RS55031B1 - Molekuli antitela koji vezuju interleukine il-17a i il-17f - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela specifičnih antigenskih determinanti za oba interleukina, IL-17A i IL-17F. Predmetni pronalazak se odnosi i na terapeutske upotrebe motekula antitela i na metode kojma se dobij aj u.

[0002] Interleukin 17 (IL-17), takođe poznat kao CTLA-8 ili IL-17A, je proinflamatomi citokin koji podstiče lučenje širokog spektra drugih citokina iz različitih ćelija koje nisu imune. 1L-17A je sposoban da izazove lučenje IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 i G-CSF priraslih ćelija kao što su fibroblaste, keratinocite, epitelne i endotelne ćelije. IL-17A je sposoban i da izazove površinsku ekspresiju ICAM-1, poliferaciju T ćelija, rast i diferencijaciju C034+ humanog progena u neutrofilima kada su ćelije kokultivisane u prisustvu ozračenih fibroblasta (Fossiez i dr.,1998, Int.Rev.lmmunol. 16, 541-551). IL-17A pretežno generiše (proizvodi) T ćelije aktivne memorije i deluje vezivanjem za površinski, svestrano rasporedjen, receptor ćelije (IL-17R) (Yao i dr., 1997, Cytokine, 9, 794-800). Takodje može da deluje kroz vezivanje sa kompleksom IL-17RA i IL-17RC (Toy i dr., 2006, J. Immunol. 177(11); 36-39). IL-17 proizvodi Tćelije koje se zovu TH17 ćelije' koje su uključene je u patogenezu odredjenih kancera (Weaver i dr., 2006, lmmunlty,24,677-688; Langowski i dr. J., 2006, 442, 461-465; lwakura i Ishigame, 2006, Clin.lnvest. 116, 5, 1218-1222).

[0003] Odredjeni broj homologa IL-17 identifikovan je i u sličnim i različitim ulogama regulisanja zapaljenskih reakcija. Za pregled porodice IL-17 citokina/receptora pogledajte u Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents,13, 287-303. Jedan takav homolog je IL-17F, takođe poznat kao IL-24 i ML-1, koji je oko55%identičan sa IL-17A i smatra se da deli identične receptore sa IL-17A (Kolls i Lmden 2004, lmmunity, 21, 467-476; Hymowitz, idr, 2001, EMBO J. 20(19), 5332-5341; Kuestner i dr, 2007, Journal of lmmunology, 179, 5462-5473).

[0004] Oba interleukina, IL-17Ai IL 17F, mogu da formiraju i homodimerne i heterodimeme proteine, sve one koji su proizvedeni od strane aktivnih humanih CD4+ T ćelija (Wright idr, 2007, J Biol Chem.282 (18), 13447-13455).

[0005] IL-17 može doprineti u posredovanju kod brojnih bolesti koje se iskazuju kroz abnormalni imuni odgovor, kao što su reumatoidni artritis i zapaljenja disajnih puteva, kao i odbacivanje organa pri transplantaciji i kod antitumornog imuniteta. Inhibitori aktivnosti IL-17 su dobro poznati u struci na primeru murine (mišjeg) IL-17R; humani Fc fuzioni protein, rastvorljivi mišji IL-17R i anti-IL-17 monoklonalna antitela (klonovi jedne imunske ćelije) korisna pri demonstraciji (prikazivanju) uloge IL-17 u različitim modelima reumatoidnog artritisa (Lubberts idr, J.Immunol. 2001,167,1004-1013; Chabaud idr., Arthritis Res.2001,3,168-177). Dodatno, neutralisanje poliklonalnih antitela (klonovi formirani iz nekoliko različitih imunskih ćelija) koristi se pri smanjenju peritonealnog formiranja adhezija (Chung idr, 2002, J. Exp. Med.,195, sa1471-1478). izvedena iz pacova anti-humana IL-17 antitela kao što je opisano u V/004/106377. Humanizovana anti-IL-17 antitela sa sklonošću od oko 220 pM kao što je opisano u VVO2006/054059. Monoklona anti-IL-17 u potpunosti humana antitela sa sklonošću od oko 188 pM Što je opisano u VVO2006/013107. Antitela koja vezuju IL-17F i IL-17A/IL-17F heterođimere, opisana u WO2006/088833. Antitela koja se posebno vezuju za IL-17A/IL-17F heterodimer, što je opisano u WO2005/010044.

[0006] IL-17F antagonist je povezan sa zaštitom protiv astme (Kawaguchi idr, 2006, J.Allergy Clin. Immunol. 117(4); 795-801). Za IL-17F se takođe smatra da ima ulogu u patologiji artritisa (Lubberts 2003, Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (5), 572-577).

[0007] Prema tome, i dva antagonista IL-17A i IL 17F mogu biti mnogo efikasnija nego samo jedan u tretiranju IL-17 posredovanih bolesti. Antitela koja vezuju IL-17A i IL-17F opisana su u VVO2007/106769 objavljenim 20.9.07. Poliklonska antitela kože IgG za humani IL-17 su dostupna iz REtD Systems, kataloški broj: AF-317-NA.

[O0O8] u mogućnosti smo da pokažemo da je moguće izolovati antitiela koja su sposobna da vežu i IL-17A i IL-17F i koja su sposobna da neutrališu delovanje oba izoforma IL-17. Otuda predmetni pronalazak daje antitela anti-IL-17, koja su sposobna za vezivanje sa IL-17A i IL- 17F. Preciznije, obezbedjeno je neutrališuce antitelo koje vezuje humani IL-17Ai humani IL-17F, uključujući teški lanac i laki lanac . Pri čemu teški lanac domena varijable sadrži sekvence u SEQ ID NO: 9 a laki lanac domena varijable sadrži sekvence u SEQ ID NO: 7 ili sekvence barem 95% identične predhodnoj i u kojima antitelo ima afinitet ka IL-17A bolje od 20pM i ima afinitet ka IL-17F bolje od 2nM.

[0009] Naročito, antitelo predmetnog pronalaska je sposobno za specifično vezivanje sa oba interleukina IL-17A i IL-17F, odnosno antitelo nije u vezi sa drugim izoformama IL-17. Po mogućstvu, antitelo predmetnog pronalaska vezuje se sa IL-17A/IL-17F heterodimerima. Po mogućstvu, antitelo predmetnog pronalaka neutralizuje aktivnosti oba IL-17AIIL-17F. U nekim slučajevima antitelo predmetnog pronalaska neutralizuje aktivnosti heterodimera IL-17A/IL-17F. Antitela predmetnog pronalaska zbog toga imaju povoljna svojstva kojima mogu inhibirati biološku aktivnost IL-17Ai IL-17F. Shodno tome, predmetni pronalazak takođe pruža upotrebu takvih antitela u lečenju i/ili profilaksi bolesti posredstvom jednog ili oba IL-17A ili IL-17F kao što su autoimune ili zapaljenske bolesti ili kancer.

[0010] Kao što se u ovom dokumentu koristi, termin neutrališuce antitelo'. opisuje antitela koja su sposobna da neutrališu signale biološke aktivnosti IL-17A i IL17F blokiranjem na primer vezivanja IL-17Ai IL 17F za jedan ili više njihovih receptora i blokiranjem vezivanja jednog ili više svojih receptora na IL-17A/IL-17F heterodimer. Stoga se i podrazumeva da se termin 'neutralisanje' u smislu koji se koristi u ovom dokumentu, odnosi na smanjenje signala bioloških aktivnosti koje može da bude delimično ili kompletno. Dalje, podrazumeva se da obim neutralizacije aktivnosti IL-17A i IL-17F antitelima može biti isti ili različit. U jednoj istanci obim neutralizacije aktivnosti za IL-17A/IL-17F heterodimera može biti isti ili različitkao i obim neutralizacije IL-17A ili IL-17F aktivnosti. [0011) U jednoj istanci antitela predmetnog pronalaska se posebno vezuju za IL-17A i IL-17F. Konkretno vezivanje znači da antitela imaju veći afinitet za IL-17Ai IL-17F polipeptide (uključujući i IL-17A/IL-17F heterodimer) nego za druge polipeptide. Po mogućstvu IL 17A i IL -17F polipeptidi su ljudski. U jednoj instanci antitelo takodje vezuje cinomolgus (makaki majmuna) IL-17F.

[0012] IL 17A ili IL-17F polipeptidi ili njihova smeša ili ćelije koje ispoljavaju jedan ili oba pomenuta polipeptida mogu se koristiti za proizvodnju antitela koja izričito prepoznaju oba polipeptida. IL-17 polipeptidi (IL-17A i IL- 17F) mogu biti 'zreli' polipeptidi ili biološki aktivni fragmenti ili njihovi derivati koji, po mogućstvu, uključuju receptore lokacije vezivanja. Po mogućstvu, IL-17 polipeptidi su zreli polipeptidi. IL-17 polipeptidi mogubiti pripremljeni procesima koji su stručno poznati iz genetskog inženjeringa ćelije domaćina koji su sistemski izraženi ili mogu biti pronadjeni u prirodnim biološkim izvorima. U prisutanoj aplikaciji, termin polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. Oni se koriste sa istim značenjem, osim ako je drugačije navedeno. Polipeptid IL-17 može u nekim slučajevima biti deo većeg proteina kao što je npr. fuzioni protein spojen za marker afiniteta. Antitela generisana protiv ovih polipeptida mogu biti dobijena, gde je neophodna imunizacija životinje, davanjem polipeptida životinji, poželjno nehumanoj životinji, koristeći dobro poznate rutinske protokole, videti za primer Handbook of Experimental Immunologv, D.M. Weir (ed.), Vol 4, Blackvvell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, kao što su zec, miš, pacov, ovca, krava ili svinja mogu biti imunizovani, pri čemu su miš, zec ili pacov obično preferirani.

[0013] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju sva antitela i funkcionalno aktivne fragmente

(delove) ili njihove derivate i mogu biti, ali ne ograničavajući se na, monoklona, multi-valentna, multi-specifična, humanizovana ili himerna antitela i antitela domaćina npr. VH, VL, VHH, jedan lanac antitela, Fab fragmenti, Fab' i F(ab'); fragmenti i epitope-veze fragmenata svake od navedenih. Ostali fragmenti antitela uključuju one opisane u međunarodnim patentima WO2005003169, WO2O05OO317O i WO2005003171. Fragmenti antitela i metode njihovog dobijanja dobro su poznati u struci, pogledati na primer Verma et Al, 1998, Journal of Immunological Methods,2lć, 165-181; Adair i Lavvson, 2005. Therapeutic antibodies. Drug Design Reviews - Online 2 (3): 209-217.

[0014] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju imunoglobulin molekule i imunološki aktivne porcije(delove) molekula tmunoglobulina, odnosno molekula koje sadrže lokaciju vezivanja antigena koji posebno vezuje jedan antigen, Imunoglobulin molekuli pronalaska mogu biti bilo koje klase (na primer, IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) ili podklase imunoglobulin molekula.

[0015] Monoklona antitela mogu biti pripremljena bilo kojom od metoda poznatih u struci kao što je hibridoma tehnika (Koler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), tnoma tehnika, ljudska Bćelija hibridoma tehnika (Kozbor i dr, 1983, lmmunology Todav, 4:72) i tehnikom EBV-hibridoma (Cole i dr,Monoclonal Antibodies i Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Lis, Inc., 1985).

[0016] Antitela za upotrebu u ovom pronalasku takođe mogu biti generisana upotrebom jednog antitela limfocita metodom kloniranja i izražavajući regiju varijable imunoglobutina cDNK-a generisanog iz jednog limfocita izabranog za proizvodnju određenog antitela, na primer metodom opisanom u Babcook, J.i dr, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; VVO2004/051268 i International Patent Application number WO2O04/106377.

[0017] Humanizovana antitela su molekuli antitela iz ne-himanih vrsta koja imaju jedan ili više regija za determinisanje komplementarnosti (CDR-ova) iz ne-humanih vrsta i okvirni region iz humanog imunoglobulin molekula (pogledati za primer US 5,585,089: WO91/09967).

[0018] Himerna antitela su ona antitela kodirana imunoglobulin genima i koja su genetski modifikovana tako da su i laki i teški lanac gena sastavljeni od segmenata gena imunoglobulina koji pripadaju različitim vrstama. Ova himerna antitela su u biti manje antigenska. Bivalentna antitela mogu se proizvesti metodama poznatim u struci (Milstein i dr, 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker idr,1991, EM80J.10:3655-3659). Viševalentna antitela mogu da sadrže višestruke specifičnosti ili mogu biti monospecifične (pogledati za primer WO 92/22853 i W005/113605).

[0019] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu takodje biti generisana korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatim u struci i uključujući i one otkrivene od strane Brinkman idr. (u J. Immunol. Methods, 1995, 132: 41-50), Ames idr. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough idr. (L"ur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic idr. (Gene, 1997 187 9-18), Surton iđr.(Advanced in lmmunology, 1994, 57:191-280) i WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225: 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108. Tehnike za proizvodnju jednog lanca antitela, kao što je opisano u US 4.946,778 mogu takodje biti prilagođene da proizvode jedan lanac antitela, koja se vezuje za IL-17A i IL 17F. Takođe, transgeni miš ili drugi organizmi, uključujući i druge sisare, mogu biti upotrebljeni da bi se izrazila humanizovana antitela.

[0020] Ostatak u domenu varijable antitela je konvencionalno numerisan prema sistemu osmišljenom od Kabat i dr. Ovaj sistem je naveden u Kabat idr,, 1987, u Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (ovde posle "Kabat idr. (gorenavedeno)"). Ovaj numerički sistem je upotrebljivan ovde u navedenim specifikacijama osim ako nije drugačije naznačeno.

[0021] Ka ba to v ostatak nije uvek podudaran direktno sa linearnim numerisanjem za ostatak amino kiseline. Stvarna linearna sekvenca aminokiselina može sadržati manje ili više aminokiseline nego što je po strogom Kabat numerisanju, kao odgovarajućim skraćivanjem ili umetanjem u strukturnu komponentu, da li u okvir ili odgovarajući odredjeni region (CDR), u domenu osnovne promenljive strukture. Ispravan Kabat numerički ostatak može biti određen na dalom antitelu poravnanjem ostataka homologa u tom nizu antitela sa "Standardnim" Kabat numeričkim nizom.

[0022] CDR-ovi teški lanaci promenljivog domena nalaze se na ostacima 31-35 (CDR-H1), na ostacima 50-65 (CDR-H2) i ostacima 95-102 (CDR-H3) prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, prema Chothia-ovoj (Chothia, C. i Lesk, A.M. j. Mol. Biol.196, 901-917 (1987)), ekvivalentno) petlji u CDR-H1, proteže se od ostataka 26 do ostataka 32. Stoga CDR-H1', koji se koristi u ovom dokumentu, sastoji se od ostataka od 26 do 35, kao što je opisano kombinacijom Kabat numeričkog sistema i Chotrtia-nove topološke definicije petlje.

[0023] CDR-ovi laki lanci promenljivog domena nalaze se na ostacima 24-34 (CDR-L1), ostacima 50-56 (CDR-L2) i ostacima 89-97 (CDR-L3) prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0024] U jednoj instanci predmetni pronalazak obezbedjuje neutrališuće antitelo, specifično za humani IL-17A i humani IL-17F, obuhvatajući teški lanac, u kome se promenljivi domen teškog lanca sastoji se od sekvenca datih u SEQ ID N0:1 za CDR-H1, sekvenca datih u SEQ ID NO:2 za CDR-H2 i sekvenca datih u SEQ ID NO:3 za CDR-H3.

[0025] U drugoj instanci predmetni pronalazak obezbedjuje neutrališuće antitelo, specifično za humani IL-17A i humani IL-17F, obrazujući laki lanac, u kome se promenljivi domen sastoji od sekvenca datih u SEQ ID NO: 4 za CDR-L1, sekvenca datih u SEQ ID NO:5 za CDR-L2 i sekvenca datih u SEQ ID NO:6 za CDR-L3.

[0026] Antitela molekula predmetnog pronalaska obezbedjuju, po mogućstvu, komplementarni laki lanac, odnosno, ili komplementarni teški lanac.

[0027] Otuda se u jednoj instanci, antitela sastoje od teškog lanca, u kome se promenljivi domen teškog lanca sastoji se od sekvenca datih u SEOJD NO:1 za CDR-H1, sekvenca datih u SEOJD NO:2 za CDR-H2 i sekvenca datih u SEQ ID NO:3 za CDR-H3 i lakog lanca u kome se promenljivi domen lakog lanca sastoji se od sekvenca datih u SEQ ID NO:4 za CDR-L1 , sekvenca datih u SEQ ID NO:5 za CDR-L2 i sekvenca datih u SEQ ID NO:6 za CDR-L3.

[0028] Procenjeno je da jedna ili više aminokiselina mogu biti zamenjene kako bi se obezbedili CDR-ovi predmetnog pronalaska, pri čemu se beznačajno menjaju sposobnosti vezivanja antitela za IL-17Ai IL-17F i neutralizovanje aktivnosti IL-17A i IL-17F. Efekti zamene bilo koje aminokiseline za vezivanje i za neutralizaciju mogu biti ispitani od strane bilo kog stručnjaka u ovoj oblasti, na primer, pomoću metoda opisanih u ovom dokumentu. Shodno tome, predmetni pronalazak daje antitela koja čine CDR-ovi izabrani iz CDRH-1 (SEQ ID NO:1), CDRH-2 (SEQ ID NO:2), CDRH-3 (SEOJD NO:3), CDRL-1 (SEOJD N0:4), CDRL-2 (SEOJD NO:5) i CDRL-3 (SEOJD NO:6) u kojoj jedna ili više aminokiselina u jednom ili više CDR-ova mogu biti zamijenjeni sa drugom amlnoKiselinom. Takodje je procenjeno da dužina jednog ili više CDR-ova mogu beznačajno izmeniti sposobnosti vezivanja antitela sa IL-17A i IL-17F i neutralizovanje aktivnosti IL-17A i IL-17F.

[0029] U jednoj takvoj instanci, antitela predmetnog pronalaska sastoje se od teškog lanca, u kome se

promenljivost domena teškog lanca sastoji od tri CDR-a u kojima niz CDRH-1 ima najmanje 6056 identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 1, CDRH-2 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 2 i/ili CDRH-3 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 3. U drugoj instanci, antitela predmetnog pronalaska se sastoje od teškog lanaca, u kome se promenljivost domena teškog lanca sastoji od tri CDR-a u kojima niz CDRH-1 ima najmanje 70*. 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEOJD NO: 1, CDRH-2 ima najmanje 70%, SQ%, 90%, 95% ili9&%identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 2 i/ili CDRH-3 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 9S%ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 3.

[0030] "Identitet', kao što je gorenavedeno, označava da je u bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama, ostatak aminokiselina identičan između sekvenci. "Sličnosti", kao što je gorenavedeno, ukazuje na to da je u bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama, ostatak od aminokiselina sličnog tipa između sekvenci. Naprimer, leucin može biti zamena za izoleucin ili val:n. Ostale aminokiseline koje često mogu biti zamena za druge, i uključuju, ali nisu ograničene na: • fenilalanin,tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance); ■ lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance); - aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amid bočne lance); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor). Stepeni identiteta i sličnosti mogu se lako izračunati (Computational Motecular Biologv, Lesk, A.M., dr., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics i Genome Projects, Smith, D.W., itd., Acađemic Press, New York, 1993; Computer

Analvsis Of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., i Gnffin, H.G., itd., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Acađemic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., itd., M Stockton Press, New York, 1991).

[0031] U jednoj instanci antitelo obezbedjeno predmetnim pronalaskom je monoklono antitelo.

[0032] U jednoj instanci antitelo obezbedjeno predmetnim pronalaskom je himerno antitelo.

[0033] U jednoj instanci antitelo obezbedjeno predmetnim pronalaskom je molekul CDR-kalemljenog antitela sastavljen od jednog ili više CDR-ova koji su dati u SEQ_ ID brojeva: od 1 do 6. Kao što je u ovom dokumentu navedeno, termin molekul CDR-kalemljenog antitela' odnosi se na molekule antitela u kojima teški i/ili laki lanac sadrži jedan ili više CDR-ova (uključujući, ako želite, jedan ili više izmenjenih CDR-ova) od donatora antitela [na primeru murine monoklonog antitela) kalemljene na teške i/ili lake lance promenljivog okvirnog regiona za prihvatanje antitela (na primer. humana antitela). Za pregled, videti Vaughan i dr, Nature Biotechnologv, 16, 535-539, 1998. U jednoj instanci umesto da se celi CDR-ovi prebacuju, samo jedan ili više specifično određenih ostataka od bilo kog od gore u tekstu opisanih CDR-ova su preneseni u okvir humanog antitela (videti naprimer, Kashmiri i dr., 2005, Methods, 36, 25-34). u jednoj instanci samo specifično određeni ostaci jednog ili više gore opisanih CDR-ova su preneseni u okvir humanog antitela. U drugoj instanci samo specifično odredjeni ostaci za svaki od CDR-ova koji su gore opisani u tekstu, su preneseni u okvir humanog antitela.

[0034] Predviđeni okvirni region teškog lanca CDR-kalemljenog antitela predmetnog pronalaska izveden je iz humane subgrupe (podgrupe) VH3 sekvenci 1-3 3-07 zajedno sa JH4. Shodno tome, obezbeđeno je neutrališuće CDR-kalemljeno antitelo kog ćini najmanje jedan CDR ne-humanog donatora kom je okvirni region teškog lanca izveden iz humane podgrupe sekvence 1-3 3-07 zajedno sa JH4. Sekvenca humanog JH4je sljedeća: WGQGTLVTVSS (YFDY). Motiv YFDY je deo CDR-H3 i nije deo okvira 4(Ravetch, JV. i dr, 1981, Celt, 27, 583-591).

[0035] Predviđeni okvirni region lakog lanca CDR-kalemljenog antitela predmetnog pronalaska izveden je iz humane embrionske podgrupe VK1 sekvenci 2-1-(1) L4 zajedno sa JK1. Shodno tome, obezbedjeno je neutrališuće CDR-kalemljeno antitelo kog čini najmanje jedan CDR ne-humanog donatora kom je okvirni region lakog lanca izveden iz humane podgrupe sekvence VK1 2-1-(1)L4 zajedno sa JK1. JK1 sekvenca je sledeća: (WT)FGQGTKVEIK. Motiv WT je deoC0R-L3 inijedeo okvira 4(Hieter, PA., idr., 1982, J. Biol. Chem., 257. 1516-1522).

[0036] Takođe, u CDR-kalemljenim antitelima predmetnog pronalaska, okvirne regije ne moraju imati baš iste sekvence kao što su u antitelu primaoca. Na primer, neuobičajeni ostaci mogu biti promenjeni u ostatke učestalog pojavljivanja za tu klasu lanca primaoca ili tipa. Alternativno, izabrani ostaci u područjima okvirnog primaoca mogu biti promenjeni tako da oni odgovaraju ostatku nadjenom na istoj poziciji u antitelu donatora (pogledati Reichmann i dr., 1998, Nature, 332, 323-324). Takve promene trebalo bi držati na minimumu neophodnom za oporavak afiniteta donatorskog antitela. Protokol za izbor ostataka u okvirnim regijama primaoca koji će možda biti potrebno promeniti navedeno je u WO 91 /09967.

[0037] Najbolje je ako u molekulu CDR-kalemljenog antitela predmetnog pronalaska teški lanac primaoca ima humane VH3 sekvence 1-3 3-07 zajedno sa JH4, tada okvirni region teškog lanca primaoca čini, dodatno, pored jednog ili više CDR-ovog davaoca, i donatorski ostatak najmanje na poziciji 94 (prema Kabat i dr.,(gore)). Shodno tome, obezbedjeno je jedno CDR-kalemljeno antitelo, gde je ostatak najmanje na poziciji 94, promenljivog domena teškog lanca, donatorski ostatak.

[0038] Po mogućstvu, u molekulu CDR-kalemljenog antitela prema predmetnom pronalasku ako laki lanac ima humanu podgrupu VK1 sekvenci 2-1-(1) 14 zajedno sa JK1, onda nema donatorkog ostatka za prenos odnosno samo CDR-ovi se prenose. Shodno tome, obezbeđen je CDR-kalemljenog antitela u kom se prenose samo CDR-ovi u okviru donatora.

[0039] Donatorski ostaci su ostaci iz antitela donatora, odnosno antitela iz kojih su CDR-ovi prvobitno dobijeni.

[0040] U jednoj instanci, antitelo predmetnog pronalaska sastoji se od teškog lanca, u kome se promenljivi domen teškog lanca sastoji od sekvenca datih u SEQ ID NO:9 (gH9).

[0041] U jednoj instaci, antitelo predmetnog pronalaska sastoji se od lakog lanca, u kome se promenljivi domen lakog lanca sastoji od sekvenca datih u SEOJD N0:7 (gl_7).

[0042] U drugoj instanci, antitelo predmetnog pronalaska sastoji se od lakog lanca, u kome se promenljivi domen lakog lanca sastoji od sekvenca koje imaju najmanje 95% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ. ID NO:7.

[0043] U jednoj instanci, antitelo predmetnog pronalaska sastoji se od teškog lanca, u kome se promenljivi domenteškog lanca sastoji od sekvenca datih u SEQ_ ID NO:9 i laki lanac, u kome se promenljivi domen lakog lanca sastoji od sekvenca datih u SEQ ID NO:7.

[0044] U drugoj instanci predmetnog pronalaska, antitelo se sastoji od teškog lanca i lakog lanca, u kome se promenljivi domen teškog lanca sastoji od sekvenca datih u SEOJD NO:9 i promenljivi domen lakog lanca imajući sekvence najmanje95%identične ili slične u sekvencama datim u SEQ ID NO:7.

[0045] Kao što je opisano gore u ovom dokumentu, molekuli antitela predmetnog pronalaska mogu se sastojati od molekula antitela koja imaju punu dužinu teških i lakih lanaca ili njihove okvire, a kao što je u domenu antitela na primer VH, VL, VHH, Fab, izmenjeni Fab, Fab', F(ab');, Fv ili scFv odlomak.

[0046] Konstanta u domenu regiona molekula antitela predmetnog pronalasKa, ako je prisutna, može biti izabrana uzimanjem u obzir predložene funkcije molekula antitela, a posebno na efekat funkcije koja može biti potrebna. Na primer, konstanta u domenu regiona može biti humani IgA, IgD, IgE, ICT ili IgM domeni. Naročito, humani IgG konstantne regionalnog domena može biti upotrebljen, a naročito od lgG1 i lgG3 izotipa kada je molekul antitela namenjen terapeutskoj upotrebi i kada su efektori funkcije antitela potrebni. Alternativno, lgG2 i lgG4 izotipe se mogu upotrebiti kada molekularno antitelo služi u terapijske svrhe i kada efektori funkcije antitela nisu potrebni, na primer za jednostavno blokiranje aktivnosti IL-17. Na primer lgG4 molekula u kojem je serin na poziciji 241 promenjen u prolin kao što je opisano u Angal idr, Molecular immunologv. 1993, 30 (i),105-108 mogu koristiti. Posebno je odredjena lgG4 konstanta domena koja se sastoji od ove promene.

[0047] U jednoj instanci antitelo teškog lanca sastoji se od CH1 domena i antitelo lakog lanca sastoji se od CL domena, ili kapa ili lambda.

[0048] U željenoj instanci antitelo dobijeno predmetnim pronalaskom je neutrališuće antitelo koje ima posebnosti za humani IL-17A i humani IL 17F u kojem se konstanta regiona teškog lanca sastoji od humanog lgG4 konstante regiona u kojem je serin na poziciji 241 zamenjen prolinom kao što je opisano u Angal i dr, gore. Shodno tome, predmetni pronalazak daje antitela u kojima teški lanac obuhvata ili se sastoji od sekvenca datih u SEQ IO N0.15.

[0049] Po mogućstvu, antitelo se sastoji od teškog lanca, pri čemu se teški lanac sastoji od sekvenca koje imaju najmanje 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEQ ID NO: 15.

[0050] U jednoj instanci jedan molekul antitela prema predmetnom pronalasku sastoji se od lakog lanca koji čine sekvence date u SEQ ID N0:11.

[0051] Po mogućstvu, antitelo se sastoji od lakog lanca, u kome se laki lanac sastoji od sekvenca koje imaju najmanje 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencama datim u SEOJD NO:11.

[0052] U jednoj instanci predmetni pronalazak obezbedjuje antitela u kojima teški lanac obuhvata ili se sastoji od sekvenca datih u SEQ ID NO: 15 i laki lanac obuhvata ili se sastoji od sekvenca datih u SEQ ID NO: 11.

[0053] Takođe predmetni pronalazak obezbedjuje određeni region ili epitope humanog IL-17A i/ili određene regione ili epitope humanog IL-17F i/ili određene regione ili epitope humanog IL-17A/F heterodimera koji se vezuje za antitelo predmetnog pronalaska, a naročito za antitelo koje se sastoji od gH9 sekvence teškog lanca (SEQ ID NO:9) i gL7 sekvence lakog lanca (SEOJD N0:7).

[0054] Određeni region ili epitop humanog polipeptida IL-17A i određeni region ili epitop humanog polipeptida IL-17F i određeni region ili epitop humanog heterodimera IL-17A/F moguće je prepoznati pomoću odgovarajuće metode mapiranja epitopa poznale u struci u kombinaciji sa bilo kojim od antitela obezbedjenih predmetnim pronalaskom. Primeri takvih metoda uključuju i skrining peptida različitih dužina izvedenih iz IL-17A i IL-17F za vezivanje antitela predmetnog pronalaska sa najmanjim fragmentom(odlomkom). To je specifično vezivanje sa antitelom koje sadrži niz epitopa koje antitela prepoznaju. Peptidi IL-17 mogu biti proizvedeni sintetički ili proteolitičkim varenjem odgovarajućeg polipeptida IL-17. Peptide koje vezuju antitelo mogu se identifikovati (prepoznati) uz pomoć, na primer, analize masene spektrometrije. U drugom primeru, NMR spektroskopija može se upotrebiti za identifikaciju epitopa vezanih antitelom predmetnog pronalaska. Jednom prepoznat, epitopski fragment(odlomak) koji vezuje antitelo predmetnog pronalaska može se upotrebiti, ako odgovara, kao imunogen da bi dobili dodatno neutrališuće antitelo koja su vezuje na isti epitop.

[0055] Antitela koja unakrsnim blokiranjem povezuju antitela predmetnog pronalaska, posebno, antitelo koje se

sastoji od gH9 sekvence za teški lanac (SEQ ID NO:9) i gL7 sekvencu za laki lanac (SEQ_ ID N0:7), mogu se upotrebiti na sličan način u neutraltsanju IL-17A i IL-17F aktivnosti. Shodno tome, predmetno otkriće takođe omogućava neutrališuce antitelo koje vezuje humani IL-17A i humani IL-17F, koji unakrsno blokira vezivanje za bilo koji od antitela koja su gore opisana za humani IL-17A i/ili humani IL-17F i/ili humani heterodimer IL-17A/F i/ili unakrsno blokiranje vezivanja IL-17A i/ili IL-17F i/ili humanog IL-17A/F heterodimera za bilo koji od tih antitela. U jednoj instanci, takva antitela se vezuju za iste epitope kao antitela gore opisana u ovom dokumentu.

[0056] Unakrsno blokirana antitela mogu se indetifikovati upotrebom bilo koje stručno pogodne metode, na primer pomoću konkurentnih ELISA ili BlAcore gde vezivanje za unakrsno blokirana antitela humanog IL-17A i/ili humanog IL-17F sprečava vezivanje antitela predmetnog pronalaska, ili obrnuto.

[0057] U jednoj instanci obezbedjeno je neutrališuće antitelo koje se vezuje za humani IL-17A i humani IL-17F, koji unakrsnim blokiranjem vezuje antitela čiji teški lanac sadrži sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) i čiji laki lanac sadrži sekvencu gL7 (SEQ ID NO:7) za humani IL-17A i za humani IL-17F. U jednoj instanci unakrsno blokiranje antitela inhibira (sprečava) vezivanje antitela koja sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) za teški lanac i sekvencu gL7 (SEQ ID NO:7) za laki lanac, za IL-17A veći od 80%, po mogućstvu veći od 85%, još bolje po mogućstvu veći od 90%, i najbolje po mogućstvu veći od 95% i za IL-17F veći od 80% , po mogućstvu veći od 85%, još bolje po mogućstvu veći od 90%, i najbolje po mogućstvu veći od 95%.

[0058] U jednoj instanci obezbedjuje se neutrališuće antitelo koja se vezuje za humani IL-17A i humani IL-17F, koja unakrsnim blokiranjem vezuju antitela čiji se teški lanac sastoji od sekvence gH9 (SEQ ID NO:9) i čiji se laki lanac sastoji od sekvenci gL7 (SEOJD N0:7) za humani IL-i7Ai za humani IL-17F i za humani heterodimer IL-17A/F. U jednoj instanci unakrsno blokiranje antitela inhibira (sprečava) vezivanje antitela teškog lanca koja sadrže sekvencu gH9 (SEOJD NO:9) i lakog lanca koja sadrže sekvencu gL7 (SEQ ID N0:7) za IL-17A više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, i po mogućstvu više od 95% i za IL-17F više od 80% , po mogućstvu više od 85%, više od 90%, i po mogućstvu više od 95% i za IL-17A/F heterodimer za IL-17F više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, čak po mogućstvu i više od 95%.

[0059] U jednoj instanci obezbedjuje se neutrališuće antitelo koje se vezuje za humani IL-17AS humani IL-17F, koja unakrsnim blokiranjem vezuju antitela čiji se teški lanac sastoji od sekvence gH9 |SEQ_ ID NO:9) i ćiji se laki lanac sastoji od sekvence gL7 (SEQ ID NO:7) za humani IL-17A ili za humani IL-17F ili za humani IL-17A/F. U jednoj instanci unakrsnim blokiranjem antitela inhibira se vezivanje antitela koje sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ ID N0:7) lakog lanca za IL-17A ili IL-17F ili IL-17A/F više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, čak po mogućstvu i više od 95%.

[0060] Dodatna, altermativna mogućnost je da pored toga, neutrališuće antitelo može biti unakrsno blokirano vezivanjem za humani IL-17A i humani IL-17F od strane antitela koje sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) za teški lanac i sekvencu gL7 (SEQ ID NO:7) za laki lanac. To takodje obezbedjuje neutratisanje molekule antitela koja se vezuje za humani IL-17A i humani IL-17F i koji je unakrsno blokiran vezivanjem humanog IL-17A i humanog II-17F za antitela koja sadrže sekvencu gH9 (SEQ IO NO:9j teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ ID NO:7) lakog lanca, U jednoj instanci neutrališuće antitelo inhibira se vezivanjem za humani IL-17A i humani IL-17F od strane antitela koja sadrže sekvencu (SEQ ID N0:9) teškog lanca i sekvencu gL7 |SEQ ID NO:7) lakog lanca više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, čak po mogućstvu i više od 95%.

[0061] U drugoj instanci obezbeduje se molekul neutrališućeg antitela koji se vezuje za humani iL-17Ai humani IL-17F koji je unakrsno blokiran vezivanjem humanog IL-17A i humanog IL-17F i IL-17A/F heterodimera za antitela koja sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ_ ID NO:7) lakog lanca. U jednoj instanci neutrališuće antitelo inhibira se vezivanjem humanog IL-17AI humanog IL-17F i humanog heterodimera IL-17A/F od strane antitela koja sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ ID N0:7) lakog lanca više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, čak po mogućstvu i više od 95%.

[0062] Takode to posebno obezbedjuje molekul neutrališućeg antitela koji se vezuju za humani IL-17A i humani IL-17F koji je unakrsno blokiran vezivanjem humanog IL-17A ili humanog IL - 17F ili humanog IL-17A/F od strane antitela koja sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID NO:9) teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ ID N0:7) lakog lanca. U jednoj instanci neutrališuće antitelo inhibira se iz vezivanja humanog IL-17A ili humanog IL-17F ili humanog IL-17A/F od strane antitela koje sadrže sekvencu gH9 (SEQ ID MO:9) teškog lanca i sekvencu gL7 (SEQ ID N0:7) lakog lanca više od 80%, po mogućstvu više od 85%, po mogućstvu više od 90%, čak po mogućstvu više od 95%.

[0063] Molekuli antitela u svakom aspektu predmetnog pronalaska imaju po mogućstvu visoki afinitet vezivanja, po mogućstvu nanomolarni, čak i više po mogućstvu pikomolarni. Podrazumeva se da afiniteti vezivanja antitela predmetnog pronalaska za humani IL-17A mogu biti različiti od afiniteta vezivanja istih antitela za humani IL-17F j/ili za heterodimer IL-17A/F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet (sklonost) ka IL-17A koja je veća od njenog afiniteta za IL-17F U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet za IL-17A koji je veći najmanje 10 puta od njenog afiniteta vezivanja za IL-17F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet (sklonost) ka IL-17A koji je bar 50 puta veći od njenog afiniteta vezivanja za IL-17F. u jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet ka IL-17A koja je barem 100 puta veći od njegovih afiniteta vezivanja za IL-17F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afiniteta za IL-17F, koji je veći od njegovog afiniteta za IL-17A. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet ka IL-17A, isto kao što imaju afinitet i ka IL-17F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska su pikonnolarnog afiniteta za IL-17A i nanomolarnog afiniteta za IL-17F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju nanomolarni afinitet za IL-17F i pikomolarni afinitet za IL-17A. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska su nanomolarnog afiniteta za oba, i zalL-17A kao i za L-17F. U jednom primeru molekuli antitela predmetnog pronalaska su pikomolarnog afiniteta za oba i IL-17A i IL-17F.

[0064] Po mogućstvu molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za IL-17A bolji od 20pM. U jednoj instanci antitelo predmetnog pronalaska ima afinitet ka IL- *7A od<*>6pM.

[0065] Po mogućstvu molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za IL-17F bolji od 2 nM.

U jednoj instanci antitelo predmetnog pronalaska ima afinitet ka IL-17F od 1,75 nM.

[0066] Po mogućstvu molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za IL-17A/F heterodimer bolji od 10nM. U jednoj instanci molekule antitela predmetnog pronataska imaju afinitet vezivanja za IL-17A/F heterodimer bolji od 500 pM. U jednoj instanci molekule antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za IL-17A/F heterodimer bolje od 150pM, U jednoj instanci molekule antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za heterodimer IL-l7A/Fod 1l6pM.

[0067] U jednoj instanci molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za cinomolgus IL-17F bolji od 2nM. U jednoj istanci molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za cinomolgus IL-17F od l.03nM.

[0068] Ocenjeno je da afinitet antitela predmetnog pronalaska može biti promenjen upotrebom bilo kojeg pogodnog metoda poznatog u struci. Predmetni pronalazak se stoga takode odnosi na varijante molekula antitela predmetnog pronalaska, koje imaju poboljšani afinitet prema IL-17Ai/ili IL-17F. Takve varijante mogu se dobiti brojem protokola afiniteta sazrevanja uključujući mutacije u CDR-ovima (Yang i dr, j. Mol. Biot., 254, 392-403, 1995), mešanjem lanaca (Marks i dr, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), upotrebom mutacionih sojeva E. coli (Low i dr, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mešanjem DNK (Patten i dr., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), faga prikazima (Thompson i dr, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i polnog PCR-a (Crameri i dr, Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan i drugi (gore) gde je diskutovano o ovakvim metodama afiniteta sazrevanja.

[0069] U jednoj instanci molekuli antitela predmetnog pronalaska neutralizuju IL-17A i IL-17F aktivnosti, na primer in vitro testovima opisanim u Examples. U jednoj instanci predmetni pronalazak obezbedjuje neutrališuće antitelo koje imaju specifičnost za humani IL-17A i IL-17F. koji je sposoban da inhibira aktivnosti 0.8nM humanog IL-17A za 50% koncentracijom manjom od 5nM. Takodje da inhibira aktivnosti 4.2nM humanog IL-T7F za 50% koncentracijom manjom od 12nM prikazano inhibitorskom aktivnošću merenom na IL-17A ili IL 17F izazvano oslobađanjem IL-6 iz Hela ćelije. U jednoj instanci koncentracija antitela koja inhibiraju (ometaju) IL-17A do 50% je manja od 3nM. U jednoj instanci koncentracija antitela koja inhibiraju IL-17F do 50% je manja odHnM. U jednoj instanci humani IL-17Ai humani IL-17F upotrebljeni u testu su rekombinirani (promenjeni) humani IL-17A i IL-17F. U jednoj instanci neutrališuće antitelo je humanizovano ili u potpunosti humano (ljudsko) antitelo.

[0070] Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku, ako je potrebno, mogu biti spojeni sa jednim ili više efektor molekula. Ocenjeno je da efektor molekul mogu činiti jedan efektor molekul ili dva ili više takvih molekula tako povezanih kao iz obrasca jednog dela da mogu biti pričvršćena na antitela predmetnog pronalaska. Gde je poželjno da se dobije jedan fragment antitela pričvršćen za efektor molekul, moze se pripremiti standardnim hemijskim ili kombinovanim DNK procedurama u kojima je deo antitela vezan direktno ili putem agensa za spajanje za efektor molekul. Tehnike za spajanje takve efektor molekule za antitela dobro su poznati u struci (videti, Helstorm i dr., Controlled Drug Deliverv, drugo izdanje, Robinson i dr,, 1987, str. 623-53; Thorpe i dr., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 i Dubowchik i dr.,1999, Pharmacology i Therapeutics, 83, 67-123). Hemijski određene procedure uključuju, na primer, ono opisano u WO 93/06231,WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 I WO03031581. Alternativno, gde je efektor molekul protein ili polipeptid, vezivanje se može učvrstiti upotrebom rekombinovanih DNK procedura, za primer pogledati kako je opisano u WO 86/01533 i EP0392745.

[0071] Termin efektor molekul kao što je u ovom dokumentu u upotrebi uključuje, na primer, antineoplastik agense, droge, otrove, biološki aktivne proteine, na primer enzime, drugim antitela ili delove antitela, sintetičke ili prirodne dobijene polimere, nukleinske kiseline i delove istih na primer, DNK, RNK i delove istih, radionuklide, posebno radiojodine, radioizotope, helirane metale, nanočestice i izveštajnim grupama kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu da detektuju NMR ili ESR spektroskopije.

[0072] Primeri efektor molekula mogu sadržati citotoksine ili citotoksične agense, uključujući i bilo koji drugi agens koji je štetan za ćelije (na primer ih ubija). Primeri uključuju kombrestatine, dolastatine, epotilone, staurosporine, maitansinonide, spongistatine, rizoksine, halihondrine, rortdine, hemiasterline, taksole, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromide, emetine, mitomicine, etopozide, tenopozide, vinkristine, vinblastine, kolhicine, doksorubicine, daunorubicine, dihidroksi antracin dione, mitoks-antrone, mitramicine, aetinomicin D, 1-dehidrotestosterone, glukokortikoide, prokaine, tetrakaine, lidokaine, propranolole, i puromicine i analoge ili homologe istih.

[0073] Efektor molekuli takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (na primer metotreksate, 6-merkaptopurine, 6-tioguanine, citarabine, 5-fluorouracil dekarbazine), alkalne agente (na primer mekhloretamine, tioepahlorambucile, melfalane, karmustine (BSNU) i iomustine (CCNU), ciklofosfamide. busulfane, dibromomanitole, streptozotocine, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platinijum (II) (DDP) cisplatine), antracikline (na primer, daunorubicin (nekadašnji daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (na primer, daktinomicin (nekadašnja aetinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC) kalihamicine ili duokarmicine), i anti-mitotičke agense (npr. vinkristine i vinblastine).

[0074] Drugi efektor molekuli mogu da uključuju helirane radionuklide kao što su "'ln a ™Y, Lu<1>", Bizmut<1>", Kalifornijum<2>", Iridijum"" i Tungsten'<8>VRenijum"<8>: ili droge kao što su, ali ne ograničavajući na, atkilfosfoholine, topoizomeraze i inhibitore, taksoid i suramin.

[0075] Drugi efektor molekuli uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi interesovanja uključuju, alt nisu ograničeni na, proteolitik enzime, hidrolaie, liaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi interesovanja uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin ili toksin difterije, protein poput insulina, faktor nekroze tumora, a-interferon, 8-iriterferon, nervni faktor rasta, izvedeni faktor rasta trombocita ili aktivator tkiva piazminogena, trombotik agens ili agens anti-angiogena, na primer, angiostatin ili en-dostatin, ili, kao modifikator biološke reakcije kao što je limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulacije kolonija granulocita makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), nervni faktor rasta (NGF) ili drugi faktori rasta i imunoglobulini.

[0076] Drugi efektor molekuli uključuju supstance detekcije koje mogu biti korisne na primer, u dijagnozi. Primeri supstanci detekcije su razni enzimi, protetičke grupe, fluorescentni materijali, luminescentni materijali, bioluminescentni materijali, radioaktivni nuklidi, metali kojaemitujetomografiju (za upotrebu u pozitronske emisione tomografije) i neradioaktivni paramagnetici jona metala. Generalno pogledati u U.S.Patent br. 4,741,900 za jone metala koji se mogu spojiti za antitela pri upotrebi u dijagnostici. Pogodni enzimi uključuju Renom peroksidaze, alkalne fosfataze, beta-galaktosiđaze ili acetilholinesteraze; pogodne protetičke grupe uključuju streptavidin. avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju umbeliferon, fluoroscein. ftuoroscein izotiocianat. rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i phicoerithrin; pogodni luminescentni materijali uključuju tuminol; pogodni bioluminescentni materijali uključuju liciferaz, tuciferin, i aekvorin; i pogodni radioaktivni nuklidi uključuju

'"I, "1, '"ln i "Te.

[0077] U drugom primeru efektor molekul može povećati poluživot antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogensko antitelo i/tli poboljšati isporuku antitela preko epitelnih barijera (prepreka) na imuni sistem. Primeri pogodnih efektor molekula ovog tipa su polimeri, albumin, albumin vezivanja proteina ili albumin vezivanja jedinjenja poput onih opisanih u WO05/117984.

[0078] Generalno gledano, gde je efektor molekul polimer to može biti sintetički ili prirodni polimer, na primer koji je opciono ravan ili razgranati lanac polialkilena, polialkenilen ili polioksialkllenski polimer ili razgranatih ili nerazgranath potisaharida, na primer homo- ili hetero-polisaharida.

[0079] Određene opcione substituente koji mogu biti prisutni u gorepomenutim sintetičkiim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0080] Određeni primeri sintetičkih polimera uključuju opciono supstituisane ravne ili razgranate lance poli(etil-eneglol), poli(propileneglikol) poli(vinilalkohol) ili derivate istih, a pogotovo opciono supstituisani poli(etill-eneglikol) kao što su metoksipoli(etileneglikol) ili derivati istih.

[0081] Određeni posebni prirodni polimeri su laktoze, amiloze, dekstran, glikogen ili derivati istih.

[0082]"Derivati", kao što je u upotrebi u ovom dokumentu, ciljano uključuje reaktivne derivate, na primer tiol-selektivno reaktivne grupe kao što su maleimid i slične. Reaktivne grupe se mogu vezati direktno ili putem veznog segmenta za polimer. Ocenjeno je da je ostatak takve grupe u nekom slučajevima deo forme proizvoda kao što je vezna grupa između dela antitela i polimera.

[0083] Veličina polimera može varirati prema želji, ali će uglavnom biti u opsegu prosečne molekularne težine od 500Da da 50000Da, po mogućstvu od 5000 da 40000Da i po mogućstvu više od 20000 da 400000a. Veličina polimera posebno može biti izabrana na osnovu namenjene upotrebe tog proizvoda, na primer, sposobnosti da lokalizuje na određenim tkivima kao što su tumori ili da poveća poluživot cirkulacijom iza pregled videti Chapman. 2002, Advanced Drug Deliverv Revievvs, 54, 531-545). Tako, na primer, gde je proizvod namenjen da napusti opticaj i probijanje tkiva, na primer za upotrebu u liječenju tumora, to može biti izazvano upotrebom polimera male molekularne težine, na primer sa molekutarnom težinom od oko 5000Da. Za aplikacije, gde je proizvod namenjen da zadrži opticaj, to može biti izazvano upotrebom polimera veće molekularne težine, na primer koji ima molekularnu težinu u opsegu od 20000Da do 40000Da.

[0084] Posebno prioritetni polimeri uključuju polialkilen polimere, kao što je poli(etileneglikol) ili, naročito, metoksipoli(etileneglikol) ili derivati istih, a naročito sa molekularnom težinom u rasponu od oko 15000Da daOko 40000Da.

[0085] U jednom primeru antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku su vezana za poli(etileneglikol|grupe (PEG). U jednom odredjenom primeru antitelo je fragment(deo) antitela i PEG molekule koji mogu biti vezani kroz sve dostupne sporedne lance aminokiselina ili terminalnu funkcionalnu grupu aminokiselina koja je locirana u fragmentu antitela, na primer u svakoj slobodnoj amino, tmino, tiol, hidroksil ili karboksil grupi. Takve aminokiseline prirodno se mogu javiti u delu antitela ili mogu biti napravljene u delu upotrebom rekombinovanih DNK metoda (videti za primer U.S. 5,219,996; U.S. 5,667,425; VV098/25971). U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska je modifikovani Fab fragment (deo) u kome je modifikacija zapravo dodatak na kraju teškog lanca C-terminala jedne ili više amino kiselina kao dozvoljen prilog za efektor molekula. Po mogućstvu, dodatne aminokiseline formiraju modifikovani zavisni region koji sadrži jedan ili više cistein ostataka na koje može biti vezan efektor molekul. Višestruke lokacije mogu se upotrebiti za vezivanje dva ili više PEG molekula.

[0086] Po mogućstvu PEG molekule su kovalentno vezane preko tiol grupe najmanje jednim cistein ostatkom (talogom), koji se nalazi u delu antitela. Svaki molekul polimera vezan za modifikovani deo antitela može biti kovalentno vezan atomom sumpora za cistein ostatak lociran u fragmentu Kovalentna veza će generalno biti disulfidna veza ili, preciznije, sumpor-ugljenik veza. Gde je tiol grupa upotrebljena kao svrha priloga da na odgovarajući način aktivira efektor molekule, na primer mogu se upotrebiti tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i derivati cisteina. Aktiviram polimer se može upotrebiti kao početni materijal u pripremi polimer-modifikovanog dela antitela, kao Što je opisano gore. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivne grupe kao što je a-halokarboksilična kiselina ili ester, na primer jodoacetinamidi, imidi, na primer maleimidi, vinil sulfon ili disulfid. Takav početni materijal može biti dobijen komercijalno (na primer iz Nektar, ranije Shearvvater Polvmers Inc., Huntsville, AL, USA) ili može biti pripremljen iz komercijalno dostupnih početnih materijala upotrebljenih konvencijalno hemijskim procedurama. Posebni PEG molekuli uključuju 20K metoksi-PEG-amine (dostupne iz Nektar, ranije Shearvvater; Rapp Polymere; and SunBio) i M-PEG-SPA (dostupno iz Nektar, ranije Shearvvater).

[0087] U jednoj istanci, antitelo je modifikovani Fab fragment (deo) koji je PEG-ilisan, odnosno ima PEG (poli(etil-eneglikol)) kovalentno vezan za njih, na primer metodom otkrivenom u EP 0948544 [videti takodje i "Poli(etil-eneglikol) Chemistry, Biotechnical i Biomedical Application", 1992, J. Milton Harris (izd.), Plenum Press, New York, "Poli(etileneglikol) Chemistry i Biological Application ", 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (izdanja) , American Chemical Society, Washington DC, i "Bioconjugation Protein Coupling Tehniques for Biomedical Sciences",1998,M. Aslam i A. Dent, Grove Publishers, New York. Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Revievvs 2002, 54:531545]. U jednom primeru PEG je vezan za cistein u zavisnom regionu. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment je grupa maleimida kovalentno vezanih sa jednom tiol grupom u modifikovani zavisni region. Lizin ostatak može biti kovalentlentno vezan za maleimid grupu, i na svaku amino grupu na lizin ostatku može biti vezan metoksipoli(etilenglikol) polimer imajući molekularnu težinu približno 20,000 Da. Stoga, ukupna molekularna težina PEG veze za Fab fragment može biti približno 40,000 Da.

[0088] U jednoj istanci, predmetni pronalazak obezbedjuje molekul neutrališućeg antitela imajući posebnosti za humani IL-17A i humani IL-17F, koji je modifikovani Fab fragment čiji teški lanac sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 9 i laki lanac sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO:7 i ima na kraju C-termmal svog teškog lanca modifikovanog zavisnog regiona koja sadrži najmanje Jedan cistein ostatak kojem je priložen efektor molekul. Po mogućstvu, efektor molekul je PEG i dodat je pomoću metode opisane u (VV098/25971 i VVO2004072116) pri čemu je lizil-maleimid grupa dodata cistein ostatku na kraju C-terminal teškog lanca, i svaka amino grupa za lizil ostatak ima kovalentno vezan metoksipoli(etilenglikol) ostataka molekularne težine oko 20 000 Da. Stoga, ukupna molekularna težina PEG priloga za antitelo je približno 4O,000Da.

[0089] U drugom primeru efektor molekulama može se priložiti deo antitela pomoću metode opisane u međunarodnim patentima VVO2005/003169, V/O2005/003170 i VVO20O5/003171.

[0090] Predmetni pronalazak obezbeđuje i izolovanu DNK sekvencu kodiranja teškog i lakog lanca za molekule antitela predmetnog pronalaska. DNK sekvence predmetnog pronalaska mogu sadržati sintetički DNK, na primer proizvod hemijske obrade, cDNA, genomske DNK ili njihovom kombinacijom.

[0091] DNK sekvence koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska mogu se dobiti metodama dobro poznatim u struci. Na primer, DNK sekvence kodiranja za deo ili celo antitelo teških i lakih lanaca može biti sintetizovano kada je to poželjno, iz odredjene DNK sekvence ili na osnovu odgovarajuće sekvence aminokiselina.

[0092] DNK kodovi za aceptor okvir sekvence su široko dostupni onima koji suStručni u ovoj oblasti i može biti očitan sintetizovanjem na bazi njima poznate sekvence aminokiselina.

[0093] Standardne tehnike molekularne biologije mogu se upotrebiti za pripremu DNK sekvence kodiranja za molekule antitela predmetnog pronalaska, željene DNK sekvence mogu biti sintetizovane potpuno ili delimično koristeći sintezu tehnike oligonukleotida. Direktno lociranje mutageneze i polimeraze tehnikom lančane reakcije (PCR) može se prigodno upotrebiti.

[0094] Primeri pogodanih sekvenci su obezbeđeni u SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14; SEQ ID N0:17 i SEOJD N0:18. Nukleotidi 1-57 u SEOJD NO18 i 1-60 u SEQ ID NO 14 kodiranje signala peptid sekvence iz antitela miša B72.3 (VVhittle idr, 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505.) koji isecanjem daje neutralisani molekul antitela predmetnog pronalaska,

[0095] Predmetni pronalazak se takodje odnosi na kloniranje ili ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više DNK sekvenci predmetnog pronalaska. Shodno tome, obezbedjeno je kloniranje ili ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više DNK sekvenci kodiranja antitela predmetnog pronalaska. Po mogućstvu, kloniranje ili ekspresioni vektor sadrži dve DNK sekvence, odnosno kodiranja lakog lancac i teškog lanca molekula antitela predmetnog pronalaska. Po mogućstvu, vektor prema predmetnom pronalasku sasloji se od sekvenci datih u SEQ ID NO: 14 i SEQ_ ID NO:18. Nukleotidi 1-57 u SEQ ID NO:18 i1-60 u SEQ ID NO 14 kodiran signal peptidne sekvence iz antitela miša B72.3 (ostatak 1-19 u 5E ID NO:16 i 1-20 SEQ ID NO;12: odnosno) koja najviše po mogućstvu isecanjem daje neutralisani molekul antitela predmetnog pronalska.

[0096] Opšte metode po kojima mogu biti građeni vektori, metodama transfekcije i metodama kulture su dobro poznati sručnjacima u ovoj oblasti. U tom pogledu, je napravljena referenca za "Current Protocols in Molecular Biology', 1999, F. M. Ausubel (izdanje), Wiley Interscience, New York i Maniatis Manual proizveden od Cold Spring Harbor Publishing.

[0097] Takođe obezbedjuje ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više kloniranih ili ekspresionih vektora a koji su sastavljeni od jedne ili više DNK sekvenci kodiranja antitela predmetnog pronalaska. Svaki pogodan sistem ćelije/vektora domaćin se mogu upotrebiti za izražavanje DNK sekvence kodiranja antitela molekule predmetnog pronalaska. Bakterijski, na primer E. coli, i drugi mikrobni sistemi mogu biti upotrebljeni ili eukariotski, na primer sisara.kao i ćelije domaćina ekspresionog sistema koja se takodje može upotrebiti. Odgovarajuće ćelije domaćina sisara uključujući CHO, mijelome ili hidrome ćelija.

[0098] Predmetni pronalazak takođe obezbedjuje proces proizvodnje molekule antitela predmetnog pronalaska sastavljen od kultivisanih ćelija domaćina koja sadrže vektor predmetnog pronalaska pod uslovima koji su pogodni za vodjenje ekspresije proteina iz DNK kodiranja molekula antitela predmetnog pronalaska, i izolovanje molekula antitela.

[0099] Molekule antitela mogu se sastojati od teškog ili lakog lanca polipeptida, gde u tom slučaju samo teški lanac ili laki lanac polipeptida kodirajuće sekvence treba da se upotrebe za transfekciju ćelije domaćina. Za proizvodnju proizvoda koji sadrže oba i teške i lake lance, red ćeiiia može biti transfekcisan sa dva vektora, prvi vektor kodiranja lakog lanca polipeptida i drugi vektor kodiranja teškog lanca polipeptida.Alternativno, jedan vektor se može upotrebiti, vektor koji uključuje sekvence kodiranja lakog lanca i teškog lanca polipeptida.

[0100] Kako su antitela predmetnog pronalaska korisna u tretmanu i/ili profilaksi patoloških stanja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koje sadrže jedan molekul antitela predmetnog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipienta, rastvarača ili nosača. Shodno tome, obezbedjena je upotreba antitela prema predmetnom pronalasku za proizvodnju u medikament. Kompozicija se uobičajeno isporučuje obezbeđena kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja normalno uključuje farmaceutski prihvatljive nosioce. Farmaceutska kompozicija (sastav) predmetnog pronalaska može dodatno sadržati farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva.

[0101] Predmetni pronalazak takođe obezbedjuje postupak za pripremu farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koje sadrže dodavanje i mešanje molekule antitela predmetnog pronalaska zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim ekscipienta, rastvarača ili nosača.

[0102] Molekul antitela može biti jedini aktivni sastojak farmaceutskih ili dijagnostičkih kompozicija ili može biti u pratnji drugih aktivnih sastojaka uključujući ostale sastojke antitela, na primer anti-TNF, anti-IL-18, anti-T ćelije, anti-IFNy ili anti-LPS antitela, ili sastojke ne-antitela kao što su ksantini.

[0103] Farmaceutske kompozicije po mogućstvu sačinjavaju terapeutski efektivne iznose (količine) antitela pronalaska. Termin "terapeutski efektivni iznos" kao što je u upotrebi u ovom dokumentu odnosi se na iznos terapeutskih agenasa potrebnih za tretman (lečenje), ublažavanje ili sprečavanje ciljanih bolesti ili stanja, ili ispoljavanje detektabilnog terapijskog ili preventivnog efekta (dejstva). Za bilo koje antitelo, terapeutski efektivni iznos može se inicijalno proceniti bilo u testovima kulture ćelija ili u životinjskim modelima, obično u glodanma, zečevima, psima, svinjama ili primatima. Modet životinja se takode može upotrebiti za određivanje opsega odgovarajuće koncentracije i puta administracije (pnmene). Takve informacije se onda mogu upotrebiti za određivanje korisnih doza i put primene kod ljudi.

[0104] Precizni terapeutski efektivni iznos za ljudski subjekt zavisiće od ozbiljnosti bolesti, opšteg zdravlja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, dijete, vreme i frekvenciju administracije, kombinacije lekova, reakcija osetljivosti i tolerancije/odgovor na terapiju. Ovaj iznos može se utvrditi rutinskim eksperimentisanjem i u okviru kliničke ocene. Generalno, terapeutski efektivni iznos će biti od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, poželjno 0,1 mg/kg do 20 mg/kg. Farmaceutske kompozicije mogu biti prigodno predstavljene u jedinici doze obrazaca koji sadrže predodredjeni iznos aktivnog agensa pronalaska po dozi.

[0105] Kompozicije mogu biti individualno pnmenjene za pacijenta ili mogu biti primenjene u kombinaciji (na primer simultano, uzastopno ili zasebno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

[0106] Doza kojom se molekul antitela predmetnog pronalaska primenjuje zavisi od prirodnih uslova za tretiranje, obima prisutnog zapaljenja i o toga da li je molekul antitela koja se upotrebljava profilaktički ili tretman (lečenje) postojećeg stanja.

[0107] Učestalost doza će zavisiti od poluživota molekula antitela i trajanja tog dejstva. Ako molekul antitela kratko deluje (na primer 2 do 10 sati) može biti neophodno davati jednu ili više doza dnevno. Alternativno, ukoliko molekul antitela ima dug poluživot (na primer 2 do 15 dana) tada se može primeniti doziranje jednom dnevno, jednom nedeljno ili čak i jednom u 1 ili 2 meseca.

[0108] Farmaceutski prihvatljiv nosač ne bi trebao sam da izaziva proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju i ne treba da je toksičan. Pogodni nosači mogu biti velike, polako metabolisane makro-molekule poput proteina, polipeptida, lipozoma, polisaharida, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, aminokiseline kopolimera i čestice neaktivnog virusa.

[0109] Mogu se upotrebiti i farmaceutski prihvatljive soli, kao na primer soli mineralne kiseline, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organske kiseline, kao što je acetati, propionati, malonati i benzoati.

[0110] Farmaceutski prihvatljivi nosači terapeutskih kompozicija pored toga mogu da sadrže tečnosti kao što su voda, slani rastvor, glicerol i etanol. Pored toga, pomoćne supstance, kao što su kvas ili emutzivni agensi ili pH puferovane supstance, mogu biti prisutne u takvim kompozicijama. Takvi nosioci omogućavaju farmaceutskoj kompoziciji oblike kao što su tablete, pilule, konfeti, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, kaše i suspenzije, za ingestiju (uzimanje) od strane pacijenta.

[0111] željeni obrasci administracije (primene) uključuju oblike pogodne za parenteralnu administraciju, na primer injekcijom ili infuzijom, na primer bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Gde je proizvod za injekcije ili infuziju, može imati oblik suspenzija, rastvora tli emulzija u masnom ili vodenom prenosniku i može da sadrži formulatorne agense, kao što su suspendovanje, konzervacija, stabilizacija i/ili agense disperzije. Alternativno, molekul antitela može biti suva forma koja se pre upotrebe rekonstituiše odgovarajućom sterilnom tečnošću.

[0112] Jednom formulisane, kompozicije za pronalazak mogu biti primenjene direktno na subjekat. Subjekti tretiranja mogu biti životinje. Međutim, prioritetno je da su kompozicije prilagođavaju za administraciju (primenu) na ljudski subjekat.

[0113] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu biti primenjene bilo kojim od puteva (načina), uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intravenozni, intramuskularni, unutar arterijski, intramedulami, intratekalni, intraventrikularni, transdermalni, nadkožni (na primer, pogledajte WO 98/20734), potkožnt, intraperitonealni, intranazalni, spoljašnji, površinski, podjezični, intravaginalni ili rektalni način. Hiposprejevi se takodje mogu koristiti za primenu farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Obično, terapeutske kompozicije mogu biti pripremljene kao injekcione, pre kao tečni rastvori ili suspenzije. Pogodan rastvor za rastvaranje u, ili suspenziji, tečni prenosnik pre ubrizgavanja injekcijom takođe može biti pripremljen.

[0114] Direktna isporuka kompozicije će generalno biti ostvarena injekcijom, potkožno, intraperitonealno, intravenozno ili intramuskularno, ili isporukom na intersticijalni (trenzitivni) prostor tkiva. Kompozicije se takodje mogu primeniti u leztji. Tretman doziranja može biti jedan raspored doza ili višestruki raspored doza.

[0115] Ocenjeno je da aktivni sastojak u sastavu može biti jedan molekul antitela. Kao takav, biće podložniji degradaciji u probavnom traktu. Stoga, ako je sastav kojom promenjen rutom koristeći probavni trakt, sastav mora sadržati agense koji štiti antitelo od degradacije pre nego što to antitelo bude apsorbovano iz probavnog trakta.

[0116] Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosiocima dostupna je u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, New 1991).

[0117] Takode predviđa da će antitelo predmetnog pronalaska biti primenjeno pri upotrebi genske terapije. Da bi se ovo postiglo, DNK sekvence kodiranog teškog i lakog lanca molekula antitela koji su pod kontrolom odgovarajuće komponente DNK su uvedene u pacijenta tako da su lanci antitela izraženi iz DNK sekvence i sastavljeni u situ.

[0118] Predmetni pronalazak takođe obezbedjuje jedan molekul antitela za upotrebu u kontroli zapaljenskih oboljenja. Po mogućstvu, molekul antitela može da se koristi da umanji zapaljenske procese ili za njihovo sprečavanje.

[0119] Predmetni pronalazak takode obezbedjuje molekule antitela predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu ili profilaksi patoloških poremećaja posredovanjem za IL-17A i/ili vezivanjem sa povećanim nivoom IL-17A i/ili II-17F. Po mogućstvu, patološki uslov je izabran iz grupe koja se sastoji od infekcije (virusne, bakterijske, gljivica i parazita), endotoksičnog šoka povezanog sa infekcijom, artritisa, reumatoidnog artritisa, astme, bolesti zapaljenja kartice, Alchajmerove bolesti, Kronove bolesti, inflamatornog oboljenja creva, Ulceroznog kolitisa, Pejronijeve bolesti, celijakije, bolesti žučne kese, Pilonidalne bolesti, upale trbušne maramice, psorijaze, vaskulitisa, hirurške adhezije, udara, Tip I dijabetesa, lajmskog artritisa, meningoencefalitis, imuno-posredovani zapaljenski poremećaji centralnog i perifernog nervnog sistema kao što je Multipla skleroza i GuiUain-bar sindrom, druge autoimune bolesti, pankreatitis, traumu (operacijska), graft-protiv-domaćma bolesti, odbijanja transplantacije, kanceri (oba solidna tumora kao što su melanom, hepatoblastom, sarkom, karcinom skvamoznih ćelija, tranzicioni kancer ćelije, kancer jajnika i kancer krvi i posebno akutne mijeloidne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, kancer i kancer debelog creva), bolesti srca, uključujući i ishemijske bolesti kao što je infarkt miokarda kao i ateroskleroze, intravaskularne koagulacije, resorpcija kostiju, osteoporoza, parodontopatija i hipohlorhdija.

[0120] Predmetni pronalazak obezbeđuje i jedan molekul antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tretmanu ili profilaksi bola.

[0121] Predmetni pronalazak dodatno obezbedjuje upotrebu jednog molekula antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za lečenje ili profilaksu patoloških poremećaja koji posreduje IL-17A i/ili IL-17F ili vezuje sa povećanim nivoom IL-17A i/ili IL-17F. Po mogućstvu patološki poremećaj je reumatoidni artritis ili Multipla skleroza.

[0122] Predmetni pronalazak dodatno obezbedjuje upotrebu jednog molekula antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za lečenje ili profilaksu bola.

[0123] Jedan molekul antitela predmetnog pronalaska može biti upotrebljen u bilo kakvoj terapiji gde je poželjno da se smanje efekti IL-17A i/ili IL-17F u ljudskom ili životinjskom telu. IL-17A i/ili IL-17F može cirkulisati u organizmu ili može biti prisutan u nepoželjno visokom nivou lokalizovano na određenoj lokaciji u organizmu, na primer lokaciji zapaljenja.

[0124] Jedan molekul antitela prema predmetnom pronalasku upotrebljava se po mogućstvu za kontrolu zapaljenske bolesti, autoimune bolesti ili kancera.

[0125] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod tretiranja ljudskog ili životinjskog subjekta koji pate od ili su u riziku od poremećaja posredovanjem IL-17A i/ili IL-17F, metod obuhvata administraciju za subjekat efektivnog iznosa molekule antitela ovog predmetnog pronalaska.

[0126] Jedan molekul antitela prema predmetnom pronalasku se takođe može koristiti za dijagnozu, na primer u in vivo dijagnozi i obradi slike stanja bolesti koje uključuju IL-17A i/ili IL-17F.

[0127] Predmetni pronalazak je dodatno opisan ovim ilustracijama samo u sleđećim primerima, koji se odnose na prateće Figure, u kojima je:

Slika: 1

(a) laki lanac V regiona antitela CA028_0496 (SEQ ID N0.7)

(b) teški lanac V regiona antitela CA028_0496 (SEQ ID NO:9)

(c) CDRH1 (SEOJD NO:1), CDRH2 (SEOJD NO:2), CDRH3 (SEOJD NO:3), CDRL1 (SEOJD NO:4), CDRL2 (SEQ ID N0:5), CDRL3 (SEQ ID NO:6) antitela CA028_496.

(d) laki lanac antitela CA028_496 (SEQ ID NO: 11).

(e) teški lanac antitela CA028_496 (SEQ ID N0:15).

I f) DNK kodiranja lakog lanca antitela CA028_496 uključujući signal sekvence (SEQ ID NO: 14).

(g) DNK kodiranja teškog lanca antitela CA028_496 uključujući signal sekvence (SEOJD NO: 18)

Slika: 2

1. efekat antitela CA028_0496 (određen Ab #496 na legendi) na humani IL-17 izazvan IL-6 produkcijom iz Hela ćelije. 2. efekat antitela CA028_0496 (određen Ab#496na legendi) na huani IL-17F indukovanjem proizvodnje IL-6 iz Hela ćelija.

DNK manipulacije i opšte metode

[0128] Soj E. coli INVaF' (Invitrogen) koji je upotrebljen za transformaciju i rutinu kulture rasta. DNK ograničenje i modifikacija enzima koja su preuzeta iz Roche Diagnostics Ltd. i New England Biolabs. Pripreme plazmida su obavljene upotrebom opreme za prečišćavanje Maxi Plasmid (OJAGEN, katalog br. 12165). DNK sekvenca reakcija se odigrava upotrebom pribora ABI Prism Big Dye terminatora sekvence (katalog ibr. 4304149) i pokreće se na jedan ABI 3100 automatizovani sekvencer (Applied Biosystems). Podaci se analiziraju pomoću programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Oligonukleotidi su dobijeni iz Invitrogena. Koncentracija IgG utvrđena je upotrebom ICT sklopa ELISA.

IL-1 7 izoforme

[0129] Rekombinantni IL-17A i IL 17Fsu kupljeni od R6.D sistema.

[0130] Rekombinantni IL-17A i IL-17F heterodimer proizveden je koristeći linkove u GS linkeru. Heterodimer ima sledeću sekvencu (SEOJD NO: 19)

[0131] MGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRS5DYYNRSTSPWNLHRN

EDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQ_0_EILVLRREPPHCPNSFRLEK

ILVSVGCTCVTPIVHHVAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRKIPKVGHTFFQKPESCP

PVPGGSMKLDIGIINENQRV5M5RNIE5R5TSPWNYTVTY/DPNRYPSEVVQAQCRNL

GCINAQGKEDISMNSVPIQQETLWRRKHQGCSVSFO.LEKVLVTVGCTCVTPVIHHV Q Rekombinantni cinomolgus IL-17F (SEQ ID NO:20)

[0132] MRKIPKVGHTFFQKPESCPPVPEGSMKLDTGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPN RYPSEVVQAQCKHLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVLRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCT CVTPVIHHVO.

[0133] Sekvenca DNK kodiranja IL-17A/F heterodimera je hemijski sintetizovana od strane Entelechon GmbH i subklonirana u pET43.1a na lokaciji Ndel/Xhol. DNK sekvenca koja kodira cino L-17F je pojačana zbog PCR upotrebe prajmera što se pokazuje Ndel i Xhol ukidanjem lokacije. PCR proizvodi vezani su u pCR4Blunt-TOPO i sekvencom proverenom pre probave i ligature u pET43.1a za Ndel/Xhol lokaciju.

[0134] pET43.1a DNK koji kodira IL-17 izoforme je upotrebljen za transfekciju BL2KDE3) ćelije i izabranih karbenicillin-otpornih klonova gajenih na 37"C preko noći u 2TY supi koja sadrži2%glukoze i 50/mg/ml karbenicillina. Kulture su onda razredjene i gajene u istoj sredini za jedan 0D4M od 0.5-0. 7, izazvane sa 1mM IPTG i gajene na 37"C još 4-5 sati.

[0135] Ćelije su ubrane centrifugiranjem i ubacivanjem tela pripremljenim iz ćelija. Ubačena tela su rastvorena u 50mM Tris-HCl, 5M guanidinijum hidrohloridu, 50mM NaCl,1mM EDTA, 2mM smanjenom (redukovanom) glutationu, 0.2mM oksidisarom glutationu, pH 8,5. Protein IL-17 se savija ukapavanjem na rastorenom proteinu iznad amortizera (pufera) bez guanidinijum hidrohlorida, intenzivnim mešanjem. Konačna zapremina izabrana je tako da konačna koncentracija proteina nije više od 0,1 mg/ml.

[0136] Savijen protein rastvor je koncentrovan ako je potrebno, pre pufer razmene sa 10mM MES pH6. Protein je tada primenjen za kolonu sa Sepharose SP HP uravnotežen sa 20mM MES pH6. Protein je eluiran sa linearnim gradijentom od 0-500 mM NaCl u MES pH6 preko 10 zapremina kolone. 2a IL-17F gradijent je produžen do 600mM NaCl. U cilju daljeg pročišćenja IL-17, odgovarajući razlomak iz Sepharose SP HP kolone su sakupljene, koncentrsane i razblažene sa 20 mM CAPSO (pH10) i primenjene na kolonu Mono Q, uravnoteženu sa 20 mM CAPSO. Protein je eluiran sa linearnim gradijentom od 0-250 mM NaCl u 20mM CAPSO preko 20 zapremina kolone. Razlomci koji sadrže IL-17 su sakupljeni i neutralisani upotrebom 1M MES pH6.

Primer 1: Proizvodnja neutrališućeg anti-IL-17 antitela

[0137] Ženski Dawly Spreg pacovi su imunizovani sa promenjenim humanim IL-17 (kupljeno od IR sistema). Pacovi su primili četiri imunizacije od 20mg IL-17 u 100ml Freund-ovog pomoćnog sredstva. Antitela 225 koja vezuju humani IL-17 izolovana su pomoću metode opisane u VVO04/051268. Geni za teški lanac domena varijable(VH) i laki lanac domena varijable(VL) antitela 225 su izolovana i sekvencirana prateći kloniranje preko reverzne transkripcije (obrnutog prepisa) PCR-a.

[0138] Niz humanih VL i VH regiona dizajnirano je upotrebom humanogV-regiona okvira primaoca i variranjem broja ostatka donatora u okvirnim regionima. Osam kalemljenih VL regiona (gLI 8) i 9 kalemljenih VH regiona (gH1 -9) su dizajnirani i geni su gradjeni oligonukleotidnomSkupštinom i PCR mutagenezom.

[0139] Laki lanac kalemljene sekvence je subkloniran u humani laki lanac vektor izraza pKH10.1 koja sadrži DNK kodiranja humanog C-Kappa konstantnog regiona (Km3 alotipa). Teški lanac kalemljene sekvence je subkloniran u humani izraz gama-4 vektor pVhg4P FL, koja sadrži DNK kodiranja humanog gama-4 konstantnog regiona koji se sastoji od šarki za stabilizaciju mutacije S241P (Angal idr.gore). Plazmidi se transificiraju u CHO ćelije i antitela proizvodeći priKazane aktivnosti za IL-17 vezujućim i neutrališućim testovima. Transfekcija CHO Ćelija izvršena je pomoću Lipofectamine™ 2000 postupkom prema uputstvima proizvodjača (InVitrogen, katalog br. 11668).

[0140] Najoptimalniji kalem zasnovan na izrazima, sklonosti i neutralizaciji potencije (gL7gH9| izabran je i nazvan CA028_0496. V region sekvenci ovog antitela su prikazani u Figura 1 (a) i (b), kao i u SEQ ID NO: 7 i 9 za laki lanac (gL7) i teške lance (gH9),

[0141] Teški lanac okvira primaoca je humana embrionska sekvenca VH3 1-3 3-07 sa okvirom 4 dolazeći iz dela humanog JH-regiona embrionskog JH4. Laki lanac okvira primaoca je humana embrionska sekvenca VK1 2-1-U) L4, sa okvirom4dolazeći iz dela humanog JK-regiona embrionskog JK1.

Primer 2: Antitelo CA028 0496 neutrališe IL-17 i IL-17F i IL 17A/F heterodimer

Hela ćelije

[0142] Moć antitela CA028_0496 protiv humanog rekombinantnog IL-17 i humanog rekombinantnog IL-17F u Hela ćelijama je testirana i uporedjena sa antitelom CDP435 (WO06/054O59). Hela ćelije su dobijene iz banke ćelija u ATCC (ATCC CCL-2). Ćelije su gajene u Dulbek-ovim modifikovanim Eagle posrednicima (DMEM) upotpunjeno sa 10% fetalnog telećeg seruma, penicilinom, gentamicinom i glutaminom. 1x10' ćelija su postavljene na ploču od 96 ležišta sa ravnim dnom za kulturu tkiva. Ćelije su inkubiraju preko noći i jednom isperu u pufer testu. Ili humani IL-17A (25ng ml-1) ili humani IL-17F (125ng ml-1) se inkubira u prisustvu osnovnih koncentracija humanog TNF-a ove smeše koji je preinkubiran sa antitela CA028..0496 ili antitela CDP435. Citokin plus antitelo dodaje se Hela ćelijama koje su bile inkubirane preko noći. Proizvodnja IL-6 u supernatantnoj kulturi ćelija je proporcionalan iznosuIL-17A/IL-17F dodatom u ćelije. Nivoi humanog IL-6 su izmereni ELISA-om i izraženi u brojkama poredjenjem sa poznatim standardnim koncentracijama humanog IL-6.

[0143] Podaci [Figure 2a i 2b) ukazuju da antitela CA028.0496 moćno neutrališu humani rekombinantni IL-17A i takodje da imaju neke aktivnosti protiv humanog IL-17F. Podaci iz ovih eksperimenata ukazuju na ta antitela CA028_0496 data jednim ICso43/ng/ml protiv humanog rekombinantnog IL-17 (25ng ml ') i1477ng/ml protiv rekombinantnog IL-17F (I25ng ml'')- Shodno tome, antitela CA028_0496 data jednim lC5ood 0.29M protiv humanog rekombinantnog IL-17 (0.78nM) i l0.18nM protiv humanog rekombinantnog IL-17F (4.l6nM) u ovom testu (računanje se zasniva na IgG pod pretpostavkom da je molekularna težina od 145,000 kao jedan prosečni lgG4 i pod pretpostavkom da IL-17A i IL-17F su dimeri).

Humane mikroglia ćelije

[0144] Humane mikroglia ćelije (TCS Cellvvorks) su postavljene na ploču od 96 ležišta sa ravnim dnom na 5.000 ćelija po ležištu u ukupnoj zapremini od 100 pl i ostavljene 24 sata za vezivanje na plastici. U tom vremenu titracije (5, 1, 0,2 i 0.04 pg/ml) humani rekombinantni IL-17A, humani rekombinantni IL-17F, cinomolgus (makaki) rekombinantnog IL-17F i humani rekombinantni heterodimer IL-17A/F u prisustvu i odsustvu 10 humanih rekombinantnih ng/ml TNFa su trostruko dodati u ležišta. Kontrolna ležišta ne sadrže stimulacije, samog IL-17A (I00ng/ml), samog TNFa i IL-l7Ai TNFa zajedno. Svi citokini su dodati u ukupnoj zapremini od 110 pt/ležištu, pravljenjem ukupne zapremine od 210 pl. U eksperimentima koja uključuju antitela, ćelije se postavljaju u ležišta na isti način. Nakon 24 sata antitela i citokini se dodaju istovremeno za dobijanje iskaza konačne koncentracije u ukupnoj konačnoj zapremini od 200 pl.

[0145] Nakon narednih 24 sata inkubacije na 37' C, supernatantt su ubrani i zamrznuti na -20'C do analize. Za analizu, supernatanti se razredjuju 1/10 i mere za IL-6, upotrebom humane IL-6 MSD opreme, prema uputstvima proizvodjača.

[0146] Ustanovljeno je da su sve izoforme IL-17 aktivne u testu, posebno u prisustvu TNFa.

[0147] Potencijal antitela CA028_0496 protiv humanog rekombinantnog IL-17A i humanog rekombinantnog IL-17F, cinomolgus rekombinantnog IL-17F i humanog reKombinantnog heterodimera IL-17A/F u humanim mikroglia ćelijama testirana je u prisustvu TNFa i upotedjena u odnosu na antitela za kontrolu i određenog antitiela IL-17A upotrebom metode koja je opisana iznad.

[0148] Kontrolno antitelo nije imalo efekta na aktivnost nekog od testiranih citokina.

[0149] Antitela CA028.0496su imala inhibitornu aktivnost protiv sva tri citokina IL-17, IL-17F i IL-17A/F, uključujući cinomolgus IL-17F, dok je određeno antitelo IL-17A imalo samo inhibitornu aktivnost protiv IL-17Ai heterodimera IL-17A/F.

Primer 3: Afinitet antitela CA028 0496 ( humanog lqG4 konstantnog regiona) za IL- 17A i IL- 17F

[0150] BlA (Bimolekularna interakcija analiza) izvršena je pomoću 3000 Biacore (Biacore AB). Svi eksperimenti su izvršeni u 25'C. Afinipur Fc fragment koze anti-humanog ICT-a, Fc specifični fragment (Jackson ImmunoResearch) je neutralisan na CM5 Sensor Chip preko hernije amino spojnica hernije na uhvaćenom nivou =6000 odgovornih jedinica (RUs). HBS EP pufer (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20, Biacore AB) je upotrebljen kao pokretni pufer sa stopom protoka od 10 pl/min. 10 pl injekcija antitela CA028_0496 (1.81 mg/ml) je upotrebljena za hvatanje anti-humanog ICT-Fc. Humani IL-17A i IL-17 izoforme su titrirane preko uhvaćenih CA028_0496 za dvostruko razblaživanje iz 50nM do sub nM brzinom protoka od 30<p>L/min. Površina je ponovo generisana 30 pL injekcijom od 40 mM HCl, praćeno jednom 5 pL injekcijom od 5 mM NaOH.

[0151] Pozadina podloge za vezivanje krive su duplo upućene i analizirane pomoću BlAevalucionog softvera (verzija 3.2) prateći standardne procedure. Kinetički parametri utvrđeni su iz okvira algoritma.

[0152] Afinitet vrednosti utvrđenom za antitelo CA028JJ496 vezuje IL-17A za 16pMi 1750pMza IL-17F. Antitelo CA028_0496 ne vezuje druge IL-17 izoforme (IL-17 B. C, D i E). Antitelo CA028 0496 stoga specifično vezuje IL-17A i IL-17F.

Primer 4: Afinitet antitela CA028 0496 (murine lgG1 kostantnog regiona) za IL-17A, cinomolgus IL-17F i heterodimer IL-17A/F

[0153] BlA (Bimolekularna interakcija analiza) izvedena je pomoću 3000 za Biacore (Biacore AB). Svi eksperimenti su izvedeni na 25<*>C. Afinipure F(ab'); fragmenta koze anti-mišji IgG, Fc specifičnog fragmenta (Jackson ImmunoResearch) je imobilisan CMS Sensor Chip (Biacore AB) putem hernije amino spojnica na uhvaćenom nivou -6000 odgovornih jedinica (RUs). HBS-EP pufer (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20, Biacore AB) je upotrebljen kao pokretni pufer sa stopom protoka od 10 pl/min. Injekcija od 10 pL antitela CAQ28_0496 u 4ug/mtL je upotrebljena za hvatanje imobilisanog anti-miša IgG, Fc. Humani IL-17A, cino IL-17F i heterodimer A/F su titrirani preko uhvaćenog CA028J3496 na udvostručenom razblaživaču od 25nM do sub nM brzinom protoka od 30 pL/nnin. Površina je ponovo generisana brzinom protoka od 10uL/min injekcijom od 10 pL za 40 mM HCl, praćeno injekcijom od 5 uL za 5 mM NaOH.

[0154] Dvostruko označene pozadine podloge za vezivanje krive su analizirane pomoću BlAevaluation softvera(verzija3.2) praćenjemstandardneprocedure.Kinetički parametri utvrdjeni su iz okvira algoritma.

[0155] Antitelo CA028_0496 ima afinitet od 2lpM za IL-17A, 116pM za heterodimer IL-17A/F i 1030pM za cinomolgus IL-17F.

[0156] To će naravno biti shvaćeno predmetnim pronalaskom opisano preko primera samo, i koji nikako ne bi da ograničavaju da se izmene detalja mogu izvršiti u polju delovanja a koje je patentni zahtevi u daljem tekstu.

LISTING SEKVENCI

[0157]

Claims (17)

1. Neutrališuće antitelo koje vezuje humani IL-17Ai humani IL-17F, obuhvatajući teški lanac i laki lanac pri čemu se teški lanac varijabilnog domena obuhvatajući sekvencu datu u SEQ ID N0:9 i laki lanac varijabilnog domena obuhvatajući sekvencu datu u SEQ_ ID NO:7 ili sekvencu najmanje 95% tome identičnu i pri čemu antitelo ima afinitet prema IL-17A bolji od 20pM i afinitet prema IL-17F bolji od ZnM

2. Neutrališuće antitelo, prema patnetnom zahtevu 1, imajući teški lanac koji obuhvata sekvencu datu u SEQ ID NO:9 i laki lanac obuhvatajući sekvencu datu u SEOJD NO:7.

3. Neutrališuće antitelo, prema patentnom zahtevu 2 koje vezuje humani IL-17A i humani IL-17F, imajući teški lanac koji obuhvata sekvencu datu u SEOJD NO: 15 i laki lanac koji obuhvata sekvencu datu u SEOJD NO:11.

4. Neutrališuće antitelo, prema bilo kom od patentnnih zahteva od 1 do 3, pri čemu je antitelo celo antitelo ili funkcionalno aktivni fragment ili derivativ istog.

5. Neutrališuće antitelo prema patentnom zahtevu 4 pri čemu je fragment antitela Fab, Fab', F(ab'h, scFv ili epitopska veza fragmenta iste.

6. Neutrališuće antitelo prema patentnom zahtevu 4 ili patentnom zahtevu 5, pri čemu je antitelo, ili fragment istog, CDR-kalemljenog antitela.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od1do 6, pri čemu je antitelo ili fragment istog, sjedinjen sa jednim ili više efektor molekula.

8. Izolovana DNK sekvenca kodiranja teškog i lakog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6.

9. Kloniranje ili vektor izraza koji obuhvata jednu ili više DNK sekvenci prema patentnom zahtevu 8.

10. Vektor prema patentnom zahtevu 9, pri čemu vektor obuhvata sekvence date u SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 18.

11. Ćelija domaćina za izraz antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, obuhvatajući: i) DNK sekvencu kodiranja teškog lanca pomenutog antitela, i ii) DNK sekvencu kodiranja lakog lanca pomenutog antitela pri čemu se DNK sekvence obezbeđuju na jednom ili više kloniranja ili vektora izraza.

12. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 11 obuhvatajući jedno ili više kloniranja ili vektora izraza prema patentnom zahtevu 9 ili patentnom zahtevu 10.

13. Proces za proizvodnju antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, obuhvatajući kulturu ćelije domaćina iz patentnog zahteva 11 i izolovanog antitela.

14. Farmaceutska kompozicija obuhvatajući antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, rastvarača ili nosača.

15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, dodatno obuhvatajući druge aktivne sastojke.

16. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15, za upotrebu u terapiji.

17. Antitelo prema bilo kojemod patentnih zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14 ili zahtevu 15. za upotrebu u tretmanu ili profilaksi patoloških poremećaja posredovano od IL-17A i/ili IL-17F, ili je povezano sa povećanim nivoom IL-17A i/ili IL-17F, pri Čemu je patološki poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od infekcija (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske), endotoksičkog šoka vezanog za infekcije, artritisa, reumatoidnog artritisa, astme, zapaljenske bolesti kartice, Alchajmerove bolesti, Kronove bolesti, Pejronijeve bolesti, Celijac bolesti, bolesti žučne kese, Pilonidal bolesti, upale trbušne maramice, psorijaze, vaskulitisa, hirurške adhezije, štoga, dijabetesa Tip I, lajmskog artritisa, meningoencefalitisa, imuno posredovanog zapaljivog poremećaja centralnog i perifernog nervnog sistema kao što je Multipla skleroza i Guillain-bar sindroma, druge autoimune bolesti , pankreatitis, traume (operacije), bolesti gra/t-versus-domaćina, odbacivanja pri transplantaciji, kancera (oba, solidna tumora kao što su melanom, hepatoblastom, sarkom, karcinom skvamoznih ćelija, kancer tranzicionih ćelija, kancer jajnika i hematološkog maligniteta, naročito u akutno mijelidne leukemije, hroničnoj mijeloidne leukemije, kancera želuca i kancera debelog creva), bolesti srca uključujući ishemijske bolesti kao što su infarkt miokarda kao i arteroskleroze, intravaskularna koagulacija, koštana respsorpcija, osteoporoza, paradentoza i hipohlorhidija.