RS56452B1

RS56452B1 - Fenoksietil piperidin jedinjenja

Info

Publication number: RS56452B1
Application number: RS20171039A
Authority: RS
Inventors: Matthew Allen Schiffler; Jeremy Schulenburg York
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2018-01-31
Also published as: EA024392B1; MX2014015953A; EP2867207A1; EP2867207B1; CO7151507A2; CA2875569A1; HK1203937A1; SI2867207T1; MA37686B1; UA114325C2; SG11201408641UA; GT201400288A; LT2867207T; DK2867207T3; AU2013280875A1; TW201412717A; CL2014003535A1; WO2014004229A1; EA201492255A1; ME02840B

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na nova fenoksietil piperidin jedinjenja, farmaceutske oblike koji sadrže ova jedinjenja, upotrebu jedinjenja u lečenju fizioloških poremećaja i na intermedijere i postupke (procese) korisne u sintezi ovih jedinjenja.

[0002] Ovaj pronalazak je iz oblasti lečenja i prevencije inflamatornih stanja, kao što su artritis, uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis, i uključujući bol povezan sa ovim stanjima. Artritis pogađa milione pacijenata u SAD i vodeći je razlog za nepokretnost. Lečenje često uključuje NSAID (nesteroidne antiinflamatorne lekove) ili COX-2 inhibitore, koji mogu da proizvedu neželjene kardiovaskularne i/ili gastrointestinalne sporedne efekte. Kao takvi, pacijenti koji imaju kardiovaskularni profil, sa hipertenzijom, mogu biti izuzeti od uzimanja NSAID ili COX-2 inhibitora. Tako, postoji potreba za jednim alternativnim tretmanom osteoartritisa i reumatoidnog artritisa, poželjno bez sporednih efekata koje pokazuju poznati tretmani.

[0003] Četiri prostaglandin E2(PGE2) receptor podtipova je identifikovano kao što sledi: EP1, EP2, EP3, i EP4. Pokazalo se da je EP4 primarni receptor uključen u zapaljenski bol zglobova kod modela glodara sa reumatoidnim artritisom i osteoartritisom (Videti, na primer, J. Pharmacol. Exp. Ther., 325, 425 (2008)). Dakle, selektivni EP4 antagonist mogao bi biti korisan u lečenju artritisa, uključujuću bol usled artritisa. Uz to, sugerisano je da pošto EP4 antagonizam nije povezan sa biosintezom prostanoida, kao što su PGI2 i TxA2, selektivni EP4 antagonist ne bi trebao da ima potencijalne kardiovaskularne sporedne efekte viđene prilikom upotrebe NSAID i COX-2 inhibitora. (Videti, na primer, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21, 484 (2011)).

[0004] WO 2013/004290 opisuje ciklične amin derivate kao EP4 receptor antagoniste. US 2005/0250818 opisuje određena orto substituisane aril i heteroaril amidna jedinjenja koja su EP4 receptor selektivni antagonisti sa analgetskom aktivnošću. Dodatno, WO 2011/102149 opisuje određena jedinjenja koja su selektivni EP4 antagonisti, koja su korisna u lečenju IL-23 posredovanih bolesti. WO 2005/105732 opisuje određena supstituisana metil aril ili heteroaril amidna jedinjenja kao antagoniste prostaglandin E2receptora.

[0005] Ovaj pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja koja su selektivni inhibitori EP4 u odnosu na EP1, EP2, i EP3. Dodatno, ovaj pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja sa potencijalom za umanivanje kardiovaskularnih ili gastrointestinalnih sporednih efekata u poređenju sa tradicionalnim NSAID.

[0006] Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule II:

R1 je H, -CN, ili F;

R2 je H ili metil;

R3 je H; i

R4 je H, metil, ili etil; ili

R3 i R4 spojeni zahjedno formiraju ciklopropil prsten;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0007] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenje Formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I ili Formule II, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju, posebno za lečenje osteoartritisa. Dodatno pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I ili Formule II, ili njegovu framaceutski prihvatljivu so za lečenje reumatoidnog attritisa. Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju bola koji je povezan sa osteoartritisom ili reumatoidnim artritisom. Dalje, ovaj pronalazak obezbežuje upotrebu jedinjenja Formule I ili Formule II ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju leka za lečenje osteo artritisa. Ovaj pronalazak obezbežuje upotrebu jedinjenja Formule I ili Formule II ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju leka za lečenje reumatoidnog artritisa. Ovaj pronalazak obezbežuje upotrebu jedinjenja Formule I ili Formule II ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju leka za lečenje bola povezanog sa osteoartritisom i reumatoidnim artritisom [0009] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutski oblik koji sadrži jedinjenje Formule I ili Formule II ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa jednim ili vise farmaceutski prihvatljivih nosilaca, razblaživača ili ekscipijenata. U posebnoj realizaciji, farmaceutski oblik sadrži jedan ili više terapeutskih agenasa. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje nove intermedijere i procese za sintezu jedinjenja Formule I ili Formule II, ili njegovih farmaceutski prihtavtljivih soli.

[0010] Kao što se ovde upotrebljava termin "lečenje" ili "lečiti" uključuje iskorenjivanje, ograničavanje, usporavanje i oporavak od progresije ili težine postojećih simptoma ili poremećaja.

[0011] Kao što se ovde upotrebljava, termin "pacijent" se odnosi na sisara, kao što je miš, gvinejsko prase, pacov, pas ili čovek. Podrazumeva se da je omiljeni pacijen čovek.

[0012] Kao što se ovde podrazumeva, termin "efektivna suma" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja posle jedinične ili višekratne administracije doze pacijentu, obezbeđuje željene efekte kod pacijenta pod dijagnozom ili tretmanom.

[0013] Efektivna količina može se lako odrediti od strane dijagnostičara, kao što su ljudi iz struke, upotrebom poznatih tehnika i posmatranjem rezultata dobijenih pod analognim uslovima.U odreživanju efektivne količine za pacijenta, nekoliko faktora se uzima u obzir od strane dijagnostičara, uključujući: vrstu sisara, veličinu, godište, opšte zdravstveno stanje, vrstu bolest ili stanja, stepen i težinu oboljenja ili stanja, odgovor individualnog pacijenta, vrsta jedinjenja koja se daje, način davanja, bioraspoložive karakteristike preparata koji se daje, odabrani dozni režim, upotreba pratećih lekova i druge relevantne okolnosti.

[0014] Jedinjenja Formule I ili Formula II, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, su generalno efektivni u širokom opsegu doza. Na primer, dnevne doze su u glavnom u opsegu od oko 0.01 do oko 50 mg/kg telesne težine. U pojedinim slučajevima nivoi doze ispod navedenog minimum, mogu biti sasvim adekvatne, dok u drugim slučajevima veće doze od navedenog maksimuma mogu se upotrebiti sa prihvatljivim sporednim efektima.

[0015] Jedinjenja u skladu sa pronalaskom su pre svega formulisana kao farmaceutski oblici koji se daju putem koji ih čini bioraspoloživim. Najpoželjnije, takvi farmaceutski oblici su za oralnu upotrebu. Takvi farmaceutski oblici i procesi za njihovo pripremanje su dobro poznati u struci. (Videti, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0016] Jedinjenja Formule I i Formule II su posebno korisna u tretmanima u skladu sa ovim pronalaskom, ali određene grupe, supstituenti I konfiguracije su poželjnije za jedinjenja Formula I i II. Sledeći paragrafi opisuju takve poželjne grupe, supstituente i konfiguracije. Podrazumeva se da su ove preference primenljive kako u tretmanu tako i u novim jedinjenjima u skladu sa ovim pronalaskom.

[0017] Poželjno je da R<1>je H, R<2>je H, R<3>je H, i X je:

[0018] Dalje je poželjno da kada R<3>je H, R<4>je metil.

[0019] Dalje je poželjno da X je

[0020] 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzenska kiselinasledeće strukture:

i njena farmaceutski aktivna so su posebno poželjni.

[0021] Hidro hlorid 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzenske kiseline je takođe veoma pogodan.

[0022] Kao što se ovde koristi, "kPa" se odnosi na kilopaskal meru; "Boc" se odnosi na tercbutoksi zaštitni grupu; karbonil "DMEM" se odnosi na Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; "ACN" se odnosi na acetonitril; "DMSO" se odnosi na dimetilsulfoksid; "DMF" se odnosi na N,N-dimetilformamid; "EtOH" se odnosi na etanol; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran; "MeOH" se odnosi na metanol; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "Et2O" se odnosi na dietil etar; "TBME" se odnosi na terc-butil metil eter; "BOP" se odnosi na benzotriazol-1-iloksitris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat; "NaHMDS" se odnosi na natrijum bis(trimetilsilil)amid; "PGE2" se odnosi na prostaglandin E2; "FBS" se odnosi na Serum Fetusa Govečeta; "IBMX" se odnosi na (3-izobutil-1-metilksantin); "MES" se odnosi na (2-(N-morfolino)etanesulfonsku kiselinu; "HEPES" se odnosi na (2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]etanesulfonsku kiselinu); "HTRF" se odnosi na homogenu vremenski razdvojenu fluorescentniu tehnologiju. "HEK" se odnosi na humani embriotski bubreg, "HBSS" se odnosi na Hank-ov izbalansiran slain rastvor; "EC80" se odnosi na koncentraciju jednog agensa koja proizvodi 80% maksimalne moguće efikasnosi datog agensa; i "IC50" se odnosi na koncentraciju jednog agensa koja proizvodi 50% maksimalnohg inhibitorskog odgovora za taj agens.

[0023] Farmaceutski prihvatljive soli i uobičajeni načini za njihovo dobijanje su poznati u struci. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217(1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,"Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); and Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Osobe obučene u oblasti sinteze, razumeće da jedinjenja Formule I i Formule II se lako mogu transformisati i izolovati u obliku farmaceutski prihvatljive soli, kao što su hidrohloridna so, upotrebom tehnika i uslova poznatih ljudima standardno obučenim u struci. Dodatno, stručnjaci u sintezi će primetiti da jeddinjena Formule I I Formule II se mogu lako pretvoriti i izolovati kao odgovarajuće slobodne baze ili slobodne kiseline iz farmaceutski prihvatljivih soli.

[0024] Ovaj pronalazak podrazumeva sve individualne enantiomere ili diastereoizomere, kao I mešavine enentiomera i diastereoizomera rečenih jedinjenja, uključujući racemate. Individualni izomeri, enantiomeri ili diastereoizomeri, mogu se odvojiti ili detektovati bilo kojom uobičajenom metodom u bilo kojoj tački sinteze jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom, metodama kao što su tehnika selektivne kristalizacije ili hiralne hromatografije (Videti na primer, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Rerastvors", John Wiley and Sons, Inc., 1981, i E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994).

[0025] Jedinjenje u skladu sa ovim pronalaskom ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može se dobiti pomoću različitih procedura poznatih ljudima iz struke, od kojih su neke prikazane u šemama, preparaturama i primerima datim niže. Specifični koraci sinteze za svaki opisani put, mogu se kombinovati na različite načine ili kombinovano sa koracima iz razlićitih šema, kako bi se pripremilo jedinjenje Formule I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Proizvodi iz svakog koraka u šemama datim niže mogu se dobit konvenkcionalnim metodama, uključijući ekstrakciju, uparavanje, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. Reagensi i početni material su lako dostupni onima koji su prosečno osposobljeni u struci. Sve supstituenti, osim u koliko nije drugačije navedeno su kao što je prethodno navedeno.

Šema 1

Postupak 1

Sinteza (S)-N-terc-butoksikarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina.

[0026]

[0027] Šema 1, Korak A: U rastvor koji se mesa od (-)-1-(4-bromofenil)etilamina (1.00 g, 5.0 mmol) u dihlorometanu (10 mL) na 0 °C, dodati di-terc-butilkarbonata (1.09 g, 5.0 mmol). Ostaviti reakcionu smešu da se zagreje do sobne temperature, zatim mešati u trajanju od dva sata. U smešu koja se meša, dodati 1 M jednomolarne hlorovodonične kiseline (25 mL), praćeno sa Et2O (25 mL). Odvojiti slojeve i ekstrahovati vodeni sloj sa Et2O (2 x 25 mL). Spojiti organske slojeve, isprati sa zasićenim vodenim NaCl (25 mL), osušiti organski sloj preko MgSO4, filtrirati kako bi se odstranio suvi ostatak I koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (1.50 g, 99% prinos). Maseni spektar (m/z) (79Br/81Br) 244/246 (M 2H - t-Bu)+, 322/324 (M Na)+.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.46-7.43 (m, 2H), 7.19-7.15 (m, 2H), 4.81-4.65 (m, 1H), 1.48-1.36 (m, 12H).

[0028] Pripremiti sledeće jedinjenje suštinski po metodi iz Postupak 1, koristeći 1-(4-bromofenil)ciklopropanamin umesto (-)-1-(4-bromofenil)etilamina

Postupak 3

Sinteza metil (S)-4-(1-terc-butoksikarbonilaminoetil)benzoata.

[0029]

[0030] Šema 1, Korak B: U Parr-ov autoklav sa mehaničkim mešanjem, dodati Pd(OAc)2 (120 mg, 0.53 mmol), 1,1’-bis(difenilfosfino)ferocena (355 mg, 0.64 mmol), (S)-N-terc-butoksikarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina (1.50 g, 5.0 mmol), anhidrovanog CH3CN (45 mL), anhidrovanog CH3OH (30 mL), i trietilamina (1.9 mL, 13.63 mmol). Zapečatiti posudu i podvrgnuti pritisku ugljen monoksida do 724 kPa. Zagrevati posudu do 85 °C i mešati smešu preko noći. Otvoriti reakcionu posudu (PAŽNJA – otrovni gas!)) i prebaciti u balon sa okruglim dnom, isprati sa CH3OH. Koncentrovati smešu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobio oranž ostatak. Dodati vodu (50 mL), zatim ekstrahovati sa EtOAc (2 x3 50 mL). Isprati kombinovane organske faze sa zasićenim vodenim NaCl (25 mL), zatim odvojiti slojeve, osušiti organsku fazu preko MgSO4, filtrirati kako bi se uklanile čvrste materije I koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskomkako bi se dobio sirovi proizvod. Prečistiti proizvod sa fleš hromatografijom na silica gelu uz eluiranje sa gradijentom od 0% do 60% EtOAc/heksan. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (1.00 g, 72% prinos). Maseni spektar (m/z) 224 (M 2H - t-Bu)+, 302 (M Na)+, 581 (2M Na)+.<1>H NMR (400 MHz, DMSOd6): δ 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.64 (dq, J = 7.4, 6.8 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 1.34 (br s, 9H), 1.28 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

[0031] Pripremite sledeće jedinjenje suštinski po metodi iz Pripreme 3, koristeći terc-butil N-[1-(4-bromofenil)ciklopropil]karbamata umesto (S)-N-terc-butoksikarbonil-1-(4-bromofenil)etilamina:

Postupak 5

Sinteza metil (S)-4-(1-aminoetil)benzoat hidrohlorida.

[0032]

[0033] Šema 1, Korak C: U metil (S)-4-(1-terc-butoksikarbonilaminoetil)benzoat (1.00 g, 3.58 mmol), dodati hlorovodonika (4 M u dioksanu, 5 mL, 20 mmol) i mešati rezultujuću smešu na sobnoj temperature jedan sat. Koncentrovati smešu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele ćvrste supstance (750 mg, 97% prinos).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.57 (br s, 3H), 7.99 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.47 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 1.50 (d, J = 6.8 Hz, 3H).

[0034] Pripremiti sledeće jedinjenje bazično na osnovu metoda iz Postupak 5, koristeći metil 4-[1-(terc-butoksi karbonilamino)ciklopropil]benzoate umesto metil (S)-4-(1-terc-butoksi karbonilaminoetil)benzoata:

Šema 2

Postupak 7

Sinteza 1-(2,2-dimetoksietoksi)-4-fluorobenzena.

[0035]

[0036] Šema 2, Korak A: Rastvoriti 4-fluorofenol (5.5 g, 49.1 mmol) u acetonitrilu (49 mL) i tretirati rastvor sa 2-bromo-1,1-dimetoksietanom (11.6 mL, 98.1 mmol) i K2CO3 (16.95 g, 122.7 mmol). Zagrevati rastvor na refluksu uz mešanje pet dana. Filtrirati smešu i koncentrovati filtrat pod smanjenim pritiskom. Podvrgnuti rezultujući sirovi material silica gel homatografiji uz eluiranje sa gradijentom od 0% do 50% EtOAc/heksan. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanenim pritiskom kako bi se dobilo jedijenje iz naslova u obliku bezbojnog ulja (5.85 g, 60% prinos). Maseni spektar (m/z) 218 (M NH4)+, 223 (M Na)+.

Šema 3

Postupak 8

Sinteza (2,2-dimetoksietoksi)cikloheksan.

[0037]

[0038] Šema 3, Korak A: Rastvoriti cikloheksanol (2.00 mL, 19.1 mmol) u DMF (9.6 mL), zatim dodati NaHMDS (1 M rastvor u THF, 21.0 mL, 21.0 mmol), i mešati rastvor na sobnoj temperature u trajanju od 5 min. Dodati 2-bromo-1,1-dimetoksietan (2.26 mL, 19.1 mmol), zatim mešati na sobnoj temperature pod atmosferom azota tri dana. Razblažiti smešu sa EtOAc (250 mL) i isprati sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (2 3 250 mL). Osušiti organsku fazu preko MgSO4, filtrirati, i koncentrovati filtrat pod smanjenim pritiskom. Podvrgnuti dobijeni sirovi material hromatografiji na silica gelu uz eluiranje sa gradijentom 0% do 10% EtOAc/heksan. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanenim pritiskom kako bi se dobilo jedijenje iz naslova u obliku bledo žutog ulja (1.10 g, 31% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.47 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.49 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.39 (s, 6H), 3.25 (tt, J = 9.2, 3.7 Hz, 1H), 1.94-1.87 (m, 2H), 1.76-1.69 (m, 2H), 1.55-1.49 (m, 1H), 1.34-1.17 (m, 5H).

Šema 4

Postupak 9

Sinteza 2-(4-fluorofenoksi)acetaldehida.

[0040] Šema 4, Korak A: Rastvoriti 1-(2,2-dimetoksietoksi)-4-fluorobenzen (1.00 g, 4.99 mmol) u hloroformu (5.0 mL) i tretirati smešu sa trifluorosirćetnom kiselinom (0.755 mL, 9.99 mmol). Mešati smešu na sobnoj temperature dva dana, zatim zagrevati do 65 °C i mešati u trajanju od 4 sata. Koncentrovati smešu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bezbojnog ulja ca. 70% čistoće, kao što je idnikovano sa<1>H NMR analizom (550 mg, 71% nekorigovani prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.85 (t, J = 0.5 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 8.9, 8.5 Hz, 2H), 6.85 (dd, J = 9.5, 4.3 Hz, 2H), 4.55 (br s, 2H).

Šema 5

Postupak 10

Sinteza 2-(cikloheksiloksi)acetaldehid.

[0041]

[0042] Šema 5, Korak A: Zakiseliti smešu od (2,2-dimetoksietoksi)cikloheksana i vode (30 mL) do pH 1.0 sa sumpornom kiselinom (9.0 M vodeni rastvor), i koncentrovati smešu do glave destilacionog suda sa kratkim putem. Smanjiti pritisak do 26.7 kPa i zagrevati smešu do 100 °C u trajanju od 1 h. Ohladiti smešu do sobne temperature, zatim ekstrahovati vodeni sloj sa TBME (2 3 75 mL). Isprati spojene organske faze sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(75 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (75 mL). Osušiti organsku fazu preko MgSO4, filtrirati I koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (634 mg, 51% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.73 (t, J = 1.0 Hz, 1H), 4.06 (d, J =1.0 Hz, 2H), 3.31 (tt, J = 9.2, 3.9 Hz, 1H), 1.95-1.89 (m, 2H), 1.79-1.68 (m, 2H), 1.57-1.50 (m, 1H), 1.39-1.20 (m, 5H).

Šema 6

Postupak 11

Sinteza metil (R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karboksilata.

[0043]

[0044] Šema 6, Korak A: Rastvoriti metil (R)-piperidin-2-karboksilat (5.00 g, 34.9 mmol) u DMF (87 mL) i tretirati sa K2CO3 (14.48 g, 104.8 mmol) i β-bromofenetolom (7.16 g, 34.9 mmol). Mešati smešu preko noći na 100 °C. Ohladiti smešu do sobne temperature i dodati EtOAc (250 mL). Isprati organsku fazu sa vodom (4 3 100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL). Osušiti organsku fazu preko K2CO3, filtrirati kako bi se uklonila čvrsta frakcija I koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom koako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku žutog ulja. Ovaj sirovi material prečistiti sa fleš hromatografijom na silica gelu uz eluiranje sa gradijentom od 20% do 100% EtOAc/heksan. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bezbojnog ulja od oko 90% čistoće po<1>H NMR analizama (6.50 g, 64% prinos). Maseni spektar(m/z) 264 (M H)+.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.27 (dd, J = 8.5, 7.3 Hz, 2H), 6.93 (t, J = 7.3Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.10 (app t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.29 (dd, J = 8.4, 4.0 Hz, 1H), 3.14 (app dt,J = 11.3, 6.4 Hz, 1H), 2.95 (app dt, J = 13.7, 6.1 Hz, 1H), 2.89 (app dt, J = 13.7, 6.1 Hz, 1H), 2.42 (ddd, J = 11.6, 7.9,3.7 Hz, 1H), 1.90-1.82 (m, 1H), 1.79 (app td, J = 8.9, 3.8 Hz, 1H), 1.67-1.59 (m, 3H), 1.39 (app td, J = 8.8, 4.0 Hz, 1H).

Postupak 12

Sinteza hidrohlorida (R)-1-(2-fenoksietil)piperidin karboksilne kiseline.

[0045]

[0046] Šema 6, Korak B: Na sobnoj temperaturi, rastvoriti metil (R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karboksilat (6.50 g, 22.2 mmol) u THF (11.1 mL) i dodati NaOH (5 M vodeni rastvor, 8.89 mL, 44.4 mmol) i zagrevati do 65 °C preko noći uz mešanje. Dodati hlorovodonik (5 M vodeni rastvor) dok pH vodene faze ne dostigne 1.0. Isprati vodenu fazu sa CH2Cl2(33 75 mL). Koncentrovati vodenu fazu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila bela čvrsta supstanca. Tretirati čvrstu supstancu sa EtOH (50 mL), filtrirati kao bi se uklonile suspendovane soli, koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (5.17 g, 81% prinos). Maseni spektar(m/z) 250 (M H)+.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.31 (dd, J = 8.8, 7.5 Hz, 2H), 7.02-6.97 (m, 3H), 4.47 (AB-kuplovan ddd, J = 11.5, 7.1,3.0 Hz, 1H), 4.38 (AB-kuplovan ddd, J = 11.8, 6.3, 3.1 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 11.2, 2.8 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 12.2 Hz, 1H),3.73-3.68 (m, 2H), 3.29 (app td, J = 13.2, 3.8 Hz, 1H), 2.35 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 2.00-1.80 (m, 4H), 1.68 (app t, J = 13.1Hz, 1H).

Šema 7

Postupak 13

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzoat.

[0047]

[0048] Šema 7, Korak A: Rastvoriti hidrohlorid (R)-1-(2-fenoksietil)piperidin karboksilne kiseline (750 mg, 2.62 mmol) i metil (S)-4-(1-aminoetil)benzoat hidrohlorid (566 mg, 2.62 mmol) u DMF (5.25 mL) na sobnoj temperaturi. Dodati trietilamin (1.65 mL, 11.81 mmol), zatim BOP (1.51 g, 3.41 mmol). Mešati smešu na sobnoj temperature tri sata, zatim razblažiti sa EtOAc (25 mL). Isprati smešu sa zasićenim vodenim rastvorom LiCl (2 3 25 mL). Osušiti organski sloj preko MgSO4, filtrirati kako bi se uklonile čvrste supstance i koncentrovati pod smanjenim pritiskom. Podvrgnuti rezultujuće žutooranž ulje sa fleš hromatografijom na silika gelu, eluirajući sa gradijentom od 0% do 100% EtOAc/heksan. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni roizvod pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (930 mg, 86% prinos). Maseni spektar(m/z) 411 (M H)+.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 8.8, 7.4 Hz, 2H), 6.89 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 6.85 (dd, J = 8.8, 1.0 Hz, 2H), 4.96 (app pentet, J = 7.2 Hz, 1H), 4.05-3.98 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.11 (app dt, J = 11.4, 3.7 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 7.2, 2.8 Hz, 1H), 2.77 (app q, J = 6.8 Hz, 1H), 2.50 (app dt, J = 11.2, 6.8 Hz, 1H), 2.15 (app td, J = 11.6, 2.8 Hz, 1H), 1.68-1.61 (m, 2H), 1.59-1.40 (m, 3H), 1.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.27-1.18 (m, 1H).

[0049] Pripremiti sledeća jedinjenja bazično po metodi iz Postupka 13, upotrebom odgovarajuće amonijum soli umesto metil (S)-4-(1-aminoetil)benzoat hidrohlorida:

Šema 8

Postupak 17

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoksikarbonil-2- karbonil]amino]etil]benzoata.

[0050]

[0051] Šema 8, Korak A: U 0 °C smeši od (R)-N-terc-butoksikarbonilpipekolinska kiselina (20.0 g, 87.2 mmol) i CH2Cl2 (400 mL), dodati trietilamin (13.4 mL, 96.0 mmol). Zatim dodati izobutil hloroformijata (12.5 mL, 96.0 mmol) u kapima i mešati 20 minuta. Dodati metil 4-[(S)-aminoetil]benzoat (17.2 g, 96.0 mmol), zatim ostaviti smešu da se zazagreje do sobne temperature i mešati jedan sat. Dodati vodu (300 mL), zatim odvojiti slojeve i isprati organski sloj sa 1 M vodenim rastvorom KHSO4 (200 mL), praćeno sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (200 mL). Odvojiti organski sloj i sušiti preko MgSO4, zatim filtrirati kako bi se uklonile čvrste supstance I koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bezbojnog ulja (34.0 g, 100% prinos). Maseni spektar(m/z) 291 (M - Boc 2H)+, 413 (M Na)+.

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.14 (app pentet, J = 7.1 Hz, 1H), 4.72 (br s, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.40 (dd, J = 6.2, 5.8 Hz, 1H), 2.63 (app td, J = 6.9, 2.4 Hz, 1H), 2.25 (br s, 1H), 1.75 (app tq, J=13.4, 6.7 Hz, 1H), 1.63-1.50 (m, 3H), 1.47 (s, 9H), 1.38 (app t, J = 5.6 Hz, 1H), 0.91 (d, J = 6.6 Hz, 3H).

Postupak 18

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzoata

[0052]

[0053] Šema 8, Korak B: U 0 °C smešu od EtOAc (136 mL) i EtOH (55.8 mL), dodati acetil hlorida (62.0 mL, 871 mmol) kap po kap, zatim ostaviti smešu da se zagreje do sobne temperature u toku 30 minuta. Dodati rastvor metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoksi karbonil-2-karbonil]amino]etil]benzoat (34.0 g, 87.1 mmol) u EtOAc (136 mL), zatim mešati reakcionu smešu na sobnoj temperaturi u trajanju od jedan sat. Ekstrahovati smešu sa vodom (23 100 mL), zatim dodati 32% vodeni rastvor amonijaka u spojene vodene faze do dostizanja pH od 10. Ekstrahovati smešu sa TBME (23 200 mL), zatim sušiti spojene organske faze preko MgSO4, filtrirati kako bi se uklonile čvrste supstance i koncentrovati filtrat pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (20.2 g, 80% prinos). Maseni spektar (m/z) 291 (M H)+, 581 (2M H)+.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.15 (br d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.14 (app pentet, J = 7.4 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.23 (dd, J = 9.9, 3.3 Hz, 1H), 3.01 (app dt, J = 11.8, 3.5 Hz, 1H), 2.68 (ddd, J = 12.1, 10.7, 3.0 Hz, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.61-1.52 (m, 1H), 1.48 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.43-1.34 (m, 2H).

Postupak 19

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzoata.

[0054]

[0055] Šema 8, Korak C: U suspenziju silica gela (100 g) u CH2Cl2 (705 mL) na sobnoj temperaturi, dodati rastvor NaIO4 (35.0 g, 161.9 mmol) u vodi (235 mL) kap po kap. Mešati smešu u trajanju od 30 minuta, zatim dodati 1,2-dihidroksi-3-fenoksipropan (21.5 g, 121.4 mmol), i mešati još 30 minuta. Filtrirati smešu kako bi se uklonila čvrsta materija, i izdvojiti slojeve filtrata. Osušiti organski sloj na MgSO4, i filtrirati kako bi se uklonila čvrsta materija. U filtrate dodati metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzoat (23.5 g, 80.9 mmol), praćeno sa natrijum triacetoksiborohidridom (35.7 g, 161.9 mmol) u malim porcijama. Mešati u trajanju od jednog sata na sobnoj temperaturi, zatim dodati 32% vodeni rastvor amonijaka do postizanja pH od 10. Odvojiti slojeve, osušiti organsku fazu preko MgSO4. Filtrirati kako bi se uklonila čvrsta supstanca, zatim koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobio sirovi materijal. Rastvoriti material u EtOAc (300 mL) i filtrirati kroz podlogu od silika gela (30 g). Koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo 36 g materijala. Dodati TBME (180 mL) i zagrevati do 50 °C. Održavajući temperature na 50 °C, dodati heksan (360 mL) u roku od 15 minuta, zatim mešati jedan sat. Ostaviti smešu da se hladi do sobne temperature, zatim izolovati čvrstu materiju filtriranjem i sušiti pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (16.7 g, 50%

prinos).

Šema 9

Postupak 20

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzoat hidrohlorida.

[0056]

[0057] Šema 9, Korak A: Tretirati metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-1-terc-butoksikarbonil-2-karbonil]amino]etil]benzoat (7.80 g, 19.98 mmol) sa hlorovodoničnom kiselinom (4 M rastvor u 1,4-dioksanu, 25.0 mL, 99.9 mmol) i mešati dobijenu smešu na sobnoj temperature 1 sat. Koncentrovati smešu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (6.0 g, 92% prinos). Maseni spektar(m/z) 291 (M H)+, 581 (2M H)+, 603 (2M Na)+.

Postupak 21

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-(4-fluorofenoksi)etil)piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzoata.

[0059] Šema 9, Korak B: Mešati smešu od 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzoat hidrohlorida (650 mg, 1.99 mmol) i 2-(4-fluorofenoksi)acetaldehida (337 mg, 2.19 mmol) u DCE (9.9 mL) na sobnoj temperature u trajanju od 30 min. Dodati sirćetne kiseline (0.113 mL, 1.99 mmol) i natrijum triacetoksiborohidrida (590 mg, 2.78 mmol) i mešati na sobnoj temperature tri dana. Ugasiti reakciju sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 (25 mL) i ekstrahovati vodeni sloj sa EtOAc (2 3 25 mL). Isprati spojene organske faze sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (25 mL), zatim osušiti organsku fazu na MgSO4, filtrirati i koncentrovati pod smanjenim pritiskom. Dobijeno ulje podvrgnuti fleš hromatografiji na silica gelu uz eluiranje sa gradijentom od 0% do 100% EtOAc/heksan . Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bele čvrste supstance (600 mg, 70% prinos). Maseni spektar (m/z) 429 (M H)+, 451 (M Na)+.

[0060] Pripremiti sledeća jedinjenja na osnovu metoda iz Postupak 21, upotrebom odgovarajućih aldehida umesto 2-(4-fluorofenoksi)acetaldehida:

Šema 10

Postupak 25

Sinteza metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-meti1-2-fenoksietil)piperidinium-2-karbonil]amino]etil]benzoat trifluoroacetata.

[0061]

[0062] Šema 10, Korak A: Mešati smešu od metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzoat hidrohlorida (150 mg, 0.46 mmol), 1-fenoksi-2-propanona (69 mL, 0.50 mmol), DCE (2.3 mL), sirćetne kiseline (26 mL, 0.46 mmol), i natrijum triacetoksiborohidrida (136 mg, 0.64 mmol) na 65 °C u trajanju od dva dana. Prekinuti reakciju sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 (75 mL) i ekstrahovati vodeni sloj sa EtOAc (75 mL). Osušiti organsku fazu preko Na2SO4, filtrirati i koncentrovati pod smanjenim pritiskom. Podvrgnuti sirovi material fazno-reverznoj hromatografiji na C18 silika gelu, eluirati sa 0.1% TFA u gradijentu od 5% do 50% ACN/voda. Koncentrovati frakcije koje sadrže željeni proizvod pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u obliku bledo žutog ulja u 2:1 smeši diastereoizomera (24 mg, 10% prinos). Maseni spektar(m/z) 425 (M H)<+>.

Šema 11

Primer 1

Sinteza hidrohlorida 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2- karbonil]amino]etil]benzenske kiseline.

[0063]

[0064] Šema 11, Korak A: Rastvoriti metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karbonil]amino]etil] benzoat (930 mg, 2.27 mmol) u THF (4.0 mL) i CH3OH (4.0 mL) na sobnoj temperaturi. Dodati NaOH (1 M vodeni rastvor, 4.5 mL, 4.5 mmol), zatim mešati dobijenu smešu na sobnoj temperature tri dana. Koncentrovati reakcionu smešu pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila gumasta materija. Dodati hlorovodonik (4 M rastvor u dioksanu, 2 mL, 8 mmol), i mešati snažno u trajanju od 10 minuta. Ukloniti suspendovane čestice filtriranjem i koncentrovati filtrate pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila bela čvrsta supstanca. Tretirati supstancu sa ključalim dietil etrom (25 mL), I izolovati suspendovane čestice filtriranjem kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (650 mg, 66% prinos) u obliku bele čvrste supstance. Maseni spektar(m/z): 397 (M H)+.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.89 (br s, 1H), 10.08 (br s, 1H), 9.41 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 8.4, 7.6 Hz, 2H), 6.96 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.02 (app pentet, J = 7.1 Hz, 1H), 4.34-4.21 (m, 2H), 4.03 (app t, J = 10.2 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.48-3.39 (m, 1H), 3.37-3.18 (m, 2H), 2.15 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 1.82-1.66 (m, 4H), 1.50-1.43 (m, 1H), 1.39 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

[0065] Pripremiti sledeća jedinjenja u osnovi prema metoama iz Primer 1, upotrebom odgovarajućim metil estara umesto metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(2-fenoksietil)piperidin-2-karbonil]amino]etil]benzoata:

Šema 12

Apsolutni Apsolutni

Primer 9

Sinteza trifluor acetata 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoksietil)piperidinium-2-karbonil]amino]etil]benzenske kiseline.

[0066]

Apsolutni

[0067] Šema 12, Korak A: Rastvoriti metil 4-[(1S)-1-[[(2R)-1-(1-metil-2-fenoksietil)piperidinium-2- karbonil]amino]etil]benzoat trifluoroacetat (24 mg, 0.045 mmol) u THF (226 mL) i tretirati smešu sa metanolom (226 mL) i natrijum hidroksidom (u vodenom rastvoru, 170 mL, 0.17 mmol). Mešati smešu preko noći na sobnoj temperature, zatim koncentrovati pod smanjenim pritiskom kako bi se dobila gumasta materija. Podvrgnuti material reverzno-faznoj hromatografiji na C18 silika gelu, eluirati sa 0.1% TFA u gradijentu od 5% do 50% ACN/voda kako bi se dobile dve odvojene frakcije, gde svaka sadrži odvojeni diastereozomerni proizvod. Koncentrovati svaku frakciju pod smanjenim pritiskom, rastvoriti svaku u minimalnoj količini metanola, tretirati svaku sa dietil etrom (5 mL), i koncentrovati svaku pod smanjenim pritiskom kako bi se dobili Izomer 1 (3.0 mg, 13% prinos) i Izomer 2 (1.1 mg, 5% prinos) jedinjenja iz naslova u obliku bele čvrste supstance.

Primer 9a: Glavni izomer (Izomer 1). Maseni spektar(m/z): 411 (M H)<+>.<1>H NMR (DMSO-d6) δ 9.75 (br s), 9.30 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.33-7.25 (m, 2H), 7.04-6.95 (m, 3H), 5.03 (app p, J = 6.8 Hz, 1H), 4.35-4.24 (m, 2H), 4.07 (dd, J = 12.1, 3.5 Hz, 1H), 3.74-3.65 (m, 1H), 3.52 (br d, J = 12.5 Hz, 1H), 3.11-2.99 (m, 1H), 2.15 (br d, J = 12.4 Hz, 1H), 1.89-1.71 (m, 4H), 1.52-1.45 (m, 1H), 1.40 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.33 (d, J = 6.8 Hz, 3H).

Primer 9b: Manjinski izomer (Izomer 2). Maseni spektar(m/z): 411 (M H)+.

[0068] Jasno je ljudima iz struke da HCl soli iz primera 1-9 se lako mgu pretvoriti u odgovarajuće slobodne baze upotrebom uslova dobro poznatim ljudima iz struke.

In Vitro vezivanje za humani EP1, EP2, EP3, i EP4

[0069] hEP1 i hEP4 membrane se dobijaju iz rekombinantnih HEK293 ćelija stabilno ekspresije humanog EP1 (Genbank accession number AY275470) ili EP4 (Genbank accession number AY429109) receptora. hEP2 i hEP3 membrane se dobijaju iz HEK293 ćelija tranzitno transfektovanih sa EP2 (Genbank accession number AY275471) ili EP3 (izoform VI: Genbank accession number AY429108) receptor plasmida. Zaleđene ćelijske palate se homogenizuju u homogenizacionom puferu uz upotrebu Teflon/stakleni homogenizator. Membrane proteina se razdele u alikvote i brzo zamrznu na suvom ledu pre skladištenja na -80 °C. Homogenizacioni puffer je sadržao 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM saharoze, 1 mM EDTA, 0.3 mM indometacina i plus Complete™, sa EDTA, dobijen od Roche Molecular Biochemicals (Kataloški broj: Number 1 697 498).

[0070] Kd vrednosti za [3H]-PGE2 vezivanje za svaki receptor su determinisane studijama zasićenja vezivanja ili homologe kompeticije. Jedinjenja su testirana na 96-udubljenja format uz upotrebu trostrukok razblaživanja kako bi se dobila kriva od 10-tačaka. Razblažena jedinjenja se inkubiraju sa 20 µg/udubljenje EP1, 10 µg/udubljenje EP2, 1 ug/udubljenje EP3 ili 10 do 20 mg/udubljenje EP4 membrana u trajanju od 90 minuta na 25 °C u prisustvu 0.3 do 0.5 nM [3H]PGE2 (PerkinElmer, 118 do 180 Ci/mmol). Vezujuća reakcija se odvija u 200 mL MES puferu (10 mM MES pH 6.0 sa KOH, 10 mM MgCl2 i 1 mM EDTA) uz upotrebu 0.5 mL polistirena 96-udubljenja dubokih-udubljenja pločice. Ne-specifično vezivanje se izračunava upoređivanjem vezivanja u prisustvu i u odsustvu 2 mM PGE2. Membrane se sakupljaju filtriranjem (TomTek harvester), ispiraju 4 puta sa hladnim puferom (10mM MES pH 6.0 sa KOH, 10 mM MgCl2), suše na 60 °C u sušnici i radioaktivnost se kvantifikuje kao odbroji u minuti (CPM) uz upotrebu TopCount detektora. Procenat specifičnog vezivanja se izračunava kao procenat vezivanja u odsustvu bilo kog drugog inhibitora, korigovan za vezivanje u prisustvu 2 µM PGE2. Podaci se analiziraju upotrebom 4-parametra nelinearnom logističkom jednačinom (ABazna Jednačina 205) kao što je prikazano: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))) gde, y = % specifične inhibicije, A = dno krive; B = vrh krive; C = relativno IC50 = koncentracija koja uzrokuje 50% inhibicije bazirano na nizu podataka od vrha do dna; D = zakrivljenje = zakrivljenje krive. Ki converzija od IC50 vrednosti (Ki = IC50/(1 [L]/Kd) gde [L] je koncentracija liganda). Jedinjenja iz Primera 1-9 ovde su testirana bazično kao što je opisano I pokazuju Ki vrednost za hEP4 manju od oko 1 µM. Tabela 1 : In Vitro vezivanje Primera 1 za humani EP1, EP2, EP3 i EP4

[0071] Još specifičnije, prateći procedure esencijalno kao što je prethodno opisano, podaci iz tabele 1 pokazuju da jedinjenje iz Primer 1 se vezuje za hEP4 na niskim nanomolarnim koncentracijama. Podaci iz tabele 1 takože pokazuju da se jedinjenje iz Primer 1 vezuje za hEP4 jače nego li za hEP1, hEP2, i hEP3 ukazujući na selektivnost za hEP4 receptor.

In Vitro humani EP4 funkcionalna antagonistička aktivnost

[0072] Probe su vršene u rekombinantnim HEK293 ćelijama stabilne ekspresije humanog EP4 receptora. Ćelijske linije su održavane kultivisanjem u DMEM sa visokom glukozom i piridoksin hidrohloridom (Invitrogen) obogaćenim sa 10% fetusnim goveđim serumom (FBS), 1 mM natrijum piruvatom, 10 mM HEPES, 500 mg/mL geneticinom i 2 mM L-glutaminom. Konfluentne kulture su uzgajane na 37 °C u atmosferi koja sadrži 5% CO2. Ćelije su sakupljene uz upotrebu 2.5% Tripsin-EDTA, suspendovane u ledenom medijumu (FBS sa 6% DMSO) na 10<7>ćelija/mL i alikvoti su čuvani u tečnom azotu. Neposredno pred testiranje, ćelije su odmrznute u DMEM, centrifugirane I resuspendovane u cAMP puferu.

[0073] Inhibicija PGE2-stimulisane cAMP proizvodnje od strane EP4 antagonista je merena upotrebom HTRF (Cisbio katalog # 62AM4PEB). Alikvot ekvivalentan broju od 4000 ćelija je inkubiran sa 50mL cAMP pufera iz testa koji sadrži PGE2u koncentraciji predeterminisanoj da proizvede EC80 (0.188nM PGE2 od Sigma, katalog # P5640-10mg) i EP4 antagonista na sobnoj temperature u trajanju od 20 minuta. cAMP test puffer sadrži 500 mL HBSS, 0.1 % BSA, 20 mM HEPES i 200 µM IBMX (Sigma 15879). CJ-042794 (4-{(1S)-1-[({5-hloro-2-[(4-fluorofenil)oksi]fenil}karbonil)amino] etil}benzenske kiseline) služi kao pozitivna kontrola. Da bi se izmerili nivoi cAMP, cAMP-d2 konjugat i anti cAMPkriptat konjugat u puferu liziranja su inkubirane tretirane ćelije na sobnoj temperature u trajanju od 1 sat. HTRF signal je detektovan upotrebom EnVision® čitača pločica (Perkin-Elmer) kako bi se izračunao stepen fluorescencije na 665 nm u odnosu na 620 nm. Sirovi podaci su konvertovani u cAMP količine (pmol/udubljenje) upotrebom cAMP standardne krive generiane za svaki eksperiment. Podaci su analizirani upotrebom 4-parameterske nelinearne logističke jednačine (ABazna Jednačina 205) kao što je prikazano: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))) gde, y = % specifične inhibicije, A = dno krive; B = vrh krive; C = relativno IC50 = koncentracija koja uzrokuje 50% inhibicije bazirano na nizu podataka od vrha do dna; D = zakrivljenje = zakrivljenje krive.

[0074] U skladu sa procedurama opisanim prethodno, jedinjenja iz iznetih Primera 1-9 testirana su kao što je opisano i pokazuju IC50 ili manji od oko 1 µM. Još specifičnije, prateći procedure kao što je opisano gore, Primer 1 ima IC50 od 6.96 2.5 nM (n=5) mereno na humanom EP4. Ovo pokazuje da jedinjenja iz Primera 1-9 su potentni antagonisti humanog EP4 in vitro.

In Vitro pacovski EP4 funkcionalna antagonistička aktivnost

[0075] Pacov EP4 cDNK (Genebank Accession# NM_03276) je kloniran u pcDNK 3.1 vektor i zatim transfektovan u HEK293 ćelije za receptor ekspresiju. Pacov Rat EP4 stabilni klon je uvećan i zatim zamrznut kao banka ćelija za buduća posmatranja jedinjenja. Da bi se testirao EP4 antagonist jedinjenja u rEP4 ćelijama, otopiti zamrznute ćelije i zatim resuspendovati ćelije u cAMP test puferu. Pufer cAMP se pravi od HBSS bez fenol crvene (Hyclone, SH30268) uz dodatak 20 mM HEPES (Hyclone, SH30237), 0.1% BSA (Gibco, 15260) i 125 µM IBMX (Sigma, 15879). Ćelije se stave na ploču sa 96-udubljenja sa pola površine od sa ravnim dnom polistirenskom crnom pločom (Costar 3694). Jedinjenja se serijski razblaže sa DMSO da bi se dobila kriva zavisnosti od koncentracije od 10-tačaka. Zatim razblažena jedinjenja dodati u cAMP test pufer koji sadrži PGE2 (Cayman 14010, u koncentraciji koja je predeterminisana da proizvede EC80) u odnosu DMSO/pufer od 1/100. Ćelije se tretiraju sa jedinjenjima u prisustvu PGE2 (EC80 koncentracija) u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nivoi cAMP generisani od strane ćelija su kvantifikovani pomoću cAMP HTRF test kita (Cisbio 62AM4PEC). Ploče se očitavaju na EnVision čitaču ploča uz upotrebu HTRF optimiziranog protokola (PerkinElmer). IC50 se izračunate uz upotrebu Graphpad Prism (v. 4) nelinearne regresije, sigmoidalni odgovor doze fitovanjem krive.

[0076] U skladu sa procedurama opisanim prethodno, jedinjenja iz iznetih Primera 1-9 testirana su kao što je opisano i pokazuju IC50 ili manji od oko 1 µM. Još specifičnije, prateći procedure kao što je opisano gore, Primer 1 ima IC50 od 15 nM mereno na pacovskom EP4. Ovo pokazuje da jedinjenja iz Primera 1-9 su potentni antagonisti pacovskog EP4 in vitro.

Tabela 1: In vitro vezivanje Primer 1 za humani EP1, EP2, EP3 i EP4

Test Jedinjenje hEP1, Ki (nM) hEP2, Ki (nM) hEP3, Ki (nM) hEP4, Ki (nM)

Primer 1 >175001550 6 1860 (n=3) >1400054 6 27 (n=7)

In Vitro antagonist aaktivnost u humanoj celokupnoj krvi

[0077] Inhibitorni efekti PGE2 na LPS-indukovanom TNFα proizvodnjom iz mikrofaga/monocita veruje se da su posredovani od strane EP4 receptora (Videti Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)). Sposobnost jedinjenja iz Primer 1 da preokrene inhibitorsku aktivnost PGF2 na LPS-indukovanu TNFα proizvodnju u humanoj celokupnoj krvi je jedna od indikacija funkcionalne aktivnosti.

[0078] Krv se sakuplja od normalnih volontera donora u natrijum heparim vakutejner epruvetama. Donori nisu uzimali NSAID-ove ili celecoxib u toku 48 sati ili glukokortikosteroide dve nedelje pre davanja krvi. Sve epruveta/donor su stavljene u 50 mL Falcon conične tube za centrifugu i 98 mL/udubljenje je raspoređeno u 96-otvora kulture tkiva ploče (Falcon 3072). Jedinjenja su razblažena u DMSO do 100 X finalno i 1 µL/udubljenje u triplikatu je dodato u krv kako bi se dobile krive odgovora od 7-tačaka. Krv je prethodno tretirana sa jedinjenjima na 37 °C, u 5% CO2 vlažnoj atmosferi, u trajanju od 30 minuta, nakon čega je dodato 1 µL/udubljenju rastvora od 1 mg/mL lipopolisaharida (LPS) (Sigma 0111:B4) u 0.2 mg/mL goveđeg albuminskog seruma (BSA)/PBS sa i bez 1 mM PGE2 (Cayman 14010) kako bi se dobila finalna LPS koncentracija od 10 mg/mL sa i bez 10 nM PGE2. Ploče su inkubirane 20-24 sati na 37 °C u 5% CO2, vlažnoj atmosferi. Ploče su centrifugirane na 1800 x g u trajanju od 10 minuta na 22 °C, u Eppendorf 5810R centrifugi. Plazma je uklonjena iz ćelijskog sloja i premeštena u v-dno polipropilenske ploče. TNFα nivoi u 2 mL plazmi su kvantifikovani pomoću komercijalno dostupnog enzimskog imunotesta (R&D Systems DY210), uz upotrebu Immulon 4 HBX ploča (Thermo 3855) i 3,3’,5,5’ tetrametilbifenil-4,4’-diamin substrata (KPL 50-76-03). Ploče su očitavane na A450-A650 na čitaču ploča (Molecular Devices Versamax) upotrebom SOFTmaxPRO (v.4.3.1) softvera. IC50 su preračunati uz pomoć Graphpad Prism (v. 4) nonlinearne regresije, sa sigmoidalnim odgovor doze fitovanjem krive. Rezultati su izraženi kao geometrijska sredina ± standardna deviajacija; n = broj nezavisnih meranja.

[0079] U skladu sa procedurama opisanim prethodno, jedinjenja iz iznetih Primera 1-9 testirana su kao što je opisano i pokazuju IC50 ili manji od oko 1 µM. Još specifičnije, prateći procedure kao što je opisano gore, Primer 1 ima IC50 od 123 ± 88 nM mereno na pacovskom EP4. Ovo pokazuje da jedinjenja iz Primera 1-9 su potentni antagonisti EP4 u humanoj krvi TNFα testu indukcije.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

R1 je H, -CN, ili F; R2 je H ili metil; R3 je H; i R4 je H, metil, ili etil; ili R3 i R4 zajedno formiraju ciklopropil prsten; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1 gde R<2>je H.
3. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1 ili zahtevom 2 gde R<3>je H i R<4>je metil.
4. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 3 gde X je:
5. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1 koje je:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 6. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 5 koje je:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 7. Hidrohlorid so jedinjenja u skladu sa zahtevom 6 koja je:
8. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa zahtevima 1 do 7 za upotrebu u terapiji.
9. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa zahtevima 1 do 7 za upotrebu u lečenju osteoartritisa.
10. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa zahtevima 1 do 7 za upotrebu u lečenju reumatoidnog artritisa.
11. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa zahtevima 1 do 7 za upotrebu u lečenju bola povezanog sa osteoartritisom i reumatoidnim artritisom.
12. Farmaceutski oblik koji sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u skladu sa zahtevima 1 do 7 u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.
13. Farmaceutski oblik u skladu sa zahtevom 12, koji još sadrži jedan ili više drugih terapeutskih agenasa. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5