno sadrži drugi varijabilni domen koji specifično vezuje drugi antigen, gde drugi antigen je antigen drugačiji od humanog CD40.
8. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.
9. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 8.
10. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 9.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efikasnu količinu polipeptida antitela bilo kog od patentnih zahteva 1-7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, gde aminokiselinska sekvenca prvog varijabilnog domena polipeptida antitela je aminokiselinska sekvenca BMS3h-56-269 prikazana u SEKVENCI SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 417.
13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, gde polipeptid antitela sadrži BMS3h-56-269-IgG1* Fc fuzioni polipeptid SEKVENCE SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1286.
14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, gde polipeptid antitela sadrži BMS3h-56-269-IgG4 Fc fuzioni polipeptid SEKVENCE SA IDENTIFIKACIONIM BROJEM: 1287.
15. Farmaceutska kompozicija bilo kog od patentnih zahteva 11-14 za primenu u metodi lečenja imunološke bolesti.
16. Farmaceutska kompozicija za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 15, gde je imunološka bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od Adisonove bolesti, alergija, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, ateroskleroze, autoimunih bolesti uha, autoimunih bolesti oka, autoimunog hepatitisa, autoimunog parotitisa, ulcerativnog kolitisa, koronarne bolesti srca, Kronove bolesti, dijabetesa, uključujući Tip 1 i/ili Tip 2 dijabetesa, epididimitisa, glomerulonefritisa, Gravesove bolesti, Guillain-Barre-ovog sindroma, Hašimotove bolesti, hemolitičke anemije, idiopatske trombocitopenijske purpure, inflamatorne bolesti creva, imunog odgovora na rekombinantne proizvode leka, sistemskog eritemskog lupusa, muške neplodnosti, multiple skleroze, miastenije gravis, pemfigusa, psorijaze, reumatske groznice, reumatoidnog artritisa, sarkoidoze, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, spondiloartropatija, tireoiditisa, odbacivanja transplantata, vaskulitisa, AIDS-a, atopijske alergije, bronhijalne astme, ekcema, lepre, šizofrenije, nasledne depresije, transplantacije tkiva i organa, sindroma hroničnog umora, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, infarkta miokarda, moždanog udara, autizma, epilepsije, Arthus-ovog fenomena, i anafilakse.
RS20180346A 2011-04-21 2012-04-20 Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40 RS57087B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161477904P 2011-04-21 2011-04-21
EP12717027.2A EP2699601B1 (en) 2011-04-21 2012-04-20 Antibody polypeptides that antagonize cd40
PCT/US2012/034519 WO2012145673A1 (en) 2011-04-21 2012-04-20 Antibody polypeptides that antagonize cd40

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57087B1 true RS57087B1 (sr) 2018-06-29

Family

ID=46000407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180346A RS57087B1 (sr) 2011-04-21 2012-04-20 Polipeptidi antitela koji antagonizuju cd40

Country Status (35)

Country Link
US (3) US9475879B2 (sr)
EP (2) EP2699601B1 (sr)
JP (2) JP6114256B2 (sr)
KR (2) KR101734614B1 (sr)
CN (2) CN103842382B (sr)
AR (1) AR086360A1 (sr)
AU (2) AU2012245309C1 (sr)
BR (1) BR112013026828A2 (sr)
CA (1) CA2833743A1 (sr)
CL (1) CL2013003043A1 (sr)
CO (1) CO6801649A2 (sr)
CY (1) CY1120637T1 (sr)
DK (1) DK2699601T3 (sr)
EA (1) EA030851B1 (sr)
ES (1) ES2664619T3 (sr)
HR (1) HRP20180571T1 (sr)
HU (1) HUE038848T2 (sr)
IL (1) IL228720B (sr)
LT (1) LT2699601T (sr)
MA (1) MA35035B1 (sr)
ME (1) ME03071B (sr)
MX (1) MX354243B (sr)
MY (1) MY165090A (sr)
NO (1) NO2699601T3 (sr)
PE (1) PE20141188A1 (sr)
PH (1) PH12013502013B1 (sr)
PL (1) PL2699601T3 (sr)
PT (1) PT2699601T (sr)
RS (1) RS57087B1 (sr)
SG (1) SG194561A1 (sr)
SI (1) SI2699601T1 (sr)
SM (1) SMT201800228T1 (sr)
TN (1) TN2013000417A1 (sr)
TW (2) TWI598363B (sr)
WO (1) WO2012145673A1 (sr)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012125569A2 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
TWI598363B (zh) 2011-04-21 2017-09-11 必治妥美雅史谷比公司 拮抗ｃｄ４０之抗體多肽
EP2702078B1 (en) 2011-04-29 2018-11-07 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
SMT202000091T1 (it) 2011-10-13 2020-05-08 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidi anticorpali che antagonizzano cd40l
CN104918957B (zh) * 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
US10435475B2 (en) 2014-03-07 2019-10-08 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize CD40 to treat IBD
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
CA2972990A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Beatrice Tien-Yi WANG Tumor necrosis factor (tnf) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
MA41459A (fr) * 2015-02-03 2017-12-12 Als Therapy Development Inst Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l
CN108025064A (zh) * 2015-05-27 2018-05-11 拉荷亚生技股份有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体和其用于诊断与治疗癌症的用途
UY36692A (es) 2015-05-29 2016-12-30 Abbvie Inc Anticuerpos anti-cd40 y usos de los mismos
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
US20190086405A1 (en) 2016-03-16 2019-03-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing and treating lupus
WO2017220989A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
WO2018088850A2 (ko) 2016-11-11 2018-05-17 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CA3047059A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Novel tnfr agonists and uses thereof
EP3600421A4 (en) * 2017-03-23 2021-01-06 The Trustees of The University of Pennsylvania ANTI-C5A ANTIBODIES AND USES OF THEM
AU2018271915B2 (en) 2017-05-24 2025-03-27 Als Therapy Development Institute Therapeutic anti-CD40 ligand antibodies
EP3630832A1 (en) * 2017-05-25 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH
CN110621697B (zh) 2017-05-25 2023-06-27 百时美施贵宝公司 拮抗性cd40单克隆抗体及其用途
EP3630842A2 (en) 2017-05-30 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-lag-3 antibody, a pd-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
JP7257971B6 (ja) 2017-06-01 2023-07-24 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
CN112839961B (zh) 2018-11-30 2023-04-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种cd40抗体药物组合物及其用途
MX2021005823A (es) 2018-11-30 2021-07-15 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo anti-cd40, fragmento de union a antigeno y uso farmaceutico del mismo.
CN113993893A (zh) * 2019-02-01 2022-01-28 拉法医疗有限公司 新cd40结合抗体
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
US20210032356A1 (en) * 2019-08-02 2021-02-04 Eastern Virginia Medical School Method for treating seizures
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
MX2022007688A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecificos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores solidos.
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US11862306B1 (en) 2020-02-07 2024-01-02 Cvs Pharmacy, Inc. Customer health activity based system for secure communication and presentation of health information
CA3172092A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 David Cheresh Compositions and methods for treating cancer
JP7523586B2 (ja) 2020-05-18 2024-07-26 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 改善された薬物動態特性を有する抗体変異体
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
CA3224374A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US12234294B2 (en) 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
CN114149508B (zh) * 2021-11-25 2023-04-28 苏州普乐康医药科技有限公司 一种结合cd40l的融合蛋白及其应用
AU2023230110A1 (en) 2022-03-08 2024-10-24 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
CN116023495B (zh) * 2022-09-05 2023-10-03 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
KR20250057233A (ko) 2023-10-20 2025-04-29 한상진 이동식 무선 자동 제습기
WO2025129007A1 (en) * 2023-12-15 2025-06-19 Werewool Inc. Soy alginate fibers
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250277048A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5247069A (en) 1986-06-13 1993-09-21 Oncogen Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5182368A (en) 1986-06-13 1993-01-26 Ledbetter Jeffrey A Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
IL104684A0 (en) 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
ATE267607T1 (de) 1993-12-23 2004-06-15 Immunex Corp Verwendung von löslichen oligomerischen cd40 liganden oder monoklonalen antikörpern zur herstellung eines arzneimitells zur vorbeugung oder behandlung von neoplastischen krankheiten
PT892643E (pt) 1996-03-20 2002-09-30 Univ Emory Metodos para inibir uma resposta imunitaria bloqueando os circuitos de gp39/cd40 e ctla4/cd28/b7 e composicoes utilizaveis para o efeito
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
WO2002028481A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Chiron Corporation Methods of therapy for b-cell malignancies using antagonist anti-cd40 antibodies
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
SI1694360T1 (sl) 2003-11-04 2010-12-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Uporaba antagonističnih anti-CD40 protiteles za zdravljenje avtoimunskih in vnetnih bolezni in zavrnitve transplantata organa
TW200540186A (en) * 2003-12-25 2005-12-16 Kirin Brewery Mutants of anti-CD40 antibody
ATE479760T1 (de) 2004-03-24 2010-09-15 Domantis Ltd Universelles signalpeptid gas1
RU2006141632A (ru) 2004-04-27 2008-06-10 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс, Инк. (Us) Антагонистические моноклональные анти-cd40-антитела и способы их применения
UA94213C2 (ru) * 2004-09-17 2011-04-26 Домантис Лимитед Применение полипептида одноцепочечного антитела, который подавляет активность cd40 или cd40l в приготовлении медикамента для лечения аутоиммунного заболевания
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
AR053579A1 (es) 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
ZA200710496B (en) 2005-06-02 2009-04-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to CD20 and used thereof
AR057253A1 (es) * 2005-12-16 2007-11-21 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40l y metodos que los utilizan
BRPI0710572A2 (pt) 2006-01-24 2013-01-08 Domantis Ltd ligante, uso do ligante, mÉtodos para o tratamento de uma doenÇa alÉrgica, de asma e de cÂncer, para a inibiÇço de uma resposta imune do tipo th2, e administraÇço de tratamento anti-il-4 e tratamento anti-il-13, composiÇço farmacÊutica, dispositivo de dispensaÇço de droga, Ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, cÉlula hospedeira, mÉtodos para a produÇço de um ligante e de inibiÇço da proliferaÇço de cÉlulas
BRPI0710826A2 (pt) 2006-04-21 2011-08-23 Novartis Ag composições farmacêuticas de anticorpo anti-cd40 antagonista
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
CN102083461B (zh) * 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
EP2350649A4 (en) * 2008-11-28 2012-11-14 Abbott Lab STABLE ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR STABILIZING THE SAME
SG183947A1 (en) 2010-03-31 2012-10-30 Boehringer Ingelheim Int Anti-cd40 antibodies
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
TWI598363B (zh) 2011-04-21 2017-09-11 必治妥美雅史谷比公司 拮抗ｃｄ４０之抗體多肽

Also Published As

Publication number Publication date
HUE038848T2 (hu) 2018-11-28
ES2664619T3 (es) 2018-04-20
PT2699601T (pt) 2018-04-05
AU2016202672A1 (en) 2016-05-26
CA2833743A1 (en) 2012-10-26
AU2016202672B2 (en) 2017-07-20
US11136406B2 (en) 2021-10-05
CN106977604A (zh) 2017-07-25
NZ618025A (en) 2015-10-30
EP3372616A1 (en) 2018-09-12
LT2699601T (lt) 2018-03-26
MX354243B (es) 2018-02-20
SMT201800228T1 (it) 2018-07-17
AU2012245309C1 (en) 2016-07-21
ME03071B (me) 2019-01-20
MY165090A (en) 2018-02-28
AU2012245309A1 (en) 2013-12-12
CN103842382A (zh) 2014-06-04
AU2012245309B2 (en) 2016-02-04
BR112013026828A2 (pt) 2016-11-29
DK2699601T3 (en) 2018-04-23
KR101734614B1 (ko) 2017-05-12
JP6114256B2 (ja) 2017-04-12
PL2699601T3 (pl) 2018-05-30
SI2699601T1 (en) 2018-04-30
JP2017099391A (ja) 2017-06-08
US20170015754A1 (en) 2017-01-19
IL228720A0 (en) 2013-12-31
US10544228B2 (en) 2020-01-28
KR101905346B1 (ko) 2018-10-05
CN103842382B (zh) 2017-03-15
US20200199244A1 (en) 2020-06-25
EP2699601A1 (en) 2014-02-26
CO6801649A2 (es) 2013-11-29
KR20170049628A (ko) 2017-05-10
EA201391564A1 (ru) 2014-02-28
CY1120637T1 (el) 2019-12-11
EA030851B1 (ru) 2018-10-31
IL228720B (en) 2018-12-31
TW201712038A (zh) 2017-04-01
US9475879B2 (en) 2016-10-25
SG194561A1 (en) 2013-12-30
TWI598363B (zh) 2017-09-11
HRP20180571T1 (hr) 2018-05-18
JP2014513953A (ja) 2014-06-19
TW201245225A (en) 2012-11-16
CL2013003043A1 (es) 2014-06-20
PH12013502013B1 (en) 2018-11-28
US20140099317A1 (en) 2014-04-10
NO2699601T3 (sr) 2018-06-16
EP2699601B1 (en) 2018-01-17
KR20140009505A (ko) 2014-01-22
PE20141188A1 (es) 2014-09-22
MA35035B1 (fr) 2014-04-03
MX2013011966A (es) 2014-02-11
WO2012145673A1 (en) 2012-10-26
TN2013000417A1 (en) 2015-03-30
AR086360A1 (es) 2013-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11136406B2 (en) Methods of treating immune diseases by administering antibody polypeptides that antagonize CD40
CN117098561A (zh) Ccr8抗体及其应用
AU2016202717A1 (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40l
JP2024511642A (ja) 新規ｔｎｆｒ２結合分子
TW202202526A (zh) Fab-HCAb結構的結合蛋白
HK1260001A1 (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40
HK1195085A (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40
HK1195085B (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40
NZ618025B2 (en) Antibody polypeptides that antagonize cd40
HK1204789B (zh) 拮抗cd40l的抗體多肽