RS56082B1 - Anti-vla-4 antitela - Google Patents

Description

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava tvrdi benefit U.S. provizorne prijave br.61/324,944, podnete April 16, 2010.

OBLAST TEHNIKE

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na alfa-4 vezujuća antitela, i njihove alfa-4 vezujuće fragmente.

STANJE TEHNIKE

[0003] Humanizovana antitela se mogu koristiti kao terapeutski agensi umesto murinskih antitela kako bi se izbegao neželjeni imuni odgovor kod ljudi nazvani HAMA (Humano anti-Mišije Antitelo) odgovor. Humanizovana antitela su uopšteno konstruisana zamenom komplementarnih utvrđenih regiona (CDRs) humanog antitela sa CDRs drugih vrsta, obično mišije antitelo.

[0004] VLA-4 (takođe nazvan Įȕ1) je član od ȕ1 integrinske porodice ćelijskih površinskih receptora. VLA-4 sadrži Į4 lanac i ȕ1 lanac i uključen je u ineterakcije ćelija-ćelija. Njegova ekspresija je uglavnom ograničena na limfoidne i mijeloidne ćelije. VLA-4 vezuje endotelijalni ćelijski ligand VCAM-1 (Vaskularni ûelijski Adhezioni Molekul-1), i može posredovati T i B limfocitno vezivanje za II vezujući fragment humanog plazma fibronectina.

[0005] WO 2006096653 otkriva anti-VLA-4 antitelo nazvano HP1/2 i njegove humanizovane varijante koristeći okvir akceptorskog varijabilnog regiona teškog lanca iz IGHV1-f.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Predmet pronalaska je definisan zahtevima.

[0007] Pronalazak je otkrio da okviri germlinijskog variabilnog regiona mogu da se koriste za optimizaciju CDR-graftovanih alfa-4 vezujućih antitela, kao što su anti-VLA-4 antitela. Prema tome, pronalazak karakteriše anti-VLA-4 varijabilne teške (VH) i varijabilne lake (VL) lance i molekule antitela koji uključuju takav okvir.

[0008] U jednom aspektu, otkrivene karakteristike anti-Į4 antitela VH lanca koji ima CDRs iz donora anti-Į4 antitela, npr., anti-Į4 antitelo opisano ovde, i VH okvir koji ima regione 1, 2, 3, i 4 iz sekvence, ili nema više od 5, 10 ili 15 razlika iz sekvence germlinijskog varijabilnog regiona za VH lanac. U jednom rešenju, varijabilni okvir regiona 4 (FR4) je humana konsenzusna sekvenca. U jednom rešenju, potpuni okvirni regioni VH lanca FR1, FR2, FR3 i FR4, su prisutni. U drugom rešenju, lanac je antigen-vezujući fragment VH regiona.

[0009] U jednom rešenju, germlinijska sekvenca je humani IGHV1-f (SEQ ID NO: 2), prikazan na FIG.1. U izvesnim rešenjima, sekvence VH okvira mogu se razlikovati sa najmanje, ali ne više od 2, 3, 4, 5, 10 ili 15 amino kiselinska ostatka iz germlinijske sekvence, npr., SEQ ID NO: 2. U jednom rešenju, VH okvir dalje obuhvata i drzge odgovarajuće humane ostatke. Na primer, VH lanac obuhvata ne-humane ostatake, na jednom ili više pozicija okvira 24, 67, 76, 80, i 94 (Kabat brojanje) SEQ ID NO:2.

[0010] U jednom rešenju, bar jedan ili više komplementarnih određenim regiona (CDRs) varijabilnih domena je izvedeno iz donora ne-humanog Į4-vezujućeg antitela. U jednom rešenju, antigenski vezujući regioni CDR-graftovanog teškog lanca varijabilnog domena obuhvata CDRs koji odgovaraju pozicijama 26-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) i 95-102 (CDR3) (Kabat brojanje; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vol.

4, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).

[0011] Stoga, u jednom rešenju, okvir varijabilnog teškog lanca (VH) ima sekvencu akceptora izvedenog iz humanog antitela germlinijske sekvence IGHV1-f.

[0012] U drugom rešenju, bar jedna amino kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino kiselinskih ostataka, u FR1 regionu VH je drugačiji od odgovarajućeg humanog germlinijskog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan okvirnom regionu nehumanog antitela iz kojegu su CDR sekvence izvedene. U jednom rešenju, amino kiselinski ostatak na Kabat poziciji 24 je mutiran kako bi bio identičan okvirnom regionu nehumanog antitela.

[0013] U drugom rešenju, bar jedna amino kiselina, i ne više od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino ksielinskih ostataka, u FR2 regionu VH je drugačija od odgovarajućeg humanog germlinijskog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan okvirnom regionu nehumanog antitela iz kojeg su CDR sekvence izvedene.

[0014] A ipak u drugom rešenju, bar jedna amino kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino kiselinskih ostataka, u FR3 VH lanca je drugačije od odgovarajućeg humanog germlinisjkog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan za okvirni region nehumanog antitela iz kojeg su CDR sekvence izvedene. U jednom rešenju, amino kiselinski ostatak na Kabat poziciji 94 je identičan okvirnom regionu nehumanog antitela. A ipak u drugom rešenju, amino kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67, 76, 80, i 94 su identični okvirnom regionu nehumanog antitela.

[0015] U izvesnim rešenjima, VH lanac antitela ima sekvence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 5.

[0016] U jednom aspektu, otkrivene karakteristike, anti-VLA-4 VL lanca koji ima CDRs iz donora anti-VLA-4 antitela, npr., anti-VLA-4 antitela opisanog ovde, i VL okvir koji ima regione 1, 2, 3, i 4 iz sekvence, ili ima ne više od 5, 10 ili 15 razlika (ili po/regionu ili ukupno) iz, germlinijske sekvence varijabilnog regiona za VL lanac. U jednom rešenju, varijabilni okvirni region 4 (FR4) je humana konsenzusna sekvenca. U jednom rešenju, kompletni okvirni regioni VL lanca FR1, FR2, FR3 i FR4, su prisutni. U drugom rešenju, lanac je antigenski vezujući fragment VL regiona.

[0017] U drugom rešenju, germlinijska sekvenca je IGKV4-1 (SEQ ID NO: 7), prikazana na FIG.2. A ipak u drugim rešenjima, okvirna sekvenca VL može se razlikovati sa najmanje jednim, ali ne više od 2, 3, 4, 5, 10 ili 15 amino kiselinskih ostataka iz okvirne germlinijske sekvence, npr., SEQ ID NO: 7. U drugom rešenju, VL karakteristika uključuje i druge humane amino kiselinske ostatke. Na primer, VL lanac dalje obuhvata ne-humane ostatke na jednom ili više pozicija okvira 1, 73, i 87 (Kabat brojanje) SEQ ID NO: 7.

[0018] U jednom rešenju, sekvenca je AAH7035.1 (SEQ ID NO: 12) ili njegova germlinijska planirana verzija (SEQ ID NO: 13), prikazana na FIG.2. U nekim rešenjima, okvirna sekvenca VL se može razlikovati sa bar jendom, ali ne više od 5, 10, 15, 20, ili 25 amino kiselinskih ostataka iz germlinijske planirane sekvence okvira, npr., SEQ ID NO: 13. U jednom rešenju, VL lanac uključuje i druge odgovarajuće humane ostatke. Na primer, VL lanac obuhvata ne-humane ostatke na jednom ili više pozicija okvira 1 i 87 (Kabat brojanje) SEQ ID NO: 12. U drugom rešenju, VL obuhvata amino kiselinske supstitucije u okvirnom regionu kako bi ličio na drugu germlinijsku sekvencu okvira, kao što je iz germlinijske sekvence IGKV4-1. U izvesnim rešenjima, sekvenca okvira VL je promenjena kako bi bila identična IGKV4-1 germlinijskoj sekvenci na pozicijama 1-3, 5-23, 35-37, 39-42, 45-49, 57, 59-61, 63-64, 70-72, 74-84,86-88, 99-106 (Kabat brojanje) SEQ ID NO:12.

[0019] U jednom rešenju, bar jedna ili više komplementarno određenih regiona (CDRs) varijabilnih domena su izvedeni iz donora ne-humanog Į4-vezujućeg antitela. U drugom rešenju, antigenski vezujući region CDR-graftovanog teškog lanca varijabilnog domena obuhvata CDRs koji odgovaraju pozicijama 24-31 (CDR1), 50-56 (CDR2) i 89-97 (CDR3) (Kabat brojanje). Stoga, u jednom rešenju, VL okvir ima akceptorsku sekvencu konstruisanu iz IGKV4-1 germlinijske sekvence, iz antitela AAH70335.1 ili iz germlinijskog planiranog antitela AAH70335.1.

[0020] U još jednom rešenju, bar jedna amino kiselina, i ne više od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR1 VL lanca je različito od odgovarajućeg humanog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan za okvir regiona nehumanog antitela iz kojeg su CDR sekvence izvedene. U jednom rešenju, amino kiselinski ostatak na N-terminalnoj poziciji FR1 je mutirao kako bi bio identičan okviru regiona nehumanog antitela.

[0021] U drugom rešenju, bar jedna amino kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR2 VL lanca je različito od odgovarajućeg humanog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan okvirnom regionu nehumanog antitela iz kojeg su CDR sekvence izvedene.

[0022] U drugom rešenju, bar jedna amino kiselina, i ne manje od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR3 VL je durgačije od odgovarajućeg humanog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka može, na primer, da bude identičan okvirnom regionu nehumanog antitela iz kojeg su CDR sekvence izvedene. U drugom rešenju, amino kiselinski ostatak na Kabat poziciji 87 je mutiran kako bi bio identičan okvirnom regionu nehumanog antitela. U još jednom rešenju, amino kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67 i 87 su mutirani kako bi bili identični okvirnom regionu nehumanog antitela. U još jednom rešenju, amino kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67, 73, i 87 SEQ ID NO: 7 su mutirani kako bi bili identični okvirnoj sekvenci nehumanog antitela

[0023] U drugim rešenjima, VL lanac antitela ima sekvence SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ili SEQ ID NO: 11.

[0024] U jednom rešenju, CDRs VH i VL akceptori okvirnih sekvenvci su odabrani da liče CDR sekvencama nehumane (npr., murine) antitelne sekvence, gde nehumano antitelo vezuje integrin alfa-4 ili njegov fragment. U drugom rešenju, sekvence CDRs su odabrane da liče na sekvence CDRs ne-humanog antitela koji vezuje B1 epitop VLA-4 Į4 lanca. U jednom rešenju, CDRs su odabrani da liče na murine monoklonalno antitelo, npr., HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, ili 21.6 (Pulido et al., J. Biol. Chem.266:10241-10245, 1991; U.S. Patent No.6,033,665). Modifikacije mogu da označavaju, npr., aksciziju ili ubacivanje ili izmenu, npr., sa usmerenim mutagenezama.

[0025] U drugom aspektu, otkrivene karakteristike antitela, ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta, obuhvataju:

- anti-VLA-4 VL lanac opisan ovde, npr., anti-VLA-4 VL lanac koji ima CDR’s iz donora anti-VLA-4 antitela, npr., anti-VLA-4 antitelo opisano ovde, i VL okvir koji ima LC okvirne regione 1, 2 i 3 iz sekvence, ili imaju ne više od 5, 10, ili 15 razlika iz, sekvence germlinijskog varijabilnog regiona VL lanca. U jednom rešenju, varijabilni region 4 je humana konsenzusna sekvenca; i

- anti-VLA-4 VH lanac opisan ovde, npr., anti-VLA-4 VL lanac koji ima CDRs iz donora anti-VLA-4 antitela, npr., anti-VLA-4 antitelo opisano ovde, i VL okvir koji ima LC okvirne regione 1, 2 i 3 iz sekvence, ili ima ne više od 5, 10 ili 15 razlika iz, sekvence germlinijskog varijabilnog regiona VL lanca. U jednom rešenju, varijabilni region 4 je humana konsenzusna sekvenca.

[0026] U jednom rešenju, antitelo vezuje jedan ili oba Įȕ1 i Įȕ7.

[0027] U drugom aspektu, VL ili VH lanac, ili antitelo, ili njegov fragment, opisan ovde je primetno označeno.

[0028] U još jednom aspektu, pronalazak karakteriše vektor koji sadrži DNK koja kodira antitelo teškog lanca, ili njegov Į4 vezujući fragment, koji je opisan ovde. U nekim rešenjima, DNK vektora kodira VH koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 5.

[0029] U još jednom aspektu, pronalazak karakteriše vektor koji sadrži DNK koja kodira antitelo lakog lanca, ili njegov Į4 vezujući fragment, koji je opisan ovde. U nekim rešenjima, DNK vektora kodira VL lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11.

[0030] U još jednom aspektu, pronalazak karakteriše vektor koji sadrži DNK koja kodira antitelo teškog lanca, ili njegov Į4 vezujući fragment, koji je opisan ovde i antitelo lakog lanca, ili njegov Į4 vezujući fragment, koji je opisan ovde.

[0031] U drugom aspektu, pronalazak karakteriše ćelije domaćina koja sadrži vektore opisane ovde, npr., jedan sposoban da iskazuje teški i/ili laki lanac antitela ili fragment antitela opisan ovde.

[0032] U jednom aspektu, pronalazak karakteriše postupak dobijanja rekombinantnog anti-Į4 antitela, ili njegovog Į4-vezujućeg fragmenta, obezbeđujući ćeliju domaćina transfektovanu sa (a) DNK sekvence koja kodira antitela teškog lanca opisana ovde, ili njegov Į4-vezujući fragment, i (b) DNK sekvence koja kodira antitela lakog lanca, ili njegov Į4-vezujući fragment, i kultivisanje transfektovane ćelije kako bi se dobio rekombinantni molekul anti-Į4 antitela ili njegov Į4 vezujući fragment. DNK koja kodira antitelo teških i lakih lanaca može biti dobijeno na istom vektoru ili različitim vektorima.

[0033] U jednom aspektu, pronalazak karakteriše postupak dobijanja rekombinantnog anti-Į4 antitela, ili njegovog Į4-vezujućeg fragmenta, obezbeđujući ćeliju domaćina transfektovana sa (a) DNK sekvence koja kodira antitelo teškog lanca, ili njegov Į4-vezujući fragment, npr., gde DNK sekvenca ima sekvence SEQ ID NOs: 3, 4, ili 5, i (b) DNK sekvence koja kodira antitelo lakog lanca, ili njegov Į4-vezujući fragment, npr., gde DNK sekvenca ima sekvence SEQ ID NOs: 8, 9, 10, ili 11, i kultivisanje transfektovane ćelijske linije kako bi se dobio rekombinantni molekul anti-Į4 antitela ili njegov Į4 vezujući fragment. DNK koja kodira antitela teških i lakih lanaca može biti dobijena na istom vektoru ili na različitim vektorima.

[0034] U drugom aspektu, pronalazak karakteriše postupak tretiranja oboljenja ili poremećaja posredovani sa Į4 integrinom, npr., Įȕ1 (VLA-4) ili Įȕ7 integrin, primenom Į4 antitela ili fragmenta antitela koji su opisani ovde, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo ili fragment, na subjekat kome je potrebno takvo lečenje. Subjekat može imati ili može biti pod rizikom za razvoj, na primer, inflamacionih, imunih, ili autoimunih poremećaja (npr., zapaljenje centralnog nervnog sistema, kao što je multipla skleroza, meningitis, neuromielitis optika, neurosarkoidoza, CNS vaskulitis, encefalitis, i transversni mielitis), graft reakcija tkiva ili organa ili graft-versus-host oboljenje, akutna CNS povreda, kao što je moždani udar, traumatična povreda mozga (TBI), ili povreda kičmene moždine (SCI); hronično renalno obolenje; alergija, npr., alergijska astma; tip 1 diabetes melitus; inflamatorni poremećaji creva, kao što je Crohn’s bolest, ulcerativni kolitis; miastenia gravis; fibromialgia; artritični poremećaji, kao što je reumatoidni artritis, psoriatični artritis; inflamatorni/imuni poremećaji kože, kao što je psorijaza, vitiligo, dermatitis, lišaj planus; sistemski lupus eritematozus; Sjogren’s Sindrom; hematološki kancer, kao što je multiple mijeloma, leukemija, limfoma; čvrsti kanceri, kao što su sarkoma ili karcinomi, npr., pluća, grudi, prostate, mozga; i fibrotični poremećaji, kao što je pulmonarna fibroza, mijelofibroza, cirkoza jetre, mesangialni proliferativni glomerulonefritis, crescentični glomerulonefritis, dijabetična nefropatija, i renalna intersticijalna fibroza.

[0035] U drugom aspektu, pronalazak karakteriše postupak lečenja pacijenta primenom na pacijenta Į4-vezujuće antitelo ili fragment antitela. U jednom rešenju, pacijent ima kancer, kao što je čvrsti tumor ili hematološka malignost. Na primer, pacijent tretiran sa Į4-vezujućim antitelom ili fragmentom antitela može imati akutnu mijeloidnu leukemiju (AML) ili multipli mijeloma (MM).

[0036] U drugom rešenju, pacijent koji ima inflamatorno obolenje, kao što je multipla skleroza, astma (npr., umerena do ozbiljna astma), reumatoidni artritis, diabetes, ili Crohnova bolest. U drugom rešenju, kompozicija se primenjuje kao režim. U još jednom rešenju, postupak dalje obuhvata odabir pacijenta pogodnog za lečenje sa kompozicijom. Pacijent pogodan za lečenje, na primer, je pokazao znak ili simptom koji ukazuje na pojavu bolesti, kao što je znak ili simptom koji ukazuje na MS.

[0037] U još jednom rešenju, postupak dalje obuhvata primenu na pacijenta drugog terapeutskog agensa, kao što je, hemoterapeutski agens, trombolitički agens, neuroprotektivni agens, anti-inflamatorni agens, steroid, citokin, ili faktor rasta.

[0038] U jednom rešenju, pacijentu se daje humanizovano anti-VLA-4 antitelo, ili njegov fragment, opisan ovde, kao što je HuHP1/2, H1L1, H1L2 ili H1L3.

[0039] U jednom rešenju, kompozicija koja sadrži Į4-vezujuće antitelo se primenjuje kao režim, kao što su regularni intervali. Na primer, kompozicija se može primenjivati jednom dnevno, nedeljno ili mesečno; jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili više; ili jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje ili više.

[0040] U jednom rešenju, doziranje može biti podešeno prema pacijentovom stepenu jasnoće pre primene anti- Į4 antitela. Na primer, u jednom rešenju, pacijentu se neće davati druga ili prateća doza pre nego što nivo anti-Į4 antitela u sistemu pacijenta nespadne ispod nivoa koji je prethodno određen. U jednom rešenju, uzorak iz pacijenta (npr. uzorak plazme, seruma, krvi ili urina) se analizira na prisustvo anti-Į4 antitela, i ako je nivo anti-Į4 antitela iznad nivo koji je prethodno određen, pacijent neće dobiti drugu ili sledeću dozu. Ako je nivo anti-Į4 antitela u sistemu pacijenta ispod prethodno određenog nivoa, onda se pacijentu daje druga ili sledeća doza.

[0041] U jednom rešenju, kompozicija se primenjuje kontinuirano, npr., tokom perioda od 30 minuta ali manje od 1, 2, 4, ili 12 sati. Kompozicija koja sadrži antitelo i drugi agens se može primeniti bilo kojim odgovarajućim metodama, npr., potkožno, intramuskularno, ili intravenozno.

[0042] U nekim rešenjima, svako antitelo i drugi agens se primenjuje u istoj dozi koja je prepisana za monoterapiju. U drugim rešenjima, antitelo se primenjuje pri dozi koja je jednaka ili manja od količine koja je potrebna za efikasnost ako se primenjuje sam. Isto tako, drugi agens se može primenjivati pri dozi koja je jednaka ili manja nego količina potrebna za efikasnost ako se primenjuje samo.

[0043] Drugi aspekt okarakterisan u opisu je postupak procene pacijenta utvrđivanjem da li pacijent ispunjava neophodne kriterijume, i da li pacijent ispunjava potrebne kriterijume odobravanja, obezbeđivanja, prepisivanja, ili primene formulacije VLA-4 vezujućeg antitela opisanog ovde na pacijenta. U jednom rešenju, prethodno odabrani kriterijum jeste neuspeh pacijenta da adekvatno odgovori na prethodno alternativno terapeutsko lečenje ili režim, npr., za lečenje MS. U drugom rešenju, prethodno odabrani kriterijum jeste odsustvo bilo kojih znakova ili simptoma progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), ili odsustvo bilo koje dijagnoze za PML. U nekim slučajevima, odabir je zasnovan na odsustvu faktora rizika za PML, na primer, subjekat nije testiran pozitivno na JC virus DNK ili nije testiran pozitivno na JC virus antitela. U drugom rešenju, kriterijum je kao što je opisano u PCT/US07/75577 (objavljeno kao WO 2008/021954), koji opisuje postupke i sisteme za distribuciju leka i za obezbeđivanje lekova pacijentima.

[0044] U drugom aspektu, obezbeđen je postupak distribucije kompozicije opisane ovde. Kompozicija koja sadrži alfa-4 vezujuće antitelo. Postupak obuhvata obezbeđivanje recipijenta (npr., krajnji korisnik, pacijent, lekar, maloprodajna ili veleprodajna apoteka, distributor, ili faramecutsko odeljenje u bolnici, domu za stare, klinici ili HMO) sa paketom koji sadrži dovoljno jedinica doza leka kako bi se pacijent lečio za najmanje 6, 12, 24, 36, ili 48 meseci. U drugom aspektu, pronalazak sadrži postupak procene kvaliteta pakovanja ili mnogo pakovanja (npr., kako bi se odredilo da li je istekao) kompozicije opisane ovde koja sadrži alfa-4 vezujuće antitelo. Postupak obuhvata procenu da li je pakovanje isteklo. Datum isticanja je najmanje 6, 12, 24, 36, ili 48 meseci, npr., više od 24 ili 36 meseca, iz prethodno odabranog događaja, kao što je proizvodnja, testiranje, ili pakovanje. U nekim rešenjima, odluka ili korak je preuzet kao rezultat analize. Na primer, u zavisnosti od prave analize, antitelo u pakovanju je korišćeno ili odbačeno, klasifikovano, odabrano, oslobođeno ili zadržano, slano, premešteno na novu lokaciju, pušteno u promet, prodato, ili nuđeno za prodaju, povučeno iz prodaje ili se više ne nudi u prodaji, u zavisnosti od toga da li je proizvod istekao.

[0045] U drugom aspektu, otkriće sadrži pakovanje koje sadrži najmanje dve dozne jedinice vodene kompozicije koja sadrži Į4 vezujuće antitelo. U jednom rešenju, sve dozne jedinice sadrže istu količinu antitela, i u drugim rešenjima postoje dozne jedinice dve ili više jačina, ili dve ili više različitih formulacija, npr., koje imaju različite jačine ili oslobađajuća svojstva.

[0046] U drugom aspektu, otkriće obuhvata postupak davanja instrukcije primaocu na primenu formulacije koja sadrži Į4 vezujuće antitelo. Postupak obuhvata davanje instrukcije primaocu (npr., krajnjeg korisnika, pacijenta, lekara, prodavca ili veleprodajnog farmaceuta, distributora, ili odeljenje farmacije u bolnici, staračkom domu, klinici ili HMO) da antitela treba da se primenjuje na pacijenta prema režimu opisanom ovde. Postupak takođe može obuhvatati instrukcije primaocu da antitelo treba da se primenjuje pre isteka datuma. Datum isticanja je najmanje 6, 12, 24, 36, ili 48 meseci, npr., više od 24 ili 36 meseca, iz prethodno odabranog događaja, kao što je proizvodnja, testiranje, ili pakovanje. U jednom rešenju, primaoc takođe prima ponudu antitela, npr., ponudu doznih jedinica antitela.

[0047] U drugom aspektu, otkriće prikazuje postupak pravljenja antitela koje sadrži CDRs iz donora antitela, kao što je ne-humano, npr., murine antitelo, i jedan ili oba teški i laki lanac varijabilnog regiona okvira izvedenog iz humanog germlinijskog varijabilnog regiona okvira regiona ili regiona. Postupak obuhvata jedan ili više od 1 i 2, gde 1 i 2 su kao što sledi:

1. identifikovanje ili odabir stabilnog humanog akceptora teškog lanca varijabilnog okvira koji ima iste ostatke kao ne-humani donor teškog lanca na jednom ili više ostataka u jednom ili više a), b) i c):

a) VH Kabat # 2, 4, 24, 26, 27, 29, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 78, 93, i 94, gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je važno za održavanje CDR konformacije; b) VH Kabat # 1, 2, 27, 28, 30, 43, 66, 68, 70, 72, 73, 74, i 75 gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je u mogućnosti da međusobno reaguje sa antigenom; i c) VH Kabat # 37, 39, 44, 45, 47, 91, 93 i 103, gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je važan za VH/VL pristupni integritet; i

2. identifikovanje ili odabir stabilnog akceptora lakog lanca varijabilnog okvira koji ima iste ostatke kao donor lakog lanca na jednom ili više ostataka u jednom ili više a), b) i c):

a) VL Kabat # 2, 4, 38, 43, 44, 48, 58, 64, 71, i 73, gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je važan za održavanje CDR konformacija;

b) VL Kabat # 1, 2, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 68, 69, i 70 gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je potencijalno u mogućnosti da međusobno reaguje sa antigenom; i c) VL Kabat # 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87, i 98, gde, bez teorije vezivanja, se veruje da je važan za VH/VL pristupni integritet;

3. obezbeđivanje varijabilnog regiona koji ima donora CDRs i odabir germline okvira koji ima upoređene ostatke identifikovane u 1 ili 2, kao što je odabir germlinijske sekvence i druge dodatne ostatke pozadinske mutacije identifikovani u 1 ili 2 germliniske u murine sekvencu tako da dalje maksimizira upoređivanje na ostacima identifikovani u 1 i 2; i

4. procena svake upoređene pozicije, kao što je sa 3D strukturnom analizom ili modelovanjem, i ako pozicija ispunjava prethodno određene standarde za rizik, na primer, posredovanjem sa CDR konformacijama, antigenske interakcije ili VH/VL pristupni integritet, onda ponovo uvođenje ekvivalentnog murine ostatka, ili uobičajenog humanog ostatka antitela, upoređivan sa strukturnim antitelom.

U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani pod (1.a) su upoređivani. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 24, 29, ili 94 su upoređeni.

[0048] U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani u (1.b) se slažu. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 1, 73, ili 75 se slažu.

[0049] U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani u (1.c) se slažu. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 37, 93, ili 103 se slažu.

[0050] U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani u (2.a) se slažu. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 2, 71 i 73 se slažu.

[0051] U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani u (2.b) se slažu. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 1, 68, ili 70 se slažu.

[0052] U jednom rešenju, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovani u (2.c) se slažu. Na primer, u jednom rešenju, ostaci 46, 87, ili 98 se slažu.

[0053] U jednom rešenju, ostatak 6 u (1.a), ostatak 2 u (1.b), i ostatak 4 u (1.c) se slažu.

[0054] U drugom rešenju, ostatak 4 u (2.a), ostatak 2 u (2.b), i ostatak 4 u (2.c) se slažu.

[0055] U jednom rešenju, germlinijska sekvenca teškog lanca je VH3, VH1 i VH5 germlinijske klase. U drugom rešenju, germlinijska sekvenca lakog lanca je Vkapa ili Vlambda sekvenca.

[0056] Termin "lečenje" se odnosi na primenu terapije u količini, načinu, i/ili modu efikasnosti kako bi se poboljšalo stanje, simptomi, ili parametri povezani sa poremećajem ili kako bi se sprečilo napredovanje pormećaja, prema ili statističkom značajnom stepenu ili stepenu detektovanom od strane stručnog lica u tehnici. Efikasna količina, način, ili režim mogu jako zavisiti od subjekta i mogu biti prilagođena subjektu.

[0057] Į4 vezujuće antitelo" se odnosi na antitelo koje se vezuje za Į4 podjedinicu VLA-4 Įȕ1) integrina, i bar delimično inhibira aktivnost VLA-4, naročito vezujuću aktivnost VLA-4 integrina ili signalnu aktivnost, npr., sposobnost da transdukuje VLA-4 posredovani signal. Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može inhibirati vezujući VLA-4 za kognatni ligand VLA-4, npr., ćelijski površinski protein kao što je VCAM-1 (Vaskularni ûlijski Adhezioni Molekul -1), ili za komponentu ekstraćelijskog matriksa, kao što je fibronectin ili osteopontin. Alfa-4 vezujuće antitelo može se vezati za oba Įȕ1 ili Įȕ7. Obično, antitelo se vezuje za B1 epitop Į4. Į4 vezujuće antitelo može se vezati za VLA-4 sa Kd manjim od oko 10-6, 10-7, 10-1, 10-9, 10-10, ili 10-11 M.

[0058] Kao što je korišćeno ovde, termin "antitelo" se odnosi na protein koji obuhvata najmanje jedan varijabilni region imunoglobulina, npr., amino kiselinsku sekvencu koja obezbeđuje varijabilni domen imunoglobulina ili sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina. Na primer, antitelo može obuhvatiti teški (H) lanac varijabilnog regiona (skraćenica ovde kao VH), i laki (L) lanac varijabilnog regiona (skraćenica ovde kao VL). U drugom primeru, antitelo obuhvata dva teška (H) lanca varijabilnih regiona i dva laka (L) lanca varijabilnih regiona. Laki lanci imunoglobulina mogu biti tipa kapa ili lambda. U jednom rešenju, antitelo je glikolizovano. Antitelo može biti funkcionalno za antitelo u zavisnosti od citotoksičnosti i/ili dopunsko posredovane citotoksičnosti, ili može biti nefunkcionalno za jednu ili obe ove aktivnosti.

[0059] VH i VL regioni mogu dalje da budu dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvani "komplementarni određeni regioni" ("CDR"), premešteni sa regiona koji su više čuvani, nazvani "okvirni regioni" (FR). Obim FRs i CDRs je tačno definisan (videti, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917). Kabat definicije su korišćene ovde. Svaka VH i VL je obično sačinjena od tri CDRs i četiri FRs, postavljene od amino-kraja do karboksil-kraja sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0060] "Imunoglobulinski domen" se odnosi na domen iz varijabilnog ili konstantnog domena imunoglobulinskih molekula. Imunoglobulinski domeni obično sadrže dva ȕ-lista obrazovani od oko sedam ȕ-oblasti, i sačuvanu disulfidnu vezu (videti, npr., A. F. Williams and A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol.6:381-405).

[0061] Kao što je korišćeno ovde, "imunoglobulinska sekvenca varijabilnog domena" se odnosi na amino kiselinsku sekvencu koja može obrazovati strukturu varijabilnog domena imunoglobulina. Na primer, sekvenca može obuhvatiti sve ili deo amino kiselinske sekvence varijabilnog domena koji se javlja u prirodi. Na primer, sekvenca može izostaviti jednu, dve ili više N- ili C-terminalnih amino kiselina, internih amino kiselina, može obuhvatiti jedno ili više ubacivanja ili dodatnih terminalnih amino kiselina, ili može obuhvatati druge alternative. U jednom rešenju, polipeptid koji obuhvata imunoglobulinsku sekvencu varijabilnog domena može se vezati za drugu imunoglobulinsku sekvencu varijabilnog domena kako bi obrazovala ciljanu vezujuću strukturu (ili "vezujuće mesto antigena"), npr., struktura koja međusobno reaguje sa VLA-4.

[0062] VH ili VL lanac antitela može dalje da obuhvati sve ili deo teškog ili lakog lanca konstantnog regiona, da bi se time formirao teški ili laki imunoglobulinski lanac, respektivno. U jednom rešenju, antitelo je tetramer dva teška imunoglobulinska lanca i dva laka imunoglobulinska lanca. Teški i laki imunoglobulinski lanci mogu biti spojeni sa disulfidnim vezama. Konstantni region teškog lanca obično obuhvata tri konstantna domena, CH1, CH2 i CH3. Konstantni region lakog lanca obično obuhvata CL domen. Varijabilni region teškog i lakog lanca sadrži vezujući domen koji uzajamno deluje sa antigenom. Konstantni regioni antitela obično posreduju vezujuće antitelo tkiva domaćina ili faktore, uključujući razne ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog komplementnog sistema.

[0063] Termin "imunoglobulin" obuhvata razne široke klase polipeptida koji mogu da budu razlikovani biohemijski. Oni obučeni u tehnici će ceniti da su teški lanci klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon (Ȗ, m, Į, į, İ) sa nekim podklasama među njima (npr., Ȗ1-Ȗ4). Priroda ovog lanca jeste da se odredi "klasa" antitela kao IgG, IgM, IgA IgD, ili IgE, respektivno. Imunoglobulinske podklase (izotipi) npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. su dobro okarakterisane i poznato je da dodeljuju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake ove klase i izotopa su lako prepoznatljivi od strane stručnjaka u pogledu trenutnog otkrića i, prema tome, su u okviru obima trenutnog pronalaska. Sve imunoglobulinske klase su jasno unutar obima predmetnog pronalaska. Laki lanci su klasifikovani kao ili kapa ili lambda (ț, Ȝ). Svaka klasa teškog lanca može biti vezana sa ili kapa ili lambda lakim lancom.

[0064] Termin "antigen-vezujući fragment" pune dužine antitela se odnosi na jedan ili više fragmenata anititela pune dužine koji zadržava sposobnost da se posebno veže za ciljani interes, npr., VLA-4. Primer vezujućih fragmenata obuhvaćen u okviru termina "antigenvezujući fragment" pune dužine antitela obuhvata (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, bivalentni fragment koji obuhvata dva Fab fragmenta povezana sa disulfidnim mostom na zavisnoj regiji; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednostruke osnove antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovani komplementarni određeni region (CDR) koji zadržava funkcionalnost. Dalje, iako dva domena Fv fragment, VL i VH, su kodirani sa odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih metoda, sa sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao singl proteinski lanac gde se VL i VH regioni spajaju kako bi se obrazovali monovalentni molekuli poznati kao pojedinačni lanac Fv (scFv). Videti npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

[0065] U nekim rešenjima, prethodno opisana antitela su pegilirana.

[0066] U nekim rešenjima, prethodno opisana antitela ili njihovi fragmenti su multispecifični. U drugim rešenjima, prethodno opisana antitela ili njihovi fragmenti su monovalenti ili bispecifični.

[0067] Detalji jednog ili više rešenja pronalaska su izloženi u priloženim crtežima i opisu u nastavku. Druge karakteristike, ciljevi, i prednosti pronalaska će biti očigledni iz opisa i crteža, i iz zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0068]

FIG.1 prikazuje tri sekvencne varijante HP1/2 teškog lanca za humani teški germlinijski IGHV1-f. Donja slova iznad sekvence predstavljaju ubacivanja prema šemi Kabat brojanja. FIG.2 prikazuje četiri varijante sekvence HP1/2 lakog lanca za germlinijske sekvence IGKV4-1 antitela (Design L0, L1, i L2) ili humanog kapa germlinijske sekvence planiranog AAH7033.1 antitela (Design L3). Niža slova iznad sekvence predstavljaju ubacivanja prema šemi Kabat brojanje.

FIG.3 je grafikon koji pokazuje rezultate ELISA analize.

FIG.4 je grafikon koji pokazuje rezultate ELISA analize.

FIG.5 je amino kiselinska sekvenca IgG4 Fc (zavisni CH2 CH3 domen). Zavisna regija je prikazana u tamno, a CH3 domena je podvučena. Označen "S" je Ser228. Kružni "N" je Asn297.

FIG.6 je grafikon koji pokazuje protok citrometrijskog podatka iz vezujućeg HuHP1/2 do raznih tumor ćelijskih linija. "HP1/2" se odnosi na humanizovano HP1/2.

FIGs.7A-7C je panel grafikona koji prikazuju inhibiciju vezujućih AML ćelijskih linija na fibronectin ili VCAM1-Ig presvučeni bunarčLći sa HuHP1/2. FIG.7A prikazuje inhibiciju vezujućeg HL60 i KG1 ćelija do FN-presvučeni zidovi. FIG.7B prikazuje inhibiciju vezujućih KG1 ćelija do VCAM1-Ig-presvučenih bunarčLća. FIG.7C prikazuje inhibiciju vezujućih HL60 ćelija do FN- i VCAM1-Ig-presvučenih bunarčLća kada se inkubira sa 20 mg/mL HuHP1/2 čvrste trake). Jasne trake ukazuju na procnata ćelijske adhezije u prisustvu kontrolnog izotipa. "HP1/2" odnosi se na humanizovani HP1/2.

FIGs.8A-8C čini panel grafikona koji pokazuju inhibiciju vezujućih MM ćelijskih linija za fibronectin ili VCAM1-Ig presvučeni bunarčLći sa HuHP1/2. FIG.8A prikazuje inhibiciju vezujućih U266 i H929 ćelija za FN-presvučene bunarčLće. FIG.8B prikazuje inhibiciju vezujućih U266 i H929 ćelija za VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće. FIG.8C prikazuje inhibiciju vezujućih U266 ćelija za FN- i VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće kada se inkubira sa 20 mg/mL HuHP1/2 (pune trake). Jasne trake ukazuju procenat ćelijske adhezije u prisustvu kontrolnog izotipa. "HP1/2" se odnosi na humanizovani HP1/2.

FIGs.9A-9C čini panel grafikona koji pokazuju inhibiciju vezujućih CLL ćelijskih linija za fibronectin ili VCAM1-Ig presvučeni bunarčLći sa HuHP1/2. FIG.9A prikazuje inhibiciju vezujućih Mec1 i JM1 ćelija za FN-presvučene bunarčLće. FIG.9B prikazuje inhibiciju vezujućih Mec1 i JM1 ćelija za VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće. FIG.9C prikazuje inhibiciju vezujućih Mec1 ćelija za FN- i VCAM1-Ig- presvučene bunarčLće kada se inkubira sa 20 mg/mL HuHP1/2 (pune treake). Jasne trake ukazuju procenat ćelijske adhezije u prisustvu kontrolnog izotipa. "HP1/2" se odnosi na humanizovani HP1/2.

DETALJAN OPIS

[0069] Antitela protiv VLA-4 su prikazala da su korisni u lečenju obolenja. Na primer, natalizumab (Tysabri®), anti-VLA-4 antitelo je korišćen za lečenje recidivne multipla skleroze i Crohn-ove bolesti. Međutim, za lečenje izvesnih stanja, na primer akutnih stanja kao što je povreda kičmene moždine (SCI) ili traumatska povreda mozga (TBI), ili lečenja koja se primenjuju u konačan broj kao što je lečenje kancera, može biti prednost za lečenje sa anti-VLA-4 antitelom koje se vezuje sa afinitetom drugačijim od natalizumab, npr., viši afinitet. Dodatno, lečenje sa anti-VLA-4 antitelima je povezano sa retkim ali ponekad fatalnim poremećajem, progresivna multifokalna leukocefalopatija (PML), za koje deo lečenja zahteva uklanjanje antitela iz subjekta koji se leči, na primer korišćenjem plazma zamene ili imunoapsorpcije. Zbog potrebe da se ukloni antitelo, takođe je poželjno da se balansira prednost antitela koje ima povećani afinitet za VLA-4 sa nedostatkom antitela koje se vezuje toliko kako bi uklanjanje učinio što težim ili obrazovao rizik povezan sa sporom ocenom preokreta. Takva antitela mogu takođe biti korisna za lečenje stanja kao što je multipla skleroza tako da manje učestalo lečenje može biti potrebno ili primena sredstvima osim infuzijom može biti mnogo efikasnija. Omogućavanje lečenja sa nižom dozom može takođe da snizi rizik suprotnih događaja kao što je PML. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja imaju takve željene osobine.

[0070] Pronalazak je zasnovan na bar delu neočekivanih karakteristika novih konstruisanih humanizovanih Į4-vezujućih antitela koja imaju vezujući afinitet za Į4 koji je veći za 10-preklopa nego ona anti-Į4 antitela natalizumaba.

[0071] Alfa-4 vezujuća antitela, i njihovi fragmenti, su obezbeđeni kada okviri varijabilnog lakog lanca (VL) i varijabilnog teškog lanca (VH) imaju akceptorske sekvence konstruisane iz germlinijskih ili germlinijskih polaniranih sekvenci antitela, kao što je IGKV4-1 ili geAAH70335.1 ili IGHV1-f antitela. CDR sekvence su izvedene iz nehumanih anti-Į4 vezujućih antitela kao što je anti-VLA-4 antitelo HP1/2. Antitela opisana ovde mogu imati povećanje od najmanje 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 preklopa na afinitet, npr., relativno na njegov matični murine. U jednom rešenju, povećanje afiniteta je najmanje 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 preklop ali je respektivno, manji od 25, 20, ili 15 preklop.

Farmaceutske kompozicije

[0072] Į4 vezujući agens, kao što je VLA-4 vezujuće antitelo, može biti formulisano kao farmaceutska kompozicija. Obično, farmaceutska kompozicija obuhvata farmaceutski prihvatljivi nosač. Kao što je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljivi nosač" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzioni medijum, presvlačenje, antibakterijske i anti fugalne, izotonične i absorpcione agensa sa odlaganjem, i slično da su fiziološki kompatibilni.

[0073] "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu bilošku aktivnost srodnog jedinjenja i ne prenosi bilo koje neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci.66:1-19). Primeri takvih soli obuhvataju kiselinske adicione soli i bazne adicione soli. Kiselinske adicione soli obuhvataju one izvedene iz neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil supstituisane alkalne kiseline, hidroksi alkalne kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli obuhvataju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što je natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N’-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilenediamin, prokain i slično.

[0074] Kompozicije antitela koje su opisane ovde mogu biti formulisane prema postupcima poznatim iz tehnike. Farmaceutska formulacija je dobro ustanovljena tehnika, i dodatno je opisana u Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); i Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3. izdanje. (2000) (ISBN: 091733096X).

[0075] U jednom rešenju, Į4 antitelo može biti formulisano sa pomoćnim materijalima, kao što je natrijum hlorid, natrijum dibazni fosfat hepahidrat, natrijum monobazni fosfat, i polisorbat 80. U jednom rešenju, Į4 antitelo može biti formulisano u citratni pufer, npr., pri pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, ili 7.5. U još jednom rešenju, Į4 antitelo može biti formulisano u rastvor koji sadrži 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, ili 15 % sukroze. Može biti obezbeđen, na primer, u pufernom rastvoru pri koncentraciji od oko 20 mg/ml i može biti čuvano na 2-8°C.

[0076] Farmaceutske kompozicije mogu takođe da budu u raznim drugim oblicima. Ovo obuhvata, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr., ubrizgavajući i infuzijski rastvori), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitoriji. Oblik može zavisiti od namenskog načina primene i terapeutske primene.

Obično, kompozicije za agense koji su ovde opisani su u obliku ubrizgavajućih ili infuzijskih rastvora.

[0077] Takve kompozicije mogu biti primenjivane sa parenteralnim načinom (npr., intravenozno, potkožno, intraperitonealno, ili intramuskularno ubrizgavanje). Fraze "parenteralna primena" i "primenjuje se parenteralno" kao što je ovde korišćeno označava načine primene osim enteralne i topične primene, obično ubrizgavanjem, i obuhvata, bez ograničenja, intravenozno, intramuskularno, intraarterialno, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardialno, intradermalno, intraperitonealno, transtrahealno, potkožno, subkutikularno, intraartikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, epiduralno i intrasternalno ubrizgavanje i infuzija.

[0078] Farmaceutske kompozicije obično moraju da budu sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i čuvanja. Farmaceutska kompozicija takođe može biti testirana kako bi se osiguralo da ipunjava regulacione i industrijske standarde za primenu.

[0079] Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom, ili druge uređene strukture pogodne za visoke koncentracije leka. Sterilni ubrizgavajući rastvori mogu da budu dobijeni inkorporiranjem agensa koji je ovde opisan u potrebnoj količini u odgovrajaućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka koje su ovde navedene, kao što je potrebno, praćeno filtracionom sterilizacijom. Uopšteno, disperzije su dobijene inkorporiranjem agensa koji je ovde opisan u sterilnu posudu koja sadrži bazni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz onih koje su ovde navedene. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih ubrizgavajućih rastvora, obični postupci dobijanja su vakuum sušenje i sušenje zamrzavanjem koji daje prah agensa opisanog ovde plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog njegovog rastvora. Odgovarajuća tečnost rastvora može biti održavana, na primer, primenom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzije i primenom površinski aktivnih supstanci.

Prolongirana absorpcija ubrizgavajućih kompozicija može se dovesti uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže absorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.

Primena

[0080] Į4 vezujuće antitelo se može primenjivati na subjekta, npr., ljudskog subjekta, raznim metodama. Za mnoge primene, način primene je jedan: intravenozno ubrizgavanje ili infuzija, potkožno ubrizgavanje, ili intramuskularno ubrizgavanje. Į4 vezujuće antitelo se može primenjivati kao fiksna doza, ili u mg/kg doze. Antitelo se može primenjivati intravenozno (IV) ili potkožno (SC). Na primer, antitelo se može primenjivati pri fiksnoj doznoj jedinici između 50-600 mg IV, npr., svake 4 nedelje, ili između oko 50-100 mg SC (npr., 75 mg), npr., bar jednom nedeljno (npr., dva puta nedeljno). U jednom rešenju, antitelo se primenjuje IV pri fiksnoj doznoj jedinici od 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, ili 600 mg ili više. Primena IV doze može biti jednom ili dva puta ili tri puta nedeljno, ili jednom svake sve, tri, četiri, ili pet nedelja, ili manje učestalo.

[0081] U jednom rešenju, antitelo se primenjuje SC fiksnoj doznoj jedinici od 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg, ili 120 mg ili više. Primena SC doze može biti jednom ili dva puta ili tri puta ili više po nedelji, ili jednom svake dve, tri, četiri, ili pet nedelja, ili manje Xčestalo.

[0082] Anti-Į4 antitelo se takođe može primenjivati u bolusu pri dozi između oko 1 i 10 mg/kg, npr., oko 6.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 1.0 mg/kg. Modifikovani dozni režim obuhvata dozu koja je manja od oko 600 mg/subjektu, oko 400 mg/subjektu, oko 300 mg/subjektu, oko 250 mg/subjektu, oko 200 mg/subjekt, ili oko 150 mg/subjektu, obično za primenu svake četiri nedelje ili jednom mesečno. Į4 vezujuće antitelo se može primenjivati, na primer, svake tri do pet nedelja, npr., svake četiri nedelje, ili mesečno.

[0083] Doziranje može biti podešeno prema pacijentovom stepenu jasnoče pre primene anti-Į4 antitela. Na primer, pacijent ne mora da primi drugu ili prateću dozu pre nego što nivo anti-Į4 antibodies u pacijentovom sistemu ne padne ispod prethodno određenog nivoa. U jednom rešenju, uzorak iz pacijenta (npr., plazma, serum, krv, urin, ili cerebrospinalna tečnost (CSF)) je analiziran na prisustvo anti-Į4 antitela, i ako je nivo anti-Į4 antitela iznad prethodno određenog nivoa, pacijent neće primiti drugu ili sledeću dozu. Ako je nivo anti-Į4 antitela u pacijentovom sistemu ispod prethodno određenog nivoa, onda se pacijentu daje druga ili sledeća prateća doza. Pacijent čiji anti-Į4 nivoi su određeni da su suviše visoki (iznad prethodno određenog nivoa) mogu se testirati ponovo posle jednog ili dva ili tri dana, ili nedelje, i ako je nivo anti-Į4-antitela u pacijentovom sistemu pao ispod prethodno određenog nivoa, pacijentu se može dati druga ili sledeća doza antitela.

[0084] Doza takođe može biti odabrana kako bi se smanjila ili izbegla proizvodnja antitela protiv Į4 vezujućeg antitela, kako bi se dostigla veća od 40, 50, 70, 75, ili 80% saturacije Į4 podjedinice, kako bi se dostigla manja od 80, 70, 60, 50, ili 40% saturacije Į4 podjedinice, ili da se spreči povećanje u nivou cirkulacije belih krvnih zrnaca.

[0085] U izvesnim rešenjima, aktivni agens se može dobiti sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je kontrolisana otpuštajuća formulacija, ukljućujući implante, i mikroenkapsulovani sistem dostave. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu se koristiti, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktonska kiselina. Mnogi postupci za dobijanje takvih formulacija su patentirani ili opšte poznati. Videti, npr., Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Second Edition, J. Robinson and V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1987.

[0086] Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjivane sa medicinskim uređajem. Na primer, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati sa hipodermičnim ubrizgavajućim uređajem bez igle. Na primer, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati sa hipodermičkim ubrizgavajućim uređajem bez igle, kao što su uređaji opisani u U.S.

Patentima Br.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri opšte poznatih implanata i modula su otkriveni u, npr., U.S. Patent Br. 4,487,603, koji otkriva implantabnu mikro-infuzijsku pumpu za izdavanje leka pri kontrolisanoj brzini; U.S. Patent Br.4,486,194, koji otkriva terapeutski uređaj za primenu medikamenata kroz kožu; U.S. Patent Br.4,447,233, koji otkriva medicinsku infuzionu pumpu za dostavu leka pri tačnoj infuzionoj brzini; U.S. Patent Br.4,447,224, koji otkriva promenjive protočne implantabne infuzione aparate za kontinuiranu dostavu leka; U.S. Patent Br.4,439,196, koji otkriva osmotski sistem dostave leka koji ima multi-komorne pregrade; i U.S. Patent Br.4,475,196, koji otkriva osmotski sistem dostave leka. Naravno, mnogu drugi takvi implanti, dostavni sistemi, i moduli su takođe poznati.

[0087] Ovo otkriće takođe takođe opisuje i uređaj za primenu prvog i drugog agensa. Uređaj može obuhvatati, na primer, jedno ili više kućišta za čuvanje farmaceutskih preparata, i može biti konfigurisana da dostavi dozne jedinice prvog i drugog agensa. Prvi i drugi agensi mogu biti čuvani u istim ili odvojenim pregradama. Na primer, uređaj može kombinovati agense pre primene. Takođe je moguće da se koriste različiti uređaji za primenu prvog i drugog agensa.

[0088] Dozni režimi su podešeni kako bi obezbedili željeni odgovor, kao što je terapeutski odgovor ili kombinatorijski terapeutski efekat. Uopšteno, bilo koja kombinacija doze (ili separacija ili istovremeno formulisana) VLA-4 vezujućeg agensa i drugog agensa može biti korišćena u cilju da se obezbedi subjekat sa oba agensa u biodostupnim kvantitetima.

[0089] Dozni jedinični oblik ili "fiksna doza" kao što je korišćeno ovde se odnosi na fizički diskretne jedinice za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu kako bi se dobio željeni terapeutski efekat koji je povezan sa potrebnim farmaceutskim nosačem i opciono povezano sa drugim agensom.

[0090] Farmaceutska kompozicija može obuhvatati "terapeutski efikasnu količinu" agensa koji je ovde opisan. Tako efikasne količine se mogu odrediti na osnovu kombinatorne efikasnosti primene prvog i drugog agensa. Terapeutski efikasna količina agensa može takođe da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinca, kao što je emlioracija bar jednog poremećenog parametra, npr., parametar multipla skleroze, ili amelioracija bar jednog simptoma poremećaja, npr., simptom multipla skleroze, kao što je mišićna atrofija, ataksija, i tremori. Treapeutski efikasna količina je takođe jedna gde bilo koja toksičnost ili štetni efekat kompozicije je nadmašen sa terapeutskim korisnim efektima.

Ureÿaji i Oprema

[0091] Formulacije koje sadrže antitelo opisane ovde se mogu primenjivati sa medicinskim uređajem. Uređaj može biti konstruisan sa karakteristikama kao što je prenosivost, čuvanje na sobnoj temperaturi, i lakoća rukovanja tako da se može koristiti u hitnim situacijama, kao što je sa netretiranim subjektom ili sa osobljen za hitne slučajeve na terenu, pomeranjem do medicinskih ustanova i druge medicinske opreme. Uređaj može obuhvatati, na primer, jedno ili više kućišta za čuvanje farmaceutskih preparata koji sadrže Į4-vezujuće antitelo, i može biti konfigurisano da dostavi jednu ili više doznih jedinica agensa.

[0092] Na primer, farmaceutska kompozicija može biti primenjivana sa transkutaneoznim dostavnim uređajem, kao što je špric, uključujući hipodermski ili multikomorni špric. Drugi pogodni dostavni uređaji uključuju stentove, katetre, mikroigle, i imlantovane uređaje za kontrolno otpuštanje. Kompozicija se može primenjivati intravenozno sa standardnom IV opremom, koja uključuje, npr., IV postavljanje cevi, sa ili bez in-line filtera. U izvesnim rešenjima, uređaj će biti špric za primenu u SC ili IM primeni.

[0093] Farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati sa medicinskim uređajima. Na primer, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati sa hipodermičnim ubrizgavajućim uređajem bez igle, kao što je uređaj otkriven u U.S. Patentima Br.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri opšte poznatih implanata i modula su opisani u, npr., U.S. Patent Br.4,487,603, koji otkriva implantabnu mikroinfuzijsku pumpu za izdavanje leka pri kontrolisanoj brzini; U.S. Patent Br.4,486,194, koji otkriva terapeutski uređaj za primenu medikamenata kroz kožu; U.S. Patent Br.4,447,233, koji otkriva medicinsku infuzionu pumpu za dostavu leka pri tačnoj infuzionoj brzini; U.S. Patent Br.4,447,224, koji otkriva promenjive protočne implantabne infuzione aparate za kontinuiranu dostavu leka; U.S. Patent Br.4,439,196, koji otkriva osmotski sistem dostave leka koji ima multi-komorne pregrade; i U.S. Patent Br.4,475,196, koji otkriva osmotski sistem dostave leka. Naravno, mnogi drugi takvi implanti, dostavni sistemi, i moduli su takođe poznati. Terapeutska kompozicija takođe može biti u obliku biodegradabilne ili nebiodegradabilne formualcije uzdržanog otpuštanja za potkožnu ili intramuskularnu primenu. Postupci za takve kompozicije su poznati u tehnici. Kontinuirana primene se takođe može postići koriščenjem implantabilne ili eksterne pumpe. Primena takođe može biti sprovedena povremeno, kao što je sa pojedinačnim dnevnim ubrizgavanjem, ili kontinuirano pri niskoj dozi, kao što je u formulaciji sa suzdržanim otpuštanjem. Dostavni uređaj može biti modifikovan tako da bude optimalno podešen za primenu Į4-vezujućeg antitela. Na primer, špric može da bude silikonizovan u tolikoj meri da je optimalan za čuvanje i dostavu antitela. Naravno, mnogi drugi implanti, dostavni sistemi, i moduli su takođe poznati.

[0094] Ovo otkriće takođe opisuje uređaj za primenu prvog i drugog agensa (npr., antitelo i drugi agens). Ovaj uređaj takođe obuhvata, na primer, jedno ili više kućišta za čuvanje farmaceutskih preparata, i može da bude konfigurisan da dostavi jediničnu dozu prvog i drugog agensa. Prvi i drugi agensi mogu biti čuvani u istom ili različitom odeljku. U jednom rešenju, prvi i drugi agensi se primenjuju sa različitim uređajima.

[0095] Į4-vezujuće antitelo može biti dostupno u opremi. U jednom rešenju, oprema obuhvata (a) posudu koja sadrži kompoziciju koja uključuje visoku VLA-4-vezujućeg antitela, opciono (b) posudu koja sadrži kompoziciju koja obuhvata drugi agens, i opciono (c) informacioni materijal. Informacioni materijal može da bude opisan, instrukcioni, marketinški ili drugi materijal koji se odnosi na postupke koji su ovde opisani i/ili primenu agenasa za terapeutski benefit. U jednom rešenju, oprema takođe obuhvata drugi agens. Na primer, oprema obuhvata prvu posudu koja sadrži kompoziciju koja uključuje Į4-vezujuće antitelo, i druga posuda koja obuhvata drugi agens.

[0096] Informacioni materijal opreme nije ograničen na njegov oblik. U jednom rešenju, informacioni materijal može obuhvatati informaciju oko proizvoda antitela, koncentracije, datuma ekspiracije, informaciju o šaržnoj ili proizvodnom mestu informacije, i tako dalje. U jednom rešenju, informacioni materijal se odnosi na postupak primene Į4-vezujućeg antitela, npr., u pogodnoj dozi, dozni oblika, ili režim primene (npr., doza, dozni oblik, ili način primene koji je ovde opisan), kako bi se lečio subjekat koji ima akutni poremećaj kao što je povreda kičmene moždine ili traumatska povreda mozga, ili inflamatorno oboljenje (npr., MS), ili ko je pri riziku da oseti epozode povezane sa inflamotnim oboljenjem. Informacija se može obezbediti u različitim formatima, uključujući štampani tekst, kompjuterski čitajući materijal, video zapis, ili audio zapis, ili informaciju koja obezbeđuje link ili adresu suštinskog materijala.

[0097] U odnosu na agens, kompozicija u opremi može obuhvatati druge sastojke, kao što je rastvarač ili pufer, stabilizator, ili konzervans. Agens može biti obezbeđen u bilo kom obliku, npr., tečnom, osušenom ili liofilizovanom obliku, i značajno čisto i/ili sterilno. Kada su obezbeđeni agensi u tečnom rastvoru, tečni rastvor je obično u vodenom rastvoru. Kada su agensi obezbeđeni kao suva forma, rekonstitucija je uglavnom dodavanjem pogodnog rastvarača. Rastvarač, npr., sterilna voda ili pufer, opciono može biti obezbeđen u opremi.

[0098] Oprema može obuhvatati jedan ili više posuda za kompoziciju ili kompozicije koje sadrže agense. U nekim rešenjima, oprema sadrži odvojene posude, delitelje ili pregrade za kompoziciju i informacioni materijal. Na primer, kompozicija može da bude sadržana u bočici, posudi, ili špricu, a informacioni materijal može biti sadržan u plastičnom džepiću ili paketiću. U drugim rešenjima, odvojeni elementi opreme su sadržani unutar pojedinačne, nepodeljene posude. Na primer, kompozicija je sadržana u bočici, posudi ili špricu na koje je vezan informacioni materijal u obliku etikete. U nekim rešenjima, oprema sadrži više (npr., pakovanje) pojedinačnih posuda, svaka sadrži jedan ili više oblika doznih jedinica (npr., dozni oblik koji je ovde opisan) agenasa. Posude mogu obuhvatati kombinaciju jedinične doze, npr., jedinica koja obuhvata oba Į4 vezujuće antitelo i drugi agens, kao u željenom odnosu. Na primer, oprema može obuhvatati više špriceva, ampula, folijskih pakovanja, blister pakovanja, ili medicinske uređaje gde svaki sadrži, na primer, pojedinačnu jediničnu dozu kombinacije. Posude oprema mogu biti nepropusne, vodootporne (npr., nepropustive pri promenama vlažnosti ili isparenja), i/ili tanke.

[0099] Oprema opciono obuhvata uređaj pogodan za primenu kompozicije, npr., špric ili drugi pogodan dostavni uređaj. Uređaj može da bude obezbeđen pre punjenja sa jednim ili oba agensa ili može biti prazan ali pogodan za punjenje.

Onkologija

[0100] Į4-vezujuća antitela i postupci opisani ovde se mogu koristiti za lečenje kancera, uključujući čvrste kancere i hematološke malignitete. Primeri čvrstih kancera obuhvataju sarkomu i karcinome, kao što su pluća, dojki, pankreasa, debelog creva, prostate, bešike i mozga. Hematološki maligniteti obuhvataju kancere kao što su multipli mijelom, leukemija, i limfoma.

[0101] Postupci su obezbeđeni za lečenje pacijenta koji ima hematološki malignitet sa kompozicijom koja sadrži Į4-vezujuće antitelo, kao što je anti-VLA-4 antitelo opisano ovde. Hematološki maligniteti su kanceri sistema obrazovanja krvi u telu i imunog sistema. Kanceri ovog tipa zahvataju celo telo, koštanu srž, i/ili limfne čvorove. Hematološki maligniteti obuhvataju leukemije, kao što su akutna limfoblastična leukemija (ALL), akutna mijelogenozna leukemija (AML), hronična mijelogenozna leukemija (CML), hronična limfocitna leukemija (CLL), akutna promielocitična leukemija, akutna eritroleukemija, i leukemija ćelije dlake (HCL); limfome, kao što je Hodgkin-ova limfoma i Ne-Hodgkin-ova limfoma; i multipli mijelom; Waldenstrom-ova makroblobulinemija; mijelodisplastični sindrom (MDS) (koji može da kulminira u AML); mijeloproliferativno obolenje, kao što je policitemija vera (takođe nazvana PV, PCV ili policitemija rubra vera (PRV)), Essencijalna trombocitoza (ET), mijelofibroza, obolenje teškog lanca; i amiloid usled obolenja og lanca.

[0102] Pacijenti koji imaju hematološku malignost mogu biti identifikovani analizom krvne slike i krvnog filma sa, na primer, svetlosnim mikroskopom, koji je koristan za identifikaciju ćelija maligniteta, i biopsijom iz limfnog čvora može biti korisno za identifikaciju limfadenopatije.

[0103] Į4-vezujuće antitelo (npr., humanizovano anti-VLA-4 antitelo, kao što je HuHP1/2, H1L0, H1L1, H1L2 ili H1L3) je korisno za lečenje leukemije, kao što je AML. Leukemije su kanceri koji potiču iz koštane srži, gde su maligne ćelije ćelije belih krvnih zrnaca (leukocita). AML (takođe nazvan akutna mijelocitična leukemija, akutna mijeloblastična leukemija, akutna granulocitična leukemija, i akutna nelimfocitična leukemija) je malignost koji proistiće iz ili granulocita ili monocita. AML je okarakterisan sa nekontrolisanim, preteranim rastom i akumulacijom ćelija nazvani leukemijski blastovi, koji padaju pod funkciju kao normalne krvne ćelije, i blokiraju proizvodnju normalnih ćelija kostiju, vodeći do deficijencije crvenih krvnih zrnaca (anemija), i plateleta (trombocitopenija) i normalnih belih zrnaca (naročito neutrofila, odn., neutropenija) u krvi.

[0104] Svi podtipovi AML su pogodni za lečenje sa VLA-4 vezujućim antitelom. Podtipovi AML su klasifikovani na osnovu faze razvoja mijeloblastoma koji su dostigli u trenutku dijagnoze. Kategorije i podsetovi dozvoljavaju lekaru da odluči koje lečenje deluje najbolje za ćelijski tip i koliko brzo se bolest može razviti. Podsetovi su: M0, mijeloblastični, na specijalnoj analizi; M1, Mijeloblastični, bez sazrevanja; M2, Mijeloblastični, sa sazrevanjem; M3, Promijelocitični; M4, Mijelomonocitični; M5, Monocitični; M6, Eritroleukemija; i M7, Megakariocitični. VLA-4 antitelo se može primenjivati sa sekundarnim agensom koji posebno odgovara podtipu AML. Na primer, akutna promijelocitična leukemija (APL) i akutna monocitična leukemija su podtipovi AML kojima treba različito lečenje nego drugi podtipovi AML. Drugi agens za lečenje APL može obuhvatati sve trans retinoinske kiseline (ATRA) ili antimetabolite, kao što je citarabin. Drugi agens za lečenje akutne monocitične leukemije može obuhvatati deoksiadenozin analog, kao što je 2-hloro-2’-deoksiadenozin (2-CDA).

[0105] Faktori rizika AML obuhvataju prisustvo izvesnih generičnih poremećaja, kao što je Down sindrom, Fanconi anemija, Shwachman-Diamond sindrom i drugi. Pacijentu koji ima AML i genetilki poremećaj se može primenjivati VLA-4 vezujuće antitelo i drugi agens za lečenje simptoma genetičkog poremećaja. Na primer, na pacijenta sa AML i Fanconi anemijom može se primenjivati VLA-4 vezujuće antitelo i antibiotik.

[0106] Drugi faktori rizika za AML obuhvataju hemoterapiju ili zračenje za lečenje različitog kancera, duvanskog dima, i izlaganje velikom broju benzena.

[0107] Drugi kanceri pogodni za lečenje sa Į4-vezujućim antitelom obuhvataju, čvrste tumore kao što je asrkoma i karcinoma (npr., fibrosarkoma, mikosarkoma, liposarkoma, hondrosarkoma, osteogenska sarkoma, kordoma, angiosarkoma, endoteliosarkoma, limfangiosarkoma, limfangioendoteliosarkoma, sinovioma, mesotelioma, Ewing-ov tumor, leiomijosarkoma, rabdomiosarkoma, karcinom janika, skvamozni karcinom, bazalni ćelijski karcinom, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, karcinom lojne žlezde, papilari karcinoma, papilari adenokarcinomi, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogenski karcinom, karcinom renalne ćelije, hepatoma, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Wilm-ov tumor, cervikalni kancer, uterin kancer, testikular kancer, karcinom malih ćelija pluća, epitelijalni karcinom, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastom, akoustični neurom, oligodendrogliom, švanom, meningiom, melanom, neuroblastom, i retinoblastom).

Drugi Poremeüaji

[0108] Formulacije i postupci opisani ovde mogu se takođe koristiti za lečenje drugih inflamatornih, imunih, ili autoimunih poremećaja, npr., zapaljenje centralnog nervnog sistema (npr., uz to multipla skleroza, meningitis, neuromijelitis optika, neurosarkoidoza, CNS vaskulitis, encefalitis, i transverzni mijelitis); graft reakcija tkiva ili organa ili graft-versus-host obolenje; akutna CNS povreda, npr., moždani udar ili povreda kičmene moždine (SCI); hronično renalno obolenje; alergija, npr., alergijska astma, umeren do teški alergijski rinitis; tip 1 diabetes melitusa; inflamatorni poremećaji creva, npr., Crohn-ova bolest, ulcerativni kolitis (npr., za lečenje ili održavanje remisije); eosinofilni gastroenteritis; mijastenia gravis; fibromialgija; poremećaji povezani sa reumatologijom/imunologijom, kao što je artritični poremećaji, npr., reumatoidni arthritis, psoriatični arthritis; dermatološki poremećaj, kao što je inflamatorno/imuno kožno obolenje, npr., psoriaza, vitiligo, dermatitis (npr., atopični dermatitis), lišaj planus, umerena do teška hronična urtikarija; sistemični lupus eritematozus (SLE; npr., lupus nefritis); skleroderma (npr., Progresivna Sistemska Skleroza (PSS), kao što je PSS pluća); akutna ili hronična primarna eozinofilna pneumonija; Sjogren-ov Sindrom; akutni koronarni sindrom (ACS); akutni miokardialni infarkt; ateroskleroza; i fibrotični poremećaji, npr., pulmonarna fibroza (npr., idiopatična pulmonarna fibroza), plućna fibroza (npr., XRT izazvan), mijelofibroza, ciroza jetre, mesangijalni proliferativni glomerulonefritis, crescentični glomerulonefritis, diabetična nefropatija, i renalna intersticijalna fibroza.

[0109] Formulacije i postupci opisani ovde mogu takođe da budu korišćeni za lečenje neuroloških poremećaja, kao što je cerebralna ishemija, uključujući prevenciju kod pacijenata sa transentnim ishemijskim napadima i/ili arterialna stenoza. Drugi primeri neuroloških poremećaja obuhvataju hroničnu inflamatornu demijelinacionu polineuropatiju (CIDP); Guillian-Barre Sindrom (GBS); okularna obolenja, kao što je makularna degeneracija (npr., vlažna makularna degradacija), i anteriorishemijska optička neuropatija; neuropatični bol (npr., simptomatski neuropatični bol); Alzheimer-ova bolest; Amiotrofična Lateralna Skleroza (ALS) (npr., obolenje modifikovanog ALS)’ i Parkinson-ova bolest.

[0110] Formulacije i postupci opisani ovde mogu takođe da budu korišćeni za lečenje pacijenata koji su podvrgnuti transplataciji, kao što je transplatacija bubrega, srca, ili koštane srži.

Multipla Skleroza

[0111] Formulacije koje sadrže alfa-4 vezujuće antitelo opisano ovde su korisni za lečenje inflamatornih obolenja, kao što je multipla skleroza (MS). Multipla skleroza je obolenje centralnog nervnog sistema koje je okarakterisano sa zapaljenjem i gubitkom mijelinskih obloga.

[0112] Pacijenti koji imaju MS mogu biti identifikovani sa kriterijumom koji je ustanovljava dijagnozu klinički definisane MS kao što je definisano radom na dijagnozi MS (Poser et al., Ann. Neurol.13:227, 1983). Na primer, pojedinac sa klinički određenim MS ima dva napada i klinički dokaz ili dve lezije ili klinički dokaz jedne lezije i paraklinički dokaz duge, odvojene lezije. Određen MS može takođe da bude dijagnostikovan dokazom dva napada i oligoklonalnim vezama IgG u cerebrospinalnoj tečnosti ili kombinacijom napada, kliničkog dokaza dve lezije i oligoklonalne veze IgG u cerebrospinalnoj tečnosti. McDonaldov kriterijum takođe može da bude korišćen za dijagnozu MS. (McDonald et al., 2001, "Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis," Ann. Neurol.50:121-127). McDonaldov kriterijum obuhvata korišćenje MRI dokaza CNS pogoršanja tokom vremena kako bi se koristio u dijagnozi MS, u odsustvu višestrukih kliničkih napada. Efikasno lečenje multipla skleroze može biti procenjeno na nekoliko različitih načina. Sledeći parametri mogu da se koriste za merenje efikasnosti lečenja. Dva primerna kriterijuma obuhvataju: EDSS (statusna skala produžene nesposobnosti), i pojava pogoršanja MRI (magnetska rezonantna slika). EDSS je postupak za ocenjivanje kliničkog oštećenja zbog MS (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Osam funkcionalnih sistema su ocenjena za tip i teškoću neurološkog oštećenja. Ukratko, pre lečenja, pacijenti su ocenjeni za oštećenje u sledećim sistemima: piramidalni, cerebela, mozak, senzori, creva i bešika, vizualni, cerebralni, i drugi. Prateće aktivnosti su sprovedene pri definisanim intervalima. Opseg skale od 0 (normalni) do 10 (smrt usled MS). Smanjenje jednog punog koraka ukazuje na efikasnost lečenja (Kurtzke, Ann. Neurol.

36:573-79, 1994). Pacijenti mogu takođe da budu dijagnostikovani korišćenjem kriterijuma korišćeni od strane onih iz tehnike.

[0113] Pogoršanja su definisana kao izgled novog simptoma koji se može prepisati MS i praćen je odgovarajućim novim neurološkim abnormalnostima (IFNB MS Study Group, supra). Dodatno, pogoršanje mora da traje najmanje 24 sata i da prethodi stabilnosti ili poboljšanju za najmanje 30 dana. Ukratko, pacijentima je urađen standardni nurološki pregled od strane lekara. Pogoršanja su ili blaga, umerena, ili teška prema promenama u Neurološkoj Skali Ocenbjivanja (Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984). Godišnja stopa pogoršanja i proporcija pogoršanje-slobodni pacijent je određena.

[0114] Terapija se može smatrati efikasnom ako postoji statistički značajna razlika u stopi ili proporciji pogoršanje-sloboda ili povraćaj-slobodni pacijenti između lečene grupe i placebo grupe za bilo koja od ovih merenja. Dodatno, vreme do prvog pogoršanja i trajanje pogoršanja i težina mogu takođe da budu izmerena. Merenje efikasnosti kao terapija u ovom pogledu je statistički značajna razlika u vremenu do prvog pogoršanja ili trajanja i težine u lečenoj grupi kada se poredi sa kontrolnom grupom. Pogoršanje-sloboda ili povraćajslobodni period više od jedne godine, 18 meseci, ili 20 meseci je naročito vredna pažnje. Efikasnost može takođe da bude procenjena korišćenjem bilo kog postupka korišćen u tehnici, na primer kako bi se procenili simptomi MS, uključujući poboljšanje mobilnosti korišćenjem prolaznog testa šetanja koji je korišćen sam ili u kombinaciji sa drugim kriterijumom.

[0115] Efikasnost primene prvog agensa i, opciono, drugog agensa, može takođe da bude procenjena na osnovu jednog ili više sledećih kriterijuma: učestalost MBP reaktivnih T ćelija određen ograničenim razblaživanjem, proliferativni odgovor MBP reaktivnih T ćelijskih linija i klonova, citokin profili T ćelijskih linija i klonova do MBP određen iz pacijenata. Efikasnost je određena smanjenjem u učestalosti reaktivnih ćelija, redukciji u timidin inkorporaciji sa izmenjenim peptidom kada se poredi sa prirodnim, i redukcija u TNF i IFN-Į.

[0116] Klinička merenja uključuju stopu relapsa u jednogodišnjim i dvogodišnjim intervalima, i menja u EDSS, uključujući vreme za napredovanje iz bazne linije 1.0 jedinice na EDSS koji postoji šest meseci. Na Kaplan-Meier krivoj, odlaganje u sudržanom napredovanju invaliditeta pokazuje efikasnost. Drugi kriterijum obuhvata promenu u području i zapremini T2 slika na MRI, i broj i zapremina lezija određene sa gadolinijumom poboljšanih slika.

[0117] MRI može biti korišćen za merenje aktivnih lezija korišćenjem gadolinium-DTPA-poboljšane slike (McDonald et al. Ann. Neurol.36:14, 1994) ili lokacije i stepen lezije korišćenjem T2 –opterećenih tehnika. Ukratko, osnovna linija MRIs je dobijena. Isto područje slike i pozicija pacijenta su koriščene za svaku sledeću studiju. Pozicioniranje i slika sekvence mogu biti odabrani kako bi maksimizovali detekciju lezije i olakšali praćenje lezije. Isto pozicioniranje i slika sekvenci može biti korišćena u sledećim studijama. Prisustvo, lokacija i stepen MS lezija mogu biti određeni od strane radiologa. Područja lezija mogu biti naglašena i sumirana deo po deo za ukupno područje lezije. Tri analize mogu biti urađene: dokaz za nove lezije, stepen izgleda aktivnih lezija, procenat promene u području lezije (Paty et al., Neurology 43:665, 1993). Poboljšanje usled terapije može biti ustanovljen statističkim poboljšanjem kod pojedinačnog pacijenta kada se poredi sa osnovnom linijom ili u tretiranoj grupi nasuprot placebo grupe.

[0118] Primerni simptomi povezani sa multipla skelrozom, koji mogu biti tretirani sa postupcima opisanim ovde, obuhvataju: optički neuritis, diplopija, nistagmus, okularna dismetrija, internuklearna oftalmoplegija, kretanje i zvučna fosfeneza, defekt dovodnog pupilarija, paresis, monoparesis, paraparesis, hemiparesis, kuadraparesis, plegia, paraplegia, hemiplegia, tetraplegia, kuadraplegia, spastičnost, disartrija, mišićna atrofija, spazam, grčevi, hipotonija, klonus, mioklonus, miokimija, sindrom nemirne noge, pad stopala, disfunkcionalni refleksi, paraestezija, anaestezija, neuralgija, neuropatični i neurogenski bol, l’hermitte’s, proprioceptivna disfunkcija, trigeminalna neuralgija, ataksija, namerni tremor, dismetrija, vestibularna ataksija, vertigo, govorna ataksija, distonija, disdiadohokinezija, učestala mikturacija, spastičnost bešike, flacidna bešika, detrusorsphincter disinergija, erektilna disfunkcija, anorgazmi, frigidnost, konstipacija, felkalna urgencija, fekalna inkontinencija, depresija, kognitivna disfunkcija, demencija, promena raspoloženja, emocijalna labilnost, euforija, bipolarni sindrom, anksioznost, afazija, disfazija, zamor, uhthoff-ov simptom, gastroesofagealni refluks, i poremećaji spavanja.

[0119] U svakom slučaju MS pokazuje jedan od nekoliko uzoraka prezentacije i sledeći kurs. one of several patterns of presentation and subsequent course. Najčešće, MS se prvo manifestuje sam kao serija napada praćeno sa potpunom ili delimičnom remisijom kao simptomi misterioznog umanjenja, samo da se vrati kasnije posle perioda stabilnosti. Ovo se zove relapsirajući-odloženi (RR) MS. Primarni-progressivni (PP) MS je okarakterisan sa postepenim kliničkim padom bez posebnih remisija, iako postoje privremeni plateus ili manje olakšanje od simptoma. Sekundarno progresivni (SP) MS počinju sa relapsirajućim odloženim tokom praćen sa kasnijim primarno progresivnim kursom. Retko, pacijenti mogu imati progresivni odloženi (PR) tok gde obolenje preuzima progresivnu putanju prekinut od strane akutnih napada. PP, SP, i PR su ponekad zbijeni zajedno i naziva se hronični progresivni MS.

[0120] Nekoliko pacijenata je iskusilo malignatni MS, definisan kao brzi i nemilosrdni pad koji rezultuje u značajnoj invalidnosti ili čak kratka smrt posle početka bolesti. Ova promena može biti sprečene ili zaustavljene primenom kombinovane terapije koja je ovde opisana.

[0121] Primena anti-Į4 antitela koaj je ovde okarakterisana može biti efikasna da olakša jedna ili više simptoma MS, kao što je jedan ili više simptoma koji su ovde opisani. Na primer, primena anti-Į4 antitela opisana ovde može biti korišćena za lečenje primarne ili sekundarne progresije multipla skleroze (PPMS ili SPMS, respektivno), i lečenej sa anti-Į4 antitelom može biti efiaksno u sprečavanju relapsa.

[0122] U odnosu na ili pre humanih studija, ćivotinjski model može biti korišćen da proceni efiaksnost korišćenja dva agensa. Primerni životinjski model za multipla sklerozu jeste eksperimentalni autoimuni encefalitis (EAE) mišijeg modela, npr., kao što je opisano u (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), i Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). Miševi mogu primiti prvi i drugi agens opisan ovde pre indukcije EAE. Potom su miševi procenjeni za karakteristične kriterijume kako bi se odredila efikasnost korišćenja dva agensa u modelu.

Generisanje Antitela

[0123] Rekombinantna antitela koja se veyuju za alfa-4 mobu biti generisana sa in vivo ili in vitro postupcima kao što je fagni prikaz. Postupci se mogu koristiti za obezbeđivanje anti-Į4 CDRs za primenu u CDR graftovanim antitelima koja su ovde opisana. Dodatno, postupci kao što je fagni prikaz može biti korišćen kako bi se odabrali takvi CDRs u kontekstu germlinijskih okvira koji su ovde otkriveni, kao što je korišćenje biblioteke gde okvir je germlinijski okvir.

[0124] EP 239400 (Winter et al.) opisuje izmene antitela supstitucijom (unutar datog varijabilnog regiona) njihovih komplementarnih određenih regiona (CDRs) za jednu vrstu sa onima iz drugoga. CDR-supstituisana antitela mogu biti manje verovatna da izazovu imuni odgovor kod ljudi kada se poredi sa pravim himernim antitelima zbog toga što CDR-supstituisana antitela sadrže znatno manje ne-humane komponente. (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Obično, CDRs murine antitelo supstituisano u odgovarajuće regione u humanom antitelu korišćenjem tehnologije rekombinantne nukleinske kiseline kako bi se dobile sekvence koje kodiraju željeno supstituisano antitelo. Genski segmenti humanog konstantnog regiona željenog izotipa (obično gama I za CH i kapa za CL) mogu biti dodati i geni teškog i lakog lanca mogu biti ponovo iskazani u ćelijama sisara kako bi se dobio rastvorno antitelo. Velika biblioteka neimunizovanog fagnog prikaza može takođe da bude korišćena kako bi izolovala visoko afinitetna antitela koja se mogu razviti kao humani terapeuci korišćenjem standardne tehnologije faga (videti, npr., Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; and Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; U.S.2003-0232333).

[0125] Anti-Į4 antitelo ili fragment antitela koji je ovde opisan pmože prepoznati epitope Į4 podjedinica koje su uključene u vezivanje za srodnog liganda, npr., VCAM-1 ili fibronektina. Antitela opisana ovde mogu inhibirati vezivanjem za jedan ili više srodnih liganada (npr., VCAM-1 i fibronektin).

[0126] U nekim rešenjima, antitela koja su ovde okarakterisana, mogu međusobno reagovati sa VLA-4 na ćelijama, npr., limfociti, ali ne izazivaju ćelijsko taloženje.

[0127] Primerno Į4 vezujuće antitelo ima jedan ili više CDRs, npr., sva tri teška lanca (HC) CDRs i/ili sva tri laka lanca (LC) CDRs određenog antitela koji je ovde opisan, ili CDRs koji su, u zbiru, bar 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identični takvom antitelu. U jednom rešenju, H1 i H2 hipervarijabilne petlje imaju istu kanonsku strukturu kao i ona antitela koja su ovde opisana. U jednom rešenju, L1 i L2 hipervarijabilne petlje imaju istu kanonsku strukturu kao i ona antitela koja su ovde opisana.

[0128] U jednom rešenju, amino kiselinska sekvenca HC i/ili LC varijabilnog domena sekvence je bar 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identična amino kiselinskoj sekvenci HC i/ili LC varijabilnog domena antitela koji je ovde opisan. Amino kiselinska sekvenca HC i/ili LC varijabilnog domena sekvence se može razlikovati sa bar jednom amino kiselinom, ali ne više od deset, osam, šest, pet, četiri, tri, ili dve amino kiseline iz odgovarajuće sekvence antitela koje je ovde opisano. Na primer, razlike mogu biti prvenstveno ili u potpunosti u okviru regiona.

[0129] Amino kiselinske sekvence HC i LC varijabilnog domena sekvenci mogu biti kodirane sa sekvencom nukleinske kiseline koja hidridizira pod visokim uslovima stresa za sekvencu nukleinske kiseline koja je ovde opisana ili jednom koja kodira varijabilni domen ili amino kiselinskom sekvencom opisanom ovde. U jednom rešenju, amino kiselinske sekvence jednog ili više regiona okvira (npr., FR1, FR2, FR3, i/ili FR4) HC i/ili LC varijabilnog domena su bar 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identične odgovarajućem okviru regiona HC i LC varijabilnih domena antitela opisani ovde. U jednom rešenju, jedan ili više teških ili lakih lanaca okvira regiona (npr., HC FR1, FR2, i FR3) su bar 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ili 100% identične sekvenci odgovarajućih regiona okvira iz humanog germlinijskog antitela.

[0130] Kalkulacije "homologni" ili "sekvencni identitet" između dve sekvence (termini su ovde korišćeni međusobno) su izvedene kao što sledi. Sekvence su usklađene za optimalna upoređivanja (npr., praznine mogu biti uvedene u jednu ili obe prvi i drugu amino kiselinsku ili nukleinso kiselinsku sekvencu za optimalno usklađivanje i nehomogene sekvence mogu se zanemariti zbog upoređivanja). Optimalno usklađivanje je određeno kao najbolji izvor koji koristi GAP program u GCG softver paketu sa Blossum 62 matriksom ocenjivanja sa kaznenom prazninom od 12, produženom kaznenom prazninom od 4, i promenom okvira kakznene praznine od 5. Amino kiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim amino kiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama su potom upoređivane. Kada je pozicija u prvoj sekvenci okupirana sa istim ostatkom amino kiseline ili nukleotida kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji (kao što je korišćeno ovde amino kiselina ili nukleinska kiselina "identitet" je ekvivalentan amino kiselini ili nukleinskoj kiselini "homologa"). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija podeljeni sa sekvencama.

[0131] Kao što je korišćeno ovde, termin "hibridizira pod visokim uslovima strogosti" opisuje uslove hibridizacije i ispiranja. Uputstvo za izvođenje reakcija hibridizacije može biti pronađena u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Vodeni i nevodeni postupci su opisani u navedenoj referenci i može se koristiti.

Visoka strogost uslova hibridizacije obuhvata hibridizaciju u 6X SSC na oko 45°C, praćeno sa jednim ili dva ispiranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 65°C, ili suštinski sličnim uslovima.

Proizvodnja Antitela

[0132] Antitela se mogu dobiti u prokariotskim i eukariotskim ćelijama. U jednom rešenju, antitela (npr., scFvs) su iskazana u ćelijama kvasca kao što je Pichia (videti, npr., Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35), Hanseula, or Saccharomyces.

[0133] U jednom rešenju, antitela, prvenstveno antitela pune dužine, npr., IgGs, su dobijena u ćelijama sisara. Primerne ćelije domaćina sisara za rekombinantnu ekspresiju obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR odabranim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), limfocitnim ćelijskim, npr., NS0 mijeloma ćelije i SP2 ćelije, COS ćelije, K562, i ćelije iz transgenske životinje, npr., transgenski sisar. Na primer, ćelija je mlečna epitelijalna ćelija.

[0134] U odnosu na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski domen, rekombinantni ekspresioni vektori mogunositi dodatne nukleinske sekvence, kao što su sekvence koje regulišu zamenu vektora na ćelijama domaćina (npr., poreklo replikacije) i odabranih marker gena. Odabrani marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina gde je vektor ubačen (videti npr., U.S. Patent Br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Primerni selektivni markeri gena obuhvataju dihidrofolatnu reduktazu (DHFR) gena (za primenu u dhfr- ćelijama domaćina sa metotreksat selekcijom/amplifikacija) i neo gen (za G418 selekcija).

[0135] U primernom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela (npr., antitela pune dužine ili njegov antigenski vezujući deo), rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira oba antitelo teškog lanca i antitelo lakog lanca je ubačen u dhfr- CHO ćelije sa posredovanom transfekcijom kalcijum fosfata. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni antitela teškog i lakog lanca su svaki operativno povezani za ojačani/promoter regulacione elemente (npr., izveden iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je CMV ojačani/AdMLP promoter regulacionog elementa ili SV40 ojačani/AdMLP promoter regulacionog elementa) da pobuđuje visoke nivoe transkripcionih gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji dozvoljava za selekciju CHO ćelija koje su transfektovane sa vektorom korišćenjem metotreksatne selekcije/pojačanja. Odabrane transformantne ćelije domaćina su kultivisane kako bi se dozvolilo za ekspresiju antitela teških i lakih lanaca i čitavo antitelo je oporavljeno iz kultivacionog medijuma. Standardne tehnike molekularne biologije su korišćene da se dobije rekombinanatni ekspresioni vektor, da transfektuje ćelije domaćina, da odabere za transformante, da se kultivišu ćelije domaćina, i da se oporavi antitelo iz kultivisanog medijuma,. Na primer, neka antitela mogu biti izolovana sa afinitetnom hromatografijom sa Protein A ili Protein G. Na primer, prečišćena Į4-vezujuća antitela mogu biti koncentrisana od oko 100 mg/mL do oko 200 mg/mL korišćenjem tehnika koncentracije proteina koje su poznate u tehnici.

[0136] Antitela takođe mogu da obuhvate modifikacije, npr., modifikacije koje pojačavaju Fc funkciju, npr., smanjuju ili uklanjaju interakciju sa Fc receptorom ili sa C1q, ili oba. Na primer, humani IgG4 konstantni region može imati Ser do Pro mutaciju na ostatku 228 kako bi popravio zavisnost regiona. Amino kiselinska sekvenca IgG4 Fc (hinge CH2 CH3 domen) je obezbeđena na FIG.5.

[0137] U drugom primeru, humani IgG1 konstantni region može biti mutiran na jednom ili više ostataka, npr., jednom ili više ostataka 234 i 237, npr., prema brojanju u U.S. Patentu Br. 5,648,260. Druge primerne modifikacije obuhvataju one opisane u U.S. Patentu Br.

5,648,260.

[0138] Za neka druga antitela koja obuhvataju Fc domen, proizvodni sisten antitela može biti konstruisan tako da sinteteizuje antitela gde Fc region je glikozilovan. U drugom primeru, Fc domen IgG molekula je glikozilovan na asparaginu 297 u CH2 domenu (videti FIG.5). Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju sa oligosaharidima biantenarnog tipa. Ova glikozilacija Xčestvuje u efektorskim funkcijama sa FcȖ receptorima i upotpunjenim C1q

(Burton and Woof (1992) Adv. Immunol.51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev.

163:59-76). Fc domen može biti dobijen u sisarskom ekspresionom sistemu koji odgovarajuće glikoziluje ostatak koji odgovara asparaginu 297. Fc domen takođe može uključivati druge eukariotske post-translacione modifikacije.

[0139] Druge pogodne modifikacije Fc domena obuhvataju one opisane u WO2004/029207. Na primer, Fc domen može biti XmAb® Fc (Xencor, Monrovia, CA). Fc domen, ili njegov fragment, može imati supstituciju na FcȖ Receptoru (FcȖR) vezujućeg regiona, kao što su domeni i fragmenti opisani u WO05/063815. U nekim rešenjima, Fc domen, ili njegov fragment, ima supstituciju na neonatalnom Fc Receptoru (FcRn) vezujućeg regiona, kao što su domeni i fragmenti opisani u WO05047327. U drugim rešenjima, Fc domen je pojedinačan lanac, ili njegov fragment, ili njegova modifikovana verzija, kao što su one opisane u WO2008143954. Druge pogodne Fc modifikacije su poznate i opisane u tehnici.

[0140] Antitela takođe mogu biti proizvedena od strane transgenske životinje. Na primer, U.S. Patent Br.5,849,992 opisuje postupak za iskazivanje antitela u mlečnoj žlezdi transgenskog sisara. Transgen je konstruisan tako da obuhvatamlečni specifični promoter i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitela od interesa, nor., antitelo opisano ovde, i pojedinačnu sekvencu za sekreciju. Mleko proizvedeno od strane ženki takvih transgenskih sisara obuhvataju, njihovo izlučivanje, antitelo od interesa, npr., antitelo opisano ovde.

Antitelo može biti prečišćeno od mleka, ili za neke primene, može se koristiti direktno.

[0141] Antitela mogu biti modifikovana, npr., sa ostatkom koji poboljšaba njegovu stabilnost i/ili retenciju u cirkulaciji, npr., u krvi, serumu, limfi, bronhoalveolarnoj lavage, ili drugih tkiva, npr., sa najmanje 1.5, 2, 5, 10, ili 50 preklopa.

[0142] Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može biti povezano sa polimerom, npr., značajnim ne-antigenskim polimerom, kao što je polialkilen oksid ili polietilen oksid. Pogodni polimeri će se značajno razlikovati po težini. Polimeri koji imaju prosečnu molekulsku težinu od oko 200 do oko 35,000 daltona (ili oko 1,000 do oko 15,000, i 2,000 do oko 12,500) mogu biti korišćeni.

[0143] Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može biti konjugovano do vodo rastvornih polimera, npr., hidrofilni polivinil polimer, npr. polivinilalkohol ili polivinilpirolidon.

Neograničavajuća lista takvih polimera obuhvataju polialkilen oksidne homopolimere kao što je polietilen glikol (PEG) ili polipropilen glikoli, polioksietilenovani polioli, njegovi kopolimeri i njegovi blok kopolimeri, obezbeđujući da je vodena rastvorljivost blok kopolimeri održavana. Dodatni korisni kopolimeri obuhvataju polioksialkilene kao što je polioksietilen, polioksipropilen, i blok kopolimeri polioksietilena i polioksipropilena (Pluronics); polimetakrilati; karbomeri; razgranati ili nerazgranati polisaharidi koji sadrže monomere saharida D-manoza, D- i L-galaktoza, fukoza, fruktoza, D-ksiloza, L-arabinoza, D-glukuronska kiselina, salicilna kiselina, D-galakturonska kiselina, D-manuronska kiselina (npr. polimanuronska kiselina, ili algininska kiselina), D-glukozamin, D-galaktozamin, D-glukoza i neuraminska kiselina uključujući homopolisaharide i heteropolisaharide kao što su laktoza, amilopektin, skrob, hidroksietil skrob, amiloza, dekstran sulfat, dekstran, dekstrini, glikogen, ili polisaharidna podjedinica kiselina mukopolisaharidi, npr. hijaluronska kiselina; polimeri šećernih alkohola kao što je polisorbitol i polimanitol; heparin ili heparon.

Primeri drugih agenasa

[0144] U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde opisane, npr., formulacije koje sadrže alfa-4 vezujuće antitelo, sadrže drugi agens, ili se primenjuju u kombinaciji sa formulacijom koja sadrži drugi agens.

[0145] U jednoj implementaciji, Į4 vezujuće antiteli i drugi agens su obezbeđeni kao koformulacije, i ko-formulacija se primenjuje na subjekat. Dalje je moguće, npr., bar 24 sata pre ili posle primene ko-formulacije, da se primeni odvojeno jedna doza formualcije Į4 vezujućeg antitela i potom jedna doza formulacije koja sadrži drugi agens. U drugoj implementaciji, antitelo i drugi agens su obezbeđeni kao odvojene formulacije, i korak primene obuhvata uzastopnu primenu antitela i drugog agensa. Uzastopne primene mogu biti obezbeđene istog dana (npr., u u okviru jednog sata jedan za drugim ili bar 3, 6, ili 12 sati odvojeno) ili različitim danima.

[0146] Uopšteno, antitelo i drugi agens svaki se primenjuju kao množina doza odvojeni u vremenu. Antitelo i drugi agens su uopšteno svaki primenjuje prema režimu. Režim za jednu ili oba može imati redovnu preiodičnost. Režim za antitelo može imati različitu periodičnost iz režima za drugi agens, npr., jedan se može primenjivati više učestalo nego druga. U jednoj implementaciji, jedan od antitelo i drugi agens se primenjuje jednom nedeljno, a drugi jednom mesečno. U drugoj implementaciji, jedan od antitelo i drugi agens se primenjuje kontinuirano, npr., tokom perioda više od 30 minuta ali manje od 1, 2, 4, ili 12 sati, a drugi se primenjuje kao bolus. Antiteli i drugi agens se mogu primenjivati bilo kojim odgovarajućom metodom, npr., potkožno, intramuskularno, ili intravenozno.

[0147] U nekim rešenjima, svaki od antitelo i drugi agens se primenjuju pri istim dozama kao svaki koji je prepisan za monoterapiju. U drugim rešenjima, antitelo se primenjuje pri dozi koja je jednaka ili manja od količine potrebne za efikasnost ako se primenjuje samo. Na isti način, drugi agens se može primenjivati pri dozi koja je jednala ili manja od količine potrebne za efikasnost ako se primenjuje sam.

[0148] Ne-ograničavajući eksperimenti drugih agenasa za lečenje multipla skleroza u kombinaciji sa Į4 vezujućim antitelom obuhvata:

1 interferone, npr., human interferon beta-1a (e.g., AVONEX® or Rebif®)) i interferon beta-1b (BETASERON™; human interferon beta supstituisan na poziciji 17;

Berlex/Chiron);

1 glatiramer acetat (takođe nazvan Copolimer 1, Cop-1; COPAXONE™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);

1 Rituxan® (rituximab) ili neko drugo anti-CD20 antitelo, npr., jedan koji se takmiči sa ili vezuje preklapajući epitop sa rituksimab;

1 mistoksantron (NOVANTRONE®, Lederle);

1 hemoterapeutik, npr., klabribin (LEUSTATIN®), azatioprin (IMURAN®), ciklofosfamid (CYTOXAN®), ciklosporin-A, metotreksat, 4-aminopiridin, i tizanidin; 1 kortikosteroid, e.g., metilprednisolone (MEDRONE®, Pfizer), prednisone;

1 imunoglobulin, e.g., Rituxan® (rituximab); CTLA4 Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) or daclizumab (an antitela that binds CD25);

1 statini; and

1 TNF antagonisti.

[0149] Glatiramer acetat predstavlja protein obrazovan iz nasumičnog lanca amino kiseline – glutaminska kiselina, lizin, alanin i tirozin (dakle GLATiramer). Glatiramer acetat može da bude sintetizovan u rastvoru iz onih amino kiselina pri odnosu od približno 5 delova alanina do 3 dela lizina, 1.5 deo glutaminske kiseline i 1 deo tirozina korišćenjem anhidrovane N-karboksiamino kiseline.

[0150] Dodatni drugi agensi obuhvataju antitela ili antagoniste drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF, i PDGF. Ipak drugi primeri durgih agenasa obuhvataju antitela do ćelijskih površinskih molekula kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 li njihovi liganda. Na primer, daclizubmab je anti-CD25 antitela koji može poboljšati multipla sklerozu.

[0151] Ipak drugi primeri antitela obuhvataju antitela koja obezbeđuju aktivnost agensa koji opisan ovde, kao što je antitelo koje angažuje receptor interferona, npr., interferon beta receptor. Obično, u implementacijama gde drugi agens obuhvata antitelo, on se vezuje ta ciljani protein osim VLA-4 ili osim Į4 integrina, ili bar epitope na VLA-4 osim jednog koji je prepoznat od strane prvog agensa.

[0152] Ipak drugi dodatni primeri drugih agenasa obuhvataju: FK506, rapamicin, micofenolat mofetil, leflunomid, ne-steroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDs), na primer, fosfodiesteraza inhibitore, adenozin agonists, antitrombocitni agensi, komplementarni inhibitori, adrenergijske agente, agense koji ometaju signalizaciju od strane proinflamatornih citokina kao što je ovde opisano, IL- 1ȕ konvertuje enzime inhibitora (npr., Vx740), anti-P7s, PSGL, TACE inhibitore, Tćelija koja signalizira inhibitore kao što su kinaza inhibitori, metaloproteinaza inhibitori, sulfasalazin, azatloprin, 6-merkaptopurini, angiotenzin koji konvertuje enzime inhibitora, rastvorljive citokin inhibitore i njihove derivate, kao što je ovde opisano, anti-inflamatorne citokine (npr. IL-4, IL-10, IL-13 i TGF).

[0153] U nekim rešenjima, drugi agens može biti korišen za lečenje jednog ili više simptoma ili sporednih efekata MS. Takvi agensi obuhvataju, npr., amantadin, baclofen, papaverin, meclizin, hidroksizin, sulfametoksazol, ciprofloksacin, docusat, pemolin, dantrolen, desmopressin, deksametason, tolterodin, fenitoin, oksibutinin, bisakodil, venlafaksin, amitriptilin, metenamin, clonazepam, isoniazid, vardenafil, nitrofurantoin, psilium hidrofilni muciloid, alprostadil, gabapentin, nortriptilin, paroksetin, propantelin bromid, modafinil, fluoksetin, fenazopiridin, metilprednisolon, karbamazepin, imipramin, diazepam, sildenafil, bupropion, i sertralin. Mnogi drugi agensi koji su mali molekuli imaju molekulsku težinu između 150 i 5000 Daltona.

[0154] Primeri TNF antagonista obuhvataju himerna, humanizovana, humana ili in vitro generisana antitela (ili njihove antigen vezujuće fragmente) do TNF (npr., humani TNF Į), kao što su D2E7, (humana TNFĮ antitela, U.S. Patent Br.6,258,562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (humanizovano anti-TNFĮ antitelo; Celltech/Pharmacia), cA2 (himerno anti-TNFĮ antitelo; REMICADE™, Centocor); fragmenti anti-TNF antitela (npr., CPD870); rastvorljivi fragmenti TNF receptora, npr., p55 ili p75 humani TNF receptori ili njihovi derivati, npr., 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein, ENBREL™; Immunex; videti npr., Arthritis & Rheumatism (1994) Vol.37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol.44, 235A), p55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein (LENERCEPT™)); enzimski antagonisti, npr., TNFa konvertujući enzimski (TACE) inhibitori (npr., derivat alfa-sulfonil hidroksaminske kiseline, WO 01155112, i N-hidroksiformamid TACE inhibitor GW 3333, -005, ili -022); i TNF-bp/s-TNFR (rastvorljivi TNF vezujući protein; videti npr., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol.39, No.9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol.268, pp.37-42).

[0155] U odnosu na drugi agens, takođe je moguće dostaviti druge agense subjektu.

Međutim, u nekim rešenjima, ni jedan proteinski ili biološki, osim Į4 vezujuće antitela i drugog agensa, se primenjuje na subjekta kao farmaceutska kompozicija. Į4 vezujuće antitelo i drugi agens mogu da budu jedini agensi koji se daju putem injekcije. U rešenjima gde je drugi agens rekombinantni protein, Į4 vezujuće antitelo i drugi agens mogu biti samo rekombinanatni agensi koji se primenjuju na subjekat, ili bar samo rekombinantne agense koji moduliraju imune ili inflamatorne odgovore. Ipak u drugim rešenjima, Į4 vezujuće antitelo samo je jedini rekombinantni agens ili jedini biološki koji se primenjuje na subjekat.

[0156] Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što se obično razume od strane običnog stručnjaka u tehnici kome ovaj pronalazak pripada. Iako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisani ovde mogu da se koriste u prakci ili pri testiranju pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani u nastavku. Dodatno, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrovani i nema se namera da budu ograničeni.

PRIMER

Primer 1. Variante anti-VLA-4 antitela su više moćnija nego humanizovani HP1/2.

[0157] Anti-VLA-4 antitela su konstruisana korišćenjem germlinijskog okvira IGKV4-1 (ili konstrukcija L1 i L2) ili germlinisko osmišenog AAH7033.1 (za konstrukciju L3) za VL lanac i germlinijskog okvira IGHV1-f za VH. Ove antitelne manje nazadne mutacije nego humanizovano HP1/2 antitelo su opisane u U.S. Patent Br.6,602,503.

Varijacije teškog lanca

[0158] Sekvence tri varijacije teškog lanca su prikazane na FIG.1 kao Konstrukcija H0, Konstrukcija H1 i kOnstrukcija H2. Svaka konstrukcija ima CDR’s murinski HP1/2 graftovan u IGHV1-f okvir. Konstrukcija H0 ne obuhvata obuhvata nazadnu mutaciju u okviru regiona sekvenci kako bi optimizovala afinitet humanizovanog antitela.

Varijacije lakog lanca

[0159] Sekvence od četiri varijacije lakog lanca su prikazane na FIG.2 kao Konstrukcija L0, Konstrukcija L1, Konstrukcija L2 i Konstrukcija L3 (takođe nazvane L0, L1, L2, L3). Svaka konstrukcija ima CDR’s murinski HP1/2 graftovan u germlinski okvir. IGKV4-1 germlinsli okvir je korišćen za Konstrukcije L0, L1, i L2, i AAH70335 germlinijski angažovan okvir je korišćen za Konstrukciju L3. Konstrukcija L0 ne obuhvata pozadinsku mutaciju okvirnog regiona, dok Konstrukcije L1, L2, i L3 imaju razne stepene pozadinskih mutacija u okvirnim regionima kako bi optimizovao afinitet humanizovanog antitela.

[0160] Rezultati kompeticije ELISA analiza su prikazani u Tbeli 1 i FIG.3. U ovom eksperimentu Įȕ1 je prethodno inkubiran sa testirajući mAb i potom je murinski HP1/2 korišćen kao kompeticijski reagens. Rezultati ovog eksperimenta gde antitela imaju laki lance L2 ili L3 su mnogo jači nego humanizovano antitelo HuHP1/2 koje je opisano u U.S. Patent Br.6,602,503. Rezultati su prikazani u Tabeli u nastavku, i na FIG.3. Teški lanac (H1) u antitelu za ovu analizu ima "Konstrukciju H1" sekvence prikazanu na FIG.1, gde se L1 odnosi na Konstrukciju L1 na FIG.2.

Tabela 1. Nadmetanje Analiza sa ELISA

[0161] U Tabeli 1, himerni mAb je himerizovano HP1/2 antitelo, gde varijabilni teški i laki lanci murina su genetski spojeni za humane IgG1 konstatne regione. Ovo antitelo je bitno identično u vezujućem afinitetu za originalno murinsko HP1/2 antitelo (Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol.16:1343-1349, 1996). Rezultati eksperimenta ukazuju da je moguće poboljšati afinitet monoklonalnog antitela relativno u odnosu na njegov murisnku osnovnu sekvencu kroz humanizaciju na germlinijsko angažovanom akceptorskom okviru.

[0162] Druga nadmetanja analiza poredi vezujući afinitet novih antitela sa humanizovanim 21.6 anti-Į4 antitelom (Tysabri® (natalizumab)) opisnaom u U.S.5,840,299. U ovom eksperimentu vezivanje smeše mišijeg HP1/2 sa testirani mAb do Įȕ1 je analizirana.

Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na FIG.4 i u Tabeli 2 u nastavku, i ukazuje da novo konstruisana antitela su oko 10-preklopa više snažnija nego natalizumab.

Tabela 2. Nadmetanje Analiza sa ELISA

Primer 2. Humanizovani HP1/2 (HuHP1/2) vezuje VLA-4 na tumornim ćelijskim linijama.

[0163] Vezivanje anti-VLA-4 antitela HuHP1/2 za više ćelijskih linija je testirano sa protočnom citometrijom. Vezivanje je testirano na CLL (hronična limfocitna leukemija) ćelijskim linijama Mec1 i JM1; na MM (multipla mijelom) ćelijkim linijama U266 i H929; i na AML (akutna mijelogena leukemija) ćelijskim linijama HL60 i KG1. HuHP1/2 vezuje sve testirane tumorne ćelijske linije (FIG.6). Podaci koji se odnose na citometrijski protok su korišćeni za izračunavanje vrednosti EC50 za antitelo koji se vezuju jedna za drugi različitih ćelijskih linija. Ova inflamacija je prikazana u Tabeli 3 u nastavku.

[0164] HuHP1/2 je takođe pronađen da blokira adheziju AML ćelijskih linija na fibronectinu (FN) i VCAM1-Ig fuzionom proteinu. Kako bi se testiralo da li antitelo može da blokira adheziju, AML ćelijskim linijama HL60 ili KG1 je dozvoljeno da se pridržavaju za FN-presvučene bunarčLće (FIG.7A) ili VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće (FIG.7B) u prisustvu povećavajućih koncentracija HP1/2 ili izotipa kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokirajuća adhezija oba ćelijska tipa do FN-presvučenih bunarčLća i VCAM1-Ig-presvučenih bunarčLća. Maksimalna inhibicija HL60 ćelije koja se vezuje za oba liganda je postignuta sa 20mg/ml HuHP1/2 (FIG.7C).

[0165] HuHP1/2 je takođe pronađeno da blokira adheziju MM ćelijskih linija za FN i VCAM1-Ig fuzionog proteina. MM ćelijskim linijama U266 i H929 je dozvoljeno da prijanjanju za FN-presvučene bunarčLće (FIG.8A) ili VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće (FIG.8B) u prisustvu povećavajućih koncentracija HP1/2 ili izotipa kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokirajuća adhezija oba tipa ćelijskih linija za FN- i VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće. Maksimalna inhibicija U266 ćelije koja se vezuje za oba liganda je postignuta sa 20mg/mL HuHP1/2 (FIG.8C).

[0166] HuHP1/2 je takođe pronađeno da blokira adheziju CLL ćelijskih linija za FN i VCAM1-Ig fuzioni protein. CLL ćelijskim linijama Mec1 i JM1 je dozvoljeno da prijanjaju za FN-presvučene bunarčLće (FIG.9A) ili VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće (FIG.9B) u prisustvu povećavajućih koncentracija HP1/2 ili izotipa kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokirajuće adhezije oba tipa ćelijskih linija za FN- i VCAM1-Ig-presvučene bunarčLće. Maksimalna inhibicija Mec1 ćelije koja se vezuje za oba liganda je dostignuta sa 20mg/ml HuHP1/2 (FIG.

9C).

[0167] IC50 vrednosti za HuHP1/2 koji se vezuje za tumorne ćelijske linije su izračunate iz podataka prikazani na FIG.7-9. Ovi podaci su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3. Kvantitacija HuHP1/2 na tumornim ćelijskim linijama

[0168] Druga rešenja su u zahtevima.

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući frgament, koji sadrži varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, pri čemu:

(a) varijabilni teški lanac sadrži okvir sekvence varijabilnog teškog lanca iz IGHVI-f i CDRs iz VH lanca murin antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu GFNIKDTYM, CDR2 sadrži sekvencu RIDPASGDTKYDPKFQV i CDR3 sadrži sekvencu GMWVSTGYALDF; i,

(b) varijabilni teški lanac sadrži okvir sekvence varijabilnog lakog lanca iz IGKV4-1 i CDRs iz VL lanca murin antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu KASQSVTNDVA, CDR2 sadrži sekvencu YASNRYT i CDR3 sadrži sekvencu QQDYSSPYT, pri čemu:

(i) amino kiselinski ostaci na pozicijama okvira 1, 67 i 87 varijabilnog lakog lanca prema Kabat šemi brojanja su supstituisani sa ne-humanim ostacima, pri čemu ne-humani ostatak na poziciji 1 okvira je serine (S), ne-humani ostatak na poziciji 67 okvira je tirozin (Y) i ne-humani ostatak na poziciji 87 okvira je fenilalanin (F); i (ii) amino kiselinski ostaci na pozicijama okvira 24 i 94 varijabilnog teškog lanca prema Kabat šemi brojanja su supstituisani sa ne-humanim ostacima, pri čemu ne-humani ostatak na poziciji 24 okvira je alanin (A) i ne-humani ostatak na poziciji 94 okvira je aspartinska kiselina (D);

i pri čemu rekombinantni molekul antitela ili njegov Į4-vezujući fragment vezuje VLA-4.

2. Postupak dobijanja rekombinantnog anti-Į4 antitela, ili njegovog Į4-vezujućeg fragmenta, obuhvata

(a) obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži DNK sekvencu koja kodira rekombinanti molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, prema zahtevu 1 i

(b) kultivisanje ćelije kako bi se dobio rekombinantni molekul anti-Į4 antitela ili njegov Į4 vezujući fragment.

3. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, prema zahtevu 1, za primenu kao medikament u lečenju pacijenta.

4. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, za primenu prema zahtevu 3 pri čemu pacijent ima kancer.

5. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, za primenu prema zahtevu 4, pri čemu pacijent ima čvrsti tumor, hematološku malignaciju, multipli mijelom ili akutnu mijeloidnu leukemiju (AML).

6. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, za primenu prema zahtevu 3, pri čemu pacijent ima inflamatorno oboljenje, multipla sklerozu, astmu, reumatoidni artritis, diabetes, optički neuritis, Crohn-ovu bolest, akutni poremećaj, povredu kičmene moždine ili traumatsku povredu mozga.

7. Rekombinantni molekul antitela, ili njegov Į4-vezujući fragment, za primenu prema zahtevu 3, pri čemu lečenje dalje obuhvata primenu na pacijenta drugog terapeutskog agensa, opciono odabran iz trombolitičnog agensa, hemoterapeutskog agensa, neurozaštitnog agensa, anti-inflamatornog agensa, steroida, citokina, ili faktora rasta.