CN103974718A - 基于艰难梭菌毒素的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及艰难梭菌TcdA和TcdB的重组片段，其可以用于开发针对艰难梭菌相关的疾病的疫苗。更具体地，本发明涉及包含ToxB-GT抗原和TcdA抗原或ToxA-GT抗原和TcdB抗原的组合。
Description
技术领域
本发明属于针对艰难梭菌(Clostridium difficile)的基于毒素的疫苗领域。
背景技术
艰难梭菌(C.difficile)是可以无症状地存在于人类肠道中的、革兰氏阴性的、形成孢子的厌氧性细菌。除去其它肠菌群(例如通过抗生素和化学疗法治疗)所建立的生态小境允许艰难梭菌孢子在结肠中萌发，从而导致严重的肠疾病[1]。因此，抗生素治疗可以将该通常无害的微生物转化成一系列肠疾病的致病因子，这是在住院患者中特别流行的结果。
艰难梭菌是医院肠感染的主要病原体[2,3]，并且造成大约20％的抗生素相关的腹泻病例、多达75％的抗生素相关的结肠炎病例和几乎所有的假膜性结肠炎病例[4]。宿主因素(诸如增加的年龄、预先存在的严重疾病和减弱的免疫防御)使个体倾向于有症状的感染[1]。这样的艰难梭菌相关的疾病(CDAD)经常发生在重症监护病房中，特别是影响超过60岁的患者。
CDAD的治疗通常包括起因抗生素的停止、口服甲硝唑或万古霉素疗法和流体替换的起始。但是，抗生素抗性的肠道病原体的出现已经导致关于抗生素用于治疗CDAD的用途的担忧。此外，多达20％的患者在完成抗生素疗程的1-2周内复发，并且复发的风险随着每次额外复发而显著增加[5,6]。还报道了超过50％的复发事件是由于不同艰难梭菌菌株的再感染，而不是原发性感染的复发[7]。预防措施是基于患者分离、手卫生和接触预防的实现，这已经获得可变的且经常有限的成功。
目前没有针对CDAD的有效疫苗。本发明的一个目的是，提供可有效地引起针对艰难梭菌的免疫应答的组合物，其用于开发用于预防和/或治疗艰难梭菌相关疾病的疫苗。
发明内容
因而，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含：
a)ToxB-GT抗原和TcdA抗原；或者
b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原。
因而，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含a)ToxB-GT抗原和TcdA抗原；或b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原。优选地，所述ToxB-GT抗原和/或所述ToxA-GT抗原是脱毒的。
在一个实施方案中，所述ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的表位；所述ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:56具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:56的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:56具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:56的表位；所述TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:1具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:1的表位；且所述TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:2具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:2的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:2具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:2的表位。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和1种、 2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种TcdA抗原，所述TcdA抗原任选地选自：(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ ID NO:1)。所述免疫原性组合物任选地进一步包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种另外的TcdB抗原，所述另外的TcdB抗原任选地选自：(1)ToxB-ED抗原(SEQ ID NO:17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO:18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQ ID NO:19)(4)ToxB-T抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B抗原(SEQ ID NO:21)、(6)ToxB-B2抗原(SEQ ID NO:22)(7)ToxB-B7(SEQ ID NO:23)或(8)全长TcdB抗原(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含ToxA-GT抗原和1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或更多种TcdB抗原，所述TcdB抗原任选地选自：(1)ToxB-ED抗原(SEQ ID NO:17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO:18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQ ID NO:19)(4)ToxB-T抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B抗原(SEQ ID NO:21)、(6)ToxB-B2抗原(SEQ ID NO:22)(7)ToxB-B7(SEQ ID NO:23)或(8)全长TcdB抗原(SEQ ID NO:2)。所述免疫原性组合物任选地进一步包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种另外的TcdA抗原，所述另外的TcdA抗原任选地选自：(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10) 、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含：i)ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原；和ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含：i)ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原；和ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、TcdA抗原和另一种TcdB抗原，任选地其中所述组合物包含：(a)ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB-B，或(b)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5-6。在一个实施方案中，所述组合物包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原、另一种TcdA抗原和另一种TcdB抗原，任选地其中所述组合包含ToxB-GT+ToxA-GT+ToxA-B2+ToxB-B。
在一个实施方案中，所述组合物中的至少2种抗原是呈杂合多肽的形式。在另一个实施方案中，所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。
在某些实施方案中，所述免疫原性组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的中和滴度。
在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包含至少一种其它艰难梭菌抗原，任选地其中所述其它艰难梭菌抗原是糖抗原。
在某些实施方案中，所述免疫原性组合物是疫苗组合物。在某些实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中，所述疫苗组合物是用作药物。在某些实施方案中，所述疫苗组合物是用于在哺乳动 物(优选人)中引起免疫应答。在某些实施方案中，所述疫苗组合物是用于治疗或预防艰难梭菌相关的疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述哺乳动物施用有效量的本文描述的免疫原性组合物或疫苗。
艰难梭菌的所有致病菌株表达一个或两个大外毒素(TcdA和TcdB，在本文中也被称作ToxA和ToxB、和毒素A和毒素B)。TcdA和TcdB属于大梭菌细胞毒素(LCD)家族且表现出49％氨基酸同一性。它们是组织成多结构域结构的单个多肽链高分子量外毒素(分别是308和270kDa)[8,9]。编码TcdA和TcdB的基因tcdA和tcdB位于19.6kb艰难梭菌致病性基因座中[10]。象LCD家族的其它成员一样，TcdA和TcdB组织成模块结构域，其中每个结构域执行不同的功能[11]。TcdA和TcdB的结构域结构显示在图1中。
TcdA/B的作用机理的概述提供在参考文献11中。简而言之，TcdA/B的C-端(在图1中用“B”表示)负责毒素与上皮细胞表面的结合。两种毒素的C-端区域由被称作梭菌重复寡肽或细胞壁结合结构域(由于它们与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)LytA的重复序列的同源性)的残基重复序列组成，且负责细胞表面识别和胞吞作用[12]。近年来，已经分辨了TcdA的C-端片段的晶体结构，从而揭示螺线管样结构，其由32个具有15-21个残基的短重复序列和7个具有30个残基的长重复序列组成(参考文献13)。TcdA和TcdB的C-端重复区域是类似的，且可以常规地鉴别。
TcdA/B与上皮细胞的结合会诱导受体介导的胞吞作用，从而促进向细胞质中的进入。内化以后，毒素需要酸性核内体才能运输至胞质溶胶。认为胞内体pH的下降会诱导构象变化，后者导致疏水易位结构域(在图1中用“T”表示)的暴露和酶促N-端(其包含糖基转移酶结构域和半胱氨酸蛋白酶结构域，在图1中分别用“GT”和“CP”表示)的插入，从而允许经由孔形成进入核内体[13]。近年来，参考文献14和15证实，来自宿主细胞的六磷酸肌醇会诱导半胱氨酸蛋白酶(“CP”)位点的N-端区域的自动催化裂解，从而将N-端葡萄糖基转移酶(“GT”)结构域释放进胞质溶胶中(认为毒素的剩 余部分残留在核内体中)。裂解后，认为GT结构域能够将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移至Rho-GTP酶，从而灭活细胞信号传递[16]。Rho-GTP酶的抑制会造成一系列级联效应，包括肌动蛋白细胞骨架和紧密连接部完整性的调节异常，它们共同地导致增加的膜渗透性和屏障功能的损失[17]、腹泻、炎症、以及嗜中性粒细胞和先天性免疫应答的其它成员的流入[18]。
因此，TcdA和TcdB外毒素是主要负责由艰难梭菌造成的临床征状的蛋白[19,20,21]，且已经成为开发用于治疗和预防CDAD的疫苗的尝试的焦点。参考文献19发现，如果在攻击前施用，针对重组TcdA的抗体足以预防腹泻。针对TcdB的免疫应答也可以在疾病表达和/或免疫中起作用，如与TcdA阴性的、TcdB阳性的艰难梭菌菌株有关的腹泻和假膜性结肠炎的众多报道所证实的[22,23,24,25]。
使用甲醛灭活的TcdA和TcdB的混合物的临床前研究已经提示，TcdA和TcdB可能涉入艰难梭菌相关的腹泻的发病机制和产生保护性免疫[26]。可以从细胞培养物中纯化TcdA和TcdB，但是灭活过程代表基于类毒素的疫苗的制备中的一个重大限制。毒素灭活通常通过甲醛处理来实现，所述甲醛处理会交联毒素多肽中的氨基酸。甲醛灭活的问题是，毒素可能发生未知的化学修饰和/或部分灭活。实际上，已经证实福尔马林灭活的分子具有受损的结合能力和降低的免疫原性[27]。关于从细胞培养物纯化的艰难梭菌毒素所衍生出的类毒素在疫苗中的应用，还存在许多安全性问题。
如在参考文献28中讨论的，认为TcdA主要负责CDAD的临床征状。使用纯化的类毒素的实验已经指示，单独的TcdA能够引起CDAD的征状，但是TcdB不能用于该目的，除非将它与TcdA混合或者存在对肠粘膜层的先前损伤[29]。得自动物模型的临床证据指示，TcdA的结合结构域可以引起血清抗体，所述血清抗体会中和TcdA的细胞毒性和致死效应(30,31,32,33)。并且，已经证实含有这些重复单元的重组无毒肽会引起中和抗体，所述中和抗体可以保护实验动物免于TcdA和艰难梭菌的攻击(34,35,36,33)。但是，令人感兴趣的是，一项新近的研究表明，毒素B是艰难梭菌毒力所必需的，并且产生单独TcdA的菌株是无毒性的(29,37)，所以艰难梭菌毒力的当前模型仍然未解决。因而，当前不清楚TcdA和TcdB的哪种组 分可以用于诱导免疫应答以治疗或预防CDAD。但是，当前的一致意见是，针对CDAD的有效免疫可能需要包含TcdA和TcdB的结合结构域的肽(38,39)，并且针对所述结合结构域的抗体会赋予对抗毒素病理学的保护。
参考文献40公开了嵌合蛋白，其保留了存在于野生型毒素中的所有功能结构域(即GT、CP、T和B结构域)，但是其中ToxA的结合结构域已经被ToxB的结合结构域替换，反之亦然。与当前的一致意见相符合，提示所述结合结构域是免疫原性的关键结构域。另外，作者指出，它们的全毒素构建体(其保留天然毒素的所有功能结构域)的嵌合性质是必需的。
但是，发明人已经令人惊奇地发现，天然毒素结构不是免疫原性所必需的，并且包含TcdA或TcdB的GT结构域的片段特别适合用于产生免疫应答，前提条件是，它们与TcdB片段组合(当使用TcdA的GT结构域时)或与TcdA片段组合(当使用TcdA的GT结构域时)。在这样的组合中采用的GT结构域通常是脱毒的。这样的组合会造成针对TcdA和TcdB的中和滴度的产生，并且比包含结合结构域片段的组合更有效地在动物模型中提供针对CDAD的保护性应答。这些组合因而提供改进的针对CDAD的疫苗。此外，重组多肽片段的应用也会避免与从细胞培养物纯化的艰难梭菌毒素所衍生出的类毒素在疫苗中的应用有关的安全性问题。
ToxB-GT抗原
全长TcdB抗原(在本文中也被称作ToxB和毒素B)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(由SEQ ID NO:31的核酸序列编码)。脱毒的TcdB抗原在本文中被称作类毒素B。
缩写“ToxB-GT”表示TcdB的葡萄糖基转移酶结构域，其位于酶促结构域(ED)的N-端区域内。ToxB-GT结构域(SEQ ID NO:18，由SEQ ID NO:47的核酸序列编码)是TcdB的与SEQ ID NO:2的氨基酸1-543对应的片段。
在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:18具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、 99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:18的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:18具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:18的表位。其它优选的片段缺乏一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:18的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:18的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:18的至少一个表位。ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:18的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxB-GT抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:18的野生型ToxB-GT抗原序列，所述ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如，相对于SEQ ID NO:18的野生型ToxB-GT抗原序列，所述ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个突变)，例如在氨基酸位置17、102、139、269、270、273、284、286、288、384、449、444、445、448、449、450、451、452、455、461、463、472、515、518和/或520。例如，所述ToxB-GT抗原可以包含在1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO:18的Tox-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的置换。具体地，1个、2个、3个、4个或5个在与SEQ ID NO: 18的ToxB-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸残基置换。在SEQ ID NO:18的氨基酸270、273、284、286和/或288被置换的情况下，所述置换优选地是D270A、R273A、Y284A、D286A和/或D288A、最优选地D270A、R273A、Y284A、D286A和D288A。这些置换对应于SEQ ID NO:2的置换D270A、R273A、Y284A、D286A和D288A。在SEQ ID NO:60中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxB-GT抗原的氨基酸序列。
在ToxB-GT包含2个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:18的ToxB-GT抗原序列的氨基酸位置102和278、或氨基酸位置102和288。在本发明的组合物中包括的脱毒ToxB-GT抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:60具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:60的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:60具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。脱毒ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:60的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的片段包含SEQ ID NO:60的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:60的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:60的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:60的至少一个表位。
缩写“ToxB-ED”表示TcdB的酶促结构域。ToxB-ED结构域(SEQ ID NO:17，由SEQ ID NO:46的核酸序列编码)是TcdB的与SEQ ID NO:2的氨基酸1-767对应的片段。TcdB的ToxB-ED结构域因而包含ToxB-GT结构域。在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原因而可以是ToxB-ED抗原。
在本发明的组合物中包括的ToxB-ED抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:17具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:17的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:17具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、650、700、750或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:17的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:17的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:17的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:17的至少一个表位。
ToxB-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:17的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxB-ED抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxB-ED抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:17的野生型ToxB-ED抗原序列，所述ToxB-ED抗原包含一个或多个氨基 酸置换(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多个突变)。例如，相对于SEQ ID NO:17的野生型ToxB-ED抗原序列，所述ToxB-ED抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个突变)，例如在氨基酸位置17、102、139、269、270、273、284、286、288、384、449、444、445、448、449、450、451、452、455、461、463、472、515、518和/或520。例如，所述ToxB-ED抗原可以包含在1个、2个、3个、4个或5个与SEQ ID NO:17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的置换。具体地，1个、2个、3个、4个或5个在与SEQ ID NO:17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸残基置换。所述ToxB-ED抗原还可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸587、653和/或698对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸587、653和/或698对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQ ID NO:17的氨基酸587、653和/或698被置换的情况下，所述置换优选地是D587N、H653A和/或C698A，最优选D587N、H653A和C698A。这些置换对应于SEQ ID NO:2的置换D587N、H653A和C698A。在SEQ ID NO:58中提供了具有在位置270、273、284、286、288、587、657和698(相对于SEQ ID NO:2)处的置换的脱毒ToxB-ED抗原的氨基酸序列。
在ToxB-ED包含2个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:17的ToxB-ED抗原序列的氨基酸位置102和278、或氨基酸位置102和288。
在本发明的组合物中包括的脱毒ToxB-ED抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:58具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％ 、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:58的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:58具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、650、700、750或更多)。脱毒ToxB-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:58的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的片段包含SEQ ID NO:58的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:58的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:58的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:58的至少一个表位。
在本发明的组合物中包括的ToxB-GT抗原和ToxB-ED抗原还可以包括存在于全长TcdB抗原中的、下面定义的ToxB-CP和/或ToxB-T结构域。ToxB-GT抗原和ToxB-ED抗原可以例如包含n个来自下面描述的ToxB-T结构域的N-端区域的氨基酸，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1025、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064或1065。
在本发明的组合物中包括的ToxB-GT和ToxB-ED抗原优选地不包含TcdB的结合结构域。具体地，所述ToxB-GT和ToxB-ED优选地不包含在 下面更详细地描述的ToxB-B结构域或该结构域的片段，例如在下面更详细地描述的ToxB-B2和/或ToxB-B7结构域。
ToxA-GT抗原
全长TcdA抗原(在本文中也被称作ToxA和毒素A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(由SEQ ID NO:30的核酸序列编码)。脱毒的TcdA抗原在本文中被称作类毒素A。
缩写“ToxA-GT”表示TcdA的葡萄糖基转移酶结构域，其位于酶促结构域(ED)的N-端区域内。ToxA-GT结构域(SEQ ID NO:4，由SEQ ID NO:33的核酸序列编码)是TcdA的与SEQ ID NO:1的氨基酸1-541对应的片段。
在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:4的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:4具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:4的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:4的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:4的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:4的至少一个表位。
ToxA-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:4的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxA-GT抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:4的野生型ToxA-GT抗原序列，所述ToxA-GT抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多个突变)。例如，所述ToxA-GT抗原可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸残基置换(即Y283A,D285A,D287A)。这些突变对应于SEQ ID NO:1的位置283、285和287。在SEQ ID NO:56中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxA-GT抗原的氨基酸序列。
在ToxA-GT抗原包含一个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置278。在ToxA-GT抗原包含2个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101和278。在ToxA-GT抗原包含3个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101、278和519、或氨基酸位置101、287和519。
在本发明的组合物中包括的脱毒ToxA-GT抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:56具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:56的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:56具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:56的表位。 其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:56的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:56的N-端的氨基酸，同时保留至少一个SEQ ID NO:56的表位。脱毒ToxB-GT的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:56的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500或多达540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
缩写“ToxA-ED”表示TcdA的酶促结构域。所述ToxA-ED结构域(SEQ ID NO:3，由SEQ ID NO:32的核酸序列编码)是TcdA的与SEQ ID NO:1的氨基酸1-769对应的片段。TcdA的ToxA-ED结构域因而包含ToxA-GT结构域。在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原因而可以是ToxA-ED抗原。
在本发明的组合物中包括的ToxA-ED抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:3具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:3的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:3具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:3的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:3的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:3的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:3的至少一个表位。
ToxA-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:3的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-ED抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxA-ED抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:3的野生型ToxA-ED抗原序列，所述ToxA-ED抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如，所述ToxA-ED抗原可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸283、285和287对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸残基置换。在SEQ ID NO:54中提供了具有在这些位置处的丙氨酸置换的脱毒ToxA-ED抗原的氨基酸序列。
所述ToxA-ED抗原还可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸589、655和/或700对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸589、655和/或700对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在氨基酸589、655和/或700被置换的情况下，所述置换优选地是D589N、H655A和/或C700A，最优选D589N、H655A和C700A。
在ToxA-ED抗原包含一个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置278。在ToxA-ED抗原包含2个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置101和278。在ToxA-ED抗原包含3 个氨基酸置换的情况下，所述置换优选地不是在SEQ ID NO:3的ToxA-ED抗原序列的氨基酸位置101、278和519、或氨基酸位置101、287和519。
在本发明的组合物中包括的脱毒ToxA-ED抗原因而可以是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:54具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:54的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:54具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:54的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:54的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:54的N-端的氨基酸，同时保留至少一个SEQ ID NO:54的表位。脱毒ToxA-ED的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:54的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个或多达750个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-GT抗原和ToxA-ED抗原还可以包括存在于全长TcdA抗原中的、下面定义的ToxA-CP和/或ToxA-T结构域。ToxA-GT抗原和ToxA-ED抗原可以例如包含n个来自下面描述的ToxA-T结构域的N-端区域的氨基酸，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1025、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064或1065。
在本发明的组合物中包括的ToxA-GT和ToxA-ED抗原优选地不包含TcdA的结合结构域。具体地，所述ToxA-GT和ToxA-ED优选地不包含在下面更详细地描述的ToxA-B结构域或该结构域的片段，例如在下面更详细地描述的ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6结构域。
TcdA抗原
本发明的组合物可以包含TcdA抗原。在本发明的组合物中包括的TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:1的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:1具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500或更多)。TcdA的氨基酸片段可以包含SEQ ID NO:1的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个、多达750个、多达1000个、多达1250个、多达1500个、多达1750个、多达2000个、多达2250个或多达2500个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的TcdA片段包含SEQ ID NO:1的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:1的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15 个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:1的N-端的氨基酸，同时保留至少一个SEQ ID NO:1的表位。其它TcdA片段缺少一个或更多个蛋白结构域。可以缺少的蛋白结构域可以包括功能性蛋白结构域，诸如在本文中讨论的“B”、“T”、“GT”、“CP”、“ToxA-ED”、“ToxA-GT”、“ToxA-CP”、“ToxA-T”、“ToxA-T4”、“ToxA-PTA2”、“ToxA-P5-7”、“ToxA-P5-6”、“ToxA-P9-10”、“ToxA-B2”、“ToxA-B3”、“ToxA-B5”和“ToxA-B6”结构域。
在本发明的组合物中可包括的TcdA抗原片段优选地选自：“ToxA-ED”、“ToxA-GT”、“ToxA-CP”、“ToxA-T”、“ToxA-T4”、“ToxA-PTA2”、“ToxA-P5-7”、“ToxA-P5-6”、“ToxA-P9-10”、“ToxA-B2”、“ToxA-B3”、“ToxA-B5”和“ToxA-B6”。该组片段在本文中被称作“TcdA抗原组”。
因而，本发明的组合物可以包含一种或多种(即1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种)选自以下的TcdA抗原：(1)ToxA-ED抗原，(2)ToxA-GT抗原，(3)ToxA-CP抗原，(4)ToxA-T抗原，(5)ToxA-T4抗原，(6)ToxA-B抗原，(7)ToxA-PTA2抗原，(8)ToxA-P5-7抗原，(9)ToxA-P5-6抗原，(10)ToxA-P9-10抗原，(11)ToxA-B2抗原，(12)ToxA-B3抗原，(13)ToxA-B5抗原，(14)ToxA-B6抗原，和(15)全长TcdA抗原。其中本发明的组合物包含一种TcdA片段，所述一种TcdA片段优选地不是单独的ToxA-CP抗原。
(1)ToxA-GT抗原、(2)ToxA-ED抗原和(15)全长TcdA抗原如上面所定义。在下面更详细地定义了其它抗原。
(3)ToxA-CP抗原
ToxA-CP结构域(SEQ ID NO:5，由SEQ ID NO:34的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸542-769。缩写“ToxA-CP”表示TcdA的半胱氨酸蛋白酶结构域，其位于酶促结构域的C-端区域内。
在本发明的组合物中包括的ToxA-CP抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:5具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:5的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:5具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、225或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:5的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:5的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:5的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:5的至少一个表位。ToxA-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:5的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-CP抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxA-CP抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:5的野生型ToxA-CP抗原序列，所述ToxA-CP抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如，所述ToxA-CP抗原可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:5的ToxA-CP抗原序列的氨基酸48、114和159对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:5的ToxA-CP抗原序列的氨基酸48、114和159对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQ ID NO:5的氨基酸48、114和/或159被置换的情况下，所述置换优选地是D48N、H114A和/或A159A，最优选D48N、H114A和A159A。这些置换对应于SEQ ID NO:1的置换D589N、H655A和C700A。在SEQ ID NO:62中提供了具有在这些位置处的丙氨酸或天冬酰胺置换的脱毒ToxA-CP抗原的氨基酸序列。
脱毒ToxA-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:62的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物仅含有一种TcdA抗原的情况下，所述一个TcdA抗原优选地不是单独的ToxA-CP。在本发明的组合物包含ToxA-CP抗原的情况下，所述抗原可以是ToxA-ED抗原。
(4)ToxA-T抗原
The ToxA-T结构域(SEQ ID NO:6，由SEQ ID NO:35的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸770-1808。缩写“ToxA-T”表示TcdA的易位结构域。
在本发明的组合物中包括的ToxA-T抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:6具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:6的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:6具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、550、600、700、800、900、1000或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:6的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:6的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:6的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:6的至少一个表位。ToxA-T的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:6的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、 多达600个、多达700个、多达800个、多达900个或多达1000个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(5)ToxA-T4
ToxA-T4结构域(SEQ ID NO:7，由SEQ ID NO:36的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1510-1775。缩写“ToxA-T4”表示在TcdA内的区域。发现ToxA-T4区域是不溶性的。
在本发明的组合物中包括的ToxA-T4抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:7具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:7的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:7具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:7的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:7的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:7的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:7的至少一个表位。ToxA-T4的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:7的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个或多达260个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(6)ToxA-B抗原
ToxA-B结构域(SEQ ID NO:8，由SEQ ID NO:37的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1809-2710。缩写“ToxA-B”表示TcdA的结合结构域的片段。TcdA的结合结构域(在图1中用“B”表示)负责毒素与上皮细胞表面的结合。发明人已经发现，与GT抗原组合的结合结构域的片 段可有效地引起免疫应答。本发明的组合物因而采用结合结构域的片段(例如ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6)。
在本发明的组合物中包括的ToxA-B抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:8具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:8的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:8具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、900或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:8的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:8的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:8的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:8的至少一个表位。ToxA-B的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:8的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达900个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(7)ToxA-PTA2
ToxA-PTA2结构域(SEQ ID NO:9，由SEQ ID NO:38的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1995-2198。缩写“ToxA-PTA2”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域，且被发现是不溶性的。如在WO98/59053中所述，ToxA-PTA2片段包含来自毒素A的C-端重复区域的8个串联重复序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-PTA2抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:9具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:9的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:9具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:9的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:9的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:9的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:9的至少一个表位。ToxA-PTA2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:9的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个或多达200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(8)ToxA-P5-7抗原
ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10，由SEQ ID NO:39的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2249-2706。缩写“ToxA-P5-7”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在WO98/59053中所述，ToxA-P5-7片段包含来自毒素A的C-端重复区域内的20个串联重复序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-P5-7抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:10具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:10的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:10具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20 、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、450或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:10的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:10的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:10的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:10的至少一个表位。ToxA-P5-7的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:10的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个或多达450个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(9)ToxA-P5-6抗原
ToxA-P5-6结构域(也被称作“P5-6”)(SEQ ID NO:11，由SEQ ID NO:40的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2387-2706。缩写“ToxA-P5-6”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在WO98/59053中所述，ToxA-P5-6片段包含来自毒素A的C-端重复区域的14个串联重复序列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-P5-6抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:11具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:11的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:11具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:11的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:11的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10 个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:11的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:11的至少一个表位。ToxA-P5-6的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:11的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个或多达300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
ToxA-p5-6抗原可以包含相对于SEQ ID NO:11的至少一个(例如1个、2个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸的突变。突变优选地涉及单个氨基酸，且优选地是点突变。所述突变可以各自独立地是缺失、插入或置换。例如，相对于ToxA-p5-6序列SEQ ID NO:11，突变的ToxA-p5-6抗原可以包括一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。作为其它例子，相对于ToxA-p5-6序列SEQ ID NO:11，突变的ToxA-p5-6抗原可以包含一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1个、2个、3个、4或5个氨基酸中的每一个)。缺失、置换或插入可以是在N-端和/或C-端处，或者可以是在2个末端之间。因而，截短是缺失的一个例子。截短可能涉及在N-端和/或C-端处的多达40个(或更多个)氨基酸的缺失。具体插入包括2个氨基酸(例如亮氨酸(L)和谷氨酸(E))在C-端处的添加，如在SEQ ID NO:84中所示。
优选的突变是氨基酸置换。氨基酸置换可以是从一种氨基酸至其它19种天然存在的氨基酸中的任一种。通常将保守置换定义为这样的置换：其引入具有充分类似的化学性质(例如具有有关的侧链)的氨基酸(例如碱性的带正电荷的氨基酸应当用另一种碱性的带正电荷的氨基酸替换)，以便维持所述分子的结构和生物学功能。遗传编码的氨基酸可以分成5个家族：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)带电荷的，即天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸；和(5)不带电荷的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪 氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言，在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物活性不具有重大影响。具体地，可以在根据SEQ ID11编号的ToxA-p5-6抗原的位置41和/或42处做出置换。具体地，在位置41处的组氨酸(H)可以被天冬氨酸(D)置换，如在SEQ ID NO:101中所示(命名为H41D的置换)。具体地，在位置42处的天冬酰胺(N)可以被丙氨酸(A)置换，如在SEQ ID NO:102中所示(命名为N42A的置换)。更具体地，ToxA-P5-6抗原可以包含这2种突变H41D和N42A，如在SEQ ID NO:103中所示。
ToxA-p5-6抗原可以是式A-Bp5-6-C的杂合多肽的一部分，其中：
A是任选的N-端另外的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以源自来自MCS的载体序列，或者所述序列可以源自辅助蛋白的过表达的外来多肽。所述另外的氨基酸可以用于亲和纯化或用于抗体检测。所述另外的氨基酸序列可以是本领域已知的任意标签，诸如GST标签、His标签、T7标签、Trx标签、MBP标签、His-GM标签等。具体地，所述另外的氨基酸序列包含序列MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS SRITR(SEQ ID NO:104)
B是ToxA-p5-6抗原，其具有选自SEQ ID NO11、SEQ ID NO84、SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
C是任选的C-端氨基序列，其具有下述序列TESTCRXQA(SEQ ID NO:105)，其中X是20种天然存在的氨基酸之一。
包含ToxA-p5-6抗原的杂合多肽的例子显示在SEQ ID NO:106、107、108、109、110和111中。Seq ID NO:111由SEQ ID NO:112的核酸序列编码。用于本发明的组合中的优选ToxA-p5-6抗原包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:111。
(10)ToxA-P9-10抗原
ToxA-P9-10结构域(SEQ ID NO:12，由SEQ ID NO:41的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1843-2706。缩写“ToxA-P9-10”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。如在WO98/59053中所述，ToxA-P9-10片段包含来自毒素A的C-端重复区域的所有36个串联重复序 列。
在本发明的组合物中包括的ToxA-P9-10抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:12具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:12的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:12具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、850或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:12的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:12的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:12的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:12的至少一个表位。ToxA-P9-10的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:12的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(11)ToxA-B2抗原
ToxA-B2结构域(SEQ ID NO:13，由SEQ ID NO:42的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2303-2706。缩写“ToxA-B2”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。将ToxA-B2设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的6个(参见图2)。
在本发明的组合物中包括的ToxA-B2抗原是包含特定氨基酸序列或由 特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:13具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:13的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:13具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:13的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:13的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:13的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:13的至少一个表位。ToxA-B2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:13的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(12)ToxA-B3抗原
ToxA-B3结构域(SEQ ID NO:14，由SEQ ID NO:43的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1839-2710。缩写“ToxA-B3”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。将ToxA-B3设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的12个(参见图3)。
在本发明的组合物中包括的ToxA-B3抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:14具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:14的至少“n”个连续氨 基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:14具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、850或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:14的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:14的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:14的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:14的至少一个表位。ToxA-B3的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:14的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(13)ToxA-B5抗原
ToxA-B5结构域(SEQ ID NO:15，由SEQ ID NO:44的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1964-2706。缩写“ToxA-B5”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。将ToxA-B5设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的10.5(参见图4)。
在本发明的组合物中包括的ToxA-B5抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:15具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:15的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:15具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25 、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、740或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:15的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:15的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:15的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:15的至少一个表位。ToxA-B5的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:15的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个或多达740个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(14)ToxA-B6抗原
ToxA-B6结构域(SEQ ID NO:16，由SEQ ID NO:45的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1890-2706。缩写“ToxA-B6”表示在TcdA的结合结构域内的一个区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。将ToxA-B6设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的11.5(参见图5)。
在本发明的组合物中包括的ToxA-B6抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:16具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:16的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:16具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:16的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:16的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:16的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:16的至少一个表位。ToxA-B6的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:16的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个或多达850个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
TcdB抗原
本发明的组合物可以包含TcdB抗原。在本发明的多肽中包括的TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:2具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:2的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:2具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2400或更多)。TcdB的氨基酸片段可以包含SEQ ID NO:2的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达350个、多达400个、多达450个、多达500个、多达550个、多达600个、多达650个、多达700个、多达750个、多达1000个、多达1250个、多达1500个、多达1750个、多达2000个、多达2250个或多达2400个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的TcdB的片段包含SEQ ID NO:2的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自 SEQ ID NO:2的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:2的N-端的氨基酸，同时保留至少一个SEQ ID NO:2的表位。其它TcdB片段缺少一个或更多个蛋白结构域。可以缺少的蛋白结构域可以包括功能性蛋白结构域，诸如在本文中讨论的“B”、“T”、“GT”、“CP”、““ToxB-ED”、“ToxB-GT”、“ToxB-CP”、“ToxB-T”、“ToxB-B”、“ToxB-B2”和“ToxB-B7”结构域。
可以在本发明的组合物中包括的TcdB片段优选地选自：“ToxB-ED”、“ToxB-GT”、“ToxB-CP”、“ToxB-T”、“ToxB-B”、“ToxB-B2”和ToxB-B7。该组抗原在本文中被称作“TcdB抗原组”。
因而，本发明的组合物可以包含一种或多种(即1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或所有8种)选自以下的TcdB抗原：(1)ToxB-ED抗原，(2)ToxB-GT抗原，(3)ToxB-CP抗原，(4)ToxB-T抗原，(5)ToxB-B抗原，(6)ToxB-B2抗原，(7)ToxA-B7抗原和(8)全长TcdB抗原。其中本发明的组合物仅包含一种TcdB片段，所述一种TcdB片段优选地不是单独的ToxB-CP。
(1)ToxB-GT抗原、(2)ToxB-ED抗原和(8)全长TcdB抗原如上面所定义。在下面更详细地定义了其它抗原。
(3)ToxB-CP抗原
ToxB-CP结构域(SEQ ID NO:19，由SEQ ID NO:48的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸544-767。缩写“ToxB-CP”表示TcdB的半胱氨酸蛋白酶结构域，其位于酶促结构域的C-端区域内。
在本发明的组合物中包括的ToxB-CP抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:19具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:19的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:19具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25 、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、230或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:19的表位。ToxB-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:19的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个或多达230个连续氨基酸残基的氨基酸序列。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:19的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:19的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:19的至少一个表位。
在本发明的组合物中包括的ToxB-CP抗原可以是脱毒的。脱毒可以如下实现：使用本领域已知的任何适当的方法例如定位诱变，突变野生型ToxB-CP抗原的氨基酸序列或编码核酸序列。优选地，相对于SEQ ID NO:19的野生型ToxB-CP抗原序列，所述ToxB-CP抗原包含一个或多个氨基酸置换(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个突变)。例如，所述ToxB-CP抗原可以包含在1个、2个或3个与SEQ ID NO:19的ToxB-CP抗原序列的氨基酸44、110和155对应的位置处的置换。具体地，1个、2个或3个在与SEQ ID NO:19的ToxB-CP抗原序列的氨基酸44、110和155对应的位置处的氨基酸可以被置换，优选地被丙氨酸或天冬酰胺残基置换。在SEQ ID NO:19的氨基酸44、110和/或155被置换的情况下，所述置换优选地是D44N、H110A和/或C155A，最优选D44N、H110A和/或C155A。在SEQ ID NO:64中提供了具有在这些位置处的丙氨酸或天冬酰胺置换的脱毒ToxB-CP抗原的氨基酸序列。这些置换对应于SEQ ID NO:2的置换D587N、H653A和C698A。脱毒ToxB-CP的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:64的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个或多达225个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的组合物仅含有一种TcdB抗原的情况下，所述一种TcdB抗原优选地不是单独的ToxB-CP。在本发明的组合物包含ToxB-CP抗原的情况下，所述抗原可以是ToxB-ED抗原。
(4)ToxB-T抗原
ToxB-T结构域(SEQ ID NO:20，由SEQ ID NO:49的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸768-1833。缩写“ToxB-T”表示TcdB的易位结构域。
在本发明的组合物中包括的ToxB-T抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:20具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:20的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:20具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、550、600、700、800、900、1000、1050或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:20的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:20的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:20的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:20的至少一个表位。ToxB-T的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:20的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达500个、多达550个、多达600个、多达700个、多达800个、900个、1000个或多达1050个、连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(5)ToxB-B抗原
ToxB-B结构域(SEQ ID NO:21，由SEQ ID NO:50的核酸序列编码) 对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1853-2366。缩写“ToxB-B”表示TcdB的结合结构域的一个片段。发明人已经发现，与GT抗原组合的结合结构域的片段可有效地引起免疫应答。本发明的组合物因而采用结合结构域的片段(例如ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7)。
在本发明的组合物中包括的ToxB-B抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:21具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:21的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:21具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:21的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:21的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:21的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:21的至少一个表位。ToxB-B的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:21的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个、多达300个、多达400个、多达450个或多达500个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(6)ToxB-B2抗原
ToxB-B2结构域(SEQ ID NO:22，由SEQ ID NO:51的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸2157-2366。缩写“ToxA-B2”表示TcdB的结合结构域的C-端区域。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdB结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。将ToxB-B2设计成包括9个假定的形成结合结构域的结构单元中的4个 (参见图6)。
在本发明的组合物中包括的ToxB-B2抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:22具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:22的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:22具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、175、200或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:22的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:22的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:22的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:22的至少一个表位。
ToxB-B2的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:22的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个或多达200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
(7)ToxB-B7抗原
ToxB-B7结构域(SEQ ID NO:23，由SEQ ID NO:52的核酸序列编码)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸2056-2366。
在本发明的组合物中包括的ToxB-B7抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:23具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或更多)；和/或(b)是SEQ ID NO:23的至少“n”个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:23具有50％或更多同一性，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25 、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:23的表位。其它优选的片段缺少一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:23的C-端的氨基酸和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个)来自SEQ ID NO:23的N-端的氨基酸，同时保留SEQ ID NO:23的至少一个表位。
ToxB-B7的氨基酸片段因而可以包含SEQ ID NO:23的例如多达30个、多达40个、多达50个、多达60个、多达70个、多达80个、多达90个、多达100个、多达125个、多达150个、多达175个、多达200个、多达250个或多达300个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
抗原组合
本发明的组合物可以包含ToxB-GT抗原和一种或多种TcdA抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自以下的TcdA抗原：如上所述的(1)ToxA-ED抗原、(2)ToxA-GT抗原、(3)ToxA-CP抗原、(4)ToxA-T抗原、(5)ToxA-T4抗原、(6)ToxA-B抗原、(7)ToxA-PTA2抗原、(8)ToxA-P5-7抗原、(9)ToxA-P5-6抗原、(10)ToxA-P9-10抗原、(11)ToxA-B2抗原、(12)ToxA-B3抗原、(13)ToxA-B5抗原、(14)ToxA-B6抗原和(15)全长TcdA抗原)。这样的组合物可以进一步包含一种或多种另外的TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7或8种选自以下的TcdB抗原作为上述的TcdB：(1)ToxB-ED抗原、(2)ToxB-GT抗原、(3)ToxB-CP抗原、(4)ToxB-T抗原、(5)ToxB-B抗原、(6)ToxB-B2抗原、(7)ToxA-B7抗原和(8)全长TcdB抗原)。
可替换地，本发明的组合物可以包含ToxA-GT抗原和一种或多种TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7或8种选自以下的TcdB抗原作为上述的TcdB：(1)ToxB-ED抗原、(2)ToxB-GT抗原、(3)ToxB-CP抗原、(4)ToxB-T抗原、(5)ToxB-B抗原、(6)ToxB-B2抗原、(7)ToxA-B7抗原和(8)全长TcdB抗原)。这样的组合物可以进一步包含一种或多种另外的TcdA抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种选自以下的 TcdA抗原：如上所述的(1)ToxA-ED抗原、(2)ToxA-GT抗原、(3)ToxA-CP抗原、(4)ToxA-T抗原、(5)ToxA-T4抗原、(6)ToxA-B抗原、(7)ToxA-PTA2抗原、(8)ToxA-P5-7抗原、(9)ToxA-P5-6抗原、(10)ToxA-P9-10抗原、(11)ToxA-B2抗原、(12)ToxA-B3抗原、(13)ToxA-B5抗原、(14)ToxA-B6抗原和(15)全长TcdA抗原)。
下面阐述了在本发明的组合物中可以包括的抗原组合的具体例子。
在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包含以下抗原的组合：i)一种ToxB-GT抗原和一种TcdA抗原，或ii)一种ToxA-GT抗原和一种TcdB抗原。
在某些实施方案中，所述组合物包含ToxA-GT和一种来自TcdB抗原组的抗原，例如ToxA-GT+ToxB-ED、ToxA-GT+ToxB-GT、ToxA-GT+ToxB-CP、ToxA-GT+ToxB-T、ToxA-GT+ToxB-B、ToxA-GT+ToxB-B2、ToxA-ED+ToxB-B7、ToxA-ED+ToxB-ED、ToxA-ED+ToxB-GT、ToxA-ED+ToxB-CP、ToxA-ED+ToxB-T、ToxA-ED+ToxB-B、ToxA-ED+ToxB-B2和ToxA-ED+ToxB-B7。
在某些实施方案中，所述组合物包含ToxB-GT和一种来自TcdA抗原组的抗原，例如ToxB-GT+ToxA-ED、ToxB-GT+ToxA-GT、ToxB-GT+ToxA-CP、ToxB-GT+ToxA-T、ToxB-GT+ToxA-T4、ToxB-GT+ToxA-PTA2、ToxB-GT+ToxA-P5-7、ToxB-GT+ToxA-P5-6、ToxB-GT+ToxA-P9-10、ToxB-GT+ToxA-B2、ToxB-GT+ToxA-B3、ToxB-GT+ToxA-B5、ToxB-GT+ToxA-B6、ToxB-ED+ToxA-ED、ToxB-ED+ToxA-GT、ToxB-ED+ToxA-CP、ToxB-ED+ToxA-T、ToxB-ED+ToxA-T4、ToxB-ED+ToxA-PTA2、ToxB-ED+ToxA-P5-7、ToxB-ED+ToxA-P5-6、ToxB-ED+ToxA-P9-10、ToxB-ED+ToxA-B2、ToxB-ED+ToxA-B3、ToxB-ED+ToxA-B5和ToxB-ED+ToxA-B6。优选地，所述组合物包含(a)ToxB-GT+ToxA-P5-6、(b)ToxB-GT+ToxA-B2、(c)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-B2或(d)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5-6。
在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含3种抗原。这样的免疫原性组合物可以包含以下抗原的组合：i)一种ToxB-GT抗原和2种TcdA 抗原；ii)一种ToxA-GT抗原和2种TcdB抗原；或iii)一种ToxB-GT抗原、一种ToxA-GT抗原和一种其它的TcdA或TcdB抗原，例如ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB-B、ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5-6。
所述免疫原性组合物可以包含4种抗原。例如，所述组合物可以包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原和2种来自TcdA和/或TcdB抗原组的另外的抗原，例如ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-GT+ToxA-B2。
已经发现，当与源自TcdA和TcdB的结合结构域的片段组合时，包含ToxA-GT和/或ToxB-GT抗原的组合是惊人地有效的。具体地，所述组合物因此可以包含以下抗原的组合：i)ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原，和(ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。所述组合物还可以包含以下抗原的组合：i)ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原和(ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。
所述组合物可以进一步包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种另外的片段。这样的其它片段优选地选自TcdA抗原组和/或TcdB抗原组。
杂合多肽
所述组合物中的抗原可以呈现为各种单独的多肽和/或“杂合”多肽。在某些实施方案中，所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。在某些实施方案中，所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。在下面更详细地描述杂合多肽(在本文中也被称作嵌合体或嵌合蛋白)。
所述抗原可以作为各种单独的多肽存在于本发明的组合物中(即混合到一起)。作为一个替代方案，本发明的组合物包含“杂合”多肽，其中将至少2种(例如2、3、4、5种或更多种)抗原表达为单个多肽链。本发明的组合物还可以包含至少一种各种单独的多肽抗原和至少一种杂合多肽。杂合多肽会提供2个主要优点：首先，通过添加克服该问题的合适杂合配偶体， 可以辅助本身不稳定或者表达较差的多肽；其次，简化了商业生产，因为为了生产在抗原性方面都有用的两种多肽仅需利用一次表达和纯化。
杂合多肽可以包含ToxB-GT抗原和一种或多种TcdA抗原。所述杂合多肽因而包含2种或更多种不同的抗原。因而，所述杂合多肽可以包含来自例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同抗原的氨基酸序列，且可以包含每种抗原的多个拷贝，即2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。
杂合多肽可以包含ToxA-GT抗原和一种或多种TcdB抗原。所述杂合多肽因而包含2种或更多种不同的抗原。因而，所述杂合多肽可以包含来自例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同抗原的氨基酸序列，且可以包含每类片段的多个拷贝，即2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝。
TcdA抗原优选地选自TcdA抗原组，例如所述杂合多肽可以包含TcdA抗原组中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种抗原。TcdB抗原优选地选自TcdB抗原组，例如所述杂合多肽可以包含TcdB抗原组中的1、2、3、4、5、6、7或8种抗原。
不同的杂合多肽可以在单一制剂中混合到一起。可以将杂合体与非杂合抗原组合。在这样的组合内，TcdA/TcdB抗原可以存在于超过一种杂合多肽中和/或作为非杂合多肽存在。优选地，TcdA/TcdB抗原作为杂合体或作为非杂合体存在，但是不作为二者存在。
所述杂合多肽还可以与缀合物或非-艰难梭菌抗原组合。
杂合多肽可以由式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH表示，其中：X是如上所述的毒素片段(优选类毒素片段)的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N-端氨基酸序列；B是任选的C-端氨基酸序列；n是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。n经常是2或3。
如果-X-部分具有野生型形式的前导多肽序列，那么其可在杂合蛋白中包含或者缺失。在某些实施方案中，除了位于杂合蛋白N-端处的-X-部分的前导多肽以外，前导多肽可缺失，即保留X1的前导多肽，但缺失X2…Xn的前导多肽。这相当于删除所有前导多肽并使用X1的前导多肽作为部分 -A-。
就{-X-L-}的各n示例而言，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂合体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少的氨基酸，即20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个)。例子包含促进克隆的短多肽序列、聚甘氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的接头氨基酸序列。一种有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO:25)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:26)，其中Gly-Ser二肽从BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，且(Gly)4四肽是典型的聚-甘氨酸接头。其它合适的接头(具体地用作最终的Ln)是Leu-Glu二肽或SEQ ID NO:27。
-A-是任选的N-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列、或促进克隆或纯化的短多肽序列(例如组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员会明白其它合适的N-端氨基酸序列。如果X1缺少其自身的N-端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，例如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
-B-是任选的C-端氨基酸序列。其通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列、促进克隆或纯化的短多肽序列(例如包含组氨酸标 签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或增强蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员会明白其它合适的C-端氨基酸序列。
例如，本发明提供了一种杂合多肽(“B4杂合体”)，其由通过肽接头(SEQ ID NO:25)与ToxA-P5-6(SEQ ID NO:11)融合的ToxB-GT(SEQ ID NO:18)组成。在图7中提供了B4杂合体的示意图(SEQ ID NO:24，由SEQ ID NO:53的核酸序列编码)。
本发明的杂合多肽通常不是全毒素，即它们不包含存在于天然毒素或全毒素中的所有功能结构域(GT、CP、T和B)。例如，在包含ToxB-GT抗原的杂合多肽也包含TcdB的结合结构域片段(例如ToxB-B、ToxB-B2和/或ToxB-B7)的情况下，所述杂合体不包含以它们在天然毒素B中存在的次序呈现的Tcd B的CP和T结构域。类似地，在包含ToxA-GT抗原的杂合多肽也包含TcdA的结合结构域片段(例如ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6)的情况下，所述杂合体不包含以它们在天然毒素A中存在的次序呈现的TcdA的CP和T结构域。
在某些实施方案中，杂合多肽中的功能结构域的N-端至C-端次序不同于在天然毒素中存在的功能结构域的次序，例如T结构域可以是GT结构域的N-端。
类似地，TcdA和TcdB片段可以以任意次序呈现。例如，在杂合多肽包含2种TcdA抗原和一种TcdB抗原的情况下，它们从N-端至C-端可以是次序A-A-B、A-B-A、B-A-A，或者在杂合多肽包含2种TcdB抗原和一种TcdA抗原的情况下，它们从N-端至C-端可以是次序B-B-A、B-A-B、A-B-B。一般而言，TcdA和TcdB抗原可以是交替的，例如A-B-A或B-A-B。
具体地，所述杂合多肽优选地不包含与TcdA的ToxA-B结构域融合的TcdB的ToxB-ED和ToxB-T结构域，其中TcdA的B-结构域直接地或经由接头与TcdB的T-结构域的C-端融合(例如修饰的全长TcdB，其中TcdB的B-结构域替换TcdA的B-结构域)。所述杂合多肽优选地不包含与TcdA的CP、T和B结构域(在N-C方向)融合的TcdB的GT结构域，其中TcdB 的GT-结构域直接地或经由接头与TcdA的CP-结构域的C-端融合(例如修饰的全长TcdA，其中TcdA的GT-结构域替换TcdB的GT-结构域)。所述杂合多肽优选地不包含与TcdB的GT、CP和T结构域(在N-C方向)融合的TcdA的B-结构域，其中TcdA的B-结构域直接地或经由接头与TcdB的GT-结构域的C-端融合。
制备本发明的组合物
本发明还提供了一种用于制备本发明的组合物的方法，所述方法包括混合如上定义的抗原组合中的任一种组合的抗原的步骤。例如，本发明提供了一种方法，其包括混合以下抗原的步骤：(i)ToxA-GT抗原和(ii)一种或多种(即1种、2种、3种或4种)TcdB抗原和任选的(iii)一种或多种(即1种、2种、3种或4种)其它TcdA抗原。例如，所述方法可以包括混合以下抗原的步骤：ToxA-GT抗原和一种或多种选自TcdB抗原组的抗原和任选的一种或多种选自TcdA抗原组的抗原。
本发明还提供了一种方法，其包括混合以下抗原的步骤：(i)ToxB-GT抗原和(ii)一种或多种(即1种、2种、3种或4种)TcdA抗原和任选的(iii)一种或多种(即1种、2种、3种或4种)TcdB抗原。例如，所述方法可以包括混合多肽的步骤，所述多肽包含ToxB-GT抗原和一种或多种选自TcdA抗原组的抗原和任选的一种或多种选自TcdB抗原组的抗原。
根据本发明的用于制备TcdA和TcdB抗原的混合物的方法可以包括以下另外的步骤：将本发明的TcdA和TcdB抗原的组合的混合物配制为药物，例如作为疫苗。这样的方法可以进一步包括以下步骤：将所述制剂包装用于作为药物(例如作为疫苗)进行贮存或分布。
与本发明一起使用的多肽
与本发明一起使用的多肽可以呈不同的形式(例如天然形式、融合体形式、糖基化形式、未糖基化形式、脂质化形式、非脂质化形式、磷酸化形式、非磷酸化形式、肉豆蔻酰基化的、非肉豆蔻酰基化的、单体形式、多聚体形式、微粒形式、变性形式等)。
与本发明一起使用的多肽可以通过多种方式(例如重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)来制备。重组表达的蛋白是优选的，特别对于杂合 多肽而言。
与本发明一起使用的多肽优选地以纯化的或基本上纯化的形式提供，即基本上不含有其它多肽(例如不含有天然存在的多肽)，具体地不含有其它艰难梭菌或宿主细胞多肽，且通常是至少约50％纯的(按重量计)，且经常是至少约90％纯的，即小于约50％、更优选地小于约10％(例如5％)的组合物由其它表达的多肽构成。因而，所述组合物中的抗原与表达所述分子的完整生物体分离。
与本发明一起使用的多肽优选地是艰难梭菌多肽。
与本发明一起使用的多肽优选地是分离的或纯化的。
术语“多肽”表示任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，且它可以被非氨基酸中断。该术语也包括已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意其它操作或修饰，诸如用标记组分组合。也包括，例如，含有氨基酸的一种或更多种类似物(包括、例如，非天然氨基酸等)、以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以作为单链或有关的链存在。
本发明提供了包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中：-P-是如上定义的氨基酸序列，且-Q-不是如上定义的序列，即本发明提供了融合蛋白。在-P-的N-端密码子不是ATG、但是该密码子不存在于多肽的N-端的情况下，它将被翻译为该密码子的标准氨基酸，而不是翻译为Met。但是，在该密码子是在多肽的N-端的情况下，它将被翻译为Met。-Q-部分的例子包括、但不限于：组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、麦芽糖-结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
本发明还提供了一种用于生产本发明的多肽的方法，所述方法包括下述步骤：在诱导多肽表达的条件下，培养用本发明的核酸转化的宿主细胞。
尽管本发明的多肽的表达可以发生在艰难梭菌中，本发明经常使用异源宿主进行表达(重组表达)。所述异源宿主可以是原核的(例如细菌)或真核的。它可以是大肠杆菌(E.coli)，但是其它合适的宿主包括桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus chosinensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧 菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌属(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明多肽的野生型艰难梭菌基因相比，有益的是，改变密码子以优化这样的宿主中的表达效率，而不影响编码的氨基酸。
本发明提供了一种用于生产本发明的多肽的方法，所述方法包括下述步骤：通过化学方法合成所述多肽的至少一部分。
核酸
本发明还提供了组合物，其包含编码上述的本发明的多肽或杂合多肽的组合的核酸(例如核酸的组合、载体或载体组合)。
编码本发明的抗原组合的核苷酸序列是已知的，或者可以根据遗传密码来设计。因而，在本发明范围内，这样的核苷酸序列可以编码本文中公开的多肽序列中的一个或更多个，或者可以编码这样的氨基酸序列，其：(a)与所述多肽中的任一个具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多，例如90％同一性或更多、或95％同一性或更多、或99％同一性或更多)；和/或(b)包含所述多肽中的任一个的至少'n'个连续氨基酸的片段:1，其中'n'是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多；例如20或更多；或例如50或更多；或例如80或更多)。
编码所有上述TcdA和TcdB抗原的核酸的天然核苷酸序列给出在序列表中，且总结在序列表表格中。编码这些抗原中的一些的核苷酸序列已经使用密码子优化方法进行了优化，并且在某些情况下也提供了经优化的核苷酸序列。密码子优化的序列的例子包括包含SEQ ID NO:55、57、59、61、63和65-69的核苷酸序列的核酸序列。本发明包括包含在序列表表格中鉴别出的核酸的组合物，所述核酸编码上述的抗原的组合。本发明还提供了可以与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可以在不同“严谨性”的条件下进行。增加杂交反应的严谨性的条件是在本领域中广泛已知的和公开的(例 如[42]的第7.52页)。有关的条件的例子包括(以严谨性递增的次序)：25℃、37℃、50℃、55℃和68℃的温育温度；10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1xSSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)的缓冲液浓度和它们的使用其它缓冲液系统的等效物；0％、25％、50％和75％的甲酰胺浓度；从5分钟至24小时的温育时间；1、2次或更多次洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤温育时间；和6x SSC、1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。杂交技术和它们的优化是本领域众所周知的[43,44,42,45,等]。
核酸可以在低严谨性条件下与靶标杂交；在其它实施方案中，它在中间严谨性条件下杂交；在优选的实施方案中，它在高严谨性条件下杂交。一组示例性的低严谨性杂交条件是50℃和10x SSC。一组示例性的中间严谨性杂交条件是55℃和1x SSC。一组示例性的高严谨性杂交条件是68℃和0.1x SSC。
本发明包括包含这些序列的互补序列的核酸(例如，用于反义或探测，或用作引物)。
根据本发明的核酸可以采取各种形式(例如单链形式、双链形式、载体、引物、探针、标记形式等)。本发明的核酸可以是环状的或分枝的，但是通常是线性的。除非另有说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方案可以利用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式中的每条链。引物和探针通常是单链的，反义核酸也是如此。
编码本文描述的抗原的核酸优选地以纯化的或基本上纯化的形式提供，即基本上不含有其它核酸(例如不含有天然存在的核酸)，特别是不含其它艰难梭菌或宿主细胞核酸，通常是至少约50％纯的(按重量计)，且经常至少约90％纯。本发明的核酸优选地是艰难梭菌核酸。
可以以多种方式制备编码本文描述的抗原的核酸，例如，通过完全或部分化学合成(例如DNA的氨基亚磷酸酯合成)、通过用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、从基因组或cDNA文库制备等。
可以将核酸连接至固体支持物(例如珠子、平板、滤器、膜、载玻片、微阵列支持物、树脂等)。可以标记核酸，例如用放射性标记或荧光标记、 或生物素标记。在将核酸用于检测技术的情况下(例如核酸是引物或作为探针的情况下)，这是特别有用的。
术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物，诸如含有经修饰的主链(例如多肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或经修饰的碱基的那些。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、探针、引物等。在本发明的核酸采取RNA形式的情况下，它可以具有或不具有5'帽。
编码本文描述的抗原的核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、扩增和复制插入的核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或包含超过一种载体类型的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，所述后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明的核酸在体内或在体外转染或感染的细胞。
当与核酸关联使用时，术语“互补”或“互补的”表示沃森-克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也可能使用碱基诸如I(嘌呤肌苷)，例如与嘧啶(C或T)互补。
编码本文描述的抗原的核酸可以用于例如：生产多肽；作为杂交探针用于检测生物样品中核酸；产生核酸的另外的拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链的寡核苷酸。
本发明提供了一种用于生产编码本文描述的抗原的核酸的方法，其中所述核酸使用化学方法部分地或完全地合成。
本发明提供了包含编码本文描述的抗原的核苷酸序列的载体(例如克 隆或表达载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。
对于本发明的某些实施方案，核酸的长度优选地是至少7个核苷酸(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300个核苷酸或更长)。
对于本发明的某些实施方案，核酸的长度优选地是多达500个核苷酸(例如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸或更长)。
菌株和变体
上面参考得自艰难梭菌菌株630的艰难梭菌ToxA和ToxB定义了抗原。ToxA和ToxB的基础参照序列可以在公开的基因数据库中容易地找到。例如，GenBank登录号AM180355是完整艰难梭菌基因组序列，并且各个ToxA和ToxB序列作为基因组序列的“特征”部分中的“基因座_标签”入口给出。在数据库中也给出了功能注解。
本发明的免疫原性组合物可用于针对由多种不同艰难梭菌菌株造成的CDAD的免疫。本发明不限于包含仅来自630菌株的片段的组合物。几个艰难梭菌菌株的序列是可得到的，包括艰难梭菌菌株R20291(SM)、艰难梭菌菌株196、艰难梭菌菌株BI1、艰难梭菌菌株BI/NAP1/027(核糖型027)、艰难梭菌菌株M120和艰难梭菌菌株M68、菌株855、菌株QCD-63q42、菌株ATCC43255的序列。可以使用标准的检索和比对技术在任何其它基因组序列中鉴别得自艰难梭菌菌株630的任何特定毒素序列的同系物。例如在菌株ATCC43255、菌株CIP107932、菌株QCD-23m63、菌株QCD-32g58、菌株QCD-37x79、菌株QCD-63q42、菌株QCD-66c26、菌株QCD-76w55、菌株QCD-97b34、菌株CD196、菌株CDBI1、菌株CDCF5、菌株CDSM、菌株CDM68、菌株CDM120或菌株R20291中。此外，可得自的艰难梭菌菌株630的序列可以用于设计引物用于扩增得自其它菌株的 同源序列。因此，本发明不限于得自该菌株的多肽，而是包括得自其它艰难梭菌菌株的这样的变体和同系物以及非天然的变体。一般而言，特定SEQID NO的合适变体包括它的等位基因变体、它的多晶型形式、它的同系物、它的直系同源物、它的旁系同源物、它的突变体等。
因而，例如，与菌株630参照序列相比，与本发明一起使用的多肽可以包括一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)氨基酸置换，诸如保守置换(即用另一个具有有关侧链的氨基酸置换一个氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。一般而言，在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物活性不具有重大影响。相对于菌株630序列，所述多肽还可以包括一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)单个氨基酸缺失。相对于TcdA和/或TcdB序列，所述多肽还可以包括一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每一个)。
类似地，与本发明一起使用的多肽可以包含这样的氨基酸序列，其：
(a)与在序列表中公开的序列相同(即100％同一性)；
(b)与在序列表中公开的序列具有序列同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)；
(c)与(a)或(b)的序列相比，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个(或更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、置换)，所述改变可以是在分开的位置，或者可以是连续的；和
(d)当用逐对比对算法与得自序列表的特定序列比对时，从N-端向C-端的x个氨基酸的每个移动窗口(使得对于延伸到p个氨基酸的比对(其中p＞x)，存在p-x+1个这样的窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其 中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；并且如果x·y不是整数，则四舍五入至最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[46]，其中使用默认参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。用EMBOSS包中的needle工具会方便地实施这种算法[47]。
一般而言，当本发明的多肽包含与得自序列表的完整艰难梭菌序列不同的序列时(例如当它包含与其具有<100％序列同一性的序列表时，或当它包含其片段时)，在每种单独情况下优选的是，所述多肽可以引起抗体，所述抗体识别它各自的毒素(TcdA或TcdB)，优选在序列表中提供的完整艰难梭菌序列。
在使用杂合多肽的情况下，所述杂合体内的各个抗原(即各个-X-部分)可以来自一种或多种菌株。例如，在n＝2的情况下，X2可以来自与X1相同的菌株，或来自不同菌株。在n＝3的情况下，所述菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X3≠X2,等。
在组(c)内，缺失或置换可以是在N-端和/或C-端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可以包括在N-端和/或C-端处缺失多达40个(或更多个)氨基酸。
免疫原性组合物和药物
在本文描述的抗原的背景下，术语“免疫原性的”用于指，该抗原能够引起针对它的来源野生型艰难梭菌蛋白的免疫应答，诸如细胞介导的应答和/或抗体应答，例如，当用于免疫受试者(优选哺乳动物，更优选人或小鼠)时。
本发明的免疫原性组合物包含根据本发明的抗原。本发明的免疫原性组合物可以用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即用于预防感染)或治疗性的(即用于治疗感染)，但是通常是预防性的。术语“保护免于感染”是指，已经激发受试者的免疫系统(例如通过疫苗接种)以触发免疫应答和排斥感染。接种疫苗的受试者因而可能受到感染，但是能够比对照受试者 更好地排斥感染。
组合物因而可以是药学上可接受的。它们经常包括除了抗原以外的组分，例如它们通常包括一种或更多种药用载体和/或赋形剂。在[48]中可得到这样的组分的彻底讨论。
通常将组合物以含水形式施用给哺乳动物。但是，在施用之前，所述组合物可以已经处于非含水形式。例如，尽管一些疫苗以含水形式制备，然后也以含水形式填充和分布和施用，将其它疫苗在制备过程中低压冻干并在使用时重构成含水形式。因此，可以干燥本发明的组合物，诸如低压冻干的制剂。
所述组合物可以包含防腐剂诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但是，优选的是，所述疫苗应当基本上不含有(即小于5μg/ml)汞材料，例如不含硫柳汞。不含汞的疫苗是更优选的。不含防腐剂的疫苗是特别优选的。
为了改善热稳定性，组合物可以包含温度保护剂。下面提供了这样的试剂的其它细节。
为了控制张度，优选的是，包含生理盐如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的，其可以以1-20mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物通常具有200mOsm/kg至400mOsm/kg的渗透压，优选240-360mOsm/kg，且更优选地落入290-310mOsm/kg的范围内。
组合物可以包含一种或多种缓冲液。典型缓冲剂包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。通常包括在5-20mM范围内的缓冲液。
组合物的pH通常为5.0-8.1，更通常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。
所述组合物优选地为无菌的。所述组合物优选地为无热原的，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。所述组合物优选地不含谷蛋白。
所述组合物可以包含用于单次免疫的物质，或者可以包含用于多次免疫的物质(即‘多剂量’试剂盒)。多剂量配置优选地包含防腐剂。作为在多剂 量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，可以将所述组合物包含容器中，所述容器具有用于取出物质的无菌接头。
通常以约0.5ml的剂量体积施用人疫苗，但是可以将一半剂量(即约0.25ml)施用给儿童。
本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。所述佐剂可以包括在下面进一步讨论的TH1佐剂和/或TH2佐剂。
可以在本发明的组合物中使用的佐剂包括、但不限于：
·矿物盐，诸如铝盐和钙盐，包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)和硫酸盐等[例如参见参考文献49的第8章和第9章]；
·水包油乳剂，诸如角鲨烯-水乳剂，包括MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span85，使用微流态化仪配制成亚微米颗粒)[参考文献49的第10章，也参见参考文献50,-,53参考文献54的第10章和参考文献55的第12章]、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；
·皂苷制剂[参考文献49的第22章]，诸如QS21[56]和ISCOMs[参考文献49的第23章]；
·病毒体和病毒样颗粒(VLP)[57-63]；
·细菌或微生物衍生物，诸如肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[64、65]、免疫刺激性的寡核苷酸[66-71]，诸如IC-31TM[72](包含26-聚体序列5'-(IC)13-3'(SEQ ID NO:28)的脱氧核苷酸和包含11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:29)的聚阳离子聚合物多肽)和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物[73-82]；
·人免疫调节剂，包括细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[83、84]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；
·生物粘着剂和粘膜粘着剂，诸如壳聚糖及其衍生物、酯化的透明质酸微球[85]或粘膜粘着剂，诸如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素[86]；
·从可生物降解的且无毒的材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成的微粒(即直径为～100nm至～150μm的颗粒，更优选地直径为～200nm至～30μm的颗粒，最优选地直径为～500nm至～10μm的颗粒)；
·脂质体[[49,87-89]的第13章和第14章；·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[90]；
·PCPP制剂[91和92]；
·胞壁酰多肽，包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰基-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)；和
·咪唑并喹诺酮化合物，包括咪喹莫特(Imiquamod)和它的同系物(例如“瑞喹莫德3M”)[93和94]。
本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以包含以上鉴定的一种或多种佐剂各个方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明中：(1)皂苷和水包油乳剂[95]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[96]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)[97]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[98]；(6)SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％吐温80TM、5％普流尼克-嵌段共聚物L121和thr-MDP，或微流态化为亚微米乳剂或涡旋以产生较大粒度的乳剂，(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种矿物盐(诸如铝盐)+LPS的无毒衍生物(诸如3dMPL)。
充当免疫刺激剂的其它物质公开于[49]的第7章。
氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的应用是特别优选的，且抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选的佐剂。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，诸如CpG和明矾，或瑞喹莫德和明矾。可以使用磷酸铝和 3dMPL的组合(已经报道这在肺炎球菌免疫中是有效的[99])。
本发明的组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。该免疫应答优选地诱导持久的(例如中和)抗体和在暴露于艰难梭菌以后可以快速地做出应答的细胞介导的免疫。
通常认为两类T细胞(CD4和CD8细胞)是启动和/或增强细胞介导的免疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可以表达CD8共受体，且通常被称作细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别在MHC I类分子上展示的抗原或与其相互作用。
CD4T细胞可以表达CD4共受体，且通常被称作T辅助细胞。CD4T细胞能够识别与MHC II类分子结合的抗原多肽。与MHC II类分子相互作用后，CD4细胞可以分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可以激活B细胞、细胞毒性的T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可以进一步分为两个在功能上不同的子集：即在它们的细胞因子和效应子功能方面不同的TH1表型和TH2表型。
活化的TH1细胞会增强细胞免疫(包括抗原特异性的CTL生成的增加)，并因此在对细胞内感染做出响应时具有特定价值。活化的TH1细胞可以分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可以通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)而导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长，TH1免疫应答也可以用于放大免疫应答。TH1刺激的B细胞可以分泌IgG2a。
活化的TH2细胞会增加抗体生成，并因此在对细胞外感染做出响应时具有价值。活化的TH2细胞可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可以导致IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产生用于将来的保护。
增强的免疫应答可以包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。
TH1免疫应答可以包括以下一种或多种：CTL的增加，与TH1免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-2、IFN-γ和TNF-β)的增加，活化的巨噬细胞的增加，NK活性的增加，或IgG2a生成的增加。优选地， 增强的TH1免疫应答包括IgG2a生成的增加。
可以使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。相对于不用佐剂的抗原的免疫接种，TH1佐剂通常引起增加的IgG2a生成水平。适用于本发明中的TH1佐剂可以包括例如皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性的寡核苷酸。免疫刺激性的寡核苷酸(诸如含有CpG基序的寡核苷酸)是用于本发明中的优选TH1佐剂。
TH2免疫应答可以包括以下一种或多种：与TH2免疫应答有关的一种或多种细胞因子(诸如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成的增加。优选地，增强的TH2免疫应答包括IgG1生成的增加。
可以使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫接种，TH2佐剂通常引起增加的IgG1生成水平。适用于本发明中的TH2佐剂包括例如，含矿物质的组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质的组合物(如铝盐)是用于本发明中的优选TH2佐剂。
优选地，本发明包括包含TH1佐剂和TH2佐剂的组合的组合物。优选地，这样的组合物会引起增强的TH1和增强的TH2应答，即，IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫接种的增加。更优选地，相对于使用单一佐剂的免疫接种(即，相对于只用TH1佐剂的免疫接种或只用TH2佐剂的免疫接种)，包含TH1和TH2佐剂的组合的组合物会引起增加的TH1免疫应答和/或增加的TH2免疫应答。
所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。优选地，免疫应答提供增强的TH1应答和增强的TH2应答中的一种或两种。
增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，所述免疫应答提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答中的一种或两种。优选地，粘膜免疫应答为TH2免疫应答。优选地，粘膜免疫应答包括IgA生成的增加。
可以将本发明的组合物制备成不同的形式。例如，可以将所述组合物制备为液体溶液或混悬液形式的注射剂。也可以制备适合在注射前溶解或 悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如低压冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备所述组合物用于局部给药，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末。可以制备所述组合物用于口服给药，例如作为片剂或胶囊剂、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地经过调味)。可以制备所述组合物用于采用细粉或喷雾进行肺给药，例如作为吸入剂。可以将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可以制备所述组合物用于鼻、耳或眼给药，例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式，设计成在即将施用给患者之前重构合并的组合物。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种低压冻干的抗原。
当在使用前即时制备组合物(例如，以低压冻干形式提供组分)并以试剂盒形式提供时，该试剂盒可以包含两个管形瓶，或者它可以包含一个已填充的注射器和一个瓶，所述注射器的内容物用于在注射前再次激活所述瓶的内容物。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学上有效量的抗原以及需要的任意其它组分。“免疫学上有效量”是指，在单次剂量中或作为一系列剂量的一部分施用给个体的对治疗或预防而言有效的量。该量随以下因素而变化：待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预见到，所述量将落入通过常规试验可以确定的相对宽范围内。如果在组合物中包含超过一种抗原，那么两种抗原可以以彼此相同的剂量或以不同的剂量存在。
如上所述，组合物可以包含温度保护剂，且该组分可能在含佐剂的组合物(特别是含有矿物质佐剂诸如铝盐的那些)中是特别有用的。如在参考文献100中所述，可以将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其冰点，例如将冰点降低至0℃以下。因此，可以将组合物储存在0℃以下但在其冰点以上以便抑制热分解。温度保护剂还允许冷冻组合物，同时保护矿物盐佐剂免于在冷冻和融化后凝聚或沉降，并且还可以在高温(例如40℃以上)保护组合物。可以混合起始水性疫苗和液体温度保护剂，使得该液 体温度保护剂形成最终混合物的1-80体积％。合适的温度保护剂应该是人施用安全的、易混溶的/可溶于水的，并且不应损害组合物的其它组分(例如抗原和佐剂)。例子包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG可以具有200-20,000Da的平均分子量。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇可以具有约300Da(‘PEG-300’)的平均分子量。
通过混合以下组分可以形成本发明的组合物：(i)水性组合物，其包含本发明的抗原组合的2种或更多种(例如2种、3种或4种)抗原，(ii)温度保护剂。然后可以将该混合物储存于例如0℃以下、0-20℃、20-35℃、35-55℃或更高温度。它可以以液体或冷冻形式储存。可以低压冻干该混合物。可替换地，通过混合以下组分可以形成所述组合物：(i)干燥组合物，其包含本发明的抗原组合的2种或更多种(例如2种、3种或4种)抗原；(ii)液体组合物，其包含温度保护剂。因此，可以利用组分(ii)重构组分(i)。
治疗方法和疫苗施用
本发明还提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：施用有效量的本发明的组合物。
本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含a)ToxB-GT抗原和TcdA抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种TcdA的多肽片段)；和/或b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段)，所述抗原用作药物，例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。特定免疫原性组合物包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含(i)ToxB-GT抗原和ToxA-P5-6抗原或(ii)ToxB-GT抗原和ToxA-B2抗原，所述抗原用作药物，例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。
本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含a)ToxB-GT抗原和TcdA抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种TcdA的多肽片段)；和/或b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段)，所述抗原用于制备在哺乳动物中引起免疫应答的药物。特定免疫原性组合物包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含(i)ToxB-GT抗原和 ToxA-P5-6抗原或(ii)ToxB-GT抗原和ToxA-B2抗原，所述抗原用于制备在哺乳动物中引起免疫应答的药物。
所述免疫应答优选地是保护性的，且优选地涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以引起加强应答。
通过用这些应用和方法在哺乳动物中引起免疫应答，可以保护哺乳动物免于艰难梭菌感染。更具体地，可以保护哺乳动物免于CDAD，包括腹泻、抗生素有关的腹泻(AAD)、腹部疼痛、发热、白细胞增多、假膜性结肠炎或中毒性巨结肠中的一种或多种。本发明的组合物对各种不同血清型的艰难梭菌是有效的。本发明的组合物可用于保护免于由艰难梭菌菌株630、B1、B1/NAP1/027(核糖型027)、R20291(SM)、196、BI1、M120M68、855、QCD-63q42、ATCC43255、CIP107932、QCD-23m63、QCD-32g58、QCD-37x79、QCD-63q42、QCD-66c26、QCD-76w55、QCD-97b34、CD196、CDBI1、CDCF5、CDSM、CDM68、CDM120或R20291等引起的CDAD。
本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分和第二组分都不是如上所述的本发明组合物，但是其中可以组合所述第一组分和第二组分以提供如上所述的本发明组合物。所述试剂盒可以进一步包括含有以下一种或多种的第三组分：说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。
所述哺乳动物优选地是人、大型兽医哺乳动物(例如马、牛、鹿、山羊、猪)和/或家养宠物(例如狗、猫、沙鼠、仓鼠、豚鼠、毛丝鼠)。最优选地，所述哺乳动物优选地是人。根据本发明的免疫原性组合物可以用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可以是小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、健康护理工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。但是，所述疫苗不仅适用于这些群体，可以用于更广泛的群体。
检查治疗性处理的效力的一种方式包括，在施用本发明的组合物以后，监测艰难梭菌感染。一种检查预防性处理的效力的方法包括，在施用本发 明的组合物以后，监测针对所述组合物中抗原的全身免疫应答(诸如监测IgG1和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(诸如监测IgA产生水平)。通常，在免疫接种之后但是在攻击之前确定抗原特异性的血清抗体应答，而在免疫接种之后和在攻击之后确定抗原特异性的粘膜抗体应答。
评估本发明组合物的免疫原性的另一种方法是重组地表达蛋白，用于通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者样品之间的阳性反应指示，该患者已经对目标蛋白产生免疫应答。该方法也可以用于鉴定免疫显性的抗原和/或抗原中的表位。
通过用疫苗组合物攻击艰难梭菌感染的动物模型(例如，仓鼠、豚鼠或小鼠)，也可以在体内确定疫苗组合物的效力。本文描述了一种这样的模型。
本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间质间隙)，或通过粘膜，诸如通过直肠、口服(例如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用，可以实现直接递送。
本发明可以用于引起全身免疫和/或粘膜免疫，优选地用于引起增强的全身免疫和/或粘膜免疫。
优选地，增强的全身免疫和/或粘膜免疫表现为增强的TH1和/或TH2免疫应答。优选地，所述增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。
可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径施用多个剂量，例如胃肠外激发和粘膜加强，粘膜激发和胃肠外加强等。通常间隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用多剂量。
可以将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)施用给患者，例如与肺炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、联合的B 型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌的联合疫苗(诸如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗等基本上同时施用。
粘膜免疫
本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含：(i)包含ToxB-GT和一种或多种TcdA的多肽片段(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或更多种TcdA的多肽片段)的多肽，和/或包含ToxA-GT和一种或多种TcdB的多肽片段(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种TcdB的多肽片段)的多肽，和(ii)细菌ADP-核糖基化毒素和/或它们的脱毒衍生物。本发明还提供了一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述哺乳动物施用有效量的这样的免疫原性组合物。
本发明的组合物的其它抗原组分
本发明还提供了进一步包含至少一种其它艰难梭菌抗原的组合物。其它艰难梭菌抗原包括例如糖抗原。使用本领域已知的标准缀合技术，可以将糖抗原缀合至本发明的肽上。用于本发明的组合物中的一种优选糖抗原是细胞壁多糖II(在本文中被称作“PS-II”)，其被认为是艰难梭菌中的保守表面抗原。PS-II重复单元的结构描述在[101]中：
[→6)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-[β-D-Glcp-(1→3]-β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Manp-(1→P]
例如，上述的多肽(诸如ToxB-GT)可以化学缀合到例如PS-II上。
本发明还提供了进一步包含至少一种不是艰难梭菌抗原的抗原的组合物。
具体地，本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的多肽和下述其它抗原中的一种或多种：
-得自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y(优选所有4种)的糖抗原。
-得自肺炎链球菌的糖或多肽抗原[例如102,103,104]。
-得自甲型肝炎病毒(诸如灭活病毒)的抗原[例如105,106]。
-得自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面抗原和/或核心抗原[例如106,107]。
-白喉抗原，诸如白喉类毒素[例如参考文献108的第3章]或CRM197突变体[例如109]。
-破伤风抗原，诸如破伤风类毒素[例如参考文献108的第4章]。
-得自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如得自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，任选地也与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3组合[例如参考文献110和111]。
-得自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)B的糖抗原[例如112]。
-脊髓灰质炎抗原[例如113,114]诸如IPV。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献108的第9、10和11章]。
-流感抗原[例如参考文献108的第19章]，诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-得自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如115]。
-得自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的蛋白抗原[例如116、117]。
-得自无乳链球菌(B群链球菌)的糖抗原。
-得自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原[例如117、118、119]。
-得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如120]。
所述组合物可以包含这些其它抗原中的一种或多种。
在必要时，可以将毒蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式将百日咳毒素脱毒[111])。
在所述组合物包含白喉抗原的情况下，还优选地包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，在包括破伤风抗原的情况下，还优选地包括白喉和百日咳抗原。类似地，在包括百日咳抗原的情况下，还优选地包括白喉和破伤风抗原。因此，DTP组合是优选的。
糖抗原优选地呈缀合物的形式。所述缀合物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白[121]、合成的多肽[122、123]、热 激蛋白[124、125]、百日咳蛋白[126、127]、得自流感嗜血杆菌的蛋白D[128]、细胞因子[129]、淋巴因子[129]、链球菌蛋白、激素[129]、生长因子[129]、得自艰难梭菌的毒素A或B[130]、铁摄取蛋白[131]等。一种优选的载体蛋白是白喉毒素的CRM197突变体[132]。
所述组合物中的抗原通常以每种至少1μg/ml的浓度存在。一般而言，任意给定抗原的浓度足以引起针对该抗原的免疫应答。
作为在本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案，可以使用编码抗原的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式)。
优选地将抗原吸附至铝盐上。
抗体
针对艰难梭菌TcdA和TcdB的抗体可以用于被动免疫法[例如133、134、135、136、137、138和139]。因此，本发明提供了本文中公开的本发明的抗原组合的对应的且特异性的抗体的组合。优选地，所述组合物包含：对ToxB-GT抗原和/或其表位特异性的抗体和对TcdA抗原和/或其表位特异性的抗体；和/或对ToxA-GT抗原和/或其表位特异性的抗体和对TcdB抗原和/或其表位特异性的抗体。提供根据本发明的抗体的组合用于同时、单独或先后施用。本发明也提供了包含这样的抗体的免疫原性组合物和药物组合物。在本文中，在本发明范围内，术语“抗体”包含本发明的抗体的组合。本发明还提供了包含本发明的抗体的组合的组合物。
本发明还提供了本发明的抗体在医学和在疗法中的用途。例如用于针对CDAD的被动免疫法。本发明还提供了一种用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括下述步骤：施用有效量的这样的组合物。如上面关于免疫原性组合物所述，这些方法和用途允许保护哺乳动物免于CDAD。具体地，本发明的抗体可以用于治疗或预防艰难梭菌感染的方法中，所述方法包括下述步骤：给所述哺乳动物施用有效量的如本文中所述的抗体的组合或包含这样的组合的组合物。在这些方法中，可以同时地、单独地或顺序地施用至少2种(例如2、3或4种)本发明的抗体。
术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子、及其能够结合抗原的片段。这些包括杂合的(嵌合的)抗体分子[140、141]；F(ab′)2和F(ab)片段和Fv 分子；非共价的异源二聚体[142、143]；单链Fv分子(sFv)[144]；二聚体和三聚体抗体片段构建体；微体[145、146]；人源化抗体分子[147-、149]；和从这样的分子得到的任意功能片段，以及通过非常规方法(诸如噬菌体展示)得到的抗体。优选地，所述抗体是单克隆抗体。得到单克隆抗体的方法是本领域众所周知的。人源化抗体或全人抗体是优选的。可以纯化或分离本发明的抗体和抗体组合。
本发明还提供了一种用于制备本发明的抗体组合的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：混合如上定义的抗体组合中的任一个组合的抗体。例如，本发明提供了一种方法，其包括混合至少2种(即2、3或4种)选自以下的抗体的步骤:(a)识别ToxA-GT抗原和/或其表位的抗体，和识别TcdB抗原和/或其表位的抗体。例如，所述方法可以包括以下步骤：混合识别ToxA-GT抗原和/或其表位的抗体，和识别TcdB抗原和/或其表位的抗体。本发明还提供了一种方法，其包括混合至少2种(即2、3或4种)选自以下的抗体的步骤：(a)识别ToxB-GT抗原和/或其表位的抗体，和识别TcdA抗原和/或其表位的抗体。例如，所述方法可以包括以下步骤：混合识别ToxB-GT抗原和/或其表位的抗体，和识别TcdA抗原和/或其表位的抗体。根据本发明的用于制备抗体混合物的方法可以包括将所述混合物配制为药物的另外的步骤。这样的方法可以进一步包括包装所述制剂用于作为药物进行贮存或分布的步骤。
概述
除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这样的技术在文献中进行了充分解释。参见，例如，[150-157等]。
在本发明涉及“表位”的情况下，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。可以凭经验鉴定这样的表位(例如使用PEPSCAN[158、159]或类似的方法)，或可以进行预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[160]、基于矩阵的方案[161]、MAPITOPE[162]、TEPITOPE[163、164]、神经网络[165]、OptiMer和EpiMer[166、167]、ADEPT[168]、T位点[169]、亲水性[170]、抗原指数[171]或在[172-176等]中公开的方法)。表位是抗原的被 抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的部分，也可以被称作“抗原决定簇”。
在该文件中使用的术语“抗原”和“氨基酸序列”应当用于包括对以上序列中的每一个以及对它们的片段、同系物、衍生物和变体的提及。术语“毒素”表示有毒的物质、特别是蛋白，其由活细胞或生物体产生，且能够在引入受试者的组织中时造成疾病，且经常能够在受试者中诱导中和抗体或抗毒素的产生。
术语“类毒素”表示，已经经历“脱毒”或“类毒素化”(例如通过重组方式、通过化学修饰等)、但是已经维持它的与抗-毒素抗体结合或诱导抗-毒素抗体产生(例如当施用给受试者时)的能力的毒素或其片段。
术语“中和滴度”表示，包含抑制或中和传染体(例如毒素)的生物学效应的“中和肽”或“中和抗体”的组合物。
在抗原“结构域”缺失的情况下，这可能涉及信号多肽、细胞质结构域、跨膜结构域、细胞外结构域等的缺失。
术语“包含”包括“包括”以及“由...组成”，例如，“包含”X的组合物可以排它地由X组成，或者可以包含其它物质，例如X+Y。
术语”由……组成”是指“包括且限于”。
术语”基本上由……组成”是指，所述组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分，但是只有当所述另外的成分、步骤和/或部件不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础特征和新颖特征时。
与数值x相关的术语“约”是指例如x±10％。
对两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比的提及表示，当进行比对时，所比较的两个序列中相同的氨基酸的百分比。使用本领域已知的软件程序，例如在参考文献177的7.7.18部分中描述的那些，可以进行该比对并确定同源性或序列同一性百分比。通过Smith-Waterman同源性检索算法确定优选比对，所述算法使用仿射缺口检索，其中缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。在参考文献178中公开了Smith-Waterman同源性检索算法。
附图说明
图1.在该研究中使用的重组毒素片段的示意图。除了在桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中表达的ToxA_GT以外，在大肠杆菌中表达所有多肽。ED＝酶促结构域；GT＝葡萄糖基转移酶结构域；CP＝半胱氨酸蛋白酶结构域；T＝易位结构域；B＝结合结构域。除了不溶性的TcdA的T4和PTA2结构域以外，所有结构域是可溶性的。
图2.将ToxA-B2设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的6个。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。
图3.将ToxA-B3设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的12个。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。
图4.将ToxA-B5设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的10.5个。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。
图5.将ToxA-B6设计成包括13个假定的形成结合结构域的结构单元中的11.5个。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdA结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。
图6.将ToxB-B2设计成包括9个假定的形成结合结构域的结构单元中的4个。使用C-端片段的晶体结构作为模板，通过计算机建模，预测TcdB结合结构域的三维结构(参见参考文献41，PDB代码2F6E)。
图7.B4杂合体的示意图。将ToxB_GT(SEQ ID NO:18)经由接头肽(SEQ ID NO:25)与ToxA-P5-6(SEQ ID NO:11)融合。
图8.总结了用于鉴别候选物片段的实验策略的程序框图。
图9.通过ELISA确定的、针对TcdA(A)和TcdB(B)的子结构域的抗体的几何平均滴度(GMT)。
图10.体外中和实验的实施例，所述实验显示了TcdA/B诱导的细胞圆化和针对ToxA_B2+ToxB-GT的血清的中和。
图11.在仓鼠研究中使用的毒素结构域片段的示意图。ED＝酶促结 构域；GT＝葡萄糖基转移酶结构域；CP＝半胱氨酸蛋白酶结构域；T＝易位结构域；B＝结合结构域。
图12.类毒素A+类毒素B。在粪便中的平均细菌脱落。用B1攻击。
图13.类毒素A+类毒素B-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
图14.ToxB_B+P5_6-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
图15.在图29中提供的数据的图解表示。
图16.得自用P5_6+ToxB_B或对照免疫的仓鼠的100mg粪便中的艰难梭菌孢子的细菌脱落。用B1菌株攻击。
图17.P5_6+ToxB_B或对照。用B1菌株攻击。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
图18.使用ToxB_GT+P5+6的免疫。在接种疫苗的动物的粪便中的定殖/(仓鼠(上图)和平均(下图))。用630菌株攻击。
图19.ToxB_GT+P5_6最终定殖结果。用630菌株攻击。
图20.ToxB_GT+P5_6。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用B1菌株攻击。
图21.ToxB_GT+P5_6。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用B1菌株攻击。
图22.ToxA-P5-6+ToxB_GT(减小的剂量)。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用B1菌株攻击。
图23.ToxA-P5-6+ToxB_GT(减小的剂量)。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠； “LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用B1菌株攻击。
图24.使用ToxB_GT(PSII)+P5_6的免疫。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用630菌株攻击。一些动物失去了特定时间点，例如在动物于收集当天不能产生粪便(特别是在腹泻阶段以后)或在特定时间点具有腹泻的情况下。
图25.得自存活的接种疫苗的动物(ToxB_GT(PSII)+P5_6(H1-H6)或ToxB_GT+P5_6(H7-8))的粪便中脱落的艰难梭菌的平均数目。
图26(a和b).ToxB_GT(PSII)+P5_6结果-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
图27.ToxB_GT+ToxA_B2。随时间(天)在接种疫苗的动物的粪便中的定殖。用B1菌株攻击。
图28(a和b).ToxB_GT+ToxA_B2。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用B1菌株攻击。
图29.ToxB_GT+ToxB_B+P5_6。接种疫苗的动物的粪便中的平均定殖。
图30.ToxB_GT+ToxB_B+P5_6。用B1攻击。在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。
图31.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-100mg粪便中的艰难梭菌孢子的平均细菌脱落。用B1攻击。
图32.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-在淘汰时的定殖。用B1攻击。
图33.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)-100mg 粪便中的艰难梭菌孢子的平均细菌脱落。用B1攻击。
图34.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染分析-细菌的局部化(x＝轴是位置：“Col”＝结肠；“Cae”＝盲肠；“LA”＝有关的内腔；“TA”＝有关的组织。Y＝轴是艰难梭菌的数目(CFU/ml))。用B1攻击。
图35.克林霉素处理以后的微生物菌群变化。
图36.在接种疫苗的动物中对微生物丛的改变。
图37.重组纯化的片段的SDS-PAGE凝胶。
图38.抗-ToxA(A)和ToxB(B)IgG滴度(UE/mL)，添加明矾或MF59作为佐剂。用重组ToxA(A)和ToxB片段(B)免疫小鼠以后的IgG应答。通过ELISA测量得自小鼠的血清中的抗毒素A和毒素B IgG滴度，所述小鼠用每种片段和Al(OH)3(对中的左列)或MF59(对中的右列)佐剂腹膜内地免疫。将结果显示为至少3个实验的几何平均值±SD。
图39：得自仓鼠的盲肠样品中针对毒素A(A)和毒素B(B)的IgG抗体，所述仓鼠用ToxA-P5-6+ToxB-GT接种疫苗。在过滤的盲肠样品上进行斑点印迹，所述盲肠样品取自感染急性期(攻击后48小时)(仓鼠1-2)和实验端点(攻击后14天)(仓鼠3-8)的接种疫苗的动物。对照动物仅用佐剂处理并在相同实验条件中感染(仓鼠9-10)。
图40：用ToxA-P5-6+ToxB-GT组合接种疫苗的仓鼠中的毒素A和B水平。值是细胞圆化所需的稀释倍数。过滤的盲肠样品取自感染急性期(攻击后48小时)和实验端点(攻击后14天)的接种疫苗的动物。对照动物仅用佐剂处理并在相同实验条件中感染。
具体实施方式
发明人鉴别出了TcdA和TcdB的重组片段，其可以用作免疫原用在预防CDAD的疫苗中。
片段
在图8中提供了实验方案的示意图。发明人设计了一组基于毒素的TcdA和TcdB片段(11种TcdA片段和6种TcdB片段)。在图1中描述了 在该研究中使用的基于毒素的片段。选择这些片段来覆盖尽可能远的TcdA和TcdB的完整长度，并基于它们的晶体结构来确定这些片段的边界。在ToxA和ToxB的细胞结合结构域(概要参见图1)的情况下，使用计算机模型。通过使用重组技术，可能使用表达系统(例如大肠杆菌、桥石短芽孢杆菌等)来容易地产生多肽片段，并且其比灭活的类毒素更稳定和更耐受降解，同样还避免许多关于灭活类毒素的应用的安全性担忧。将在实施例中使用的包含ToxA-GT或ToxB-GT的片段脱毒。在图37中显示了用于免疫接种的肽的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。
重组毒素片段的克隆、表达和纯化
使用聚合酶不完全引物延伸(Polymerase Incomplete Primer Extension，PIPE)方法，将序列克隆进pet15b+载体(Nterm-HIS标签)中。正常的PCR产生不完全延伸产物的混合物。使用简单引物设计，将短重叠序列引入在这些不完全延伸混合物的末端，这允许互补链对合和产生杂合的载体/插入物组合。将所有杂合体直接转化进大肠杆菌HK100受体细胞中。选择单个氨苄西林抗性菌落，并通过菌落PCR检查重组质粒的存在。用从阳性克隆(ToxA_GT，在桥石短芽孢杆菌中表达)纯化的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将ToxA-p5-6抗原表达为包含SEQ ID NO104的N-端氨基酸序列和SEQ ID NO105的C-端氨基酸序列的杂合多肽。该杂合多肽的氨基酸序列显示在SEQ ID NO111中。SEQ ID NO:111由SEQ ID NO:112的核酸序列编码。
采用PIPE方法来制备具有废除的酶活性的ToxA-GT(Y283A、D285A、D287A)、TcdA-CP(D589A、H655A和C700A，相对于SEQ ID NO:1编号)、ToxB-GT(D270A、R273A、Y284A、D286A和D288A)和ToxB-CP(D587A、H653A和C698A)突变体。
如下诱导蛋白表达：在指数生长期中，将1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)加入到培养物中，随后在25℃温育4小时。将细胞提取物加载上SDS-PAGE凝胶以检查蛋白表达(数据未显示)。
对于ToxA_GT，将野生型艰难梭菌毒素A的催化域(残基1-541)克隆进pNI-His载体(Takara Bio)中。进行定位诱变，以得到(Y283A、D285A、 D287A)ToxA-GT突变体。将质粒电穿孔进桥石芽孢杆菌(B.choshinensis)HPD31-SP3菌株(Takara Bio)中。将桥石芽孢杆菌表达细胞在TMNm中在25℃、1600rpm培养48小时。通过IMAC色谱法纯化蛋白，并使用PD-10脱盐柱(GE)将其缓冲液交换进PBS中。通过BCA测定，进行蛋白定量。
对于一些实验，在还原端化学修饰重复单元的甘露糖以后，将PSII缀合至2种不同的载体蛋白(艰难梭菌重组蛋白：ToxA_B2和ToxB_GT)。第一步是在10mM NaPi缓冲液(pH9.0)中在室温用50mM NaBH4(Sigma)还原甘露糖2小时；将还原的PSII通过Sephadex G25色谱法(G&EHealthcare)在水中纯化，然后用15当量的NaIO4(Sigma)在10mM NaPi缓冲液(pH7.2)中在室温在暗处氧化2小时。然后将氧化的PSII通过Sephadex G25色谱法(G&E Healthcare)在水中纯化。然后使用4:1(PSII重量/蛋白重量)的化学计量学，在200mM NaPi/1M NaCl缓冲液(pH8.0)中和在有NaBH3CN(2:1,PSII重量/NaBH3CN重量)存在下，将氧化的PSII(10mg/ml)缀合至载体蛋白。将混合物在37℃温育48-72小时，用磁力搅拌器非常轻柔地混合。使用尺寸排阻Superdex75色谱法(G&E Healthcare)在10mM NaPi/10mM NaCl缓冲液(pH7.2)中，从多余的未缀合的PSII中纯化缀合物。使用7％Tris-乙酸盐凝胶(NuPAGE，得自Invitrogen)在NuPAGE Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(20x,Invitrogen)中通过SDS-PAGE表征缀合物。通过MicroBCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)确定蛋白浓度。通过HPAEC-PAD分析确定总糖浓度。将未缀合的糖通过SPE C4疏水相互作用柱(0.5mL树脂,Bioselect,Grace Vydac)分离，并随后通过HPAEC-PAD分析进行估测。
类毒素A和类毒素B的纯化和灭活
将艰难梭菌菌株VPI10463孢子储备物接种在BHIS平板(补充了酵母浸出物[5mg/ml]和L-半胱氨酸[0.1％]的脑心浸液)上，并在36℃温育2天。将菌落从制备的平板添加至胰蛋白胨-酵母浸出物-甘露醇(TYM)培养基中，并在厌氧室中在35℃温育16小时。将200μl90％甘油与800μl艰难梭菌培养物(在590nm为1OD)一起加入1-ml冷冻瓶中。立即将该瓶放入-80℃冰柜中进行贮存。将100μl甘油储备物加入10ml TYM培养基中并 在厌氧室中在35℃温育16小时。给每1毫升胰蛋白胨-酵母浸出物(TY)培养基接种种子培养物(1/100稀释度)。将培养物在厌氧室中在35℃温育5天。然后将样品在4℃在3000g离心15分钟，并穿过0.22μm孔径过滤器过滤。然后通过切向流过滤浓缩上清液。
级分I：AS50
在0℃历时2h将80.03g硫酸铵加入到在胰蛋白胨酵母浸出物培养基(265ml)中的、得自菌株VPI10463的6倍浓缩的培养物上清液(50％饱和度)中。继续在0℃搅拌3h，然后通过在4℃在10000rpm离心30分钟使沉淀物沉淀。将沉淀物再悬浮于缓冲液A中并在4℃通过2次缓冲液更换(A：50mM Tris-HCl，pH7.5，50mM NaCl；B：50mM Tris-HCl，pH7.5，1M NaCl)(2x1l)进行透析，得到27ml(级分I)终体积的浓度为6.118mg/ml的mini BCA。
级分II：HiTrap Q HP，pH7.5
通过在2x5ml HiTrap Q HP柱(串联)上的色谱法，分离ToxA和ToxB。以2ml/min，施加30柱体积的从0至100％B的线性梯度。ToxA在20％B附近洗脱，ToxB在50％B附近洗脱(数据未显示)。在Tris-乙酸盐缓冲液中在7％PAA凝胶上分析20μl级分I、4、14-44(数据未显示)。
级分IIIb：HiTrap Q HP，pH5.0
通过在HiTrap Q HP上的色谱法在pH5.0进一步纯化ToxB(级分IIb)。缓冲液包括C：20mM哌嗪-HCl，pH5.0，50mM NaCl；D，20mM哌嗪-HCl，pH5.0，1M NaCl。施加分段梯度：30-60％D,15柱体积。ToxB在40％D洗脱(数据未显示)。在7％PAA凝胶上在Tris-乙酸盐缓冲液中分析10μl每种级分(数据未显示)。
级分IIIa：HiTrap Q HP，pH7.5
以2ml/min将30柱体积的B施加于2-20％的分段梯度。ToxA在15％B附近洗脱。在7％PAA凝胶上在Tris-乙酸盐缓冲液中分析20μl每种级分(数据未显示)。将洗脱液(Pool)在2l50mM Tris-HCl、50mM NaCl中在4℃透析过夜。终体积：52ml(级分IIIa)。
进行最终的质量控制。
对蛋白质印迹，将制品加载到7％Tris乙酸盐SDS-PAA凝胶上，并使用I-Blot机器转移至硝酸纤维素(12min转移)。将膜在TBST中洗涤3次，并用1％BSA(Promega)在TBST中封闭过夜。以1:5000在TBST中加入第一抗体保持1h。将膜在TBST中洗涤3次各5min。以1:8000在TBST中加入第二抗体(Promega抗-兔AP缀合物)保持45min。将印迹在TBST中洗涤3次并在MilliQ水中洗涤2次各5min。将印迹在稳定化的AP底物(Promega)中显影20秒(数据未显示)。
发现ToxA和Tox B制品完全没有交叉污染。
为了持久贮存，进行透析。透析缓冲液包含50mM Tris-HCl、500mM NaCl和10％甘油。通过2次500ml缓冲液更换，透析样品。在透析以后定量样品(数据未显示)。
类毒素的脱毒
将制品在PBS中透析。Tris可以与甲醛反应。从1.5mg每种蛋白(ToxA:1.5mg对应于9.375ml(9.7ml)，和ToxB:1.5mg对应于4.411ml(4.5ml))开始。将样品在1l每种PBS中在4℃透析40h。将Tox A在20％的PEG20.000于PBS中的溶液中透析4h。体积减小至3.7ml。
ToxA和ToxB的甲酰化
ToxA和B的分子量：是大约300kDa。制品包括0.25mg/ml ToxA和o.35mg/ml ToxB。溶解素储备物包含1M的赖氨酸.HCl在PBS中的溶液。在下面的表1(a和b)中包括了总结:
表1(a).类毒素A制剂的总结
表1(b).类毒素B制剂的总结
在37℃在旋转振荡器上120h以后，各自抽取1ml，并在2x500ml PBS中透析2x24h。使用基于细胞的毒性测定，证实样品为活化的(数据未显示)。
小鼠的免疫
然后用片段免疫小鼠，以确定所述片段是否是免疫原性的。
对于每种抗原，使用2组各8只雌性CD1小鼠。用10ug抗原(在明矾佐剂(组1)或弗氏佐剂中配制)免疫每个组。在第0、21和35天腹膜内地进行免疫。在第49天进行最终的抽血和淘汰。然后通过ELISA确定用毒素片段免疫的小鼠的总抗体应答。用TcdA和TcdB包被微孔滴定板，并与针对片段的抗体、继之以碱性磷酸酶缀合的第二抗体一起温育。加入底物(磷酸对硝基苯酯或pNPP)以后，通过平板读数器在405/620-650nm的双波长分析平板。经由针对参考标准曲线的内插，定量抗体滴度。
显示用毒素片段免疫的小鼠的总抗体应答的ELISA研究显示在图9中。令人感兴趣的是，ToxB-GT片段具有与全长TcdB-ED结构域一样的免疫原性。除了ToxA-CP以外，所有毒素片段都是免疫原性的。IgG应答(用明矾或MF59作为佐剂)显示在图38中。
体外细胞圆化中和测定
体外中和测定是基于以下证据：艰难梭菌毒素会使肌动蛋白细胞骨架失稳，从而造成具有典型细胞圆化的细胞病变效应。抗-毒素抗体可以中和细胞毒性，从而阻止细胞圆化。因此，使用免疫血清来评价所述片段的在体外中和TcdA和TcdB的毒性效应的能力。
将人成纤维细胞(IMR-90)培养至80-90％汇合。每个细胞系对毒素具有不同的敏感性，所以确定了在24小时中造成100％细胞圆化所需的最小TcdA和TcdB剂量(CTU100)。将CTU100确立为20ng/mL(对于TcdA)和10pg/mL(对于TcdB)。将1:8至1:32,000的2倍血清稀释液与1CTU100的每种毒素一起在37℃预温育90min。然后将血清+毒素的混合物加给细胞，随后在16-18小时以后观察。端点滴度代表能够抑制细胞圆化的最高 稀释度的倒数。阳性对照是血清α-类毒素A和B，阴性对照是免疫前血清和得自仅用佐剂处理的小鼠的血清。
结果
中和滴度总结在表2和3中，典型中和实验的结果显示在图10中。发现ToxA结合结构域的可溶性片段会诱导强中和抗体，无论它们是否用MF59或明矾作为佐剂。不溶性片段ToxA-PTA2,ToxA-CP和ToxA-T4不会诱导中和抗体。ToxA-CP(其没有被鉴别为免疫原性的)也不会诱导中和抗体。针对ToxA产生的血清没有交叉中和ToxB(表2)。
表2.针对TcdA的子结构域产生的血清的中和滴度(用“/”表示实验重复中的差异)。
表3.针对TcdB的子结构域产生的血清的中和滴度。*指示50％中和(用“/”表示实验重复中的差异)。
ToxB-B、ToxB-ED和ToxB-GT诱导弱中和抗体应答，其类似于当用MF59或明矾作为佐剂时。相反，Tox-B2、ToxB-B7、ToxB-CP不会诱导 中和抗体。针对ToxB产生的血清不会交叉中和ToxA(表3)。
因而，针对TcdA的抗体不能交叉中和TcdB，反之亦然。
小鼠免疫接种研究(上面)和得自体外细胞圆化测定的结果共同地提示，TcdA和/或TcdB的ED的N-端区域(即GT结构域)是免疫原性的，且对于引起针对它各自的毒素的中和抗体而言是重要的。此外，由ToxB-GT片段(以及ToxB-ED片段，其包含ToxB-GT序列)诱导的中和抗体应答与使用TcdB的大多数结合结构域(即ToxB-B片段)得到的中和抗体应答相同或者优于后者。
还进行了毒性试验，以证实与天然全长毒素B相比，ToxB-GT中的D270A、Y284A、D286A和D288A突变是否会导致毒性的降低。使用上述的测定方案，试验了从20ng/ml至40ugr/ml范围内的10种浓度的范围。与突变的ToxB-GT一起温育的成纤维细胞在试验的浓度没有表现出任何形态学改变，而10pg/ml的天然全长毒素B在相同实验条件下造成细胞圆化(数据未显示)。因此，D270A、Y284A、D286A和D288A突变会导致在试验的实验条件下的毒性丧失。
片段的组合
为了确定是否可能得到能够诱导毒素A和毒素B的伴随中和的血清，发明人然后组合了最有前途的毒素片段。在表4中总结了针对所述毒素组合的血清的中和滴度。
表4.针对TcdA和TcdB的单个子结构域的组合产生的血清的中和滴度(用“/”表示实验重复中的差异)。
发明人发现，针对几种试验组合的抗体能够交叉中和TcdB，反之亦然。相反，P5_6+ToxB-B2、ToxA_B2+ToxB-B7、ToxA_B3+ToxB_B2和ToxA_B6+ToxB-B7的组合没有交叉中和。ToxA-P5_6+ToxB-B和ToxA-B2+ToxB-GT作为最有前途的片段组合出现，进一步突出了ToxB-GT在功能上替代ToxB-B区域的能力。
令人感兴趣的是，所有包含ToxB-GT的组合能够象包含TcdB的大多数结合结构域(即ToxB-B)的等效组合一样诱导针对毒素A和毒素B和组合的中和滴度。
嵌合蛋白
发明人设计了将不同TcdA和TcdB结构域组合成单个多肽的嵌合蛋白(总结在表5中)。在“B1”中，ToxB-ED是ToxA-P5-6的N-端；在“B1小”中，ToxB-CP是ToxA-P5-6的N-端；在“B4”中，ToxB-GT是ToxA-P5-6的N-端。使用这些嵌合体在与片段相同的实验条件下进行了体外中和研究。结果总结在表5中。3种含有与TcdB的酶促结构域融合的p5_6片段的嵌合蛋白诱导的血清能够中和TcdA，但是不能中和TcdB。令人感兴趣 的是，由p5_6诱导的ToxA中和活性在3种p5_6嵌合体之间是可变的。这可能是由于折叠和/或免疫原性的变化。类似地，含有TcdA和TcdB的结合结构域片段的B4嵌合体诱导的抗体具有针对TcdA的有效中和活性，但是对TcdB没有(表5)。
表5.针对嵌合蛋白产生的血清的中和滴度.
这些数据提示，包含以下多肽的组合的组合物具有比包含得自ToxA和ToxB的序列的嵌合多肽更好的性能：a)多肽，其包含ToxB-GT和一种或多种TcdA的多肽片段，或b)多肽，其包含ToxA-GT和一种或多种TcdB的多肽片段。
在仓鼠中的效力试验
仓鼠免疫研究通常包括10只叙利亚金色仓鼠。在每组内，在第1、14、28和36天经由腹膜内(i.p.)途径用4剂抗原(在MF59佐剂中配制的50ug每种抗原)免疫6只仓鼠。总是包括2只未处理的动物和2只接种单独MF59佐剂的动物作为阴性对照。在第60天，将所有仓鼠用克林霉素(30mg/kg仓鼠体重)处理以除去肠共生菌群。12小时以后，通过经口管饲大约250个艰难梭菌孢子来攻击动物。在攻击后持续14天，监测体温和临床征状(诸如腹泻)的存在。将体温下降至35℃作为实验的人道端点，在此点将动物淘汰。使用在感染前3周插入动物体腔中的芯片，通过遥测法测量体温。表6显示了用B1或630菌株感染以后体温下降2℃之前的时间(对于每种艰难梭菌菌株，评估5只仓鼠)。
表6.从B1菌株或630菌株感染至仓鼠体温下降2℃的时间
| 仓鼠 | 感染的B1 | 感染的630 |
| 1 | 31小时 | 46小时 |
| 2 | 33小时30min | 49小时 |
| 3 | 33小时45min | 48小时45min |
| 4 | 32小时30min | 46小时30min |
| 5 | 32小时 | 45小时50min |
感染后分析包括证实，仓鼠已经被感染菌株特异性地感染(使用多基因座变量串联重复分析(MVLA)，基于得自7个重复区域的带型)、以及粪便和肠中的细菌计数。
没有发现感染会干扰抗-毒素免疫应答，因为在攻击之前收集的、得自用ToxA-B2+ToxA-GT+ToxB-B3+ToxB-GT突变体接种疫苗的动物的样品血清表现出与攻击以后测得的那些结果可比较的中和滴度(数据未显示)。
还对接种疫苗的仓鼠和对照仓鼠进行了终末定殖分析。当达到35℃的体温端点时，在第2天(攻击后)淘汰对照动物。在第15天(攻击后，在实验结束时)淘汰接种疫苗的动物。取出肠，并对确定的回收细菌进行细菌计数。为了计算总细菌负载(孢子和营养细胞)，纵向打开每个切片，并通过在2次10ml PBS更换中轻轻洗涤来除去内容物。使用Stomacher将组织在5mlPBS中匀浆化1min，并确定匀浆物的活菌计数。将系列10倍稀释物铺板在含有20g/ml两性霉素B的CCFA血液琼脂平板上以抑制酵母生长。为了估测存在于样品中的孢子的数目，将样品在56℃加热10min，并通过如上所述的活菌计数方法来确定存在的孢子的数目。没有与粘膜层亲密结合的生物体在本文中被描述为“腔结合的”(LA)。更亲密地结合(即通过简单洗涤没有除去)的生物体在本文中被描述为“组织结合的”(TA)。
还进行了肠中毒素含量的评估。将肠洗液穿过0.22μm过滤器过滤以除去细菌细胞。然后将过滤的洗液以10倍递增浓度(对于结肠，5倍)放在汇合的Vero细胞上保持24小时。温育以后，将细胞洗涤、固定，然后用吉姆萨染液染色。如果毒素存在的话，那么细胞圆化会造成颜色的脱离和缺失。毒素含量数据代表细胞保持附着(染色)时的稀释度。
然后在仓鼠模型中试验了许多毒素结构域片段。在图11中提供了试验的片段的细节。在表7中提供了抗原组合的细节和得到的结果的概要。在下面更详细地描述了得自每个试验的结果。
表7.仓鼠疫苗接种实验的总结.1＝导致增加的体积和更高测得孢子数的技术问题.
在这些研究中使用2种不同的艰难梭菌菌株，即630菌株(基因组序列可在NCBI公开得到)和B1菌株。已知630菌株会造成延长的感染，具有严重性更低的病理学和减少的量的体内毒素。已知B1菌株会在仓鼠中造成严重病理学(G.Douce,个人通信)，具有急性感染和高水平的损伤。
类毒素A+类毒素B
将全长灭活的类毒素A和类毒素B的组合用作阳性对照。可以认为该组合代表用于与本发明的组合进行对比的“黄金标准”(参见参考文献179和180)。使用发酵来生产类毒素，然后纯化，并最后灭活。
6只动物接受5μg每种类毒素(用MF59作为佐剂)。2只仅接受佐剂，且2只不处理。基于文献来选择要施用的量。使用灭活的类毒素(例如用甲 醛)的主要问题是，灭活是不完全的，因而在应用于受试者时造成潜在健康风险。
用B1菌株攻击动物。所有对照动物死亡，一只接种疫苗的动物(H1)在最后一只对照动物之后不久死亡，表现出与对照类似的体温特性(数据未显示)。所有其它接种疫苗的仓鼠存活至实验结束(表8)。
表8.全长灭活的类毒素A+类毒素B的结果.用B1攻击。
| 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 | ||
| H1 | 疫苗 | 45小时50分 | 34.17℃ |
| H2 | 疫苗 | 44天 | |
| H3 | 疫苗 | 14天 | |
| H4 | 疫苗 | 14天 | |
| H5 | 疫苗 | 14天 | |
| H6 | 疫苗 | 14天 | |
| H7 | 疫苗 | 29小时10分 | 31.98℃ |
| H8 | 疫苗 | 31小时1分 | 32.58℃ |
| H9 | 疫苗 | 30小时36分 | 34.25℃ |
| H10 | 疫苗 | 28小时37分 | 31.3℃ |
仓鼠H2、H3和H4在恢复期中表现出腹泻的短发作，且H5表现出更长的腹泻和嗜睡阶段。给H5施用再水合疗法(皮下施用盐水)，这导致另一次腹泻发作，随后恢复。因此，发现用全长类毒素免疫会针对B1菌株保护83％的仓鼠。
细菌脱落分析揭示，CFU在攻击后的几天(第5、9和11天)中从接种疫苗的动物脱落，即使当征状(腹泻)消失时。H5发生脱水，所以在第5天难以检测任何粪便团粒，所以，仅在9和11天以后分析脱落。在11天以后，H4在粪便中不具有可检测的艰难梭菌(图12)，尽管该动物在实验结束时仍然定殖在肠道中。在图13中提供了在淘汰时的定殖的分析。
肠中的毒素B含量评估揭示，与在2天后死亡的对照相比，在15天以后在存活的接种疫苗的仓鼠的肠中存在更少的毒素B(表9)。在结肠中也证实了该结果(表10)。H1是接种疫苗的仓鼠，其在感染的急性期中死亡，且存在高水平的毒素B，其等于死亡的对照动物中存在的毒素B的水平。
表9.类毒素A+类毒素B-盲肠中的毒素含量.用B1攻击。将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | 类毒素A+类毒素B | 108 |
| H2 | 类毒素A+类毒素B | 101 |
| H3 | 类毒素A+类毒素B | 101 |
| H4 | 类毒素A+类毒素B | 0 |
| H5 | 类毒素A+类毒素B | 101 |
| H6 | 类毒素A+类毒素B | 101 |
| H7 | 仅佐剂 | 105 |
| H8 | 仅佐剂 | 107 |
| H9 | 无 | 104 |
| H10 | 无 | 106 |
表10.类毒素A+类毒素B-结肠中的毒素含量.用B1攻击。将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | 类毒素A+类毒素B | 1∶390625 |
| H2 | 类毒素A+类毒素B | 0 |
| H3 | 类毒素A+类毒素B | 0 |
| H4 | 类毒素A+类毒素B | 0 |
| H5 | 类毒素A+类毒素B | 1.5 |
| H6 | 类毒素A+类毒素B | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 1∶125 |
| H8 | 仅佐剂 | 1∶3125 |
| H9 | 无 | 1∶15625 |
| H10 | 无 | 1∶15625 |
总之，使用5μg全长类毒素A和全长类毒素B的疫苗接种会导致针对严重疾病对6只动物中的5只的保护。但是，疫苗接种不会保护免于腹泻，就H5而言，所述腹泻持续相对较长的时间。在实验结束时，在接种疫苗的动物中可检测出较低量的孢子，并且3只动物也表现出较低的定殖水平。并且，在实验结束时在接种疫苗的动物中检测出非常低量的毒素B，尽管它们仍然被定殖。这可以通过例如抗体的毒素结合和/或细菌毒素表达的减少来解释。
ToxA-P5_6或ToxB_B的各个片段
首先使用分别与TcdA和TcdB的细胞结合结构域的部分对应的P5_6或ToxB_B的单个片段(用MF59作为佐剂的50ug抗原)，进行使用重组片 段的疫苗接种试验。在两种情况下，没有观察到针对用大约100个B1菌株孢子攻击的保护(数据未显示)。在实验端点时从所有动物进行样品抽血。如通过ELISA测得的，所有用ToxA-P5_6免疫的动物具有针对p5-6蛋白和毒素A的高抗体滴度(数据未显示)，但是这些抗体不是抗感染保护性的。没有评估毒素A中和能力。如通过ELISA测得的，所有用ToxB_B免疫的动物具有针对ToxB_B蛋白的高抗体滴度(数据未显示)。没有足够的纯化的毒素B用于试验这些针对完整毒素B的血清的致反应力。这些抗体不是抗感染保护性的，没有评估毒素B中和能力。因而，各种抗原没有表现出保护性，尽管存在抗体。
P5_6和ToxB_B的片段的混合物
然后用50μg P5_6和50μg ToxB_B的混合物(用MF59作为佐剂的50ug每种抗原)免疫仓鼠，随后用菌株630攻击(结果显示在表11中)。
表11.用P5_6+ToxB_B免疫仓鼠.攻击菌株630.*＝在恢复期表现出间歇腹泻的仓鼠。攻击菌株是630。
| 仓鼠 | 免疫原 | 到达端点的时间 | 到达端点的时间 |
| 1 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天 | |
| 2 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天 | |
| 3 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天 | |
| 4 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天* | |
| 5 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天* | |
| 6 | ToxB_B+P5_6 | 存活9天 | |
| 7 | 单独的MF59 | 34小时36分 | |
| 8 | 单独的MF59 | 32小时36分 | |
| 9 | 无 | 65小时44分 | |
| 10 | 无 | 33小时36分 | |
| 平均值 | 41小时40分 |
接种疫苗的动物被完全保护免于死亡，但是存活者在恢复期中表现出轻度腹泻。感染后分析显示在表12和图14中。表12表明，得自接种疫苗的小鼠的粪便物中的艰难梭菌的量在多达1周内保持较高，从而指示抗毒素应答不会影响定殖。
表12.ToxB_B+P5_6-在粪便物中回收的艰难梭菌的感染后分析.*＝ND＝细菌不可检测出。
但是，细菌计数随时间下降，并且可以在感染后14天内完全清除。图14显示了细菌的局部化，并揭示，在实验端点，与接种疫苗的仓鼠相比，对照具有更高水平的腔和组织相关的细菌。通过MVLA证实，感染后回收的细菌是艰难梭菌菌株630(数据未显示)。
因此，P5_6和ToxB-B的组合提供了针对艰难梭菌攻击的强保护。令人感兴趣的是，抗毒素应答似乎不会显著影响定殖，因为所有动物在例如攻击后6天保持被重度定殖。这些数据也提示，ToxA和ToxB(至少其片段)的组合是保护所必需的。
P5_6和ToxB_B
考虑到针对菌株630的成功免疫，发明人试验了用P5_6+ToxB_B免疫是否会保护免于更产生毒素的B1菌株。将6只动物用50ug每种抗原(用MF59作为佐剂)免疫，随后用103个B1菌株孢子攻击。作为对照，2只动物接受单独的佐剂(H7-H8)，且2只动物不接受疫苗接种(H9-H10)。攻击后，所有对照动物死亡。一只接种疫苗的动物(H1)在最后一只对照动物之后不久死亡。所有其它接种疫苗的动物(H2-H6)存活至实验结束(表13)。这表明，83％的接种P5/6+ToxB_B的动物被保护免于B1菌株攻击(也由图15表示)。
表13.P5_6+ToxB_B结果.用B1菌株攻击。
| 动物 | 免疫原 | 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 |
| H1 | 疫苗 | 33小时2分 | 34.16℃ |
| H2 | 疫苗 | 15天 | |
| H3 | 疫苗 | 15天 | |
| H4 | 疫苗 | 15天 | |
| H5 | 疫苗 | 15天 | |
| H6 | 疫苗 | 15天 | |
| H7 | 仅佐剂 | 32小时5分 | 34.87℃ |
| H8 | 仅佐剂 | 29小时50分 | 34.54℃ |
| H9 | 对照 | 30小时36分 | 34.49℃ |
| H10 | 对照 | 28小时37分 | 33.64℃ |
然后确定每100mg粪便物的菌落数(图16)。这揭示，生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。令人感兴趣的是，脱落的数目实际上增加至感染后约5天，然后下降。在感染后第1天，6只接种疫苗的动物中的仅1只在它们的粪便中脱落可检测的艰难梭菌。在第3天之前，所有存活的接种疫苗的动物脱落相对较高数目的艰难梭菌。这些动物脱落高水平直到第11天。在第15天，5只动物中的仅3只在它们的粪便中脱落可检测的艰难梭菌(检测限为约200个孢子)。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图17)。仓鼠4和5表现出在平板上的高水平的污染性菌群，其遮蔽了任何存在的低艰难梭菌孢子(这些也适用于2只在第11天不可从粪便中回收艰难梭菌的动物)。
肠中的毒素B含量评估揭示，与2天后死亡的对照相比，在15天后存活的接种疫苗的仓鼠的肠中几乎不存在或不存在毒素B(表14)。H1是接种疫苗的仓鼠，其在感染急性期中死亡且具有高水平的毒素，这等于死亡的对照动物中存在的毒素水平。在死于感染急性期的动物中，在结肠中存在比盲肠更少的毒素B。
表14.P5_6+ToxB_B或对照.用B1菌株攻击.肠(盲肠和结肠)中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。
ToxB_B+P5_6+PSII
用ToxB_B+P5_6+PSII-CRM的混合物免疫动物，其中将多糖缀合至CRM载体蛋白。与粪便分析和肠中毒素含量评估一起进行保护研究。
类毒素A+ToxB_B
发明人然后试验了使用TcdA结合结构域的片段是否会影响使用全长类毒素A得到的保护。发现使用全长(灭活)类毒素A和ToxB_B的混合物(用MF59作为佐剂的5ugr类毒素A和50ugrToxB_B)的免疫会保护免于630菌株以及B1菌株的攻击。用630菌株攻击的未接种疫苗的动物具有强腹泻和温度下降，在此时将它们淘汰(表15)。相反，免疫的动物度过了630菌株攻击，且仅一只接种疫苗的动物仅表现出轻度腹泻。动物在恢复时表现出轻度腹泻。
表15.类毒素A+毒素B_B结果.用630攻击.一只动物发生非常有限的腹泻(*)。未接种疫苗的动物具有强腹泻和温度下降。
| 仓鼠 | 免疫原 | 实验结束 | 到达端点的时间 |
| 1 | 类毒素A+毒素B_B | 存活 | |
| 2 | 类毒素A+毒素B_B | 存活* | |
| 3 | 类毒素A+毒素B_B | 存活 | |
| 4 | 单独的MF59 | 57小时52分 | |
| 5 | 无处理 | 47小时4分 | |
| 平均值 | 52小时28分 |
用B1菌株攻击的未接种疫苗的动物也具有强腹泻和温度下降，在此时也将它们淘汰(表16)。免疫的动物度过攻击，其中2只在恢复期中发生轻度腹泻。因此，使用类毒素A和类毒素B_B的混合物的免疫会保护免于B1菌株攻击以后的死亡，但是不会保护免于腹泻(表16)。
表16.类毒素A+毒素B_B结果.用B1攻击.具有轻度腹泻的恢复(*)；强腹泻和温度下降(**)。接种疫苗的动物被保护免于死亡，但是没有被保护免于温度下降。
| 仓鼠 | 免疫原 | 实验结束 | 到达端点的时间 |
| 1 | 类毒素A+毒素B_B | 存活* | |
| 2 | 类毒素A+毒素B_B | 存活* | |
| 3 | 类毒素A+毒素B_B | 存活 | |
| 4 | 单独的MF59 | 29小时47分** | |
| 5 | 无处理 | 32小时24分** | |
| 平均值 | 31小时15分 |
其它组合
如以上所讨论的，发明人确定，包含GT结构域的片段是免疫原性的且能够诱导针对它们各自的毒素的中和滴度。为了试验包含GT结构域的 片段是否能够赋予针对CDAD的保护，发明人使用630和B1攻击菌株试验了许多另外的组合(总结在表7中)。
ToxB_GT+P5_6(630)
首先，发明人试验了使用ToxB_GT和ToxA-P5_6的混合物(用MF59作为佐剂)的免疫是否会保护免于630菌株攻击。发现与ToxB-B片段组合的ToxA-P5_6会赋予针对的630菌株攻击的100％保护。在该实验中，当用630攻击时，接种疫苗的动物都没有表现出腹泻，且没有观察到临床征状(表17)。用630菌株攻击的未接种疫苗的动物(仓鼠#9)具有强腹泻和温度下降，在此时将它们淘汰。
表17.ToxB_GT+P5+6结果.用630攻击.接种疫苗的动物都没有遭受腹泻。
| 动物 | 免疫原 | 到达<35℃的时间 | 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 |
| H1 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 36.4℃ | |
| H2 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 36.7℃ | |
| H3 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 37.2℃ | |
| H4 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 36.9℃ | |
| H5 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 36.2℃ | |
| H6 | ToxB_GT+P5_6 | 15天 | 36.2℃ | |
| H7 | 仅佐剂 | 35小时28分 | 41小时34分 | 26.2℃ |
| H8 | 仅佐剂 | 37小时37分 | 41小时53分 | 25.9℃ |
| H9 | 无处理 | 38小时15分 | 42小时 | 33.8℃ |
然后确定了每100mg粪便物的菌落数(图18)，从而证实了生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。
终末定殖评估也揭示，所有接种疫苗的动物表现出比对照更低数目的CFU和更低比例的孢子。在仓鼠#4和#5中不存在可检测的艰难梭菌孢子(数据未显示)，并且仓鼠#2与其它接种疫苗的仓鼠相比表现出终末定殖的10倍下降(图19)。
肠中的毒素B含量评估揭示，与在2天后死亡的对照相比，在15天以后在接种疫苗的仓鼠中存在更少的毒素B(表18)。在结肠中也证实了该结果(表19)。
表18.ToxB_GT+P5_6-盲肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用630菌株攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5_6+toxB_GT | 102 |
| H2 | P5_6+toxB_GT | 101 |
| H3 | P5_6+toxB_GT | 101 |
| H4 | P5_6+toxB_GT | 101 |
| H5 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H6 | P5_6+toxB_GT | 101 |
| H7 | 仅佐剂 | 105 |
| H8 | 仅佐剂 | 104 |
| H9 | 无 | 104 |
表19.ToxB_GT+P5_6-结肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用630菌株攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5_6+toxB_GT | 1:5 |
| H2 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H3 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H4 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H5 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H6 | P5_6+toxB_GT | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 1:3125 |
| H8 | 仅佐剂 | 1:25 |
| H9 | 无 | 1:625 |
因此，使用ToxB_GT和ToxA-P5_6的混合物的免疫会提供针对630菌株攻击的强保护，其象使用与ToxA-P5_6组合的ToxB-B片段一样好。
ToxB_GT+P5_6(B1)
考虑到针对菌株630的成功免疫，发明人试验了用P5_6+ToxB_GT免疫是否会保护免于B1菌株。将动物(H1-H6)用ToxB_GT+P5_6的混合物(50ugr每种抗原，用MF59作为佐剂)免疫。对照(仅佐剂)具有强腹泻和温度下降，在此时将它们淘汰。所有免疫的动物度过B1菌株攻击(6/6)(表20)，表现出单次腹泻发作。这是首次发生在重组抗原的任意组合。
表20.ToxB_GT+P5_6结果.用B1菌株攻击。
然后确定每100mg粪便物的菌落数(图20)，证实了生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。所有存活的动物在它们的粪便中脱落高水平的艰难梭菌。仅一只动物(H4)在第11天不具有可检测的孢子。
表21.ToxB_GT+P5_6-盲肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图21)。结果表明，除了H4以外，所有存活的仓鼠在淘汰时具有定殖在盲肠和结肠中的艰难梭菌。所有定殖的存活仓鼠似乎具有比死于感染急性期的动物更高的营养细胞:孢子比。
表22.ToxB_GT+P5_6-结肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5/6+toxB_GT | 1∶25 |
| H2 | P5/6+toxB_GT | 1∶5 |
| H3 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H4 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H5 | P5/6+toxB_GT | 1∶5 |
| H6 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 1∶625 |
| H8 | 未接种疫苗的对照 | 1∶625 |
肠中的毒素B含量评估揭示，与死于感染急性期的动物(H7和H8)相比，在接种疫苗的动物(H1-H6)的盲肠中存在更少的毒素B(表21)。与其它接种疫苗的动物相比，来自接种疫苗组的H3和H6具有更高的毒素B水平。H4不具有毒素B，这在预料之中，因为在淘汰时在肠中不存在可检测的艰难梭菌。在结肠中也证实了该结果(表22)。如在得自盲肠的肠洗液中所见，与死亡的对照动物中的高水平相比，在14天以后在存活仓鼠中几乎不存在或根本不存在活性毒素B。并且，在结肠中存在比在盲肠中明显更少的毒素B，并且仅在结肠中表现出大量毒素B的动物也是死于急性疾病的动物。这还可以通过例如抗体与毒素的结合和/或细菌毒素表达的下降来解释。
总之，使用ToxA-P5-6+ToxB_GT的疫苗接种会在B1菌株攻击后提供100％存活。该组合不会保护动物免于B1菌株攻击以后的腹泻，尽管征状相对有限。相反，发现与ToxB-B片段组合的ToxA-P5_6仅赋予针对 B1菌株攻击的83.3％保护，所以使用与TcdA片段组合的ToxB-GT片段代表胜过使用ToxB-B片段的改进(也参见图40)。
ToxB_GT+P5_6(较低剂量)
现在试验较低剂量(20ugr每种抗原)是否也会赋予针对B1菌株的保护。所有接种疫苗的动物(H1-H8)度过B1菌株攻击，且对照动物(H7-H8)死亡(表23)。
表23.ToxA-P5-6+ToxB_GT结果(减小的剂量)。用B1菌株攻击。
除了没有表现出临床征状的H2以外，所有接种疫苗的动物表现出单次腹泻发作。未接种疫苗的对照在腹泻发生以后不久死亡，并且在它们的体温下降至35℃以下时淘汰。在攻击后48淘汰H1和H5，尽管事实上它们已经从感染的腹泻阶段恢复(和基于已经存活的经验)。在该阶段淘汰H1和H5，以提供一些关于在该感染阶段存在的毒素B和肠损伤的信息。然后确定每100mg粪便物的菌落数(图22)，从而证实生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。计算每个疫苗接种组的艰难梭菌的平均脱落，并且与在其中B1为攻击菌株的任意前述实验相比，这些动物内的脱落似乎减少。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图23)。结果表明，所有存活的仓鼠在淘汰时具有定殖在盲肠和结肠中的艰难梭菌。H7和H8不具有存在于盲肠或结肠中的可检测的孢子，且在攻击后14天被淘汰时具有比其它接种疫苗的动物更低数目的营养细菌。H2、H3、H4和H6在淘汰时具有更高的营养细胞与孢子之比。H6的定殖程度高于H2、H3和H4。H1和H5是已经 从攻击恢复且在攻击后48小时被淘汰的接种疫苗的动物。与仅遭受较短的轻度发作的H5相比，H1具有更长的、更严重的腹泻发作。两只动物已经从腹泻恢复，并且它们的尾巴在攻击后48小时被淘汰时是干燥的。H1和H5具有与死于感染急性期的对照动物相当的营养细菌和孢子数目。
肠中的毒素B含量评估揭示，在攻击后14天被淘汰的接种疫苗的动物的盲肠中几乎不存在或根本不存在活性毒素B(表24)。
表24.ToxA-P5-6+ToxB_GT(减小的剂量)-盲肠中的毒素B含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
在攻击后48h被杀死的接种疫苗的动物具有存在于盲肠中的高水平的毒素B，并且量与在攻击后大约29h死于感染急性期的动物相当。也在结肠中证实了这些观察结果(表25)。
表25.ToxA-P5-6+ToxB_GT(减小的剂量)-结肠中的毒素B含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5/6+toxB_GT | 1∶3125 |
| H2 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H3 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H4 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H5 | P5/6+toxB_GT | 1∶3125 |
| H6 | P5/6+toxB_GT | 1∶5 |
| H7 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H8 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H9 | 未接种疫苗的对照 | 1∶15625 |
| H10 | 未接种疫苗的对照 | 1∶15625 |
如在得自盲肠的肠洗液中所见，相对于死亡的对照动物或在攻击后48h被淘汰的2只接种疫苗的动物中的高水平，14天后在存活仓鼠中几乎不存在或根本不存在活性毒素B。并且，在结肠中存在比在盲肠中更少的毒素 B，并且仅在肠中表现出大量毒素B的动物是死于急性疾病的对照动物。在48h被淘汰的那些动物表现出降低的水平，而在攻击后14天被淘汰的那些动物表现出微小的或不可检测的毒素B水平。
还评估了肠中的毒素A含量水平。将肠洗液穿过0.22μm过滤器过滤以除去细菌细胞。然后将过滤的洗液以递减浓度放在汇合的HT29细胞上保持24小时。温育以后，将细胞洗涤、固定，然后用吉姆萨染液染色。如果毒素存在的话，那么细胞圆化会造成颜色的脱离和缺失。毒素含量数据代表细胞保持附着(染色)时的稀释度。肠中毒素A含量评估揭示，攻击后14天淘汰的接种疫苗的动物几乎不存在或根本不存在毒素A。在攻击后48小时淘汰的接种疫苗的动物H1和H5具有与死于感染急性期的对照动物(H9和H10)可比较的量的肠毒素A(表26)。
表26.ToxA-P5-6+ToxB_GT(减小的剂量)-盲肠中的毒素A含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5/6+toxB_GT | 104 |
| H2 | P5/6+toxB_GT | 101 |
| H3 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H4 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H5 | P5/6+toxB_GT | 103 |
| H6 | P5/6+toxB_GT | 101 |
| H7 | P5/6+toxB_GT | 101 |
| H8 | P5/6+toxB_GT | 0 |
| H9 | 未接种疫苗的对照 | 103 |
| H10 | 未接种疫苗的对照 | 103 |
总之，当用艰难梭菌菌株B1攻击时，使用p5/6+toxB-GT(每剂20μg每种抗原)的疫苗接种会保护动物免于死亡，但是不会阻止腹泻。所有存活的动物在整个实验中被定殖，且在它们的粪便中脱落艰难梭菌孢子。在淘汰时，所有动物仍然被艰难梭菌定殖，其中仅一些表现出低水平的营养细胞，且其它表现出更高水平的孢子和营养细胞。存活至实验结束的动物在肠腔中表现出低水平的毒素(A或B)。
相比而言，对照动物在感染后大约29h发生感染。这些动物表现出营养细胞和孢子在切离的肠组织中的高计数和过滤的提取物中的高毒素水平。令人感兴趣的是，2只接种疫苗的动物(其已经从疾病的腹泻阶段恢 复，但是在48h时被淘汰)似乎表现出更接近地反映对照动物的相应值的计数和毒素水平，其中接种疫苗的动物具有相对较高的存在于腔内的毒素的量。但是，这些动物不再显示腹泻的事实提示，响应于损伤而从循环中产生和释放的抗体会保护动物免于疾病的更致命的后果。
因此，使用ToxA-P5-6+ToxB_GT的组合的免疫会在B1菌株攻击后提供100％存活，即使当使用更低量的抗原时。即使当使用20ug每种抗原时，该组合胜过与ToxB-B片段组合的ToxA-P5_6(使用50ug每种抗原)。
用R20291(SM)攻击的ToxA-P5-6+ToxB-GT
考虑到使用ToxA-P5-6+ToxB-GT的组合的免疫提供的针对630和B1菌株的高保护水平，发明人试验了该组合是否也会保护免于R20291(SM)菌株攻击。因此，用ToxA-5-6+ToxB-B的混合物(用MF59作为佐剂)免疫动物。与粪便分析和肠中毒素含量评估一起进行保护研究。
ToxB_GT-PSII+P5_6
发明人然后试验了PSII的包含是否可以诱导能够减少定殖的免疫应答。将ToxB_GT与PSII化学缀合，该缀合物能够诱导PSII-特异性抗体(通过ELISA证实，数据未显示)。并且，没有发现与PSII的化学缀合会损害中和活性。
该实验由3个用菌株630攻击的组组成：用ToxB_GT(PSII)+P5_6疫苗接种(H1-H6)，用ToxB_GT+P5_6疫苗接种(H7-8)和用单独佐剂处理(H9-H10)。结果显示在表27中。H1-H3没有显示出腹泻发作，但是H4具有2次发作，并在第二次发作以后被淘汰。在仓鼠H1-H6中，5/6存活。在仓鼠H7和H8中，2/2存活。
表27.ToxB_GT(PSII)+P5_6结果.攻击菌株630。
| 到达＜35℃的时间 | 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 | ||
| H1 | P5/6+toxB_GT-PSII | 14天 | ||
| H2 | P5/6+toxB_GT-PSII | 14天 | ||
| H3 | P5/6+toxB_GT-PSII | 14天 | ||
| H4 | P5/6+toxB_GT-PSII | 89小时40分 | 89小时50分 | 34.55℃ |
| H5 | P5/6+toxB_GT-PSII | 14天 | ||
| H6 | P5/6+toxB_GT-PSII | 14天 | ||
| H7 | P5/6+toxB_GT | 14天 | ||
| H8 | P5/6+toxB_GT | 14天 | ||
| H9 | 对照 | 33小时37分 | 37小时48分 | 20.0℃ |
| H10 | 对照 | 54小时43分 | 64小时0分 | 29.88℃ |
然后确定每100mg粪便物的菌落数(图24)，从而证实生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。所有存活的动物在它们的粪便中脱落高水平的艰难梭菌。
在图25中显示了在得自存活的接种疫苗的动物(ToxB_GT(PSII)+P5_6(H1-H6)或ToxB_GT+P5_6(H7-8))的粪便中脱落的艰难梭菌的平均数目。这表明，在包括PS-II时，对定殖可能存在轻微的优点。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图26(a和b))。结果显示在存活的(接种疫苗的)动物中的低或无组织相关的艰难梭菌定殖。关于H4得到的结果与阴性对照相当。
因此，仅在没有存活的动物中观察到高菌落计数动物。
嵌合体B4
发明人然后试验了使用包含ToxB-GT+ToxA-P5-6的杂合蛋白(“B4”嵌合体)得到的保护性(protectivity)。用50ug B4嵌合体(用MF59作为佐剂)免疫6只动物(H1-6)。作为对照，2只动物接受单独的佐剂(H7-H8)，且2只动物不接受疫苗接种(H9-H10)。腹膜内地施用抗原。用630菌株攻击动物(在攻击前淘汰了H1和H8)。所有对照动物死亡，但是3/5的接种疫苗的动物存活至实验结束(表28)。因此，与使用单一抗原的混合物相比，将ToxB-GT和ToxA-P5-6表达为嵌合体似乎会降低该抗原组合的有效性。
表28.嵌合体B4结果.用630菌株攻击.接种疫苗的动物被完全保护免于死亡，但是没有被保护免于腹泻.*由于与芯片插入有关的脓肿，将动物淘汰。
| 仓鼠 | 免疫原 | 到达端点的时间 | 到达端点的时间 |
| 1 | 在攻击前淘汰* | ||
| 2 | B4嵌合体 | 存活至实验结束 | |
| 3 | B4嵌合体 | 存活 | |
| 4 | B4嵌合体 | 存活 | |
| 5 | B4嵌合体 | 165小时 | |
| 6 | B4嵌合体 | 155小时 | |
| 7 | 单独的MF59 | 大约35小时** | |
| 8 | 在攻击前淘汰* | ||
| 9 | 无处理 | 62小时35分 | |
| 10 | 无处理 | 37小时21分 | |
| 平均值 | 44小时58分 |
通过在攻击后定期从笼子取出粪便样品，确定动物的定殖评估。将粪便称重，再悬浮于无菌PBS中，然后铺板在选择性培养基上。然后确定每100mg粪便物的菌落数(表29)，从而证实生物体在攻击后数天内以高数目脱落(在H6的粪便中不可检测出细菌)。
表29.100mg得自用嵌合体B4免疫的仓鼠或对照的粪便中的艰难梭菌孢子的细菌脱落.用630菌株攻击.*ND＝细菌不可检测出。
ToxB_GT+ToxA_B2
发明人然后试验了使用与不同TcdA片段组合的ToxB_GT的免疫是否能够赋予与ToxB-GT+ToxA-P5/6相同的高保护水平。因此，将动物用ToxB-GT+ToxA_B2的混合物免疫，并用B1菌株攻击。用ToxB_GT+ToxA_B2的混合物(用MF59作为佐剂)免疫动物(H1-H6)。对照(仅佐剂(H7和H8)和无佐剂(H9和H10))具有强腹泻和温度下降，在此时将它们淘汰。所有免疫的动物度过B1菌株攻击(6/6)(表30)。
表30.ToxB_GT+ToxA_B2结果.用B1菌株攻击。
| 抗原 | 到达＜35℃的时间 | 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 | |
| H1 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H2 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H3 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H4 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H5 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H6 | toxA_B2+toxB_GT | 14天 | ||
| H7 | 仅佐剂 | 31小时17分 | 31小时40分 | 33.94℃ |
| H8 | 仅佐剂 | 33小时8分 | 33小时20分 | 34.59℃ |
| H9 | 对照 | 30小时2分 | 30小时45分 | 32.31℃ |
| H10 | 对照 | 32小时7分 | 32小时35分 | 34.23℃ |
除了没有表现出腹泻的H3以外，所有免疫的动物表现出单次腹泻发 作(H1表现出该批中最严重的腹泻，并且被密切监测)。当用B1菌株攻击时，所有表现出临床征状的动物具有比在任意前述实验中观察到的结果更短的腹泻发作。
然后确定每100mg粪便物的菌落数(图27)，从而证实生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。所有存活的动物在它们的粪便中脱落高水平的艰难梭菌。在第14天之前，4只免疫的仓鼠(H2、H3、H4和H6)在它们的粪便中不具有可检测的艰难梭菌孢子。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图28(a-b))。结果表明，所有存活的仓鼠在淘汰时具有定殖在盲肠和结肠中的艰难梭菌，但是，细菌计数是非常低的，并且接近检测限的下限。H2和H6似乎不具有与组织有关的可检测的细菌。所有定殖的存活仓鼠似乎具有比死于感染急性期的动物更高的营养细胞:孢子比。
肠中的毒素B含量评估揭示，在接种疫苗的动物的盲肠中几乎不存在(H5)或根本不存在活性毒素B(在所有接种疫苗的动物淘汰时，H5具有在肠中最高的细菌数目)(表31)。在结肠中也证实了该结果(表32)。
表31.B_GT+ToxA_B2-盲肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxB_GT | 0 |
| H2 | toxA_B2+toxB_GT | 0 |
| H3 | toxA_B2+toxB_GT | 0 |
| H4 | toxA_B2+toxB_GT | 0 |
| H5 | toxA_B2+toxB_GT | 101 |
| H6 | toxA_B2+toxB_GT | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 104 |
| H8 | 仅佐剂 | 104 |
| H9 | 对照 | 104 |
| H10 | 对照 | 104 |
表32.B_GT+ToxA_B2-结肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
如在得自盲肠的肠洗液中所见，与死亡的对照动物中的高水平相比，在14天以后在存活仓鼠中几乎不存在或根本不存在活性毒素B。并且，在结肠中存在比在盲肠中明显更少的毒素B，并且仅在结肠中表现出大量毒素B的动物也是死于急性疾病的动物。
总之，使用ToxA-B2+ToxB_GT的疫苗接种会在B1菌株攻击后提供100％存活，由此胜过使用全长灭活类毒素达到的保护水平，并匹配使用ToxB-GT+ToxA-P5-6达到的高保护水平。该组合不会保护动物免于B1菌株攻击后的腹泻。尽管如此，在B1菌株攻击后，征状是相对有限的，且严重性甚至低于任何前述试验组合。所有存活的动物在整个实验中被定殖，尽管3/6的接种疫苗的动物在感染后14天没有在粪便中表现出可检测的艰难梭菌孢子(尽管在此时可以从肠直接培养可检测数目的艰难梭菌)。并且，接种疫苗的动物在实验结束时表现出在肠中相对较低的毒素B水平。这还可以通过例如抗体与毒素的结合和/或细菌毒素表达的下降来解释。
ToxA-B2+ToxB_B+ToxB_GT
发明人然后试验了使用ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-B2的疫苗接种是否对针对CDAD的保护具有任何作用。用ToxA-B2+ToxB_B+ToxB-GT的混合物免疫动物。与粪便分析和肠中毒素含量评估一起进行了保护研究。
ToxB_B+ToxA-P5_6+ToxB_GT
发明人然后试验了使用与ToxB-B片段组合的ToxB-GT+ToxA-P5-6的疫苗接种是否对针对CDAD的保护具有任何其它作用。因此，用ToxB_B+P5_6+ToxB_GT的混合物(用MF59作为佐剂)免疫动物。未接种疫苗的对照具有强腹泻和温度下降，在此时将它们淘汰。6只接种疫苗的仓鼠中的5只(83％)度过了B1菌株攻击(表33)。
表33.在MF59佐剂中的ToxB_GT+ToxB_B+P5_6.用B1攻击.6只接种疫苗的动物中的5只存活.H1 和H4表现出单次持续大约1小时的腹泻发作.
| 到达＜35℃的时间 | 在淘汰时的时间 | 在淘汰时的温度 | ||
| H1 | 疫苗 | 15天 | ||
| H2 | 疫苗 | 50小时50分 | 50小时54分 | 34.69℃ |
| H3 | 疫苗 | 15天 | ||
| H4 | 疫苗 | 15天 | ||
| H5 | 疫苗 | 15天 | ||
| H6 | 疫苗 | 15天 | ||
| H7 | 仅佐剂 | 28小时47分 | 28小时47分 | 34.12℃ |
| H8 | 仅佐剂 | 28小时50分 | 28小时50分 | 33.46℃ |
| H9 | 对照 | 30小时48分 | 30小时48分 | 34.9℃ |
| H10 | 对照 | 29小时32分 | 29小时32分 | 32.2℃ |
仓鼠H1和H4仅表现出单次持续大约20小时的腹泻发作，仓鼠H3、H5和H6不具有腹泻发作。粪便分析(图29)表明，艰难梭菌生物体在攻击后数天以非常高的数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。在图30中提供了终末定殖的概要。
肠中的毒素B含量评估揭示，与在2天后死亡的对照相比，在15天以后在6只接种疫苗的仓鼠中的5只中存在更少的毒素B(表34)。
表34.ToxB_B+P5_6+ToxB_GT.盲肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用B1菌株攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 101 |
| H2 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 106 |
| H3 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H4 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H5 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H6 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 101 |
| H7 | 仅佐剂 | 106 |
| H8 | 仅佐剂 | 105 |
| H9 | 无 | 105 |
| H10 | 无 | 105 |
在结肠中也证实了该结果(表35)。H2在50小时54分钟死亡，且具有与死亡的对照动物类似量的肠中毒素B。
表35.ToxB_B+ P5_6+ToxB_GT.结肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用B1菌株 攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H2 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 1∶25 |
| H3 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H4 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | |
| H5 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H6 | P5_6+toxB_B+toxB-GT | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 1∶15625 |
| H8 | 仅佐剂 | 1∶78125 |
| H9 | 无 | 1∶78125 |
| H10 | 无 | 1∶78125 |
因此，使用ToxB_B+P5_6+ToxB_GT的混合物的免疫会提供针对630菌株攻击的强保护，但是似乎不会赋予任何胜过ToxB-GT+ToxA-P5-6的优点。
ToxA_GT+ToxB_GT+ToxB_B+ToxA_B2
发明人然后试验了使用包含ToxA-GT的抗原组合免疫所赋予的保护性水平。因此，用ToxA-GT+ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-B2的混合物免疫动物。6只动物接受50μg每种抗原(用MF59作为佐剂)(H1-H6)。1只动物接受单独的佐剂(H7)，2只未处理(H8-H9)，且1只未攻击(H10)。在该实验中使用的攻击菌株是B1菌株。所有对照动物在攻击后死亡，在体温下降至临床端点之前不久表现出腹泻。1只接种疫苗的动物(H1)表现出疾病和脱水的征象，且在最后一只对照动物之后不久死亡，从而显示与对照类似的体温特性(数据未显示)。所有其它接种疫苗的动物存活至实验结束(表36)。H2-H6在恢复期中表现出单次短腹泻发作。因此，83％的接种疫苗的受试者被保护免于当用B1菌株攻击时的死亡。
表36. ToxA_GT + ToxB_GT + ToxB_B + ToxA_B2结果.攻击菌株B1。
细菌脱落分析(图31)揭示了粪便中的艰难梭菌孢子随时间的下降(第7天以后显著下降)，并且该趋势与使用全长类毒素得到的数据相当。在第3天不可得到关于H4的数据，H3和H5在第14天不具有可检测的孢子。所有存活的仓鼠具有比死于感染急性期的动物更高的营养细胞:孢子比。在图32中提供了在淘汰时的定殖分析。
对于度过B1菌株攻击的仓鼠，在第14天分析了毒素B含量(表37)。
表37.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-盲肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 104 |
| H2 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 103 |
| H3 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H4 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 101 |
| H5 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H6 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H7 | 仅佐剂 | 104 |
| H8 | 未接种疫苗的对照 | 104 |
| H9 | 未接种疫苗的对照 | 104 |
接种疫苗的动物表现出低肠毒素B水平，尽管被细菌定殖(除了H2以外，其具有更多的可检测的毒素B，且其在淘汰时被更严重地定殖)。接种疫苗的仓鼠H1(其在感染急性期死亡)具有与未接种疫苗的和仅佐剂的对照(其在感染后28h死亡)等量的肠毒素B。在结肠中证实了这些观察结果(表38)。在结肠中存在比在盲肠中明显更少的毒素B，并且仅在结肠中
表现出大量毒素B的动物也是死于急性疾病的动物。
表38.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2-结肠中的毒素含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 接种疫苗ed | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 1:3125 |
| H2 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 1:25 |
| H3 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H4 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H5 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 0 |
| H6 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_B+toxB_GT | 1:5 |
| H7 | 仅佐剂 | 1:625 |
| H8 | 未接种疫苗的对照 | 1:3125 |
| H9 | 未接种疫苗的对照 | 1:15625 |
总之，使用ToxA_GT+ToxB_GT+ToxB_B+ToxA_B2的疫苗接种会保护6只动物中的5只免于当用B1菌株攻击时的死亡，但是不会保护免于腹泻。通过在组合中包含ToxA-GT实现的保护水平与当用全长灭活类毒素免疫时达到的保护水平相当。所有存活的动物在整个实验中被定殖，并且在粪便中脱落相等水平的艰难梭菌孢子。在淘汰时，所有动物仍然被艰难梭菌定殖。存活的接种疫苗的动物表现出与对照相比在肠中更高的营养细胞:孢子比例。除了1只(H2)以外，存活动物在肠中表现出低毒素B活性水平。这还可以通过例如抗体与毒素的结合和/或细菌毒素表达的下降来解释。总之，该组合表现出与使用类毒素的黄金标准免疫所得到的效力相当的效力。
ToxA_B2+ToxB_GT+ToxB_GT+ToxB_B+ToxA_GT较低剂量
发明人然后试验了使用较低抗原剂量的ToxA_GT+ToxB_GT+ToxB_B+ToxA_B2(20ugr每种抗原)是否也会赋予针对B1菌株的高水平保护。
所有接种疫苗的动物(H1-H8)度过了B1菌株攻击，并且对照动物(H7-H8)在它们的体温下降至35℃以下时被淘汰(表39)。应当指出，1只接种疫苗的动物(H2)在攻击后9天被淘汰，这归因于身体情况的缺失而不是体温下降(该动物没有增加重量，发生脱水，并且正常肠功能没有恢复，如通过成形粪便物的缺失所证实)。
表39.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)结果.用B1攻击。
然后确定每100mg粪便物的菌落数(图33)，从而证实生物体在攻击后数天内以高数目脱落，即使当征状(腹泻)已经减轻时。发现粪便中的孢子水平在第8天以后显著下降。
还进行了在淘汰时的定殖分析(图34)。结果表明，所有存活的仓鼠在淘汰时在肠中被艰难梭菌定殖。在攻击后9天被淘汰的H2具有与死于感染急性期的对照动物(H8、H9和H10)相当的量的营养细胞和孢子。H1、H3和H4具有高水平的艰难梭菌，但是与死于感染急性期的动物相比存在更低水平的孢子。H5、H6和H7具有更低的艰难梭菌数目和更低的孢子水平。H6在盲肠或结肠中不具有与组织有关的可检测的孢子。
盲肠中毒素B含量的评估揭示，在攻击后14天被淘汰的接种疫苗的动物的盲肠中几乎不存在或根本不存在活性毒素(表40)。令人感兴趣的是，对照动物H8几乎不存在或根本不存在活性毒素，这是意外的，因为该动物在感染急性期死亡。在攻击后9天被淘汰的H2具有与死于感染急性期的对照动物(H9和H10)相当的存在于肠中的毒素量。H1和H3具有存在的活性毒素，而H4和H6具有更少的存在的毒素。H5和H7不具有存在的活性毒素，这与存在的低细菌数目相关。
表40.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)。盲肠中的毒素B含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度.用B1攻击。用B1攻击。
| 仓鼠 | 抗原 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 104 |
| H2 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 108 |
| H3 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 104 |
| H4 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 102 |
| H5 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H6 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 102 |
| H7 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H8 | 对照 | 101 |
| H9 | 对照 | 108 |
| H10 | 对照 | 108 |
在结肠中观察到类似的毒素结果(表41)，其中H8似乎不具有存在于肠中的活性毒素。在感染急性期死亡的H9和H10具有存在于结肠中的高水平的毒素。在攻击后9天被淘汰的H2具有存在于结肠中的活性毒素，而在攻击后14天被淘汰的动物几乎不存在或根本不存在活性毒素。
表41.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)。结肠中的毒素B含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 抗原 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H2 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:125 |
| H3 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:25 |
| H4 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H5 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H6 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H7 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 0 |
| H8 | 对照 | 0 |
| H9 | 对照 | 1:78125 |
| H10 | 对照 | 1:15625 |
还使用上述方法评估了盲肠中的毒素A含量水平。肠中毒素A含量评估揭示，H9和H10具有存在的高毒素A水平。也在感染急性期死亡的H8几乎不具有存在的活性毒素，尽管该结果与以前的毒素B测量结果一致。与在攻击后14天被淘汰的动物(其几乎不存在或根本不存在活性毒素)相比，在攻击后9天被淘汰的H2具有存在于盲肠中的更高毒素A水平(表42)。
表42.ToxB_GT+ToxA_GT+ToxB_B+ToxA_B2(较低剂量)。盲肠中的毒素A含量.将数据表示为细胞保持附着时的稀释度。用B1攻击。
| 仓鼠 | 抗原 | 裂解细胞的最终稀释度 |
| H1 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:25 |
| H2 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:125 |
| H3 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:25 |
| H4 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:25 |
| H5 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:5 |
| H6 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:5 |
| H7 | toxA_B2+toxA_GT+toxB_GT+toxB_B(低剂量) | 1:5 |
| H8 | 对照 | 1:5 |
| H9 | 对照 | 1:15625 |
| H10 | 对照 | 1:625 |
总之，使用较低剂量的ToxA-B2+ToxA_GT+ToxB_GT+ToxB_B(每剂20μg每种抗原)的免疫也会保护动物免于死亡，但是不会免于腹泻。除了1只(H2)以外，所有度过初次攻击的动物恢复了正常的肠功能。因此，与使用类毒素的黄金标准相比，使用较低剂量的ToxA-B2+ToxA_GT+ToxB_GT+ToxB_B的免疫似乎会提供类似的或更好的保护水平。
得自接种疫苗的仓鼠的中和滴度
通过体外中和测定分析了得自接种疫苗的仓鼠的血清结果显示在表43中。
表43.得自接种疫苗的仓鼠的体外中和滴度(用“/”表示实验重复中的差异)。显示了用于对比的选择的中和滴度.减小的抗原剂量是20μg每种抗原。
用包含至少一种得自ToxA的片段和至少一种得自ToxB的片段的片段混合物、以及全长毒素A和毒素B免疫的动物产生了针对两种毒素的中和滴度。在试验的组合中，仅ToxA-B2+ToxB-B+ToxB_GT没有产生针对两种毒素的中和滴度，并且未发现会保护免于630菌株。并且，用单个片段免疫的动物产生了仅针对它们各自的毒素的中和滴度，并且没有观察到是保护性的。这些数据提示，针对艰难梭菌的保护需要产生针对两种毒素的中和滴度。
微生物丛的分析
用艰难梭菌攻击的、从单次腹泻发作恢复的接种疫苗的动物继续在粪便中脱落生物体持续至少3周。为了分析艰难梭菌感染对微生物组的影响，通过感染前和感染后粪便物的16S扩增，监测变化。
首先，发明人评估了克林霉素处理以后的微生物菌群变化(图35)。从每个样品的454测序返回平均3000个序列，并分配门。在未处理的正常仓鼠中，拟杆菌门是最丰富的门(59％)。克林霉素处理导致拟杆菌门的急剧收缩、变形杆菌的连续繁殖(84％)和总微生物多样性的损失。从第2天观察到增加的梭杆菌回收。在第5天之前观察到多样性的恢复，尽管在第15天之前，门微生物丰度仍然尚未完全恢复。
发明人然后试验了接种疫苗的动物中的微生物菌群变化。疫苗接种会保护仓鼠免于产毒素的艰难梭菌630的致命攻击，尽管细菌生长和毒素产生。如在图36中所示，存活动物表现出与在克林霉素处理的动物中观察到的结果一致的微生物丛变化。在第14天，这些门减少，但是停留在高于其 它感染方案。微生物多样性下降至第4天的SDI1.3，但是然后增加至类似于克林霉素前水平(SDI1.7)。
总之，发明人发现，使用包括毒素B的酶促结构域的毒素片段的疫苗接种会提供针对艰难梭菌感染的最高保护水平。广谱抗生素克林霉素的施用会导致降低的微生物复杂性。尽管微生物丛多样性随时间增加，它从未恢复至克林霉素前水平。这些数据与临床数据一起提示，艰难梭菌毒素相关的损伤可以增强由抗生素造成的微生物丛生态失调，并且这可能揭示为什么患者保持复发易感性。
肠腔中的毒素特异性的IgG的研究
研究了毒素特异性的IgG在用ToxA-P5-6+ToxB-GT接种疫苗的动物的肠腔中的存在。尽管针对ToxA的应答在感染急性期中更高，在端点时可检测出增加的量的抗-ToxB抗体(图39)。
为了进一步评价使用ToxA-P5-6+ToxB-GT的疫苗接种的影响，监测在体内产生的毒素水平，并执行肠组织学。
在感染后48小时在对照和接种疫苗的仓鼠中检测出高毒素水平(图40)，而伴有上皮坏死和多形核白细胞(PMN)流入的严重肠炎仅在对照动物中观察到。得自接种疫苗的动物的组织表现出更少的上皮损伤和有限的PMN浸润。观察到与粘蛋白生产细胞的出现和隐窝至尖部长度增加有关的增生，特别是在下结肠中。
受保护的动物在感染后14天在肠腔内表现出低毒素水平，尽管存在高数目的与肠组织有关的艰难梭菌菌落。肠上皮似乎恢复正常状态，没有多形核白细胞流入。令人感兴趣的是，在没有明显盲肠改变的同时，一些增生在这些动物的末端结肠中持续。
结论
发明人已经发现，包含ToxB-GT和TcdA片段的艰难梭菌抗原组合的施用能够提供针对CDAD的高保护水平，其与使用基于结合结构域的片段进行免疫相当或者优于后者。
仓鼠疫苗接种实验导致片段组合的鉴别，所述片段组合能够保护动物免于在没有疫苗接种存在下甚至在B1菌株攻击以后通常观察到的致命结 果。
令人惊奇地，发明人还发现，与使用杂合多肽相比，使用作为各种单独多肽(即混合到一起)的本发明组合物的免疫会赋予针对CDAD的强得多的保护。这通过“B4嵌合体”来例证，所述“B4嵌合体”仅表现出针对更温和的630菌株的中等保护水平。
本发明的组合会有力地减轻CDAD的临床征状，诸如脱水和腹泻。此外，由本发明的组合提供的保护水平匹配或超过使用灭活类毒素提供的保护。通过使用重组多肽，发明人也能够克服与使用灭活类毒素的疫苗接种有关的多血质(plethora)问题。
因此，发明人已经提供了针对CDAD的多菌株疫苗候选物，其可以比使用灭活类毒素更安全地且更容易地生产，且其会提供针对艰难梭菌的基于结合结构域的免疫的替代方案。
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Claims (23)
1.一种免疫原性组合物，其包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含
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b)ToxA-GT抗原和TcdB抗原。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述ToxB-GT抗原和/或所述ToxA-GT抗原是脱毒的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，
所述ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:60的表位；
所述ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:56具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:56的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:56具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:56的表位；
所述TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:1具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:1的表位；和
所述TcdB抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:2具有80％或更多同一性；和/或b)是SEQ ID NO:2的至少7个连续氨基酸的片段，或者属于这样的多肽：所述多肽与SEQ ID NO:2具有80％或更多同一性且包含SEQ ID NO:2的表位。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种TcdA抗原，所述TcdA抗原任选地选自：(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ IDNO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ IDNO:1)。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种另外的TcdB抗原，所述另外的TcdB抗原任选地选自：(1)ToxB-ED抗原(SEQID NO:17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO:18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQID NO:19)(4)ToxB-T抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B抗原(SEQ IDNO:21)、(6)ToxB-B2抗原(SEQ ID NO:22)(7)ToxB-B7(SEQ ID NO:23)或(8)全长TcdB抗原(SEQ ID NO:2)。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含ToxA-GT抗原和1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或更多种TcdB抗原，所述TcdB抗原任选地选自：(1)ToxB-ED抗原(SEQ ID NO:17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO:18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQ ID NO:19)(4)ToxB-T抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B抗原(SEQ ID NO:21)、(6)ToxB-B2抗原(SEQ ID NO:22)(7)ToxB-B7(SEQ ID NO:23)或(8)全长TcdB抗原(SEQ ID NO:2)。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或更多种另外的TcdA抗原，所述另外的TcdA抗原任选地选自：(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ ID NO:1)。
8.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原和TcdA抗原，其中所述TcdA抗原选自ToxA-P5-6和ToxA-B2。
9.一种免疫原性组合物，其包含：i)ToxA-GT抗原或ToxB-GT抗原；和ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。
10.一种免疫原性组合物，其包含：i)ToxA-GT抗原和ToxB-GT抗原；和ii)至少一种选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5和/或ToxA-B6的TcdA抗原；和至少一种选自ToxB-B、ToxB-B2抗原和/或ToxA-B7的TcdB抗原。
11.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、TcdA抗原和另一种TcdB抗原，任选地其中所述组合物包含：(a)ToxB-GT+ToxA-B2+ToxB-B，或(b)ToxB-GT+ToxB-B+ToxA-P5-6。
12.根据任意前述权利要求所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含ToxB-GT抗原、ToxA-GT抗原、另一种TcdA抗原和另一种TcdB抗原，任选地其中所述组合包含ToxB-GT+ToxA-GT+ToxA-B2+ToxB-B。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中的至少2种所述抗原是呈杂合多肽的形式。
14.根据权利要求1-12中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原无一是呈杂合多肽的形式。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的中和滴度。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种其它艰难梭菌抗原，任选地其中所述其它艰难梭菌抗原是糖抗原。
17.作为疫苗组合物的根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物。
18.根据权利要求17所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含佐剂。
19.用作药物的根据权利要求17或权利要求18所述的疫苗组合物。
20.用于在哺乳动物中引起免疫应答的根据权利要求17-19中的任一项所述的疫苗组合物。
21.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人。
22.用于治疗或预防艰难梭菌相关的疾病的根据权利要求18-21中的任一项所述的疫苗组合物。
23.一种用于在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述哺乳动物施用有效量的根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物或疫苗。
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