RS56070B1

RS56070B1 - Nova imunoterapija protiv nekoliko tumora uključujući gastrointestinalni karcinom i karcinom želuca

Info

Publication number: RS56070B1
Application number: RS20170553A
Authority: RS
Inventors: Toni Weinschenk; Jens Fritsche; Steffen Walter; Peter Lewandrowski; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2017-10-31
Also published as: ES2753206T3; HUE033682T2; EP2547354A2; US9993523B2; EA201792409A3; ES2642562T3; NZ795528A; JP2021080263A; TWI486445B; US20210260160A1; JP2022141743A; CA2789857A1; US11298404B2; EA202091241A2; EP3329933A1; RS59554B1; EA202091250A2; JP2018057393A; RS54182B1; TW202102535A

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na tumor-asocirane epitope koje prepoznaju CD8+ T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji predstavljaju aktivne farmaceutske sastojke smeše za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore. Predmetni pronalazak odnosi se na peptidne sekvence dobijene iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, naročito odgovora od strane citotoksičnih T ćelija (CTL).

Osnovne informacije o pronalasku

Karcinom želuca je oboljenje u kojem se maligne ćelije formiraju u sluzokoži želuca. Karcinom želuca može da se razvije u bilo kom delu želuca i može da se proširi preko želuca na druge organe; konkretno na jednjak, pluća i jetru. Karcinom želuca je četvrti najčešći karcinom širom sveta sa 930.000 slučajeva dijagnostikovanih u 2002. godini. To je bolest sa velikom stopom smrtnosti (~800.000 godišnje), što ga čini drugim najčešćim uzrokom smrti usled raka širom sveta posle karcinoma pluća. On je češći kod muškaraca i javlja se češće u azijskim zemljama i zemljama u razvoju. (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.)

On predstavlja oko 2% (25.500 slučajeva) svih novih slučajeva raka na godišnjem nivou u Sjedinjenim Američkim Državama, ali je mnogo učestaliji u drugim zemljama. To je vodeća vrsta raka u Koreji, gde čini 20,8% malignih neoplazmi. U Japanu, karcinom želuca ostaje najčešći rak kod muškaraca. Svake godine u Sjedinjenim Američkim Državama karcinom želuca bude dijagnostikovan kod oko 13.000 muškaraca i 8.000 žena. Većina su stariji od 70 godina.

Karcinom želuca je četvrti najčešći karcinom širom sveta, nakon karcinoma pluća, dojke i kolona i rektuma. Pored toga, karcinom želuca ostaje drugi

najčešći uzrok smrti usled raka. Američko udruženje za rak procenjuje da je u 2007. godini bilo procenjenih milion novih slučajeva, od kojih je približno 70% bilo u zemljama u razvoju, i oko 800.000 smrtnih slučajeva (http://www.cancer.org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_2007_rev2.pdf.)

Postoji ogromna geografska varijacija u incidenciji ove bolesti širom sveta. Stope bolesti su najviše u Aziji i delovima Južne Amerike, a najniže u Severnoj Americi. Najveće stope smrtnosti zabeležene su u Čileu, Japanu, Južnoj Americi i bivšem Sovjetskom Savezu.

Karcinom želuca se često dijagnostikuje u uznapredovalom stadijumu, zato što se u većem delu sveta ne sprovodi skrining, izuzev u Japanu (i ograničeno u Koreji) gde se često postiže rana detekcija. Tako, on nastavlja da predstavlja veliki izazov za zdravstvene radnike. Faktori rizika za karcinom želuca su infekcija sa Helicobacter pylori (H. pylori), pušenje, visok unos soli i drugi faktori ishrane. Mali broj karcinoma želuca (1% do 3%) je udružen sa sindromima nasledne predispozicije za karcinom želuca. Mutacije E-kadherina javljaju se u približno 25% porodica sa autozomno dominantnom predispozicijom za difuzni tip karcinoma želuca. Ovaj podskup karcinoma želuca zove se nasledni difuzni karcinom želuca. Može biti od koristi da se obezbedi genetsko savetovanje i da se razmotri profilaktička gastrektomija kod mladih, asimptomatskih nosilaca gametske mutacije skraćivanja.

Zid želuca čine tri tkivna sloja: sluzokoža (unutrašnji sloj), mišićni (srednji) sloj i serozni (spoljašnji) sloj. Karcinom želuca započinje u ćelijama koje sačinjavaju sluzokožu i kako raste, širi se kroz spoljašnje slojeve. Koriste se četiri vrste standardnog lečenja. Lečenje karcinoma želuca može uključivati operativni zahvat, hemioterapiju, zračnu terapiju ili hemioiradijaciju. Operativno lečenje predstavlja primarnu terapiju za karcinom želuca. Cilj operativnog lečenja je da se postigne kompletna resekcija sa negativnim ivicama (R0 resekcija). Međutim, približno 50% pacijenata sa lokoregionalnim karcinomom želuca ne može da bude podvrgnuto R0 resekciji. R1 označava mikroskopski rezidualni karcinom (pozitivne ivice); a R2 označava krupni (makroskopski) rezidualni karcinom, ali bez udaljene bolesti. Ishod pacijenta zavisi od inicijalnog stadijuma karcinoma u vreme postavljanja dijagnoze (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology™).

Stopa 5-godišnjeg preživljavanja za kurativnu hiruršku resekciju kreće se u rasponu od 30 do 50% za pacijente sa bolešću u stadijumu II i od 10 do 25% za pacijente sa bolešću u stadijumu III. Kod ovih pacijenata postoji velika verovatnoća za lokalni i sistemski relaps. Metastaze se javljaju u 80-90% osoba sa karcinomom želuca, sa stopom šestomesečnog preživljavanja od 65% kod onih kojima je dijagnoza postavljena u ranim stadijumima i manje od 15% kod onih kojima je dijagnoza postavljena u kasnim stadijumima.

Stoga, i dalje postoji potreba za novom efikasnom i bezbednom opcijom lečenja za karcinom želuca, karcinom prostate, karcinome usne duplje, oralni skvamocelularni karcinom (OSCC), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), MALT limfom indukovan H. pylori, karcinom kolona/kolorektalni karcinom, glioblastom, nemikrocelularni karcinom pluća (NSCLC), karcinom grlića materice, humani karcinom dojke, rak prostate, rak kolona, karcinome pankreasa, pankreasni duktalni adenokarcinom, karcinom jajnika, hepatocelularni karcinom, rak jetre, tumore mozga različitih fenotipova, leukemije kao što su akutna limfoblastna leukemija (ALL), rak pluća, Juingov (eng. Ewing) sarkom, karcinom endometrijuma, skvamocelularni karcinom glave i vrata, epitelijalni karcinom larinksa, karcinom jednjaka, karcinom usne duplje, karcinom mokraćne bešike, karcinome jajnika, karcinom bubrežnih ćelija, atipični meningeom, papilarni karcinom štitaste žlezde, tumore mozga, karcinome pljuvačnog kanala, rak grlića materice, ekstranodularne T/NK-ćelijske limfome, Non-Hočkinov limfom i maligne solidne tumore pluća i dojke i druge tumore, koja bi poboljšala stanje pacijenata bez primene hemioterapijskih agenasa ili drugih agenasa koji mogu imati ozbiljna neželjena dejstva.

U dokumentu WO 2007/005638 izložen je ASPM za upotrebu u medicini, kao i odgovarajuća nukleinska kiselina, vektori i ćelije domaćina, peptid koji je specifično definisan u predmetnom patentnom zahtevu 1 nije izložen u D13. Suri Anish et al, Eur J Imunol vol. 36, br.3, mart 2006, stranice 544-557 (potporne informacije) izlaže peptid ID BR. SEKV 2 koji se vezuje za MHC molekule klase I H2-Kd normalnih i TAP deficijentnih ćelija. Predmetni pronalazak inkorporira peptide koji stimulišu imunski sistem i deluju kao antitumorski agensi na neinvazivan način.

Kratak pregled pronalaska

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije (TCD8<+>), koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 10 aminokiselinskih ostataka dobijene iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Postoje dve klase MHC molekula: MHC molekuli klase I koji se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina (MHC klasa I receptori) odnosno alfa i beta lanca (MHC klasa II receptori). Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. MHC klase I prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, DRIP-ova i većih peptida. MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ). Oni primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju u toku procesa endocitoze, i nakon toga obrađuju. Komplekse peptida i MHC molekula klase I prepoznaju CD8-pozitivni citotoksični T limfociti koji nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

Da bi peptid izazvao ćelijski imunski odgovor, on mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i spečifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida.

Peptidi koji vezuju MHC klasu I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični CTL, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani da mogu da prepoznaju T ćelije, pripadaju ovoj klasi koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ovi antigeni ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije ili NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ovi TAA dele tumore i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao; većina njih nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za karcinom prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je βkatenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore, a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumorspecifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne, ili u uporedivo malim količinama, od strane normalnih zdravih tkiva. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). U oba slučaja, esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, budući da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena, treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije sa odgovarajućim TCR-om i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Zato su TAA početna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi CTL koji mogu biti izolovani iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva.

Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna subpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR-om i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. Zato je važno da se odaberu samo oni peptidi iz prekomerno eksprimiranih ili selektivno eksprimiranih proteina koji su prezentovani u vezi sa MHC molekulima protiv kojih se može naći funkcionalna T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

T pomoćničke ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Kratak opis crteža

Slika 1: Primerni maseni spektar iz CDC2-001 koji pokazuje njegovu prezentaciju na primarnom uzorku tumora GC2464. NanoESI-LCMS je izvršena na peptidnom pulu eluiranom iz uzorka Ca želuca 2464. Maseni hromatogram za m/z 597.3501 ± 0,001 Da, z = 2 pokazuje maksimum peptida na vremenu retencije 151,63 min. B) Detektovani maksimum u masenom hromatogramu na 151,63 min otkrio je signal m/z 597.3501 u MS spektru. C) Maseni spektar kolizijom indukovane disocijacije iz izabranog prekursora m/z 597.3501 zabeležen u nanoESI-LCMS eksperimentu na datom vremenu retencije potvrdio je prisustvo CDC2-001 u uzorku tumora GC2464. D) Obrazac fragmentacije sintetičkog CDC2-001 referentnog peptida zabeležen je i upoređen sa generisanim prirodnim obrascem fragmentacije TUMAP prikazanim u C za verifikaciju sekvence.

Slika 2: Profili ekspresije mRNK izabranih proteina u normalnim tkivima i u 25 uzoraka karcinoma želuca

a) CDC2 (ID kompleta probe: 203213_at)

b) ASPM (ID kompleta probe: 219918_s_at)

Slika 3: Primerni rezultati peptid-specifične in vitro imunogenosti TUMAP klase I. CD8+ T ćelije su pripremljene pomoću veštačkih APĆ u koje je ubačen relevantni (levi panel) odnosno irelevantni peptid (desni panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je dvostrukim bojenjem sa relevantnim plus irelevantnim A*2402-multimerima. Prikazane ćelije su sinhronizovane na živim CD8+ limfocitima, a brojevi u dijagramu predstavljaju procente multimerpozitivnih ćelija.

Detaljan opis pronalaska

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku. Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfaamino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, ili duži sa dužinom od 10, 11, 12, 13 ili 14 aminokiselina.

Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 14 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor.

T-ćelijski „epitop“ zahteva kratak peptid koji se vezuje za MHC receptor klase I, koji obrazuje trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*0l, HLA-A*02 i HLA-A*024 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od

ovih lokusa.

Tabela 1: Učestalosti ekspresije F HLA*A024 i najučestaliji serotipovi HLA*A02402. Učestalosti

su izvedene iz učestalosti haplotipova Gfunutar američke populacije adaptirane iz rada Mori et al.

(Mori et al.1017-27) primenom Hardi-Vajnberg formule F=1-(1-Gf)². Za detalje pogledajte rad

Chanock et al. (Chanock et al.1211-23).

Učestalosti ekspresije serotipova HLA*24 i A*2402 širom sveta

Alel Populacija Fenotip izračunat na osnovu učestalosti alela

A*24 Filipini 65%

A*24 Ruski Nenci 61%

A*240 Japan 59%

2

A*24 Malezija 58%

A*240 Filipini 54%

2

A*24 Indija 47%

A*24 Južna Koreja 40%

A*24 Šri Lanka 37%

A*24 Kina 32%

A*240 Indija 29%

2

A*24 Zapadna Australija 22%

A*24 SAD 22%

A*24 Rusija, Samara 20%

A*24 Južna Amerika 20%

A*24 Evropa 18%

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na DNK sekvencu obuhvata i

jednolančanu i dvolančanu DNK. Tako, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije,

odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim

komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence. Termin

„kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod

ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod

prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer deoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu deoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani u takvom vektoru ili smeši koji nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, jer se ti termini podrazumevaju od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine izričito se razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito se razmatra.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.

Termin „aktivni fragment“ označava fragment koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Ovo znači da će bilo koji takav fragment kao deo svog niza aminokiselina nužno sadržati segment, fragment ili deo, koji je u velikoj meri identičan, ako ne i potpuno identičan, sekvenci ID BR.

SEKV: 1 do 33 koje su istovetne sa prirodno postojećim ili „roditeljskim“ proteinima ID BR. SEKV: 1 do 33. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od uobičajenih endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa sekvencom shodno patentnom zahtevu ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili sekvencom shodno patentnom zahtevu („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

Procenat identičnosti = 100 [I -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku; a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Originalni peptidi koji su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike, ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi, a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koji inače ne bi mogli da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima pronalaska, a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, aminokiseline koje poseduju nestandardne R grupe (tj. R grupe koje se ne nalaze u uobičajenih 20 aminokiselina prirodnih proteina) takođe se mogu koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane CTL, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Poželjno, kada se CTL specifični za peptid sa ID BR. SEKV: 1 do 33 testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane CTL dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

Tako epitopi predmetnog pronalaska mogu biti identični prirodno javljajućim tumor-asociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od 4 ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.

Imunoterapijski pristupi za lečenje

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena sada je otvorilo mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 12 ostataka dobijene iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

MHC molekuli klase I se mogu naći na većini ćelija koje sadrže jedro koje prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja uglavnom endogenih proteina, proteina citosola ili jedra, DRIP-ova i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija.

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne, ili u uporedivo malim količinama, od strane normalnih zdravih tkiva. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu takođe biti ushodno regulisani i tako indirektno biti tumorasocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa. U oba slučaja, esencijalno je prisustvo epitopa u aminokiselinskoj sekvenci antigena, budući da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

Zato su TAA početna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi CTL koji mogu biti izolovani iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva (Lemmel et al.450-54;Weinschenk et al.5818-27).

T pomoćničke ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL-a u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asociranih peptida/MHC-a na površini ćelije. Na ovaj način, tumor-asocirani peptidni epitopi T pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8-pozitivnih CTL (MHC molekul klase I) ili pomoću CD4-pozitivnih CTL (MHC molekul klase II) važna je u razvoju tumorskih vakcina. Zato je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi smeše peptida koje sadrže peptide koji se vezuju za MHC komplekse bilo koje od ove dve klase.

Imajući u vidu ozbiljna neželjena dejstva i troškove u vezi sa lečenjem karcinoma preko su potrebni bolji metodi prognoze i dijagnostikovanja. Zato, postoji potreba da se identifikuju drugi faktori koji predstavljaju biomarkere za karcinom uopšte i konkretno za karcinom želuca. Pored toga, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju karcinoma uopšte i konkretno karcinoma želuca.

Nadalje, ne postoji ustanovljen terapijski dizajn za pacijente sa karcinomom želuca sa biohemijskim relapsom nakon radikalne prostatektomije, koja je obično izazvana rezidualnim tumorom ostavljenim in situ u prisustvu lokalno uznapredovalog rasta tumora. Bili bi poželjni novi terapijski pristupi koji pružaju niži morbiditet sa uporedivom terapijskom efikasnošću u odnosu na trenutno dostupne terapijske pristupe.

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji su korisni za lečenje karcinoma želuca i druge tumore koji prekomerno eksprimiraju peptide pronalaska. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na uzorcima primarnog humanog karcinoma želuca (pogledajte primer 1 i sliku 1).

Dokazano je da je izvorni gen iz kojeg su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimiran u karcinomu želuca, karcinomu bubrežnih ćelija, karcinomu kolona, nemikrocelularnom karcinomu pluća, adenokarcinomu, karcinomu prostate, benignim neoplazmama i malignom melanomu u poređenju sa normalnim tkivima (pogledajte primer 2 i sliku 2), što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije peptida, tj. ovi peptidi su snažno prezentovani na tumorskom tkivu, ali ne i na normalnim tkivima.

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično od strane T limfocita/T ćelija. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije karcinoma želuca koje prezentuju dobijene peptide.

Pokazano je da su svi peptidi predmetnog pronalaska, koji su bili kompatibilni sa platformom za validaciju – pogledajte primer 3, sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore (pogledajte primer 3 i sliku 3). Tako su peptidi korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ se odnosi na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati) ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Pored toga što su korisni za lečenje malignih tumora, peptidi predmetnog pronalaska su takođe korisni kao sredstva za dijagnostikovanje. Budući da su peptidi napravljeni iz ćelija karcinoma želuca i budući da je utvrđeno da ovi peptidi nisu prisutni u normalnim tkivima, ovi peptidi mogu da se koriste za dijagnostikovanje prisustva malignog tumora.

Prisustvo peptida patentnog zahteva na biopsijama tkiva može da pomogne patologu u postavljanju dijagnoze karcinoma. Detekcija određenih peptida pomoću antitela, masene spektrometrije ili drugih metoda poznatih u stručnoj oblasti mogu da pokažu patologu da je tkivo maligno ili inflamirano ili uopšteno obolelo. Prisustvo grupa peptida može da omogući klasifikaciju ili subklasifikaciju obolelih tkiva.

Detekcija peptida na uzorku obolelog tkiva može da omogući donošenje odluke o koristima terapija koje uključuju imunski sistem, posebno ako je poznato ili se očekuje da T limfociti budu uključeni u mehanizam delovanja. Gubitak MHC ekspresije je dobro opisani mehanizam pomoću kojeg inficirane ili maligne ćelije izbegavaju imunološki nadzor. Tako prisustvo peptida pokazuje da analizirane ćelije ne iskorišćavaju ovaj mehanizam.

Peptidi mogu da se koriste za analizu limfocitnih odgovora protiv tih peptida, kao što su T-ćelijski odgovori ili odgovori antitelima protiv peptida ili peptida u kompleksu sa MHC molekulom. Ovi limfocitni odgovori mogu da se koriste kao prognostički markeri za donošenje odluke o daljim koracima lečenja. Ovi odgovori mogu takođe da se koriste kao surogat markeri u imunoterapijskim pristupima čiji je cilj indukcija limfocitnih odgovora pomoću različitih sredstava, npr. vakcinacije proteinom, nukleinskim kiselinama, autolognim materijalom, ili adoptivni transfer limfocita. U smislu genske terapije, limfocitni odgovori protiv peptida mogu se razmatrati u pogledu procene neželjenih dejstava. Praćenje limfocitnih odgovora može takođe biti dragocena alatka za kontrolne preglede terapija transplantacijom, npr. za detekciju bolesti graft protiv domaćina i domaćin protiv grafta.

Peptidi mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Oni se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Pored toga, ona mogu da se koriste za verifikaciju dijagnoze malignog tumora patologa postavljene na osnovu uzorka biopsije.

Predmetni pronalazak usmeren je na peptid koji ima celokupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina, koje sadrže sekvencu izabranu iz grupe a) sekvenca koja sadrži ID BR. SEKV 2 b) varijante ID BR. SEKV 2 koja indukuje unakrsnu reakciju T ćelija sa navedenim peptidom, naznačeno time što je navedena varijanta izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF za upotrebu u medicini.

U tabeli 2 su prikazani opisani peptidi, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV, kao i izvorni proteini iz kojih ovi peptidi mogu nastati. Svi peptidi se vezuju za HLA A*024 alele.

Tabela 2: Izneti peptidi

* peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom Dodatni interesantni HLA A*024 peptidi

U drugom otelotvorenju pronalaska, predstavljeni su peptidi protiv karcinoma želuca koji se vezuju za HLA A*02. Za osobe koje su A*02 i/ili A*24 pozitivne, smeše predstavljenih peptida mogu da se koriste za lečenje karcinoma želuca. Preferiraju se smeše od 2 do 20 peptida i smeše od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 i 20 peptida.

Protein ciklusa ćelijske deobe 2 (CDC2)

Serin/treonin kinaza CDC2, takođe poznata kao Cdk1 (ciklin-zavisna kinaza 1), igra važnu ulogu u kontroli ćelijskog ciklusa. Poznata je kao glavni regulator tranzicije iz faze G2 u fazu M. Na kraju međufaze, ona se vezuje za cikline tipa A. Nakon razgrađivanja omotača jedra, ciklini tipa A se zamenjuju ciklinom B, koji obrazuje faktor promocije mitoze (MPF) sa Cdc2. MPF je od suštinskog značaja za vođenje ćelija kroz mitozu.

Funkcija Cdc2 u mitozi je nezamenjiva i ne može da se kompenzuje pomoću aktivnosti drugih Cdk, kao što su Cdk2, 4 i 6. Za razliku od toga, prijavljeno je da Cdc2 ima ulogu i u drugim fazama ćelijskog ciklusa, kao što je takođe prelazak G1-S, i da je u stanju da zameni „međufazne Cdk“. Stoga se smatra da je Cdc2 jedina esencijalna Cdk ćelijskog ciklusa.

Prekomerna ekspresija Cdc2 je pronađena kod nekoliko karcinoma i često korelira sa lošom prognozom. Među njima se nalaze karcinom prostate, karcinomi usne duplje, oralni skvamocelularni karcinom (OSCC), akutna mijeloidna leukemija (AML) (Qian et al.), MALT limfom indukovan H. pylori (Banerjee et al.217-25) i karcinom kolona (Yasui et al.36-41). U karcinomu želuca, prijavljena je prekomerna ekspresija i/ili pojačana aktivnost i ona bi mogla da ima ulogu u uzrokovanju istog. Inhibitori Cdc2 i drugih Cdk su razmotreni kao kandidati za lekove za terapiju raka (Shapiro 1770-83).

Abnormalni vretenasti protein udružen sa mikrocefalijom (ASPM)

Abnormalni vretenasti protein udružen sa mikrocefalijom (ASPM) je humani ortolog abnormalnog vretena Drozofile (asp). On je uključen u regulaciju neurogeneze i njegova mutacija dovodi do nastanka autozomno recesivne primarne mikrocefalije. ASPM se nalazi na polovima deobnog vretena u toku mitoze. Prekomerna ekspresija ASPM predložena je kao marker i potencijalni cilj terapije u lečenju glioblastoma. siRNK-posredovano utišavanje ekspresije inhibira proliferaciju tumorskih ćelija i proliferaciju nervnih matičnih ćelija. Prekomerna ekspresija ASPM može takođe da predvidi pojačan invazivni/metastatski potencijal, ranu rekurenciju tumora i lošu prognozu kod hepatocelularnog karcinoma. ASPM je bio ushodno regulisan kod besmrtnih ćelija i u tkivima nemikrocelularnog karcinoma pluća (Jung, Choi, and Kim 703-13).

Matriksne metaloproteaze 3 (MMP3)

MMP3, takođe nazvana progelatinaza ili stromelizin 1, jeste endopeptidaza koja cepa komponente ekstraćelijskog matriksa (EĆM), kao što su fibronektin, laminin, elastin, protein jezgra proteoglikan i neheliksni regioni kolagena. MMP su važni za nekoliko fizioloških procesa koji zahtevaju preuređivanje EĆM, kao što je migracija ćelija tokom embriogeneze, remodeliranje tkiva, vaskularizacija, involucija dojke u laktaciji i zarastanje rana. MMP3 takođe imaju ulogu u agregaciji trombocita. Patološka stanja koja uključuju pojačanu ekspresiju i sekreciju MMP3 uključuju autoimunska zapaljenska stanja i maligne tumore.

MMP3 je prekomerno eksprimirana u nekim tumorima, i ima ulogu u epitelno-mezenhimnoj tranziciji (EMT). Ona takođe može doprineti u ranim fazama kancerogeneze, time što izaziva epigenetske promene koje dovode do stvaranja malignog fenotipa (Lochter et al.180-93). Pokazano je da polimorfizmi u MMP3 promoteru, koji su udruženi sa nivoima ekspresije, utiču na rizik i prognozu nekih karcinoma kao što su adenokarcinom jednjaka (Bradbury et al.793-98) i skvamocelularni karcinom usne duplje (Vairaktaris et al.4095-100) (Liu et al.430-35). Pacijenti sa karcinomom želuca koji je pozitivan na H.pylori sa povišenim nivoima MMP3 i MMP7 u serumu imali su veću invaziju limfnih čvorova i kraće preživljavanje. U kohorti koju su činila 74 pacijenata sa karcinomom želuca, MMP3 je bio eksprimiran u 27% slučajeva (Murray et al.791-97).

c-Met

c-Met posreduje u potencijalno onkogenim aktivnostima faktora rasta hepatocita (HGF)/faktora rasejanja, što uključuje promociju rasta ćelija, motilitet, preživljavanje, rastvaranje ekstraćelijskog matriksa i angiogenezu. Vezivanje HGF aktivira nishodne signalne događaje, uključujući Ras, fosfatidilinozitol 3' kinazu, fosfolipazu Cγ i mitogenom-aktivirane protein kinazne puteve (Dong et al. 5911-18;Furge et al.10722-27;Furge, Zhang, and Vande Woude 5582-89;Montesano et al.355-65;Naldini et al.501-04;Ponzetto et al.4600-08). c-Met je predominantno eksprimiran u epitelijalnim ćelijama. Onkogena aktivnost c-Met (takođe i u neepitelnim malignim tkivima) može nastati usled amplifikacije/prekomerne ekspresije, aktivirajućih mutacija, akvizicije HGF/c-met autokrinih petlji ili konstitutivne fosforilacije (Di Renzo et al.147-54;Ferracini et al.739-49;Fischer et al.733-39;Koochekpour et al.5391-98;Li et al.8125-35;Maulik et al.41-59;Qian et al.589-96;Ramirez et al.635-44;Tuck et al.225-32) (Nakaigawa et al.3699-705). Konstitutivna aktivacija c-Met kod transgenskih miševa koji prekomerno eksprimiraju HGF pokreće opštu tumorogenezu (Takayama et al.701-06;Wang et al.1023-34). Utišavanje MET rezultuje inhibicijom rasta tumora i metastaza (Corso et al.684-93). Amplifikacija MET je dovedena u vezu sa progresijom karcinoma želuca kod ljudi (Lin et al.5680-89).(Yokozaki, Yasui, and Tahara 49-95).

Ubikvitin karboksil-terminalna hidrolaza L5 (UCHL5)

UCHL5, takođe poznata kao ubikvitin C-terminalna hidrolaza (UCH37) ili INO80R, jeste deubikvitinaza povezana sa proteazomom. Ona rastavlja poliubikvitinske lance spojene sa proteinima sa distalnog kraja, tako što cepa izopeptidnu vezu između C-terminalnog Cys76 i Lys48 (Nishio et al.855-60). U nukleusu, UCHL5 je povezan sa Ino80 hromatin-remodelirajućim kompleksom. Nakon vezivanja sa proteazom, ona postaje aktivirana i može doprineti regulaciji transkripcije ili reparacije DNK, za koju se sugeriše da je posredovana Ino80 i proteazomom.

Ubikvitin-specifične proteaze, poput UCHL5, uključene su u nekoliko procesa kao što su kontrola progresije ćelijskog ciklusa, diferencijacija, replikacija i reparacija DNK, transkripcija, kontrola kvaliteta proteina, imunski odgovor i apoptoza. UCHL5 može doprineti malignoj transformaciji. Pokazano je da je njena aktivnost ushodno regulisana u tkivu karcinoma grlića materice kod ljudi, u poređenju sa okolnim normalnim tkivom. Ona može da deubikvitinira i samim tim stabilizuje TGF-beta receptor i njegove nishodne medijatore, Smad proteine, čime pojačava TGF-beta signalizaciju. Pojačana TGF-beta signalizacija može da deluje kao tumorski promoter u kasnim stadijumima progresije karcinoma, iako ima dvojnu ulogu i takođe može biti tumorski supresor u ranim stadijumima i pre incijacije (Bierie and Moses 29-40;Horton et al.138-43;Wicks et al.8080-84;Wicks et al.761-63).

Proteinski receptor koji stimuliše makrofage (MST1R)

MST1R (takođe poznat kao RON) receptor je član Met familije receptorskih tirozin kinaza na ćelijskoj površini, i primarno je eksprimiran na epitelijalnim ćelijama i makrofagima. MST1R može da indukuje migraciju, invaziju, proliferaciju i preživljavanje ćelija, kao odgovor na njegov ligand. Onkogena svojstva su pokazana in vitro kao i na životinjskim modelima in vivo, i često je deregulisan u humanim karcinomima (Dussault and Bellon, 2009). Kliničke studije su pokazale da je prekomerna ekspresija MST1R udružena sa lošom prognozom i nastankom metastaza. Ekspresija MST1R je značajna u tkivima karcinoma želuca i podudarnom paraneoplastičnom tkivu, ali nije zapažena u normalnoj sluzokoži želuca (Zhou et al.236-40). Utišavanje ekspresije MST1R u ćelijama karcinoma prostate rezultuje smanjenom hemotaksom endotelijalnih ćelija in vitro, kao i smanjenim rastom tumora i smanjenom gustinom mikro krvnih sudova posle ortotopske transplantacije u prostatu in vivo. siRNK-posredovano utišavanje ekspresije MST1R, u visoko tumorogenoj ćelijskoj liniji karcinoma kolona, dovelo je do smanjene proliferacije, u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Kinezinu sličan protein (KIF2C)

KIF2C je mikrotubulna depolimeraza koja reguliše pravilno povezivanje kinetohore i mikrotubula u toku formiranja vretena. Važan je za odvajanje hromozoma u anafazi i može biti neophodan za koordinaciju početka odvajanja sestrinskih centromera. Poremećeno povezivanje mikrotubula na kinetohorama dovodi do pogrešnog odvajanja hromozoma i aneuploidije, što se zapaža kod većine solidnih tumora (Maney et al.67-131;Moore and Wordeman 537-46). KIF2C je prekomerno eksprimiran u ćelijama karcinoma dojke (Shimo et al.62-70), karcinoma kolona, kolorektalnog karcinoma i karcinoma želuca (Nakamura et al.543-49). Ćelijska linija karcinoma želuca (AZ521) koja stabilno eksprimira KIF2C pokazala je povećanu proliferaciju i migraciju u poređenju sa lažno transfektovanim ćelijama. Povećana ekspresija KIF2C kod karcinoma želuca može da bude udružena sa invazijom limfatika, metastazama u limfnim čvorovima i lošom prognozom. Tretiranje ćelija karcinoma dojke sa malim interferirajućim RNK, koje su usmerene protiv KIF2C, inhibiralo je njihov rast.

Proteini strukturalnog održavanja hromozoma 4 (SMC4)

SMC proteini su hromozomske ATP-aze koje imaju ulogu u organizaciji i dinamici hromozoma višeg stepena. SMC4 je jezgrena komponenta kondenzinskog kompleksa, koji ima ulogu u kondenzaciji hromatina, a doveden je takođe u vezu sa nukleolarnom segregacijom, reparacijom DNK i održavanjem regije privezivanja hromatina. Pronađeno je da je SMC4 gen veoma visoko eksprimiran u normalnoj prostati i pljuvačnoj žlezdi, veoma slabo u kolonu, pankreasu i crevima, a nimalo u drugim tkivima. Ekspresija RNK je opažena u visokim nivoima u mnogim ćelijskim linijama karcinoma i uzorcima karcinoma, uključujući karcinom dojke, prostate, kolona i pankreasa (Egland et al.5929-34).

Efrin tip A receptor 2 (EPAH2)

Eph receptori su jedinstvena familija receptorskih tirozin kinaza (RTK), koji imaju ključne uloge u formiranju embrionskih obrazaca, neuronskom ciljanju i vaskularnom razvoju u toku normalne embriogeneze. Stimulacija EphA2 pomoću njegovog liganda (efrin-A1) dovodi do autofosforilacije EphA2, stimulacija vrši reverziju onkogene transformacije. Eph receptori i njihovi ligandi efrini su često prekomerno eksprimirani u širokom spektru karcinoma. EphA2 je često prekomerno eksprimiran i funkcionalno izmenjen u agresivnim tumorskim ćelijama i smatra se da vrši promociju rasta tumora tako što pojačava adheziju ćelija za ekstraćelijski matriks, rast nezavisan od usidravanja i angiogenezu. Prekomerna ekspresija EphA2 i EfrinaA-1 je pokazana kod karcinoma želuca, što korelira sa dubinom invazije tumora, stadijumima po TNM klasifikaciji, metastazama u limfnim čvorovima i lošom prognozom (Yuan et al.2410-17).

ATAD2

ATAD2 (takođe poznat kao ANCCA) je novi član AAA+ ATP-azne familije proteina. On pojačava transkripcionu aktivnost androgenog receptora (AR) i estrogenog receptora (ER), dovodeći do transkripcije gena što uključuje IGF1R, IRS-2, SGK1 i preživljavanja (AR) odnosno ciklin D1, cmyc i E2F1 (ER). On takođe pojačava transkripcionu aktivnost c-Myc.

Ekspresija ATAD2 je visoka kod nekoliko humanih tumora, kao što su karcinom dojke, karcinom prostate i osteosarkom. Ekspresija je dovedena u vezu sa lošom prognozom.

AVL9

Iznenađujuće, pronađeno je da je ovaj protein izvorni protein, a dostupno je vrlo malo ograničenih podataka o AVL9 proteinu i funkciji odgovarajućeg gena.

Kolagen alfa-1 (XII) lančani protein (Col12A1)

Kolagen alfa-1 (XII) lanac je protein koji kod ljudi kodira gen COL12A1. Ovaj gen kodira alfa lanac kolagena tipa XII, člana FACIT (kolageni udruženi sa fibrilama sa prekinutim trostrukim spiralama) familije kolagena. Tip XII kolagena je homotrimer koji se nalazi u vezi sa tipom I kolagena, vezi za koju se smatra da modifikuje interakcije između fibrila kolagena I i okolnog matriksa. Identifikovane su i alternativne spojene varijante transkripta koje kodiraju različite izooblike.

Kolagen alfa-3(VI) lančani protein (COL6A3)

COL6A3 kodira alfa-3 lanac, jedan od tri alfa lanca kolagena tipa VI. Pokazano je da se proteinski domeni vezuju za proteine ekstraćelijskog matriksa, interakcija koja objašnjava značaj ovog kolagena u organizaciji komponenti matriksa. Remodeliranje ekstraćelijskog matriksa kroz prekomernu ekspresiju kolagena VI doprinosi otpornosti ćelija karcinoma jajnika na cisplatin.

Prisustvo kolagena VI korelira sa gradusom tumora, prognostičkim faktorom za karcinom jajnika (Sherman-Baust et al.377-86). COL6A3 je prekomerno eksprimiran u kolorektalnom tumoru (Smith et al.1452-64), karcinomu pljuvačnih žlezda (Leivo et al.104-13) i diferencijalno eksprimiran u karcinomu želuca (Yang et al.1033-40). COL6A3 je identifikovan kao jedan od sedam gena sa tumor-specifičnim spojenim varijantama. Validirane tumor-specifične spojene alteracije su bile veoma dosledne, što je omogućilo jasno odvajanje normalnih od malignih uzoraka, a u nekim slučajevima čak i različitih stadijuma tumora (Thorsen et al.1214-24).

Fankonijeva anemija, komplementaciona grupa I (FANCI)

FANCI protein se lokalizuje u hromatinu kao odgovor na oštećenje DNK i uključen je u reparaciju DNK (Smogorzewska et al.289-301). Mutacije u FANCI genu dovode do Fankonijeve anemije, genetskog heterogenog recesivnog poremećaja, koji karakteriše citogenetska nestabilnost, preosetljivost na agense koji unakrsno vezuju DNK, povećano oštećenje hromozoma i defektna reparacija DNK. Alternativno spajanje FANCI daje dve varijante transkripta, koje kodiraju različite izooblike.

Protein toplotnog šoka 90kDa beta član 1 (HSP90B1)

HSP90 član 1 (takođe poznat kao protein regulisan glukozom 94, Grp94) je humani šaperon. On učestvuje u procesima povezanim sa ER kao što su: translacija, kontrola kvaliteta proteina i degradacija povezana sa ER (ERAD), ER detekcija stresa i vezivanje kalcijuma / zadržavanje kalcijuma u ER (Christianson et al.272-82;Fu and Lee 741-44). HSP90 sadrži KDEL sekvencu, tipičnu za rezidentne proteine ER, ali se takođe pojavljuje i na površini tumorskih ćelija (Altmeyer et al.340-49), kao i ekstraćelijski. Poznato je da se HSP oslobađaju iz nekrotičnih (ali ne i apoptotičnih) ćelija i iz ćelija koje su pod stresom usled različitih stimulusa, kao što su toplotni šok i oksidativni stres, i mogu se naći u cirkulaciji (Basu et al.1539-46;Tsan and Gao 274-79). Van ćelija, HSP90 modulira (uglavnom stimuliše) imunske odgovore i uključen je u prezentaciju antigena. Na površini ćelija, može da služi kao receptor za ulazak patogena i/ili signalizaciju (Cabanes et al. 2827-38). U slučaju tumor-specifične ekspresije na površini ćelija ili oslobađanja, on može indukovati antitumorski imunitet (Zheng et al.6731-35). Pokazano je da vakcine bazirane na HSP90 stvaraju imunitet protiv malignog tumora i infektivnih bolesti i u profilaktičkim i u terapijskim protokolima (pregledano u (Bolhassani and Rafati 1185-99;Castelli et al.227-33;Murshid, Gong, and Calderwood 1019-30)).

Međutim, HSP90 se može smatrati i ciljem antitumorske terapije budući da 1) korelira sa progresijom tumora i dovodi do rezistencije na apoptozu, takođe nakon lečenja zračenjem ili hemioterapije, i 2) prekomerno je eksprimiran u mnogim tumorima uključujući karcinom želuca, osteosarkom (Guo et al.62-67), karcinom dojke (Hodorova et al.31-35). Prekomerna ekspresija HSP90 udružena je sa agresivnim ponašanjem i lošom prognozom kod karcinoma želuca (Wang, Wang, and Ying 35-41;Zheng et al.1042-49). Nishodna regulacija HSP90 u karcinomu želuca dovodi do apoptoze malignih ćelija (Sheu, Liu, and Lan e1096).

Muc 6

MUC6 je eksprimiran u ćelijama mukoze. Smatra se da je njegova primarna funkcija zaštita osetljivih epitelnih površina od štetnih efekata stalnog izlaganja širokom spektru endogenih kaustičnih ili proteolitičkih agenasa (Toribara et al., 1997). MUC6 takođe može imati ulogu u organogenezi epitela (Reid and Harris, 1999). Ekspresija MUC6 se može naći u normalnoj sluznici želuca. Prekomerno je eksprimiran u nekim malignim tumorima kao što su intestinalni adenom i karcinom, karcinom pluća (Hamamoto et al.891-96), kolorektalni polipi (Bartman et al.210-18) i karcinom dojke (Pereira et al.210-13), dok u odgovarajućim normalnim tkivima nije eksprimiran. Smatra se da visok stepen ekspresije MUC6 u mucinoznim karcinomima deluje kao barijera širenju karcinoma, dovodeći do njihovog manje agresivnog biološkog ponašanja (Matsukita et al.26-36). Ekspresija MUC6 je bila niža u karcinomima želuca nego u adenomima ili normalnoj sluznici, i obrnuto je korelirala sa veličinom tumora, dubinom invazije, invazijom limfatika i venskih sudova, metastazama u limfnim čvorovima i određivanjem stadijuma prema Međunarodnoj uniji za borbu protiv raka (UICC). Nishodna regulacija MUC6 može doprineti malignoj transformaciji želudačnih epitelnih ćelija i biti u osnovi molekularne osnove rasta, invazije, metastaziranja i diferencijacije karcinoma želuca (Zheng et al.817-23). Takođe postoje dokazi da je infekcija sa Helicobacter pylori, što je jedan od vodećih uzroka karcinoma želuca, povezana sa smanjenom ekspresijom MUC6 (Kang et al.29-35;Wang and Fang 425-31).

Kinetohorni protein Nuf2

NUF2 (CDCA-1) gen kodira protein, koji je veoma sličan Nuf2 kvasnica, komponentu konzerviranog proteinskog kompleksa udruženog sa centromerom. Kvasnični Nuf2 nestaje iz centromere tokom profaze mejoze kada centromere gube svoju povezanost sa polovima deobnog vretena, i ima regulatornu ulogu u odvajanju hromozoma. Pokazano je da csiRNK survivina i hNuf2 prolazno utišavaju njihove mRNK, dovodeći do multinukleacije odnosno ćelijske smrti usled zastoja u mitozi (Nguyen et al.394-403). Nuf2 i Hec1 su neophodni za organizaciju stabilnih vezujućih mesta na plus-kraju mikrotubula na spoljašnjoj ploči, koja su neophodna za održavanje sila polova potrebnih za biorijentaciju na kinetohorama (DeLuca et al.519-31).

Pronađeno je da je Nuf2 protein prekomerno eksprimiran u nemikrocelularnom karcinomu pluća, udružen sa lošom prognozom (Hayama et al.10339-48) i u karcinomu grlića materice (Martin et al.

333-59). Kod hirurški reseciranih tkiva karcinoma želuca (difuzni tip, 6; intestinalni tip, 4), 2 varijante NUF2 su bile ushodno regulisane. Sugerisano je da alternativne spojene varijante otkrivene u ovoj studiji mogu biti potencijalno korisne kao dijagnostički markeri i/ili novi ciljevi antitumorske terapije (Ohnuma et al.57-68). Pronađeno je da siRNK-posredovano utišavanje ekspresije protiv NUF2 inhibira proliferaciju ćelija i indukciju apoptoze u nemikrocelularnom karcinomu pluća, karcinomu jajnika, karcinomu grlića materice, karcinomu želuca, kolorektalnom karcinomu i gliomima (Kaneko et al.1235-40).

Lipid fosfat fosfohidrolaza 2 (PPAP2C)

Fosfataze fosfatidinske kiseline (PAP) pretvaraju fosfatidinsku kiselinu u diacilglicerol i imaju ulogu u de novo sintezi glicerolipida, kao i u receptorom-aktiviranoj transdukciji signala posredovanoj fosfolipazom D. Prijavljene su tri alternativne spojene varijante transkripta koje kodiraju posebne izooblike. PPAP2C je ushodno regulisana u transformisanim primarnim mezenhimalnim matičnim ćelijama odraslih osoba (MMC) i brojnim humanim malignim tumorima. Može biti neophodna za povećanu proliferaciju ćelija. Prekomerna ekspresija PPAP2C, osim u slučaju katalitički neaktivnog mutanta, dovodi do preranog ulaska u S fazu, praćenu preranim nakupljanjem ciklina A. Utišavanje ekspresije smanjuje proliferaciju ćelija odlaganjem ulaska u S fazu (Flanagan et al.249-60).

40S ribozomski protein S11 je protein (RPS11)

Ribozomi se sastoje od male 40S podjedinice i velike 60S podjedinice. Ove podjedinice zajedno su sačinjene od 4 vrste RNK i približno 80 strukturno različitih proteina. RPS11 gen kodira ribozomski protein koji je komponenta 40S podjedinice. RPS11 je bio među šest gena pronađenih u skriningu fekalnih markera baziranih na RNK, za dijagnostikovanje kolorektalnog karcinoma. Pronađen je specifično u fekalnim kolonocitima porekla od pacijenata sa karcinomom (Yajima et al.1029-37).

E3 ubikvitin-proteinska ligaza familije Seven in absentia homolog 2 (SIAH2)

SIAH2 je E3 ubikvitin ligaza. Među njenim supstratima nalaze se beta-katenin, TRAF2 i DCC (deletiran kod kolorektalnog karcinoma) (Habelhah et al.5756-65;Hu and Fearon 724-32;Nakayama, Qi, and Ronai 443-51). SIAH2 takođe dovodi do degradacije nuklearnog proteina repp86, što rezultuje poništavanjem zastoja u mitozi, izazvanog prekomernom ekspresijom ovog proteina (Szczepanowski et al.485-90). SIAH2 ima svojstva promocije tumora i metastaza preko najmanje dva puta, što je prikazano u (Nakayama, Qi, and Ronai 443-51): Prvo, dovodi do ubikvitinacije i degradacije proteina u signalnom putu odgovora na hipoksiju, što dovodi do pojačane transkripcione aktivnosti faktora indukovanih hipoksijom (HIF) (Nakayama, Qi, and Ronai 443-51)(Calzado et al.85-91). Drugo, suprimira Sprouty2, specifični inhibitor Ras/ERK signalnog puta. Aktivnost SIAH2 korelira sa razvojem tumora pankreasa, najverovatnije preko njegovog pozitivnog efekta na Ras signalizaciju (Nakayama, Qi, and Ronai 443-51).

Iako je uloga SIAH2 u malignom tumoru delimično kontroverzna, neki izveštaji pokazuju udruženost niskih nivoa SIAH2 sa lošijom prognozom ili odgovorom na terapiju (Confalonieri et al.

2959-68) (Jansen et al.263-71), drugi pokazuju tumorogenu ulogu (Frasor et al.13153-57).

Inhibicija SIAH2 se razmatra kao antitumorska terapija, jer je pokazano da inhibira rast ksenografta u modelima melanoma kod miševa (Qi et al.16713-18;Shah et al.799-808) i ćelijskim linijama humanog karcinoma pluća graftovanih u atimične miševe (Ahmed et al.1606-29).

Natrijum- i hlor-zavisni transporter taurina (SLC6A6)

SLC6A6 je natrijum- i hlor-zavisni transporter taurina (TauT) (Han et al., 2006). Miševi sa utišanom ekspresijom transportera taurina (taut-/-) pate od hronične bolesti jetre usled nedostatka taurina, što može da uključi poremećaj funkcije mitohondrija (Warskulat et al., 2006). Ekspresija SLC6A6 je potisnuta tumor-supresorskim genom p53, a transaktivirana je protoonkogenima kao što su WT1, c-Jun i c-Myb. Prekomerna ekspresija SLC6A6 štiti ćelije bubrega od nefrotoksičnosti uzrokovane cisplatinom (Han et al., 2006; Han and Chesney, 2009). Ekspresija SLC6A6 mRNK je bila ushodno regulisana faktorom nekroze tumora alfa (TNF-alfa) u humanim epitelnim Caco-2 ćelijama creva (Mochizuki et al., 2005).

Ubikvinol-citohrom c reduktaza vezujući protein (UQCRB)

Protein kodiran UQCRB genom je deo ubikvinol-citohrom c oksidoreduktaza kompleksa. On vezuje ubikvinon i učestvuje u transferu elektrona. Mutacije u ovom genu su povezane sa deficijencijom mitohondrijskog kompleksa III. Opisano je postojanje pseudogena na X hromozomu.

UQCRB gen bi mogao biti potencijalni onkogen ili tumor-supresorski gen duktalnog adenokarcinoma pankreasa (Harada et al.13-24). Nađeno je da je prekomerno eksprimiran u hepatocelularnom karcinomu (Jia et al.1133-39)

Receptor 3 humanog epidermalnog faktora rasta (ERBB3)

ERBB3 kodira člana familije receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) koji pripadaju receptorima sa tirozin kinaznom aktivnošću. Aktiviraju ga neuregulini, drugi ERBB i ne-ERBB receptori kao i druge kinaze i noviji mehanizmi. On nishodno stupa u izraženu interakciju sa fosfoinozitol 3-kinaza/AKT preživljavanje/mitogenim putem, ali takođe i sa GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK i regulatorom transkripcije EBP1 (Sithanandam and Anderson 413-48). Prekomerna ekspresija ERBB3 je pronađena u mnogim malignim tumorima uključujući karcinom želuca, gde bi mogao imati ključnu uzročnu ulogu i negativno uticati na prognozu (Kobayashi et al.1294-301) (Slesak et al.2727-32). (Zhang et al.2112-18) su pronašli da je prekomerna ekspresija ERBB3 češća u difuznom tipu (26,2%) karcinoma želuca nego u intestinalnom tipu (5,0%). U oba tipa, prekomerna ekspresija je bila udružena sa lošom prognozom. Pristupi za ciljanje ERBB3 u terapiji malignih tumora uključuju RNK aptamere za ekstraćelijski domen (Chen et al.9226-31), blokadu ekspresije njegovog gena sintetskim faktorima transkripcije (Lund et al.9082-91), inhibitorima tipa malih molekula kao što je vitamin E izomer γ-tokotrienol (Samant and Sylvester 563-74), miRNK (Scott et al.1479-86) i siRNK (Sithanandam et al.1847-59).

Prominin 1 (Prom1)

Funkcija: Prominin-1, takođe nazvan CD133, identifikovan je kao molekul specifičan za CD34+ hematopoezne progenitorske ćelije (Yin et al., 1997) i pokazano je da je marker za normalne matične ćelije i matične ćelije karcinoma (MĆK) raznih tkiva. Nalazi se uglavnom u protruzijama plazma membrane i može biti uključen u organizaciju topologije membrane ili održavanje lipidnog sastava plazma membrane. Predloženo je da spojeni izooblik prominina-1 nazvan AC133-2 kojem nedostaje mali egzon od 27 aminokiselina, može predstavljati još bolji marker matičnih ćelija (Mizrak et al., 2008; Bidlingmaier et al., 2008).

Obično je samo mali procenat tumorskih ćelija pozitivan na prominin-1, kao što se i očekuje od MĆK markera. U zavisnosti od tipa tumora, broj pozitivnih ćelija po masi tumora dostiže od 1 do 15%, ali uglavnom iznosi oko 2%.

Prominin-1 je doveden u vezu sa formiranjem tumora, angiogenezom i hemiorezistencijom (Zhu et al, 2009a) (Bruno et al, 2006; Hilbe et al, 2004) (Bertolini et al., 2009). Međutim, ćelije pozitivne na prominin-1 mogle bi biti dostupne imunskom sistemu, budući da mogu biti ubijene od strane NK ćelija (Castriconi et al., 2007; Pietra et al., 2009) i citotoksičnih T ćelija (Brown et al., 2009).

Iako je za mnogo vrsta malignih tumora pokazano da su ćelije pozitivne na prominin-1 funkcionalno MĆK i da je njihova ekspresija često udružena sa lošom prognozom, i dalje postoje kontroverze. Neki izveštaji navode da je molekul niti neophodan niti dovoljan za identifikovanje MĆK (Cheng et al., 2009; Wu and Wu, 2009). Moguće je da kombinacije prominina-1 sa drugim molekulima kao što je CD44, ili čak višestruke kombinacije kao što su prom1(+), CD34(+), CD44(+), CD38(-), CD24(-), služe kao bolji MĆK markeri (Zhu et al., 2009b; Fulda and Pervaiz, 2010)

U difuznom karcinomu želuca, ekspresija PROM1 sugerisana je na osnovu in silico analize (Katoh and Katoh, 2007), a prekomerna ekspresija u karcinomu želuca u poređenju sa normalnim tkivom želuca na proteinskom nivou objavljena je od strane (Smith et al., 2008). Međutim, (Boegl and Prinz, 2009) su prijavili da je ekspresija prominina-1 smanjena u karcinomu želuca, naročito u kasnim stadijumima, i tvrdili da ekspresija prominina-1 više korelira sa angiogenezom – koja je takođe smanjena u kasnijim stadijumima – nego sa rastom tumora. Studija koja je koristila ćelijske linije karcinoma želuca (Takaishi et al., 2009) tvrdi da je CD44, a ne prominin-1, MĆK marker u karcinomu želuca.

Matriksna metaloproteinaza 11 (MMP11)

Kao i druge MMP, MMP11 je endopeptidaza sa funkcijama u procesima koji zahtevaju remodeliranje tkiva, kao što su razvoj, zarastanje rana i formiranje ožiljka. Takođe može negativno da reguliše homeostazu masti smanjivanjem diferencijacije adipocita. Za razliku od drugih MMP, ona ne može da cepa tipične molekule ekstraćelijskog matriksa – izuzev kolagena VI. Međutim, identifikovani su drugi supstrati kao što su alfa-2-makroglobulin, određeni inhibitori serin-proteaza (serpini) uključujući alfa 1-antitripsin, insulinu sličan faktor rasta – vezujući protein 1 i receptor laminina. U malignom tumoru, MMP11 je uglavnom eksprimirana u ćelijama strome koje okružuju tumorsko tkivo. Ovo je pokazano kod brojnih tumorskih entiteta. Navedeno je da je MMP11 prekomerno eksprimirana u stromi najinvazivnijih humanih karcinoma, ali retko u sarkomima i drugim neepitelnim tumorima. U većini slučajeva, ali ne u svim, MMP11 je eksprimirana u ćelijama strome u neposrednoj okolini tumora, dok su same tumorske ćelije, normalna tkiva i ćelije strome udaljene od tumora negativne. Viši nivoi MMP11 koreliraju sa malignim fenotipom / većom invazivnošću i lošom prognozom. Međutim, u papilarnom karcinomu štitaste žlezde, ekspresija MMP11 je obrnuto povezana sa agresivnim karakteristikama karcinoma. MMP11 je pronađena u tumorskom tkivu kao i u serumu pacijenata sa karcinomom želuca, a njena ekspresija je korelirala sa metastazama (Yang et al.). Pored toga, (Deng et al.274-81) su pokazali da je MMP11 visoko eksprimirana u tumorskim ćelijskim linijama i primarnom tumoru karcinoma želuca – za razliku od drugih tipova karcinoma, ne isključivo u stromi – kao i da se čini da povećava proliferaciju tumorskih ćelija.

Faktor nuklearne transkripcije Y podjedinica beta (NFYB)

NFYB, takođe nazvan CBF-B ili CBF-A je, pored NFYA i NFYC, deo heterotrimernog faktora bazalne transkripcije NF-Y (takođe i CCAAT-vezujući faktor ili CBF), koji se vezuje za CCAAT motive – ili obrnute motive, ATTGG, nazvane Y-strukturni element – na promoterima i pojačivačima brojnih gena. Među NF-Y ciljnim genima su geni MHC klase II, PDGF beta-receptor, nekoliko proteina toplotnog šoka, gen popravke nepodudaranja hMHL1 i topoizomeraza II alfa. NFYB nije klasičan onkogen, međutim njegova funkcija bi mogla doprineti tumorogenezi. Prvo, mnogi geni ćelijskog ciklusa kao što su ciklin A, ciklin B1, Aurora A i cdk1 predstavljaju cilj NF-Y. Bez funkcionalnog NFYB, ćelije su zaustavljene u G2 / M fazi ćelijskog ciklusa. (Park et al.) pokazuju da je ushodna regulacija ciklina B2 i drugih gena povezanih sa ćelijskim ciklusom u kolorektalnom adenokarcinomu posledica aktivnosti NF-Y. Drugo, aktivnost NF-Y sprečava apoptozu. Ćelije kojima nedostaje NF-Y podvrgnute su apoptozi usled aktivacije p53 i smanjene transkripcije anti-apoptotskih gena koji sadrže CCAAT strukturne elemente u svojim promoterima, kao što je Bcl-2 (Benatti et al.1415-28). Treće, njegova tumorogena svojstva su pojačana u kombinaciji sa drugim faktorima transkripcije. Na primer, mutirani p53 vezuje se za NF-Y i p300 proteine, povećavajući ekspresiju gena ćelijskog ciklusa indukovanih od strane NF-Y.

ABL1

Proteinska tirozin kinaza c-Abl kreće se između nukleusnih i citoplazmatskih odeljaka. Nukleusna c-Abl je uključena u inhibiciju ćelijskog rasta i apoptozu, dok citoplazmatska c-Abl može imati ulogu u dinamici aktina, morfogenezi i signalizaciji uzrokovanoj ekstraćelijskim stimulusima, kao što su faktori rasta i ligandi integrina. Prijavljeno je da citoplazmatska c-Abl promoviše mitogenezu. Aktivnost proteina c-Abl je negativno regulisana sopstvenim SH3 domenom; delecija SH3 domena pretvara ABL1 u onkogen. U hroničnoj mijeloidnoj leukemiji (HML), gen se aktivira translokacijom unutar BCR (eng. breakpoint cluster region) gena na hromozomu 22. Nastali fuzioni protein BCR-ABL nalazi se u citosolu i omogućava ćelijama da proliferišu bez regulacije citokinima (Zhao et al.). Aktivnost c-Abl je takođe ushodno regulisana u solidnim tumorima, kao što je pokazano za karcinome dojke i nemikrocelularni karcinom pluća. Prekomerna ekspresija nije dovoljna, već je za konstitutivnu kinaznu aktivnost potrebna fosforilacija proteina. U ćelijama karcinoma dojke, fosforilacija c-Abl je indukovana tirozin kinazama ćelijske membrane, uključujući SFK, članove familije EGFR i IGF-1 receptor. ABL fuzioni proteini nisu otkriveni u solidnim tumorima (Lin and Arlinghaus, 2008). Pokazano je da je ABL eksprimirana u karcinomu želuca i pridruženim mikro krvnim sudovima, što ukazuje na moguću ulogu u angiogenezi. Značajno je da H.pylori citotoksin-udružen gen A (CagA) dovodi do aktivacije c-Abl, što zatim dovodi do fosforilacije EGFR i time blokira EGFR endocitozu (Bauer, Bartfeld, and Meyer 156-69). Nekoliko inhibitora tirozin kinaza je, manje ili više, specifično za Abl. Imatinib (Gleevec) se koristi kao terapija prve linije za HML, a takođe je odobren za pacijente sa uznapredovalim stromalnim tumorima gastrointestinalnog trakta (GIST), jer takođe deluje i na KIT (Pytel et al.66-76) (Croom and Perry, 2003). Drugi inhibitori koji se koriste za terapiju karcinoma su dasatinib i nilotinib (Pytel et al.66-76) (Deremer, Ustun, and Natarajan 1956-75).

Polo-like kinaza 4 (Plk4)

Članovi familije polo kinaza (PLk1-4) su važni u toku ćelijske deobe, budući da regulišu nekoliko koraka tokom mitoze. Plk4 je organizator formiranja i dupliranja centriole (Rodrigues-Martins et al.

1046-50). Iako je Plk1 jasan onkogen, funkcija Plk4 u karcinomu je dvosmislena. Nishodna regulacija, kao i prekomerna ekspresija Plk4, je udružena sa karcinomom kod ljudi, miševa i muva (Cunha-Ferreira et al.43-49). Na primer, pronađeno je da je Plk4 prekomerno eksprimirana u kolorektalnom karcinomu, ali je manja grupa pacijenata pokazala snažnu nishodnu regulaciju Plk4 (Macmillan et al. 729-40). Ovo se može objasniti činjenicom da i prekomerna ekspresija i nedostatak Plk4 vode aberantnom formiranju centriole, što dovodi do abnormalnog broja centrozoma i struktura koje se često otkrivaju u tumorskim ćelijama i doprinose mitotskim aberacijama koje izazivaju pogrešno odvajanje hromozoma i aneuploidije (Peel et al.834-43).

(Kuriyama et al.2014-23). (Korzeniewski et al.6668-75).

GTP-aza aktivirajući protein 3 koji sadrži IQ motiv (IQGAP3)

IQGAP proteini učestvuju u ćelijskim signalnim putevima kao i u arhitektonici citoskeleta i ćelijskoj adheziji. Poseduju domen sa sekvencom sličnom onoj kod RasGAP proteina, te se shodno tome, vezuju za male GTP-aze. Međutim (uprkos njihovom nazivu), nijedan od njih nema aktivnost aktiviranja GTP-aze. Za IQGAP1 i IQGAP2 je pokazano da oni čak i stabilizuju GTP-vezano stanje Rac1 i Cdc42 proteina, dok se za IQGAP3 sugeriše da stabilizuje aktivirani Ras (Nojima et al.971-78;White, Brown, and Sacks 1817-24). Vezuju se za kalcijum/kalmodulin preko svojih IQ-domena, a preko kalponinskog homolognog domena za aktinske filamente (White, Brown, and Sacks 1817-24). (Wang et al.567-77) prijavljuju da je IQGAP3 eksprimiran u mozgu, gde je udružen sa aktinskim filamentima kao i sa Rac1 i Cdc42. Nakuplja se u distalnim delovima aksona i promoviše izduživanje aksona zavisno od Rac1/Cdc42. IQGAP proteini su povezani sa karcinomima. Smatra se da je IQGAP1 onkogen. On pojačava nekoliko signalnih puteva vezanih za karcinom kao što su MAP kinaza, beta-katenin i VEGF-posredovani signalni putevi, i prekomerno je eksprimiran u mnogim tumorima. Izgleda da IQGAP2 funkcioniše kao tumorski supresor i pronađeno je da je smanjen u karcinomima želuca sa lošom prognozom (White, Brown, and Sacks 1817-24). Dostupno je malo informacija o IQGAP3. (Skawran et al.505-16) su pronašli da se nalazi među genima koji su značajno ushodno regulisani u hepatocelularnom karcinomu. Dve studije izveštavaju da je IQGAP3 specifično eksprimiran u proliferišućim (Ki67+) ćelijama tankog creva, kolona i jetre kod miševa (Nojima et al.971-78) (Kunimoto et al.621-31).

Domen spiralnog namotaja koji sadrži 88a (CCDC88A)

CCDC88A je aktin-vezujući Akt supstrat koji ima ulogu u organizaciji aktina i ćelijskoj pokretljivosti zavisnoj od Akt kod fibroblasta. CCDC88A/Akt signalni put je takođe esencijalan u postneonatalnoj angiogenezi posredovanoj VEGF-om.

CCDC88A je takođe visoko eksprimiran u raznim humanim malignim tkivima, uključujući karcinome dojke, kolona, pluća i karcinom grlića materice. On ima važnu ulogu u progresiji tumora aberantnom aktivacijom Akt signalnog puta.

Ciklin B1 (CCNB1)

CCNB1 je indukovan tokom G2/M faze mitoze i obrazuje mitoza-promovišući faktor (MPF) zajedno sa ciklin-zavisnom kinazom 1 (Cdk1)/Cdc2. Prekomerna ekspresija je pronađena u raznim malignim tumorima i često je udružena sa lošom prognozom, npr. u karcinomu dojke (Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009; Suzuki et al., 2007), meduloblastomu (de et al., 2008), nemikrocelularnom karcinomu pluća (Cooper et al., 2009), karcinomu grlića materice (Zhao et al., 2006) i drugim. On je bio jedan od gena uključenih u potpisu koji čini 11 gena za koje je nađeno da predviđaju kratak interval do rekurencije bolesti kod pacijenata sa 12 različitih vrsta malignih tumora (Glinsky, 2006). Nisu pronađene specifične informacije o karcinomu želuca.

Ciklin D2 (CCND2)

CCND2 se vezuje i aktivira, kao i drugi ciklini D-tipa (D1 i D3), ciklin-zavisnu kinazu 4 (Cdk4) ili Cdk6. Ovo je neophodno za G1/S tranziciju. Pronađeno je da je CCND2 prekomerno eksprimiran u mnogim tumorima, uključujući tumore testisa i jajnika (Sicinski et al., 1996), hematološke malignitete (Hoglund et al., 1996; Gesk et al., 2006) i karcinom želuca, gde može biti izazvan H.pylori infekcijom i udružen sa lošom prognozom (Yu et al., 2003). (Yu et al., 2001) (Oshimo et al., 2003) (Takano et al., 1999) (Takano et al., 2000).

Ciklin E2 (CCNE2)

CCNE2 se vezuje i aktivira, kao i drugi ciklin E-tipa, CCNE1, Cdk2. Ova aktivnost je maksimalna u prelasku iz faze G1 u fazu S. U zdravim okolnostima CCNE2 ne može da se detektuje u ćelijama u stanju mirovanja i može da se nađe samo u tkivima koja se aktivno dele (Payton and Coats, 2002). On je često aberantno eksprimiran u karcinomima, npr. u karcinomu dojke, i u vezi je sa lošom prognozom (Desmedt et al., 2006; Ghayad et al., 2009; Payton et al., 2002; Sieuwerts et al., 2006), kao i u metastatskom karcinomu prostate (Wu et al., 2009).

Karcinoembriogeni antigen-povezani ćelijski adhezioni molekuli 1, 5 i 6 (CEACAM 1, 5 i 6) CEACAM su glikoproteini vezani za membranu koji posreduju u interakcijama ćelija-ćelija i aktiviraju integrinske signalne puteve (Chan and Stanners, 2007). Oni takođe mogu služiti kao receptori za patogene kao što su E.coli (Berger et al., 2004) (Hauck et al., 2006) i mogu biti uključeni u imunsku regulaciju (Shao et al., 2006).

CEACAM5 i CEACAM6 imaju prokancerogene funkcije. Oni inhibiraju anoikis (Ordonez et al., 2000), promovišu nastanak metastaza (Marshall, 2003; Ordonez et al., 2000) i ometaju ćelijsku polarizaciju i arhitekturu tkiva (Chan and Stanners, 2007). Uloga CEACAM1 kod karcinoma je nejasna. On može biti supresor tumora u ranim stadijumima i doprinositi formiranju metastaza, izbegavanju imunskog odgovora od strane tumora i angiogenezi u kasnijim stadijumima (Hokari et al., 2007; Liu et al., 2007; Moh and Shen, 2009). Njegova funkcionalna uloga zavisi od izooblika, budući da se CEACAM1 javlja u 11 spojenih varijanti, čiji odnos određuje ishod signalizacije (Gray-Owen and Blumberg, 2006; Leung et al., 2006; Neumaier et al., 1993; Nittka et al., 2008). Odnos spojenih varijanti može biti promenjen u karcinomu (Gaur et al., 2008).

CEACAM5 ili CEACAM6 ili oba su prekomerno eksprimirani u skoro 70% svih humanih tumora i često su udruženi sa lošom prognozom (Chan and Stanners, 2007; Chevinsky, 1991). Nivo CEACAM5 u serumu je ustanovljeni klinički marker za karcinom kolona i rektuma, s tim da visoki nivoi ukazuju na lošu prognozu ili rekurenciju (Chevinsky, 1991; Goldstein and Mitchell, 2005). Takođe je sugerisan kao marker za druga oboljenja uključujući i karcinom želuca, međutim sa ograničenom prognostičkom snagom (Victorzon et al., 1995). CEACAM1 može biti ushodno ili nishodno regulisan u karcinomu u zavisnosti od oboljenja (Kinugasa et al., 1998) (Dango et al., 2008) (Simeone et al., 2007). (Han et al., 2008) pronašli su visoke nivoe CEACAM5 i CEACAM6 u devet ćelijskih linija karcinoma želuca, dok CEACAM1 nije mogao da se detektuje. Za razliku od toga, analiza uzoraka primarnog tumora od 222 pacijenta pokazala je ili bojenje citoplazme ili membrane za CEACAM1. Oblik vezan za membranu doveden je u vezu sa pojačanom angiogenezom (Zhou et al., 2009). Takođe, studija sprovedena od strane (Kinugasa et al., 1998) pokazala je ushodnu regulaciju u adenokarcinomima želuca.

Kod nekih tumora CEACAM1 je nishodno regulisan u tumorskim ćelijama, što dovodi do ushodne regulacije VEGF, a VEGF ili uslovi hipoksije mogu indukovati CEACAM1 u okolnom endotelu. U skladu sa tim, monoklonalno antitelo protiv CEACAM1 je blokiralo VEGF-indukovano formiranje endotelne trake (Oliveira-Ferrer et al., 2004; Tilki et al., 2006; Ergun et al., 2000).

Naročito je CEACAM5 testiran kao cilj za antitumorske lekove, među ostalima, pomoću vakcinalnih pristupa. Ove studije su pokazale da CEACAM5 može biti cilj ćelijskih imunskih reakcija (Cloosen et al., 2007; Marshall, 2003). Kratak pregled o CEACAM5 T-ćelijskim epitopima je naveden u (Sarobe et al., 2004).

Hloridni kanal 3 (CLCN3)

CLCN3 je Cl- kanal koji može biti sinhronizovan zapreminom i doprineti regulatornom smanjenju zapremine (RVD) koje se javlja kao reakcija na povećanje zapremine ćelija u slučaju stanja kao što su cikliranje ćelija ili hipoosmoza (Lemonnier et al., 2004; Sardini et al., 2003). Međutim, o ovoj tački se vode kontroverzni razgovori (Wang et al., 2004), a kanal koji smanjuje zapreminu, koji se aktivira u toku apoptoze, drugačiji je od CLCN3 (Okada et al., 2006).

Ekspresija CLCN3 se menja u toku ćelijskog ciklusa, pri čemu je maksimum u S fazi (Wang et al., 2004). CLCN3 struje mogu biti važne u procesima relevantnim za karcinom kod bolesti kod kojih je CLCN3 ushodno regulisan, kao što je gliom: Tumorske ćelije moraju da se izbore sa proliferativnim povećanjima zapremine, da savladaju hipoosmotske uslove, npr. u peritumorskom edemu (Ernest et al., 2005; Olsen et al., 2003; Sontheimer, 2008).

Pored toga, prijavljeno je da CLCN3 pojačava otpornost na etopozid povećavanjem acidifikacije kasnog endocitnog odeljka (Weylandt et al., 2007).

siRNK-posredovano utišavanje CLCN3 je smanjilo migraciju ćelija nazofaringealnog karcinoma in vitro (Mao et al., 2008).

DNAJC10

DNAJC10 je član kompleksa supramolekularne ER-asocirane degradacije (ERAD) koji prepoznaje i otvara pogrešno preklopljene proteine radi njihove efikasne retrotranslokacije (Ushioda et al., 2008).

Pokazano je da je protein povišen u hepatocelularnom karcinomu (Cunnea et al., 2007). Utišavanje DNAJC10 od strane siRNK u ćelijama neuroektodermalnih tumora je povećalo apoptotički odgovor na hemioterapeutski lek fenretinid (Corazzari et al., 2007). Pokazano je da ERdj5 smanjuje preživljavanje ćelija neuroblastoma time što nishodno reguliše odgovor neotvorenog proteina (UPR) (Thomas and Spyrou, 2009).

Faktor 2 inicijacije eukariotske translacije, podjedinica 3 gama (EIF2S3)

EIF2S3 je najveća podjedinica proteinskog kompleksa (EIF2) koji regrutuje inicijalnu metioniltRNK ka 40S ribozomskoj podjedinici (Clemens, 1997). Delovanje kinaza koje nishodno regulišu aktivnost EIF, kao što je RNK-zavisna protein kinaza (PKR), može biti proapoptotičko i tumorsupresorno (Mounir et al., 2009). Kod karcinoma želuca prijavljeni su povišeni nivoi fosforilisanog i nefosforilisanog EIF2, a opažena je i redistribucija nukleusa. Ova deregulacija ukazuje na upletenost eIF2alfa u gastrointestinalnom karcinomu (Lobo et al., 2000).

Faktor 3 inicijacije eukariotske translacije, podjedinica L (EIF3L)

EIF3L je jedna od 10 do 13 podjedinica EIF3, koja je u vezi sa malom ribozomskom podjedinicom. EIF3L ima ulogu u prevenciji prevremenog vezivanja velike ribozomske podjedinice. EIF3L spada u pet podjedinica za koje je prijavljeno da nisu esencijalne za formiranje EIF3 (Masutani et al., 2007). Skrining test pomoću antisens biblioteke je sugerisao da nishodna regulacija EIF3L pojačava antitumorogenu aktivnost 5-fluorouracila u ćelijama hepatocelularnog karcinoma (Doh, 2008).

Epiplakin1 (EPPK1)

EPPK1 je gen plakin familije sa umnogome nepoznatim funkcijama. Poznato je da plakin geni deluju u međusobnom povezivanju citoskeletnih filamenata i da ih pričvršćuju na adhezivnom spoju povezanom za plazma membranu (Yoshida et al., 2008).

Receptor 39 spregnut sa G proteinom (GPR39)

GPR39 je receptor spregnut sa Gproteinom, za koji se smatra da je uključen u gastrointestinalne i metaboličke funkcije (Yamamoto et al., 2009). Njegova signalizacija aktivira cAMP i elemente serumskog odgovora (Holst et al., 2004). Endogeni ligand za GPR39 je najverovatnije cink (Chen and Zhao, 2007). GPR39 je novi inhibitor ćelijske smrti, što bi moglo da predstavlja terapeutski cilj sa implikacijama za procese koji uključuju apoptozu i karcinom u vezi sa stresom endoplazmatskog retikuluma (Dittmer et al., 2008). Pronađeno je da je GPR39 ushodno regulisan u mikročipovima sa ksenograftovima humanih fetalnih bubrežnih HFK i ksenograftovima Vilmsovog tumora nalik na matične ćelije obogaćene sa blastemom (Metsuyanim et al., 2009), kao i u hipokampalnim ćelijskim linijama otpornim na različite stimulatore ćelijske smrti (Dittmer et al., 2008).

ERBB2/HER2/NEU

ERBB2 je član EGFR familije receptorskih tirozin kinaza. Njegov ligand nije poznat, ali je on preferirani partner heterodimerizacije za druge članove HER familije (Olayioye, 2001). U karcinomima HER2 deluje kao onkogen, uglavnom zbog toga što visok stepen amplifikacije gena indukuje prekomernu ekspresiju proteina u ćelijskoj membrani i posledično preuzimanje povoljnih svojstava za malignu ćeliju (Slamon et al., 1989). Prekomerna ekspresija je zabeležena u određenom procentu u mnogim malignim tumorima, uključujući karcinom želuca. Uglavnom, on je udružen sa lošom prognozom (Song et al., 2010) (Yonemura et al., 1991) (Uchino et al., 1993) (Mizutani et al., 1993).

ERBB2 je cilj monoklonalnog antitela trastuzumaba (registrovanog pod nazivom Herceptin), za koje se smatra da predstavlja opciju lečenja za pacijente sa HER2-pozitivnim uznapredovalim karcinomom želuca, u kombinaciji sa hemioterapijom (Meza-Junco et al., 2009; Van Cutsem et al., 2009). Drugo monoklonalno antitelo, pertuzumab, koje inhibira dimerizaciju HER2 i HER3 receptora, u naprednim je fazama kliničkih ispitivanja (Kristjansdottir and Dizon, 2010). Selektivna prekomerna ekspresija HER2 i HER3 u dva histološka tipa karcinoma želuca (intestinalni tip i difuzni tip) u snažnoj je vezi sa lošom prognozom (Zhang et al., 2009).

Beta-4 integrin (ITGB4)

Integrini posreduju u ćelijskoj adheziji kao i transdukciji signala spolja ka unutra i unutra ka spolja. Integrin beta-4 podjedinica se heterodimerizuje sa alfa-6 podjedinicom. Nastali integrin promoviše obrazovanje hemidezmozoma između unutarćelijskog keratinskog citoskeleta i bazalne membrane (Giancotti, 2007). Integrin beta-4 ima dvojnu funkciju u karcinomu, budući da može da posreduje u stabilnoj adheziji s jedne strane, a proinvazivnoj signalizaciji (uključujući Ras/Erk PI3K signalizaciju) i angiogenezi s druge strane (Giancotti, 2007; Raymond et al., 2007). On je prekomerno eksprimiran u mnogim tumorima kao i u angiogenim endotelijalnim ćelijama, što često korelira sa progresijom i metastazama. Visoki nivoi su zabeleženi u karcinomu želuca, naročito u ćelijama koje invadiraju stromu (Giancotti, 2007; Tani et al., 1996). Međutim, on je bio nishodno regulisan u karcinomu želuca nediferenciranog tipa kako je tumor vršio dublju invaziju, moguće zbog postepene epitelno-mezenhimne tranzicije, budući da je beta-4 integrin epitelijalni integrin (Yanchenko et al., 2009).

Lipokalin (LCN2)

LCN2 ili lipokalin asociran sa neutrofilnom gelatinazom (NGAL) je protein koji reguliše gvožđe koji postoji kao monomer, homodimer ili disulfidno povezan heterodimer sa MMP9 (Coles et al., 1999; Kjeldsen et al., 1993). Ekspresija je povećana kod nekoliko karcinoma i u nekim slučajevima u vezi je sa progresijom. Mehanistički, on može da stabilizuje MMP9 i menja E-kadherin posredovanu ćelija-ćelija adheziju, čime povećava invaziju. Kompleksi MMP-9 i LCN2 su dovedeni u vezu sa lošijim preživljavanjem kod karcinoma želuca (Kubben et al., 2007) (Hu et al., 2009). Iako je jasan protumorski efekat opažen kod različitih tumora kod ljudi, neke studije su pokazale da LCN2 može da inhibira pro-neoplastički faktor HIF1-alfa, FA-kinaznu fosforilaciju i takođe sintezu VEGF, što ukazuje na to da u alternativnim stanjima, LCN2 takođe, paradoksalno, ima antitumorski i antimetastatski efekat u neoplazmama, na primer, kolona, jajnika i pankreasa (Bolignano et al., 2009; Tong et al., 2008). LCN2 može biti koristan za inhibiciju angiogeneze tumora, pored toga što suprimira stvaranje metastaza tumora kod karcinoma koji pokazuju aktivaciju ras (Venkatesha et al., 2006).

Sukcinat dehidrogenazni kompleks, podjedinica C (SDHC)

SDHC je jedna od četiri nukleusno-kodiranih podjedinica sukcinat dehidrogenaze (mitohondrijalni kompleks II), koja prenosi elektrone sa sukcinata na ubikvinon, čime se dobijaju fumarati i ubikvinol. Deficijencija sukcinat dehidrogenaze može izazvati GIST (McWhinney et al., 2007). Familijarni gastrointestinalni stromalni tumori mogu biti izazvani mutacijama u genima podjedinice SDHB, SDHC i SDHD, a abdominalni paragangliomi udruženi sa gastrointestinalnim tumorima mogu biti jedinstveno izazvani mutacijama SDHC (Pasini et al., 2008). Mutirani SDHC protein kod transgenskih miševa stvara oksidativni stres i može doprineti oštećenju nukleusne DNK, mutagenezi i konačno tumorogenezi (Ishii et al., 2005). Sukcinat dehidrogenaza se smatra supresorom tumora (Baysal, 2003; Gottlieb and Tomlinson, 2005). Smanjeni nivoi ovog enzimskog kompleksa mogu dovesti do tumorogeneze (Eng et al., 2003).

Kinaza koja vezuje PDZ (PBK)

PBK je MEK3/6-vezan MAPKK koji aktivira p38 MAP kinazu, npr. nishodno od receptora faktora rasta (Abe et al., 2000; Ayllon and O'connor, 2007). JNK može biti sekundarni cilj (Oh et al., 2007). Kako je kod odraslih PBK eksprimirana u testisima (videti u nastavku), pretpostavlja se da ima funkciju u spermatogenezi (Abe et al., 2000; Zhao et al., 2001). Pored ovoga, ona doprinosi otpornosti na proliferaciju i apoptozu kod tumorskih ćelija: Ona je fosforilisana i aktivirana u toku mitoze, što je neophodno za formiranje vretena i citokinezu (Gaudet et al., 2000; Matsumoto et al., 2004; Park et al., 2009) (Abe et al., 2007). Druge funkcije u vidu promocije rasta i antiapoptoze uključuju nishodnu regulaciju p53 i fosforilaciju histona (Park et al., 2006; Zykova et al., 2006) (Nandi et al., 2007). PBK je klasifikovana kao karcinom-testis antigen (Abe et al., 2000; Park et al., 2006) i pronađeno je da je prekomerno eksprimirana u mnogim karcinomima.

Polimeraza (DNK-usmerena), delta 3, pomoćna podjedinica (POLD3)

Kompleks DNK polimeraze delta je uključen u replikaciju i reparaciju DNK. On se sastoji od proliferirajućeg ćelijskog nukleusnog antigena (PCNA), faktora C replikacije više podjedinica i polimeraznog kompleksa koji čine četiri podjedinice: POLD1, POLD2, POLD3 i POLD4 (Liu and Warbrick, 2006). POLD3 ima krucijalnu ulogu u efikasnom recikliranju PCNA u toku ciklusa disocijacije-asocijacije pol delta u toku faze elongacije replikacije DNK (Masuda et al., 2007).

Proteazom (Prozom, macropain) 26S podjedinica, non-APTaza, 14 (PSMD14)

PSMD14 je komponenta 26S proteazoma. On pripada 19S kompleksu (19S cap; PA700), koji je odgovoran za deubikvitinaciju supstrata u toku proteazomalne degradacije (Spataro et al., 1997). Prekomerna ekspresija PSMD14 u ćelijama sisara utiče na ćelijsku proliferaciju i odgovor na citotoksične lekove kao što su vinblastin, cisplastin i doksorubicin (Spataro et al., 2002). siRNK supresija PSMD14 u HeLa ćelijama rezultirala je smanjenjem održivosti ćelija i povećanjem nivoa poliubikvitiniranog proteina (Gallery et al., 2007). Nishodna regulacija PSMD14 od strane siRNK ima značajan uticaj na održivost ćelija izazivajući ćelijski zastoj u fazi G0-G1, što na kraju dovodi do starenja (Byrne et al., 2010).

Proteazom (Prozom, macropain) 26S podjedinica, APTaza, 2 (PSMC2)

PSMC2 je deo sistema proteazoma 26S. On je član trostruko A familije ATP-aza, koje imaju aktivnost sličnu šaperonima. Pokazano je da ova podjedinica interaguje sa nekoliko bazalnih faktora transkripcije, tako da pored toga što učestvuje u funkcijama proteazoma, ova podjedinica može učestvovati u regulaciji transkripcije. Pokazano je da sistem proteazoma 26S u skeletnim mišićima može da bude aktiviran pomoću TNF-alfa (Tan et al., 2006). U HBx transgenskim miševima koji nose regulatorni gen za hepatitis B HBx u svojim gametima i razviju HCC, PSMC2 i druge podjedinice proteazoma ushodno su regulisane u tumorskim tkivima (Cui et al., 2006). Nivoi mRNK za podjedinicu ATP-aze PSMC2 kompleksa 19S povećani su u kaheksiji usled raka (Combaret et al., 1999).

Protein tirozin kinaza 2 (PTK2)

PTK2 je nereceptorska tirozin kinaza koja modulira signalizaciju integrina i može promovisati rast tumora, progresiju i metastaze ((Giaginis et al., 2009); (Hauck et al., 2002); (Zhao and Guan, 2009)). Smatra se da je PTK2 marker za karcinogenezu i progresiju karcinoma (Su et al., 2002; Theocharis et al., 2009; Jan et al., 2009). Prekomerna ekspresija i/ili povećana aktivnost se javlja kod širokog spektra karcinoma kod ljudi, uključujući i karcinom želuca. PTK2 takođe vrši transdukciju signala nishodno od receptora za gastrin, što doprinosi proliferaciji ćelija karcinoma želuca (Li et al., 2008b). Pokazano je da osam procenata karcinoma želuca nosi Epštajn-Bar virus (EBV). Podlinije ćelijskih linija humanog karcinoma želuca inficirane sa EBV prezentovale su povećanu fosforilaciju PTK2 (Kassis et al., 2002). Nivo fosforilacije PTK2 tirozina u epitelijalnim ćelijama želuca je smanjen od strane cagA pozitivnog proizvoda Helicobacter pylori.

Tetraspanin 1 (TSPAN1) i tetraspanin 8 (TSPAN8)

TSPAN1 i TSPAN8 pripadaju familiji tetraspanina koju karakterišu četiri transmembranska domena i unutarćelijski N- i C-kraj koji imaju ulogu u raznovrsnim procesima uključujući adheziju ćelija, pokretljivost, aktivaciju i invaziju tumora. Oni često obrazuju velike molekularne komplekse sa drugim proteinima kao što su integrini na površini ćelije (Tarrant et al., 2003; Serru et al., 2000). Funkcije TSPAN1 još uvek nisu poznate i mogu uključivati i ulogu u sekreciji (Scholz et al., 2009). TSPAN1 je prekomerno eksprimiran u nekoliko karcinoma i često je u vezi sa stadijumom, progresijom i lošim kliničkim ishodom. U značajnoj meri je prijavljeno da je on prekomerno eksprimiran kod 56,98% od 86 slučajeva karcinoma želuca, a prekomerna ekspresija bila je u pozitivnoj vezi sa kliničkim stadijumom, infiltracijom i statusom limfnih čvorova, a negativno sa stopama preživljavanja i stepenom diferencijacije tumora (Chen et al., 2008). Prijavljeno je da je TSPAN8 gen udružen sa metastazom kod mnogih vrsta tumora (PMID: 16467180). Kod gastrointestinalnog karcinoma ekspresija TSPAN8 je udružena sa lošom prognozom (PMID:

16849554).

Protein cinkov prst 598 (ZNF598)

ZNF598 je protein cinkov prst sa još uvek nepoznatom funkcijom.

A dezintegrin i metaloproteinaza 10 (ADAM10)

ADAM10 ima ulogu u angiogenezi, razvoju i tumorogenezi. On je prekomerno eksprimiran u karcinomu želuca. Selektivni inhibitori ADAM protiv ADAM-10 su u fazi kliničkih ispitivanja za lečenje karcinoma. (PMID: 19408347)

Matriksna metaloproteinaza 12 (MMP12)

MMP12 je cink endopeptidaza koja razlaže elastin i mnoge druge proteine matriksa i nematriksne proteine i uključena je u migraciju makrofaga i inhibiciju angiogeneze (Chakraborti et al., 2003; Chandler et al., 1996; Sang, 1998). Ona takođe ima ulogu u patološkim procesima destrukcije tkiva, kao na primer u astmi, emfizemu i hroničnoj opstruktivnoj bolesti pluća (HOBP), reumatoidnom artritisu i rastu tumora (Cataldo et al., 2003; Wallace et al., 2008). Inhibitori MMP12 se razmatraju kao agensi za lečenje ovih stanja (Churg et al., 2007; Norman, 2009). MMP12 je često prekomerno eksprimirana u karcinomima, gde može da ima različite funkcije. Iako može biti uključena u rastvaranje matriksa i, samim tim, metastaziranje, ona takođe može da inhibira rast tumora kroz proizvodnju angiostatina, koji negativno utiče na angiogenezu. Povećana ekspresija MMP12 je prijavljena za karcinom želuca, i pokazano je da ima pozitivan učinak: U negativnoj je vezi sa gustinom mikro krvnih sudova, VEGF, stepenom diferencijacije tumora, vaskularnom invazijom, metastazama u limfnim čvorovima i rekurencijom. Pacijenti sa prekomernom ekspresijom MMP12 su pokazali značajno bolju stopu preživljavanja (Cheng et al., 2010; Zhang et al., 2007b; Zhang et al., 2007a)

Ribonukleotidna reduktaza M2 (RRM2)

RRM2 je jedna od dve podjedinice ribonukleotidne reduktaze koja stvara deoksiribonukleotide iz ribonukleotida. Prekomerna ekspresija RRM2 je opažena u tumorima koji obuhvataju i karcinom želuca, a i pojačava metastatski potencijal (PMID: 18941749) (PMID: 19250552) Utišavanje RRM2 od strane siRNK je usporilo rast tumora kod različitih vrsta (miš, pacov, majmun) (PMID:

17929316; PMID: 17404105).

Transmembranska proteaza, serin 4 (TMPRSS4)

TMPRSS4 je transmembranska serinska proteaza tipa II koja se nalazi na površini ćelije i koja je veoma eksprimirana u nekoliko tumorskih tkiva, uključujući karcinom pankreasa, kolona i želuca. Biološke funkcije TMPRSS4 kod karcinoma još uvek nisu poznate. TMPRSS4 ima četiri spojene varijante (Scott et al., 2001; Sawasaki et al., 2004). Ekspresija u karcinomu jajnika je bila u vezi sa stadijumom tumora (Sawasaki et al., 2004). TMPRSS4 je veoma povišena u tkivima karcinoma pluća. Utišavanje TMPRSS4 od strane siRNK pomoću tretmana malom ometajućom RNK u ćelijskim linijama karcinoma pluća i kolona dovedeno je u vezu sa smanjenjem ćelijske invazije i adhezije ćelije za matriks, kao i modulacijom proliferacije ćelija (Jung et al., 2008).

Dejodinaza, jodtironin, tip II (DIO2)

DIO2 konvertuje prohormon tiroksin (T4) u bioaktivni 3,3’,5-trijodtironin (T3). Ona je veoma eksprimirana u štitastoj žlezdi, a nađeno je da su ekspresija i/ili aktivnost deregulisani u karcinomima štitaste žlezde (de Souza Meyer et al., 2005) (Arnaldi et al., 2005). Međutim, ona je takođe pronađena i u drugim tkivima, kao što su normalno tkivo pluća i karcinom pluća (Wawrzynska et al., 2003), kao i tumorima mozga (Murakami et al., 2000).

Insulinu sličan faktor rasta 2 mRNK vezujući protein 3 (IGF2BP3)

IGF2BP3 je primarno prisutan u nukleolusu, gde vezuje IGF2 mRNK i sprečava njenu translaciju. Ima ulogu u embriogenezi i nishodno je regulisan u odraslim tkivima. U ćelijama tumora može biti ushodno regulisan te se smatra onkofetalnim proteinom (Liao et al.2005). Nađeno je da je on prekomerno eksprimiran u mnogim karcinomima, uključujući karcinom želuca, i da je udružen sa lošom prognozom (Jeng et al.2009) (Jiang et al.2006). Peptidi dobijeni iz IGF2BP3 su testirani u studijama vakcinacije protiv karcinoma (Kono et al.2009).

Lamin B1 (LMNB1)

Lamin B1 je protein matriksa nukleusne lamine i uključen je u održavanje stabilnosti jedra, strukturi hromatina i ekspresiji gena. U ranim stadijumima apoptoze lamin se degradira (Neamati et al.1995) (Sato et al.2008b; Sato et al.2008a; Sato et al.2009). LMNB1 je eksprimiran do određene mere u esencijalno svim normalnim somatskim ćelijama, a preliminarne studije ukazuju na to da on može biti smanjen u toku patogeneze nekih karcinoma uključujući karcinom želuca (Moss et al.1999). U drugim karcinomima, kao što je hepatocelularni karcinom, LMNB1 je ushodno regulisan i u pozitivnoj je vezi sa stadijumom tumora, veličinom i brojem nodula (Lim et al.2002).

Wingless-type MMTV familija mesta integracije, član 5A

WNT5A je sekretovani signalni protein uključen u razvojne procese i onkogenezu. Utvrđeno WNT5A signaliziranje kroz uvojite i LRP5/LRP6 receptore dovodi do održavanja matičnih/progenitorskih ćelija, dok neutvrđeno WNT5A singaliziranje kroz uvojite i ROR2/PTK/RYK receptore kontroliše polarnost tkiva, ćelijsku adheziju ili kretanje, npr. na spoju tumora i strome, što dovodi do invazije (Katoh and Katoh, 2007). On može biti supresor tumora kod nekih karcinoma, ali je ushodno regulisan kod drugih, što uključuje karcinom želuca, gde doprinosi progresiji i stvaranju metastaza i dovodi do loše prognoze (Li et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009) (Kurayoshi et al., 2006).

Protein koji aktivira fibroblast, alfa (FAP)

FAP je integralna membranska gelatinaza. Njegova pretpostavljena aktivnost u vidu proteaze serina može igrati ulogu u kontroli rasta fibroblasta ili interakciji između epitela i mezenhimnog sloja u toku razvoja, reparacije tkiva i epitelijalne karcinogeneze (Scanlan et al.1994). FAP ima potencijalnu ulogu u rastu tumora, stvaranju metastaza i angiogenezi kroz procese ćelijske adhezije i migracije, kao i brzoj degradaciji komponenti EĆM. On je prisutan na ćelijama tumora koje vrše invaziju EĆM, u reaktivnim fibroblastima asociranim sa karcinomom i u endotelijalnim ćelijama koje su uključene u angiogenezu, ali ne i u neaktivnim ćelijama istog tipa. (Dolznig et al.2005; Kennedy et al.2009; Rettig et al.1993; Rettig et al.1994; Scanlan et al. 1994; Zhang et al.2010).

Ekspresija FAP je pronađena u ćelijama karcinoma želuca, a i povezanim fibroblastima stome (Zhi et al.2010) (Chen et al.2006) (Mori et al.2004; Okada et al.2003). U modelu na miševima, pokazano je da su ćelije koje eksprimiraju FAP neizlišna imunosupresivna komponenta mikrosredine tumora (Kraman et al.2010). U modelima vakcinacije tumora na miševima, FAP je uspešno korišćen kao cilj za CD8+ i CD4+ T-ćelijske odgovore (Loeffler et al.2006; Wen et al. 2010) (Lee et al.2005) (Fassnacht et al.2005).

Koatomerski proteinski kompleks, podjedinica gama (COPG);

koatomerski proteinski kompleks, podjedinica gama 2 (COPG2);

Koatomerski proteinski kompleks, podjedinica beta 1 (COPB1)

COPG, COPG2 i COPB1 su podjedinice koatomerskog kompleksa, koji se takođe zove kompleks 1 (COPI) proteina omotača koji je udružen sa vezikulama koje nisu obložene klatrinom. Vezikule koje su obložene sa COPI posreduju u retrogradnom transportu iz Goldžijevog aparata do ER i intra-Goldžijevom transportu (Watson et al., 2004). One takođe mogu biti uključene u anterogradni transport (Nickel et al., 1998). Retrogradni prenos reguliše, između ostalog, EGF-zavisan nuklearni transport EGFR, koji se vezuje za COPG (Wang et al., 2010). Pronađeno je da je COPG prekomerno eksprimiran u ćelijama karcinoma pluća i mikrovaskularnim endotelijalnim ćelijama povezanim sa karcinomom pluća (Park et al., 2008).

Sekvenca sveprisutno eksprimiranog COPG2 je 80% identična sa GOPG (Blagitko et al., 1999). COPG2 može da obrazuje kompleks sličan COP I umesto COPG, koji verovatno ima zanemarljivu funkciju (Futatsumori et al., 2000).

Utišavanje COPB1 u ćelijskim linijama koje eksprimiraju transmembranski regulator sprovođenja cistične fibroze (CFTR) ukazuje na to da je koatomerski kompleks uključen u prenošenje CRTR do plazma membrane (Denning et al., 1992) (Bannykh et al., 2000).

Enzim koji vrši konjugaciju ubikvitina E2S (UBE2S)

UBE2S je pomoćni faktor kompleksa koji promoviše anafazu (APC), E3 ubikvitin ligaza koja reguliše mitotički izlazak i G1 tako što cilja regulatore ćelijskog ciklusa. UBE2S produžava lance ubikvitina nakon pre-ubikvitinacije substrata od strane drugih komponenti (Wu et al., 2010). UBE2S takođe cilja VHL protein za proteazomalnu degradaciju, čime stabilizuje HIF-1alfa (Lim et al., 2008), a moguće i podržava proliferaciju, epitelno-mezehimnu tranziciju i metastaziranje (Chen et al., 2009) (Jung et al., 2006). UBE2S je prekomerno eksprimiran kod nekoliko karcinoma.

Član 11 familije kinezina (KIF11)

KIF11 je neophodan za stvaranje bipolarnog mitotičkog vretena. Pronađeno je da je ushodno regulisan kod nekoliko karcinoma, što često korelira sa kliničkim i patološkim parametrima (Liu et al., 2010) (Peyre et al., 2010). Mali molekularni inhibitori KIF11 kao što je S-Tricil-L-cistein (STLC), koji su razvijeni kao potencijalni antitumorski lekovi, zaustavljaju ćelije u mitozi i promovišu apoptozu ćelija karcinoma (Tsui et al., 2009) (Wiltshire et al., 2010) (Ding et al., 2010). U kliničkim uslovima, inhibitori KIF11 su pokazali samo umerenu aktivnost (Kaan et al., 2010; Tunquist et al., 2010; Wiltshire et al., 2010; Zhang and Xu, 2008).

A dezintegrin i domen metaloproteaze 8 (ADAM8)

Za ADAM8 se inicijalno smatralo da je imunospecifični ADAM, ali je pronađen i u drugim tipovima ćelija, i to često u uslovima koji uključuju zapaljenje i remodeliranje EĆM, uključujući karcinome i respiratorne bolesti kao što je astma (Koller et al.2009) Mnoge vrste ADAM-a, uključujući ADAM8, eksprimirane su u humanim malignim tumorima, gde su uključeni u regulaciju aktivnosti faktora rasta i funkcija integrina, što dovodi do promocije ćelijskog rasta i invazije, iako precizni mehanizmi za ovo u ovom trenutku i dalje nisu jasni (Mochizuki and Okada 2007). U tumorima želuca kod miševa, ADAM8 i drugi ADAM-i su bili povećani, najverovatnije zbog pojačane EGFR signalizacije (Oshima et al.2011).

Homolog proteina ciklusa ćelijske deobe 6 (S.cerevisiae) (CDC6)

CDC6 je esencijalan za inicijaciju replikacije DNK. On se nalazi u nukleusu u toku G1, ali prelazi u citoplazmu na početku S faze. CDC6 takođe reguliše aktivaciju tačke kontrole replikacije kroz interakciju sa ATR (Yoshida et al.2010). Deregulacija CDC6 može dovesti do inaktivacije INK4/ARF lokusa koji kodira tri važna tumor-supresorska gena: p16INK4a i p15INK4b, koji su oba aktivatori puta retinoblastoma, i ARF, koji je aktivator p53 (Gonzalez et al.2006). Utišavanje CDC6 od strane siRNK bi moglo da spreči proliferaciju i da promoviše apoptozu (Lau et al.2006). CDC6 je ushodno regulisan u karcinomima uključujući i karcinom želuca (Nakamura et al.2007) (Tsukamoto et al.2008).

Receptor za F2R faktor koagulacije II (trombin) (F2R)

F2R, koji se takođe naziva proteinazom aktiviran receptor (PAR1) je receptor spojen sa G-proteinom. Signali od strane PAR1, PAR2 i PAR4 mogu da regulišu oslobađanje kalcijuma ili mitogenom-aktiviranu aktivaciju protein kinaze i dovesti do agregacije trombocita, relaksacije krvnih sudova, ćelijske proliferacije, oslobađanja citokina i zapaljenja (Oikonomopoulou et al. 2010). Smatra se da je F2R uključen u proliferaciju endotela i tumorskih ćelija kao i angiogenezu, a on je prekomerno eksprimiran u invazivnim i metastatskim tumorima mnogih vrsta. Nivoi ekspresije direktno koreliraju sa stepenom invazivnosti malignog tumora (Garcia-Lopez et al.2010) (Lurje et al. 2010). U ćelijama karcinoma želuca, aktivacija F2R može da pokrene niz odgovora koji promovišu rast i invaziju tumorskih ćelja, npr. prekomernu ekspresiju NF-kapaB, EGFR i tenascina-C (TN-C) (Fujimoto et al. 2010). U skladu sa tim, pronađeno je da je ekspresija F2R u karcinomu želuca udružena sa dubinom invazije zida, peritonealnom diseminacijom i lošom prognozom (Fujimoto et al.2008). Mišje monoklonalno antihumano PAR1 antitelo (ATAP-2), koje prepoznaje epitop (SFLLRNPN) u okviru N-kraja trombinskog receptora, opisano je, kao i peptidni agonist PAR1 TFLLRNPNDK (Hollenberg and Compton 2002; Mari et al.1996; Xu et al.1995)

Olfaktomedin 4 (OLFM4)

OLFM4, čija funkcija je umnogome nepoznata, prekomerno je eksprimiran u inflamiranom epitelu kolona i u velikom broju tipova humanih tumora, naročito tumorima digestivnog sistema (Koshida et al., 2007). OLFM4 je jasan marker matičnih ćelija u ljudskim crevima i označava podskup ćelija kolorektalnog karcinoma (van der Flier et al., 2009). OLFM4 inhibira protein GRIM-19 koji promoviše apoptozu (Zhang et al., 2004) (Huang et al., 2010), reguliše ćelijski ciklus i promoviše prelazak u S fazu u proliferaciji malignih ćelija. Pored toga, OLFM4 je u vezi sa adhezijom karcinoma i metastaziranjem (Yu et al., 2011b). Forsirana prekomerna ekspresija OLFM4 u mišjim ćelijama tumora prostate dovela je do bržeg formiranja tumora u singeneičkom domaćinu (Zhang et al., 2004). Pronađeno je da je OLFM4 prekomerno eksprimiran u karcinomu želuca (Aung et al., 2006). Inhibicija ekspresije OLFM4 bi mogla da indukuje apoptozu u prisustvu citotoksičnog agensa u ćelijama karcinoma želuca (Kim et al., 2010). Takođe, koncentracija OLFM4 u serumu kod pacijenata sa karcinomom želuca pre operacije bila je povećana u poređenju sa zdravim donorima (Oue et al., 2009). OLFM4 je identifikovan kao novi ciljni gen za retinoične kiseline (RAs) i agens demetilacije 5-aza-2'-deoksicitidina. Za ova dva leka je dokazano da su efikasni u lečenju određenih pacijenata sa mijeloidnom leukemijom (Liu et al., 2010).

Thy-1 ćelijski površinski antigen (THY1)

Thy-1 (CD90) je glikoprotein usidren na GPI koji se nalazi na mnogim tipovima ćelija uključujući T ćelije, neurone, endotelijalne ćelije i fibroblaste. Thy-1 je uključen u procese koji uključuju adheziju, regeneraciju nerava, rast tumora, supresiju tumora, migraciju, ćelijsku smrt i aktivaciju T ćelija. (Rege and Hagood 2006b; Rege and Hagood 2006a) (Jurisic et al.2010). Izgleda da je Thy-1 marker angiogeneze kod odraslih, ali ne i embrionske angiogeneze (Lee et al.1998). Pored toga, on je smatran markerom za razne vrste matičnih ćelija (mezenhimalne matične ćelije, hepatičke matične ćelije („ovalne ćelije“) (Masson et al.2006), keratinocitne matične ćelije (Nakamura et al.

2006) i hematopoetske matične ćelije (Yamazaki et al.2009)). Thy-1 je ushodno regulisan kod nekoliko karcinoma uključujući karcinom želuca i GIST, za koje je i predložen da bude marker (Yang and Chung 2008; Zhang et al.2010) (Oikonomou et al.2007).

Centrozomalni protein 250 kDa (CEP250)

Cep250 ima ulogu u koheziji centara koji organizuju mikrotubule (Mayor et al., 2000). On se takođe naziva i protein asociran sa centrozomalnim Nek2 ili C-Nap1, budući da se

nalazi istovremeno sa i da je supstrat serin/treonin kinaze Nek2. Nek2 kinaza i njeni supstrati regulišu povezanost između centrozoma (Bahmanyar et al., 2008). Na početku mitoze, kada se centrozomi odvajaju radi formiranja bipolarnog vretena, C-Nap1 je fosforilisan i naknadno se odvaja od centrozoma. In vitro eksperimenti su pokazali da prekomerna ekspresija Cep250 narušava organizaciju mikrotubula na centrozomu (Mayor et al., 2002).

Hipoksijom indukovan faktor 1, alfa podjedinica (osnovni heliks-petlja-heliks faktor transkripcije) (HIF1A)

HIF1A je podjedinica faktora indukovanog hipoksijom koja je osetljiva na kiseonik (HIF), faktora transkripcije koji je aktivan u uslovima hipoksije koji se često nalaze kod tumora. On posreduje u transkripciji više od 60 gena koji su uključeni u preživljavanje, metabolizam glukoze, invaziju, metastaziranje i angiogenezu (npr. VEGF). HIF1 je prekomerno eksprimiran u mnogim malignim tumorima i često je udružen sa lošom prognozom, a smatra se i interesantnom metom za farmakološku manipulaciju (Griffiths et al.2005; Quintero et al.2004; Stoeltzing et al.2004) (Zhong et al.1999).

Kod karcinoma želuca, HIF1A doprinosi angiogenezi (Nam et al.2011), korelira sa veličinom tumora, slabijom diferencijacijom, stadijumom tumora, kraćim preživljavanjem (Qiu et al.2011) i metastaziranjem (Wang et al.2010) (Han et al.2006; Kim et al.2009; Oh et al.2008; Ru et al. 2007). Takođe se smatra da dovodi do rezistencije na hemioterapijske lekove kao što su 5-FU kroz inhibiciju lekom-indukovane apoptoze i smanjenje unutarćelijske akumulacije leka (Nakamura et al.

2009) (Liu et al.2008). HIF-1alfa-inhibitor 2-metoksi-estradiol značajno smanjuje metastatska svojstva ćelija karcinoma želuca (Rohwer et al.2009).

v-Ki-ras2 homolog virusnog onkogena Kirsten sarkoma pacova (KRAS)

KRAS je član male GPT-azne superfamilije i protoonkogen koji je uključen u rane korake mnogih puteva prenošenja signala, kao što su MAPK- i AKT-posredovani putevi, koji su potencijalno onkogeni. Supstitucije jedne aminokiseline dovode do aktiviranja mutacija, što rezultuje transformacijom proteina koji ima glavnu ulogu u raznim malignim bolestima, uključujući karcinom želuca (Capella et al., 1991). Onkogene mutacije KRAS nisu tako česte kod karcinoma želuca. U podskupu karcinoma želuca, KRAS lokus je bio umnožen, što je rezultovalo prekomernom ekspresijom KRAS proteina. Tako umnožavanje gena verovatno obrazuje molekularnu osnovu prekomerne aktivacije KRAS kod karcinoma želuca (Mita et al., 2009). Mutirani KRAS aleli doprinose indukciji VEGF usled hipoksije (Kikuchi et al., 2009; Zeng et al., 2010). Mutirani KRAS može takođe da se detektuje u serumu ili plazmi pacijenata sa karcinomom i bio je samim tim predložen kao lako dostupan tumorski marker (Sorenson, 2000). Peptid KRAS-001 je dobijen iz samo jedne od dve spojene varijante – NP_004976 (188 aminokiselina), a ne iz spojene varijante NP_203524 (189 aminokiselina). Spojene varijante se razlikuju u svom poslednjem egzonu, na kojem se nalazi KRAS-001.

Non-SMC kondenzin I kompleks, podjedinica G (NCAPG)

NCAPG je deo kondenzin I kompleksa, koji je sastavljen od proteina strukturalnog održavanja hromozoma (SMC) i non-SMC proteina, a reguliše kondenzaciju hromozoma i odvajanje u toku mitoze (Seipold et al., 2009). Prekomerna ekspresija NCAPG je pronađena kod brojnih tumora uključujući karcinom nazofaringsa (Li et al., 2010), hepatocelularni karcinom (Satow et al., 2010) i melanom (Ryu et al., 2007). U normalnim tkivima, NCAPG je pokazao najveću ekspresiju u testisu. Sugerisano je da može biti mogući marker proliferacije i potencijalni prognostički indikator u karcinomima (Jager et al., 2000).

Topoizomeraza (DNK) II alfa (TOP2A) i topoizomeraza (DNK) II beta (TOP2B)

TOP2A i TOP2B kodiraju veoma homologne izooblike DNK topoizomeraze, koja kontroliše i menja topološka stanja DNK u toku transkripcije i uključena je u kondenzaciju hromozoma, odvajanje hromatida, replikaciju i transkripciju. Topoizomeraza je meta za nekoliko antitumorskih lekova, kao što su antraciklini, a razne mutacije su udružene sa otpornošću na lek (Kellner et al., 2002) (Jarvinen and Liu, 2006). TOP2A (ne i TOP2B) je esencijalna za ćelijsku proliferaciju. Ona se nalazi neposredno pored HER2 onkogena i umnožena je kod velike većine tumora dojke kod kojih je umnožen i HER2, ali takođe i u tumorima bez umnožavanja HER2 (Jarvinen and Liu, 2003), kao i u mnogim drugim vrstama tumora. Takođe, pronađeno je da je TOP2A bio umnožen i prekomerno eksprimiran u podskupu karcinoma želuca, često zajedno sa HER2 (Varis et al., 2002) (Liang et al., 2008).

Laminin, gama 2 (LAMC2)

Laminini su glavni nekolageni konstituenti bazalnih membrana. Oni su uključeni u ćelijsku adheziju, diferencijaciju, migraciju, signaliziranje i metastaziranje. Gama 2 lanac zajedno sa alfa 3 i beta 3 lancima sačinjava laminin 5. LAMC2 promoviše invazivni rast ćelija humanih karcinoma in vivo. On je veoma eksprimiran od strane humanih karcinoma na invazionom frontu, a ekspresija korelira sa lošom prognozom (Tsubota et al., 2010). Proizvod laminina 5 koji nastaje cepanjem od strane MPP-2 je sposoban da aktivira EGFR signalizaciju i promoviše ćelijsku pokretljivost (Schenk et al., 2003). U karcinomu želuca LAMC2 mogu da indukuju članovi EGFR familije ili Wnt5a, a pokazano je da invazivna aktivnost zavisi od LAMC2 (Tsubota et al., 2010) (Yamamoto et al., 2009).

Aril ugljovodonični receptor (AHR)

AHR vezuje planarne aromatične ugljovodonike kao što su TCDD (2,3,7,8-tetrahlorodibenzo-pdioksin) i posreduje u transkripciji gena, uključujući enzime koji metabolišu ksenobiotike kao što su enzimi citohroma P450. On takođe ima ulogu u progresiji ćelijskog ciklusa (Barhoover et al.2010).

Smatra se da je AhR delimično udružen sa tumor-promovišućom aktivnošću dioksina, zato što poseduje pro-proliferativne i antiapoptotičke funkcije, i može dovesti do deregulacije kontakta između ćelija, dediferencijacije i pojačane pokretljivosti (Watabe et al.2010) (Dietrich and Kaina 2010) (Marlowe et al.2008). Eskpresija AHR može biti nishodno regulisana od strane TGF-beta (Dohr and Abel 1997; Wolff et al.2001) i indukovana od strane Wnt ili beta-kateninskom signalizacijom (Chesire et al.2004). Prekomerna ekspresija AHR je pronađena u mnogim malignim tumorima uključujući karcinom želuca, gde je korelirala sa čestom ekspresijom CYP1A1 (Ma et al.

2006). Ekspresija AHR i nukleusna translokacija su bile veće kod karcinoma želuca nego u normalnim tkivima, a ekspresija se postepeno povećavala u toku kancerogeneze (Peng et al.2009a). Aktivacija AhR puta pojačava invazivnost ćelija karcinoma želuca verovatno kroz c-Jun-zavisnu indukciju MMP-9 (Peng et al.2009b). U modelima na miševima, ekspresija konstitutivno aktivnog mutanta aril ugljovodoničnog receptora (CA-AhR) rezultuje razvojem tumora želuca i korelira sa povećanom smrtnošću (Andersson et al.2002; Kuznetsov et al.2005). Čini se da je funkcija AhR u malignim tumorima dvosmislena, budući da neke studije takođe ukazuju na njegovu tumorsupresorsku aktivnost (Gluschnaider et al.2010) (Fan et al.2010).

Receptor motiliteta posredovan hijaluronanom (RHAMM) (HMMR)

HMMR može da bude prisutan na površini ćelije gde vezuje hijaluronsku kiselinu (HA) i interaguje sa HA receptorom CD44. Ova interakcija ima ulogu u procesima kao što su pokretljivost ćelija, zarastanje rana i invazija (Gares and Pilarski, 2000). Unutar ćelije, HMMR se vezuje za citoskelet, mikrotubule, centrozome i mitotičko vreteno i ima ulogu u kontroli integriteta mitotičkog vretena. HMMR je prekomerno eksprimiran u tkivima nekoliko karcinoma (Sohr and Engeland, 2008). Smatralo se da HA štiti ćelije karcinoma od napada imunskog sistema. Nivo HA u serumu je često povećan kod pacijenata sa metastazama (Delpech et al., 1997). HMMR je identifikovan kao obećavajući tumor-asocirani antigen, i mogući prognostički faktor u AML i HLL. Peptidi dobijeni iz HMMR su korišćeni u vakcinama protiv leukemije. Takođe, HMMR-001 je bio testiran za in vitro imunogenost, ali nije bio korišćen za vakcinaciju (Tzankov et al., 2011) (Greiner et al., 2010;

Schmitt et al., 2008; Tabarkiewicz and Giannopoulos, 2010) (Greiner et al., 2005). Prekomerna ekspresija HMMR je takođe pronađena u nekoliko drugih karcinoma i često je bila udružena sa lošom prognozom. HMMR je takođe bio prekomerno eksprimiran u karcinomu želuca, često zajedno sa CD44, i bilo je sugerisano da olakšava invaziju i metastaziranje (Li et al., 1999) (Li et al., 2000a) (Li et al., 2000b).

TPX2, mikrotubul-asociran, homolog (Xenopus laevis) (TPX2)

TPRX2 je protein udružen sa proliferacijom koji je eksprimiran u S-, G(2)- i M-fazama ćelijskog ciklusa i smatra se markerom proliferacije (Cordes et al., 2010).

On je neophodan za normalnu nukleaciju mikrotubula, npr. za formiranje mitotičkih vretena. TPX2 regrutuje i aktivira Aurora A (Bird and Hyman, 2008; Moss et al., 2009). Fosforilacija TPX2 sa Polo-like kinazom 1 povećava njegovu sposobnost da aktivira Aurora A (Eckerdt et al., 2009). TPX2 je prekomerno eksprimiran u mnogim vrstama tumora i često je istovremeno prekomerno eksprimiran sa Aurora-A (Asteriti et al., 2010). Primeri gde je pronađena prekomerna ekspresija TPX2 (često udružena sa lošom prognozom ili kasnim stadijumom) su meningeomet al., 2010), karcinom pluća (Kadara et al., 2009) (Lin et al., 2006; Ma et al., 2006) (Manda et al., 1999) i hepatocelularni karcinom (Shigeishi et al., 2009b) (Satow et al., 2010) (Wang et al., 2003).

Predmetni pronalazak se tako odnosi na peptid koji ima celokupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe a) sekvenca koja sadrži ID BR. SEKV 2 b) varijanta ID BR. SEKV 2 koja indukuje unakrsnu reakciju T ćelija sa navedenim peptidom, naznačeno time što je navedena varijanta izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF za upotrebu u medicini.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na prethodno opisane peptide za upotrebu u medicini koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na prethodno opisane peptide za upotrebu u medicini, naznačeno time što se peptid sastoji ili esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 95.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide za prethodno opisanu upotrebu, naznačeno time što peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide za prethodno opisanu upotrebu, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, koji konkretno sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenjivog lanca (Ii).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira prethodno opisane peptide, pod uslovom da peptid nije kompletan humani protein.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na prethodno opisanu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira prethodno opisanu nukleinsku kiselinu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu kako je ranije opisana ili vektor ekspresije kako je ranije opisan za upotrebu u medicini.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kako je ranije opisana ili vektor ekspresije kako je ranije opisan.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na opisanu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na opisanu ćeliju domaćina, naznačeno time što je antigenprezentujuća ćelija dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje opisanog peptida, metod koji se sastoji od kultivisanja opisane ćelije domaćina i izolovanja peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), metod koji se sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen bilo koji opisani peptid.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod kako je opisan, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod kako je opisan, naznačeno time što antigenprezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid za upotrebu koji sadrži ID BR. SEKV 2 ili varijantu aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPFWFRF, SFNPFWFRF i SFNPLWLRF.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću opisanog metoda, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži opisanu aminokiselinsku sekvencu.

Opisan je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju opisanu aminokiselinsku sekvencu, metod koji obuhvata davanje efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) pacijentu kako je definisano.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa pronalaskom za primenu u lečenju raka, kao što su, na primer, karcinom želuca, gastrointestinalni, kolorektalni, karcinom pankreasa, pluća ili bubrega.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa pronalaskom za primenu u vidu leka na način kako je opisano, naznačeno time što je lek vakcina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na primenu peptida u skladu sa pronalaskom za proizvodnju i razvijanje antitela koja su specifična protiv kompleksa MHC/peptid koji sadrži navedeni peptid.

Opisani su konkretni markerski proteini koji mogu da se koriste za prognozu karcinoma želuca. Pored toga opisana je primena ovih novih ciljeva za lečenje raka. Kako je navedeno u ovom dokumentu, u literaturi je opisano da su proteini koje kodiraju ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NUF2, OLFM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A , TSPAN1, WNT5A, HIF1A i PTK2 prekomerno eksprimirani u karcinomu želuca u poređenju sa normalnim tkivima želuca i drugih vitalnih organa (npr. jetra, bubreg, srce).

Pokazano je da proteini koje kodiraju ABL1, ADAM10, ADAM8, AHR, ASPM, ATAD2, CCDC88A, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, CLCN3, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HIF1A, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, IQGAP3, ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NFYB, NUF2, OLFM4, PBK, PLK4, PPAP2C, PROM1, PTK2, RRM2, SIAH2, THY1, TOP2A, TPX2, TSPAN1, TSPAN8, UBE2S, UCHL5 i WNT5A imaju važnu ulogu u tumorogenezi, budući da su uključeni u malignu transformaciju, rast ćelija, proliferaciju, angiogenezu ili invaziju u normalno tkivo. Takođe za proteine koje kodiraju DNAJC10, EIF2S3, EIF3L, POLD3, PSMC2, PSMD14 i TMPRSS4 postoje određeni dokazi da imaju funkcije koje su relevantne za rak.

Pokazano je da su proteini koje kodiraju PROM1, WNT5A, SMC4, PPAP2C, GPR38, OLFM4 i THY1 veoma eksprimirani i/ili funkcionalno važni u matičnim ćelijama i/ili matičnim ćelijama raka. Smatra se da je PROM1 marker za matične ćelije karcinoma želuca, iako su podaci kontroverzni. Matične ćelije raka su podpopulacija tumorskih ćelija sa potencijalom za samostalno obnavljanje koji je neophodan za održiv rast tumora. Ove ćelije se nalaze u specijalizovanim i visokoorganizovanim strukturama, takozvanim nišama matičnih ćelija raka, koja su neophodna za održavanje potencijala za samostalno obnavljanje matičnih ćelija raka.

Pokazano je da je prekomerna ekspresija proteina AHR, ASPM, ATAD2, CCNB1, CCND2, CCNE2, CDK1 (CDC2), CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HIF1A, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF11, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, LMNB1, MET, MMP11, MMP3, MST1R, MUC6, NCAPG, NUF2, OLFM4, PBK, PPAP2C, PROM1, PTK2, TMPRSS4, TPX2, TSPAN1 i WNT5A u tumorima u vezi sa uznapredovalim stadijumima bolesti i lošom prognozom za pacijente.

Zbog toga su opisani metodi za identifikaciju životinja, poželjno čoveka, za koju je verovatno da ima karcinom želuca. U jednom primeru, utvrđena verovatnoća iznosila je između 80 do 100 procenata. Jedan takav metod sastoji se od utvrđivanja nivoa najmanje jednog od proteina MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 u uzorku tumora od životinje. U jednom otelotvorenju, uzorak se dobija radikalnom hirurškom intervencijom. U drugom primeru, uzorak se dobija iglenom biopsijom.

Kada je utvrđeni nivo MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC620% ili više ushodno regulisan u ćelijama u odnosu na nivo utvrđen u benignim epitelijalnim ćelijama istog uzorka, smatra se da životinjski subjekat najverovatnije ima karcinom želuca.

Što je više različitih proteina iz grupe koja se sastoji od MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 ushodno regulisano, to je veća verovatnoća da će za životinjski subjekat biti utvrđeno da verovatno ima karcinom želuca.

U jednom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 se vrši in situ. U drugom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 se vrši in vitro. U još jednom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 se vrši in vivo. U jednom primeru utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 se vrši pomoću Laser Capture mikroskopije spregnute sa Western blot testom.

U jednom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 se vrši pomoću antitela specifičnog za MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6. U još jednom takvom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 vrši se pomoću PCR sa prajmerom koji je specifičan za mRNK koja kodira MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6. U još jednom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 vrši se sa nukleotidnom probom koja je specifična za mRNK koja kodira MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6. U jednom takvom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 vrši se pomoću Northern blot testa. U drugom primeru, utvrđivanje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 vrši se pomoću eseja zaštite ribonukleaze. U drugim primerima, imunološki testovi kao što su enzimski vezani imunospot eseji (ELISA), radioimunoeseji (RIA) i Western blot testovi, mogu da se koriste za detekciju MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptida u uzorku telesne tečnosti (kao što su krv, serum, pljuvačka, mokraća ili peritonealna tečnost). Biopsije, uzorci tkiva i uzorci ćelija (kao što su jajnici, limfni čvorovi, sljušteni uzorci površinskih epitelijalnih ćelija jajnika, biopsije pluća, biopsije jetre), i bilo koji uzorak tečnosti koja sadrži ćelije (kao što su peritonealna tečnost, pljuvačka i pleuralni izlivi) mogu da se testiraju izvršavanjem deagregacije i/ili rastvaranja uzorka tkiva ili ćelija i podvrgavanjem uzorka imunoeseju za detekciju polipeptida, kao što su ELISA, RIA ili Western blot. Takvi uzorci ćelija ili tkiva mogu takođe da se analiziraju pomoću metoda zasnovanih na nukleinskim kiselinama, npr. amplifikacija pomoću reverzno transkripcione lančane reakcije polimeraze (RT-PCR), Northern hibridizacije ili slot- ili dot-blotovanja. Da bi se izvršila vizuelizacija distribucije tumorskih ćelija u okviru uzorka tkiva, mogu da se primene dijagnostički testovi koji čuvaju strukturu tkiva uzorka, npr. imunohistološko bojenje, in situ RNK hibridizacija, ili in situ RT-PCR kako bi se detektovao markerski polipeptid karcinoma želuca, odnosno mRNK. U cilju in vivo lokalizacije tumorskih masa mogu da se upotrebe imidžing testovi, kao što su magnetna rezonanca (MR), tako što će se u telo ispitanika uvesti antitelo koje se specifično vezuje za MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptid (konkretno polipeptid koji se nalazi na površini ćelije), naznačeno time što je antitelo konjugovano ili na drugi način spojeno sa paramagnetnim obeleživačem (ili drugim prikladnim jedinjenjem koje može da se detektuje u zavisnosti od imidžing metoda koji se koristi); alternativno, lokalizacija neobeleženog antitela koje je specifično za tumorski marker može da se detektuje pomoću sekundarnog antitela koje je spojeno sa jedinjenjem koje može da se detektuje.

Pored toga, opisani su himerni/fuzioni proteini/peptidi koji sadrže MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6

polipeptide i njihove fragmente, uključujući funkcionalne, proteolitičke i antigene fragmente.

Fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula pogodno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4<+>T ćelije. CD4<+>stimulišući epitopi su dobro poznati u ovoj oblasti i uključuju one definisane za tetanusni toksoid. U jednom primeru, peptid je fuzioni protein, koji konkretno sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii). U jednom primeru, opisan je skraćeni humani protein ili fuzioni protein proteinskog fragmenta i drugog polipeptidnog dela pod uslovom da ljudski deo uključuje jednu ili više inventivnih sekvenci aminokiselina.

Opisana su antitela protiv MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptida, himernih/fuzionih proteina koji sadrže MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptide, kao i protiv fragmenata MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptida, uključujući proteolitičke i antigene fragmente, kao i protiv himernih/fuzionih proteina/peptida koji sadrže ove fragmente. Pored toga, takođe su opisani i metodi upotrebe takvih antitela za prognozu raka i konkretno karcinoma želuca.

Antitela predmetnog pronalaska mogu biti poliklonalna antitela, monoklonalna antitela i/ili himerna antitela. Besmrtne ćelijske linije koje proizvode monoklonalno antitelo predmetnog pronalaska takođe su deo predmetnog pronalaska.

Osoba dovoljno stručna u navedenoj oblasti će razumeti da će u nekim slučajevima veća ekspresija MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 kao gena tumorskog markera ukazivati na lošiju prognozu za ispitanika koji ima karcinom želuca. Na primer, relativno veći nivoi MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 ekspresije mogu ukazivati na relativno veći primarni tumor, veće tumorsko opterećenje (npr. više metastaza) ili relativno maligniji fenotip tumora.

Što je više različitih proteina iz grupe koju čine MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 prekomerno eksprimirano, to je prognoza lošija.

Opisane dijagnostičke i prognostičke metode obuhvataju primenu poznatih metoda, npr. metode zasnovane na antitelima u cilju detekcije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptida, kao i metode zasnovane na hibridizaciji i/ili umnožavanju nukleinskih kiselina u cilju detekcije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 mRNK.

Pored toga, budući da brza destrukcija ćelija tumora često ima za posledicu stvaranje antitela, tumorski markeri pronalaska za karcinom želuca mogu da se koriste u serološkim esejima (npr. ELISA test seruma ispitanika) radi detekcije autoantitela protiv MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 kod ispitanika. Nivoi autoantitela specifičnih za MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptid koji su najmanje oko tri puta veći (i poželjno najmanje pet puta ili sedam puta veći, najpoželjnije 10 ili 20 puta veći) nego u kontrolnom uzorku, indikativni su za karcinom želuca.

MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptidi koji se nalaze na ćelijskoj površini, unutar ćelije ili su sekretovani, mogu svi da se koriste za analizu biopsija, npr. uzoraka tkiva ili ćelija (uključujući ćelije dobijene iz tečnih uzoraka, kao što je tečnost peritonealne duplje) u cilju identifikacije prisustva ćelija karcinoma želuca u biopsijama tkiva ili ćelija. Biopsija može da se analizira kao intaktno tkivo ili kao uzorak čitavih ćelija, ili po potrebi može da se izvrši deagregacija i/ili rastvaranje uzorka tkiva ili ćelija za specifičnu vrstu dijagnostičkog testa koji će da se koristi. Na primer, biopsije ili uzorci mogu biti podvrgnuti analizi čitavog tkiva ili čitavih ćelija radi utvrđivanja nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptida ili nivoa mRNK in situ, npr. primenom imunohistohemije, in situ mRNK hibridizacije ili in situ RT-PCR. Vešt stručnjak će znati kako da obradi tkiva ili ćelije radi analize nivoa polipeptida ili mRNK primenom imunoloških metoda kao što su ELISA, imunobloting ili ekvivalentne metode, ili analize nivoa mRNK pomoću analitičkih metoda zasnovanih na nukleinskim kiselinama, kao što su RT-PCR, Northern hibridizacija, ili slot- ili dot-bloting.

Kompleti za merenje nivoa ekspresije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6.

Opisani su kompleti za detekciju povećanog nivoa ekspresije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 kao markerskog gena karcinoma želuca kod ispitanika. Komplet za detekciju markerskog polipeptida karcinoma želuca poželjno sadrži antitelo koje specifično vezuje izabrani markerski polipeptid za karcinom želuca. Komplet za detekciju markerske mRNK za karcinom želuca poželjno sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina (npr. jedan ili više oligonukleotidnih prajmera ili proba, DNK probe, RNK probe ili šablone za stvaranje RNK proba) koje se specifično hibridizuju sa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 mRNK.

Konkretno, komplet zasnovan na antitelima može da se koristi za detekciju prisustva i/ili merenje nivoa MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptida koji je specifično vezan od strane antitela ili njegovog imunoreaktivnog fragmenta. Komplet može da sadrži antitelo koje je reaktivno na antigen i reagens za detekciju reakcije antitela sa antigenom. Takav komplet može biti ELISA komplet i može sadržati kontrolu (npr. određenu količinu specifičnog markerskog polipeptida za karcinom želuca), primarna i sekundarna antitela kada je to prikladno, i sve druge neophodne reagense kao što su jedinjenja koja mogu da se detektuju, enzimski supstrati i reagensi u boji, kako je opisano ranije. Dijagnostički komplet može, alternativno, da bude komplet za imunoblot koji uopšteno sadrži komponente i reagense opisane u ovom tekstu.

Komplet zasnovan na nukleinskim kiselinama može da se koristi za detekciju i/ili merenje nivoa eskpresije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 detektovanjem i/ili merenjem količine MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 mRNK u uzorku, kao što je biopsija tkiva ili ćelija. Na primer, RT-PCR komplet za detekciju povećane ekspresije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 poželjno sadrži oligonukleotidne prajmere koji su dovoljni da se izvrši reverzna transkripcija markerske mRNK za karcinom želuca u cDNK i PCR umnožavanje markerske cDNK za karcinom želuca, i poželjno će takođe sadržati kontrolne PCR šablonske molekule i prajmere radi izvođenja odgovarajućih negativnih i pozitivnih kontrola, i unutrašnjih kontrola za određivanje količine. Osoba stručna o navedenoj oblasti će razumeti kako da odabere odgovarajuće prajmere za izvođenje reakcija reverzne transkripcije i PCR, kao i odgovarajuće kontrolne reakcije koje treba izvršiti. Takve smernice se mogu naći, npr., u radu F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1997. U stručnoj oblasti su poznate brojne varijacije RT-PCR. Ciljano dostavljanje imunotoksina u MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 može da se koristi kao terapijski cilj za lečenje ili prevenciju karcinoma želuca. Na primer, molekul antitela koje se specifično vezuje za polipeptid MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 koji se nalazi na ćelijskoj površini može da se konjuguje sa radioizotopom ili drugim toksičnim jedinjenjem. Ispitaniku se daju konjugati antitela tako da vezivanje antitela za njegov srodni polipetid karcinoma želuca rezultuje ciljanim dostavljanjem terapeutskog jedinjenja ćelijama karcinoma želuca, čime se tretira karcinom jajnika.

Terapeutsko jedinjenje može biti toksin, radioizotop, lek, hemijska supstanca ili protein (pogledajte npr. Bera et al. „Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2“ Cancer Res.59:4018-4022 (1999)). Na primer, antitelo može biti povezano ili konjugovano sa bakterijskim toksinom (npr. toksin difterije, egzotoksin A pseudomonasa, toksin kolere) ili biljnim toksinom (npr. ricinski toksin) za ciljano dostavljanje toksina ćeliji koja eksprimira MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6. Ovaj imunotoksin može biti dostavljen ćeliji, a nakon vezivanja markerskog polipeptida karcinoma želuca koji se nalazi na površini ćelije, toksin konjugovan sa antitelom specifičnim za marker karcinoma želuca biće dostavljen ćeliji.

Pored toga, za bilo koji od polipeptida MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 za koji postoji specifični ligand (npr. ligand koji vezuje protein koji se nalazi na površini ćelije), ligand može da se koristi umesto antitela da bi se toksično jedinjenje ciljano dostavilo ćeliji karcinoma želuca na način kako je opisano ranije.

Termin „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog polipeptida karcinoma želuca, isporučivanje toksina ćeliji karcinoma želuca koja eksprimira markerski gen za karcinom želuca u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida karcinoma želuca) opisanih u ovom dokumentu.

Kad god je to moguće, opisana antitela mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osoba vešta u ovoj oblasti će razumeti da za stvaranje opisanih antitela mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za karcinom želuca kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK. Na primer, cDNK koja kodira MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptid, ili njegov fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasci, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za karcinom želuca koji se koristi za stvaranje antitela.

Osoba stručna u navedenoj oblasti će znati da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela, pogledajte npr. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka karcinoma želuca fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalna antitela“, na način na koji je korišćen u ovom dokumentu, odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (patent registrovan u SAD-u pod br.4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu registrovanom u SAD-u pod br.4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno, Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u stručnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u dokumentu WO 94/29348 objavljenom 22. decembra 1994. i patentu registrovanom u SAD-u pod brojem 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fe fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena i sposobnost da unakrsno vezuje antigen.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u navedenoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Opisana antitela mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci kostura Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela su dobro poznati u stručnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. U skladu sa tim, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (patent registrovan u SAD-u pod brojem 4,816,567), naznačeno time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Opisana antitela se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u navedenoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne, kao i sistemske, terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski, a takva određivanja spadaju u okvir veštine stručne oblasti. Osobe stručne u navedenoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela za tretiranje karcinoma želuca, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u navedenoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija karcinoma želuca kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, koje rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje karcinoma želuca.

Budući da je pokazano da su proteini ABL1, ADAM10, AHR, CCND2, CDC6, CDK1, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM6, COL6A3, EIF2S3, LOC255308, EPHA2, ERBB2, ERBB3, F2R, FAP, HMMR, HSP90B1, IGF2BP3, ITGB4, KIF2C, KRAS, LAMC2, LCN2, MET, MMP11, MMP12, MMP3, MST1R, NUF2, OLFM4, PROM1, RRM2, THY1, TMPRSS4, TOP2A, TSPAN1, WNT5A, HIF1A i PTK2 visoko eksprimirani u najmanje jednom podskupu tkiva karcinoma želuca u poređenju sa normalnim tkivima, inhibicija njihove ekspresije ili aktivnosti može da se integriše u bilo koju terapijsku strategiju za lečenje ili preveniranje karcinoma želuca.

Princip antisens terapije bazira se na hipotezi da sekvencno-specifična supresija ekspresije gena (preko transkripcije ili translacije) može da se postigne unutarćelijskom hibridizacijom između genomske DNK ili mRNK i komplementarnih antisens vrsta. Obrazovanje takvog dupleksa hibridne nukleinske kiseline ometa transkripciju ciljne genomske DNK koja kodira tumorski antigen, ili obradu/transport/translaciju i/ili stabilnost ciljne mRNK tumorskog antigena.

Antisens nukleinske kiseline mogu da se isporuče raznovrsnim pristupima. Na primer, antisens oligonukleotidi ili antisens RNK može da se direktno da ispitaniku (npr. intravenskom injekcijom) u obliku koji omogućava preuzimanje u ćelije tumora. Alternativno, u ćelije in vivo, mogu da se uvedu virusni ili plazmidni vektori koji kodiraju antisens RNK (ili fragmente RNK). Antisens efekti mogu takođe da se indukuju sens sekvencama; međutim, stepen fenotipskih promena je veoma varijabilan. Fenotipske promene indukovane efikasnom antisens terapijom se procenjuju u skladu sa promenama u, npr. nivoima ciljne mRNK, nivoima ciljnog proteina i/ili nivoima aktivnosti ciljnog proteina.

U specifičnom primeru, inhibicija funkcije tumorskog markera želuca pomoću antisens genske terapije može da se postigne direktnim davanjem antisens RNK tumorskog markera karcinoma želuca ispitaniku. Antisens RNK tumorskog markera može da se proizvede i izoluje pomoću bilo koje standardne tehnike, ali se najčešće proizvodi in vitro transkripcijom pomoću antisens cDNK tumorskog markera pod kontrolom visoko efikasnog promotera (npr. T7 promoter). Unošenje antisens RNK tumorskog markera u ćelije može se izvršiti bilo kojom od metoda za direktno unošenje nukleinskih kiselina koje su opisane u nastavku.

Alternativna strategija za inhibiranje funkcije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 pomoću genske terapije obuhvata unutarćelijsku ekspresiju anti- MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 antitela ili dela anti- MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 antitela. Na primer, gen (ili fragment gena) koji kodira monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 polipeptid i inhibira njegovu biološku aktivnost, postavlja se pod transkripcionu kontrolu specifične (npr. tkivno- ili tumor-specifične) genske regulatorne sekvence, unutar vektora ekspresije nukleinske kiseline. Vektor se zatim daje ispitaniku tako da ga preuzimaju ćelije karcinoma želuca ili druge ćelije, koje zatim sekretuju anti- MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6 antitelo, i time blokiraju biološku aktivnost MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptida. Poželjno je da MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 polipeptidi budu prisutni na ekstraćelijskoj površini ćelija karcinoma želuca.

U metodama opisanim ranije u tekstu, koje obuhvataju unošenje i preuzimanje egzogene DNK u ćelije ispitanika (tj. transdukciju ili transfekciju gena), nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti u obliku ogoljene DNK ili nukleinske kiseline mogu biti u vektoru za dostavljanje nukleinskih kiselina ćelijama u cilju inhibicije ekspresije proteina tumorskog markera karcinoma želuca. Vektor može biti komercijalno dostupan preparat, kao što je adenovirusni vektor (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Kvebek, Kanada). Dostavljanje nukleinskih kiselina ili vektora ćelijama može biti putem različitih mehanizama. U jednom primeru, dostavljanje je moguće putem lipozoma, primenom komercijalno dostupnih preparata lipozoma kao što su LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO- 25 BRL, Inc, Gaithersburg, Merilend), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Nemačka) i TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc, Medison, Viskonsin), kao i drugih lipozoma koji su razvijeni u skladu sa standardnim procedurama u stručnoj oblasti. Pored toga, nukleinska kiselina ili vektor ovog pronalaska mogu da se dostavljaju in vivo pomoću elektroporacije, tehnologije koja je dostupna od kompanije Genetronics, Inc. (San Diego, Kalifornija) kao i pomoću aparata SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp, Tuson, Arizona).

U jednom primeru, dostavljanje vektora može biti putem virusnog sistema, kao što je sistem retrovirusnog vektora u koji se može upakovati rekombinantni retrovirusni genom. Rekombinantni retrovirus potom može da se koristi za inficiranje i samim tim dostavljanje antisens nukleinske kiseline inficiranim ćelijama koja inhibira ekspresiju MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB ili MUC6. Naravno, tačan metod uvođenja izmenjene nukleinske kiseline u ćelije sisara nije ograničen na primenu retrovirusnih vektora. Za ovu proceduru široko su dostupne i druge tehnike, uključujući primenu adenovirusnih vektora, adeno-asociranih virusnih (AAV) vektora, lentivirusnih vektora, pseudotipiziranih retrovirusnih vektora. Takođe mogu da se koriste fizičke tehnike transdukcije, kao što je dostavljanje lipozomom i receptorom-posredovana endocitoza i drugi mehanizmi endocitoze. Ovaj pronalazak može da se koristi zajedno sa bilo kojim od ovih ili drugim često korišćenim metodama za transfer gena.

Antitela se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke eseje. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom primeru, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ekstraćelijske domene dva ili više MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 ciljeva, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, kao i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u stručnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak, dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 proteina in situ.

Predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji ima celokupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina i koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe a) sekvenca koja sadrži ID BR. SEKV 2 b) varijanta ID BR. SEKV 2 koja indukuje unakrsnu reakciju T ćelija sa navedenim peptidom, naznačeno time što je navedena varijanta izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF za upotrebu u medicini.

Peptidi za upotrebu pronalaska imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Sekvence koje se ovde upoređuju mogu imati adiciju ili deleciju (na primer, praznina i slično) u optimalnom poravnanju dveju sekvenci. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili alatke za analizu koje su dostupne u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u ovoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong et al.8809-14); (Appay et al.1805-14; Colombetti et al.2730-38; Zaremba et al.4570-77).

Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da su bočni lanci od, na primer, jednog ili dva aminokiselinskog ostataka izmenjeni (na primer zamenjeni bočnim lancem nekog drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno javlja ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid još uvek može da se veže za HLA molekul na suštinski isti način kao peptid koji se sastoji od date aminokiselinske sekvence u ID BR. SEKV 1 do 33. Na primer, peptid može da se modifikuje tako da barem zadržava, ako ne i poboljšava, sposobnost da interaguje sa i da se vezuje za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što je HLA-A*02 ili -DR, i na taj način barem zadržava, ako ne i poboljšava, sposobnost vezivanja za TCR aktivirani CTL.

CTL mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature (Rammensee, Bachmann, and Stevanovic) i baza podataka (Rammensee et al.213-19), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Varijante predmetnog pronalaska zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih CTL, koji naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska.

Oni aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorima mogu da se modifikuju zamenjivanjem sa nekom drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantne MHC. Stoga, pored navedenih klauzula, peptid pronalaska može biti bilo koji peptid (a pod tim pojmom pronalazači podrazumevaju i oligopeptide ili polipeptide), koji uključuje aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili varijantu kako sledi.

Tabela 3: Opisane varijante i motiv peptida u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do 33

Takođe, mogu biti prikladni i duži peptidi. Takođe je moguće da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže aktuelni epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

U skladu sa tim, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje peptide i varijante epitopa MHC klase I za upotrebu u medicini naznačene time što peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina.

Naravno, peptid ili varijanta za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti.

U naročito preferiranom otelotvorenju pronalaska peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 2 za upotrebu u medicini.

„Esencijalno se sastoji od“ će značiti da peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, pored sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 95 ili njene varijante, sadrži dodatne N- i/ili C-terminalno locirane produžetke od aminokiselina koji nužno ne obrazuju deo peptida koji funkcioniše kao epitop za epitop MHC molekula.

Ipak, ovi produžeci mogu biti važni za obezbeđivanje efikasnog uvođenja peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom u ćelije. U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigenasociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „Ii“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497.

Pored toga, peptid ili varijanta mogu sadržati reverzne peptidne veze ili nepeptidne veze.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, koji je pomoću reference inkorporiran u ovaj dokument. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i za T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent registrovan u Sjedinjenim Američkim Državama pod brojem 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajevima peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili t-butiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil ili amido grupa.

Nadalje, peptidi pronalaska mogu biti sintetisani tako da se izmeni njihova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida pronalaska može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida pronalaska.

Slično tome, opisani peptid ili varijanta može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije su dobro poznati u stručnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, koji je pomoću reference inkorporiran u ovaj dokument. Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksil grupa i sulfidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u ovoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, izdanja Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.

Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.

Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom.

Woodward-ov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline.

Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala.

Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina.

Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.

Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka.

Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.

U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).

Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG često je udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.

Peptid ili varijanta, naznačeno time što peptid sadrži nepeptidne veze, poželjno je otelotvorenje pronalaska. Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lu et al. (1981) i referencama u istom. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/1-hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonske kiseline ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (Bruckdorfer, Marder, and Albericio 29-43) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid ili varijantu peptida za upotrebu pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu, ali i ne moraju, sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarno kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane (Saiki et al.487-91)). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u stručnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u patentima registrovanim u SAD-u pod br.4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid, koji sačinjava jedinjenje pronalaska, može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, kao i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u ovoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer od kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za blaktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže preprotripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u stručnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćin koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (Br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju kvasnice, ćelije insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, i Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Metod koji je izložio Beggs (1978) Nature 275,104-109 takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems, ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u stručnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koji sadrži prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) trenutno se ispituju za lečenje karcinoma prostate (Sipuleucel–T) (Rini et al.67-74; Small et al.3089-94).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida ili njegove varijante, metod koji obuhvata kultiviranje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Brunsvig et al.1553-64; Staehler et al.).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedena T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Karre et al 1985.

Poželjno, ćelija domaćin pre transfekcije značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje ko-stimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i ko-stimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivni CTL.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji je sposoban da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 2 ili varijantu njegove aminokiselinske sekvence, naznačeno time što je navedena varijanta izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje CTL in vitro. Na primer, metode opisane u radovima Peoples et al (1995) i Kawakami et al (1992) koriste autologne tumor-infiltrirajuće limfocite za stvaranje CTL. Plebanski i saradnici (1995) upotrebljavaju autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje CTL. Jochmus i saradnici (1997) opisuju proizvodnju autolognih CTL pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Hill i saradnici (1995) i Jerome i saradnici (1993) upotrebljavaju B ćelije u proizvodnji autolognih CTL. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih CTL. S. Walter i saradnici 2003. opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U ovoj studiji, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa ko-stimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija, a metod je detaljno opisan u dokumentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer, Porta et al (1994)) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, opisane su aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodama pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 1 do 95.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije).

Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentni imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije kako su opisane mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase I) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase I; (Dengjel et al.4163-70)).

T ćelije kako su opisane mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe opisuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, metod koji obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao, ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u stručnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u stručnoj oblasti i mogu se naći npr u (Dudley et al.850-54; Dudley et al.2346-57; Rosenberg et al.889-97; Rosenberg et al.

1676-80; Yee et al.16168-73); pregledani u (Gattinoni et al.383-93) i (Morgan et al.).

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, vektor ekspresije, ćelija ili aktivirani CTL koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato, svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transfektovane tako da ko-eksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i Longenecker 1993). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 CTL je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 CTL, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u ovoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ID BR. SEKV: 2 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 15 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest ili trinaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Polinukleotid može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u stručnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. (Pascolo et al.117-22). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK.

Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Medikament pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvansa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CTL i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, Amplivax®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, betaglukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil, ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF.

Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema opisani su ranije (Allison and Krummel 932-33). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem! sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD-u pod br.5,849,589, posebno i u celosti inkorporiran u ovom dokumentu pomoću reference) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) [Gabrilovich 1996].

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim, tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg 471-84). Patent registrovan u SAD-u pod br.6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, bevacizumaba, celebreksa, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Bez izvođenja suvišnih eksperimenata, tručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska.

Poželjni adjuvansi su imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutska smeša u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitnomakrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutska smeša u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitnomakrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), imikvimoda i rezikvimoda.

U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je imikvimod ili rezikvimod.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je subkutana, intradermalna, intramuskularna ili za oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmakološki prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša takođe može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed.2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u patentu EP2113253.

Predmetni pronalazak obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju malignih tumora, konkretno karcinoma želuca, karcinoma bubrežnih ćelija, karcinoma kolona, nemikrocelularnog karcinoma pluća, adenokarcinoma, karcinoma prostate, benigne neoplazme i malignog melanoma.

Dalje je opisan komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži rastvarač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Opisani kompleti se sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrže uputstva na posudi ili zajedno sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za subkutanu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr.2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni rastvarač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja rastvarača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75µg), a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne ili korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rastvarače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Ovako opisani kompleti mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, ovako opisani kompleti obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd.) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente prikazanog kompleta.

Prikazana formulacija je ona koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, subkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. Primena može biti i pomoću infuzione pumpe.

Budući da su opisani peptidi dobijeni iz MST1R, UCHL5, SMC4, NFYB, PPAP2C, AVL9, UQCRB i MUC6 izolovani iz karcinoma želuca, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje karcinoma želuca.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

PRIMERI

PRIMER 1:

Identifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tumorska tkiva pacijenata obezbedili su Medicinski fakultet prefekture Kjoto (Kyoto Prefectural University of Medicine – KPUM), Kjoto, Japan, Univerzitetski medicinski fakultet grada Osaka (OCU), Osaka, Japan, kao i Univerzitetska bolnica u Tćbingenu, Nemačka. Pre operacije su od svih pacijenata pribavljeni pisani informisani pristanci. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i uskladištena na -80°C do izolacije TUMAP-a.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk, K.1991; Seeger, F.H.T1999) primenom HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Metode

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters), a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-Orbitrap hibridnom masenom spektrometru (ThermoFisher Scientific) opremljenom ESI izvorom. Skupovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometar je radio u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence. Na slici 1 je prikazan primerni spektar koji je dobijen iz tumorskog tkiva za MHC klasa I-asocirani peptid CDC2-001 i njegov elucioni profil na UPLC sistemu.

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptide pronalaska

Nisu svi peptidi koji su identifikovani kao da su prezentovani na površini tumorskih ćelija od strane MHC molekula pogodni za imunoterapiju, zato što je većina ovih peptida dobijena iz normalnih ćelijskih proteina koje eksprimiraju mnoge vrste ćelija. Samo nekoliko ovih peptida je tumorasocirano i verovatno je da su sposobni da indukuju T ćelije sa velikom specifičnošću prepoznavanja za tumor iz kojeg su dobijeni. Da bi identifikovali takve peptide i sveli rizik od autoimunosti indukovane vakcinacijom na minimum, pronalazači su se fokusirali na one peptide koji su dobijeni od proteina koji su prekomerno eksprimirani na tumorskim ćelijama u poređenju sa većinom normalnih tkiva.

Idealni peptid će biti izveden iz proteina koji je jedinstven za tumor i nije prisutan u bilo kom drugom tkivu. Da bi se identifikovali peptidi koji su dobijeni iz gena sa profilom ekspresije sličnim idealnom, identifikovani peptidi su dodeljeni proteinima, odnosno genima, iz kojih su dobijeni i generisani su profili ekspresije ovih gena.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su od strane različitih kliničkih lokacija (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani sa malterom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK;

Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) izmešana je tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka. Leukociti su izolovani iz uzoraka krvi 4 zdrava dobrovoljca.

Kvalitet i kvantitet svih RNK uzoraka procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Eksperimenti na mikročipu

Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix. Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5–8 µg ukupne RNK, primenom SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena pomoću kompleta BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili pomoću kompleta GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizacija i bojenje cRNK sa streptavidin-fikoeritrin i biotiniliranim antistreptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani pomoću GCOS softvera (Affymetrix), upotrebom podrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix. Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala datih od strane softvera, a normalni uzorak bubrega je arbitrarno podešen na 1,0.

Profili ekspresije izvornih gena koji su veoma prekomerno eksprimirani u karcinomu želuca prikazani su na slici 2.

PRIMER 3

In vitro imunogenost za IMA941 MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bismo dobili informacije u pogledu imunogenosti TUMAP predmetnog pronalaska, sproveli smo istraživanja korišćenjem dobro ustanovljene platforme za in vitro stimulaciju koja je već opisana od strane (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). Pomoću ovog sistema, mogli smo da pokažemo rezultate za pozitivnu imunogenost (tj. ekspanziju određenih T ćelija) za 47 od 54 testiranih HLA-A*2402 restrikovanih TUMAP-a, i za 3 od 3 testirana HLA-A*0201 restrikovana TUMAP-a, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 4).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bismo izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ) napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, prvo smo izolovali CD8 T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*24 ili iz HLA-A*2 trombocitno-leukocitnih međuslojeva zdravih donora dobijenih iz banke krvi u Tubingenu.

CD8 T ćelije su bile ili direktno obogaćene ili su prvo izolovane PBMC-a (mononuklearne ćelije periferne krvi) primenom standardnog medijuma za separaciju na osnovu gradijenta gustine (PAA, Cölbe, Nemačka). Izolovani CD8 limfociti ili PBMC su inkubirani do primene T-ćelijskog medijuma (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U TCM je dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nćrnberg, Nemačka) citokina za ovaj korak kultiviranja. Izolacija CD8+ limfocita izvršena je pozitivnom selekcijom primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanja su izvršena na ranije opisan način (Walter et al.4974-78) sa manjim modifikacijama. Ukratko, proizvedeni su biotinilirani rekombinantni HLA-A*2402 u koje je ubačen peptid i HLA-A*0201 molekuli kojima nedostaje transmembranski domen i koji su biotinilirani na karboksi kraju teškog lanca. Prečišćeno ko-stimulatorno mišje IgG2a anti humano CD28 At 9.3 (Jung, Ledbetter, and Muller-Eberhard 4611-15) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom veličine 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD). pMHC koje su korišćene kao visoka i niska imunogena kontrola bile su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV iz modifikovanog Melan-A/MART-1), odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5).

800.000 perli / 200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 600 ng biotin-anti-CD28 plus 200 ng relevantnih biotin-pMHC (perle velike gustine). Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3-4 dana na 37°C, 5% CO2 i relativna vlažnost 95%. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 3-4 dana na 37°C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta.

Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa fluorescentnim A*0201 ili A*2402 HLA multimerima (proizvedenim na način opisan od strane {Altman, 1996 ALTMAN1996 /id}) i klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) ili dodatno sa markerom održivosti (Live/dead-Aqua ili –Violet boja (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka)), i sprovedene su na četvorobojnom FACSCalibur (BD) ili LSRII SORP citometru (BD; osamnaest boja, opremljen sa plavom (488 nm), ljubičastom (405 nm), crvenom (640 nm) odnosno zelenom (532 nm) bojom.) Peptidno-specifične ćelije su izračunate kao procenat ukupnih CD8+ T ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FCSExpress ili FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro priprema specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovana je odgovarajućom sinhronizacijom i upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifične CD8+ T ćelije nakon in vitro stimulacije (tj. frakcija multimer+ ćelijske populacije u okviru ovog mesta sačinjavala je najmanje 1% CD8+ ćelija, učestalost je bila najmanje 10 puta veća od srednje vrednosti odgovarajućih negativnih kontrola (stimulacija sa irelevantnim i bojenje sa relevantnim multimerom) i ćelije se nisu nalazile na dijagonali dijagrama).

In vitro imunogenost za IMA941 peptide

Za 47 od 54 testiranih HLA-A*2402 peptida i za 3 od 3 testirana HLA-A*0201 peptida, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za dva peptida pronalaska prikazani su na slici 3 zajedno sa odgovarajućom negativnom kontrolom. Rezultati za 54 A*2402 i 3 A*0201 peptida sumirani su u tabeli 4.

Tabela 4: In vitro imunogenost HLA klasa I peptida

Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane Immatics pokazuju procenat pozitivnih testiranih donora i mesta kod procenjivih uzoraka. Najmanje četiri donora i 48 mesta je moglo da se evaluira za svaki peptid. ID BR. SEKV: 2 je sekvenca pronalaska.

Sledeći peptidi su već opisani u drugim aplikacijama od strane Immatics i obuhvaćeni u vakcinama IMA901 (MET-001 i TOP-001), IMA910 (MET-001 i TOP-001) i IMA950 (IGF2BP3-001). Na primer, MET-001 dovodi do izuzetno dobrih in vivo reakcija, podaci se mogu uzeti kao indikacija za kliničku korisnost peptida.

Spisak referenci

Ahmed, A. U., et al. "Effect of disrupting seven-in-absentia homolog 2 function on lung cancer cell growth." J Natl.Cancer Inst. 100.22 (2008): 1606-29.

Allison, J. P. and M. F. Krummel. "The Yin and Yang of T cell costimulation." Science 270.5238 (1995): 932-33.

Altmeyer, A., et al. "Tumor-specific cell surface expression of the-KDEL containing, endoplasmic reticular heat shock protein gp96." Int J Cancer 69.4 (1996): 340-49.

Appay, V., et al. "Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide." Eur.J Immunol.36.7 (2006): 1805-14.

Banerjee, S. K., et al. "Expression of cdc2 and cyclin B1 in Helicobacter pylori-associated gastric MALT and MALT lymphoma : relationship to cell death, proliferation, and transformation." Am J Pathol. 156.1 (2000): 217-25.

Bartman, A. E., et al. "Aberrant expression of MUC5AC and MUC6 gastric mucin genes in colorectal polyps." Int J Cancer 80.2 (1999): 210-18.

Basu, S., et al. "Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kappa B pathway." Int Immunol. 12.11 (2000): 1539-46.

Bauer, B., S. Bartfeld, and T. F. Meyer. "H. pylori selectively blocks EGFR endocytosis via the nonreceptor kinase c-Abl and CagA." Cell Microbiol.11.1 (2009): 156-69.

Benatti, P., et al. "A balance between NF-Y and p53 governs the pro- and anti-apoptotic transcriptional response." Nucleic Acids Res 36.5 (2008): 1415-28.

Bertolini, G., et al. "Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 106.38 (2009): 16281-86.

Bierie, B. and H. L. Moses. "TGF-beta and cancer." Cytokine Growth Factor Rev.17.1-2 (2006): 29-40.

Bitoun, E. and K. E. Davies. "The robotic mouse: unravelling the function of AF4 in the cerebellum." Cerebellum. 4.4 (2005): 250-60.

Bolhassani, A. and S. Rafati. "Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development." Expert.Rev.Vaccines. 7.8 (2008): 1185-99.

Borset, M., et al. "The role of hepatocyte growth factor and its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies." Leuk.Lymphoma 32.3-4 (1999): 249-56.

Bradbury, P. A., et al. "Matrix metalloproteinase 1, 3 and 12 polymorphisms and esophageal adenocarcinoma risk and prognosis." Carcinogenesis 30.5 (2009): 793-98.

Brown, C. E., et al. "Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells." Cancer Research 69.23 (2009): 8886-93.

Bruckdorfer, T., O. Marder, and F. Albericio. "From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future." Curr.Pharm.Biotechnol. 5.1 (2004): 29-43. Brunsvig, P. F., et al. "Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer." Cancer Immunol.Immunother. 55.12 (2006): 1553-64.

Cabanes, D., et al. "Gp96 is a receptor for a novel Listeria monocytogenes virulence factor, Vip, a surface protein." EMBO J 24.15 (2005): 2827-38.

Calzado, M. A., et al. "An inducible autoregulatory loop between HIPK2 and Siah2 at the apex of the hypoxic response." Nat.Cell Biol.11.1 (2009): 85-91.

Castelli, C., et al. "Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer." Cancer Immunol.Immunother. 53.3 (2004): 227-33.

Castriconi, R., et al. "Both CD133+ and C." Eur.J Immunol.37.11 (2007): 3190-96.

Chanock, S. J., et al. "HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and -DRB1 Alleles in a Caucasian Population from Bethesda, USA." Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-23.

Chen, C. H., et al. "Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100.16 (2003): 9226-31.

Chen, Z. and J. J. O'Shea. "Regulation of IL-17 production in human lymphocytes." Cytokine 41.2 (2008): 71-78.

Cho, S. O., et al. "Helicobacter pylori in a Korean Isolate Expressed Proteins Differentially in Human Gastric Epithelial Cells." Dig.Dis.Sci. (2009).

Christianson, J. C., et al. "OS-9 and GRP94 deliver mutant alpha1-antitrypsin to the Hrd1-SEL1L ubiquitin ligase complex for ERAD." Nat.Cell Biol.10.3 (2008): 272-82.

Cisek, L. J. and J. L. Corden. "Phosphorylation of RNA polymerase by the murine homologue of the cell-cycle control protein cdc2." Nature 339.6227 (1989): 679-84.

Colombetti, S., et al. "Prolonged TCR/CD28 engagement drives IL-2-independent T cell clonal expansion through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin." J Immunol.176.5 (2006): 2730-38.

Confalonieri, S., et al. "Alterations of ubiquitin ligases in human cancer and their association with the natural history of the tumor." Oncogene 28.33 (2009): 2959-68.

Corso, S., et al. "Silencing the MET oncogene leads to regression of experimental tumors and metastases." Oncogene 27.5 (2008): 684-93.

Cox, C. V., et al. "Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood ALL." Blood 113.14 (2009): 3287-96.

Cunha-Ferreira, I., et al. "The SCF/Slimb ubiquitin ligase limits centrosome amplification through degradation of SAK/PLK4." Curr.Biol.19.1 (2009): 43-49.

DeLuca, J. G., et al. "Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites." Mol.Biol.Cell 16.2 (2005): 519-31.

Deng, H., et al. "Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells." Biochem.Biophys.Res Commun. 326.2 (2005): 274-81.

Dengjel, J., et al. "Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas." Clin Cancer Res.12.14 (2006): 4163-70.

Deremer, D. L., C. Ustun, and K. Natarajan. "Nilotinib: a second-generation tyrosine kinase inhibitor for the treatment of chronic myelogenous leukemia." Clin Ther.30.11 (2008): 1956-75.

Di Renzo, M. F., et al. "Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer." Clin.Cancer Res.1.2 (1995): 147-54.

Dong, G., et al. "Hepatocyte growth factor/scatter factor-induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma." Cancer Res.61.15 (2001): 5911-18.

Dudley, M. E., et al. "Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes." Science 298.5594 (2002): 850-54.

Dudley, M. E., et al. "Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma." J.Clin.Oncol. 23.10 (2005): 2346-57.

Duong, C., et al. "Pretreatment gene expression profiles can be used to predict response to neoadjuvant chemoradiotherapy in esophageal cancer." Ann Surg Oncol 14.12 (2007): 3602-09. Egland, K. A., et al. "High expression of a cytokeratin-associated protein in many cancers." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 103.15 (2006): 5929-34.

Eramo, A., et al. "Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population." Cell Death Differ 15.3 (2008): 504-14.

Esashi, F., et al. "CDK-dependent phosphorylation of BRCA2 as a regulatory mechanism for recombinational repair." Nature 434.7033 (2005): 598-604.

Escobar, M. A., et al. "Profiling of nuclear extract proteins from human neuroblastoma cell lines: the search for fingerprints." J Pediatr.Surg 40.2 (2005): 349-58.

Ferracini, R., et al. "The Met/HGF receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit." Oncogene 10.4 (1995): 739-49.

Fischer, J., et al. "Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours." Oncogene 17.6 (1998): 733-39.

Flanagan, J. M., et al. "Genomics screen in transformed stem cells reveals RNASEH2A, PPAP2C, and ADARB1 as putative anticancer drug targets." Mol.Cancer Ther.8.1 (2009): 249-60.

Fong, L., et al. "Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98.15 (2001): 8809-14.

Frasor, J., et al. "Estrogen down-regulation of the corepressor N-CoR: mechanism and implications for estrogen derepression of N-CoR-regulated genes." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 102.37 (2005): 13153-57.

Frew, I. J., et al. "Generation and analysis of Siah2 mutant mice." Mol.Cell Biol.23.24 (2003): 9150-61.

Fu, Y. and A. S. Lee. "Glucose regulated proteins in cancer progression, drug resistance and immunotherapy." Cancer Biol.Ther.5.7 (2006): 741-44.

Furge, K. A., et al. "Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98.19 (2001): 10722-27.

Furge, K. A., Y. W. Zhang, and G. F. Vande Woude. "Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins." Oncogene 19.49 (2000): 5582-89.

Gattinoni, L., et al. "Adoptive immunotherapy for cancer: building on success." Nat.Rev.Immunol.

6.5 (2006): 383-93.

Gherardi, E. and M. Stoker. "Hepatocyte growth factor--scatter factor: mitogen, motogen, and met." Cancer Cells 3.6 (1991): 227-32.

Glen, A., et al. "iTRAQ-facilitated proteomic analysis of human prostate cancer cells identifies proteins associated with progression." J Proteome.Res 7.3 (2008): 897-907.

Gnjatic, S., et al. "NY-CO-58/KIF2C is overexpressed in a variety of solid tumors and induces frequent T cell responses in patients with colorectal cancer." Int J Cancer (2009).

Guo, W. C., et al. "Expression and its clinical significance of heat shock protein gp96 in human osteosarcoma." Neoplasma 57.1 (2010): 62-67.

Habelhah, H., et al. "Stress-induced decrease in TRAF2 stability is mediated by Siah2." EMBO J 21.21 (2002): 5756-65.

Hamamoto, A., et al. "Aberrant expression of the gastric mucin MUC6 in human pulmonary adenocarcinoma xenografts." Int J Oncol 26.4 (2005): 891-96.

Harada, T., et al. "Genome-wide analysis of pancreatic cancer using microarray-based techniques." Pancreatology. 9.1-2 (2009): 13-24.

Harper, L. J., et al. "Stem cell patterns in cell lines derived from head and neck squamous cell carcinoma." J Oral Pathol.Med 36.10 (2007): 594-603.

Hayama, S., et al. "Activation of CDCA1-KNTC2, members of centromere protein complex, involved in pulmonary carcinogenesis." Cancer Research 66.21 (2006): 10339-48.

Hayashi, M., et al. "High expression of HER3 is associated with a decreased survival in gastric cancer." Clinical Cancer Research 14.23 (2008): 7843-49.

Heike, M., et al. "Expression of stress protein gp96, a tumor rejection antigen, in human colorectal cancer." Int J Cancer 86.4 (2000): 489-93.

Hodorova, I., et al. "Gp96 and its different expression in breast carcinomas." Neoplasma 55.1 (2008): 31-35.

Horton, R. A., et al. "A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein." Anal.Biochem.360.1 (2007): 138-43.

House, C. M., A. Moller, and D. D. Bowtell. "Siah proteins: novel drug targets in the Ras and hypoxia pathways." Cancer Research 69.23 (2009): 8835-38.

Howard, E. W., et al. "Decreased adhesiveness, resistance to anoikis and suppression of GRP94 are integral to the survival of circulating tumor cells in prostate cancer." Clin Exp.Metastasis 25.5 (2008): 497-508.

Hu, G. and E. R. Fearon. "Siah-1 N-terminal RING domain is required for proteolysis function, and C-terminal sequences regulate oligomerization and binding to target proteins." Mol.Cell Biol.19.1 (1999): 724-32.

Huang, Y., et al. "Characterization of GPR56 protein and its suppressed expression in human pancreatic cancer cells." Mol.Cell Biochem.308.1-2 (2008): 133-39.

Jansen, M. P., et al. "Downregulation of SIAH2, an ubiquitin E3 ligase, is associated with resistance to endocrine therapy in breast cancer." Breast Cancer Res Treat.116.2 (2009): 263-71.

Jia, H. L., et al. "Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma." Clinical Cancer Research 13.4 (2007): 1133-39.

Jucker, M., et al. "The Met/hepatocyte growth factor receptor (HGFR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma." Leuk.Res.18.1 (1994): 7-16.

Jung, G., J. A. Ledbetter, and H. J. Muller-Eberhard. "Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates." Proc Natl Acad Sci U S A 84.13 (1987): 4611-15.

Jung, H. M., S. J. Choi, and J. K. Kim. "Expression profiles of SV40-immortalization-associated genes upregulated in various human cancers." J Cell Biochem. 106.4 (2009): 703-13.

Kaneko, N., et al. "siRNA-mediated knockdown against CDCA1 and KNTC2, both frequently overexpressed in colorectal and gastric cancers, suppresses cell proliferation and induces apoptosis." Biochem.Biophys.Res Commun. 390.4 (2009): 1235-40.

Kang, H. M., et al. "Effects of Helicobacter pylori Infection on gastric mucin expression." J Clin Gastroenterol. 42.1 (2008): 29-35.

Ko, M. A., et al. "Plk4 haploinsufficiency causes mitotic infidelity and carcinogenesis." Nat.Genet.

37.8 (2005): 883-88.

Kobayashi, M., et al. "Activation of ErbB3-PI3-kinase pathway is correlated with malignant phenotypes of adenocarcinomas." Oncogene 22.9 (2003): 1294-301.

Koochekpour, S., et al. "Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas." Cancer Res.57.23 (1997): 5391-98.

Korzeniewski, N., et al. "Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels." Cancer Research 69.16 (2009): 6668-75.

Krieg, A. M. "Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation." Nat.Rev.Drug Discov.5.6 (2006): 471-84.

Kunimoto, K., et al. "Involvement of IQGAP3, a regulator of Ras/ERK-related cascade, in hepatocyte proliferation in mouse liver regeneration and development." J Cell Physiol 220.3 (2009): 621-31.

Kuriyama, R., et al. "Gamma-tubulin-containing abnormal centrioles are induced by insufficient Plk4 in human HCT116 colorectal cancer cells." J Cell Sci.122.Pt 12 (2009): 2014-23.

Lee, H. S., et al. "MUC1, MUC2, MUC5AC, and MUC6 expressions in gastric carcinomas: their roles as prognostic indicators." Cancer 92.6 (2001): 1427-34.

Leivo, I., et al. "Characterization of gene expression in major types of salivary gland carcinomas with epithelial differentiation." Cancer Genet.Cytogenet.156.2 (2005): 104-13.

Lemmel, C., et al. "Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling." Nat.Biotechnol.22.4 (2004): 450-54.

Li, G., et al. "Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development." Oncogene 20.56 (2001): 8125-35.

Lim, S. O., et al. "Expression of heat shock proteins (HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, GRP78, GRP94) in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules." World J Gastroenterol. 11.14 (2005): 2072-79.

Lin, W., et al. "Tyrosine kinases and gastric cancer." Oncogene 19.49 (2000): 5680-89.

Liu, B. and Z. LI. "Endoplasmic reticulum HSP90b1 (gp96, grp94) optimizes B-cell function via chaperoning integrin and TLR but not immunoglobulin." Blood 112.4 (2008): 1223-30.

Liu, S. Y., et al. "Requirement of MMP-3 in anchorage-independent growth of oral squamous cell carcinomas." J Oral Pathol.Med 36.7 (2007): 430-35.

Lochter, A., et al. "The significance of matrix metalloproteinases during early stages of tumor progression." Ann N.Y.Acad.Sci.857 (1998): 180-93.

Lund, C. V., et al. "Zinc finger transcription factors designed for bispecific coregulation of ErbB2 and ErbB3 receptors: insights into ErbB receptor biology." Mol.Cell Biol.25.20 (2005): 9082-91. Ma, S., et al. "Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells." Gastroenterology 132.7 (2007): 2542-56.

MacLeod, R. J., M. Hayes, and I. Pacheco. "Wnt5a secretion stimulated by the extracellular calcium-sensing receptor inhibits defective Wnt signaling in colon cancer cells." Am J Physiol Gastrointest.Liver Physiol 293.1 (2007): G403-G411.

Macmillan, J. C., et al. "Comparative expression of the mitotic regulators SAK and PLK in colorectal cancer." Ann Surg Oncol 8.9 (2001): 729-40.

Maney, T., et al. "The kinetochore of higher eucaryotes: a molecular view." Int Rev.Cytol.194 (2000): 67-131.

Martin, C. M., et al. "Gene expression profiling in cervical cancer: identification of novel markers for disease diagnosis and therapy." Methods Mol.Biol.511 (2009): 333-59.

Matsukita, S., et al. "Expression of mucins (MUC1, MUC2, MUC5AC and MUC6) in mucinous carcinoma of the breast: comparison with invasive ductal carcinoma." Histopathology 42.1 (2003): 26-36.

Maulik, G., et al. "Role of the hepatocyte growth factor receptor, c-Met, in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition." Cytokine Growth Factor Rev.13.1 (2002): 41-59.

Mizrak, D., M. Brittan, and M. Alison. "CD133: molecule of the moment." J Pathol.214.1 (2008): 3-9.

Montesano, R., et al. "Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis." Cell Growth Differ.9.5 (1998): 355-65.

Monzani, E., et al. "Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential." Eur.J Cancer 43.5 (2007): 935-46.

Moore, A. and L. Wordeman. "The mechanism, function and regulation of depolymerizing kinesins during mitosis." Trends Cell Biol.14.10 (2004): 537-46.

Morgan, R. A., et al. "Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes." Science (2006).

Mori, M., et al. "HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry." Transplantation 64.7 (1997): 1017-27.

Murray, G. I., et al. "Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gastric cancer." Gut 43.6 (1998): 791-97.

Murshid, A., J. Gong, and S. K. Calderwood. "Heat-shock proteins in cancer vaccines: agents of antigen cross-presentation." Expert.Rev.Vaccines.7.7 (2008): 1019-30.

Nakaigawa, N., et al. "Inactivation of von Hippel-Lindau gene induces constitutive phosphorylation of MET protein in clear cell renal carcinoma." Cancer Res.66.7 (2006): 3699-705.

Nakamura, Y., et al. "Clinicopathological and biological significance of mitotic centromereassociated kinesin overexpression in human gastric cancer." Br.J Cancer 97.4 (2007): 543-49. Nakayama, K., J. Qi, and Z. Ronai. "The ubiquitin ligase Siah2 and the hypoxia response." Mol.Cancer Res 7.4 (2009): 443-51.

Naldini, L., et al. "Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET." Oncogene 6.4 (1991): 501-04.

Nguyen, Q. N., et al. "Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells." Biochim.Biophys.Acta 1758.3 (2006): 394-403.

Nishio, K., et al. "Crystal structure of the de-ubiquitinating enzyme UCH37 (human UCH-L5) catalytic domain." Biochem.Biophys.Res Commun.390.3 (2009): 855-60.

Nojima, H., et al. "IQGAP3 regulates cell proliferation through the Ras/ERK signalling cascade." Nat.Cell Biol.10.8 (2008): 971-78.

Nomura, H., et al. "Enhanced production of matrix metalloproteinases and activation of matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A) in human gastric carcinomas." Int J Cancer 69.1 (1996): 9-16. Nomura, H., et al. "Network-based analysis of calcium-binding protein genes identifies Grp94 as a target in human oral carcinogenesis." Br.J Cancer 97.6 (2007): 792-801.

Ohnuma, S., et al. "Cancer-associated splicing variants of the CDCA1 and MSMB genes expressed in cancer cell lines and surgically resected gastric cancer tissues." Surgery 145.1 (2009): 57-68.

Park, Y. H., et al. "Capecitabine in combination with Oxaliplatin (XELOX) as a first-line therapy for advanced gastric cancer." Cancer Chemother.Pharmacol. (2007).

Pascolo, S., et al. "The non-classical HLA class I molecule HFE does not influence the NK-like activity contained in fresh human PBMCs and does not interact with NK cells." Int.Immunol. 17.2 (2005): 117-22.

Peel, N., et al. "Overexpressing centriole-replication proteins in vivo induces centriole overduplication and de novo formation." Curr.Biol.17.10 (2007): 834-43.

Pereira, M. B., et al. "Immunohistochemical study of the expression of MUC5AC and MUC6 in breast carcinomas and adjacent breast tissues." J Clin Pathol.54.3 (2001): 210-13.

Pietra, G., et al. "Natural killer cells kill human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells." Int Immunol. 21.7 (2009): 793-801.

Poller, D. N., et al. "Production and characterization of a polyclonal antibody to the c-erbB-3 protein: examination of c-erbB-3 protein expression in adenocarcinomas." J Pathol.168.3 (1992): 275-80.

Pons, E., C. C. Uphoff, and H. G. Drexler. "Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines." Leuk.Res.22.9 (1998): 797-804.

Ponzetto, C., et al. "A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor." Mol.Cell Biol.13.8 (1993): 4600-08.

Poppe, M., et al. "Phosphorylation of Helicobacter pylori CagA by c-Abl leads to cell motility." Oncogene 26.24 (2007): 3462-72.

Pytel, D., et al. "Tyrosine kinase blockers: new hope for successful cancer therapy." Anticancer Agents Med Chem.9.1 (2009): 66-76.

Qi, J., et al. "The ubiquitin ligase Siah2 regulates tumorigenesis and metastasis by HIF-dependent and -independent pathways." Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 105.43 (2008): 16713-18.

Qian, C. N., et al. "Met protein expression level correlates with survival in patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma." Cancer Res. 62.2 (2002): 589-96.

Qian, Z., et al. "Cytogenetic and genetic pathways in therapy-related acute myeloid leukemia." Chem.Biol.Interact. (2009).

Ramirez, R., et al. "Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma." Clin Endocrinol.(Oxf) 53.5 (2000): 635-44. Rammensee, H. G., et al. "SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs." Immunogenetics 50.3-4 (1999): 213-19.

Rammensee, H. G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 1997.

Rappa, G., O. Fodstad, and A. Lorico. "The stem cell-associated antigen CD133 (Prominin-1) is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma." Stem Cells 26.12 (2008): 3008-17.

Richardson, G. D., et al. "CD133, a novel marker for human prostatic epithelial stem cells." J Cell Sci. 117.Pt 16 (2004): 3539-45.

Rini, B. I., et al. "Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigenpresenting cells (provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy." Cancer 107.1 (2006): 67-74.

Rodrigues-Martins, A., et al. "Revisiting the role of the mother centriole in centriole biogenesis." Science 316.5827 (2007): 1046-50.

Rosenberg, S. A., et al. "A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone." N.Engl.J.Med. 316.15 (1987): 889-97.

Rosenberg, S. A., et al. "Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report." N.Engl.J Med 319.25 (1988): 1676-80.

Rott, R., et al. "Monoubiquitylation of alpha-synuclein by seven in absentia homolog (SIAH) promotes its aggregation in dopaminergic cells." J Biol.Chem.283.6 (2008): 3316-28.

Rutella, S., et al. "Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors." Clinical Cancer Research 15.13 (2009): 4299-311.

Saiki, R. K., et al. "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239.4839 (1988): 487-91.

Samant, G. V. and P. W. Sylvester. "gamma-Tocotrienol inhibits ErbB3-dependent PI3K/Akt mitogenic signalling in neoplastic mammary epithelial cells." Cell Prolif.39.6 (2006): 563-74.

Sanidas, E. E., et al. "Expression of the c-erbB-3 gene product in gastric cancer." Int J Cancer 54.6 (1993): 935-40.

Scott, G. K., et al. "Coordinate suppression of ERBB2 and ERBB3 by enforced expression of micro-RNA miR-125a or miR-125b." J Biol.Chem.282.2 (2007): 1479-86.

Sergina, N. V., et al. "Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinaseinactive HER3." Nature 445.7126 (2007): 437-41.

Shah, M., et al. "Inhibition of Siah2 ubiquitin ligase by vitamin K3 (menadione) attenuates hypoxia and MAPK signaling and blocks melanoma tumorigenesis." Pigment Cell Melanoma Res 22.6 (2009): 799-808.

Shapiro, G. I. "Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment." J Clin Oncol 24.11 (2006): 1770-83.

Sherman-Baust, C. A., et al. "Remodeling of the extracellular matrix through overexpression of collagen VI contributes to cisplatin resistance in ovarian cancer cells." Cancer Cell 3.4 (2003): 377-86.

Sheu, M. L., S. H. Liu, and K. H. Lan. "Honokiol induces calpain-mediated glucose-regulated protein-94 cleavage and apoptosis in human gastric cancer cells and reduces tumor growth." PLoS.ONE. 2.10 (2007): e1096.

Shimo, A., et al. "Involvement of kinesin family member 2C/mitotic centromere-associated kinesin overexpression in mammary carcinogenesis." Cancer Sci.99.1 (2008): 62-70.

Singh, S. K., et al. "Identification of a cancer stem cell in human brain tumors." Cancer Res.63.18 (2003): 5821-28.

Singh, S. K., et al. "Identification of human brain tumour initiating cells." Nature 432.7015 (2004): 396-401.

Sithanandam, G. and L. M. Anderson. "The ERBB3 receptor in cancer and cancer gene therapy." Cancer Gene Ther.15.7 (2008): 413-48.

Sithanandam, G., et al. "Inactivation of ErbB3 by siRNA promotes apoptosis and attenuates growth and invasiveness of human lung adenocarcinoma cell line A549." Oncogene 24.11 (2005): 1847-59. Skawran, B., et al. "Gene expression profiling in hepatocellular carcinoma: upregulation of genes in amplified chromosome regions." Mod.Pathol.21.5 (2008): 505-16.

Slesak, B., et al. "Expression of epidermal growth factor receptor family proteins (EGFR, c-erbB-2 and c-erbB-3) in gastric cancer and chronic gastritis." Anticancer Res 18.4A (1998): 2727-32.

Small, E. J., et al. "Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer." J Clin Oncol. 24.19 (2006): 3089-94.

Smith, L. M., et al. "CD133/prominin-1 is a potential therapeutic target for antibody-drug conjugates in hepatocellular and gastric cancers." Br.J Cancer 99.1 (2008): 100-09.

Smith, M. J., et al. "Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification." Br.J Cancer 100.9 (2009): 1452-64.

Smogorzewska, A., et al. "Identification of the FANCI protein, a monoubiquitinated FANCD2 paralog required for DNA repair." Cell 129.2 (2007): 289-301.

Staehler, M., Stenzl, A., Dietrich, P. Y., Eisen, T., Haferkamp, A., Beck, J., Mayer, A., Walter, S., Singh-Jasuja, H., and Stief, C. A phase I study to evaluate safety, immunogenicity and anti-tumor activity of the multi-peptide vaccine IMA901 in renal cell carcinoma patients (RCC). Journal of Clinical Oncology, 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I Vol 25, No.18S (June 20 Supplement), 2007: 5098.6-20-2007.

Ref Type: Abstract

Stemmann, O., et al. "Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase." Cell 107.6 (2001): 715-26.

Suetsugu, A., et al. "Characterization of CD133+ hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells." Biochem.Biophys.Res.Commun. 351.4 (2006): 820-24.

Suva, M. L., et al. "Identification of Cancer Stem Cells in Ewing's Sarcoma." Cancer Research (2009).

Swallow, C. J., et al. "Sak/Plk4 and mitotic fidelity." Oncogene 24.2 (2005): 306-12.

Szczepanowski, M., et al. "Regulation of repp86 stability by human Siah2." Biochem.Biophys.Res Commun. 362.2 (2007): 485-90.

Tajima, Y., et al. "Gastric and intestinal phenotypic marker expression in early differentiated-type tumors of the stomach: clinicopathologic significance and genetic background." Clinical Cancer Research 12.21 (2006): 6469-79.

Takaishi, S., et al. "Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44." Stem Cells 27.5 (2009): 1006-20.

Takayama, H., et al. "Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94.2 (1997): 701-06.

Teofili, L., et al. "Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth factor, in Hodgkin disease." Blood 97.4 (2001): 1063-69.

Thorsen, K., et al. "Alternative splicing in colon, bladder, and prostate cancer identified by exon array analysis." Mol.Cell Proteomics.7.7 (2008): 1214-24.

Tirino, V., et al. "The role of CD133 in the identification and characterisation of tumour-initiating cells in non-small-cell lung cancer." Eur.J Cardiothorac.Surg 36.3 (2009): 446-53.

Todaro, M., et al. "Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4." Cell Stem Cell 1.4 (2007): 389-402.

Topol, L., et al. "Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3-independent beta-catenin degradation." J Cell Biol.162.5 (2003): 899-908.

Toribara, N. W., et al. "Human gastric mucin. Identification of a unique species by expression cloning." J Biol.Chem. 268.8 (1993): 5879-85.

Tsan, M. F. and B. Gao. "Heat shock protein and innate immunity." Cell Mol.Immunol.1.4 (2004): 274-79.

Tuck, A. B., et al. "Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma." Am.J.Pathol. 148.1 (1996): 225-32.

Vairaktaris, E., et al. "Association of -1171 promoter polymorphism of matrix metalloproteinase-3 with increased risk for oral cancer." Anticancer Res 27.6B (2007): 4095-100.

Vandenbroeck, K., E. Martens, and I. Alloza. "Multi-chaperone complexes regulate the folding of interferon-gamma in the endoplasmic reticulum." Cytokine 33.5 (2006): 264-73.

Walter, S., et al. "Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres." J.Immunol. 171.10 (2003): 4974-78.

Wang, Q., et al. "Overexpression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 and GRP78 in human lung cancer tissues and its significance." Cancer Detect.Prev.29.6 (2005): 544-51. Wang, R., et al. "Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice." J.Cell Biol.153.5 (2001): 1023-34.

Wang, R. Q. and D. C. Fang. "Effects of Helicobacter pylori infection on mucin expression in gastric carcinoma and pericancerous tissues." J Gastroenterol.Hepatol.21.2 (2006): 425-31.

Wang, S., et al. "IQGAP3, a novel effector of Rac1 and Cdc42, regulates neurite outgrowth." J Cell Sci. 120.Pt 4 (2007): 567-77.

Wang, X., et al. "Immunolocalisation of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in colonic adenocarcinoma." Acta Histochem.110.2 (2008): 117-23.

Wang, X. P., et al. "Expression and significance of heat shock protein 70 and glucose-regulated protein 94 in human esophageal carcinoma." World J Gastroenterol.11.3 (2005): 429-32.

Wang, X. P., et al. "Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 70 and glucose-regulated protein 94 in human colonic adenocarcinoma." World J Gastroenterol.11.7 (2005): 1056-59.

Wang, X. P., Q. X. Wang, and X. P. Ying. "Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in human gastric adenocarcinoma." Tohoku J Exp.Med 212.1 (2007): 35-41.

Weinschenk, T., et al. "Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines." Cancer Res.62.20 (2002): 5818-27.

White, C. D., M. D. Brown, and D. B. Sacks. "IQGAPs in cancer: a family of scaffold proteins underlying tumorigenesis." FEBS Lett. 583.12 (2009): 1817-24.

Wicks, S. J., et al. "Reversible ubiquitination regulates the Smad/TGF-beta signalling pathway." Biochem.Soc Trans. 34.Pt 5 (2006): 761-63.

Wicks, S. J., et al. "The deubiquitinating enzyme UCH37 interacts with Smads and regulates TGF-beta signalling." Oncogene 24.54 (2005): 8080-84.

Yajima, S., et al. "Expression profiling of fecal colonocytes for RNA-based screening of colorectal cancer." Int J Oncol 31.5 (2007): 1029-37.

Yang, L., et al. "IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human T(H)17 cells." Nature (2008).

Yang, S., et al. "Molecular basis of the differences between normal and tumor tissues of gastric cancer." Biochim.Biophys.Acta 1772.9 (2007): 1033-40.

Yao, D. F., et al. "Abnormal expression of HSP gp96 associated with HBV replication in human hepatocellular carcinoma." Hepatobiliary.Pancreat.Dis.Int 5.3 (2006): 381-86.

Yasui, W., et al. "Increased expression of p34cdc2 and its kinase activity in human gastric and colonic carcinomas." Int J Cancer 53.1 (1993): 36-41.

Yee, C., et al. "Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99.25 (2002): 16168-73.

Yin, S., et al. "CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity." Int.J Cancer 120.7 (2007): 1444-50.

Yokozaki, H., W. Yasui, and E. Tahara. "Genetic and epigenetic changes in stomach cancer." Int Rev.Cytol. 204 (2001): 49-95.

Yuan, W., et al. "Expression of EphA2 and E-cadherin in gastric cancer: correlated with tumor progression and lymphogenous metastasis." Pathol.Oncol Res 15.3 (2009): 473-78.

Yuan, W. J., et al. "Over-expression of EphA2 and EphrinA-1 in human gastric adenocarcinoma and its prognostic value for postoperative patients." Dig.Dis.Sci.54.11 (2009): 2410-17.

Zaremba, S., et al. "Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen." Cancer Res.57.20 (1997): 4570-77.

Zhang, X., R. M. Kedl, and J. Xiang. "CD40 ligation converts TGF-beta-secreting tolerogenic CD4-8- dendritic cells into IL-12-secreting immunogenic ones." Biochem.Biophys.Res Commun. 379.4 (2009): 954-58.

Zhang, X. L., et al. "Comparative study on overexpression of HER2/neu and HER3 in gastric cancer." World J Surg 33.10 (2009): 2112-18.

Zhao, C., et al. "Hedgehog signalling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia." Nature (2009).

Zheng, H., et al. "Cell surface targeting of heat shock protein gp96 induces dendritic cell maturation and antitumor immunity." J Immunol. 167.12 (2001): 6731-35.

Zheng, H., et al. "MUC6 down-regulation correlates with gastric carcinoma progression and a poor prognosis: an immunohistochemical study with tissue microarrays." J Cancer Res Clin Oncol 132.12 (2006): 817-23.

Zheng, H. C., et al. "Overexpression of GRP78 and GRP94 are markers for aggressive behavior and poor prognosis in gastric carcinomas." Hum.Pathol.39.7 (2008): 1042-49.

Zhou, G., et al. "2D differential in-gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers." Mol.Cell Proteomics.1.2 (2002): 117-24.

Zhou, L., et al. "TGF-beta-induced Foxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function." Nature 453.7192 (2008): 236-40.

Zhu, K. J., et al. "Imiquimod inhibits the differentiation but enhances the maturation of human monocyte-derived dendritic cells." Int Immunopharmacol. 9.4 (2009): 412-17.

Claims

Patentni zahtevi

1. Peptid koji ima celokupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe

a) sekvenca koja sadrži ID BR. SEKV 2 i

b) varijanta ID BR. SEKV 2 koja indukuje unakrsnu reakciju T ćelija sa navedenim peptidom, naznačeno time što je navedena varijanta izabrana iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF za upotrebu u medicini.

2. Peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, koji ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

3. Peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što peptid sadrži nepeptidne veze.

4. Fuzioni protein koji obuhvata peptidnu sekvencu kao deo izabran iz grupe

a) sekvence koja se sastoji od ID BR. SEKV 2 i

b) varijante ID BR. SEKV 2 izabrane iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF, koje konkretno sadrže N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

5. Nukleinska kiselina, koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 4, pod uslovom da peptid nije kompletan humani protein, naznačeno time što je navedena nukleinska kiselina poželjno DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukelinsku kiselinu.

6. Nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5 za upotrebu u medicini.

7. Ćelija domaćin, koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, koja je antigen-prezentujuća ćelija.

8. Metod za proizvodnju peptida za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu metod obuhvata kultiviranje ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 7, kao i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili medijuma za njeno kultiviranje.

9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), metod koji se sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.

10. Metod u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time što navedena antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.

11. Aktivirani citotoksični T limfocit (CTL), proizveden metodom u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili 10, koji selektivno prepoznaje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.

12. Citotoksični T limfocit (CTL) u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u lečenju malignog tumora, koji ubija ciljne ćelije kod pacijenta, naznačeno time što navedene ciljne ćelije aberantno prezentuju peptid u skladu sa ID BR. SEKV 2.

13. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 12 za primenu u lečenju raka, kao što su, na primer, karcinom želuca, gastrointestinalni, kolorektalni, karcinom pankreasa, pluća ili bubrega.

14. Peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije, ćelija ili aktivirani citotoksični T limfocit za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je navedeni lek vakcina.

15. Neterapijska upotreba peptida koji ima celokupnu dužinu od između 10 i 14 aminokiselina, koje obuhvataju sekvencu izabranu iz grupe

a) sekvence koja sadrži ID BR. SEKV 2 i

b) varijante ID BR. SEKV 2 izabrane iz grupe sekvenci SFNPLWLRI, SFNPLWLRL, SFNPLWLRF, SFNPLWLRL i SFNPLWLRF za stvaranje i razvoj antitela koja su specifična protiv kompleksa MHC/peptid koji sadrži navedeni peptid.