RS55669B1

RS55669B1 - Proizvodnja aktivne visoko fosforilisane ljudske n-acetilglaktozamin-6-sulfataze i njene primene

Info

Publication number: RS55669B1
Application number: RS20170165A
Authority: RS
Inventors: Vish Koppaka; Michel Claude Vellard; Augustus O Okhamafe; Kidisti Araya
Original assignee: Biomarin Pharm Inc
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2017-06-30
Also published as: PL2595650T3; KR101598897B1; ES2616263T3; AR119552A2; IL260282B; JP2013532986A; US20120189605A1; ZA201300286B; HUE033163T2; US8940513B2; KR101949906B1; IL224125B; CN103037895B; US8765437B2; AU2011280937A1; DK2595650T3; BR112013001558B1; RU2607376C2; SG187580A1; PE20171799A1

Description

POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

OBLAST PRONALASKA

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na tehničko polje ćelijske i molekularne biologije i medicine, naročito na proizvodnju aktivnih visoko fosforilisanih ljudskih lizozomnih sulfataza enzima i na njihovu upotrebu u upravljanju bolesti lizozomnog skladištenja izazvanu nedostatkom lizozomnog sulfataza enzima. Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na proizvodnju aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) i njenu upotrebu u kontroli mukopolisaharidoze rVa (MPS IVa ili Morkio sindrom) i drugih bolesti lizozomnog skladištenja povezanih sa nedostatkom GALNS.

STANJE TEHNIKE

[0002]Bolesti lizozomnog skladištenja (LSD) rezultat su nedostatka pojedinih lizozomnih enzima unutar ćelija koji su od suštinskog značaja za razgradnju ćelijskog otpada u lizozomima. Nedostatak takvih lizozomnih enzima dovodi do akumulacije unutar nerazgrađenog „materijala za skladištenje" u lizozomu, što dovodi do oticanja i prestanka rada lizozoma i na kraju do oštećenja ćelija i tkiva. Veliki broj lizozomnih enzima su identifikovani i u korelaciji su sa njima povezanim bolestima. Kada je identifikovan nedostajući enzim, tretman se može smanjiti samo na problem efikasnog dostavljanja zamenskog enzima na zahvaćena tkiva pacijenata.

[0003]Jedan od načina za lečenje oboljenja lizozomnog skladištenja je terapija intravenozne zamene enzima (ERT) (Kakkis, Expert Opin. Investig. Drugs 11(5): 675-685, 2002). ERT koristi prednosti vaskulature da nosi enzim sa jedne lokacije primene na većinu tkiva. Kada je enzim široko distribuiran, mora biti unet u ćelije. Osnova za upijanje u ćelije nalazi se u jedinstvenoj osobini lizozomnog enzima. Lizozomni enzimi čine posebnu klasu glikoproteina definisanih fosfatom na 6-položaju terminalnih manoznih ostataka. Manoza-6-fosfat je vezan sa visokim afinitetom i specifičnošću receptorom koji se nalazi na površini većine ćelija

(Munier-Lehmann et al., Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). Manoza-6-fosfat receptor (MPR), koja ima mesta vezivanja dva manoza-6-fosfata po polipeptidnom lancu (Tong et al., J. Biol. Chem. 264:7962-7969, 1989), usmerava apsorpciju enzima iz krvi u tkivo i onda posreduje intracelularnu usmeravanje na lizozom.

[0004]Proizvodnja veliko lizozomnih enzima obuhvata eksprimiranje u ćelijskim linijama sisara. Cilj je preovlađujuće lučenje rekombinantnih enzima u okolni medijuma rasta za prikupljanje i dalju obradu. U idealnom sistemu za proizvodnju velikog obima lizozomnih enzima, enzim će biti efikasno fosforilisan, i zatim usmeren prvenstveno ka ćelijskoj površini (tj. za sekreciju), pre nego prvenstveno ka lizozomu. Kao što je gore opisano, ova podela fosforilisanih lizozomnih enzima je upravo suprotno od onoga što se dešava u normalnim ćelijama. Proizvodne ćelijske linije koje se koriste za proizvodnju lizozomnih enzima fokusiraju se na maksimiziranje nivoa manoza-6-fosfata po molu enzima, ali ih karakteriše niska specifična produktivnost.In vitropokušaji proizvodnje lizozomnih enzima koji sadrže visoke nivoe manoza-6-fosfat radikala su rezultirali mešovitim uspehom (Canfield et al., U.S. Patent No. 6,537,785).In vitroenzim pokazuje visoke nivoe manoza-6-fosfata, kao i visoke nivoe nemodifikovane terminalne manoze. Konkurencija između manoza-6-fosfat i manoza receptora za lizozomni enzim rezultuje u neophodnosti za visokim dozama enzima za efikasnosti, i može dovesti do veće imunogenosti na štetu pacijenta koji se tretira.

[0005]Sulfataze predstavljaju jedinstvene podklase lizozomnih enzima. Sulfataze cepaju sulfatne estre od raznih supstrata, uključujući, na primer, steroide, ugljene hidrate, proteoglikane i glikolipide. Sve poznate eukariotske sulfataze sadrže cistein ostatak na svom katalitičkom mestu. Aktivnost sulfataze zahteva nakon translacije modifikaciju ovog cistein ostatka do Ca-formilglicina (FGly). Cistein do FGly post-translaciona aktivacija enzima dešava se u endoplazmatičnom retikulumu na nerazvijenoj sulfatazi odmah posle translacije, pre navođenja sulfataze na lizozom (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968, 1997). Formilglicin-stvarajući enzim koji katalizuje ovu reakciju je faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1). Naglašavajući značaj ove jedinstvene post-translacione modifikacije je činjenica da mutacije u SUMF1, koji dovodi do oštećenja FGly formiranja lizozomnih sulfataza enzima, što izazva višestruki nedostatak sulfataze (MSD) kod ljudi (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

[0006]Prema tome, terapeutska efikasnost pripreme lizozomnog sulfataza enzima zavisi od nivoa manoza-6-fosfata, i prisustvu aktivnog enzima u toj pripremi.

[0007] Stoga, postoji potreba u ovoj oblasti za efikasnim i produktivnim sistemom za proizvodnju velikog obima terapeutski efektivnih, aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzima za upravljanje poremećaja skladištenja lizozoma izazvanih ili povezanih sa nedostatkom takvih lizozomnih sulfataza enzima.

REZIME PRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak se odnosi na otkriće da kada je derivat ćelijske linije CHO-K1 (označen G71), koji je defektan u endozomnoj acidifikaciji, projektovan tako da eksprimira rekombinantni ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1), modifikovane G71 ćelije proizvode visoke prinose aktivnih vrlo fosforilisanih rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima, delom sprečavajući gubitak materijala lizozomnog odeljka proizvodne ćelijske linije. U jednom aspektu, pronalazak daje END3 komplementarnu grupu ćelijske linije da ko-eksprimira rekombinantni ljudski SUMF1 i rekombinantnu ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS), što rezultuje visokim prinosima aktivnog vrlo fosforilisanog enzima. Primeri ćelijskih linija su G71, G71 Si njihovi derivati koji zadržavaju željena svojstva G71, tj., sposobnost da proizvede visoke prinose aktivnih visoko fosforilisanih rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima. Ova aplikacija jedne END3 komplementarne grupe modifikovanik CHO-K1 ćelijskih linija koje ko-eksprimiraju rekombinantni ljudski SUMF1 i rekombinantni lizozomni sulfataza enzim bi bila posebno korisna za proizvodnju aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzima koji se koriste za kontrolu bolesti lizozomnog skladištenja putem terapije enzimske zamene (ERT).

[0009] Ovde se govori o novom postupku za proizvodnju aktivnih visoko fosforilisanog rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima ili njegovih biološki aktivnih fragmenata, mutanata, varijanti ili derivata u END3 komplementarnoj grupi CHO ćelija ili derivata u količinama koje omogućavaju njihovu terapeutsku upotrebu. Postupak može da sadrži korake: (a) kultivisanje CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njenog derivata; (b) dobijanje prvog vektora eksprimiranja sisara koji je sposoban da eksprimira aktivan visoko fosforilisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim ili njegov biološki aktivni fragment, mutant, varijantu ili derivat u CHO-izvedenoj END3 komplementarnoj grupi ćelija ili njenog derivata; (c) pripremanje drugog vektora eksprimiranja sisara koji je sposoban da eksprimira rekombinantni ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) ili njegov biološki aktivni fragment, mutant, varijantu ili derivat u CHO-izvedenoj END3 komplementarnoj grupi ćelija ili njenog derivata; (d) transfektovanja CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njenog derivata sa prvim i drugim vektorima eksprimiranja; (e) odabir i kloniranje transfektovanih CHO-izvedenih END3 komplementarnih grupa ćelija ili njihove derivate koji eksprimiraju aktivni visoko fosforilisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim ili njegov biološki aktivan fragment, mutant, varijantu ili derivat; i (f) optimizaciju postupka kultivisanja ćelija za proizvodnju visoko fosforilisanog rekombinantnog ljudski lizozomnog sulfataza enzima ili njegovog biološki aktivnog fragmenta, mutanta, varijante ili derivata koji su ovde obelodanjeni. Rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim može biti izabran iz grupe koju čine arilsulfataza A (ARSA), arilsulfataza B (ARSB), iduronat-2-sulfataza (IDS), sulfamidaza/heparin-N-sulfataza (SGSH), N-acetilglukozamin-sulfataza (G6S) i N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS).

[0010] Ovde obelodanjen postupak može uključivati korake transfektovanja cDNK koja kodira ceo ili deo lizozomnog sulfataza enzima i cDNK koja kodira ceo ili deo ljudskog SUMF1 u CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihove derivate. Prvi i drugi vektori eksprimiranja, koji su sposobni da eksprimiraju kodiranje aktivnog visoko fosforilisanog rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima i ljudske SUMF1, respektivno, mogu se transfekovati istovremeno u CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihove derivate. Prvi i drugi vektori eksprimiranja mogu se sekvencijalno transfektovati u CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihov derivat. Može se koristiti cDNK koji kodira ljudski lizozomni sulfataza enzim pune dužine. cDNK koja kodira njegov biološki aktivni fragment, mutant, varijantu ili derivat se takođe može koristiti. cDNK koja kodira ljudski SUMF1 pune dužine mogu se koristiti. cDNK koja kodira njegov biološki aktivni fragment, mutant, varijantu ili derivat se takođe može koristiti. Višestruki vektori eksprimiranja mogu da se koriste za prenos ljudskog lizozomnog sulfataza enzima i ljudskog SUMF1 cDNK simultano ili sekvencijalno u CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihov derivat. Jedan vektor eksprimiranja može se koristiti za prenos ljudskog lizozomnog sulfataza enzima i ljudskog SUMF1 cDNK simultano u CHO-izvedene komplementarne grupe ćelija ili njihov derivat. CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihov derivat mogu biti G71 ćelijska linija, ćelijska linija G71 S, ili G71 ili G71 S derivat.

[0011]Ovde se govori o postupku koji može da sadrži proizvodnju aktivnog visoko fosforilisanog rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima, kao što su npr. arilsulfataza A (ARSA), arilsulfataza b (ARSB), iduronat-2-sulfataza (IDS), sulfamidaza/heparin-N-sulfataza ( SGSH), N-acetilglikozamin-sulfataza (G6S) ili N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS), iz END3 komplementarnih grupa CHO ćelijskih linija ili njihovih derivata. Ovde se govori o postupku koji može da sadrži proizvodnju aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) iz END3 komplementarnih grupa CHO ćelijskih linije ili njihovih derivata. Ćelijske linije END3 komplementarnih grupa su sve modifikovane ćelijske linije CHO koje zadržavaju odlike ćelijskih linija END3 komplementarnih grupa, poput defektivne endozomne acidifikacije. CHO-izvedene END3 komplementarne grupe ćelija ili njihov derivat mogu biti G71 ćelijska linija, ćelijska linija G71 S, ili G71 ili G71 S derivat.

[0012]Ovde je obelodanjena sisarska ćelijska linija sa defektnom endozomnom acidifikacijom karakterisana svojom sposobnošću da proizvodi aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske lizozomne sulfataza enzime u količinama koji omogućavaju terapeutsko korišćenje lizozomnog sulfataza enzima. Ovde su opisane CHO-K1-izvedene ćelijske linije END3 komplementarnih grupa, označene G71, G71S, ili njihovi derivati, koji su u stanju da proizvede visoke prinose aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske lizozomne sulfataza enzime, čime se omogućava proizvodnja velikih razmera ovakvih terapeutskih lizozomnih sulfataza enzima. Ćelijske linije mogu eksprimirati i lučiti rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim u količinama od najmanje oko 0,5, poželjno najmanje oko 0,75, poželjnije najmanje oko 1,0, i čak poželjnije najmanje oko 1,25 pikograma/ćelij a/dan.

[0013]Ćelijska linija END3 komplementarne grupe može biti bilo koja modifikovana ćelijska linija CHO koja zadržava svojstva komplementarnosti grupe ćelijske linije END3, poput defektivne endozomne acidifikacije. END3 komplementarne grupe CHO ćelijskih linija mogu biti izvedene iz G71 ili njegovog derivata i mogu sadržati (a) vektor eksprimiranja za rekombinantni ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i (b) vektor eksprimiranja za ljudski rekombinantni lizozomni sulfataza enzim, gde ljudski rekombinantni lizozomni sulfataza enzim može biti izabran iz grupe koju čine arilsulfataza A (ARSA), arilsulfataza B (ARSB), iduronat-2-sulfataza (IDS), sulfamidaza/heparin-N-sulfataza (SGSH), N-acetilglukozamin-sulfataza (G6S) i N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza

(GALNS). END3 komplementarne grupe CHO ćelijske linije mogu da sadrže vektor

eksprimiranja za rekombinantnu ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS). END3 komplementarne grupe CHO ćelijske linije mogu eksprimirati i lučiti rekombinantne ljudske GALNS. END3 komplementarne grupe CHO ćelijske linije mogu biti izabrane iz grupe koju čine klon 4, klon 5, klon C6, klon C2, klon C5, klon Cl, klon CIO, klona Cll i klon C30. END3 komplementarne grupe CHO ćelijska linija koja može biti klon C2. END3 komplementarna grupa CHO ćelijske linije može biti prilagođena rastu u suspenziji.

[0014] Ovde su opisani rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzimi proizvedeni u skladu sa postupcima koji su ovde opisani i time prisutni u količinama koje omogućavaju terapeutsko korišćenje lizozomnih sulfataza enzima. Lizozomni sulfataza enzimi mogu biti proteini pune dužine ili njihovi fragmenti, mutanti, varijante ili derivati. Lizozomni sulfataza enzim ili njegov fragment, mutant, varijanta ili derivat može biti modifikovan po želji da poboljša svoju stabilnosti ili farmakokinetičke osobine (npr., PEGilacija, mutageneza, fuzija, konjugacija). Enzim može biti ljudski lizozomni sulfataza enzim, fragment ljudskog lizozomnog sulfataza enzima koji ima biološku aktivnost prirodnog sulfataza enzima ili polipeptid koji ima značajnu homologiju sekvence aminokiseline sa ljudskim lizozomnim sulfataza enzimom. Lizozomni sulfataza enzim može biti protein ljudske ili sisarske sekvence, porekla ili izvora. Lizozomni sulfataza enzim može biti takav da njegov nedostatak izaziva ljudsku bolest, kao što su metahromatska leukodistrofija ili MLD (tj. arilsulfataza A (ARSA)), Maroteauk-Lami sindrom ili MPS VI (tj. arilsulfataza B (ARSB)), Hunter sindrom ili MPS III (tj. iduronat-2-sulfataza (IDS)), Sanfilipo sindrom ili MPS lila (tj. sulfamidaza/heparin-N-sulfataza (SGSH)), Sanfilipo D sindrom ili MPS Illd (tj., N-acetilglucosamin- sulfataza (G6S)) i Morkio A sindrom ili MPS IVa (tj. N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)). Lizozomni sulfataza enzim može biti takav da njegov nedostatak izaziva Morkio A sindrom ili MPS IVa (tj., N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)). Lizozomni sulfataza enzim može biti takav daje njegov nedostatak povezan sa ljudskim bolestima, kao što je višestruki nedostatka sulfataze ili MSD (tj., N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)).

[0015] Lizozomni sulfataza enzim takođe može biti poreklom ili izvorom iz ljudske ili sisarske sekvence. Lizozomni sulfataza enzim može biti identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa odgovarajućim delom ljudske ili sisarske aminokiselinske sekvence lizozomnog sulfataza enzima. Polipeptid deo može biti prirodan lizozomni sulfataza enzim iz čoveka ili sisara. Lizozomni sulfataza enzim polipeptid može biti suštinski homologan (tj. najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%) ili 99% identičnosti aminokiselinskoj sekvenci) ćelom dužinom polipeptida, do prirodne lizozomni sulfataza enzim aminokiselinske sekvence ljudskog ili sisarskog enzima. Lizozomni sulfataza enzim može biti ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS). Sekvenca aminokiseline ljudskog GALNS je navedena u SEQ ID NO: 4, od čega aminokiseline 27 do 522 odgovaraju izlučenom prekursorskom proteinu. GALNS enzim može sadržati ili se sastojati od aminokiselinske sekvence najmanje oko 95%>, 96%, 97%, 98%o ili 99% identične sa aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4 ili sekvencu identičnom aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4. GALNS enzim poželjno zadržava katalitička mesta aminokiseline koja odgovaraju Cis na položaju 53. Mučeni prekursor protein (aminokiselina 79 iz SEQ ID NO: 4) sposoban je da bude pretvoren u Ca-formilglicin. GALNS enzim može takođe zadržati druge aminokiseline u aktivnim šupljinama, uključujući najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili sve naelektrisane aminokiseline: Asp288, Asn289, Asp39, Asp54, His236 , Lisl40, Hisl42, Lis310 i a-spiralu: Arg83. Sukegavva, Ljudsk Molecular Genetics, 2000, Vol. 9, No. 9 1283-1290, opisuje dodatne mutacije koje bi umanjile GALNS aktivnost kod pacijenata i korelira jačinu različitih mutacija na njihove 3-dimenzionalne lokacije unutar enzima.

[0016]Ovde opisan lizozomni sulfataza enzim može biti visoko fosforilisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim proizveden od strane endozomne ćelijske linije sa defektnom acidifikacijom, npr. CHO-izvedena END3 komplementarna grupa ćelijska linija. END3 komplementarna grupa ćelijska linija je svaka modifikovana ćelijska liniji CHO koja zadržava odlike komplementarnosti grupe ćelijske linije END3, poput defektne endozomne acidifikacije. CHO-izvedena END3 komplementarna grupu ćelija obelodanjena ovde ili njihov derivat, može biti G71 ćelijska linija, G71S ćelijske linije, ili G71 ili G71S derivat. Ovde opisani lizozomni sulfataza enzim može biti proizveden u bilo kojoj ćeliji domaćinu, npr., bilo kojoj CHO ćeliji ili CHO ćelija-izvedenoj liniji, kultivisanoj u uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje i sekreciju visoko fosforilisanog rekombinantnog lizozomnog sulfataza enzima pri relativno visokom prinosu, npr., u količinama od najmanje oko 0,5, najmanje oko 0,75, najmanje oko 1,0, ili najmanje oko 1,25 pikograma/ćelija/dan.

[0017]Ovde opisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim može imati visok nivo fosforilisanih oligosaharida (tj., veći od oko 0,25, poželjno veći od 0,5, a još poželjnije veći od oko 0,75 bis-fosforilisanih oligomanozniih lanaca po proteinskom lancu). [00181Ovde je opisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim, npr. GALNS, sa određenim visokim nivoom fosforilisanih oligosaharida. Na primer, ovde opisan lizozomni sulfataza enzim može imati od 0,5 do 1,0 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili od 0,5 do 0,9 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili od 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili od 0,5 do 0,75 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili od 0,54 do 0,75 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu . Drugi slični opsezi su razmatrani, npr. najmanje 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6 ili 0,65 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, do 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,98 ili 1,0 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili bilo koja kombinacija od bilo kojih od ovih brojeva. Enzim može biti rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS), npr. iz SEQ ID NO: 4.

[0019]Ovde opisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim može imati visok procenat (tj. najmanje oko 50%, 55%, 60%> ili 65%o, poželjno najmanje oko 70%, 75%, 80%>, 85% , 90%, ili 95%) konverzije aktivnog mesta cistein ostatka na Ca-formilglicin (FGly). U poželjnim otelotvorenjima, enzim je aktivna rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) i aktivno mesto cistein ostatka je Cis na položaju 53 (položaj 79 iz SEQ ID NO: 4).

[0020]Ovde opisan rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim može imati visok stepen fosforilisanih oligosaharida, npr. neki od ovde opisanih opsega ili nivoa bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, zajedno sa visokim procentom konverzije na aktivnom mestu cistein ostatak do Ca-formilglicina (FGly), npr., bilo koji od ovde opisanih procenata. Ovde opisan enzim može biti aktivna visoko fosforilisana rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS), npr. iz SEQ ID NO: 4.

[0021]Ovde je opisano daje najmanje 99,5%>, najmanje 99%>, najmanje 98,5%, najmanje 98%, najmanje 97%, najmanje 95%>, najmanje 90%>, najmanje 85%>, najmanje 80%>, najmanje 75%, najmanje 70%, ili najmanje 65% rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima, npr. GALNS (SEQ ID NO: 4), u obliku prekursora kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima ili SDS-kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE).

[0022]Pored toga, lizozomni sulfataza enzim, npr. GALNS (SEQ ID NO: 4), opciono takođe pokazuje specifičnu aktivnost koja je najmanje oko 30% (npr. 35%, 40%, 45%>, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-puta, 2,5-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 10-puta, 15-puta, 20-puta, 30-puta, 40-puta ili 50-puta) veća od specifične aktivnosti kontrolne lizozomnog sulfataza enzima iste aminokiselinske sekvence koja je proizvedena u ćelijama domaćinima (npr. CHO ćelijama ili CHO-izvedenim ćelijama) koje ne eksprimiraju rekombinantni ljudski SUMF1.

[0023]Opisan lizozomni sulfataza enzim, npr. GALNS (SEQ ID NO: 4), može pokazivati specifičnu apsorpciju (Kuptake) u fibroblaste koja je oko 0,1 do 10 nM, ili oko 0,1 do 7 nM, ili oko 0,5 do 5 nM, ili oko 1 do 5 nM, ili oko 1 do 3,5 nM, oko 1 nM, oko 1,5 nM, oko 2 nM, oko 2,5 nM, oko 3 nM ili oko 3,5 nM, ili bilo koju kombinaciju bilo kojih od ovih brojeva.

[0024]Ovde je opisano da najmanje oko 50%>, najmanje oko 55%>, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, ili najmanje oko 80% rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima, npr. GALNS (SEQ ID NO: 4), vezuje receptor kolonu manoza-6-fosfata.

[0025]Prema ovom aspektu, dati su pročišćeni preparati GALNS enzima u kojima GALNS (SEQ ID NO: 4) enzim ima čistoću od najmanje oko 95%>, 97%, 98%> ili 99% kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima. U nekim otelotvorenjima, značajna količina GALNS enzimske komponente pročišćenog preparata u formi izlučenog prekursora (npr. najmanje 98%, 98,5%, 99% ili 99,5%> prekursora), kako je utvrđeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima ili drugom postupku detekcije prekursora (npr., SDS-PAGE pod redukcionim uslovima sa Komasi plavim ili srebrnim bojenjem ili hromatografsko razdvajanje primenom HPLC (npr. C4 reverzna fazna (RP), C3 RP) ili hromatografija isključivanja veličine (SEC), ili kombinacija elektroforetskog razdvajanja i hromatografskog razdvajanje, npr. SDS-PAGE, praćeno kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE)).

[0026]U određenim otelotvorenjima, GALNS enzim pročišćenog komponenta preparata ima visok nivo fosforilisanih oligosaharida, npr. neki od opsega ili nivoa bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu koji su ovde opisani, zajedno sa visokim procentom konverzije aktivnog mesta cistein ostatka do Ca-formilglicina (FGly), npr., bilo koji od procenata ovde opisanih. U još određenijim otelotvorenjima, pročišćeni preparat ima Kuptake kako je ovde opisano.

[0027]U povezanim aspektima, predmetni pronalazak daje sterilne sastave koje sadrže GALNS enzim pročišćen postupcima koji su ovde opisani, zajedno sa sterilnim farmaceutski prihvatljivim rastvaračem, nosačem i/ili ekscipijensom. Takvi sterilni sastavi mogu imati oblik rastvora ili liofilizovanog praha, opciono u bočicama koje mogu biti rekonstituisane dodavanjem sterilnog razblaživača.

[0028]U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za pročišćavanje rekombinantnih ljudskih GALNS enzima koji se proizvode ovde obrađenim postupcima. Ovde opisani lizozomni sulfataza enzimi mogu biti pročišćeni korišćenjem procesa u dve kolone (boja-ligand hromatografija, npr. plava sefaroza i hromatografija izmene katjona, na primer, SE Hi-Cap), koji sadrže najmanje pet koraka pročišćavanja: (1) filtriranje prikupljenog materijala, odnosno, medijum kulture iz END3 komplementarne grupe CHO ćelijske linije ili njegovog derivata koji eksprimira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim; (2) pH prilagođavanje filtriranog materijala do pH 4,5 (da indukuje taloženje kontaminirajućih proteina); (3) nanošenje filtriranog pH-prilagođenog materijala na kolonu boja-ligand, na primer, crnu sefaroza kolonu, ispiranja kolone i eluiranje lizozomnog sulfataza enzima iz kolone; (4) nanošenje eluata iz kolone boja-ligand na kolonu izmene katjona, npr. SE Hi-Cap kolona, ispiranje kolone i eluiranje lizozomnog sulfataza enzima iz kolone; i (5) ultrafiltriranje i dijafiltriranje eluata iz katjonske izmene. Opciono, filtrirani materijal u koraku (1) je koncentrisan 10-20 puta ultrafiltracijom pre prilagođavanja pH. Opciono, ultrafiltriran i dijafiltriran lizozomni sulfataza enzima u koraku (5) je formulisan u formulacijski pufer. U naročito poželjnom otelotvorenju, lizozomni enzim je rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS).

[0029]Ovde opisani lizozomni sulfataza enzimi mogu biti pročišćeni korišćenjem procesa tri kolone (obuhvatnom hromatografijom, npr. zamena katjona SE Hi-Cap; hromatografijom posredovanja, npr. boja-ligand Kapto plavi cink helatna sefaroza FF ili obuhvatnim prijanjanjem i hromatografija poliranja, npr. TovoPearl Butil 650M, fenil sefaroza Hi-Sub ili fenil sefaroza Low-Sub) koji sadrži najmanje pet koraka pročišćavanja: (1) ultra filtriranje prikupljenog materijala, odnosno, medijuma kulture iz END3 komplementarne grupe CHO ćelijskih linija ili njihov derivat koji eksprimira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzima, od, na primer, Sartocon kasete, (30 kDa Hidrosart); (2) pH prilagođavanje filtriranog materijala do pH 4,5 (da indukuje taloženje kontaminirajućih proteina); (3) nanošenje filtriranog pH-prilagođenog prihoda na obuhvatnu kolonu, na primer, Fractogel EMD SE Hi-CAP (M) zamenu katjona, ispiranja kolone i eluiranjem lizozomnog sulfataza enzima iz kolone; (4) nanošenje eluata sa obuhvatne kolone na posredničku kolonu, na primer, boja-ligand Kapto crna, Kapto plav, cink helatna sefaroza FF ili obuhvatnim prijanjanjem, ispiranja kolone i eluiranje lizozomnog sulfataza enzima iz kolone; i (5) nanošenje eluata na kolonu za poliranje, na primer, TovoPearl Butil 650M, fenil sefaroze Hi-Sub ili fenil sefaroze Low-Sub, ispiranja kolone i eluiranje lizozomnog sulfataza enzima iz kolone. Isprani lizozomni sulfataza enzim iz koraka (5) je formulisano u formulacijski pufer. Opciono, eluirani lizozomni sulfataza enzim iz koraka (5) se ultrafiltrira zatim formuliše u formulacijskom puferu. Opciono, lizozomni sulfataza enzim iz kolone u koraku (4) je izložena do pH 3,5 za nisku pH virusnu inaktivaciju pre nanošenja na kolonu za poliranje u koraku (5). U naročito poželjnom otelotvorenju, lizozomni sulfataza enzim je rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza

(GALNS).

Predmetni pronalazak daje postupak pročišćavanja rekombinantnog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima, gde navedeni GALNS enzim sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID: 4, gde pomenuti GALNS enzim: ima čistoću od najmanje 95% kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje 50% konverziju cistein ostatka na položaju 53 na Ca-formilglicin (FGly), i između je 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanog oligomanoznog lanca po monomernom proteinskom lancu, i pri čemu je najmanje 98%> pomenutog GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno natrijum dodecil sulfat-kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE), koja sadrži: a) filtriranje medijuma kulture sadrži GALNS enzim koji se luči iz ćelijske linije sisara koja eksprimira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i rekombinantnog ljudskog GALNS enzima, ultrafiltriranje/dijafiltriranje filtriranog medijuma kulture, pri čemu je ultrafiltiran/dijafiltiran medijum kulture koncentrisan oko 20X, a filtriranje ugljem 20X koncentrisan ultrafiltiran/dijafiltiran medijum kulture; b) nanošenje ugljem filtriranog 20X ultrafiltiranog/dijafiltiranog medijuma kulture iz koraka a) na Zn-helatnu sefarozau FF obuhvatne kolone, ispiranja kolone pod takvim uslovima da se GALNS enzim zadržava na koloni, uz eluiranje GALNS enzima iz kolone; c) filtriranja eluata iz Zn-helatne sefarozae FF obuhvatne kolone u koraku b) kroz filter za uklanjanje virusa; d) podešavanje pH eluata iz Zn-helatne sefarozae FF obuhvatne kolone iz koraka c) do oko pH 4,5 ± 0,1, i filtriranje pH 4,5 prilagođenog eluata iz Zn-helatne sefarozae FF obuhvatne kolone; e) nanošenje pH 4,5-prilagodenog filtrata iz Zn- helatne sefarozae FF obuhvatne kolone iz koraka d) na kolonu izmene katjona Fractogel EMD SE Hi-Cap, ispiranje kolone pod takvim uslovima da se GALNS enzim zadržava na koloni, uz eluiranje GALNS enzima iz kolone; f) podešavanje pH eluata iz Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone zamene katjona iz koraka e) do oko pH 3,5 ±0,1 za virusnu inaktivaciju; g) prilagođavanje pH 3,5-virusno inaktiviranog eluata iz koraka f) do oko pH 5,0, a zatim

nanošenje pH 5,0-prilagođenog virusno inaktiviranog eluata na TovoPearl Butil 650M

kolonu za poliranje, ispiranja kolone pod takvim uslovima da se GALNS enzim zadržava na koloni, uz eluiranje GALNS enzima iz kolone;

h) pufer razmena eluata iz TovoPearl Butil 650M kolone za poliranje iz koraka g) u formulaciji koja sadrži 20mM NaOAc/HOAc, 50mm NaH2P04, 30mm arginin HCI, 2%

(v/v) sorbitol, pH 5,4, podešavanje koncentracija GALNS enzima u formulaciji do oko 3 mg/ml;

i) uklanjanje ostataka virusa i/ili DNK filtriranjem pufera razmenjene formulacije u koraku h) sa DV20 filterom i Mustang Q filterom; i

j) dodavanje polisorbat 20 (P20) formulaciji u koraku i) do konačne koncentracije od 0,01% (v/v).

[0030] U nekim otelotvorenjima, materijal se sakuplja u koraku (1) na pH od oko 6,5. U nekim otelotvorenjima, filter ugalj u koraku (1) je Zeta Plus R55 aktivni ugalj filter. U nekim otelotvorenjima, obuhvatna kolona u koraku (2) je Zn-IMAC kolona gde je Zn-IMAC kolona Zn-helatne sefarozae FF obuhvatne kolone. U nekim otelotvorenjima, filter u koraku (3) je Mustang Q filter. U nekim otelotvorenjima, pH kiselina eluata ili filtriranog eluat iz koraka (2) ili (3) se prilagođava u koraku (4) do oko 4,5 ± 0,1. U nekim otelotvorenjima, kolona posrednik u koraku (5) je kolona zamene katjona gde je kolona zamene katjona Fractogel EMD SE Hi-Cap kolona. U nekim otelotvorenjima, niska pH eluata iz kolone posrednika iz koraka (6) se prilagođava u koraku (6) do oko 3,5 ± 0,1. U nekim otelotvorenjima, kolona poliranja u koraku (7) je kolona hidrofobne interaktivne hromatografije (HIC) gde je HIC kolona je TovoPearl Butil 650M kolona.

[0031]U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži 20mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, 30 mM arginin HCI, 2% (v/v) sorbitola, pH 5,4. U nekim otelotvorenjima, nejonski surfaktant je polisorbat 20 (PS20). U nekim otelotvorenjima, koncentracija lizozomnog sulfataza enzima u formulaciji je prilagođena do oko 3 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni filter je filter DV20 i DNK filter je Mustang Q filtera. U nekim otelotvorenjima, nejonski surfaktant dodat formulaciji je polisorbat 20 (PS20) do konačne koncentracije od 0,01% (v/v).

[0032]Ovde je opisan pročišćen preparat aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) ili njen biološki aktivan mutant, varijanta ili derivat korisni za lečenje pacijenta koji pati od Mukopolisaharidoze tip IVa (MPS IVa) ili Morkio A sindroma. U poželjnom otelotvorenju, pročišćeni sastav aktivnih visoko fosforilisanog rekombinantnog ljudskog GALNS ima komponentu GALNS enzima koji ima: (a) čistoću od najmanje oko 95%, 97%, 98%, ili 99% kao što je određeno Komasi plavim bojenjem ili srebrnim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima; (b) najmanje oko 80%>, 85%>, 90%>, ili 95%> konverzije cistein ostatka na položaju 53 u Ca-formilglicinu (FGly) (položaj 79 iz SEQ ID NO: 4); (c) N-vezana glikozilacija na ostacima asparagina na položajima 178 i 397, pri čemu su neki od oligomanoznih lanaca vezani za asparagin ostatak na položaju 178 bis-fosforilacije; (d) od 0,5 do 0,8, ili od 0,5 do 0,75, ili od 0,54 do 0,75 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu (npr. bar 0,5, 0,55, 0,6 ili 0,65 i do 0,7, 0,75 ili 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, ili bilo koja kombinacija bilo kojih od ovih brojeva); i (e) najmanje 98%>, 98,5%, 99%> ili 99,5%> od GALNS enzima je u obliku prekursora kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima ili SDS-kapilarnom gel elektroforezom (SDS -CGE). Pored toga, GALNS enzim može opciono takođe (f) pokazati specifičnu aktivnost koja je najmanje oko 30%> (npr. 35%>, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2-puta, 2,5-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 10-puta, 15-puta, 20-puta, 30-puta , 40-puta ili 50-puta) veća od specifične aktivnosti kontrolnog GALNS enzima sekvence iste aminokiseline koja je proizvedena u ćelijama domaćinima (npr. CHO ćelija ili CHO-izvedene ćelije) koje ne eksprimiraju rekombinantni ljudski SUMF1. Opciono, GALNS enzim pokazuje specifičnu apsorpciju (Kuptake) u fibroblaste koje je oko 0,1 do 10 nM, ili oko 0,1 do 7 nM, ili oko 0,5 do 5 nM, ili oko 1 do 5 nM, ili oko 1 do 3,5 nM, oko 1 nM, oko 1,5 nM, oko 2 nM, oko 2,5 nM, oko 3 nM ili oko 3,5 nM, ili bilo koju kombinaciju bilo kojih od ovih brojeva.

[0033]Pročišćeni, aktivni visoko fosforilisan rekombinantni ljudski GALNS sastoji se od velike grupe od oko 55-60 kDa (tj. prekursor ljudskog GALNS ima najmanje 98%, najmanje 98,5%o, najmanje 99%>, ili najmanje 99,5% vidljivih proteina) i manjih grupa na -39 kDa i -19 kDa (tj. zreli ili obrađeni ljudski GALNS ima manje od oko 2%, manje od oko 1,5%, manje od oko 1% ili manje od oko 0,5% vidljivih proteina) kao što je određeno pomoću SDS-CGE. U naročito poželjnom otelotvorenju, pročišćeni, aktivni visoko fosforilisan rekombinantni ljudski GALNS sastoji se od jedne grupe od oko 55-60 kDa (tj. prekursor ljudskog GALNS) kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, ili kao što je određeno od strane SDS- CGE. U jednom otelotvorenju, pročišćeni, aktivni visoko fosforilisani rekombinantni ljudski GALNS je za upotrebu u lečenju MPS IVa ili Morkio A sindroma.

[0034]CHO-izvedena END3 komplementarna grupa ćelija ili njihov derivat je G71 ćelijska linija, G71 S ćelijska linija ili njihov G71 ili G71 S o kom je ovde govori.

[0035]Ovde se takođe govori o postupku terapije zamene enzima primenom terapeutski efikasne količine lizozomnog sulfataza enzima pacijentu kome je potrebna terapija zamene enzima, gde ćelije pacijenta imaju lizozome koji sadrže nedovoljne količine lizozomnog sulfataza enzima da spreče ili smanje oštećenja ćelija, pri čemu dovoljna količina lizozomnog sulfataza enzima ulazi u lizozome da spreči ili smanji oštećenja ćelija. Ćelije mogu da budu u okviru ili bez CNS ili ne moraju krenuti iz krvi sa kapilarnim zidovima čije endotelne ćelija su blisko zapečaćene za difuziju aktivnog agensa kratkim vezama.

[0036]Pročišćeni, aktivni visoko fosforilisani rekombinantni ljudski GALNS pročišćen postupcima iz ovog pronalaska sastoji se od velike grupe od oko 55-60 kDa (tj. prekursor ljudskog GALNS ima najmanje oko 98%, najmanje oko 98,5%>, u najmanje oko 99% ili najmanje oko 99,5%> vidljivih proteina) i manjih grupa na -39 kDa i -19 kDa (tj. zreli ili obrađeni ljudski GALNS ima manje od oko 2%, manje od oko 1,5%, manje od oko 1% ili manje od oko 0,5%> vidljivih proteina) kao što je određeno pomoću SDS-CGE. U naročito poželjnom otelotvorenju, pročišćeni, aktivni visoko fosforilisan rekombinantni ljudski GALNS sastoji se od jedne grupe od oko 55-60 kDa (tj. prekursor ljudskog GALNS) kao što je određeno od strane SDS- CGE. U jednom aspektu ovde je data primena bilo koje formulacije ovde opisane koja sadrži pročišćeni rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim za proizvodnji leka za lečenje pacijenta koji pati od Mukopolisaharidoze tip IVa (MPS IVa) ili Morkio sindroma.

[0037] Ovde su opisani farmaceutski sastavi koji sadrže aktivni visoko fosforilisani rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim kakvi su opisani gore i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu sadržati aktivnu visoko fosforilisanu rekombinantnu ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS) proizvedenu pomoću postupaka iz ovog pronalaska ijedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. Takvi farmaceutski sastavi mogu da budu pogodni za primenu na nekoliko načina kao što je intratekalna, parenteralna, topikalna, intranazalna, inhalaciona ili oralna primena. Farmaceutski sastavi mogu biti pogodni za parenteralnu primenu. Ovde opisane sekvence nukleinske kiseline, koje mogu da kodiraju lizozomni sulfataza enzim pune dužine ili njegove fragmente, mutante, varijante ili derivate, mogu se primenjivatiin vivou ćelije pogođene nedostatkom lizozomnog enzima.

[0038] Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu sadržati aktivnu visoko fosforilisanu rekombinantnu ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS) ili njen biološki aktivan fragment, mutant, varijantu ili derivat koji su proizvedeni pomoću postupaka prema pronalasku ijedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa za formulaciju koji sadrži jedan ili više pufera, ijedan ili više stabilizatora. Sastav može sadržati količinu fosfatnog pufera koji je efikasna da smanji defosforilaciju navedenog GALNS enzima; i stabilizujuću količinu jednog ili više stabilizatora izabranih iz grupe koju čine soli aminokiselina, puferi aminokiselina, surfaktanti i polioli; gde je navedena formulacija na pH od oko 5,0-5,8.

[0039]U nekim otelotvorenjima, GALNS enzim sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4, i ima: (i) čistoće od najmanje oko 95%> kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, (ii) najmanje oko 80% konverzije cistein ostatka na položaju 53 do Ca-formilglicina (FGly), i (iii) između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanog oligomanoznog lanca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 95% pomenutih GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno pomoću SDS-kapilarne gel elektroforeze. U nekim otelotvorenjima, GALNS enzim ima najmanje oko 90% konverzije cistein ostatka na položaju 53 do Ca-formilglicina (FGly). U nekim otelotvorenjima, između 50% do 80%> GALNS enzima se vezuje za receptor kolonu manoza-6-fosfata. U nekim otelotvorenjima, GALNS enzim ispoljava specifičnu apsorpciju (Kuptake) u fibroblast koji je oko 1 do 5 nM. U nekim otelotvorenjima, GALNS enzim ispoljava specifičnu apsorpciju (Kuptake) u fibroblast koji je oko 1 do 3,5 nM.

[0040]Koncentracija GALNS enzima u formulaciji je od oko 0,1 do 10 mg/ml, poželjno od oko 0,5 do 5 mg/mL i još poželjnije od oko 0,5 do 1,5 mg/mL.

[0041]U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži količinu fosfatnog pufera koja je efikasna u smanjenju defosforilacije pomenutog GALNS enzima gde je fosfatni pufer NaEhP04. U daljem otelotvorenju, formulacija dalje sadrži drugi pufer. U jednom otelotvorenju drugi pufer je pufer acetat, gde je acetatni pufer NaOAc/HOAc. Primeri pufera su detaljnije opisani u Detaljnom opisu.

[0042]Smatra se daje koncentracija NaOAc/HOAc u formulaciji od oko 10 do 30 mM. U povezanom otelotvorenju, koncentracija NaFL:P04 u formulaciji je od oko 25 do 75 mM. U izvesnim otelotvorenjima, pH formulacije je oko pH 5,0-5,8.

[0043]Formulacija može da sadrži stabilizujuću količinu jednog ili više stabilizatora izabranih iz grupe koju čine soli aminokiselina, puferi aminokiselina, surfaktanti i poliolo. U jednom otelotvorenju, stabilizator je arginin so ili pufer, opciono arginin hidrohlorid. U povezanom otelotvorenju, stabilizator je polisorbat, opciono polisorbat 20. Stabilizator može biti trihidrični ili viši šećerni alkohol, opciono sorbitol. Primeri stabilizatora su detaljnije opisani u Detaljnom opisu.

[0044]U nekim otelotvorenjima, stabilizatori su izabrani od Arginin HC1 ili Tween-20 (polisorbat 20), i sorbitola. U nekim otelotvorenjima, koncentracija Arginin HC1 u formulaciji je 10 do 50 mM. U drugom otelotvorenju, koncentracija Tween-20 je od oko 0,005 do 0,015% (v/v). U povezanom otelotvorenju, koncentracija sorbitola u formulaciji je od oko 1,0 do 3,0% (v/v). U jednom otelotvorenju, formulacija sadrži arginin so ili pufer, polisorbat, i poliol. Predmetni pronalazak daje formulaciju koja obuhvata a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen ovde opisanim postupkom, gde navedeni GALNS enzim sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%> identična aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4, i ima čistoću od najmanje 95%> kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje 50% konverziju cistein ostatka na položaju 53 u Ca-formilglicinu (FGly), i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanoh oligomanoznoh lanca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 98%> pomenutog GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno pomoću SDS-CGE, i b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji sadrže: (i) količinu fosfatnog pufera koja je efikasna da smanji defosforilaciju pomenutog GALNS enzima, gde je fosfatni pufer NaFbP04u koncentraciji od oko 25mM do 75mm; i (ii) stabilizujući iznos sledećeg: arginin so ili pufer, opciono arginin hidrohlorid, gde su arginin so ili pufer u koncentraciji od oko 10 mM do 50mm; polisorbat, opciono polisorbat 20; a trihidrični ili viši šećerni alkohol, opciono sorbitol; gde je navedena formulacija na pH od oko 5,0-5,8. Predmetni pronalazak takođe daje formulaciju koji sadrži a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen ovde opisanim postupkom, gde navedeni GALNS enzim sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%> identična aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4, i ima čistoću od najmanje 95%> kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje 50% konverziju cistein ostatka na položaju 53 u Ca-formilglicinu (FGly), i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanoh oligomanoznoh lanca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 98%> pomenutog GALNS enzima je u obliku prekursora kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada je podvrgnuto SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, i b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji sadrže: (i) NaOAc/HOAc i NaH2P04kao pufera, pri čemu je koncentracija NaOAc/HOAc oko 20 +/- 10 mM a koncentracija NaH2P04je 50 +/- 25 mm; i (ii) Arginin HC1, polisorbat 20 i sorbitol kao stabilizatori, pri čemu je koncentracija Arginin HC1 oko 30 +/- 20 mm, koncentracija polisorbata 20 je oko 0,01% +/- 0,005%> (v/v) i koncentracija sorbitola je oko 2,0% +/- 1,0% (v/v); i (iii) pH od oko 5,4 +/- 0,4.

[0045]Ovde se govori o postupku za prevenciju defosforilacije rekombinantnog ljudskog GALNS enzima obuhvata mešanje GALNS enzima i fosfatnog pufer, do konačne koncentracije fosfatnog pufera koja je između oko 25 mM i 75 mM. Količina defosforilacije se može smanjiti u poređenju sa formulacijom istog enzima u 1 mM fosfatni pufer, npr. pri testiranju posle 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci ili 6 meseci čuvanja na sobnoj temperaturi (npr. 25°C).

[0046]U naročito poželjnom otelotvorenju, farmaceutski sastav sadrži aktivno visoko fosforilisani rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen postupcima iz ovog pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa u formulaciji koja sadrži NaOAc/HOAc i NaH2P04kao pufere, i arginin HCI, Tween-20 (polisorbat 20) i sorbitol kao stabilizatore. Koncentracija GALNS u formulaciji je oko 1,0 +/- 0,5 mg/ml. Koncentracija NaOAc/HOAc u formulaciji je oko 20 +/-10 mM, a koncentracija NaH2P04 u formulaciji je oko 50 +/- 25 mM. pH formulacije je pH 5,4 +/- 0,4. Koncentracija arginina HCI u formulaciji je oko 30 +/- 20 mM. Koncentracija Tween-20 u formulaciji je oko 0,01 +/- 0,005% (v/v). Koncentracija sorbitola u formulaciji je oko 2,0+/- 1,0% (v/v).

[0047]Postupak za detekciju aktivnost lizozomnog sulfataza enzima sadrži (a) kultivisanje hondrocitnih ćelija od pacijenta sa nedostatakom lizozomnog sulfataza enzima, npr. pacijenta koji pati od Morkio sindroma, u uslovima koji pospešuju održavanje diferencijacije hondrocita; (b) dovođenje u kontakt hondrocita sa lizozomnim sulfataza enzimom koji degradira keratan sulfat; i (c) detektovanje nivoa keratan sulfata u ćelijama, pri čemu je smanjen nivo keratan sulfata u ćelijama u kontaktu sa lizozomnim sulfataza enzimom poređenju sa ćelijama koje nisu u kontaktu sa lizozomnim sulfataza enzimom indikativan za ovde opisane aktivnosti lizozomnog sulfataza enzima. Lizozomni sulfataza enzim može biti N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS). Kultivisanje može biti izvedeno u medijumu koji sadrži insulin faktor rasta 1 (IGF1), transformišući faktor rasta beta (TGF-P), transferin, insulin i askorbinska kiselina. Keratan sulfat može se detektovati konfokalnom mikroskopijom, ili preko vezivanja za anti-keratan sulfat antitela. Postupak može da se vrši sa lizozomnim sulfataza enzimom, uključujući prirodni ili rekombinantni ljudski enzim ili njegove fragmente ili varijante, uključujući varijante koje obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%> ili 100% identična prekursoru ljudskog enzima, bez njegove signalne sekvence, ili zrele forme.

[0048]Ovde je opisan test na bazi ćelija za merenje aktivnosti rekombinantnog ljudskog lizozomnog enzima pri degradiranju prirodnih supstrata. Postupak može sadržati (a) kultivisanje izolovane ljudske ćelije sa nedostatkom lizozomnog enzima pod uslovima u kojima se prirodni supstrati za lizozomni enzima akumuliraju; (b) dovođenje u kontakt ćelije sa lizozomnim enzimom; (c) lizom ćelije; (d) dodavanje ćelijskom lizatu enzima koji (i) je specifičan za prirodne podloge, i (ii) čepa male oligosaharide od prirodnih supstrata; (e) obeležavnje male oligosaharide sa detektabilnom grupom; (f) opciono razdvajanje obeleženih malih oligosaharida; (g) detektovanje obeleženih malih oligosaharida; i (h) određivanje aktivnosti lizozomnog enzima pri degradira prirodnih supstrata poređenjem (i) količine obeleženih malih oligosaharida iz ćelija koje su bile u dodiru sa lizozomnim enzimom sa (ii) količinom obeleženih malih oligosaharida iz ćelija koje nisu bile u dodiru sa lizozomnim enzimom, pri čemu smanjenje (h)(i) u poređenju sa (h)(ii) označava aktivnost lizozomnog enzima pri degradira prirodnih supstrata. Mali oligosaharida mogu biti mono-, di-, ili tri-saharidi. Mali oligosaharid može biti disaharid.

[0049]Pogodne ljudske ćelije koje se mogu koristiti u testu baziranom na ćelijama uključuju bilo koju ljudski ćeliju koja ima nedostatak lizozomnog enzima koji se testira tako da može akumulirati prirodne supstrate za lizozomni enzim. Na primer, mogu se koristiti ćelije koje prirodno imaju pun (100%) ili delimičan nedostatak aktivnosti, npr. 30%>, 50%>, 70%, 80%>, 90%, 95%o smanjenja aktivnosti ili više. Mogu se koristiti ćelije koje eksprimiraju mutirani enzim sa smanjenom aktivnošću, ili ćelije izvedene iz obolelih od bolesti lizozomnog skladištenja, npr. Mukopolisaharidoza. Mogu se koristiti ćelije koje su rekombinantno izmenjene da obore ili smanje aktivnost lizozomnog enzima, npr. uvođenjem mutacije koja kodira gen ili njegov promoter ili druga regulatorna regija. Mogu se koristiti ćelije tretirane da smanje aktivnost lizozomnog enzimska, npr. tretiran antisens ili RNK interferencije da se smanji eksprimiranje enzima.

[0050]Odgovarajući enzimi koji cepaju (digestuju) male oligosaharide iz ugljenih hidrata i koji su „specifični za" (tj. pretežno digestuju) prirodne supstrate lizozomnih enzima mogu biti odabrani od onih koji su prosečni stručnjaci u ovoj oblasti. Na primer, za detekciju aktivnosti GALNS ili GLB1 (enzima koji degradira keratan sulfat) enzim iz koraka (d) može biti Keratanaza II ili bilo koji enzim koji deluje prvenstveno na keratan sulfat. Kao drugi primer, za detektovanje IDU, ARSB, IDS ili GUSB (enzimi koji degradiraju dermatan sulfat), enzim iz faze (d) može biti Hondroitinaza ABC ili bilo koji enzim koji deluje prvenstveno na dermatan sulfat. Kao drugi primer, za detektovanje IDU, IDS, SGHS, G6S ili GUSB (enzimi koji degradiraju heparan sulfat), enzim iz faze (d) može biti Heparanaza I ili Heparanaza 11, ili oboje. Kao još jedan primer, za detektovanje GAA (enzim koji degradira glikogen), enzim iz koraka (d) može biti a-amilaza ili bilo enzim koji deluje prvenstveno na glikogen.

[0051]Ovaj postupak na bazi ćelija je sposoban za veliku osetljivost pri otkrivanju aktivnosti lizozomnog enzima. U nekim otelotvorenjima, aktivnost lizozomnog enzim može biti detektovana kada je koncentracija lizozomnog enzima niska oko 10 nM, ili oko 5 nM, ili oko 1 nM, ili oko 0,75 nM, ili oko 0,5 nM, ili oko 0,25 nM, ili oko 0,1 nM, ili oko 0,05 nM, ili oko 0,01 nM, ili oko 0,005 nM, ili oko 1 pM, ili oko 0,5 pM.

KRATAKOPIS SLIKA

[0052]Slika 1 opisuje nukleotidnu sekvencu ljudskog faktora 1 modifikovanja sulfataze (SUMFl)(SEQTDNO: 1).

Slika 2 opisuje aminokiselinsku sekvencu ljudskog faktora 1 modifikovanja sulfataze (SUMFl)(SEQIDNO:2).

Slika 3 opisuje nukleotidnu sekvencu ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze

(GALNS) (SEQ ID NO: 3).

Slika 4 opisuje aminokiselinsku sekvencu ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) (SEQ ID NO: 4). Signalni peptid od 26 aminokiselina na N-terminusu je odsutan kod obrađenih GALNS.

Slika 5 prikazuje strukturu i karakteristike obrađene ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) (SEQ ID NO: 5).

Slika 6 prikazuje eksprimiranje ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) iz G71S ćelije ko-transfektovane sa ljudskim faktorom 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i ljudskim GALNS vektorima eksprimiranja. (A) ispitivanje G71S klona za aktivni GALNS u 96-komorica. (B) GALNS produktivnost G71S klona u pikogramo po ćeliji dnevno.

Slika7 ilustruje šemu WAVE bioreaktor kontrolera koji se koristi za proizvodnju na veliko G71 S ćelija koje eksprimiraju ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS) i njene varijante.

Slika8 prikazuje stabilnost aktivnosti pročišćenog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima nakon čuvanja na 4°C (rombovi) ili na -70°C (trouglovi).Slika9 prikazuje pročišćavanje ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) putem (A) Plava sefaroza 6 Fast Flow hromatografije koju sledi sledi (B) Fractogel SE Hi-CAP hromatografija. Čistoća je određena Komasi plavim bojenjem SDS-PAGE (levo) i Western blotting korišćenjem (IVA) anti-GALNS antitela (desno).

Slika 10prikazuje pročišćavanje ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) putel ultrafiltracije/dijafiltracije (UF/DF), Fractogel SE Hi-Cap hromatografijom, Zn-helatnom sefaroznom hromatografijom i TovoPearl Butil 650M hromatografijom. Čistoća je određena Komasi plavim bojenjem SDS-PAGE (gore levo) i Western blotting korišćenjem anti-GALNS antitela (gore desno), anti-katepsin L antitela (dole levo) i anti-CHOP (proteini jajnih ćelija kineskog hrčka) (dole desno).

Slika 11prikazuje dijagrame toka procesa za oporavak ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) i proces pročišćavanja koji se koristi za proces Faze I/II (levo) i procesa Faze TIT (desno).

Slika 12prikazuje poređenje ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) pročišćene prema procesu Faze VII (putanja 3) ili procesa Faze III (putanja 5). Pet mikrograma (5 ug) pročišćenog GALNS je razdvojeno sa SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, a Gel je obojen sa Komasi plavim. Putanja 1 odgovara 15 uL SeeBlue PLUS2 Markeru. Molekulske masa u kDa su indikovane levo od obojenog gela.

Slika 13prikazuje amanjenje zavisno od doze u iznosu dermatan sulfat supstrata koje je primećeno kod GM01391 ćelija tretiranih sa IDU.

Slika 14prikazuje umanjenje zavisno od doze u iznosu dermatan sulfat supstrata koje je primećeno u GM00519 ćelijama tretiranim sa ARSB.

Slika 15prikazuje apsorpciju ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS), ili neobeleženu (krugovi) ili konjugovanu sa A488 (kvadrati) ili A555 (trouglovi), iz kultivisanih sinoviocita.

Slika 16prikazuje stabilnost pročišćenog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima nakon čuvanja tokom 1 ili 2 meseca na 5°C, na 25°C ili na 40°C kao što je naznačeno u formulaciji koja sadrži 15 mM arginin HCI, 30 mM arginin HCI, 15 mM NaCl ili 30 mM NaCI (paneli označeni kao 51, 52, 54 ili 55, respektivno) na pH 5,0, pH 5,4 ili pH 5,8 (paneli označeni kao A, B ili C, respektivno). Stabilnost je merena procentom (%) oblasti ispod pika GALNS agregata u formulaciji posle čuvanja kako je utvrđeno hromatografijom isključenja veličine-tečnom hromatografijom visokih performansi (SEC-HPLC).

Slika 17 prikazuje stabilnost aktivnosti pročišćenog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima nakon čuvanju 2 meseca na 5°C, na 25°C ili na 40°C kao što je naznačeno u formulaciji koja sadrži 15 mM arginin HCI, 30 mM arginin HCI, 15 mM NaCl ili 30 mM NaCI (paneli označeni kao 51, 52, 54 ili 55, respektivno) na

pH 5,0, pH 5,4 ili pH 5,8 (paneli označeni kao A, B ili C, respektivno).

Slika 18 prikazuje profil glikozilacionog pročišćenog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima nakon čuvanja 2 meseca na 5°C, na 25°C ili na 40°C kao što je naznačeno u formulaciji koja sadrži 15 mM arginin HCI, 30 mM arginin HCI, 15 mM NaCl ili 30 mM NaCI, na pH 5,0, pH 5,4 ili pH 5,8, kako je naznačeno. Procenat bis-fosforilisane manoze 7 (BPM7) merenje kapilarnom elektroforezom (CE) posle digestije GALNS enzima sa PNGazom F za cepanje asparagin N-vezanih oligosaharida. Referenca ukazuje procenat BPM7 za referentnu seriju GALNS čuvanu tokom 2 meseca na 5°C, na 25°C ili na 40°C, kao što je naznačeno u formulaciji koja sadrži 100 mM fosfatni pufer.

Slika 19 prikazuje stabilnost pročišćenog ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima nakon čuvanja 2 meseca na 5°C, na 25°C ili na 40°C kao što je naznačeno u formulaciji koja sadrži 15 mM arginin HCI, 30 mM arginin HCI, 15 mM NaCl ili 30 mM NaCI (paneli označeni kao 51, 52, 54 ili 55, respektivno) na pH 5,0, pH 5,4 ili pH 5,8 (paneli označeni kao A, B ili C, respektivno). Stabilnost GALNS enzima merena je procentom (%) oblasti ispod pika GALNS enzima u formulaciji posle čuvanja kao što je određeno pomoću reverzno fazne-tečne hromatografijom visokih performansi (RP-HPLC).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0053] Predmetni pronalazak se odnosi na otkriće postupka koja miri potrebu za proizvodnjom u velikim razmerama rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima sa potrebom za aktivnim visoko fosforilisovanim lizozomnim sulfataza enzim proizvodom koji je efikasna u navođenju lizozoma i stoga je terapeutski efektivan.

[0054]Terapeutska efikasnost sastava lizozomnog enzima zavisi od nivoa manoza-6-fosfata u tom sastavu. Fosfat se dodaje ciljanom glikoproteinu putem post-translacione modifikacije u endoplazmatični retikulum i početak Goldžijevog aparata. Savijeni lizozomni enzimi pokazuju jedinstvenu tercijarnu odrednicu koja je priznata od strane oligosaharidne izmene enzima. Determinanta se sastoji od niza specifično razmaknutih lizina i nalazi se na većini lizozomnih enzima uprkos odsustvu primarne sekvence homologije. Modifikacioni enzim, UDP-GlcNAc fosfotransferaza, vezuje se za determinante proteina i dodaje GlcNAc-1-fosfat na 6-položaj terminalnih manoza ostataka na oligosaharidima neposredna mestima vezivanja; drugi enzim, fosfodiestar a-GlcNAcaza zatim otcepljuje GlcNAc-fosfatnu vezu dajući manoza-6-fosfat terminalni oligosaharid (Canfield et al., U.S. Patent No. 6,537,785). Svrha manoza-6-fosfat modifikacije je preusmeravanje lizozomnih enzima od sekretornog puta ka lizozomnom putu unutar ćelije. Enzim koji nosi manoza-6-fosfat je vezan putem MPR u trans Goldžijevom aparatu i usmeren na lizozom umesto na površinu ćelije.

[0055]Pored prisustva manoza-6-fosfat markera na lizozomnim enzim oligosaharidima, lizozomno usmeravanje enzima zavisi od acidifikacije tranzitnih endozomima koji proizilaze iz kraja trans Goldžijevog aparata. Hemijsko gašenje u kiseloj sredini u okviru ovih endozomima sa difuzabilnim osnovnim molekulima rezultuje u prepuštanju vezikularnog sadržaja, uključujući lizozomne enzime, u ekstracelularni miljea (Braulke et al, Eur. J. Cell Biol. 43(3): 316-321, 1987). Acidifikacija zahteva određenu vakularnu ATPazu ugrađenu u membranu endozoma (Nishi et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(2): 94-103, 2002). Od neuspeha ove ATPaze se očekuje da poveća lučenje lizozomnog enzima na račun lizozomnog rutiranje. Od proizvodnih ćelijskih linija koje nose nedostatke u vakularnu ATPazu se očekuje da spreče neproduktivnu odlivanje fosforilisanog rekombinantnog enzima u intracelularni lizozomne odeljak.

[0056]U 1984., mutant ćelije jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO) specifično defektne u endozomnoj acidifikaciji generisane su i okarakterisane (Park et al, Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150, 1991). CHO-K1 ćelije su hemijski mutirane i izabran za opstanak na povišenim temperaturama u prisustvu toksina. Ti toksini su zahtevali endozomnu acidifikaciju za potpuno ispoljavanje svoje smrtnosti (Marnell et al, J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). U prethodnom ispitivanju, koktel dva toksina sa različitim mehanizmima delovanja je izabran da se izbegne izbor rezistencije na specifične toksine. Princip je da, iako je mala verovatnoća slučajnih povoljnih mutacija koje dovode do otpornosti na jedan konkretan toksin, verovatnoća za dve simultane slučajne povoljne mutacije specifične za dva potpuno različita toksina ne postoji. Selekcije su izvedene na povišenoj temperaturi kako bi se omogućile temperaturno osetljive mutacije. Ova genetičko ispitivanje rezultovalo je u dva mutanta, od kojih je jedan označen kao G.7.1 (G71), koji su otporni na toksine na povišenim temperaturama. Lezija u G71 nije zbog apsorpcije ili mehanizma delovanja dva toksina, nego je rezultat nesposobnosti klona da acidifikuje endozome na povišenim temperaturama. Ova nesposobnost je takođe evidentna na dozvoljenim temperaturama (34°C), mada u manjoj meri. Za G71 ćelije je takođe otkriveno da su auksotrofne za gvožđe na povišenim temperaturama, uprkos normalnom preuzimanju transferina iz medijuma (Timchak et al., J. Biol. Chem. 261(30): 14154-14159, 1986). Pošto je gvožđe oslobođeno iz transferina samo na niskom pH, auksotrofnost za gvožđe uprkos normalnoj apsorpciji transferina ukazuju na neuspeh endozomne acidifikacije. Drugo ispitivanje je pokazalo da se defekt acidifikacije prvenstveno manifestuje u endozomima umesto lizozoma (Stone et al., J. Biol. Chem. 262(20): 9883-9886, 1987). Podaci o G71 bili su u skladu sa zaključkom daje mutacija dovela do destabilizacije vakularne ATPaze odgovorne za endozomnu acidifikaciju. Destabilizacija je bila najvidljivija na povišenim temperaturama (39,5°C) ali je delimično izražena čak i na nižim temperaturama (34°C). Proučavanje saobraćanja dva endogena lizozomna enzima, katepsin D i alfa-glukozidaze, u G71 ćelijama (Park et al., Somat. Cell Mol. Genet. 17(2):137-150, 1991) pokazala je da su oba enzima kvantitativno lučena na povišenim temperaturama, a nije bilo uticaja na glikozilaciju enzima. Sekrecija fosforilisane kiseline alfa-glukozidaze je značajno poboljšana na nedozvoljenim temperaturama.

[0057]Terapeutska efikasnost sastava lizozomnog sulfataza enzima ne zavisi samo od nivoa manoza-6-fosfata, nego takođe zavisi od prisustva aktivnog enzima u tom sastavu. Sve poznate sulfataze sadrže cistein ostatak na svom katalitičkom mestu; ovaj cistein ostatak je post-translatorno modifikovan do Ca-formilglicina (FGly) kako bi aktivirao enzim. Ova cistein do FGly post-translatorna aktivacija enzima, koji je katalizovana faktorom 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1), javlja se u okviru endoplazmatičnog retikuluma na nesavijenim sulfatazama odmah posle translacije, pre navođenja sulfataze na lizozom (Dierks et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968, 1997). Značaj ove jedinstvene post-translacione modifikacije je istaknuta činjenicom da mutacije u SUMF1, koji dovode do oštećenog FGly formiranja kod lizozomnog sulfataza enzima, izazvaju višestruki nedostatak sulfataze (MSD) kod ljudi (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005). [00581Prema tome, sposobnost G71 ćelija, mutiranih CHO ćelija koje su defektne u endozomnoj acidifikaciji, da koeksprimiraju rekombinantni ljudski enzim za modifikaciju sulfataze (SUMF1) i ljudski lizozomni sulfataza enzima daje mehanizam za proizvodnju u velikim razmerama aktivnih visoko fosforilisanih rekombinantnih ljudskih lizozomnih sulfataza enzima korisnih za upravljanje poremećaja skladištenja lizozoma izazvanih ili povezanih sa nedostatkom takvih lizozomnih sulfataza enzima.

I. DEFINICIJE

[0059]Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje koje obično podrazumeva onaj koje uobičajeno stručan u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Sledeće reference daju stručnjaku u oblasti opštu definiciju mnogih termina koji se koriste u ovom pronalasku:. Singleton et al.,

DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE

CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); i Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

[0060]Napominje se da kad se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine uključuju množinu reference ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0061]Kad se ovde koriste, sledeći termini imaju značenja koja su im pripisana ukoliko drugačije nije naznačeno.

[0062]„Alelna varijanta" se odnosi na bilo koji od dva ili više polimorfnih oblika gena koji zauzimaju isti genetski lokus. Alelne varijacije nastaju prirodno putem mutacija, i mogu rezultirati fenotipskim polimorfizmom unutar populacije. Genetske mutacije mogu da budu tihe (tj., nema promene u kodiranom polipeptidu) ili mogu kodirati polipeptide koji imaju izmenjene aminokiselinske sekvence. „Alelne varijante" takođe se odnose na cDNK poreklom iz iRNK transkripata genetskih alalnih varijanti, kao i proteine koje on kodira.

[0063]„Amplifikacija" se odnosi na bilo koji način kojim je polinukleotidna sekvenca kopirana i tako proširen na veći broj polinukleotidnih molekula, npr. putem reverzne transkripcije, polimeraze lančane reakcije, i ligaze lančane reakcije.

[0064]Prva sekvenca je „besmislena sekvenca" u odnosu na druge sekvence ako polinukleotid čija sekvenca je prva sekvenca koja specifično hibridizuje sa polinukleotidom čija sekvenca je druga sekvenca.

[0065] „cDNK" se odnosi na DNK koji je komplementaran ili identičan iRNK, bilo u jednolančanom ili dvolančanom obliku.

[0066] Konvencionalna notacija se ovde koristi da opiše polinukleotidne sekvence: levi kraj jednolančane polinukleotidne sekvence je 5'-kraj; levi smer dvolančane sekvence polinukleotida naziva se 5'-pravac. Smer od 5' do 3' dodavanja nukleotida do nastajućih RNK transkripata se označava kao smer transkripcije. DNK lanac koji imaju istu sekvencu kao mRNK se spominje kao „kodirajući lanac"; sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao mRNK transkribovan iz te DNK i koja se nalazi od 5' do 5'-kraj RNK transkripta se označavaju kao „uzvodne sekvence"; sekvence na DNK lancu koje imaju istu sekvencu kao RNK i koji su od 3' do 3'-kraj transkripta kodirajuće RNK se nazivaju „nizvodne sekvence".

[00671 „Komplementarno" se odnosi na topološku kompatibilnosti ili zajedničko uparivanje aktivnih površina dva polinukleotida. Stoga, dva molekula se mogu opisati kao komplementarna, i dalje, karakteristike dodirne površine su komplementarne međusobno. Prvi polinukleotid je komplementaran drugom polinukleotidu ako je nukleotidna sekvenca prvog polinukleotida identična sa nukleotidnom sekvencom vezivnog polinukleotidnog partnera drugog polinukleotida. Stoga, polinukleotid čija sekvenca je 5'-TATAC-3'je komplementaran sa polinukleotidom čija je sekvenca 5'-GTATA-3'. Nukleotinda sekvenca je „suštinski komplementarana" sa referentnom nukleotidnom sekvencom ako je sekvenca komplementarna sa predmetnom nukleotidnom sekvencom značajno identična referentnoj nukleotidnoj sekvenci.

[0068] „Konzervativna supstitucija" se odnosi na supstituciju u polipeptidu aminokiseline sa funkcionalno sličnom aminokiselinom. Sledećih šest grupa svaka sadrži aminokiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (K); 4) Arginin (R), Lizin (K);

5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); i

6) Fenilalanin (F), Tirozin (I), Triptofan (V).

[0069] Izraz „fragment" kada se koristi u vezi sa polipeptidima odnosi se na polipeptide koji su kraći od polipeptida pune dužine na osnovu isecanjem na N-terminusu ili C-terminusu proteina, ili oboje, i/ili brisanja unutrašnjeg dela ili regije proteina. Fragmenti polipeptida mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci.

[0070] Izraz „mutant" kada se koristi u vezi sa polipeptidima, odnosi se na polipeptide u kojima je jedna ili više aminokiselina proteina zamenjena različitim aminokiselinama. Supstitucija aminokiselina može da bude konzervativna supstitucija, kako je iznad definisano, ili može biti nekonzervativna supstitucija. Mutant polipeptidi mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci.

[0071] Izraz „derivat" kada se koristi u vezi sa polipeptidima odnosi na polipeptide hemijski modifikovane takvim tehnikama kao što su, na primer a ne za ograničenje, ubikvitinacija, obeležavanje (npr. sa radionuklidima ili različitim enzimima), vezivanje sa kovalentno, polimerima kao što je pegilacijom (tj. derivatizaciju sa polietilen glikolom) i umetanjem ili supstitucijom hemijskom sintezom aminokiselina kao što je ornitin, koji se normalno ne javljaju u ljudskim proteinima. Izvedeni polipeptidi mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci.

[0072] Izraz „derivat" kada se koristi u vezi sa ćelijskim linijama odnosi se ćelijske linije koje su potomci roditeljske ćelijske linije; Na primer, ovaj izraz obuhvata ćelije koje su dodavane ili subklonirane od roditeljskih ćelija i zadržavaju željene osobine, potomci roditeljske ćelijske linije koji su mutirani i odabrani za čuvanje željene osobine, i potomci roditeljske ćelijske linije koje imaju izmene tako da sadrže različite vektore eksprimiranja ili različite egzogeno dodate nukleinske kiseline.

[0073] „Detektovanje" se odnosi na određivanje prisustvo, odsustvo ili količine analita u uzorku, i može uključivati kvantifikovanje količine analita u uzorku ili po ćeliji u uzorku.

[0074] „Deo koji može da se detektuje" ili „obeleživač" odnosi na sastav koji može da se detektuje spectroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim ili hemijskim načinima. Na primer, korisni obeleživači uključuju<32>P,<35>S, fluorescentne boje, elektronski guste reagense, enzime (npr., kao što se obično koristi u ELISA), biotin-streptavadin, diokigenin, haptene i proteine za koje su antiserum ili monoklonska antitela dostupni, ili molekule nukleinske kiseline sa sekvencom komplementaranom za cilj. Deo koji može da se detektuje često generiše merljiv signal, kao što je radioaktivan, hromogen ili fluorescentni signal, koji se može koristiti da se kvantifikuje količina vezana delom koji može da se detektuje u uzorku. Deo koji može da se detektuje može ugraditi u ili pripojiti prajmeru ili sondi bilo kovalentno ili preko jonskih, van der Valsovih ili vodoničnih veza, npr. inkorporacijom radioaktivnih nukleotida ili biotinilovanih nukleotida koje prepoznaje streptavadin. Deo koji može da se detektuje može biti direktno ili indirektno detektovan. Indirektno detektovanje može uključivati vezivanje drugog dela koji se može direktno ili indirektno detektovati na deo koji može da se detektuje. Na primer, deo koji može da se detektuje može biti ligand partnera za vezivanje, kao što je biotin, koji je partner za vezivanje za streptavadin ili nukleotidna sekvencom, koja je partner za vezivanje za komplementarnu sekvencu, na koju se može da se specifično hibridizuje. Partner za vezivanja može sam da bude direktno detektovan, na primer, antitelo može samo da bude obeleženo sa fluorescentnim molekulom. Partner za vezivanje se takođe može indirektno detektovati, na primer, nukleinska kiselina koja ima komplementarnu nukleotidnu sekvencu može biti deo razgranatog DNK molekula koji se zauzvrat može detektovati preko procesa hibridizacije sa drugim obeleženim molekulima nukleinske kiseline, (pogledati, npr., Fahrlander et al., Bio/Technology 6:1165, 1988). Kvantitativno određivanje signala se postiže, na primer, scincilacionim brojanjem, denzitometrijom ili protočnom citometrijom.

[0075] „Dijagnostifikovanje" znači identifikovanje prisustva ili prirode patološkog stanja. Dijagnostički postupci se razlikuju po svojoj specifičnosti i selektivnosti. Iako pojedinačni dijagnostički postupak ne može dati definitivnu dijagnozu stanja, dovoljno je ako postupak daje pozitivan pokazatelj koji pomaže u dijagnostici.

[0076] Izraz „efikasna količina" označava dozu koja je dovoljna da proizvede željeni rezultat na zdravstveno stanje, patologiju, i bolesti pacijenta ili za dijagnostički svrhu. Željeni rezultat može sadržati subjektivno ili objektivno poboljšanje kod primaoca doze. „Terapeutski efikasna količina" se odnosi na onu količinu agensa koja je efikasna da proizvede namenjeno povoljno dejstvo na zdravlje.

[0077]„Kodiranje" se odnosi na usađenu osobinu specifičnih sekvenci nukleotida u polinukleotidu, poput gena, cDNK, ili mRNK, da služe kao šablon za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima koji imaju ili definisanu sekvenca nukleotida (tj. rRNK, tRNK i iRNK) ili definisanu sekvencu aminokiselina i rezultujuće biološke osobine. Stoga, gen kodira protein ako transkripcija i translacija mRNK proizvedeni od strane tog gena proizvode protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu. Kako kodirajući lanac, čija je nukleotidna sekvenca identična sa mRNK sekvencom i obično se dobij a u sekvenci unosa, tako i nekodirajući lanac, koji se koristeise kao šablon za transkripciju, gena ili cDNK, mogu biti označena kao da kodiraju protein ili drugi proizvod tog gena ili cDNK. Ukoliko nije drugačije naznačeno, „nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu" obuhvata sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedna druge i kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. Nizovi nukleotida koji kodiraju proteine i RNK mogu uključivati introne.

[0078]„Ekvivalentna doza" odnosi se na dozu, koja sadrži istu količinu aktivnog agensa.

[00791„Sekvenca kontrole eksprimiranja" odnosi se na nukleotidne sekvence u polinukleotidu koje regulišu ekspremiranje (transkripciju i/ili translaciju) nukleotidne sekvence operativno povezane na nju. „Operativno povezan" označava funkcionalnu vezu između dva dela u kojima aktivnost jednog dela (na primer, sposobnost da reguliše transkripciju) rezultuje akcijom sa druge strane (npr. transkripcija sekvence). Sekvence kontrole eksprimiranja mogu uključiti, na primer i bez ograničenja, sekvence promotera (npr. inducibilne ili konstitutivne), pojačivače, terminatore transkripcije, početni kodon (tj. ATG), spajanje signala za introne, i zaustavni kodona.

[0080]„Vektor eksprimiranja" odnosi se na vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji sadrži sekvence kontrole eksprimiranja operativno povezane sa nukleotidnom sekvencom koja se eksprimira. Vektor eksprimiranja sadrži dovoljne cis-delujuće elemente za eksprimiranje; drugi elementi za eksprimiranje mogu biti isporučeni od strane ćelije domaćina iliin vitrosistemu za eksprimiranje. Vektori eksprimiranja uključuju sve one poznate u struci, kao što su kozmidi, plazmidi (npr. goli ili sadržani u lipozomima) i virusi koji inkorporiraju rekombinantni polinukleotid.

[0081]„Visoko fosforilisan", „visok nivo fosforilacije" i „visok nivo fosforilisanih oligosaharida" odnose se na pripreme lizozomne sulfataza enzima u kojima se najmanje 50% lizozomnog sulfataza enzima vezuje za katjon-nezavisan manoza-6- fosfat receptor putem fosforilisanih oligosaharida. Vezivanje je dalje okarakterisano osetljivošću na nadmetanje sa manoza-6-fosfatom. Visoko fosforilisan lizozomni sulfataza enzim može se takođe odnositi na lizozomni sulfataza enzima sa najmanje 0,25, poželjno bar 0,5, i još poželjnije najmanje 0,75 bis-fosforilisanog oligomanoznog lanaca po lancu proteina. Alternativno, visoko fosforilisana lizozomni sulfataza enzim (GALNS) se može odnositi na enzim kom je specifična apsorpcija, Kuptake (koncentracija enzim/ligand koja daje polovinu maksimalne apsorpcione vrednosti), u fibroblastima oko 0,1 do 10 nM, ili oko 0,1 do 7 nM, ili oko 0,5 do 5 nM, ili oko 1 do 5 nM, ili oko 1 do 3,5 nM, oko 1 nM, oko 1,5 nM, oko 2 nM, oko 2,5 nM, oko 3 nM ili oko 3,5 nM , ili bilo koja kombinaciju jednog od ovih brojeva.

[0082]„Bis-fosforilisani oligomanozni lanci", kako se ovde koristi, odnosi se na manozu koja sadrži oligosaharidne lance koji su N-vezani za asparagin ostatke u lizozomnom sulfataza enzimu i sadrži dva manoza-6-fosfat ostatka. Tipično, bis-fosforilisani oligomanozni lanci imaju 7 manoznih ostataka, tj., bis-fosfat manoza 7 (BPM7), koji su povezane sa dva GlcNAc ostatka, koji su za uzvrat povezani sa asparagin ostatkom u lizozomnom sulfataza enzimu.

[0083]„Aktivno", „aktivirano" i „visok nivo aktivacije" odnosi se na preparate lizozomnog sulfataza enzima u kojima je najmanje 50%>, 55%, 60%>, 65%>, poželjno najmanje 70%, 75%, 80% , 85%o, 90%o, ili 95% proteinovog aktivnog mesta cistein ostatka post-translatorno modifikovano do Ca-formilglicina (FGly). Alternativno, „aktivnio", „aktivirano" i „visok nivo aktivacije" odnosi se na pripreme lizozomnog sulfataza enzima koje pokazuju specifičnu aktivnost koja je najmanje oko 30% (npr. 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%o, 90%, 95%o, 2-puta, 2,5 puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 10-puta , 15-puta, 20-puta, 30-puta, 40-puta ili 50-puta) veća od specifične aktivnosti kontrolne sekvence lizozomnog sulfataza enzima iste aminokiseline koja je proizvedena u ćelijama domaćinima (npr. CHO ćelijama ili CHO-izvedenim ćelijama) koje ne eksprimiraju rekombinantni ljudski SUMF1. Odgovarajuća kontrolna priprema lizozomnog sulfataza enzima poželjno ima istu aminokiselinsku sekvencu kao visoko aktivne pripreme i eksprimira isti gena koristeći isti promoter ili regulatornu sekvencu/sekvence u istoj ćeliji domaćinu, osim što ćelija domaćin ne eksprimira rekombinantni ljudski SUMF1, proizvedena je pod istim ili sličnim uslovima, uključujući kultivisanja za isti vremenski period kulture, i opciono je pročišćena na isti ili sličann način kao visoko aktivna priprema.

[0084]„Aktivno visoko fosforilisano" odnosi se na pripreme lizozomnog sulfataza enzima u kojima je najmanje 50%, poželjno najmanje 70%, poželjnije najmanje 90%, ajoš poželjnije najmanje 95%> proteinovog aktivnog mesta cistein ostatka post-translatorno modifikovano do Ca-formilglicina (FGly) i sa najmanje 0,25, poželjno bar 0,5, ajoš poželjnije najmanje 0,75 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po proteinskom lancu.

[0085]Izraz „biološki aktivan" označava polipeptid (tj., enzim) fragmente, mutante, varijante ili derivate koje zadržavaju najmanje znatnu količinu (npr., najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 70%, ajoš poželjnije najmanje oko 90%) jedne ili više bioloških aktivnosti polipeptida pune dužine. Kada se koristi u vezi sa lizozomnim sulfataza enzimom, njegovi biološki aktivni fragment, mutant, varijanta ili derivat zadržavaju najmanje značajnu količinu aktivnosti sulfataze (tj., cepanje sulfatnih estera od njegovih ciljnih supstrata). Kada se koristi u odnosu na faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1), biološki aktivni fragment, mutant, varijanta ili derivat zadržava najmanje značajnu količinu aktivnosti stvaranja formilglicina (tj., modifikacija aktivnog mesta cistein ostatka lizozomnog sulfataza enzima do Ca - formilglicina (FGly)).

[0086]Izraz „čist" ili „pročišćen" kada se koristi u vezi sa polipeptidima odnosi se na količinu polipeptida koja je analiziran u odnosu na bilo koje kontaminirajuće supstance koje se mogu detektovati korišćenjem određenih postupaka. Za rekombinantni lizozomni sulfataza enzim pronalaska, „čistoća" se može odrediti podvrgavanjem pripreme sulfataza enzima elektroforetskom razdvajanju pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima, zatim bojenjem sa Komasi plavom ili srebrom, ili hromatografskim razdvajanjem po HPLC (npr. C4 reverzna faza (RP), C3 RP) ili nekim drugim hromatografskim razdvajanjem, npr. isključenjem veličine (SEC) i slično. Korišćenjem nekog od ovih postupaka, pročišćeni rekombinantni lizozomni sulfataza enzim pronalaska ima čistoću od najmanje oko 80%>, ili najmanje oko 85%>, poželjno najmanje oko 90%>, još poželjnije najmanje oko 95%>, a čak još poželjnije najmanje oko 97%, 98% ili 99%.

[0087]Izraz „prekursor" ili „prekursorski oblik" odnosi se na oblik rekombinantnog lizozomnog sulfataza enzima koji se izlučuje iz ćelije sisara, odnosno nema signalnu sekvencu, ali ima nedostatak određenih modifikacije, npr., unutrašnje cepanje proteina, koje se obično javljaju u lizozomu. Izraz „zreo", „zreo oblik", „obrađen" ili oblik" odnosi se na oblik rekombinantnog lizozomnog sulfataza enzima koji obično postoji u lizozomu. Za rekombinantni lizozomni sulfataza enzim pronalaska, može se odrediti relativno obilje „prekursora" ili „ prekursorskih oblika" i „zrelih", „zrelih oblika", „obrađenih" ili „obrađenih oblika" podvrgavanjem preparata sulfataza enzima elektroforetskom odvajanju pomoću SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, praćeno bojenjem sa Komasi plavim ili srebrom, ili hromatografskim razdvajanjem pomoću HPLC (npr. C4 reverzna faza (RP), C3 RP) ili bilo kojim drugim hromatografskim razdvajanjem, npr., isključenje veličine (SEC ) i slično, ili kombinacijom elektroforetskog razdvajanja i hromatografskog razdvajanje, npr. SDS-PAGE praćeno kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE). Korišćenjem ovih postupaka, pročišćeni rekombinantni lizozomni sulfataza enzimi pronalaska sastoje se od najmanje oko 65%, 70%, odnosno 75%, poželjno najmanje oko 80% ili 85%, još poželjnije najmanje oko 90%, ajoš poželjnije najmanje oko 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% ili 99,5% „prekursora" ili „prekursorskog oblika". Alternativno, koristeći ove postupke, pročišćeni rekombinantni lizozomni sulfataza enzimi pronalaska sastoje se od manje od oko 35%, 30%> ili 25%, poželjno manje od oko 20%> ili 15%>, još poželjnije manje od oko 10%>, pa čak i više poželjno manje od oko 5%, 3%, 2%, 1,5%, 1% ili 0,5% „zrelih", „zrelih oblika", „obrađenih" ili „obrađenih oblika". U nekim otelotvorenjima, samo „prekursor" ili „prekursorski oblik" je detektovan (tj. priprema sulfataza enzima se u osnovi sastoji od jedne detektovane grupe kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, ili kao što je određeno pomoću SDS-CGE ili jedan pik kada se analiziraju pomoću HPLC).

[0088] Izrazi „identičan" ili procenat „identičnosti" u kontekstu dva ili više polinukleotida ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se porede i poravnaju za maksimalno međusobno odgovaranje, mereno korišćenjem jednog od narednih algoritama za poređenje sekvenci ili vizuelnim pregledom.

[0089] „Veznik" se odnosi na molekul koji spaja dva druga molekula, bilo kovalentno ili kroz jonske, van der Valsove ili vodonične veze, npr., molekul nukleinske kiseline koji hibridizuje do jedne komplementarnu sekvence na 5' kraju i na drugu komplementarnu sekvenca na 3' kraju, čime se pridružuje dvema nekomplementarnim sekvencama.

[0090]„Nizak nivo fosforilacije" ili „niska fosforilacija" odnosi se na dobijanje lizozomnih sulfataza enzima kod kojih apsorpcija fibroblasta u ćelije ima pola maksimalne koncentracije veće od 10 nM ili je deo lizozomnog sulfataza enzima koji vezuje manozu-6-fosfat receptor kolonu manji od oko 25%.

[0091] „Prirodno" ili „pojavljuje se u prirodi" kada se misli na objekat odnosi na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili sekvenca polinukleotida koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi, i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji, je prirodna i javlja se u prirodi.

[0092] „Farmaceutski sastav" se odnosi na sastav pogodan za farmaceutsku upotrebu kod životinje pacijenta, uključujući ljude i sisare. Farmaceutski sastav sadrži farmakološki efikasnu količinu terapeutskog lizozomnog sulfataza enzima i takođe sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljiv nosača, razblaživača ili ekscipijens. Farmaceutski sastav obuhvata sastav koja sadrži aktivni sastojak, i inertni sastojak koji čine nosač, razblaživač ili ekscipijens, kao i bilo koji proizvod koji rezultuje, direktno ili indirektno, kombinacijom, kompleksiranjem ili agregacijom bilo koja dva ili više sastojaka, ili disocijacije jednog ili više sastojaka, ili druge tipova reakcija ili interakcija jednog ili više sastojaka. Prema tome, farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku obuhvataju svaki sastav napravljen mešanjem lizozomnog sulfataza enzima predmetnog pronalaska ijedan ili više farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0093] „Farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens" odnosi se na bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, razblaživača, pufera i ekscipijenasa, kao što su, na primer, ali ne ograničavajući se na, fosfatni pufer slani rastvor, 5% vodeni rastvor dekstroze, i emulzije, kao što su ulje/voda ili voda/ulje, i razne vrste agensa za vlaženje i/ili adjuvansa. Pogodni farmaceutski nosači, razblaživači ili ekscipijensi i formulacije su opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Poželjni farmaceutski nosači, razblaživači ili ekscipijensi zavisiće od nameravanog načina primene aktivnog agensa. Tipični načini primene uključuju, na primer, ali ne ograničavaju se na, enteralnu (npr. oralno) ili parenteralnu (npr., potkožnu, intramuskularnu, intravensku ili intraperitonealnu) injekciju; ili topikalnu, transdermalnu, ili transmukozalnu primenu.

[0094] „Farmaceutski prihvatljiva so" je so koja se može formulisati u lizozomni sulfataza enzim za farmaceutsku upotrebu uključujući, npr. metalne soli (natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, itd) i soli amonijaam ili organski amini.

[0095] „Polinukleotid" se odnosi na polimer sastavljen od nukleotidnih jedinica. Polinukleotidi obuhvataju nukleinske kiseline koje se javljaju u prirodi, kao što su dezoksiribonukleinska kiselina („DNK") i ribonukleinska kiselina („RNK") kao i analoge nukleinskih kiselina. Analozi nukleinske kiseline uključuju one koje uključuju neprirodne baze, nukleotide koji učestvuju u vezama sa drugim nukleotidima osim fosfodiestarskih veza koje se javljaju u prirodi, ili koji uključuju baze vezane preko veza koje nisu fosfodiestarska veza. Tako, nukleotidni analozi uključuju, na primer i bez ograničenja, fosforotioate, fosforoditioate, fosforotriestere, fosforamidate, boranofosfate, methilfosfonate, hiralnim-metil fosfonate, 2-O-metil ribonukleotide, peptid-nukleinske kiseline (PNAS), i slično. Takvi polinukleotidi mogu biti sintetisani, na primer, pomoću automatskog DNK sintesajzera. Izraz „nukleinska kiselina" se obično odnosi na velike polinukleotide. Izraz „oligonukleotid" se obično odnosi na kratke polinukleotide, generalno ne veće od oko 50 nukleotida. Podrazumeva se da kada je nukleotidna sekvenca predstavljena DNK sekvencom (tj. A, T, G, C), to takođe uključuje RNK sekvencu (tj. A, U, G, C), gde „U" zamenjuje ,,T".

[0096] „Polipeptid" se odnosi na polimer sastavljen od aminokiselinskih ostataka, povezane prirodne strukturne varijante i njihove sintetičke analoge, koji se ne javljaju u prirodi, vezane peptidnim vezama, i povezane prirodne strukturne varijante, i njihovi sintetički analozi koji se ne javljaju u prirodi. Sintetičke polipeptidi se mogu sintetisati, na primer, pomoću automatskog sintetizera polipeptida. Termin „protein" se obično odnosi na velike polipeptide. Termin „peptid" se obično odnosi na kratke polipeptide. Konvencionalna notacija se koristi da prikaže polipeptidne sekvence: levi kraj polipeptidne sekvence je amino-terminus; desni kraj polipeptidne sekvence je karboksil-terminus.

[0097] „Prajmer" se odnosi na polinukleotid koji je sposoban da specifično hibridizuje sa unapred određenim polinukleotidnim obrascima i daje tačku inicijacije sinteze komplementarnog polinukleotida. Takva sinteza se javlja kad se polinukleotidni prajmer stavlja pod uslove u kojima se indukuje sinteza, tj., u prisustvu nukleotida, komplementarnog polinukleotida obrasca, i agensa za polimerizaciju kao što je DNK polimeraze. Prajmer je obično jednolančani, ali može biti dvolančani. Prajmeri su tipično dezoksiribonukleinske kiseline, ali široki raspon sintetičkih i prirodne prajmeri su korisni za mnoge primene. Prajmer je komplementaran obrascu za koji je određeno da hibridizuje kako bi služio kao mesto za pokretanje sinteze, ali nije neophodno da odražava tačnu sekvencu obrasca. U takvom slučaju, specifična hibridizacija prajmera prema šablonu zavisi od strogosti uslova hibridizacije. Prajmeri mogu biti obeleženi sa, npr. hromogenim, radioaktivnim ili fluorescentnim ostacima i korišćeni kao delovi koji se mogu detektovati.

[0098] „Sonda" kada se koristi u vezi sa polinukleotidom, odnosi se na polinukleotid koji je sposoban da specifično hibridizuje sa određenom sekvencom drugog polinukleotida. Sonda specifično hibridizuje za ciljni komplementarni polinukleotid, ali nije neophodno da odražava tačnu komplementarnu sekvencu obrasca. U takvom slučaju, specifična hibridizacija sonde za navođenje zavisi od strogosti uslova hibridizacije. Sonde mogu biti obeležene sa, npr. hromogenom, radioaktivnim ili fluorescentnim ostacima i korišćeni kao delovi koji se mogu detektovati.

[0099] „Profilaktički" tretman je tretman primenjen na pacijentu koji ne pokazuje znake bolesti ili pokazuje samo rane znake u cilju smanjenja rizika od razvoja patologije. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu biti davana kao profilaktički tretman da smanje verovatnoću razvijanja patologije ili da minimizuju ozbiljnost patologije, ako je razvijena.

[0100] „Rekombinantni polinukleotid" se odnosi na polinukleotid koji ima sekvence koje nisu prirodno spojene. Amplifikovani ili sklopljeni rekombinantni polinukleotid može biti uključen u odgovarajući vektor, a vektor se može koristiti za transformaciju odgovarajuće ćelije domaćina. Ćelija domaćin koja sadrži rekombinantni polinukleotid se naziva „rekombinantna ćelija domaćin". Gen je zatim eksprimiran u rekombinantnoj ćeliji domaćinu za proizvodnju, na primer, „rekombinantnog polipeptida". Rekombinantnim polinukleotid takođe može imati nekodirajuću funkciju (npr. promoter, mesto početka replikacije, ribozoma-vezujuće mesto, itd).

[0101] „Hibridizuje specifično", „specifična hibridizacija" ili „selektivno hibridizuje" se odnosi na vezivanje, dupleksiranje, ili hibridizovanje molekula nukleinske kiseline poželjno za određenu nukleotidnu sekvencu pod strogim uslovima kada je taj sekvenca prisutna u kompleksnoj smesi (npr. totalna ćelijska) DNK ili RNK.

[0102]Izraz „strogi uslovi" se odnosi na uslove pod kojima će sonda preferencijalno da hibridizuje svoju ciljnu sekvencu, i u manjoj meri, ili uopšte ne, druge sekvence. „Stroga hibridizacija" i „uslovi pranja stroge hibridizacije" u kontekstu eksperimenata hibridizacije nukleinske kiseline kao što su Southern ili Northern hibridizacija zavise od sekvence, a razlikuju se pod različitim parametrima životne sredine. Opširan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina nalazi se u Tijssen (1993) Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Biologv—Hvbridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hvbridization and the strategv of nucleic acid probe assavs", Elsevier, New York. Generalno, visoko stroga hibridizacija i uslovi pranja se biraju oko 5°C niže od termalne tačke topljenja (Tm) za specifičnu sekvencu pri definisanoj jonskoj jačini i pH. Trnje temperatura (ispod definisane jonske jačine i pH) pri kojoj 50% ciljne sekvence hibridizuje u savršeno odgovarajuću sondu. Veoma strogi uslovi se biraju da budu jednaki Tm za određenu sondu.

[0103]Primer uslova podudarne hibridizacije za hibridizaciju komplementarnih nukleinskih kiselina koje imaju više od 100 komplementarnih ostataka na filteru u Southern ili Northern blotu je 50%) formalin sa 1 mg heparina na 42°C, gde se hibridizacija sprovodi preko noći. Primer veoma strogih uslova pranja iznosi 0,15 M NaCT, na 72°C oko 15 minuta. Primer strogih uslova pranja je 0,2Ks SSC pranja na 65°C tokom 15 minuta (pogledati, Sambrooket al.za opis SSC pufera). Cesto, veoma strogom pranju prethodi slabo strogo pranje za uklanjanje pozadinskog signala sonde. Primerno srednje strogo ispiranje za dupleks od, npr., više od 100 nukleotida, je lk SSC na 45°C tokom 15 minuta. Primer nisko strogog ispiranja za dupleks od, npr. više od 100 nukleotida, je 4-6Ks SSC na 40°C tokom 15 minuta. Uopšteno, odnos signala i šuma od 2x (ili više) od onog zapaženog za nepovezane sonde u određenom testu hibridizacije ukazuje detekciju specifične hibridizacije.

[0104]„Pacijent" dijagnoze ili tretmana je čovek ili neljudska životinja, uključujući sisara ili primata.

[0105]Fraza „suštinski homologne" ili „suštinski identične" u kontekstu dve nukleinske kiseline ili polipeptida, generalno se odnosi na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje imaju najmanje 40%, 60%, 80%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti nukleotidnog ili aminokiselinskog ostatka kada se porede i poravnaju za maksimalno međusobno odgovaranje, mereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci ili vizuelnim pregledom. Poželjno, značajna identičnost postoji preko regija sekvenci, odnosno najmanje oko 50 ostataka dužine, poželjnije preko regije od najmanje oko 100 ostataka, a najpoželjnije sekvence su značajno identične preko najmanje oko 150 ostataka. U najpoželjnijem otelotvorenju, sekvence su značajno identične ćelom dužinom jednog ili oba poređena biopolimera.

[0106]Za poređenje sekvenci, obično jedna sekvenca služi kao referentna sekvenca sa kojom se test sekvence porede. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, test i referentne sekvence se unose u kompjuter, koordinate podsekvenci su određene, ako je potrebno, i parametri programa algoritma sekvence su određeni. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava procenat identičnosti sekvence za test sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu određenih parametara programa.

[0107]Optimalno usklađivanje sekvenci za poređenje može se sprovesti, na primer, algoritmom lokalne homologije od Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, algoritmom poravnavanja homologija od Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, traženjem postupka sličnosti od Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, kompjuterizovanom implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili vizuelnim pregledom.

[0108]Jedan primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara poravnavanje višestrukih sekvenci iz grupe srodnih sekvenci korišćenjem naprednih, poravnanja u parovima da pokaže odnos i procenat identičnosti sekvence. Takođe crta drvo ili dendogram koji pokazuje i klastera odnose koji se koriste za kreiranja poravnanje. PILEUP koristi pojednostavljenje progresivnog postupka poravnanja od Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. Postupak koji se koristi je sličan postupku koji je opisan kod Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Program može poravnati do 300 sekvenci, svaki maksimalne dužine od 5,000 nukleotida ili aminokiselina. Postupak višestrukog poravnavanja počinje sa poravnavanjem dve najsličnije sekvence, proizvodeći klaster dve poravnate sekvence. Ova grupa se zatim poravnava sa sledećom najviše srodnom sekvencom ili klasterom poravnatih sekvenci. Dva klastera sekvenci su poravnata jednostavnim produženjem poravnavanja dve pojedinačne sekvence. Konačno poravnanje se postiže nizom progresivnih, uparenih poravnanja. Program se pokreće određivanjem specifične sekvence i njihovih aminokiselinskih ili nukleotidnih koordinata za regije poređenja sekvence, i određivanjem parametara programa. Na primer, referentna sekvenca se može uporediti sa drugim test sekvencama za utvrđivanje procenta odnosa identičnosti koristeći sledeće parametre: ponderisana podrazumevana razlika (3,00), ponderisana podrazumevana razlika dužina (0,10), i ponderisane razlike na kraju. Drugi algoritam koji je koristan za generisanje višestrukih poravnanja sekvenci je Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680,1994).

[0109]Još jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence je algoritam BLAST, koji je opisan u Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. Softver za obavljanje BLAST analize je javno dostupan preko National Center for Biotechnologv Information. Ovaj algoritam obuhvata najpre identifikaciju parova sekvenci sa visokim rezultatom (HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine W u ispitivanoj sekvenci, koji se ili poklapaju ili zadovoljavaju neke pozitivne vrednosti praga rezultata T kada se poravnaju reči iste dužine u bazi podataka sekvenci. T se naziva prag za rezultat susedne reči (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Ovi početni pogoci susednih reči deluju kao seme za pokretanje pretrage da se nađu duži HSP koji ih sadrže. Pogoci reči se zatim proširiuju u oba smera duž svake sekvence za koliko kumulativni rezultat poravnanje može da se poveća. Kumulativni rezultati se obračunava primenom, za sekvence nukleotida, parametara M (nagradni rezultat za par podudarajućih ostataka, uvek> 0) i N (kazneni rezultat za nepodudarajuće ostatke; uvek <0). Za sekvence aminokiseline, matrica bodovanja se koristi za izračunavanje kumulativne ocene. Proširenje pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja padne u iznosu X od svoje maksimalne ostvarene vrednosti; kumulativni rezultat stigne do nule ili niže, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka sa negativnim rezultatom; ili kad se dostigne kraj bilo koje od sekvenci. Parametri BLAST algoritma V, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi kao zadatu dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M = 5, N = -4, i poređenje oba lanca. Za sekvence aminokiselina, BLASTP program koristi kao zadatu dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 matrica bodovanja (pogledati Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989).

[0110]Pored obračuna procenta identičnosti sekvence, BLAST algoritam takođe vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence (pogledati, npr., Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Jedna mera sličnosti koju daje BLAST algoritam je najmanji zbir verovatnoća (P(N)), koji daje indikaciju verovatnoće kojom bi poklapanje između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence moglo da se dogodi slučajno. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom sa referentnom sekvencom ako je najmanji zbir verovatnoća u poređenju testirane nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom manji od oko 0,1, još poželjnije manji od oko 0,01, a najpoželjnije manji od oko 0,001.

[0111]Dalji indikator da su dve sekvence nukleinskih kiselina ili polipeptidi suštinski identični je daje polipeptid kodiran od strane prve nukleinske kiselina imunološki uzajamno reaktivan sa polipeptidom kodiranim od strane druge nukleinske kiseline, kao što je opisano u nastavku. Dakle, polipeptid je tipično značajno identičan drugom polipeptidu, na primer, kada se dva peptida razlikuju samo po konzervativnim supstitucijama. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinskih kiselina suštinski identične jeste da dva molekula hibridizuju međusobno pod strogim uslovima, kao što je ovde opisano.

[0112]„Suštinski čisto" ili „izolovano" označava daje predmetna vrsta dominantna prisutna vrsta (tj. na molarnoj osnovi, brojnija nego bilo koje druge pojedinačne makromolekulske vrste u sastavu), a značajno pročišćen fragment je sastav u kome predmetna vrsta sadrži bar oko 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta. Generalno, suštinski čist preparat znači daje oko 80% do 90% ili više od makromolekulskih vrsta prisutnih u sastavu pročišćeni željena vrsta. Predmetna vrsta je pročišćena do suštinske homogenosti (kontaminirajuće vrste ne mogu se detektovati u sastavu konvencionalnim postupcima detekcije) ako se sastav suštinski sastoji od samo jedne makromolekulske vrste. Vrste rastvarači, mali molekuli (<500 daltona), stabilizatori (npr., BSA) i vrste elementalni joni se ne smatraju makromolekularnim vrstama za potrebe ove definicije. U nekim otelotvorenjima, lizozomni sulfataza enzimi pronalaska su suštinski čisti ili izolovani. U nekim otelotvorenjima, lizozomni sulfataza enzimi pronalaska su suštinski čisti ili izolovani u odnosu na makromolekularne početne materijale koji se koriste u njihovoj sintezi. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav pronalaska sadrži suštinski pročišćeni ili izolovani terapeutski lizozomni sulfataza enzim pomešan sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa.

[0113]„Terapeutski" tretman je tretman dat pacijentu koji ispoljava znake ili simptome patologije u cilju smanjenja ili eliminisanja tih znaka ili simptoma. Znaci ili simptomi mogu biti biohemijski, ćelijski, histološki, funkcionalani, subjektivni ili objektivni. Lizozomnni sulfataza enzimi pronalaska mogu biti dati kao terapeutski tretman ili dijagnoza.

[0114] „Terapeutski indeks" se odnosi na opseg doza (količina i/ili tajming) iznad minimalne terapeutske količine i ispod neprihvatljivo toksične količine.

[0115] „Tretman" se odnosi na profilaktički tretman lečenje ili terapeutski tretman ili dijagnostički tretman.

[0116] Izraz „jedinični oblik doze" kad se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinično doziranje za ljudske i životinjske pacijente, gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu lizozomnog sulfataza enzima predmetnog pronalaska izračunatu u količini dovoljnoj da proizvede željeni efekat zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. Specifikacije za nove oblike jediničnog doziranja iz ovog pronalaska zavise od konkretnog lizozomnog sulfataza enzima i efekta koji se treba postići, i farmakodinamike asocirane sa svakim lizozomnim sulfataza enzimom u domaćinu.

II. PROIZVODNJA LIZOZOMNOG SULFATAZA ENZIMA

[0117] Ovde je opisan novi postupak za proizvodnju aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzima u količinama koje omogućavaju terapijsku primenu takvih enzima. Uopšteno, postupak može da karakteriše transformaciju odgovarajuće ćelijske linije sa cDNK koji kodira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) ili njen biološki aktivan fragment, mutant, varijantu ili derivat i cDNK koji kodira lizozomni sulfataza enzim pune dužine u količinama koji omogućavaju terapijsku primenu takvih enzima. Uopšteno, postupak karakteriše transformaciju odgovarajuće ćelijske linije sa cDNK koji kodira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) ili njen biološki aktivan fragment, mutant, varijantu ili derivat i cDNK koji kodira lizozomni sulfataza enzim pune dužine ili njegov biološki aktivan fragment, mutant, varijantu ili derivat. Stručnjaci iz ove oblasti mogu pripremiti i druge eksprimirajuće konstrukte osim onih ovde izričito opisanih za optimalnu proizvodnju takvih lizozomnih sulfataza enzima u odgovarajućim transfektovanim ćelijskim linijama. Staviše, vešti stručnjaci lako mogu dizajnirati fragmente cDNK koja kodira biološki aktivne fragmente, varijante, mutanti ili derivate od prirodnog SUMF1 ili lizozomni sulfataza enzim koji poseduju istu ili sličnu biološku aktivnost kao prirodni enzimi pune dužine

Ćelije domaćini

[0118]Ćelije domaćini koje koriste za proizvodnju rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima mogu biti ćelijske linije deficijentne u endozomnoj acidifikaciji koje karakteriše njihova sposobnosti da proizvedu takve lizozomne sulfataza enzime u količinama koji omogućavaju terapeutsko korišćenje enzima. Ovde je opisana ćelijska linija END3 komplementarne grupe, označena kao G71. Ovde je opisana G71 ćelijska linija koja je adaptirana za rast u kulturi bez seruma suspenzije, označen kao G71 S. Ovde su takođe opisani derivati G71 i G71S ćelijskih linija koje su dodatno subklonirane ili koji sadrže različite plazmide eksprimiranja.

[0119]Ćelije koje sadrže i eksprimiraju DNK ili RNK koji kodiraju rekombinantni protein su ovde označene kao genetski modifikovane ćelije. Ćelije sisara koje sadrže i eksprimiraju DNK ili RNK koji kodiraju rekombinantni protein se nazivaju genetski modifikovane ćelije sisara. Uvođenje DNK ili RNK u ćelije poznatim postupkom transfektovanja, kao što je, na primer i ne ograničavan]ući se na, elektroporaciju, mikroinjektiranje, bombardovanje mikroprojektilima, kapanje kalcijum fosfatom, modifikovano kapanje kalcijum fosfatom, katjonski lipidni tretman, fotoporaciju, fuzione metodologije, receptorom posredovan transfer, ili kapanje polibrenom. Alternativno, DNK ili RNK se mogu uvesti infekcijom sa virusnim vektorom. Postupci proizvodnje ćelija, uključujući ćelije sisara, koje eksprimuju DNK ili RNK koji kodiraju rekombinantni protein su opisani u patentnim prijavama U.S. Ser. No. 08/334,797, pod nazivom „In Vivo Protein Production and Deliverv Svstem for Gene Therapv", od Richard F Selden, Douglas A. Treco i Michael W. Heartlein (podneto 4. novembra 1994); U.S. Ser. No. 08/334,455, pod nazivom "In Vivo Production and Deliverv of Ervthropoietin or Insulinotropin for Gene Therapv", od Richard F Selden, Douglas A. Treco i Michael W. Heartlein (podneto 4. novembra 1994) i U.S. Ser. No. 08/231,439, pod nazivom "Targeted Introduction of DNA Into Primarv or Secondarv Cells and Their Use for Gene Therapv", od Douglas A. Treco, Michael W. Heartlein i Richard F Selden (podneto 4. novembra 1994).

[0120]Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima mogu biti ćelijske linije deficijentne u endozomnoj acidifikaciji koje karakteriše njihova sposobnosti da proizvedu takve lizozomne sulfataza enzime u količinama koji omogućavaju terapeutsko korišćenje enzima. CHO-Kl-izvedena, ćelijska linija END3 komplementarne grupe, označena kao G71, i ćelijska linija G71 koja je adaptirana za rast u kulturi bez seruma suspenzije, označena kao G71 S, koje ko-eksprimiraju ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i rekombinantni lizozomni sulfataza enzim, su stoga u stanju da proizvede visoke prinose aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzima, kao što je navedeno u „DEFINICIJAMA", čime se omogućava ovde opisana proizvodnja u velikim razmerama terapeutskih lizozomnih sulfataza enzima. G71 ili G71 S ćelijska linija, ili njen derivat, mogu eksprimirati i lučiti rekombinantni lizozomni sulfataza enzim u količinama od najmanje oko 0,5, poželjno najmanje oko 0,75, poželjnije najmanje oko 1,0, i čak poželjnije najmanje oko 1,25 pikograma/ćelia/dan.

Vektori i konstrukti nukleinskih kiselina

[0121]Konstrukt nukleinske kiseline koji se koristi da izrazi rekombinantni protein, ili ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) ili lizozomni sulfataza enzim ili oba, može biti onaj koji je eksprimiran ekstrahromozomno (epizomalno) u transfektovanim ćelijama sisara, ili onaj koji integriše, bilo slučajno ili na prethodno odabranom ciljnom mesto kroz homologne rekombinacije, u genom ćelije primaoca. Konstrukt koji je eksprimiran ekstrahromozomno sadrži, pored sekvence koja kodira rekombinantni protein, sekvence dovoljne za eksprimiranje proteina u ćelijama i, opciono, za replikaciju konstrukta. On obično sadrži promoter, DNK koja kodira rekombinantni protein i mesto poliadenilaciije. DNK koja kodira rekombinantni protein se postavlja u konstrukt na takav način daje njeno eksprimiranje pod kontrolom promotera. Opciono, konstrukt može sadržati dodatne komponente kao što su jedno ili više od sledećeg: mesto deljenja, sekvenca pojačavač, selektivni marker gena pod kontrolom odgovarajućeg promotera, i amplifikovati marker gena pod kontrolom odgovarajućeg promotera, i regiju vezivanja matrica (MAR) ili neki drugi element poznat u struci koji povećava eksprimiranje regije u koji je umetnut.

[0122]Kada se DNK konstrukt integriše u genom ćelije, ona treba da obuhvati samo sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju rekombinantni protein. Opciono, može da uključi promoter i pojačivač sekvencu, mesto ili mesta poliadenilaciije, a mesto ili mesta deljenja, sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju selektivni marker ili markere, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju amplifikovati marker, regiju vezivanja matrica (MAR ) ili neki drugi element poznat u struci koji povećava eksprimiranje regije u koji je umetnut, i/ili DNK homologan genomskom DNK ćelije primaoca, za navođenje integracije DNK na odabrano mestu u genomu (da cilja DNK ili DNK sekvence).

Postupci kultivisanja ćelija

[0123]Ćelije sisara koje sadrže DNK ili RNK koji kodira rekombinantni protein su kultivisane pod uslovima koji odgovaraju rastu ćelija i eksprimiranju DNK ili RNK. Te ćelije koje eksprimiraju rekombinantni protein mogu se identifikovati, korišćenjem poznatih postupaka i postupaka koji su ovde opisani, a rekombinantni protein se može izolovati i pročistiti, takođe korišćenjem poznatih postupaka i postupaka koji su ovde opisani, sa ili bez amplifikacije produkcije rekombinantnog proteina. Identifikacija se može sprovesti, na primer, kroz skrining genetski modifikovanih ćelija sisara koje ispoljavaju fenotip indikativan prisustvu DNK ili RNK koja kodira rekombinantni protein, kao što PCR skrining, skriningu pomoću Southern blot analize ili skrining za eksprimiranje rekombinantnog proteina. Izbor ćelija koje sadrže ugrađen DNK koji kodira rekombinantni protein može se ostvariti uključivanjem selektivnog markera u DNK konstrukt, uz naknadno kultivisanje transfektovanih ili inficiranih ćelija koje sadrže selektivni marker gen pod uslovima pogodnim za preživljavanje onih ćelija koje eksprimiraju selektivni marker gen. Dalja amplifikacija uvedenog DNK konstrukta može se postići kultivacijom genetski modifikovanih ćelija sisara pod odgovarajućim uslovima (npr. kultivisanje genetski modifikovanih ćelija sisara koje sadrže amplifikovati marker gen u prisustvu koncentracije leka pri kojoj samo ćelije koje sadrže višestruke kopije amplificiranog marker gena mogu da opstanu).

[0124]Genetski modifikovane sisarske ćelije koje eksprimiraju rekombinantni protein mogu se identifikovati, kako je ovde opisano, detektovanjem eksprimiranog proizvoda. Na primer, ćelije sisara koje eksprimiraju aktivne visoko fosforilisane lizozomne sulfataza enzime mogu se identifikovati pomoću sendvič enzimskog imunotesta. Antitela mogu biti usmerene ka delu aktivnog agensa.

Varijante lizozomnih sulfataza enzima

[0125]U nekim otelotvorenjima, aktivni visoko fosforilisani lizozomni sulfataza enzim mutanti ili varijante mogu biti pripremljeni i biće korisni u različitim primenama u kojima se aktivni visoko fosforilisani lizozomni sulfataza enzimi mogu koristiti. Mutanti ili varijante aminokiselinskih sekvenci polipeptida mogu biti mutanti ili varijante supstitucije, umetanja ili brisanja. Mutantima ili varijantama brisanja nedostaje jedan ili više ostataka iz prirodnog proteina koji nisu neophodni za funkciju ili imunogene aktivnosti. Uobičajeni tip mutanata ili varijanti brisanja je jedna nedostajuća sekretorna signalna sekvenca ili signalne sekvence koje upućuju protein da se veže na određeni deo ćelije. Mutante ili varijante umetanja tipično obuhvataju dodavanje materijala na ne-terminalnu tačku u polipeptidu. Ovo može da uključuje umetanje jednog imunoreaktivnog epitopa ili jednostavno jedan ostatak. Terminalni dodaci, koji se nazivaju i fuzioni proteini, razmatraju se u nastavku. [01261 Varijante mogu biti suštinski homologne ili suštinski identične nemodifikovanom lizozomnom sulfataza enzimu kao što je navedeno gore. Poželjne varijante su one koje su varijante aktivnog visoko fosforilisanog lizozomnog sulfataza enzim polipeptida koji zadržava bar neke biološke aktivnosti, npr. aktivnost sulfataze lizozomnog sulfataza enzima. Druge poželjne varijante obuhvataju varijante ljudskog N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza polipeptida koje zadržavaju najmanje neke od aktivnosti sulfataze ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze.

[0127] Mutanti ili varijante supstitucije tipično razmenjuju jednu aminokiselinu od dva divlja tipa polipeptida za drugu najednom ili više položaja unutar proteina, i mogu biti dizajnirani da moduliraju jedno ili više svojstava polipeptida, kao što su, na primer i bez ograničavanja, stabilnost protiv proteolitičkog cepanja, bez gubitka drugih funkcija ili svojstava. Supstitucije ove vrste poželjno su konzervativne, to jest, jedna aminokiselina je zamenjena sa drugom sličnog oblika i naboja. Konzervativne supstitucije su dobro poznate u struci i obuhvataju, na primer, promene: alanin u serin; arginin to lizin; asparagin u glutamin ili histidina; aspartat u glutamat; cistein u serin; glutamin u asparagin; glutamat u aspartat; glicin u prolin; histidin u asparagin ili glutamin; izoleucin u leucin ili valina; leucina u valin ili izoleucin; lizin u arginin; metionin u leucin ili izoleucin; fenilalanin u tirozina, leucin ili metionin; serin u treonin; treonin u serin; triptofan u tirozin; tirozin u triptofan ili fenilalanin; i valin u izoleucin ili leucin.

[0128] Ovde se govori o generisanju mutanata ili varijanti mesta glikozilacije u kojima je mutirano O- ili N-vezano mesto glikozilace lizozomnog sulfataza enzima. Takvi mutanti ili varijante mogu dati važne informacije koje se odnose na biološku aktivnost, fizičku konstrukciju i potencijal vezivanja supstrata aktivnog visoko fosforilisanog lizozomnog sulfataza enzima. Ovde su opisani mutanti ili varijante aktivnog visoko fosforilisanog lizozomnog sulfataza enzim polipeptida koji se mogu se generisati tako da zadrže biološku aktivnost, ali imaju povećanu ili smanjenu aktivnost vezivanja supstrata. Kao takve, mutacije aktivnog mesta ili katalitičke regije su posebno razmatrane u cilju stvaranja mutanta ili varijante proteina sa izmenjenom aktivnost vezivanja supstrata. Sekvenca aktivnog visoko fosforilisanog lizozomnog sulfataza enzima može se uporediti drugim srodnim enzimima i odabrani ostaci su specifično mutirani.

[0129]Numerisanje aminokiselina zrelog proteina iz pretpostavljenog amino terminala kao što je aminokiselinski broj 1, primerne mutacije koje mogu biti korisne uključuju, na primer, supstitucije svih ili nekih od potencijalno glikoziliranih asparagina, uključujući položaje 178 i 397 rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) (pogledati Sliku 5).

[0130] Vezivanje supstrata može biti modifikovana mutacijama na/pored aktivnog mesta lizozomnog sulfataza enzima. Uzimajući u obzir da su takve mutacije primerne, stručnjaci iz oblasti će prepoznati da druge mutacije sekvence enzima mogu da se naprave kako bi se dobile dodatne strukturne i funkcionalne informacije o ovom proteinu i njegovoj aktivnosti.

[0131] Kako bi se konstruisali gore opisani mutante ili varijante, stručnjak u oblasti može primeniti dobro poznate standardne tehnologije. Posebno se misli na N-terminalna brisanja, C-terminalna brisanja, interna brisanja, kao nasumična i mutageneza tačke.

[0132] N-terminalna i C-terminalna brisanja su oblici mutageneze brisanja koja koriste prednosti, na primer, u prisustvu odgovarajućeg pojedinačnog restrikcionog mesta blizu kraja C- ili N-terminalne regije. DNK se čepa na mestu i isečeni krajevi se degradiraju nukleazama kao što su BAL31, egzonukleaza III, DNaza I, i S1 nukleaza. Ponovnom spajanje dva kraja proizvodi niz DNK sa brisanjima različitih veličina oko restrikcionih položa. Proteini eksprimirani iz takvih mutanata mogu biti testirana za odgovarajuću biološku funkciju, npr. enzimsku aktivnost, korišćenjem standardnih tehnika u struci, i opisani su u specifikaciji. Slične tehnike se mogu koristiti za interno brisanje mutanata pomoću dva odgovarajuće postavljena restrikciona mesta, čime se omogućava precizno definisano brisanje, i krajevi se ponovo spajaju kako je gore opisano.

[0133] Takođe su razmatrani mutanti parcijalne digestije. U takvim slučajevima, prosečan stručnjak u oblasti će koristiti „frekventni sekač" koji seče DNK na mnogim mestima u zavisnosti od dužine vremena reakcije. Tako, variranjem reakcionih uslova moguće je generisati seriju mutanata različitih veličina, koji se zatim mogu testirati na aktivnost.

[0134] Mutacije slučajnog umetanja mogu se takođe obavljati sečenjem DNK sekvence sa DNazom I, na primer, i umetanjem pojasa nukleotida koji kodiraju 3, 6, 9, 12, itd., aminokiselina i ponovnim spajanjem kraja. Jednom kada je takva mutacija napravljena, mutanti se mogu ispitivati za različite aktivnosti koje je ispoljavao divlji tip proteina. [01351Mutageneza tačke takođe može biti korišćena da određeno identifikuje koji aminokiselinski ostaci su važni u određenim aktivnostima povezanim sa biološkom aktivnosti lizozomnog sulfataza enzima. Tako, prosečan stručnjak u oblasti će moći da generišete pojedinačne promene baze u DNK lancu tako da rezultuju izmenjenim kodonom i genetskom mutacijom.

[0136]Aminokiseline određenog proteina mogu biti izmenjene da stvore ekvivalentni, ili čak poboljšan, molekul druge generacije. Takve promene razmatraju supstituciju date aminokiseline proteina bez značajnijeg gubitka interaktivnog vezujućeg kapaciteta sa strukturama kao što su, na primer, antigen-vezujuće regije antitela ili mesta vezivanja na molekulima supstrata ili receptorima. Pošto su interaktivni kapacitet i priroda proteina ono šta definiše proteinovu biološki funkcionalnu aktivnost, određene aminokiselinske supstitucije mogu da se učine u sekvenci proteina, u njegovoj osnovna sekvenci DNK kodiranja, a da se još uvek dobije protein sa sličnim karakteristikama. Stoga, razne izmene mogu da se učine u DNK sekvencama gena bez znatnog gubitka njihove biološke korisnosti ili aktivnosti, kao što je razmatrano u daljem tekstu.

[0137]U pravljenju ovakvih izmena, može se razmatrati hidropatski indeks aminokiselina. Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukture nastalog proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima, i slično. Svakoj aminokiselini dodeljen je hidropatski indeks na osnovu svojih hidrofobičnosti i karakteristika naelektrisanja (Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982). Generalno, aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili vrednost, a da i dalje rezultuju u proteinu sa sličnom biološkom aktivnošću, tj. da se i dalje dobij a biološki funkcionalno ekvivalentan protein.

[0138]Pored toga, supstitucija sličnih aminokiselina može se efikasno vršiti na osnovu hidrofilnosti. U.S. Patent 4,554,101 navodi da najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, regulisana hidrofilnošću susednih aminokiselina, korelira sa biološkim svojstvima proteina. Kao takva, aminokiselina može biti zamenjena drugom koja imaj slične hidrofilne vrednost, a da se i dalje dobije biološki ekvivalentan i imunološki ekvivalentan protein.

[0139]Primeri aminokiselinske supstitucije koji se mogu koristiti u ovom kontekstu

pronalaska uključuju ali nisu ograničeni na razmene arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin. Druge takve supstitucije koji uzimaju u obzir potrebu za zadržavanje nekih ili svih biološke aktivnosti dok ste menjanje sekundarne strukture proteina će biti dobro poznati prosečnom stručnjaku.

[0140]Drugi tip varijante koja je razmatrana za pripremu polipeptida prema pronalasku je primena peptidnih mimetika. Mimetici su molekuli koji sadrže peptida koji oponašaju elemente sekundarne proteinske struktura. Pogledajte, na primer, Johnson et al, "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hali, New York (1993). Razlog za korišćenje peptidnih mimetika je u tome što peptidna kičma proteina postoji primarno da orijentiše bočne lance aminokiselina na takav način da se olakšaju molekulske interakcije, kao što su one između antitela i antigena. Odpeptidnog mimetika se očekuje se dozvoli molekulske interakcije slične prirodnom molekulu. Ovi principi se mogu koristiti u kombinaciji sa prethodno opisanim principima, kako bi se konstruisala druga generacija molekula koja ima mnoga prirodna svojstva lizozomnog sulfataza enzima, ali sa izmenjenim i čak poboljšanim karakteristikama.

Modifikovana glikozilacija lizozomnih sulfataza enzima

[0141]Varijante aktivnog visoko fosforilisanog lizozomnog sulfataza enzima mogu se proizvesti tako da imaju modifikovan obrazac glikozilacije u odnosu na roditeljski polipeptid, na primer, brisanje jedne ili više ugljenohidratnih grupa, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutni u prirodnom polipeptidu.

[0142]Glikozilacija je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezano se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe na bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence za prepoznavanje enzimskog vezivanja ugljenohidratne grupe na asparaginski bočni lanac. Prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. Tako, N-vezana mesta glikozilacije se mogu dodati polipeptidu menjajući aminokiselinsku sekvencu tako da sadrži jednu ili više od ovih tripeptidnih sekvenci. O-vezana glikozilacija se odnosi na dodatak jednog šećera od N-aceilgalactozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se mogu koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. O-vezana mesta glikozilacije mogu se dodati umetanjem ili supstitucijom jednog ili više serin ili treonin ostataka u sekvenci originalnog polipeptida.

Zamena domena

[01431 Različiti delovi lizozomnih sulfataza enzim proteina poseduju veliki deo homolognosti sekvence. Mutacije mogu biti identifikovane kod lizozomnih sulfataza enzim polipeptida koje mogu izmeniti njegovu funkciju. Ove studije su potencijalno važne iz najmanje dva razloga. Prvo, one pružaju opravdano očekivanje da još drugih homologa, alelskih varijanti i mutanta ovog gena mogu postojati u srodnim vrstama, kao što su pacov, zec, majmun, šimpanza, babun, krava, svinja, konj, ovca i mačka . Nakon izolovanja ovih homologa, varijanti i mutanata, i u kombinaciji sa drugim analizama, mogu se identifikovati pojedini aktivni ili funkcionalni domeni. Drugo, ovo će obezbediti polaznu osnovu za dalju mutacionu analizu molekula kao što je opisano gore. Jedan od načina na koji se informacije mogu iskoristiti je „zamena domena".

[0144] Prebacivanje domena podrazumeva stvaranje rekombinantnih molekula koji koriste različite, ali povezane polipeptide. Na primer, upoređivanjem sekvenci lizozomnog sulfataza enzim, npr. N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze, sa onom iz sličnog lizozomnog sulfataza enzima iz drugog izvora, i sa mutantima i alelskim varijantama ovih polipeptida, može da se predvidi funkcionalnost značajnih regijama ovih molekula. Moguće je, zatim, da se zamene srodni domeni ovih molekula u nastojanju da se utvrdi kritičnost ovih regija za enzimsku funkciju i efekte u poremećajima lizozomnog skladištenja. Ovi molekuli mogu imati dodatnu vrednost u tome da ove se „himere" mogu razlikovati od prirodnih molekula, pritom možda nudeći istu ili čak poboljšanu funkciju.

[0145] Na osnovu brojnih sada identifikovanih lizozomnih sulfataza enzima, dalja analiza mutacija i njihovog predviđenog efekta na sekundarne strukture će doprineti ovom shvatanju. Smatra se da će mutanti koji menjaju domene između lizozomnh sulfataza enzima dati korisne informacije o stmkturi/funkciji odnosa ovih molekula i polipeptida sa kojima su u interakciji.

Fuzioni proteini

[0146] Pored gore opisanih mutacije, predmetni pronalazak dalje razmatra generisanje specijalizovane vrste varijanti umetanja, poznate kao fuzioni protein. Ovaj molekul generalno ima sve ili znatan deo prirodnog molekula, vezan na N- ili C-terminus, na sve ili deo drugog polipeptida. Na primer, fuzioni proteini tipično koriste vodeće sekvence iz drugih vrsta da omoguće rekombinantno eksprimiranje proteina u heterolognom domaćinu. Druga korisna fuzija uključuje dodavanje imunološki aktivnog domena, kao što su epitop antitela, da bi se olakšalo pročišćavanje fuzionog proteina. Uključivanje mesta cepanja, na ili blizu fuzionog čvora, olakšaće uklanjanje nepotrebnih polipeptida nakon pročišćavanja. Druge korisne fuzije uključuju povezivanje funkcionalnih domena, kao što su aktivna mesta enzima, domena glikozilacije, signala ćelijskog navođenja ili transmembranskih regija.

[0147JPostoje različiti komercijalno dostupni sistemi eksprimiranja fuzionih proteina koji se mogu koristiti u ovom pronalasku. Posebno korisni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, glutation S-transferaza (GST) sistem (Pharmacia, Piscataway, NJ), sistem maltoze koja vezuje protein (NEB, Beverlev, MA), FLAG sistem (IBI, New Haven, CT) je 6xHis sistem (Qiagen, Chatsworth, CA). Ovi sistemi su sposobni da proizvode rekombinantne polipeptide koji nose samo mali broj dodatnih aminokiselina, za koje je malo verovatno da će uticati na antigenu sposobnost rekombinantnog polipeptida. Na primer, FLAG sistem i 6xHis sistem dodaju samo kratke sekvence, od kojih se za obe zna da su slabo antigene i da ne utiču negativno na savijanje polipeptida do svoje prirodne konformacije. Drugi N-terminalna fuzija za koju se razmatra da li je korisna je fuzija Met-Lis dipeptida na N-terminalnoj regiji proteina ili peptida. Takva fuzija može proizvesti korisno povećanje u eksprimiranja ili aktivnosti proteina.

[0148]Naročito korisni fuzioni konstrukt može biti onaj gde je aktivni izuzetno fosforilisan lizozomni sulfataza enzim polipeptid ili njegov fragment fuzionisan za hapten kako bi se poboljšala imunogenost lizozomnog sulfataza enzim fuzionog konstrukta. Ovo može biti korisno u proizvodnji antitela za aktivni izuzetno fosforilisani lizozomni sulfataza enzim kako bi se omogućila detekciju proteina. U drugim otelotvorenjima, fuzioni konstrukt može da se napravi tako da poboljša navođenje sastava povezanih sa lizozomnim sulfataza enzimom za određeno mesto ili ćeliju.

[0149]Drugi fuzioni konstrukti uključujuću heterologni peptida sa željenim osobinama, npr. motiv za navođenje lizozomnog sulfataza enzima do određenog organa, tkiva ili ćelijskog tipa. U poželjnom otelotvorenju, fuzioni konstrukt uključujući peptid za ciljanje kosti, npr., 6 ostataka asparaginske kiselinskih (6xAsp ili 6D) fuzionisani za lizozomni sulfataza enzim mogu navoditi enzim do pojedinih lokacija u kosti.

[0150]Takođe su razmatrane ostale fuzione konstrukcije uključujući heterologni polipeptida sa željenim osobinama, npr., Ig konstantna regija kako bi se produžio poluživot u serumu ili antitelo ili njegov fragment za navođenje. Drugi fuzioni sistemi proizvode polipeptidne hibride tamo gde je poželjno izvući fuzionog partnera iz željenog polipeptida. U jednom otelotvorenju, fuzioni partner je vezan za rekombinantni aktivni visoko fosforilisani lizozomni sulfataza enzim polipeptida putem peptidne sekvence koja sadrži specifičnu sekvencu prepoznavanja za proteazu. Primeri pogodnih sekvenci su one koje su priznate od od Tobacco Etch Virus proteazee (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ili od Factor Xa (New England Biolabs, Beverlev, MA).

Derivati

[0151]Kako je gore navedeno, derivat se odnosi na polipeptide hemijski modifikovane takvim tehnikama, kao što su na primer ali bez ograničavanja na, ubikvitinacija, obeležavanje (npr. sa radionuklidima ili različitim enzimima), kovalentno spajanje polimera poput pegilacije (derivatizacijom sa polietilen glikolom) i ubacivanje ili supstitucija hemijskom sintezom aminokiselina kao što je ornitin. Derivati enzima lizozomne sulfataza su takođe korisni kao terapeutska sredstva i mogu biti proizvedeni pomoću postupaka prema pronalasku.

[0152]Polietilen glikol (PEG) može biti vezan za lizozomni sulfataza enzim proizveden postupcima pronalaska kako bi se obezbedio duži poluživotin vivo.PEG grupa može biti bilo koje pogodne molekulske težine i može biti linearana ili razgranata. Prosečna molekulska težina PEG poželjno će biti u opsegu od oko 2 kiloDaltona („kDa") do oko 100 kDa, poželjnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, najpoželjnije od oko 5 kDa do oko 10 kDa. PEG grupe će generalno biti vezane za lizozomni sulfataza enzim pronalaska putem acilacije ili reduktivne alkilacije preko reaktivne grupe na PEG delu (npr. aldehid, amino, tiol, ili estarska grupa) za reaktivnu grupu na ostatku proteina (npr. aldehid, amino ili estarska grupa). Dodavanje PEG molekula na željeni polipeptid može biti izvedeno korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci. Pogledati, npr. međunarodnu objavu br. WO 96/11953 i U.S. patent No. 4,179,337.

[0153]Ligacija lizozomnog sulfataza enzim polipeptida sa PEG se obično odigrava u vodenoj fazi i može se lako pratiti reverznom fazom analitičke HPLC. PEGilirani peptidi se mogu lako pročisti preparativnom HPLC i karakterisati analitičkom HPLC, analizom aminokiselina i masenom spektrometrijom sa laserskom desorpcijom.

Obeleživač

[0154] U nekim otelotvorenjima, terapeutski lizozomni sulfataza enzim je obeležen kako bi se olakšala njegova detekcija. „Obeleživač" ili „deo koji može da se detektuje" predstavlja sastav koji može da se detektuje spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskih, hemijskim, ili drugim fizičkim sredstvima. Na primer, obeleživači pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne obeleživače (npr.<32>P), fluorofore (npr. fluorescein), elektronski guste reagense, enzimi (npr., kao što se obično koristi u ELISA), biotin, digoksigenin ili haptene kao proteine koji se mogu napraviti tako da se mogu detektovati, na primer, ugrađivanjem radioaktivnog obeleživač u hapten ili peptid, ili koristiti za detektovanje antitela specifično reaktivnih sa hapteoma ili peptidom.

[0155] Primeri obeleživača pogodnih za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni, na fluorescentne boje (npr. fluorescein izotiocijanat, Tekas crveno, rodamin, i slično), radioaktivne obeleživače (npr. 3H, 1251, 35S, 14C ili<32>P), enzime (npr. ren peroksidaza, alkalna fosfataza i drugi koji se uobičajeno koriste u ELISA), i kolorimetrijski obeleživači kao što je koloidno zlato, obojeno stakla ili plastične perle (npr. polistirol, polipropilen, lateks, itd).

[0156] Obeleživač može da može biti kupio van direktno ili indirektno do željen komponente lizozomnog sulfataza enzima prema postupcima dobro poznatim u struci. Poželjno, obeleživač je u jednom otelotvorenju kovalentno vezan za lizozomni sulfataza enzim upotrebom izocijanat reagensa za konjugaciju aktivnog agensa prema pronalasku. U jednom aspektu pronalaska, bifunkcionalni izocijanat reagensi prema pronalasku mogu se koristiti za konjugovanje obeleživača do lizozomnog sulfataza enzima kako bi se formirao obeleživač lizozomni sulfataza enzima konjugat bez aktivno agensa vezanog za sebe. Obeleživač lizozomni sulfataza enzim konjugat može se koristiti kao posrednik za sintezu obeleženog konjugata prema pronalasku ili se može koristiti za detekciju lizozomnog sulfataza enzim konjugata. Kao što je opisano gore, širok spektar obeleživača može da se koristi, gde izbor obeleživača zavisi od potrebne osetljivosti, lakoće konjugacije sa željenom komponentom lizozomnog sulfataza enzima, uslova stabilnosti, dostupnih instrumenta, i uslova odlaganja. Neradioaktivni obeleživači su često vezani indirektnim sredstvima. Generalno, ligand molekul (npr., biotin) je kovalentno vezan za lizozomni sulfataza enzim . Ligand se zatim vezuje za drugi molekul (npr., streptavidin), koji se inherentno može detektovati ili kovalentno vezati za sistem signala, kao što je enzim koji se može detektovati, fluorescentno jedinjenje ili hemiluminiscentno jedinjenje.

[0157]Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska takođe mogu biti konjugovani direktno za jedinjenja koja generišu signalnih, npr. konjugacijom sa enzimom ili fluorofora. Enzimi pogodni za upotrebu kao obeleživača uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrolaze, posebno fosfataze, esteraze i glikosidaze ili oksidotaze, naročito peroksidaze. Fluorescentna jedinjenja, tj. fluorofori, pogodni za upotrebu kao obeleživači uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescein i njegove derivata, rodamin i njegovih derivata, dansil, umbeliferon itd. Dalji primeri pogodnih fluorofora uključuju, ali nisu ograničeni na, eozin , TRITC-amin, kinin, fluoresceinWV, akridin žuto, lisamin rodamin, B sulfonil hlorid erithroscein, rutenijum (tris, bipiridinium), Tekas crveno, nikotinamid adenin dinukleotid, flavin adenin dinukleto itd. Hemiluminiscentna jedinjenja pogodna za upotrebu kao obeleživači uključuju, ali nisu ograničena na, luciferin i 2,3-dihidroftalazinedione, npr., luminol. Za pregled različitih sistema obeležavanje ili proizvodnje signalnih koje se mogu koristiti u postupcima iz ovog pronalaska, pogledati U.S. Patent No. 4,391,904.

[0158]Načini za detektovanje obeleživača su dobro poznati stručnjacima u oblasti. Tako, na primer, kad je obeleživač radioaktivan, načini za detetovanje uključuju scintilacioni brojač ili fotografski film, kao kod autoradiografije. Kad je obeleživač fluorescentni marker, može se detektovati pobuđivanjem fluorohorma uz odgovarajuće talasne dužine svetlosti i detektovanje nastalog fluorescencije. Fluoroscencija se može detektovati vizuelno, upotrebom elektronskih detektora poput uparenih uređaja pod naponom (CCD senzori) ili fotomultiplera i slično. Slično, enzimski obeleživači mogu biti otkriveni obezbeđivanjem odgovarajućeg supstrata za enzim i detektovanjem nastalog reakcionog proizvoda. Kolorimetrijski ili hemiluminescentni obeleživači mogu biti otkrivena jednostavnim posmatranjem boje povezane sa obeleživačem. Drugi sistemi obeležavanja i detekcije pogodni za upotrebu u postupcima iz ovog pronalaska biće očigledni stručnjacima u oblasti. Takvi obeleženi modulatori i ligandi se mogu koristiti u dijagnozi bolesti ili zdravstvenog stanja.

[0159]U poželjnom otelotvorenju, postupak obuhvata korak proizvodnji aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzima iz ćelijskih linija koje imaju defekat u endozomnom saobraćanju. U naročito poželjnom otelotvorenju, postupak obuhvata korak izrade aktivne visoko fosforilisane rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) iz CHO ćelijske linije G71, ili njen derivat. Proizvodnja lizozomnog sulfataza enzima kao što je GALNS, obuhvata korake: (a) razvijanje G71 ili G71 derivatne ćelijske liniju koja ko-eksprimira rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim, npr. N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS), i rekombinantni ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1); (b) kultivisanje ćelijskih linija koje ko-eksprimiraju ljudski lizozomni sulfataza enzim i SUMF1; i (c) skaliranje ćelijskih linija koje ko-eksprimiraju ljudski lizozomni sulfataza enzim i SUMF1 do bioreaktora za proizvodnju lizozomnog sulfataza enzima. cDNK ljudskog lizozomnog sulfataza enzima, npr. N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) i SUMF1 su subklonirani u sisarske vektore eksprimiranja u suštini kako je opisano u nastavku.

[0160] Za razvoj ćelijske linije, G71 ili G71S, G71 klon prilagođena za rast u kulturi bez seruma suspenzije je ko-transfektovan sa ljudskim GALNS vektorom eksprimiranja sisara, ljudskim SUMF1 vektorom eksprimiranja sisara i odabranim marker genom, i stabilni transformanti su odabrani. Posle prvog kruga subkloniranja stabilnih transfektanata, ćelijske linije su odabrane korišćenjem fluorescentnog supstrata i specifično označene. G71 ili G71S ćelijske linije su analizirani za produktivnost specifičnu za ćelije (pg proizvod/ćelija) na propeleru sa mikronosačima ili u suspenziji kulture, respektivno. Najbolji proizvođači ljudskih GALNS su identifikovani i skalirani do bioreaktora za proizvodnju pretkliničkog materijala.

[0161] Ovde se govori o testu na bazi ćelija, za merenje aktivnosti rekombinantnog ljudskog lizozomnog enzima da degradira prirodne supstrate. Postupak može sadržati (a) kultivisanje izolovane ljudske ćelije sa nedostatkom lizozomnog enzima pod uslovima u kojima se prirodni supstrati za lizozomne enzime akumuliraju; (b) dovođenje u kontakt ćelije sa lizozomnim enzimom; (c) lizu ćelije; (d) dodavanja ćeliji lizata enzim koji (i) je specifično za prirodne supstrane, i (ii) čepa male oligosaharide od prirodnih supstrata; (e) obeležavanje malih oligosaharidi sa delom koji se može detektovati; (f) opciono razdvajanje obeleženih malih oligosaharida; (g) detektovanje obeleženih malih oligosaharida; i (h) određivanje aktivnosti lizozomnog enzima da degradira prirodne susptrate poređenjem (i) količinom obeleženih malih oligosaharida iz ćelija koje su u dodiru sa lizozomnim enzimom sa (ii) količinom obeleženih malih oligosaharida iz ćelija koje nisu u dodiru sa lizozomnim enzimom, pri čemu smanjenje (h) (i) u poređenju sa (h) (ii) označava aktivnost lizozomnog enzima da degradira prirodne supstrate. U jednom otelotvorenju, mali oligosaharid je mono-, di-, ili tri-saharid. U srodnom otelotvorenju, mali oligosaharid je disaharid.

[0162]Lizozomni enzim je N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS).

[0163]Pogodne ljudske ćelije koje se mogu koristiti u testu baziranom na ćelijama uključuju bilo koje ljudske ćeliju koje su deficijentne u lizozomnom enzimu koji se testira, tako da mogu akumulirati prirodne supstrate za lizozomni enzim. Na primer, mogu se koristiti ćelije koje prirodno pokazuju pun (100%) ili delimičan nedostatak na aktivnosti, npr. 30%>, 50%>, 70%, 80%o, 90%, 95%o ili više smanjenja aktivnosti. Mogu se koristiti ćelije koje eksprimiraju mutirani enzim sa smanjenom aktivnošću, ili ćelije izvedene iz pacijenata obolelih od bolesti lizozomnog skladištenje, npr. mukopolisaharidoze. Mogu se koristiti ćelije koje su rekombinantno izmenjene da obore ili smanje aktivnost lizozomnog enzima, npr. uvođenjem mutacije na kodirajući gen ili njegov promotera ili drugu regulatornu regiju. Mogu se koristiti ćelije tretirane da smanje aktivnost lizozomnog enzima, npr. tretirane sa antisensom ili RNKi kako bi se smanjilo eksprimiranje enzima ekspresije.

[0164]Pogodni enzimi koji cepaju (digestuju) male oligosaharide iz ugljenih hidrata i koji su „specifični za" (tj. pretežno digestuju) prirodne supstrate iz lizozomnih enzima mogu biti odabrani od onih koji su uobičajeno stručni u oblasti. Na primer, za detekciju aktivnosti GALNS ili GLB1 (enzimi koji degradiraju keratan sulfat), enzim iz koraka (d) može biti Keratanaza II ili bilo koji enzim koji deluje prvenstveno na keratan sulfat. Kao drugi primer, za detekciju IKD, ARSB, IDS ili GUSB (enzimi koji degradiraju dermatan sulfat), enzim iz faze (d) može biti Hondroitinaza ABC ili bilo koji enzim koji deluje prvenstveno na dermatan sulfat. Kao drugi primer, za detekciju IKD, IDS, SGHS, G6S ili GUSB (enzimi koji degradiraju heparan sulfat), enzim iz faze (d) može biti Heparanaza I ili Heparanaza II, ili oboje. Kao još jedan primer, za detekciju GAA (enzim koji degradira glikogen), enzim iz koraka (d) može biti a-amilaza ili bilo koji enzim koji deluje prvenstveno na glikogen.

[0165]Ovaj postupak na bazi ćelija je sposoban za veliku osetljivost u otkrivanju aktivnosti

lizozomnog enzima. Aktivnost lizozomnog enzima može se detektovati kada je koncentracija lizozomnog enzima toliko niska kao što je oko 10 nM, ili oko 5 nM, ili oko 1 nM, ili oko 0,75 nM, ili oko 0,5 nM, ili oko 0,25 nM, ili oko 0,1 nM , ili oko 0,05 nM, ili oko 0,01 nM, ili oko 0,005 nM, ili oko 1 pM, ili oko 0,5 pM.

III.PROČIŠĆAVANJELIZOZOMNIHSULFATAZA ENZIMA

[01661Bioreaktivni materijal koji sadrži rekombinantni ljudski GALNS je filtriran, koncentrisan 20 puta ultrafiltracijom/dijafiltracijom, a zatim filtriran kroz ugalj pre nanošenja na obuhvatnu kolonu. Koncentrisan Bioreaktor Materijal je naneta na Zn-helatnu sefarozu FF (Zn-IMAC) kolonu sa provodnosti od -55 ± 5 mS/cm, opran sekvencijalno sa 10 mM acetat/fosfatom, 500 mM NaCI, pH 7,0 i 10 mM acetat/fosfatom, 125 mM NaCl, pH 7,0 (pufer A), a zatim eluiran sa smesom 70% pufera A i 30%> 10 mM acetat/fosfata, 125 mM NaCl, 300 mM imidazola, pH 7,0 (pufer B). Zn-helatna sefaroza FF (Zn-IMAC) kolona je prilagođena na provodnost od -6,0 ± 0,5 mS/cm i pH 7,0 i sipano u Mustang Q filtera za uklanjanje potencijalnih virusa. Mustang Q Filtrat je prilagođen do pH 4,5 ±0,1, filtriran kroz CUNO 60ZA filtera, što je praćen 0,2 um inlin filterom, a zatim je postavljen na Fractogel EMD SE Hi-Cap (M) kolonu, ispran uzastopno sa 10 mM acetat/fosfata, 50 mM NaCI, pH 4,5 i mešavinom 80% pufera A (10 mM acetat/fosfat, pH 5,0) i 20% pufera B (10 mM acetat/fosfat, 250 mM NaCI, pH 5,0), i eluiran sa linearnim gradijentom 20%>-75%> pufera B (u 80%>-25%> pufera A). Fractogel EMD SE Hi-Cap kolona eluata je zatim podešena do pH 3,5 ±0,1 dodavanjem 0,2 M citrat pufera, pH 3,4 za nisku pH virusnu inaktivaciju. Nisko pH virusno inaktiviran eluat Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone je prilagođen do 2M NaCI i do pH 5,0 dodavanjem 0,2 M citratnog pufera, pH 6,0, a zatim je postavljen na TovoPearl Butil 650M kolonu, ispran sa 10 mM acetat/fosfatom , 2M NaCl, pH 5,0 (pufer A), a zatim eluiran sa mešavinom 35% pufera A i 65% pufera B (10 mM acetat/fosfat, pH 5,0). TovoPearl Butil 650M eluat je puferski razmenjen na 20 mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, 30 mM arginin HCI, 2%> (v/v) sorbitol, pH 5,4, i prilagođen do finalne koncentracije od 3 mg/mL GALNS. Puferno razmenjen i koncentraciono prilagođen GALNS je filtriran kroz virusni filter (DV20) i DNK filter (Mustang Q) kako bi se uklono bilo koji ostatak virusa i DNK. Polisorbat 20 ili PS20 je dodat finalnoj koncentraciji od 0,01% (v/v), rezultujući u većini supstance leka (BDS). BDS je čuvan na 2-8°C ili je zamrznut.

[0167]Alternativno, bioreaktivni materijal koji sadrži rekombinantni ljudski GALNS je filtriran, koncentrisan 20 puta ultrafiltracijom/dijafiltracijom, a zatim filtriran kroz ugalj pre nanošenja na obuhvatnu kolonu. Koncentrisan bioreaktivni materijal je naneta na Zn-helatna sefaroza FF (Zn-IMAC) kolona sa provodljivošću od -50 ± 5 mS/cm, opran sekvencijalno sa 10 mM acetat/fosfatom, 500 mM NaCI, pH 7,0 i 10 mM acetat/fosfatom, 125 mM NaCI, pH 7,0 (pufer A), a zatim eluiran sa smesom 70% pufera A i 30% 10 mM acetat/fosfata, 125 mM NaCl, 300 mM imidazola, pH 7,0 (pufer B). Eluat Zn-helatne sefaroze FF (Zn-IMAC) kolone je filtriran da se uklone virusi i prilagođen do pH 4,5 ±0,1 sa 1,75 M acetatom, pH 4,0, filtrira kroz Millipore COHC filter, pomešan sa 10 mM acetat/fosfata, pH 4,5 u 30:70 (v/v) odnosu, a zatim postavljen na Fractogel EMD SE Hi-Cap (M) kolonu sa provodnosti od <7 mS/cm, opran sekvencijalno sa 10 mM acetat/fosfatom, 50 mM NaCI, pH 4,5 i mešavinom 80% pufera A (10 mM acetat/fosfat, pH 5,0) i 20% pufera B (10 mM acetat/fosfat, 250 mM NaCI, pH 5,0), i eluiran linearnim gradijentom 20%-75%> pufera B (u 80%>-25% pufera A). Eluat Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone je zatim prilagođen do pH 3,5 ±0,1 dodavanjem 0,4 M citrat pufera, pH 3,4 za nisku pH virusnu inaktivacije. Nisko pH virusno inaktiviran eluat Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone je prilagođen do 2M NaCI i do pH 5 dodavanjem 0,4 M citratnog pufera, pH 6,0, pomešan sa 10 mM acetat/fosfatom, pH 5, koji sadrži 5 M NaCl kako bi postigao koncentraciju od 2M NaCl, a zatim je postavljen na TovoPearl Butil 650M kolonu, ispran sekvencijalno sa 10 mM acetat/fosfatom, 2M NaCI, pH 4,4 ± 0,1 i 10 mM acetat/fosfatom, 2,5M NaCI, pH 5,0 (pufer A), a zatim eluiran linearnim gradijentom od 100% do 32% pufera A i 0% do 68% pufera B (10 mM acetat/fosfat, pH 5,0), a zatim smesom 32% pufera A i 68% pufera B. TovoPearl Butil 650M eluat je puferski razmenjen na 20 mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, 30 mM arginin HCI, 2% (v/v) sorbitol, pH 5,4, i opciono prilagođen do finalne koncentracije od 3 mg/mL GALNS. Puferno razmenjen i koncentraciono prilagođen GALNS je filtriran kroz virusni filter (DV20) i DNK filter (Mustang Q) kako bi se uklono bilo koji ostatak virusa i DNK. Polisorbat 20 ili PS20 je dodat finalnoj koncentraciji od 0,01% (v/v), rezultujući u većini supstance leka (BDS). BDS je čuvan na 2-8°C ili je zamrznut.

[0168] Pročišćavanje rekombinantnog ljudskog GALNS je detaljno opisano u nastavku, i pročišćavanje rekombinantnog ljudskog GALNS koje prati procedure modifikovane iz gore navedenih protokola je detaljno opisano niže.

[0169] Rekombinantni ljudski GALNS enzim je eksprimiran u G71S ćelijama kao što je opisano u PrimeruIIIi pročišćen kao što je opisano u Primeru V ili Primeru VI. pročišćen rekombinantni ljudski GALNS prema pronalasku može se uporediti sa drugim dokumentovanim pripremama GALNS. Masue et al., J. Biochem. 110:965-970, 1991 opisuje pročišćavanje i karakterizaciju GALNS iz ljudske placente. Za pročišćeni enzim je utvrđeno da ima molekulsku masu od 120 kDa, koja se sastoji od polipeptida 40 kDa i 15 kDa, od kojih se drugi pokazao kao glikoprotein. Stoga, Masueet al.GALNS enzimu izgleda da odgovara prerađenom obliku prikazanom na Slici 5. Bielicki et al., Biochem. J. 279:515-520, 1991 opisue pročišćavanje i karakterizaciju GALNS iz ljudske jetre. Kada se analizira pomoću SDS-PAGE, enzim je imao molekularnu masu od 70 kDa pod neredukcionim uslovima, i molekularne mase 57 kDa, 39 kDa i 19 kDa pod redukcionim uslovima. Bielicki et al., Biochem J. 311: 333-339, 1995 opisuje pročišćavanje i karakterizaciju rekombinantnog ljudskog GALNS iz jajnih ćelija kineskog krčka. Za enzim pročišćeni na SDS-PAGE je utvrđeno da imaju molekularnu masu od 58-60 kDa pod neredukcionim uslovima i molekularne mase 55-57 kDa, 39 kDa i 38 kDa pod redukcionim uslovima. Stoga,Bielickiet al.GALNS enzimi izgleda odgovaraju smesi prethodno obrađenog (prekursor) oblika enzima i prerađenom obliku prikazanom naSlici5. Nasuprot tome, rekombinantni ljudski GALNS enzim pronalaska se sastoji skoro u potpunosti prekursorskog oblika enzima (pogledatiSliku 9iSliku 12),ili pretežno (tj., najmanje oko 85%) prekursorskog oblika enzima (pogledati

Sliku 10).

IV. LIZOZOMNI SULFATAZA ENZIMI I BOLESTI LIZOZOMNOG

SKLADIŠTENJA

[0170]Lizozomni sulfataza enzim je enzim pune dužine ili njegov bilo koji fragment, mutant, varijanta ili derivat koji zadržavaju najmanje znatnu količinu (npr. najmanje oko 50%>, poželjno najmanje oko 75%, i još poželjnije najmanje oko 90%>), suštinski sve ili sve terapeutske ili biološke aktivnosti (npr. aktivnost sulfataze) enzima.

[0171]U nekim otelotvorenjima, lizozomni sulfataza enzim je onaj koji, ukoliko se ne eksprimira ili proizvodi, ili ako je značajno redukovan u eksprimiranju ili proizvodnji, dovodi do bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, bolesti lizozomnog skladištenja. U nekim otelotvorenjima, lizozomni sulfataza enzim je onaj koji, ukoliko se ne eksprimira ili proizvodi, i, ili ako je značajno redukovan u eksprimiranju ili proizvodnji, ne mora sam po sebi dovesti do bolesti, ali čije je odsustvo ili redukovanje eksprimiranja ili proizvodnje povezano sa bolešću, uključujući ali ne ograničavajući se na, bolesti lizozomnog skladištenje. Poželjno, lizozomni sulfataza enzim potiče ili je dobijen od čoveka.

[0172]Poželjno, u lečenju bolesti lizozomnog skladištenja, lizozomni sulfataza enzim je enzim koji se nalazi u ćeliji, koji bi, ukoliko nije eksprimiran ili proizvedena ili nema značajno redukovano eksprimiranje ili proizvodnju, doveo do bolesti lizozomnog skladištenja. Alternativno, u lečenju bolesti lizozomnog skladištenja, lizozomni sulfataza enzim je enzim čije su odsustvo ili značajno redukovano eksprimiranje ili proizvodnja povezani sa bolešću, iako njegova odsustvo ili značajno redukovano eksprimiranje ili proizvodnja ne moraju sami po sebi dovesti do bolesti. Poželjno, lizozomni sulfataza enzim potiče ili je dobijen od čoveka.

[0173]Poželjno, enzim je lizozomni sulfataza enzim, kao što su arilsulfataza A (ARSA)

(Genbank Accession No. NP 000478 (izoforma a), Genbank Accession No. NP001078897 (izoforma b) i druge varijanti), arilsulfataza B/N- acetilglikozamin 4-sulfataza (ARSB)

(Genbank Accession No. P15848), iduronat-2-sulfataza (IDS) (Genbank Accession No. NP 000193 (izoforma a), Genbank Accession No. NP 006114 (izoforma b)), sulfamidaza/heparin-N-sulfataza (SGSH) (Genbank Accession No. NP 000190), N-acetilglikozamin-sulfataza (G6S) (Genbank Accession No. NP 002067) i Galaktoza 6-sulfataza/N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) (Genbank Accession No. NP 000503 ). Sledi tabela bolesti lizozomnog skladištenja, kao i kod njih u nedostatku lizozomni sulfataza enzimi, koji su korisni kao terapeutski agensi:

[0174]U poželjnim otelotvorenjima, lizozomni sulfataza enzim je rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim proizveden od strane ćelijske linije koje su u nedostatku za endozomnu acidifikaciju. U poželjnijim otelotvorenjima, rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzim je aktivan i ima visok nivo fosforilisanih oligosaharida utvrđenim pod „Definicije". U većini poželjnim otelotvorenja, lizozomani sulfataza enzim je aktivna vrlo fosforilisana rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS).

[0175]Tako, bolesti lizozomnog skladištenja koji se mogu lečiti ili sprečiti formulacije prema predmetnom pronalasku obuhvataju Morkio sindrom ili MPS IVa. U naročito poželjnom otelotvorenju, lizozomni sulfataza enzim je takva da njegov nedostatak izaziva Morkio sindrom ili MPS Iva. [01761Stoga, po gornjoj tabeli, za svaku bolest lizozomnog sulfataza enzima bilo bi poželjno da sadrži određen aktivni lizozomni sulfataza enzim koji je u nedostatku kod bolesti. Na primer, za postupke koji uključuju MPS II, poželjni enzim je iduronat-2-sulfataza. Za postupke koji uključuju MPS IIIA, poželjni enzim je sulfamidaza/heparin-N-sulfataza. Za postupke koji uključuju MPS Illd, poželjni enzim je N-acetilglikozamin 6-sulfataza. Za postupke koji uključuju MPS IVA, poželjni enzim je galaktoza 6-sulfataza/N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza. Za postupke koji uključuju MPSVI, poželjni enzim je N-acetilgalaktozamin 4-sulfataza. Za postupke koji uključuju metahromatsku leukodistrofiju (MLD), poželjni enzim je arilsulfataza Za postupke koji uključuju višestruki nedostatak sulfataze (MSD), enzim može biti arilsulfataza A, arilsulfataza bB/N-acetilglikozamin 4-sulfataza, iduronat-2-sulfataza, sulfamidaza/heparin-N-sulfataza, N-acetilglikozamin-sulfataza ili galaktoza 6-sulfataza/N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza, a poželjni enzim je galaktoza 6-sulfataza/N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza.

V MUKOPOLISAHARIDOZA TIPA IVA (MORKIO SINDROM MPS IVA)

[0177] Mukopolisaharidoza tipa IVA (Morkio sindrom, MPS IV) je nasledno, autozomno recesivno oboljenje koje pripada grupi bolesti skladištenja mukopolisaharida. Morkio sindrom je uzrokovan nedostatkom jednog lizozome enzima potrebnog za degradaciju dva glikozaminglikana (GAG), keratan sulfata (KS) i hondroitin-6-sulfata (C6S). Konkretno, MPS IVa karakteriše odsustvo enzima N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS), i lučenje KS u urinu. Nedostatak GALNS rezultuje akumulacijom neuobičajeno velikih količina mukopolisaharida u hijalinim hrskavicama, koje su glavna komponenta skeletnih tkiva. Svi pacijenti imaju sistemsku skeletnu displaziju. Drugi simptomi variraju u ozbiljnosti od pacijenta do pacijenta, i mogu uključivati gubitak sluha, katarakte, kičmenu nestabilnost, srčane valvularne bolesti i disajnih problema, između ostalog.

[0178] GALNS hidrolizuje sulfat estarske veze galaktoza-6-sulfata iz KS i N-acetilgalaktozamin-6-sulfata iz C6S. Ljudski GALNS je eksprimiran kao 55-60 kDa prekursorski protein sa samo 2 potencijalna mesta glikozilacije povezana sa asparaginom. Manoza-6-fosfat (M6P) je deo oligosaharida prisutnih na GALNS molekulu. M6P je priznat od strane receptora na površini lizozomnih ćelija i, shodno tome, od ključnog je značaja za efikasnu apsorpciju GALNS.

[0179] Kao i sve sulfataze, GALNS treba da bude obrađen enzimom koji aktivira formilglicin (FGE) koji je kodirana genom faktora 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) kako bi dobio aktivnost. Zbog ovog koraka aktivacije, koja uključuje post-translatornu modifikaciju aktivnog mesta cistein ostatka na Ca-formilglicinu (FGly), prekomerno eksprimiranje rekombinantnih sulfataza može dovesti do proizvodnje sulfataza enzima sa niskom specifičnom aktivnosto (tj., mešavina aktiviranih i neaktiviranih sulfataza enzima), kao i sa niskim proizvodnim titrom (odnosno degradaciju i/ili nedostatak lučenja neaktiviranih sulfataza).

[0180] Ovde je opisan aktivan visoko fosforilisani ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza enzim koristan za lečenje Morkio sindroma i drugih bolesti, npr. višestrukog nedostatka sulfataze (MSD), koje su izazvane ili povezane sa nedostatkom enzima N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze. Takav aktivan visoko fosforilisan ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza enzim ima sposobnost da se lokalizuju na tkiva u kojima se akumuliraju KS i C6S, ima adekvatne nivoe M6P za efikasnu apsorpciju, ima dovoljno visok procenat FGly za aktivnosti enzima, i ima relativno visok nivo proizvodnje.

[0181] Treba da se razume da postupci koji su ovde opisani mogu biti primenjivi za proizvodnju drugih lizozomnih sulfataza enzima, npr., arilsulfataze A (ARSA), arilsulfataze b/N-acetilglikozamin 4-sulfataze (ARSB), iduronat-2-sulfataze (IDS), sulfamidaze/heparin-N-sulfataze (SGSH) i N-acetilglikozamin-sulfataze (G6S), koje su korisne za tretman bolesti lizozomnog skladištenja koje su prouzrokovani ili odlikuju nedostatkom istih.

VI. FARMACEUTSKI SASTAVI I PRIMENA

[0182] Lizozomni sulfataza enzimi ovog pronalaska se mogu primenjivati različitim načinima. Za oralne pripreme, lizozomni sulfataza enzimi mogu biti korišćeni sami ili u kombinaciji sa odgovarajućim aditivima kako bi se napravile tablete, praškovi, granule ili kapsule, na primer, sa konvencionalnim aditivima, kao što su laktoza, manitol, kukuruzni škrob ili krompirov škrob; sa vezivima, kao što su kristalna celuloza, derivati celuloze, akacija, kukuruzni škrob ili želatini; sa dezintegratorima, kao što su kukuruzni škrob, krompirov škrob ili natrijum karboksimetilceluloza; sa lubrikantima, kao što su talk ili magnezijum stearat; i ukoliko je poželjno, sa razblaživačima, puferima, agensima za kvašenje, konzervansima i aromama.

[0183]Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska mogu biti formulisani u preparate za injekcije rastvaranjem, suspenzovanjem ili emulgovanjem u vodenom ili ne vodenom rastvaraču, kao što su biljna ili druga slična ulja, sintetički gliceridi alifatične kiseline, estri viših alifatičnih kiselina ili propilen glikol; i ukoliko je poželjno, sa konvencionalnim aditivima, kao što su rastvarači, izotonični agensi, agensi za suspenzovanje, emulgatori, stabilizatori i konzervanse.

[0184] Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska se mogu koristiti u formulaciji aerosola kako bi se primenjivali putem inhalacije. Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska mogu da se formulišu u prihvatljivim gorivima pod pritiskom poput dihlorodifluorometana, propana, azota i slično.

[0185] Dalje, lizozomni sulfataza enzimi pronalaska mogu biti smešteni u supozitorije mešanjem sa raznim bazama kao što su baze za emulgovanje ili baze rastvorive u vodi. Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska mogu se primenjivati rektalno preko supozitorija. Supozitoriji mogu uključivati sredstva kao što su kakao puter, karbovoskovi i polietilen glikoli, koji se tope na temperaturi tela, ali očvršćuju na sobnoj temperaturi.

[0186] Jedinični dozni oblici lizozomnog sulfataza enzima pronalaska za oralnu ili rektalnu primenu kao što su sirupi, eliksiri, i suspenzije mogu biti dati, pri čemu svaka jedinica doze, na primer, kašičica, kašika, tableta ili supozitorij, sadrži unapred određenu količinu lizozomnog sulfataza enzima koji sadrži aktivni agens. Slično, jedinični dozni oblici za injekciju ili intravensko davanje mogu sadržati lizozomni sulfataza enzim kao rastvor u sterilnoj vodi, normalnom slanom rastvoru, ili drugom farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0187] U praktičnoj primeni, lizozomni sulfataza enzimi iz ovog pronalaska mogu se kombinovati kao aktivni sastojak, u bliskoj mešavini sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa prema konvencionalnim farmaceutskim tehnikama mešanja. Nosač, razblaživač ili ekscipijens mogu imati raznovrsne oblike u zavisnosti od poželjnog oblika željene priprema za primenu, npr., oralno ili parenteralno (uključujući intravensko). U pripremi sastava lizozomnog sulfataza enzima za oralne oblike doziranja, može da se koristi bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medijuma, kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi, agensi za ukus, konzervansi, agensi za bojenje i slično u slučaju tečnih oralnih priprema, na primer, suspenzija, eliksira i rastvora; ili nosači kao što su škrobovi, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, agensi za granulaciju, lubrikanti, veziva, agensi za dezintegraciju i slično, u slučaju čvrstih oralnih priprema, na primer, praškovi, tvrde i meke kapsule i tablete, gde su čvrste oralne pripreme poželjnje od tečnih priprema. Predmetni pronalazak daje formulaciju koja obuhvata a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen ovde opisanim postupkom, gde navedeni GALNS enzima sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4, i ima čistoću od najmanje 95%> kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukucionim uslovima, ima najmanje 50% konverziju cistein ostatka na položaju 53 u Ca-formilglicinu (FGly), i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 98%> pomenutog GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno pomoću SDS-CGE, i b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji sadrže: (i) količinu fosfatnog pufera koja je efikasna da smanji defosforilaciju pomenutog GALNS enzima, gde je fosfatni pufer NaH2P04na koncentraciji od oko 25mM do 75mm; i (ii) stabilizujući iznos sledećeg: arginin so ili pufer, opciono arginin hidrohlorid, gde su arginin so ili pufer na koncentraciji od oko 10 mM do 50mm; polisorbat, opciono polisorbat 20; i trihidrični ili viši alkoholni šećeri, opciono sorbitol; gde je navedena formulacija na pH od oko 5,0-5,8. Predmetni pronalazak takođe daje formulaciju koji sadrži a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen ovde opisanim postupkom, gde navedeni GALNS enzim sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinama 27 do 522 od SEQ ID NO: 4, i ima čistoću od najmanje 95% kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukucionim uslovima, ima najmanje 50% konverziju cistein ostatka na položaju 53 u Ca-formilglicini (FGly), i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanog oligomanoznog lanaca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 98%> pomenutog GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada podležu SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, i b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji sadrže: (i) NaOAc/HOAc i NaH2P04kao pufere, pri čemu je koncentracija NaOAc/HOAc oko 20 +/- 10 mM, a koncentracija NaH2P04 je 50 +/- 25 mm; i (ii) Arginin HCI, polisorbat 20 i sorbitol kao stabilizatore, pri čemu je koncentracija Arginin HCI oko 30 +/- 20 mm, koncentracija polisorbata 20 je oko 0,01%> +/- 0,005%> (v/v) i koncentracija sorbitola je oko 2,0% +/- 1,0% (v/v); i (iii) pH od oko 5,4 +/- 0,4.

U nekim otelotvorenjima, formulacija može da sadrži drugi pufer.

[0188]Drugi pufer može biti bilo koji agens odgovarajuć za održavanje pH u željenom opsegu. Pogodni puferi uključuju Tris, citrat, sukcinat, acetat, glukonat ili druge pufere organske kiseline. U nekim otelotvorenjima, stabilizator je so ili pufer aminokiselina, opciono so ili pufer arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanina, ornitin, leucina, 2-fenilalanin i glutaminska kiselina. U nekim otelotvorenjima, stabilizator je surfaktant, opciono nejonski surfaktant. Odgovarajući surfaktanti uključuju polisorbate, npr. polisorbat 20 ili polisorbat 80, polikamere, npr. polikamer 188 ili 184, derivate polioksietilen, derivate polioksipropilena, natrijum monolaurat i SDS. Neograničavajući primeri poznatih nejonskih surfakanata uključuju alifatične, primarne ili sekundarne linearne ili razgranat lance alkohola ili fenola sa alkilen oksidom, generalno etilen oksid i generalno 6-30 etilen oksid grupe. Ostali poznati nejonski surfaktanti uključuju mono- ili di-alkil alkanolamide, alkil poliglukozide i polihidroksi amide masnih kiselina. Neograničavajući primeri poznatih anjonskih surfaktanata uključuju natrijum, amonijum, i mono-, di- i trietanolamin soli alkil sulfata, alkil etar sulfate, alkaril sulfonate, alkil suksinati, alkil sulfosukcinat, N-alkoil sarkozinati, alkil fosfati, alkil etar fosfati, alkil etar karboksilati i a-olefin sulfonati. Alkil grupe generalno sadrže od 8 do 18 atoma ugljenika i mogu biti nezasićene. Alkil etar sulfatei, alkil etar fosfati, i alkil etar karboksilati mogu da sadrže od 1 do 10 etilen oksid ili propilen oksid jedinica po molekulu, a poželjno sadrže 2 do 3 etilen oksid jedinice po molekulu. Poznati anjonski surfaktanti obuhvataju natrijum ili amonijum lauril sulfat i natrijum ili ammoinium lauril etar sulfat. Neograničavajući primeri poznatih amfoteričnih surfaktanata uključuju alkil amine okside, alkil betaine, alkil amidopropil betaine, alkil sulfobetaine, alkil glicinate, alkil karboksiglicinate, alkil amfopropionate, alkil amidopropil hidroksisultaine, acil taurate i acil glutamate gde alkil i acil grupe imaju od 8 do 18 atoma ugljenika.

[0189]U nekim otelotvorenjima, stabilizator je poliol ili šećer, poželjno trihidrini ili viši alkoholni šećer. Pogodni polioli uključuju eritritol, arabitol, maltitol, cellobiitol, laktitol, manitol treitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinisitol, galaktitol, glicerol, i glicerin. Poznati polioli uključuju alkohole dobijene od laktoze, trehaloze i stahioza. Poznati redukcioni šećeri uključuju saharozu, trehalozu, sorboza, melezitoza i melitrozu. Poznati šećeri uključuju ksilit, manozu, fruktoza, glukozu; disaharide kao što su laktoza, maltoza, saharoza, trisaharide poput melitroze, i polisaharide poput dekstrana.

[0190]Ovde je opisan postupak za prevenciju defosforilacije pročišćenog rekombinantnog ljudskog GALNS enzima, obuhvata mešanje pomenutog GALNS enzima i količine fosfatnog pufera, koja je efikasna da smanji defosforilaciju, opciono do konačne koncentracije između oko 25 mM i oko 75 mM fosfatnog pufera. U nekim otelotvorenjima, pročišćeni rekombinantni ljudski GALNS enzim takođe meša sa drugim puferom, uključujući bilo koji od gore opisanih agenasa. U nekim otelotvorenjima, enzim se takođe meša sa stabilišućom količinom jednog ili više stabilizatora izabranih iz grupe koju čine soli aminokiselina, puferi aminokiselina, surfaktanti i polioli. U primernim otelotvorenjima, količina defosforilacije je redukovana poređenju sa formulacijom istog enzima u 1 mM fosfatnom puferu, npr. pri testiranju posle 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci ili 6 meseci čuvanja na sobnoj temperaturi (npr. 25°C). U specifičnim otelotvorenjima, ubrzano testiranje stabilnost se vrši posle skladištenja u tolikim intervalima vremena na 40°C.

[0191]U određenim otelotvorenjima, smanjenje defosforilacije u formulaciji GALNS (u poređenju sa 1 mM fosfatnog pufera) može biti najmanje oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 10%, oko 15% , oko 20%, oko 30%, oko 40% ili oko 50% ili više. U drugom otelotvorenjima, nivo bis-fosforilisane manoze 7 (BPM7) na GALNS u formulaciji je od oko 25% do oko 40%, ili oko 30% do 35%.

[0192]U otelotvorenjima bilo koje od gore navedenih formulacija ili postupaka, enzim GALNS je rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu sa aminokiselinama 27 do 522 iz SEQ ID NO: 4, i (i) ima čistoću od najmanje oko 95%> kao što je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, (ii) koji ima najmanje oko 80%o konverzije cistein ostatka na položaju 53 na Ca-formilglicine (FGly), i (iii) ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, pri čemu je najmanje 98%, najmanje 98,5%, najmanje 99% ili najmanje 99,5% pomenutog GALNS enzima u obliku prekursora kao što je određeno Komasi plavim bojenjem, kada se podvrgne SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, ili SDS-kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE).

[0193]U pogledu transdermalnih načina primene, postupci za transdermalnu primenu lekova su opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro et al., Eds. Mack Publishing Co., 1985). Dermalni ili kožni flasteri su poželjan način transdermalne primene lizozomnog sulfataza enzima pronalaska. Flasteri poželjno daju pojačivač apsorpcije kao što je DMSO kako bi se povećala apsorpcija lizozomnog sulfataza enzima. Drugi postupci za transdermalnu primenu leka su opisani u U.S. Pat. Nos. 5,962,012, 6,261,595, and 6,261,595.

[0194]Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi, kao što su sredstva, ađuvanti, nosači ili razblaživači su komercijalno dostupni. Štaviše, takođe su komercijalno dostupne farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, kao što su agensi za pH prilagođavanje i puferi, agensi za prilagođavanje osmotskog pritiska, stabilizatori, agensi za vlaženje i slično.

[0195]U svakom od ovih aspekata, sastavi lizozomnog sulfataza enzima uključuju, ali nisu ograničeni na, smese, pogodne za oralnu, rektalnu, topikalnu, parenteralnu (uključujući potkožno, intramuskularno i intravenski), pulmonarnu (nazalna ili bukalnu inhalacija), ili nazalnu primenu, iako će najpogodniji put u svakom datom slučaju zavisiti delom od prirode i ozbiljnosti stanja koje se leči, kao i od prirode aktivnog sastojka. Primerni načini primene su oralni i intravenski put. Sastavi lizozomnog sulfataza enzima mogu biti prikladno predstavljeni u obliku jedinične doze, i pripremljene pomoću bilo kog od postupaka koji su dobro poznati u oblasti farmacije.

[0196]Zbog njihove lakoće primene, tablete i kapsule predstavljaju najpogodnije oralne dozne oblike, i u tom slučaju se očugledno primenjuju čvrsti farmaceutski nosači. Ukoliko se želi, tablete mogu biti obložene standardnim vodenim ili nevodenim tehnikama. Procenat aktivnog lizozomnog sulfataza enzima u ovim sastavima može, naravno, da varira, i može pogodno biti između oko 2 procenta do oko 60 procenata težine jedinice.

[0197]Sastavi lizozomnog sulfataza enzima prema predmetnom pronalasku mogu se primenjivati u kapsulama ili pripojeni za virusne koverte ili vezikule, ili inkorporirani u ćelije. Vezikule su micelarne čestice koje su obično sferični i koje su često lipidne. Lipozomi su vezikule formirane iz dvoslojne membrane. Pogodne vezikule uključuju, ali nisu ograničene na, unilamelarne vezikule i multilamelarne lipidne vezikule ili lipozomi. Takve vezikule i lipozomi mogu biti napravljeni od širokog spektra lipidnih ili fosfolipidnih jedinjenja, kao što su fosfatidilholin, fosfatidna kiselina, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingomijelin, glikolipid, gangliozidim itd., korišćenjem standardnih tehnika, kao što su one opisane u, na primer, U.S. Patent No. 4,394,448. Takve vezikule ili lipozomi mogu da se koriste za primenu lizozomnog sulfataza enzime intracelularno, i da isporuči lizozomni sulfataza enzime ciljnim organima. Kontrolisano oslobađanje jednog željenog lizozomnog sulfataza enzima može se takođe postići upotrebom enkapsulacije (pogledati, na primer, U.S.

Patent No. 5,186,941).

[0198]Može da se koristi bilo koji put primene koja rastvara sastav lizozomnog sulfataza enzim u krvotoku, ili poželjno, najmanje izvan krvno-moždane barijere. Poželjno, sastav lizozomnog sulfataza enzima se primenjuje periferno, najpoželjnije intravenski, ili putem srčanog katetera. Takođe su korisne intrajugularne i intrakarotidne injekcije. Sastavi lizozomnog sulfataza enzima mogu se primenjivati lokalno ili regijelno, kao što je intraperitonealno, potkožno ili intramuskularno. U jednom aspektu, sastavi lizozomnog sulfataza enzima kompoložaje se primenjuju sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosačem, razblaživača ili ekscipijenasa.

[0199]Stručnjaci će lako shvatiti da nivoi doziranja mogu varirati kao funkcija specifičnog lizozomnog sulfataza enzima, ozbiljnosti simptoma i osetljivosti pacijenta na sporedne efekte. Poželjne doze za dat lizozomni sulfataza enzim su lako određuju od strane stručnjaka u oblasti pomoću različitih sredstava uključujući, ali ne ograničavajući se na, odgovor na dozu i farmakokinetičkih procena sprovedenih kod pacijenata, kod testiranih životinja, iin vitro.

[0200]Doze koje se daju takođe mogu zavisiti od individualnih potreba, od željenog efekta, konkretnog lizozomnog sulfataza enzima, i od izabranog načina primene. Doze lizozomnog

sulfataza enzima su u rasponu od oko 0,2 pmol/kg do oko 20 nmol/kg, poželjne doze variraju od 2 pmol/kg do 2 nmol/kg, a naročito poželjne doze kreću se od 2 pmol/kg do 200 pmol/kg. Alternativno, doze lizozomnog sulfataza enzima mogu biti u opsegu od 0,01 do 1000 mg/kg, poželjne doze mogu biti u opsegu od 0,1 do 100 mg/kg, a naročito poželjne doze u rasponu od 0,1 do 10 mg/kg. Ove doze će biti pod uticajem, na primer, ali ne ograničavajući se na, određen lizozomni sulfataza enzim, oblik farmaceutskog sastava, način primene i mesto delovanja određenog lizozomnog sulfataza enzima.

[0201]Lizozomni sulfataza enzimi pronalaska su korisni za terapeutske, profilaktičke i dijagnostičke intervencije na životinjama, a posebno kod ljudi. Lizozomni sulfataza enzimi se mogu pokazati poželjnu akumulaciju u određenim tkivima. Poželjne medicinske indikacije za dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, bilo koje stanje povezano sa ciljanim organom u pitanju (npr., pluća, jetra, bubreg, slezina).

[0202]Predmetni postupci nalaze primenu u tretmanu različitih bolesnih stanja. U izvesnim otelotvorenjima, od posebnog značaja je upotreba predmetnih postupaka kod bolesnih stanja gde je željena aktivnost lizozomnog sulfataza enzima prethodno identifikovana, ali gde se lizozomni sulfataza enzim ne dostavlja adekvatno na ciljano mesto, oblasti ili odeljku čime bi proizvode potpuno zadovoljavajući terapeutski rezultat. Kod takvih lizozomnih sulfataza enzima, predmetni postupci proizvodnje aktivnih visoko fosforilisanih lizozomnih sulfataza enzime mogu da se koristiti za poboljšanje terapeutske efikasnosti i terapeutskog indeksa lizozomnog sulfataza enzima.

[0203]Tretman je predviđeno da obuhvata bilo koji povoljan ishod po pacijenta koji je povezan sa davanjem lizozomnog sulfataza enzima, uključujući smanjenu verovatnoću sticanja bolesti, prevenciju bolesti, usporavanje, zaustavljanje ili preokretanje progresije bolesti, ili ublažavanje simptoma povezanih sa bolesnim stanjem koje utiče domaćina, gde se koristi ublažavanje ili korisnost u širem smislu odnose najmanje na smanjenja veličine parametra, npr. simptoma, povezanog patološkog stanja koje se tretira, kao što su zapaljenje i bol povezan sa njim. Kao takav, tretman uključuje i situacije u kojima je patološko stanje, ili najmanje simptom povezane sa nji, potpuno inhibiran, na primer, sprečen da se desi, ili zaustavljen, na primer, prestao, tako daje domaćin više ne pati od patološkog stanja, ili najmanje ne pati od simptoma koji karakterišu patološka stanja.

[0204]Različiti domaćini ili pacijenti se mogu lečiti u skladu sa predmetnim postupcima. Generalno takvi domaćini su „sisari" ili „sisarski", gde se ovi izrazi široko koriste za opisivanje organizama koji su u klasi sisara, uključujući redove mesoždera (na primer, psi i mačke), glodara (npr., miševi, zamorci i pacovi) i primata (npr., ljudi, šimpanze, i majmuni). U mnogim otelotvorenjima, domaćini će biti ljudi.

PRIMERI

PRIMER I

VEKTORI EKSPRIMIRANJA SISARAZALJUDSKI FAKTOR 1 MODIFIKOVANJA

SULFATAZEILJUDSKU N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZU (GLANS)

[0205]Cilj je bio konstrukcija sisarskih vektora eksprimiranja odgovarajućih za proizvodnju, u stabilnim transfektovanim ćelijama, adekvatne količine aktivnih lizozomnih sulfataza enzima sa poboljšanim nivoima fosforilacije.

[0206] cDNKpune dužine ljudskog faktora 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) (pogledati prijavu patenta Sjedinjenih država br. US 20005/0123949, datum objave 9. jun 2005, i US 2004/0229250, datum objave 8. novembar, 2004), koje kodirju 374 aminokiselina polipeptid kloniran u vektor eksprimiranja sisara cDNK4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), koji sadrži ljudski CMV pojačivač-promoter i višestruka mesta kloniranja. Efikasna terminacija transkripta je obezbeđena prisustvom poliadenilacione sekvence goveđeg hormona rasta. Selekcioni marker je bio zeocina gen za rezistenciju pod kontrolom EM-7 promotera i SV40 rane sekvence poliadenilacije. Dobijeni plazmid je označen kao pcDNK4 SUMF1. Sekvence ljudskg SUMF1 polinukleotida (SEQ ID NO: 1) i polipeptida (SEQ ID NO: 2) su prikazane na Slici 1 i Slici 2, respektivno.

[0207] cDNK pune dužine ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) (pogledati Tomatsu et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun. 181(2):677-683, 1991), koji kodira 522 aminokiselina polipeptid, uključujući 26 aminokiselina signalni peptid, kloniranje u vektor eksprimiranja sisara pCIN (BioMarin), koji sadrži ljudski CMV pojačivač-promoter vezan za zečji P-hemoglobi IVS2 intron i višestruka mesta kloniranja. Efikasna terminacija transkripta je obezbeđena prisustvom poliadenilacione sekvence goveđeg hormona rasta. mSelekcioni marker je bio neomicin fosfotransferaza gen koji nosi tačkastu mutaciju kako bi smanjio efikasnost enzima. Oslabljen marker je dalje hendikepiran sa slabim HSV-tk promoterom. Dobijeni plazmid je označen kao pCIN 4A. Sekvence ljudskog GALNS polinukleotida (SEQ ID NO: 3) i polipeptida (SEQ ID NO: 4) su prikazane na Slici 3 i Slici4,respektivno.

[0208] Kako bi se povećali nivoi eksprimiranja SUMF1 i GALNS, elementi regije pripajanja matrica (MAR) (pogledati Mermod et al., U.S. Patent No. 7,129,062) su klonirani u SUMF1 i GALNS plazmidima eksprimiranja.

[0209] BMAR SUMF1 je napravljen digestijom p <1_68 Ks Ks Ncol ispunjen MAR (Selexis) sa BamHI i HincII, a zatim ubacivanjem oslobođenog MAR fragmenta u pcDNA4 SUMF1 digestiran sa Bglll i Nrul.

[0210]PMAR SUMF1 je napravljen digestijom P <1 68 Ncol ispunjen (MAR) SV40 EGFP (Selexis) sa Hindlll i Xbal kako bi se uklonio eGFP gen, a zatim umetanjem SUMF1 gena, koji je oslobođen od pcDNA4 SUMF1 digestijom sa Hindlll i Xbal.

[0211]BMAR 4Aje napravljen digestijom BMAR SUMF1 sa PmeI i Spel kako bi se uklonio SUMF1 gen, a zatim umetanjem GALNS gena, koji je oslobođen od pCIN 4A digestijom sa PmeI i Spel.

[0212]PMAR 4A je napravljen digestijom P <1_68 Ncol ispunjen (MAR) SV40 EGFP (Selexis) sa Hindlll i Xbal kako bi se uklonio EGFP gen, a zatim umetanjem GALNS gena, koji je oslobođen od pCIN 4A digestijom sa Hindlll i Xbal.

[0213]cDNK pune dužine ljudskog GALNS je takođe kloniran u pcDNA4 vektoru eksprimiranja sisara (Invitrogen, Carlsbad, CA). pCDNA4 SUMF1 je digestiran sa Hindlll i Xbal kako bi se uklonio SUMF1 cDNK i pCIN 4Aje digestiran sa Hindlll i Xbal kako bi se izolovao GALNS cDNK. GALNS cDNK Hindlll/Xbal fragment je ligiran u Hindlll/Xbal fragment pcDNA4 vektora. Dobijeni plazmid je označen kao pcDNA4-4A.

[0214]Integritet GALNS gena u pCIN 4A, BMAR i pCDNA4-4A vektorima eksprimiranj je potvrđen restrikcionom mapiranjem koristeći enzime dobijene iz New England Biolabs. PMAR 4A vektor eksprimiranja nije mapiran.

[0215]Struktura potpuno prerađenog oblika ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) je prikazana na Slici 5. GALNS se eksprimira kao 522 aminokiselina polipeptid sa 26 aminokiselina signalnom peptidnom sekvencom. 496 aminokiselina GALNS polipeptid se luči kao pred-obrađen (prekursor) oblik enzima koji ima molekularnu masu od oko 55-60 kDa. U aktivnim GALNS, cistein ostatak na položaju 53 prekursora ili potpuno prerađenog GALNS polipeptida (odgovara položaju 79 GALNS polipeptida pune dužine) je konvertovan u Ca-formilglicin (FGly) putem faktora 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1). U lizozomu, GALNS se čepa nakon položaja 325 potpuno prerađenog GALNS polipeptida, rezultujući u GALNS peptidnih fragmenatima od oko 40 kDa i 19 kDa. Ove GALNS peptidi su spojeni disulfidnim mostom između cistein (C) ostataka na položaj ma 282 i 393 na potpuno prerađenom GALNS polipeptidu. Postoje dva kanonskih N-povezana mesta glikozilacije, na položajima 178 i 397 potpuno prerađenog GALNS polipeptida. Bis-fosforilisana manoza 7 (BPM7), koja sadrži 2 manoza-6-fosfat ostatke, pronađena je na N178, ali ne na N397.

PRIMER II

G71S ĆELIJSKE LINIJE KOJE KO-EKSPRIMIRAJU LJUDSKI FAKTOR 1

MODIFIKOVANJA SULFATAZE (SUMF1) I LJUDSKUN-ACETILGALAKTOZAMIN-6-SULFATAZU (GALNS)

[0216]Cilj je bio da se razviju ćelijske linije sposobne za proizvodnju aktivnih lizozomnih sulfataza enzima sa poboljšanim nivoima fosforilacije.

[0217]G71 ćelije (Rockford K. Draper) su izvedene direktno iz CHO-K1 (ATCC CCL-61). G71 ćelijska linija je temperaturno osetljiv mutant od CHO-K1 u pogledu acidifikacije endozoma, koja je uočena da daje razlike u ukupnom lučenju proteina i fosforilaciji na manoznim ostacima za nekoliko enzima pri povišenim temperaturama (Park et al, Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150, 1991; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984).

[02181G71 ćelije su održavane na 34°C u BioWhittaker UltraCHO medijumu sa 2,5% goveđim fetalnim serumom, 2 mM glutaminom, gentamicinom i amfotericinom.

[0219]Kako bi se omogućila lakša upotreba ćelijskih linija za proizvodnju proteina, adherentne G71 ćelije su unapred prilagođene za medijum rasta bez seruma koristeći protokol za prilagođavanje sidro-zavisnih, seruma-zavisnih sisarskih ćelija za suspenziju velike gustine kulture bez seruma (Sinacore et al., Mol. Biotechnol. 15(3):249-257, 2000), što je rezultovalo u ćelijskoj liniji prilagođenoj suspenziji kulture bez seruma, G71S. Alternativno, adherentne G71 ćelije, nakon što su stabilno transfektovane kao što je opisano niže, mogu se prilagoditi medijumu rasta bez seruma, kako je navedeno u Sinacoreet al.

[0220]Uparene kombinacije ljudskih SUMF1 i ljudskih GALNS vektora eksprimiranja(Primer I),ili pcDNA4 SUMF1 plus pCIN4 4A, BMAR SUMF1 plus BMAR 4A ili PMAR SUMF1 plus PMAR 4A, transfektovane su prema protokolu MARtech II kao što je opisao Selexis u G71S ćelijama uzgajanim u medijumu kulture je dopunjen sa antibiotički-antimikotičkim rastvorom (100 IU penicilina, 10 mg streptomicina, 25 ug amfotericina B, Cellgro). Transfekcioni bazeni su gajeni u UltraCHO medijumu (Cambrex) sa dodatkom 5% y-ozračene goveđeg fetalnog seruma (FBS, JRH), 200 ug/mL G418 (AG Scientific) i 200 ug/mL zeocina (Invitrogen), i klonirani su ograničavanjem razblaživanja u 96-komoričnim pločama u istom medijumu rasta. Rast klona je praćen putem Cell Screen (Innovatis) snimanja. Svi klonovi su ispitani korišćenjem snimanja aktivnosti enzima ELISA za aktivni GALNS (pogledatiPrimerIV). Ćelijska produktivnost je izračunata deljenjem snimanja aktivnosti enzima ELISA sa GALNS aktivnost po rastu ćelija (Vl-Cell, Beckman Coulter) dnevno, tokom perioda od 4 dana.

[0221]202 G71S klonovi su generisani i ispitivani za aktivni GALNS: 86 klonova je ko-transfektovano sa pcDNA4 SUMF1 plus pCIN 4 A, 65 klonova je ko-transfektovano sa BMAR SUMF1 plus BMAR 4A i 51 klonova je ko-transfektovane sa PMAR SUMF1 plus PMAR 4A. Klonovi su prvobitno su odabrani na osnovu visokih nivoa aktivnog GALNS iz kulture tkiva sa 96-komoričnih ploča (Slika 6A). GALNS aktivnost je merena korišćenjem snimanja aktivnosti enzima ELISA i predstavljena u ng/mL (y-osa). X-osa prikazuje tri ko-transfekciona uslova koji se koriste za SUMF1 i GALNS eksprimiranje: hCMV promoter bez MAR, hCMV promoter sa MAR, i SV40 promoter sa MAR. Svaka traka predstavlja jedinstveni klon odgovarajuće populacije. Gustina ćelija nije uzeta u obzir u ovom 96-komoričnom ispitivanju klonova i nisu svi ko-transfektovani G71S klonovi prikazani na ovoj slici.

[0222]G71S klonovi koji najviše proizvode aktivni GALNS su odabrani za analizu produktivnost (Slika 6B). Dnevna ćelijska produktivnost merena u pg/ćeliji/dan i dobija se deljenjem GALNS aktivnost gustinom ćelija za taj dan. Ova cifra prikazuje četvrti dan (96 sata) nakon sejanja pri 5xl0<5>ćelija/boca. Klonovi su analizirani za GALNS korišćenjem snimanja aktivnosti enzima ELISA u pg/ćelija/dan (y-osa). Pozitivne kontrole su se sastojale od GALNS koji eksprimira BHK i CHO klonova (BioMarin). Svaka vertikalna crta predstavlja jedan klon. Aktivni GALNS je proizveden od strane pCIN 4A klonova, ali samo marginalno iznad pozadine testa.

[0223]Analiza klonova 96-komoričnog ispitivanja i 4-odvnevnog testa produktivnosti pokazali su da ko-transfekcija vektora eksprimiranja sa MAR elementima povećava produktivnost G71S klonova u odnosu na ko-transfekciju vektora eksprimiranja bez MAR elemenata. BMAR 4A + BMAR SUMF1 ko-transfektovani klonovi pokazali su brzo generisanje u bazenu, brz rast klona, i sposobnost da proizvedu više od 2 puta više aktivnih GALNS od najproduktivnijih PMAR 4A klonova, i do 10 puta više od CHO 4A i BHK 4A klonova kojima nedostaju Mar elementi.

[0224]G71S klonovi koji eksprimiraju GALNS su prilagođeni za medijum rasta bez seruma koristeći protokol naveden uSinacore et al., Mol. Biotechnol. 15(3):249-257, 2000. Cela adaptacija je urađena u prisustvu oba selekciona agensa (zeocin na 200 ug/mL i neomicin na 200 ug/mL). G71 klonovi koji eksprimiraju GALNS gajeni u T-posudama su podeljeni na sledeći način: (1) u 125 ml šejker sa Cambrek UltraCHO medijumom i 5% FBS (lot # 8L2242); (2) u 125 mL šejker sa JRH 302M medijumom (proizvodni medijum) i 5% FBS; i (3) u T-posude kao rezerva (UltraCHO, 5% FBS). Kada su osnovane suspenzije kulture, adherentne ćelije su odbačene, i odvikavanje od FBS je pokrenuto. Kada je stopa rasta vraćena do > 0,5 (l/dan) tokom 3 prolaza i vijabilnost bila > 95%, koncentracija FBS je smanjena za 50%. Ćelije su ostavljene u svakoj datoj koncentraciji FBS tokom minimum 3 prolaza. Jednom prilagođene rastu od 2,5%o FBS, ćelije su nanasene direktno u medijum bez seruma. Ćelije su čuvane u svežem medijumu sa 10%> (v/v) DMSO. Ispitivanje odmrzavanja je sprovedeno da se obezbedi da su ćelije preživele proces zamrzavanja. Dva G71S klona koja eksprimiraju GALNS iz BMAR 4A + BMAR SUMF1 transfektovanja, klonovima 4 i 5 je trebalo otprilike 15 prolaza za adaptaciju na kulturu suspenzije bez seruma. Klon koji eksprimira iz pcDNA4 SUMF1 plus pCIN 4A transfektovanja, C6, je takođe izolovan i prilagođen kulturi bez seruma.

[0225]Uparene kombinacije ljudskih SUMF1 i ljudskih GALNS vektora eksprimiranja(Primer I),pcDNA4 SUMF1 plus pCDNA4-4A, transfektovane su u G71S ćelije u suštini kao što je opisano gore, osim što je 200 ug/mLZeocina (Invitrogen) korišćen za selekciju. Šest klonova koji eksprimiraju GALNS, C2, C5, C7, CIO, Cll i C30, su izolovani i prilagođene suspenziji kulture bez seruma, u suštini kao što je opisano gore.

PRIMER III

KULTIVISANJE VELIKIH RAZMERA G71S ĆELIJSKIH LINIJA KOJE

EKSRPIMIRAU LJUDSKU N-ACETILGALAKTOZAMIN-6-SULFATAZU(GALNS)

[0226]Cilj je bio da se izmeri proizvodnja enzima iz G71S klonova koji eksprimiraju ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS). G71S ćelijske linije prilagođene suspenziji kulture bez seruma koje ko-eksprimiraju ljudski SUMF1 i ljudskih GALNS kultivisane su u velikim razmerama i ispitivane za aktivnu proizvodnju GALNS enzima. [02271Postoje prilagođavanje suspenziji kulturi bez seruma bilo relativno brzo za G71S ćelijsku liniju domaćina, odlučeno je da proizvodnja može da se uradi u WAVE bioreaktoru koji radi u režimu perfuzije. WAVE bioreaktor omogućava veću fleksibilnost u obimu inokuluma jer skaliranje na gore može da se uradi direktno u vreći, čime se smanjuje rizik od kontaminacije i ubrzava proizvodnja materijala.Slika7 prikazuje šematsko podešavanje WAVE bioreaktora. Dijagram pokazuje, u režimu perfuzije, da nanesena ćelija prati zapreminu medijuma u vreći, određujući težinu vreći i prilagođavajući mesta hranjenja i prikupljanja kako bi se održala željena zapremina. U 10 L vrećama, pH je takođe kontrolisan do željene zadate tačke uz pomoć sonde koja se ubacuje u vreću.

[0228]Materijal G71S klonova 4 i 5 koji eksprimiraju GALNS proizveden je u 1 L skali. pH kulture nije pod kontrolom u ovim ponavljanjima. Operativno ograničenje WAVE vreća je protok od 3 zapremina suda dnevno (VV/dan). U cilju sprečavanja bilo koje inaktivacije materijala, ciljna specifična stopa perfuzije ćelije (CSPR) je 0,3 nl/ćelija/dan, što rezultuje u prosečnom vremena zadržavanja od osam sati za GALNS enzime. Stoga, gustina ćelija u vreći je održavana na oko 10-12 kl 06 ćelija/mL. Stopa rasta za G71S klonove 4 i 5 koji eksprimiraju GALNS je 0,16 i 0,20, respektivno. Krvarenje za održavanje ciljane gustine ćelija je rađeno direktno u vreći.

[0229]pH prikupljene tečnosti je prilagođen do pH između 5,5 i 6,5 za održavanje enzimske aktivnost, pošto se ranije pokazalo daje GALNS stabilan na pH 6. Ovo je postignuto pomoću tempiranog bolus dodavanja 5% zapremine pH 4,0 natrijum citrat pufera mešanog u skladu sa prikupljanjem sa reaktora. Korigovana prikupljena tečnost je čuvana na 4°C pre dalje obrade. Dva G71S klonova koji eksprimiraju GALNS, klonovi 4 i 5, prosečno su titrali oko 4,2 mg/L sa povezanom specifičnom produktivnosti od oko 1,25 pg/ćelija/dan.

[0230]G71S klonovi koji eksprimiraju GALNS, C2, C5, C6, C7, CIO, Cll i C30, slično su gajeni u velikim količinama i procenjeni za aktivnu proizvodnju GALNS enzima.

PRIMER IV

MERENJE KONCENTRACIJE I AKTIVNOSTI LJUDSKEN-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)

[0231]Enzimom povezani imunosorbentski testovi (ELISA) razvijeni su za merenje koncentracije GALNS enzima i aktivnosti iz G71S klonova koji ko-eksprimiraju ljudski SUMF1 i ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS).

ELISA snimanje aktivnosti enzima

[0232] ELISA snimanja aktivnosti enzima meri aktivnost GALNS enzima u čvrstoj fazi, nakon snimanja od strane nekog anti-GALNS specifičnog antitela vezanog za ELISA ploču.

[0233]Puferi.Pufer A (karbonatni pufer): rastvoriti 3,09 grama Na2C03i 5,88 grama NaHCChu 900 ml dejonizovane (Dl) H2O, zatim dodati Dl H2O do finalne zapremine od 1000 ml. Proverite da lije pH između 9,4 i 9,6, zatim sterilisati filtriranjem. Da bi se potpuno prekrila jedna 96-komorična mikroploča sa 100 uL po komorici, razblažiti 19 uL anti-GALNS antitela u jednu cev (12 mL). Pufer B (ELISA puferu za blokiranje i serijski pufer za razblaživanje): lx kiseli PBS, 0,05% Tween-20 i 2% BSA, prilagođeno do pH 6,5 sa sirćetnom kiselinom. Pufer B<w>(pufer za ispiranje): 100 mM NaOAc i 0,05% Tween-20, prilagođen do pH 6,5 sa sirćetnom kiselinom. Pufer C (substratni pufer): 25 mM natrijum acetat, 1 mM NaCI, 0,5 mg/mL desalinizovanog BSA i 0,01%> natrijum azida, prilagođeno do pH 4,0 sa ledenom sirćetnom kiselinom. Pufer D (b-galaktozidaza pufer): 300 mM natrijum fosfat, 0,1 mg/ml BSA, 0,01% natrijum azid i 0,01% Tween-20, prilagođen do pH 7,2 sa fosfornom kiselinom. Pufer E (zaustavni pufer): 350 mM glicin i 440 mM karbonatni pufer, prilagođen do pH 10,7 sa 6 M NaOH.

[0234]Reagensi.Anti-GALNS IgG antitelo: poliklonska zečja antitela su Protein G pročišćena iz seruma. U D-PBS, ukupni protein = 3,17 mg/mL (BCA). Alikvoti (19 uL) se čuvaju na -20°C za jednokratnu upotrebu svaki. 4MU-Gal-6-S supstrat (čvrst; 440 MV): 100 mM pripremljene u Dl vodi i čuvane na 4°C. (3-galaktozidaza (Sigma G-4155): razblaženo do 12 ug/mL u Puferu D pre upotrebe.

[0235]Protokol:Vezati anti-GALNS antitela za ploču: Nunc MaxiSorp ELISA ploča (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135) je obložena sa anti-GALNS antitelom na konačnoj koncentraciji proteina od 5 |Lig/mL u Puferu A. Za pripremu ovog rastvora, otopiti jedan 19 uL alikvot, obrtati ga kratko (10 sekundi) u mikrocentrifugi za prikupljanje tečnosti. Prebaciti svih 19 uLu 12 ml Pufera A. Mešati energično inverzijom, a zatim sipati u rezervoar, praćeno nanošenjem na ploču (100 uL po komorici) koristeći multi-kanalne pipete. Pokriti ploču i inkubirati na 4°C tokom noći. Odstraniti nevezana anti-GALNS antitela: oprati ploču ispiranjem sa Puferom B<w>tri puta. Blokiranje: blokirati ploču sa Puferom B (320 uL po komorici), zatim pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 1 sata. Pripremiti seriju razređenja pročišćenog GALNS standarda i test uzoraka (nepoznanice) tokom koraka blokiranja: standardno se razblažuje u Puferu B do gornjeg kraja linearnog opsega testa (128 ng/mL u Redu A), zatim serijski razblažava (2-struko) u redovima B-G na 96-komoričnoj ploči. Red H je prazan pufera (tj. bez GALNS enzima). Prvo, pripremiti 500 uL koncentracije na 128 ng/mL u Puferu B. Zatim, razblažiti serijski 2-struko u Puferu B (250 uL u 250 uL) do dostizanja 2 ng/ml. Ukloniti puferu za blokiranje: posle koraka blokiranja, Pufer B se odbacuje. Vezati GALNS enzim standardnih i test uzoraka do anti-GALNS antitela: staviti na ploču 100 uL/komorica serijski razblaženog standarda i test uzorake (ponavljanje u dva primerka). Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 1 sata. Ukloniti GALNS inhibitore: oprati ploču ispiranjem sa Puferom B<w>, tri puta. Dodati GALNS supstrat (prva reakcija): priprema dovoljno konačnog rastvora supstrata za nanošenje 100 uLpo komorici (pripremljeno ne više od 1 sata pre upotrebe). Razblažiti osnovni rastvor 4MU-Gal-6-S (100 mM) do 1 mM u Puferu C. Staviti 100 uL po komorici. Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 30 min. Dodati P-galaktozidazu (druga reakcija): dodati 50 uL 12 ug/ml P-galaktozidaza u Pufer D u svaku komoricu. Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 15 min. Zaustavljanje reakcije: dodati 100 uL Pufera E (zaustavni pufer) u svaku komoricu za jonizaciju oslobođenog 4MU. Transfer do fluoroplata: transfer (8 komorica u datom trenutku) 200 uL od 250 uL iz svake komorice ELISA ploče do crne netretirane mikrotitar ploče sa ravnim dnom (Fluoroplate, Costar # 3915). Čitanje fluorescencije: pročitati ploču na Gemini čitaču ploče (Molecular Devices Corporation) korišćenjem SOFTmax PRO programa (366 nm ekscitacija, 446 nm emisija, 435 nm odrezak).

GLANS ELISA

[0236] GALNS ELISA meri koncentraciju GALNS enzima u medijumu kondicioniranom za ćelijsku kulturu ili drugim uzorcima procesa koristeći sendvič imunotest.

[0237]Puferi.Pufer A (karbonatni pufer): rastvoriti 3,09 grama Na2C03i 5,88 grama NaHCChu 900 ml dejonizovane (Dl) EhO, zatim dodati Dl H2O do finalne zapremine od 1000 ml. Proverite da lije pH između 9,4 i 9,6, zatim sterilisati filtriranjem. Da bi se potpuno prekrila jedna 96-komorična mikroploča sa 100 uL po komorici, razblažiti 19 uL anti-GALNS antitela u jednoj cevi (12 mL). Pufer B (ELISA puferu za blokiranje i serijski pufer za razblaživanje): lx kiselinski PBS, 0,05% Tween-20 i 2% BSA, prilagođen do pH 6,5 sa sirćetnom kiselinom. Pufer B<w>(pufer za ispiranje): 100 mM NaOAc i 0,05% Tween-20, prilagođen do pH 6,5 sa sirćetnom kiselinom. Pufer F (zaustavni pufer): 2N H2SO4: u ukupno 600 mL, dodati 100 ml 12N H2SO4i 500 mL milliO vodu.

[0238]Reagensi.Anti-GALNS IgG antitelo: zečja poliklonska antitela su Protein G pročišćen iz seruma. U D-PBS, ukupni protein = 3,17 mg/mL (BCA). Alikvoti (19 uL) se čuvaju na - 20°C za jednokratnu upotrebu svaki. HRP-konjugovano detektovanje antitela (RIVAH): konačno konjugovano antitelo je razblaženo 1: 100 u D-PBS/1% BSA i čuvano u 120 uL alikvotima na -20°C za jednokratnu upotrebu. TMB EIA komplet supstrata (BioRad #172-1067).

[0239]Protokol.Vezati anti-GALNS antitelo na ploču: Nunc MaxiSorp ELISA ploča (Nalge/Nunc International, Fisher # 12-565-135) je obložena sa anti-GALNS antitelom na konačnoj koncentraciji proteina od 5 ug/mL u Puferu A. Za pripremu ovog rastvora, istopiti jedan 19 uL alikvot, obrtati kratko (10 sek) u mikrocentrifugi za prikupljanje tečnosti. Prebaciti svih 19 uLu 12 ml Pufera A. Mešati energično inverzijom, a zatim sipati u rezervoar, zatim staviti na ploču (100 uL po komorici) koristeći multi-kanalne pipete. Pokriti ploču i inkubirati na 37°C (konvekcioni inkubator), tokom 2 sata. Ne koristiti toplu blokadu. Odstrani nevezana anti-GALNS antitela: oprati ploču ispiranjem sa Puferpm B<w>, tri puta. Blokiranje: blokiramje ploča sa Puferom B (320 uL po komorici), zatim pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 1 sata. Pripremiti serije razređenja pročišćenog GALNS standarda i test uzoraka (nepoznanice) u koraku blokiranja: standard se razblažuje u Puferu B do gornjeg kraja linearnog opsega testa (40 ng/mL u Redu A), zatim serijski razblažava (2 -struko) u redovima B-G na 96-komoričnoj ploči. Red H je prazan pufer (tj. bez GALNS enzima). Prvo, pripremiti 500 uL koncentracije na 40 ng/mL u Puferu B. Zatim, razblažiti serijski 2-struko u Puferu B (250 uL u 250 uL) do dostizanja 0,625 ng/ml. Ukloniti pufer za blokiranje: posle koraka blokiranja, Pufer B se odbacuje. Vezati GALNS enzim standard i test uzorake za anti-GALNS antitelo: staviti na ploču sa 100 uL/komorica serijski razblaženog standarda i test uzorake (ponavljanje u dva primerka). Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 1 sata. Pranje: oprati ploču ispiranjem sa Puferom B<w>, tri puta. Vezati antitelo konjugat koji se detektuje: otopiti jedan alikvota (120 uL) RIVAH antitela, obrtati kratko (10 sek) u mikrocentrifugi za prikupljanje tečnosti. Razrediti svih 120 pL u 11,9 ml Pufera B i snažno obrnuti cev za mešanje. Sipati u rezervoar i dodati 100 uLpo komorici sa višekanalnom pipetom. Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 30 min. Pranje: oprati ploču ispiranjem sa Puferom B<*>, tri puta. TMB supstrat: priprema konačnog rastvora supstrata mešanjem 1,2 ml Rastvora B sa 10,8 ml Rastvora A. Sipati u rezervoar i dodati 100 uL po komorici sa višekanalnom pipetom. Pokriti ploču i inkubirati na 37°C tokom 15 min. Zaustavljanje rastvora: pipetirati 12 mL 2N H2SO4zaustavnog rastvora u rezervoar i dodati 100 uL po komorici sa višekanalnom pipetom. Mešati laganim dodirom. Čitanje A450: pročitali ploču u čitaču ploča.

Test specifične GALNS aktivnosti

[0240]Test specifične GALNS aktivnosti meri enzimsku aktivnost GALNS u rastvoru korišćenjem GALNS-specifičnog supstrata.

[0241]Puferi.MilliQ H2O se koristi za sve pufere. Pufer za razblaživanje (DB): za 1 L DB, rastvoriti 1,74 mL sirćetne kiseline, 0,75 g natrijum acetata, 233,6 mg NaCl, 2 mL 50% Tween-20 i 10 mL 1% natrijum azida u MilliQ H2O, i prilagoditi pH do 4,0 +/- 0,5 sa 0,1 M NaOH ako je pH manji od 3,95 i sa 0,1 M sirćetne kiseline ako je pH veći od 4,05. Konačne koncentracije su: 19,5 mM sirćetne kiseline, 5,5 mM natrijum acetata, 1 mM NaCl, 0,1 % Tween-20 i 0,01% natrijum azida. Fosfatni pufer (PB): za 1L PB, rastvoriti 13,9 g NaFhPGM-H2O i 55g NaHP04-7H20 u MilliQ H2O, i podesiti pH na 7,2. Konačna koncentracija je 300 mM NaPi. Zaustavi pufer (SB): za 1 L SB, rastvoriti 26,2 g glicina i 46,6 g natrijum karbonata u MilliQ H20 i prilagodit pFf na 10,6 sa NaOH. Test puer (AB): razrediti 4MU-Gal-6S 1:50 u DB (2 mM konačno). P-galaktozidaza pufer (bGB): 25 ug/mL p-glaktozidaza u 300mmNaPi, pH 7,2.

[0242]Reagensi.4MU-Gal-6S: lOOmm u H20 (Toronto Research Chemicals Cat. # M334480). P-galaktozidaza: Sigma G 4155. 4-metilumbeliferon (4MU standard): Sigma M-1381 (lOmMuDMSO).

[0243]Protokol.Obaviti serijska razblaživanja GALNS enzima. Za pročišćen i formulisanO GALNS (~l,5mg/mL), razblaži uzorke 1: 10,000 u cevima za mikrocentrifugu sa niskom adhezijom proteina (USA Scientific Cat#1415-2600) koje sadrže DB, pre 1: 1 serijskog razblaživanja. Smestiti 100 uL DB 96-komoričnu ploču sa niskim vezivanjem proteina. U prvom redu, pipetirati 100 uL GALNS uzorka. Sad serijski razblažiti (1: 1) niz ploču (A-G na 96-komoričnoj ploči). No uzorak se dodaje do komorice H (prazna). Linearni opseg ovog testa je 1-75 ng/mL. Koristiti isti postupak za pripremu 4MU standardne krive. Rastvoriti 10 mm 4MU u DMSO 1: 100 u DB. Početi 4MU standardnu krivu dodavanjem 50 uL od 50 uM 4MU u prvu komoricu, a potom serijski razblažiti. Dodati 50 uL supstrata razblaženog u AB

(2 mM 4MU galaktoza-6S u DB) na 96-komoričnoj fluorescentnoj ploči. Pre-inkubirati supstrat tokom 10 min na 37°C. Dodati 50 uL od 100 uL serijskih razblaženja GALNS i 4MU standarda do 50 uL supstrata u AB. Inkubirati na 37°C tokom 30 min (ova prva reakcija uklanja sulfat sa supstrata), ugasiti prvu reakciju i započeti drugu reakciju dodavanjem 50 uL P-galaktozidaze (razblažiti P-glaktozidazu do 25 |ug/mL u PGB) . Fosfat inhibira GALNS i povećanje pH takođe zaustavlja GALNS reakciju. Rezultujući pH je sada u optimalnom opsegu pH od P-galaktozidaze. Inkubirati ovu drugu reakciju tokom 15 min na 37°C. Joniziranje oslobađa 4MU dodavanjem 100 uL SB. Pročitati EKS355 Em460 na čitaču 96-komorčnih fluorescentnih ploča. Obračun enzimske aktivnosti (na 37°C u pH 4,0 puferu): 1 jedinica = umol 4MU oslobođen/min; aktivnost = umol 4MU/min/mL; specifična aktivnost = umol 4MU/min/mg. Obračun koncentracije proteina: korišćenje koeficijenta ekstinkcije od GALNS (1 mg/ml = 1,708 jedinica apsorbancije na 280nm).

PRIMERV

PROČIŠĆAVANJELJUDSKEN-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE(GALNS)

[0244]Cilj je bio da se dobije velika količinu rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS). Stabilno transfektovane G71 ćelije koje ko-eksprimiraju ljudski SUMF1

i ljudski GALNS su uzgajane u uslovima bioreaktorske kulture, i aktivni enzim GALNS je pročišćen iz medijuma ćelije.

[0245]Tečna hromatografija. Aparatura.Amersham Pharmacia Biotech AKTA explorer 900 sistem, koristeći Unicorn kontrolni softver.

[0246]Protein analitički postupci.Standardne procedure su praćene za SDS-PAGE, Komasi plavim bojenjem (B101-02-COOM), Western blottingom i Bradford Protein testovi. Ponavljanja pročišćavanje se ispituju pomoću prinosa aktivnosti, a čistoća GALNS proizvoda se vizuelno procenjuje pomoću SDS-PAGE. Prisustvo obrađenih nečistoća je detektovano Western blotting-om korišćenjem anti-GALNS antitela. Koncentracija proteina je merena korišćenjem proteinskog testa za Bradford. Koncentracija konačnog pročišćenog GALNS proteina je merena A280 merenjem korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,708.

[0247]Hromatografije smole.Plava sefaroza 6 FF (GE Healthcare, lot #306346) i Fractogel SE Hi-Cap (Merck KgaA, FC040894449).

[0248]Određivanje aktivnosti GALNS enzima.Specifična aktivnost GALNS je određivana korišćenjem malog fluorescentnog supstrata 4-metilumbeliferil-6-S-Gal (4-MU-6-S-GAL). Test specifične GLANS aktivnosti uključuje dvostepenu reakciju , pri čemu je potrebno dodavanje P-galaktozidaze posle inkubacije GALNS sa supstratom tokom određenog vremena kako bi se oslobodla fluorescentna oznaka. Merenja se vrše pomoću čitača fluorescentnih ploča.

[0249]10DG kolona desalinizacije (Bio-RAD) je uravnotežena sa puferom za uravnoteženje (EKB, 50 mM NaOAc, 10 mM NaCI, pH 5,8). MilliQ H20 je korišćena za sva pufere. Tri (3) mL pročišćenog GALNS (0,5 - 2 mg/mL) je naneseno na kolonu za desalinizaciju, eluirano i prikupljeno u 4 ml alikvotima u odvojenim epruveta pomoću EQB. Koncentracija proteina je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije GALNS (1 mg/mL = 1,708 jedinica apsorbancije na 280 nm).

[0250]Desalinizovani uzorci GALNS su serijski razblaženi (1:1) u puferu za razblaživanje (DB, 50 mM NaOAc, 1 mM NaCI, pH 4,0 + 0,5 mg/mL BSA). BSA je desalinizovan pre korišćenja nanošenjem 50 mg/ml BSA (ne više od 5% CV) na G25 kolonu prethodno uravnoteženu sa milliQ H2O. 100 uL na desalinizovanog GALNS uzorka pipetiran u prvi redu 96-komorične ploče sa niskim vezivanjem proteina, a serijski razblaženi uzorci GALNS su pipetirani niz ploču (redove A-G na 96-komoričnim pločama). 100 uL DB je pipetirano u poslednju komoricu (H). Na gornjem kraju linearnog opsega ovog testa je 200 ng/mL, i linearni opseg je 3 - 200 ng/ml. Isti postupak je izvršena za dobijanje standardne krive sa 4-methilumbelliferonom (4MU) (Sigma M-1381, 10 mM u DMSO). 50 uL od 100 uL serijskih razblaženja GALNS i 4MU prebačeno u novu 96-komoričnu fluorescentnog ploču (ploča sa crnim dnom). 50 pL od 2 mM 4MU galaktoza-6S (u milliQ H2O) je dodat uzorcima koji treba da se testiraju, i inkubirano na 37°C tokom 30 minuta. Ova prva reakcija je ugašena, a pokrenuta je druga reakcija dodavanjem 50 uL P-galaktozidaze (Sigma G-4155, razblaženo do 12 ug/mL u 300 mM NaPi, pH 7,2), i inkubirano na 37°C tokom 15 minuta. Oslobođen 4MU je jonizovan dodavanjem 100 uL zaustavnog pufera (glicin/karbonat, pH 10,6). Ploče su očitane na čitaču 96-komoričnih fluorescentnih ploča (ekscitacija 355 nm, emisija 460 nm). 1 jedinica je definisana kao 1 umol 4MU oslobođen/min, enzimska aktivnost je data u umol 4MU/min/mL, i specifična aktivnost je data u umol 4MU/min/mg, sve na 37°C u pH 4,0 puferu.

[0251]Prvi proces pročišćavanja.Prvi proces pročišćavanja uključivao je korak ultrafiltracije (UF) praćen procesom pročišćavanja sa 2-kolone.

1. Filtracija prikupljanja (HF): bioreaktivni materijal je 0,2 uM sterilno filtriran.

2. Ultrafiltracija (UF): bioreaktivni materijal je koncentrovan 10-20X ultrafiltracijom kroz 30 kD Sartocon membraue. 3. pH 4,5 prilagođavanje: koncentrovani bioreaktivni materijal (UF (20X)) je prilagođen pH do 4,5 sa puferom za pH prilagođavanje (1,75 M NaOAc, pH 4,0) na sobnoj temperaturi i filtriranje pod sterilnim uslovima pre nanošenja na Plava sefaroza kolonu. 4. Plava sefaroza 6 brzi protok (FF): pH 4,5 prilagođen UF (20X) je nanesen na Plava sefaroza kolonu, GALNS protein je eluiran kao što je prikazano u Tabeli 1 i na Slici 9A.

5. Fractogel SE Hi-Cap: eluat iz Plava sefaroza kolone je podešen do pH 4,3 i sipan u Fractogel SE Hi-Cap kolonu i GALNS protein je eluiran kao što je prikazano uTabeli2 i na

Slici 9B.

GALNS protein u eluatu je sakupljen frakcionacijom, odbacujući prethodno eluirano rame i naknadno eluiran rep. 6. Konačna UF/HF: eluat iz Fractogel SE Hi-CAP kolone se koncentruje ultrafiltracijom i sterilno filtrira kako je gore opisano.

[0252]Formulacija,pročišćeni GALNS protein je formulisan u 10 mM NaOAc, 1 mM NaH2P04, 0,005% Tween-80, pH 5,5.

[0253]Studije stabilnosti.Stabilnost konačnog formulisanog pročišćenog GALNS se prati na 4°C i -70°C u funkciji vremena čuvanjem malih alikvota GALNS uzoraka na odgovarajućim temperaturama. U određenim vremenskim tačkama, smrznutih alikvoti uzoraka su brzo otopljeni na 37°C vodene kupke pre aktivnosti merenja.Slika8 pokazuje daje pročišćeni GALNS bio stabilan na 4°C i -70°C tokom perioda od do najmanje 79 dana u formulacionom puferu.

[0254]Rezultati prvog procesa pročišćavanja.Tabela3 prikazuje prinose pročišćavanja za tri pripreme GALNS proteina proizvedenih od G71S klona 4 u bioreaktor suspenziji kulture. Čistoća je vizuelno procenjena pomoću SDS-PAGE daje oko 95% u svim slučajevima.

[0255]Slika 9 prikazuje SDS-PAGE GALNS proteina odvojen (A) Plava sefaroza 6 hromatografijom brzog toka, praćeno (B) Fractogel SE Hi-CAP hromatografijom. Gelovi su bojeni Komasi plavim (levo) ili anti-GALNS antitelom (desno). Za Western blot, anti-GALNS zečje antitelo je razblaženo do 1:5000, i sekundarno antitelo je anti-alkalno fosfataza zečje antitelo. GALNS protein ima prividnu molekularnu težinu od -55-60 kDa na SDS-PAGE, u skladu sa očekivanom veličinom izlučenog pred-prerađenog (prekursor) oblika enzima kom nedostaje 26 aminokiselinski ostatak signalni peptid je, i takođe mu nedostaje cepanje posle položaja 325.

[0256]N- terminus karakterizacija.N-terminus pročišćenog GALNS proteina je određena putem LC/MS. N-terminalna sekvenca je bila APKPPN, što odgovara predviđenom N-terminusu izlučenog oblika GALNS koji nemaju 26 aminokiselinski ostatak signalni peptid (uporediti ljudske GALNS polipeptidne sekvence na Slici 4 i Šlica 5).

[0257]Drugi proces pročišćavanja.Drugi proces pročišćavanja uključivao je korak ultrafiltracije/dijafiltracije (UF/DF) praćen 3-kolone procesom pročišćavanja.

1. Ultrafiltracija (UF/DF): bioreaktivni materijal je koncentrovan 20X

ultrafiltracijom/dijafiltracijom kroz 30 kD Sartocon membranu na pH 5,5.

2. pH 4,5 prilagođavamke: koncentrovana bioreaktivni materijala (UF/DF (20X)) je

prilagođen pH do 4,5 sa puferom za prilagođvanje pH (1,75 M NaOAc, pH 4,0) na sobnoj temperaturi i sterilno filtriran pre nanošenja na Fractogel EMD SE Hi-CAP kolonu.

3. Fractogel EMD SE Hi-Cap: pH 4,5 prilagođen UF/DF (20Ks) se nanosi na

Fractogel EMD SE Hi-Cap kolonu, ispran uzastopno sa 10 mM acetat/fosfatom, 50 mM NaCl, pH 4,5 i 10 mM acetatu/fosfatom, 50 mM NaCI, pH 5,0, a GALNS protein je eluiran sa 10 mM acetat/fosfatom, 140 mM NaCI, pH 5,0.

5. Zn-helatna sefaroza FF: eluat iz Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone je podešen na

500 mM NaCI, pH 7,0 i nanesen u Zn-helatnu sefarozu FF (Zn-IMAC) kolonu, isparan sa 10 mM acetat/fosfatom, 125 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 7,0 i GALNS protein je eluiran sa 10 mM acetat/fosfataom, 125 mM NaCI, 90 mM imidazolom, pH 7,0.

6. pH 3,5 prilagođavanje: eluat iz Zn-helatne sefaroze FF kolone koja sadrži GALNS

protein je prlagođen na pH 3,5 za nisku pH virusnu inaktivacije i zatim prilagođen do

10 mM acetat/fosfata, 2 M NaCl, pH 5,0.

7. TovoPearl Butil 650M: nisko pH prilagođen eluat iz Zn-helatne sefaroze FF kolone je nanet na TovoPearl Butil 650M kolonu, ispran sa 10 mM acetat/fosfatom, 2 M NaCl, pH 5,0, i GALNS protein je eluiran sa 10 mM acetat/fosfatom, 0,7 M NaCl, pH 5,0. 8. Konačni UF/HF: eluat iz TovoPearl Butil 650M eluata je ultrafiltriran i dijafiltriran u 20 mM acetatu, 1 mM fosfatu, 150 mM NaCI, pH 5,5.

[0258]Formulacija,pročišćeni GALNS protein je formulisan u 10 mM NaOAc/HOAc, 1 mM NaH2P04, 150 mM NaCl, 0,01% Tween-20, pH 5,5.

[0259]Rezultati drugog procesa pročišćavanja.Tabela4 prikazuje oporavak za GALNS protein proizveden od G71S klona C2 u bioreaktor suspenziji kulture koristeći drugi procesa pročišćavanja. Čistoća formulisanog GALNS enzima (tj., prekursor i zrelih ili prerađenih forme zajedno) je oko 98%>, kao što je određeno putem C3 RP-HPLC. Procenat prekursora oblika GALNS enzima je oko 85% kao što je određeno pomoću SDS-kapilarne gel elektroforeze.

[0260] Slika 10prikazuje SDS-PAGE GALNS enzima odvojena

unltrafiltracijorn/dijafiltracijom (UF/DF), Fractogel SE Hi-CAP hromatografijom, Zn-helatnom sefaroznom FF hromatografijom i TovoPearl Butil 650M hromatografijom. Gelovi su bojeni Komasi plavim (gore levo), anti-GALNS antitelaom (gore desno), anti-katepsin L

(dole levo) i anti-CHO proteinima (CHOP, dole desno). Za Western blot, anti-GALNS poliklonsko zečje antitelo je razblažen do 1: 5000, i sekundarno antitelo je anti-zečji AP konjugat; anti-katepsin L kozje poliklonsko antitelo je razblaženo do 1: 1000, i sekundarno antitelo je anti-kozji HRP konjugat; i anti-CHOP zečje poliklonsko antitelo je razblaženo do 1: 1000, a sekundarno antitelo je anti-zečji HRP konjugat. Prekursorski GALNS enzim ima prividnu molekulsku težinu od -55-60 kDa na SDS-PAGE, i zrela ili prerađeni oblici GALNS enzima imaju očigledne molekularne težine -39 kDa i -19 kDa na SDS-PAGE.

[0261]Sažetak prvog procesa pročišćavanja.GALNS enzim je pročišćen korišćenjem toka pročišćavanja koji je modifikovan od standardnog toka (pogledatiTabelu5). Bioreaktivni prikupljen materijal je 0,2 um sterilno filtriran i čuva na 4°C pre nanošenja na plavu-sefaroznu obuhvatnu kolonu. Filtrirani bioreaktivni materijal je nanesen neposredno ili je koncentrovan do 15X ultrafiltracijom. Modifikacija toka pročišćavanje je bilo neophodno zbog nizvodnih koraka pročišćavanja, SP sefaroza hromatografija praćena Fenil sefaroza hromatografijom, nije dala dovoljno čist GALNS. Koristeći SE Hi-Cap hromatografiju kao zamena za dve nizvodne kolone pročišćavanja rezultovalo je u 2-kolone procesu pročišćavanja, sa značajno poboljšanom čistoćom konačnog materijala, dok je ukupan GALNS oporavak značajno povećan od -22% do -80%. Čistoća GALNS enzima (sastoji se uglavnom od prekursor oblika, pogledatiSliku 9),kako je utvrđeno C4-RP hromatografijom, grubo je procenjena na > 95%, i pročišćeni GALNS enzim je ostao stabilan u formulacionom puferu duže od 79 dana na 4°C i na -70°C.

[0262]Sažetak drugog procesa pročišćavanja.GALNS Enzim je takođe pročišćena korišćenjem drugog toga pročišćavanje (pogledatiTabelu 6).Ukupni GALNS povraćaj je bio oko 70%, a čistoća GALNS enzima (uključujući prekursor i zrele ili obrađene oblika, pogledatiSliku 10),kako je utvrđeno C4-RP hromatografijom, grubo je procenjena na oko 97%.

[0263]Ovi testovi pokazuju da gore opisani protokoli za dobijanje rekombinantnih lizozomnih sulfataza enzima pružaju efikasan postupak za proizvodnju velikih količina visoko pročišćenog enzima, posebno izlučenog prethodno obrađenog (prekursor) oblika ljudske N-acetilgalaktozamin-6- sulfataze (GALNS).

PRIMER VI

PROČIŠĆAVANJE LJUDSKE N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS) SA MINIMALNIM PODREZIVANJEM

[0264] Kontrola proteolitičke digestacije rekombinantnih enzima je pitanje u proizvodnji i formulaciji lekova zasnovanih na proteinima. Cilj je bio da se dobije velika količina rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) u izlučenom prethodno obrađenom (prekursor) obliku. Proizvodni proces je razvijen kako bi omogućio u proizvodnju u velikim razmerama ljudskog GALNS sa minimalnim podrezivanjem od proteaza, posebno, katepsina L.

[0265] Kako se ovde koristi, „minimalno podrezan" znači daje GALNS najmanje 98%, najmanje 98,5%, najmanje 99% ili najmanje 99,5% netaknut u konačnim pročišćenim formulacijama, sudeći po SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, praćeno Komasi plavim bojenjem ili SDS-kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE).

[0266]U toku razvoja proizvodnoog procesa za proizvodnju GALNS u velikim razmerama, utvrđeno je daje -55 kDa izlučen prekursor oblik enzima bio podložna proteolitskoj degradaciji proteazama, posebno katepsinom L, koje su aktivne pri kiselom pH. Proteaza degradacija GALNS generiše zreo, podrezan oblik GALNS, koji se može posmatrati kao dve grupe bendova -40 kDa i -19 kDa na SDS-PAGE pod redukcionim uslovima. Ovo proteolitičko podrezivanje je pogoršano niskim pH (tj., 4,5 do 5,0) potrebnim za korak obuhvatne kolone razmene katjona. Ovaj pH raspon daje uslove koji su povoljni za aktivnost kiselih proteaza, kao što katepsini, prisutnih u prikupljenoj ćelijskoj kulturi.

[0267] Promene su napravljene u GALNS oporavku i procesu pročišćavanja kako bi se se minimizovalo prisustvo i/ili aktivnost proteaza koje mogu podrezati GALNS izlučen u medijum ćelijske kulture.

[02681 Dijagrami toka koji prikazuju primeran oporavak i proces pročišćavanja za masovnu proizvodnju GALNS su prikazani naSlici 11.Proces na levoj strani prikazuje oporavka i proces pročišćavanja koji se koriste u procesu Faze I/II, slično toku pročišćavanja gore opisanom u Primeru V, što rezultuje u varijabilnoj količini podrezivanja, od -6-30% peptidnog lanca zbog aktiviranja katepsina L, kao što je određeno pomoću SDS-PAGE obavljenim pod redukcionim uslovima, praćeno Komasi plavim bojenjem (pogledati Sliku12, red 3) ili u rasponu od 65,3%> do 93,7% netaknutog prekursor obliku GALNS, sudeći po SDS-CGE (pogledati Tabelu 8). Postupak SDS-PAGE daje vizuelne, ali kvalitetnije podatke o degradaciji proteina, dok postupak SDS-CGE daje više kvantitativne informacija u vezi sa % netaknutog proteina prisutnog u konačnim pročišćenim formulacijama.

[0269] Proces na desnoj strani Slike11prikazuje oporavak i proces pročišćavanja korišćen u Fazi III procesa, koji rezultuju u minimalnom podrezivanju, u rasponu od 98% do 99,6%o netaknutog prekursor oblika GALNS, sudeći po SDS-PAGE obavljenim pod redukcionim uslovima, praćeno Komasi plavim bojenjem (pogledati Sliku12, red 5) ili SDS-CGE (pogledati Tabelu 8).

[0270]Pregledpromenaprocesa.Kako bi se smanjili obim i varijabilnost GALNS podrezivanja, dva faktora su uzeta u obzir: (i) proteaze su značajno manje aktivne na neutralnom pH; i (ii) koraci hromatografije razmene katjona i hromatografije imobilisanog metalnog afiniteta (IMAC) odvajaju proteaze iz GALNS. Proces Faze II (pogledatiSliku 11,desno) iskorišćava ove faktore i pomaže u smanjenju odrezivanja GALNS tokom postupka pročišćavanja. Ovo je postignuto zamenom redosleda prvih koraka dve kolone, sa snimanjem na Zn-IMAC koloni na pH 6,5 do 7,0. Ova zamena prve dve kolone takođe je pogodna za prikupljanje i skladištenje materijala ćelijske kulture na višem pH (tj., pH 6,5) u odnosu na kiseliji pH (tj., pH 5,5) koji je korišćen u procesu Faze I/II (pogledatiSliku 11,levo). Skladištenje prikupljenog materijala bez ćelija na pH 6,5 smanjuje mogućnost aktivacije proteazea, na primer, katepsina, prisutnih u tečnosti ćelijske kulture, i tako sprečava ili smanjuje odrezivanje GALNS.

[0271]Proces Faze III.Svaki od koraka u primernom procesu Faze III za oporavak i pročišćavanje GALNS sažet je u nastavku. 1. Prikupljanje materijala bez ćelija (IX). Stabilno transfektovane G71 ćelije koje ko-eksprimiraju ljudski SUMF1 i ljudski GALNS su uzgajane u uslovima bioreaktivne kulture kao što je opisano uPrimeruIII. Bioreaktivni materijal (tj. tečnost ćelijske kulture) koji sadrži GALNS je sakupljen na pH 6,5, i filtriran koristeći tok filtracije od CUNO 30SP02A, što je praćeno sa CUNO 90ZA08Ai 0,2 um CUNO BioAssure filterom. 2. UF/DF (20X). Tečnost ćelijske kulture je ultrafiltrirana/dijafiltrirana (UF/DF) u 10 mM fosfat/acetatu, 50 mM NaCl, pH 6,5 sa provodnosti od < 7 mS/cm. UF/DF faza se izvodi korišćenjem Sartocon 30 kDa Hidrosart kaseta. Tečnost ćelijske kulture je koncentrovana 20X. Poređenja radi, korak UF/DF procesa Faze I/II se izvodi na pH 5,5. Što je veća pH u procesu Faze III, time se smanjuje mogućnost odrezivanja GALNS proteazama prisutnim u prikupljenom materijalu bez ćelija. 3. Ugljeni filter. UF/DF (20X) materijal je filtriran kroz Zeta Plus R55 aktivni ugljenik (Z1274) i nakon toga sterilno filtriran kroz 0,2 uM filter pre skladištenja na 2-8°C. Ugljeni filter značajno smanjuje pritisak nakon kasnijeg nanošenja na Zn-IMAC kolonu. 4. Hromatografije imobilisanog metalnog afiniteta (IMAC). Kolona hromatografije Zn-imobilisanog metalnog afiniteta (Zn-IMAC) je uravnotežena u 10 mM fosfat/acetatu, 500 mM NaCI, pH 7,0, i nanesena pri provodnosti od -55 ± 5 mS/cm sa ugljem filtriranim UF/DF ( 20Ks) materijalom na pH 7,0 ±0,1 dodavanjem 50 mM fosfatnog pufer, pH 9,2 koji sadrži 2,5 M NaCI. Nanesena kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetata, 500 mM NaCI, pH 7,0, što je praćeno sa 10 mM fosfat/acetata, 125 mM NaCI, pH 7,0 (Pufer A). GALNS je eluiran iz kolone sa smesom 70% Pufera A i 30% Pufera B (10 mM fosfat/acetat, 125 mM NaCI, 300 mM imidazol, pH 7,0). 5. Mustang Q filtera. Eluat Zn-IMAC kolone je prilagođen na provodnost od ~6,0 ± 0,5 mS/cm na pH 7,0 i nanesen na Mustang Q filtera za uklanjanje virusa. 6. Prilagođavanje pH-vrednosti i filtracija. Mustang Q Filtrat je prilagođem do pH 4,5 ± 0,1, filtriran kroz CUNO 60ZA filter što je praćeno sa 0,2 uM inlin filterom, i zatim je nanet na kolonu razmene katjona. 7. Hromatografija razmene katjona. Fractogel SE HiCap kolona razmene katjona je uravnotežena u 10 mM fosfat/acetatu, 50 mM NaCI, pH 4,5, i nanesena sa filtriranim Mustang Q filtratom podešenim do pH 4,5 ±0,1 pri provodnosti od <7 mS/cm. nanesena kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetata, 50 mM NaCI, pH 4,5, nakon čega je usledilo 80%:20% smese 10 mM fosfat/acetata, pH 5,0 (Pufer A) i 10 mM fosfat/acetata, 250 mM NaCl, pH 5,0 (Pufer B). GALNS je eluiran iz kolone sa linearnim gradijentom od 20 do 75% Pufera B u 80%> do 25% Pufera A (tj. 50 do 190 mM NaCl). 8. Držanje niskog pH za viralnu inaktivaciju. Fractogel SE HiCap eluat je acidifikovan do pH 3,5 ± 0,1 za virusnu inaktivaciju dodavanjem 0,2 M citrat pufera, pH 3,4, koji je održan u niskom pH tokom~1 sata, ponovo prilagođen na pH 5,0 ±0,1 dodavanjem 0,2 M citrat pufera, pH 6,0, i zatim nanet na kolonu poliranja hromatografije hidrofobne interakcije (HIC). 9. Hromatografije hidrofobne interakcije (HIC). TovoPearl Butil 650M HIC kolona je uravnotežena u 10 mM fosfat/acetatu, 2 M NaCl, pH 5,0, i napunjena sa pH-niskim virusno inaktiviranim Fractogel SE HiCap eluatom prilagođenim do 2 M NaCl, pH 5,0. nanesena kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetatom, 2 M NaCl, pH 5,0 (Pufer A). GALNS je eluiran iz kolone sa smesom 35% Pufera A i 65% Pufera B (10 mM fosfat/acetat, pH 5,0). 10. Razmena pufera i prilagođavanje rhGALNS do 3 mg/ml. TovoPearl Butil 650M HIC eluat je puferski razmenjen u 20 mM acetatu, 50 mM fosfatu, 30 mM argininu, 2% (v/v) sorbitolu, pH 5,4, i zatim prilagođen do konačne GALNS koncentracie od 3 mg/mL u istom puferu. 11. Virusno i DNK uklanjanje filtracijom. TovoPearl Butil 650M HIC eluat sa razmenjenim puferom je filtriran kako bi se uklonili sve preostale viruse i DNK koristeći virusni filtera (DV20) i DNK filtera (Mustang Q). 12. PS20 dodat do 0,01%. TovoPearl Butil 650M HIC eluat, virusno i DNK filtriran i sa razmenjenim puferom je prilagođen do 0,01% (v/v) polisorbata 20 (PS20 ili Tween-20). 13. BDS skladištenje na 2-8°C ili zamrznuto. Konačna formulacija pročišćenog GALNS, tj. najveći deo leka (BDS), je čuvan na 2-8°C ili zamrznut.

[0272]Rezultati.Kao što se vidi iz SDS-PAGE rezultata (pogledatiSliku 12,red 5), očigledna molekularna masa glavne grupe je -55 kDa, u skladu sa očekivanom vrednosti za GALNS monomer. Grupe koji migriraju na očigledne molekularne mase od -40 kDa i -19 kDa u lot# AP400802, koji je generisan pomoću procesa Faze I/II (red 3), su degradacioni proizvodi GALNS koji rezultuju iz proteolitičkog odrezivanja između K348 i G349. Ovo podrezivanje je u velikoj meri smanjeno u lot#BMN110-0110-001, koji je generisan korišćenjem procesa Faze III (red 5). Postoji mala grupa u obe pripreme koja migrira malo sporije od -40 kDa proizvoda cepanja.

[02731Pregled daljim promenaprocesa.Modifikovani proces Faze Ili je razvijen za rešavanje određenih izazova: (i) formiranje taloga u koncentrovanom prikupljenom materijalu; (ii) gubitak GALNS pri Zn-IMAC koraku snimanja; (iii) gubitak GALNS u fragmentu pranja tokom TovoPearl Butil koraka; i (iv) prisustvo visokih nivoa CHOP nečistoća u eluatu TovoPearl Butil koraka.

[0274]Modifikovan proces Faze III.Svaki od koraka u primernom procesu Faze III za oporavak i pročišćavanje GALNS sažet je u nastavku. 1. Prikupljanje materijala bez ćelija (IX). Stabilno transfektovane G71 ćelije koje ko-eksprimirju ljudski SUMF1 i ljudskih GALNS su uzgajane u uslovima bioreaktivne kulture kao što je opisano uPrimeru III.Bioreaktivni materijal (tj. tečnost ćelijske kulture) koji sadrži GALNS je sakupljen na pH 6,5, i filtriran koristeći tok filtracije od Millipore DOHC, što je praćeno sa Millipore XOHC i 0,2 uM Millipore SHC filterom. 2. UF/DF (20X). Tečnost ćelijske kulture je ultrafiltrirana/dijafiltrirana (UF/DF) u 10 mM fosfat/acetatu, 50 mM NaCl, pH 6,5 sa provodnosti od < 7 mS/cm. UF/DF faza se izvodi korišćenjem Sartocon 30 kDa Hidrosart kaseta. Tečnost ćelijske kulture je koncentrovana 20X. 3. Ugljeni filter. UF/DF (20X) materijal je filtriran kroz Zeta Plus R55 aktivni ugljenik (Z1274) i nakon toga sterilno filtriran kroz 0,2 uM filter pre skladištenja na 2-8°C. 4. Hromatografija imobilisanog metalnog afiniteta (IMAC). Kolona hromatografije Zn-imobilisanog metalnog afiniteta (Zn-IMAC) je isprana sa 50 mM acetatnog pufera, pH 5,0, napunjena sa 50 mM ZnSGM, isprana sa 50 mM acetatnog pufera, pH 5,0, a zatim uravnotežena u 10 mM fosfatnom/acetatu, 500 mM NaCl, pH 7,0, koji sadrži 5 mM imidazola. Uravnotežen Zn-IMAC je napunjen pri provodnosti od -50 ± 5 mS/cm sa ugljeno filtriranim UF/DF (20Ks) materijalom na pH 7,0 ±0,1 sa mešanjem u skladu sa 50 mM fosfatnim puferom, pH 9,2 ±0,1 koji sadrži 2,5 M NaCI u 75:25 (v/v) odnos tokom nanošenja Zn-IMAC kolone. Nanesena kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetata, 500 mM NaCI, pH 7,0, što je praćeno sa 10 mM fosfat/acetata, 125 mM NaCI, pH 7,0 (Pufer A). GALNS je eluiran iz kolone sa smesom 70% Pufera A i 30% Pufera B (10 mM fosfat/acetat, 125 mM NaCI, 300 mM imidazol, pH 7,0). 5. Prilagođavanje pH-vrednosti i filtracija. Eluat Zn-IMAC kolone je prilagođen do pH 4,5 ±0,1 sa 1,75 M acetatom, pH 4,0, a zatim filtriran kroz Millipore COHC filter. Filtrirani materijal je izmešan u skladu sa 10 mM fosfat/acetatom, pH 4,5 u 30:70 (v/v) odnosom tokom nanošenja kolone razmene katjona. 6. Hromatografija razmene katjona. Fractogel SE HiCap kolona razmene katjona je uravnotežena u 10 mM fosfat/acetatu, 50 mM NaCI, pH 4,5, i nanet joj je pH 4,5-prilagođena i filtriran eluat Zn-IMAC kolone sa provodnosti od <7 mS/cm. Nanesena kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetata, 50 mM NaCI, pH 4,5, nakon čega je usledilo 80%:20% smese 10 mM fosfaa/acetata, pH 5,0 (Pufer A) i 10 mM fosfat/acetata, 250 mM NaCl, pH 5,0 (Pufer B). GLNS je eluiran iz kolone sa linearnim gradijentom od 20 do 75% Pufera B u 80% do 25% Pufera A (tj. 50 do 190 mM NaCl). 7. Držanje niskog pH za viralnu inaktivaciju. Fractogel SE HiCap eluat je acidifikovan do pH 3,5 ±0,1 za virusnu inaktivaciju dodavanjem 0,4 M citrat pufera, pH 3,4, koji je održan u niskom pH tokom~1 sata, ponovo prilagođen na pH 5,0 ±0,1 dodavanjem 0,4 M citrat pufera, pH 6,0, sjedinjen sa 10 mM fosfat/acetat puferaom, pH 5, koji sadrži 5 M NaCl kako bi se postigla konačna koncentracija od 2 M NaCl, i zatim je filtriran kroz 0,2 uM filter pre nanošenja na kolonu poliranja hromatografije hidrofobne interkacije

(HIC).

8. Hromatografija hidrofobne interakcije (HIC). TovoPearl Butil 650M HIC kolona je uravnotežena u 10 mM fosfat/acetatu, 2 M NaCl, pH 4,4, i napunjena sa pH-niskim virusno inaktiviranim Fractogel SE HiCap eluatom prilagođenim do 2 M NaCl, pH 3,3-

4,4. Naneta kolona je isprana sa 10 mM fosfat/acetatom, 2 M NaCl, pH 4,4, nakon čega sledi 10 mM fosfat/acetata, 2,5 M NaCl, pH 5,0 (Pufer A). GALNS je eluiran iz kolone sa linearnim gradijentom od 100% do 32% Pufera A u 0 do 68%> Pufera B (10 mM fosfat/acetat, pH 5,0) (tj. 2,5 do 0,8 M NaCl), što je praćeno mešanjem 32% Pufera A i 68% Šufera B (tj. 0,8 M NaCI). 9. Razmena pufera, DNK i virusno uklanjanje filtracijom i prilagođavanje rhGALNS do 3 mg/ml. TovoPearl Butil 650M HIC eluat je puferski razmenjen u 20 mM acetatu, 50

mM fosfatu, 30 mM argininu, 2% (v/v) sorbitolu, pH 5,4. ToyoPearl Butil 650M HIC eluat sa razmenjenim puferum je filtriran kako bi se uklonili sve preostale DNK i viruse pomoću DNK filtera (Mustang Q) i virusnog filtera (DV20). Filtrirani, TovoPearl Butil 650M HIC eluat sa razmenjenim puferum je zatim prilagođen do konačne GALNS koncentracije od 3 mg/mL u istom puferu kao gore.

10. PS20 dodat do 0,01%. TovoPearl Butil 650M HIC eluat, virusno i DNK filtriran i sa

razmenjenim puferom je prilagođen do 0,01% (v/v) polisorbata 20 (PS20 ili Tween-20).

11. BDS skladištenje na 2-8°C ili zamrznuto. Konačna formulacija pročišćenog

GALNS, tj. najveći deo leka (BDS), je propuštena kroz 0,2 uM Millipak 200 filter u konačni kontejner skladištenja i čuvan u vrećama na 2-8°C ili zamrznut.

[0275]Rezultati.Nakon ovog modifikovang procesa Faze HI, vezivanje GALNS za u Zn-IMAC i TovoPearl Butil kolone je poboljšanao, i CHOP nečistoće u TovoPearl Butil eluatu su redukovane. GALNS pročišćen ovim modifikovanim procesom Faze Ilije uporediv po svim testiranim svojstavima (npr., ona u Tabeli 7 u nastavku) sa enzimom pročišćenim gore opisanim procesom Faze III.

[0276]Karakterisanje rhGALNS napravljen] a procesom Faze III oporavka i pročišćavanja.GALNS pročišćen korišćenjem procesa Faze III poređenje sa enzimom pročišćenim procesom Faze I/II. Rezultati karakterisanja su dati u Tabeli 7. Iako obe GALNS pripreme deluju uporedivo po svim testiranim svojstvima, enzim pročišćen procesom Faze III pokazuje značajno manje podrezivanja odnosu na onaj pročišćen pocesom Faze I/II.

[0277] Tabela8 poredi procenat netaknutog GALNS koristeći SDS-CGE postupak u konačnoj pročišćenoj formulaciji u lotovma koji su pripremljeni korišćenjem procesa Faze I/II (65,3-93,7%) ili procesa Faze III (98-99,6%)). Ovde dobijene vrednosti podržavaju rezultate dobijene iz SDS-PAGE postupka i pokazuju daje obim podrezivanja značajno smanjen kao rezultat modifikacija učinjenim procesu pročišćavanja.

[0278]Ovi testovi pokazuju da gore opisan protokol za dobijanje rekombinantnog lizozomnog sulfataza enzima sa minimalnim odrezivanjem daje efikasan postupak za proizvodnju na veliko visoko pročišćenog enzima, posebno izlučenog pred-obrađenog (prekursor) oblika ljudske N-acetilgalaktozamin -6-sulfataza (GALNS).

PRIMER VII

KARAKTERISANJE PROČIŠĆENE LJUDSKE N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)

[0279]G71 ćelijske linije proizvode proteine (npr. lizozomni enzimi) sa većim nivoima visoko manozne fosforilacije nego što je primećeno kod prosečne ćelijske linije sisara, i odgovarajućim nižim nivoom nefosforilisanih visoko manozih oligosaharida. Lizozomni sulfataza enzim (npr. rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)), koji sadrži visok nivo bis-fosforilisanih visoko manoznih oligosaharida, kako je ovde definisano, u poređenju sa molekulima dobijenim u Canfield et al, U.S. Patent 6,537,785, koji ne sadrže kompleksne oligosaharide, i pokazuju samo visoko manozne oligosaharide.

[02801Za određivanje nefosforilisanih visoko manoznih nivoa na lizozomnom sulfataza enzimom, stručnjak u oblasti može koristiti eksoglikozidaza sekvenciranje oslobođenih oligosaharida („FACE sekvenciranje"), kako bi utvrdio procente nefosforilisanih visoko

manozni oligosaharidnih lanaca. Na normalnom FACE gelu za profilisanje sa oslobađanjem lotova, nefosforilisana visoka manoza ko-migrira sa posebnim složenim oligosaharida (npr., oligomanozn 6 i potpuno sijaliliran biantenarni kompleks). Nefosforilisana visoka manoza se zatim diferencira od drugih oligosaharida enzimskim sekvenciranjem.

[0281]Kako bi se odredilo da li pročišćeni lizozomni sulfataza enzim (npr. rekombinantna ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)) eksprimiran u G71S ćelijama ispoljava povećanu fosforilaciju, utvrđenje nivo manoza-6-fosfataa (M6P) na lizozomnom sulfataza enzimu, kao i sposobnost enzima da se veže za M6P receptor (MPR).

[0282]Rekombinantni ljudski GALNS enzim, pročišćen i eksprimiran u G71S ćelijama, analiziranje ugljovodoničnom elektroforezom pomognutom fluorescecijom (FACE) i hromatografijom na MPR-sefaroza smoli. Sistem FACE koristi poliakrilamidnu gel elektroforezu da razdvoji, kvantifikuje i odrediti sekvence oligosaharida oslobođenih iz glikoproteina. Relativni intenzitet oligomanoza 7 bis-fosfat (07P) grupe na FACE (Hague et al., Electrophoresis 19(15): 2612-20, 1998) i procenat aktivnosti zadržavan na MPR koloni (Cacia et al., Biochemistrv 37(43): 15154-61, 1998) daju pouzdane mere nivoa fosforilacije po molu proteina.

[0283]Specifična aktivnost.Specifična aktivnost rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) je određena korišćenjem malog fluorescentnog supstrata 4-metilumbeliferil-6-S-GAL(4MU-Gal-6S) na 37°C. Korišćenjem ovog testa, specifična aktivnost pročišćenog GALNS bila je 165 umol/min/mg (0,165 U/mg).

[0284]Stabilnost ljudskog seruma.Određena jeex vivostabilnost GALNS u serumu. Ljudski serum (Sigma H-4522) je filterom sterilisan kroz 0,2 pm PES filter, i 4 mL filterom sterilisanog ljudskog seruma je pred-inkubirano u bocu sa T-25 ćelijskom kulturom tokom 1 sata na 37°C u atmosferi 10% C02(pH u ovom trenutku je 7,4 ± 0,1). 0,4 mL desalinizovanog, pročišćenog GALNS (2 mg/mL pročišćenog GALNS je desalinizovano u PBS korišćenjem Bio-RAD 10DG kolona) dodat je pred-inkubiranom ljudskom seruma, ili PBS kontroli koja sadrži 0,5 mg/L BSA. 100 uL uzorci su povučeni na određenim vremenskim tačkama (npr. 0, 1, 3,5, 7,5 i 26 sati) i dodati u 900 ml pufera za gašenje (QB, 50 mM NaOAc, pH 5,6 + 150 mM NaCl + 0,5 mg/ml BSA + 0,001 % Tween-80). Uzorci su čuvani na 4°C dok nosu bili spremni za merenje GALNS enzimske aktivnosti.

[0285] GALNS enzimska aktivnost je merena korišćenjem snimanje aktivnosti enzima ELISA. Ekstrapolacijom eksponencijalne krive opadanja % rezidualne GALNS enzimske aktivnosti,ex vivopoluživot u serumu pročišćenog GALNS je procenjen na 217 sati.

[0286]Unos u sinovicite ( hrondrociti).Odrođena je sposobnost GALNS da se apsorbuje od strane sinovicita (hrondrocita).

[0287] Hondrociti (ATCC broj CRL-1832) su kultivisani u medijumu za rast (Ham's F12 + 10%o FBS) na 37°C u 5% CO2u 12-komoričnim posudama. Analiza apsorpcije tri uzorka zahteva 4 x 12-komorične ploče. Pročišćeni uzorci GALNS i GALNS referenca su razblaženi do 1 uM u acPBS/BSA (kiseli PBS + 200 ug/mL BSA). Od 1 uM materijala, krive razblaživanja apsorpcije za GALNS uzorke i referencu su pripremljene: 50,5 uL (1 uM rhASB) u 5 mL razblaživaču testa apsorpcije (UAD, DMEM + 2 mM L-glutamin + 0,5 mg/mL BSA), što dovodi do 10 nM GALNS uzoraka i reference, koji su dodatno serijski razblaženi do 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 i 0,16 nM serijskim dvostrukim razblaživanjem u UAD. Medijum za rast iz 12-komoričnih posuda konfluentnih hondrocita je aspiriran, u komorice je dodato 1 mL UAD (prazan) ili serijskih razblaženja GALNS uzoraka ili reference, i inkubirano je tokom 4 sata na 37°C u 10% CO2inkubatoru. Apsorpcioni medijum je aspiriran, naginjanjem svake posude za potpunost, i svako ležište je isprano jedanput sa 1 mL PBS. PBS je aspiriran i hondrociti su odvojeni dodavanjem 0,5 mL tripsin/EDTA ( 0, 25% tripsin/0,1% EDTA (Mediatech 25-053-CI, lot 25053025)) po komorici. Nakon odvajanja od ploče, hondrociti su alikvotirani u prethodno na ledu ohlađene Ependorf epruvete (30 epruveta ukupno). Tripsinizovani hondrociti su ohlađeni, a zatim peletirani pri maloj brzini u mikrofugi (4000 rpm u trajanju od 3 minuta). Tripsin je aspiriran potpuno, ćelijski pelet je ispran sa 1 mLPBS, ponavljajući korake mikrofuge i aspiracije jednom. 200 uL pufera ćelijske lize (CLB, 50 mM natrijum acetat, pH 5,6 + 0,1%> Triton X-100) je dodato u svaku epruvetu. Ćelijski pelet je resuspendovan pulsnim vorteksom tri puta. Nakon resuspendovanja smese ćelijske lize su ostavljene preko noći na -80°C, ili direktno analizirane.

[0288]Ćelijski lizati su istopljeni na sobnoj temperaturi i prebačen u led dok su topljeni. Ćelijski lizati su vorteksovani kako bi se resuspendovao bilo kakav vidljiv čvrst materijal, i zatim centrifugiran u mikrofugi na 14 krpm tokom 10 minuta na 4°C kako bi se nerastvoreni materijal pretvorio u pelet. Površinski slojevi su preneseni na svežu grupu epruveti i pelet je odbačena. Zatim je test GALNS aktivnosti izvedena na površinskim slojevima. Obično se izvodi kriva razblaživanja sa sedam tačaka (serijsko dvostruka razblaženja sa početkom na 10 nM i završetkom na 0,16 nM), što ograđuje očekivani Kapsorpcijeprilično ravnomerno na obe strane. Molaritet polaznih uzoraka je izračunat pomoću isključivo proteinske molekularne težine.

[0289]Pročišćeni GALNS je Kd za aposrpciju u sinoviocite, na osnovu jednog mesta vezivanja Uganda, od 4,9 nM.

[0290]Test vezivanja manoza- 6- fosfat ( M6P) receptor ploče.Sposobnost GALNS da se vezuje za manoza-6-fosfat (M6P) receptor je određen u testu vezivanja ploče. FluoroNunc ploče sa visokim vezivanjem su obložene sa 4 ug/ml M6P receptorom. Obložene ploče su isprane dva puta sa 250 uL/komorica puferu za pranje (WB, TBS + 0,05% Tween 20) i nespecifično vezivanje je blokirano sa 200 uL/komorica pufera za blokiranje i razblaživanje (BDB, Pierce SuperBlock pufer, lot #CA46485). Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Tokom ovog koraka blokiranja, pročišćeni uzorci GALNS (0,5 - 2 mg/mL čuvani na 4°C tokom 2 nedelje) su razblaženi do 10 nM u BDB, a zatim serijski razblaženi u puferu za razblaživanje (DB, 50 mM NaOAc, 1 mM NaCI, pH 4,0 + 0,5 mg/mL BSA) (250 uL+ 250 uL) pa do 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 i 0,16 nM. Blokirane ploče su isprane sa WB kao gore, i razblaženi uzorci GALNS su odloženi u udubljenja u duplikatu pri 100 uL/komorica i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi. Tokom ovog koraka inkubacije, 2 mM supstrata aktivnosti je pripremljeno razblaživanjem 0,1 ml od 100 mM 6S-galaktoza-4MU (čuvano u H2O, -20°C) u 5 mL DB i prethodno zagrejan u 37°C vodenoj kupki. Posle inkubacije, ploče su isprane dva puta sa WB kao gore, i 100 uL razblaženog supstrata je dodato i određenja je GALNS specifična aktivnost.

[0291]Korišćenjem testa, pročišćeni GALNS ima Kd za vezivanje za M6P receptor, zasnovano najednom mestu vezivanja, od 2,4 nM.

[0292]Vezivanje manoza- 6- fosfat ( M6P) receptora kolone.Sposobnost GALNS da se vezuje za manoza-6-fosfat (M6P) receptor je određena u testu vezivanja kolone. M6P receptor kolona je pripremljena prema uputstvu proizvođača. M6P receptor je od Peter Lobelove laboratorije, smole kolona je NHS aktivirana smola (Bio-RAD Affi-Gel 15), a veličina kolone je 0,7 ml. M6P receptora kolona je uravnotežena sa 10 zapremina kolone (CV) pufera za uravnotežavanje (EQ, kiseli PBS, pH 6,0 koji sadrži 5 mM P-glicerofosfat, 0,05% Tween 20, 5 mM glukoza-1-fosfat i 0,02%> NaNb) pri brzina protoka od 0,25 mL/min. 6 ug pročišćenog GALNS (po 200 uL) je naneseno M6P receptor kolonu pri brzini protoka od 0,1 mL/min. Nevezana GALNS je ispran iz kolone sa 10 CV od EQ pri protoku od 0,25 mL/min. Vezani GALNS je eluiran iz kolone koristeći 0-100%> eluacioni pufer (EL, kiseli PBS, pH 6,0 koji sadrži 5 mM P-glicerofosfat, 0,05% Tween 20, 5 mM manoza-6-fosfat i 0,02% NaN3) gradijent (10 CV), što je praćeno sa 2 CV od 100% EL. Kolona je ponovo uravnotežena sa 3 CV od EQ.

[0293]Korišćenjem GALNS ELISA, procenat pročišćenih GALNS koji su vezani za M6Preceptor je utvrđen na 56%.

[0294]Analiza ukupnih oligosaharida kapilarnom elektroforezom ( CE).Kako bi se odredio nivo manoza-6-fosforilacije na GALNS, N-vezan profil ugljenih hidrata ukupnih oligosaharida na GALNS je određena kapilarnom elektroforezom (CE) kako je opisano u Ma et al., Anal. Chem. 71(22):5185-5192, 1999. Postupak je koristio PNGazu F za cepanje asparagin N-vezanih oligosaharida. Otcepljeni oligosaharidi su izolovani i derivatizovani fluorescentnom bojom, i primenjeni na G10 spin kolonu kako bi se uklonio višak boje. pročišćeni, fluorescentno obeleženi oligosaharidi su elektroforetički odvojeni, i vrhovi su naknadno kvantifikovani pomoću MDQ-CE softvera (32 Karat Ver. 7,0).

[0295]Korišćenjem ovog testa, količine bis-fosforilisane manoze 7 (BPM7), mono-fosforilisane manoze 6 (MPM6) i sijalne kiseline koja sadrže oligosaharide za pročišćeni GALNS bile su 0,58 mol/mol enzima, 0,08 mol/mol enzima i nisu se mogle detektovati, respektivno. Procenat GALNS proteina koji sadrže BPM7 je procenjen na 29%.

[0296]Bis7 karakterisanje oligosaharida.Određena je lokacija bis-fosforilisanog manoza 7 (BPM7) oligosaharida na GALNS. Asparagin (Asn) ostatak na položaju 178 je bio N-vezan glikoziliran do BPM7. Asn ostatak na položaju 397 nije bio N-vezan glikoziliran do BPM7, ali je utvrđeno da su pretežno šećeri oligomanoznog tipa.

[02971Afinitet hidroksiapatita. In vitrokoštani model je razvijen kako bi se utvrdio da li su GALNS imali mogućnost da ciljaju kosti. 4 mg/ml HTP-DNK nivo hidroksiapatit (Bio-RAD) suspenzije je pripremljena i uravnotežen u DBS + 50 ug/mL BSA, pH 7,4. Pročišćeni GALNS, posle dodavanja 50 ug/ml BSA, je desalinizovan u DBS, pH 7,4. Desalinizovani GALNS, u konačnoj koncentraciji od približno 2 mg/mL, je serijski razblažen u DBS + 50 ug/mL BSA, pH 7,4 u 96-komoričnoj ploči. 50 uL serijski razblaženih GALNS prebačeno je 96-komoričnu filter ploču (Millipore #MSGVN2210, hidrofilni PVDF, nisko vezivanje proteina, 22 uM veličina pora). 50 uL hidroksiapatit suspenzije je dodato u komorice filter ploče koja sadrži serijski razblaženi GALNS i inkubirano je tokom 1 sata na 37°C sa blagim mešanjem. Ploča je podvrgnuta vakuumskoj filtraciji.

[0298]Vakuumski filtrirani površinski slojevi su analizirani za HPLC ili GALNS enzimske aktivnosti kao što je opisano gore. pročišćeni GALNS imao je Kd za hidroksiapatit od 3-4,0 uM.

[0299]G71S ćelijska linija koja eksprimira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) proizvodi lizozomni sulfataza enzime sa većim količinama aktivacije (tj. konverzija aktivnog mesta cistein ostatka do Ca-formilglicina (FGly)). [03001Kako bi se utvrdilo da li pročišćeni rekombinantni lizozomni sulfataza enzim (npr., ljudska N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS)) ko-eksprimiran sa SUMF1 u G71S ćelijama ispoljava povećano aktiviranje, utvrđenje iznos konverzije aktivnog mesta cistein ostatka na FGly na pročišćeom lizozomnom sulfataza enzimu.

[0301]GALNS aktiviranja.Procenat aktivacije, tj., procenat konverzija aktivnog mesta cisteina (Cis) Ca-formilglicin (FGly) cistein ostatka, od GALNS, je određen putem LC/MS (TFA). TIC/1000 za Cis, FGly i Gly su bili 39, 1840 i 183, respektivno, što pokazuje daje oko 90% pročišćenog GALNS u aktivnom (tj. FGly) obliku.

[0302]Sažetak.Tabela9 prikazuje sažetak karakterisanja rekombinantnog GALNS eksprimiranog u G71S klon 4 ćelijama.Tabela 10prikazuje sažetak karakterisanja rekombinantnog GALNS eksprimiranog u G71S klon C2 ćelijama.

[0303]Ovi rezultati pokazuju da pročišćeni rekombinantni ljudski GALNS ima visok nivo aktivacije, i visoke nivoe manoza-6-fosfat fosforilacije. stoga, G71S ćelije koje ko-eksprimiraju SUMF1 i lizozomni sulfataza enzim (tj. GALNS) efikasnije proizvede aktivni visoko fosforilisani lizozomni sulfataza enzim. Povećan nivo visoko manoznih ostataka na takvim lizozomnim sulfataza enzimima dovodi do povećane apsorpcije od strane MPR na ćelijama.

PRIMER VIII

IN VITROAPSORPCIJA I AKTIVNOST REKOMBINANTNE LJUDSKE N-ACET1LGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS) U MORKIO HONDROCITIMA

[0304]Procenjena je apsorpcija rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) od strane lizozoma Morkio hondrocita i sposobnosti GALNS da degradira keratan sulfat (KS)in vitro.

[0305]Hondrociti od pacijenata sa Mukopočisaharidozom tipa IVa (MPS IVa, Morkio sindrom) imaju smanjenu GALNS aktivnost i pokazuju lizozomne akumulaciju KS.In vitromodel MPS IVa je utvrđen korišćenjem hondrocita izolovanih iz biopsije ilijačne kreste MPS IVa pacijenta. Primarni hondrociti, međutim, se de-diferencijraju i u kulturi gube svoje karakteristike hondrocita. Na taj način, uspostavljene su uslovi kulture koji izazivaju diferencijaciju hondrocitain vitro.

[0306]Hondrociti izolovani iz MPS IVa pacijenta, označeni kao MQCH, su kultivisani u alginatim zrncima u prisustvu IGF-1, TGF-0, transferina, insulina i askorbinske kiseline (Medijum rasta hondrocita, Lonza #CC-3225). Medijum kulture je menjan dva puta nedeljno tokom trajanja eksperimenata, od 6 do 15 nedelja. Ovi uslovi kultivisanja indukovali su eksprimiranje fenotipa hondrocita i diferencijaciju. Ove MQCH ćelije eksprimirale su markere hondrocita, uključujući i regiju određivanja pola Y-box 9 (Sox 9), kolagen II, kolagen X, oligomerni matrični protein hrskavica,i agrekan mRNK, mereno kvantitativnom RT-PCR analize korišćenjem RNK izolovane iz kulture MQCH ćelija . Ove kultivisane MQCH ćelije takođe su razradile ekstracelularni matriks.

[0307]Konfokalna mikroskopija izvedena je da potvrdi da su MQCH ćelije akumulirale KS. MQCH ćelija u 8 nedelja staroj kulturi su tripsinizovane, citospinovane na staklene pločice, fiksirane u acetonu, i zamrznute do upotrebe. Nakon topljenja, ćelije su rehidrirane i obojene koristeći, kao primarna i sekundarna antitela, monoklonsko antitelo anti-KS (Chemicon) i kozje anti-zečje antitelo konjugovano sa Alexa-488 (zeleno), respektivno. MQ-CH ćelije su pokazale tačkaste intracelularne mrlje, u skladu sa lizozomnom KS akumulacijom.

[0308]Kako bi se odredilo da li pročišćen rekombinantni ljudski GALNS može da se apsorbuje od strane MQCH ćelija u lizozomima i da degradira KS, 6 nedelja stara MQCH ćelijska kultura je inkubirana sa 10 nM rekombinantnog ljudskog GALNS dvaput nedeljno tokom 9 nedelja. GALNS apsorpcija i KS izbijanje su mereni konfokalnom mikroskopijom. Korišćena primarna antitela su: (a) anti-GALNS poliklonsko zečje antitelo i anti-lizozomno povezan membranski protein-1 (LAMP-1) monoklonsko antitelo, ili (b) anti-KS monoklonsko antitelo i anti-LAMP-1 poliklonsko antitelo. Korišćena sekundarna antitela su: antitela konjugovana sa Alexa-488 (zeleno) za detektovanje anti-GALNS ili anti-KS antitela, ili antitela konjugovana sa Alexa-555 ili -594 (crveno) za detektovanje anti-LAMP-1 antitela. Pripreme MQCH ćelija su postavljene u držač koji sadrži DAPI, koji mrlja jezgra.

[0309]Značajna ko-lokalizacija enzima GALNS i KS sa lizozomnim markerom, LAMP-1, je primećena kod MQCH ćelija tretiranih sa GALNS. Nakon izlaganja MQCH rekombinantnom ljudskom GALNS, količina intracelularnog KS je smanjena. [03101GALNS apsorpcija je takođe merena korišćenjem ELISA snimanja GALNS enzima i ELISA specifične aktivnosti GALNS, kako je opisan uPrimeru IVgore. Normalni ljudski hondrociti (NHKC), koji eksprimiraju GALNS, korišćeni su kao pozitivna kontrola. Kao što je prikazano uTabelama 11i12,netretirane MQCH ćelije nisu imale vidljiv GALNS enzim ili aktivnost, dok su MCKH ćelije tretirane tokom 9 nedelja sa 10 Nm GALNS imale značajan GALNS enzima i aktivnost.

[0311]Ovi rezultati pokazuju da se pročišćeni rekombinantni ljudski GALNS apsorbuje od strane Morkio hondrocita u lizozome i da može degradirati lizozomni KSin vitro.Ovi Morkio hondrociti su korisni kaoin vitromodel efikasnost za testiranje lizozomnih sulfataza enzima, kao što je GALNS, koji degradiraju KS.

PRIMER IX

IN VITROAKTIVNOST REKOMBINANTNIH LUDSKIH LIZOZOMNIH ENZIMA

KOD DEGRADIRANJA PRIRODNIH SUPSTRANA U TESTU ZASNOVANOM NA

ĆELIJAMA

[0312]In vitrotestovi zasnovani na ćelijama su razvijeni za merenje aktivnosti rekombinantnih lujdskih lizozomnih enzima, npr. lizozomnih sulfataza enzima, da degradira prirodne supstrate.

[0313]Enzimska aktivnost rekombinantnih ljudskih lizozomnih enzima, npr. lizozomnih sulfataza enzima, tipično je merenain vitrotestom bez ćelija korišćenjem veštačkog fluorogenog supstrata (pogledatiPrimer4 za GALNS). Međutim, merena aktivnost enzima zavisi od veličine veštačkog supstrata, tj., broja jedinica monosaharida. Pored toga, aktivnost enzima je merena u okruženju koje ne odražava situacijuin vivo.Tako,in vitrotest bez ćelija ne uzima u obzir sposobnost lizozomnog enzima da čepa prirodne supstrate, niti njegovu sposobnost da bude apsorbovan u ciljane ćelije i lokalizovan do lizozoma.

[0314]In vitrotest zasnovan na ćelijama je razvijen za merenje aktivnosti dva rekombinantna ljudska lizozomna enzima, alfa-L-L-Iduronidaze (IDU) i arilsulfataze B (ARSB), kako bi degradirali svoje prirodne supstrate, tj. supstrate koji sadrže intracelularni dermatan sulfat (DS). DS sadrži varijabilno sulfatiranu iduronsku kiselinu P (l-3)-N-acetilgalaktozamin p (1-4) disaharid jedinice.

[0315]ARSB-deficijentne GM00519 ljudske ćelije fibroblasta ili IDU- deficijentne GM01391 ljudske ćelije fibroblasta su kultivisane do konfluencije u 12-komoričnim pločama, a kulture su održavane nakon konfluencije 3-6 nedelja kako mi se omogućila akumulacija intracelularnog DS.

[0316]GM00519 ili GM01391 ćelije nakon konfluencije su zatim izložene zasićenim dozama rekombinantnog ljudskog ARSB (10 nM) ili rekombinantnog ljudskog IDU (25 nM), respektivno, tokom 4-5 dana. Netretirane i sa lizozomnim sulfataza enzimom tretirane ćelije su prikupljene, lizirane i centrifugirane.

[0317]Aktivnost lizozomnog enzima u ćelijskim lizatima je merena određivanjem zaostalog DS sadržaja ćelija putem: (1) lize ćelija; (2) specifična digestacija supstrata koji sadrže DS u disaharide koristeći hondroitin ABC lizu (EC 4.2.2.4) u ćelijske lizate; (3) obeležavanja DS disaharida sa fluorescentnom bojom (npr. 2-amino-akridon, AMAC); (4) razdvajanja DS disaharida (npr. elektroforezom kapilarne zone, CZE); i (5) detektovanje obeleženih DS disaharida (na primer, laserski indukovana fluorescija, LIF). Takvi postupci su opisani, na primer, u Zinellu et al., Electrophoresis 2:2439-2447, 2007, i Lamari et al, J. Chromatogr. B 730:129-133, 1999 (recenzija u Volpi et al, Electrophoresis 29:3095-3106, 2008).

[0318] Tabela13 pokazuje procenat degradacije DS koristeći GM00519 ćelije tretirane sa ARSB, kao što je određeno merenjem količine disaharida koji sadrži N-acetilgalaktozamin-4-sulfat (4S disaharid) koji je dominantan DS disaharid. Slični rezultati dobijeni su korišćenjem GM01391 ćelija tretiranih sa IKD.

[03191Gornji test je pokazao da ciljane ćelije apsorbuju rekombinantni ljudski ARSB i IDU, koji se zatim lokalizuju do lizozoma, gde degradiraju svoj prirodni supstrat, intracelularni

DS.

[0320J Eksperiment pronalaženja doze je izveden kako bi se odredila koncentracija na kojoj IDU počinje da ograniči stope u ovom testu baziranom na ćelijama. GM01391 ćelije su kultivisane u 12-komoričnim pločana. Nakon 4 nedelje nakon konfluencije, ćelije su izložene različitim koncentracijama IDU, od 0,8 nM do 25 nM, tokom 6 ili 26 sati. Ćelijski lizati su pripremljeni i obrađeni kao što je gore opisano. Za IDU je utvrđeno da ne posčne da ograničava stopu ispod 1 nM.

[0321] U drugom eksperimentu pronalaženja doze, GM01391 ćelije na 3 nedelje nakon konfluencije su izložene raznim koncentracijama IDU, od 0,01 do 0,2 nM, tokom 2 dana. Ćelijski lizati su pripremljeni i obrađena kao što je gore opisano. U ovom eksperimentu, poznata količina unutrašnjeg standardnog monosaharida, GlcNAc-6S, je skočila u ćelijskim lizatima kako bi kontrolisala za oporavak tokom obrade. Kao što je prikazano na Slici 13, smanjenje zavisno od doze u iznosu DS supstrata je primećeno u GM01391 ćelijama tretiranim sa IDU.

[0322]U sličnom eksperimentu pronalaženja doze, GM00519 ćelije na 3 nedelje nakon konfluencije su izloženi raznim koncentracijama ARSB, od 0,001 do 0,06 nM, tokom 5 dana. Ćelijski lizati su pripremljeni i obrađena kao što je gore opisano. U ovom eksperimentu, poznata količina unutrašnjeg standardnog monosaharida, GlcNAc-6S, je skočila u ćelijskim lizatima kako bi kontrolisala za oporavak tokom obrade.. Kao što je prikazano naSlici 14,smanjenje zavisno od doze u iznosu DS supstrata je primećeno u GM00519 ćelijama tretiranim sa ARSB.

[0323]In vitrotest zasnovan na ćelijama je razvijen za merenje aktivnost rekombinantnog ljudskog lizozomnog sulfataza enzima, GALNS, pri degradiranju svog prirodnog supstrata, tj. supstrata koji sadrže intracelularni keratan sulfat (KS).

[0324]GALNS-deifcijentne MQCH ćelije su kultivisane kao što je opisano uPrimeru8 gore i tretirane rekombinantnim ljudskim GALNS na 1 ili 10 nM. Posle tretmana, MQCH ćelijski lizati su pripremljeni i digestirani sa Keratanazom II (EO 3.2.1), koja razgrađuje veće KS oligosaharide u KS disaharide. KS disaharidi su označeni sa AMAC, razdvojeni sa CZE i detektovani sa LIF, kao što je opisano gore za DS disaharide. GlcNAc-6S, KS monosaharid, je skočio kod ćelijskih lizata kao interni standard kontrole za oporavak tokom obrade. Merene su količine dva karakteristična KS disaharida, Gal6S-GlcNAc6S i Gal-GlcNAc6S, a dobijeni podaci su koriguje za iznos oporavljenog GlcNAc6S. Tabela 14 prikazuje procenat degradacije KS koristeći MQCH ćelije tretirane sa GALNS, kao što je određeno merenjem količine dva karakteristična KS disaharida.

[0325]Gore navedeni test je pokazao da ciljne ćelije apsorbuju rekombinantni ljudski GALNS, koji se zatim lokalizovan na lizozomima, gde GALNS degradira svoj prirodni supstrat, intracelularni KS.

[0326]Generalno, ovi rezultati pokazuju da aktivnost rekombinantnih ljudskih lizozomnih enzima, ARSB, IDU i GALNS, pri razgradnji svojih prirodnih supstrata može da se meri i kvantifikuje uin vitrotestovima zasnovanim na ćelijama. Treba napomenuti da ovajin vitrotest zasnovan na ćelijama može lako da se modifikuje za merenje i kvantifikovanje aktivnosti drugih lizozomnih sulfataza enzimima, kao i za širok spektar rekombinantnih lizozomnih enzima.

PRIMERX

DOSTAVLJANJE REKOMBINANTNE LJUDSKE N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)DO SPECIFIČNIH TKIVA

[0327]Procenjena je, nakon primene na miševima, sposobnost rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS), pročišćene i eksprimirane u G71 ćelijama, da se dostavi specifičnim tkivima zahvaćenim, ili povezanim sa, nedostatkom GALNS.

[0328]Visoko specifična distribucija keratan sulfata daje veoma karakterističan fenotip Mukopolisaharidoze tipa IVa (MPS IVA) ili Morkio sindroma. Keratan sulfat se prvenstveno nalazi u hrskavicama (ploče rasta kostiju kod zglobova, srčani zalistak, grkljana i nosne pregrade) i rožnjači, i ta tkiva koja pokazuju akumulaciju keratan sulfata kod MPS IVA pacijenata. Stoga, za N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS), koja je u nedostatku kod MPS IVA ili Morkio sindroma, važno je pokazati dostavljanje GALNS enzima do ploča rasta kostiju kod zglobova, srčanog zaliska, rožnjače, grkljana i nos. Kako bi se ispitala ova specifična tkiva, koje su slabo vaskularizovani ciljevi, ispitivano je dostavljanje fluorescentnog GALNS kod miševa.

[0329]Dva postupka imunohistohemijskog bojeja su testirana na miševima: (1) ljudski GALNS konjugovan sa Alexa 488 i (2) nekonjugovanog ljudski GALNS. Konjugacija ljudskog GALNS za Alexa 488 je izvedena korišćenjem Molecular Probes Alexa Fluor 488 C5maleimid kompleta za obeležavanje (A-10254). Maleimid hernija konjugacije rezultovala u 1:1 odnosu obeležavanja i proteina.

[0330]Kako bi se potvrdilo da fluorescentna oznaka ne ometa apsorpciju GALNS, imunohistohemijski eksperiment je sproveden pomoću veštačkih sinoviocita (ATCC # CRL-1832). Standardni test apsorpcije je korišćen za poređenje nekonjugovanog GALNS sa konjugovanim GALNS (GALNS-A488 ili GALNS-A555). Ćelije su inkubirane sa enzimom GALNS tokom 4 sata sa naknadnim lovom a-L-L-iduronidaze (IDU) tokom 2 sata. Rezultati su pokazali da Alexa 488 konjugacija ne ometa ćelijsku apsorpciju.Slika 15prikazuje procenjen Kd za GALNS, GALNS-A488, i GALNS-A555. Apsorpcija je merena putem antigen ELISA iz ćelijskog lizata pre nego enzimske aktivnosti, jer obeležavane deaktiviralo enzim. Utvrđeno je da su Kd nekonjugovanog i konjugovanog GALNS enzima otprilike jednaki.

[0331]Za određivanje stabilnosti fluorescentnog oznake kada je enzim GALNS inkorporiran u ćeliju, obavljeno je imunološkog bojenje na nekonjugovanom i konjugovanog GALNS. Primarno antitelo korišćeni za bojenje bio je protein G-pročišćenog anti-GALNS zečjeg antitela u koncentraciji od 1 ug/mL. Sve slike su napravljene na Leica IRE2 širokopojasnom epi-fluorescentnom mikroskopu korišćenjem MetaMorph softvera. Dekonvolucija slika je neophodna za merenje ko-lokalizacije u ovim slikama, zbog prisustva svetlosti van ravni. Dekonvolucija je urađena pomoću AutoKuant/AutoDeblur softvera za vizuelizaciju koristeći funkciju teoretske tačke širenja (slepi algoritam).

[0332]Imunološko bojenje je pokazalo prilično dobro preklapanje sa signalom koji je pojačan preko GALNS-A488 materijala. Primećeno povećanje osetljivosti bilo je usled toga što su i primarno i sekundarno antitelo bili poliklonsko.

[0333]Kako bi se odredilo da li je GALNS enzim usmeren ka lizozomu, obavljeno je imunološko bojenje kultivisanih sinoviocita sa Molecular Probes Lvsotracker ili drugim enzimom koji se lokalizuje u lizozom. Čini se kao daje Lvsotracker pokazao određeno preklapanje sa GALNS-488 enzimom; međutim, bojenje nije bilo uniformno. Dvočasovni lov sa rekombinantnom ljudskom N-acetilgalactose amin-4-sulfatazom (rhASB), lizozomnim enzimom, pokazao je određenu ko-lokalizaciju sa GALNS.

[0334]Prethodni eksperimenti su pokazali daje GALNS-A488 enzim apsorbovan od strane ćelija i da lokalizuje na lizozom, i da se može koristiti za određivanje biodistribucijein vivo.

[0335]Sprovedena su dvain vivoispitivanja. Prvo pilot ispitivanje je jedna doza (10 mg/kg) bolus injekcije u repnu venu normalnih Balb/c miševa, što je praćeno drugim ispitivanjem sa više (5) injekcija svakog drugog dana od 10 mg/kg u repnu venu normalnih Balb/c miševa.Tabela 15 i Tabela 16opisuje eksperimentalne planove za prvo i drugo ispitivanje, respektivno.

[0336]U prvom pilot ispitivanju, srce, jetra i zglob cevanice/butne kosti su prikupljeni u vremenskim tačkama 2 sata i 24 sata. U drugom ispitivanju, srce, bubreg, jetre, i kosti sa kvadricepsom i soleusom su prikupljeni u vremenskim tačkama 2 sata, 4 sata i 8 sati. Za oba ispitivanja, srce, bubreg, i jetra su potapanjem fiksirani u 4% paraformaldehida (PFA) tokom 4 dana, parafinski obrađeni, i zatim secirani do 7 uM debljine. Kosti, uključujući mišić u drugom ispitivanju, su potapanjem fiksirane u 4% PFA tokom 8 dana, dekalcifikovane, parafinski obrađene i secirane na 7 uM debljine.

[0337]Slike miševa kojima je ubrizgan GALNS-A488 su dobijeni na Zeiss konfokalnom mikroskopu sa laserskim skeniranjem. Za analizu u prvom pilot ispitivanju, jedna konfokalna grupa po uzorku je uzeta iz srčanog zaliska i jetre i korišćena je za volumetrijsku analizu. Dve konfokalne grupe/uzorak su uzete za ploču rasta i korišćene su za volumetrijsku analizu. U drugom ispitivanju, jedna konfokalna grupa/uzorak za srčanih zalistak, bubrega i jetru je uzeta i korišćena za volumetrijsku analizu; dve konfokalne grupe/uzorak za ploču rasta i zone ostatka hrskavice (zrc) su uzete i korišćena za volumetrijsku analizu.

[0338JZaključci iz ispitivanja snimanja konfokalne mikroskopije bili su: (1) daje moguće detektovati fluorescentni GALNSin vivo;(2) signal bio specifičan (odsustvo pozadine) i

lokalizacija je bila lizozomna; (3) prisustvo GALNS je demonstriranu u sinusoidalnoj ćeliji u jetri; (5) u srcu, GALNS enzim je bio prisutan u septumu i pretkomori, ali je još važnije daje jasno vidljiva na nivou srčanog zaliska, gde je dublje distribuiran nakon višestrukih injekcija;

(6) u zglob cevanice/butne kosti, GALNS enzim je bio prisutan u mineralizovanom delu kosti (epifiza), kao i u srži. GALNS bio prisutan u ploči rasta. Određenije, GALNS je obilan u

hondrocitima zone mirovanja(ili zone rezervne hrskavice), prisutan na početku proliferativne zone i ponovo obilan u zoni osipanja na kraju ploče rasta. Iako je teško kvantifikovati kumulativni efekat više injekcija, činilo se drugo ispitivanje prikazuje širu distribuciju.Tabela 17prikazuje sažetak ispitivanja snimanja konfokalne mikroskopije.

[0339]Za sekundarno bojenje, početni korak je bio optimizacija GALNS primarnog antitela. Različita tkiva su bojeni razblaženjima od 1:100 do 1:400 sa proteinom G-pročišćen anti-GALNS zečjeg antitela. Rezultati u prvom pilot ispitivanju pokazuju daje razblaženje 1:100 bilo optimalno za visok odnos signala i šuma. Ovaj rezultat je potvrđen u drugom ispitivanju. Preostale pločice su obrađeni na primarnom razblaživanju antitela od 1:100 i sekundarnom razblaživanju antitela od 1:1000.

[0340] Signal za Balb/c miševe dozirane sa GALNS je imao signal iznad kontrole (tj. PBS-Cys doziranih miševa) kada je obojen sa proteinom G-pročišćenog anti-GALNS antitela. Kako bi te potvrdilo daje GALNS enzim lokalizovan u lizozomu, sekcije su bojene sa anti-LAMP1 antitelom. LAMPI je marker lizozoma. Slike su pokazale preklapanje između anti-LAMP1 i anti-GALNS antitela, što ukazuje daje enzim GALNS je lokalizovan u lizozomu.

[0341] Generalno, dvain vivoispitivanja pokazuju daje GALNS biodistribucija povezana sa vaskularizacijom, tj., više vaskularizovana tkiva sadrže više fluorescentni signal. Sto je još važnije, ispitivanja pokazuju prisustvo GALNS na mestima akumulacije keratan sulfata kod Morkio sindroma, čak i ako su ta mesta slabo vaskularizovana.

PRIMER XI

FORMULACIJE LJUDSKE N-ACEILGALACTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)

[0342] Cilj je bio da se ispita efekat različitih ekscipijenasa, npr., pufera, izotoničnih agensa i stabilizatora, na aktivnost i strukturu rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze (GALNS) u formulacijama ovog pronalaska.

[0343] Enzim GALNS je pripremljen kao što je opisano u Primeru V.

[0344] Enzim GALNS je okarakterisan kao što je opisano u Primeru VII.

[0345] U Primeru V, pročišćeni, rekombinantni ljudski GALNS enzim je formulisan u 10 mM NaOAc/HOAc, 1 mM NaH2P04, 150 mM NaCI, i 0,005% ili 0,01% Tween-20, na pH 5,5. Konstatovano je da nakon čuvanja u fosfatnom puferu niske koncentracije, došlo do defosforilacije GALNS enzima. Shodno tome, koncentracija fosfatnog pufera je povećana na 100 mM NaH2P04. Nakon čuvanju u fosfatnom puferu visoke koncentracije, uočena je značajna defosforilacija GALNS enzima. Međutim, rastvorljive agregati GALNS su posmatrani po čuvanju na 5°C, 25°C ili 40°C, i nerastvorljive agregati GALNS su posmatrani po čuvanju na 40°C.

[0346]U prvom ispitivanju, procenjen je efekat koncentracije stabilizatora i pH na stabilnost rekombinantnog GALNS. Pročišćeni rekombinantni GALNS enzim je formulisan u 20 mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, 0,01% Tween-20, i 4% saharozi ili 2% sorbitolu. Testirani stabilizatori: 15 mm ili 30 mm arginin hidrohlorid (arginin HCI); i 15 mM ili 30 mM NaCI. Testirana pH vrednost: 5,0, 5,4 i 5,8. Za pH 5,8 formulacije je utvrđeno da variraju od pH 5,8 do 6,0. Nakon držanja formulacija enzima do 2 meseca na 5°C, 25°C ili 40°C, GALNS enzim je analiziran korišćenjem raznih testova opisanih uPrimeruVI.

[0347]Formiranje rastvorljivih agregata u različitim formulacijama je određeno profilisanjem GALNS enzima tečnom hromatografijom viskoih performansi isključenja veličine (SEC-HPLC). Prisustvo 15 mM i 30 mM arginin HCI je potisnulo rast rastvorljivih agregata kao što je određeno pomoću SEC-HPLC(Slika 16).

[0348]Stabilnost aktivnosti GALNS enzima u formulacijama je merena korišćenjemin vitrotesta aktivnosti enzima. Na 5°C, aktivnost GALNS enzima je bila stabilna u prisustvu Arginin HCI ili NaCl; na 25°C, aktivnost GALNS enzima je neznatno smanjena u prisustvu Arginin HCI ili NaCl; i na 40°C, aktivnost GALNS enzima u NaCl sadrži formulacije koje ispoljavaju najmanju stabilnost(Slika 17).

[0349]Defosforilaciju GALNS enzima u formulacijama je ispitana merenjem procenat bis-fosforilisane manoze 7 (BPM7) kapilarnom elektroforezom (CE) nakon digestije enzima sa PNGazom F za cepanje asparagin N-vezanih oligosaharida. Posle 2 meseca na 5°C, 25°C ili 40°C, GALNS enzim u svim formulacijma enzima je imao profil glikozilacije u smislu % BPM7 koji je bio uporediva profilu glikozilacije referentnog lota GALNS koji je korišćen u fazi I kliničkih formulacija(Slika 18).

[0350]Čistoća GALNS enzima u formulacijama je određena profilisanjem enzima pomoću reverzno fazno-tečne hromatografije visokih performansi (RP-HPLC). Posle 2 meseca na 5°C ili 25°C, nijedna od formulacija nije ispoljavala bilo kakve promene oblasti pika; na 40°C, formulacije koje sadrže Arginin HCI na pH 5,0 i pH 5,4 takođe nisu ispoljavale bilo kakve promene oblasti pika, ali formulacije koje sadrže NaCI na pH 5,0 i pH 5,4 i sve formulacije na pH 5,8 su ispoljile smanjenje površine oblasti pika(Slika 19).U RP-HPLC hromatogramima, post-pik ramena su zabeležena u formulacijama. Formulacija GALNS koja sadrži 30 mM arginin HCI ispoljila je najmanje istaknuto post-pik rame.

PRIMERXII

PRIMERNE FORMULACIJE LJUDSKE N-ACEILGALACTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)

[0351] Sledeći primer daje smernice parametara koji treba se koriste za formulisanje sastava koje sadrže rekombinantnu ljudsku N-acetilgalaktozamin-6-sulfatazu (GALNS) ili biološki aktivne fragmenate, mutante, varijante ili njihove analoge, koji su korisne za lečenje Morkio sindroma ili MPS IVa. Parametri koji se koriste za formulisanje GALNS sastava iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, pufere za održavanje pH vrednosti, agense za prilagođavanje izotoničnosti, odsustvo ili prisustvo stabilizatora, i odsustvo ili prisustvo drugih ekscipijenasa, nosača, razblaživača, i slično.

[0352] U Primeru XI, rekombinantni GALNS je formulisan u koncentraciji od oko 1 mg/mL. Poželjni GALNS se formuliše u koncentraciji u rasponu od oko 0,1 do 10 mg/ml, poželjno od oko 0,5 do 5 mg/mL, i poželjnije od oko 0,5 do 1,5 mg/mL. U jednom otelotvorenju, formulacija GALNS sastava pronalaska ima koncentraciju GALNS enzima od oko 1 +/- 0,5 mg/mL.

[0353] U Primeru XI, rekombinantni GALNS enzim je formulisan u 20 mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, na pH 5,0, 5,4 i 5,8. Poželjna pufer je NaOAc/HOAc, ili njegov ekvivalent, i NaH2P04, ili njegov ekvivalent, sa koncentracijom NaOAc/HOAc u opsegu od oko 5 do 100 mM, poželjno od oko 5 do 50 mM, i još poželjnije od oko 10 do 30 mM, i koncentracija NaH2P04rasponu od oko 5 do 100 mM, poželjno od oko 25 do 100 mM, i poželjnije od oko 25 do 75 mM. U jednom primernom otelotvorenju, formulacija GALNS sastava pronalaska ima koncentraciju NaOAc/HOAc puera od oko 20 +/-10 mM i koncentraciju NaH2P04pufera od oko 50 +/- 25 mM

[0354] Poželjna pH vrednost formulacije je oko pH 4,5-6,5, poželjno oko pH 5,0-6,0 i poželjnije oko pH 5,0-5,8. U jednom otelotvorenju, formulacija GALNS sastava pronalaska ima pH vrednost od oko 5,4 +/- 0m4.

[0355] U Primeru XI, rekombinantni GALNS enzim je formulisan u 15 mM ili 30 mM arginin HCI ili NaCl. Stabilizujući agens je poželjno arginin HCI, ili njegov ekvivalent, sa koncentracijom u rasponu od oko 5 do 200 mM, poželjno od oko 10 do 100 mM, ajoš poželjnije od oko 10 do 50 mM. U jednom primemom otelotvorenju, formulacija GALNS sastava pronalaska ima Arginin HCI koncentraciju od oko 30 +/- 20 mM.

[0356] U Primeru XI,rekombinantni GALNS enzim je formulisan u 0,01% Tween-20. stabilizujući agens je poželjno Tween-20 (takođe poznat kao polisorbat-20), ili njegov ekvivalent, sa koncentracijom u rasponu od oko 0,001 do 1,0% (v/v), poželjno od oko 0,005 do 0,2%o (v/v), i poželjnije od oko 0,005 do 0,015% (v/v). U jednom otelotvorenju, formulacija GALNS sastava pronalaska ima Tween-20 koncentraciju od oko 0,01% +/-0,005% (v/v).

[0357] U Primeru XI,rekombinantni GALNS enzim je formulisan u 4% saharozi ili 2% sorbitolu. Poželjni stabilizator/agens protiv zamrzavanja/agens za toničnost je sorbitol, ili njegov ekvivalent, sa koncentracijom u rasponu od oko 0,1 do 10% (v/v), poželjno od oko 0,5 do 5%> (v/v), ajoš poželjnije od oko 1,0 do 3,0%> (v/v). Primer formulacije GALNS sastava pronalaska ima koncentraciju sorbitola od oko 2,0%> +/- 1,0% (v/v).

[03581Prema tome, primerne formulacije sastava GALNS enzima pronalaska su prikazane uTabeli18.

PRIMER XIII

EFEKTIREKOMBINANTNE LJUDSKE N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZE (GALNS)I DRUGIH LIZOZOMNIH SULFATAZA ENZIMA KODMIŠEVA SANEDOSTATKOM AKTIVNOSTI LIZOZOMNOGSULFATAZA

ENZIMA

[0359]Procenjeni su efekti aktivnih visoko fosforilisanih ljudskih lizozomnih sulfataza enzima pronalaska, na primer, rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS), kod miševa kojima imaju nedostatak aktivnosti lizozomnog sulfataza enzima.

[0360]Rekombinantni ljudski GALNS protein je eksprimiran u G71S ćelijama i pročišćen. Drugi rekombinantni ljudski lizozomni sulfataza enzimi mogu biti eksprimirana i pročišćeni u osnovi prema ovde opisanim postupcima ili postupcima poznatim u struci.

[0361]Opisano je nekoliko mišjih modela nedostajućeg ljudskog lizozomnog sulfataza

enzima, kao što su: metahromatska leukodistrofija (MLD) (nedostatak arilsulfataze A), (Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14821-14826, 1996), mukopolisaharidoza tipa VI (MPS VI) ili Maroto-Lami sindrom (nedostatak arilsulfataze B) (Evers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219, 1996), mukopolisaharidoza tipa II (MPS II) ili Hunterov sindrom (nedostatak iduronat-2-sulfataze) (Muenzer et al., Acta Paediatr. Suppl. 91(439):98-99, 2002; Cardone et al., Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236, 2006), mukopolisaharidoza tipa lila ( MPS ITIa) ili Sanfilipo sindrom (nedostatak sulfamidaze/heparan-N-sulfataze) (Bhaumik et al., Glycobiology 9(12): 1389-1396, 1999), mukopolisaharidoza tip IVa (MPS IVa ) ili Morkio sindrom (nedostatak N-acetilgalaktozamin-6-sulfataze) (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003), i višestruki nedostatak sulfataze (MSD) (nedostatak faktora 1 modifikovanja sulfataze) (Settembre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511, 2007). Mišjem model mukopolisaharidoze tipa Illd (MPS Illd) ili Sanfilipo D sindrom (nedostatak n-acetilglukozaminska 6-sulfataze) tek treba da budu opisani.

[0362]Mišji modeli nedostatka ljudskog lizozomnog sulfataza enzima mogu se koristiti za procenu izvodljivost terapije zamene enzima (ERT) kao načina za lečenje poremećaja lizozomnog skladištenja. Na primer, MPS IVa knock-out miševi( GALNS' 1'miševi; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003) nemaju aktivnost GALNS enzima koja može da se detektuje i pokazuju povećane urinarne glikozaminoglikane (GAG), tj. keratin sulfat i hondroitin-6-sulfat, i akumulacija GAG u više tkiva i organa, npr., jetri, bubrezima, slezini, srcu, mozgu, koštanoj srži i hrskavicama. TheGALNS<1>'miševi, međutim, ne pokazuju skeletne abnormalnosti povezane sa ljudskom bolesti. Drugi MPS IVa mišji model je razvijen da eksprimira neaktivan ljudski GALNS i mutirani, neaktivni endogeni mišji GALNS( GALNStm( hC79SmC76S) slumiševi; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 14:3321-3335, 2005). KodGALNSm^ hC79SmC76S^ slumiševa, koji nemaju aktivnost enzima GALNS koja može da se detektuje, urinarno GAG izlučivanje se povećava, GAG se akumuliraj a u više tkiva, uključujući i unutrašnje organe, mozak, rožnjaču, kosti, ligamenate i koštanu srž, lizozomno skladištenje je obeleženo u višestrukim tkivima, i skladištenje u kostima je evidentno. Patološke promene kodGALNSm( hC79SmC76S) sluse razlikuju od onih primećenih kodGALNS' 1'miševa. Međutim, kao iGALNS' 1'miševi,GALNSm( hC79SmC76S) slumiševi ne ispoljavaju košane abnormalnosti povezanih sa ljudskom bolesti. Tako,GALNS-''iGALNStm( hC79S mC76S) slu<m>iševi se mogu koristiti da se ispita efekat primene rekombinantnog ljudskog GALNS na povećane urinarne GAG i na akumulaciju GAG u tkivima.

[0363]Četiri nedelje starimGALNS-'', GALNS""( hC79SmC76S) sluilidivljim miševima su davane nedeljne intravenske injekcije (n = najmanje 6 ili 8 po grupi) na različitim dozama rekombinantnog ljudskog GALNS (npr., 0,1 , 0,3, 1, 3, 10 mg/kg) ili kontrolni nosač, kroz 16-20 nedelja starosti, a zatim su žrtvovani za histološka ispitivanja. Urin je prikupljaju od miševa i urinarno lučenje GAG je određeno kao što je opisano (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003 ). Patološki pregled različitih tkiva se obavlja kao opisano (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358, 2003).

[0364]KorišćenjemGALNS-''iliGALNSm( hC79SmC76S) slumiševa, od rekombinantnog ljudskog GALNS prema pronalasku se očekuje da pokaže sposobnost da smanji: (1) urinarno lučenje GAG; (2) akumulacija GAG na višestrukim tkivima, npr., unutrašnjim organima, mozgu, rožnjači, kostima, ligamentima i koštanoj srži; (3) lizozomno skladištenje u višestrukim tkivima; i (4) skladištenje u kostima.

[0365]Efekat rekombinantnog ljudskog GALNS se vrši u mišjem modelu višestrukog nedostatka sulfataze (MSD)( SUMFV1miševi; Settembre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511, 2007). Zato štoSUMF1' 1miševi pokazuju čest mortalitet u ranom životu, davanje injekcija sa rekombinantnim ljudskim GALNS ovih miševa se obavlja ranije nego kod gore opisanihGALNS~ Lmiševa.

[0366] Posle postupaka poznatih u tehnici, efekti drugih rekombinantnih ljudskih lizozomnih sulfataza enzima, tj. arilsulfatazea A, arilsulfatze B, iduronat-2-sulfataze, sulfamidaze/heparan-N-sulfataze i n-acetilglukozamin-6-sulfataza su ispitivani u mišjim modelima MLD( ASA''-miševi; Hess et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14821-14826, 1996), MPS VI{ Asl- s1-miševi; Evers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219, 1996), MPS II(WAmiševi; Cardone et al, Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236, 2006), MPS lila (Bhaumik et al, Glycobiology 9(12): 1389-1396, 1999) i MSD{ SUMFl1'miševi; Settembre et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511, 2007).

PRIMER XIV

TRETMAN LJUDSKIH PACIJENATA, KOJI BOLUJU OD

MUKOPOLISAHARIDOZE TIPA IVA (ILI MORKIO SINROMA)ILIDRUGOG NEDOSTATKA LIZOZOMNOG SULFATAZA ENZIMA, SA LJUDSKKOM N-ACETILGLAKTOZAMIN-6-SULFATAZON (GALNS) I DRUGIM LIZOZOMNIM SULFATAZA ENZIMIMA

[0367] Ljudski pacijenati koji manifestuju klinički fenotip nedostatka lizozomnog sulfataza enzima, kao što je u bolesnika sa dijagnozom mukopolisaharidoze tipa IVA (MPS IVa ili Morkio sindrom), razmatrani su za terapiju zamene enzim sa rekombinantnim enziom, odnosno, ljudskom N-acetilglaktozamin-6-sulfatazom (GALNS). Svi pacijenti koji pate od nedostatka lizozomnog sulfataza enzima ispoljavaju neke kliničke dokaze o preteranoj ili štetnoj akumulaciji u visceralnom i mekom tkivu materijala za skladištenje u svojim lizozoma, što se manifestujue kroz različite stepene funkcionalnog oštećenja ili pogoršanja zdravstvenog stanja, povezanog sa određenom bolestima skladištenja lizozoma. Svi MPS IVa pacijenti manifestuju neke kliničke dokaze koštanog deformiteta, niskog rasta i abnormalne hoda, i/ili akumulacije glikozaminoglikana (GAG) u krvi ili urinu, sa različitim stepenom funkcionalnog oštećenja.

[0368]Poželjno, nivoi enzima se prate kod pacijenta koji pati od nedostatka lizozomnog sulfataza enzima kako bi se potvrdilo odsustvo ili smanjena aktivnost lizozomnog sulfataza enzima u tkivima. Pacijenti sa manje od 10%, poželjno manje od 5%, poželjnije manje od 2% i čak još poželjnije manje od 1% aktivnosti lizozomnog enzima kod inače normalnog pacijenta su pogodni kandidati za tretman sa odgovarajućim lizozomnim sulfataza enzimom. Podaci mogu biti prikupljeni kako bi se odredila aktivnost lizozomnog sulfataza enzima kod pacijenta pre, za vreme i posle terapije.

[0369] Efikasnost se određuje merenjem procenta smanjenje urinarnog lučenja supstrata, tj. glikozaminoglikana (GAG) lizozomnog sulfataza enzima tokom vremena. Urinarni GAG nivoi kod pacijenta sa nedostatkom lizozomnog sulfataza enzima se porede sa normalnim nivoima lučenja i/ili nivoa kod netretiranih pacijenata sa istim nedostatkom lizozomnog sulfataza enzima i/ili nivoa kod istog pacijentom pre terapije lizozomnim sulfataza enzimom. Smanjenje veći od 25%, poželjno smanjenje veće od 50%, lučenja nedegradiranog GAG nakon terapije lizozomnog sulfataza enzima je ispravan način da se izmeri odgovor pojedinca na terapiju.

[0370] Efikasnost se takođe mogu odrediti prema smanjenih znacima i simptomima patologijama povezanih sa bolesti skladištenja lizozoma. Efikasnost može odrediti biopsijom tkiva i ispitivanjem ćelija i/ili lizozoma kako bi se odredio stepen kojim su GAG smanjeni u lizozomima, ćelijama ili tkivima. Efikasnost se može odrediti funkcionalnim procenama, koje mogu biti objektivne ili subjektivne (npr. smanjen bol ili poteškoće u funkciji, povećana mišićna snaga ili izdržljivost, povećavan kapacitet srca, vežbe izdržljivosti, promene u telesnoj masi, visini ili izgledu, i slično) .

[0371] Farmaceutski sastav sadrži rekombinantni ljudski GALNS, eksprimiran u G71S ćelijama i pročišćeni i formulisane prema postupcima poznatim u struci. Poželjno je za primenjivati farmaceutski sastav pronalaska intravenozno.

[0372] Osnovni dizajn inicijalnog kliničkog ispitivanja efekta primene rekombinantnih ljudskih GALNS pacijentima koji boluju od MPS Iva uključuje otvoreno ispitivanje, bezbednost povećanja doza/ispitivanje efikasnosti, gde su različite doze enzima intravenozno davane pacijentima u fiksnom intervalu, na primer ali ne ograničavajući se na, nedeljne injekcije enzima. [03731Kod MPS rVa pacijenata, efikasnost je određena merenjem, npr. smanjenog GAG u krv ili urinarnu, što se očekuje da bude primećeno nakon nekoliko nedelja ERT, povećane izdržljivost u testovima kardioloških, plućnih/ili motornih funkcija, što se očekuje da bude primećeno nakon nekoliko meseci ERT, i/ili skeletnih promena i/ili rasta tela, što se očekuje da bude primećeno nakon nekoliko godina ERT.

[0374] Urinarna GAG merenja su korisna za uspostavljanje odgovarajućeg režima doze, kao i za određivanje efikasnosti, merenjem procenta smanjenje urinarnog GAG lučenja tokom vremena.

[0375] Različiti testove izdržljivosti mogu da se koriste, uključujući, na primer, ali ne ograničavajući se na, testove hoda (distanca hodanja na 6 ili 12 minuta), penjanje uz stepenike (stepenici u minutu), i plućne/respiratorne funkcije, uključujući srčane funkcije (EKG, ehokardiogram), plućne funkcije (FVC, FEVj, pik protok).

[03761 Za mlađe pacijente koji se leče tokom dužeg vremenskog perioda, može da se meri rast (visina).

[0377] Bolesti skladištenja lizozoma povezane sa nedostatkom aktivnosti lizozomnog sulfataza enzima koji se mogu lečiti ili sprečiti korišćenjem postupaka iz ovog pronalaska su: metahromatska leukodistrofija (MLD), mukopolisaharidoza tipa VI (MPS VI) ili Maroto-Lami sindrom, mukopolisaharidoza tipa II (MPS II) ili Hanterov sindrom, mukopolisaharidoza tipa lila (MPS lila) ili Sanfilipo sindrom, mukopolisaharidoza tipa Illd (MPS Illd) ili Sanfilipo D sindrom, mukopolisaharidoza tipa IVa (MPS IVa) ili Morkio sindrom, ili višestruki nedostatak sulfataze (MSD). Za svaku bolest lizozomnog skladištenja, rekombinantni lizozomni sulfataza enzim bi činio specifični lizozomni sulfataza enzim.

[0378] Za postupke koje uključuju MLD, poželjni lizozomni sulfataza enzim je arilsulfataza A. Za postupke koje uključuju MPS VI, poželjni lizozomni sulfataza enzim je arilsulfataza B. Za postupke koje uključuju MPS II, poželjni lizozomni sulfataza enzim je iduronat-2-sulfataza. Za postupke uključuju MPS IIIA, poželjni lizozomni sulfataza enzim je sulfamidaza/heparan-N-sulfataza. Za postupke uključuju MPS Illd, poželjni lizozomni sulfataza enzim je N-acetilglukozamin-6-sulfataza. Za postupke uključuju MPS IVA, poželjni lizozomni sulfataza enzim je N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza. Za postupke uključuju MSD, poželjni lizozomni sulfataza enzim je N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza.

Claims

1. Postupak pročišćavanja rekombinantne ljudske N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzima, gde navedeni GALNS enzim obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinama 27 do 522 od SEQ ID NO:4, gde navedeni GALNS enzim: ima čistoću od najmanje 95%> kako je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje 50%> konverzije kristalnog ostatka na položaju 53 do CQ-formilglicina (FGly),i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, i gde je najmanje 98% navedenog GALNS enzima u prekursor obliku kako je određeno natrijum dodecil sulfat-kapilarnom gel elektroforezom (SDS-CGE), koja obuhvata: a) filtriranje medijum kulture koja sadrži GALNS enzim izlučen iz sisarske ćelijske linije koja eksprimira ljudski faktor 1 modifikovanja sulfataze (SUMF1) i rekombinantni ljudski GALNS enzim, ultrafiltriranje/dijafiltriranje filtrirane medijum kulture, gde je ultrafiltriran/dijafiltiran medijum kulture koncentrisan oko 20X, i filtriranje ugljem je 20 X koncentrisano ultrafiltriran/dijafiltriran medijuma kulture; b) nanošenje ugljem filtriran 20X ultrafiltriran/dijafiltriran medijum kulture iz koraka a) na Zn-helatnom sefarozom FF obuhvatnu kolonu, pranje kolone pod uslovima da GALNS enzim bude zadržan na koloni, i eluiranje GALNS enzima sa kolone; c) filtriranje eluata sa Zn-helatne sefaroze FF obuhvatne kolone u koraku b) kroz filter kako bi se uklonili virusi; d) prilagođavanje pH eluata od Zn-helatnom sefarozom FF obuhvatne kolone filtrata iz koraka c) do oko pH 4,5 ± 0,1, i filtriranje pH 4,5-prilagođenog eluata sa Zn-helatnom sefarozom FF obuhvatne kolone filtratom; e) nanošenje pH 4,5-prilagođenog filtrata sa Zn-helatnom sefarozom FF obuhvatne kolone iz koraka d) na Fractogel EMD SE Hi-Cap kolonu katjonske zamene, pranje kolone pod uslovima tako da GALNS enzim bude zadržan na koloni, i eluiranje GALNS enzima sa kolone; f) prilagođavanje pH eluata od Fractogel EMD SE Hi-Cap kolone katjonske zamene iz koraka e) do oko pH 3,5 ±0,1 za virusnu inaktivaciju; g) prilagođavanje pH 3,5-virusno inaktiviranog eluata iz koraka f) do oko pH 5,0, zatim nanošenje pH 5,0-prilagođenog virusno inaktiviranog eluata na ToyoPearl Butil 650 M kolonu za poliranje, pranje kolone pod uslovima tako da GALNS enzim bude zadržan na koloni, i eluiranje GALNS enzima sa kolone; h) zamena pufera eluata sa TovoPearl Butil 650 M kolone za poliranje iz koraka g) u formulaciju obuhvata 20 mM NaOAc/HOAc, 50 mM NaH2P04, 30 mM arginin HCI, 2% (w/v) sorbitol, pH 5,4, i prilagođavanje koncentracije GALNS enzima u formulaciji do oko 3 mg/mL; i) uklanjanje bilo kog ostatka virusa i/ili DNK filtriranjem puferski zamenjene formulacije u koraku h) sa DV20 filterom i Mustang Q filterom; i j) dodavanje polisorbata 20 (PS20) formulaciji u koraku i) do konačne koncentracije od 0,01% (w/v).

2. Primena formulacije bilo kog od patentnih zahteva 3-12 koja obuhvata pročišćen rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim u proizvodnji leka za tretiranje pacijenta koji pati od mukopolisaharidoze tipa Iva (MPS IVa) ili Morkio A sindroma.

3. Formulacija obuhvata (a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen prema patentnom zahtevu 1, gde navedeni GALNS enzim obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinama 27 do 522 od SEQ ID NO:4, i ima čistoću od najmanje 95%> kako je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje 50%> konverzije kristalnog ostatka na položaju 53 do CQ-formilglicina (FGly),i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, gde je najmanje 98% navedenog GALNS enzima u prekursorskom obliku kako je određeno putem SDS-CGE, i (b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji obuhvataju: (i) količinu fosfatnog pufera koja je efikasna za smanjenje defosforilacije navedenog GALNS enzima, gde je fosfatni pufer NaH2P04na koncentraciji od oko 25 mM do 75 mM; i (ii) stabilizujuća količina sledećeg: arginin so ili pufer, opciono arginin hidrohlorid, gde je arginin so ili pufer na koncentraciji od oko 10 mm do 50 mm; polisorbat, opciono polisorbat 20; i trihidrični ili viši šećerni alkohol; gde je navedena formulacija na pH od oko 5,0-5,8.

4. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde formulacija dalje obuhvata drugi pufer, opciono acetatni pufer.

5. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde je GALNS enzim najmanje 95% čist kako je određeno putem RP-HPLC.

6. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde se između 50% do 80% GALNS enzima vezuje za manoza-6-fosfat receptor kolonu.

7. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde GALNS enzim ispoljava specifičnu apsorpciju (Kuptake) u fibroblaste koja je od 1 do 5 nM, poželjno od 1 do 3,5 nM.

8. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde je koncentracija GALNS enzima oko 0,5 do 1,5 mg/mL.

9. Formulacija prema patentnom zahtevu 4, gde su puferi NaOAc/HOAc i NaH2P04,

10. Formulacija prema patentnom zahtevu 9, gde je koncentracija NaOAc/HOAc na oko 10 do 30 mM i koncentracija NaH2P04na oko 25 do 75 mM.

11. Formulacija prema patentnom zahtevu 3, gde su stabilizatori Arginine HCI, polisorbat 20 i sorbitol.

12. Formulacija prema patentnom zahtevu 11, gde je koncentracija Arginine HCI na oko 10 do 50 mM, koncentracija polisorbata 20 na oko 0,005% do 0,015% (w/v), i koncentracija sorbitol na oko 1,0% do 3,0% (w/v).

13. Formulacija obuhvata: (a) rekombinantni ljudski N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GALNS) enzim pročišćen prema patentnom zahtevu 1, gde navedeni GALNS enzim obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinama 27 do 522 od SEQ ID NO:4, i ima čistoću od najmanje oko 95% kako je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, ima najmanje oko 50%> konverzije kristalnog ostatka na položaju 53 do Ca-formilglicina (FGly), i ima između 0,5 do 0,8 bis-fosforilisanih oligomanoznih lanaca po monomernom proteinskom lancu, gde je najmanje 98% navedenog GALNS enzima u prekurskor obliku kako je određeno Komasi plavim bojenjem kada se podvrgne SDS-PAGE pod edukcionim uslovima, i (b) jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa koji obuhvataju: (i) NaOAc/HOAc i NaH2P04kao pufere, gde je koncentracija NaOAc/HOAc na oko 20 +/- 10 mM i koncentracija NaH2P04na oko 50+ 1- 25mM; (ii) Arginin HCI, polisorbat 20 i sorbitol kao stabilizatiore, gde je koncentracija Arginin HCI na oko 30 +/- 20 mM, koncentracija polisorbata 20 na oko 0,01% +/-0,005% (w/v) i koncentracija sorbitola na oko 2,0%> +/- 1,0% (w/v); i (iii) pH od oko 5,4 +/- 0,4,

14. Formulacija prema patentnom zahtevu 13 gde se jedan ili više farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijens suštinski sastoji od: (i) NaOAc/HOAc, gde je koncentracija NaOAc/HOAc na oko 20 +/- 10 mM; (ii) NaH2P04, gde je koncentracija NaH2P04 na oko 50 +/-25 mM; i (iii) Arginina HCI, polisorbata 20 i sorbitola kao stabilizatora, gde je koncentracija Arginin HCI na oko 30 +/- 20 mM, koncentracija polisorbata 20 na oko 0,01% +/-0,005% (w/v) i koncentracija sorbitola na oko 2,0%> +/- 1,0% (w/v).