RS56646B1 - Radioterapijske čestice i suspenzije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jednu, više čestica ili suspenziju istih ili različitih čestica koje obuhvataju razgradivo jedinjenje i alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku. Čestice su korisne za upotrebu u lečenju kancera.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Beta-emitujući radiokoloidi i mikročestice koristile su se nekoliko godina sa malo uspeha protiv peritonealnog ascitesa i semena mikroskopskih tumora. Međutim, kasniji efekti i morbidnost zbog intestinalne toksičnosti učinili su ove tretmane zastarelim i hemoterapija postala je standardna korisna terapija kod npr. kancera jajnika. Još uvek postoji značajna medicinska potreba za novim modalitetom protiv intrakavitarnog kancera.

[0003] Alfa emiteri ranije su predloženi kao tretman za intraperitonealni kancer. Predložena su dva tipa hemijskih klasa, (1) radioimunokonjugati i (2) suspenzije čestica mikro- ili nano-veličine. Prednost sa radioimunokonjugatima je potencijal za specifično ciljanje ćelija, a nedostatak je značajno curenje proizvoda u krvotok što izaziva potencijalnu sistemsku toksičnost.

[0004] Prednost sa mikro/nano česticama i koloidima je potencijal za poboljšano lokalno zadržavanje koje smanjuje udaljenu toksičnost. S druge strane je potencijal za nehomogeno taloženje doze i zračenje žarišta i takođe da li sama čestica može da izazove iritaciju zbog inertnosti na degradaciju itd.

Ako će se koristiti mikročestice i/ili nanočestice, izbor je ako treba da budu potpuno stabilne ili polako razgradive.

[0005] Upotrebom potpuno stabilnih čestica prednosti uključuju mali rizik sistemske toksičnosti.

Nedostaci uključuju potencijalno više heterogenu raspodelu doza zračenja i malo rizika od lokalne toksičnosti od "žarišta". Stabilne radioterapijske čestice koriste se za radioembolizaciju upotrebom visoko energetskog beta emitera<90>Y stabilno obeleženog na ne-razgradive staklene sfere (TheraSphere™) ili sfere na bazi smole (SIR-Spheres™) za lečenje primarnih tumora i metastaza jetre. U ovom slučaju tkivo jetre će štititi protiv toksičnog zračenja creva itd.

Drugi pristup bio bi da se koriste razgradive čestice koje sporo oslobađaju neke od radionuklida: Moguće prednosti uključuju više homogenu raspodelu doza zračenja zbog poboljšane difuzije nuklida majki i ili nuklida ćerki kratkog životnog veka i manju tendenciju za "žarištima" koji izazivaju lokalnu toksičnost. Mogući nedostaci uključuju potencijal za sistemskom toksičnošću zbog mogućeg prenosa oslobođenog radionuklida u krv i dalje ponovne distribucije. Razgradive čestice uglavnom se koriste za druga citotoksična jedinjenja poput hemoterapeutika, a ne za radionuklide, trenutno.

WO99/51278 opisuje agense za radioterapiju koji obuhvataju čvrste ili porozne čestice neorganskog materijala sa prosečnim prečnikom čestica od oko 0,05 do 5000 mikrometara i koje sadrže pogodan radionuklid. Neorganski materijal uključuje monomerne i polimerne oblike, i mešavine monomernih i polimernih oblika jednog ili više od sledećih: alumina, karbonata, silicijum dioksida, i fosfata i njihovih organskih i neorganskih katjonskih soli. Opisana je priprema čestica kalcijum karbonata obloženih sa<169>Yb, i da<212>Bi može da se primenjuje.

Prema tome, postoji potreba za poboljšanim sistemom dostave za zračenje alfa čestica protiv intrakavitarnih kancera.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Cilj ovog pronalaska odnosi se na česticu koja obuhvata razgradivo jedinjenje i alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, kod koje radionuklid predstavlja<224>Ra, a razgradivo jedinjenje odabrano je iz grupe koju čine CaCO3, PEG-modifikovan CaCO3, proteinmodifikovan CaCO3, karbohidrat-modifikovan CaCO3, lipid-modifikovan CaCO3, vitamin-modifikovan CaCO3, organsko jedinjenje-modifikovan CaCO3, polimer-modifikovan CaCO3i/ili neorganski kristalmodifikovan CaCO3i veličina čestice je od 1 nm do 500 µm.

U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, čestica obuhvata jedno ili više jedinjenja odabranih iz grupe koju čine monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, radioimunokonjugat, imunokonjugat, helat-antitelo konjugat, vitamini uključujući folat i derivate folata, peptidi, minitela, i Affibody-ji.

[0007] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jednu ili više čestica prema ovom pronalasku i razblaživač, nosač, surfaktant, i/ili ekscipijens.

[0008] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pripremljena sa količinom radionuklida koja je 1kBq do 10GBq po doziranju.

[0009] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pripremljena sa količinom radionuklida koja je 50 MBq do 100 GBq pogodnom za proizvodnju multidoza u industrijskoj razmeri (molimo da unesete količine koje smatrate da su realne ovde).

[0010] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutska kompozicija je suspenzija čestica koja obuhvata monodispergovane ili polidispergovane čestice obeležene sa alfa emitujućim radionuklidom i/ili radionuklidom koji generiše alfa emitujuću ćerku. U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pogodna za intravenoznu ili intrakavitarnu injekciju.

[0011] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu kao lek.

[0012] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u intrakavitarnoj terapiji, radioembolizaciji ili radiosinovektomiji.

[0013] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u lečenju kancera.

[0014] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je kancer odabran iz grupe koju čine intraperitonealni kanceri, intrakranijalni kanceri, pleuralni kanceri, kanceri bešike, srčani kanceri, i kanceri u subarahnoidnoj šupljini.

[0015] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na postupak lečenja ili poboljšanja koji obuhvata davanje čestica ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska pojedincu kom je to potrebno.

[0016] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na postupak za pripremu čestice ovog pronalaska, gde taj postupak obuhvata dovođenje u međusobni kontakt alfa emitujućeg radionuklida i biorazgradivog jedinjenja sa ili bez upotrebe nosača za radionuklid.

[0017] Neki drugi aspekt ovog otkrića odnosi se na kit koji obuhvata nano ili mikro česticu prema ovom pronalasku, alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i opciono instrukcije za upotrebu kita.

[0018] Neki drugi aspekt ovog otkrića odnosi se na kit koji obuhvata nano ili mikro čestice prema ovom pronalasku, alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i opciono instrukcije za upotrebu kita za pripremu bifunkcionalnog farmaceutskog rastvora koji obuhvata suspenziju čestica i rastvor radioimunokonjugata.

[0019] U jednom primeru izvođenja ovog otkrića, kit obuhvata helator-konjugovan molekul, uključujući monoklonalno antitelo.

KRATAK OPIS SLIKA

[0020]

Fig.1 Tkivna distribucija 20 sati, 4 dana i 7 dana nakon intraperitonealne injekcije<224>Ra-obeleženih CaCO3mikročestica (A) i rastvorenog<224>RaCl2(B) kod golih miševa. Merenja radioaktivnosti izvode se najmanje 3 dana nakon žrtvovanja životinja, odnosno omogućavajući vreme da nuklidi ćerke budu u ravnoteži sa<224>Ra.

Fig.2 Masa intraperitonealnih SKOV-3 tumora lečenih slanim, hladnim česticama ili<224>Ra-obeleženim mikročesticama kalcijum karbonata na dan 44 i 45 nakon početka lečenja.

Fig.3 Preživljavanje životinja sa intraperitonealnim ES-2 ascites kancerom lečenim slanim rastvorom ili<224>Ra-obeleženim mikročesticama kalcijum karbonata.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Ovi pronalazači su identifikovali lečenje kancera sa manje rizika za intestinalnu toksičnost na osnovu alfa emitera kratkog dometa.

[0022] Ovaj pronalazak bazira se na polako razgradivim nano- ili mikročesticama koje obuhvataju alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, npr.<224>Ra.

[0023] Tako, jedan cilj ovog pronalaska odnosi se na česticu koja obuhvata razgradivo jedinjenje i alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, gde radionuklid predstavlja<224>Ra, pri čemu je razgradivo jedinjenje odabrano iz grupe koju čine CaCO3, PEG-modifikovan CaCO3protein-modifikovan CaCO3, karbohidrat-modifikovan CaCO3, lipid-modifikovan CaCO3, vitaminmodifikovan CaCO3, organsko jedinjenje-modifikovan CaCO3, polimer-modifikovan CaCO3i/ili neorganski kristal-modifikovan CaCO3, i čestica je od 1 nm do 500 µm.

Radionuklidi

[0024] Radionuklidi ovog pronalaska mogu da budu alfa emitujući radionuklid<224>Ra i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku.

[0025] Glavne prednosti jedinjenja koja emituju alfa čestice u lokalnoj terapiji u npr., intraperitonealnoj šupljini je kraći opseg, obično manji od 0,1 mm za alfa čestice u poređenju sa opsezima od mm do cm za beta-čestice iz medicinskih beta emitera poput<90>Y,<131>I i<32>P.

[0026] Upoteba alfa-emitera trebalo bi u intrakavitarnim okolnostima da smanji rizik za toksičnost zbog ozračavanja dubljih regija unutrašnjih organa poput radiosenzitivnih ćelija intestinalnih kripti u slučaju i.p. upotrebe. Takođe, prednost je visok linearni prenos energije emitovanih alfa čestica budući da je veoma malo alfa pogodaka potrebno da se ubije ćelija i mehanizam ćelijske otpornosti poput toga da je manji problem visok kapacitet popravke za kidanja DNK lanca zbog velike verovatnoće proizvodnje nepopravljivih kidanja dvostrukog lanca (Ritter et al., 1977).

[0027] Visok efekat po raspadu znači da je manje radioaktivnosti potrebno što smanjuje potrebu za zaštitom bolničkog osoblja i rođaka budući da većina alfa- i beta-emitera takođe emituje malo X-zraka i gama zraka od kojih se treba zaštititi.

[0028] Tabela 1 prikazuje glavna svojstva zračenja<224>Ra. Potpuni raspad<224>Ra i ćerki proizvodi ukupno 4 alfa-čestice. Važan aspekt je sudbina<220>Rn jer ovaj nuklid potencijalno bi mogao da se raširi dalje od nuklida majke jer je potencijalno hemijski inertan na vezivanje u kristale.

Tabela 1. Glavna svojstva zračenja iz<224>Ra serija.

[0029] Radijum-224 je jedan alfa-emiter, ali i drugi mogu takođe da se primene na ovo otkriće.

Tako, u jednom primeru izvođenja ovog otkrića je radionuklid odabran iz grupe koju čine<224>Ra,<212>Bi,<212>Pb<223>Ra,<225>Ra,<225>Ac,<213>Bi,<211>At,<227>Th.

[0030] Veoma povoljno otkriće u primerima bilo je da je količina radioaktivnosti potrebna za proizvodnju značajnih terapeutskih efekata bila tako niska kao što je 200 kBq po kg telesne mase što je ekvivalentno sa samo 4-5 kBq po mišu. Ovo se poredi poželjno sa nekoliko stotina kBq po mišu od<211>At i<212>Pb potrebnih u alfa-radioimunoterapiji protiv eksperimentalnog peritonealnog kancera kod miševa (Gustafsson et al., 2012; Boudousq et al., 2013). Ovo svojstvo može snažno da smanji probleme izlaganja od X-zrakova i gama zrakova tokom davanja i upotrebe čestica ovog pronalaska, kao što je primer za<224>Ra-CC.

[0031] Količina<224>Ra korišćena po doziranju za pacijenta može da bude u opsegu od 1 kBq do 10 GBq, poželjnije 100 kBq do 100 MBq, još poželjnije opseg je 0,5 MBq do 25 MBq.

[0032] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pripremljena sa količinom radionuklida koja je 1 kBq do 10 GBq po doziranju.

[0033] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pripremljena sa količinom radionuklida koja je pogodna za proizvodnju multidoza u industrijskoj razmeri npr., 50 MBq do 100 GBq.

Razgradivo jedinjenje

[0034] Razgradivo jedinjenje ovog otkrića može da bude bilo koje jedinjenje koje se može razgraditi.

[0035] Razgradnja se može izvesti bilo kojim putem odabranim iz grupe koju čine visok pH, nizak pH, proteaze, enzimi, nukleaze i/ili ćelijskim procesima poput endocitoze, što takođe uključuje fagocitozu.

[0036] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je razgradivo jedinjenje odabrano iz grupe koju čine CaCO3, PEG-modifikovan CaCO3, protein-modifikovan CaCO3, karbohidrat-modifikovan CaCO3, lipidmodifikovan CaCO3, vitamin-modifikovan CaCO3, organsko jedinjenje-modifikovan CaCO3, polimermodifikovan CaCO3, i/ili neorganski kristal-modifikovan CaCO3.

[0037] U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska je razgradivo jedinjenje CaCO3(CC).

Čestice kalcijum karbonata (CC) mogu da se koriste kao mešavine sa drugim solima ili proteinima ili peptidima i da se podvrgnu površinskoj modifikaciji pomoću surfaktanata kao što su oleati i slično.

[0038] U posebnom primeru izvođenja je CC korišćen sa jedinjenjem odabranim iz grupe koju čine polietilen glikol-modifikovane čestice kalcijum karbonata ili neorganski kristal-modifikovan CC.

[0039] U posebnom primeru izvođenja CC čestice su modifikovane sa funkcionalnim receptorom i ili antigen-vezujućim grupama, uključujući monoklonalna antitela i derivate i vitamine i derivate koji omogućavaju receptorsko ili antigensko vezivanje čestice za pojedinačne ciljne ćelije i obolela tkiva.

[0040] Kada se<224>Ra rastvor u ravnoteži sa nuklidima ćerkama koristi za obeležavanje čestica, poseban primer izvođenja je da se prvo rastvoru doda helator za<212>Pb pre kontakta sa CC česticama, čime se obrazuje bifunkcionalna radioterapijska mešavina. Helator je poželjno konjugovan sa ciljnim afinitetnim molekulom, npr., monoklonalnim ili poliklonalnim antitelom ili derivatima antitela, vitaminima ili derivatima vitamina.

Karakteristike

[0041] Čestice mogu da imaju razne karakteristike.

[0042] Veličina čestica može da varira u zavisnosti od namenjenih upotreba i primena.

[0043] Tip kristala može da bude bilo koji poznati oblik CC i mogu da se koriste veličine koje variraju od 1 nm do 500 µm. Poželjnije, veličina je u opsegu od 100 nm do 50 µm, a dalje poželjn je da je veličina u opsegu od 1-10 µm.

U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je veličina čestice od 1 nm do 500 µm.

[0044] Kod miševa, na osnovu peritonealnih površina količina CC-čestica treba da bude u opsegu od 0,1 mg do 50 mg, verovatno povoljnije 1 mg do 15 mg. Kod ljudi korišćene količine treba da se pomnože sa 10 do 10000 u poređenju sa miševima, verovatno povoljnije sa 0,1 - 10 g za npr., intraperitonealnu terapiju. Za druge šupljine količine mogu da se podese prema relativnoj površinskoj oblasti ili prema zapremini prisutnog fluida.

[0045] U primerima ovog pronalaska otkriveno je da<224>Ra može da se koristi za radioobeležavanje razgradivog kalcijum karbonata. Kalcijum karbonat ima oko 14 % manju gustinu nego kalcijum hidroksiapatit i možda će biti lakše da se zadrži u suspenziji bez sedimentacije vs. čestice kalcijum hidroksiapatita iste veličine. Kalcijum karbonat je korišćen kao glavni sastojak sa ili bez dodavanja malih količina koprecipitata npr., barijum sulfat, kao nosač za<224>Ra.

[0046] Prema tome, u jednom primeru izvođenja dodaju se koprecipitati. Oni su odabrani iz grupe koju čine barijum sulfat, stroncijum sulfat, i barijum hromat. Količina je obično u opsegu od 0,01% do 10% vs. kalcijum karbonat, a poželjno 0,1-1% vs. kalcijum karbonat.

Dodatna jedinjenja u čestici

[0047] Razgradiva čestica može da obuhvata mnogo različitih dodatnih jedinjenja. Oni mogu da služe raznim svrhama koje uključuju ciljanje, stabilnost, rastvorljivost i brzinu razgradnje.

[0048] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, čestica obuhvata jedno ili više jedinjenja odabranih iz grupe koju čine monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, radioimunokonjugat, imunokonjugat, helat-antitelo konjugat, vitamini uključujući folat i derivate folata, peptidi, minitela, i Affibody-ji.

[0049] U posebnom primeru izvođenja farmaceutska suspenzija<224>Ra-obeleženih uključuje<212>Pbobeleženo antitelo, fragment antitela ili protein ili peptid ili derivat vitamina (ciljani konjugat) sa afinitetom za receptore uključujući antigene na tumornim ćelijama pri ćemu će<224>Ra-obeležene čestice dati opštu oblast zračenja alfa čestica na intraperitonealnim površinama uključujući na površinama intraperitonealnih organa, a<212>Pb obeleženo antitelo ili slično daje posebnu dozu alfa čestica na tumorne ćelije vezivanjem za receptor ili antigen.

[0050] Radionuklidi u ovom pronalasku mogu da budu konjugovani sa ciljnim molekulom upotrebom bifunkcionalnih helatora.

[0051] Oni mogu da budu ciklični, linearni ili razgranati helatori. Posebno se mogu napomenuti helatori poliaminopolikiseline which obuhvataju linearnu, cikličnu ili razgranatu poliazaalkansku kičmu sa kiselim (npr. karboksialkil) grupama vezanim za atome azota kičme.

[0052] Primeri pogodnih helatora uključuju DOTA derivate kao što su p-izotiocijanatobenzil-1,4,7,10-tetraazaciklododekan- 1,4,7, 10-tetrasirćetna kiselina (p-SCN-Bz-DOTA) i tetra primarna amidna varijanta ovog DOTA jedinjenja, nazvana TCMC, i DTPA derivati kao što je p-izotiocijanatobenzildietilentriaminpentasirćetna kiselina (p-SCN-Bz-DTPA), pri čemu su prvi ciklični helatori, a drugi linearni helatori.

[0053] Metalacija kompleksnog ostatka može se izvesti pre ili nakon konjugacije kompleksnog ostatka sa ciljnim ostatkom.

[0054] Postupak radioobeležavanja biće uopšteno pogodniji u smislu vremena korišćenog itd. ako je helator konjugovan sa antitelom pre nego što se odigralo radioobeležavanje. Principi pripreme radioobeleženih konjugata upotrebom helatora povezanih sa antitelima opisani su šire u npr. Liu, 2008.

Farmaceutska kompozicija

[0055] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jednu ili više čestica prema ovom pronalasku i razblaživač, nosač, surfaktant, i/ili ekscipijens.

[0056] Prihvatljivi farmaceutski nosači uključuju, ali bez ograničenja, ne-toksične pufere, punioce, izotonične rastvore, rastvarače i ko-rastvarače, anti-mikrobne konzervanse, antioksidanse, agense za vlaženje, antipenušavce i agense za zgušnjavanje itd. Određenije, farmaceutski nosač može da bude, ali bez ograničenja, normalan slani rastvor (0,9 %), polu-normalan slani rastvor, Ringerov laktat, rastvorena saharoza, dekstroza, npr.3,3 % dekstroze/0,3 % slanog rastvora. Fiziološki prihvatljivi nosač može da sadrži radiolitički stabilizator, npr. askorbinska kiselina, humani serum albumin, koji štiti integritet radiofarmaceutika tokom skladištenja i isporuke.

[0057] Farmaceutske kompozicije mogu da obuhvataju mnoštvo čestica. One mogu da budu iste ili različite.

[0058] Prema tome, u nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutska kompozicija je suspenzija čestica koja obuhvata monodispergovane ili polidispergovane čestice obeležene sa alfa emitujućim radionuklidom i/ili radionuklidom koji generiše alfa emitujuću ćerku.

Davanje

[0059] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija pogodna za intravenoznu ili intrakavitarnu injekciju.

Primene

[0060] Prethodno je predložena upotreba alfa emitujućih mikročestica protiv i.p. kancera. Archer et al (US 4970062 A) predlažu upotrebu koloida železo hidroksida kao nosača za alfa emitere, sa naglaskom na<212>Pb ali navodeći nekoliko drugih potencijalnih korisnih alfa-emitera uključujući<224>Ra. Bloomer et al (1981) predlaže upotrebu<211>At-obeleženog koloida telura, dok Vergote et al (1992) predlaže upotrebu<211>At-obeleženih monodispergovanih polimernih čestica. Larsen i Salberg (US 8142758 B2) predlaže upotrebu čestica hidroksiapatita obeleženih sa<223>Ra ili drugim alfa emiterima, uključujući<224>Ra. Problem sa ovima je u slučaju Archer et al., da hidroksid možda nije dobar za pripremu radijumom obeležene čestice bez hidroksida zemnoalkalnog metala, a naročito radijum ima relativno visoku rastvorljivost u vodi (Kirby et al., 1964).

[0061] Otkriveno je da će astatin-211 telur koloid biti nestabilan uzrokujući izloženost tiroidee (Vergote et al., 1992) i da<211>At-obeležene polimerne čestice nisu biorazgradive a zbog kratkog poluživota i ograničenog postojećeg kapaciteta proizvodnje za<211>At biće skup i nepraktičan u kliničkoj upotrebi velikih razmera. Takođe, zbog hemijske inertnosti i male kompleksnosti katjonskog radijuma nije razmatrana upotreba koloida telura ili polimernih čestica kao nosača za radijum. Upotreba hidroksiapatita kao nosača za radijum daje dobar prinos obeležavanja ali kalcijum hidroksiapatit ima veliku gustinu koja može da izazove bržu sedimentaciju i manje idealnu distribuciju doze zračenja kada se koristi u kavitarnoj terapiji kao suspenzija mikročestica.

[0062] Ispitivanje i istraživanje koje se odnosi na nove čestice, kao na primer<224>Ra-obeležene čestice kalcijum karbonata (CC) predstavljene ovde imali su neka neželjena otkrića: Moguće je da se dobije visok prinos obeležavanja i relevantna stabilnost proizvoda in vitro, dobro i.p. zadržavanje kompatabilno sa poluživotom<224>Ra, sporo oslobađanje<224>Ra in vivo, dobra tolerancija za čestice u miševima. Značajna antitumorna aktivnost u modelima tumora u miševima. Naročito zanimljivo i neočekivano otkriće bila je dobra apsorpcija u i.p. masti što je važno budući da je i.p. mast uključujući omentum osnova za metastatski rast tumora (Gerber et al., 2006). Predpostavljalo se da je potrebna više lipofilna struktura za i.p. apsorpciju masti, pa je tako iznenađenje da čestice kalcijum karbonata korišćene ovde pokazuju takvu značajnu apsorpciju.

[0063] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu kao leka.

[0064] Medicinske upotrebe čestica ovog pronalaska uključuju humanu ili veterinarsku upotrebu u (1) intrakavitarnoj terapiji (2) radioembolizaciji (3) radiosinovektomiji. Intrakavitarna terapija može da uključuje lečenje npr., intraperitonalnih kancera, intrakranijalnih kancera, pleuralnih kancera, kancera bešike, srčanih kancera, kancera u subarahnoidnoj šupljini. Primeri šupljina gde čestice mogu da se koriste je kranijalna šupljina, torakalna šupljina, plućna šupljina, spinalna šupljina, karlična šupljina, perikard, pleuralna šupljina, šupljina bešike ili njihova kombinacija uključujući širenje kancera na peritoneum ili moždane opne i organe unutar bilo koje od ovih šupljina.

[0065] U posebnom primeru izvođenja za upotrebu sadašnjih čestica je lečenje ili poboljšanje intrakavitarne bolesti koja je infekcija ili zapaljenje pre nego ili u kombinaciji sa kancerom.

[0066] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je infekcija odabrana iz grupe koju čine bakterijska infekcija i virusna infekcija.

[0067] Radioembolizacija može da uključuje lečenje primarnog ili metastatskog kancera u organu npr., jetri davanjem čestica ovog pronalaska u krvni sud koji vodi ka tumoru u jetri ili nekom drugom čvrstom organu infiltriranom tumornim tkivom. Radiosinovektomija za poremećaje zglobova uključujući hronična zapaljenja je lečenje ciljanim zračenjem za bolne bolesti zglobova upotrebom radioaktivnih supstanci. Njegova upotreba uključuje lečenje hemofilnog artritisa.

[0068] Danas, bazira se na jedinjenjima koja emituju beta-čestice korišćenim za zapaljenske ili reumatoidne bolesti, ili sinovijalnu artrozu raznih zglobova, naročito kolena, ruke i gležnja.<224>Ra-CC čestice opisane ovde koje su razgradive mogu da budu veoma korisne u radiosinovektomiji.

[0069] Čestice se poželjno daju lokalnom injekcijom, npr. intrakavitarnom.

[0070] U posebnom primeru izvođenja čestice se ubrizgavaju direktno u tumor.

[0071] Proizvodi mogu da budu dispergovani u različitim puferima kompatabilnim sa medicinskim injekcijama, npr., rastvorene soli i ili proteini i ili lipidi i ili šećeri.

[0072] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u intrakavitarnoj terapiji, radioembolizaciji ili radiosinovektomiji.

[0073] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na česticu ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u lečenju kancera.

[0074] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je kancer odabran iz grupe koju čine intraperitonealni kanceri, intrakranijalni kanceri, pleuralni kanceri, kanceri bešike, srčani kanceri, i kanceri u subarahnoidnoj šupljini.

[0075] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska je kancer odabran iz grupe koju čine metastatski kancer, kancer pluća, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer dojki, neoplastični meningitis, peritonealni kancer, pleuralni izliv, maligni mezoteliom, kancer dojki, sarkomi, kanceri mozga poput glioblastoma i astrocitoma, kancer bešike, i kancer jetre.

[0076] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na postupak lečenja ili poboljšanja koji obuhvata davanje čestica ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska pojedincu kom je to potrebno.

Postupci za pripreme i kitovi

[0077] Neki drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na postupak za pripremu čestice ovog pronalaska, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u međusobni kontakt alfa emitujućeg radionuklida i biorazgradivog jedinjenja sa ili bez upotrebe nosača za radionuklid.

[0078] Rastvor koji obuhvata alfa emiter, odnosno<224>Ra rastvor sa potomstvom<212>Pb u mešavini može da se prethodno tretira sa helat-antitelo konjugatom do kompleksa<212>Pb pre obeležavanja čestica da bi se proizveo dvokomponentni terapeutski sistem koji sadrži radioimunokonjugat za<212>Pb antigenspecifično lečenje i alfa emiter, npr.<224>Ra-čestice za opšte lečenje šupljine.

[0079] Poželjan način za upotrebu ovoga bio bi pomoću kita koji sadrži fiolicu A sa helat-konjugovanim antitelom i fiolicu B sa alfa emiterom, npr,<224>Ra u ravnoteži sa nuklidima ćerkama, i fiolicu C sa mikročesticama, pri čemu se sadržaj A dodaje fiolici B, ili vice versa, i inkubira od nekoliko minuta do nekoliko sati pre nego što se mešavina prenese u fiolicu C radi dalje inkubacije za nekoliko minuta do nekoliko sati pre prenošenja u špric i ubrizgavanja u pacijenta.

[0080] Ovaj princip može značajno da smanji nivo<212>Pb-radioimunokonjugata potrebnog za terapiju budući da se očekuje da<224>Ra-CC-čestice snažno doprinesu antitumornoj aktivnosti u takvom sistemu.

[0081] Neki drugi aspekt ovog otkrića odnosi se na kit koji obuhvata nano ili mikro česticu prema ovom pronalasku, alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i opciono instrukcije za upotrebu kita.

[0082] Neki drugi aspekt ovog otkrića odnosi se na kit koji obuhvata nano ili mikro čestice prema ovom pronalasku, alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i opciono instrukcije za upotrebu kita za pripremu bifunkcionalnog farmaceutskog rastvora koji obuhvata suspenziju čestica i rastvor radioimunokonjugata.

[0083] U jednom primeru izvođenja ovog otkrića, kit obuhvata helator-konjugovan molekul, uključujući monoklonalno antitelo.

[0084] Trenutni postupci i proizvod omogućavaju centralizovanu proizvodnju i isporuku krajnjem korisniku budući da radionuklid ima poluživot od nekoliko dana. Neki drugi aspekt ovog pronalaska je upotreba biorazgradive čestice koja se sporo rastvara u kalcijum i karbonat čime se proizvode male količine proizvoda koje su već u izobilju prisutne u telu. Takođe treba napomenuti sledeće karakteristike: Kada se alfa emiter, npr.<224>Ra apsorbuje na površini čestica kalcijum karbonata, postoji značajno oslobađanje<220>Rn kratkog života (t1/2= 56 s) koji će zajedno sa<216>Po ultra kratkog života (t1/2= 0,16 s) proizvesti dve alfa čestice pre raspada na beta emiter<212>Pb dužeg života (t1/2= 10,6 h). Olovo ima veoma visoku precipitabilnost sa kalcijum karbonatom tako da će<212>Pb u i.p. fluidu težiti da se ponovo udruži sa česticama smanjujući curenje<212>Pb u sistemsku cirkulaciju.

[0085] Može da bude korisno da je<220>Rn, ako se oslobodi iz mikro čestica, veoma lipofilan jer npr., intraperitonealni kancer do značajnog stepena ima tendenciju da raste u omentumu, veliki masni jastučić tkiva koji se preliva preko creva u abdomenu (Gerber et al., 2006).

[0086] Prethodno proizvedene čestice i naknadna površinska sedimentacija ili ko-sedimentacija radionuklida za dublju inkluziju radionuklida su dva postupka korisna za proizvodnju terapeutskog proizvoda. Prvi postupak omogućiće malo oslobađanje nuklida ćerke<220>Rn što može da smanji nehomogenost doze iz nehomogene distribucije čestica. Zbog kratkog poluživota (56 s.)<220>Rn, neće se značajno ponovo raspodeliti iz šupljine i neće da se raširi u dublje slojeve površina tkiva. Takođe, količine radionuklida su veoma male da bi izazvale bilo kakve značajne fizičke ili hemijske efekte, npr., pritisak gasa, iz proizvodnje radona u šupljini. Do neke mere, korisno je da se koriste veće količine čestica npr., smanjena specifična aktivnost da bi se poboljšala površinska distribucija radionuklida u<224>Ra serijama.

[0087] Bifunkcionalna suspenzija može da se izradi npr., prema sledećem<224>Ra rastvoru u puferu pH 5-6 dodato je TCMC-obeleženo antitelo do 1 mg/ml i inkubiran je od 2 minuta do nekoliko sati nakon čega je rastvor dodat fiolici sa česticama kalcijum karbonata (CC) i inkubiran tokom 2 minuta do nekoliko sati. Mešavinu treba dati što je pre moguće da bi se izbeglo smanjenje specifične aktivnosti<212>Pb-obeleženog proizvoda. Najbolje je da se ovo koristi kao kit sistem kog kog je<224>Ra u fiolici A, helator-konjugovan protein je u fiolici B i CC čestice su u fiolici C.

[0088] Takođe je moguće da se doda<212>Pb da bi se dobio ekstra snažan ciljni konjugat u mešavini sa<224>Ra-CC česticama. Obično, odnos između<224>Ra i<212>Pb u takvom sistemu može da bude blizu 1:1, ali u nekim rastvorima za lečenje može da bude korisno da se poveća količina<212>Pb-konjugata vs.<224>Ra čestice do čak 10:1 ili više. U poslednjem slučaju bilo bi potrebno da se ili doda ekstra<212>Pb pre pripreme ciljnog konjugata ili izvadi malo<224>Ra-CC čestica pre davanja terapeutske mešavine.

[0089] Ovaj pronalazak odnosi se na nova radioterapijska jedinjenja na bazi alfa-emitera poput<224>Ra sa radionuklidima ćerkama. Radijum-224 apsorbuje se na površinima čestica kalcijum karbonata ili može da bude ko-sedimentiran tokom pripreme upotrebom nosača npr., tragovi barijum sulfata.

[0090] U posebnom primeru izvođenja<224>Ra može da bude ko-kristalizovan sa kalcijumom radi formiranja karbonatnih kristala, gde je<224>Ra unutar kristali a ne na površini kako bi se izbeglo bekstvo nuklida ćerki.

[0091] Međutim, u nekim okolnostima, delimično sporo oslobađanje radionuklida može da bude korisno jer ovo može da deluje na bolju homogenost doza, npr., na površinama peritoneuma, i da smanji zračenje "žarišta" iz lokalnih agregata kristalnih čestica.

[0092] Opseg zračenja glavne dozne komponente<224>Ra serija, alfa čestice, obično je manji od 0,1 mm u tkivu omogućavajući dostavu terapeutskih relevantnih doznih nivoa zračenja površinama peritoneuma i organima prisutnim u šupljini bez uzrokovanja oštećenja dubljih regija tkiva i peritoneuma. Poznato je iz starijih studija da beta-emitujući koloidi i čestice mogu da pokažu neku antitumornu aktivnost kada se koristi adjuvans u intraperitonealnoj terapiji, ali kasniji efekti zbog zračenja creva itd. čine ove proizvode nepovoljnim u pogledu odnosa troškovi-korist.

[0093] Glavni razlog za sporedne efekte je prodor zračenja u dublje regije creva zbog opsega zračenja od nekoliko mm. Prelaskom na alfa emitere može da se izbegne problem ozračivanja površina tkiva duboko ispod. Neki drugi aspekt u korist alfa čestica je visok linearni prenos energije alfa čestica koja izaziva veliki deo letalnih kidanja dvostrukih lanaca na ćelijama i smanjujući efekat statusa kiseonika za ćeliju da bi preživela tretman. Takođe, relativna biološka efikasnost obično je znatno viša za alfa čestice vs. beta čestice.

[0094] Ovaj pronalazak razlikuje se od prethodno opisanih alfa-emitujućih koloida na nekoliko načina, (1) ima sporo oslobađanje<224>Ra i nuklida ćerke, što može da ima efekat "zaglađivanja" doze smanjujući probleme nehomogene distribucije alfa čestica u oblasti davanja. (2)<212>Pb koji je ćerka koja duže živi (t1/2= 10,6 h.) nakon raspada<220>Rn kratkog života (t1/2= 56 s.) i raspada<216>Po (t1/2= 0,15 s.), lako se ponovo apsorbuje ispitivanim česticama, što može da smanji curenje<212>Pb u sistemsku cirkulaciju. Tako, pronađeno je da su čestice kalcijum karbonata posebno pogodne kao nosač za<224>Ra. (3) Sam materijal čestica je ne-toksičan u korišćenim nivoima i čestice se polako razgrađuju do ne-toksičnih jona, čime je visoko biokompatibilan.

[0095] Čestice mogu da se proizvedu u veličinama od nanometara do nekoliko desetina mikrometara i radioobeleže sa visokim prinosima obeležavanja i mogu da se čuvaju nekoliko dana što je važno budući da je tako omogućena centralizovana proizvodnja i isporuka suspenzija čestica spremnih za upotrebu bolnicama. Nekoliko različitih klasa CC kristala može da se koristi uključujući heksagonalni β-CaCO3, ortorombični λ-CaCO3.

Opšta napomena

[0096] Podrazumeva se da se svaka karakteristika i/ili aspekt opisan gore u vezi sa jedinjenjima i česticama prema ovom otkriću primenjuje po analogiji na postupke i primene opisane ovde.

Sledeće slike i primeri obezbeđeni su u nastavku radi ilustrovanja ovog pronalaska.

PRIMERI

Primer 1 Proizvodnja<224>Ra

[0097] Sav posao sa koncentrovanim radioaktivnim preparatima uključujući uparavanje rastvarača itd. izveden je u komori sa rukavicama. Izvor<228>Th u 1 M HNO3je nabavljen od komercijalnog dobavljača. Acsmola nabavljena je od Eichrom Technologies LLC (Lisle, IL, SAD) u obliku prethodno upakovane patrone.

[0098] Da bi se koristila manja zapremina rastvarača, oko trideset procenata materijala u patroni (Patrona 1) izvučeno je i ponovo spakovano u manju kolonu (Patrona 2) izrađenu filtracionom kolonom od 1 ml (Isolute SPE, Biotage AB, Uppsala, Švedska). Suspenzija koja predstavlja 20% izvornog sadržaja patrone korišćena je za imobilisanje<228>Th u 500 mikrolitara 1 M HNO3 koji je dodat u 500 mikrolitara 1 M HCl i inkubiran tresenjem fiolice (fiolica od 4 ml, E-C uzorak, Wheaton, Millville, NJ, SAD) tokom najmanje 4 sata. Patroni 2 dodata je mala količina (oko 0,1 ml) Ac-smole. Nakon toga, suspenzija je dodata patroni 2 upotrebom prethodno napunjenog materijala kao sloja hvatača. Radijum je mogao biti eluiran iz Patrone 2 u 2 ml 1 M HCl.2 ml rastvora radijuma upareno je do suva, upotrebom blok grejača i ispiranjem fiolice sa N2gasom kroz otvor Teflon cevi i izlaz u gumeni/Teflon septum na fiolici i dovođenjem kisele pare u biker zasićenog NaOH tokom N2-gasa.

[0099] Ostatak je rastvoren u 0,5 ml 1 M HNO3i napunjen na patronu 3 koju čini Isolute kolona od 1 ml upakovana sa oko 250 mg Dowex anjonskim izmenjivačem. Patrona 3 je isprana sa 7 ml 1 M HNO3, čime je uklonjen<212>Pb, i konačno sa 3-4 ml 8 M HNO3da bi eluirao<224>Ra.<224>Ra eluat uparen je do suva, upotrebom bloka grejača i toka N2-gasa, a ostatak je mogao da se rastvori u 0,1 M HCl. Obično, više od 70%<224>Ra prisutnog u<228>Th izvoru moglo je da se izvuče i prečisti upotrebom opisanih postupaka.

[0100] Kasnije je faza anjonske izmene prekinuta i 2 ml sirove 1 M HCl je korišćeno bez uparavanja i napunjeno na drugu patronu sa Ac-smolom koja je isprana sa dodatnih 0,5 ml HCl da bi se proizveo eluat od 2,5 ml koji sadrži<224>Ra. Ovo je upareno do suva i rastvoreno u 0,2 ml ili više 0,1 M HCl. Pre upotrebe u obeležavanju čestica,<224>Ra rastvor je dodat količini koja odgovara 10% zapremine sa 5 M amonijum acetatom radi podešavanja pH na 5-6.

Primer 2 Merenje radioaktivnih uzoraka

[0101] Radioaktivni uzorci prebrojani su na Cobra II Autogamma brojaču (Packard Instruments, Downer Grove, IL, SAD) ili Hidex Automatic Gamma brojaču (Hidex, Turku, Finska). Tokom ekstrakcije<224>Ra iz<228>Th izvora, korišćen je CRC-25R dozni kalibrator (Capintec Inc., Ramsey, NJ, SAD).

[0102] Za određivanje distribucije<224>Ra,<212>Pb i<212>Bi u stvarnom vremenu u uzorcima, korišćen je detektor sa germanijumom visoke čistoće i hlađenjem tečnim azotom (HPGe) (GWC6021, Canberra Industries, Meriden CT, SAD). Ovo je kombinovano sa DSA 1000 digitalnim signalnim analizatorom i Genie 2000 softverom (Canberra).

Primer 3 Priprema mikročestica

[0103] Mikročestice kalcijum karbonata pripremljene su postupkom spontanog taloženja.0,33 M Na2CO3(Merck, Nemačka) rastvor brzo je sipan u jednaku zapreminu 0,33 M CaCl2(Merck, Nemačka). Nakon intenzivnog vorteksovanja tokom 30 sekundi, suspenzija čestica je ostavljena tokom 5 minuta. Čestice su isfiltrirane na filter papiru, isprane sa približno 30 ml vode i osušene preko noći na sobnoj temperaturi. Filtracija i ispiranje izvedeni su u staklenom uređaju za vakuumsku filtraciju (Whatman) sa filterom od 0,45 µm od nitroceluloze (Whatman). Suve mikročestice čuvane su na sobnoj temperaturi. Dobijene mikročestice bile su sferičnog oblika sa prečnicima unutar 1-10 µm i srednjeg 3-5 µm kao što je pokazano mikroskopijom podržano analizom u Countess™ automatskom brojaču ćelija (Invitrogen).

Primer 4 Radioobeležavanje mikročestica

[0104] Željena količina CaCO3-čestica preneta je u Eppendorf epruvetu i suspendovana u 1 ml vode. Suspenzija čestica se sonikuje u ultrazvučnom kupatilu tokom 10-15 minuta, praćeno sa 4 faze ispiranja; prva 2 puta sa 1 ml vode, a onda 2 puta sa 1 ml 0,1M Na2SO4(Alfa Aesar, Nemačka). Čestice su razdvojene od rastvora za ispiranje centrifugiranjem. Nakon ispiranja, čestice su suspendovane u DPBS (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) dopunjene sa 0,5% goveđim serumom albuminom (0,1 ml po 15 mg čestica) i inkubirane na HulaMixer (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Program mešanja bio je sledeći: orbitalni opseg rotacije bio je 14 o/min, recipročni opseg bio je 20° i vibracioni opseg bio je 3°. Zapremina 0,1M rastvora Na2SO4koja odgovara 3 µg SO4po mg čestica (0,3%) dodata je suspenziji čestica. Dalje,<224>Ra-rastvor prenet je u epruvetu sa suspenzijom čestica, zatim je odmah usledilo dodavanje 0,07 M rastvora BaCl2·2H2O (Merck, Nemačka) što odgovara 3 µg Ba po mg čestica (0,3%). Između dodavanja različitih rastvora, suspenzija čestica temeljno je izmešana na vorteks mikseru. Ako je zapremina radioaktivnog i/ili BaCl2·2H2O rastvora koji se dodaje premašila 10 µl, dodavan je u porcijama (5-10 µl u isto vreme, sa temeljnim vorteksovanjem između). Ukupna zapremina radioobeležavanja iznosila je 0,1 ml rastvora po 15 mg čestica, odnosno zapremina supernatanta uklonjenog pre dodavanja SO4-rastvora podešena je prema zapreminama drugih rastvora koji se dodaju. Čestice u rastvoru za radioobeležavanje inkubirane su na HulaMixer tokom najmanje 1 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi, sa istim programom mešanja kako je prethodno opisano. Konačno, čestice su isprane od 1-3 puta saharoznim puferom. Saharozni pufer sadrži 94 mg/ml saharoze (Sigma Ultra, St. Louis, MO, SAD) i 2,1 mg/ml Na2SO4. Efikasnost obeležavanja određena je merenjem čestica i ispiranjem rastvora(a) sa HPGe detektorom.

[0105] Rezultati: Za osam pojedinačnih eksperimenata, sa česticama iz tri različite šarže čestica, prinosi obeležavanja bili su kao što sledi:<212>Pb 96,5 ± 1,9 %,<212>Bi 96,7 ± 2,1%,<224>Ra 95,5 ± 3,2% (srednja vrednost ± SD). Rezultati pokazuju da su<224>Ra sa nuklidima ćerkama efikasno apsorbovani od strane mikročestica. Čestice kalcijum karbonata koje su čuvane u praškastom obliku na sobnoj temperaturi tokom 2 meseca apsorbovale su<224>Ra i njegove nuklide ćerki sa sličnom efikasnošću kao sveže pripremljene čestice.

Primer 5 In vitro stabilnost radioobeleženih mikročestica

[0106] In vitro stabilnost radioobeleženih mikročestica, pripremljenih kao što je opisano u Primeru 4, ispitivana je u 2 različita rastvora. Čestice su inkubirane ili u 1-1,4 ml saharoznog pufera na sobnoj temperaturi ili u 0,5 ml fetalnog telećeg seruma na 37°C. U različitim vremenskim tačkama, suspenzije su centrifugirane i izmerene su aktivnosti u supernatantu i peletirane čestice. Nakon toga, ako je ispitivanje stabilnosti trebalo da se nastavi kasnije, pelet čestica resuspendovan je u novom alikvotu ili saharoznog pufera ili fetalnog telećeg seruma, i dalje inkubiran.

Tabela 2. Zadržavanje<224>Ra česticama kalcijum karbonata in vitro.

[0107] Podaci pokazuju da<224>Ra se dobro zadržava na česticama kalcijum karbonata tokom nekoliko dana in vitro ukuzujući na obećavajuća svojstva za radioterapijsku upotrebu. To takođe ukazuje da proizvod može da ima rok trajanja od nekoliko dana omogućavajući centralizovanu proizvodnju i isporuku do udaljenih krajnjih korisnika.

Primer 6 Ponovna apsorpcija/asocijacija<212>Pb na mikročestice

[0108] CaCO3mikročestice pripremljene su kao što je opisano za postupak radioobeležavanja, osim što nije dodat nikakav radioaktivni rastvor. Umesto toga, čestice su inkubirane u mešavini 450 µl fetalnog telećeg seruma i 50 µl<224>Ra-rastvora (prethodno zagrejan do 37°C), radi merenja količine<212>Pb koja se apsorbovala na "hladne" mikročestice pripremljene pod istim uslovima kao za radioobeležavanje.

Suspenzija čestica inkubirana je na 37°C sa brzinom obrtanja 800 o/min. Nakon 10 minuta, suspenzija čestica se spustila, 250 µl supernatanta preneto je u Eppendorf epruvetu i izmerena je aktivnost. Nakon toga, čestice su resuspendovane u supernatantu, i ispitivanje je prošireno merenjima nakon 1 sata i 24 sata. Tabela 3 predstavlja rezultate ispitivanja.

Tabela 3. Apsorpcija<212>Pb iz rastvora na čestice kalcijum karbonata.

[0109] Podaci pokazuju da je<212>Pb u medijumu značajno apsorbovan iz medijuma što ukazuje da<220>Rn difuzija u mikrosredini čestica kalcijum karbonata može biti praćena značajnom ponovnom apsorpcijom proizvoda ćerke<212>Pb. Ovo može da smanji sistemsku toksičnost od apsorpcije<212>Pb u krvi.

Primer 7 In vivo biodistribucija i stabilnost radioobeleženih mikročestica.

[0110] Pozadina: Da bi se procenila korisnost<224>Ra obeleženih čestica kalcijum karbonata za intrakavitarnu upotrebu suspenzije čestica, one su ubrizgane intraperitonealno u miševe i izmerena je naknadna biodistribucija<224>Ra. Postupci: Radioobeležene mikročestice pripremljene su kako je opisano u primeru 4. Nakon ispiranja, pelet čestica je resuspendovan u saharoznom puferu na pH 7-7,5 do koncentracije čestica od približno 13 mg/ml. Institucionalno odgajane, 6-19 nedelja stare ženke Athymic Nude-Foxn1<nu>miševa telesnih masa od 17,1-28,3 g korišćene su za ispitivanja biodistribucije. Dato im je 0,4 ml suspenzije čestica intraperitonealnom injekcijom, koje sadrže 11-18 kBq<224>Ra vezano za približno 5 mg mikročestica. Miševi su žrtvovani i različita tkiva su uzeta za merenja radioaktivnosti 20 sati (n=2), 4 dana (n=3) i 7 dana (n=3) nakon injekcije. Kao kontrola, izvedeni su eksperimenti biodistribucije sa slobodnim<224>Ra (rastvoren RaCl2), davanjem 0,25 ml 0,9% rastvora NaCl sa približno 12kBq<224>Ra intraperitonealno svakom mišu.<224>RaCl2-rastvor imao je pH od 5,5. Radi poređenja, grupa od 3 miša žrtvovana je u istim vremenskim tačkama nakon injekcije kao za ispitivanje biodistribucije sa radioobeleženim mikročesticama (Fig.1A).

[0111] Rezultati: Fig.1A i B prikazuju profile biodistribucije<224>Ra-obeleženog kalcijum karbonata i slobodnih<224>Ra respektivno. Na osnovu apsorpcije butne kosti oslobađanje<224>Ra je lagano iz<224>Raobeleženog kalcijum karbonata sa oko petinom nakon 20 sati povećavajući se do približno trećine 7.

dana nakon davanja. Ovo ograničeno oslobađanje radionuklida može u jednom aspektu da bude korisno budući da može da smanji doznu heterogenost iz radioobeleženih čestica. Važno je pomenuti da postoji znatna apsorpcija u i.p. masti što je obećavajuće uzimajući u obzir ulogu i.p. masti u intraperitonealnom širenju metastaza kancera. Zaključno,<224>Ra-obeležen kalcijum karbonat ima veoma obećavajuća svojstva distribucije koja se odnose na intrakavitarnu radioterapiju.

Primer 8. Antitumorna aktivnost<224>Ra-obeleženih mikročestica u modelu i.p. kancera kod golog miša.

[0112] Pozadina: Radi ispitivanja terapeutske aktivnosti<224>Ra-obeleženih mikročestica kalcijum karbonata korišćen je model tumora intraperitonealnih mikrometastaza kod golog miša. Materijali i postupci: SKOV-3-luc ćelije (5·10<6>ćelija u 0,25 ml RPMI) ubrizgane su intraperitonealno u institucionalno odgojene, 6 nedelja stare ženke Athymic Nude-Foxn1<nu>miševa sa telesnim masama od 17,7-23,6 g. Tri dana kasnije, miševi su tretirani intraperitonealnim injekcijama<224>Ra-obeleženih mikročestica kalcijum karbonata u saharoznom puferu sa aktivnostima od 200 kBq/kg (0,25-0,3 ml), 600 kBq/kg (0,35-0,4 ml) ili 3 injekcije od 200 kBq/kg (0,25-0,4 ml). Druga grupa imala je 48 sati između svake injektirane frakcije. Kontrolne životinje primile su slani rastvor (0,4 ml) ili 200 mg/kg (0,35-0,4 ml) ne-obeleženih mikročestica u saharoznom puferu. Miševi su randomizovani u grupe za tretman pre ćelijske inokulacije, pri čemu je svaku grupu činilo 8 miševa. Na dan 44 i 45 nakon početka tretmana, sve životinje su eutanizovane cervikalnom dislokacijom. Tokom disekcije, prisustvo makroskopskih tumora je ocenjeno pažljivim vizuelnim pregledom svake životinje i svi vidljivi tumori u peritonealnoj šupljini su uklonjeni i izmereni.

[0113] Rezultati: Podaci su prikazani na Fig.2. Nije bilo značajne razlike između prosečnih masa tumora dve kontrolne grupe koje su primile ili slani rastvor ili ne-obeležene mikročestice kalcijum karbonata. Sve grupe koje su primile<224>Ra-obeležene mikročestice imale su snažno suzbijanje rasta tumora kao što je pokazano veoma smanjenim masama tumora što je bilo statistički značajno u poređenju sa kontrolama. Iako nije bilo statističke razlike između<224>Ra tretiranih grupa, postojala je tendencija ka većoj supresiji rasta tumora sa većim doziranjem<224>Ra i frakcionisanim tretmanom.

[0114] Zaključno,<224>Ra obeležene mikročestice kalcijum karbonata pokazale su snažnu i konzistentnu antitumornu aktivnost kod miševa sa intraperitonealnim tumorima.

Primer 9 Terapeutski efekti u modelu agresivnog ascites kancera.

[0115] Pozadina: Humani kancer jajnika često dovodi do intraperitonealnog ascitesa. Humana ćelijska linija kancera jajnika ES-2 proizvodi agresivni rast tumornih ćelija i kancerogenog ascitesa kod golih miševa.

[0116] Materijali i postupci: ES-2 ćelije (10·10<6>ćelija u 0,3 ml RPMI) injektirane su intraperitonealno u institucionalno odgajane, 6 nedelja stare ženke Athymic Nude-Foxn1<nu>miševa sa telesnim masama od 18,1-23,2 g.25 sati kasnije, miševi su tretirani sa intraperitonealnim injekcijama<224>Ra-obeleženih mikročestica kalcijum karbonata u saharoznom puferu sa aktivnostima od 100 kBq/kg (0,3 ml), 300 kBq/kg (0,3-0,35 ml) ili 500 kBq/kg (0,3-0,35 ml). Kontrolne životinje primile su 0,35 ml slanog rastvora. Miševi su randomizirani u grupe za tretman pre ćelijske inokulacije, pri čemu je svaku grupu činilo 7-8 miševa. Životinje su izmerene i praćene za progresiju bolesti minimum 3 puta nedeljno, i svaki dan kada su pokazale kliničke znakove koji ukazuju na ulazak u poslednju fazu bolesti. Svi miševi su eutanizirani cervikalnom dislokacijom na dan kada su dostigli krajnju tačku gubitka blagostanja, uzimajući u obzir abdominalne distenzije koje pogoršavaju pokretljivost ili disanje, brz gubitak ili dobitak telesne mase zajedno sa opštim izgledom i ponašanjem miševa. Nakon eutanazije, izvršena je autopsija na miševima za grubo patološko ispitivanje.

[0117] Rezultati: Vremena preživljavanja zabeležena su kao dani nakon inokulacije tumornih ćelija, i prikazana je (Fig.3) preliminarna kriva preživljavanja koja uključuje podatke do 20. dana praćenja. Na dan 19. nakon inokulacije tumornih ćelija, svi miševi u grupi sa slanim rastvorom i najnižom dozom (100 kBq/kg) bili su eutanizovani, pri čemu 86 % miševa (6/7) u grupi sa srednjom (300 kBq/kg) i visokom (500 kBq/kg) dozom nije dostiglo krajnju tačku ispitivanja. Ove preostale životinje su pregledane na dan 20. Srednje preživljavanje svake grupe predstavljeno je u Tabeli 4.

Tabela 4. Srednje preživljavanje miševa sa intraperitonealnim ES-2 kancerom ascitesom tretiranih slanim rastvorom ili<224>Ra-obeleženim kalcijum karbonatom.

[0118] Zaključak: Dobijeno je značajno produženje životnog veka sa<224>Ra-obeleženim mikročesticama kalcijum karbonata što ukazuje na značajan potencijal za intrakavitarni ascites.

Primer 10 Priprema dvokomponentne radioterapijske mešavine.

[0119] U nekim aspektima može da bude korisno da se kombinuju<224>Ra-obeležene čestice kalcijum karbonata sa ćelijski-specifičnim radiofarmaceutikom. Ovo se dobija kada se<224>Ra rastvor u ravnoteži sa nuklidima ćerkama kombinuje sa<212>Pb vezujućim helatnim konjugatom pre kontakta sa česticama kalcijum karbonata.

[0120] Postupci: 0,2 ml 0,5 M rastvoru amonijum acetata od<224>Ra u ravnoteži sa nuklidima ćerkama dodat je 1 mg/ml TCMC-obeleženog monoklonalnog antitela (mAb) (trastuzumab, cetuksimab ili OI-3) i inkubirano tokom 60 minuta. Zatim je reakciona mešavina dodata u 30 mg mikročestica kalcijum karbonata u 0,2 ml 1% goveđeg seruma albumina i mešana tokom 30 minuta. Mešavina je zatim centrifugirana i supernatant i pelet prebrojani su zasebno na gama brojaču i analizirani sa detektorom germanijuma.

[0121] Pripremljena je radioterapijska mešavina koju čine<212>Pb-obeleženo antitelo i<224>Ra-CaCO3 mikročestice. Za obeležavanje antitela sa<212>Pb, antitelo Cetuksimab je prvo konjugovano sa helatorom, TCMC.

[0122] Da bi se pripremio radioimunokonjugat,<224>Ra-rastvor sa 0,5 M amonijum acetatom (pH između 5 i 6) izmešan je sa TCMC-Cetuksimabom i reagovao je tokom 30 minuta na 37°C sa brzinom rotacije od 350 o/min. Radiohemijska čistoća dobijenog proizvoda ocenjena je hromatografskim trakama (Biodex), i pronađeno je da je iznad 95% za<212>Pb. CaCO3 mikročestice pripremljene su kao što je opisano za postupak radioobeležavanja, osim što je dodata radioaktivnost bio rastvor opisan gore, koji sadrži i<224>Ra i<212>Pb-obeležen TCMC-Cetuksimab. Nakon 1,5 sati inkubacije na sobnoj temperaturi na HulaMixer, čestice u rastvoru za radioobeležavanje su se spustile i razdvojeni su supernatant i frakcija čestica. Distribucija aktivnosti<224>Ra i<212>Pb u peletu čestica i supernatant određeni su HPGe detektorom. Analiza radiohemijske čistoće izvedena je na alikvotu supernatanta.

[0123] Podaci su predstavljeni u Tabelama 5 i 6. Tabela 6 pokazuje da je 66,39 % ukupne<212>Pb aktivnosti pronađeno u supernatantu, dok je 98,41 %<224>Ra zadržano na česticama. Od oslobođenog<212>Pb najmanje 98 % bilo je vezano za protein (Tabela 5), što predstavlja frakciju antitelo-vezanog<212>Pb pre nego što je antitelo izmešano sa česticama. U Tabeli 6 prikazana je frakcija<212>Pb-antitelo konjugata i<224>Ra u slobodnoj cirkulaciji i vezan za čestice kalcijum karbonata. Podaci pokazuju da se<224>Ra vezuje za čestice dok je glavni deo<212>Pb-konjugata slobodan da cirkuliše u medijumu. Tako je dobijena bifunkcionalna radioterapijska mešavina pogodna za injekciju.

[0124] Zaključno,<224>Ra rastvori pomešani sa<212>Pb-TCMC-antitelo konjugatima mogu da se koriste za pripremu<224>Ra-CC mikročestica dajući dvokomponentnu terapeutsku mešavinu sa radioimunokonjugatom (RIC) i radioobeleženim mikročesticama sa antigen-ciljanim svojstvima kao i radioterapijskim svojstvima mikročestica. Ovo može da bude prednost u stvaranju kombinacije opšteg zračenja u šupljini i specifične tumorne ćelije-ciljanog RIC tretmana protiv kancera. Dodavanje RIC može da poboljša mikrodistribuciju alfa zračenja da bi se poboljšao terapeutski efekat na otpornost ćelija kancera.

Tabela 5. Analize tankoslojne hromatografije<212>Pb-TCMC-antitelo konjugata pre i nakon apsorpcije na čestice kalcijum karbonata.

Tabela 6. Apsorpcija<224>Ra rastvora koji sadrži<212>Pb-TCMC-antitelo od strane čestica

Primer 10 B Opis sistema sa kitom za pripremu radioterapijske mešavine<212>Pb radioimunokonjugata i<224>Ra mikročestica.

[0125] Fiolica (A) sa rastvorom<224>Ra u vodenom rastvoru (npr.0,5 M amonijum acetat, pH 5-6) ostavljen je da se raspada tokom 1 dana ili više za proizvodnju<212>Pb. Vodeni rastvor (B) TCMC-antitelo konjugata ili sličnog helat-konjugovanog antitela i fiolica (C) sa suvim ili vodenim mikročesticama kalcijum karbonata. Sadržaji fiolice A i B umešane su zajedno u jednoj od fiolica i inkubirani za 1 min do 4 sata, a zatim pomešani sa fiolicom C i inkubirani za 1 minut do 4 sata. Nakon svake faze inkubacije može ili ne mora da se sprovede kontrola kvaliteta. Konačno, kombinovana mešavina od A, B, i C uvučena je u špric i data pacijentu.

Reference

[0126]

Atcher RW and Hines JJ. Colloid labelled with radionuclide and method

US 4970062 A (submitted 1989)

Bloomer, W.D., McLaughlin, W.H., Neirinckx, R.D., Adelstein, S.J., Gordon, P.R., Ruth, T.J., Wolf, A.P. Astatine-211-tellurium radiocolloid cures experimental malignant ascites. Science.1981;212:340-341.

Boudousq V1, Bobyk L, Busson M, Garambois V, Jarlier M, Charalambatou P, Pèlegrin A, Paillas S, Chouin N, Quenet F, Maquaire P, Torgue J, Navarro-Teulon I, Pouget JP. Comparison between internalizing anti-HER2 mAbs and non-internalizing anti-CEA mAbs in alpha-radioimmunotherapy of small volume peritoneal carcinomatosis using 212Pb. PLoS One.2013 Jul 29;8(7).

Gustafsson AM1, Back T, Elgqvist J, Jacobsson L, Hultborn R, Albertsson P, Morgenstern A, Bruchertseifer F, Jensen H, Lindegren S.Comparison of therapeutic efficacy and biodistribution of 213Bi- and 211At-labeled monoclonal antibody MX35 in an ovarian cancer model. Nucl Med Biol. 2012 Jan;39(1):15-22.

Kirby, H. W; Salutsky, Murrell L (1964). The Radiochemistry of Radium (PDF). National Academies Press, pp 5.Larsen RH and Salberg G. Alpha-emitting hydroxyapatite particles. US patent No.8142758 B2 (submitted 2005)

Liu S. Bifunctional coupling agents for radiolabeling of biomolecules and target specific delivery of metallic radionuclides. Adv Drug Deliv Rev.2008, 60 (12), 1347-1370.

Ritter MA, Cleaver JE, Tobias CA. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA breaks. Nature.1977 Apr 14;266(5603):653-5.Scott A. Gerber,* Viktoriya Y. Rybalko,* Chad E.

Bigelow,† Amit A. Lugade,* Thomas H. Foster,† John G. Frelinger,* and Edith M. Lord* Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. Am J Pathol.2006 Nov; 169(5): 1739-1752.

Vergote I, Larsen RH, de Vos L, Nesland JM, Bruland O, Bjørgum J, Alstad J, Trope C, Nustad K.

Therapeutic efficacy of the alpha-emitter 211At bound on microspheres compared with 90Y and 32P colloids in a murine intraperitoneal tumor model. Gynecol Oncol.1992 Dec;47(3):366-72.

STAVKE OPISA

[0127]

1. Čestica koja obuhvata razgradivo jedinjenje i alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku.

2. Čestica prema stavki 1, kod koje je radionuklid odabran iz grupe koju čine<224>Ra,<212>Bi,<212>Pb<223>Ra,<225>Ra ,<225>Ac,<213>Bi,<211>At,<227>Th.

3. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-2, kod koje je razgradivo jedinjenje odabrano iz grupe koju čine CaCO3, PEG-modifikovan CaCO3, protein-modifikovan CaCO3, karbohidrat-modifikovan CaCO3, lipidmodifikovan CaCO3, vitamin-modifikovan CaCO3, organsko jedinjenje-modifikovan CaCO3, polimermodifikovan CaCO3i/ili neorganski kristal-modifikovan CaCO3.

4. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-3, pri čemu je veličina čestice od 1 nm do 500 µm.

5. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-4, koja dalje obuhvata jedno ili više jedinjenja odabranih iz grupe koju čine monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, radioimunokonjugat, imunokonjugat, helat-antitelo konjugat, vitamini koji uključuju folat i derivate folata, peptidi, minitela, i Affibody-ji.

6. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jednu ili više čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 i razblaživač, nosač, surfaktant, i/ili ekscipijens.

7. Farmaceutska kompozicija prema stavci 6, pripremljena sa količinom radionuklida koja je 1kBq do 10GBq po doziranju.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od stavki 6-7, pripremljena sa količinom radionuklida koja je 50 MBq do 100 GBq pogodnom za proizvodnju multidoza u industrijskoj razmeri.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od stavki 6-8, pri čemu ta kompozicija predstavlja suspenziju čestica koja obuhvata monodispergovane ili polidispergovane čestice obeležene sa alfa emitujućim radionuklidom i/ili radionuklidom koji generiše alfa emitujuću ćerku.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od stavki 6-9, koja je pogodna za intravenoznu ili intrakavitarnu injekciju.

11. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema stavkama 6-9, za upotrebu kao lek.

12. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema stavkama 6-9, za upotrebu u intrakavitarnoj terapiji, radioembolizaciji ili radiosinovektomiji.

13. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema stavkama 6-9, za upotrebu u lečenju kancera.

14. Čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema stavkama 6-9, za upotrebu prema stavci 12-13, pri čemu je kancer odabran iz grupe koju čine intraperitonealni kanceri, intrakranijalni kanceri, pleuralni kanceri, kanceri bešike, srčani kanceri, i kanceri u subarahnoidnoj šupljini.

15. Postupak lečenja ili poboljšanja koji obuhvata davanje čestica prema bilo kojoj od stavki 1-5 ili farmaceutske kompozicije prema stavci 6-9 pojedincu kom je to potrebno pomoću jednog tretmana ili ponovljenog doziranja.

16. Postupak za pripremu čestica prema bilo kojoj od stavki 1-6, gde taj postupak obuhvata dovođenje u međusobni kontakt alfa emitujućeg radionuklida i biorazgradivog jedinjenja sa ili bez upotrebe nosača za radionuklid.

17. Kit koji obuhvata;

- nano ili mikro česticu prema bilo kojoj od stavki 1-6,

- alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku,

- nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i

- opciono instrukcije za upotrebu kita.

18. Kit koji obuhvata;

- nano ili mikro čestice prema bilo kojoj od stavki 1-6,

- alfa emitujući radionuklid ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku,

nosač, razblaživač i/ili ekscipijens, i

opciono instrukcije za upotrebu kita radi pripreme bifunkcionalnog farmaceutskog rastvora koji obuhvata suspenziju čestica i rastvor radioimunokonjugata.

19. Kit prema stavci 18, koji dalje obuhvata helator-konjugovan molekul, uključujući monoklonalno antitelo.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Čestica koja obuhvata razgradivo jedinjenje i alfa emitujući radionuklid i/ili radionuklid koji generiše alfa emitujuću ćerku, kod koje

radionuklid je<224>Ra,

razgradivo jedinjenje je odabrano iz grupe koju čine CaCO3, PEG-modifikovan CaCO3, proteinmodifikovan CaCO3, karbohidrat-modifikovan CaCO3, lipid-modifikovan CaCO3, vitamin-modifikovan CaCO3, organsko jedinjenje-modifikovan CaCO3, polimer-modifikovan CaCO3i/ili neorganski kristalmodifikovan CaCO3, i

čestica je od 1 nm do 500 µm.

2. Čestica prema zahtevu 1, pri čemu je čestica od 100 nm do 50 µm.

3. Čestica prema bilo kom od zahteva 1-2, koja dalje obuhvata jedno ili više jedinjenja odabranih iz grupe koju čine monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, radioimunokonjugat, imunokonjugat, helat-antitelo konjugat, vitamini uključujući folat i derivate folata, peptidi, minitela, i Affibody-ji.

4. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jednu ili više čestica prema bilo kom od zahteva 1-3 i razblaživač, nosač, surfaktant, i/ili ekscipijens.

5. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4, pripremljena sa količinom radionuklida koja je 1kBq do 10GBq po doziranju ili sa količinom radionuklida koja je 50 MBq do 100 GBq pogodnom za proizvodnju multidoza u industrijskoj razmeri.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 4-5, pri čemu je ta kompozicija suspenzija čestica koja obuhvata monodispergovane ili polidispergovane čestice obeležene sa alfa emitujućim radionuklidom i/ili radionuklidom koji generiše alfa emitujuću ćerku.

7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 4-6, koja je pogodna za intravenoznu ili intrakavitarnu injekciju.

8. Čestica prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevima 4-7, za upotrebu kao lek.

9. Čestica prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevima 4-7, za upotrebu u intrakavitarnoj terapiji, radioembolizaciji ili radiosinovektomiji.

10. Čestica prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevima 4-7, za upotrebu u lečenju ili poboljšanju kancera.

11. Čestica za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu je kancer odabran iz grupe koju čine intraperitonealni kanceri, intrakranijalni kanceri, pleuralni kanceri, kanceri bešike, srčani kanceri, i kanceri u subarahnoidnoj šupljini.

12. Čestica prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevima 4-7, za upotrebu prema zahtevima 10-11, gde se davanje izvodi kao jedan tretman ili ponovljeno doziranje.

13. Postupak za pripremu čestice prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u međusobni kontakt alfa emitujućeg radionuklida i biorazgradivog jedinjenja sa ili bez upotrebe nosača za radionuklid.