RS55707B1

RS55707B1 - Izolovani polipeptid toksin a i toksin b proteina c. difficile i njihova upotreba

Info

Publication number: RS55707B1
Application number: RS20170202A
Authority: RS
Inventors: Larry Ellingsworth; David Flyer; Jing-Hui Tian; Steven Fuhrmann; Stefanie Kluepfel-Stahl; Gregory Glenn; Kerstin Westritschnig
Original assignee: Valneva Austria Gmbh; Intercell Usa Inc
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2017-07-31
Also published as: MX350126B; JP2014525249A; LT2753352T; EP3167899A1; EP2753352B2; US20210121554A1; US12324831B2; AU2011298306B2; ZA201400610B; US20250360191A1; US11478540B2; KR20140057315A; HK1200357A1; US10821166B2; HRP20170193T1; EP2753352A1; US11357844B2; US20190290747A1; CA2873272A1; MX2014002595A

Description

[0001] OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovde je opisan izolovani polipeptid koji sadrži receprot-vezujuće domeneClostridium difficiletoksina A i toksina B i njegova upotreba kao vakcina. Ovaj izolovani polipeptid obezbeđuje anti-toksin imunitet na oba toksina.

[0003] POZADINA PRONALASKA

[0004] Clostridium difficile je

vodeći uzrok dijareje povezane sa nozokomijalnim antibiotikom i postala je glavni zdravstveni problem u bolnicama, staračkim domovima i ostalim ustanovama za negu. Tro[kovi bolnica su pocenjeni na 2 biliona dolara u Evropi i 3.2 biliona dolara u Sjedinjenim Državama.

[0005] Uzročni agens je gram pozitivna, spora formirajuća anaerobična bakterija, koja se uobičajeno može naći u okruženju, ali je takođe prisutna u intestinalnom traktu kod 2-3% zdrave odrasle populacije.C. difficilepovezane bolesti (CDAD) povezane su remećenjem normalne flore kolona, uobičajeno kao rezultat davanja antibiotika. Nakon izlaganja C.difficilespore u okolinu, organizam može kolonizovati intestinalnu mukozu gde proizvodnja bolesti koja izaziva toksine može dovesti do CDAD. Bolest se može kretati od blage nekomplkovane dijareje do teškog pseudomembranoznog kolitisa i toksičnog megakolona.

[0006] CDAD je postala sve problematičnija u zdravstvenim ustanovama. Nedavno ispitivanje pokazalo je da 31% hospitalizovanih pacijenata koji prijamu antibiotike postaju kolonizovani od strane C.difficile,a kod 56% tih pacijenata koji postanu kolonizovani dolazi do razvoja CDAD. Uopšteno, C.difficile jeodgovorna za 10-25% svih dijareja povezanih sa antibiotikima, 50-75% kolitisa povezanog sa antibiotikima i 90-100% pseudomembranoznog kolitisa povezanog sa antibiotikom. Tretiranje CDAD uključuje prekid uzročnog antibiotika nakon čega sledi tretiranje bilo metronidazolom ili vankomicinom. Ponovo vraćanje na antibiotsko tretiranje sa prekidama događa se kod približno 20% pacijenata, često kao rezultat rekolonizacije od strane C.difficile.

[0007] U 2003,C. difficileizbijanje u Kvebeku, Kanada indikovalo je nastanak većeg virulentog sojaC. difficilepoznatog kao Severnoamerički fenotip 1/027 (NAPI). NAPI je povezan sa većom virulencijom, slabim ishoda i većim stopama morbiditeta i mortaliteta u poređenju sa prethodnim sojevima. Pojava ovog soja dodaje probleme koji se već mogu nabrojati u pokušajima da se kontroliše incidenca CDAD

[0008] Fidaksomicin( Dificid©) za prevenciju rekurentne bolestiprvi je u novoj klasi makrocikličnih antibiotskih lekova suženog sprektra (Revill, P.; Serradell, N.; Bolos, J. (2006). "Tiacumicin B: macrolide antibiotic treatment C. difficile-related diarrhea". Drugs of the Future 31 (6): 494-497). On je fermentacioni proizvod dobijen iz aktinomiceteDactylosporangium aurantiacum podvrsta hamdenesis.Fidaksomicin je ne-sistemski, što znači da se apsorbuje minimalno u krvotoku, baktericidan je, i pokazuje selektivno iskorenjivanje patogeneClostridium difficilesa minimalnim remećenjem više vrsta bakterija koje čine normalnu, zdravu intestinalnu floru. Održavanje normalnih fizioloških uslova u kolonu može sniziti mogućnost povratka infekcije Clostridium difficile (Johnson, Stuart (2009-06). "Recurrent Clostridium difficile infection: a review of risk factors, treatments, and outcomes". Journal of Infection 58 (6): 403-410). lako se smatra da uvođenjem ove nove klase antibiotskog leka može da poboljša tretman CDAD, i dalje postoji potreba za preventivnim lekom, naročito kod visoko rizičnih pacijenata kao što su stariji i imunokompromitovani pacijenti.

[0009] CDAD je rezultat akcija dva egzotoksina proizvedena od strane C.difficile,toksina A i toksina B (koji su takođe označeni sa CTA i CTB, respektivno). Oba toksina su izlučeni proteini velike molekularne mase (<~>300 kDa) koji poseduju višestruko funkcionalne domene (Voth DE i Ballard JD, Clinical Microbiologv Revievvs 18:247-263 (2005)). N-terminalni domen oba toksina sadrži aktivnost ADP-glukoziltransferaze koja modifikuje Rho-nalik GTPaze. Ova modifikacija izaziva gubitak polimerizacije aktina i citoskeletne promene koje rezultiraju remećenjem čvrstih epitelnih veza kolona. To vodi ka preterane eksudacije tečnosti u kolon što rezultira dijarejom. Centralni domen sadrži hidrofobni domen i smatra se da je uključen u membranski transport. C-terminalni domen oba toksina sadrži višestruko homologne regione koji se nazivaju ponavljajuće jedinice (RUs) koje su uključene u vezivanje toksina za ciljanu ćeliju (Ho et al, PNAS 102:18373-18378 (2005)). Ponavljajuće jedinice su klasifikovane ili kao kratke (21-30 amino kiselina) ili duge (<~>50 amino kiselina). Ponavljajuće jedinice se kombinuju radi obrazovanja klastera, od kojih svaku obično sadrži jednu dugu i 3 - 5 kratkih ponavljajućih jedinica. Toksin A pune dužine poseduje 39 ponavljajućih jedinica (ARUs) organizovane u 8 klastera (Dove et al. Infect. Immun. 58:480-488 (1990), dok toksin B pune dužine sadrži 24 ponavljajućih jedinica (BRUs) organizovane u 5 klastera (Barroso et al., Nukleinske kiseline Res. 18:4004 (1990); Eichel-Streiber et al., Gene 96:107-113 (1992)).

[0010] [0008]Određeni broj ispitivanja, i iz životinjskih modela i iz kliničkog, ukazala su ulogu anti-toksin antitela u zaštiti odC. difficilepovezane bolesti. Hrčci imunizovani formalin inaktiviranim toksinom A i toksinom B gerenerisali su visoke nivoe anti-toksin antitela i bili su zaštićeni od letalnog čelendža C.difficilebakterije (Giannasca PJ i Warny M, Vaccine 22:848-856 (2004)). Pored toga, pasivni transfer mišjeg anti-toksin antitela zaštitio je hrčke na dozno zavisan način. Kvne L et al. (The Lancet 357:189-193

[0011] (2001)) pijavili su da je razvoj odgovora anti-toksin A antitela tokom inicijalne epizode CDAD u korelaciji sa zaštitom od recidiva bolesti.

[0012] Determinante prepoznate od strane zaštitinog anti-toksin antitela lokalizovane su u C-terminalnom domenu koji sadrži ponavljajuće jedinice koje funkcionišu kao domen vezivanja receptora. Inicijalno, Lverlv et al. (Current Microbiologv 21:29-32 (1990)) otkrivaju da je C-terminalni domen toksina A, koji sadrži 33 ponavljajućih jedinica, sposoban da indukuje proizvodnju neutralizujućeg anti-toksin antitela i može zaštititi od infekcije C.difficile.U ovom iszpitivanju hrčcima je subkutano injektovan prečišćen rekombinantni polipeptid više puta pre čelendžovanja bakterijom, međutim, postignuta je samo delimična zaštita. Još jedno ispitivanje (Rvan et al., Infect. Immun. 65:2941-49

[0013] (1997)) pokazalo je da izolovani polipeptid koji sadrži 720 amino kiselinskih ostataka iz C-terminusa CTA i sekrecioni signal hemolizizina A izE. coli(eksprimiran uVibrio cholerae)indukuju zaštitni sistemski i mukozalni imunitet proitv male doze CTA u zečijem CDAD modelu.

[0014] Takođe je prijavljeno da je neophodan odgovor antitela protiv C-terminalnog domena oba toksina A i B kako bi se postigla potpuna zaštita (Kink i Williams, Infect. Immun. 66:2018-25 (1998), U.S. Pat. No. 5,736,139 (1998)). Ovo ispitivanje otkrilo je da je C-terminalni domen svakog toksina najefektivniji u generisanju toksin-neutralizujućih antitela. To pokazuje efektivnost oralno dostavljenih ptičijih antitela (antitoksin) podignutih protiv C-terminalnog domena za CTA i CTB u letalnom modelu kod hrčka. Rezultati takođe indikuju da antitoksin može biti efektivan u tretiranju i upravljanju CD AD kod ljudi. U još jednom ispitivanju, potvrđeno je da humana anti-toksin A i B monoklonalna antitela obezbeđuju zaštitu protiv smrtnosti kod hrčaka izazvane C.difficile(Babcock et al., Infect. Immun. 74:6339-6347 (2006)). Zaštita je primećena samo od strane antitela usmerenih protiv domena vezivanja receptora bilo kog toksina, a pojačana zaštita primećena je nakon tretiranja sa oba anti-toksin A i B antitela.

[0015] [0011]Sa druge strane, Ward et al. (Infect. Immun. 67: 5124-32 (1999)) uzimaju u obzir 14 ponavljajućih jedinica iz C.difficiletoksina A (14 CTA) za ispitivanje aktivnosti adjuvansa. Ponavljajuće jedinice su klonirane i eksprimirane bilo sa N-terminalnom polihistidinskom oznakom (14 CTA-HIS) ili fuzionisane za netoksični domen vezivanja iz tetanus toksina (14 CTA-TETC). Oba fuziona proteina data intranazalno gerenerisali su anti-toksin A serum antitela, ali bez odgovora na mukoznoj površini kod miševa. Pojačani sistemski i mukozalni anti-toksin A odgovori primećeni su nakon ko-davanja saE. coli toplotno-labilnimtoksinom (LT) ili njegovim mutiranim oblikom LTR72. Na osnovu tih podataka, Wardetal.Predlažu primenu ne-toksične 14 CTA-TETC fuzije kao mukozalni adjuvans u humanoj vakcini usmerenoj protiv klostridijalnih patogena.

[0016] Skorija biohemijska ispitivanja o domenima ponavljajućih jedinica C.difficiletoksina pozabavila se minimalnim sekvencijalnim zahtevima za obrazovanje stabilne tercijarne strukture (Demarest SJ et al., J. Mol. Bio. 346:1197-1206 (2005)). Peptid 11 ponavljajuće jedinice izveden iz toksina A, pronađen je sa pravilnom tercijarnom strukturom, a ponavljajućih jedinica 6 i 7 iz toksina A i B nisu. Pronađeno je da pravilno savijeni segment 11 ponavljajuće jedinice održava osobinu vezivanja receptora. Drugo ispitivanje ispitivalo je funkcionalne karakteristike fragmenata toksina A koji sadrže 6, 11 ili 15 ponavljajuće jedinice (DingleT, Glikobiologv 18:698-706 (2008)). Samo 11 i 15 ponavljajuće jedinice bile su sposobne da komepetitivno inhibiraju toksin neutralizujuću sposobnost anti-toksin A antitela. Dok su Dok je za sva 3 fragmenta pronađeno da imaju hemaglutinacionu aktivnost, duži fragmenti pokazali su veću hemaglutinacionu aktivnost od onih kraćih. Podaci ukazuju da su struktura domena vezivanja receptora toksina i imunogenost zadržane u fragmentima domena koji sadrže više od 11-14 ponavljanja.

[0017] Thomas et al. (WO97/02836, U.S. Pat. No. 5,919,463 (1999)) takođe opisujuC. difficiletoksin A, toksin B i određene njihove fragmente( npr.,C-terminalni domen koji sadrži neke ili sve od ponavljajućih jedinica) kao mukozalne adjuvanse. Oni su pokazali da je intranazalno davanje CTA ili CTB značajno pojačalo mukozalni imuni odgovor na heterologni antigen kao što jeHelicobacter pyloriureaza, ovalbumin, ili hemocijanin iz morskih puževa (KLH) u višestrukim mišjim odeljcima i povezan je sa zaštitom protiv čelendža saHelicobacter.Dodatno, aktivnost adjuvansa toksina Afuzionog proteina procenjena je: 794 C-terminalni amino kiselinski ostaci CTA koji obuhvat ARUs (toksin A ponavljajuće jedinice) fuzionisani su sa glutaciona-S-transferaza (GST), a rezultujući polipeptid GST-ARU eksprimirana jeE. coli.Ovo ispitivanje demonstriralo je značajno pojačanje imunog odgovora od strane GST-ARU na ko-davane antigene u serumu i mukozalnim sekrecijama.

[0018] Sva ova ispitivanja sugerišu potencijalnu upotrebu ne-toksičnog, rekombinantnog proteina koji obuhvata bilo C.difficiletoksin A, ili toksin B, ili njihove fragmente, ili njihove kombinacije radi proizvodnje aktivne vakcine protiv CDAD. Trenutno, ni jedna vakcina protivC. difficilenije komercijalno dostupna, iako je kandidat vakcina koja se sastoji od formalin- detoksifikovanih celih toksina A i B procenjena u humanoj fazi I i Ma ispitivanja. Prijavljeno je da parenteralna imunizacija sa ovom vakcinom indukuje odgovore anti-toksin IgG i toksin-neutralizujućeg antitela (Kotloff KL et al., Infect. Immun. 69:988-995 (2001); Aboudola S et al., Infect. Immun. 71:1608-1610(2003)).

[0019] [0015]Literatura dalje pokazuje da bi konstrukcija rekombinantnog fuzionog proteina koji sadrži obe i toksin A i B domene vezivanja receptoraC. difficile,bilo u celosti ili njihove fragmente, bila efikasan i komercijalno održiv pristup za razvijanje vakcina. Takav pristup pokušan je sa dvodelnim fuzionim proteinom fragmenta 700 bazog para toksina A i fragment 1300 baznog para toksina B od strane Varfolomeeva et al. (Mol. Genetics, Microb. i Virol. 3:6-10 (2003)). Ovaj pristup je takođe opisan od strane Belyi i Varfolomeeva (FEMS Letters 225:325-9 (2003)) pokazujući konstrukciju rekombinantnog fuzionog proteina koji se sastoji od tri dela: dva C-terminalna domena sačinjenja od ponavljajuće jediniceC. difficiletoksina A i toksina B praćeno fragmentomClostridium perfringensenterotoksina Cpe. Fuzioni protein je eksprimiran uE. coli,ali je proizvod akumuliran u inkluzionim telima i nije bio stabilan. Štaviše, prinos čistog proizvoda postignut u ovom ispitivanju (50 u.g po 100 ml kulture) bilo je značajno nizak.

[0020] VVilkins et al. (VVO 00/61762, U.S. Pat. No. 6,733, 760 (2004)) takođe opisuju upotrebu ponavljajuće jedinicerekombinantnog C. difficile toksinaA i B (rekombinantni ARU i rekombinantni BRU)

[0021] i njihovih polisaharidnih konjugata u pripremi vakcine protiv CDAD. Rezultujući rekombinantni ARU protein obuhvata 867 amino kiselinskih ostataka dok rekombinantni BRU protein sadrži 622 amino kiseline u dužini. Za razliku od prethodno pomenutih ispitivanja, ovaj rad je pokazao ekspresiju visokog nivoa rekombinantnih ARU i BRU rastvorljivih proteina uE. coli.Miševi vakcinisani sa rekombinantnim ARU i sa polisaharidom-konjugovani rekombinantni ARU oba optočena visokim nivoom neutralizujućeg anti-toksin A antitela i koji su bili veoma zaštićeni od letalnog čelendža saC. difficiletoksinom A. Pored toga, VVilkinset al.Sugerišu primenu rekombinantnog fuzionog proteina koji se satoji od oba i ARU i BRU za pripremu vakcine.

[0022] Postoji potreba za razvijanjem vakcine protiv CDAD. Rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od ARU i BRU može biti potencijalno koristan kao vakcina.

[0023] Telferat al. (VVO 2010/017383) predlažu upotrebu oslabljenih mikroorganizama, kao što jeSalmonella;eksprimirajući na svojoj površini imunogeni polipeptid koji obuhvataC. difficileC-terminalne ponavljajuće jedinice toksina A i/ili C-terminalne ponavljajuće jedinice toksina B radi vakcinisanja protiv CDAD oralnim davanjem humanom subjektu. Taj rekombinantni polipeptid uključivao je najmanje 20 ponavljanja toksina A i/ili 15 ponavljanja toksina B, i dalje je uključivao signal sekrecije, npr., CIvA oznaku za S.typhimurium.

[0024] SUŠTINA PRONALASKA

[0025] [0019]Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju imunogena ili vakcine kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Ovde su opisani novi alati i postupci za konstruisanje, proizvodnju i upotrebu oblika toksina A i toksina BC. difficile.Ovde je opisan izolovani polipeptid C-TAB koji obuhvata SEQ ID NO:2 (C-TAB.G5) ili neki njegov derivat, SEQ ID NO: 4 (C-TAB.G5.1). C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 obuhvata 19 ponavljajućih jedinica C-terminalnog domena toksina A fuzionisane sa 23 ponavljajuće jedinice C-terminalnog domena toksina B. Ovde su opisane kompozicije i formulacije koje obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. Kompozicije ili formulacije mogu da sadrže izolovani polipeptid, dodatni antigen, adjuvans, i/ili ekscipijens. Alternativno, kompozicije ili formulacije mogu suštinski da se sastoje od izolovanog polipeptida bez adjuvansa ili drugih aktivnih sastojaka (ali koji opciono obuhvataju ekscipijens kao što je nosač, pufer i/ili stabilizator). Štaviše, kompozicije ili formulacije ovog pronalaska mogu da se daju istovremeno sa drugim lekovima kao što je antibiotik naročito kod npr. subjekata sa rekurentnom CDAD ili kod subjekata kojima je neophodna česta i/ili produžena upotreba antibiotika.

[0026] Ovde je opisana vakcina koja obuhvata ovde opisan izolovani polipeptid. Vakcina može dalje da obuhvata adjuvans, kao što je alum, adjuvans izveden iz ADP-ribozilacionog egzotoksina ili drugih. Vakcina može da se daje u jedno-doznom režimu, dvo-doznom režimu (data npr. unutar 3 do 20 dana, npr. nakon 10 do 15 dana od prve doze), tro-doznom režimu (data npr. nakon približno 7 dana i približno 21 dan od prve doze), ili više od tro-doznog režima, poželjno dvo- ili tro-doznom režimu, pri čemu doza obuhvata 20 u.g do 200u.g količine polipeptida ovog pronalaska.

[0027] Ovde je opisan postupak preveniranja, tretiranja, ili ublažavanja jednog ili više simptoma bolesti, kao što je CDAD, davanjem ovde opisanog izolovanog polipeptida, subjektu kome je to potrebno. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može da se daje subjektu intramuskularno ili drugom putanjom isporuke.

[0028] [0022]Ovde je opisan postupak preveniranja neke bolesti, kao što je CDAD, davanjem ovde opisanog izolovanog polipeptida ili neke kompozicije koja obuhvata pomenuti polipeptid, subjektu u riziku od CDAD, kao što je npr. subjekat sa sledećim profilom: i) subjekat sa slabijim imunim sistemom kao što je npr. stariji subjekat (npr. subjekat iznad 65 godina starosti) ili subjekat ispod 2 godine starosti; ii) imunokompromitovani subjekat kao što je npr. subjekat sa SIDA; iii) subjekat koji uzima ili planira da uzima imunosupresione lekove; iv) subjekat sa planiranom hospitalizacijom ili subjekat koji je hospitalizovan; v) subjekat koji je ili se očekuje da će biti u jedinici intenzivne nege (ICU); vi) subjekat koji se podvrgava ili planira da se podvrgava gastrointestinalnoj operaciji; vii) subjekat koji je ili planira da bude pod dugoročnom negom kao što je starački dom; viii) subjekat sa komorbiditetima koji zahtevaju čestu i/ili produženu upotrebu antibiotika; ix) subjekat koji je subjekat sa dva ili više od prethodno pomenutih profila, kao što je npr. stariji subjekat koji planira da se podvrgne gastrointestinalnoj operaciji; x) subjekat sa zapaljenskom bolesti creva; i/ili xi) subjekat sa rekurentnom CDAD kao što je npr. subjekat koji je iskusio jednu ili više episoda CDAD

[0029] Ovde su opisani postupci proizvodnje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se proizvesti iz nukleinske kiseline koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid koristeći bakterijski ekspresioni sistem, kao što jeE. coli ekspresionisistem.

[0030] Ovde je opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid gde su 19 ponavljajućih jedinica toksina A povezane sa 23 ponavljajuće jedinice toksina B putem linkera koji se sastoji od najmanje 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino kiselinskih ostataka. Kao primer, linker može da obuhvata sekvencu RSMH (Arg-Ser-Met-His) (amino kiseline 439-442 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4).

[0031] Ovde je opisana varijanta izolovanog polipeptida koji obuhvata najmanje jednu mutaciju (npr., umetanje, zamenu ili brisanje), na primer u ARU i/ili BRU. Sekvenca te varijanta može imati 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta sa SEQ ID NO: 2.

[0032] Ovde su opisani postupci za proizvodnju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida ili njegovih varijanti pomoću rekombinantnog DNK inženjeringa, bakterijske fermentacije i prečišćavanja proteina. Ovde su opisani postupci za konstruisanje nukleinskih kiselina koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. Ovde su opisani postupci proizvodnje C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovanog polipeptida koristeći bakterijski ekspresioni sistem, kao što jeE. coli ekspresionisistem.

[0033] Ovde su opisani postupci za preveniranje i tretiranje CDAD kod subjekata kojima je to potrebno, kao što su ljudi. U ovom postupku, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 se daje subjektu bilo sam ili se daje zajedno sa jednim ili više adjuvanasa kao što je alum ili ostali. Subjekti mogu biti zdravi pojedinci koji su u riziku od izlaganja C.difficile,humani subjekti koji su tretirani i oporavljeni od C.difficileinfekcije i koji su u riziku od ponovne infekcije od straneC. difficile,ili humani subjekti koji su trenutno inficirani C.difficilei čije stanje se može poboljšati indukcijom C.difficiletoksin-neutralizujućeg antitela.

[0034] [0028]Ovde je opisana imunogena kompozicija koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Imunogena kompozicija može dalje da uključi adjuvans kako bi se pojačao antigen-specifični imuni odgovor i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili druge komponente u formulaciji pogodnoj za davanje subjektu kome je to potrebno. Imunogena kompozicija može se dostaviti instramuskularnom (IM) dostavom, intradermalnom (ID) dostavom, subkutanom (SC) dostavom, intraperitonealnom (IP) dostavom, oralnom dostavom, nazalnom dostavom, bukalnom dostavom, ili rektalnom dostavom.

[0035] Ovde je opisana imunogena kompozicija koja izaziva antitela koja se vezuju za nativne C.difficiletoksine i neutrališu njihovu citotoksičnu aktivnost čime se obezbeđuje dugoročna, aktivna zaštita, i/ili tretiranje protiv C.difficilepovezane bolesti (CDAD).

[0036] Ovde su opisane imunogene kompozicije korisne za prevenciju ili tretiranje C.difficilepovezane bolesti kod subjekata kojima je to potrebno.

[0037] Ovde su opisane nukleinske kiseline i njihovi fragmenti ili varijante koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Ovde su opisani ekspresioni vektori koji obuhvataju nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1.

[0038] Ovde su opisana antitela i njihovi fragmenti, kao što su neutralizujuća, humanizovana, monoklonalna, himerna i poliklonalna antitela, specifična za C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Antitela ili njihovi fragmenti mogu da prepoznaju toksin A i/ili toksin B.

[0039] Ovde je opisana vakcina koja obuhvata polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 2 iliSEQIDNO:4.

[0040] Ovde su opisani dijagnostički kompleti koji obuhvataju ovde opisane nukleinske kiseline, polipeptide i/ili antitela.

[0041] Druga ostvarenja i prednosti ovog pronalaska navedeni su u delu opisa, koji sledi.

[0042] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0043] FIG. 1A pokazuje nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 izolovani polipeptid (SEQ ID NO: 1). FIG. 1B pokazuje sekvencu amino kiseline C-TAB.G5 izolovanog polipeptida (SEQ ID NO: 2). Amino kiselinski linker između domena toksina A i domena toksina B je podvučen.

[0044] FIG. 2A pokazuje nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid (SEQ ID NO: 3).

[0045] FIG. 2B pokazuje sekvencu amino kiseline C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida (SEQ ID NO: 4). Amino kiselinski linker između domena toksina A i domena toksina Bje podvučen. FIG. 3 pokazuje jačanje proizvodnje antitela kod C-TAB.G5 vakcinisanih miševa povećavanjem doze C-TAB.G5 i ko-dostavom sa alumnim adjuvansima. Miševi su primili dve vakcinacije IM injektovanjem. IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela procenjeni su pomoću ELISA dve nedelje nakon prvog i drugog injektovanja. FIG. 4 pokazuje grafičku reprezentaciju anti-C-TAB, anti-toksin A, i anti-toksin B IgG indukcije kod miševa koji su primali povećane doze C-TAB.G5 sa i bez aluma sa dva IM injektovanja. FIG. 5 pokazuje titre antitela tokom jednog log doznog opsega kod miševa imunizovanih sa C-TAB.G5 u prisustvu ili bez aluma. IgG titri procenjeni su pomoću ELISA dve nedelje nakon druge imunizacije. Podaci pokazuju da alum značajno povećava proizvodnju antitela kod vakcinisanih miševa. FIG. 6 pokazuje zaštitni efekat kod miševa vakcinisanih sa C-TAB.G5 (sa i bez aluma), a zatim izloženih letalnoj dozi toksina A ili toksina B. Miševi koji su primali dve vakcine (IM) u dvonedeljnom intervalu čelendžovani su (IP) tri nedelje kasnije. Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) ocenjena su dve nedelje nakon drugog injektovanja, i određen je procenat životinja koje su preživele letalni čelendž. Povišene doze C-TAB.G5 dodelile su veću TNA proizvodnju, kao i povišenu zaštitu od letalnog čelendža. Prisustvo aluma dalje je povećalo TNA proizvodnju, kao i što je dodelilo veće preživljavanje pri nižim dozama. FIG. 7 pokazuje poređenje odgovora antitela i efikasnost zaštite C-TAB.G5 kod vakcinisanih mladih (6-7 nedelja) i starih (18 meseci) miševa. Miševi koji su primali dve vakcine (IM) u dvonedeljnom intervalu čelendžovani su (IP) tri nedelje kasnije. Ocenjeni su ELISA IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela, TNA proizvodnju kao i ukupno preživljavanje. Mladi miševi pokazali su veći odgovor antitela čak i bez aluma, a obe grupe pokazale su poboljšano preživljavanje kada su vakcinisani u prisustvu aluma. FIG. 8 pokazuje poređenje kinetika razvoja anti-C-TAB IgG antitela kod vakcinisanih mladih i starih miševa. Mladi miševi pokazali su veće stope i raniju IgG proizvodnju, a obe grupe pokazale su poboljšane odgovore kada su vakcinisane u prisustvu aluma. FIG. 9 pokazuje poređenje u anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B proizvodnji antitela kod miševa imunizovanih bilo sa C-TAB.G5.1 ili toksoid A i B mešavinom (1:1). Miševi su primili dve vakcine IM injektovanjem. IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela procenjeni su pomoću ELISA dve nedelje nakon drugog injektovanja. Imunizacija sa toksoidom indukuje antitelo na molekulu N-terminalnog dela toksina dok imunizacija sa C-TAB indukuje antitelo na molekulu C-terminalno dela toksina. FIG. 10 pokazuje poređenje u TNA proizvodnji i zaštitu protiv čelendža sa toksinom A ili B kod miševa imunizovanih bilo sa C-TAB.G5.1 ili toksoid A i B mešavinom. Miševi koji su primali dve vakcine (IM) u dvonedeljnom intervalu čelendžovani su (IP) tri nedelje kasnije sa letalnom dozom toksina A ili toksina B. FIG. 11 pokazuje anti-C-TAB (A), anti-toksin A (B), i anti-toksin B (C) IgG proizvodnju kod hrčaka imunizovanih sa C-TAB.G5.1 sa i bez aluma. Hrčci su primili tri vakcine IM injektovanjem na dan 0 i dan 14. IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela procenjeni su pomoću ELISA na dan 14, 28 i 35. FIG. 12 pokazuje grafičku reprezentaciju razvoja anti-C-TAB IgG antitela kod hrčaka imunizovanih sa C-TAB.G5.1 sa ili bez aluma. FIG. 13 pokazuje poređenje u TNA i zaštite kod hrčaka imunizovanih sa C-TAB. G5.1 sa ili bez aluma. Dve nedelje nakon treće vakcinacije, hrčci su primili letalnu dozu toksina A ili toksina B IP injektovanjem. FIG. 14 pokazuje preživljavanje hrčaka vakcinisanih sa C-TAB.G5.1 nakon intragastričnog davanja letalne doze spora C.difficile.Podaci preživljavanja prikazani su kao Kaplan-Meier krive koje odgovaraju preživljavanju, a statistička analiza urađena je koristeći analizu log rangiranja. Pri svim dozama spora (10<2>, IO<3>i IO<4>), primećeno je 100 % preživljavanje hrčaka u vakcinisanoj grupi, a preživljavanje je značajno ojačano kada se uporedi sa placebo grupom. FIG. 15 pokazuje anti-C-TAB, anti-toksin A, i anti-toksin B proizvodnju antitela kod makaki majmuna imunizovanih sa C-TAB.G5.1 u prisustvu ili bez aluma. Dve grupe majmuna (tri po grupi, 4-6 godina) primili su 200 u.g C-TAB.G5.1 sa ili bez 250 u.g aluma. Uzorci krvi uzeti su ispitnog dana 0,14, 28 i 42. ELISA postupak korišćen je radi procenjivanja anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B IgG titara. FIG. 16 pokazuje poređenje imunogenosti C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 dostavljenog putem 1 u.g - 30 u.g doznog opsega bilo u PBS ili histidinskom puferu. Miševi su primili dve vakcine (IM) u dvonedeljnom intervalu. IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela procenjeni su pomoću ELISA dve nedelje nakon drugog injektovanja. Sva tri titra antitela nisu bila značajno različita (T-test analiza) između C-TAB.G5 dostavljenog u PBS ili histidinskom puferu i C-TAB.G5.1 dostavljnog u histidinskom puferu. FIG. 17 pokazuje poređenje imunogenosti C-TAB.G5, C-TABNCTB i C-TADCTB kod miševa. Miševi su primili dve vakcine svakog rekombinantnog proteina u dvonedeljnom intervalu IM injektovanjem. Sve imunizacije izvedene su u alumnom adjuvansom. IgG titri za anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B antitela procenjeni su pomoću ELISA dve nedelje nakon drugog injektovanja. Sva tri fuziona proteina pokazuju visoku imunogenost. FIG. 18 pokazuje zaštitu od čelendža sa nativnim toksinom B kod miševa. Miševi su imunizovani kako je indikovano za FIG. 17, a tri nedelje kasnije čelendžovani su IP injektovanjem letalnom dozom nativnog toksina B. FIG. 19 pokazuje poređenje u TNA i zaštiti kod hrčaka vakcinisanih bilo sa C-TAB.G5.1 ili C-TADCTB u odsustvu ili prisustvu aluma. Dve nedelje nakon treće vakcinacije, hrčci su primili letalnu dozu toksina A ili toksina B IP injektovanjem. FIG. 20 pokazuje TNA proizvodnju i zaštitu protiv čelendža toksinom A ili toksinom B kod miševa imunizovanih sa C-TAB.G5.1 u različitim režimima. Poređenje u TNA proizvodnji i zaštiti između grupe miševa vakcinisanih IM injektovanjem tri puta na dan 0, 3 i 14, ili na dan 0, 7 i 21, ili na dan 0,14 i 28. Tri nedelje nakon poslednjeg injektovanja, miševi su čelendžovani letalnom dozom toksina A ili toksina B (panel A je u obliku tabele, a panel B u obliku grafika). FIG. 21 pokazuje zaštitu (preživljavanje) protiv čelendža sa C.difficile toksinomA (55 ng/miš) kod miševa imunizovanih jednim davanjem 10u.g C-TAB.G5.1 i 12.5 u.g aluma (u 100 u.1). Pomenuti čelendž izveden je 21 dan, 35 dana ili 49 dana nakon imunizacije.

[0046] DETALJAN OPIS

[0047] Opšti opis

[0048] Ovde je opisana imunogena kompozicija za indukovanje zaštitnih i/ili terapeutskih imunih odgovora na C.difficile toksineA i B koja obuhvata upotrebu izolovanog polipeptida C-TAB.G5 (SEQ ID NO: 2) ili nekog njegovog derivata, C-TAB.G5.1 (SEQ ID NO: 4). koji obuhvata 19 ponavljajućih jedinica (RU) toksina A i 23 ponavljajuće jedinice (RU) toksina B ili peptidne fragmente, ili njihove varijante.

[0049] Ovde su opisani postupci proizvodnje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida i postupak pripremanja kompozicije (npr. vakcina) korisne u prevenciji i/ili tretiranju CDAD kod sisara. Sledeći opis obezbeđuje detalje i primere konstruisanja, eksprimiranja i prečišćavanja rekombinantnih izolovanih polipeptida, njihove primene kao antigeni za indukovanje specifičnog-imunog odgovora kao i procenjivanje zaštite kod subjekata. Subjekti mogu biti životinje ili ljudi.

[0050] C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi za upotrebu u ovde opisanim postupcima i kompozicijama mogu se pripremiti koristeći bilo koje od nekoliko standardnih postupaka. Na primer, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 može se proizvesti koristeći standardne rekombinantne DNK tehnike, gde je pogodna ćelija domaćin transformisana sa pogodnim ekspresionim vektorom koji sadrži deo fragmenta toksin-kodorajuće nukleinske kiseline (videtinpr.Dove et al., Infect. Immun. 58:480-8 (1990), i Barroso et al., Nucleic Acids Research 18:4004 (1990). Bilo koji od širokog spektra ekspresionih sistema može se koristiti za proizvodnju rekombinantnih polipeptida. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 mogu se proizvesti u prokariotskom domaćinu( npr.bakterija, kao što jeE. coliiliBacillus)ili u eukariotskom domaćinu( npr.ćelije kvasca, ćelije sisara( npr.COS1, NIH3T3, ili JEG3 ćelije), ili ćelije insekata( npr. Spodoptera frugiperda(SF9) ćelije)). Takve ćelije dostupne su kod, na primer, American Tvpe Culture Collection (ATCC). Postupak transformacije i transfekcije i odabir ekspresionog vektora zavisiće od odabranog sistema domaćina. Postupci transformacije i transfekcije opisani su od strane,npr.,Ausubeletal.,ISBN: 047132938X C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1, naročito kratki fragmenti, takođe se mogu proizvesti hemijskom sintezom, npr., postupcima opisaim u Solid Phase Peptide Svnthesis, 1984, 2nd ed., Stewart i Mladi, Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, III., ili standardnim in vitro translacionim postupcima.

[0051] Pored C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 sekvenci, ovde su opisane njihove varijante koje su funkcionalno aktivne i imunogene. Te varijante mogu imati isti nivo imunogenosti kao i C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Ta varijanta može imati amino kiselinske supstitucije, delecije, ili umetke u poređenju sa SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4. Geni koji kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 ili njihove varijante mogu se izraditi primenom standardnih postupaka (videti ispod; takođe videti,npr.Ausubelet al.,gore).

[0052] [0041]Pored C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 sekvenci, ovde su opisani dalji derivati C-TAB.G5 koji obuhvataju dodatna ponavljanja. Kao primer, fuzioni protein, C-TABNCTB (SEQ ID NO: 18, kodiran pomoću SEQ ID NO: 17), obuhvata, kao i C-TAB.G5,19 ponavljajućih jedinica CTA (amino kiseline 2272-2710), 23 ponavljajuće jedinice CTB (amino kiseline 1850-2366), i dalje dodatnih 10 ponavljanja CTB (amino kiseline 1834-2057) fuzionisane sa C-terminusom CTB. Dalja varijanta, C-TADCTB fuzioni protein (SEQ ID NO: 20, kodiran pomoću SEQ ID NO: 19) obuhvata C-TAB.G5 (19 ponavljanja CTA i 23 ponavljanja CTB) plus dodatne 24 ponavljajuće jedinice CTB (amino kiseline 1834-2366) fuzionisane sa C-terminusom C-TAB.G5. Varijanta takođe može da obuhvata dodatne kopije C-TAB.G5 ili njegovog dela. Na primer, C-TADCTB obuhvata dvostruki deo ponavljajućih jedinica CTB prisutnog u C-TAB.G5.

[0053] Ovde su opisani postupci za ekpresiju visokog nivoa C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 u bakterijskom sistemu kao stojeE. coli kojaobuhvata uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju C-TAB. G5 ili C-TAB.G5.1 u bakterijskoj ćeliji domaćinu i koja eksprimira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1.

[0054] Dodatno, ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može biti kovalentno kuplovan ili umrežen sa adjuvansima (videti,npr.,Crvz et al., Vaccine 13:67-71(1994); Liang et al., J. Immunologv 141:1495-501 (1988) i Czerkinskv et al., Infect. Immun. 57:1072-77 (1989)).

[0055] Ovde je opisana vakcina koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid koji može da zaštiti i obezbedi terapiju protiv CDAD. Ovde opisana vakcina obuhvata novi antigen koji se može dostaviti intramuskularnim (IM), intradermanim (ID), subkutanim (SC), oralnim, nazalnim, bukalnim, ili rektalnim putem. Vakcina može da obezbedi imunu zaštita ili indukuje antitela za pasivnu imunizaciju.

[0056] Ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid obezbeđuje neku vakcinu za imunizaciju protiv CDAD. Ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid ili njegove varijante, predstavlja kandidat kombinovane vakcine usmeren da proširi pokrivanje zaštite protiv C.difficilepovezanih bolesti, kao što je CDAD, do nivoa koji do sada nije poznat niti objavljen. Ovaj koncept pojedinačne vakcine koji pruža zaštitu ili umanjuje ozbiljnost C.difficilepovezanih bolesti, predstavlja unikatan koran napred u upravljanju javnim zdravljem na globalnom nivou, a naročito redukovanju ozbiljnosti epidemija (npr. starački domovi, kruzeri).

[0057] Kako se ovde koristi, "toksin A protein" ili "toksin B protein" odnosi se na toksične proteine C.difficilekoji su primarno odgovorni za CDAD. Toksin A i toksin B obuhvataju višestruko ponavljajuće jedinice odgovorne za imunogenost u C-terminalnim vezujućim domenima.

[0058] Kako se ovde koristi "divlji-tip" ili "nativni" odnosi se na neki protein pune dužine sačinjen nukleinske kiseline ili sekvence amino kiseline kakva bi endogeno mogla da se nađe u ćeliji domaćinu.

[0059] [0048]Kako se ovde koristi, izrazi" Clostridium difficilepovezana bolest", "bolest koja se odnosi naClostridium difficile","bolest povezana saClostridium difficile", " Clostridium difficiletoksin-posredovana bolest"," Clostridium difficileinfekcija", i "CDAD" odnose se na bolesti izazvane, direktno ili indirektno, infekcijom saClostridium difficile.

[0060] "Antigen" se odnosi na supstancu koja indukuje specifičan imuni odgovor kada se predstavi imunim ćelijama nekog organizma. Na primer, antigen može biti nukleinska kiselina, protein, polipeptid, peptid, glikoprotein, ugljeni hidrat, lipid, glikolipid, lipoprotein, fuzioni protein, fosfolipid, ili konjugat njihove kombinacije. Antigen može da obuhvata jedan imunogeni epitop, ili više imunogenih epitopa prepoznatih od strane receptora B-ćelije( tj.,antitelo na membrani B ćelije) ili receptora T-ćelije. Antigen se može obezbediti kao čestica nalik virusu (VLP) ili kao ceo mikrob ili mikroorganizam kao što je, na primer, bakterija ili virion. Antigen može biti neki inaktivirani ili oslabljeni živi virus. Antigen se može dobiti iz ekstrakta ili lizata, bilo iz cele ćelije ili samo iz membrane; ili, antigen se može hemijski sintetizovati ili proizvesti na rekombinantan način. Antigen može da se daje sam ili sa adjuvansom. Jedan molekul antigena može imati i karakteristike antigena i adjuvansa.

[0061] Pod "adjuvansom" podrazumeva se bilo koja supstanca koja se koristi da specifično ili ne-specifično pojača antigen-specifičan imuni odgovor, moguće putem aktivacije ćelija koje predstavljaju antigen. Primeri adjuvanasa uključuju uljanu emulziju (npr., kompletan ili nekompletan Freundov adjuvans), Montanide nekopmletni Seppic adjuvans kao što je ISA, emulzione adjuvanse tipa ulje u vodi kao što je Ribi sistem adjuvansa, formulaciju sintaksa adjuvansa koja sadrži muramil dipeptid, adjuvans soli aluminijuma (ALUM), polikatjonski polimer, naročito polikatjonski peptid, naročito poliarginin ili peptid koji sadrži najmanje dva LvsLeuLvs motiva, naročito KLKLLLLLKLK, imunostimulatorni oligodeoksinukleotid (ODN) koji sadrži ne-metilovane citozin-gvanin dinukleotide (CpG) u definisanom baznom kontekstu (npr., kako je opisano u WO 96/02555) ili ODN-ove na bazi inozina i citidina( npr.,kako je opisano u VVO 01/93903), ili deoksinukleinsku kiselinu koja sadrži deoksi-inozin i/ili deoksiuridinske ostatke (kako je opisano u VVO 01/93905 i WO 02/095027), naročito Oligo(dldC)<i3>(kako je opisano u VVO 01/93903 i VVO 01/93905), neuroaktivno jedinjenje, naročito humani hormon rasta (opisan u VVO 01/24822), ili njihove kombinacije, hemokin( npr.,defensini 1 ili 2, RANTES, MlPl-a, MIP-2, interleukin-8, ili citokin( npr.,interleukin-lp, -2, -6, -10 ili -12; interferon-y; faktor-a nekroze tumora; ili granulocitni-monocitni-kolonija stimulacioni faktor) (obrađeno u Nohria i Rubin, 1994), varijanta muramil dipeptida( npr.,murabutid, treonil-MDP ili muramil tripeptid), sintetičke varijante MDP, protein toplotnog šoka ili njegova varijanta, varijanta Leishmania major LelF (Skeiky et al., 1995, J. Exp. Med. 181:1527-1537), ne-toksične varijante bakterijskih ADP-ribozilacionih egzotoksina (bAREs) uključujući varijante na mestu cepanja tripsina (Dickenson i Clements, (1995) Infection and lmmunity 63 (5): 1617-1623) i/ili ribozilaciju koja utiče na ADP (Douceet al.,1997) ili hemijski detoksikovane bAREs (toksoidi), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamil-L-alanin-2-[l,2-dipalmitoil-s-glicero-3-

[0062] (hidroksifosforiloksi)]etilamid (MTP-PE) i kompozicije koje sadrže metabolizovano ulje i emulzioni agens. Adjuvans može da se daje sa antigenom ili se može davati sam, bilo istom putanjom, ili drugačijom putanjom od one kojom se daje antigen. Jedan molekul adjuvansa može imati osobine i adjuvansa i antigena.

[0063] Pod "efektivna količina" podrazumeva se neka količina terapeutskog agensa dovoljna da indukuje ili pojača antigen-specifičan imuni odgovor, za antigen, ili tretira ili dijagnostikuje stanje, za lek. Takvo indukovanje imunog odgovora može obezbediti tretiranje kao što je, na primer, imunozaštita, desensitizacija, imunosupresija, modulacija autoimune bolesti, potencijator imunološkog nadzora kancera, ili terapeutska vakcinacija protiv neke utvrđene infektivne bolesti. Tretiranje uključuje lečenje, ublažavanje, ili prevenciju.

[0064] Pod "nukleinska kiselina" podrazumeva se bilo jedna baza deoksiribonukleinske kiseline ili ribonukleinska kiselina ili njena sekvenca spojene fosfodiestarskim vezama.

[0065] Pod "terapeutski agens" podrazumeva se bilo koji molekul sposoban za upotrebu u tretiranju bolesti, ublažavanju simptoma bolesti, preveniranju bolesti, ili dijagnistikovanju bolesti. Na primer, terapeutski agens može biti antigen ili lek.

[0066] Pod "subjekat" podrazumeva se neka životinja. Subjekat može biti bilo koja životinja, uključujući bilo koje kičmenjake. Subjekat može biti domaća stoka, laboratorijska životinja (uključujući, ali ne ograničavajući se na, glodare kao što je pacov, hrčak, gerbil, ili miš) ili kućni ljubimac. U jednom ostvarenju, životinja može biti sisar. Primeri sisara uključuju ljude, primate, torbare, pse, majmune, glodare, mačke, majmune, kitove, delfine, krave, svinje, i konje. Subjektu može biti potrebno tretiranje bolesti ili mu može biti potrebno profilaktičko tretiranje.

[0067] Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" označava imunoglobulinski molekul ili fragment imunoglobulinskog molekula sa sposobnošću da se specifično veže za određeni antigen. Antitela su dobro poznata stručnjiacima iz oblasti imunologije. Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" označava ne samo molekule antitela pune dužine već i fragmente molekula antitela koji zadržavaju antigen vezujuću sposobnost. Takvi fragmenti dobro su poznati u ovoj oblasti i regularno se upošljavaju iin vitroiin vivo.Određenije, kako se ovde koristi, izraz "antitelo" označava ne samo imunoglobulinske molekule pune dužine već i antigen vezujuće aktivne fragmente kao što su dobro poznati aktivni fragmenti F(ab')2, Fab, Fv, i Fd.

[0068] Kako se ovde koristi, izraz "varijante" mogu da uključe proteine i/ili polipeptide i/ili peptide koji se razlikuju od polipeptida divljeg-tipa, gde su jedan ili više ostataka konzervativno supstituisani funkcionalno sličnim ostatkom, i dalje koji pokazuje suštinski iste funkcionalne osobine polipeptida divljeg-tipa. Primeri konzevativnih supstitucija uključuju supstituciju jednog ne-polarnog (hidrofobnog) ostatka za drugi( npr.izoleucin, valin, leucin ili metionin) za još jedan, supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka za još jedan( npr.između arginina i lizina, između glutamina i asparagina, između glicina i serina), supstituciju jednog baznog ostatka za još jedan( npr.lizin, arginin ili histidin), ili supstituciju jednog kiselog ostatka za još jedan( npr.asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina). Varijanta može da uključi bilo koji polipeptid sa tercijarnom strukturom suštinski identičan polipeptidu ovog pronalaska koji takođe pokazuje funkcionalne osobine ovde opisanih polipeptida. Varijanta može biti mutant polipeptida divljeg tipa.

[0069] Kako se ovde koristi "tretiranje" može da uključi bilo koji tip intervencije upotrebljene kao pokušaj da se izmeni prirodni kurs pojedinca ili ćelije. Tretiranje može da uključi, ali nije ograničeno na, davanjenpr.,farmaceutske kompozicije, same ili u kombinaciji sa drugim modalitetima za tretiranje koji su opšte poznati u ovoj oblasti. "Tretiranje" može biti izvedeno profilaktički, ili nakon započete patogene pojave.

[0070] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" može da uključi bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa aktivnim sastojskom, omogućava da taj sastojak zadrži biološku aktivnost i da ne uđe u reakciju sa imunim sistemom subjekta. Farmaceutski prihvatljivi nosači i/ili ekscipijensi mogu da uključe pufere, stabilizatore, razblaživače, prezervativ, i sredstva za poboljšanje rastvaranja. Uopšteno, priroda nosača ekscipijenasa zavisiće od određenog načina davanja koji se koristi. Primera radi, parenteralne formulacije obično obuhvataju injektabilne tečnosti koje uključuju farmaceutski i fiziološki prihvatljive tečnosti kao što je voda, fiziološki rastvor, izbalansirani slani rastvori, vodene dekstroze, glicerol i slično, kao vozilo. Za čvrste kompozicije (npr. oblici praha, pilule, tablete, ili kapsule), mogu se uključiti konvencionalni ne-toksični čvrsti nosači, na primer, manitol, laktoza, škrob, ili magnezijum stearat farmaceutskih gradi. Pored biološki neutralnih nosača, farmaceutske kompozicije koje se mogu davati sadrže minorne količine ne-toksičnih pomoćnih supstanci, kao šo su agensi za vlaženje i emulzovanje, prezervativi, i agense za PH puferovanje i slično, na primer natrijum acetat ili sorbitan monolaurat.

[0071] [0059]Kako se ovde koristi, "fuzija" može da se odnosi na nukleinske kiseline i polipeptide koji obuhvataju sekvence koje se prirodno ne pojavljuju međusobno povezane u redosledu ili kontekstu u kojem su smeštene u skladu sa ovim pronalaskom. Fuziona nukleinska kiselina ili polipeptid ne obuhvataju neminovno prirodnu sekvencu nukleinske kiseline ili polipeptida u svojoj celosti. Fuzioni proteini imaju dva ili više segmenata međusobno spojeni putem normalnih peptidnih veza. Fuziona nukleinske kiseline ima dva ili više segmenata međusobno spojena putem normalnih fosfodiestarskih veza.

[0072] Izolovani polipeptidi

[0073] Ovde su opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi kako je navedeno u SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, respektivno, koji obuhvataju 19 ponavljajućih jedinica C.difficiletoksina A i 23 ponavljajuće jedinice C.difficiletoksina B. Homolog C-TAB.G5, kao što je C-TAB.G5.1, može se razlikovati od C-TAB.G5 za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino kiselina. C-TAB. G5.1 polipeptid je fuzioni protein koji sadrži isti C-terminalni domen toksina B kao i C-TAB.G5, a C-terminalni domen toksina A izveden je iz C.difficilesoja VPI-10463 koji je homologan u skladu sa C-TAB.G5 polipeptidom izvedenim iz C.difficilesoja 630 i razlikuje se za dve amino kiseline na položajima 155-156. C-TAB.G5.1 kodirajuća sekvenca, kako je navedeno u SEQ ID NO: 3, kodon-optimizovana je radi poboljšane ekspresije unutarE. coli ćelijedomaćina. Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu biti efektivni neutralizovanju toksičnih efekataC. difficiletoksina A i toksina B.

[0074] Toksin A i toksin B kodirani su pomoćutrdA(SEQ ID NO: 5) itrdB(SEQ ID NO: 7) gena,C. difficilesoja 630, respektivno. Strukrutalno,C. difficiletoksini obuhvataju ADP-glikozil transferaza domen, cistein proteaza domen, hidrofobni region, i receptor vezujući region. C-terminalni domen sadrži veoma ponavljajuće jedinice (RUs) (takođe poznate kao kombinovano ponavljajući oligope ptidi (CROPS)). RUs mogu biti dugi ili kratki oligopeptidi i mogu da obuhvataju 20 do 50 amino kiselina sa konsenzus YYF motivom koji se ponavlja. RUs su grupisane u klastere. Kao na primer, toksin A, soj 630 (SEQ ID NO: 6) kodiran pomoću divljeg-tipatrdAgena (SEQ ID NO: 5) sadrži 39 RUs. 39 RUs su grupirane u 8 klastera. Toksin B, soj 630 (SEQ ID NO: 8) kodiran pomoću divljeg-tipatrdBgena (SEQ ID NO: 7)koji sadrži 24 RUs koje su grupisane u 5 klastera. Tabele 1 i 2 ispod, pokazuju amino kiselinske položaje svake od RUs u C.difficiletoksinu A i toksinu B kodirane pomoćutrdAgena itrdBgena.

[0075]

[0076] Shodno tome, C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi obuhvataju 19 RUs iz C-terminalnog domena C.difficile toksinaA i 23 RUs iz C-terminalnog domena C.difficile toksinaB, respektivno. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 obuhvataju toksin A amino kiseline 2272-2710 iz SEQ ID NO: 6 fuzionisan sa toksin B amino kiselinama 1850-2366 iz SEQ ID NO: 8. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid obuhvata sekvencu amino kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, respektivno.

[0077] Respektivni RUs u C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanom polipeptidu takođe mogu biti iz varijante C.difficiletoksina A ili toksina B. Ove RUs u C-TAB izolovanom polipeptidu takođe mogu biti kombinacija prirodnog ili varijanteC. difficiletoksina A ili toksina B.

[0078] RUs u C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanim polipeptidima obuhvataju duge RUs i kratke RUs, i duge Rus, a kratke RUs organizovane su u klaster. C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptidi ovog pronalaska obuhvata 4 klastera 3 do 5 kratkih RUs praćeni jednom dugom RU C.difficiletoksina A i 5 klastera 3 do 5 kratkih RUs praćenih jednom dugom RU C.difficiletoksina B.

[0079] Kratke i duge RUs sadrže konzervirane motive. Kratka ponavljajuća jedinica može da obuhvata 15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ili 26 amino kiselina. Svaka kratka ponavljajuća jedinica može da obuhvata konzervirane tirozin motive, kao što je YYF, FYF, YFF, FYI, ili HYF. Kratka ponavljajuća jedinica može dalje da obuhvata aspartat/histidin ostatak pre tirozin motiva ukoliko je sledeća ponavljajuća jedinica duga ponavljajuća jedinica. Duga ponavljajuća jedinica može da obuhvata 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 amino kiselina. Svaka duga ponavljajuća jedinica može da obuhvata tirozin ponavljajući motiv kao što je FEYF, FKYF, ili YKYF.

[0080] U ovom pronalasku, toksin A i toksin B delovi C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida mogu biti fuzionisani deirektno zajedno. Toksin A i toksin B delovi mogu biti razmaknuti regionom linkera. Region linkera može da obuhvata 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11 do 15, 20 do 30,40, 45, ili 50 amino kiselina. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da se region linkera može adaptirati kako bi se izmenilo pozicioniranje toksin A i toksin B delova tako da je u njihovom eksprimiranom i preklopljenom obliku, svaka toksin ponavljajuća jedinica C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovanim polipeptidima, pozicionirana tako da optimalno izlaže potencijalne epitope i zadržava svoju imunogenost. RUs i klasteri u C-TAB izolovanim polipeptidima takođe se mogu razdvojiti linkerima. U jednom ostvarenju, linker obuhvata peptid RSMH (439-442 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4).

[0081] [0067]Ovde opisani C-TAB izolovani polipeptidi mogu imati najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencijalnog identiteta ili sekvencijalne sličnosti sa SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4. Kako je poznato u ovoj oblasti "sličnost" između dva polipeptida ili polinukleotida određena je poređenjem amino kiselinske ili nukleotidne sekvence i njenih konzerviranih nukleotidnih ili amino kiselinskih supstitucija jednog polinukleotida ili polipeptida u sekvenci drugog polinukleotida ili polipeptida. Takođe poznat u struci je "identitet" koji označava stepen sekvencijalne povezanosti između dva polipeptida ili dva polinukleotida sekvence kako je određeno identifikovanjem poklapanja između dve niti takvih sekvenci. Oba i identitet i sličnost mogu se lako izračunati (Computational Molecular Biologv, Lesk, A. M., edv Oxford Universitv Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analvsis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersev, 1994; Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analvsis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, NewYork, 1991). Dok postoji više postupaka za merenje identiteta i sličnosti između dve polinukleotidne ili polipeptidne sekvence, izrazi "identitet" i "sličnost" dobro su poznati stručnjacima iz te oblasti (Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analvsis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Postupci koji se uobičajeno koriste radi određivanja identiteta ili sličnosta između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na one opisane u Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, i Carillo, H., i Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073

[0082] (1988).

[0083] Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi su imunogeni. Na primer, ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu imati najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% imunološke aktivnosti odgovarajućeg bakterijskog toksina A, a C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu imati najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% imunološke aktivnosti odgovarajućeg bakterijskog toksina B. Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu se koristiti kao vakcine za tretiranje, preveniranje, ili ublažavanje simptoma CDAD

[0084] Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi takođe uključuju varijante C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida koji ima SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4, respektivno. Varijante mogu imati amino kiselinske umetke, supstitucije i/ili delecije koje imaju minimalan do nikakav efekat na aktivnost, funkciju ili oblik izolovanog polipeptida. Primeri takvih supstitucija uključuju supstituciju jednog ne-polarnog ostatka sa nekim drugim, supstituciju jednog polarnog ostatka sa nekim drugim, supstituciju jednog baznog ostatka sa nekim drugim, ili supstituciju jednog kiselog ostatka sa nekim drugim. Varijante C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida mogu dalje da uključuju umetke, supstitucije i/ili delecije amino kiselina u odnosu na sekvencu amino kiseline ekstracelularnog domena nativnog toksina A ili toksina B što daje minimalni efekat na aktivnost, funkciju i/ili strukturu polipeptida. Stručnjacima iz ove oblasti poznate su ne-prirodne amino kiseline koje se takođe mogu primeniti. Ne-prirodne amino kiseline uključuju, na primer, beta-alanin (beta-Ala), ili druge omega-amino kiseline, kao što je 3-amino propionska, 2,3-diamino propionska (2,3-diaP), 4-amino buterna i tako dalje, alfa-aminizobuterna kiselina (Aib), sarkozin (Sat), ornitin (Orn), citrulin (Cit), t-butilalanin (t-BuA), t-butilglicin (t-BuG), N-metilisoleucin (N-Melle), fenilglicin (Phg), i cikloheksilalanin (Cha), norleucin (Nle), cisteinska kiselina (Cva) 2-naftilalanin (2-Nal); l,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-3-carboksilna kiselina (Tic); beta-2-tienilalanin (Thi); i metionin sulfoksid (MSO).

[0085] [0070]Nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde opisane C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide mogu biti kodon optimizovane kako bi se pojačala ekspresija u različitim ćelijama domaćinima. Kodon optimizacija odnosi se na modifikovanje nukleotidne sekvence kako bi se pojačala ekspresija proteina u prikladnoj ćeliji domaćinu zamenom jednog ili više kodona nativne sekvence sa kodonima koji se češće koriste u genima te ćelije domaćina ili u genima domaćina iz kojeg je izvedena ćelija. Razne vrste pokazuju posebnu sklonost ka određenim kodonima određene amino kiseline. Ovde je opisana kodon-optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid radi pojačane ekspresije

[0086] u E. coli.

[0087] Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu se pripremiti bilo kojim poznatim tehnikama. Na primer, izolovani polipeptidi mogu biti eksprimirani putem genetskog inženjeringa. Kao primer, translacija rekombinantne DNK. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi takođe se mogu pripremiti sintetički. Kao primer, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu biti sintetizovani koristeći sintetičkui tehniku čvrste faze inicijalno opisana od strane Merrifield (J. Am Chem. Soc. 85:2149-2154). Druge tehnike sinteteizovanja polipeptida mogu se naći kod, na primer, Kent et al.

[0088] (1985) u Svnthetic Peptidi in Biologv and Medicine, eds. Alitalo et al., Elsevier Science Publishers, 295-358.

[0089] Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu biti izolovani ili obezbeđeni u suštinski čistom obliku. Suštinski čisto označava da su proteini i/ili polipeptidi i/ili peptidi suštinski oslobođeni ostalih supstanci sa kojima se mogu naći u prirodi iliin vivosistemima u izvesnoj meri praktični i pogodni za njihovu namenjenu i pogodnu upotrebu. Određenije, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi su dovoljno čisti i dovoljno oslobođeni od ostalih bioloških konstituenata njihovih ćelija domaćina tako da mogu biti korisni u, na primer, generisanju antitela, sekvencionisanju, ili proizvodnji farmaceutskih preparata. Dobro poznatim tehnikama, suštinski čisti polipeptidi mogu se proizvesti u svetlu ovde opisanih sekvenci nukleinske kiseline i amino kiseline. Kako suštinski prečišćen izolovani polipeptid ovog pronalaska može biti pomešan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem u neki farmaceutski preparat, izolovani polipeptid može da obuhvata samo određeni maseni procenat preparata. Bez obzira na to, izolovani polipeptid je suštinski čist tako da je suštinski izdvojen iz supstanci sa kojima može biti povezan u živim sistemima.

[0090] Ovde su opisani izolovani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi koji obuhvataju dodatne polipeptide. Dodatni polipeptidi mogu biti fragmenti većeg polipeptida. U jednom ostvarenju, postoji jedan, dva, tri, četiri, ili više dodatna polipeptida fuzionisani sa C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanim polipeptidima. U nekim ostvarenjima, dodatni polipeptidi su fuzionisani ka amino terminusu C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. U drugim ostvarenjima, dodatni polipeptidi su fuzionisani ka karboksil terminusu C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. U daljim ostvarenjima, dodatni polipeptidi ravnaju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. U još daljem ostvarenju, dodatni polipeptidi su dispergovani između toksin A dela i toksin B dela C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida.

[0091] U nekim ostvarenjima, dodatni polipeptidi pomažu u usmeravanju sekrecije ili podćelijske lokalizacije C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. Takvi polipeptidi nazivaju se "pojedinačna sekvenca." Sekretorni signal je opisan, na primer u U.S. Pat. 6,291,212 i U.S. Pat 5,547,871.

[0092] Sekreciona signalna sekvenca kodira sekrecione peptide. Sekrecioni peptid je neka sekvenca amino kiseline koja deluje tako da usmerava sekreciju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 iz ćelije. Sekrecioni peptidi generalno su oakarakterisani jezgrom hidrofobnih amino kiselina i tipično su (ali ne isključivo) pronađeni na amino terminusima novo sintetizovanih proteina. Sekrecioni peptid može biti pocepan iz C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida tokom sekrecije. Sekrecioni peptidi mogu da sadrže mesta obrade koja omogućavaju cepanje signalnog peptida iz zrelog proteina kako on prolazi kroz sekrecionu putanju. Mesta obrade mogu biti kodirana signalnog peptida ili mogu biti dodata signalnom peptidu pomoću, na primer,in vitromutageneze. Sekrecione signalne sekvence mogu biti neophodne za kompleksne serije post-translacionih faza obrade kako bi se omogućila sekrecija C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Signalna sekvenca može odmah pratiti inicijalni kodon i kodirati signalni peptid na amino-terminalnom kraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. Signalna sekvenca može prethoditi zaustavnom kodonu i kodirati signalni peptid na karboksi-terminalnom kraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1. U većini slučajeva, signalna sekvenca se čepa specifičnom proteazom, koja se naziva signalna peptidaza. Primeri sekrecionih signalnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na ompA, pelB, i ST pre-pro.

[0093] U nekim ostvarenjima, dodatni polipeptidi pomažu stabilizaciju, strukturu i/ili prečišćavanje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. U nekim ostvarenjima dodatni polipeptidi mogu da obuhvataju neki epitop. U drugim ostvarenjima, dodatni polipeptidi mogu da obuhvataju afinitetnu oznaku. Kao primer, fuzija polipeptida koja obuhvata neki epitop i/ili neku afinitetnu oznaku na C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanom polipeptidu može pomoći prečišćavanje i/ili identifikacija polipeptida. Kao primer, polipeptidni segment može biti His-oznaka, mvc-oznaka, S-peptide oznaka, MBP oznaka (maltoza vezujući protein), GST oznaka (glutation S-transferaza), FLAG oznaka, tioredoksin oznaka, GFP oznaka (zeleno fluorescentni protein), BCCP (biotin karboksilni nosač protein), kalmodulin oznaka, Strep oznaka, HSV-epitopna oznaka, V5-epitopna oznaka, i CBP oznaka. Upotreba takvih epitopa i afinitetnih oznaka poznata je stručnjacima iz ove oblasti.

[0094] [0077]U daljim ostvarenjima, dodatni polipeptidi mogu da obezbede C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid koji obuhvata mesta za cepanje polipeptida. Kao primer, polipeptid može biti pocepan hidrolizom peptidne veze. U nekim ostvarenjima, cepanje se izvodi enzimom. U nekim ostvarenjima, cepanje se odvija u ćeliji. U drugim ostvarenjima, cepanje se odvija putem veštačke manipulacije i/ili veštačkog uvođenja cepajućeg enzima. Kao primer, cepajući enzimi mogu da uključe pepsin, tripsin, himotripsin, trombin, i/ili Faktor Xa. Cepanje omogućava olakšanje izolovanja C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida iz polipeptida. Cepanje može dalje omogući odvajanje toksin A dela iz toksin B dela. Cepanje takođe može da omogući izolovanje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida fuzionisanog sa polipeptidima iz drugih polipeptida, kao što je putem cepanja epitopa primenjenog za prečišćavanje eksprimiranog proteina.

[0095] C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu dalje da poseduju dodatne strukturalne modifikacije koje ne dele sa istim organski sintetizovanim peptidom, kao što je adenilacija, karboksilacija, glikozilacija, hidroksilacija, metilacija, fosforilacija ili miristilacija. Ove dodate strukturalne modifikacije mogu se dalje odabrati ili preferirati odgovarajućim izborom rekombinantnog ekspresionog sistema. Sa druge strane, fuzioni polipeptidi mogu imati svoju sekvencu koja je produžena principima i praksom organske sinteze.

[0096] Ovde su opisane nukleinske kiseline koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide koji obuhvataju polipeptidni deo dobijen iz C.difficile toksinaA i polipeptidni deo dobijen iz C.difficiletoksina B. Nukleinske kiseline mogu da uključe jedno ili dvolančane oblike deoksiribonukleotida ili ribonukleotida ili njihovih polimera. Ovde su opisane ribonukleinske kiseline koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. Ovde su opisane nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod strogim uslovima sa nukleinskom kiselinom koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid i njegov komplement. Strogi uslovi odnose se na stepen homologije između sondom ili filterom vezane nukleinske kiseline; što je veća strogoća, to je veći procenat homologije između sondom i filterom vezane nukleinske kiseline. Temperatura za strogo ispiranje može se odrediti na osnovu Tm nukleinske kiseline (na osnovu G/C sadržaja). Na stroge uslove dalje se može uticati koncetracijom soli u puferu, kao što je standardni natrijum citrat (SSC). Ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje imaju približno 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencijalne sličnosti ili sekvencijalnog identiteta sa SEQ ID NO: 1.

[0097] C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može dalje da obuhvata region linkera, primera radi linker manji od približno 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 amino kiselinskog ostatka. Linker može biti kovalentno spojen za i između polipeptidnog dela izvedenog iz toksina A ili njegovog dela i polipeptidnog dela izvedenog iz toksina B.

[0098] [0081]Ovde su opisane nukleinske kiseline koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide koji se degenerišu u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3, respektivno. Degenerisanje genetskog koda dozvoljava varijacije nukleotidne sekvence toksin A proteina, toksin B proteina i/ili izolovanog polipeptida o kome je reč, i dalje proizvodeći polipeptid koji ima identičnu sekvencu amino kiseline kao polipeptid kodiran pomoću nativne DNK sekvence. Procedura, poznata kao "kodon optimizacija"

[0099] (opisana u U.S. Patentu 5,547,871) obezbeđuje ga dizajniranjem takve izmenjene DNK sekvence. Dizajn kodon optimizovanih gena uzima u obzir mnoge faktore, uključujući frekventnost upotrebe kodona u organizmu, najbliže susedne frekvencije, RNK stabilnost, potencijal za sekundarnim formiranjem strukture, putanja sinteze i namenske buduće DNK manipulacije tog gena. Određenije, dostupni postupci mogu se koristiti da izmene kodone koji kodiraju dati izolovani polipeptid sa onim koji kvasac lako prepoznaje kada se koristi ekspresioni sistemi kvasca, ili ćelije insekata kada se koristi ekspresioni sistem ćelija insekata. Degeneracija genetskog koda takođe omogućava da se ista sekvenca amino kiseline kodira i translatuje na mnogo različitih načina. Na primer, leucin, serin i arginin svaki se kodiraju pomoću šest različitih kodona, dok se valin, prolin, treonin, alanin i glicin svaki kodiraju pomoću četiri različita kodona. Međutim, učestalost upotrebe takvih sinonimnih kodona varira od genoma do genoma između eukariota i prokariota. Na primer, sinonimni kodon-odabrani šabloni među sisarima su veoma slični, dok su evoluciono udaljeni organizmi kao što je kvasac (kao što je S.cerevisiae),bakterija (kao što jeE. coli)i insekti (kao što jeD. melanogaster)otkrivaju jasno različite šablone frekvencije upotrebe genomskog kodona (Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 8,49-62 (1980); Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Marovama, T., et al., Nucl. Acid Res., 14,151-197 (1986); Aota, S., et al., Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., et al., Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). Ove razlike u kodon-odabranim šablonima čini se da doprinose nivoima ukupne ekspresije pojedinih gena brzinama izduživanja modulirajućih peptida. (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285,165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol.,

[0100] 207, 365-377 (1989); Randall, L. L, et al., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., et al., J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146,1-21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).

[0101] Poželjne frekvencije upotrebe kodona za sintetički gen trebalo bi da utiče na upotrebu kodona nuklearnih gena izvedenih iz istog (ili što je moguće usko povezaniji) genoma ćelije/organizma koji je namenjen za upotrebu za ekspresiju rekombinantnog proteina.

[0102] Poželjni postupci za određivanje identiteta dizajnirani su da daju najveće poklapanje između dve testirane sekvence. Postupci za određivanje identiteta i sličnosti kodifikovani su u kompjuterskim programima. Poželjni postupci kompjuterskog programiranja za određivanje identiteta i sličnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, et al., Nucl. Acid Res.

[0103] 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)). Stepen sličnosti ili identiteta koji se odnosi se na prethodno, određen je kao stepen identiteta između dve sekvence, što često ukazuje na derivaciju prve sekvence od druge. Stepen identiteta između dve nukleinske kiseline može se odrediti označavanjem komjuterskih programa poznatih u struci kao što je GAP obezbeđen u GCG programskom paketu (Needleman i VVunsch J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)). U cilju određivanja stepena identiteta između dve nukleinske kiseline za ovaj pronalazak, GAP se koristi sa sledećim podešavanjima: GAP izrada grešaka od 5.0 i GAP produšenje grešaka od 0.3.

[0104] Ovde je opisan vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. Vektor može biti bilo koja od brojnih nukleinskih kiselina u koje željena sekvenca može biti umetnuta restrikcijom i ligacijom radi transporta između različitih genetskih okruženja ili za ekspresiju u ćeliji domaćinu. Vektori su tipično komponovani od DNK, ali i RNK vektori su takođe dostupni. Vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide i fagemide. Klonirajući vektor je onaj koji je sposoban da se replicira u ćeliji domaćinu, i koji je dalje okarakterisan jednom ili više endonucleaznim restrikcionim mestima na kojima taj vektor može biti isečen na determinacioni način i u kojima se željena DNK sekvenca može vezati tako da novi rekombinantni vektor zadrži svoju sposobnost da se replikuje u ćeliji domaćinu. U slučaju plazmida, replikacija željene sekvence može se desiti mnogo puta kako se plazmid povećava u broju kopija unutar domaćina bakterije ili samo jednom po domaćinu pre nego što se domaćin redprodukuje mitozom. U slučaju faga, replikacija se može desiti aktivno tokom litične faze ili pasivno tokom lizogene faze.

[0105] Vektori mogu dalje da sadrže promoter sekvencu. Promoter moće da uključi netranslanovanu nukleinsku kiselinu obično lociranu uzvodno od kodirajućeg regiona koji sadrži mesto za inicijaciju transkripcije nukleinske kiseline. Promoter region takođe može da uključi druge elemente koji deluju kao regulatori genske ekspresije. U daljim ostvarenjima ovog pronalaska, ekspresioni vektor sadrži dodatni region kako bi se olakšao odabir ćelija koje imaju inkorporiran ekspresioni vektor. Promoter sekvenca često je vezana (inkluzivno) na svom 3' terminusu mestom inicijacije transkripcije i prošire se uzvodno (5' pravac) kako bi uključio minimalan broj baza i elemenata potrebnih da iniciraju transkripciju na nivoima koji se mogu detektovati iznad pozadine. Unutar promoter sekvence može se naći mesto inicijacije traskripcije, kao i protein vezujući domeni odgovorni za vezivanje RNK polimeraze. Eukariotski promoteri će često, ali ne uvek, da sadrže "TATA" kutije i "CAT" kutije.

[0106] Vektori mogu dalje da sadrže jednu ili više marker sekvenci pogodnih za upotrebu u identifikaciji

[0107] i odabiru ćelija koje su transformisane ili transfektovane kao vektor. Markeri uključuju, na primer, gene koji kodiraju proteine koji povećavaju ili smanjuju bilo rezistenciju ili osetljivost na antibiotike ili druga

[0108] jedinjenja, gene koji kodiraju enzime čija se aktivnost može detektovati standardnim ogledima poznatim u struci (npr., (3-galaktozidaza ili alkalinska fosfataza), i gene koji vidljivo utiču na fenotip transformiranih ili trensfektovanih ćelija, domaćina, kolonija ili plakova. Poželjni vektori su oni sposobni za autonomnu replikaciju i ekspresiju strukturalnog genskog proizvoda prisutnog u DNK segmentima za koje su oprerativno povezani.

[0109] Ekspresioni vektor je onaj u koji se željena nukleinska kiselina može insertovati restrikciojom i ligacijom tako daje operativno spojen za regulatorne sekvence i može biti eksprimiran kao RNK transkript. Ekspresija se odnosi se na transkripciju i/ili translaciju endogenog gena, transgena ili kodirajućeg regiona u ćeliji.

[0110] Kodirajuća sekvenca i regulatorne sekvence operativno su spojene kada su kovalentno povezane na takav način da smeštaju ekspresiju ili transkripciju kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu regulatornih sekvenci. Poželjno je da se kodirajuće sekvence prevedu u funkcionalni protein, pri čemu se kaže da su dve DNK sekvence operativno spojene ukoliko indukcija promotera u 5' regulatornim sekvencama rezultira transkripcijom kodirajućih sekvenci i ukoliko priroda veze između dve DNK sekvence ne (1) rezultira uvođenjem mutacije pomeranjem okvira (2) umešava se sa sposobnošću promoterskog regiona da usmeri transkripciju kodirajućih sekvenci, ili (3) umešava se sa sposobnošću odgovarajućeg RNK transkripta da se prevede u protein. Prema tome, promoterski region operativno bi bio spojen sa kodirajućom sekvencom ukoliko je promoterski region sposoban da izvede transkripciju te DNK sekvence tako da rezultujući transkrip može biti preveden u željeni protein ili polipeptid.

[0111] Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu se proizvesti eksprimiranjem kodirajuće nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Nukleinska kiselina može biti transformisana ili transfektovana u ćelije domaćine. Shodno tome, neki ovde opisani aspekti uključuju transformisanje i/ili transfekciju nukleinske kiseline koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovane polipeptide. Transformisanje je uvođenje egzogene ili heterologne nukleinske kiseline u unutrašnjost prokariotske ćelije. Transfekcija je uvođenje egzogene ili heterologne nukleinske kiseline u unutrašnjost eukariotske ćelije. Transformisanje ili transfektovanje nukleinske kiseline može i ne mora biti integrisano (kovalentno povezano) u hromozomsku DNK sačinjavajući genom ćelije. U prokariotima, na primer, transformisanje nukleinske kiseline može se održavati na nekom epizomalnim elementu kao što je plazmidni ili virusni vektor. Uzimajući u obzir eukariotsku ćeliju, stabilno transfektovana ćelija je ona u kojoj transfektovanje nukleinske kiseline postaje intergrisano u hromozomu tako da je nasleđeno od strane ćerke ćelije putem hromozomske replikacije. Ova stabilnost je pokazana osobinom eukariotske ćelije da utvrdi ćelijske linije ili klonove sačinjene od populacije čerke ćelije koja sadrži the transfektovanu nukleinsku kiselinu.

[0112] Više eukariotske ćelijske kulture mogu se koristiti eksprimiraju proteine ovog pronalaska, bilo iz ćelija kičmenjaka ili bezkičmenjaka, uključujući insekte, a procedure njihovog razmnožavanja dobro su poznate (videti, na primer, Kruse et al. (1973) Tissue Culture, Academic Press).

[0113] Ćelije domaćini i vektori za replikaciju nukleinske kiseline i za eksprimiranje kodiranih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida takođe su obezbeđeni. Bilo koji vektori ili ćelije domaćini mogu se koristiti, bilo prokariotske ili eukariotske. Mnogi vektori i ćelije domaćini poznati su u struci za ovakve svrhe. U okviru uobičajenih veština stručnjaka iz ove oblasti je da odabere pogodan set za željenu primenu.

[0114] DNK sekvence koje kodiraju toksin A i toksin B, ili njihove delove mogu klonirane iz raznih genomskih ili cDNK biblioteka izvedeni iz C.difficilei ostalih poznatih toksin A i toksin B eksprimirajućih prokariota poznatih u stanju tehnike. Tehnike za izolovanje takvih DNK sekvenci koje koriste postupke na bati sonde predstavljaju uobičajene tehnike i dobro su poznate stručnjacima iz ove oblasti. Sonde za izolovanje takvih DNK sekvenci može biti bazirane na objavljenim DNK ili proteinskim sekvencama. Alternativno, postupak lančane reakcije polimeraze (PCR) opisan u Mullis et al. (U.S. Pat. No. 4,683,195) i Mullis (U.S. Pat. No. 4,683,202) može se koristiti. Odabir biblioteke i odabir sonde za izolovanje takvih DNK sekvenci je unutar nivoa uobičajenog stručnjaka iz ove oblasti.

[0115] Pogodne ćelije domaćini mogu biti izvedene iz prokariota ili eukariota. Pogodni prokariotski domaćini uključuju:Pseudomonaskao što jeP. aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcuskao što je S.aureusi 5.epidermidis, Serratia marcescens, Bacilluskao što jeB. subtillisiB. megaterium, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Micrococcuskao što jeM. luteusiM. roseus,iProteus vulgaris.Pogodne ćelije domaćini za eksprimiranje polipeptida ovog pronalaska u višim eukariotima uključuju: kvasce kao što jeSaccharomyces ( npr. S. cerevisiae) ;293 (humani embrionski bubreg) (ATCC CRL-1573); 293F (Invitrogen, Carlsbad CA); 293T i varijantu 293T/17 (293tsA1609neo i varijantu ATCC CRL-11268)

[0116] (human embrionski bubreg transformisan SV40 T antigenom); COS-7 (bubreg majmuna CVI linije transformisan sa SV40)(ATCC CRL1651); BHK (ćelije bubrega bebe hrčka) (ATCC CRL10); CHO (jajne ćelije kineskog hrčka); mišje Sertoli ćelije; CVI (ćelije bubrega majmuna) (ATCC CCL70); VER076 (ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna) (ATCC CRL1587); HeLa (ćelije karcinoma humanog cervikuma) (ATCC CCL2);

[0117] MDCK (pseće ćelije bubrega) (ATCC CCL34); BRL3A (ćelije jetre bizonskog pacova) (ATCC CRL1442); W138 (humane ćelije pluća) (ATCC CCL75); HepG2 (humane ćelije jetre) (HB8065); i MMT 060652 (mišji tumor dojke) (ATCC CCL51).

[0118] Ovde su opisane nukleinske kiseline koje kodiraju izolovani polipeptid koji obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide i dodatne polipeptide. Vektori korisni za konstruisanje eukariotskih ekspresionih sistema za proizvodnju fuzionih polipeptida obuhvataju nukleinsku kiselinu koja kodira izolovani polipeptid operativno povezab sa pogodnom sekvencom za transkripcionu aktivaciju, kao što je promoter i/ili operator. Ostale tipične karakteristike mogu da uključe pogodna mesta vezivanja ribozoma, završavajuće kodone, pojačivače, prekidače, ili elemente replikacije. Ove dodatne karakteristike mogu se umetnuti u vektor na pogodnom mestu ili mestima komvencionalnim tehnikama spajanja kao što je restrikciona endonukleazna digestija i ligacija.

[0119] U nekim ostvarenjima, dodatne nukleinske kiseline mogu biti fuzionisane sa nukleinskom kiselinom koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. Fuzionisana nukleinska kiselina može da kodira polipeptide koji mogu da pomognu u prečišćavanju i/ili imunogenosti i/ili stabilnosti bez pomeranja kodon čitajućeg okvira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida. Fuzionisane nukleinske kiseline mogu da kodiraju sekrecionu sekvencu, koja može i ne mora biti pocepana iz C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. Fuzionisane nukleinske kiseline ne moraju produžiti eksprimirani polipeptid u značajnoj meri. Fuzionisane nukleinske kiseline mogu da kodiraju manje od šezdeset dodatnih amino kiselina u C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. U nekim ostvarenjima, fuzionisane nukleinske kiseline slede nakon nukleinske kiseline koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. U drugim ostvarenjima, fuzionisane nukleinske kiseline prethode nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. U drugim ostvarenjima, fuzionisane nukleinske kiseline okružuju nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide.

[0120] [0096]U nekim ostvarenjima, fuzionisane nukleinske kiseline mogu da kodiraju polipeptid kako bi se potpomoglo prečišćavanje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. U nekim ostvarenjima fuzionisana nukleinska kiselina će kodirati neki epitop i/ili neku afinitetnu oznaku. Primeri polipeptida koji potpomažu prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, His-oznaku, mvc-oznaku, S-peptidnu oznaku, MBP oznaku, GST oznaku, FLAG oznaku, tioredoksin oznaku, GFP oznaku, BCCP, kalmodulin oznaku, Strep oznaku, HSV-epitop oznaku, V5-epitop oznaku, i CBP oznaku. U drugim ostvarenjima, fuzionisana nukleinska kiselina može da kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid koji ima mesto usmereno za, ili sklono za, cepanje. U jednom ostvarenju, fuzionisana nukleinska kiselina može da kodira polipeptide koji obuhvataju mesta enzimatskog cepanja. U daljim ostvarenjima, enzimatsko cepanje može pomoći u izolovanju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida, kao i ostalih segmenata fuzionisanih polipeptidnih segmenata, iz još drugih polipeptida. Kao primer, intermedijarna nukleinska kiselina koja kodira mesto enzimatskog cepanja smešteno između nukleinske kiseline koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid i i neki epitop mogu da omoguće naknadno odvajanje eksprimiranih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida i epitopa. Takva mesta takođe mogu biti prisutna između toksin A dela i toksin B dela.

[0121] Ovde su opisani ekspresioni sistemi dizajnirani da pomognu u eksprimiranju i obezbeđivanju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. Ekspresioni sistem može da obuhvata neku ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sa nekom nukleinskom kiselinom koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. Ćelija domaćin može biti prokariot. Prokariot može bitiE. coli.Ćelija domaćin može biti neka eukariotska ćelija.

[0122] Ekspresioni sistem može dalje da obuhvata agense radi potpomaganja u odabiru ćelija domaćina uspešno transformisane ili transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid može dalje da eksprimira gene koji pomažu ćeliji domaćinu u otpornosti na antibiotike, kao što su geni koji su otporni na kanamicin ili gentamicin ili ampicillin ili penicillin. Takvi rezistentni geni omogućavaju odabir ćelija domaćina koje imaju pravilno inkorporiranu nukleinsku kiselinu koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, što je stručnjacima iz ove oblasti poznato.

[0123] Još jedan ovde opisan aspekat usmeren je na generisanje antitela. Primeri ovde opisanih antitela, uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela proizvedena imunizovanjem subjekta sa C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanim polipeptidom. Antitela gerenerisana imunizacijom sa C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanim polipeptidom mogu se specifično vezati za toksin A ili toksin B, ili mogu unakrsno reagovati sa C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanim polipeptidom. Antitela proizvedena od strane ovde opisanog C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida mogu biti okarakterisana primenom postupaka dobro poznatih u struci.

[0124] [0100]Antitela proizvedena primenom C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida ovog pronalaska mogu da obuhvate monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, fragmente antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, itd.), himerna antitela, bispecifična antitela, antitela samo sa teškim lancima, heterokonjugatna antitela, jednolančana (ScFv), jedno domenska antitela, njihove varijante, pri čemu izolovani polipeptidi obuhvataju neki deo antitela, humanizovanog antitela, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koji obuhvata mesto prepoznavanja antigena zahtevane specifičnosti, uključujući glikolizacione varijante antitela, vrijante sekvenca amino kiseline antitela, i kovalentno modifikovana antitela. Poželjna antitela izvedena su iz miševa, pacova, čoveka, zečeva, pasa, svinja, jednogrbe kamile, kamile, lame, mačaka ili primata, ili bilo kog drugog porekla (uključujući himerna, fragmente i/ili humanizovana antitela).

[0125] U drugim ostvarenjima, antitela proizvedena imunizovanjem sa C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1

[0126] izolovanim polipeptidom zatim su humanizovana postupcima poznatim u struci. Humanizovano antitelo je imunoglobulinski molekul koji sadrži minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U još daljim ostvarenjima, potpuno humana antitela dobijaju se primenom komercijalno dostupnih miševa koji su koji su projektovani da eksprimiraju specifične humane imunoglobulinske proteine. U drugim ostvarenjima, antitela su himerna. Himerno antitelo je antitelo koje kombinuje karakteristike iz dva različita antitela. Postupci pripremanja himernog antitela dobro su poznata u struci.

[0127] U drugim ostvarenjima, obezbeđuje se nukleotidna sekvenca koja kodira antitela i zatim ih klonira u vektor radi ekspresije ili propagacije. U još jednom ostvarenju, antitela su izrađena rekombinantno i eksprimirana koristeći postupke poznate u struci. Kao primer, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti kao antigen za svrhe izolovanja rekombinantnih antitela ovim tehnikama. Antitela se mogu izraditi rekombinantno primenom genske sekvence koja eksprimira antitelo rekombinantno u ćelijama domaćinima. Postupci za izradu varijanti antitela i rekombinantnih antitela su poznate u struci.

[0128] U drugim ostvarenjima, antitela su vezana za nosač konvencionalnim postupcima u struci, za upotrebu u, na primer, izolovanju ili prečišćavanju nativnog toksina A ili toksina B ili detektovanje nativnog toksina A ili toksina B ili C.difficileu biološkom uzorku ili primerku.

[0129] Kompozicije i formulacije

[0130] Ovde su opisane kompozicije koje obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovane polipeptide. Kompozicije mogu biti farmaceutske kompozicije koje obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid i neki farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicije koje se koriste u ovde opisanim postupcima generalno obuhvataju, kao na primer, ali bez ograničenja, i efektivnu količinu ovde opisanog C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida (npr., neka količina dovoljna da indukuje imuni odgovor) ili antitelo protiv C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovanih polipeptida (npr., neka količina neutralizujućeg antitela dovoljna da umanji infekciju, ublaži simptom infekcije i/ili spreči infekciju). Farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvata farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore poznate u struci (videti generalno Remington, (2005) The Science and Practice of Pharmacv, Lippincott, VVilliams i VVilkins).

[0131] Ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti u postupcima za imunizovanje ili tretiranje ljudi i/ili životinja sa CDAD. Prema tome, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptidi mogu se koristiti unutar farmaceutske kompozicije. Ovde opisana farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvati farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense. Farmaceutski prihvatljivi nosači i/ili ekscipijensi korisni u ovom pronalasku su konvencionalni i mogu da uključe pufere, stabilizatore, razblaživače, prezervativ, i sredstva za poboljšanje rastvaranja. Remington's Farmaceutski Sciences, od E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), opisuje kompozicije i formulacije pogodne za farmaceutsku dostavu ovde opisanih polipeptida. Uopšteno, priroda ekscipijenasa nosača zavisiće od određenog načina davanja koji se upošljava. Primera radi, parenteralne formulacije obično obuhvataju injektabilne tečnosti koje uključuju farmaceutski i fiziološki prihvatljive tečnosti kao što je voda, fiziološki rastvor, izbalansirani slani rastvori, vodene dekstroze, glicerol i slično, kao vozilo. Za čvrste kompozicije (npr. oblici praha, pilule, tablete, ili kapsule), mogu se uključiti konvencionalni ne-toksični čvrsti nosači, na primer, manitol, laktoza, škrob, ili magnezijum stearat farmaceutskih gradi. Pored biološki neutralnih nosača, farmaceutske kompozicije koje se mogu davati sadrže minorne količine ne-toksičnih pomoćnih supstanci, kao šo su agensi za vlaženje i emulzovanje, prezervativi, i agense za PH puferovanje i slično, na primer natrijum acetat ili sorbitan monolaurat.

[0132] U jednom ostvarenju farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvata imunostimulacionu supstancu, kao što je adjuvans. Adjuvans može biti odabran na osnovu postupka davanja i mogu da uključe mineralne adjuvanse na bazi ulja kao što je Freundov kompletan i nekompletan adjuvans, Montanidov nekompletan Seppic adjuvans kao što je ISA, adjuvansi na bazi emulzije ulje u vodi kao što je Ribi adjuvans sistem, formulacija sintaksnog adjuvansa koja sadrži muramil dipeptid, aluminijum hidroksid ili adjuvans soli aluminijuma (alum), polikatjonski polimer, naročito polikatjonski peptid, naročito poliarginin ili peptid koji sadrži najmanje dva LvsLeuLvs motiva, naročito KLKLLLLLKLK, imunostimulatorni oligodeoksinukleotid (ODN) koji sadrži ne-metilovani citozin-gvanin dinukleotid (CpG) u definisanom baznom kontekstu( npr.kako je opisano u WO 96/02555) ili ODN-ove na bazi inozina i citidina( npr.kako je opisano u VVO 01/93903), ili deoksinukleinsku kiselinu koja sadrži deoksi-inozin i/ili deoksiuridinske ostatke (kako je opisano u WO 01/93905 i WO 02/095027), naročito Oligo(dldC)<i3>(kako je opisano u VVO 01/93903 i VVO 01/93905), neuroaktivno jedinjenje, naročito humani hormon rasta (opisan u VVO 01/24822), ili njihove kombinacije. Takve kombinacije su u skladu sa onim npr. opisanim u VVO 01/93905, VVO 02/32451, VVO 01/54720, VVO 01/93903, VVO 02/13857, VVO 02/095027 i VVO 03/047602. Poželjno, adjuvans je aluminijum hidroksidni adjuvans.

[0133] [0107]Prihvatljiv nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoca pri dozama i koncentracijama koja su data. Nosači, ekscipijensi ili stabilizatori mogu dalje da obuhvataju pufere. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, ugljene hidrate (kao što je monosaharid i disaharid), šećere (kao što je saharoza, manitol, i sorbitol), fosfat, citrat, antioksidanse (kao što je asckorbinska kiselina i metionin), prezervativ (kao što je fenol, butanol, benzanol; alkilni parabeni, katekol, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametoniuni hlorid, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hloride, i m-kresol), polipeptide niske molekularne mase, proteine (kao što je serum albumin ili imunoglobulini), hidrofilne polimere amino kiseline, helacione agense (kao što je EDTA), so-formirajuće kontra-jone, metalne komplekse (kao što su Zn-proteinski kompleksi), i nejonske surfaktante (kao što je TVVEEN™ i polietilen glikol).

[0134] Ovde opisana farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvata dodatne agense koji služe da pojačaju i/ili dopune željeni efekat. Kao primer, da pojačaju imunogenost C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida ovog pronalaska kada se daje kao subjedinična vakcina, farmaceutska kompozicija može dalje da obuhvata adjuvans.

[0135] Primer farmaceutske kompozicije može biti imunogena kompozicija. Ovde su opisane imunogene kompozicije koja obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovane polipeptide. Imunogena kompozicija može dalje da uključi farmaceutski prihvatljiv nosač ili druge nosače i/ili ekscipijense u formulaciji pogodnoj za injektovanje u sisare. Imunogena kompozicija je bilo koja kompozicija materijala koji izmamljuje neki imuni odgovor kod sisarskog domaćina kada se imunogena kompozicija injektuje ili drugačije uvede. Imuni odgovor može biti humoralni, celularni, ili oba. Pojačivački efekat odnosi se na povišeni imuni odgovor na imunogenu kompoziciju nakon naknadnog izlaganja sisarskog domaćina istoj imunogenoj kompoziciji. Humoralni odgovor rezultira u proizvodnji antitela od strane sisarskog domaćina nakon izlaganja imugenoj kompoziciji.

[0136] Ovde opisane imunogene kompozicije pobuđuju neki imuni odgovor kod sisarskog domaćina, uključujući ljude i ostale životinje. Imuni odgovor može biti bilo ćelijski zavustan odgovor ili antitelo zavistan odgovor ili oba; a dalji odgovor može da obezbedi imunološku memoriju ili pojačivački efekat ili oba kod sisara domaćina. Ove imunogene kompozicije su korisne kao vakcine i mogu da obezbede zaštitni odgovor od strane sisarskih subjekata ili domaćina na infekciju sojevima C.difficile.

[0137] [0111]Ovde su opisani postupci za proizvodnju imunogene kompozicije konstruisanjem nukleinske kiseline koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid i eksprimira komponentu C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida u mikrobijalnom domaćinu; ponovo dobijanje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida iz kulture domaćina; konjugovanje C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida u drugu proteinsku komponentu, ponovo dobijanje konjugovanog proteina i polisaharidne komponente. Nukleinska kiselina koja kodira C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se održavati kroz rast domaćina konstantnim i stabilno selektivnim pritiskom. Održavanje ekspresionog vektora može se dodeliti inkorporiranjem u ekspresionom vektoru genetske sekvence koja kodira selektivni genotip, čija ekspresija u mikrobijalnoj ćeliji domaćinu rezultira selektivnim fenotipom. Selektivna genotipska sekvenca takođe može da uključi gen koji komplementira neku uslovnu letalnu mutaciju. Druge genetske sekvence mogu se inkorporirati u ekspresioni vektor, kao što su drugi geni otporni na lekove ili geni koji komplementuju letalne mutacije. Mikrobijalni domaćini mogu da uključe: Gram pozitivnu bakteriju; Gram negativnu bakteriju, kao što jeE. coli;kvasce; filamentozne gljive; ćelije sisara; ćelije insekata; ili biljne ćelije.

[0138] Ovde opisani postupci takođe su obezbeđeni za nivo ekspresije C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida u domaćinu u nivou većem od približno 50 mg/litar kulture, nivo veći od približno 100 mg/litar, nivo veći od približno 500 mg/litar, ili nivo veći od približno 1 g/litar. Protein može biti dobijen bilo kojim od brojnih postupaka poznatih u oblasti izolovanja i dobijanja proteina, kao što je taloženjem amonijum sulfata praćeno jonoizmenjivačkom hromatografijom.

[0139] Ovde su opisani postupci za pripremanje imunogene kompozicije koja obezbeđuje da se proteinska komponenta konjuguje za drugu proteinsku komponentu jednim od brojnih načina poznatih stručnjacima iz ove oblasti, kao što je amidizaciona reakcija.

[0140] Ovde su opisane formulacije koje obuhvatju C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid za tretiranje i preveniranje CDAD. U jednom ostvarenju, formulacija može da uključi ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, adjuvans, i neki farmaceutski prihvatljiv nosač. U još jednom

[0141] ostvarenju, formulacija uključuje ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, ili se suštinski sastoji od jednog ili više ovde opisanih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida. Formulacija može da obuhvata ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid i adjuvans. Formulacija može dalje da uključuju dodatni antigen ili neki lek. Štaviše, formulacija može da uključi jedan ili više lekova i pored izolovanog polipeptida i/ili adjuvansa može da uključi jedan ili više lekova.

[0142] [0115]Formulacija koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može biti u tečnom ili suvom obliku. Suva formulacija može se lako skladištiti i transportovato. Suve formulacije prekidaju hladan lanac potreban od mesta proizvodnje vakcine do lokala gde se odvijati vakcinacija. Alternativno, suvi, aktivni sastojak formulacije sam po sebi može biti poboljšanje obezbeđivanjem čvrstog partikulisanog oblika koji se uzima i obrađuje antigenom predstavljajućih ćelija. Ovi mogući mehanizmi opisani su ne da bi ograničili okvir ovog pronalaska ili njegove ekvivalente, već kako bi se obezbedio uvid u rad ovog pronalaska i kako bi se vodila upotreba ove formulacije u imunizaciji i vakcinaciji.

[0143] Suve formulacije C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida mogu se obezbediti u raznim oblicima: na primer, finim ili granulisanim praškovima, liofilizovanom prahu, uniformnim filmovima, peletima, i tabletama. Ona može biti osušena na vazduhu, osušena povišenom temperaturom, liofilizovana, osušena zamrzavanjem ili prskanjem, obložena ili osušena na čvrstom supstratu, a zatim osušena, posuta na čvrsti supstrat, brzo zamrznuta, a zatim polako osušena pod vakuumom, ili njihovim kombinacijama. Ukoliko su različiti molekuli aktivni sastojci formulacije, oni mogu biti umešani u rastvor, a zatim osušeni, ili umešani samo u čvrstom obliku.

[0144] Formulacije koje obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid u tečnom ili čvrstom obliku, kao što je suvi oblik, mogu biti primenjene sa jednim ili više adjuvanasa na istim ili odvojenim mestima ili simultanim ili frekventnim, ponavljanim primenama. Formulacija može da uključi druge antigene tako da davanje formulacije indukuje imuni odgovor na više antigena. U takvom slučaju, ostali antigeni mogu imati različite hemijske strukture kako bi se indukovao imuni odgovor specifičan za različite antigene. Najmanje jedan antigen i/ili adjuvans može se održavati u suvom obliku pre davanja. Naknadno oslobađanje tečnosti iz rezervoara ili ulazak tečnosti u rezervoar koji sadrži suvi sastojak formulacije najmanje će delimično rastvoriti taj sastojak.

[0145] Čvrste materije (npr., čestice nanometarskih ili mikrometarskih dimenzija) takođe mogu biti inkorporirane u formulaciju. Čvrsti oblici (npr., nanočestice ili mikročestice) mogu pomoći u dispergovanju ili rastvaranju aktivnih sastojaka; obezbediti tačku pričvršćivanja za adjuvans, C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid, ili oba za supstrat koji se može opsonizovati antigenom predstavljenih ćelija, ili njihovim kombinacijama. Formulacije sa produženim oslobađanjem iz porozne čvrste materije formirane kao list, štap ili perla, deluju kao depo.

[0146] Najmanje jedan sastojak ili komponenta formulacije( tj.,C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid, adjuvans, ili lek) može se obezbediti u suvom obliku pre davanja formulacije. Ova formulacija takođe se može koristiti sa konvencionalnim enternalnim, mukozalnim, ili parenteralno imunizacionim tehnikama.

[0147] [0120]Formulacija koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid može se proizvesti pod aseptičnim uslovima prihvatljivim za pogodne regulatorne agencije( npr.,Davanje hrane i lekova, EMEA za biološke agense i vakcine. Opciono, komponente kao što su desikanti, ekscipijensi, stabilizatori, ovlaživači, prezervativ, ili njihove kombinacije mogu se uključiti u formulaciju čak iako su imunološki neaktivni. Međutim, oni mogu imati druge poželjne osobine ili karakteristike.

[0148] [0121]Postupci za proizvodnju farmaceutske formulacije dobro su poznati. Komponente formulacije mogu se kombinovati sa farmaceutski-prihvatljivim nosačem ili vozilom, kao i bilo koja kombinacija opcionih aditiva( npr.,razblaživači, veziva, ekscipijensi, stabilizatori, desikanti, prezervativ, boje). Upotreba čvrstih nosača, i dodavanje ekscipijenasa koji bi pomogli u rastvaranju suvih komponenti ili stabilizatori imunogenih ili adjuvansnih aktivnosti, predstavljaju poželjna ostvarenja. Videti, uopšteno, Ullmann's Enciklopedia of Industrial Chemistrv, 6th Ed. (electronic edition, 2003); Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd (Gennaro, 2005, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2nd Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker); i Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliverv Sistemoms (Ansel et al., 2005, VVilliams & VVilkins).

[0149] Dobre proizvodne prakse poznate su u farmaceutskoj industriji i regulišu se od strane državnih agencija( npr.,Davanje hrane i lekova, EMEA. Sterilne tečne formulacije mogu se pripremiti rastvaranjem namenjene komponente formulacije u dovoljnoj količini pogodnog rastvarača, praćeno sterilizacijom filtriranjem kako bi se uklonili kontaminirajući mikrobi. Uopšteno, disperzije se mogu pripremiti inkorporiranjem raznih sterilisanih komponenata formulacije u sterilni nosač koji sadrži bazni disperzioni medijum. Za proizvodnju čvrstih oblika koji moraju biti sterilni, može se koristiti vakuumsko sušenje ili sušenje zamrzavanjem.

[0150] Uopšteno, čvrsti dozni oblici( npr.,praškovi, granule, peleti, tablete) mogu se izraditi od najmanje jednog aktivnog sastojka ili komponente formulacije.

[0151] Pogodne procedure tabletiranja su poznate. Formulacija se takođe može proizvesti enkapsuliranjem čvrtih oblika od najmanje jednog aktivnog sastojka, ili držeći ih odvojene od tečnosti u odeljcima ili komorama. Veličina svake doze i intervala doziranja subjektu mogu se koristiti kako bi se odredila pogodna veličina i oblik tablete, kapsule, odeljka, ili komore.

[0152] Formulacije će sadržati neku efektivnu količinu aktivnih sastojaka( npr.,lek, antigen i adjuvans) zejedno sa nosačem ili pogodnim količinama nosača kako bi se obezbedile farmaceutski-prihvatljive kompozicije pogodne za davanje čoveku ili životinji.

[0153] Relativne količine aktivnih sastojaka, kao što su količine C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida, unutar neke doze i dozni raspored mogu se podestiti pogodno za efikasno davanje subjektu

[0154] (npr.,životinja ili čovek). Ovo podešavanje takođe može da zavisi od određene bolesti ili stanja subjekta, i da li je namenjeno tretiranju ili profilaksi. Kako bi se pojednostavilo davanje formulacije subjektu, svaka jedinica doze sadrži aktivne sastojke u prethodno određenim količinama za jedan krug imunizacije.

[0155] Postoje mnogi uzroci polipeptidne nestabilnosti ili degradacije, uključujući hidrolizu i denaturaciju. U slučaju denaturacije, prostiranje ili tro-dimenzionalna struktura proteina je poremećena i protein se odmotava iz svoje uobičajene globularne strukture. Umesto da se ponovo savije u svoje prirodno prostiranje, hidrofobna interakcija može da izazove cirkulisanje molekula zajedno( tj.,agregacija) ili ponovo savijanje u neprirodno prostiranje. Bilo koji od ovih rezultata mogu da obuhvate smanjenje ili gubitak imunogenske ili adjuvansne aktivnosti. Stabilizatori mogu biti dodati da oslabe ili spreče ovakve probleme.

[0156] Formulacija, ili bilo koji intermedijer u njenog proizvodnji, može biti prethodno tretirana zaštitnim agensima( tj.,krioprotektantima i suvim stabilizatorima), a zatim podvrgnuta stopama hlađenja i finalnim temperaturama koje minimiziraju formiranje ledenih kristala. Odgovarajućim odabirom kriozaštitnih agenasa i upotreba prethodno odabranih parametara sušenja, skoro svaka formulacija može se kriopripremiti za pogodnu željenu krajnju upotrebu.

[0157] Podrazumeva se da je sledeći opis opcionih aditiva kao što su ekscipijensi, stabilizatori, desikanti, i prezervativi izveden po njihovoj funkciji. Prema tome, određene hemikalije mogu delovati kao neke kombinacije primaoca, stabilizatora, desikanta, i/ili prezervativa. Takva hemikalija bila bi imunološki-neaktivna jer ne indukuje direktno neki imuni odgovor, ali povećava taj odgovor pojačivanjem imunološke aktivnosti antigena ili adjuvansa: na primer, redukovanjem modifikacije antigena ili adjuvansa, ili denaturisanjem tokom sušenja i ciklusa rastvaranja.

[0158] [0130]Stabilizatori uključuju ciklodekstrin i njihove varijante (videti U.S. Pat. No. 5,730,969). Pogodni prezervativ kao što je saharoza, manitol, sorbitol, trehaloza, dekstran, i glicerin takođe se mogu dodati kako bi stabilisali finalnu formulaciju (Hovvell i Miller, 1983). Stabilizator odabran od nejonskih surfaktanata, D-glukoze, D-galaktoze, D-ksiloze, D-glukuronske kiseline, soli D-glukurosnke kiseline, trehaloze, dekstrana, hidroksietil škrobova, i njihove mešavine, mogu se dodati u formulaciju. Dodavanje soli alkalnih metala ili magnezijum hlorida može stabilizovati C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, opciono uključujući serum albumin i sušenje zamrzavanjem kako bi se dalje pojačala stabilnost. C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid takođe može biti stabilzovan dovođenjem u kontakt sa saharidom odabranim iz grupe koju čine dekstran, hondroitin sumporna kiselina, škrob, glikogen, insulin, dekstrin, i so alginske kiseline. Ostali šećeri koji se mogu dodati uključuju monosaharide, disaharide, šećere alkohola, i njihove mešavine( npr.,glukoza, manoza, galaktoza, fruktoza, saharoza, maltoza, laktoza, manitol, ksilitol). Polioli mogu stabilisati polipeptid, a oni su vodo-meščjivi ili vodo-rastvorni. Pogodni polioli mogu biti polihidroksi alkoholi, monosaharidi i disaharidi uključujući manitol, glicerol, etilen glikol, propilen glikol, trimetil glikol, vinil pirolidon, glukoza, fruktoza, arabinoza, manoza, maltoza, saharoza, i njihovi polimeri. Razni ekscipijensi takođe mogu da stabilišu polipeptide, uključujući serum albumin, amino kiseline, heparin, masne kiseline i fosfolipide, surfaktante, metale, poliole, redukujući agensi, metal helirajući agensi, polivinil pirolidon, hidrolizovan želatin, i amonijum sulfat.

[0159] Kao primer, formulacija C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida može se stabilizovati u saharozi, trehalozi, poli(mlečna kiselina) (PLA) i poli(laktid-ko-glikolid) (PLGA) mikrosferama pogodnim odabirom ekscipijenasa ili stabilizatora (Sanchezetal.,1999). Saharoza, ili trehaloza mogu biti pogodno primenjene kao aditiv budući da su neredukovani saharid, i prema tome ne izazivaju aminokarbonilne reakcije sa supstancama koje nose amino grupe kao što su proteini. Saharoza ili trehaloza mogu se kombinovati sa drugim stabilizatorima kao što su saharidi.

[0160] Dodatno, formulacija koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može da uključi terapeutske agense, kao što su npr. anestetici, analgetici, anti-inflamatori, steroidi, antibiotici, antiartritici, anorektici, antihistamini, i antineoplastici. Primeri takvih terapeutskih agenasa uključuju lidokain i nesteroidne anti-zapaljenske lekove (NSAID). U još jednom ostvarenju, terapeutski agensi su antigeni i adjuvansi. U još jednom ostvarenju, formulacija koja obuhvata antigen i/ili adjuvans može se primeniti odvojeno, ali zajedno sa drugim terapeutskim agensima, kao npr. anestetici, analgetici, anti-inflamatori, steroidi, antibiotici, antiartritici, anorektici, antihistamini, i antineoplastici. U poželjnom ostvarenju, antibiotic su fidaksomicin, metronidazol ili vankomicin.

[0161] Formulacija koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid može se dostaviti raznim putanjama davanja kao što je npr. intramuskularno.

[0162] [0134]Polimeri se mogu dodati formulaciji i mogu delovati kao ekscipijens, stabilizator, i/ili prezervativ aktivnog sastojka kao i za redukovanje koncentracije aktivnog sastojka koji zasićava rastvor koji se koristi za rastvaranje suvog oblika aktivnog sastojka. Takva redukcija odvija se jer polimer redukuje efektivnu zapreminu rastvora ispunjavanjem "praznog" prostora. Prema tome, količine antigena/adjuvansa mogu se konzervirati bez redukovanja količine zasićenog rastvora. Bitno termodinamičko razmatranje odnosi se na to da će neki aktivni sastojak u zasićenom rastvoru biti "usmeren" u regione niže koncentracije. U rastvoru, polimeri se takođe mogu stabilizovati i/ili sačuvati antigen/adjuvans-aktivnost rastvorenih sastojaka formulacije. Takvi polimeri uključuju etilen ili propilen glikol, vinil pirolidon, i O-ciklodekstrin polimere i kopolimere.

[0163] Obezbeđena je jedna ili jedinična doza formulacije koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid pogodna za davanje. Količina adjuvansa i/ili C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovanog polipeptida u jediničnoj dozi može biti bilo gde u širokom opsegu od približno 0.001 u.g do približno 10 mg. Ovaj opseg može biti od približno 0.1 ug do približno 1 mg; suženiji ospeg je od približno 5 u.g do približno 500 u.g. Drugi pogodni opsezi su između približno 20 u.g do približno 200 ug, kao što je npr. približno 20 u.g, približno 75 u.g ili približno 200 u.g. Poželjna doza za C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid je od približno 20 u.g ili 200 u.g ili manja. Odnos između C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida i adjuvansa može biti približno 1:1 ili približno 1:1.25, ali se i veći odnosi takođe mogu koristiti( npr.,približno 1:10 ili manje), ili se takođe mogu koristiti niži odnosi C-TAB izolovanog polipeptida prema adjuvansu( npr.,približno 10:1 ili više).

[0164] C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti kao antigen i može se predstaviti imunoj ćeliji, i može se indukovati antigen-specifičan imuni odgovor. Ovo se može desiti pre, tokom, ili nakon infekcije patogenom, kao što jeC. difficile.Može biti potreban samo C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, a ne i dodatni adjuvans, ukoliko je imunogenost formulacije dovoljna da ne zahteva aktivnost adjuvansa. Formulacija može da uključi dodatni antigen tako da primena formulacije indukuje neki imuni odgovor protiv višestrukih antigena( tj.,multivalentan). Antigen-specifični limfociti mogu da učestuju u imunom odgovoru i, u slučaju učešća B limfocita, antigen-specifična antitela mogu biti deo imunog odgovora. Formulacije prethodno opisane mogu da uključe desikante, ekscipijense, ovlaživače, stabilizatore, i prezervative poznate u struci.

[0165] [0137]Formulacija koja obuhvata ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti za tretiranje subjekta( npr.,čoveka ili životinje kojoj je potrebno tretiranje kao što je prevencija bolest, zaštita od efekata infekcije, redukovanje ili ublažavanje simptoma bolesti, kao što je CDAD, ili njihove kombinacije). Npr. formulacija koja obuhvata ovde opisan C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti za tretiranje subjekta u riziku od CDAD, kao što je npr. subjekat sa sledećim profilom: i) subjekat sa oslabljenim imunim sistemom kao što je npr. stariji subjekat (npr. subjekat iznad 65 godina starosti) ili subjekat ispod 2 godine starosti; ii) imunokopromitovani subjekat kao što je npr. subjekat sa SIDA; iii) subjekat koji uzima ili planira da uzima imunosupresione lekove; iv) subjekat sa planiranom hospitalizacijom ili subjekat koji je hospitalizovan; v) subjekat koji je ili se očekuje da će biti u jedinici intenzivne nege (ICU); vi) subjekat koji se podvrgava ili planira da se podvrgava gastrointestinalnoj operaciji; vii) subjekat koji je pod ili planira da bude pod dugoročnom negom kao što su starački dom ; viii) subjekat sa komorbiditetima koji zahtevaju čestu i/ili produženu upotrebu antibiotika; ix) subjekat koji je subjekat sa dva ili više od prethodno navedenih profila, kao što je npr. stariji subjekat koji planira da se podvgrne gastrointestinalnoj operaciji; x) subjekat sa zapaljenskom bolesti creva; i/ili xi) subjekat sa rekurentnom CDAD kao što je npr. subjekat koji je prošao jednu ili više epizoda CDAD.

[0166] Tretman može vakcinisati subjekta protiv infekcije patogenom ili protiv njegovih patogenih efekata kao što su oni izazvani sekrecijom toskina. Formulacija se može koristiti terapeutski radi tretiranja postojećih bolesti, zaštitno radi prevencije bolesti, kako bi se smanjila ozbiljnost i/ili trajanje bolesti, kako bi se ublažili simptomi bolesti, ili njihove kombinacije.

[0167] Formulacije koje obuhvataju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovane polipeptide mogu se dostaviti raznim putanjama davanja uključujući, ali ne ograničavajući se na oralne, subkutane, intradermalne, intravenozne, intra-arterialne, intramuskularne, intrakardijalne, intraspinalne, intratorakalne, intraperitonealne, intraventrikularne, i/ili podjezične putanje.

[0168] Formulacija takođe može da obuhvata jedan ili više adjuvanasa ili kombinacija adjuvanasa. Obično, adjuvans i formulacija su umešani pre uvođenja antigena ali, alternativno, mogu biti predstavljeni odvojeno unutar kratkog vremesnkog intervala.

[0169] [0141]Adjuvansi uključuju, na primer, uljanu emulziju( npr.,kompletan ili nekompletan Freundov adjuvans), Montanidov nekompletni Seppic adjuvans kao što je ISA, adljuvansi emulzije ulje u vodi kao što je Ribi adjuvans sistem, sintaks adjuvans formulacija koja sadrži muramil dipeptid, aluminijum hidroksid ili adjuvansnu so (ALUM), polikatjonski polimer, naročito polikatjonski peptid, naročito poliarginin ili peptid koji sadrži najmanje dva LvsLeuLvs motiva, naročito KLKLLLLLKLK, imunostimulatorni oligodeoksinukleotid (ODN) koji sadrži ne-metilovani citozin-gvanin dinukleotid (CpG) u definisanom baznom kontekstu( npr.kako je opisano u WO 96/02555) ili ODN-ove na bazi inozina i citidina( npr.kako je opisano u VVO 01/93903), ili deoksinukleinsku kiselinu koja sadrži deoksi-inozin i/ili deoksiuridinske ostatke (kako je opisano u VVO 01/93905 i VVO 02/095027), naročito Oligo(dldC)<i3>(kako je opisano u VVO 01/93903 i VVO 01/93905), neuroaktivno jedinjenje, naročito humani hormon rasta (opisan u VVO 01/24822), ili njihove kombinacije, hemokin( npr.,defensini 1 ili 2, RANTES, MlPl-a, MIP-2, interleukin-8, ili citokin( npr.,interleukin-lB, -2, -6, -10 ili -12; interferon-y; faktor-a nekroze tumora; ili granulocitni-monocitni-kolonija stimulacioni faktor) (obrađeno u Nohria i Rubin, 1994), varijanta muramil dipeptida( npr.,murabutid, treonil-MDP ili muramil tripeptid), sintetičke varijante MDP, protein toplotnog šoka ili varijanta, varijanta Leishmania major LelF (Skeikyet al.,1995), ne-toksične varijante bakterijskih ADP- ribozilacionih egzotoksina (bAREs) uključujući varijante na mestu cepanja tripsina (Dickenson i Clements, 1995) i/ili ribozilaciju koja utiče na ADP (Douceetal.,1997), ili hemijski detoksikovane bAREs (toksoidi), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamil-L-alanin-2-[l,2-dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroksifosforiloksi)]etilamid (MTP-PE) i kompozicije koje sadrže metabolizovano ulje i emulzioni agens, gde su ulje i emulzifirajući agens predstavljeni u obliku emulzije ulje-u-vodi koja ima kapljice ulja suštinski sve manje od jednog mikrona u prečniku (videti, na primer, EP 0399843). Takođe, videti Richardsetal.(1995) za druge adjuvanse korisne u imunizaciji.

[0170] Adjuvans može biti izabran da prvenstveno indukuje antitelo ili ćelijske efektore, specifične izotipove antitela( npr.,IgM, IgD, IgAl, lgA2, sekrecioni IgA, IgE, IgGl, lgG2, lgG3, i/ili lgG4), ili specifične T-ćelijske podsetove( npr.,CTL, Thl, Th2 i/ili T<DTh>) (videti, na primer, Munozet al.,1990; Glennetal.,1995) .

[0171] Poznato je da nemetilovani CpG dinukleotid ili motivi aktiviraju B ćelije i makrofage (Stacevet al.,1996) . Ostali oblici DNK mogu se koristiti kao adjuvansi. Bakterijske DNK pripadaju klasi struktrure koja ima šablone koji omogućavaju da imuni sistem prepozna njihova patogena porekla kako bi stimulisao imuni odgovor koji vodi ka adaptivnim imunim odgovorima (Medzhitov i Janeway, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9(1): 4-9). Ove strukture nazivaju se patogenom povezani molekularni šabloni (PAMPs) i uključuju lipopolisaharide, teihoinske kiseline, nemetilovani CpG motivi, dvolančana RNK, i manine. PAMPs indukuju endogene signale koji mou da posreduju zapaljenski odgovor, ponašaju se kao ko-stimulatori T-ćelijske funkcije i kontrolišu efektorsku funkciju. Sposobnost PAMPs da indukuje ove odgovore igra ulogu u njihvom potencijalu kao adjuvansi, a njihove mete su APCs kao što su makrofage i dendritične ćelije. PAMPs se takođe mogu primeniti u konjukciji sa drugim adjuvansima radi indukovanja različitih ko-stimulacionih molekula i kontrole različitih efektorskih funkcija za vođenje imunog odgovora, na primer od Th2 do Thl odgovora.

[0172] Ovde je opisana upotreba C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida kao agensa za vakcinu. Ovde opisane vakcine ili imunogene kompozicije mogu da uposle efektivnu količinu antigena. Biće uključena neka količina antigena koja će izazvati da subjekat proizvede specifičan i dovoljan imunološki odgovor kako bi se obezbedila zaštita subjekta od naknadnog izlaganja C.difficile.Antigen može biti C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. U jednom ostvarenju, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid je dat sam ili u kombinaciji sa adjuvansom.

[0173] [0145]Ovde je opisana upotreba C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida kao subjedinične vakcine. Subjedinična vakcina odnosi se upotrebu fragmenta patogena kao agensa za inokulaciju. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da vakcine obezneđuju način za generisanje antitela u određenom delu ili regionu patogena.

[0174] Dozni raspored davanje i efikasnost vakcine može se odrediti postupcima poznatim u struci. Količina vakcine i režim imunizacije mogu da zavise od određenog antigena i adjuvansa koji se upošljavaju, načina i frekvencije davanja, i željenog efekta( npr.,zaštita i/ili tretiranje). Uopšteno, ovde opisana vakcina može da se daje u količinama koje se kreću od između 1 u.g i 100 mg, kao što je npr. između 60 u.g i 600 ug. Pojedinačna doza vakcine koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može biti u opsegu od približno 1 u.g do približno 1 mg, poželjno od približno 5 u.g do približno 500 u.g, poželjnije od približno 20 u.g do približno 200 u.g. Odnos između C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida i adjuvansa kao što je alum može biti približno 1:1 kao što je npr. 1:1.25, ali se takođe mogu primeniti i veći odnosi( npr.,približno 1:10 ili manje), ili se takođe mogu primeniti niži odnosi

[0175] (npr., približno 10:1 ili više). U jednom ostvarenju, u vakcini koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid, adjuvans aluminijum hidroksid primeniće se u opsegu od približno 50 u.g/mL do približno 200 u.g/ml_, poželjno u količini od približno 125 u.g/mL finalne formulacije.

[0176] Vakcina koja obuhvata C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid može se davati oralno, intravenozno, subkutano, intra-arterijalno, intramuskularno, intrakardijalno, intraspinalno, intratorakalno, intraperitonealno, intraventricularno, i/ili podjezično.

[0177] Režim imunizacije se može odrediti postupcima poznatim u struci. Davanje vakcine može se ponavljati kako je određeno da je neophodno od strane stručnjaka iz ove oblasti. Na primer, prva doza može biti praćena 1, 2, 3 ili više dopunjivačkih doza u nedeljnim, dvonedeljnim ili mesečnim intervalima. U jednom ostvarenju ovog pronalaska, prva doza je praćena jednim ili dva dopunjivačkim davanjima u intervalima od približno 7 do približno 14 dana kao što je npr. nakon 7 dana i 21 dan nakon prvog davanja. U poželjnom ostvarenju, terapeutski efektivna količina vakcine daje se dva ili tri puta u intervalima od 14 dana +/-1, 2 ili 3 dana (dvonedeljno) subjektu. U jednom ostvarenju ovog pronalaska, terapeutski efektivna količina vakcine daje se jednom.

[0178] [0150]Još jedan aspket je usmeren na populaciju koja se može tretirati na osnovu ovog pronalaska. U jednom ostvarenju, ta populacija uključuje zdrave pojedince koji su u riziku od izlaganjaC. difficile,naročito, pojedinci kojima predstoji hospitalizacija ili smeštanje u starački dom, kao i zaposleni u bolnicama, staračkim domovima i ostalim ustanovama za negu. U još jednom ostvarenju, populacija uključuje prethodno inficirane pacijente kojim se bolest vratila nakon prekida tretiranja antibioticima, ili kod pacijenata kod kojih antibiotsko tretiranje nije bilo efikasno.

[0179] U još jednom ostvarenju ovog pronalaska, populacija uključuje pojedince koji su najmanje 18 godina stari ili više. U jednom poželjnom ostvarenju, humani subjekat je od 18 do 65 godina star. U još jednom poželjnom ostvarenju, humani subjekat je stariji pojedinac iznad 65 godina starosti. Poslednja grupa je najranjivija populacija koja boluje odC. difficileinfekcija. U još nekom ostvarenju, humani subjekat je mlađi od 18 godina starosti.

[0180] Postupci upotrebe C- TAB. G5 ili C- TAB. G5. 1 izolovanog polipeptida

[0181] Ovde su opisani postupci upotrebe izolovanog polipeptida. Na primer, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid može se koristiti u prevenciji ili tretiranju bolesti povezane saC. difficile.Kao primer, uvođenje izolovanih polipeptida ovog pronalaska u imuni sistem subjekta može da indukuje imuni odgovor koji uključuje antitela koja proizvodi subjekat koja su usmerena protiv izolovanog polipeptida. Takva antitela korisna su u prepoznavanjuC. difficile.

[0182] Ovde su opisani postupci dostavljanja izolovanih polipeptida do subjekta, što obuhvata davanje izolovanog polipeptida subjektu. Izolovani polipeptid može da se daje kao tečan i kao čvrst. Izolovani polipeptid može dalje da uključi farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0183] Ovde su opisani postupci za identifikovanje i ivolovanje varijabilnih domena antitela koje prepovnaje i vevuje se za toksin A i ili toksin B koji obuhvata upotrebu C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida za proizvodnju imunog odgovora, prečišćavanje, a zatim karakterizaciju antitela proizvedenih kao odgovor na C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid. Identifikovani epitopi mogu se koristiti za kloniranje daljih antitela ili njihovih fragmenata.

[0184] Jedan aspekat ovog opisa usmeren je delom na tretman, prevenciju i detekcijuC. difficile.U nekim ostvarenjima, subjekat, kao što je životinja, prima tretiranje i/ili prevenciju i/ili detekciju C.difficile.U drugim ostvarenjima, životinja je čovek. Na primer, ovde opisani polipeptidi mogu se koristiti da podignu antitela uC. difficilein vivo. Kao dalji primer, ovde opisani polipeptidi mogu se koristiti da odrede da li subjekat proizvodi antitela uC. difficile.U nekim ostvarenjima, polipeptid se koroste da izoluju antitela. Kao primer, polipeptidi mogu biti vezani za afinitetnu matricu.

[0185] [0156]Kao još jedan primer, ovde opisana nukleinska kiselina može se koristiti da transformiše i/transfektuje ćelije u rekombinantno proizvedene polipeptide i/ili antitela ovog pronalaska. Ovde opisane ukleinske kiseline takođe se mogu primeniti, na primer, kako bi se odredilo da li je subjekat inficiran saC. difficile.Kao primer, ovo se može postići primenom postupaka radiobeležene hibridizacije.

[0186] Kao dalji primer, ovde opisana antitela mogu se primeniti za prepoznavanje infekcije od straneC. difficile.Kao primer, antitela mogu da prepoznaju nativni toksin A i/ili toksin B kao antigen. Ovde opisana antitela takođe se mogu primeniti za borbu protiv infekcijeC. difficile.Kao primer, humanizovana antitela ili fragmenti antitela ili monoklonalna antitela mogu uposliti sam subjektov imuni odgovor kaC. difficileinfekciji. Kao dalji primer, ovde opisana antitela mogu se kuplovati sa citokinom ili toksinom ili enzimom ili markerom kako bi se potpomoglo tretiranje i detekcija infekcije.

[0187] Dalji aspekti ovog opisa ondose se na dijagnostičke oglede. Ovaj opis može se primeniti sa mnogim ogledima poznatim u struci. Stručnjacima iz ove oblasti poznat je širok spektar ispitivanja na bazi upotrebe ovde opisanih polipeptida, nukleinskih kiselina i antitela. Ovde opisani polipeptidi, antitela i nukleinske kiseline mogu, na primer, biti obeleženi, kao što je sa radioaktivnim, hemiluminiscentnim, fluorescentim i/ili obojenim molekulima. Ovde opisana antitela, nukleinske kiseline i polipeptidi sebe pozajmljuju za upotrebu u ogledima kao na primer DNK ogledi (kao što je Southern blot analiza), RNK (kao što je Northern blot analiza), proteinski ogledi (kao što je Western blot analiza), hromatografski ogledi (kao što je gasna, tečna, HPLC, ekskluziona na osnovu eličine), imunoogledi (kao što je ELISA) i strukturalni ogledi (kao što je cristalografija i NMR spektroskopija). Ovde opisana antitela, polipeptidi i nukleinske kiseline mogu se dalje upotrebiti kao probe. Ogledi koji pojačavaju signale iz probe takođe su poznati stručnjacima iz ove oblasti.

[0188] Kompleti

[0189] Ovde su opisani kompleti koji obuhvataju na primer, a ne ograničavaju se na, nukleinske kiseline koje kodiraju C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid, i/ili antitela protiv C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovanog polipeptida. Ti kompleti mogu da uključe jedan ili više kontejnera i instrukcija za upotrebu u skladu sa bilo kojim ovde opisanim postupcima. Ovde opisani C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 izolovani polipeptid i/ili antitela mogu se koristiti u raznim ogledima uključujući imunooglede za detektovanjeC. difficile.U jednom ostvarenju, C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 izolovani polipeptid služi da funkcioniše kao antigen radi detektovanja antitela u biološkim uzorcima. Kontejneri mogu biti dozna jedinica, grupna pakovanja( npr.,višedozna pakovanja) ili subjedinična doza. Kompleti ovog pronalaska pogodni su za pakovanje. Takođe su razmatrana pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa specifičnim uređajem, kao što je inhalator, uređaj za nazalno davanje ili neki infuzioni uređaj. Komplet može imati sterilni pristupni port. Kontejner takođe može da ima sterilni pristupni port. Kompleti opciono mogu da obezbede dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije.

[0190] Kompleti mogu da se koriste za detektovanje prisustvaC. difficileili za detektovanje bolesti povezane saC. difficile,kao što je CDAD. Kompleti se mogu koristiti da spreče ili tretiraju bolesti povezane saC. difficile.Ovde opisani kompleti takođe se mogu primeniti da ublaže simptome bolesti povezane saC. difficile.

[0191] Bez daljeg opisivanja, smatra se da stručnjak iz ove oblasti, koristeći prethodni opis i sledeće ilustrativne primere, može da napravi i izvede zaštićeni pronalazak. Sledeći radni primeri prema tome, specifično ukazuju na poželjna ostvarenja ovog pronalaska, i nisu konstruisani da na bilo koji način ograniče ostatak ovog pronalaska.

[0192] PRIMERI

[0193] Primer 1: Pripremanje C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 izolovanih polipeptida.

[0194] Ovaj Primer opisuje pripremanje izolovanih polipeptida koji obuhvataju deloveC. difficile toksinaA (CTA) i B (CTB) radi ekspresijeu E. colićelijama. Postupak opisan u nastavku može se primeniti za izradu raznih izolovanih polipeptida koji obuhvataju CTA i CTB. Kao primer, opisan je izolovani polipeptid koji obuhvata deo C-terminalnog domena CTA i deo C-terminalnog domena CTB.

[0195] Primer 1.1: Kloniranje C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 genskih konstrukata.

[0196] Deo CTA gena (Pristupni br. YP-001087137) koji kodira amino kiseline 2026 do 2710 C-terminalnog domena pojačan je pomoću PCR iz genomskog DNKC. difficilesoja 630 (ATCC BAA-1382) koristeći sledeće prajmere:

[0197] forvardni: 5'- caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc -3'(SEQ ID NO: 9) i

[0198] reverzni: 5'- CTCGAGttagccatatatcccaggggc -3' (SEQ ID NO: 10).

[0199] Pojačavanje sa forvardnim prajmerom kreiranim kaoSpelmesto, i pojačavanje sa reverznim prajmer kreiranim kaoXholmesto.

[0200] Deo CTB gena (Pristupni br: YP-00108735) koji kodira amino kiseline 1850 do 2366 C-terminalnog domena pojačan sa PCR koristeći sledeće prajmere:

[0201] forvardni: 5'- caccATGCATatgagtttagttaatagaaaacag -3' (SEQ ID NO: 11) i

[0202] reverzni: 5'- ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc -3' (SEQ ID NO: 12).

[0203] Pojačavanje sa forvardnim prajmerom stvaraNsilmesto, a pojačavanje sa reverznim prajmerom

[0204] stvara Xhol mesto.

[0205] PCR reakcije izvedene su primenom PCR Super-Mix (Invitrogen). Uslovi ciklusa bili su 95°C tokom 2 minuta, 95°C tokom 45 sekundi, 55°C tokom 50 sekundi, 68°C tokom 8 minuta (30 ciklusa), i 72°C tokom 10 minuta. PCR proizvodi prečišćeni su Kompletom za brzu ekstrakciju gena (Invitrogen) i povezani u PCR 2.1 doPO vektor (Invitrogen). Ligacione mešavine upotrebljene su da tranformišuE. coliMech-1 ćelije toplotnim šokom. Tranformacije su postavljene na ploče ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Bele kolonije su pokupljene i uzgajane u 15 ml epruvetama sa 4 ml LB medijuma koji sadrži 100 u.g/ml ampicillina. Kulture su inkubisane tokom noći na 37°C, a plazmidi ekstrahovani sa Kompletom za brzo minipripemanje plazmida (Invitrogen).

[0206] CTA genski fragment u PCR 2.1-TOPO/TA vektoru svaren je saSpeliXhol,a fragment je kloniran u intermedijerni vektor, takođe svaren saSpeliXhol,koristeći T4 DNK Ligazu. Linker koji sadrži tri mesta restrikcije( BgLII- Nsil- SacI)zatim je ubačen na 3' kraju CTA genskog fragmenta pomožu PCR koristeći sledeći set sintetičkih prajmera:

[0207] forvardni: 5'- AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc -3' (SEQID NO: 13)

[0208] reverzni: 5'- cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc -3' (SEQ ID NO: 14).

[0209] CTB genski fragment u PCR 2.1 -TOPO/TB svaren je saNsiliXhol,i svareni CTB genski fragment vezan je za intermedijerni vektor koji sadrži CTA gen i linker, koji je takođe svaren saNsiliXhol.CTB gen je ubačen u 3' do linkera dajući konstrukt sekvencu 5'-CTA-linker-CTB-3'. Ovaj fuzioni konstrukt odnosi se na C-TAB.V1 intermedijerni vektor.

[0210] C-TAB.G5 gen pojačanje pomoću PCR iz C-TAB.Vl intermedijernogvektora koristeći prajmere: forvardni: 5'- caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga (SEQID NO: 15)

[0211] reverzni: 5' - CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg (SEQ ID NO: 16).

[0212] [0171]PCR reakcije izvedene su primenom PCR Super mix (Invitrogen). Uslovi ciklusa bili su 95 °C tokom 2 minuta, 95 °C tokom 45 sekundi, 55 °C tokom 50 sekundi, 68 °C tokom 4 minuta (30 ciklusa) i 72 °C tokom 10 minuta. PCR proizvodi prečišćeni su Kompletom za brzu ekstrakciju gena (Invitrogen) i povezani u PCR2.1-TOPO vektor (Invitrogen). Ligacione mešavine upotrebljene su da tranformišuE. coliMech-1 ćelije toplotnim šokom. Tranformacije su postavljene na ploče ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Bele kolonije su pokupljene i uzgajane u 15 ml epruvetama sa 4 ml LB medijuma koji sadrži 100 u.g/ml ampicillin. Kulture su inkubisane tokom noći na 37 °C, a plazmidi ekstrahovani sa kompletom za brzu mini pripremu plazmida (Invitrogen). C-TAB.G5 fuzioni gen u PCR 2.1-TOPOTA vektoru svaren je saNcoliXholrestrikcionog enzima. Ovi C-TAB fragmenti povezani u pET28 ekspresionom vektoru svareni su sa istim restrikcionim enzimima. Ovaj rezultujući konstrukt kodira toksin A C-terminalni domen iz amino kiselina 2272 do 2710 fuzionisane sa toksin B C-terminalnim domenom iz amino kiselina 1851 do 2366. pET28/C-TAB.G5 konstrukt transformisan je uE. coliBL21 (DE3) radi ekspresije. Pet kolonija koje sadrže C-TAB.G5 fuzioni gen odabrane su za analizu.

[0213] C-TAB.G5.1 kodirajuća sekvenca dobijena je kodon optimizacijom za poboljšanu ekspresiju

[0214] unutarE. coli ćelijadomaćina. Upotreba kodona adaptirana je na kodon sklonostE. coli gena.Dodatno, GC sadržaj podešen je da produži mRNK polu život; region veoma visokog (>80 %) ili veoma niskog (<30 %) GC sadržaja je zaobiđen. Prema tome, oprimizovani gen omogućava visoke i stabilne stope ekspresijeu E. coli.Kodon optimizovani C-TAB.G5.1 gen sintetizovan jein situi podkloniran u ekspresionom vektoru pET-28b(+).

[0215] DNK Sekvencionisanje:

Plazmid DNK sekvence potvrđene su primenom hernije sekvencionisanja ciklusa terminatora bojenja sa d-Rhodamine bojama. Podaci sekvencionisanja analizirani su primenom Jellvfish softvera.

[0216] Primer 1.2: Ekspresija rekombinantnih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 fuzionih proteinau E. coli.

[0217] Ekspresija C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 genskih konstrukata može se izvesti primenom standardne procedure za ekspresijuu E. coli.

[0218] Skrining kolonije za ekspresiju rekombinantnog C- TAB fuzionog proteina:

u svrhu skrininga, kolonije su odabrane i uzgajane u 15 ml Falcon epruvetama sa 4 ml LB medijuma sa 50 u.g/ml kanamicina. Epruvete su kultivisane tokom noći 37°C sa umešavanjem na 250 o/min. Nakon inicijalne faze rasta, 1 ml kulture iz svake epruvete transferovano je u tkivne ploče sa 24 bubarčića, a ekspresija je indukovana sa 1 mM izopropil-B-D-l-tiogalakto-puranozidom (IPTG) tokom 3 h na 30°C. Ćelijski peleti sakupljeni su centrifugiranjem na 12,000 g tokom 1 min u mikrocentrifugi. Pripremljeni su lizati ćelijskih peleta, a rastvorna frakcija je procenjena pomoću SDS-PAGE i VVestern Blot analize radi ekspresije C-TAB fuzionog proteina. Pozitivni klonovi odabrani su za dalju procenu.

[0219] Fermentacija šarže za C- TAB. G5 ekspresiju:

Zasejane kulture uzgajane su u pet 500 ml bočica za umešavanje od kojih svaka sadrži 150 ml Super Bujon medijuma obogaćenog sa 30 p.g/ml kanamicina. Kulture su uzgajane tokom 12 h na 28°C uz kontinualnu agitaciju pri 275 o/min dok OD<6oo>nije dostigao 2

[0220] - 2.5. Bočice za umešavanje primenjene su za inokulisanje fermentera koji 10 L Super Bujona. Kultura je uzgajana približno 4.5 h na 37°C do OD<6oo>= 3.5 - 4. Za indukovanje proizvodne ekspresije, dodat je 0.1 mM IPTG i uzgajanje je nastavljeno dodatnih 4 h na 25°C. Zatim su ćelije sakupljene centrifugiranjem, a

[0221] ćelijska pasta je odložena smrznuta na - 70°C. Tipična stopa prodizvodnje specifične ekspresije postignuta ovim fermentacionim procesom bila je približno 200 mg/ml.

[0222] Fermentacija uvođenjem šarži za C- TAB. G5. 1 pripremanje:

Alikvot od 500 u.1 glicerinskoj podlozi banke semena (čuvana na -75°C) upotrebljen je kako bi se inokulisalo 100 ml medijuma pred-kulture dopunjenog sa 30 u.g/ml kanamicina u 1 L bočici za mešanje. Pred-kultura je inkubisana na 37°C uz konstantno mešanje na<~>150 o/min tokom približno 7 h dok nije postignut OD<6oo>= 1.0-2.0. 25 mL pred-kulture primenjeno je za inokulisanje 7 L medijuma fermentacije šaržom u standardnom industrijskom 15 Lfermenteru opremeljenom sa sistemom za kontrolu procesa, koji može da izvede fermentacije uvođenjem šarži. 7 L faza šarže sa kulturom izvedena je 12 h na 37°C (OD<6oo>= 12-15) dok nije potrošena glukoza. Faza uvođenja glukoze (proizvodnja biomase) zatim je inicijalizovana eksponencijalnim načinom uvođenja pri specifičnoj konstanti stope rasta u. = 0.25/h na 37°C tokom 6 h (OD<6oo>= 40-50). Jeda sat pre zamene na konstantnu fazu uvođenja i indukciju sa finalnom koncentracijom od 1 mM IPTG (proizvodnja proizvoda), temperatura je redukovana na 30°C kako bi se smanjio rizik od uključivanja formiranja tela. Faza ekspresije prizvoda nastavljena je još jedno 5 h sa konstantnim uvođenjem na 30°C (OD<6oo>=<~>100), što je za rezultat imalo ukupno vreme fermentacionog proseca od 23 h i konačnu zapreminu kulture od<~>8.2 L. Vlažna ćelijska biomasa od približno 1.2 kg sakupljena je centrifugiranjem i odložena na <-<70>°C. Stopa specifične ekspresije uobičajenog proizvoda dostiguta ovakvom fermentacijom uvođenjem šarži iznosila je do 1.3 g/L.

[0223] Primer 1.3: Prečišćavanje rekombinantnih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 fuzionih proteina.

[0224] Prečišćavanje C- TAB. G5 analitičkog uzorka:

Zamrznuta ćelijska pasta odmrznuta je i resuspendovana u 10 mM limunska kiselina/NaOH puferu pri pH 5.6, a ćelijska suspenzija provučena je dva puta kroz homogenizator (GEA Niro Soavi homogenizator) pri 550 bara. Suspenzija je centrifugirana dva puta: jednom na 13500 o/min tokom 30 minuta i drugi put na 18000 o/min u ultracentrifugi tokom jednog sata. Supenatanti su sakupljeni, a pH je podešena na 5.6 puferom 50 mM limunske kiseline od pH 3. Pročišćeni ćelijski lizati provučeni su kroz SP kolonu brzog protoka sa puferom 10 mM limunska kiselina/NaOH na pH 5.6. Proteini su eluirani sa lineranim gradijentom natrijum hlorida povećavan od 0 do 500 mM u 20 mM NaPi. Frakcije koje sadrže C-TAB.G5 su sakupljene. Konduktivnost je podešena do 5 mS/cm sa destilovanom H<2>0. Tris je dodat u 25 mM finalne koncentracije. Sakupljene frakcije provučene su kroz DEAE kolonu brzog protoka. Protein je eluiran linearnim gradijentom naterijum hlorida koji je povećavan od 50 do 500 mM u 25 mM Trisu. Ponovo, frakcije koje sadrže C-TAB.G5 su sakupljene, a 1.5 M Na-Citrat, pH 7.5, dodat je finalnoj koncentraciji od 0.4 M. C-TAB.V1 bazenčić uveden je na fenol sefaroza HP kolonu ekvilibrisanu sa 25 mM Trisom, 0.4 M Na-Citrat pH 7.5. C-TAB.G5 fuzioni protein eluiran je sa redudovanom koncentracijom soli u lineranom gradijentu koristeći 5 mM Tris, pH 7.5. Sve kolone praćene su AKTA Prime hromatografskim sistemom. Prečišćeni C-TAB fuzionom proteinu zamenjen je pufer sa PBS koristeći 50 K membranu.

[0225] Prečišćavanje C- TAB. G5. 1 preparata šarže:

Biomasa je odložena na -80°C do obrade. 450 g zamrznute ćelijske paste (ekvivalentno 2.90 L fermenteru) razblaženo je sa 4 zapremine liziranog pufera (20 mM Hepes, pH 7.5,<~>0.6 mS/cm) (npr. 450 g paste + 1800 mL pufera) i otopljeno na ovaj način tokom<~>1 h±0.5 h pod mehaničkim umešavanjem. Opciono, preostale grudvice mogu se resuspendovati primenom Ultraturrax (npr. 5 min pri 8000 o/min). Ćelijska lizija izvedena je na Niro Soavi Panda visokom homogenizeru (640±25 bara, 3 ciklusa). Lizat je ohlađen do < 10°C koristeći toplotni izmenjivač i održavan na ovoj temperaturi do centrifugiranja. Sirovi ćelijski lizat je podvrgnut serijskom centrifugiranjem u fazi serijskog centrifugiranja (Beckmann Avanti JLA 60.25) koji je upravljan pri 14000 o/min (30000 g) na 4°C tokom 30 min. Supernatanti su ohlađeni i sakupljeni. Polutečni deo peleta je takođe odbačen, kako bi se smanjio rizik od zapušavanja faze filtriranja. Sakupljeni supernatanti su zatim filtrirani putem filter kapsule Supercap PDH4 100/5 inča dubine (Pali) (250 cm<2>efektivne površine filtracije). Preostali lizat u filter kućištu ispran je puferom lizije. Nakon pročišćavanja, alikvot rastvora IM Tris podloge, pH 7.5, dodat je lizatu do finalne koncentracije od 25 mM. Puferska kompozicija finalnog lizata je 20 mM Hepes, 25 mM Tris, pH 7.5, provodljivost<~>6 mS/cm). Lizat još uvek može biti blago mutan nakon filtracije, ali ovaj ne utiče na sledeću fazu hvatanja. Faza hvatanja izvodi se na sobnoj temperaturi sa DEAE Sefaroza FF (GE Healthcare) u XK50/30 koloni (GE Healthcare) sledećih dimenzija: prečnik 50 mm, visina upakovanog kreveta 20 cm, zapremina upakovanog kreveta<~>400 mL. Gustina unosa je otpr. gel 0.8 do 1.2 g biomase/mL. Postupak je izveden Akta Explorer sistemom (GE Healthcare) i praćen na 280 nm. Ekvilibracija se izvodi na 100 cm/h sa otpril. 5 CV 25 mM Trisa, 20 mM Hepes, 25 mM NaCI, pH 7.5, provodljivost<~>5 mS/cm dok pH, provodljivost i 280 nm apsorbanca ne postanu stabilni. Lizat je uveden u kolonu na 75 cm/h a protok je odbačen. Kada je sav filtrirani lizat uveden, protok je nastavljen sa otpril. 5 CV ekvilibracionog pufera dok 280nm apsorbanca nije stabilizovana. Nečistoće su uklonjene iz kolone tokom faze ispiranja 2 sa 5 CV 25 mM Tris, 175 mM NaCI, pH 7.5, provodljivost 19 mS/cm. C-TAB protein je eluiran iz kolone fazom eluiranja sa 3 CV 25 mM Tris, 375 mM NaCI, pH 7.5, provodljivost 36 mS/cm. Sakupljanje C-TAB koje sadrži frakcije počinje kada 280 nm apsorbanca počinje da se povećava (obično nakon 1 CV) i traje tokom približno 0.5 do 1.0 CV. Sakupljene frakcije koje sadrže C-TAB mogu se sačuvati na 2-8°C tokom noći. Faza prečišćavanja intermedijera izvedena je sa SP-Sefaroza FF (GE Healthcare) u XK50/30 koloni (GE Healthcare) na sobnoj temperaturi sa sledećim dimenzijama: prečnik 50 mm, visina upakovanog kreveta 20 cm, zapremina upakovanog kreveta<~>400 mL. Gustina maksimalnog unosa je otpril. gel 4-5 mg C-TAB/mL. Postupak je izveden Akta Explorer sistemom (GE Healthcare) i praćen na 280 nm. Faze ekvilibracije, pranja i linearnog gradijentisanja izvedene su pri maksimalnim brzinama protoka od 200 cm/h (65 mL/min) ukoliko prekomerni povratni pritisak (>4 bar) to ne spreči. Ekvilibracija se izvodi sa otpril. 5-10 CV pufera G na 200 cm/h dok pH, provodljivost i 280 nm apsorbanca ne postanu stabilni. Pre uvođenja, DEAE bazen morao je biti podešen kako bi se omogućilo vezivanje C-TAB na SP-FF smoli. DEAE bazen razblažen je 25 puta sa SP-FF ekvilibracionim puferom (10 mM limunska kiselina, 2 mM EDTA, pH 5.5±0.1, provodljivost<~>2 mS/cm) do finalne provodljivosti od ne više od 3.5 mS/cm, pH 5.5 ± 0.1. Ukoliko je potrebno dodatni MilliQ vode dodaje se kako bi se postigla željena provodljivost. Treba imati na umu da je niska provodljivost veoma kritična da omogući vezivanje C-TAB na SP-FF. Uzorak je uveden u kolonu na 150 cm/h, a protok je odbačen. Nakon uvođenja uzorka, protok je nastavljen sa otpril. 5 CV ekvilibracionog pufera na 200 cm/h dok 280 nm apsorbanca nije stabilizovana. Eluiranje je izvedeno linearnim gradijentom na 100 cm/h od 0 % ekvilibracionog pufera do 30 % 20 mM natrijum fosfata, 500 mM NaCI, pH 7.0 preko 10 CV. Frakcije su sakupljene, a objedinjivanje je izvedeno UV 280 nm apsorbancom. Objedinjivanje počinje na 15 % maksimalnog pika i završava se na 15 % maksimalnog pika. Bazen je odmah podešen na 400 mM citrata (finalna pH 7, otpril. 49 mS/cm) koristeći rastvor 1.5 M citratne podloge, pH 8.0. Podešeni SPFF bazen trebalo bi da ima pH 7 i otpril. 49 mS/cm i odložen je na 2-8°C tokom noći.

[0226] Faza polirajuće hromatografije izvodi sa Phenvl-Sefaroza HP (GE Healthcare) u XK50/30 koloni (GE Healthcare) na sobnoj temperaturi sa sledećim dimenzijama: prečnik 50mm, visina upakovanog kreveta 15 cm, zapremina upakovanog kreveta<~>300 mL. Gustina unosa je otpr. gel 4-5 mg C-TAB/mL. Postupak je izveden Akta Explorer sistemom (GE Healthcare) i praćen na 280nm. Faze ekvilibrsanja, uvođenja, pranja i eluiranja izvedene su pri maksimalnoj brzini protoka od 100 cm/h (33 mL/min) ukoliko prekomerni povratni pritisak (>4 bar) to ne spreči. U tom slučaju, brzina protoka mora da se redukuje. Ekvilibrisanje se izvodi sa otpril. 5-10 CV 25 mM Tris, 400 mM natrijum citrata, pH 7.5,46 mS/cm pri 100 cm/h dok pH, provodljivost i 280 nm apsorbanca ne postanu stabilni. Uzorak je uveden u kolonu na 100 cm/h, a protok je odbačen. Nakon uvođenja uzorka, protok je nastavljen sa otpril. 5 CV ekvilibracionog pufera pri 100 cm/h dok 280 nm apsorbanca nije stabilizovana. Eluiranje je izvedeno lineranim gradijentom pri 100 cm/h od 100 % ekvilibracionog pufera / 0% 5 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mS/cm do 100 % 5 mM Trisa, pH 7.5, 0.5 mS/cm preko 20 CV. Frakcije su sakupljene, a objedinjivanje je izvedeno UV280nm apsorbancom. Objedinjivanje počinje na otpril. 10-15 % maksimalnog pika i završava se na otpril. 20% maksimalnog pika. Podešeni bazen je odložen na 2-8°C tokom noći. Pripremanje finalne proteinskog rastvora supstance C-TAB leka postignuto je sa 30 kDa odsečenom filtracijom tangencijalnog protoka (TFF, Pellicon 2 membrana, Millipore) koja je izvedena na sobnoj temperaturi. Rastvor proteina je dijafiltriran ka formulacionim puferom (20 mM Histidin, 75 mM NaCI, 5 % Saharoza, 0.025 % Tween<®>80, pH 6.5) dok prožeta pH nije odgovarala 6.5±0.2).

[0227] Finalna koncentracija proteina podešena je na 2 mg/mL u skladu sa UV merenjem pri 280 nm koristeći 1.566 kao specifičan koeficijent izumiranja na 280 nm za C-TAB (konc. proteina 1 mg/mL, 1 cm kiveta).

[0228] SDS- PAGE i vVestern Blot Analiza:

Celi ćelijski lizati i prečišćen C-TAB.G5 ili C-TAB. G5.1 fuzioni protein resuspendovani su u Nu-Page puferu sa uzorcima koji sadrži betamerkaptoetanol i kuvani tokom 10 min. Uzorci (25 u.1) su uvedeni na 3 - 8 % Tris-Acetatni gel. Nakon elektrofereze (150 V tokom 1 h), proteini su vizualizovani bojenjem gelova jednostavnom pvaom bojom ili upotrebljeni za VVestern blot analizu.

[0229] C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 specifična ekspresija određena je vVestern blot analizom koristeći toksin-specifična antitela. Proteini su preneti na 23 V tokom 60 min na PVDF membrani koristeći lxTransferni pufer u 10 % metanolu. Membrane su blokirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa 0.5 % kaseinom u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru (PBS). Transferne membrane su inkubisane tokom 2 h na sobnoj temperaturi bilo sa monoklonalnim antitelom protiv Toksina B (GenVVav; klon B426M) ili in-house dobijenim antitelom morskog praseta protiv Toksina A (List Biological Labs). Isprane membrane su inkubisane sa anti-morsko prase IgG ili anti-mišjim IgG konjugovane sa peroksidazom rena. Blotovi su oprani, a AEC supstrati dodati. Blotovi su inkubisani uz nežno umešavanje tokom 5-10 minuta. Blotovi su isprani vodom kako bi se zaustavio razvoj boje.

[0230] RBC hemaglutinacija:

ćelijski vezujući domen toksina A, ali ne i toksina B, pokazao se da je sposoban za aglutinaciju zečijih crvenih krvnih ćelija (RBCs). Aglutinacioni postupak je rezultat vezivanja toksina A za glikan skvencu pronađenu u krvnim antigenima zečijih RBCs. Uzorci (C-TAB.G5 i nativni toksin A) su razblaženi do 100 u.g/ml u PBS. U mikrotitarsku ploču sa V-dnom, pripremljena su dvostruka serijaska razblaženja u duplikatu kroz ploču, počevši od 100 u.g/ml i ostavljajući 50 u.1 razblaženja u svakom bunarčiću. Pedeset mikrolitara 0.75 % zečije RBC/PBS suspenzije dodato je u svaki bunarčić mikrotitarske ploče, a ploča je inkubisana tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Hemaglutinacija je indikovana neuspelim formiranjem peleta RBCs na dnu te ploče. Hemaglutinacioni titar uzorka predstavljen je koncentracijom proteina prisutnog u bunarčiću sa najvećim razblaženjem uzorka u kojem nije primećen RBC pelet.

[0231] Primer 2: Dozna titracija rekombinantnog C-TAB.G5 fuzionog proteina u prisustvu i bez aluma kod

[0232] miševa.

[0233] Ovaj ogled namenjen je da se odredi izvodljivostin vivodozne titracije C-TAB.G5 sa i bez alumnog adjuvansa kao C-TAB ogled potencije. Korišćeni alum bio je Alvdragel, (alum hidroksid, Brenntag). C57BL/6 ženki miševa (Charles River Labs.), starosti između 8 i 9 nedelja, upotrebljene su za imunizaciju. Sve životinje primile su prvu imunizaciju intramuskularnim (IM) injektovanjemm (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga imunizacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14. Ukupno od 72 miševi podeljeno na 12 grupa vakcinisano je kako sledi:

[0234] • Grupa 1: Samo PBS

[0235] • Grupa 2: 100 (154) ng C-TAB.G5

[0236] • Grupa 3: 300 (462) ng C-TAB.G5

[0237] • Grupa 4: 1,000 (1,540) ng C-TAB.G5

[0238] • Grupa 5: 3,000 (4,620) ng C-TAB.G5

[0239] • Grupa 6: 10,000 (15,400) ng C-TAB.G5

[0240] • Grupa 7: PBS sa 50 u.g alum

[0241] • Grupa 8:10.0 (15.4) ng C-TAB.G5 sa 50 u.g aluma OH

[0242] • Grupa 9: 30.0 (46.2) ng C-TAB.G5 sa 50 u.g aluma OH

[0243] • Grupa 10:100 (154) ng C-TAB.G5 sa 50 u.g aluma OH

[0244] • Grupa 11: 300 (462) ng C-TAB.G5 sa 50 u.g aluma OH

[0245] • Grupa 12:1,000 (1,540) ng C-TAB.G5 sa 50 u.g aluma OH

[0246] U ovom ispitivanju koncentracija proteina prvo je određena u skladu sa standrdnim protokolom Quick Start™ Bradford Protein Assav (Bio-Rad). Kasnije, koncentracija proteina (prikazana u zagradama) ponovo je određena UV merenjem na 280 nm u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 1.3. U svim ispitivanjima dodatnog praćena, koncentracija proteina merena je UV postupkom.

[0247] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon prve imunizacije (ispitni dan 14) i dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja.

[0248] Serum IgG ELISA:

Serum antitela izazvana u C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 (nazivaju se C-TAB), toksin A i toksin B ili njihovi toksoidi procenjeni su u enzim-povezanom imunosorbentnom ogledu (ELISA). Ukratko, rastvor podloge od 1.0 u.g/ml toksina A, toksina B ili C-TAB.G5 izolovanog polipeptida pripremljen je u PBS i 100 u.1 dodato je u svaki bubarčić ploče sa 96 bunarčića. Nakon inkubacije na 4°C tokom noći, ploče su oprane i blokirane sa 0.5 % kasein blokirajućim puferom. Ploče su oprane ponovo i u ploče su dodata serijska, dvostruka razblaženja ispitnog seruma. Nakon druge inkubacije na 4°C tokom noći, ploče su oprane i inkubisane sa peroksidaza-konjugovanim anti-mišjim IgG (H + L). Nakon 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo oprane, dodat je peroksidaza supstrat (2,2'- azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonat), a boji je dopušteno da se razvije tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 u.1 2 % SDS u bunarčiće. Ploče su iščitane sa ELISA čitača ploče pri apsorbanco od 405 nm. Titri antitela u serumu prijavljeni su kao geometrijska sredina ELISA jedinice, što predstavlja serumska razblaženja koja rezultiraju kao OD 405 nm čitanja od 1.0. Kao negativna kontrola, upotrebljen je pred-imunizacioni serum dobijen iz životinjskog pred-krvarenja pre prve imunizacije kako bi se procenio odgovor antitela.

[0249] Životinje koje su primile C-TAB.G5 pokazale su dozno zavisno povećanje u titrima antitela, pri čemu je alumni adjuvans omogućio značajno poboljšane titre antitela pri nižoj dozi C-TAB. G5. FIG. 3 pokazuje titre za anti C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B IgG. FIG. 4 pokazuje grafičko poređenje titara antitela u prisustvu ili odsustvu aluma.

[0250] Primer 3: Imunogenost i zaštitna efikasnost C-TAB.G5 kod miševa.

[0251] Ovaj ogled namenjen je proceni imunogenosti i zaštitne efikasnosti C-TAB.G5 kod vakcinisanih miševa koji su primili letalni čelendž C.difficile toksinaA ili toksina B. Ženke C57BL/6 miševa (Charles River Labs.), stare 6-7 nedelja, korišćene su za ovaj ogled. Sve životinje su primile prvu vakcinaciju intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga vakcinacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14.116 miševa podeljeno je u grupe koje su vakcinisane kako sledi:

[0252] • Grupa 1: Samo PBS

[0253] • Grupa 2: 3 u.g C-TAB.G5

[0254] • Grupa 3:10 u.gC-TAB.G5

[0255] • Grupa 4: 30 u.g C-TAB.G5

[0256] • Grupa 5: 3 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0257] • Grupa 6:10 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0258] • Grupa 7: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0259] • Grupa 8:: Samo PBS

[0260] • Grupa 9: 3 u.g C-TAB.G5

[0261] • Grupa 10: 10 u.g C-TAB.G5

[0262] • Grupa 11: 30 u.g C-TAB.G5

[0263] • Grupa 12: 3 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0264] • Grupa 13:10 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0265] • Grupa 14: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH

[0266] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B zatim su određeni pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU).

[0267] FIG. 5 pokazuje titre antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B kod miševa procenjenih dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Ovaj ogled pokazuje da je C-TAB.G5 fuzioni protein veoma imunogen kod miševa i da može da indukuje snažan odgovor antitela protiv oba, toksina A i toksina B čak i bez dodavanja adjuvansa. C-TAB.G5 imunogenost može biti značajno uvećana (više nego za jedan log) ko-dostavom sa alum hidroksidom. Životinje koje su primale C-TAB.G5 sa ili bez aluma pokazale su 2-struko povišen odgovor antitela tokom jedno lognog doznog opsega.

[0268] Pored procenjivanja titara antitela, antitela gerenerisana imunizacijom sa C-TAB.G5 ocenjena su na njihovu sposobnost da neutrališu nativni toksin A i B uin vitroogledu neutralizacije toksina (TNA).

[0269] Ogled toksin neutralizujućeg antitela ( TNA).

Zain vitroanalizu, 125 u.1 bilo toksina A (5 ng/ml) ili toksina B (1 ng/ml) inkubisano je sa 125 u.1 serijskih razblaženja anti-seruma dobijenog od imunizovanih miševa. Nakon jedno h inkubacije na 37°C, toksin:serum mešavina dodata je u mikrotitarske bazenčiće koji sadrže Vero ćelije (ćelije bubrega majmuna), i mikrotitarske ploče su inkubisane tokom 18 h. Inkubacija bilo toksina A ili B sa Vero ćelijama rezurtirala je kao promena u ćelijskoj morfologiji i gubitak ćelijskog prijanjanja što je izmereno neuralnim crvenim bojenjem toksinom tretiranih ćelija nakon uklanjanja ne-adherentnih ćelija. Titar neutralizacije toksina seruma prijavljen je kao razblaženje seruma koje je dalo 50 % smanjenje u aktivnosti toksina.

[0270] Rezultati TNA ogleda prikazani su na FIG. 6. Podaci ukazuju da su antitela gerenerisana nakon imunizacije sa samim C-TAB.G5 sposobna da neutralizuju toksičnu aktivnost nativnog toksina A, ali ne i toksina B. Kada je C-TAB. G5 dat zajedno sa alumom, TNA titri su uvećani sa približno 6-strukim povećanjem u anti-toksin A TNA i samo 2-struko nižim titrima u anti-toksin B TNA. Ovi podaci ukazuju da C-TAB.G5 izolovani polipeptid ne samo da zadržava prepoznavanje antitela antigenskih epitopa prisutnih u nativnom toksinu, već obuhvata kritične antigenske epitope potrebne za generisanje funkcionalnog toksin neutralizujućeg antitela. Prema tome, C-TAB.G5 je efektivan u neutralizujućim toksičnim efektima C.difficiletoksina A i toksina B i, prema tome, koristan je u vakcinaciji.

[0271] [0196]Pored ocenjivanja odgovora antitela, određena je i sposobnost C-TAB.G5 imunizacije da zaštiti miševe od letalnog čelendža nativnih toksina. Tri nedelje nakon druge vakcinacije (ispitni dan 35) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=8) primile su intraperitonealnu (IP) letalnu dozu bilo 25 ng toksina A ili 50 ng toksina B. Preživljavanje miševa praćeno je tokom sledećih 9 dana , a rezultati su prikazani na FIG. 6. Ovaj eksperiment pokazao je daje imunizacija miševa sa C-TAB.G5 u odsustvu alumnog adjuvansa bila sposobna da obezbedi 100 % zaštitu protiv letalnog čelendža sa nativnim toksinom A i 50 % zaštite protiv toksin B čelendža. Ko-dostavom C-TAB.G5 sa alumom, pojačalo je zaštitni imunitet ka toksinu B za do 100 % zaštite. Ovi podaci ukazuju da C-TAB.G5 vakcinacija indukuje imuni odgovor dovoljan da zaštiti miševe od toksičnih efekata oba i toksina A i B u modelu letalnog čelendža.

[0272] Primer 4: Procena imunogenosti i zaštitne efikasnosti C-TAB.G5 kod mladih i starih miševa.

[0273] Ovo ispitivanje namenjeno je da uporedi imuni odgovor usmeren protiv C-TAB.G5 kod mladih i starih miševa. Ženke C57BL/6 miševa (Charles River Labs.), stare 6-7 nedelja i 18 meseci, respektivno, korišćene su za ovaj ogled. Sve životinje su primile prvu vakcinaciju intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga vakcinacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14.192 miševa podeljeno je u grupe koje su vakcinisane kako sledi:

[0274] • Grupa 1: PBS kod mladih miševa

[0275] • Grupa 2: PBS kod starih miševa

[0276] • Grupa 3:10 u.g C-TAB.G5 kod mladih miševa

[0277] • Grupa 4: 30 ng C-TAB.G5 kod mladih miševa

[0278] • Grupa 5: 10 u.g C-TAB.G5 kod starih miševa

[0279] • Grupa 6: 30 u.g C-TAB.G5 kod starih miševa

[0280] • Grupa 7: 10 u,g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod mladih miševa

[0281] • Grupa 8: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod mladih miševa

[0282] • Grupa 9:10 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod starih miševa

[0283] • Grupa 10: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod starih miševa

[0284] • Grupa 11: PBS kod mladih miševa

[0285] • Grupa 12: PBS kod starih miševa

[0286] • Grupa 13:10 u.g C-TAB.G5 kod mladih miševa

[0287] • Grupa 14: 30 u.g C-TAB.G5 kod mladih miševa

[0288] • Grupa 15: 10 u.g C-TAB.G5 kod starih miševa

[0289] • Grupa 16: 30 u.g C-TAB 5<th>kod starih miševa

[0290] • Grupa 17: 10 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod mladih miševa

[0291] • Grupa 18: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod mladih miševa

[0292] • Grupa 19:10 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod starih miševa

[0293] • Grupa 20: 30 u.g C-TAB.G5 + 50 u.g aluma OH kod starih miševa

[0294] Tri nedelje nakon druge vakcinacije (ispitni dan 35) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=<6>) primile su letalni čelendž intraperitonelanim (IP) injektovanjem sa 25 ng toksina A ili 50 ng toksina B. Preživljavanje miševa praćeno je tokom sledećih 9 dana.

[0295] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon prve imunizacije (ispitni dan 14) i dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B zatim su određeni pomoću i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU). Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) određena su primenom Vero ćelija tretiranih sa citotoksičnom količinom rekombinantnog toksina A i toksina B.

[0296] Mlade životinje koje su primile C-TAB.G5 vakcinu pokazale su značajno više nivoe svih testiranih antitela, u odnosu na stare životinje. Naročito visoki titri antitela dobijeni su kod mladih miševa vakcinisanih sa C-TAB.G5 u prisustvu alum hidroksida (FIG. 7). Naročito značajno poboljšanje postignuto je u toksin B TNA titru. U isto vreme, nije bilo značajne razlike u sposobnosti mladih i starih miševa da izdrže toksin A i toksin B čelendže. Međutim, obe grupe su pokazale poboljšne stope zaštite kada su vakcinisane u prisustvu aluma. FIG. 7 pokazuje poređenje C-TAB.G5 imunogenosti i zaštitne efikasnosti kod mladih vs. starih miševa. FIG. 8 pokazuje kinetike razvoja anti-C-TAB antitela kod mladih i starih miševa.

[0297] Primer5:Poređenje imunogenosti i zaštitna efikasnost C-TAB.G5.1 i toksoida A i B.

[0298] Ovo ispitivanje namenjeno je da uporedi imunogenost i zaštitnu efikasnost C-TAB.G5.1, vs. toksoid A/B. Primenjeni toksoid A/B bio je mešavina jednakih delova (1:1) toksoida A (serijski #1009132) i toksoida B (serijski # 1009133). Toksoid je pripremljen fiksacijom formalina i obezbeđen od strane TechLab. Ženke C57BL/6 miševa (Charles River Labs.), stare 6-7 nedelja, korišćene su za ovaj ogled. Sve životinje su primile prvu vakcinaciju intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga vakcinacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14.180 miševa podeljeno je u grupe koje su vakcinisane kako sledi:

[0299] • Grupa 1: Samo PBS

[0300] • Grupa 2: 10 u.g C-TAB.G5.1

[0301] • Grupa 3: 30 u.g C-TAB.G5.1

[0302] • Grupa 4: 10 u.g C-TAB.G5.1 + 50 u.g aluma OH

[0303] • Grupa 5:10 u.g C-TAB.G5.1 + 50 u.g aluma OH

[0304] • Grupa 6: 30 u.g toksoida A/B

[0305] • Grupa 7:10 u.g toksoida A/B

[0306] • Grupa 8: 30 u.g toksoida A/B + 50 u.g aluma OH

[0307] • Grupa 9: 30 u.g toksoida A/B + 50 u.g aluma OH

[0308] • Grupa 10: PBS

[0309] • Grupa 11: 10 |ig C-TAB.G5.1

[0310] • Grupa 12: 30 u.g C-TAB.G5.1

[0311] • Grupa 13:10 u.g C-TAB.G5.1 + 50 u.g aluma OH

[0312] • Grupa 14: 30 u.g C-TAB.G5.1 + 50 u.g aluma OH

[0313] • Grupa 15:10 u.g toksoida A/B

[0314] • Grupa 16: 30 u.g toksoida A/B

[0315] • Grupa 17: 10 u.g toksoida A/B + 50 u.g aluma OH

[0316] • Grupa 18: 30 u.g toksoida A/B + 50 u.g aluma OH

[0317] Tri nedelje nakon druge vakcinacije (ispitni dan 35) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=6) primile su letalni čelendž intraperitonelanim (IP) injektovanjem sa 28 ng toksina A ili 50 ng toksina B. Preživljavanje miševa praćeno je tokom sledećih 9 dana.

[0318] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon prve imunizacije (ispitni dan 14) i dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B zatim su određeni pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU). Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) određena su primenom Vero ćelija tretiranih sa citotoksičnom količinom rekombinantnog toksina A i toksina B.

[0319] Ovo ispitivanje pokazuje imunogenost i zaštitnu efikasnost C-TAB.G5.1 i toksoida A/B kod miševa nakon dve vakcinacije. Životinje koje su primile C-TAB.G5.1 pokazale su niže ali značajnije anti-C-TAB titre antitela, u odnosu na životinje koje su primile toksoid A/B. Takođe, ko-dostavom aluma znatno su uvećani odgovori svih testiranih antitela. Kao rezultat, nivo anti-C-TAB i anti-toksin A antitela postignuti kod životinja imunizovanih bilo sa C-TAB.G5.1 ili sa toksoidom A/B u prisustvu aluma, bili su slični. Sniženi titar antitela primećen je samo za anti-toksin B antitelo kada su miševi imunizovani sa C-TAB.G5.1, u odnosu na miševe imunizovan sa toksoidom A/B. Treba napomenuti, za razliku od antitela gerenerisanih protiv C-TAB.G5.1 prepoznavajućih epitopa u C-terminalnom delu molekula toksina, antitela indukovana sa toksoidnom imunizacijom bila su specifična prema N-terminalnom delu molekula toksina, što je očitano u anti-toksin ELISA. Prema tome, anti-toksin A i anti-toksin B antitela gerenerisana kod miševa imunizovanih sa C-TAB.G5.1 i toksoidom A/Bm bila su antitela različite specifičnosti i, prema tome, ne mogu se direktno upoređivati. Međutim, podaci ukazuju da je odgovor antitela na C-TAB. G5.1 imunizaciju značajno viši, kao u slučaju imunizacije sa toksoidima. Dodatno, ispitivanje toksin čelendža pokazalo je da je sposobnost C-TAB.G5.1 imunizacije da zaštiti miševe od letalnog čelendža uporedivo za

[0320] efikasnosti zaštite od toksoida A i B. FIG. 9 pokazuje poređenje imunogenosti C-TAB.G5.1 i toksoida A/B.

[0321] FIG. 10 pokazuje toksin neutralizaciju i podatke zaštite za miševe imunizovane sa C-TAB.G5.1 u poređenju sa onim imunizovanim sa toksoidom A/B.

[0322] Primer 5.1: Poređenje titara antitela i zaštitne efikasnosti C-TAB.G5.1 u različitim režimina imunizacije.

[0323] Ovo ispitivanje namenjeno je da uporedi imunogenost i zaštitnu efikasnost C-TAB.G5.1 kod miševa koji su primali tri doze vakcine u različitim režimima imunizacije. Ženke C57BL/6 miševa (Charles River Labs.), stare 6-7 nedelja, korišćene su za ovaj ogled. 135 miševa podeljeno je u 14 grupa. Sve životinje u grupi br. 2-13 primile su tri vakcine intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine ili levi mišić butine u danima naznačenim u nastavku. Miševi u grupama 1 i 8 nisu primili vakcinaciju; oni su služili kao negativna kontrola. Imunizacija je izvedena kako sledi:

[0324] [0206]Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja na ispitni dan 0, 3,7,14, 21, 28, 35 i 42. Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B određeni su pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU). Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) određena su na ispitni dan 42 primenom Vero ćelija tretiranih sa citotoksičnom količinom rekombinantnog toksina A i toksina B.

[0325] Tri nedelje nakon poslednje vakcinacije (ispitni dan 49) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=8) primile su letalni čelendž intraperitonelanim (IP) injektovanjem sa 28 ng toksina A ili 50 ng toksina B. Preživljavanje miševa praćeno je tokom sledećih 9 dana.

[0326] Ovo ispitivanje pokazuje da su svi titri antitela izmereni dve nedelje nakon treće vakcinacije ili na ispitni dan 35 i 42 uporedivi u svim režimima imunizacije, iako režimi imunizacije za 0/14/28 pokazuju najbolje odgovore antitela. Ukoliko se uporede titri antitela izmereni dve nedelje nakon druge vakcinacije, onda su su režimi imunizacije za 0/14/28 bolji od režima imunizacije za 0/7/21, i mnogo bolji od režima imunizacije za 0/3/14. Ovo ispitivanje potvrdilo je da su anti-toksin A/B titri antitela značajno pojačani kada je antigen zajedno injektovan sa aluminijum hidroksidom (podaci nisu pokazani). Ovo ispitivanje takođe pokazuje čak i dve doze vakcine sa alumom date u dvonedeljnom intervalu mogu da izmame visok nivo antitela, u poređenju sa nivoom dobijenim nakon tri doze vakcinacija.

[0327] Nivo toksin A/B neutralizujućih antitela je znatno viši režimu imunizacije za 0/7/21 i 0/14/28 u odnosu na režim imunizacije za 0/3/14.

[0328] Kompletna zaštita protiv čelendža sa toksinom A ne zahteva alum u režimu imunizacije za 0/7/21 i 0/14/28, ali ni za 0/3/14. Režim imunizacije za 0/14/28/ sa alumom indukovao je najviši nivo zaštite (87.5%) protiv toksin B čelendža, dok režim imunizacije za 0/7/21 obezbeđuje 37.5 % zaštite, a 0/3/14 pokazuje 28.6 % zaštite. Rezultati ovog ispitivanja prikazani su na FIG. 20.

[0329] Primer 6: Procena imunogenosti i zaštitne efikasnosti rekombinantnog C-TAB.G5.1 fuzionog proteina

[0330] kod hrčaka.

[0331] Ovo ispitivanje je namenjeno za dalju procenu imunogenosti rekombinantnog fuzioni proteina C-TAB.G5.1 datog sa ili bez adjuvansa u različitom životinjskom modelu.

[0332] Ženke hrčaka (Harlan), stare preko 7 nedelja i težine između 80 i 90 g korišćene su za ovaj ogled. Sve životinje su primile prvu vakcinaciju bolus (50 p.1) intramuskularnim (IM) injektovanjem u desni mišić butine na dan 0. Druge vakcinacija je IM injektovana u levi mišić butine na dan 14, a treća vakcinacija je IM injektovana na dan 28. Hrčci su podeljeni u grupe (N=6) i vakcinisani kako sledi:

[0333] • Grupa 1: Samo formulacija pufera

[0334] • Grupa 2:10 u.g C-TAB.G5.1

[0335] • Grupa 3:10 ng C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0336] • Grupa4:30u.gC-TAB.G5.1

[0337] • Grupa 5: 30 ng C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0338] • Grupa 6: 100 u.g C-TAB.G5.1

[0339] • Grupa 7:100 u.g C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0340] • Grupa 10: Samo formulacija pufera

[0341] • Grupa 11. 10 u.g C-TAB.G5.1

[0342] • Grupa 12. 10 u.g C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0343] • Grupa 13. 30 u.g C-TAB.G5.1

[0344] • Grupa 14. 30 u.g C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0345] • Grupa 15 100 ug C-TAB.G5.1

[0346] • Grupa 16.100 u.g C-TAB.G5.1 + 100 u.g aluma OH

[0347] Dve nedelje nakon treće vakcinacije (ispitni dan 42) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=6) primile su letalni čelendž intraperitonelanim (IP) injektovanjem sa 75 ng toksina A ili 125 ng toksina B. Dodatnih 12 hračaka iskorišćeno je za doznu titraciju toksin A ili toksin B čelendža na dan 44. Preživljavanje hrčaka praćeno je tokom sledećih 8 dana.

[0348] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon prve imunizacije (ispitni dan 14), nakon druge imunizacija (ispitni dan 28) i treće imunizacija (ispitni dan 35). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B zatim su određeni pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU). Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) određena su primenom Vero ćelija tretiranih sa citotoksičnom količinom rekombinantnog toksina A i toksina B.

[0349] Ovaj ogled pokazuje da su hrčci, slično kao i miševi, bili sposobni da odgovore na C-TAB.G5.1 vakcinaciju. Životinje koje su primile C-TAB.G5.1 pokazale su dozno zavisno povećanje u svim testiranim titrima antitela, dok je alumni adjuvans značajno poboljšao titre antitela u svim dozama C-TAB.G5. Najviši titri primećeni su dve nedelje nakon druge injekcije (ispitni dan 28). FIG. 11 (A-C) pokazuje titre antitela za svaku grupu imunizovanih hrčaka. FIG. 12 pokazuje kinetike razvoja anti-C-TAB antitela kod hrčaka imunizovanih sa C-TAB. G5 u prisustvu ili odsustvu alum hidroksida.

[0350] [0216]Rezultati TNA ogleda prikazani su na FIG. 13. Ovi rezultati slični su onim dobijenim za miševe i pokazuju da su antitla generisana C-TAB.G5.1 fuzionog proteina kod hrčaka efektivna u neutralizujućim toksičnim efektimaC. difficiletoksina A i toksina B.

[0351] FIG. 13 takođe pokazuje podatke zaštite za hrčke imunizovane sa C-TAB.G5.1 nakon letalnog toksin čelendža. Visoka zaštita postignuta je čak i vakcinacijom sa C-TAB. G5.1 u odsustvu adjuvansa. Nivo zaštite je poboljšan do 100 % dodavanjem alumaa u vakcinu.

[0352] Primer 7: Zaštitna efikasnost C-TAB.G5.1 fuzionog proteina protivC. difficilespora čelendža kod

[0353] hrčaka tretiranih klindamicinom.

[0354] Sledeće antibiotsko tretiranjeC. difficilemože da kolonizuje stomak i, ukoliko je toksigeno, može da izazove dijareju povezanu sa antibiotikom.C. difficilepovezane bolesti (CDAD) ljudi umodelovano je kod hrčaka primenom klindamicina kako bi životinje postale pogodne za kolonizaciju, dijareju i smrt, obično unutar nekoliko dana nakon zasejavanja toksigenog soja. Kako bi se odredila efikasnost C-TAB.G5.1 vakcine, vakcinisani i ne-vakcinisani hrčci čelendžovani su sa klindamicinom iC. difficilesoja 630.100 u.g C-TAB.G5.1 umešano je sa 125 u.g alum-hidroksid adjuvansa. Ženke odraslih hrčaka težine<~>100 g primile su 3 vakcine intramuskularnim (IM) injektovanjem na dan 0,14 i 28. Placebo je bio PBS.

[0355] 48 hrčaka podeljeno je u grupe od 8 i vakcinisani su kako sledi:

[0356] Grupa 1: Samo PBS + 10<2>spora čelendž

[0357] Grupa 2: C-TAB.G5.1 + 10<2>spora čelendž

[0358] Grupa 3: Samo PBS + 10<3>spora čelendž

[0359] Grupa 4: C-TAB.G5.1 + 10<2>spora čelendž

[0360] Grupa 5: Samo PBS + IO<4>spora čelendž

[0361] Grupa 6: C-TAB.G5.1 + IO<4>spora čelendž

[0362] Na dan 42 sve životinje u svim grupama primile su oralnu dozu 10 mg klindamicin fosfata/ kg telesne težine. Na dan 43 sve životinje u svim grupama dozirane su oralnom sondom sa ispranim sporamaC. difficilesoja 630. Tri nivoa spora čelendža je primenjeno (<~>10<2>, IO<3>i IO<4>). Opservacija, ali ne i tretiranje, nastavljeno je do dana 54. Na kraju isptivanja, sve preživele životinje nisu razvile obolenje tokom > 5 dana.

[0363] Uzorci krvi su izvučeni kako bi se dobio serum serološka ispitivanja na dan 0,14, 28, 42 i dan 54 (kraj isptivanja). Izmet je sakupljan na dan 1 i 42, direktno iz anusa hrčaka, ili ukoliko je bilo potrebno, između smeštaja.

[0364] [0221]Rezultati su prikazani na FIG. 14 pokazujući krive preživljavanja nakon spora čelendža kod hrčaka. Podaci preživljavanja prikazani su kao Kaplan-Meier krive koje odgovaraju preživljavanju, a statistička analiza urađena je koristeći analizu log rangiranja. Pri svim dozama spora, primećeno je 100 % preživljavanje hrčaka u vakcinisanoj grupi, a preživljavanje je značajno ojačano kada se uporedi sa placebo grupom.: p=0.02<45>pri IO<2>sporama, p=0.0006 pri IO<3>sporama, p<0.0001 pri IO<4>sporama.

[0365] Primer 8: Imunogenost i efikasnost zaštite C-TAB.G5.1 kod majmuna.

[0366] Ovo ispitivanje namenjeno je da proceni imunogenost i zaštitu C-TAB.G5.1 kod makaki majmuna. Šest ženki makaki majmuna, starih između 4 i 6 godina i težine između 2 i 4 kg, upotrebljene su za ovo ispitivanje. Dve grupe od tri majmuna podeljene su u prvu grupu (Grupa 1) koja je primala 200 u.g C-TAB.G5.1 i drugu (Grupa 2) koja je primala 200 u.g C-TAB.G5.1 i 250 u.g aluma. Kao alum adjuvans, korišćen je Rehvdragel (Reheis, serijski #534401, razblažen u PBS do 2 mg/ml). Pre sakupljanja krvi ili imunizacije, životinje su obrijane (ukoliko je bilo potrebno).

[0367] l<va>(ispi<t>ni dan 0) i 3<ća>(ispi<t>ni dan 28) imunizacija injektovane su u levu ruku (deltoid), 2<ga>imunizacija (ispitni dan 14) injektovana je u desnu ruku (deltoid). Grupa 1 primila je 200 u.g samog C-TAB.G5.1 u 0.5ml lxPBS IM injektovanjem, a Grupa 2 je primila 200 u.g C-TAB.G5.1 sa 250 u.g aluma u 0.5ml lxPBS IM injektovanjem.

[0368] U utvrđenim vremenskim tačkama (ispitni dani 0,14, 28 i 42), 2-3 mL cele krvi obezbeđeno je standardnim postupcima u epruvete za odvajanje seruma. Uzorci seruma zamrznuti su na približno -20°C. ELISA postupak je zatim primenjen kako bi se odredili anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B IgG titri. Titri antitela predstavljeni su u ELISA jedinicama (EU).

[0369] FIG. 15 pokazuje da povišene doze C-TAB. G5.1 vode ka povišenoj proizvodnji antitela koja prepoznaju sva tri proteina, dok prisustvo aluma značajno poboljšava nivoe antitela. Najviši titri antitela primećeni su sa dve vakcinacije na dan 42. Ovi podaci jasno ukazuju izvodljivost upotrebe rekombinantnih C-TAB.G5 ili C-TAB.G5.1 fuzionih proteina za vakcinaciju subjekata kada je to potrebno.

[0370] Primer 9: Poređenje imunogenosti C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1.

[0371] Ovo ispitivanje namenjeno je da uporedi imunogenost C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 kao i efekat dva različita pufera u kojima se dostavlja C-TAB. C57BL/6 ženke miševa (Charles River Labs.), stare između 8 i 9 nedelja, korišćene su za imunizaciju. Sve životinje su primile prve imunizacije intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga imunizacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14. Ukupno 72 miša podeljeno je u 12 grupa vakcinisane kako sledi:

[0372] Grupa 1:1 u.g C-TAB.G5 u PBS

[0373] Grupa 2: 3 u.g C-TAB.G5 u PBS

[0374] Grupa 3:10 u.g C-TAB.G5 u PBS

[0375] Grupa 4: 30 u.g C-TAB.G5 u PBS

[0376] Grupa 5:1 u.g C-TAB.G5 u histidinskom puferu

[0377] Grupa 6: 3 u.g C-TAB.G5 u histidinskom puferu

[0378] Grupa 7:10 u.g C-TAB.G5 u histidinskom puferu

[0379] Grupa 8: 30 u.g C-TAB.G5 u histidinskom puferu

[0380] Grupa 9:1 u.g C-TAB.G5.1 u histidinskom puferu

[0381] Grupa 10: 3 u.g C-TAB.G5.1 u histidinskom puferu

[0382] Grupa 11: 10 u.g C-TAB.G5.1 u histidinskom puferu

[0383] Grupa 12: 30 u.g C-TAB.G5.1 u histidinskom puferu

[0384] Uzorci krvi sakupljeni su od svih životinja dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B određeni su pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice.

[0385] FIG. 16 pokazuje da se svi titri antitela (anti-C-TAB, anti-toksin A i anti-toksin B) nisu značajno razlikovali (što je pokazano T-test analizom) u 1-30 u.g doznom opsegu za tri formulacije vakcine. Nešto viša proizvodnja antitela postignuta je sa C-TAB.G5 formulacijom u histidinskom puferu, u odnosu na PBS. Nije primećena značajna razlika između imunizacije sa C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 histidinskim formulacijama. Prema tome, ovo ispitivanje pokazalo je jednaku imunogenost C-TAB.G5 i C-TAB.G5.1 konstrukata.

[0386] Primer 10: Priprema i procena alternativnih C-TABNCTB i C-TADCTB fuzionih proteina.

[0387] Ovaj Primer opisuje pripremanje dva druga fuziona proteina koji obuhvataju jedan deo C-terminalnog domena CTA i dva dela C-terminalnog domena CTB izvedenih izC. difficilesoja VPI-10463. C-TABNCTB fuzioni protein (SEQ ID NO: 18) obuhvata, kao i C-TAB.G5,19 ponavljajuće jedinice CTA (amino kiseline 2272-2710), 23 ponavljajuće jedinice CTB (amino kiseline 1850-2366), plus dodatnih 10 ponavljanja CTB (amino kiseline 1834-2057) fuzionisane sa C-terminusom CTB. C-TADCTB fuzioni protein (SEQID NO: 20) obuhvata C-TAB.G5 sekvencu (19 ponavljanja CTA i 23 ponavljanja CTB) plus dodatne 24 ponavljajuće jedinice CTB (amino kiseline 1834-2366) fuzionisane sa C-terminusom C-TAB.G5. Prema tome, C-TADCTB obuhvata dvostruki deo ponavljajućih jedinica CTB. Kloniranje C-TABNCTB i C-TADCTB genskih konstrukata izvedeno je na sličan način kao onaj opisan u Primeru 1. 1 Rekombinantni fuzioni proteini eksprimirani suu E. coli ćelijamai prečišćeni primenom standardnih procedura kako je opisano u Primeru 1.2. Izolovani polipeptidi procenjeni su ispitivanjima imunogenosti i zaštite kod životinja.

[0388] Primer 10.1: Poređenje imunogenosti i zaštitne efikasnosti C-TAB.G5, C-TABNCTB i C-TADCTB kod

[0389] miševa.

[0390] Ovo ispitivanje namenjeno je da uporedi imunogenost i zaštitnu efikasnost C-TAB.G5, C-TABNCTB i C-TADCTB kod miševa vakcinisanih sa pet antigen doza tokom dva log opsega. Ženke C57BL/6 miševa (Charles River Labs.), stare 6-7 nedelja, korišćene su za ovaj ogled. Sve životinje su primile dve vakcinacije: prvu intramuskularnim (IM) injektovanjem (50 u.1) u desni mišić butine na dan 0. Druga vakcinacija izvedena je IM injektovanjem u levi mišić butine na dan 14. Sve imunizacije izvedene su bez aluma. Uzorci krvi sakupljeni su dve nedelje nakon druge imunizacija (ispitni dan 28). Serum je odložen na -20°C do analiziranja. Titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B određeni su pomoću ELISA i prijavljeni kao ELISA jedinice (EU) prikazane na FIG. 17.

[0391] Ovaj ogled pokazuje da su alternativni fuzioni proteini C-TADCTB i C-TABNCTB, kao i C-TAB. G5, visoko imunogeni i sposobni da indukuju jak odgovor antitela protiv oba toksina A i toksina B čak i bez dodavanja adjuvansa.

[0392] Pored ocenjivanja odgovora antitela, određena je i sposobnost C- TADCTB i C-TABNCTB imunizacije da zaštiti miševe od letalnog čelendža nativnog toksina B. Tri nedelje nakon druge vakcinacije (ispitni dan 35) životinje u vakcinisanim i ne-vakcinisanim grupama (N=6) primile su intraperitonealnu (IP) letalnu dozu 50 ng toksina B. Preživljavanje miševa praćeno je tokom sledećih 9 dana , a rezultati su prikazani na FIG. 18. Ovaj eksperiment pokazao je da je imunizacija miševa sa 33 u.g C-TADCTB bez aluma bila sposobna da obezbedi 100 % zaštite protiv letalnog čelendža sa nativnim toksinom B, dok je ista doza C-TAB.G5 i C-TABNCTB indukovala samo delimičnu zaštitu. Ovi podaci ukazuju da, slično C-TAB.G5, i dva druga fuziona proteina C-TADCTB i C-TABNCTB mogu biti zaštitni protiv letalnog čelendža sa nativnim toksinom.

[0393] Primer 10.2: Poređenje imunogenosti i zaštitne efikasnosti C-TAB.G5.1 i C-TADCTB kod hrčaka.

[0394] Ovo ispitivanje namenjeno je za dalju procenu imunogenosti alternativnog fuzionog proteina C-TADCTB datog sa ili bez alumnog adjuvans u različitom životinjskom modelu.

[0395] [0234]Ispitivanje je konstruisano kako je opisano u Primeru 6: ženke hrčaka vakcinisane su tri puta IM injektovanjem (ispitni dan 0,14 i 28) u prisustvu ili bez 100 u.g alum hidroksida. Dve nedelje nakon treće vakcinacije (ispitni dan 42) sve životinje su primile letalni čelendž intraperitonelanim (IP) injektovanjem sa 75 ng toksina A ili 125 ng toksina B. Uzorci krvi sakupljeni su na ispitni dan 14, 28 i 35, a titri antitela u serumu za C-TAB, toksin A i toksin B određeni su pomoću ELISA. Toksin A i toksin B neutralizujuća antitela (TNA) izmerena su u serumu na dan 35. Preživljavanje hrčaka praćeno je i prijavljeno kao % zaštite.

[0396] Ovaj ogled pokazuje da fuzioni protein C-TADCTB može da indukuje odgovor anti-toksin antitela kod hrčaka, slično kao kod miševa. Alum adjuvans značajno je poboljšao titre svih testiranih antitela. Rezultati TNA ogleda prikazani na FIG. 19 ukazuju da su antitela gerenerisana protiv C-TADCTB efektivna u neutralizujućim toksičnim efektima C.difficiletoksina A i toksina B. FIG. 19 takođe pokazuje podatke poređenja zaštite za hrčke imunizovane bilo sa C-TAB.G5.1 ili sa C-TADCTB. Visoka zaštita postignuta je vakcinacijom sa oba rekombinantna fuziona proteina.

[0397] Primer 11: Faza 1 otvoreno obeleženog ispitivanja u procenjivanju bezbednosti, imunogenosti i

[0398] doznog odgovora farmaceutske kompozicija koja obuhvata C-TAB. G5.1

[0399] Farmaceutska kompozicija koja obuhvata C-TAB.G5.1, rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od skraćenogClostridium difficile ( C. difficile)Toksina A i Toksina B, data je u tri različite doze: 20 u.g sa Al(OH)<3>(alum), 75 i 200 u.g bez ili sa Al(OH)<3>, respektivno, intramuskularnim (IM) injektovanjem, tri vakcine na dan 0, 7 i 21.

[0400] CIUEVI ISPITIVANJA

[0401] Primarni:

[0402]

[0403] ■ Radi ispitivanja bezbednosti i tolerisanja farmaceutske kompozicije koja obuhvata C-TAB. G5.1 čak do 6 meseci nakon treće vakcinacija.

[0404] Sekundarni:

[0405] ■ Radi ispitivanja imunog odgovora izmerenog protiv vakcine antigen C-TAB.G5.1 i nativnih Toksina A i BC. difficileza tri različite doze i dve formulacije na dan 0, 7,14, 21, 28,113, 201 nakon prve vakcinacije kako bi se obezbedila prva indikacija optimalne doze i formulacije. ■ Radi ispitivanja kapaciteta C-TAB.G5.1 vakcinom-indukovanih IgG antitela radi neutralizacijeC. difficileToksina A i B in vitro.

[0406] DIZAJN ISPITIVANJA

[0407] Ovo je faza 1 otvoreno obeleženog, delimično nasumičnog, dozno povećavajućeg ispitivanja koje se satoji od dela A kod zdravih pojedinaca starosti između >18 i <65 godina i dela B kod zdravih starijih pojedinaca >65 godina, pri čemu je poslednja grupa najranjivija populacija koja može da oboli od C.difficileinfekcija. Deo A je sproveden sa vakcinacionim rasporedom na Dan 0, 7 i 21 u pet tretiranih grupa od po 12 zdravih odraslih subjekata radi ispitivanja bezbednosti i doznog odgovora na 20 u.g C-TAB.G5.1 vakcine sa adjuvansom, i na 75 u.g i 200 p.g C-TAB.G5.1 vakcine sa ili bez adjuvansa, respektivno. Bezbednost i imunogenost biće analizirani pošto su svi odrasli subjekti dela A primili treću vakcinaciju, pri čemu će svi podaci bezbednosti biti ocenjeni od strane nadzornog odbora za praćenje bezbednosti (DSMB) pre upisivanja subjekata iz dela B. U slučaju da su nebezbedne ili bezuspešno tretirane grupe (tj., doze koje ne indukuju značajne IgG odgovore) identifikovane tokom međuanalize, ove tretirane grupe će biti odbačene i neće se sprovoditi u nastavku dela B.

[0408] Deo B ispitivanja teži da potvrdi doze kod starije popilacije. Shodno tome, Deo B će se sprovesti u 5 tretirajućih grupa od po 20 starijih zdravih subjekata po grupi. Biće primenjivan raspored vakcinacije na Dan 0, 7 i 21. Ovaj dizajn ispitivanja omogućava upoređivanje doznih odgovora i kod odraslih i kod starijih pojedinaca. Poslednja starosna grupa je glavni cilj populacije zaC. difficilevakcinu, jer predstavljaju najranjiviju polulaciju za dve ciljane indikacije u razvojnom putuC. difficile vakcine,tj. pristupu preventivne vakcinacije radi prevenciji rekurentneC. difficiledijareje i prevenciji primarne C.difficileinfekcije, baziranom na osnovu starosti i rizikom povezanim sa starosti. Međutim, stariji subjekti mogu imati manje odgovore na vakcinaciju u odnosu na mlađe odrasle subjekte; prema tome, potrebna je dozna potvrda u ciljanoj starijoj popilaciji doze iz rane faze razvoja. Međuanaliza pošto su svi odrasli iz deka A vakcinisani omogućiće odbacivanje ne-bezbedne ili doze/formulacije koja ne indukuje značajne IgG odgovore kod odraslih, kako bi se ublažio rizik izlaganja subjekata u starijoj grupi potencijalno nebezbednoj ili bezuspešnoj dozi (npr. Najnižoj dozi) i/ili formulacije (npr. formulacije bez adjuvansa) vakcine.

[0409] C-TAB.G5.1 vakcina je vodeni rastvor C-TAB.G5.1 u 20 mM L-Histidinu, 75mM NaCI, 5% Saharoza, 0.025% Tween<*>80; pH6.5 proizvedena standardim postupcima.

[0410]

Claims

1. Kompozicija imunogena ili vakcine koja obuhvata izolovani polipeptid koji ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline kakva je navedena u SEQ ID NO: 4, i neki farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, u kojoj pomenuti polipeptid obezbeđuje 100% preživljavanja hrčaka vakcinisanih pomenutim polipeptidom nakon intragastričnog davanja doze od IO<2>, IO<3>ili IO<4>sporaClostridium difficile.

3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, u kojoj polipeptid obuhvata 19 ponavljajućih jedinica izvedenih iz C-terminalnog domena toksinaA Clostridium difficile.

4. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojoj polipeptid obuhvata 23 ponavljajuće jedinice izvedene iz C-terminalnog domena toksina BClostridium difficile.

5. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, u kojoj polipeptid ima najmanje 90%, poželjnije 95%, najpoželjnije 99% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline kakva je navedena u SEQ ID NO: 4.

6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, u kojoj polipeptid ima sekvencu kakva je navedena u SEQID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4.

7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, koja dalje obuhvata adjuvans.

8. Kompozicija prema zahtevu 7, u kojoj adjuvans obuhvata alum.

9. Izolovani polipeptid koji ima najmanje 85% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline kakva je navedena u SEQ ID NO: 4, ili kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 8, za upotrebu u prevenciji ili tretiranju saC. difficilepovezanom bolešću (CDAD).

10. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, za upotrebu u prevenciji CDAD kod subjekta koji je u riziku od CDAD.

11. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, gde je pomenuti subjekat u riziku od CDAD: i) stariji subjekat; ii) subjekat sa SIDA; iii) subjekat koji uzima ili planira da uzima imunosupresione lekove; iv) subjekat sa planiranom hospitalizacijom ili subjekat koji je hospitalizovan; v) subjekat koji je ili se očekuje da će biti u jedinici intenzivne nege; vi) subjekat koji je podvrgnut ili planira da se podvrgne gastrointestinalnoj operaciji; vii) subjekat koji je ili planira da bude pod dugoročnom negom kao stoje starački dom; viii) subjekat sa komorbiditetima koji zahtevaju čestu i/ili produženu upotrebu antibiotika; ix) subjekat sa rekurentnom CDAD; x) subjekat ispod 18 godina starosti; xi) subjekat od 18 do 65 godina starosti; ili xii) subjekat iznad 65 godina starosti.

12. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, gde pomenuti subjekat u riziku od CDAD ima iznad 65 godina.

13. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, gde tretman CDAD uključuje redukovanje ozbiljnosti i/ili trajanja bolesti, ublažavanje simptoma bolesti, ili njihove kombinacije.

14. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 13, koja dalje obuhvata dodatni antigen.

15. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 14, koja dalje obuhvata terapeutski agens odabran iz grupe koju čine anestetici, analgetici, anti-zapaljenska sredstva, steroidi, antibiotici, antiartritici, anorektici, antihistamini i antineoplastici.