ES2616263T3 - Fabricación de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana, altamente fosforilada, activa, y usos de la misma - Google Patents
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Abstract
Un método de purificación de una enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante, comprendiendo dicha enzima GALNS una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, en el que dicha enzima GALNS: tiene una pureza de al menos 95 %, determinada por tinción con azul de Coomassie, cuando se somete a una SDS-PAGE en condiciones no reductoras, tiene una conversión de al menos 50 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα -formilglicina (FGly), y tiene entre 0,5 y 0,8 cadenas de oligomanosa bis-fosforilada por cadena de proteína monomérica, y en el que al menos el 98 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora, determinada por electroforesis capilar en gel con dodecil sulfato sódico (SDS-CGE), que comprende: a) la filtración de un medio de cultivo que contiene la enzima GALNS segregada de una línea celular de mamífero que expresa el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano y la enzima GALNS humana recombinante, la ultrafiltración/diafiltración del medio de cultivo filtrado, mediante el cual el medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado se concentra a aproximadamente 20X, y la filtración en carbón vegetal del medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20 X concentrado; b) la carga del medio del cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20X filtrado en carbón vegetal de la etapa a) en una columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna y la elución de la enzima GALNS de la columna; c) la filtración del eluato de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn en la etapa b) a través de un filtro para eliminar los virus; d) el ajuste del pH del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn de la etapa c) a aproximadamente pH 4,5 ± 0,1 y la filtración del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5; e) la carga del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5 de la etapa d) en una columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna; f) el ajuste del pH del eluato de la columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap de la etapa e) a aproximadamente pH 3,5 ± 0,1 para la inactivación de virus; g) el ajuste del eluato que ha experimentado inactivación de virus a pH 3,5 de la etapa f) a aproximadamente pH 5,0, después la carga del eluato que ha experimentado inactivación de virus ajustado a pH 5,0 en una columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna; h) el cambio de tampón del eluato de la columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M de la etapa g) en una formulación que comprende NaOAc/HOAc 20 mM, NaH2PO4 50 mM, HCl arginina 30 mM, sorbitol al 2 % (p/v), pH 5,4 y el ajuste de la concentración de la enzima GALNS en la formulación a aproximadamente 3 mg/ml; i) la retirada de cualquier virus y/o ADN residual filtrando la formulación cuyo tampón se ha cambiado en la etapa h) con un filtro DV20 y un filtro Mustang Q; y j) la adición de polisorbato 20 (PS20) a la formulación en la etapa i) a una concentración final de 0,01 % (p/v).
Description
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enzimas sulfatasas lisosomales de longitud completa o fragmentos, mutantes, variantes o derivados de las mismas pueden administrarse in vivo en células que están afectadas por una deficiencia enzimática lisosomal.
La composición farmacéutica desvelada en el presente documento puede comprender una N-acetilgalactosamina-6sulfatasa (GALNS) humana recombinante altamente fosforilada, activa, o un fragmento mutante, variante o derivado de la misma, biológicamente activo, producido por los métodos de la invención y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables en una formulación que comprende uno o más agentes tampón y uno o más estabilizantes. La composición puede comprender una cantidad de tampón fosfato eficaz para reducir la desfosforilación de dicha enzima GALNS; y una cantidad estabilizante de uno o más estabilizantes seleccionados de un grupo que consiste en sales de aminoácidos, tampones de aminoácidos, tensioactivos y polioles; estando dicha formulación a un pH de aproximadamente 5,0-5,8.
En algunas realizaciones, la enzima GALNS comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, y tiene: (i) una pureza de al menos aproximadamente 95 % determinada por tinción con azul de Coomassie, cuando se somete a SDS-PAGE en condiciones no reductoras, (ii) al menos aproximadamente una conversión del 80 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα-formilglicina (FGly), y (iii) entre 0,5 a 0,8 cadenas de oligomanosa bis-fosforiladas por cadena de proteína monomérica, en el que al menos el 95 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora, determinada por electroforesis capilar en gel con SDS. En algunas realizaciones, la enzima GALNS tiene al menos aproximadamente un 90 % de conversión del resto de cisteína en la posición 53 a Cα-formilglicina (FGly). En algunas realizaciones, entre el 50 % al 80 % de la enzima GALNS se une a una columna de receptor de manosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, la enzima GALNS exhibe una absorción (Kabsorción) específica en fibroblastos que es de aproximadamente 1 a 5 nM. En algunas realizaciones, la enzima GALNS exhibe una absorción específica (Kabsorción) en fibroblastos que es de aproximadamente 1 a 3,5 nM.
La concentración de la enzima GALNS en la formulación es de aproximadamente 0,1 a 10 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 5 mg/ml y más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 1,5 mg/ml.
En determinadas realizaciones, la formulación comprende una cantidad de tampón fosfato eficaz para reducir la desfosforilación de dicha enzima GALNS, en el que el tampón fosfato es NaH2PO4. En una realización adicional, la formulación comprende adicionalmente un segundo tampón. En una realización el segundo tampón es un tampón de acetato en el que el tampón de acetato es NaOAc/HOAc. En el apartado Descripción Detallada se describen ejemplos de tampones con mayor detalle.
Se contempla que la concentración de NaOAc/HOAc en la formulación es de aproximadamente 10 a 30 mM. En una realización relacionada, la concentración de NaH2PO4 en la formulación es de aproximadamente 25 a 75 mM. En determinadas realizaciones, el pH de la formulación es de aproximadamente 5,0-5,8.
La formulación puede comprender una cantidad estabilizante de uno o más estabilizantes seleccionados del grupo que consiste en sales de aminoácidos, tampones de aminoácidos, tensioactivos y polioles. En una realización, el estabilizante es una sal de arginina o un tampón, opcionalmente clorhidrato de arginina. En una realización relacionada, el estabilizante es un polisorbato, opcionalmente polisorbato 20. El estabilizante puede ser un alcohol de azúcar trihídrico o superior, opcionalmente sorbitol. En el apartado Descripción Detallada se describen ejemplos de estabilizante con mayor detalle.
En determinadas realizaciones, los estabilizantes se seleccionan de clorhidrato de arginina o Tween-20 (polisorbato 20), y sorbitol. En algunas realizaciones, la concentración de HCl arginina en la formulación es de aproximadamente 10 a 50 mM. En otra realización, la concentración de Tween-20 es de aproximadamente 0,005 a 0,015 % (p/v). En una realización relacionada, la concentración de sorbitol en la formulación es de aproximadamente 1,0 a 3,0 % (p/v). En una realización, la formulación comprende una sal o tampón de arginina, un polisorbato y un poliol. La presente invención proporciona una formulación que comprende a) la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante purificada por un método enseñado en el presente documento, comprendiendo dicha enzima GALNS una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, y que tiene una pureza de al menos 95 %, determinada por tinción con azul de Coomassie, cuando se somete a SDS-PAGE en condiciones no reductoras, que tiene una conversión de al menos 50 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα-formilglicina (FGly), y que tiene entre 0,5 a 0,8 cadenas de oligomanosa bisfosforiladas por cadena proteína monomérica, en el que al menos el 98 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora determinada por SDS-CGE, y b) uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables que comprenden: (i) una cantidad de tampón fosfato eficaz para reducir la desfosforilación de dicha enzima GALNS, en el que el tampón fosfato es NaH2PO4 a una concentración de aproximadamente 25 mM a 75 mM; y (ii) una cantidad estabilizante de lo siguiente: una sal o tampón de arginina, opcionalmente clorhidrato de arginina, en el que la sal o tampón de arginina está a una concentración de aproximadamente 10 mM a 50 mM; un polisorbato, opcionalmente polisorbato 20; y un alcohol de azúcar trihídrico o superior, opcionalmente sorbitol; en el que dicha formulación está a un pH de aproximadamente 5,0-5,8. La presente invención proporciona también una formulación que comprende a) una enzima N-acetilgalactosamina-6sulfatasa (GALNS) humana recombinante purificada por un método enseñado en el presente documento,
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comprendiendo dicha enzima GALNS una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, y que tiene una pureza de al menos 95 %, determinada por tinción con azul de Coomassie cuando se somete SDS-PAGE en condiciones no reductoras que tiene una conversión de al menos 50 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα-formilglicina (FGly), y que tiene entre 0,5 a 0,8 cadenas de oligomanosa bisfosforiladas por cadena proteína monomérica, en el que al menos el 98 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora, determinada por tinción con azul de Coomassie cuando se somete a SDS-PAGE en condiciones reductoras, y b) uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables que comprenden: (i) NaOAc/HOAc y NaH2PO4 como agente tampón, en el que la concentración de NaOAc/HOAc es de aproximadamente 20 +/-10 mM y la concentración de NaH2PO4 es de 50 +/-25 mM; y (ii) HCl arginina, polisorbato 20 y sorbitol como estabilizantes, en el que la concentración de HCl arginina es de aproximadamente 30 +/-20 mM, la concentración de polisorbato 20 es de aproximadamente 0,01 % +/-0,005 % (p/v) y la concentración de sorbitol es de aproximadamente 2,0 % +/-1,0 % (p/v); y (iii) un pH de aproximadamente 5,4 +/-0,4.
En el presente documento se enseña un método de prevención de la desfosforilación de una enzima GALNS humana recombinante que comprende mezclar la enzima GALNS y un tampón fosfato, a una concentración final de tampón fosfato que está entre aproximadamente 25 mM y 75 mM. La cantidad de desfosforilación puede reducirse en comparación con una formulación de la misma enzima en tampón fosfato 1 mM, por ejemplo, cuando se ensaya después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses, de conservación a temperatura ambiente (por ejemplo a 25 °C).
En una realización particularmente preferida, la composición farmacéutica comprende una enzima Nacetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana, recombinante, altamente fosforilada, activa, purificada con los métodos de la invención, y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, en una formulación que comprende NaOAc/HOAc y NaH2PO4 como agentes tampón, y HCl arginina, Tween-20 (polisorbato 20) y sorbitol como estabilizantes. La concentración de GALNS en la formulación es de aproximadamente 1,0 +/-0,5 mg/ml. La concentración de NaOAc/HOAc en la formulación es de aproximadamente 20 +/-10 mM, y la concentración de NaH2PO4 en la formulación es de aproximadamente 50 +/-25 mM. El pH de la formulación es de 5,4 +/-0,4. La concentración de HCl arginina en la formulación es de aproximadamente 30 +/20 mM. La concentración de Tween-20 en la formulación es de aproximadamente 0,01 +/-0,005 % (p/v). La concentración de sorbitol en la formulación es de aproximadamente 2,0 +/-1,0 % (p/v).
En el presente documento se enseña un método para detectar la actividad de una enzima sulfatasa lisosomal que comprende (a) cultivar células de condrocitos de un paciente que padece deficiencia de enzima sulfatasa lisosomal, por ejemplo, de un paciente que padece síndrome de Morquio, en condiciones que promuevan el mantenimiento de la diferenciación de los condrocitos; (b) poner en contacto los condrocitos con una enzima sulfatasa lisosomal que degrade queratán sulfato; y (c) detectar los niveles de queratán sulfato en las células, en las que un nivel de queratán sulfato reducido en las células que se han puesto en contacto con la enzima sulfatasa lisosomal en comparación con las células que no se han puesto en contacto con la enzima sulfatasa lisosomal, es indicativo de actividad de enzima sulfatasa lisosomal. La enzima sulfatasa lisosomal puede ser N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS). El cultivo puede realizarse en medios que comprendan factor 1 de crecimiento de insulina (IGF1), factor beta de crecimiento transformante (TGF-β), transferrina, insulina y ácido ascórbico. El queratán sulfato puede detectarse por microscopía confocal, o a través de la unión a un anticuerpo contra queratán sulfato. El método puede realizarse con cualquier enzima sulfatasa lisosomal, incluyendo una enzima humana recombinante o de origen natural, o fragmentos o variantes de la misma, incluyendo variantes que comprendan una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la enzima humana precursora, sin secuencia señal, o a su forma madura.
En el presente documento se desvela un ensayo basado en células para medir la actividad de una enzima lisosomal humana recombinante para degradar sustratos naturales. El método puede comprender (a) cultivar una célula humana aislada deficiente en enzima lisosomal, en condiciones en las que se acumulen los sustratos naturales para la enzima lisosomal; (b) poner en contacto la célula con la enzima lisosomal; (c) causar la lisis de la célula; (d) añadir al lisado celular una enzima que (i) sea específica para los sustratos naturales, y (ii) escinda oligosacáridos pequeños de los sustratos naturales; (e) marcar los oligosacáridos pequeños con un residuo detectable; (f) opcionalmente separar los oligosacáridos pequeños marcados; y (h) determinar la actividad de la enzima lisosomal para degradar los sustratos naturales comparando (i) la cantidad de oligosacáridos pequeños marcados de células que se han puesto en contacto con la enzima lisosomal con (ii) la cantidad de oligosacáridos pequeños marcados de células que no se han puesto en contacto con la enzima lisosomal, en el que la reducción en (h)(i) en comparación con (h)(ii) indica la actividad de la enzima lisosomal para degradar sustratos naturales. El oligosacárido pequeño puede ser un mono-, di, o tri-sacárido. El oligosacárido pequeño puede ser un disacárido.
Las células humanas adecuadas que pueden usarse en el ensayo basado en células, incluyen cualquier célula humana que sea deficiente en la enzima lisosomal que se va someter a ensayo, de tal manera que pueda acumular los sustratos naturales para la enzima lisosomal. Por ejemplo, células que exhiban de manera natural una deficiencia completa (100 %) o parcial en cuanto a actividad, por ejemplo, puede usarse una reducción del 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más en cuanto a actividad. Pueden usarse células que expresen una enzima mutante con actividad disminuida, o células procedentes de pacientes que padecen una enfermedad por depósito lisosomal, por
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ejemplo, una mucopolisacaridosis. Pueden usarse células alteradas de manera recombinante para desactivar (knockout) o reducir la actividad enzimática lisosomal, por ejemplo, introduciendo una mutación en el gen codificante
o en su promotor o en otra región reguladora. Pueden usarse células tratadas para reducir la actividad enzimática lisosomal, por ejemplo, tratadas con ARN antisentido o ARNi para reducir la expresión enzimática.
Los expertos habituales en la técnica pueden seleccionar enzimas adecuadas que escindan (digieran) oligosacáridos pequeños de hidratos de carbono y que sean “específicas para” (es decir, digieran predominantemente) los sustratos naturales de la enzima lisosomal. Por ejemplo, para la detección de la actividad de GALNS o GLB1 (enzimas que degradan queratán sulfato) la enzima de la etapa (d) puede ser queratanasa II o cualquier enzima que actúe principalmente sobre queratán sulfato. Como otro ejemplo, para la detección de IDU, ARSB, IDS o GUSB (enzimas que degradan dermatán sulfato), la enzima de la etapa (d) puede ser condroitinasa ABC o cualquier enzima que actúe principalmente sobre dermatán sulfato. Como otro ejemplo, para la detección de IDU, IDS, SGHS, G6S o GUSB (enzimas que degradan heparán sulfato), la enzima de la etapa (d) puede ser heparanasa I o heparanasa II, o ambas. Como otro ejemplo más, para la detección de GAA (una enzima que degrada glicógeno), la enzima de la etapa (d) puede ser α-amilasa o cualquier enzima que actúe principalmente sobre glicógeno.
Este método basado en células puede tener una gran sensibilidad en la detección de actividad enzimática lisosomal. En algunas realizaciones, la actividad enzimática lisosomal puede ser detectable cuando la concentración de la enzima lisosomal es tan solo de aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 5 nM, o de aproximadamente 1 nM, o de aproximadamente 0,75 nM, o de aproximadamente 0,5 nM, o de aproximadamente 0,25 nM, o de aproximadamente 0,1 nM, o de aproximadamente 0,05 nM, o de aproximadamente 0,01 nM, o de aproximadamente 0,005 nM, o de aproximadamente 1 pM, o de aproximadamente 0,5 pM.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 describe la secuencia de nucleótidos del factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano (SEQ ID NO: 1).
La Figura 2 describe la secuencia de aminoácidos del factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano (SEQ ID NO: 2).
La Figura 3 describe la secuencia de nucleótidos de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana (SEQ ID NO: 3).
La Figura 4 describe la secuencia de aminoácidos de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana (SEQ ID NO: 4). En la GALNS procesada, el péptido señal de 26 aminoácidos del extremo N no está presente.
La Figura 5 representa la estructura y las características de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana procesada (SEQ ID NO: 5).
La Figura 6 muestra la expresión de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana de células G71S transfectadas conjuntamente con el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano y con vectores de expresión de GALNS humana. (A) Exploración del Clon G71S para GALNS activa en 96 pocillos. (B) Productividad de GALNS del Clon G71S en picogramos por célula por día.
La Figura 7 ilustra un esquema del controlador del biorreactor WAVE utilizado para la producción a gran escala de células G71 S que expresan la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana y variantes de la misma.
La Figura 8 muestra la estabilidad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada después de conservación a 4 °C (rombos) o a -70 °C (triángulos).
La Figura 9 muestra la purificación de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana por (A) cromatografía con azul sefarosa 6 de flujo rápido (FF, Fast Flow) seguida de (B) cromatografía Fractogel SE Hi-CAP. La pureza se determina mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE (a la izquierda) y mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-GALNS (IVA) (a la derecha).
La Figura 10 muestra la purificación de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF), cromatografía Fractogel SE Hi-Cap, cromatografía con Sefarosa FF quelante con Zn y cromatografía ToyoPearl Butyl 650M. La pureza se determina mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE (parte izquierda superior) y mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-GALNS (parte derecha superior), un anticuerpo anti-catepsina L (parte izquierda inferior) y un anti-CHOP (proteínas de células de ovario de hámster chino (parte derecha inferior).
La Figura 11 muestra los diagramas de flujo del proceso de la recuperación de la N-acetilgalactosamina-6sulfatasa (GALNS) humana y del proceso de purificación usado para el proceso en fase I/II (a la izquierda) y el
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proceso en fase III (a la derecha).
La Figura 12 muestra la comparación de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada de acuerdo con el proceso en fase I/II (carril 3) o el proceso en fase III (carril 5). Se separaron 5 microgramos (5 μg) de GALNS purificada por SDS-PAGE en condiciones reductoras, y el gel se tiñó con azul de Coomassie. El carril 1 corresponde a 15 μl de marcador SeeBlue Plus2. Los pesos moleculares en kDa se indican a la izquierda del gel teñido.
La Figura 13 muestra una disminución dependiente de la dosis en la cantidad de sustrato de dermatán sulfato observada en células GM01391 tratadas con IDU.
La Figura 14 muestra una disminución dependiente de la dosis en la cantidad de sustrato de dermatán sulfato observada en células GM00519 tratadas con ARSB.
La Figura 15 muestra la absorción de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana, no marcada (círculos)
o conjugada con A488 (cuadrados) o con A555 (triángulos), por sinoviocitos cultivados.
La Figura 16 muestra la estabilidad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada después de su conservación durante 1 o 2 meses a 5 °C, a 25 °C o a 40 °C, según se indica en una formulación que comprende HCl arginina (clorhidrato de arginina) 15 mM, HCl arginina 30 mM, NaCl 15 mM o NaCl 30 mM (paneles indicados como 51, 52, 54 o 55, respectivamente) a pH 5,0, pH 5,4 o pH 5,8 (paneles indicados como A, B o C, respectivamente). La estabilidad se midió por el porcentaje (%) de área pico de agregados de GALNS en la formulación después de su conservación, determinada por cromatografía en fase líquida de alto rendimiento – cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC).
La Figura 17 muestra la estabilidad de la actividad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada después de conservación durante 2 meses a 5 °C, a 25 °C o a 40 °C, como se indica en una formulación que comprende HCl arginina 15 mM, HCl arginina 30 mM, NaCl 15 mM o NaCl 30 mM (paneles indicados como 51, 52, 54 o 55, respectivamente) a pH 5,0, pH 5,4 o pH 5,8 (paneles indicados como A, B o C, respectivamente).
La Figura 18 muestra el perfil de glicosilación de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada después de conservación durante 2 meses a 5 °C, a 25 °C o a 40 °C, según se indica en una formulación que comprende HCl arginina 15 mM, HCl arginina 30 mM, NaCl 15 mM o NaCl 30 mM, a pH 5,0, pH 5,4 o pH 5,8, como se indica. El porcentaje de manosa 7 bis-fosforilada (BPM7) se midió mediante electroforesis capilar (CE) después de la digestión de la enzima GALNS con PNGasa F para escindir los oligosacáridos ligados a N de la asparagina. La referencia indica el porcentaje de BPM7 para un lote de referencia de GALNS conservado durante 2 meses a 5 °C, a 25 °C o a 40 °C, como se indica en una formulación que comprende tampón fosfato 100 mM.
La Figura 19 muestra la estabilidad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) human purificada después de conservación durante 2 meses a 5 °C, a 25 °C o a 40 °C, como se indica en una formulación que comprende HCl arginina 15 mM, HCl arginina 30 mM, NaCl 15 mM o NaCl 30 mM (paneles indicados como 51, 52, 54 o 55, respectivamente) a pH 5,0, pH 5,4 o pH 5,8 (paneles indicados como A, B o C, respectivamente). La estabilidad de la enzima GALNS se midió como porcentaje (%) de área pico de enzima GALNS en la formulación después de conservación, determinado por cromatografía en fase líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento de un método que reconcilia la necesidad de fabricar a gran escala enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes con la necesidad de obtener un producto de enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada, activa, que sea eficaz en lisosomas diana y que sea por tanto terapéuticamente eficaz.
La eficacia terapéutica de una preparación enzimática lisosomal depende del nivel de manosa-6-fosfato en esa preparación. El fosfato se añade a la glicoproteína diana mediante una modificación postraduccional en el retículo endoplasmático y Golgi precoz. Las enzimas lisosomales plegadas presentan un determinante terciario único que reconoce una enzima de modificación de oligosacáridos. El determinante está compuesto por un conjunto de lisinas específicamente separadas y que se encuentra en la mayoría de las enzimas lisosomales a pesar de la ausencia de homología de secuencia primaria. La enzima de modificación, la UDP-GlcNAc fosfotransferasa, se une al determinante de la proteína y añade GlcNAc-1-fosfato en la posición 6 de restos de manosa terminales en oligosacáridos próximos al sitio de unión; una segunda enzima, la fosfodiéster α-GlcNAcasa, escinde después el enlace GlcNAc-fosfato para dar un oligosacárido de manosa-6-fosfato terminal (Canfield et al., patente de Estados Unidos N.º. 6.537.785). La finalidad de la modificación de manosa -6-fosfato es desviar enzimas lisosomales de la ruta secretora a la ruta lisosomal dentro de la célula. La enzima portadora de manosa-6-fosfato está unida mediante
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En el presente documento se observa que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno”, “una”, “el”, “la” y “lo”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa.
Como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados adscritos a los mismos a menos que se especifique de otra manera.
“Variante alélica” se refiere a cualquiera de dos o más formas polimórficas de un gen que ocupa el mismo locus genético. Las variaciones alélicas surgen de manera natural a través de mutaciones, y pueden dar lugar a polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (es decir, sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Las “variantes alélicas” también se refieren a ADNc procedentes de transcritos de ARNm de variantes alélicas genéticas, así como las proteínas codificadas por estos.
“Amplificación” se refiere a cualquier medio mediante el cual se copia una secuencia de polinucleótidos y por tanto se expande en un número más grande de moléculas de polinucleótidos, por ejemplo, por transcripción inversa, reacción en cadena de polimerasa y reacción en cadena de ligasa.
Una primera secuencia es una “secuencia antisentido” con respecto a una segunda secuencia, si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia, se hibrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia.
“ADNc” se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, en forma mono o bicatenaria.
En el presente documento para describir las secuencias polinucleotídicas se usa la anotación convencional: el extremo a la izquierda de una secuencia de polinucleótidos monocatenaria es el extremo 5’; la dirección a la izquierda de una secuencia de polinucleótidos bicatenaria se denomina dirección 5’. La dirección de la adición de nucleótidos de 5’ a 3’ a transcritos de ARN naciente se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que la de un ARNm se denomina “cadena codificante”; las secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la de un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que se localizan en 5’ al extremo 5’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias aguas arriba”; las secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la del ARN y que se localizan en 3’ al extremo 3’ del transcrito de ARN codificante se denominan “secuencias aguas abajo”.
"Complementariedad" se refiere a la compatibilidad topológica o emparejamiento entre sí de superficies de interacción de dos polinucleótidos. Por tanto, las dos moléculas pueden describirse como complementarias, y además, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que es idéntica a la secuencia de polinucleótidos del compañero de unión polinucleotídico del segundo polinucleótido. Por tanto, el polinucleótido cuya secuencia 5’-TATAC-3’ es complementaria a un polinucleótido cuya secuencia es 5’-GTATA-3’. Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia si la complementariedad de secuencia con la secuencia de nucleótidos sujeto es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.
"Sustitución conservativa" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar. Cada uno de los seis grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), serina (S), treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), glutamina (Q);
4) Arginina (R), lisina (K);
5) Isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y
6) Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).
El término “fragmento”, cuando se usa en referencia a polipéptidos, se refiere a polipéptidos que son más cortos que el polipéptido de longitud completa debido al truncamiento en cualquiera del extremo N o extremo C de la proteína o en ambos, y/o a la deleción de una región o parte interna de la proteína. Los fragmentos de un polipéptido pueden generarse por métodos conocidos en la técnica.
El término “mutante”, cuando se usa en referencia a polipéptidos, se refiere a polipéptidos en los que se han sustituido uno o más aminoácidos de la proteína por un aminoácido diferente. La sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservativa, como se ha definido anteriormente, o puede ser una sustitución no conservativa. Pueden generarse polipéptidos mutantes por métodos conocidos en la técnica.
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método particular. Para las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes de la invención, la “pureza” puede determinarse sometiendo la preparación de la enzima sulfatasa a separación electroforética mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras seguido de tinción con azul de Coomassie o plata, o por separación cromatográfica mediante HPLC (por ejemplo, fase inversa (FI) C4, FI C3) o mediante cualquier otra separación cromatográfica, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y similar. Usando cualquiera de estos métodos, las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes purificadas de la invención tienen una pureza de al menos aproximadamente 80 %, o de al menos aproximadamente 85 %, preferentemente de al menos aproximadamente 90 %, más preferentemente de al menos aproximadamente 95 %, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 97 %, 98 % o 99 %.
El término “precursora" o la expresión "forma precursora" se refieren a la forma de la enzima sulfatasa lisosomal recombinante que segrega una célula de mamífero, es decir, que carece de la secuencia señal, aunque carece de determinadas modificaciones, por ejemplo, escisión interna de las proteínas, que normalmente se produce en el lisosoma. El término “madura”, la expresión “forma madura”, “procesada” o “forma procesada” se refiere a la forma de la enzima sulfatasa lisosomal recombinante que normalmente existe en el lisosoma. Para las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes de la invención, la abundancia relativa de “precursor” o “forma precursora” y “madura”, “forma madura”, “procesada” o “forma procesada” puede determinarse sometiendo la preparación de la enzima sulfatasa a una separación electroforética mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido de tinción con azul de Coomassie o plata, o por separación cromatográfica mediante HPLC (por ejemplo, fase inversa (FI) C4, FI C3) o mediante cualquier otra separación cromatográfica como por ejemplo, exclusión por tamaño (SEC) y similares,
o una combinación de separación electroforética y separación cromatográfica, por ejemplo, SDS-PAGE seguido de electroforesis capilar en gel (SDS-CGE). Usando estos métodos, las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes purificadas de la invención constan de al menos aproximadamente 65 %, 70 %, o 75 %, preferentemente de al menos aproximadamente 80 % u 85 %, más preferentemente de al menos aproximadamente 90 %, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 95 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 % de "precursor" o "forma precursora." Como alternativa, usando estos métodos, las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes purificadas de la invención constan de menos de aproximadamente 35 %, 30 % o 25 %, preferentemente de menos de aproximadamente 20 % o 15 %, preferentemente de menos de aproximadamente 10 %, e incluso más preferentemente de menos de aproximadamente 5 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1 % o 0,5 % de "madura," "forma madura," "procesada" o "forma procesada." En algunas realizaciones, solo se detecta el "precursor" o la "forma precursora" (es decir, la preparación de la enzima sulfatasa consta esencialmente de una sola banda detectable cuando se somete a SDS-PAGE en condiciones reductoras, o como se determina mediante SDS-CGE, o de un solo pico cuando se analiza mediante HPLC.
El término “idénticas” o la expresión porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o de restos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para obtener una correspondencia máxima, que se mide usando los algoritmos de comparación de secuencias indicados más adelante o mediante inspección visual.
“Enlazador” se refiere a una molécula que une otras dos moléculas, de manera covalente o a través de enlaces iónicos, van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia complementaria en el extremo 5’ y con otra secuencia complementaria en el extremo 3’, uniendo de este modo dos secuencias no complementarias.
“Bajo nivel de fosforilación” o “baja fosforilación” se refiere a una preparación de enzimas sulfatasas lisosomales en las que la absorción en células de fibroblasto tiene una concentración máxima media de más de 10 nM o la fracción de enzimas sulfatasas lisosomales que se unen a la columna de receptor de manosa-6-fosfato es menor de aproximadamente 25 %.
“De origen natural”, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo una secuencia de polipéptidos o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.
“Composición farmacéutica” se refiere a una composición adecuada para su uso farmacéutico en un sujeto animal incluyendo seres humanos y mamíferos. Una composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de una enzima sulfatasa lisosomal terapéutica y también comprende uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica abarca una composición que comprende uno o más principios activos, y uno o más principios inertes que constituyen el transportador, diluyente o excipiente, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, formación de complejos o agregación de cualquiera de dos o más de los principios, o de la disociación de uno o más de los principios, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los principios. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición fabricada mezclando una enzima sulfatasa lisosomal de la presente invención y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
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Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987. El método que se usa es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de
5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento emparejado de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo se alinea después con la siguiente secuencia más relacionada o grupo de secuencias alineadas. Dos grupos de secuencias se alinean mediante una extensión múltiple del alineamiento emparejado de dos secuencias individuales. El alineamiento final se realiza mediante una serie de alineamientos de emparejamiento progresivo. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y diseñando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos ponderados finales. Otro logaritmo que es útil para generar alineamientos múltiples de secuencias es Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994).
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990. El programa informático para realizar análisis BLAST se encuentra disponible al público en el National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica la identificación inicial de pares de secuencias de alta puntuación (HSPs, high scoring secuence pairs) identificando palabras W (del inglés words) de longitud corta en la secuencia a investigar, que bien coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. La T (del inglés threshold) se refiere al umbral de puntuación de la palabra próxima (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Estos aciertos de palabra próxima inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSPs más largos que las contenga. Los aciertos de palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como aumente la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos emparejados; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no emparejados; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye por la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa va de cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X, de algoritmo BLAST, determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por defecto una longitud de palabra
(W) de 11, una expectativa (E) de 10, M= 5, N= -4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 10915, 1989).
Además, para calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787, 1993). Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más baja (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produciría una coincidencia al azar entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más baja en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferentemente menor de aproximadamente 0,01 y más preferentemente menor de aproximadamente 0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente en cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por tanto, un polipéptido es en general sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos únicamente se diferencian por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe en el presente documento.
“Sustancialmente puro” o “aislado” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 % (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura significa que aproximadamente del 80 % al 90 % o más de la especie macromolecular que está presente en la composición es la especie de interés purificada. La especie objeto está purificada a homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) y la composición consta esencialmente de una sola especie macromolecular. Las especies de disolventes, moléculas pequeñas (<500 daltons), estabilizantes (por ejemplo, BSA) y especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares para los fines de esta definición. En algunas realizaciones, las enzimas sulfatasas lisosomales de la invención están sustancialmente puras o aisladas. En
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algunas realizaciones, las enzimas sulfatasas lisosomales de la invención están sustancialmente puras o aisladas con respecto a los materiales de partida macromoleculares utilizados en su síntesis. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención comprende una enzima sulfatasa lisosomal terapéutica aislada o sustancialmente purificada, mezclada con uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Un tratamiento “terapéutico” es un tratamiento que se administra a un sujeto que presenta signos o síntomas de patología con la finalidad de disminuir o eliminar esos signos o síntomas. Los signos o síntomas pueden ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionales, subjetivos u objetivos. Las enzimas sulfatasas lisosomales de la invención pueden proporcionarse como un tratamiento terapéutico o de diagnóstico.
“Índice terapéutico” se refiere al intervalo de dosis (cantidad y/o medición del tiempo) por encima de la cantidad terapéutica mínima y por debajo de una cantidad inaceptablemente tóxica.
“Tratamiento” se refiere a tratamiento profiláctico o tratamiento terapéutico o a tratamiento diagnóstico.
La expresión “forma de dosificación unitaria”, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para seres humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de enzima sulfatasa lisosomal de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado junto con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las especificaciones para las nuevas formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen de la enzima sulfatasa lisosomal particular empleada y del efecto que vaya a obtenerse, y de las propiedades farmacodinámicas asociadas a cada enzima sulfatasa lisosomal en el hospedador.
II. Producción de enzimas sulfatasas lisosomales
En el presente documento se desvela un nuevo método de producción de enzimas sulfatasas lisosomales altamente fosforiladas, activas, en cantidades que permitan el uso terapéutico de dichas enzimas. En general, el método puede caracterizar la transformación de una línea celular adecuada con el ADNc que codifica el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) o un fragmento, mutante, variante o derivado del mismo, biológicamente activo, y un ADNc que codifica enzimas sulfatasas lisosomales de longitud completa en cantidades que permitan el uso terapéutico de dichas enzimas. En general, el método caracteriza la transformación de una línea celular adecuada con el ADNc que codifica el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano o un fragmento, mutante, variante o derivado del mismo, biológicamente activo, y un ADNc que codifica la enzima sulfatasa lisosomal de longitud completa o un fragmento, mutante, variante o derivado del mismo biológicamente activo. Los expertos en la técnica pueden preparar construcciones de expresión distintas de las expresamente descritas en el presente documento, para la producción óptima de dichas enzimas sulfatasas lisosomales, en líneas celulares transfectadas adecuadas con las mismas. Además, los expertos pueden diseñar fácilmente fragmentos de ADNc que codifiquen fragmentos, mutantes, variantes o derivados biológicamente activos del SUMF1 de origen natural o enzimas sulfatasas lisosomales que posean la misma actividad biológica o similar que la de las enzimas de longitud completa de origen natural.
Células hospedadoras
Las células hospedadoras que se usan para producir las enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes puede ser líneas celulares deficientes en acidificación endosomal, caracterizadas por su capacidad para producir dichas enzimas sulfatasas lisosomales en cantidades que permitan el uso de la enzima desde el punto de vista terapéutico. En el presente documento se desvela la línea celular del grupo de complementación END3, denominada G71. En el presente documento se desvela una línea celular G71 que se ha adaptado para el crecimiento en cultivo en suspensión sin suero, denominada G71 S. En el presente documento también se desvelan derivados de las líneas celulares G71 y G71S que se han subclonado adicionalmente o que contienen diferentes plásmidos de expresión.
En el presente documento las células que contienen y expresan ADN o ARN que codifica una proteína recombinante se denominan células genéticamente modificadas. Las células de mamífero que contienen y expresan ADN o ARN que codifica la proteína recombinante se denominan células de mamífero genéticamente modificadas. La introducción del ADN o del ARN en las células es mediante un método de transfección conocido, tal como, por ejemplo, y sin limitación, electroporación, microinyección, bombardeo con microproyectiles, precipitación con fosfato de calcio, precipitación con fosfato de calcio modificado, tratamiento con lípidos catiónicos, fotoelectroporación, metodologías de fusión, transferencia mediada por receptores o precipitación con polibreno. Como alternativa, el ADN o el ARN pueden introducirse por infección con un vector vírico. Se describen métodos de producción de células, incluyendo células de mamífero, que expresan ADN o ARN que codifican una proteína recombinante, en las Solicitudes de Patente, en trámite junto con la presente, U.S. Ser. N.º 08/334,797, titulada “In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy”, de Richard F Selden, Douglas A. Treco y Michael W. Heartlein (presentada el 4 de noviembre de 1994); U.S. Ser. N.º 08/334,455, titulada “In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for Gene Therapy”, de Richard F Selden, Douglas A. Treco y Michael W. Heartlein (presentada el 4 de noviembre de 1994) y U.S. Ser. N.º 08/231,439, titulada “Targeted Introduction of DNA Into
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Caracterización de oligasacárido bis7. Se determinó la localización de oligasacáridos de manosa 7 bis-fosforilada (BPM7) en la GALNS. El resto de asparagina (Asn) en la posición 178 se N-glucosiló con BPM7. El resto de Asn en la posición 397 no se N-glucosiló con BPM7, pero se observó que eran predominantemente azúcares de tipo oligomanosa.
Afinidad con hidroxiapatita. Se desarrolló un modelo de hueso in vitro para determinar si la GALNS tenía la capacidad de dirigirse a hueso. Se preparó una suspensión de hidroxiapatita de calidad HTP-DNA 4 mg/ml (Bio-RAD) y se equilibró en DBS + BSA 50 g/ml, pH 7,4. La GALNS purificada, después de añadir BSA 50 g/ml, se desalinizó en DBS, pH 7,4. La GALNS desalinizada, a una concentración final de aproximadamente 2 mg/ml, se diluyó en serie en DBS + BSA 50 g/ml, pH 7,4, en una placa de 96 pocillos. Se transfirieron 50 l de la GALNS diluida en serie a una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore n.º SGVN2210, PVDF hidrófila, baja unión a proteína, tamaño de poro 22 m). Se añadieron 50 l de la suspensión de hidroxiapatita a los pocillos de la placa de filtro que contenía la GALNS diluida en serie y se incubó durante 1 hora a 37 ºC con una leve agitación. La placa se sometió a filtración por vacío.
Los sobrenadantes de la filtración al vacío se analizaron con respecto a la actividad enzimática de GALNS o por HPLC como se ha descrito anteriormente. La GALNS purificada tenía una Kd para hidroxiapatita de 3-4,0 M.
La línea celular G71S que expresaba el factor 1 de modificación de sulfatasas (SUMF1) humano produce enzimas sulfatasa lisosomales con cantidades más altas de activación (es decir, conversión del resto de cisteína en el sitio activo en C-formilglicina (FGly)).
Para determinar si la enzima sulfatasa lisosomal recombinante purificada (por ejemplo, la N-acetilgalactosamina-6sulfatasa (GALNS) humana) co-expresada con SUMF1 en células G71S mostraba una activación aumentada, se determinó la cantidad de conversión del resto de cisteína de sitio activo en FGly de la enzima sulfatasa lisosomal purificada.
Activación de GALNS. El porcentaje de activación, es decir, el porcentaje de conversión del resto de cisteína (Cys) del sitio activo en C-formilglicina (FGly) de la GALNS se determinó por LC/MS (TFA). El valor de TIC/1000 para Cys, FGly y Gly fue 39, 1840 y 183, respectivamente, indicando que aproximadamente el 90 % de la GALNS purificada estaba en una forma activa (es decir, FGly).
Resumen. La Tabla 9 muestra un resumen de la caracterización de la GALNS recombinante expresada en células del clon 4 de G71S. La Tabla 10 muestra un resumen de la caracterización de la GALNS recombinante expresada en células del clon C2 de G71S.
Tabla 9: Caracterización de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana producida a partir del clon 4 de G71S
- Categoría del ensayo
- GALNS
- Actividad específica: Actividad/Antígeno por ELISA
- 0,165 U/mg
- Actividad específica: Actividad/Proteína
- 7,7 U/mg
- Pureza por C4-RP
- > 95 % (6 lotes ensayados)
- Tamaño por SEC
- 115 kDa (homodímero)
- Estabilidad en suero a 37 ºC
- 217 Horas
- Absorción: Condrocitos
- 4,9 nM
- Absorción: Fibroblastos
- 5,0 nM
- Absorción: Osteoblastos
- 7,8 nM
- Productividad
- 1,3 pg/célula/día
- Título
- 4,2 mg/l
- Unión en placa al receptor de M6P
- 2.4 nM
- Unión en columna al receptor de M6P: % de unión
- 56 %
- Contenido de M6P por CE: % de carbohidrato total
- 29 %
- Contenido de M6P: mol M6P/mol GALNS
- 0,58
- Contenido de ácido siálico por CE
- 1 %
- Afinidad de hidroxiapatita
- 4 M
- Activación: % de FGly
- 90 %
50
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-
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