[go: up one dir, main page]

RS57024B1 - Anti-pseudomonas psl vezujući molekuli i njihova upotreba - Google Patents

Anti-pseudomonas psl vezujući molekuli i njihova upotreba

Info

Publication number
RS57024B1
RS57024B1 RS20180333A RSP20180333A RS57024B1 RS 57024 B1 RS57024 B1 RS 57024B1 RS 20180333 A RS20180333 A RS 20180333A RS P20180333 A RSP20180333 A RS P20180333A RS 57024 B1 RS57024 B1 RS 57024B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
binding
cam
aeruginosa
Prior art date
Application number
RS20180333A
Other languages
English (en)
Inventor
Antonio Digiandomenico
Paul G Warrener
Charles K Stover
Bret Sellman
Sandrine Guillard
Ralph Minter
Steven Rust
Mladen Tomich
Original Assignee
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medimmune Ltd filed Critical Medimmune Ltd
Publication of RS57024B1 publication Critical patent/RS57024B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
POZADINA
Oblast obelodanjivanja
[0001] Ovo obelodanjivanje odnosi se na anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule i njihovu upotrebu, naročito pri sprečavanju i tretiranju Pseudomonas infekcije. Štaviše, obelodanjivanje daje sastave i metode za sprečavanje i tretiranje Pseudomonas infekcije. Pozadina obelodanjivanja
[0002] Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) je gram-negativni oportunistički patogen koji izaziva oba, akutne i hronične infekcije kod ugroženih pacijenata (Ma i dr., Journal of Bacteriology 189(22):8353-8356 (2007)). Ovo je delom usled visoke prirodne otpornosti bakterije na klinički korišćene antibiotike, i delom usled formiranja biofilmova visoko otpornih na antibiotike (Drenkard E., Microbes Infect 5:1213-1219 (2003); Hancokc & Speert, Drug Resist Update 3:247-255 (2000)).
[0003] P. aeruginosa je česti uzrok infekcija dobijenih u bolnici u zapadnom svetu. Često je agent izazivanja baktermije kod žrtava opekotina i pojedinaca sa ugroženim imunim sistemom (Lyczak i dr., Microbes Infect 2:1051-1060 (2000)). Najčešći je uzrok nozokomijalne gram-negativne upale pluća (Craven i dr., Semin Respir Infect 11:32-53 (1996)), naročito kod pacijenata sa mehaničkom ventilacijom, i patogen je koji najviše preovlađuje u plućima pojedinaca sa cističnom fibrozom (Pier i dr., ASM News 6:339-347 (1998)). Ozbiljne P. aeruginosa infekcije mogu postati sistemske, što se završava sa sepsom. Sepsa je okarakterisana teškom sistemskom inflamacijom, koja se često ispoljava u otkazivanju više organa i smrti.
[0004] Pseudomonas Psl egzopolisaharid prijavljen je da pričvršćen za površinu P. aeruginosa i misli se da je značajan pri olakšavanju kolonizacije tkiva domaćina i uspostavljanju/održavanju formiranja biofilma (Jackson, K.D., i dr., J Bacteriol 186, 4466-4475 (2004)). Njegova struktura čini ponavljajući pentasaharid bogat manozom (Byrd, M.S., i dr., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)). B. Borlee i dr., Molecular Microbiology (2010) 75(4), pp.827-842 prikazuje da Psl polisaharid interaguje sa proteinom CdrA u biofilmu i obelodanjuje poliklonalna antitela protiv Psl egzopolisaharida.
[0005] Usled povećavajuće otpornosti na više lekova, preostaje potreba u struci za razvijanjem novih strategija za identifikaciju novih Pseudomonas-specifičnih profilaktičkih i terapeutskih agenasa.
KRATAK REZIME
[0006] Jedno otelotvorenje usmereno je na monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, egzopolisaharid, gde antitelo promoviše OPK od P. aeruginosa.
[0007] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za isti Pseudomonas Psl epitop kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji čini varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) regiona WapR-004, Cam-003, Cam-004 ili Cam-005.
[0008] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje pomoću antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL od WapR-004, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005.
[0009] Neka otelotvorenja koja obuhvataju predmetno obelodanjivanje obuhvataju vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je opisano iznad, gde VH i VL od WapR-004 sadrže SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:12, respektivno, VH i VL od Cam-003 sadrže SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2, respektivno, VH i VL od Cam-004 sadrže SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:2, respektivno, i VH i Vl od Cam-005 sadrže SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:2, respektivno.
[0010] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za isti Pseudomonas Psl epitop kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži VH i VL regione od WapR-001, WapR-002 ili WapR-003.
[0011] Dalje je obelodanjen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje pomoću antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL od WapR-001, WapR-002, ili WapR-003.
[0012] Neka otelotvorenja obuhvataju vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kao što je opisano iznad, gde VH i VL od WapR-001 sadrže SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6, respektivno, VH i VL od WapR-002 sadrže SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8, respektivno i VH iVL od WapR-003 sadrže SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10, respektivno.
[0013] Dalje je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti Pseudomonas Psl epitop kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži VH i VL regione od WapR-016.
[0014] Takođe je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje pomoću antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji sadrži VH i VL od WapR-016.
[0015] Neka otelotvorenja obuhvataju vezujući molekul npr., antitelo ili njegov fragment kao što je opisano iznad gde VH i VL od WapR-06 sadrže SEQ ID NO:SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO:16, respektivno.
[0016] Takođe je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH antitela, gde VH sadrži sekvencu aminokiseline bar 90% identičnu ili identičnu sa SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, ili SEQ ID NO: 15.
[0017] Neka otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži sekvencu aminokiseline bar 90% identičnu ili identičnu sa SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, i SEQ ID NO: 16.
[0018] Takođe je dato izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas psl, koji sadrži VH i VL sekvencu aminokiseline bar 90% identičnu ili identičnu sa :(a) SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, respektivno, (b) SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2, respektivno, (c) SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2 , respektivno, (d) SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 , respektivno, (e) SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8, respektivno, (f) SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10, respektivno, (g) SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 , respektivno, (h) SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 14, respektivno; ili (i) SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, respektivni. U specifičnim otelotvorenjima, iznad-opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 i VL sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 2. U drugim otelotvorenjima, iznad-opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže VH sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 11 i VL sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 12.
[0019] Takođe je obelodanjen vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH antitela, gde VH sadrži VH region-1 koji određuje komplementarnost (VHCDR1) sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina sa: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, ili SEQ ID NO: 59.
[0020] Takođe je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH antitela, gde VH sadrži VH region-2 koji određuje komplementarnost (VHCDR2) sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri ili dve zamene aminokiseline sa: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, ili SEQ ID NO: 60.
[0021] Dalje je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH antitela, gde VH sadrži VH region-3 koji određuje komplementarnost (VHCDR3) sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri ili dve zamene aminokiseline sa: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ili SEQ ID NO: 61.
[0022] Takođe je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži VL region-1 (VLCDR1) koji određuje komplementarnost sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri ili dve zamene aminokiseline sa: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, ili SEQ ID NO: 62.
[0023] Dalje je obelodanjen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži VL region-2 koji određuje komplementarnost (VLCDR2) sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri ili dve zamene aminokiseline sa: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, ili SEQ ID NO: 63.
[0024] Neka otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži VL region-3 (VLCDR3) koji određuje komplementarnost sa sekvencom aminokiseline identičnom sa ili identičnom osim za četiri, tri ili dve zamene aminokiseline sa: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, ili SEQ ID NO: 64.
[0025] Takođe je dat izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH antitela, gde VH sadrži VHCDR1, VHCDR2, i VHCDR3 sekvence aminokiseline identične sa, ili identične osim za četiri tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina u jednom ili više od VHCDR sa: SEQ ID NO: 17, 18, i 19, SEQ ID NO: 23, 24, i 25, SEQ ID NO: 26, 27, i 28, SEQ ID NO: 29, 30, i 31, SEQ ID NO: 35, 36, i 37, SEQ ID NO: 41, 42, i 43, SEQ ID NO: 47, 48, i 49, SEQ ID NO: 53, 54, i 55, ili SEQ ID NO: 59, 60, i 61, respektivno.
[0026] Neka otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži VLCDR1, VLCDR2, i VLCDR3 sekvence aminokiseline identične sa, ili identične osim za četiri tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina u jednom ili više od VHCDR sa: SEQ ID NO: 20, 21, i 22, SEQ ID NO: 32, 33, i 34, SEQ ID NO: 38, 39, i 40, SEQ ID NO: 44, 45, i 46, SEQ ID NO: 50, 51, i 52, SEQ ID NO: 56, 57, i 58, ili SEQ ID NO: 62, 63, i 64, respektivno.
[0027] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL antitela, gde VL sadrži VLCDR1, VLCDR2, i VLCDR3 i VLCDR3 sekvence aminokiseline identične sa ili identične osim za četiri tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina u jednom ili više od VHCDR sa: SEQ ID NO: 20, 21, i 22, SEQ ID NO: 32, 33, i 34, SEQ ID NO: 38, 39, i 40, SEQ ID NO: 44, 45, i 46, SEQ ID NO: 50, 51, i 52, SEQ ID NO: 56, 57, i 58, ili SEQ ID NO: 62, 63, i 64, respektivno.
[0028] Neka otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je opisano iznad, koji (a) može da inhibira vezivanje f Pseudomonas aeruginosa za epitelne ćelije, (b) može da promoviše OPK P. aeruginosa, ili (c) može da inhibira vezivanje P. aeruginosa to epitelnih ćelija i može da promoviše OPK P. aeruginosa.
[0029] Druga otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je opisano iznad, gde se maksimalno inhibiranje P. aeruginosa vezivanja za epitelne ćelije ostvaruje pri koncentraciji antitela od oko 50 µg/ml ili manje, 5,0µg/ml ili manje, ili oko 0,5µg/ml ili manje, ili pri koncentraciji antitela u opsegu od oko 30 µg/ml do oko 0,3 µg/ml, ili pri koncentraciji antitela od oko 1 µg/ml, ili pri koncentraciji antitela od oko 0,3 µg/ml.
[0030] Određena otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je opisano iznad gde je OPK EC50 manje od oko 0,5 µg/ml, manje od oko 0,05µg/ml, ili manje od oko 0,005µg/ml, ili gde je OPK EC50 u opsegu od oko 0,001 µg/ml do oko 0,5 µg/ml, ili gde je OPK EC50 manje od oko 0,2 µg/ml, ili gde je OPK EC50 manje od oko 0,02 µg/ml.
[0031] Takođe je obuhvaćen izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov fragment kao što je opisano ispod, koji se specifično vezuje za P. aeruginosa Psl sa afinitetom okarakterisanim konstantom disocijacije (KD) koja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M, ili gde je KDu opsegu od oko 1 x 10<-10>do oko 1 x 10<-6>M. U jednom otelotvorenju, izolovani antitelo kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl, sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1.18 x 10<-7>M, kao što je određeno sa OCTET® testom vezivanja. u drugom otelotvorenju, izolovano antitelo kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl, sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1.44 x 10<-7>M, kao što je određeno sa OCTET® testom vezivanja.
[0032] U različitim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli su humanizovani.
[0033] U različitim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli su himerni.
[0034] U različitim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli su potpuno ljudski.
[0035] U određenim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli su Fab fragmenti, Fab' fragmenti, F(ab)2fragmenti ili scFv fragmenti.
[0036] U određenim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli sadrže konstantu regiona lakog lanca koji se sastoje od ljudskog regiona kapa konstante ili ljudskog regiona lambda konstante.
[0037] U određenim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli sadrže konstantu regiona teškog lanca ili njegov fragment. U daljim otelotvorenjima, konstanta regiona teškog lanca ili njegov fragment je ljudski IgG1.
[0038] U određenim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli su monoklonalna antitela.
[0039] U nekim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli npr., antitela ili njegovi fragmenti konjugovani su sa agensom izabranim iz grupe koju čine antimikrobni agens, terapeutski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, detektabilna oznaka, polietilen glikol (PEG), ili kombinacija dva ili više bilo koja navedena agensa. U daljim otelotvorenjima, detektabilna oznaka izabrana je iz grupe koja se sastoji iz enzima, fluorescentne oznake, hemiluminiscentne oznake, bioluminiscentne oznake, radioaktivne oznake, ili kombinacije dve ili više bilo koje navedene detektabilna oznake.
[0040] Dodatna otelotvorenja obuhvataju sastave koji sadrže iznad opisane vezujuće molekule npr., antitela i njegove fragmente i nosač.
[0041] Određena otelotvorenja obuhvataju izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira iznad opisani VH. U nekim otelotvorenjima polinukleotid dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira iznad opisani VL, gde je vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment izražen specifičnim vezivanje polinukleotida za Pseudomonas Psl. U nekim otelotvorenjima polinukleotid kao što je ovde opisano kodira scFv molekul uključujući VH i VL, koji sadrži nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 ili SEQ ID NO: 70. U drugim otelotvorenjima, obelodanjivanje obuhvata izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira iznad opisani VL. U daljim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira iznad opisani VH, gde je vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment izražen specifičnim vezivanjem polinukleotida za Pseudomonas Psl.
[0042] Određena otelotvorenja daju vektore koji sadrže iznad opisane polinukleotide. U sledećim otelotvorenjima, polinukleotidi su operativno povezani sa promoterom. U dodatnim otelotvorenjima, obelodanjivanje daje ćelije domaćina koje sadrže takve vektore. U sledećim otelotvorenjima, obelodanjivanje daje vektore gde je polinukleotid operativno povezan sa promoterom, gde vektori mogu da vrše ekspresiju vezujućeg molekula npr., antitela ili njegovog fragmenta kao što je opisano iznad koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl u pogodnoj ćeliji domaćina.
[0043] Neka otelotvorenja daju metodu za proizvodnju vezujućeg molekula npr., antitela ili njegovog fragmenta kao što je opisano iznad koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor koji sadrži iznad opisane polinukleotide i vraćanje navedenog antitela ili njegovog fragmenta. Sledeća otelotvorenja daju izolovani vezujući molekul ili njegov fragment proizveden iznad opisanom metodom.
[0044] U nekim otelotvorenjima, Pseudomonas vrsta je Pseudomonas aeruginosa.
[0045] U sledećim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli ili njihovi fragmenti, antitela ili njihovi fragmenti, ili sastavi vezuju se za dva ili više, tri ili više, četiri ili više ili pet ili više različitih P. aeruginosa serotipova, ili za bar 80 bar 85%, bar 90% ili bar 95% P. aeruginosa sojeva izolovanih iz zaraženih pacijenata. U sledećim otelotvorenjima sojevi P. aeruginosa izolovani su iz jednog ili više od pluća, pljuvačke, oka, gnoja, izmeta, urina, sinusa, rane, kože, krvi, kosti, ili tečnosti kolena. P. aeruginosa serotipovi kategorisani su u skladu sa International Antigen Typing System (IATS) originalno opisano u Liu, P.V. i dr. Int. J. Syst. Bacteriol.33:256-264 (1983), dok je dopunjeno u npr., Liu P.V., Wang S., J. Clin. Microbiol.28:922-925 (1990).
[0046] Neka otelotvorenja usmerena su na metode sprečavanja ili tretiranja Pseudomonas infekcije kod subjekta koji ima potrebu za time, koje obuhvataju davanje subjektu efektivne količine vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta, antitela ili njegovog fragmenta, sastava, polinukleotida, vektora ili ćelije domaćina ovde opisane. U daljim otelotvorenjima, Pseudomonas infekcija je P. aeruginosa infekcija. U nekim otelotvorenjima, subjekt je čovek. U određenim otelotvorenjima, infekcija je očna infekcija, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, kožna infekcija, infekcija krvi, infekcija kosti, ili kombinacije dve ili više navedenih infekcija. U daljim otelotvorenjima, subjekt ima akutnu upalu pluća, povredu od opekotine, infekciju rožnjače, cističnu fibrozu ili njihove kombinacije.
[0047] Neka otelotvorenja usmerena su na metodu blokiranja ili sprečavanja vezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije koja obuhvata dovođenje u kontakt smeše epitelnih ćelija i P. aeruginosa sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, sastavom, polinukleotidom, vektorom ili ćelijom domaćina ovde opisanom.
[0048] Takođe je obelodanjena metoda promovisanja OPK od P. aeruginosa koja obuhvata dovođenje smeše ćelija fagocita i P. aeruginosa u kontakt sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, sastavom ,polinukleotidom, vektorom ili ćelijom domaćina ovde opisanom. U daljim otelotvorenjima, ćelije fagocita su diferencirane HL-60 ćelije ili ljudski polimorfonuklearni leukociti (PMN).
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
1
Slika 1 (A-F): Fenotipski skrining celih ćelija sa ljudskim bibliotekama faga antitela identifikovanim P. aeruginosa funkcionalno aktivnim specifičnim antitelima. (A) Pregled cele strategije odabira antitela. (B) Dijagram toka koji opisuje proces izolovanja varijabilnog regiona gena antitela iz pacijenata koji su nedavno izloženi P. aeruginosa. (C) Karakteristike prikaznih biblioteka scFv faga, koje ukazuju na veličinu i raznolikost repertoara kloniranog antitela. (D) Upoređivanje efikasnosti prikazanog odabira faga upotrebom ili biblioteke antitela pacijenta ili biblioteke izvornih antitela, kada je izabrano P. aeruginosa 3064 Δ WapR (<1>) ili P. aeruginosa PAO1 MexAB OprM Δ WapR (<2>) u suspenziji. Kolone pokazuju izlazne titre (u CFU) u svakom krugu odabira i krugovi ukazuju na proporciju udvostručenih VH CDR3 sekvenci, kao indikacija klonalnog obogaćenja. (E) ELISA skrin prikaza scFv od faga za test vezivanje više sojeva P. aeruginosa. ELISA podaci (adsorbancija pri 450 nm) prikazani su za pojedinačne fag-scFvs iz odabira i jedan irelevantni fag-scFv. (F) FACS vezivanje P. aeruginosa specifičnih antitela sa reprezentativnim sojevima iz jedinstvenih P. aeruginosa serotipova. Za svako antitelo testirano ljudsko IgG negativno kontrolno antitelo prikazano je kao osenčeni vrh.
Slika 2 (A-D): Procenjivanje specifičnih mAbs koje promovišu OPK P. aeruginosa (A) Test opsonofagocitoze sa luminiscentnom P. aeruginosa serogrupom 05 soja (PAO1.lux), sa razblaživanjem prečišćenih monoklonalnih antitela izvedenih iz ispiranja faga. (B) Test opsonofagocitoze sa luminiscentnom P. aeruginosa serogrupom O11 soja (9882-80.lux), sa sa razblaživanjem prečišćenih WapR-004 i Cam-003 monoklonalnih antitela izvedenih iz ispiranja faga. Kod oba A i B, R347 izotop koji se poklopio sa ljudskim monoklonalnim antitelom koji se nije vezalo za P. aeruginosa antigene, korišćeno je kao negativna kontrola. (A,B) Rezultat su reprezentativni podaci od tri nezavisna eksperimenta izvršena za svako antitelo. (C-D): Procenjivanje Cam-003 promovisanja opsonofagocitnog ubijanja (OPK) P. aeruginosa (C) Test Opsonofagocitoze sa reprezentativnim ne-mukoidnim sojevima iz klinički relevantnih O-antigen serotipova (6294 (06 ExoU-), 6077 (O11 ExoU<+>), 9882-80.lux (O11 ExoU-), 33356 (09 ExoU-), 2410.lux (06) i 6206.lux (O11 ExoU<+>)). (D) Test opsonofagocitoze sa reprezentativnim mukoidnim sojevima koji su projektovani da budu luminiscentni (A004.lux, A010.lux i A015.lux). Linije predstavljaju procenat ubijanja i kolone grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Procenat ubijanja izračunat je relativno u odnosu na dobijene rezultate u testovima izvršenim u prisustvu antitela. (C,D) R347 kontrola je korišćena unutar pojedinačnih testova za svaki soj. Jednostavnosti radi, R347 kontrola nije obuhvaćena u slikama. Rezultati su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta izvršena za svaki soj. Slika 3 (A-K): Identifikacija P. aeruginosa Psl ciljanih polisaharida antitela izvedenih iz fenotipskog skrininga. Reaktivnost antitela određena je indirektnom ELISA na pločama obloženim sa ukazanim P. aeruginosa sojevima: (A) divlji tip PAO1, PAO1ΔwbpL, PAO1ΔrmlC i PAO1ΔgalU. (B) PAO1ΔpslA. Genway antitelo specifično je za P. aeruginosa protein spoljašnje membrane i korišćeno je kao pozitivna kontrola. (C) FACS vezujuća analiza Cam-0003 za PAO1 i PAO1ΔpslA. Cam-003 ukazan je punom crnom linijom i čistim vrhom; izotip koji se poklopio sa ne-P. aeruginosa-specifičnim ljudskim G1 antitelom korišćen je kao negativna kontrola i ukazan je kao siva linija i osečeni vrh. (D) LPS prečišćen od PAO1 i PAO1ΔpslA rastvoren je sa SDS-PAGE i imunoblot je napravljen sa antiserumom izvedenim iz miševa vakcinisanih sa PAO1ΔwapRΔalgD, mutirani soj deficitan sa O-antigen transportom do spoljašnje membrane i proizvodnjom alginata. (E) Cam-003 ELISA podaci vezivanja sa izogenim mutantima PAO1. Traka 1: PAO1ΔwbpLΔalgD; Traka 2: PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA; Traka 3: PAO1ΔwbpLΔalgDΔpelA; Traka 4: PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA pUCP; Traka 5: PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA pPW145. pPW145 je pUCP ekspresioni vektor koji sadrži pslA. * Ukazuje na P<0.005 upotrebom Mann-Whitney U-testa u poređenju sa Cam-003 vs. R347 vezivanjem. (F i G) Testovi opsonofagocitoze koji ukazuju da Cam-003 posreduje samo ubijanju sojeva koji su u stanju da vrše proizvodnju Psl (divlji tip PAO1 i PAO1ΔpslA dopunjeni in trans sa pslA genom). (H i I) ELISA podaci koji ukazuju na reaktivnost anti-Psl antitela WapR-001, WapR-004, i WapR-016 sa PAO1 ΔwbpLΔalgD i PAO1 ΔwbpLΔalgDΔpslA. (J) Reaktivnost antitela određena je indirektnim ELISA na pločama obloženim sa ukazanim P. aeruginosa sojevima: divlji top PAO1, PAO1ΔwbpL, PAO1ΔwbpLΔalgD, PAO1ΔrmlC i PAO1ΔgalU. R347 je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima. (A, B, C, F, G, H, I, J). Svaki panel je reprezentativni set podataka iz tri nezavisna eksperimenta. (K) Anti-Psl antitelo prikaz obogaćenog Psl izolovanog iz celih P. aeruginosa ćelija kao što je mereno sa FORTEBIO® OCTET® 384 instrumentom. R347 je korišćen kao negativna kontrola. Rezultati su reprezentativni podaci iz tri nezavisna eksperimenta. ;Slika 4: Anti-Psl mAbs inhibirano ćelijsko vezivanje luminiscentnih P. aeruginosa sojeva PAO1.lux za A549 ćelije. Log-faza PAO1.lux dodata je konfluentnom monosloju od A549 ćelija pri MOI 10 što je praćeno analizom RLU nakon ponavljanja ispiranja kako bi se uklonilo nevezani P. aeruginosa. Rezultati su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta izvršena u duplikatu za svaku koncentraciju antitela. ;Slika 5 (A-U): In vivo održavanje/povećavanje ekspresije Psl predmetnih P. aeruginosa sojeva. Cam-003 antitelo prikazano je kao puna crna linija i kao čisti vrh; ljudska IgG negativna kontrola antitela prikazana je kao siva linija i osenčeni vrh. (A) Za pozitivnu kontrolu, Cam-003 je testiran za vezivanje za sojeve gajene do log faze iz kulture preko noći (∼5 x 10<8>/ml). (B) Inokula za svaki soj pripremljen je do 5 x 10<8>CFU/ml od TSA ploče preko noći gajene do rasta i testirane za reaktivnost na Cam-003 protočnom citometrijom. (C) Četiri sata posle intraperitonealnog izazova, bakterije su sakupljene iz miševa peritonealnim ispiranjem i testirane su za prisustvo Psl sa Cam-003 protočnom citometrijom. (D) četiri sata i (E) dvadeset četiri sata nakon intranazalnog izazova, bakterije su sakupljene iz miševa bronhoalveolarnim ispiranjem (BAL) i testirane na prisustvo Psl sa Cam-003 protočnom citometrijom. Svaki panel protočne citometrije reprezentativan je set podataka iz pet nezavisnih eksperimenata (F-U) Vezivanje P. aeruginosa specifičnih antitela (Cam-003, Cam-004 i Cam-005) za reprezentativne sojeve iz jedinstvenih P. aeruginosa serotipova (F) PAO1(O5), (G) 2135 (O1), (H) 2531 (O1), (I) 2410 (06), (J) 2764 (O11), (K) 2757 (O11), (L) 33356 (09), (M) 33348 (O1), (N) 3039 (NT), (O) 3061 (NT), (P) 3064 (NT), (Q) 19660 (NT), (R) 9882-80 (O11), (S) 6073 (O11), (T) 6077 (O11) i (U) 6206 (O11). Cam-003, Cam-004, i Cam-005 antitela prikazana su kao sive linije i čisti vrh; ljudska IgG negativna kontrolna antitela prikazana su kao puna crna linija i osenčeni vrh. ;Slika 6 (A-G): Stope preživljavanja za životinje tretirane sa anti-Psl monoklonalnim antitelima Cam-003 ili WapR-004 u P. aeruginosa modelu akutne upale pluća. (A-D) Životinje su tretirane sa Cam-003 pri 45, 15 i 5 mg/kg i R347 pri 45 mg/kg ili PBS 24 sata pre intranazalne infekcije sa (A) PAO1 (1,6 x 10<7>CFU), (B) 33356 (3 x 10<7>CFU), (C) 6294 (7 x 10<6>CFU), (D) 6077 (1 x 10<6>CFU). (E-F) Životinje su tretirane sa WapR-004 pri 5 i 1mg/kg kao što je ukazano što je praćeno sa infekcijom sa 6077 at (E) (8 x 10<5>CFU), ili (F) (6 x 10<5>CFU). Životinje su pažljivo praćene za preživljavanje do 72 sata (A-D) ili 120 sati (E-F). (G) Životinje su tretirane sa Cam-003 at 15 mg/kg ili 5 mg/kg, ili R347 pri 15 mg/kg 24 sata pre intranazalne infekcije sa PAO1 (4,4 x 10<7>CFU), i Cam-003 pri 15 mg/kg 24 sata pre intranazalne infekcije ;;;1 ;sa PAO1ΔpslA (3 x 10<7>CFU). U svim eksperimentima, PBSi R347 je služilo kao negativne kontrole. Rezultati su prikazani kao Kaplan-Meier krive preživljavanja; razlike u preživljavanju izračunate su preko Log-rank testa za Cam-003 vs. R347. (A) Cam-003 (45mg/kg - P<0,0001; 15mg/kg - P=0,0003; 5mg/kg - P=0,0033). (B) Cam-003 (45mg/kg - P=0,0012; 15mg/kg - P=0,0012; 5mg/kg - P=0,0373). (C) Cam-003 (45mg/kg - P=0,0007; 15mg/kg - P=0,0019; 5mg/kg - P=0,0212). (D) Cam-003 (45mg/kg - P<0,0001; 15mg/kg - P<0,0001; 5mg/kg - P=0,0001). Rezultati su reprezentativni za bar dva nezavisna eksperimenta. (E) [Cam-003 (5mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P=0,02; Cam-003 (1mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P=0,4848; WapR-004 (5mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P=0,0886; WapR-004 (5mg/kg) vs. Cam-003 (5mg/kg): P=0,0017; WapR-004 (1mg/kg) vs. Cam-003 (1mg/kg): P=0,2468; R347 (5mg/kg) vs. PBS: P=0,6676] (F) [Cam-003 (5mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P=0,0004; Cam-003 (1mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (1mg/kg) vs. R347 (5mg/kg): P<0,0001; WapR-004 (5mg/kg) vs. Cam-003 (5mg/kg): P=0,0002; WapR-004 (1mg/kg) vs. Cam-003 (1mg/kg): P=0,2628; R347 (5mg/kg) vs. PBS: P=0,6676. (G) Cam-003 (15mg/kg - P=0,0028; 5mg/kg - P=0,0028)]. ;Rezultati su reprezentativni za pet nezavisnih eksperimenata. ;Slika 7 (A-F): Anti-Psl monoklonalna antitela, Cam-003 i WapR-004, smanjuju opterećenje organa nakon indukcije akutne upale pluća. Miševi su tretirani sa Cam-003 antitelima 24 sata pre infekcije sa (A) PAO1 (1,1 x 10<7>CFU), (B) 33356 (1 x 10<7>CFU), (C) 6294 (6,25 x 10<6>CFU) (D) 6077 (1 x 10<6>CFU), i WapR-004 antitelima 24 sata pre infekcije sa (E) 6294 (∼1 x 10<7>CFU), i (F) 6206 (∼1 x 10<6>CFU).24 sata nakon infekcije, životinje su eutanazirane što je praćeno sa sakupljanjem ili organima za identifikaciju sposobnih CFU. Razlike sposobnih CFU određene su Mann-Whitney U-testom za Cam-003 ili WapR-004 vs. R347. (A) Pluća: Cam-003 (45mg/kg -P=0.0015; 15mg/kg - P=0,0021; 5mg/kg - P=0,0015); Slezina: Cam-003 (45mg/kg -P=0,0120; 15mg/kg - P=0,0367); Bubrezi: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0092; 15mg/kg -P=0,0056); (B) Pluća: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0010; 15mg/kg - P<0,0001; 5mg/kg - P=0,0045); (C) Pluća: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0003; 15mg/kg - P=0,0039; ;5mg/kg - P=0,0068); Slezina: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0057; 15mg/kg - P=0,0230; 5mg/kg - P=0,0012); (D) Pluća: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0005; 15mg/kg -P=0,0003; 5mg/kg - P=0,0007); Slezina: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0015; 15mg/kg -P=0,0089; 5mg/kg - P=0,0089); Bubrezi: Cam-003 (45mg/kg - P=0,0191; 15mg/kg P=0,0355; 5mg/kg - P=0,0021). (E) Pluća: WapR-004 (15mg/kg - P=0,0011; 5mg/kg - P=0,0004; 1mg/kg - P=0,0002); Slezina: WapR-004 (15mg/kg - P<0,0001; 5mg/kg - P=0,0014; 1mg/kg - P<0,0001); F) Pluća: WapR-004 (15mg/kg - P<0,0001; 5mg/kg - P=0,0006; 1mg/kg - P=0,0079); Slezina: WapR-004 (15mg/kg - P=0,0059; 5mg/kg - P=0,0261; 1mg/kg - P=0,0047); Bubreg: WapR-004 (15mg/kg - P=0,0208; 5mg/kg - P=0,0268. ;Slika 8 (A-G): Anti-Psl monoklonalna antitela Cam-003 i WapR-004 aktivna su u P. aeruginosa modelu keratitisa i modelu termalne povrede. Miševi su tretirani sa kontrolnim IgG1 antitelima ili Cam-003 pri 45mg/kg (A, B) ili 15mg/kg (C, D) ili PBS ili kontrolnim IgG1 antitelima ili Cam-003 pri 45mg/kg ili WapR-004 pri 45mg/kg ili 15mg/kg ili 5mg/kg (F, G) 24 sata pre infekcije sa 6077 (O11-citotoksični - 2 x 10<6>CFU). Neposredno pre infekcije, tri 1 mm ogrebotine su napravljene na levoj rožnjači svake životinje što je praćeno sa topikalnom primenom P. aeruginosa u 5 µl inokulumu. 24 sata nakon infekcije, kornealni patološki rezultati izračunati su što je praćeno uklanjanjem oka za određivanje sposobnih CFU. Razlike u rezultatima patologije i sposobnim CFU određeni su Mann-Whitney U-testom. (A) P=0,0001, (B) P<0,0001, (C) P=0,0003, (D) P=0,0015. (F) i (G) Cam-003 (45mg/kg) vs. WapR-004 (45mg/kg): P=0,018; Cam-003 (45mg/kg) vs. WapR-004 (15mg/kg): P=0,0025; ;WapR-004 (45mg/kg) vs. WapR-004 (15mg/kg): P=0,1331; WapR-004 (5mg/kg) vs. Ctrl: P<0,0001. Rezultati su reprezentativni za pet različitih eksperimenata. (E) Analiza preživljavanja od Cam-003 i R347 tretiranih CF-1 miševa u P. aeruginosa modelu termalne povrede nakon 6077 povrede (2 x 10<5>CFU) (log-rank: R347 vs. Cam-003 15mg/kg, P=0,0094; R347 vs. Cam-003 5mg/kg, P=0,0017). Rezultati su reprezentativni bar za tri nezavisna eksperimenta. (n) se odnosi na broj životinja u svakoj grupi. ;Slika 9 (A-E): A Cam-003 Fc mutant antitelo, Cam-003-TM, je smanjio OPK i in vivo efikasnost ali se održava anti-ćelijska aktivnost povezivanja. (A) PAO1.lux OPK test sa Cam-003 i Cam-003-TM, što prihvata mutacije u Fc domenu koji sprečava Fc interakcije sa Fcγ receptorima (Oganesyan, V., i dr., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008)). R347 je korišćen kao negativna kontrola. Rezultati su reprezentativni podaci za tri nezavisna eksperimenta. (B) PAO1 test ćelijskog povezivanja sa Cam-003 i Cam-003-TM. Rezultati su reprezentativni podaci za dva nezavisna eksperimenta. (C-E) Model akutne upale pluća koji poredi efikasnost Cam-003 vs. Cam-003-TM. P. aeruginosa soja 6077 modela akutne upale pluća upotrebom ;;;1 ;BALB/c miševa inokuliranih sa (C) 1,22 x 10<6>(D) 2,35 x 10<5>ili (E) 1,07 x 10<6>poređenjem efikasnosti Cam-003 sa Cam-003-TM. Miševi su tretirani sa antitelom 24 sata pre izazova. (C-E) Deset životinja korišćeno je u svakoj grupi. Rezultati su reprezentativni podaci iz dva nezavisna eksperimenta. ;Slika 10 (A-B): A: Mapiranje epitopa i identifikacija afiniteta relativnog vezivanja za anti-Psl monoklonalna antitela. Mapiranje epitopa izvršeno je kompeticijom ELISA i potvrđeno je upotrebom OCTET® protočnog sistema sa Psl izvedenim iz supernatanta kulture preko noći P. aeruginosa soja PAO1. Afiniteti relativnog vezivanja mereni su na FORTEBIO® OCTET® 384 instrumentu. Takođe su prikazane koncentracije antitela gde je ćelijsko vezivanje maksimalno inhibirano i OPK EC50 vrednosti za svako antitelo. B. Afiniteti relativnog vezivanja različitih WapR-004 mutanta kao što je mereno na FORTEBIO® OCTET® 384 instrumentu. Takođe su prikazane OPK EC50 vrednosti za različite mutante. ;Slika 11: (A-M): Evolucija WapR-004 (W4) mutanta klonova u P. aeruginosa OPK testu (A-M) Test opsonofagocitoze sa luminiscentnom P. aeruginosa serogrupom 05 soja (PAO1.lux), sa razblaženjem različitih W4 mutant klonova u scFv-Fc formatu. U nekim instancama, W4 IgG1 je uključen u testu i ukazan je kao W4-IgG1. W4-RAD-Cam i W4-RAD-GB predstavljaju istu WapR-004RAD sekvencu koja je ovde opisana. „W4-RAD“ je skraćeni naziv za WapR-004RAD, i W4-RAD-Cam i W4-RAD-GB oznake u panelima D do M predstavljaju dva različita pripremanja WapR-004RAD. U svim eksperimentima, R347, ljudsko IgG1 monoklonalno antitelo koje se ne vezuje za P. aeruginosa antigene, korišćeno je kao negativna kontrola. ;Slika 12: Metoda konjugacije sprovedene van mesta za Polimiksin B (PMB) do mAbs u kojima je heterobifunkcionalni SM-PEG12veznik (Pierce) konjugovan do primarnog amina na PMB pod uslovima određenim u korist konjugacije pojedinačnog veznika. Efikasnost konjugacije i nivoi slobodnog PMB-veznika u uzorcima određeni su sa UPLC i masenom spektrometrijom. ;Slika 13 (A-B): PMB-mAb konjugati usmereni na mesto. Upotrebom razvijene metode konjugacije usmerene na mesto, PMB je konjugovan sa CAM-003 i A7 (hIgG1 kontrola) mAb varijante sa ili jednim (SM, ND10), dva (DM, ND10/19) ili tri (TM, ND4/10/19) cisteina projektovana u Fc region. A: Cam-003 i A7 Fc region mutirani ostaci. B: Prosečan broj PMB u PMB-mAb konjugatima (pojedinačni mutant (SM) > dvostruki mutant 1 (DM1) > dvostruki mutant 2 (DM2)). ;;;1 ;Slika 14 (A-B): Procena vezivanja PMB-mAb konjugata za divlji tip P. aeruginosa PAO1 ćelija sa FACS analizom. A: Cam-003 (Cam-003-SM-PMB, Cam-003-DM1-PMB, Cam-003-DM2-PMB, lažni-konjugovani divlji tip Cam-003 (Cam-003-Mock-PMB)). B: A7 kontrolni konjugati (A7-SM-PMB, A7-DM1-PMB, A7-DM2-PMB, lažni-konjugovani divlji tip A7 (A7-Mock-PMB)). R347 je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima. ;Slika 15 (A-B): OPK aktivnost PMB-mAb konjugata protiv A: P. aeruginosa PAO1 divljeg tipa soja i B: protiv ΔpslA P. aeruginosa soja koji ne pokazuje Ps1 cilj. ;Slika 16 (A-B): Neutralizacija P. aeruginosa LPS sa PMB-mAb konjugatima. A: PMB-Cam-003 konjugati i lažni konjugati divljeg tipa Cam-003 i B: PMB-A7 konjugati i lažni-konjugovati divlji tip A7. ;Slika 17: Struktura prikazuje polimiksin, ciklični antibakterijski lipopeptid koji neutralizuje proinflamatorne efekte LPS i može biti korišćen za tretiranje Gramnegativnih MDR infekcija (kolisitin/polimiksin E). Polimiksini imaju 5 pozitivno naelektrisanih diamonbuternih kiselina (kružne) koje posreduju interakcije sa negativno-naelektrisanim Lipidom A u LPS i neutralizuju proinflamatornu aktivnost. Slika 18 (A-B): OPK aktivnost sa ljudskom HL-60 neutrofil ćelijskom linijom u prisustvu zečijeg komplementa procenjena je upotrebom P. aeruginosa soja PAO1 koji vrši ekspresiju bakterijske luciferaze. A: % ubijanja sa CAM-003-PMB Konjugatima. B: % ubijanja sa A7-PMB Konjugatima. ;Slika 19 (A-B): A. Procenat preživljavanja C57B1/6 miševa doziranih sa 45 mg/kg CAM-TM-PMB Konjugatima. B: Procenat preživljavanja C57B1/6 miševa doziranih sa 45 mg/kg A7-TM-PMB Konjugatima. ;Slika 20 (A-B): A. Procenat preživljavanja C57B1/6 miševa doziranih sa 45 mg/kg, 15 mg/kg i 5 mg/kg CAM-TM-PMB Konjugatima. B: Procenat preživljavanja C57B1/6 miševa doziranih sa 45 mg/kg, 15 mg/kg i 5 mg/kg A7-TM-PMB Konjugatima. ;Slika 21 (A-C): Procenat preživljavanja C57B1/6 miševa doziranih sa mAb ili PMB-mAb konjugatima i.p A: 10 mg/kg. B: 1 mg/kg. C: 0.1 mg/kg. ;;DETALJNI OPIS ;I. DEFINICIJE ;[0050] Treba napomenuti da izraz „a“ ili „an“ entiteta se odnose na jedan ili više od tog entiteta; na primer, „vezujući molekul koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl,“ ;;;1 ;prihvata se da predstavlja jedan ili više vezujućih molekula koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl. Kao takvi, izrazi „a“ (ili „an“), „jedan ili više“, i „bar jedan“ mogu se naizmenično ovde upotrebljavati. ;;[0051] Kao što se ovde koristi, termin „polipeptid“ namenjen je da obuhvati pojedinačni „polipeptid“ kao i više „polipeptida“, i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama takođe poznatim kao peptidne veze). Termin „polipeptid“ odnosi se na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Stoga, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „lanac aminokiseline“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi da se odnosi na lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, obuhvaćeni su u definiciji „polipeptida“ i termin „polipeptid“ može biti korišćen umesto, ili naizmenično sa bilo kojim od ovih termina. ;Termin „polipeptid“ takođe je namenjen da se odnosi na proizvode modifikacija nakon ekspresije polipeptida, uključujući bez ograničenja, glikozilaciju, acetilaziju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje ili modifikaciju aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. Polipeptid može biti izveden iz prirodnih bioloških izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može biti stvoren na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu. ;;[0052] Polipeptid kao što je ovde obelodanjeno može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više 500 ili više, 1.000 ili više ili 2.000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako nemaju nužno takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom nazivaju se savijenim, i polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, ali mogu da prihvate veliki broj različitih konformacija, nazivaju se nesavijenim. Kao što se ovde koristi, termin glikoprotein odnosi se na protein spojen sa bar jednom grupom ugljenih hidrata koja je povezana za protein preko bočnog lanca koji sadrži kiseonik ili azot ostatka aminokiseline, npr., serin ostatak ili asparagin ostatak. ;;[0053] „Izolovani“ polipeptid ili fragment, varijanta ili njegov derivat odnosi se na poli peptid koji nije u svom prirodnom okruženju. Nije potreban naročiti nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može biti uklonjen iz svog početnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini čija se ekspresija vrši u ćelijama domaćina ;;;1 ;smatraju se izolovanim kao što je ovde opisano, kako su prirodni ili rekombinantni polipeptidi koji su bili razdvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom. ;;[0054] Drugi polipeptidi koji su ovde opisani su fragmenti, derivati, analozi, ili varijante prethodnih polipeptida i bilo koja njihova kombinacija. Termini „fragment“, „varijanta“, „derivat“ i „analog“ kada se odnose na vezujući molekul kao što je antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl kao što je ovde opisano obuhvataju bilo koje polipeptide koji zadržavaju bar neko od svojstava antigen-vezivanja odgovarajućeg izvornog antitela ili polipeptida. Fragmenti polipeptida obuhvataju, na primer, proteolitičke fragmente kao i fragmente uništavanja, dodatno specifičnim fragmentima antitela razmatrani ovde na drugom mestu. Varijante vezujućih molekula, npr., antitelo koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl kao što je ovde obelodanjeno obuhvata fragmente kao što je opisano iznad i takođe polipeptide sa izmenjenim sekvencama aminokiseline usled zamena, uništavanja ili unošenja aminokiselina. Varijante se mogu pojaviti prirodno ili veštački. Varijante koje se veštački pojavljuju mogu biti proizvedene upotrebom poznatih tehnika mutageneze. Varijantni polipeptidi mogu sadržati konzervativne ili nekonzervativne zamene, uništavanje ili dodavanje aminokiselina. Derivati vezujućeg molekula npr., antitela koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl kao što je ovde opisano su polipeptidi koji su bili izmenjeni tako da pokazuju dodatna svojstva koja se ne nalaze na izvornim polipeptidima. Primeri obuhvataju fuzione proteine. Varijantni polipeptidi takođe se mogu nazivati „analozi polipeptida“. Kao što se ovde koristi „derivat“ vezujućeg molekula npr., antitela koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl odnosi se na predmetni polipeptid koji ima jedan ili više ostataka hemijski izvedenih reakcijom funkcionalne bočne grupe. Takođe obuhvaćeni kao „derivati“ su oni peptidi koji sadrže jedan ili više prirodnih derivata aminokiselina od dvadeset standardnih aminokiselina. Na primer, 4-hidroksiprolin može biti zamenjen sa prolinom; 5-hidroksilizin može biti zamenjen sa lizinom; 3-metilhistidin može biti zamenjen sa histidin; homoserin može biti zamenjen sa serinom; i ornitin može biti zamenjen sa lizinom. ;;[0055] Termin „polinukleotid“ namenjen je da obuhvati pojedinačnu nukleinsku kiselinu kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukt, npr., informacionu RNK (mRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu fosfodiester vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr., amidnu vezu, kao što se ;;;1 ;nalazi kod peptida nukleinski kiselina (PNA)). Termin „nukleinska kiselina“ odnosi se na jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr., DNK ili RNK fragmenti prisutni u polinukleotidu. „Izolovana“ nukleinska kiselina ili polinukleotid odnosi se na molekul nukleinske kiseline DNK ili RNK, koji su uklonjeni iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantno polinulkleotidno kodiranje vezivanja molekula, npr., antitela koje se specifično vezuje za Pseudomonas Psl sadržano u vektoru smatra se izolovanim kao što je ovde opisano. Dalji primeri izolovanih polinukleotida obuhvataju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani RNK molekuli obuhvataju in vivo ili in vitro RNK transkripte ili polinukleotide. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline dalje obuhvataju molekule koji se sintetički proizvode. Dodatno, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu sadržati regulatorni element kao što su promoter, mesto vezivanja ribozoma ili određivač transkripcije. ;;[0056] Kao što se ovde koristi, „region kodiranja“ je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona koji su prevedeni u aminokiseline. Iako „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) nije preveden u aminokiselinu, može se smatrati da je deo regiona kodiranja, ali bilo koje bočne sekvence, na primer, promoteri, mesta vezivanja ribozoma, određivači transkripcije, introni i slično, nisu deo regiona kodiranja. Dva ili više regiona kodiranja mogu biti prisutna u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr., na jednom vektoru ili u različitim polinukleotidnim konstruktima, npr., na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, bilo koji vektor može sadržati pojedinačni region kodiranja ili može sadržati dva ili više regiona kodiranja, npr., pojedinačni vektor može odvojeno kodirati varijabilni region teškog lanca imunoglobulina i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina. Dodatno, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu kodirati heterologne regione kodiranja, ili spojene ili koji nisu spojeni sa nukleinskom kiselinom koja kodira vezujući molekul koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat. Heterologni regioni kodiranja obuhvataju bez ograničenja specijalizovane elemente ili motive, kao što su peptid signala lučenja i heterologni funkcionalni domen. ;;[0057] U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina su DNK. U slučaju DNK, polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid obično može sadržati promoter i/ili druge elemente kontrolisanja transkripcije ili prevođenja operativno povezane sa jednim ili više regiona kodiranja. Operativna veza je kada je region ;;;2 ;kodiranja za proizvod gena, npr., polipeptid, povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci na takav način da postavlja ekspresiju proizvoda gena pod uticaj kontrole ili regulatornih sekvenci. Dva DNK fragmenta (kao što su polipeptidni region kodiranja i promoter povezan sa njim) „operativno su povezani“ ukoliko se indukovanje funkcije promotera ispolji u transkripciji mRNK koja kodira željeni proizvod gena i ukoliko priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost vršenja ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije proizvoda gena ili ne utiče na sposobnost DNK šablona da bude transkribovan. Stoga, region promotera bi bio operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ukoliko bi promoter bio u stanju da efektivno transkribuje tu nukleinsku kiselinu. Promoter može biti promoter specifičan za ćeliju koji usmerava suštinsku transkripciju DNK samo u prethodno određene ćelije. Drugi elementi kontrolisanja transkripcije, pored promotera, na primer poboljšivači, operatori, represori i signalni određivanja transkripcije mogu operativno biti povezani sa polinukleotidnom do direktne transkripcije specifične za ćeliju. Pogodni promoteri i drugi regioni kontrolisanja transkripcije ovde su obelodanjeni. ;;[0058] Različiti kontrolni regioni transkripcije poznati su stručnima u ovoj oblasti. Oni obuhvataju, bez ograničenja regione kontrolisanja transkripcije koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti promotera i poboljšivača iz citomegalovirusa (neposredni rani promoter u konjunkciji sa intronom-A), simian virusa 40 (rani promoter) i retrovirusa (kao što je Rausov virus sarkoma). Drugi regioni kontrolisanja transkripcije obuhvataju one izvedene iz gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i β-globin zeca, kao i druge sekvence koje su u stanju da kontrolišu ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni kontrolisanja transkripcije obuhvataju promotere specifične za tkivo i poboljšivače kao i limfokininducibilne promotere (npr., promoteri inducibilni interferonima ili interleukinima). ;;[0059] Slično, više različitih elemenata kontrolisanja prevođenja, poznato je stručnima u ovoj oblasti. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na mesta vezivanja ribozoma, kodone iniciranja i određivanja prevođenja i elemente izvedene iz pikornavirusa (naročito mesto ulaza unutrašnjeg ribozoma ili IRES, takođe koje se naziva kao CITE sekvenca). ;;[0060] U drugim otelotvorenjima, polinukleotid može biti RNK, na primer u obliku informacione RNK (mRNK). ;[0061] Regioni kodiranja polinukleotida i nukleinske kiseline mogu biti povezani dodatnim regionima kodiranja koji kodiraju signalne ili peptide za lučenje, koji upravljaju lučenje polipeptida kodiranog polinukleotidima kao što je ovde obelodanjeno, npr., polinukleotidno kodiranje vezujućeg molekula koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivati. Prema hipotezi signala, proteini koje luče ćelije sisara imaju signalni peptid ili sekvencu vođenja lučenja koja se odvaja od zrelog proteina kada se eksportovanje rastućeg proteinskog lanca preko grubog entoplazmatskog retikulima započne. Stručni u ovoj oblasti svesni su da polipeptidi izlučeni od strane ćelije kičmenjaka imaju signalni peptid spojen na N-terminusu polipeptida, koji je odvojen od celog ili polipeptida „pune dužine“ kako bi proizveo izlučenu ili „zrelu“ formu polipeptida. U određenim otelotvorenjima, izvorni signalni polipeptid, npr., signalni peptid teškog ili lakog lanca imunoglobulina se koristi, ili funkcionalni derivat one sekvence koja zadržava sposobnost direktnog lučenja polipeptida koji je operativno povezan sa njom. Alternativno, heterologni signalni peptida sisara, ili njegov funkcionalni derivat može biti korišćen. Na primer, vodeća sekvenca divljeg-tipa može biti zamenjena sa vodećom sekvencom plazminogen aktivatora ljudskog tkiva (TPA) ili sa mišijom β-glukuronidazom. ;;[0062] Ovde su obelodanjeni određeni vezujući molekuli, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati. Ukoliko se naročito ne odnosi na antitela pune veličine kao što su prirodna antitela, termin „vezujući molekul“ obuhvata antitela pune veličine kao i antigen-vezujuće fragmente, varijante, analoge ili derivate takvih antitela, npr., prirodna antitela ili imunoglobulin molekuli ili projektovani molekuli antitela ili fragmenti koji vezuju antigen na način sličan molekulima antitela. ;;[0063] Kao što se ovde koristi, termin „vezujući molekul“ odnosi se u najširem smislu na molekul koji specifično vezuje antigenu determinantu. Neograničavajući primer antigen vezujućeg molekula je antitelo ili njegov fragment koji sadržava antigen-specifično vezivanje. ;;[0064] Termini „antitelo“ i „imunoglobulin“ mogu se naizmenično ovde upotrebljavati. Antitelo (ili njegov fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde obelodanjeno sadrže bar varijabilni domen teškog lanca i bar varijabilne domene teškog lanca i lakog lanca. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka relativno su dobro shvaćene. Videti, npr., Harlow i dr., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). ;;[0065] Kao što će se detaljnije razmatrati ispod, termin „imunoglobulin“ sadrži različite široke klase polipeptida koje se mogu razlikovati biohemijski. Oni stručni u ovoj oblasti prihvatiće da su teški lanci klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon (γ, µ, α, δ, ε) sa nekim pod klasama među njima (npr., γ1-γ4). U prirodi je ovog lanca da određuje „klasu“ antitela kao IgG, IgM, IgA IgG, ili IgE, respektivno. Pod klase (izotipovi) imunoglobulina npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. dobro su okarakterisani i poznati da dodeljuju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova su prepoznatljive stručnima u ovoj oblasti u pogledu trenutnog prikazivanja i, u skladu sa time, su unutar okvira ovog obelodanjivanja. ;;[0066] Laki lanci klasifikovani su ili kao kapa ili lambda (κ, λ). Svaki teški lanac može biti vezan ili sa kapa ili lambda lakim lancem. Uopšteno, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugi, i delovi „repa“ dva teška lanca spojena su međusobno kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama kada su imunoglobulini stvoreni ili pomoću hibridoma, B ćelija i su generalno projektovane ćelije domaćina. U teškom lancu, sekvence aminokiselina prostiru se od N-terminusa na razdvojenim krajevima Y konfiguracije do C-terminusa na dnu svakog lanca. ;;[0067] Oba, laki i teški lanci podeljeni su na regione strukturne i funkcionalne homologije. Termini „konstanta“ i „varijabla“ funkcionalne se koriste. U vezi sa time, biće prihvaćeno da varijabilni domeni oba, delovi lakog (VL) i teškog (VH) lanca određuju prepoznavanje antigena i specifičnost. Obratno, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) dodeljuju značajna biološka svojstva kao što su lučenje, transplacetalna mobilnost, vezivanje Fc receptora, komplementarno vezivanje i slično. Konvencijom numerisanje konstantnih domena regiona povećava se kako postaju udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminusa antitela. N-terminalni deo je varijabilni region i C-terminalni deo je konstantni region; CH3 i CL domeni zapravo sadrže karboksi-terminus teškog i lakog lanca, respektivno. ;;[0068] Kao što je iznad ukazano, varijabilni region dopušta vezivanje molekula da selektivno prepozna i specifično veže epitope na antigenima. To je, VL domen ili VH domen, ili pod set ;;;2 ;regiona koji određuju komplementarnost (CDR), vezujućeg molekula, npr., antitela kombinovanog da formira varijabilne regioni koji definišu tro-dimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaternarna struktura vezivanja molekula formira mesto vezivanja antigena prisutno na kraju svake ruge od Y. Preciznije, mesto vezivanja antigena određeno je sa tri CDR na svakom od VH i VL lanaca. ;;[0069] U prirodnim antitelima, šest „regiona određivanja komplementarnosti“ ili „CDR“ prisutnih u svakom region vezivanja antigena su kratke, ne-susedne sekvence aminokiselina koje su specifično pozicionirane da formiraju antigen vezujući domen dok antitelo zauzima svoju tro-dimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Ostatak aminokiselina u antigen vezujućim domenima, koji naziva se regionima „okvira“, pokazuje manju međumolekulsku varijabilnost. Regioni okvira u velikom prihvataju β-ploča konformaciju i CDR formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima formiraju deo strukture β-ploče. Stoga, regioni okvira imaju ulogu da formiraju skelu koja služi za pozicioniranje CDR u ispravnoj orijentaciji pomoću unutrašnjeg lanca, nekovalentnim interakcijama. Antigen vezujući domen formiran pozicioniranjem CDR definiše površinsku komplementarnost epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina promoviše nekovalentno vezivanje antitela za svoj srodni epitop. Aminokiseline koji sadrže CDR i regione okvira, respektivno, mogu biti lako identifikovane za bilo koji dati varijabilni region teškog ili lakog lanca od strane stručne osobe u ovoj oblasti, kako su precizno određene (videti „Sequences of Proteins of Immunological Interest,“ Kabat, E., i dr., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). ;;[0070] U slučaju kada postoje dve ili više definicija termina koji je korišćen i/ili prihvaćen u struci, definicija termina kao što je ovde korišćeno namenjena je da obuhvati sva ta značenja ukoliko nije eksplicitno naglašeno suprotno. Specifični primer je upotreba termina „regiona određivanja komplementarnosti“ („CDR“) za opisivanje ne-susednih mesta kombinovanja antigena koja se nalaze u varijabilnom regiona oba, teškog i lakog lanca polipeptida. Ovaj naročiti region opisan je od strane Kabat i dr., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i od strane Chothia i dr., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), gde definicije obuhvataju preklapajuće ili pod setove ostataka aminokiselina pri međusobnom poređenju. Svejedno, primena bilo koje definicije kada se odnosi na CDR antitela ili njegovih varijanti namenjena je da bude u okviru termina kao što je ovde definisano. Odgovarajući ostaci aminokiselina koji obuhvataju CDR kao što je definisano svakom od iznad navedenih referenci izneti su iznad u Tabeli I kao upoređivanje. Tačan broj ostataka koji obuhvataju određeni CDR će zavisiti od sekvence i veličine CDR. Stručni u ovoj oblasti mogu rutinski odrediti koji ostaci sadrže određeni CDR uz datu sekvencu aminokiseline varijabilnog regiona antitela. ;;TABELA 1: CDR Definicije<1>;; ;;; [0071] Kabat i dr. su takođe definisani sistem numerisanja za sekvence varijabilnog domena koji je primenjiv za bilo koje antitelo. Stručna osoba u ovoj oblasti može nedvosmisleno dodeliti ovaj sistem „Kabat numerisanja“ bilo kojoj sekvenci varijabilnog domena, bez oslanjanja da bilo koje eksperimentalne podatke iza same sekvence. Kao što se ovde koristi, „Kabat numerisanje“ odnosi se na sistem numerisanja koji je iznet od strane Kabat i dr., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Ukoliko nije drugačije naznačeno, reference za numerisanje specifičnih pozicija ostataka aminokiselina u vezujućem molekulu koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, npr., antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat kao što je ovde definisano u skladu su sa sistemom Kabat numerisanja. ;;[0072] Vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati obuhvataju, ali nisu ograničeni na, poliklonalna, monoklonalna, ljudska, humanizovana ili himerna antitela, antitela sa jednim lancem, fragmenti koji vezuju epitop, npr., Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs sa jednim lancem (scFv), antitela sa jednim lancem, disulfidno povezani Fvs (sdFv), fragmenti koji sadrže ili VL ili VH domen, fragmenti ;;;2 ;proizvedeni bibliotekom Fab ekspresije. ScFv molekuli poznati su u struci i opisani su npr., u patentu SAD 5,892,019. Imunoglobulin ili molekuli antitela obuhvaćeni ovim obelodanjivanjem mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase molekula imunoglobulina. ;;[0073] „Specifičnim vezivanjem“ generalno se misli da se vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat vezuje za epitop preko njegovog antigen vezujućeg domena i da vezivanje podrazumeva komplementarnost između antigen vezujućeg domena i epitopa. Prema ovoj definiciji, kaže se da se vezujući molekul „specifično vezuje“ za epitop kada se veže za taj epitop preko svog antigen vezujućeg domena lakše nego što bi se vezao za nasumični nepovezani epitop. Termin „specifičnost“ ovde se koristi da kvalifikuje relativni afinitet kojim se određeni vezujući molekul vezuje za određeni epitop. Na primer, vezujući molekul „A“ može se smatrati da ima veću specifičnost za dati epitop nego vezujući molekul „B“, ili vezujući molekul „A“ može se smatrati da se vezuje za epitop „C“ sa većom specifičnošću nego što ima za povezani epitop „D“. ;;[0074] Sa „preferencijalno vezuje“ misli se na to da se antitelo specifično vezuje za epitop lakše nego što bi se vezalo za povezani slični, homologni ili analogni epitop. Stoga, antitelo koje se „preferencijalno vezuje“ za dati epitop verovatnije bi se vezalo za epitop nego za povezani epitop, iako takvo antitelo može unakrsno reagovati sa povezanim epitopom. ;;[0075] Putem neograničavajućeg primera, vezujući molekul, npr., antitelo može se smatrati da se vezuje za prvi epitop preferencijalno ukoliko se vezuje za navedeni prvi epitop sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja nego KDantitela za drugi epitop. U još jednom neograničavajućem primer, vezujući molekul kao što je antitelo može se smatrati da se vezuje za prvi antigen preferencijalno ukoliko vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je bar za jedan red veličine manji od KDantitela za drugi epitop. U još jednom neograničavajućem primeru, vezujući molekul može se smatrati da se vezuje za prvi epitop preferencijalno ukoliko vezuje prvi epitop sa afinitetom koji je bar za dva reda veličine manje nego KDantitela za drugi epitop. ;;[0076] U drugom neograničavajućem primeru, vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat mogu se smatrati da se vezuju za prvi epitop preferencijalno ukoliko se vezuju za prvi epitop sa stopom odstupanja (k(off)) koja je manja nego k(off) ;;;2 ;antitela za drugi epitop. U još jednom neograničavajućem primeru, vezujući molekul može se smatrati da se vezuje za prvi epitop preferencijalno ukoliko se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je bar jedan red veličine manji od k(off) antitela za drugi epitop. U još jednom neograničavajućem primeru, vezujući molekul može se smatrati da se vezuje za prvi epitop preferencijalno ukoliko se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je bar dva reda veličine manji od k(off) antitela za drugi epitop. ;;[0077] Vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde obelodanjen može se reći da se vezuje za ciljani antigen, npr., polisaharid ovde obelodanjen ili njegov fragment ili varijantu sa stopom odstupanja (k(off)) manjom ili jednom 5 X 10<-2>sec<-1>, 10<-2>sec<-1>, 5 X 10<-3>sec<-1>ili 10<-3>sec<-1>. Vezujući molekul kao što je ovde opisano može se reći da se vezuje za ciljani antigen, npr., polisaharid sa stopom odstupanja (k(off)) manjom ili jednom 5 X 10<-4>sec<-1>, 10<-4>sec<-1>, 5 X 10<-5>sec<-1>, ili 10<-5>sec<-1>, 5 X 10<-6>sec<-1>, 10<-6>sec<-1>, 5 X 10<-7>sec<-1>, ili 10<-7>sec<-1>. ;;[0078] Vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde obelodanjen može se reći da se vezuje za ciljani antigen, npr., polisaharid sa stopom poklapanja (k(on)) većom ili jednom 10<3>M<-1>sec<-1>, 5 X 10<3>M<-1>sec<-1>, 10<4>M<-1>sec<-1>ili 5 X 10<4>M<-1>sec<-1>. Vezujući molekul kao što je ovde opisano može se reći da se vezuje za ciljani antigen, npr., polisaharid sa stopom poklapanja (k(on)) većom ili jednom 10<5>M<-1>sec<-1>, 5 X 10<5>M<-1>sec<-1>, 10<6>M<-1>sec<-1>, ili 5 X 10<6>M<-1>sec<-1>, ili 10<7>M<-1>sec<-1>. ;;[0079] Vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat se kaže da konkurentno inhibira vezivanje referentnog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta do datog epitopa, ukoliko se preferencijalno vezuje za taj epitop do okvira kada blokira, do određenog stepena, vezivanje referentnog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta za epitop. ;Konkurentno inhibiranje može biti određeno bilo kojom metodom poznatom u struci, na primer ELISA testovima konkurencije. Vezujući molekul može se reći da konkurentno inhibira vezivanje referentnog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta do datog epitopa bar za 90%, bar za 80%, bar za 70%, bar za 60% ili bar za 50%. ;;[0080] Kao što se ovde koristi, termin „afinitet“ odnosi se na merenje jačine vezivanja pojedinačnog epitopa sa CDR molekula imunoglobulina. Videti, npr., Harlow i dr., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988) na ;;;2 ;stranama 27-28. Kao što se ovde koristi, termin „avidnost“ odnosi se na opštu stabilnost kompleksa između populacije imunoglobulina i antigena, koji je, funkcionalna kombinovana snaga smeše imunoglobulina sa antigenom. Videti, npr., Harlow na stranama 29-34. Avidnost se odnosi na oba, afinitet pojedinačnih molekula imunoglobulina u populaciji sa specifičnim epitopima, i takođe na valence imunoglobulina i antigena. na primer, interakcija između bivalentnih monoklonalnih antitela i antigena sa visoko ponavljajućom strukturom epitopa, kao što je polimer, bi bila ona sa visokom avidnošću. ;;[0081] Vezujući molekuli ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante, i derivati ovde obelodanjeni takođe mogu biti opisani ili određeni u vidu njihove unakrsne reaktivnosti. Kao što se ovde koristi, termin „unakrsna reaktivnost“ odnosi se na sposobnost vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, specifičnog za jedan antigen, da reaguje sa drugim antigenom; meru povezanosti između dve različite antigene supstance. Stoga, vezujući molekul je unakrsno reaktivan ukoliko se vezuje za epitop koji je različit od onoga koji je indukovao njegovu formaciju. Unakrsno reaktivni epitop generalno sadrži dosta istih komplementarnih strukturnih svojstava kao i indukovani epitop, i u nekim slučajevima, može zaista se uklopiti bolje nego original. ;;[0082] Vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat takođe mogu biti opisani ili određeni na osnovu njihovog afiniteta za vezivanje sa antigenom. Na primer, vezujući molekul može se vezati za antigen sa konstantom disocijacije ili KDkoja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10-<2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M. ;;[0083] Fragmenti antitela uključujući antitela sa jednim lancem mogu sadržati varijabilne regione same ili u kombinaciji sa celinom ili delom od sledećeg: regionom zgloba, CH1, CH2 i CH3 domenom. Vezujući molekuli, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovde obelodanjen može biti od bilo kog životinjskog porekla uključujući ptice i sisare. Antitela mogu biti ljudska, mišija, od magarca, zeca, koze, zamorčeta, kamile, lame, konja ili kokoške. U drugom otelotvorenju, varijabilni region može biti sprovodeći po poreklu (npr., od ajkule). Kao što se ovde koristi, „ljudska“ antitela obuhvataju antitela koja imaju sekvence aminokiseline ljudskog imunoglobulina i obuhvataju antitela izolovana iz ljudskih biblioteka ;;;2 ;imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više ljudskih imunoglobulina i koje ne vrše ekspresiju endogenih imunoglobulina, kao što je opisano infra i, na primer, u pat. SAD. br. 5,939,598 od Kucherlapati i dr. ;;[0084] Kao što se ovde koristi, „deo teškog lanca“ obuhvata sekvence aminokiseline izvedene iz teškog lanca imunoglobulina, vezujući molekul, npr., antitelo koje sadrži deo teškog lanca sadrži bar jedno od: CH1 domena, zglobni (npr., gornji, srednji, i/ili donji region zgloba) domen, CH2 domen, CH3 domen ili njihovu varijantu ili fragment. Na primer, vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat može sadržati polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar jedan deo zglobnog domena i CH2 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen i CH3 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar deo zglobnog domena i CH3 domen ili polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar deo zglobnog domena, CH2 domen i CH3 domen. U drugom otelotvorenju, vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat sadrži polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen. Dalje, vezujući molekul za upotrebu u obelodanjivanju može biti bez bar dela CH2 domena (npr., ceo ili deo CH2 domena). Kao što je izneto iznad, osoba stručna u ovoj oblati prihvatiće da ovi domeni (npr., delovi teškog lanca) mogu biti modifikovani tako imaju različite sekvence aminokiselina u poređenju sa prirodnim molekulima imunoglobulina. ;;[0085] Delovi teškog lanca vezujućeg molekul, npr., antitela kao što je ovde opisano mogu biti izvedeni iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, deo teškog lanca polipeptida može sadržati CH1 domen izveden iz IgG1 molekula i zglobni region izveden iz IgG3 molekula. U drugom primeru, deo teškog lanca može sadržati zglobni region izveden, delom, iz IgG1 molekula i, delom, iz IgG3 molekula. U drugom primeri, deo teškog lanca može sadržati himerni zglob izveden, delom, iz IgG1 molekula i, delom, iz IgG4 molekula. ;;[0086] Kao što se ovde koristi, termin „deo lakog lanca“ obuhvata sekvence aminokiseline izvedene iz lakog lanca imunoglobulina. Deo lakog lanca sadrži bar jedan od VL ili CL domena. ;;[0087] Vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati ovde obelodanjeni mogu biti opisani ili određeni u vidu epitopa ili delova antigena, npr., ciljanog polisaharida koji oni prepoznaju ili se specifično vezuju za. Deo ciljanog ;;;2 ;polisaharida koji specifično interaguje sa antigen vezujućim domenom antitela je „epitop“ ili „antigena determinanta“. Ciljani antigen, npr., polisaharid može sadržati pojedinačni epitop, ali obično sadrži bar dva epitopa, i može sadržati bilo koji broj epitopa, u zavisnosti od veličine, konformacije i tipa antigena. ;;[0088] Kao što je prethodno ukazanu, pod jedinično strukture i tro-dimenzionalna konfiguracija konstantnih regiona različitih klasa imunoglobulina dobro je poznata. Kao što se ovde koristi, termin „VH domen“ obuhvata amino terminalne varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina i termin „CH1 domen“ obuhvata prvi (najviše amino terminal) konstantni region domena teškog lanca imunoglobulina. CH1 domen susedan VH domenu je amino terminal za zglobni region teškog lanca molekula imunoglobulina. ;;[0089] Kao što se ovde koristi „CH2 domen“ obuhvata deo teškog lanca molekula koji se prostire, npr., od oko ostatka 244 do ostatka 360 antitela upotrebom konvencionalnih šema numerisanja (ostaci 244 do 360, sistem numerisanja po Kabatu; i ostaci 231-340 EU sistem numerisanja; videti Kabat EA i dr. op. cit. CH2 domen je jedinstven u tome što nije blisko uparen sa drugim domenom. Već, dva N-povezana granata lanca ugljena hidrata su postavljena između dva CH2 domena nepromenjenog izvornog IgG molekula. Takođe je dobro dokumentovano da se CH3 prostire od CH2 domena do C-terminala IgG molekula i sadrži približno 108 ostataka. ;;[0090] Kao što se ovde koristi „zglobni region“ obuhvata deo teškog lanca molekula koji spaja CH1 domen za CH2 domen. Ovaj zglobni region sadrži približno 25 ostataka i fleksibilan je, time omogućavajući da se dva N-terminalna antigen vezujuća regiona nezavisno kreću. Zglobni regioni mogu biti podeljeni na tri različita domena: gornji, srednji i donji zglobni region (Roux i dr., J. Immunol.161:4083 (1998)). ;;[0091] Kao što se ovde koristi termin „disulfidna veza“ obuhvata kovalentnu vezu formiranu između dva atoma sumpora. Cistein aminokiseline sadrži tiol grupu koja može formirati disulfidnu vezu ili most sa drugom tiol grupom. Kod većine prirodnih IgG molekula, CH1 i CL regioni povezani su disulfidnom vezom i dva teška lanca povezana su sa dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 upotrebom sistema numerisanja po Kabatu (pozicija 226 ili 229 po EU sistemu numerisanja). ;[0092] Kao što se ovde koristi, termin „himerno antitelo“ držaće se da označava bilo koje antitelo gde je imunoreaktivni region ili mesto dobijeno izvođenjem iz prve vrste i konstantni region (koji može biti nepromenjen, delimični ili modifikovan) dobijen je iz druge vrste. U nekim otelotvorenjima ciljani vezujući region ili mesto biće od izvora koji nije ljudski (npr., miš ili primat) i konstanti region je ljudski. ;;[0093] Kao što se ovde koristi, termin „projektovano antitelo“ odnosi se na antitelo u kojem je varijabilni domen ili u teškom i lakom lancu ili oba su izmenjena bar delimičnim zamenjivanjem jednog ili više CDR iz antitela poznate specifičnosti i, ukoliko je potrebno, zamenjivanjem delimičnog regiona okvira i menjanjem sekvence. Iako CDR mogu biti izvedeni iz antitela iste klase ili čak podklase kao antitelo iz kojeg su regioni okvira izvedeni, predviđeno je da će CDR biti izvedeni iz antitela različite klase i poželjno iz antitela druge vrste. Projektovano antitelo u kojem je jedan ili više „donora“ CDR od ne-ljudskih antitela poznate specifičnosti kalemljeno u ljudski teško lanac ili laki lanac regiona okvira ovde se naziva kao „humanizovano antitelo“. Ne mora biti neophodno da se zamene svi CDR sa kompletnim CDR varijabilnog regiona donora da bi se prevela sposobnost antigen vezivanja jednog varijabilnog domena na drugi. Već, može samo biti neophodno da se prevedu oni ostaci koji su neophodni za održavanje aktivnosti ciljanog mesta vezivanja. Dato objašnjenje izneto u, npr., pat. SAD. br.5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, i 6,180,370, biće u okviru sposobnosti stručnih u ovoj oblasti, ili vršenjem rutinskih eksperimenata ili testom probanja za dobijanje funkcionalnih projektovanih ili humanizovanih antitela. ;;[0094] Kao što se ovde koristi „ispravno savijen polipeptid“ obuhvata polipeptide (npr., anti-Pseudomonas Psl antitela) u kojima su svi funkcionalni domeni koji čine polipeptid jasno aktivni. Kao što se ovde koristi, termin „neispravno savijeni polipeptid“ obuhvata polipeptide kod kojih je bar jedan od funkcionalnih domena neaktivan. U jednom otelotvorenju, ispravno savijen polipeptid sadrži polipeptidne lance povezane sa bar jednom disulfidnom vezom i, obratno, neispravno savijeni polipeptid sadrži polipeptidne lance koji nisu povezani sa jednom disulfidnom vezom. ;;[0095] Kao što se ovde koristi termin „projektovan“ obuhvata manipulaciju nukleinskim kiselinama ili polipeptidnim molekulima sintetičkim putem (npr., rekombinantnim tehnikama, in vitro peptidnom sintezom, enzimskim ili hemijskim spajanjem peptida ili kombinacijom ovih tehnika). ;;;1 ;[0096] Kao što se ovde koristi, termini „povezan“, „spojen“ ili „spajanje“ koriste se naizmenično. Ovi termini odnose se na međusobno spajanje dva ili više elementa ili komponenata, bilo kojim merama uključujući hemijsku konjugaciju i rekombinantne mere. „Spajanje u okviru“ odnosi se na spajanje dva ili više polinukleotidna okvira otvorena za čitanje (ORF) kako bi se formirao neprekidni duži ORF, na način koji održava ispravno translatorno čitanje okvira i originalnog ORF. Stoga, rekombinantni spojeni protein je jedan protein koji sadrži dva ili više segmenta koji odgovaraju polipeptidima kodiranim originalnim ORF (čiji segmenti normalno nisu spojeni u prirodi). Iako je čitanje okvira stoga napravljeno neprekidnim kroz spojene segmente, segmenti mogu fizički ili prostorno odvojeni, na primer, veznim sekvencama unutar okvira. Na primer, polinukleotidi koji kodiraju CDR varijabilnog regiona imunoglobulina mogu biti spojeni, u okviru, ali mogu biti odvojeni polinukleotidnim kodiranjem bar jednog regiona okvira imunoglobulina ili dodatnim CDR regionima, sve dok su „spojeni“ CDR zajedno prevedeni kao deo neprekidnog polipeptida. ;;[0097] U kontekstu polipeptida, „linearna sekvenca“ ili „sekvenca“ je poredak aminokiselina u polipeptidu u pravcu od amino do karboksil terminala gde ostaci koji su međusobno susedni u sekvenci su susedni u primarnoj strukturi polipeptida. ;;[0098] Termin „ekspresija“ kao što se ovde koristi odnosi se na proces kojem gen proizvodi biohemijski, na primer, polipeptid. Proces obuhvata bilo koje ispoljavanje funkcionalnog prisustva gena unutar ćelije uključujući, bez ograničenja, obaranje gena kao i kao i oba, prelaznu ekspresiju i stabilnu ekspresiju. Obuhvata bez ograničenja prevođenje gena u informacionu RNK (mRNK), i prevođenje takve mRNK u polipeptide. Ukoliko je krajnji željeni proizvod biohemikalija, ekspresija obuhvata stvaranje te biohemikalije i bilo kojih prekursora. Ekspresija gena proizvodi „proizvod gena“. Kao što se ovde koristi, proizvod gena može biti ili nukleinska kiselina, npr., informaciona RNK proizvedena prevođenjem gena ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Proizvodi gena ovde opisani dalje obuhvataju nukleinske kiseline sa post transkripcionim modifikacijama, npr., poliadenilacija ili polipeptidi sa post translatornim modifikacijama, npr., metilacija, glikozilacija, dodavanje lipida, povezivanje sa drugim proteinskim pod jedinicama, proteolitičko cepanje i slično. ;;[0099] Kao što se ovde koristi, termini „tretirati“ ili „tretiranje“ odnose se na oba, terapeutsko tretiranje i profilaktičke ili preventivne mere, gde je cilj da se spreči ili uspori ;;;2 ;(ublaži) neželjena fiziološka promena, infekcija, ili poremećaj. Povoljni ili poželjni klinički rezultati obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje okvira bolesti, stabilizovanje (tj., nepogoršavanje) stanja bolesti, klirens ili redukciju infektivnih agenasa kao što je P. aeruginosa u subjektu, kašnjenje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje ili palacija stanje bolesti, i remisija (ili delimična ili ukupna), ili uočljiva ili neuočljiva. ;„Tretiranje“ takođe može da označi produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem ukoliko se ne primi tretiranje. Oni koji imaju potrebu za tretiranjem obuhvataju one koji već imaju infekciju, stanje ili poremećaj kao i one koji su skloni da imaju stanje ili poremećaj ili oni kod kojih se stanje ili poremećaj treba sprečiti, npr., kod pacijenata sa opekotinama ili imunosupresivnih pacijenata podložnih P. aeruginosa infekciji. ;;[0100] „Subjekt“ ili „pojedinac“ ili „životinja“ ili „pacijent“ ili „sisar“ označava bilo koji subjekt, naročito subjekt koji je sisar, za koga je poželjna dijagnoza, prognoza ili terapija. Subjekti koji su sisari obuhvataju, ljude, kuće životinje, domaće životinje i životinje iz zoološkog vrta, životinje za sport ili kućne ljubimce kao što su psi, mačke zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, goveda, krave, medvedi i tako dalje. ;;[0101] Kao što se ovde koristi, fraze kao što su „subjekt koji bi imao korist od davanja anti-Pseudomonas Psl antitela“ i „životinja koja ima potrebu za tretiranjem“ obuhvataju subjekte, kao što su subjekti koji su sisari, koji bi imali korist od davanja anti-Pseudomonas Psl antitela upotrebljenih npr., za detektovanje Pseudomonas Psl (npr., za dijagnostičku proceduru) i/ili za tretiranje, tj., palaciju ili sprečavanje bolesti sa anti-Pseudomonas Psl antitelima. Kao što je opisano detaljnije ovde, anti-Pseudomonas Psl antitelo može biti korišćeno u nekonjugovanoj formi ili može biti konjugovano, npr., u lek ili prolek, ili izotop. ;;II. VEZIVANJE MOLEKULA ;[0102] Jedan aspekt usmeren je na izolovane vezujuće molekule npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, gde vezujući molekul (a) može da inhibira vezivanje Pseudomonas aeruginosa za epitelne ćelije, (b) može da promoviše, posreduje ili poboljša opsonofagocitno ubijanje (OPK) P. aeruginosa, ili (c) može da inhibira vezivanje vezivanje P. aeruginosa za epitelne ćelije i može da promoviše, posreduje ili poboljša OPK P. aeruginosa. U određenim otelotvorenjima, vezujući molekul ili njegov fragment kao što je opisano iznad može biti antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je Cam-003 ili WapR-004. ;[0103] Kao što se ovde koristi, termin „antigen vezujući domen“ obuhvata mesto koje specifično vezuje epitop na antigenu (npr., epitop Pseudomonas Psl). Antigen vezujući domen antitela obično obuhvata bar deo teškog lanca varijabilnog domena imunoglobulina i bar deo lakog lanca varijabilnog domena imunoglobulina. Mesto vezivanja formirano ovih varijabilnih regiona određuje specifičnost antitela. ;;[0104] Obelodanjivanje je posebno usmereno na izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti Pseudomonas Psl epitop kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži teški lanac varijabilnog regiona (VH) i laki lanac varijabilnog regiona (VL) regiona WapR-004, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005. ;;[0105] Dalje je obuhvaćen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za o Pseudomonas Psl i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji sadrži VH i VL od WapR-004, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005. ;;[0106] Jedno otelotvorenje usmereno je na izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za isti Pseudomonas Psl epitop kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži VH i VL regione od WapR-001, WapR-002, ili WapR-003. ;;[0107] Takođe je obuhvaćen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji sadrži VH i VL od WapR-001, WapR-002, ili WapR-003. ;;[0108] Dalje je obuhvaćen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za o Pseudomonas Psl i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji sadrži VH i VL od WapR-016. ;;;4 ;[0109] Takođe je obuhvaćen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl i konkurentno inhibira Pseudomonas Psl vezivanje sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji sadrži VH i VL od WapR16. ;;[0110] Metode pravljenja antitela dobro su poznate u struci i opisane su ovde. Kada su antitela do različitih fragmenata od, ili do potpunog Pseudomonas Psl bez signalne sekvence, proizvedena, odrođavajući koje će se aminokiseline ili epitop od Pseudomonas Psl za koje antitelo ili antigen vezujući fragment vezati može biti određeno protokolima mapiranja epitopa kao što je ovde opisano kao i poznatim metodama u struci (npr., dvostruka antitelosendvič ELISA kao što je opisano u "Chapter 11 - Immunology," Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel i dr., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Dodatni protokoli mapiranja epitopa mogu se pronaći u Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996), koji su oba sadržani ovde sa referencama u svojoj potpunosti. Mapiranje epitopa takođe može biti izvršeno komercijalno dostupnim merama (tj., ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)). ;;[0111] U određenim aspektima, obelodanjivanje je usmereno na vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim konstantnom disocijacije (KD) koja je manja od KDza navedeno referentno monoklonalno antitelo. ;;[0112] U određenim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde obelodanjeno vezuje se specifično za bar jedan epitop od Psl, tj., vezuje se za takav epitop lakše nego što bi se vezalo za nepovezani ili nasumični epitop; vezuje se preferencijalno za bar jedan epitop od Psl tj., vezuje se za takav epitop lakše nego što bi se vezao za povezani, slični, homologni ili analogni epitop; konkurentno inhibira referentno antitelo koje se samo vezuje specifično ili preferencijalno za određeni epitop od Psl; ili se vezuje za bar jedan epitop od Psl sa afinitetom okarakterisanim konstantnom disocijacije KDmanjom od oko 5 x 10<-2>M, oko 10<-2>M, oko 5 x 10<-3>M, oko 10<-3>M, oko 5 x 10<-4>M, oko 10<-4>M, oko 5 x 10<-5>M, oko 10<-5>M, oko 5 x 10<-6>M, oko 10<-6>M, oko 5 x 10<-7>M, oko 10<-7>M, oko 5 x 10<-8>M, oko 10<-8>M, oko 5 x 10<-9>M, oko 10<-9>M, oko 5 x 10<-10>M, oko 10<-10>M, oko 5 x 10<-11>M, oko 10<-11>M, oko 5 x 10<-12>M, oko 10<-12>M, oko 5 x 10<-13>M, oko 10<-13>M, oko 5 x 10<-14>M, oko 10<-14>M, oko 5 x 10<-15>M, ili oko 10<-15>M. ;;[0113] Kao što se koristi u kontekstu vezivanja konstante disocijacije, termin „oko“ dozvoljava stepen disocijacije inherentan metodama korišćenim za merenje afiniteta antitela. Na primer, u zavisnosti od nivoa preciznosti korišćenih instrumenata, standardne greške zasnovane na broju izmerenih uzoraka, i greške zaokruživanja, termin „oko 10<-2>M“ može obuhvatati, na primer, od 0,05 M do oko 0,005 M. ;;[0114] U specifičnim otelotvorenjima, vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, varijanta ili derivat vezuje se za Pseudomonas Psl sa stopom odstupanja (k(off)) manjom ili jednakom 5 X 10<-2>sec<-1>, 10<-2>sec<-1>, 5 X 10<-3>sec<-1>, ili 10<-3>sec<-1>. ;Alternativno, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat vezuje se za Pseudomonas Psl sa stopom odstupanja (k(off)) manjom ili jednakom 5 X 10<-4>sec<-1>, 10<-4>sec<-1>, 5 X 10<-5>sec<-1>, ili 10<-5>sec<-1>5 X 10<-6>sec<-1>, 10<-6>sec<-1>, 5 X 10<-7>sec<-1>ili 10<-7>sec<-1>. ;;[0115] U drugim otelotvorenjima, vezujući molekul, npr., antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde obelodanjeno vezuje se za Pseudomonas Psl sa stopom poklapanja (k(on)) većom ili jednakom 10<3>M<-1>sec<-1>, 5 X 10<3>M<-1>sec<-1>, 10<4>M<-1>sec<-1>ili 5 X 10<4>M<-1>sec<-1>. Alternativno, vezujući molekul, npr., antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde obelodanjeno vezuje se za Pseudomonas Psl sa stopom poklapanja (k(on)) većom ili jednakom 10<5>M<-1>sec<-1>, 5 X 10<5>M<-1>sec<-1>, 10<6>M<-1>sec<-1>, ili 5 X 106 M<-1>sec<-1>ili 10<7>M<-1>sec<-1>. ;;[0116] U različitim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde opisano promoviše opsonofagocitno ubijanje Pseudomonas, ili inhibira Pseudomonas vezivanje za epitelne ćelije. U određenim otelotvorenjima ovde opisanim, Pseudomonas Psl je Pseudomonas aeruginosa Psl. U drugim otelotvorenjima, određeni vezujući molekuli ovde opisani mogu se vezati za strukturno povezane molekule polisaharida bez obzira na njihov izvor. Takvi Pslnalik molekuli mogu se očekivati da budu identični ili da imaju dovoljnu strukturnu povezanost sa P. aeruginosa Psl kako bi dozvolili specifično prepoznavanje od strane jednog ili više vezujućih molekula koji su obelodanjeni. Na primer, određeni vezujući molekuli ovde opisani mogu se vezati za Psl-nalik molekule proizvedene od strane drugih bakterijskih vrsta, na primer, Psl-nalik molekuli proizvedeni od strane drugih Pseudomonas vrsta, npr., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, ili Pseudomonas alcaligenes. Alternativno, određeni vezujući molekuli kao što je ovde opisani mogu se vezati za Psl-nalik molekule proizvedene sintetički ili od strane ćelija domaćina genetski modifikovanih da proizvode Pslnalik molekule. ;;[0117] Ukoliko nije specifično naglašeno, kao što se ovde koristi „njegov fragment“ u referenci na vezujući molekul, npr., antitelo odnosi se na antigen-vezujući fragment, tj., deo antitela koji se specifično vezuje za antigen. ;;[0118] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu sadržati konstanti region koji posreduje jednoj ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa za konstantni region antitela može aktivirati komplementarni sistem. Aktiviranje komplementa od značaja pri opsonizaciji i lizi patogena. Aktiviranje komponente takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može biti uključeno u autoimunu hipersenzitivnost. Dalje, antitela se vezuju za receptore na različitim ćelijama preko Fc regiona, sa mestom vezivanja Fc receptora na Fc regionu vezivanja za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji broj Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela za Fc receptore na površini ćelije pokreće broj značajnih i različitih bioloških odgovora uključujući hvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelom pomoću ćelija ubica (što se naziva antitelo-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost, ili ACDD), oslobađanje inflamatornih posrednika, placentalni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina. ;;[0119] Prema tome, određena otelotvorenja ovde obelodanjena mogu obuhvatati anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivat gde se bar frakcija ili jedan ili više konstantnih regiona domena uništava ili drugačije menja kako bi se dobile željene biohemijske karakteristike kao što su smanjene efektorske funkcije, sposobnost za ne-kovalentnom dimerizacijom, povećana sposobnost lokalizacije na mestu tumora, redukovani polu-raspad u serumu, ili povećani polu-raspad kada se poredi sa celim, neizmenjenim antitelom približno istog imunogeniciteta. Na primer, određeni vezujući molekuli ovde opisani antitela sa uništenim domenom koja sadrži polipeptidni lanac sličan teškom lancu imunoglobulina ali koji mogu da nemaju deo ili jedan ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim otelotvorenjima, jedan ceo domen konstantnog regiona modifikovanog antitela će biti uništen, na primer, svi ili deo CH2 domena će biti uništeni. ;;[0120] Modifikovane forme anti-Pseudomonas Psl vezujućih molekula, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu biti napravljeni iz celih prekursor ili roditeljskih antitela upotrebom tehnika poznatih u struci. Primerne tehnike ovde su razmatrane na drugom mestu. ;;[0121] U određenim otelotvorenjima, oba, varijabilni i konstantni regioni anti-Pseudomonas Psl vezujućih molekula, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti potpuno su ljudski. Potpuno ljudska antitela mogu biti napravljena tehnikama koje su poznate u struci i kao što je ovde opisano. Na primer, potpuno ljudska antitela protiv specifičnog antigena mogu biti pripremljena davanjem antigena transgenoj životinji koja je bila modifikovana da proizvodi takva antitela u odgovoru na antigeni izazov, ali čiji je endogeni lokus onesposobljen. Primerne tehnike koje se mogu koristiti da se naprave takva antitela opisane su u patentima SAD: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Druge tehnike poznate su u struci. Potpuno ljudska antitela mogu slično tome biti proizvedena različitim prikaznim tehnologijama, npr., prikazom faga ili drugim virusnim sistemima prikaza, kao što je ovde detaljnije opisano na drugom mestu. ;;[0122] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati as kao što je ovde obelodanjeno mogu biti napravljeni ili proizvedeni upotrebom tehnika koje su poznate u struci. U određenim otelotvorenjima, vezujući molekuli ili njegovi fragmenti „rekombinantno su proizvedeni“, tj., proizvedeni su upotrebom DNK tehnologije. Primerne tehnike za pravljenje molekula antitela ili njihovih fragmenata ovde su detaljnije razmatrane na drugom mestu. ;;[0123] Kod određenih anti-Pseudomonas Psl vezujućih molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati ovde opisani, Fc deo može biti mutiran kako bi smanjila detektorska funkcija upotrebom tehnika poznatih u struci. Na primer, uništavanje ili isključivanje (preko tačke mutacije ili na drugi način) konstantnog regiona domena može smanjiti vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela time povećavajući lokalizaciju tumora. U drugim slučajevima može biti da modifikacije konstantnog regiona ograničavaju vezivanje komplementa i time smanjuju polu-raspad u serumu i nespecifično vezivanje konjugovanih citotoksina. U drugim modifikacijama konstantni region može se koristiti za modifikovanje disulfidnih veza ili grupa oligosaharida što omogućava poboljšanu lokalizaciju usled povećane antigen specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Dobijeni fiziološki profil, biodostupnost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što su lokalizacija, biodistribucija i polu-raspad u serumu, lako se mogu meriti i kvantifikovati upotrebom dobro poznatih imunoloških tehnika bez nepotrebnih eksperimenata. ;;[0124] Kod određenih otelotvorenja, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati neće izneti uništavajući imuni odgovor kod životinje koja se tretira, npr., kod čoveka. U jednom otelotvorenju, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati modifikovani su da smanje njihov imunogenicitet upotrebom tehnika prihvaćenih u struci. Na primer, antitela mogu biti humanizovana, de-humanizovana ili himerna antitela mogu biti napravljena. Ovi tipovi antitela izvedeni su iz antitela koje nije ljudsko, obično antitelo miša ili primata, koje zadržava ili suštinski zadržava svojstva antigen-vezivanja roditeljskog antitela, ali koje je manje imunoeno kod ljudi. Ovo se može postići različitim metodama, uključujući (a) kalemljenje celokupnih varijabilnih domena koji nisu ljudski na ljudske konstantne region kako bi se stvorila himerna antitela; (b) kalemljenje bar dela jednog ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji nisu ljudski u okvir čoveka i konstantne regione sa ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira; ili (c) transplantaciju celokupnih varijabilnih domena koji nisu ljudski, ali „oblaganjem“ sa nalikljudskim delom zamenjivanjem površinskih ostataka. Takve metode obelodanjene su u Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci.81:6851-6855 (1984); Morrison i dr., Adv. Immunol. ;44:65-92 (1988); Verhoeyen i dr., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. ;28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), i pat. SAD. br.5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, i 6,190,370. ;;[0125] De-imunizacija takođe može biti korišćena za smanjivanje imunogeniciteta antitela. Kao što se ovde koristi, termin „de-imunizacija“ obuhvata izmenjivanje antitela kako bi se modifikovali epitopi T ćelija (videti, npr., WO9852976A1, WO0034317A2). Na primer, VH i VL sekvence iz početnog antitela analizirane su i ljudska „mapa“ epitopa T ćelije iz svakog V regiona pokazuje lokaciju epitopa u odnosu na regione koji određuju komplementarnost (CDR) i druge ključne ostatke u sekvenci. Pojedinačni epitopi T ćelije iz mape epitopa T ćelije analizirani su u cilju identifikovanja alternativnih zamena aminokiselina sa malim rizikom menjanja aktivnosti krajnjeg antitela. Opseg alternativnih VH i VL sekvenci dizajniran je sadržanjem kombinacija zamena aminokiselina i ove sekvence suštinski su inkorporirane u opseg vezujućih polipeptida, npr., Pseudomonas Psl-specifičnih antitela ili njegovih antigen-vezujućih fragmenata ove opisanih, koji su zatim testirani za funkciju. Celokupni geni teškog i lakog lanca koji sadrže modifikovane V i ljudske C regioni zatim su klonirani u ekspresione vektore i kasnije su uvedeni plazmidi u ćelijske linije za proizvodnju celog antitela. Antitela zatim su poređena u odgovarajućim biohemijskim i biološkim testovima, i optimalna varijanta je identifikovana. ;;[0126] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu biti stvoreni bilo kojom pogodnom metodom poznatom u struci. Poliklonalna antitela za antigen od interesa mogu biti proizvedena različitim procedurama dobro poznatim u struci. Na primer, anti-Pseudomonas Psl antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti dat različitim životinjskim domaćinima uključujući ali neograničavajući se na zečeve, miševe, pacove, kokoške, zamorce, koze, magarce, itd., kako bi se uzrokovala proizvodnja u serumu koji sadrži poliklonalna antitela specifična za antigen. Različiti adjuvansi mogu biti korišćeni za povećavanje imunološkog odgovora, u zavisnosti od vrste domaćina, i obuhvataju ali nisu ograničeni na, Freundove (kompletne i nekompletne), mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronični polioli, polianjoni, peptidi, uljne emulzije, ključni hemocijanini morskog puža, dinitrofenol i potencijalno korisni ljudski adjuvansi kao što su BCG (bacil Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Takvi adjuvansi dobro su poznati u struci. ;;[0127] Monoklonalna antitela mogu biti pripremljena upotrebom širokog opsega tehnika poznatih u struci uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantne i tehnologije prikazivanja faga, ili njihovom kombinacijom. Na primer, monoklonalna antitela mogu biti proizvedena upotrebom tehnika hibridoma uključujući one poznate u struci i naučene, na primer u Harlow i dr., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) ;;[0128] Antitela koja kodiraju DNK ili fragmenti antitela (npr., antigen vezujuća mesta) takođe mogu biti izvedeni iz biblioteka antitela, kao što su biblioteke prikaza faga. Naročito, ;;;4 ;takvi fagi mogu biti korišćeni za prikazivanje antigen-vezujućih domena čija se ekspresija izvršila iz repertoara biblioteke kombinatornog antitela (npr., od čoveka ili miša). Fag koji vrši ekspresiju antigen vezujućeg domena koji se vezuje za predmetni antigen može biti izabran ili identifikovan sa antigenom, npr., upotrebom obeleženog antigena ili antigena vezanog ili zahvaćenog za čvrstu površinu ili zrno. Fagi koji se koriste u ovim metodama obično su filamentozni fagi uključujući fd i M13 vezujuće domene čija se ekspresija vrši od faga sa scFv, Fab, Fv OE DAB (pojedinačni Fv region iz lakih ili teških lanaca) ili disulfidno stabilizovanih Fv antitela domena rekombinantno spojenih ili za gen faga III ili gen VIII protein. Primerne metode iznete su, na primer, u EP 368684 B1; pat. SAD 5,969,108, Hoogenboom, H.R. and Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy i dr. Nat. Med.8:801 (2002); Huie i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682 (2001); Lui i dr., J. Mol. Biol. ;315:1063 (2002). Nekoliko objava (npr., Marks i dr., Bio/Technology 10:779-783 (1992)) opisalo je proizvodnju ljudskih antitela sa visokim afinitetom zamenjivanjem lanaca, kao i kombinatornom infekcijom i in vivo rekombinacijom kao strategijom za pravljenje velikih biblioteka faga. U drugom otelotvorenju, ribozomni prikaz može se koristiti da zameni bakteriofage kao platformu za prikaz (videti, npr., Hanes i dr., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750 (2001); ili Irving i dr., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). U još jednom otelotvorenju, biblioteke površine ćelija mogu biti proverene za antitela (Boder i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty i dr., J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Takve procedure daju alternativne tradicionalnim hibridoma tehnikama za izolovanje i kasnije kloniranje monoklonalnih antitela. ;;[0129] Kod metoda prikaza faga, funkcionalni domeni antitela prikazani su na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiranu. Na primer, DNK sekvence koje kodiraju VH i VL regione pojačane su od životinjskih cDNK biblioteka (npr., ljudske ili mišije cDNK biblioteke limfoidnog tkiva) ili sintetičkih cDNK biblioteka. U određenim otelotvorenjima, DNK kodiranje VH i VL regiona spojeno je međusobno sa scFV veznikom pomoću PCR i klonirano je u fagemidni vektor (npr., p CANTAB 6 ili pComb 3 HSS). ;Vektor je elektroporisan u E. coli i E. coli je zaražena sa pomoćnim fagima. Fagi koji se koriste u ovim metodama obično su filamentozne fagi uključujući fd i M13 i VH ili Vl regioni obično su rekombinantno spojeni ili za gen III faga ili gen VIII. Fagi koji vrše ekspresiju antigen vezujućeg domena koji se vezuje za predmetni antigen (tj., Pseudomonas Psl) mogu biti izabrani ili identifikovani sa antigenom, npr., upotrebom obeleženog antigena ili antigena vezanog ili zahvaćenog na čvrstoj površini ili zrnu. ;[0130] Dodatni primeri metoda prikaza faga koji se mogu koristiti za pravljenje antitela obuhvataju one obelodanjene u Brinkman i dr., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i dr., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough i dr., Eur. J. Immunol. ;24:952-958 (1994); Persic i dr., Gene 187:9-18 (1997); Burton i dr., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT prijavi br. PCT/GB91/01134; PCT objavama WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i pat. SAD br.5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108. ;;[0131] Kao što je opisano u referencama iznad i primerima ispod, nakon odabira faga, kodirajući regioni antitela od faga mogu biti izolovani i korišćeni za stvaranje celih antitela, uključujući ljudska antitela, ili bilo koji drugi željeni antigen vezujući fragment i vršiti ekspresiju u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, kvasca i bakterije. Na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2fragmenata takođe mogu biti korišćene upotrebom poznatih metoda u struci kao što su one obelodanjene u PTC objavama WO 92/22324; Mullinax i dr., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); i Sawai i dr., AJRI 34:26-34 (1995); i Better i dr., Science 240:1041-1043 (1988). ;;[0132] Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju Fvs sa jednim lancem i antitela obuhvataju one opisane u pat. SAD br.4,946,778 i 5,258,498; Huston i dr., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i dr., PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra i dr., Science 240:1038-1040 (1988). U određenim otelotvorenjima za takvo terapeutsko davanje, himerna humanizovana ili ljudska antitela mogu se koristiti. Ljudsko antitelo je molekul u kojem su različiti delovi antitela izvedeni iz različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja imaju varijabilni region izveden iz mišijeg monoklonalnog antitela i ljudski konstantni region imunoglobulina. Metode za proizvodnju himernih antitela dobro su poznate u struci. Videti, npr., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i dr., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i dr., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); pat. SAD br.5,807,715; 4,816,567; i 4,816397, humanizovana antitela su molekuli antitela iz vrsta koje nisu ljudi koja se vezuju za željeni antigen koji ima jedan ili više regiona određivanja komplementarnosti (CDR) od vrsta koje nisu ljudi i regiona okvira iz ljudskog molekula imunoglobulina. Često, ostaci okvira u ljudskim regionima okvira biće zamenjeni sa odgovarajućim ostatkom iz CDR donorskog antitela kako bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, vezivanje antigena. Ove zamene okvira identifikovane su metodama koje su dobro poznate u struci, npr., modeliranjem interakcija CDR i ostataka okvira kako bi identifikovali ostatke okvira značajne za vezivanje antigena i upoređivanje sekvenci za identifikovano neobičnih ostataka okvira na određenim pozicijama (Videti, npr., Queen i dr., U.S. Pat. No.5,585,089; Riechmann i dr., Nature 332:323 (1988),). Antitela mogu biti humanizovana upotrebom različitih tehnika poznatih u struci uključujući, na primer, CDR-kalemljenje (EP 239,400; PCT objava WO 91/09967; pat. SAD br. ;5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), furniranje ili obnavljanje površine (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka i dr., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. i dr., PNAS 91:969-973 (1994)), i zamena lanaca (pat. SAD br.5,565,332). ;;[0133] Potpuno ljudska antitela naročito su poželjna za terapeutsko tretiranje ljudskih pacijenata. Ljudska antitela mogu biti napravljena različitim metodama poznatim u struci uključujući metode prikaza faga opisanih iznad korišćenjem biblioteka antitela izvedenih iz ljudskih sekvenci imunoglobulina. Takođe videti pat. SAD br.4,444,887 i 4,716,111; i PCT objave WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, i WO 91/10741. ;;[0134] Ljudska antitela takođe mogu biti proizvedena upotrebom transgenih miševa koji nisu u stanju da vrše ekspresiju funkcionalnih endogenim imunoglobulina, ali koji mogu vršiti ekspresiju ljudskih imunoglobulin gena. Na primer, ljudski teški lanac i laki lanac imunoglobulin gen kompleksa mogu biti uvedeni nasumično ili putem homologne rekombinacije u matične embrionske ćelije miša. Pored toga, mogu se angažovati različite kompanije kako bi se obezbedila ljudska antitela proizvedena u transgenim miševima usmerenim protiv odabranog antigena koji koristi tehnologiju sličnu onoj opisanoj iznad. ;;[0135] Potpuno ljudska antitela koja prepoznaju izabrani epitop mogu biti stvorena upotrebom tehnika koje se nazivaju „usmereni odabir“. U ovom pristupu izabrano ne-ljudsko monoklonalno antitelo, npr., mišije antitelo, koristi se da usmerava odabir potpuno ljudskog antitela prepoznajući isti epitop. (Jespers i dr., Bio/Technology 12:899-903 (1988). Videti takođe, patent SAD br.5,565,332.) ;;;4 ;[0136] U drugom otelotvorenju, DNK koja kodira željena monoklonalna antitela može biti lako izolovana i sekvenconisana upotrebom konvencionalnih procedura (npr., upotrebom oligonukleotidnih sondi koje su u stanju da se vežu specifično za gene koji kodiraju teški i laki lanac antitela miša). Izolovane i podklonirane ćelije hibridoma ili izolovani fagi, na primer, mogu služiti kao izvor takve DNK. Kada je izolovana, DNK može biti postavljena u ekspresione vektore koji se zatim prebacuju u prokariotske ili eukariotske ćelije domaćina, kao što su E. coli ćelije, COS ćelije majmuna, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koji u suprotnom ne proizvode imunoglobuline. Naročito, izolovana DNK (koja može biti sintetička kao što je ovde opisano) može se koristiti za kloniranje sekvenci konstantnih i varijabilnih regiona za proizvodnju antitela kao što je opisano u Newman i dr., pat. SAD. br.5,658,570, podnetoj 25. januara, 1995. Transformisane ćelije koji vrše ekspresiju željenog antitela mogu se gajiti u relativno velikim količinama kako bi se dobile kliničke i komercijalne zalihe imunoglobulina. ;;[0137] U jednom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo sadrži bar jedan teški ili laki lanac CDR molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži bar dva CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži bar tri CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži bar četiri CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul sadrži bar pet CDR iz jednog ili više molekula antitela. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul prema opisu sadrži bar šest CDR iz jednog ili više molekula antitela. ;;[0138] U specifičnom otelotvorenju, sekvenca aminokiselina teškog i/ili lakog lanca varijabilnih domena može biti ispitana za identifikovanje sekvenci regiona koji određuju komplementarnost (CDR) metodama koje su dobro poznate u struci, npr., upoređivanjem sa poznatim sekvencama aminokiselina drugih teških i lakih lanaca varijabilnih regiona radi određivanja regiona hipervarijabilnosti sekvence. Upotrebom rutinskih rekombinantnih DNK tehnika, jeda ili više CDR koji se mogu uneti u regione okvira, npr., u ljudske regione okvira kako bi humanizovali ne-ljudska antitela. Regioni okvira mogu biti prirodni ili konsenzusni regioni okvira, i poželjno ljudski region okvira (videti, npr., Chothia i dr., J. Mol. Biol. ;278:457-479 (1998) za spisak ljudskih regiona okvira). Polinukleotid stvoren kombinovanjem regiona okvira i CDR kodira antitelo koje se specifično vezuje za jedan epitop željenog antigena, npr., Psl. Jedna ili više zamena aminokiselina može biti izvršena u regionima okvira, i zamene aminokiseline poboljšavaju vezivanje antitela za svoj antigen. Dodatno, takve metode mogu biti korišćene za pravljenje zamena aminokiselina ili brisanja jednog ili više varijabilnih regiona cistein ostataka koji učestvuju u međulančanoj disulfidnoj vezi kako bi se stvorili molekule antitela koji nemaju jednu ili više međulančanih disulfidnih veza. Druge izmene polinukleotida obuhvaćene su predmetnim obelodanjivanjem i u okviru su sposobnosti osobe koja je stručna u ovoj oblasti. ;;[0139] Takođe su dati vezujući molekuli koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili sastoje se od, varijanti (uključujući derivate) molekula antitela (npr., VH regioni i/ili VL regioni) ovde opisanih, gde se vezujući molekuli ili njihovi fragmenti specifično vezuju za Pseudomonas Psl. Standardne tehnike poznate onima koji su stručni u ovoj oblasti mogu se koristiti za uvođenje mutacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira vezivanje molekula ili njegovo fragmenta koji se specifično vezuje Pseudomonas Psl, uključujući, ali bez ograničenja, mutagenezu određenu mestom i PCR-posredovanu mutagenezu koja se ispoljava u zamenama aminokiselina. Varijante (uključujući derivate) kodiraju polipeptide koji sadrže manje od 50 zamena aminokiselina, manje od 40 zamena aminokiselina, manje od 30 zamena aminokiselina, manje od 25 zamena aminokiselina, manje od 20 zamena aminokiselina, manje od 15 zamena aminokiselina, manje od 10 zamena aminokiselina, manje od 5 zamena aminokiselina, manje od 4 zamene aminokiselina, manje od 3 zamene aminokiselina ili manje od 2 zamene aminokiselina u odnosu na referentni VH region VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL region, VLCDR1, VLCDR2, ili VLCDR3. „Konzervativna zamena aminokiseline“ je ona u kojoj se ostatak aminokiseline zamenjuje sa ostatkom aminokiseline koja ima bočni lanac sličnog naelektrisanja. Porodice ostataka aminokiselina koji imaju bočne lance sa sličnim naelektrisanjem definisane su u struci. Ove familije obuhvataju aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-granati bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Alternativno, mutacije mogu biti uvedene nasumično duž svih delova sekvence kodiranja, kao što je mutagenezom zasićenja, i dobijeni mutanti mogu biti provereni za biološku aktivnost kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost (npr., sposobnost vezivanja za Pseudomonas Psl). ;;;4 ;[0140] Na primer, moguće je uvesti mutacije samo u regione okvira ili samo u CDR regione molekula antitela. Uvedene mutacije mogu biti tihe ili neutralne misens mutacije, tj., nemaju ili imaju malo uticaja na sposobnost antitela da se veže za antigen. Ovi tipovi mutacija mogu biti od koristi pri optimizaciji upotrebe kodona, ili poboljšati proizvodnju hibridoma antitela. Alternativno, ne-neutralne misens mutacije mogu izmeniti sposobnost antitela da se veže za antigen. Lokacija većine tihih i neutralnih misens mutacija najverovatnije se nalazi u regionima okvira, dok su lokacije većine ne-neutralnih misens lokacija verovatno u CDR, iako ovo nije apsolutno zahtevano. Osoba stručna u ovoj oblasti bila bi u stanju da dizajnira i testira mutant molekula sa željenim svojstvima kao što je bez menjanja aktivnost vezivanja antigena ili menjanje aktivnosti vezivanja (npr., poboljšanje aktivnost vezivanja antigena ili promena u specifičnost antigena). Nakon mutageneze, može se rutinski vršiti ekspresija proteina i/ili funkcionalna aktivnost kodiranog proteina, (npr., sposobnost da se veže za bar jedan epitop od Pseudomonas Psl) može biti određena upotrebom tehnika koje su ovde opisano ili rutinskim tehnikama menjanja poznatim u struci. ;;III. POLIPEPTIDI ANTITELA ;[0141] Obelodanjivanje dalje je usmereno na izolovane polipeptide koji čine vezujuće molekule, npr., antitela ili njegove antigen-vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju za Pseudomonas Psl i polinukleotide koji kodiraju takve polipeptide. Vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti kao što je ovde obelodanjeno, sadrže polipeptide, npr., sekvence aminokiseline koje kodiraju, na primer, Psl-specifične antigen vezujuće regione izvedene iz molekula imunoglobulina. Polipeptid ili sekvenca aminokiseline „izvedena iz“ označenog proteina odnosi se na poreklo polipeptida. U određenim slučajevima polipeptid ili sekvenca aminokiseline koja je izvedena iz određenog početnog polipeptida ili sekvence aminokiseline ima sekvencu aminokiseline koja je suštinski identična sa početnom sekvencom ili njenim delom, gde se deo sastoji bar od 10-20 aminokiselina, bar 20-30 aminokiselina, bar 30-50 aminokiselina ili koja se drugačije može identifikovati od strane osobe koja je stručna u ovoj oblasti kako ima svoje poreklo u početnoj sekvenci. ;;[0142] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži teški lanac varijabilnog regiona (VH) imunoglobulina sa sekvencom aminokiseline koja je bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od to: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ;;;4 ;SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0143] Dalje je dat izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH sekvencu aminokiseline identičnu, ili identičnu osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiselina sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0144] Neka otelotvorenja obelodanjuju izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, gde jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH je bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa jednim ili više referentnim teškim lancem VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 sekvenci aminokiseline od jedne ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0145] Dalje je obelodanjen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, gde je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan sa jednim, ili identičan osim za četiri, tri, dve ili jednu zamenu aminokiseline, sa jednim ili više referentnim teškim lancem VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 sekvence aminokiseline jedne ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 Kao što je prikazano na Tabeli 2. Stoga, prema ovom otelotvorenju, VH sadrži jedan ili više VHCDR1, VHCDR2, ili VHCDR3 identičan ili identičan osim za četiri, tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina, sa jednim ili više VHCDR1, VHCDR2, ili VHCDR3 sekvenci aminokiseline prikazanih na Tabeli 3. ;;[0146] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži laki lanac varijabilnog domena (VL) imunoglobulina sekvence aminokiseline sa bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnošću sa jednom ili više od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID ;;;4 ;NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0147] Neka otelotvorenja obelodanjuju izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL sekvencu aminokiseline identičnu, ili identičnu osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiselina, sa jednom ili više od ;SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0148] Takođe je obelodanjen izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, gde jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL su bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identični sa jednim ili više referentnih lakih lanaca VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 sekvenci aminokiselina jedne ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2. ;;[0149] Dalje je dat izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, gde je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL identično, ili identično osim za četiri, tri dva ili jednu zamenu aminokiseline sa jednim ili više referentnih teških lanaca VLCDR1, VLCDR2 i/ili VLCDR3 sekvenca aminokiseline jedne ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2. Stoga, prema ovom otelotvorenju, VL sadrži jedan ili više VLCDR1, VLCDR2, ili VLCDR3 identičan ili identičan osim za četiri, tri, dva ili jednu zamenu aminokiselina, sa jednim ili više VLCDR1, VLCDR2, ili VLCDR3 sekvenci aminokiseline prikazanih na Tabeli 3. ;;[0150] U drugim otelotvorenjima, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži, sastoji se suštinski od, ili sastoji se od VH i VL sekvenci aminokiseline bar sa 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnošću sa: ;;;4 ;(a) SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, respektivno,(b) SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2, respektivno,(c) SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2 , respektivno,(d) SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 , respektivno,(e) SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8, respektivno,(f) SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10, respektivno,(g) SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 , respektivno,(h) SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 14, respektivno; (i) SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, respektivno; ili (j) SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 12 , respektivno. U određenim otelotvorenjima, iznad-opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 11 i VL sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 12. U nekim otelotvorenjima, iznad-opisano antitelo i njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 1 i VL sa sekvencom aminokiseline od SEQ ID NO: 2. U drugim otelotvorenjima, iznad-opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži VH sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 11 i a VL sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO: 12. ;;[0151] U određenim otelotvorenima, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim sa konstantnom disocijacije (KD) ne većom od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10-<8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M. ;;[0152] U specifičnim otelotvorenjima, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl, sa afinitetom okarakterisanim sa konstantom disocijacije (KD) u opsegu od oko 1 x 10<-10>do oko 1 x 10<-6>M. U jednom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl, sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1,18 x 10<-7>M, kao što je određeno sa OCTET® testom vezivanja koji je ovde opisan. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano specifično se vezuje za Pseudomonas Psl, sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1,44 x 10<-7>M, kao što je određeno sa OCTET® testom vezivanja koji je ovde opisan. ;;;4 ;[0153] Neka otelotvorenja obuhvataju izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili njegov fragment kao što je opisano iznad, koji (a) može da inhibira povezivanje Pseudomonas aeruginosa za epitelne ćelije, (b) može da promoviše OPK P. aeruginosa, ili (c) može da inhibira povezivanje P. aeruginosa za epitelne ćelije i da promoviše OPK P. aeruginosa. ;;[0154] U nekim otelotvorenjima izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment kao što je opisano iznad, gde se maksimalno inhibiranje P. aeruginosa vezivanja za epitelne ćelije ostvaruje pri koncentraciji antitela od oko 50 µg/ml ili manje, 5,0µg/ml ili manje, ili oko 0,5µg/ml ili manje, ili pri koncentraciji antitela u opsegu od 30 µg/ml do oko 0,3 µg/ml, ili pri koncentraciji antitela od oko 1 µg/ml, ili pri koncentraciji antitela od oko 0,3 µg/ml. ;;[0155] Određena otelotvorenja obuhvataju izolovane vezujuće molekule, npr., antitelo ili njegov fragment kao što je opisano iznad, gde je OPK EC50 manje od oko 0,5 µg/ml, manje od oko 0,05µg/ml, ili manje od oko 0,005µg/ml, ili gde je OPK EC50 u opsegu od oko 0,001 µg/ml do oko 0,5 µg/ml, gde je OPK EC50 u opsegu od oko 0,02 µg/ml do oko 0,08 µg/ml gde je OPK EC50 u opsegu od oko 0,002 µg/ml do oko 0,01 µg/ml ili gde je OPK EC50 is manje od oko 0,2 µg/ml, ili gde je OPK EC50 manje od 0,02 µg/ml. U određenim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji je ovde opisan specifično se vezuje za isti Psl epitop kao monoklonalno antitelo WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005, ili će konkurentno inhibirati takvo monoklonalno antitelo iz vezivanja za Pseudomonas Psl. WapR-004RAD je identično sa WapR-004 osim za zamenu aminokiseline G98A VH sekvence aminokiseline SEQ ID NO: 11. ;;[0156] Neka otelotvorenja obuhvataju WapR-004 (W4) mutante koji sadrže scFv-Fc molekul sa sekvencom aminokiseline identičnom, ili identičnom osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiseline amino sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146. ;;[0157] Druga otelotvorenja obuhvataju WapR-004 (W4) mutante koji sadrže scFv-Fc molekul sa sekvencom aminokiseline sa bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnosti sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146. ;;[0158] U nekim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde opisan specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonalno antitelo WapR-001, WapR-002, ili WapR-003, ili će konkurentno inhibirati takvo monoklonalno antitelo iz vezivanja za Pseudomonas Psl. ;;[0159] U nekim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde opisan specifično se vezuje za isti epitop kao ;;;1 ;monoklonalno antitelo WapR-016, ili će konkurentno inhibirati takvo monoklonalno antitelo iz vezivanja za Pseudomonas Psl. ;TABELA 2: Referentne VH i VL sekvence aminokiselina*
2
4
TABLA 3: Referentne VH i VL CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence aminokiselina
[0160] Bilo koji anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti ili derivati ovde opisani dalje mogu obuhvatati dodatne polipeptide, npr., signalne peptide kako bi upravljali lučenjem kodiranih polipeptida, antitela konstantnih regiona kao što je ovde opisano ili drugih heterolognih polipeptida kao što je ovde opisano. Dodatno, vezujući molekuli ili njihovi fragmenti prema opisu obuhvataju polipeptidne fragmente kao što je opisano na drugom mesto. Dodatno anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati ovde opisani mogu biti fuzioni polipeptidi, Fab fragmenti, csFvs ili drugi derivati kao što je ovde opisano.
[0161] Takođe, kao što je ovde na drugom mestu opisano detaljnije, obelodanjivanje obuhvata sastave koji sadrže anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule, npr., antitela ili njegove fragmente, varijante ili derivate koji su ovde opisani.
[0162] Takođe će stručni u ovoj oblasti prihvatiti da se anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati ovde opisani mogu modifikovati tako da se razlikuju u sekvenci aminokiselina od prirodnog vezujućeg polipeptida iz kojeg su izvedeni. Na primer, polipeptid ili sekvenca aminokiselina izvedena iz određenog proteina može biti slična, npr., imati određeni procenat identičnosti sa početnom sekvencom, npr., može biti 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% identična sa početnom sekvencom.
[0163] Termin „procenat identičnosti sekvence“ između dva polinukleotida ili polinukleotidne sekvence odnosi se na broj identično poklopljenih pozicija koje dele sekvence u prozoru za upoređivanje, uzimajući u obzir dodavanja i brisanja (npr., praznine) koje se moraju uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poklopljena pozicija je bilo koja pozicija gde su dva identična nukleotida ili aminokiseline predstavljene u oba, u cilju i referentnoj sekvenci. Praznine predstavljene u ciljanoj sekvenci se ne broje kako praznine nisu nukleotidi ili aminokiseline. Slično tome, praznine predstavljene u referentnoj sekvenci nisu brojane kako su ciljana sekvenca nukleotida ili aminokiseline brojane, a ne nukleotidi ili aminokiseline iz referentne sekvence.
[0164] Procenat identičnosti sekvence izračunat je određivanjem broja pozicije na kojima se pojavljuje identičan ostatak aminokiseline ili baza nukleinske kiseline kod obe sekvence kako bi se doprineo broj poklopljenih pozicija, deljenjem broja poklopljenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za upoređivanje i množenjem rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti sekvence između dve sekvence može biti ostvareno upotrebom lako dostupnih softvera kako za onlajn upotrebu tako i za preuzimanje. Pogodni softverski programi dostupni su od različitih izvora, i za poravnanje oba, proteinskih i nukleotidnih sekvenci. Jedan pogodan program za određivanja procenta identičnosti sekvence je bl2seq, deo BLAST paketa programa dostupnog od strane Nacionalnog centra za biotehnološke informacije vlade SAD BLAST veb stranica (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq vrši upoređivanje između dve sekvence upotrebom ili BLASTN ili PLASTP algoritma. BLASTN se koristi za upoređivanje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP koristi za upoređivanje sekvenci aminokiselina. Drugi pogodni programi su, npr., Needle, Stretcher, Water, ili Matcher, deo EMBOSS paketa bioinformatičkih programa i takođe dostupnih od strane Evropskog instituta za bioinformacije (EBI) na www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
[0165] Različiti regioni u pojedinačnom polinukleotidu ili polipeptidnoj ciljanoj sekvenci koja se poravnava sa polinukleotidom ili polipeptidnom referentnom sekvencom može imati sopstveni procenat identičnosti sekvence. Zabeleženo je da se procenat identičnosti sekvence zaokružuje na najbližih deset. Na primer, 80,11, 80,12, 80,13, i 80,14 zaokružuju se na 80,1, dok se 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, i 80,19 zaokružuju na 80,2. Takođe je zabeleženo da će vrednost dužine uvek biti ceo broj.
[0166] Osoba stručna u ovoj oblasti prihvatiće da stvaranje poravnanja sekvence za izračunavanje procenta identičnosti sekvence nije ograničeno na binarna sekvenca-sekvenca poravnavanje isključivo vođeno primarnim podacima o sekvenci. Poravnanja sekvence mogu biti izvedena iz više poravnanja sekvenci. Jedan pogodan program za stvaranje više poravnanja sekvence je ClustalW2 dostupan od www.clustal.org. Još jedan pogodan program je MUSCLE, dostupan od www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 i MUSCLE su alternativno dostupni, npr., od EBI.
[0167] Takođe će biti prihvaćeno da poravnanja sekvence mogu biti stvorena integrisanjem podataka sekvence sa podacima iz heterogenih izvora kao što su strukturni podaci (npr., kristalografičke proteinske strukture), funkcionalni podaci (npr., lokacija mutacija) ili filogenetski podaci. Pogodni program koji integriše heterogene podati kako bi stvorio više poravnanja sekvence je T-Coffee dostupan na www.tcoffee.org, i alternativno dostupan, npr., od EBI. Takođe će biti prihvaćeno da krajnje poravnanje koje se koristi da se računa procenat identičnosti sekvence može organizovati ili automatski ili ručno.
[0168] Bez obzira da li je bilo koji naročiti polipeptid bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičan sa drugim polipeptidom može biti određen upotrebom metoda i kompjuterskih programa/softvera poznatim u struci, bez ograničenja na, BESTFIT program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT koristi algoritam lokalne homologije od Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), kako bi pronašao najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za poravnanje sekvence za određivanje da li je određena sekvenca na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom, parametri se postavljanju, naravno, tako da se procenat identičnosti računa preko cele dužine sekvence referentnog polipeptida i da su praznine u homologiji do 5% ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci dozvoljene.
[0169] Dalje, zamene nukleotida ili aminokiseline, brisanje ili unošenje koje dovodi do konzervativnih zamena ili promena u „ne-esencijalnim“ regionima aminokiseline mogu biti izvršene. Na primer, polipeptid ili sekvenca aminokiseline izvedena iz određenog proteina može biti identična sa početnom sekvencom osim za jednu ili više pojedinačnih zamena, unošenja ili brisanja aminokiseline, npr., jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, petnaest, dvadeset ili više pojedinačnih zamena, unošenja ili brisanja aminokiselina. U određenim otelotvorenjima, polipeptid ili sekvenca aminokiselina izvedena iz određenog proteina mora da ima od jedan do pet, jedan do deset, jedan do petnaest, jedan do dvadeset pojedinačnih zamena, unošenja ili brisanja aminokiselina u odnosu na početnu sekvencu.
[0170] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde opisan može da sadrži, da se sastoji suštinski od, ili sastoji od fuzionog proteina. Fuzioni proteini su himerni molekuli koji sadrže, na primer, antigen-vezujući domen imunoglobulina sa bar jednim ciljanim mestom vezivanja, i bar jedan heterologni deo, tj., deo za koji nije prirodno povezan u prirodi. Sekvence aminokiselina mogu normalno postojati u odvojenim proteinima koji su dovedeni zajedno u fuzioni polipeptid ili mogu normalno postojati u istom proteinu ali su postavljene u novom poretku u fuzionom polipeptidu.
Fuzioni proteini mogu biti stvoreni, na primer, hemijskom sintezom ili stvaranjem i prevođenjem polinukleotida u kojem su peptidni regioni kodirani u željenu vezu.
[0171] Termin „heterologni“ kao što se primenjuje za polinukleotid, polipeptid, ili drugu grupu označava da se polinukleotid, polipeptid ili druga grupa izvodi iz određenog entiteta koji se od ostatka entiteta za koji se vezuje razlikuje. U neograničavajućem primeru, „heterologni polipeptid“ koji se spaja za vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, varijanta ili derivat izveden je iz ne-imunoglobulin polipeptida iste vrste, ili imunoglobulin ili ne-imunoglobulin polipeptida druge vrste.
IV. FUZIONI PROTEINI I KONJUGATI ANTITELA
[0172] U nekim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti dati više puta u konjugovanoj formi. U još jednom otelotvorenju, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti dati u nekonjugovanoj formi, i zatim u konjugovanoj formi i obrnuto.
[0173] U specifičnim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivate mogu biti konjugovani za jedan ili više antimikrobni agens, na primer, Polimiksin B (PMB). PMB je mali lipopeptid antibiotik odobren za tretiranje Gram-negativnih infekcija otpornih na više lekova. Dodatno njegovoj bakterocidalnoj aktivnosti, PMB vezuje lipopolisaharide (LPS) i neutrališe njihove proinflamatorne efekte (Dixon, R.A. & Chopra, I. J Antimicrob Chemother 18, 557-563 (1986)). LPS se smatra značajnim doprinosom inflamaciji i nastupanju Gram-negativne sepse (Guidet, B., i dr., Chest 106, 1194-1201 (1994)). Terapije koje neutralizuju i/ili uklanjanju LPS iz cirkulacije imaju potencijal da spreče ili odlože nastupanje sepse i poboljšaju klinički ishod. Polimiksin B (PMB) je lipopeptidni antibiotik odobren za tretiranje Gram-negativnih infekcija otpornih na više lekova. Dodatno njegovoj bakteriocidalnoj aktivnost, PMB vezuje LPS i neutralizuje njihove proinflamatorne efekte. Konjugati PMB za nosače molekula prokazali su da neutralizuju LPS i posreduju zaštitu kod modela životinja za endotoksemiju i infekciju (Drabick, J.J., i dr. Antimicrob Agents Chemother 42, 583-588 (1998)). Takođe je obelodanjena metoda za povezivanje jednog ili više PMB molekula za cistein ostatke uvedene u Fc region monoklonalnih antitela (mAb) prema obelodanjivanju. Na primer, Cam-003-PMB konjugati zadržali su specifično, mAb-posredovano vezivanje za P. aeruginosa i takođe zadržali OPK aktivnost. Štaviše, mAb-PMB konjugati vezuju i neutralizuju LPS in vitro.
[0174] U određenim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat ovde opisan može da sadrži heterolognu sekvencu aminokiseline ili jednu ili više drugih grupa koje se normalno ne povezuju sa antitelom (npr., antimikrobni agens, terapeutski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, uočljiva oznaka, polietilen glikol (PEG) i kombinacija dva ili više bilo koja navedena agensa). U sledećim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat može sadržati uočljivu oznaku izabranu iz grupe koju čine enzim, fluorescentna oznaka, hemiluminiscentna oznaka, bioluminiscentna oznaka, radioaktivna oznaka ili kombinacije dve ili više bilo koje navedene uočljive oznake.
V. POLINUKLEOTIDI KOJI KODIRAJU VEZUJUĆE MOLEKULE
[0175] Ovde su takođe dati molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule, npr., antitela ili njegove fragmente, varijante ili derivate koji su ovde opisani.
[0176] Jedno otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira region (VH) imunoglobulina sa teškim lancem
1
sekvence amino kiseline koja je bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ IS NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0177] Još jedno otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VH sekvencu aminokiseline, identičnu, ili identičnu osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiselina sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0178] Sledeće otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VH, gde je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan, ili identičan osim za četiri, tri, dva ili jednu zamenu aminokiseline sa jednom ili više referentnih VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 teškog lanca sa sekvencom koja je jedna ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0179] Drugo otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VH, gde je jedan ili više od VHCDR1, VHCDR2 ili VHCDR3 regiona VH identičan, ili identičan osim za četiri, tri, dve ili jednu zamenu aminokiseline, sa jednim ili više referentnih VHCDR1, VHCDR2 i/ili VHCDR3 teškog lanca sa sekvencom aminokiseline koja je jedna ili više od: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, ili SEQ ID NO: 74 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0180] Sledeće otelotvorenje daje izolovani vezujući molekul npr., antitelo ili antigenvezujući fragment koji sadrži VH kodiran od strane polinukleotida koji se specifično ili preferencijalno vezuje za Pseudomonas Psl.
2
[0181] Drugo otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira region (VL) imunoglobulina sa lakim lancem sekvence amino kiseline koja je bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0182] Sledeće otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VL sekvencu aminokiseline identičnu, ili identičnu osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiselina sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0183] Još jedno otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira VL, gde je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL bar 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%, identičan sa jednim ili više referentnim VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 lakog lanca sa sekvencama aminokiseline koja je jedna ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0184] Dalje otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl koji sadrži VL, gde je jedan ili više od VLCDR1, VLCDR2 ili VLCDR3 regiona VL identičan, ili identičan osim za četiri, tri, dve ili jednu zamenu aminokiseline, sa jednim ili više referentnih VLCDR1, VLCDR2 i/ili VLCDR3 teškog lanca sa sekvencom aminokiseline koja je jedna ili više od: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 kao što je prikazano na Tabeli 2.
[0185] U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili antigenvezujući fragment koji sadrži VL kodiran od strane polinukleotida specifično ili preferencijalno se vezuje za Pseudomonas Psl.
[0186] Jedno otelotvorenje daje izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira scFv molekul koji sadrži VH i VL, gde je scFv bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičan sa jednom od SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ili SEQ ID NO:70 što je prikazano na Tabeli 4.
Tabela 4: Referentne scFv sekvence nukleinskih kiselina
4
[0187] U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran od strane jednog ili više iznad opisanih polinukleotida, koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od VH i VL sekvenci aminokiseline sa bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičnosti sa:
(a) SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, respektivno, (b) SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2, respektivno, (c) SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2 , respektivno, (d) SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 , respektivno, (e) SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8, respektivno, (f) SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10, respektivno, (g) SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 , respektivno, (h) SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 14, respektivno; (i) SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, respektivno; ili (j) SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 12 , respektivno.
[0188] U određenim otelotvorenjima, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran od strane jednog ili više ovde opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim sa konstantnom disocijacije (KD) koja nije veća od 5 x 10<-2>M, 10<-2>M, 5 x 10<-3>M, 10<-3>M, 5 x 10<-4>M, 10<-4>M, 5 x 10<-5>M, 10<-5>M, 5 x 10<-6>M, 10<-6>M, 5 x 10<-7>M, 10<-7>M, 5 x 10<-8>M, 10<-8>M, 5 x 10<-9>M, 10<-9>M, 5 x 10<-10>M, 10<-10>M, 5 x 10<-11>M, 10<-11>M, 5 x 10<-12>M, 10<-12>M, 5 x 10<-13>M, 10<-13>M, 5 x 10<-14>M, 10<-14>M, 5 x 10<-15>M, ili 10<-15>M.
[0189] U specifičnim otelotvorenjima, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran od strane jednog ili više ovde opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim sa konstantom disocijacije (KD) koja je u opsegu od oko 1 x 10<-10>do oko 1 x 10<-6>M. U jednom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran od strane jednog ili više ovde opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1,18 x 10<-7>M, kao što je određeno OCTET® testom vezivanja koji je ovde opisan. U drugom otelotvorenju, izolovani vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran od strane jednog ili više ovde opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za Pseudomonas Psl sa afinitetom okarakterisanim sa KDod oko 1,44 x 10<-7>M, kao što je određeno OCTET® testom vezivanja koji je ovde opisan.
[0190] U određenim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat kodiran od strane jednog ili više iznad opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti Psl epitop kao i monoklonalno antitelo WapR-004, WapR-004RAD, Cam-003, Cam-004, ili Cam-005, ili će potpuno konkurentno takvo monoklonalno antitelo od vezivanja za Pseudomonas Psl. WapR-004RAD je identično sa WapR-004 osim zamene nukleinske kiseline G293C VH sekvence nukleinske kiseline koja kodira VH sekvencu aminokiseline od SEQ ID NO:11 (zamena nukleotida u VH-kodirajućem delu SEQ ID NO:71 na poziciji 317). Sekvence nukleinske kiseline koja kodira WapR-004RAD VH predstavljena je kao SEQ ID NO 76.
[0191] Neka otelotvorenja daju izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira W4 mutant scFv-Fc molekul sekvence aminokiseline identične, ili identične osim za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više zamena aminokiselina sa jednom ili više od:SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.
[0192] Druga otelotvorenja daju izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira W4 mutant scFv-Fc molekul sekvence aminokiseline bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identične sa jednom ili više od: SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; ili SEQ ID NO: 146.
[0193] Jedno otelotvorenja daju izolovani polinukleotid koji sadrži, suštinski se sastoji, ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira W4 mutant scFv-Fc molekul, gde je nukleinska kiselina bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identična sa jednom ili više od SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, ili SEQ ID NO: 152, SEQ IS NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214; ili SEQ ID NO: 215.
[0194] U drugim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat kodiran od strane jednog ili više iznad opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonalno antitelo WapR-001,
1
WapR-002, ili WapR-003, ili će konkurentno inhibirati takvo monoklonalno antitelo od vezivanja za Pseudomonas Psl.
[0195] ] U drugim otelotvorenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat kodiran od strane jednog ili više iznad opisanih polinukleotida, specifično se vezuje za isti epitop kao monoklonalno antitelo WapR-016, ili će konkurentno inhibirati takvo monoklonalno antitelo od vezivanja za Pseudomonas Psl.
[0196] Obelodanjivanje takođe obuhvata fragmente polinukleotida kao što je ovde opisano na drugom mesto- Dodatni polinukleotidi koji obuhvataju fuzione polinukleotide, Fab fragment i druge derivate kao što je ovde opisano takođe su dati.
[0197] Polinukleotidi mogu biti proizvedeni ili napravljeni pomoću bilo koje poznate metode u struci. Na primer, ukoliko je nukleotidna sekvenca antitela poznata, polinukleotid koji kodira antitelo može biti sastavljen iz hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr., kao što je opisano u Kutmeier i dr., BioTechniques 17:242 (1994)), ukratko, to obuhvata sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, normalizaciju i vezivanje ovih oligonukleotida, i zatim pojačavanje vezanih oligonukleotida sa PCR.
[0198] Alternativno, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat može biti stvoren iz nukleinske kiseline od pogodnih izvora. Ukoliko klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije dostupan, ali je poznata sekvenca molekula antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo može biti hemijski sintetisana ili dobijena od pogodnog izvora (npr., cDNK biblioteka antitela ili cDNK biblioteka stvorena od nukleinske kiseline, poželjno poli A+RNK, izolovane iz, bilo kojeg tkiva ili ćelija koje vrše ekspresiju antitela kao što su ćelije hibridoma izabrane da vrše ekspresiju antitela) PCR pojačavanjem upotrebom sintetičkih primera koji se mogu hibridizovati na 3’ i 5’ kraju sekvence ili kloniranjem sonde oligonukleotida specifične za određenu sekvencu gena kako bi se identifikovao, npr., cDNK klon od cDNK biblioteke koja kodira antitelo. Pojačane nukleinske kiseline stvorene sa PCR mogu zatim biti klonirane u vektore za kloniranje koji se mogu replicirati bilo kojom poznatom metodom u struci.
2
[0199] Kada se nukleotidna sekvenca i odgovarajuća sekvenca aminokiseline anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata odrede, nukleotidnom sekvencom može se manipulisati upotrebom metoda poznatih u struci za manipulaciju nukleotidnih sekvenci, npr., rekombinantne DNK tehnike, mutageneza usmerena na mestu, PCR, itd. (videti, na primer, tehnike opisane u Sambrook i dr., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) i Ausubel i dr., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), za stvaranje antitela koja imaju različite sekvence aminokiselina, na primer za stvaranje zamena, uklanjanja i uvođenja aminokiselina.
[0200] Polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment varijanta ili derivat može biti sastavljen od poliribonukleotida ili polidezoksiribonukleotida koji mogu biti neizmenjena RNK ili DNK ili izmenjena RNK ili DNK. Na primer, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment varijanta ili derivat može biti sastavljen od jedno- ili dvo-lančane DNK, DNK koja je mešavina jedno- i dvo-lančanih regiona, jedno- i dvo-lančane RNK i RNK koja je mešavina jedno- i dvo-lančanih regiona, hibridnih molekula koji sadrže DNK i RNK koje mogu biti jedno-lančane ili, obično dvo-lančane ili mešavina jedno- i dvo-lančanih regiona. Dodatno, polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat mogu biti sastavljeni od tro-lančanih regiona koji sadrže RNK ili DNK ili oba, RNK i DNK. Polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat takođe može da sadrži jednu ili više modifikovanih baza ili DNK ili RNK glavne lance modifikovane za stabilnost ili druge razloge. „Modifikovane“ baze obuhvataju, na primer, titrisane baze i neobične baze kao što je inozin. Različite modifikacije mogu biti izvršene na DNK i RNK; stoga, „polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski i metabolički modifikovane forme.
[0201] Izolovani polinukleotid koji kodira veštačke varijante polinukleotida izvedenog iz imunoglobulina (npr., deo imunoglobulina teškog lanca ili lakog lanca) može biti stvoren uvođenjem jedne ili više nukleotidnih zamena, dodataka ili uklanjanja u nukleotidnu sekvencu imunoglobulina kao što je uvođenje jedne ili više zamena, dodavanja ili uklanjanja aminokiseline u kodirani protein. Mutacije mogu biti uvedene standardnim tehnikama, kao što je mutageneza upravljana mestom i PCR posredovana mutageneza. Konzervativne zamene aminokiselina napravljene su na jednom ili više ostataka aminokiselina koji nisu suštinski.
VI. EKSPRESIJA POLIPEPTIDA ANTITELA
[0202] Kao što je dobro poznato RNK može biti izolovana iz originalnih ćelija hibridoma ili iz drugih transformisanih ćelija poznatim tehnikama, kao što je ekstrakcija gvanidinijum izotiocijanata i precipitacija koja je praćena centrifugiranjem ili hromatografijom. Kada je poželjno, mRNK može biti izolovana iz ukupne RNK standardnim tehnikama kao što je hromatografija na oligo dT celulozi. Pogodne tehnike poznate su u struci.
[0203] U jednom otelotvorenju, cDNK koje kodiraju lake i teške lance anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovo fragmenta, varijante ili derivata mogu biti napravljene, ili simultano ili odvojeno upotrebom reverzne transkriptaze i DNK polimeraze u skladu sa dobro poznatim metodama. PCR može biti započeta primerima konsenzusnog konstantnog regiona ili određenijim primerima na osnovu objavljenih DNK lakog i teškog lanca i sekvenci aminokiselina. Kao što je razmatrano iznad, PCR takođe se može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju lake i teške lance antitela. U ovom slučaju biblioteke mogu biti proveren sa konsenzusnim primerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde mišijeg konstantnog regiona.
[0204] DNK, obično plazmidna DNK može biti izolovana iz ćelija upotrebom tehnika poznatih u struci, restrikciono mapirane i sekvencirane u skladu sa standardom, dobro poznatim tehnikama već iznetim detaljno, npr., u prethodnim referencama koje se odnose na rekombinantne DNK tehnike. naravno, DNK može biti sintetička u skladu sa predmetnom obelodanjivanjem u bilo kojoj tački u toku procesa izolacije ili kasnijih analiza.
[0205] Nakon manipulacije izolovanog genetskog materijala radi dobijanja anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata prema obelodanjivanje, polinukleotidi koji kodiraju anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule, obično se unose u ekspresioni vektor za uvođenje u ćelije domaćina koje se mogu koristiti za proizvodnju željene količine anti-Pseudomonas Psl vezujućih molekula.
[0206] Rekombinantna ekspresija antitela, ili njegovog fragmenta, derivata ili analoga, npr., teški ili laki lanac antitela koji se vezuje za ciljani molekul koje je ovde opisan, npr., Psl, zahteva stvaranje ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo. Kada se
4
polinukleotid koji kodira molekul antitela ili teški ili laki lanac antitela, ili njegov deo (koji sadrži teški ili laki lanac varijabilnog domena) prema obelodanjivanju dobije, vektor za proizvodnju molekula antitela može biti proizveden rekombinantnom DNK tehnologijom upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Stoga, metode za pripremanje proteina vršenjem ekspresije polinukleotida koji sadrži antitelo koje kodiranje nukleotidne sekvence su ovde opisane. Metode koje su dobro poznate onima koji su stručni u ovoj oblasti mogu biti korišćene za pravljenje ekspresionih vektora koji sadrže antitela koja kodiraju sekvence i odgovarajuće transkripcione i translatorne kontrolne signale. Ove metode obuhvataju, na primer, in vitro rekombinantne DNK tehnike, sintetičke tehnike i in vivo genetsku rekombinaciju. Obelodanjivanje, stoga, daje, ponovljive vektore koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira molekul antitela prema obelodanjivanju, ili njegov teški ili laki lanac, ili varijabilni domen teškog ili lakog lanca, operativno povezanog za promoter. Takvi vektori mogu obuhvatiti nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr., PCT objavu WO 89/01036; i pat. SAD br.5,122,464) i varijabilni domen antitela može biti kloniran u takve vektore za vršenje ekspresije celokupnog teškog ili lakog lanca.
[0207] Termin „vektor“ ili „ekspresioni vektor“ ovde se koristi da označi srednje vektore korišćene u skladu sa predmetnom obelodanjivanjem kao prenosilac za uvođenje u i ekspresiju željenog gena u ćeliju domaćina. Kao što je poznato stručnima u ovoj oblasti, takvi vektori lako se mogu izabrati iz grupe koju čine plazmidi, fagi, virusi i retrovirusi. Uopšteno, vektori kompatibilni sa trenutnim obelodanjivanjem sadržanje marker za odabir, odgovarajuća mesta izvršenje kloniranja željenog gena i sposobnost da uđu i/ili se repliciraju u eukariotskoj ili prokariotskoj ćeliji.
[0208] Za svrhu ovog obelodanjivanja, brojni sistemi ekspresionih vektora mogu se upotrebiti. Na primer, jedna klasa vektora koristi DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su goveđi papiloma virus, polioma virus, adenovirus, vakcinija virus, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV) ili SV40 virus. Drugi obuhvataju upotrebu policistronskih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma. Dodatno, ćelije koje su integrisale DNK u njihove hromozome mogu biti izabrane uvođenjem jednog ili više markera koji pokazuju odabir transfektovanih ćelija domaćina. Marker može obezbediti prototrofiju aukotrofnom domaćinu, otpornost na biocid (npr., antibiotike) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Selektivni markerski gen može biti direktno povezan sa DNK sekvencama koje se izražavaju ili se unose u istu ćeliju pomoću kotransformacije. Dodatni elementi takođe mogu biti potrebni za optimalnu sintezu mRNK. Ovi elementi mogu uključivati signalne sekvence, signale vezivanja, kao i promotere transkripcije, pojačivače i signale prekidanja.
[0209] U nekim otelotvorenjima klonirani geni varijabilnog regiona uneti su u ekspresioni vektor zajedno sa genima lakog i teškog lanca konstantnog regiona (npr., ljudskog) sintetičkog kao što je razmatrano iznad. Naravno, bilo koji ekspresioni vektor koji je u stanju da izazove ekspresiju u eukariotskim ćelijama može se koristiti u predmetnom obelodanjivanju. Primeri pogodnih vektora obuhvataju, ali nisu ograničeni na plazmide pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, i pZeoSV2 (dostupne od Invitrogen, San Diego, CA), i plazmid pCI (dostupan od Promega, Madison, WI). Uopšteno govoreći, skrining velikog broja transformisanih ćelija za one koji vrše ekspresiju adekvatno visokog nivoa ako su teški i laki lanci imunoglobulina je rutinsko eksperimentisanje koje se može izvršiti, na primer, robotskim sistemima.
[0210] Uopštenije, kada se vektor ili DNK sekvenca koja kodira monomernu podjedinicu anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata prema obelodanjivanju pripremi, ekspresioni vektor može biti uveden u odgovarajuću ćeliju domaćina. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može biti ostvareno različitim tehnikama koje su dobro poznate osobi koja je stručna u ovoj oblasti. One obuhvataju ali nisu ograničene na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, precipitaciju kalcijum fosfata, spajanje ćelija sa envelopiranom DNK, mikroinjekcija, i infekcija sa nepromenjenim virusom. Videti, Ridgway, A. A. G.
"Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp.470-472 (1988). Obično, uvođenje plazmida u domaćina je preko elektroporacije. Ćelije domaćina koji primaju ekspresioni konstrukt gaje se pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca, i testirane su za sintezu proteina teških i lakih lanaca. Primerne tehnike testiranja obuhvataju enzim-povezani imunosorbentski test (ELISA), radioimunotest (RIA), ili analiza sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS), imunohistohemija i slično.
[0211] Ekspresioni vektor se prenosi u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama i transfektovane ćelije se zatim kultivišu konvencionalnim tehnikama kako bi proizvele antitelo za upotrebu u ovde opisanim metodama. Stoga, obelodanjivanje obuhvata ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijantu ili derivat, ili njegov teški ili laki lanac, operativno povezan sa heterolognim promoterom. U nekim otelotvorenjima za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju oba, teške i lake lance mogu zajedno vršiti ekspresiju u ćeliji domaćina za vršenje ekspresije celokupnog molekula imunoglobulina, kao što je detaljnije izneto ispod.
[0212] Određena otelotvorenja obuhvataju izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira iznad-opisane VH i VL, gde vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment čiju ekspresiju vrši polinukleotid specifično se vezuje za Pseudomonas Psl. U nekim otelotvorenjima polinukleotid kao što je opisano kodira scFv molekul uključujući VH i VL, bar 80%, 85%, 90% 95% ili 100% identičan sa jednom ili više od SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, ili SEQ ID NO: 70 kao što je prikazano na Tabeli 4.
[0213] Neka otelotvorenja obuhvataju vektore koji sadrže iznad opisane polinukleotide. U daljim otelotvorenjima, polinukleotidi su operativno povezani sa promoterom. U dodatnim otelotvorenjima, obelodanjivanje daje ćelije domaćina koje sadrže takve vektore. U daljim otelotvorenjima, obelodanjivanje daje vektore gde je polinukleotid operativno povezan sa promoterom, gde vektori mogu da vrše ekspresiju vezujućeg molekula koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl u pogodnoj ćeliji domaćina.
[0214] Takođe je data metoda za proizvodnju vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta koji se specifično vezuje za Pseudomonas Psl, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja obuhvata vektor koji sadrži iznad-opisane polinukleotide i dobijanje navedenog antitela ili njegovog fragmenta. U daljim otelotvorenjima, obelodanjivanje daje izolovani vezujući molekul ili njegov fragment proizveden iznad-navedenim metodama.
[0215] Kao što se ovde koristi, „ćelija domaćina“ odnosi se na ćeliju koja prima vektore napravljene upotrebom tehnika rekombinantne DNK i koje kodiraju bar jedan heterologni gen. U opisu procesa za izolaciju antitela iz rekombinantnih domaćina, termini „ćelije“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično da označe izvor antitela ukoliko nije jasno navedeno drugačije. Drugim rečima, dobijanje polipeptida iz „ćelija“ može da označava ili iz centrifugiranih celih ćelija ili iz ćelijske kulture koja sadrži oba, medijum i suspendovane ćelije.
[0216] Različiti sistemi domaćin-ekspresioni vektor mogu se koristiti za vršenje ekspresije molekula antitela za upotrebu u ovde opisani metodama. Takvi domaćin-ekspresioni sistemi predstavljaju prenosioce sa kojima se predmetna kodirajuća sekvenca može proizvesti i kasnije prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektuju sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, da vrše ekspresiju molekula antitela prema obelodanjivanju in situ.
Ovo obuhvata ali nije ograničeno na mikroorganizme kao što su bakterije (npr., E. coli, B. subtilis) transformisane sa rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnim DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; kvasac (npr., Saccharomyces, Pichia) transformisan sa rekombinantnim ekspresionim vektorima za kvasac koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; sistemi ćelija insekata inficirane sa ekspresionim vektorom rekombinantnog virusa (npr., bakulovirus) koji sadrži sekvence kodiranja antitela; sistemi ćelija biljaka inficirani sa ekspresionim vektorom rekombinantnog virusa (npr., karfiol mozaik virus, CaMV; tobako mozaik virus, TMV) ili transformisani sa ekspresionim vektorom rekombinantnog plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrži sekvence kodiranja antitela; ili sistemi ćelija sisara (npr., COS, CHO, BLK, 293, 3T3 ćelije) koje primaju rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotere izvedene iz genoma ćelija sisara (npr., metalotionein promoter) ili virusa sisara (npr., adenovirus kasni promoter; vakcinija virus 7.5K promoter). Bakterijske ćelije kao što su Escherichia coli, ili eukariotske ćelije, naročito za ekspresiju celog rekombinantnog molekula antitela, koriste se za ekspresiju rekombinantnog molekula antitela. Na primer, ćelije sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), u konjunkciji sa vektorom kao što je element glavnog posrednog ranog promotera gena iz ljudskog citomegalovirusa je efektivni ekspresioni sistem za antitela (Foecking i dr., Gene 45:101 (1986); Cockett i dr., Bio/Technology 8:2 (1990)).
[0217] Ćelijska linija domaćina korišćena za ekspresiju proteina često je od sisara poreklom; oni koji su stručni u ovoj oblasti imaju sposobnost da odrede posebne ćelijske linije domaćina koje su najpogodnije da se u njima vrši ekspresija željene proizvodnje gena. Primerne ćelijske linije obuhvataju, ali nisu ograničene na CHO (jajnika kineskog hrčka), DG44 i DUXB11 (linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (ljudskog karcinoma vrata), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI aa SV40 T antigenom), VERY, BHK (bubrega mladunčeta hrčka), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasta kineskog hrčka) BALBC/3T3 (fibroblasta miša), HAK (linija bubrega hrčka), SP2/O (mijeloma miša), P3x63-Ag3.653 (mijeloma miša), BFA-1clB (goveđe endotelijalne ćelije), RAJI (ljudskih limfocita) i 293 (ljudskog bubrega). Ćelije domaćina obično su dostupne od komercijalnih servisa, od Američke kolekcije kultura tkiva ili iz objavljene literature.
[0218] Dodatno, soj ćelija domaćina može biti odabran koji vrši moduliranje ekspresije unetih sekvenci, ili modifikuje i procesira proizvod gena na željeni specifičan način. Takve modifikacije (npr., glikozilacija) i procesiranje (npr., cepanje) proizvoda proteina može biti značajno za funkciju proteina. Različite ćelije domaćina ima karakteristike i specifične mehanizme za post-translatorno procesiranje i modifikaciju proteina i proizvoda gena. odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu biti izabrani radi osiguravanje ispravne modifikacije i procesiranja stranih proteina čija je izvršena ekspresija. U tom cilju, eukariotske ćelije domaćina koje poseduju celularnu mašinu za odgovarajuće procesiranje primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju proizvoda gena mogu se koristiti.
[0219] Za dugotrajnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom, poželjna je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno vrše ekspresiju molekula antitela mogu se konstruisati. Umesto da koriste ekspresione vektore koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu se transformisati pomoću DNK kontrolisane pomoću odgovarajućih elemenata za kontrolu ekspresije (npr. promotera, pojačivača, sekvenci, terminatora transkripcije, lokacija poliadenilacije itd.) i markera koji se bira. Nakon uvođenja strane DNK, ćelije koje su projektovane mogu se razvijati 1-2 dana u obogaćenoj sredini, a zatim se prebacuju na selektivnu sredinu. Odabrani marker u rekombinantnom plazmidu daje otpor odabiru i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u njihove hromozome i rastu i formiraju fokus koji se zauzvrat može klonirati i proširiti u ćelijske linije. Ova metoda se može pogodno koristiti za projektovanje ćelijskih linija koje stabilno izražavaju molekul antitela.
[0220] Više sistema za odabir može se koristiti, uključujući ali bez ograničenja timidin kinaza herpes simpleks virusa (Wigler i dr., Cell 11:223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaza (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), i adenin fosforibosiltransferaza (Lowy i dr., Cell 22:8171980) gena mogu se koristiti u tk-, hgprt- or aprt-ćelijama respektivno. Takođe, antimetabolitska otpornost može biti korišćena kao osnova odabira sledećih gena: dhfr, koji daje otpornost na metotreksat (Wigler i dr., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, koji daje otpornost na mikofenoličnu kiselinu (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, koji daje otpornost na aminoglikozid G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); i Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem.62:191-217 (1993);, TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993); i hygro, koji daje otpornost na higromicin (Santerre i dr., Gene 30:147 (1984). Metode poznate u struci tehnologije rekombinantne DNK koje se mogu koristiti opisane su u Ausubel i dr. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); i u odeljcima 12 i 13, Dracopoli i dr. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin i dr., J. Mol. Biol.150:1 (1981).
[0221] Nivoi ekspresije molekula antitela mogu biti povećani pojačavanjem vektora (za razmatranje, videti Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol.3. (1987)). Kada se marker u sistemu vektora vrši ekspresiju antitela pojača, pojačanje u nivou inhibitora prisutnog u kulturi ćelija domaćina povećaće broj kopija marker gena. Kako je pojačani region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela takođe će se povećati (Crouse i dr., Mol. Cell. Biol.3:257 (1983)).
[0222] In vitro proizvodnja dozvoljava povećanju da da veće količine željnih polipeptida. Tehnike za kultivisanje ćelija sisara pod uslovima kulture tkiva poznate su u struci i obuhvataju homogenu suspenziju kulture, npr., u reaktoru sa vazdušnim mostom ili u reaktoru sa kontinualni mešanjem, ili imobilisanu ili zarobljenu ćelijsku kulturu, npr., u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na mikro zrnima od agaroze ili keramičkim čaurama. Ukoliko je neophodno i/ili poželjno, rastvori polipeptida mogu biti prečišćeni prilagodljivim metodama hromatografije, npr., gelskom filtracijom, hromatografijom sa razmenom jona, hromatografijom na DEAE-celulozi ili (imuni-)afinitet hromatografija, npr., nakon preferencijalne biosinteze sintetičkog zglobnog regiona polipeptida ili pre ili posle koraka HIC hromatografije koji je ovde opisan.
[0223] Konstrukti koji kodiraju anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule, npr., antitela ili njegove fragmente, varijante ili derivate kao što je ovde opisano takođe mogu da budu izraženi iz ne-sisarskih ćelija kao što su bakterije ili kvasci ili ćelije biljaka. Bakterije koje brzo zauzimaju nukleinske kiseline obuhvataju članove enterobacteriaceae, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što su Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, i Haemophilus influenzae. Dalje će se prihvatiti da kada se vrši ekspresija u bakterijama, heterologni polipeptidi obično postaju deo sadržanih tela. Heterologni polipeptidi moraju biti izolovani, prečišćeni i zatim sastavljeni u funkcionalne molekule. Kada su poželjne tetravalentne forme, podjedinice će se samostalno sastaviti u tetravalentna antitela (WO02/096948A2).
[0224] U bakterijskim sistemima, razni ekspresioni vektori mogu se povoljno izabrati u zavisnosti od namenjene upotrebe za molekul antitela čija se vrši ekspresija. Na primer, kada se proizvodi velika količina takvog proteina, za stvaranje farmaceutskog sastava molekula antitela, vektori koji usmeravaju ekspresiju visokog nivoa proizvoda fuzionog proteina koji se lako prečišćavanju mogu biti poželjni. Takvi vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, E. coli ekspresioni vektor pUR278 (Ruther i dr., EMBO J.2:1791 (1983)), gde se sekvenca koja kodira antitelo može pojedinačno povezati u vektor u okviru sa lacZ kodirajućim regionom tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektore pIN vectors (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); i slično. pGEX vektori mogu se koristiti za vršenje ekspresije stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini mogu se rastvoriti i lako se prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matricu glutation-agaroza zrna što je praćeno ispiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori dizajnirani su da obuhvataju trombin ili faktor Xa mesta cepanja proteaze tako da se klonirani ciljani gen može osloboditi iz GST grupe.
[0225] Dodatno prokariotama, eukariotski mikrobi takođe se mogu koristiti. Saccharomyces cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac je najčešće koričen eukariotski mikroorganizam iako je dosta drugih sojeva obično dostupno, npr., Pichia pastoris.
1
[0226] Za ekspresiju u Saccharomyces, plazmid YRp7, na primer, (Stinchcomb i dr., Nature 282:39 (1979); Kingsman i dr., Gene 7:141 (1979); Tschemper i dr., Gene 10:157 (1980)) obično se koristi. Ovaj plazmid već sadrži TRP1 gen koji daje marker za odabir za mutantni soj kvasca koji nema sposobnost da raste u triptofanu, na primer ATCC br.44076 od PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). Prisustvo trpl lezije kao karakteristika genoma domaćina ćelija potom obezbeđuje efektivno okruženje za otkrivanje transformacije rastom u odsustvu triptofana.
[0227] U sistemu insekata, Autographa californica nuklearni polihedroza virus (AcNPV) obično se koristi kao vektor za vršenje ekspresije stranih gena. Virus raste u Spodoptera frugiperda ćelijama. Sekvenca koja kodira antitelo može se pojedinačno klonirati u nesuštinske regione (na primer, polihedrin gen) virusa i postaviti pod kontrolu AcNPV promotera (na primer polihedrin promoter).
[0228] Kada se izvrši rekombinantna ekspresija anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, može se prečistiti bilo kojom metodom prečišćavanja molekula imunoglobulina poznatom u struci, na primer, hromatografijom (npr., hromatografija sa razmenom jona, afinitetom, naročito afinitetom za specifični antigen nakon Proteina A, i ekskluziona), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Još jedna metoda za povećanje afiniteta antitela prema obelodanjivanje obelodanjena je u US 2002 0123057 A1.
VII. IDENTIFIKACIJA SEROTIP-INDIFERENTNIH VEZUJUĆIH MOLEKULA [0229] Obelodanjivanje obuhvata ciljani pristup indiferentnih celih-ćelija za identifikovanje serotip zavisnih terapeutskih vezujućih molekula, npr., antitela ili njihovih fragmenata sa boljim ili željenim terapeutskim aktivnostima. Ova metoda može se koristiti za identifikovanje vezujućih molekula koji mogu da antagonizuju, neutralizuju, prečiste ili blokiraju neželjenu aktivnost infektivnog agensa, npr., bakterijskog patogena. Kao što je poznato u struci, mnogi infektivni agensi vrše ekspresiju značajne varijacije u njihovim dominantnim površinskim antigenima, što im omogućava da izbegnu imuni nadzor.
Identifikacija metoda koje su ovde opisani može da identifikuje vezujuće molekule koji ciljaju antigene koji su deljeni između mnogo različitih Pseudomonas vrsta ili drugih Gramnegativnih patogena, time pružajući terapeutski agens koji može ciljati više patogena od više
2
vrsta. Na primer, metoda je korišćena za identifikovanje niza vezujućih molekula sa Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, i Pseudomonas alcaligenes) i/ili inhibiranje povezivanja takvih bakterijskih ćelija za epitelne ćelije.
[0230] Određena otelotvorenja obelodanjuju metode za identifikovanje serotip-indiferentnih vezujućih molekula koji obuhvataju: (a) pripremanje naivnih i/ili oporavljenih biblioteka antitela u fagima, (b) uklanjanje serotip-specifičnih antitela iz biblioteke iscrpljivanje panela, (c) skrining biblioteke za antitela koja se specifično vezuju za cele ćelije nezavisne od serotipa, i (d) skrining rezultata antitela za željena funkcionalna svojstva.
[0231] Određena otelotvorenja daju pristup fenotipskog skrininga celih ćelija kao što je ovde obelodanjeno sa bibliotekama faga antitela izvedenih ili iz naivnih ili P. aeruginosa inficiranih oporavljenih pacijenata. Upotrebom strategije panela koja je početno izabrana u poređenju sa serotip-specifičnom reaktivnošću, različiti klonovi koji vezuju P. aeruginosa cele ćelije su izolovani. Izabrani klonovi pretvoreni su u ljudska IgG1 antitela i potvrđeni su da reaguju sa P. aeruginosa kliničkim izolatima bez obzira na klasifikaciju serotipa ili mesto izolovanja tkiva (videti Primere). Funkcionalni skrin aktivnosti koji je ovde opisan ukazao je da su antitela efektivna pri prevenciji P. aeruginosa povezivanja za ćelije sisara i da posreduju opsonofagocitno (OPK) ubijanje na način koji je zavistan od koncentracije i nezavistan od serotipa.
[0232] U daljim otelotvorenjima, iznad opisani vezujući molekuli ili njegovi fragmenti, antitela ili njegovi fragmenti ili sastavi, vezuju se za dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više različitih P. aeruginosa serotipova, ili sa bar 80%, bar 85%, bar 90% ili bar 95% P. aeruginosa sojeva izolovanih iz inficiranih pacijenata. U daljim otelotvorenjima, P. aeruginosa sojevi izolovani su iz jednog ili više od pluća, pljuvačke, očiju, gnoja, izmeta, urina, sinusa, rane, kože, krvi, kostiju ili tečnosti iz kolena.
VIII. FARMACEUTSKI SASTAVI KOJI SADRŽE ANTI- PSEUDOMONAS PSL VEZUJUĆE MOLEKULE
[0233] Farmaceutski sastavi koji se koriste u predmetnom obelodanjivanju sadrže farmaceutski prihvatljive nosače dobro poznate stručnima u ovoj oblasti. Preparati za parenteralno davanje obuhvataju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije i emulzije. Određeni farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno mogu biti oralno dati u prihvatljivoj formi doziranja uključujući, npr., kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. Određeni farmaceutski sastavi takođe mogu biti dati nazalnim aerosolima ili inhalacijom. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni kao na primer, antimikrobi, antioksidansi, helatirajući agensi, i inertni gasovi i slično. Pogodne formulacije za upotrebu u terapeutskim metodama ovde opisani obelodanjene su u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980).
[0234] Količina anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata koji mogu biti kombinovani sa materijalima nosača za proizvodnju jedne forme doziranja zavisiće od domaćina koji se tretira i naročitog načina davanja. Režimi doziranja takođe mogu biti prilagođeni kako bi pružili optimalni željeni odgovor (npr., terapeutski ili profilaktički odgovor). Sastavi takođe mogu sadržati anti-Pseudomonas Psl vezujuće molekule, npr., antitela ili njegove fragmente, varijante ili derivate dispergovane u biokompatabilnom materijalu nosača koji funkcioniše kao pogodan sistem isporuke ili nošenja za jedinjenja.
IX. METODE TRETIRANJA KOJE KORISTE TERAPEUTSKE VEZUJUĆE MOLEKULE
[0235] Metode za pripremanje i davanje anti-Pseudomonas Psl vezujućih molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata ovde koje su obelodanjene za subjekat koji ima potrebu za njima dobro su poznate ili se lako određuju od strane stručnih u ovoj oblasti. Način davanja anti-Pseudomonas Psl vezujućeg molekula, npr., antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, može biti, na primer, oralni, parenteralni, inhalacijom ili topikalni. Termin parenteralno kao što se ovde koristi obuhvata, npr., intra venozno, intraarterijalno, intraperitonealno, intramuskularno ili subkutano davanje. Pogodna forma davanja bio bi rastvor za injekciju, posebno za intravenoznu ili intraarterijalnu injekciju ili infuziju. Međutim, u drugim metodama kompatibilnim sa ovim učenjima, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde pisano mogu se isporučiti direktno na mesto štetne ćelijske populacije, npr., infekcije time povećavajući izlaganje željenog tkiva terapeutskom agensu. Na primer, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul može se direktno davati u tkivo oka, povredu opekotine ili tkivo pluća.
[0236] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekul, npr., antitelo ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati kao što je ovde obelodanjeno mogu biti dati u farmaceutski efikasnoj količini za in
4
vivo tretiranje Pseudomonas infekcije. U vezi sa time, biće prihvaćeno a će obelodanjeni vezujući molekuli biti formulisani tako da pomažu davanje i promovišu stabilnost aktivnih agenasa. Za svrhe trenutnog davanja, farmaceutski efikasna količina smatraće se da označava količinu dovoljno da se postigne efikasno vezivanje za cilj i da se ostvari korist, npr., tretiranje, ublažavanje, olakšavanje, prečišćavanje ili prevencija Pseudomonas infekcije.
[0237] Neka otelotvorenja usmerena su na metodu za sprečavanje tretiranja Pseudomonas infekcije kod subjekta koji ima potrebu za time, koja obuhvata davanje subjektu efektivne količine vezujućeg molekula ili njegovo fragmenta, antitela ili njegovog fragmenta, sastava, polinukleotida, vektora ili ćelije domaćina ovde opisanih. U daljim otelotvorenjima, Pseudomonas infekcija je P. aeruginosa infekcija. U nekim otelotvorenjima, subjekat je čovek. U određenim otelotvorenjima, infekcija je očna infekcija, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, kožna infekcija, infekcija krvi, infekcija kostiju ili kombinacije dve ili više navedene infekcije. U daljim otelotvorenjima, subjekt ima akutnu upalu pluća, povredu od opekotine, infekciju rožnjače, cističnu fibrozu ili njihovu kombinaciju.
[0238] Određena otelotvorenja usmerena su na metodu za blokiranje ili sprečavanje povezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije koja obuhvata dovođenje smeše epitelnih ćelija i P. aeruginosa u kontakt sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, sastavom, polinukleotidom, vektorom ili ćelijom domaćina ovde opisanim.
[0239] Takođe je obelodanjena metoda za pojačavanje OPK P. aeruginosa koja obuhvata dovođenje smeše fagocitnih ćelija i P. aeruginosa u kontakt sa vezujućim molekulom ili njegovim fragmentom, antitelom ili njegovim fragmentom, sastavom, polinukleotidom, vektorom ili ćelijom domaćina ovde opisanim. U daljim otelotvorenjima, fagocitne ćelije su diferencirane HL-60 ćelije ili ljudske polimorfonuklearni leukociti (PMN).
[0240] U skladu sa okvirom ovog obelodanjivanja, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti dati čoveku ili drugoj životinji u skladu sa iznad navedenim metodama tretiranja u količini koja je dovoljna da proizvede terapeutski efekat. Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati ovde obelodanjeni mogu se dati takvom čoveku ili drugoj životinji u konvencionalnoj formi doziranja pripremljenoj kombinovanjem antitela prema obelodanjivanju sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom u skladu sa poznatim tehnikama.
[0241] Efikasne doze sastava prema predmetnom obelodanjivanju, za tretiranje Pseudomonas infekcije zavisiće u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način davanja, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, to da li je pacijent čovek ili životinja, druge medikamente koji se daju i i da li je tretiranje profilaktičko ili terapeutski. Obično, pacijent je čovek ili sisar koji nije čovek uključujući transgene sisare koji se mogu takođe tretirati. Doziranje za tretiranje može biti titrisano rutinskim metodama poznatim onima koji su stručni u ovoj oblasti kako bi se optimizovala bezbednosti i efikasnost.
[0242] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti dati u više prilika pri različitim učestalostima u zavisnosti od različitih faktora poznatih onima koji su stručni u ovoj oblasti. Alternativno, anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli, npr., antitela ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti dati kao formulacije sa neprekidnim oslobađanjem, u kom se slučaju manje frekventna davanja zahtevaju. Doze i učestalost će zavisiti od polu-raspada antitela u pacijentu.
[0243] Sastavi prema obelodanjivanju mogu biti dati bilo kojom pogodnom metodom, npr., parenteralno, intraventrikularno, oralno, inhalacionim sprejom, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara. Termin „parenteralno“ kao što se ovde koristi obuhvata subkutanu, intravenoznu, intramuskularnu, intra-artikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalno, intrahepatsku, intralezionu i intrakranijalnu injekciju ili tehnike infuzije.
X. IMUNOTESTOVI
[0244] Anti-Pseudomonas Psl vezujući molekuli ili njegovi fragmenti, varijante ili derivati mogu biti testirani za imunospecifično vezivanje bilo kojom metodom poznatom u struci. Imunotestovi koji se mogu koristiti obuhvataju ali nisu ograničeni na konkurentne i nekonkurentne sisteme testova koji koriste tehnike kao što su western blot-ovi, radioimunotestovi, ELISA (enzim povezani imunosorbentni test), „sendvič“ imunotestovi, imunoprecipitacioni testovi, preciptin reakcije, preciptin reakcije sa difuzijom gela, imunodifuzioni testovi, testovi aglutinacije, testovi fiksacije komplementa, imunoradiometrički testovi, imunotestovi fluorescencije, protein A imunotestovi, kako bi se samo nekoliko spomenulo. Takvi testovi su rutinski i dobro su poznati u struci (videti., npr., Ausubel i dr., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol.1 (1994), Primerni imunotestovi opisani su ukratko ispod (ali nisu namenjeni kao vid ograničenja).
[0245] Postoje različite metode dostupne za merenje afiniteta antitelo-antigen interakcije, ali relativno malo za određivanje stope konstanti. Većina metoda oslanja se ili na označavanje antitela ili antigena, što neizbežno komplikuje rutinska merenja i uvodi neizvesnosti u merene količine. Afinitet antitela može biti meren različitim metodama, uključujući. OCTET®, BIACORE®, ELISA, i FACS.
OCTET® sistem koristi biosenzore u formatu ploče sa 96 otvora za beleženje kinetske analize. Vezivanje proteina i događaji disocijacije mogu biti praćeni merenjem vezivanja jednog proteina u rastvor za drugi protein imobilizovani na FortéBio biosenzor. U slučaju merenja vezivanja anti-Psl antitela za Psl, Psl je imobilizovan na OCTET® vrhovima što je praćeno analizom vezivanja antitela, koja su u rastvoru. Povezivanje i prekidanje povezivanja antitela za imobilizovani Psl zatim se detektuje senzorom instrumenta. Podaci se zatim sakupljaju i eksportuju u GraphPad Prism za podešavanje krive afiniteta.
[0246] Površina plazmon rezonanca (SPR) koja se vrši na BIACORE® nudi broj prednosti u poređenju sa konvencionalni metodama merenja afiniteta antitelo-antigen interakcija: (i) ne postoji potreba za obeležavanje antitela ili antigena; (ii) antitela nemaju potrebu da budu prečišćena unapred, supernatant ćelijske kulture može se koristiti direktno; (iii) merenja u realnom vremenu koja dozvoljavaju brzo polu-kvantitativno upoređivanje različitih interakcija monoklonalnih antitela, omogućena su i dovoljna za mnogo svrha procenjivanja; (iv) biospecifična površina može biti regenerisana tako da se nizovi različitih monoklonalnih antitela mogu lako uporediti pod identičnim uslovima; (v) analitičke procedure potpuno su automatizovane i obimni nizovi merenja mogu biti izvršeno bez intervencije korisnika.
BIAapplications Handbook, verzija AB (ponovo štampana 1998), BIACORE® code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, verzija AB (ponovo štampana 1998), BIACORE® code No. BR-1001-84.
[0247] SPR zasnovana ispitivanja vezivanja zahtevaju da se jedan član para vezivanja imobilizuje na površini senzora. Vezujući parnjak koji se imobilizuje naziva se ligand.
Vezujući partner u rastvoru naziva se analit. U nekim slučajevima, ligand je povezan indirektno za površinu vezivanjem za drugi imobilizovani molekul, koji se naziva molekul za hvatanje. SPR odgovor reflektuje promenu u masenoj koncentraciji na površini za detekciju kako se analiti vezuju ili prekidaju vezu.
[0248] Na osnovu SPR, BIACORE® praćenja merenja u realnom vremenu interaguju čim se dogode. Tehnika je dobro pogodna za određivanje kinetskih parametara. Komparativno rangiranje afiniteta je veoma lako za vršenje, i oba, kinetske i konstantne afiniteta mogu biti izvedene iz podataka senzograma.
[0249] Kada se analit ubrizga u diskretnom puls preko površine liganda, dobijeni senzogram može biti podeljen na tri suštinske faze: (i) Povezivanje analita sa ligandom u toku ubrizgavanja uzorka; (ii) Stanje ravnoteže ili mirovanja u toku ubrizgavanja uzorka, gde je stopa vezivanja analiza uravnotežena prekidanjem veze od kompleksa; (iii) Prekidanje veze analita od površine u toku proticanja pufera.
[0250] Faze povezivanje i prekidanja veze daju informacije o kinetici analit-ligand interakciji (kai kd, stope formiranja kompleksa i prekidanja veze, kd/ka= KD). Faza ravnoteže daje informacije o afinitetu analit-ligand interakcije (KD).
[0251] BIAevaluation softver daje pruža sveobuhvatne mogućnosti za podešavanje krive koristeći numeričku integraciju i globalne algoritme za podešavanje. Uz odgovarajuću analizu podataka, stope odvajanja i konstante afiniteta interakciju mogu se dobiti jednostavnim istraživanjima BIACORE®. Raspon afiniteta koji se meri ovom tehnikom je vrlo širok i u rasponu je od mM do pM.
[0252] Specifičnost epitopa je važna karakteristika monoklonalnog antitela. Mapiranje epitopa sa BIACORE®, za razliku od konvencionalnih tehnika koje koristi radioimunotest, ELISA ili druge metode adsorpcije površine, ne zahteva obeležavanje ili prečišćena antitela, i omogućava ispitivanja specifičnosti na više lokacija koristeći niz od nekoliko monoklonskih antitela. Pored toga, veliki broj analiza se može automatski obrađivati.
[0253] Eksperimenti vezani za par testiraju sposobnost dva MAbs da se istovremeno vezuju za isti antigen. MAbs usmereni protiv različitih epitopa će se vezati nezavisno, dok će MAbs usmereni protiv identičnih ili blisko povezanih epitopa ometati vezivanje. Ti eksperimenti vezani za BIACORE® su jednostavni za izvođenje.
[0254] Na primer, može se koristiti molekul za hvatanje da bi se vezao prvi Mab, praćen dodatkom antigena i drugog MAb sekvencijalno. Senzogrami će otkriti: 1. Koliko se antigena vezuje za prvi Mab, 2. U kojoj meri drugi MAb se vezuje za površinski vezani antigen, 3. Ako se drugi MAb ne vezuje, bez obzira da li obrtanje reda test na paru menja rezultate.
[0255] Inhibiranje peptida je još jedna tehnika koja se koristi za mapiranje epitopa. Ova metoda može da dopuni studije vezivanja antitela na osnovu para i može povezati funkcionalne epitope sa strukturnim osobinama kada je primarna sekvenca antigena poznata. Peptidi ili fragmenti antigena testiraju se za inhibiranje vezivanja različitih MAbs za imobilizovani agens. Pretpostavlja se da su peptidi koji ometaju vezivanje datog MAb strukturalno povezani sa epitopom koji je definisan tim MAb.
[0256] Praksa obelodanjivanja će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike ćelijske biologije, ćelijske kulture, molekularne biologije, transgenske biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru ove struke. Takve tehnike u potpunosti su objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook i dr., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i dr., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis i dr. U.S. Pat. No:
4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984);
Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu i dr. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i Ausubel i dr., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
[0257] Standardna referentna dela koji iznose generalne principe imunologije obuhvataju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed.5, Elsevier Health Sciences Division (2005); i Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988).
[0258] Kako je sada obelodanjivanje opisano detaljno, isto će biti jasno shvaćeno sa referencama na sledeće primeri, koji su ovde obuhvaćeni samo sa svrhom prikazivanja i nisu namenjeni da ograniče obelodanjivanje.
PRIMERI
Primer 1: Konstruisanje i skrining biblioteka prikaza faga ljudskog antitela
[0259] Ovaj primer opisuje pristup paniranja celih ćelija indiferentan od cilja sa bibliotekama faga ljudskih antitela izvedenih iz oba, naivnih i P. aeruginosa inficiranih oporavljenih pacijenata za identifikovanje novih zaštitnih agenasa protiv Pseudomonas infekcije (Slika 1A). Testovi obuhvaćeni u in vitro funkcionalnim skrinovima obuhvatili su testove ubijanja opsonofagocitoze (OPK) i testove povezivanja ćelija upotrebom linije epitelnih ćelija A549. Vodeći kandidati, na osnovu bolje in vitro aktivnosti, testirani su u modelima P. aeruginosa akutne upale pluća, keratoze i infekcije opekotine.
[0260] Slika 1B prikazuje pravljenje biblioteke prikaza faga ljudskih antitela. Cela krv je objedinjena od 6 pacijenata od kojih je uzeta 7-10 dana nakon dijagnoze što je praćeno sa RNK ekstrakcijom i pravljenjem biblioteke faga kao što je prethodno opisano (Vaughan, T.J., i dr., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996); Wrammert, J., i dr., Nature 453, 667-671 (2008)). Slika 1C prikazuje da je krajnja klonirana scFv biblioteka sadržala 5.4 x 10<8>transformantata i sekvenciranje je otkrilo da je 79% scFV gena bilo u punoj dužini u u okviru. VH CDR3 petlje, često značajne za određivanje specifičnosti epitopa, bile su 84% različite na nivou aminokiselina pre odabira biblioteke.
[0261] Dodatno biblioteci pacijenta, biblioteka prikaza naivnih ljudskih scFv koja je sadržala je 1x10<11>vezujućih članova (Lloyd, C., i dr., Protein Eng Des Sel 22, 159-168 (2009)) korišćena je za izolaciju antitela (Vaughan, T.J., i dr., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)). P.aeruginosa (1x10<9>) ubijena toplotom imobilizovana je u IMMUNO™ Cevima (Nunc; MAXISORP™) što je praćeno odabirom prikaza faga kao što je opisano (Vaughan, T.J., i dr., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) sa izuzetkom trietanolamina (100nM) koji su korišćeni kao pufer za eluiranje. Za odabir P. aeruginosa u suspenziji, ćelije ubijene toplotom, blokirane su što je praćeno dodavanjem blokiranih faga ćeliji. Nakon ispiranja, eluirani fagi korišćeni su za inficiranje E. coli ćelija kao što je opisano (Vaughan, 1996). Dobijanje faga iz E. coli i vezivanje za P. aeruginosa ubijene toplotom sa ELISA izvršeno je kao što je opisano (Vaughan, 1996).
[0262] Nakon razvijanja i validacije metodologije odabira afiniteta celih ćelija, oba, nova biblioteka oporavljenih pacijenata i prethodno stvorena naivna biblioteka (Vaughan, T.J., i dr., Nat Biotechnol 14, 309-314 (1996)) su prošle kroz odabir afiniteta na suspenzijama P. aeruginosa soja 3064 koji sadrži O-antigen kao i na izogenom wapR mutant soju koji nije imao površinsku ekspresiju O-antigena. Slika ID prikazuje da su izlazni titri iz sukcesivnih odabira biblioteka pacijenata pronađeni da se povećavaju pri povećanoj stopi za biblioteku pacijenta više nego za naivnu biblioteku (1x10<7>u odnosu na 3x10<5>u rundi 3, respektivno). Dodatno, dupliranje VH CDR3 sekvenci petlje u bibliotekama (mera klonalnog obogaćivanja u toku odabira) takođe je pronađeno da je veće u biblioteci pacijenta, dostižući 88-92%, u poređenju sa 15-25% kod naivne biblioteke u rundi 3 (Slika 1D). Pojedinačni svFv fagi iz odabira afiniteta su sledeći proveravani sa ELISA za reaktivnost na P. aeruginosa heterologne serotip sojeve (Slika 1E). ELISA ploče (Nunc; MAXISORP™) obložene su sa P. aeruginosa sojevima iz preko noći gajenih kultura kao što je opisano (DiGiandomenico, A., i dr., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)). Isprana antitela dodavana blokiranim pločama 1 sat, isprana i tretirana sa HRP-konjugovanim anti-ljudskim sekundarnim antitelima 1 sat što je praćeno razvijanjem i analizom kao što je (Ulbrandt, N.D., i dr., J Virol 80, 7799-7806 (2006)). Dominantne vrste faga dobijene iz odabira cele ćelije sa obe biblioteke dalo je serotip specifičnu reaktivnost (podaci nisu prikazani). Klonovi koji su pokazali serotip nezavisno vezivanje u prisustvu nespecifičnog vezivanja za E. coli ili goveđi serum albumin izabrani su za dalju procenu.
1
[0263] Za IgG ekspresiju VH i VL lanci izabranih antitela klonirani su u ljudske IgG1 ekspresione vektore, čija se zajednička ekspresija izvršila u HEK293 ćelijama, i koji su prečišćeni sa hromatografijom protein A afiniteta kao što je opisano (Persic, L., i dr., Gene 187, 9-18 (1997)). Ljudska IgG1 antitela napravljena sa varijabilnim regionima iz ovih izabranih serotip zavisnih faga potvrđena su sa P. aeruginosa specifičnošću i prioritetna su za kasniju analizu vezivanja celih ćelija za dominantne klinički relevantne serotipove sa FACS analizom (Slika 1F), kako je ova metoda strožija od ELISA. Za protočnu citometriju zasnovanu na testovima vezivanja mid-log faza P. aeruginosa soje koncentrovana je u PBS do OD650od 2,0. Nakon inkubiranja antitela (10 µg/mL) i bakterije (∼1 x 10<7>ćelija) 1 sat pri 4°C sa drmanjem, isprane ćelije inkubirane su sa ALEXA FLUOR 647® kozjim antiljudskim IgG antitelom (Invitrogen, Carlsbad, CA) 0.5 sati pri 4°C. Isprane ćelije obeležene su sa BACLIGHT™ zelenom bakterijskom oznakom kao što je preporučeno (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uzorci su prošli kroz LSR II protočni citometar (BD Biosciences) i analizirani upotrebom BD FacsDiva (v.6.1.3) i FlowJo (v.9.2; TreeStar). Antitela koja pokazuju vezivanje sa FACS dalje su bila prioritetna za testiranje funkcionalne aktivnosti u testu opsonofagocitnog ubijanja (OPK).
Primer 2: Procenjivanje mAb promovisanja OPK P. aeruginosa
[0264] Ovaj primer opisuje procenjivanje prioritetnih ljudskih IgG1 antitela da promovišu OPK P. aeruginosa. Slika 2A prikazuje da sa izuzetkom WapR-007 i negativne kontrole antitela R347, sva su antitela posredovala ubijanje zavisno od koncentracije luminiscentnog P. aeruginosa serogrupe 05 soja (PAO1.lux) WapR-004 i Cam-003 su pokazali bolju OPK aktivnost. OPK testovi izvršeni su kao što je opisano u (DiGiandomenico, A., i dr., Infect Immun 72, 7012-7021 (2004)), sa modifikacijama. Ukratko, testovi su izvršeni u pločama sa 96 otvora upotrebom 0,025 ml svake OPK komponente; P. aeruginosa sojevi; isprani serum mladunčeta zeca; diferencirane HL-60 ćelije; i monoklonalno antitelo. U nekim OPK testovima, luminiscentni P. aeruginosa sojevi, koji su konstruisani kao što je opisano (Choi, K.H., i dr., Nat Methods 2, 443-448 (2005))., su korišćeni. Luminiscentni OPK testovi izvršeni su kao što je opisano iznad ali sa određivanjem relativnih jedinica luciferaze (RLU) upotrebom Perkin Elmer ENVISION Višeznačnog čitača ploča (Perkin Elmer).
[0265] Sposobnost WapR-004 i Cam-003 antitela da posreduju OPK aktivnost jedan naspram drugog klinički relevantnog O-antigen serotip soja, 9882-80.lux, je procenjen. Slika
2
2B prikazuje da se pojačana WapR-004 i Cam-003 OPK aktivnost proširuje na soj 9882-80 (O11).
[0266] Sposobnost Cam-003 da posreduje OPK aktivnost protiv reprezentativnih nemukoidnih sojeva iz klinički relevantnih O-antigen serotipova i protiv mukoidnih P. aeruginosa sojeva koji su izvedeni iz pacijenata sa cističnom fibrozom su procenjeni. Cam-003 posredovano potentno OPK svih ne-mukoidnih kliničkih izolata je testirano (Slika 2C). Dodatno, Cam-003 posredovano potentno ubijanje svih mukoidnih P. aeruginosa izolata koje je testirano (Slika 2D).
[0267] Dodatno, ovaj primer opisuje procenjivanje WapR-004 (W4) mutanta u scFv-Fc formatu za promovisanje OPK P. aeruginosa. Jedan mutant, Wap-004RAD (W4-RAD), specifično je stvoren preko mutageneze usmerene na mestu kako bi uklonio RGD motiv u VH. Drugi W4 mutanti pripremljeni su kao što sledi. Grupisani PCR izvršen je kao što je opisano (Roux, K.H., PCR Methods Appl 4, S185-194 (1995)), kako bi se pojačale W4 varijante (izvedene iz somatskih hipermutacija) iz scFv biblioteke izvedene iz oporavljenih P. aeruginosa inficiranih pacijenata, za analizu. Ovo je biblioteka iz koje je izveden WapR-004. W4 varijantni fragmenti pod-klonirani su i sekvencirani upotrebom standardnih procedura poznatim u struci. W4 mutanti lakog lanca (LC) su rekombinovani sa WapR-004 teškog lanca (HC) kako bi se proizveli W4 mutanti u scFv-Fc formatu. Dodatno WapR-004 RAD teškog lanca (HC) mutanti su rekombinovani sa roditeljskim LC od M7 i M8 u scFv-Fc formatu. Konstrukti su pripremljeni upotrebom standardnih procedura poznatih u struci. Slike 11 (A-M) pokazuju osim izuzetka za negativnu kontrolu antitelo R347, da su svi WapR-004 (W4) mutanti posredovali ubijanje zavisno od koncentracije luminiscentnog P. aeruginosa serogrupe 05 soja (PAO1.lux
Primer 3: Serotip zavisna anti-P. aeruginosa antitela koja ciljaju Psl egzopolisaharid [0268] Ovaj primer opisuje identifikaciju ciljanih anti-P. aeruginosa antitela izvedenih iz fenotipskog skrininga. Ciljana analiza izvršena je za testiranje to ga da li su serotip zavisna antitela ciljana protein ili antigen ugljenih hidrata. Nije primećen nikakav gubitak vezivanja u ELISA za PAO1 ekstrakte celih ćelija iscrpno digestiranih sa proteinazom K, što predlaže da je reaktivnost ciljala površinski dostupne ostatke ugljenih hidrata (podaci nisu prikazani). Izogeni mutanti stvoreni su u genima odgovornim za O-antigen, alginat i biosintezu LPS jezgra; wbpL (O-antigen-deficitan); wbpL/algD (O-antigen i alginat deficitan); rmlC (Oantigen-deficitan i sa skraćenim spoljašnjim jezgrom); i galU (O-antigen-deficitan i sa skraćenim unutrašnjim jezgrom). P. aeruginosa mutanti stvoreni su na osnovu strategije zamene alela opisane od strane Schweizer (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)). Vektori su mobilisani iz E. coli soja S17.1 u P. aeruginosa soj PAO1; rekombinanti su izolovani kao što je opisano (Hoang, T.T., i dr., Gene 212, 77-86 (1998)). Uništavanje gena potvrđeno je sa PCR. P. aeruginosa mutanti su dopunjeni sa pUCP30T-zasnovanim konstruktima koji su primili gene divljeg tipa. Reaktivnost antitela određena je indirektnom ELISA na pločama obloženim sa iznad ukazanim P. aeruginosa sojevima: Slike 3A i 3J pokazuju da je Cam-003 vezivanje za wbpL ili wbpL/algD dvostruki mutant bilo nepromenjeno, međutim vezivanje za rmlC i galU mutante je ukinuto. Dok su ovi rezultati bili konzistentni sa vezivanjem za LPS jezgro, reaktivnost na LPS prečišćenim sa PAO1 nije primećena. Geni rmlC i galU su nedavno pokazani da su potrebni za biosintezu Psl egzopolisaharida, ponavljajućeg pentasaharid polimera koji sadrži D-manozu, L-ramnozu, i D-glukozu. Cam-003 vezivanje za izogeni pslA knockout PAO1ΔpslA, je testirano, kako je pslA potreban za Psl biosintezu (Byrd, M.S., i dr., Mol Microbiol 73, 622-638 (2009)). Vezivanje Cam-003 za PAO1ΔpslA je ukinuto kada je testirano sa ELISA (Slika 3B) i FACS (Slika 3C), dok je LPS molekul u ovom mutantu nepromenjen (Slika 3D). Vezivanje Cam-003 dobijeno je iz PAO1ΔwbpL/algD/pslA trostrukog mutanta dopunjenog sa pslA (Slika 3E) kao i sposobnost Cam-003 da posreduje opsonsko ubijanje dopunjenom PAO1ΔpslA u poređenju sa mutantom (Slika 3F i 3G).
Vezivanje Cam-003 antitela za Pel egzopolisaharid mutant je takođe nepromenjeno što dalje potvrđuje Psl kao metu za naše antitelo (Slika 3E). Testovi vezivanja potvrdili su da se preostalo antitelo takođe vezuje za Psl (Slike 3H i 3I).
[0269] Za potvrđivanje toga da se sva antitela vezuju za isti region, test vezivanja hvatanja Psl izvršen je upotrebom FORTEBIO® OCTET® 384 instrumenta kao što je opisano iznad. Antigen je bio proteinazom K-tretiran obogaćeni ugljeni hidrat prečišćen od PAO1ΔwbpL/algD/pelA (O-antigen-, alginat- i Pel egzopolisaharid-deficitan). Pojedinačna antitela su se vezala za aminopropilsilan biosenzore što je praćeno blokiranjem i dodavanjem antigena obogaćenog ugljenog hidrata. Nakon ispiranja radi uklanjanja nevezanog antigena, vezivanje neobeleženih mAb za zahvaćeni antigen je ukinuto. Sva vezana antitela (Cam-003, Cam-004, Cam-005, WapR-001, WapR-002, WapR-003, WapR-007 i WapR-016), sa izuzetkom kontrolnog mAb R347, su bila u stanju da uhvate antigen koji je reagovao sa svakim od Cam-003, WapR-001, WapR-002, WapR-003, i WapR-016 (Slika 3K). Minimalna
4
reaktivnost za zahvaćeni Psl posmatrana je sa Cam-004, Cam-005 i WapR-007 iako su sva tri ova antitela zahvatila dovoljno Psl da potentno reaguju sa Cam-003, WapR-001, WapR-002, WapR-003, i WapR-016 (Slika 3K). Ovi rezultati predlažu da su sva mAb izvedena iz fenotipskog skrininga koja se vezuju za P. aeruginosa nezavisno od serotipa ciljala epitope povezane sa Psl egzopolisaharidom.
Primer 4: Anti-Psl mAb blok povezivanje P. aeruginosa za kultivisane epitelne ćelije [0270] Ovaj primer pokazuje da su anti-Psl antitela blokirala P. aeruginosa povezivanje sa epitelnim ćelijama. Anti-Psl antitela dodata su u kofluentni višesloj A549 ćelija (alveolarna bazalna epitelna ćelijska linija ljudskog adenokarcinoma) uzgajan u neprozirnoj ploči sa 96 otvora (Nunc Nunclon Delta). Log-faze luminiscentni P. aeruginosa PAO1 soj (PAO1.lux) dodat je pri MOI 10. Nakon inkubiranja PAO1.lux sa A549 ćelijama pri 37°C 1 sat, A549 ćelije su isprane što je praćeno dodavanjem LB+0.5% glukoze. Bakterije su kvantifikovane što kratkom inkubacijom na 37°C kao što je izvršeno u OPK testu opisanom u Primeru 2. Merenja iz otvora bez A549 ćelija korišćena su za ispravljanje ne-specifičnog vezivanja- testa opisanog u Primeru 2. Slika 4 prikazuje da su, osim izuzetka Cam-005 i WapR-007, sva antitela smanjila povezivanje PAO1.lux za A549 ćelije na način zavistan od doze. mAb koji se najbolje pokazao u OPK testovima, WapR-004 i Cam-003 (videti Slike 2A-B, i Primer 2), takođe su najaktivniji pri inhibiranju P. aeruginosa ćelijskog povezivanja za 549 epitelne ćelije pluća, dajući do ∼80% smanjenja u poređenju sa negativnom kontrolom. WapR-016 je treće najaktivnije antitelo, koje pokazuje sličnu inhibitornu aktivnost kao WapR-004 i Cam-003 ali pri 10-puta većoj koncentraciji antitela.
Primer 5: In vivo obrađeni P. aeruginosa sojevi održavaju/povećavaju ekspresiju Psl [0271] Za testiranje da li se Psl ekspresija in vivo održava, miševi su intraperitonealno ubrizgani sa P. aeruginosa izolatima što je praćeno sakupljanjem bakterije peritonealnim ispiranjem četiri sata nakon infekcije. Prisustvo Psl analizirano je sa kontrolnim antitelom i Cam-003 protočnom citometrijom kako su uslovi za vezivanje antitela stroži i omogućavaju kvantifikaciju ćelija koje su pozitivne ili negativne na ekspresiju Psl. Za ex vivo vezivanje, bakterijska inokula (0,1 ml) pripremljena je preko noći u TSA ploči i isporučena je intraperitonealno u BALB/c miševe. Pri 4. satu, nakon izazova, bakterije su sakupljene, RBC lizirane, izložene ultrazvuku i resuspendovane u PBS dopunjene sa 0.1% Tween-20 i 1% BSA. Uzorci su obeleženi i analizirani kao što je prethodno opisano u Primeru 1. Slika 5 pokazuje da su bakterije sakupljene peritonealnim ispiranjem sa tri soja P. aeruginosa divljeg tipa pokazale jako Cam-003 obeležje, što je uporedivo sa log fazom kultivisanim bakterijama (uporediti Slike 5A i 5C). In vivo pređene bakterije divljeg tipa pokazale su pojačano obeležje kada su se uporedile sa inokulom (uporediti Slike 5B i 5C). Unutar inokule, Psl nije detektovan za soj 6077 i bio je minimalno detektovan za sojeve PAO1 (O5) i 6206 (O11-citotoksični). Vezivanje Cam-003 za bakterije povećao je vezu sa inokulom što ukazuje da je Psl ekspresija održavana ili smanjena in vivo. Sojevi divljeg tipa 6077, PAO1, i 6206 vrše ekspresiju Psl nakon in vivo prolaza, međutim soj PAO1 koji prima uništavanje pslA (PAO1ΔpslA) nije u stanju da reaguje sa Cam-003. Ovi rezultati dalje naglašavaju Psl kao cilj monoklonalnih antitela.
[0272] Nivo Psl ekspresije/pristupačnosti na površini P. aeruginosa sojeva PAO1 i 6206 u modelu akutne upale pluća je procenjen. Bakterije pripremljene inkubacijom preko noći, u konfluentnim pločama, kao što je opisano iznad, intranazalno su date BALB/c miševima. 4 i 24 sata nakon infekcije, bakterije su dobijene iz pluća bronhoalveolarnim ispiranjem. Uzorci su obeleženi i analizirani kao što je prethodno opisano u Primeru 1. Jako Cam-003 obeležje primećeno je za PAO1 4 sata nakon infekcije, ali je bilo minimalno za 6206 u ovoj vremenskoj tački (Slika 5D). Međutim, za oba soja PAO1 i 6206, jako Cam-003 obeležje primećeno je 24 sata nakon infekcije (Slika 5E).
[0273] Vezivanje P. aeruginosa specifičnih antitela (Cam-003, Cam-004 i Cam-005) za reprezentativne sojeve iz jedinstvenih P. aeruginosa serotipova (PAO1(O5) (Slika 5F), 2135 (O1) (Slika 5G), 2531 (O1) (Slika 5H), 2410 (06) (Slika 5I), 2764 (O11) (Slika 5J), 2757 (O11) (Slika 5K), 33356 (09) (Slika 5L), 33348 (O1) (Slika 5M), 3039 (NT) (Slika 5N), 3061 (NT) (Slika 5O), 3064 (NT) (Slika 5P), 19660 (NT) (Slika 5Q), 9882-80 (O11) (Slika 5R), 6073 (O11) (Slika 5S), 6077 (O11) (Slika 5T) i 6206 (O11) (Slika 5U), procenjeno je protočnom citometrijom kao što je generalno opisano iznad.
Primer 6: Stope preživljavanja za životinje tretirane sa anti-Psl monoklonalnim antitelima Cam-003 i WapR-004 u modelu P. aeruginosa akutne upale pluća
[0274] Antitela ili PBS data su 24 sata pre infekcije u svakom modelu. P. aeruginosa akutna upala pluća, keratitis, i modeli infekcije termalne povrede izvršeni su kao što je opisano (DiGiandomenico, A., i dr., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 4624-4629 (2007)), sa modifikacijama. U modelu akutne upale pluća, BALB/c miševi (The Jackson Laboratory) inficirani su sa P. aeruginosa sojevima suspendovanim u 0.05 ml inokulima. U modelu termalne povrede, CF-1 miševi (Charles River) dobili su opekotine na 10% površine tela sa metalnim žigom zagrejanim do 92°C 10 sekundi. Životinje su subkutano inficirane sa P. aeruginosa sojem 6077 pri ukazanoj dozi. Za eksperimente opterećenja organa, akutna upala pluća uzrokovana je u miševima što je praćeno sakupljanjem pluća, slezine i bubrega 24 sata nakon infekcije za određivanje CFU.
[0275] Monoklonalna antitela Cam-003 i WapR-004 procenjena su u modelu smrtne akutne upale pluća protiv P. aeruginosa sojeva koji predstavljanju najčešće serotipove povezane sa kliničkom bolešću. Slike 6A i 6C prikazuju značajno preživljavanje zavisno od koncentracije kod miševa tretiranih sa Cam-003 inficiranih sa sojevima PAO1 i 6294 kada se porede sa kontrolom. Slike 6B i 6D prikazuju potpunu zaštitu od izazova sa 33356 i citotoksični soj 6077 je dat sa Cam-003 pri 45 i 15 mg/kg dok je 80 i 90% preživljavanje primećeno pri 5mg/kg za 33356 i 6077, respektivno.
Slike 6E i 6F prikazuju značajno preživljavanje zavisno od koncentracije kod WapR-004-tretiranih miševa u modelu akutne upale pluća sa sojem 6077 (O11) (8 x 10<5>CFU) (Slika 6E), ili 6077 (011) (6 x 10<5>CFU) (Slika 6F). Slika 6G prikazuje da su pri 120 Cam-003 dali 100 % preživljavanje nakon infekcije sa sojem PAO1. Povećano preživljavanje nije primećeno protiv Psl mutant sojeva, PAO1ΔpslA, korišćen je kao negativna kontrola u ispitivanju PAO1 akutne upale pluća (Slika 6G) što potvrđuje nedostatak Cam-003 aktivnosti protiv sojeva deficitnih ekspresijom Psl.
[0276] Cam-003 i WapR-004 su sledeći ispitivani za njihovu sposobnost da smanje P. aeruginosa opterećenje organa u plućima i širenje na distalne organe, i kasnije životinje su tretirane sa različitim koncentracijama WapR-004, Cam-003, ili kontrolnim antitelima pri različitim koncentracijama. Cam-003 je bilo efektivno pri smanjenju P. aeruginosa opterećenja jetre u poređenju sa sva četiri testirana soja. Cam-003 je bilo najefektivnije protiv visoko patogenog citotoksičnog soja, 6077, gde je niska doza bila efektivna kao visoka doza (Slike 7D). Cam-003 takođe je imao zabeležen efekat pri smanjenju diseminacije za slezinu i bubrege kod miševa inficiranih sa PAO1 (Slika 7A), 6294 (Slika 7C), i 6077 (Slika 7D), dok diseminacija za ove organe nije primećena kod 33356 inficiranih miševa (Slika 7B). Slike 7E i 7F prikazuju da slično, WapR-004 smanjuje opterećenje organa nakon uzrokovanja akutne upale pluća sa 6294 (06) i 6206 (O11). Naročito, WapR-004 je bilo efektivno pri smanjenu P. aeruginosa diseminacije za slezinu i bubrege kod inficiranih miševa.
Primer 7: Stope preživljavanja za životinje tretirane sa anti-Psl monoklonalnim antitelima Cam-003 i WapR-004 u modelu P. aeruginosa infekcije rožnjače
[0277] Cam-003 i WapR-004 efikasnost procenjena je sledeća za P. aeruginosa model infekcije rožnjače koja naglašava sposobnost patogena da se vežu i kolonizuju oštećeno tkivo. Slike 8 A-D i 8 F-G prikazuju da miševi koji su primili Cam-003 i WapR-004 imali značajno manju patologiju i smanjeni broj bakterija u ukupnim homogenatima oka nego što je primećeno kod životinja tretiranih sa negativnom kontrolom. Slika 8E prikazuje da je Cam-003 bilo takođe efikasno kada je testirano za model termalne povrede, dajući značajnu zaštitu pri 15 i 5mg/kg kada je poređeno sa kontrolom tretiranom sa antitelom.
Primer 8: A Cam-003 Fc mutant antitelo, Cam-003-TM, je smanjio OPK i in vivo efikasnost ali održava aktivnost anti-ćelijskog povezivanja
[0278] Kako je dat potencijal za dvojne mehanizme akcije, Cam-003 Fc mutant, Cam-003-TM, stvoren je koji prima mutacije u Fc domenu što smanjuje njegovu interakciju sa Fcγ receptorima (Oganesyan, V., i dr., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704 (2008))., kako bi se identifikovalo ukoliko je zaštita bila više povezana sa anti-ćelijskim povezivanjem ili OPK aktivnošću. P. aeruginosa mutanti su stvoreni na osnovu strategije zamene alela opisane od strane (Schweizer, H.P., Mol Microbiol 6, 1195-1204 (1992); Schweizer, H.D., Biotechniques 15, 831-834 (1993)). Vektori su mobilisani iz E. coli soja
S17.1 u P. aeruginosa soj PAO1; rekombinanti su izolovani kao što je opisano (Hoang, T.T., i dr., Gene 212, 77-86 (1998)). Uništavanje gena potvrđeno je sa PCR. P. aeruginosa mutanti su dopunjeni sa pUCP30T-zasnovanim konstruktima koji primaju gene divljeg tipa. Slike 9A prikazuju da je Cam-003-TM pokazao 4-puta pad u OPK aktivnosti u poređenju sa Cam-003 (EC500.24 i 0.06, respektivno) ali je bio isto efikasan u testu povezivanja ćelije (Slika 9B). Slika 9C prikazuje da je Cam-003-TM takođe maje efikasno protiv upale pluća što predlaže da je optimalna OPK aktivnost neophodna za optimalnu zaštitu. OPK i test povezivanja ćelija izvršeni su kao što je prethodno pisano u Primerima 2 i 4, respektivno. Kada je testirano u modelu upale pluća kod miševa, Cam-003 TM imalo je sličnu potentnost kao Cam-003 pri nisko infektivnom inokulumu od 6077 (2,4x10<5>CFU) (Slika 9D). Međutim, dalja titracija doze antitela praćena izazovom sa većim infektivnim inokulumom (1,07x10<6>) pokazala je da je Cam-003 aktivnost bolja od Cam-003-TM, što predlaže da OPK aktivnost značajno doprinosi optimalnoj zaštiti in vivo (Slika 9E).
Primer 9: Mapiranje epitopa i relativni afinitet za anti-Psl antitela
[0279] Mapiranje epitopa izvršeno je konkurentnom ELISA i potvrđeno je upotrebom OCTET® protočnog sistema sa Psl izvedenim iz supernatanta kulture uzgajane preko noće P. aeruginosa soja PAO1. Za konkurentnu ELISA, antitela su biotilinovane upotrebom EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin i Biotinilacionim kompletom (Thermo Scientific). Ploče obložene antigenom tretirane su sa EC50biotinilovanim antitelima zajedno inkubirnim sa neobeleženim antitelima. Nakon inkubacije sa HRP-konjugovanim streptavidinom (Thermo Scientific), ploče su razvijene kao što je opisano iznad. Konkurentni eksperimenti između anti-Psl mAb odredili su da li su antitela ciljala bar tri posebna epitopa, koja se nazivaju kao klase 1, 2 i 3 antitela (Slika 10A). Klase 1 i 2 antitela nisu se ogledala za vezivanje, međutim klase 3 antitelo, WapR-016, delimično inhibira vezivanje klase 1 i 2 antitela.
[0280] Afinitet antitela određen je pomoću OCTET® testa vezivanja koristeći Psl izveden iz supernatanta PAO1 kulture gajene preko noći. Antitelo KDje određeno osrednjavanjem kinetike vezivanja sedam koncentracija za svako antitelo. Merenja afiniteta izvršena su pomoću FORTEBIO® OCTET® 384 instrumenta pomoću 384-kosih ploča sa otvorima. Supernatant iz PAO1 kulture gajene preko noći ± pslA gen korišćeni su kao kao izvor Psl. Uzorci su stavljeni na senzore OCTET® AminoPropylSilane (hidrirani u PBS) i blokirani, što je praćeno merenjem vezivanja anti-Psl mAb pri nekoliko koncentracija i prekida vezivanja u PBS 1% BSA. Sve procedure su izvedene kako je (Wang, X., i dr., J Immunol Methods 362, 151-160). Kriva podataka o povezivanju i prekidanju veze sirovih ΔnM je podešena sa GraphPad Prism. Slika 10A prikazuje relativni afinitet vezivanja anti-Psl antitela okarakterisan iznad. Antitela klase 2 imala su najviši afinitet od svih anti-Psl antitela. Slika 10A takođe prikazuje rezime povezivanja ćelija i podatke OPK eksperimenata. Slika 10B prikazuje relativne afinitete vezivanja i OPK EC50 vrednosti mutanta Wap-004RAD (W4RAD), kao i drugih W4 mutanta pripremljenih kao što je opisano u Primeru 1.
Primer 10: Vezivanje Polimiksin B (PMB)-mAb konjugata za P. aeruginosa PAO1 ćelije procenjeno je sa FACS
[0281] U ovom primeru, PMB konjugovan za opsonsko monoklonalno antitelo (mAb) koje je u stanju da posreduje bakterijski klirens procenjeno je za određivanje toga da li bi konjugat poboljšao i/ili proširio funkcionalnost mAb, takođe uz smanjenje toksičnost PMB, CAM-003, mAb koje cilja P. aeruginosa Psl površinski egzopolisaharid, koji posreduje aktivnost potentnog opsonofagocitnog ubijanja (OPK) i zaštite in vivo izabrano je za procenu konjugata.
[0282] Ovaj primer procenjuje vezivanje različitih Polimiksin B (PMB)-mAb konjugata za P. aeruginosa PAO1 ćelije. Upotrebom metode konjugacije sa dva koraka usmerene na mestu (Slika 12), Polimiksin B (PMB) konjugovan je za Cam-003 i A7 (hIgG1 kontrola) mAb varijante ili sa jednim ili dvostrukim cisteinom projektovanim na Fc region. Cam-003 i A7 mAb Fc varijante pripremljene su upotrebom standardnih protokola kao što je opisano u (Dimasi, N. i dr., J Mol Biol.393(3):672-92 (2009)). Heterobifunkcionalni SM(PEG)12veznik (Pierce) prvobitno je konjugovan za jedan od primarnih amina u PMB preko NHS grupe u vezniku pod uslovima određenim u korist konjugacije pojedinačnog veznika.
Polimiksin B sulfat (Sigma) rastvoren je u PBS pH 7,2 pri 2 mg/ml i reagovan sa SM(PEG)12veznikom pri odnosu 4:1 PMB:veznik. Reakcija je izvršena pri sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta nakon čega je zaustavljena sa 50 mM glicina. Efikasnost konjugacije SM(PEG)12veznika za to PMB bilo je približno 25%. Sirovi preparati PMB-PEG12su zatim reagovani sa deprotektovanim Fc cistein mAb varijantama i konjugovani preko maleamida u PEG12vezniku (videti, npr., WO 2011/005481 i WO 2009/092011). PMB-mAb konjugati prečišćeni su ekstenzivnom dijalizom. Konjugati su početno dijalizirani u 3,3X PBS pH 7,2 sa 0.7% CHAPS sa četiri razmene pufera, što je praćeno dijalizom u IX PBS pH 7,2 sa dodatnim razmenama pufera. Efikasnost konjugacije i nivoi slobodnog PMB-veznika u uzorcima određeni su sa UPLC i masenom spektometrijom.
[0283] CAM-003 je specifično za P. aeruginosa Psl površinski egzopolisaharid i posreduje potentnu OPK aktivnost i zaštitu kod više in vivo modela. Slika 13A prikazuje mutirane ostatke Cam-003 i A7 Fc regiona. SM (A339C), DM1 (T289C/A339C), DM2 (A339C/S442C). Efikasnost konjugacije PMB-mAb varijanti određena je analizom masene spektometrije teških lanaca u prečišćenim konjugatima. (videti, npr., WO 2011/005481 i WO 2009/092011). Opšta efikasnost konjugacije bila je 75-85%. Prečišćenost konstrukata bila je >95% relativno u odnosu na konjugovane u poređenju sa slobodnim PMB-veznikom. Sika 13B prikazuje srednji broj PMB u OMB-Cam-003 i PMB-A7 konjugatima (dvostruki mutant 2 (DM2) > dvostruki mutant 1 (DM1) > jednostruki mutant (SM)). A7 konjugati pokazali su veću efikasnost konjugacije u poređenju sa Cam-003 konjugatima. Kontaminacija sa slobodnim PMB u prečišćenim preparatima određena je kao zanemarljiva. Vezivanje PMB-Cam-003 i PMB-A7 konjugata za P. aeruginosa PAO1 ćelije procenjeno je sa FACS. R347
1
je korišćen kao negativna kontrola u svim eksperimentima. Uzorci su obeleženi i analizirani kao što je prethodno opisano u Primeru 1. Nikakvo značajno razlikovanje u vezivanju Cam-003 konjugata u poređenju sa nekonjugovanim lažno-konjugovanim Cam-003 nije primećeno (Slika 14A). Vezivanje A7 kontrolnih konjugata bilo je proporcionalno broju PMB molekula po konjugatu (Slika 14B). Ova analiza ukazuje da konjugacija PMB za Cam-003 ne utiče značajno na vezivanje celih ćelija i da konjugovani PMB može posredovati direktno vezivanje za ćelije, po svoj prilici vezivanjem za LPS.
Primer 11: Procenjivanje PMB-mAb konjugata koji promovišu OPK P. aeruginosa [0284] Ovaj primer opisuje dva niza eksperimenata koji procenjuju sposobnost PMB-mAb konjugata da promovišu OPK P. aeruginosa. U prvom od eksperimenata (Slike 15A-B), konjugat-posredovana OPK aktivnost ljudskih HL-60 neutrofilnih ćelijskih linija u prisustvu komplementa zeca procenjena je upotrebom P. aeruginosa sojeva koji su vršili ekspresiju bakterijske luciferaze kao što je opisano u Primeru 2. R347 je korišćeno kao negativna kontrola u ovim eksperimentima. CAM-003 konjugati zadržali su potentnu OPK aktivnost, iako je smanjena sa povećanjem broja PMB po konjugatu (SM > DM1 > DM2) (Slika 15A). CAM-003 konjugati nisu pokazali OPK aktivnost protiv ΔpslA P. aeruginosa soja koji ne vrši ekspresiju Psl cilja, što ukazuje da je mAb-posredovano vezivanje neophodno za ubijanje (Slika 15B). U drugom nizu eksperimenata, smanjenje luminiscencije praćeno sa 2 sata inkubacije relativno kontroli koja nije imala mAb korišćeno je za određivanje % ubijanja. Slika 18A prikazuje da su CAM-003 konjugati zadržali OPK aktivnost, iako je smanjena povećavanjem broja PMB po konjugatu, naročito u DM i TM konstruktima (WT>SM>DM>TM). CAM-003 konjugati nisu pokazali OPK aktivnost protiv PAO! ΔpslA soj koji nije vršio ekspresiju Psl cilja (nije prikazano). Slika 18B prikazuje da A7-PMB konjugati nisu posredovali OPK što ukazuje da je mAb-posredovano vezivanje neophodno za ubijanje.
Primer 12: Neutralizacija P. aeruginosa LPS sa PMB-mAb konjugatima
[0285] Neutralizacija P. aeruginosa O10 LPS aktivnosti procenjena ja prethodnom inkubacijom PMB-mAb konjugata ili PMB samostalno sa LPS 1h, što je praćeno stimulacijom mišijih RAW 264.7 makrofaga i kvantifikacijom TNF lučenja. Krajnja koncentracija LPS bila je 2ng/ml. TNF je kvantifikovan sa FACS-zasnovanom BD™ Cytometric Bead Array (CBA) metodom (BD Biosciences) nakon 6 sati stimulacije. LPS neutralizacija izmerena je smanjenjem TNF proizvodnje relativno u odnosu na LPS
1 1
maksimalni odgovor. PMB-Cam-003 konjugati, ali ne lažni-konjugati divljeg tipa Cam-003 pokazali su LPS neutralizaciju. Efikasnost neutralizacije bila je direktno proporcionalna srednjem broju PMB u konjugatu (DM2 > DM1 > SM) (Slika 16A). PMB-A7 konjugati, ali ne lažni-konjugati divljeg tipa A7 pokazali su LPS neutralizaciju (Slika 16B). A7 konjugati pokazali su bolju neutralizaciju od CAM-003 konjugata. A7 konjugati pokazali su bolju neutralizaciju od CAM-003 konjugata verovatno usled veće efikasnosti konjugacije ostvarene u ovim molekulima. Približno 2 konjugovana PMB molekula/mAb potrebna su za neutralizaciju količine LPS neutralizovane sa slobodnim PMB molekulom.
Primer 13: Procenjivanje Cam-003-PMB konjugata usmerenih na mesto kod modela miševa
[0286] Efikasnost Cam-003 PMB konjugata procenjena je u dva tipa modela miševa: 1) model izazivanja endotoksemije (LPS), za određivanje sposobnosti konjugata da neutralizuju i/ili da uklone toksičnost LPS in vivo; i 2) P. aeruginosa model sepse, za procenjivanje da li Cam-003-PMB konjugati utiču na poboljšanu zaštitu protiv bakterijskog izazova relativno u odnosu na antitelo samo preko PMB-posredovane LPS neutralizacije i/ili klirensa, dodatno antitelo-posredovanom bakterijskom klirensu. Drugi P. aeruginosa modeli izazivanja mogu biti korišćeni za testiranje efikasnosti Cam-003-PMB konjugata (videti ispod).
A. Model endotoksemije
[0287] Dobro je utvrđeno da PMB može vezati i neutralisati LPS in vivo i posredovati zaštitu od LPS izazova (Morrison, DC. i dr. J. Immunochemistry 13(10):813-818 (1976), Drabick, JJ. i dr., Antimicrob Agents Chemother.42(3):583-588 (1998)). U modelu endotoksemije, konjugati Cam-003-PMB će biti procenjeni zbog njihove sposobnosti da zaštite životinje od LPS izazova. Prečišćeni LPS iz Gram-negativnih bakterija, uključujući P. aeruginosa i E. coli, biće iskorišćeni za izazivanje miševa pri utvrđenim minimalnim smrtnim dozama (LD100). Kako su miševi relativno otporni na LPS, D-galaktozamin se takođe može zajedno dati, jer u velikoj meri povećava osetljivost miševa na LPS grubo na one od ljudi (Galanos, C. i dr., Proc Natl Acad Sci U S A.76(11):5939-5943 (1979)). Takvi modeli su široko korišćeni za predkliničko procenjivanje efikasnosti LPS neutralizujućih molekula, uključujući antitela i konjugate polimiksin-proteina (Bailat, S. i dr., Infect Immun. 65(2):811-814 (1997), Birkenmeier, G. i dr., J Pharmacol Exp Ther.318(2):762-771 (2006), Drabick, JJ. i dr., Antimicrob Agents Chemother. 42(3):583-588 (1998)). C-003-PMB konjugati, kontrolni konjugati i nekonjugovani Cam-003 mogu se primenjivati ili terapeutski ili profilaktički, a
1 2
njihova sposobnost zaštite životinja od LPS izazova može se proceniti. Obim zaštite koji se posreduje PMB konjugatima može biti u korelaciji sa nivoima proinflamatornih citokina i hemokina izmerenih u serumu ili u plazmi, uključujući TNF, KC i IL-6.
B. Modeli P. aeruginosa izazova
[0288] Nekoliko modela miševa P. aeruginosa infekcije mogu se koristiti za procenu sposobnosti konjugata Cam-003-PMB da posreduju zaštitu. P. aeruginosa se može davati intraperitonealno miševima (model sepse), intravenozno (bakteremijski model) ili intranazalno (model upale pluća) pri određenim dozama LD100. Ovi modeli prethodno su korišćeni za predkliničko ispitivanje efikasnosti pasivnih ili aktivnih vakcina (Frank, DW. i dr., J Infect Dis.186(1):64-73. (2002), Secher, T. i dr., J Antimicrob Chemother.66(5):1100-1109 (2011), Miyazaki, S. i dr., J Med Microbiol.43(3):169-175 (1995), Dunn, DL. i dr., Surgery 96(2):440-446 (1984)).
[0289] Kao i u modelu endotoksemije, takođe je potrebno senzitivizirati miševe sa D-galaktozaminom pre bakterijskog izazova kako bi prevazišli urođenu rezistenciju na LPS toksičnost i da bi se mogao proceniti doprinos LPS neutralizacije i/ili klirensa na in vivo efikasnost PMB konjugata. D-galaktozamin dokazan je da smanjuje LD100 Gram-negativne bakterije, verovatno povećavajući osetljivost na LPS odvajanje u toku infekcije (Bucklin, SE. i dr., J Infect Dis.172(6): 1519-27 (1995)).
[0290] Cam-003-PMB konjugati, kontrolni konjugati i nekonjugovani Cam-003 mogu se primenjivati ili terapeutski ili profilaktički. Sposobnost CAM-003 konjugata da utiču na povećanje zaštite Cam-003 samo pomoću neutralizacije i/ili klirensa bakterijske LPS preko konjugovane PMB grupe može se odrediti u ispitivanjima preživljavanja. Efikasnost Cam-003-PMB konjugata u posredovanom bakterijskom klirensu takođe se može proceniti kvantifikovanjem P. aeruginosa bakterija u serumu i organima, uključujući slezinu, bubrege i pluća, nakon infekcije. LPS nivoi u serumu ili plazmi takođe se mogu kvantifikovati kako bi se procenio obim bakterijskog klirensa i LPS klirensa i/ili neutralizacija putem konjugata Cam-003-PMB i uporediti ih sa nekonjugovanim Cam-003 i kontrolnim antitelo-PMB konjugatima.
C. Podaci modela endotoksemije
1
[0291] Konkretno, C57B1/6 miševi (10 po grupi) dozirani su i.p. sa mAb ili PMB-mAb konjugatom 6h pre izazova sa P. aeruginosa PAO10 LPS (Sigma) i D-galaktozaminom. Kontrola PMB dozirana je i.p.2 h pre izazivanja pri 0,2 mg/kg i obično daje 80-100% zaštitu. Kontrolni miševi dozirani sa nekonjugovanim CAM-003 su svi umrli u okviru od 18h. Slike 19A i B pokazuju da su kod 45 mg/kg DM i TM konjugati CAM-003 i A7 dali 90-100% zaštitu, dok SM konjugati nisu bili zaštitni.
[0292] Konjugati TM su dozirani sa 45, 15 i 5 mg/kg. Kao što je prikazano na slikama 20A i B, gubitak zaštitne aktivnosti je bio bolji kod CAM-003-TM-PMB nego kod A7-TM-PMB, koji je zadržao 80% zaštite na 5 mg/kg. Ove razlike ukazuju na to da jedinstvene strukturne osobine mAb mogu uticati na LPS neutralizaciju aktivnosti konjugovanog PMB-a, kao što se prethodno videlo in vitro.
D. Podaci modela sepse
[0293] C57B1/6 miševi (10 po grupi) primili su mAb ili PMB-mAb konjugate i.p (10,1 i 0,1 mg/kg) 6 sati pre i.p. izazova sa LD80-100 dozom P. aeruginosa soja 6294 (4E7 CFU).
Podaci iz dva ispitivanja bili su kombinovani u ovoj analizi. Preživljavanje je praćeno tokom 72h. Kombinovani rezultati dva ispitivanja prikazani su na Slikama 21A-C:. Većina kontrolnih miševa doziranih A7 ili baferom umrlo je za 24 sata. Nekonjugovani CAM-003 pokazuje zaštitu od 50-90%. Aktivnost zaštite deluje da je inverzno povezana sa dozom. Konjugati CAM-003-PMB dali su bolju zaštitu od nekonjugovanih mAb pri visokoj dozi od 10 mg/kg, što ukazuje na to da je neutralizacija LPS odvajanja tokom infekcije doprinela opstanku. Kontrolni konjugat A7-DM-PMB pokazao je 50% zaštitnu aktivnost pri 10 mg/kg, što ukazuje na to da neutralizacija LPS može obezbediti dobrobit preživljavanja. Nasuprot tome, konjugati su bili manje zaštitni od CAM-003 pri maloj dozi od 0,1 mg/kg, a zaštitna aktivnost povezana je sa in vitro OPK aktivnošću konjugata (VT>SM>DM>TM). Zajednički rezultati pokazuju da konjugovani PMB može dodati zaštitnu aktivnost opsonskom antitelu posredovanjem neutralizacije LPS i dopunjavati njegovu funkciju bakterijskog klirensa.
[0294] Visoka efikasnost konjugovana PMB za projektovane Fc ostatke cisteina postignuta je korišćenjem SM-PEG12 heterobifunkcionalnog veznika. Niz PMB konjugata usmerenih na lokalizaciju CAM-003, potentnog opsonskog i zaštitnog mAb koji cilja P. aeruginosa Psl egzopolisaharid, procenjen je in vitro i in vivo. CAM-003-PMB konjugati zadržali su in vitro OPK aktivnost. Međutim, aktivnost OPK uticala je na povećanje prosečnog broja PMB po
1 4
mAb. DM i TM PMB-mAb konjugati pružili su zaštitu u P. aeruginosa modelu endotoksemije, pokazujući da je LPS funkcija neutralizovanja PMB preneta na mAb.
Konjugati CAM-003-PMB pokazali su veću zaštitnu aktivnost od nekonjugovanog CAM-003 mAb u modelu P. aeruginosa sepse pri velikoj dozi (10 mg/kg) i smanjenu aktivnost pri maloj dozi (0,1 mg/kg). Ovi podaci ukazuju na to da konjugovani PMB može dopuniti bakterijski klirens posredovan opsonskim CAM-003 mAb i poboljšati zaštitu pomoću neutralizacije LPS. Poboljšanje zaštitne aktivnosti pomoću CAM-003-PMB konjugata u modelu sepse izgubljeno je pri nižim dozama, pri čemu su nivoi konjugovanog PMB suviše niski da bi se neutralizovao LPS, a primarni način zaštite je verovatno mAb-posredovan bakterijski klirens. Gubitak zaštitne aktivnosti CAM-003-PMB konjugata u nižim dozama u skladu je sa smanjenjem in vitro OPK aktivnosti kao rezultat PMB konjugacije. Ova ispitivanja pokazuju da konjugovani PMB na opsonskom mAb može preneti LPS neutralizaciju i rezultirati povećanom zaštitnom aktivnošću u sistemskom modelu P. aeruginosa infekcije. Optimizacija lokacija konjugata kako bi se smanjio negativni uticaj na OPK aktivnost može dalje poboljšati zaštitnu aktivnost PMB konjugata u odnosu na nekonjugovane opsonske mAb.
LISTA SEKVENCI
[0295]
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za A Pseudomonas Psl egzopolisaharid, gde antitelo podsti;e opsonofagocitno ubijanje (OPK) P. aeruginosa, opciono, gde antitelo inhibira povezivanje P. aeruginosa za epitelne ćelije.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje konkurentno inhibira vezivanje Pseudomonas Psl egzopolisaharida sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca i (VL) zabrane iz grupe koju čine:
SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 (Cam-003),
SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2 (Cam-004),
SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2 (Cam-005),
SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 (WapR-001),
SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8 (WapR-002),
SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10 (WapR-003),
SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 (WapR-004),
SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 12 (WapR-004RAD), i
SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16 (WapR-016).
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) koji imaju sekvence aminokiselina bar 90% identične sa VH i VL izabranim iz grupe koju čine:
(a) SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2,
(b) SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2,
(c) SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2,
(d) SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6,
(e) SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8,
(f) SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10,
(g) SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12,
(h) SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 12; i
(j) SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16.
koje opciono sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) koji imaju sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji iz:
(a) SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2,
2
(b) SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 2,
(c) SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2,
(d) SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6,
(e) SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8,
(f) SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10,
(g) SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12,
(h) SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 12; i
(j) SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanac (VH) koji sadrže VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 i VLCDR3 koji imaju sekvence aminokiselina identične sa:
SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, i 22,
SEQ ID NO: 23, 24, 25, 20, 21, i 22,
SEQ ID NO: 26, 27, 28, 20, 21, i 22,
SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, i 34,
SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, i 40,
SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, i 46,
SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, i 52,
SEQ ID NO: 47, 48, 75, 50, 51, i 52, ili
SEQ ID NO: 59, 60, 61, 62, 63, i 64, respektivno.
5. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-4, koje je humanizovano, himerno ili potpuno ljudsko.
6. Sastav koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnim zahteva 1-5, i nosač.
7. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-5.
8. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7.
9. Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili vektor prema patentnom zahtevu 8.
10. Metod za proizvodnju antitela, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7, i dobijanje antitela.
11. Izolovano antitelo proizvedeno metodom prema patentnom zahtevu 10.
12. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-5 ili sastav prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu pri prevenciji ili tretiranju Pseudomonas infekcije kod subjekta koji ima potrebu za time,
opciono gde je Pseudomonas infekcija P. aeruginosa infekcija,
opciono gde je subjekat čovek,
opciono gde je infekcija očna infekcija, infekcija pluća, infekcija opekotine, infekcija rane, infekcija kože, infekcija krve, infekcije kostiju, ili kombinacija dve ili više navedenih infekcija.
13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-5 i 11 ili sastav prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu pri blokiranju ili prevenciji povezivanja P. aeruginosa za epitelne ćelije, gde se smeša epitelnih ćelija i P. aeruginosa dovode u kontakt sa antitelom ili sastavom.
14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-5 i 11 ili sastav prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu pri promovisanju OPK P. aeruginosa, gde se smeša fagocitnih ćelija i P. aeruginosa dovodi u kontakt sa antitelom ili sastavom, opciono gde su fagocitne ćelije diferencirane HL-60 ćelije ili ljudski polimorfonuklearni leukociti (PMN).
2 2
RS20180333A 2011-06-10 2012-06-08 Anti-pseudomonas psl vezujući molekuli i njihova upotreba RS57024B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161495460P 2011-06-10 2011-06-10
US201161530461P 2011-09-02 2011-09-02
US201261613317P 2012-03-20 2012-03-20
PCT/US2012/041538 WO2012170807A2 (en) 2011-06-10 2012-06-08 Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof
EP12796646.3A EP2718320B1 (en) 2011-06-10 2012-06-08 Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57024B1 true RS57024B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=47296761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180333A RS57024B1 (sr) 2011-06-10 2012-06-08 Anti-pseudomonas psl vezujući molekuli i njihova upotreba

Country Status (23)

Country Link
US (4) US9403901B2 (sr)
EP (2) EP2718320B1 (sr)
JP (2) JP6058645B2 (sr)
KR (1) KR102111171B1 (sr)
CN (1) CN103974975B (sr)
AU (3) AU2012267732A1 (sr)
BR (1) BR112013031485B1 (sr)
CA (1) CA2838211C (sr)
CY (1) CY1120557T1 (sr)
DK (1) DK2718320T3 (sr)
ES (1) ES2664972T3 (sr)
HK (1) HK1257190A1 (sr)
HR (1) HRP20180458T1 (sr)
HU (1) HUE038509T2 (sr)
LT (1) LT2718320T (sr)
MX (1) MX349886B (sr)
PL (1) PL2718320T3 (sr)
PT (1) PT2718320T (sr)
RS (1) RS57024B1 (sr)
RU (2) RU2014100111A (sr)
SI (1) SI2718320T1 (sr)
SM (1) SMT201800168T1 (sr)
WO (1) WO2012170807A2 (sr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024123712A1 (en) * 2022-12-04 2024-06-13 Genentech, Inc. Analysis of candidate cytotoxic compositions

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6058645B2 (ja) 2011-06-10 2017-01-11 メディミューン，エルエルシー 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用
SMT202000542T1 (it) * 2011-11-07 2020-11-10 Medimmune Ltd Terapie di combinazione utilizzando molecole di legame anti-psl e pcrv di pseudomonas
BR112015010240A2 (pt) * 2012-11-06 2017-08-22 Medimmune Ltd Terapias de combinação através do uso de mo-léculas de ligação de psl e de pcrv anti-pseudomonas
US20160115250A1 (en) * 2013-05-14 2016-04-28 Medlmmune, Llc Synthetic Oligosaccharide Subunits Of The PSL Exopolysaccharide Of Pseudomonas Aeruginosa And Uses Thereof
TWI751102B (zh) * 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
GB201518668D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
SG10201913100WA (en) 2015-11-30 2020-03-30 Medimmune Ltd Method for preventing or treating nosocomial pneumonia
JP2019509737A (ja) 2016-03-11 2019-04-11 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． ＴＧＦβ１結合性免疫グロブリンおよびその使用
AU2017261374B2 (en) * 2016-05-05 2024-06-20 Inovio Pharmaceuticals, Inc. DNA antibody constructs for use against pseudomonas aeruginosa
CN110475829B (zh) 2017-04-03 2022-09-20 富士胶片株式会社 油墨组合物及其制造方法、以及图像形成方法
GB201816553D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Centauri Therapeutics Ltd Novel compounds and therapeutic uses thereof
GB201816554D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Centauri Therapeutics Ltd Novel compounds and therapeutic uses thereof
EP3923978A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for using bispecific antibodies to bind complement and a target antigen
KR20220115829A (ko) * 2019-11-12 2022-08-18 젠자임 코포레이션 결핍된 cftr 활성에 의해 매개된 병태를 치료하기 위한 5-원 헤테로아릴아미노설폰아미드
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CA3188725A1 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing pseudomonas psl and uses thereof
CN116059381B (zh) * 2022-12-29 2025-03-07 中国科学院长春应用化学研究所 一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒及其制备方法和应用

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
EP0215131B1 (en) * 1985-03-11 1992-06-17 Teijin Limited E87ag antigen of pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibody against it, and hybridoma
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE768377T1 (de) 1988-09-02 1998-01-02 Dyax Corp Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
AU2238292A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
EP1231268B1 (en) 1994-01-31 2005-07-27 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
DE69800716T2 (de) 1997-04-14 2001-09-20 Micromet Gesellschaft Fuer Biomedizinische Forschung Mbh Neues verfahren zur herstellung von anti-humanen antigenrezeptoren und deren verwendungen
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US6190370B1 (en) 1997-07-25 2001-02-20 Arrow International, Inc. Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
JP4169478B2 (ja) 1998-04-21 2008-10-22 マイクロメット アーゲー Ｃｄ１９×ｃｄ３特異的ポリペプチドおよびその使用
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
ATE352040T1 (de) 2000-11-17 2007-02-15 Univ Rochester In-vitro verfahren zur herstellung und identifizierung von immunglobulin moleküle in eukaryotischen zellen
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
US20020146753A1 (en) 2001-04-06 2002-10-10 Henrik Ditzel Autoantibodies to glucose-6-phosphate isomerase and their participation in autoimmune disease
US7119172B2 (en) * 2001-05-21 2006-10-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. P. aeruginosa mucoid exopolysaccharide specific binding peptides
US20030232387A1 (en) 2002-06-14 2003-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind alphaE integrin
US20090215992A1 (en) 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2520588A1 (en) 2005-08-19 2012-11-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2007260787A1 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Zymogenetics, Inc IL-17 and IL-23 antagonists and methods of using the same
US7553936B2 (en) 2006-12-04 2009-06-30 The United States of America as represented by Secretary Department of Health and Human Services Anti-TREM-like transcript-1 (TLT-1) antibodies and compositions
EP2514767A1 (en) 2006-12-19 2012-10-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders
SG186017A1 (en) * 2007-11-30 2012-12-28 Kalobios Pharmaceuticals Inc Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
PL2248826T3 (pl) 2008-01-10 2013-11-29 Shionogi & Co Przeciwciało skierowane przeciwko PcrV
CN102083460A (zh) 2008-01-18 2011-06-01 米迪缪尼有限公司 用于位点特异性偶联的半胱氨酸工程化抗体
JP2012510468A (ja) 2008-11-28 2012-05-10 アボット・ラボラトリーズ 安定な抗体組成物およびこれを安定させるための方法
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
CA2751433A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Combination antibiotic and antibody therapy for the treatment of pseudomonas aeruginosa infection
US9096659B2 (en) 2009-03-18 2015-08-04 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against Pseudomonas aeruginosa
CA2755133A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Selective and potent peptide inhibitors of kv1.3
EP2417157A1 (en) * 2009-04-09 2012-02-15 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipolysaccarides (lps) of serotype lats 01 of pseudomonas aeruginosa
CN102802661B (zh) 2009-06-22 2016-01-13 米迪缪尼有限公司 用于位点特异性偶联的工程改造的Fc区
EP2515935A4 (en) 2009-12-22 2013-08-28 Kalobios Pharmaceuticals Inc METHOD FOR TREATING STAPHYLOCOCCUS INFECTION IN A PATIENT WITH PSEUDOMONAS AERUGINOSA INFECTION WITH LOW PATHOGEN LEVEL
MX375113B (es) 2011-02-08 2025-03-04 Medimmune Llc Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de staphylococcus aureus y métodos de uso.
JP6058645B2 (ja) 2011-06-10 2017-01-11 メディミューン，エルエルシー 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用
SMT202000542T1 (it) * 2011-11-07 2020-11-10 Medimmune Ltd Terapie di combinazione utilizzando molecole di legame anti-psl e pcrv di pseudomonas
AU2012336069A1 (en) 2011-11-07 2014-05-22 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
DK2917360T3 (da) 2012-11-06 2020-03-30 Medimmune Llc Antistoffer mod S. aureus-overflade-determinanter
BR112015010240A2 (pt) 2012-11-06 2017-08-22 Medimmune Ltd Terapias de combinação através do uso de mo-léculas de ligação de psl e de pcrv anti-pseudomonas
CN112316135A (zh) 2012-11-06 2021-02-05 米迪缪尼有限公司 治疗金黄色葡萄球菌相关疾病的方法
US20160115250A1 (en) 2013-05-14 2016-04-28 Medlmmune, Llc Synthetic Oligosaccharide Subunits Of The PSL Exopolysaccharide Of Pseudomonas Aeruginosa And Uses Thereof
EP3139950A4 (en) 2014-05-05 2017-12-20 Medimmune, LLC Multi-specific anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules and uses thereof
TWI719938B (zh) 2014-06-19 2021-03-01 美商麥迪紐有限責任公司 多重細菌感染之治療
SG10201913100WA (en) 2015-11-30 2020-03-30 Medimmune Ltd Method for preventing or treating nosocomial pneumonia
AU2017261374B2 (en) 2016-05-05 2024-06-20 Inovio Pharmaceuticals, Inc. DNA antibody constructs for use against pseudomonas aeruginosa
JP6988094B2 (ja) 2017-01-27 2022-01-05 富士フイルムビジネスイノベーション株式会社 ポリイミド前駆体組成物、及びポリイミド成形体の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024123712A1 (en) * 2022-12-04 2024-06-13 Genentech, Inc. Analysis of candidate cytotoxic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
CN103974975A (zh) 2014-08-06
SI2718320T1 (en) 2018-06-29
JP6058645B2 (ja) 2017-01-11
KR20140034877A (ko) 2014-03-20
HK1257190A1 (en) 2019-10-18
CA2838211A1 (en) 2012-12-13
US10370436B2 (en) 2019-08-06
US20210130442A1 (en) 2021-05-06
US10844114B2 (en) 2020-11-24
LT2718320T (lt) 2018-04-10
BR112013031485A8 (pt) 2022-05-17
NZ618266A (en) 2016-04-29
RU2018102606A (ru) 2019-02-22
RU2014100111A (ru) 2015-07-20
BR112013031485B1 (pt) 2022-06-14
BR112013031485A2 (pt) 2016-11-22
JP6420813B2 (ja) 2018-11-07
EP2718320B1 (en) 2018-01-10
PT2718320T (pt) 2018-03-26
MX2013014372A (es) 2014-08-21
SMT201800168T1 (it) 2018-05-02
EP2718320A2 (en) 2014-04-16
PL2718320T3 (pl) 2018-06-29
HUE038509T2 (hu) 2018-10-29
JP2014519334A (ja) 2014-08-14
US20160297872A1 (en) 2016-10-13
EP2718320A4 (en) 2015-03-04
CN103974975B (zh) 2018-06-29
AU2017204447B2 (en) 2019-08-01
AU2017204447A1 (en) 2017-07-20
CY1120557T1 (el) 2019-07-10
ES2664972T3 (es) 2018-04-24
HRP20180458T1 (hr) 2018-06-29
WO2012170807A3 (en) 2013-03-28
JP2017074057A (ja) 2017-04-20
AU2012267732A1 (en) 2014-01-09
EP3385280A1 (en) 2018-10-10
CA2838211C (en) 2023-08-01
RU2018102606A3 (sr) 2019-02-22
KR102111171B1 (ko) 2020-05-14
MX349886B (es) 2017-08-17
US20140227285A1 (en) 2014-08-14
US20190322726A1 (en) 2019-10-24
RU2708977C2 (ru) 2019-12-12
AU2019257355A1 (en) 2019-11-14
DK2718320T3 (en) 2018-03-26
US9403901B2 (en) 2016-08-02
WO2012170807A2 (en) 2012-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12428473B2 (en) Combination therapies using anti-pseudomonas PSL and PCRV binding molecules
US10844114B2 (en) Anti-Pseudomonas Psl binding molecules and uses thereof
US20150284450A1 (en) Combination therapies using anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules
HK1196833B (en) Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof
HK1196833A (en) Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof
NZ618266B2 (en) Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof