RS51778B - POSTUPAK ZA RADIOAKTIVNO OBELEŽAVANJE ANTITELA KONJUGOVANOG ZA HELATOR POMOĆU 111In - Google Patents

Abstract

Postupak za radioaktivno obeležavanje antitela konjugovanog za helator pomoću 111In, naznačen time što se dobija radioaktivno obeleženo antitelo u kliničkoj formulaciji koja može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljih koraka za prečišćavanje kojima se uklanja neugrađeni radioaktivni obeleživač, koji podrazumeva: (i) mešanje helator-konjugovanog antitela sa rastvorom koji sadrži 111In, gde je zapreminska količina rastvora koji sadrži 111 In 5,5 mCi podeljena sa koncentracijom radioaktivnosti u vreme obeležavanja, te dalje gde je pH vrednost rastvora koji sadrži 111In podešena na 3 do 6 pre nego što se pomeša sa helator-konjugovanim antitelom.(ii) inkubiranje mešavine 30 minuta da se dobije radioaktivno obeleženo antitelo kod koga je ugradnja radioaktivnog obeleživača veća od 95%, tako da radioaktivno obeleženo antitelo može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača; i(iii) razblaživanje obeleženog antitela do odgovarajuće koncentracije u puferu za formulaciju koji sadrži fiziološki rastvor soli, sredstvo za zaštitu od radioaktivnog zračenja, te nekonjugovani bifunkcionalni helator, kako bi se dobila klinička formulacija takva, da navedena klinička formulacija koja sadrži navedeno radioaktivno obeleženo antitelo može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljih koraka prečišćavanja kojima se uklanja neugrađeni radioaktivni obeleživač.Prijava sadrži još 8 zavisnih patentnih zahteva.

Description

STANJE TEHNIKE

1. Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se na ogled vezivanja antitela i kitove za radio-obeležavanje, preparacije liofiliziranih ćelija, reagense i protokole za testiranje kliničke efikasnosti terapeutskih antitela za tretman/oslikavanje tumora i tumorskih ćelija. Posebno, kitovi predmetnog pronalaska koriste se za pravljenje i procenu radioobeleženih konjugata antitela koji će se koristiti za tretman i oslikavanje B-ćelija tumora limfoma ciljanjem antigena BP35 ("CD20") površine B ćelija.

2. Stanje tehnike

Sve publikacije i patentne prijave ovde su inkorporirane referencama u istom obimu u kojem je svaka pojedinačna publikacija ili patentna prijava posebno i pojedinačno naznačena da bude inkorporirana referencom.

Imuni sistem kičmenjaka (na primer, primata, koji uključuju ljude, čovekolike majmune, majmune itd) sastoji se od brojnih organa i tipova ćelija koji su evoluirali da: pouzdano i posebno prepoznaju strane mikroorganizme ("antigen") koji napadaju kičmenjaka-domaćina; specifično se vežu za takve strane mikroorganizme; i eliminišu/unište takve strane mikroorganizme. Limfociti, kao i drugi tipovi ćelija, su kritični za imuni sitem. Limfociti se produkuju u timusu, slezini i koštanoj srži (odrasli) i predstavljaju 30% ukupnih belih krvnih ćelija prisutnih u cirkulatornom sistemu ljudi (adulti).

Postoje dve glavne sub-populacije limfocita: T ćelije i B ćelije. T ćelije su odgovorne za imunitet posredovan ćelijama, dok su B ćelije odgovorne za produkciju antitela (humoralni imunitet). Me|utim, T ćelije i B ćelije mogu se smatrati nezavisnim - u tipičnom imunom odgovoru, T ćelije se aktiviraju kada se T receptor veže za fragmente antigena koji su vezani za glikoproteine ("MHC") glavnog histokompatibilnog kompleksa na površini antigena prezentirane ćelije; takva aktivacija uzrokuje osloba|anje bioloških medijatora ("interleukina") koji, u osnovi, stimulišu B ćelije da se diferenciraju i produkuju antitelo ("imunoglobuline") protiv antigena.

Svaka B ćelija u domaćinu pokazuje različito antitelo na svojoj površini, tako da

će jedna B ćelija pokazati antitelo specifično za jedan antigen, dok će druga B ćelija pokazati antitelo specifično za različit antigen. Prema tome, B ćelije su vrlo raznovrsne i ta raznovrsnost je kritična za imuni sistem. Kod ljudi, svaka B ćelija produkuje ogroman broj molekula antitela (tj. oko 10<7>do 10<8>). Takva produkcija antitela najčešće prestaje (ili se potpuno smanjuje) kada se strani antigen neutralizuje. Povremeno, me|utim, proliferacija odre|enih B ćelija će se produžiti bez smanjivanja; takva proliferacija može rezultirati kancerom koji je označen kao "limfom B ćelija".

I T ćelije i B ćelije sadrže ćejiske površinske proteine koji se mogu upotrebiti kao 'markeri"

za razlikovanje i identifikovanje. Jedan takav humani marker B ćelija je humani B-

limfocit-ograničeni diferencirani antigen Bp35, označen kao "CD20". CD20 se izražava tokom ranog razvića pre-B ćelija i ostaje sve do diferencijacije plazma ćelija. Specifično, CD20 molekul može regulisati korak u procesu aktivacije koji je neophodan za inicijaciju ćelijskog ciklusa i dife-rencijaciju i obično se izkazuje na vrlo visokim nivoima neoplastičnih ("tumor") B ćelija. Po definiciji, CD20, prisutan je i u "normalnim" B ćelijama kao i u "malignim" B ćelijama, tj. onim B ćelijama čija nezaustavljena proliferacija može voditi do limfoma B ćelija. Tako CD20 površinski antigen ima potencijal da posluži kao kanditat za "ciljanje" limfoma B ćelija.

U osnovi, takvo ciljanje može se uopštiti na sledeći način: antitela specifična za CD20 površinski antigen B ćelija su, npr., injektirana pacijentu. Ta anti-CD20 antitela specifično se vezuju za CD20 antigen ćelijske površine (očigledno) i normalnih i malignih B ćelija; anti-CD20 antitelo vezano za CD20 površinski antigen može voditi do destrukcije i iscrpljivanja neo-plastičnih B ćelija. Sem toga, hemijski agens ili radioaktivni obeleživači koji imaju potencijal da uništavaju tumor mogu biti konjugovani za anti-CD20 antitelom tako da je agens specifično "isporučen" npr., neoplastičnim B ćelijama. Bez obzira na pristup, primarni cilj je da se uništi tumor: specifični pristup može biti određen posebnim anti-CD20 antitelom koje se upotrebljava i tako, dostupni pristupi ciljnom CD20 antigenu mogu značajno varirati.

Na primer, pokušaji takvog ciljanja CD20 površinskih antigena su izneseni. Objavljeno je da je mišje (miš) monoklonalno antitelo 1F5 (anti-CD20 antitelo) davano kontinuiranim intra-venskim infuzijama pacijentima sa limfomom B ćelija. Ekstremno visoki nivoi (>2 grama) 1F5 su prema izveštaju bili potrebni da iscrpe cirkulišuće tumorske ćelije, i rezultati su opisani kao "prolazni". Press i sar., "Monoklonalno antitelo 1F5 (anti-CD20) seroterapija humanog limfoma B ćelija," Blood 69/2:584-591 (1987).

Potencijalni problem sa tim pristupom je da monoklonalna antitela koja nisu čovekova (npr., mišja monoklonalna antitela) tipično nemaju ljudski efektor funkcionalnosti, tj., nisu u stanju da, inter alia, posreduju potpuno zavisan lizis ili liziranje humanih ciljnih ćelija putem ćelijske toksičnosti zavisne od antitela ili Fc-receptorima posredovane fagocitoze. Dalje, ne-humana monoklonalna antitela mogu biti prepoznata od strane humanog domaćina kao strani proteirj; prema tome, ponovljene injekcije takvih stranih antitela mogu voditi ka indukciji imunih odgovora koji vode štetnoj reakciji hiperosetljivosti. Za monoklonalna antitela na miševima-bazirana, često se spominju kao humani anti-mišji antitelo odgovor, ili "HAMA" odgovor. U dodatku, ta "strana" antitela mogu biti napadnuta od imunog sistema domaćina, tako da su u stvari neutralizovana pre nego što dostignu njihovo ciljno mesto.

Limfociti i ćelije limfoma su karakteristično senzitivne na radioterapiju. Prema tome, B ćelije malignosti su privlačni ciljevi za radioimunoterapiju (RIT) iz nekoliko razloga: lokalna emisija jonizujućeg zračenja radioobeleženih antitela može ubiti ćelije sa ili bez ciljnih antigena (npr., CD20) u neposrednoj blizini antitela vezanog za antigen; penetrirajuće zračenje, tj., beta emiteri, mogu ukloniti problem ograničenog pristupa antitelu u mnogo ili puno vaskularizovanim tumorima; i totalna količina antitela koja je potrebna može biti redukovana. Radionukleotid emituje radioaktivne čestice koje mogu oštetiti ćelijsku DNK do tačke gde ćelijski reper mehanizmi nisu u stanju da omoguće ćeliji da produži život: prema tome, ako su ciljne ćelije tumori, radioaktivno obeležavanje probitačno ubija ćelija tumora. Radioaktivna antitela, po definiciji, uključuju upotrebu radioaktivne supstance koja može imati potrebu za predostrožnošću i za pacijenta (tj., moguće transplantacije koštane srži) kao i za snabdevača zdravstvenim potrebama (tj., potreba prakse visokog stepena predostrožnosti kada se radi sa radioaktivnošću).

Prema tome, pristup poboljšanju mogućnosti mišjih monoklonalnih antitela da se deluje na tretman poremećaja B-ćelije bio je da se konjuguje radioaktivni obeleživač sa antitelom tako da obeleživač ili toksin bude lokalizovan na mestu tumora. Toksini (tj., hemoterapeutski agensi kao što su doksorubicin ili mitomicin C) su takođe bili konjugovani na antitela. Vidi, na primer, PCT objavljenu patentnu prijavu WO 92/07466 (objavljena 14. 5. 1992.).

"Himerna" antitela, tj., antitela koja sadrže delove iz dve ili više različitih vrsta (npr., miša i čoveka) razvijena su kao alternativa "konjugovanim" antitelima. Kreirana su miš/čovek himerna antitela i pokazano je da iskazuju karakteristike vezivanja roditeljskog mišijeg antitela i efektor funkcioniše u asocijaciji sa humanim konstantnim regionom. Vidi npr., Cabillv i sar., US patent br. 4,816,567; Shoemaker i sar., US patent 4,978,745; Beavers i sar., US patent 4,975,369; i Boss i sar., US patent 4,816,397 koji su svi inkorporirani ovde referencom. Generalno ta himerna antitela su konstruisana pripremanjem genomske biblioteke gena iz DNK ekstrahovane iz prethodno-postojećih mišjih hibridoma. Nishimura i sar. (1987) Cacncer Research 47:999. Biblio-teka se tada pregleda za varijabilne regionalne gene i iz teških i iz lakih lanaca koji pokazuju tačan put rearanžmana fragmenta. Klonirani geni varijabilnog regiona se zatim vezuju u ekspre-sioni vektor koji sadrži klonirane kasete odgovarajućih teških ili lakih lanaca humanog gena konstantnog regiona. Himerni geni se zatim eksprimiraju u ćelijskoj liniji koja se izabere, obično liniji mišjeg mieloma.

Na primer, Liu, A.V. i sar., "Produkcija himernih monoklonalnih antitelaza CD20 miš-čovek sa potentnom Fc-zavisnom biološkom aktivnošću", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), opisuje himerno antitelo miš/čovek usmereno protiv CD20 antigena. Vidi takođe, PCT publikaciju br. WO 88/04936. Međutim, nema informacije u vezi sa mogućnosti, efikasnosti ili praktičnosti upotrebe Liu-ovih himernih antitela za tretman poremećaja B ćelije u referenci.

Zabeleženo je da funkcionalni oglediin vitro(npr., lizis zavistan od komplementa ("CDC"); ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela ("ADCC"), itd) ne mogu u potpunosti predvi-deti sposobnost bilo kog antitela dain vivouništi ili iscrpe ciljne ćelije koje pokazuju specifičan antigen. Vidi, na primer, Robinson, R.D. i sar., "Himerna miš-čovek anti-karcinom antitela koja posreduju u različitim ćelijskim antitumorskim biološkim aktivnostima," Hum. Antibod, Hvbridomas, 2:84-93 (1991) (himerično miš-čovek antitelo ima nedetektabilnu ADCC aktivnost). Prema tome, potencijalna terapeutska efikasnost antitela može se stvarno proceniti samoin vivoeksperimentima.

Do tog kraja, prijave koje zajedno egzistiraju br. 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967, ovde inkorporirane referencom u potpunosti, otkrivaju radioobeležene anti-CD20 konjugate za dijagnostičko "oslikavanje" B ćelija tumora limfoma pre davanja terapeutskih antitela. "ln2B8" konjugat sadrži monoklonalna antitela miša, 2B8, antigen CD20 specifičan za čoveka, koji je pričvršćen za lndijum[111] (<111>ln) preko bifunkcionalnog helatora, tj., MX-DTPA (dietilentria-minpentasirćetna kiselina), koji sadrži mešavinu 1:1 1-izotiocijanatobenzil-3-metil-DTPA i 1-metil-3-izotiocijanatobenzil-DTPA. Indijum[111] je selekcionisan kao dijagnostički radionukleotid zato što emituje gama zračenje i nalazi upotrebu kao agens oslikavanja.

Patenti koji se odnose na helatore i konjugate helatora poznati su u praksi. Na primer, US patent br. 4,831,175 Gansow-a je usmeren na polisupstituisane helate dietilentriaminpenta-sirćetne kiseline i konjugate proteina koji sadrže isto i metode za njihovo pripremanje. US patenti br. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850 i 5,124,471 Gansow-a takođe se odnosi na polisupstituisane DTPA helate. Ti patenti su ovde u celini inkorporirani referencama.

Specifični bifunkcionalni helator upotrebljen da olakša helaciju u prijavama br. 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967 je odabran zato što poseduje visok afinitet za trivalentne metale i obezbeđuje povećane odnose tumor-prema-ne tumor, smanjeno uzimanje u kostima, i većein vivozadržavanje radionukleotida na ciljnim mestima, tj., tumorskim mestima limfoma B-ćelija. Međutim, drugi bifunkcionalni helatori su poznati u praksi i mogu biti takođe korisni za terapiju tumora.

Takođe u prijavama br. 08/475,813, 08/475.815 i 08/478,967 opisana su radioobeležena terapeutska antitela za ciljanje i razaranje B ćelija limfoma i ćelija tumora. Posebno, Y2B8 konjugat sadrže isto anti-humano CD20 mišje monoklonalno antitelo, 2B8, pričvršćeno za itrijum-[90] (<W>Y) preko istog bifunkcionalnog helatora. Taj radionukleotid je odabran za terapiju iz nekoliko razloga. 64 časovni poluživot<M>Y je dovoljno dug da omogući akumulaciju antitela od strane tumora i za razliku od<131>1, on je čisti beta emiter visoke energije bez pratećeg gama zračenja u njegovom raspadanju, sa rasponom od 100 do 1000 ćelija u prečniku. Minimalna količina radijacije koja prodire omogućuje davanje izvan pacijenta ^V-obeleženih antitela. Dalje, nije neophodna internalizacija obeleženog antitela radi ubijanja ćelija, i lokalna emisija jonizujućeg zračenja mora biti letalna za susedne tumorske ćelije kojima nedostaje ciljni antigen.

Zato što je<X>Yradionukleotid bio pričvršćen za 2B8 antitelo koristeći isti bifunkcionalni helator molekul MX-DTPA, Y2B8 konjugat ima isu prednost diskutovanu prethodno, npr., povećano ostajanje radionukleotida na ciljnom mestu (tumor). Međutim, za razliku od,<11>ln, on ne može biti upotrebljen za svrhe oslikavanja zbog nedostatka gama zračenja asociranog sa njim. Tako, dijagnostički "oslikavajući" radionukleotid kao što je,<11>ln može biti upotrebljen za određivanje lokacije i relativne veličine tumora pre i/ili nakon davanja terapeutskog himernog ili ^-obeleženog antitela sa ciljem redukcije tumora. Dodatno, indijum-obeleženo antitelo omogućuje da budu napravljene doziometrijske procene.

U zavisnosti od nameravane upotrebe antitela, tj., kao dijagnostičkog ili terapeutskog agensa, u praksi su poznati i upotrebljeni i drugi radioobeleživač za slične potrebe. Na primer, radionukleotidi koji su bili korišćeni u kliničkoj dijagnozi uključuju<1>311, ,2SI,<123>l, "TC,<67>Ga kao i<1>,<1>ln. Antitela su takođe bila obeležena sa raznovrsnim radionukllidima za potencijalnu upotrebu u ciljanoj imunoterapiji (Peirersz i sar. (1987) Upotreba konjugata monoklonalnih antitela za di-jagnozu i tretman kancera. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125). Ti radionuklidi uključuju<188>Re i<186>Re kao i* °Y,i u manjem obimu199Au i<67>Cu. I-[131] je takođe upotrebljavan u terapeutske svrhe. US patent br. 5,460,785 obezbeđuje listing takvih radioizotopa i ovde je inkorporiran referencom.

Kao što je izneseno u prijavama koje zajednički egzistiraju 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967 davanje radioobeleženog Y2B8 konjugata, kao i neobeleženog himeričnog anti-CD20 antitela, rezultiralo je značajnom redukcijom tumora kod miševa koji su imali limfoblastični tumor B ćelije. Štaviše, tamo izneseni humani klinički trijali pokazali su značajno siromašenje B ćelija kod limfoma pacijenata infuzovanih sa himeričnim anti-CD20 antitelom. U stvari, nedavno je hi-merični 2B8 objavljen kao prvo nacionalno FDA-potvrđeno anti-kancer monoklonalno antitelo pod imenom Rituxan®. Prema tome, za najmanje jedno himerno anti-CD20 antitelo bilo je pokazano da demonstrira terapeutsku efikasnost u tretmanu limfoma B ćelije.

U dodatku US prijava br. 08/475,813, inkorporirana referencom, otkriva postupno davanje Rituxan-a®, himernog anti-CD20, sa oba ili bilo sa indijum-obeleženim ili itrijum-obeleženim mišjim monoklonalnim antitelom. I ako radioobeležena antitela korišćena u tim kombinovanim terapijama su mišja antitela, inicijalni tretman sa himeričnim anti-CD20 dovoljno osiromašuje populaciju B ćelija tako da je zapažen HAMA odgovor, potpomažući kombinovani terapeutski i dijagnostički način.

Prema tome, u tom kontekstu kombinovane imunoterapije, mišja antitela mogu naći određenu upotrebu kao dijagnostički reagens. Štaviše, u US patentnoj prijavi 08/475,813 je pokazano da terapeutski efektivna doza itrijum-obeleženog anti-CD20 antitela praćena davanjem Rituxan-a® je dovoljno da (a) očisti sve preostale B ćelije u perifernoj krvi koje nisu očišćene sa himeričnim anti-CD20 antitelom; (b) započne trošenje B ćelije iz limfnih čvorova; ili (c) započne trošenje B ćelije iz drugih tkiva.

Na taj način, konjugacija radiobeleživača za terapeutska kancer antitela obezbeđuje vredno kliničko oruđe koje se može upotrebiti da se proceni potencijalna terapeutska efikasnost takvih antitela, kreiraju dijagnostički reagensi da se prati napredak tretmana, i dodatni izmišljeni terapeutski reagensi koji se mogu upotrebiti da pojačaju početni tumor-ubijajući potencijal himernog antitela. Uzevši u obzir da je dokazana efikasnost ant-CD20 antitela u tretmanu ne-Hodgkin-ovog limfoma i poznata senzitivnost limfocita na radioaktivnost, bila bi jako probitačna da takva terapeutska antitela postanu komercijalno dostupna u obliku kita pomoću kojeg oni mogu biti odmah modifikovani sa radioobeleživačima i dati direktno pacijentu u kliničkom okruženju.

I ako postoji mnogo metoda i reagenasa za ostvarivanje radioobeležavanja antitela, ono što nedostaje u praksi je prigodan nosač za stavljanje tih reagenasa u kliničkom okruženju, na način da oni mogu lako biti produkovani i davani pacijentu pre značajnog raspadanja radio-obeleživača ili značajne destrukcije antitela zbog prisustva radiobeleživača. Nedostatak tako po-godnih načina da se komercijalizuje ova vredna tehnologija može biti zbog slabog inkorporiranja efektivnosti pokazanih nekim od poznatih protokola za obeležavanje i zbog naknadne potrebe za kolonskim prečišćavanjem reagensa nakon procedure radioobeležavanja. Odlaganje u razvitku takvih kitova može delom biti i zbog prethodnog nedostatka dostupnosti čistih komercijalnih radioizotopa koji se mogu upotrebiti da generišu efektivno obeležene produkte uz odsustvo naknadnog prečišćavanja. Alternativno, možda je razlog što su takvi kitovi generalno nedostupni stvarni nedostatak antitela koja bi bila u stanju da postignu bilo potvrdu ili efikasnost koju je dostigao Rituxan® za tretman limfoma kod humanih pacijenata.

Na primer, kako je diskutovano u US patentu 4,636,380, inkorporiranom ovde sa referencom, generalno se verovalo među naučnicima da bi za radiofarmaceutik da bi dostigla kliničku upotrebu bilo potrebno da pretrpi dugačak i tegoban proces separacije i prečišćavanja. Zaista, injiciranje nevezanih radiobeleživača pacijentu nebi bilo poželjno. Potreba za daljim koracima prečišćavanja čini nemogućim proces radioobeležavanja antitela u kliničkom okruženju, posebno za doktore koji nemaju ni opremu niti vreme za prečišćavanje sopstvenih terapeutika.

Dalje, radioobeleženi proteini mogu biti bitno nestabilni, posebno oni obeleženi sa radio-litičkim izotopima kao što je^ V,koji ima tendenciju da uzrokuje oštećenja antitela kad je duže pričvršćen u neposrednoj blizini. I obrnuto, takva radioliza uzrokuje nepouzdanu efektivnost terapeutika zbog gubitka radiobeleživača i/ili redukuje vezivanje na ciljni antigen i može voditi neželjenim imunim odgovorima usmerenim na denaturisani protein. Ipak bez opreme za obeležavanje i prečišćavanje antitela na mestu, kliničari nisu imali izbora već da naruče terapeutska antitela već obeležena, ili bi ih obeležili izvan mesta na odgovarajućoj opremi i transportovali nakon obeležavanja za davanje pacijentu. Sve takve manipulacije su dodavale jako mnogo vremena periodu između obeležavanja i davanja, doprinoseći tako nestabilnosti terapeutika dok su u efektu smanjivali mogućnosti radioobeleženih kitova u kliničkom okruženju.

Drugi su neuspešno pokušavali da razviju kitove sa radiobeleženim antiteiima koji bi bili dovoljno stručni da prethode odvojenom koraku prečišćavanja antitela. Na primer, Cvtogen je nedavno lansirao komercijalni kit za radioobeležavanje mišjeg monoklonalnog antitela usmerenog na glikoprotein TAG-72 asociran sa tumorom. Međutim Cytogen-ovo antitelo je posebno nepo-godno za formulisanje kita zbog tendencije da razvije čestice tokom čuvanja koje se kasnije moraju ukloniti dodatnim korakom filtriranja. Štaviše, Cytogen-ovo antitelo uzrokovalo je štetne reakcije kod pacijenata zbog HAMA odgovora.

Drugi su tvrdili da su razvili protokole za radioobeležavanje koji će biti pogodni za formiranje kita u tome što odvojeni korak prečišćavanja neće biti potreban (Richardson i sar. (1987) Optimizacija i dozirana produkcija DTPA-obeleženog antitela kita za rutinsku upoptrebu u 111 In imunoscintografiji. Nuc. Med. Commun. 9: 347-356; Chinol i Hnatovvich (1987) Generator-produkovan itrijum-[90] za radioimunoterapiju. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470). Međutim, takvi protokoli nisu bili u stanju da dostignu nivoe inkorporacije koje su predmetni istraživači dostigli koristeći protokole ovde otkrivene, koji su rezultirali efektivnošću inkorporacije od najmanje 95%. Takvi nivoi inkorporacije obezbeđuju dodatnu korist povećane sigurnosti, u tome što gotovo neće biti nevezanog obeleživača injiciranog pacijentu kao rezultat niske radioinkorporacije.

Protokoli uključeni u kitove predmetnog pronalaska omogućuju brzo obelečavanje koje može biti postignuto za otprilike pola časa ili za toliko malo kao što je pet minuta u zavisnosti od obeleživača. Štaviše, kit protokoli predmetnog pronalaska imaju efikasnost obeležavanja preko 95% prevazilazeći tako potrebu daljeg prečišćavanja. Prevazilazeći potrebu daljeg prečišćavanja, polu-život radiobeleživača i integritet antitela rezervisani su za terapeutske svrhe za koje su obeleženi.

Predmetna prijava otkriva pogodne kitove i metode kojima dijagnostička i terapeutska antitela mogu biti radioobeležena i data pacijentu na ponovljiv, odgovarajući i prigodan način. Kitovi predmetnog pronalaska transformišu proces radioobeležavanja antitela u standardnoj proceduri bez probelma i bez briga, koja značajno olakšava protokole tretmana pacijenta. Predmetni kit obezbeđuje prednosti u odnosu na prethodnu praksu u tome što su određeni opti-malni parametri za obeležavanje i davanje terapeutika ili dijagnostika, redukujući tako cenu do-biti. Pošto ovde opisani kitovi obezbeđuju optimum parametara u skladu sa određenim obeleživačem, upotreba kita dizajniranog za određeni obeleživač takođe će minimizovati kanibali-zaciju, tj., onu koja se dešava kada se koristi neodgovarajući kit za određeni obeleživač. Izbegavanje kanibalizacije u povratku takođe obezbeđuje optimum efikasnosti obeležavanja. Štaviše, protokoli i sterilni, ingradijenti bez pirogena uključeni sa svakim kitom čine da proces bude mnogo prijatniji za korisnika, pošto su otklonjeni sterilisanje, testiranje pirogena i prečišćavanje nakon obeležavanja.

3. Sadržaj pronalaska

Predmetni pronalazak uključuje kitove za radioobeležavanje dijagnostičkog ili terapeutskog antitela pre davanja pacijentu sadržeći najmanje (i) vijal koji sadrži helator-konjugovano antitelo, (ii) vijal koji sadrži formulaciju pufera za stabilizovanje i davanje radioobeleženog anti-tela i (iii) uputstva za radiobeležavanje antitela, gde su pomenuti vijali isporučeni u takvoj količini i takvoj koncentraciji da kada se kombinuju sa radioobeleživačem dovoljne čistoće i aktivnosti u skladu sa uputstvima za kit, nije potrebno dalje prečišćavanje obeleženog antitela pre davanja pomenutom pacijentu. Štaviše, kada je obeleženo u skladu sa instrukcijama za kit i sa radioizotopom dovoljne čistoće, inkorporacija takvog izotopa može dostići nivoe više od 95%, i čak tako visoke kao što je 98% ili više.

Antitelo koje se uključuje u kit je najpoželjnije anti-CD20 antitelo. Antitelo se isporučuje u obliku pomoću kojeg je pričvršćeno za bifunkcionalni helator. Preferentno, antitelo je konjugovano na MX-DTPA, ali mogu se upotrebiti drugi helatori kao što su fenil- ili benzil-konjugati DTPA, cikloheksil-DTPA, EDTA derivati i DOTA. Prema predmetnom pronalasku helator može biti bilo koji helator koji je najmanje bifunkcionalan, tj., koji poseduje najmanje dva mesta vezivanja (najmanje jedno mesto za helatiranje metalik jona i najmanje jedno mesto za vezivanje za proteinski veznik).

U zavisnosti od antitela koje se upotrebljava, konjugovano antitelo je tipično isporučeno u koncentarciji od 0.5 do 30 mg/mi, još poželjnije 2 mg/ml. Zapremina konjugovanog antitela zavisiće od koncentracije i količine potrebne za optimalno obeležavanje u zavisnosti od radio-beleživača. Međutim, konjugovano antitelo treba da bude isporučeno u takvoj zapremini i koncentraciji da se cela zapremina doda u reakcioni vijal koristeći sterilnu siringu i aseptične tehnike. To će omogućiti povećanu ponovljivost i laku upotrebu. Svi reagensi i kitovi ovde obelodanjeni su sterilni i bez pirogena i posebno dizajnirani za jednostavnost i brzinu u davanju direktno, od testiranja antitela do davanja. Sa nekim obeleživačima ne postoji potreba za testiranje efikasnosti obeležavanja.

Posebno probitačna komponenta kita je formulacija pufera za stabilizaciju protiv efekata radiolize i davanje radioobeleženih konjugovanih antitela pacijentu. Formulacioni pufer je farmaceutski prihvatljiv nosač koji služi i kao razređivač za obeleženo antitelo i pufer za davanje. I ako bilo koji farmaceutski prihvatljiv razređivač može biti upotrebljen za davanje terapeutskih ili dijagnostičkih antitela pacijentu, formulacioni pufer predmetnog pronalaska je posebno pogodan za davanje radioobeleženih antitela..

Na primer, formulacioni pufer predmetnog pronalaska sadrži radioprotektant kao što je humani serum albumin (HSA) ili askorbat, koji umanjuje radiolizu zahvaljujući itrijumu i u manjem stepenu indijumu. U praksi su poznati drugi radioprotektanti, koji takođe mogu biti upotrebljeni u formulaciji pufera predmetnog pronalaska, tj., čistači slobodnih radikala (fenol, sulfiti, glutation, cistein, gentisična kiselina, mikotinska kiselina, askorbil palmitat, HOP(:0)H2, glicerol, natrijum formaldehid sulfoksilat, Na2S205, Na2S203i S02itd.).

Treba zabeležiti da, dok su radioprotektanti generalno upotrebljeni u formulaciji pufera da zaštite antitelo od radiolize, može biti moguće pogoditi dalju zaštitu uključivanjem radioprote-ktanata u reakcioni pufer takođe. Generalno to nije bilo urađeno ranije, tj., sa HSA zahvaljujući prisustvu metala koji bi interferirali sa procesom obeležavanja. Međutim, može biti moguće da se "očisti" HSA korišćenjem helatirajuće smole tako da može biti uključen u reakcioni pufe takođe. Kod askorbata ili drugih radioprotektanta može takođe postojati potreba da budu tretirani da se uklone kontaminirajući metali.

Formulacioni pufer predmetnog pronalaska takođe sadrži višak nekonjugovanog helatora. Svrha uključivanja nekonjugovanog helatora je što taj helator služi da očisti bilo koji ne-proteinski vezani radioobeleživač kod pacjenta i deluje na ekskreciju radioobeleživača redukujući tako uzimanje "kost-zahtevnih" izotopa, tj.,<90>Y,od kostiju pacjenta. Na primer, kada je antitelo kita konjugovano na DTPA helator, višak DTPA ili bilo koji drugi helator može biti uključen u formulaciju pufera. Formacioni pufer je takođe preferentno isporučen u zapremini tako da su potpuni sadržaji preneti u reakcioni vijal. Kao što je gore diskutovano, to rezultira u povećanoj lakoći upotrebe i ponovljivosti zato što ne moraju da se mere i prenose određene zapremine.

Poželjna formulacija pufera sadrži fosfatni pufer ili fiziološku so, humani serum albumin i DTPA. Humani serum albumin je poželjno u koncentraciji od oko 1 do 25% (w/v) i još poželjnije u koncentraciji od oko 7.5% (w/v). Koncentracija DTPA je poželjna oko 1 mM. Askorbat može biti upotrebljn kao alternativa humanom serum albuminu, i tipično se koristi u koncentraciji od oko 1 do 100 mg/ml. Premda se može upotrebiti širi raspon koncentracija bez ugrožavanja sigurnosti pacijenta.

Antitelo kita za radioobeležavanje se lako obeležava sa izabranim radioizotopom preko bifunkcionalnog helatora prema metodima predmetnog pronalaska. Radi dalje jednostavnosti u tom smislu, kit predmetnog pronalaska može takođe sadržti vial koji sadrži pufer za doterivanje pH rastvora radioizotopa i sterilni stakleni reakcioni vijal za obavijanje obeležavanja i nakon toga za reseuspendovanje finalnog radioobeleženog antitela u formulacionom puferu. Reakcioni vijal od 10 ml je obično dovoljan, ali vijali koji su u stanju da nose 5 do 20 mililitara mogu se takođe upotrebiti. Pufer je preferentno rastvor natrijum acetat sa malo metala u koncentraciji od 10 do 1000 mM, najpoželjnije 50 mM.

Specifični kit predmetnog pronalaska sadrži MX-DTPA konjugovano antitelo, 2B8-MX-DTPA. 2B8 je anti-CD20 antitelo za koje je pokazano da deluje na iscrpljivanje B ćelija nakon davanja pacijentima sa limfomom. Međutim, mora da bude očigledno onima sa iskustvom u praksi da kit za radioobeležavanje predmetnog pronalaska može biti optimizovan za radio-beležavanje drugih anti-CD20 antitela, ili bilo kojeg drugog antitela koje je bilo konjugovano za DTPA ili drugi polivalentni helator. Preferirani kit predmetnog pronalaska može sadržati najmanje (i) vijal koji sadrži MX-DTPA konjugovano 2B8 antitelo, bilo u rastvoru ili liofilizirano (zahtevajući rekonstituciju); i (ii) vijal koji sadrži formulacioni pufer za davanje radiobeleženog antitela pacijentu. Preferirani kit će takođe sadržati (iii) pufer za doterivanje pH izotopa, i (iv) reakcioni vijal. Alternativno, i još poželjnije", pufer je isporučen u reakcionom vijalu eliminišući tako korake merenja i prenošenja pufera i povećavajući jednostavnost, konzistentnost i sterilnost komponenti kita. Međutim, zamišljeni su i drugi oblici, tj. kako se pufer dodaje vijalu izotopa prvo, i puferizovani izotop se zatim prenosi u reakcioni vijal. U ovom slučaju, reakcioni vijal može biti isporučen sa potrebnom zapreminom antitela. Alternativno, vial izotop/pufer može biti napravljen dovoljno velikim da primi dodavanje konjugata antitela, tj., direktno u vijal za isporučivanje. To bi elimini-salo potrebu za rakcionim vijalom.

Kao što je gore opisano, uključena je druga poželjna konfiguracija kita u kojoj sam reakcioni vijal sadrži potrebne zapremine konjugovanog antitela (tj., 1 ili 1.5 ml_ za<111>ln i<90>Y respektivno). Antitelo može biti isporučeno u puferu koji obezbeđuje odgovarajući pH za radio-obeležavanje u skaldu sa specifičnim željenim izotopom (tj., pH 3-6 za<111>ln pH 3-5 za* °Y).Mogu biti upotrebljeni različiti puferi u zavisnosti od izotopa (tj., natrijum acetat za<X>Y, natrijum citrat za<111>ln). pH i sastav pufera mogu takođe varirati u zavisnosti od prirode vezujućih veznika koji treba da se obeleže (tj., peptidi za obeležavanje mogu dozvoliti da se upotrebi pH < 3). U biti zatim, izotop će biti prenesen direktno u reakcioni vijal, kao i formulacioni pufer. Ograničavajuća upotreba kita do dva koraka prenošenja će dodatno povećati ponovljivost i jednostavnost i dalje smanjiti šansu za kontaminaciju sterilnosti tokom rukovanja sa kompo-nentama kita.

Kitovi za radioobeležavanje predmetnog pronalaska mogu dalje sadržati vijal radioizotopa, ili se radioizotop može naručiti odvojeno od odgovarajućeg snabdevača. Preferirani radioizotopi predmetnog pronalaska su<111>ln hlorid i WY hlorid u HCI i ako obelodanjeni metodi nisu ograničeni na te izotope. U praksi su poznati i drugi radionukleotidi koji su bili upotrebljeni za primene oslikavanja, kao što je opisano u US patentima br. 4,634,586, 5,460,785 i 5,766,571, koji su ovde inkorporirani referencom. Indijum-[111] je posebno probitačan za oslikavanje B ćelija tumora i takođe su beta emiteri kao što je<X>Y posebno korisni kao radioterapeutski agensi. Premda mogu biti upotrebljeni drugi radioizotopi pogodni za ovu ili druge svrhe, tj., alfa emiteri, mogu biti upotrebljeni u zavisnosti od helatora upotrebljenog za konjugaciju antitela.

S obzirom na dokazanu efektivnost kombinovanih terapeutskih načina obelodanjenih u US patentnoj prijavi br. 08/475,813, dalji oblik kita će takođe uključivati odvojeni vijal za himerno antitelo, tj., Rituxan®, da bi se davao pre ili nakon radioobeleženog anti-CD20 antitela. Kada se himerično antitelo daje pre radioobeleženog antitela, HAMA odgovor, koji se može generalno dogoditi u odgovoru na davanje mišjeg anti-CD20 antitela, može biti značajno smanjen, povećavajući tako terapeutsku korisnost radioobeleženih mišjih antitela. Štaviše, kada se upotrebi himerno anti-CD20 da se očiste cirkulišuće B ćelije, dijagnostičke slike koje se nakon toga do-bijaju sa "<1>ln-obeleženim antitelima mogu biti čistije.

Treba takođe da bude očigledno da i dijagnostičko i radiobeležavajuće antitelo i terapeutski radiobeleženo antitelo može biti upotrebljeno zajedno u kombinovanom terapeutskom režimu. U tom pogledu dijagnostičko antitelo može se upotrebiti bilo pre ili nakon terapeutskog antitela da se učini vidljivom veličina tumora pre i posle tretmana. U tom slučaju, kit predmetnog pronalaska može sadržati odvojene, možda bojom-kodirane, puferske vijale formulisane specifično prema zahtevanom optimalnom pH za radioobeležavanje antitela sa specifičnim radioizotopima koji treba da se koriste. Takav sistem će potvrditi da je upotrebljen odgovarajući pufer za svaki obeleživač i omogućiće kliničaru istu lakoću radioobeležavanja dva antitela kao da su nabavljena dva kita. Efekt takvog kita je da kombinuje komponente iz dva kita za radio-obeležavanje u jedan.

Komponente kita za radioobeležavanje predmetnog pronalaska su isporučene u odgo-varajućoj koncentraciji i pH<*>tako da se sterilnost lako održava pre davanja antitela i potreba za dodatnim puferima ili nosiocima je mala. Međutim, onima sa iskustvom u praksi mora biti očigledno da neki reagensi mogu biti pripremljeni, sterilisani i testirani na sterilnost u okruženju. Prema tome, varijacije kita predmetnog pronalaska zamišljene su u zavisnosti od budžeta i preferenci korisnika.

Kit za radiobeležavanje predmetnog pronalaska može se koristiti u metodu za radio-obeležavanje helator-konjugovanog antitela za davanje pacijentu. U skladu sa predmetnim pronalaskom takav metod sadrži, generalno, (i) mešanje helator-konjugovanog antitela sa rastvorom koji sadrži radioizotop; (ii) jnkubiranje mešavine tokom odgovarajućeg vremena na odgo-varajućoj temperaturi; i (iii) rastvaranje obeleženog antitela do odgovarajuće koncentracije u formulacionom puferu, tako da radioobeleženo antitelo može biti direktno davano pacijentu bez daljeg prečišćavanja.

Najpoželjnije antitelo je anti-CD20 antitelo i posebno, anti-CD20 antitelo može biti 2B8. Antitelo može biti konjugovano na bilo koji odgovarajući helator, tj., MX-DTPA, CHX-DTPA, fenil-ili benzil-DTPA, DOTA, EDTA derivati itd. Poželjan je MX-DTPA. Metodi za pravljenje konjugata antitela poznati su u praksi (Kozak i sar. (1989); Mirzadeh i sar. (1990), Brachbiel i sar. (1986).

Predmetni istraživači pronašli su da metod za radioobeležavanje helator-konjugovanog antitela funkcioniše najbolje kada se rastvor koji sadrži radioobeieživač dotera na pH od između 3.0 i 6.0 i još preferentnije do oko 4.2 pre nego što se pomeša sa helator-konjugovanim antitelom. Natrijum acetat sa malim sadržajem metala je posebno poželjan za doterivanje pH i ako mogu biti upotrebljeni drugi puferi. Poželjno je da je natrijum acetat u koncentraciji od između oko 10 i 1000 mM i još poželjnije 50 mM.

Kada je radioizotop 111ln hlorid, zapreminska količina<t11>ln hlorida koja treba da se upotrebi da se pripremi pojedinačna doza za davanje obični je oko 5.5 mCi podeljena sa koncentracijom radioaktivnosti u vreme obeležavanja. Za davanje pacijentu, uobičajena dijagnostička doza<111>ln je oko 2 do 10 mCi. Količina natrijum acetata upotrebljenog za doterivanje pH varira u zavisnosti od koncentracije natrijum acetata i rastvora nosača izotopa, i može prema tome biti vrlo široka. Kada je koncentracija natrijum acetata 50 mM, količina potrebna za doterivanje pH je obično oko 1.2 puta zapreminska količina od upotrebljenog<111>ln hlorida, premda mogu biti upotrebljene veće zapremine. Mora biti shvaćeno da odnos natrijum acetata prema HCI je ono što je važno i količina upotrebljenog natrijum acetata menjaće se u zavisnosti od količine i koncentracije HCI u puferu. Oko 1 ml helator-konjugovanog antitela u koncentracijama od oko 2 mg/ml je zatim pomešana sa radioobeleženim acetatnim rastvorom i mešavina je inkubirana oko 30 minuta ili za vreme dovoljno da se dostigne optimalno obeležavanje antitela. Takvo vreme može biti u rasponu od oko 30 sekundi do oko 60 minuta. Zatim je dodan formulacioni pufer u količini neophodnoj da se dostigne ukupna konačna konačna zapremina od oko 10 ml.

Optimalno vreme potrebno za obeležavanje antitela može varirati u zavisnosti od antitela, posebnog radiobeleživača i posebnog konjugata koji je upotrebljen. Važan faktor u optimizaciji vremena određenog za radiobeležavanje je odnos helator prema antitelu reagensa koji se obeležava. Na primer, odnos helator prema antitelu mora biti dovoljno visok da se dostigne terapeutski koristan nivo inkorporacije, tj., 90 do 95% u' zavisnosti od radioizotopa, ali nesme takođe biti pre visok da ne bude kompromitovan strukturni integritet ili imunoreaktivnost antitela. To zahteva određene balansirajuće procese koji u nekim slučajevima mogu voditi nižem nivou konjugovanih helatora i dužem vremenu obeležavanja.

Na primer, za 2B8 i MX-DTPA, otkriveno je da obeležavanje može biti obavljeno za manje od pet minuta za ^ i u oko trideset minuta za 111 In da se dostigne željeni nivo radioinkorporacije, sa samo oko 1 1/2 do 1 molami odnos helatora prema antitelu. Prema tome nije bilo neophodno, da se poveća odnos helatora prema antitelu zato što je željeni nivo radioinkorporacije dostignut. Štaviše, nije bilo preporučljivo da se poveća količina konjugovanih helatora zato što to može delovati na imunoreaktivnost antitela. Takvi parametri mogu biti empirijski određeni za druga antitela za dizajniranje kitova kao što su oni opisani u predmetnom pronalasku.

Kada je radioizotop<X>Yhlorid, zapreminska količina ?Y hlorida upotrebljena za pripremanje pojedinačne doze za davanje obično je u rasponu od oko 10 do 50 mCi i preferentno je oko 45 mCi, podeljena sa koncentracijom radioaktivnosti u vreme obeležavanja. Količina natrijum acetata upotrebljenog za doterivanje pH varira u zavisnosti od koncentracije natrijum acetata i koncentracije nosača izotopa i prema tome može biti veoma velika. Kada je koncentracija natrijum acetata 50 mM i<90>Y je isporučen u 50 mM HCI, količina potrebna za doterivanje pH je tipično oko 1.2 puta zapreminska količina upotrebljenog<90>Y hlorida. Oko 1.5 ml helator-konjugovanog antitela u koncentarciji od oko 2 mg/ml je zatim pomešana sa radiobeleženim acetatnim rastvorom i inkubirana oko 5 minuta ili vreme dovoljno da se dostigne optimalno obeležavanje antitela. Takvo vreme može biti u rasponu od oko 30 sekundi do oko 60 minuta. Formulacioni pufer je dodan u količini neophodnoj da se dostigne ukupna konačna zapremina od oko 10 ml.

Poželjno, metod radioobeležavanja pronalaska je izveden koristeći kit za radio-obeležavanje opisan ovde. Međutim, onima sa iskustvom u praksi mora biti očigledno da su poželjne komponente i uslovi samo prihvatljivi vodiči za praktikovanje metoda pronalaska i da mogu biti zamenjeni u nekom stepenu sa odgovarajućom optimizacijom. Uslovi koji izlaze izvan onih preferiranih ali koji još uvek izvrašavaju cilj metoda smatraju se da su u delokrugu pronalaska.

Kit za radioobeležavanje predmetnog pronalaska može takođe biti isporučen sa reagensima pogodnim za prigodno verifikovanje afiniteta vezivanja antitela nakon radioobeležavanja. U takvom slučaju, kit pronalaska može se takođe upotrebiti za određivanje procenta vezivanja radiobeleženih antitela za ciljne ćelije pre davanja antitela pacijentu. Predmetni istraživači su takođe našli da određeni ogled vezivanja zaštićenog kit može biti koristan za testiranje afiniteta antitela generalno za koje prečišćeni antigen nije dostupan. Prema tome, komponente ogleda vezivanja mogu takođe biti prodate kao odvojeni kit.

Generalno, ogled vezivanja i kit za radiobeležavanje sadrže (i) najmanje jedan vijal liofiliziranih ćelija koje ispoljavaju antigen koji je prepoznat od strane antitela u kitu; (ii) vijal koji sadrži helator-konjugovano antitelo; (iii) vijal koji sadrži formulacioni pufer, i (iv) instrukcije za radioobeležavanje antitela tako da radioobeleženo antitelo može biti dato direktno pacijentu bez potrebe za ponovnim prečišćavanjem. Kao što je opisano gore za kit za radiobeležavanje, taj kit može takođe sadržati vijal koji sadrži pufer za doterivanje pH radioizotopa i sterilni stakleni reakcioni vijal. Pufer je preferentno rastvor natrijum acetata sa malim sadržajem metala u koncentraciji od oko između 10 i 1000 mM i stakleni raekcioni vijal prima zapreminu od najmanje 5 ml. Antitelo je poželjno anti-CD20 antitelo, i helator je poželjno MX-DTPA. Kako je to prethodno opisano mogu se upotrebiti i drugi helatori. Poželjno konjugovano antitelo je 2B8-MX-DTPA, premda bilo koje helator-konjugovano antitelo može biti obeleženo i njegov afinitet procenjen. Formulacioni pufer je slani fosfatni pufer koji sadrži radioprotektant i nekonjugovani helator kao što je gore opisano i radioizotop može biti a i ne mora uključen i preferentno je 111 In hlorid ili ?Y hlorid. Mogu se upotrebiti i drugi radioizotopi u zavisnosti od helatora.

Razlika između ogled vezivanja/kit za radiobeležavanje i gore opisanog kita za radio-beležavanje je uključivanje antigen-pozitivnih ćelija da služe kao ciljni supstrat za testiranje afiniteta antitela. Kada je antigen CD20, poželjne CD20-pozitivne ćelije su SB ćelije (ATCC # CCL 120), ali bilo koje CD20-pozitivne ćelije mogu biti upotrebljene. Ogled vezivanja i kit za radiobeležavanje mogu dalje uključivati antigen-negativne ćelije da se koriste kao negativna kontrola. Preferirane CD20-negativne ćelije su HSB ćelije (ATCC # CCL 120.1), ali bilo koje CD20-negativne ćelije mogu biti upotrebljene.

Naravno, kombinovani kit za radiobeležavanje i ogled vezivanja mogu dalje sadržati vijal himeričnog anti-CD20 antitela u dodatku na antitelo da bude obeležen sa ciljem uticanja na kombinovani terapeutski način, ili za čišćenje perifernih B ćelija pre dijagnostičkih slika. Takvo odvojeno antitelo je preferentno Rituxan®, ali može biti bilo koje antitelo za koje je pokazano da je efikasno u ubijanju ćelije tumora. U stvari, dva različita tipa antitela mogu se kombinovati u jednom kitu, tj., antitela usmerena na dva različita antigena B ćelije, sve dotle dok kombinovani terapeutski režim služi da se nacilja isti tip ćelija, tj., B ćelije limfoma.

Upravi kako se komponente kita mogu koristiti da se obeleže druga antitela, mogu se pripremiti druge ćelije za testiranje afiniteta antitela u zavisnosti od ciljnog antigena. Međutim, za ant-CD20 antitela, ogled vezivanja i kit za radioobeležavanje predmetnog pronalaska su posbno pogodni za komercijalno okruženje u tome što su ciljne ćelije obezbeđene u liofiliziranom obliku. To omogućuje da se verifikacija efektivnosti antitela odvija jednostavno i sistematski, i negira probleme i troškove uključene u održavanje postrojenja za kulturu ćelija. Liofilizirane ćelije se obično isporučuju u količinama od između 0.5 i 500 X 10<6>ćelija po vijalu prema metodima pronalaska.

Mogće je da će neka postrojenja preferirati da naruče antitelo koje je već radio-obeleženo, u kom slučaju takvo postrojenje može zahtevati reagens ogleda vezivanja sa ciljem da obezbedi da antitela zadržavaju ciljni afinitet. U tom slučaju predmetni pronalazak takođe obezbeđuje za ogled vezivanja kit za određivanje procenta vezivanja radioobeleženog antitela za njegovu ciljnu ćeliju. Takav kit uključuje najmanje jedan vijal fiksiranih i/ili liofiliziranih antigen-pozitivnih ćelija i može po potrebi sadržati antigen-negativne ćelije kao što je opisno gore za ogled vezivanja i kit za radioobeležavanje. Štaviše, treba da je jasno da varijacije ovog kita mogu uključivati neobeleženo kontrolno antitelo za verifikovanje specifičnosti vezivanja antitela korisnika preko ogleda kompetitivnosti.

Ponovo, kada je antigen CD20, CD20-pozitivne ćelije poželjno su SB ćelije (ATCC # CCL 120) i CD20-negativne ćelije poželjno su HSB ćelije (ATCC # CCL 120.1), koje su ispo-ručene u liofi lizi ranom obliku u količinama od 0.5 i 50 X 10<6>ćelija. U tom slučaju, poželjno antitelo je MX-DTPA konjugat od 2B8 obeležen sa In ili<W>Y.

U pogledu dodatnih oblika kitova obelodanjenih ovde, mora se naglasiti da je jedna od prednosti kita za radioobeležavanje i metoda predmetnog pronalaska u tome što nije neophodan dalji korak prečišćavanja i radioobeleženo antitelo može se davati direktno pacijentu sačuvavši na taj način korisno vreme i povećavajući stabilnost antitela. Prema tome, naglašeno je da, dok za kliničara može biti poželjno da testira ili verifikuje specifičnost vezivanja i afiniteta radio-obeleženog antitela pre davanja, takav test može biti zaboravljen sa određenim izotopom ako su stabolnost antitela i inhibicija radiolize posebno važni, tj., kao sa itrijumom. Obezbeđujući oblike kita gde afinitet vezivanja i specifičnost mogu biti testirani, predmetni pronalazači ni na jedan način ne sugerišu da su takvi testovi potrebni u metodima ili kitovima pronalaska. Opcija da se testira validnost takvog antitela je isključivo opcija kliničara.

Predmetni pronalazači su takođe našli da je metod koji se koristi za pripremanje fiksiranih i liofiiiziranih ćelija za ogled vezivanja kitova predmetnog pronalaska posebno pogodan za pripremanje ćelija za komercijalne kitove. Ćelije mogu biti fiksirane pre liofilizacije da se popravi struktura/stabilnost. Posebno, ćelije predmetnog pronalaska pokazuju visoku ponovljivost kada se koriste za ogled vezivanja antitela.

Posebno, predmetni pronalazak uključuje metode za pripremanje liofiiiziranih ćelija koji sadrži (i) žetvu ćelija pri ćelijskoj gustini od 0.5 do 2 X 10<6>ćelija po ml putem centrifugiranja; (ii) ispiranje ćelija najmanje jedan put u balansiranom rastvoru soli, tj., HBSS; (iii) resuspendo-vanje istaloženih ćelija u puferu za liofilizaciju koji sadrži rastvor balansiranih soli sadržeći noseći protein i najmanje jedan tip šećera; (iv) rasejavanje u alikvote resuspendovanih ćelija u tube za mikrofuge ili staklene vijale; i (v) liofiliziranja ćelija 12-96 časova i još poželjnije 24-72 časa na oko 30-60 militora. Metod je posebno pogodan za pripremanje liofiiiziranih ćelija gde su po-menute ćelije SB ćelije (ATCC # CCL 120) ili HSB ćelije (ATCC # CCL 120.1), ali je lako pri-menjiv i na druge tipove ćelija. ,

Preferentno, pufer obično sadrži goveđi serum albumin kao noseći protein u koncentarciji od 1% (w/v) i manitol u koncentraciji od 10%. Međutim, razumljivo je da se mogu upotrebiti drugi noseći proteini, tj., HSA, i drugi šećeri. Ćelije se prikupljaju centrifugiranjem na brzini od oko 1300 rpm i dodaje se rastvor soli HBSS (Hank-sov balansirani rastvor soli). Obično se ćelije resuspenduju u koncentraciji od 50 X 10<6>ćelija po ml. Međutim, onima sa iskustvom u praksi mora biti očigledno da gornji uslovi mogu biti modifikovani malo bez da se značajno ugrozi vijabilnost ćelija. Štaviše, gornji uslovi mogu biti dopunjeni dodatnim procedurama diza-jniranim da optimizuju proces za veće količine ćelija. Npr., tangencijalni protok dijafiltracije da se ćelije razmene u puferu za liofilizaciju.

Kitovi ogleda vezivanja predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti u ogledu za procenjivanje afiniteta vezivanja radioobeleženog antitela. Takav ogled je takođe predmet predmetnog pronalaska. Ogled vezivanja za određivanje procenta vezivanja radioobeleženog antitela na nje-gove ciljne ćelije generalno sadrži sledeće korake: (i) mešanje najmanje jednog alikvota radio-obeleženog antitela sa najmanje jednim alikvotom antigen pozitivnih ćelija (ii) mešanje jednog alikvota radioobeleženog antitela identično alikvotu koraka (i) sa najmanje jednim alikvotom pufera za razblaživanje iste zapremine kao i alikvot antigen-pozitivnih ćelija u koraku (i) kao kontrole; (iii) obaranje ćelija centrifugiranjem; (iv) merenje radioaktivnosti u supernatantu istaloženih ćelija i kontroli; i (v) poređenje količine radioaktivnosti u supernatantu ćelija sa količinom radioaktivnosti u kontroli.

Kao što kit za radiobeležavanje predmetnog pronalaska po potrebi sadrži<111>ln hlorid iliXYhlorid, ogled vezivanja predmetnog pronalaska je tipično obavljen sa antitelima obeleženim sa<1n>ln ili MY. Kada je<111>ln radioobeleživač radioaktivnost u oglednim tubama meri se koristeći gama brojač. Kada je * °Y obeleživač radioaktivnost se meri koristeći scintilacioni brojač, premda i gama brojač može biti upotrebljen.

Za ogled vezivanja predmetnog pronalaska, preferirano antitelo je anti-CD20 antitelo i anti-CD20 antitelo preferentno je 2B8, gde je 2B8 antitelo obeleženo pomoću kita za radio-obeležavanje predmetnog pronalaska. Međutim, bilo koje radioobeleženo antitelo može biti testirano pod uslovom da isporučene ćelijama koje pokazuju određeni antigen. Kada je antigen CD20 poželjne ćelije za izvođenje ogleda su SB ćelije (ATCC # CCL 120), međutim, ogled takođe može biti optimizovan i izveden sa bilo kojim radioobeleženim antitelom i odgovarajućom ciljnom ćelijom.

Pufer za rastvaranje koji se koristi u ogledu mora obezbediti vezivanje antitela, tj., fiziološki pufer, po mogućstvu da sadrži protein nosač, npr., BSA, da umanji ne-specifično vezivanje za ćelije. Premda tuba sa puferom za razblaživanje služi kao kontrola, u ogled može biti uključena dalja kontrola koristeći antigen-negativne ćelije. U tom slučaju, ogled vezivanja dalje sadrži sledeće korake: (i) mešanje najmanje jednog alikvota radioobeleženog antitela sa najmanje jednim alikvotom antigen-negativnih ćelija; (ii) obaranje centrifugiranjem antigen-negativnih ćelija; (iv) merenje radioaktivnosti u supernatantu antigen-negativnih istaloženih ćelija; i (v) poređenje količine radioaktivnosti u supernatantu antigen-negativnih ćelija sa količinom radioaktivnosti u supernatantu antigen-pozitivnih ćelija i kontroli. Poređenjem radioaktivnosti dobijene iz te tube sa puferom za razblaženje kao kontrolom poslužiće kao mera količine ne-specifičnog vezivanja za antigen-pozitivne ćelije. Kada je CD20 antigen i CD20-pozitivne ćelije su SB ćelije, CD20 negativne ćelije preferentno su HSB ćelije (ATCC # CCL 120.1).

Kao što je opisano gore liofilizirane ćelije predmetnog pronalaska obezbeđuju jednostavan, efektivan i ponovljiv standard za testiranje efikasnosti vezivanja radioobeleženog antitela. Prema tome, ogled vezivanja predmetnog pronalaska je preferentno izveden koristeći liofilizirane ćelije uključene u kitove ogleda vezivanja predmetnog pronalaska. U dodatku, ogled radio-obeležavanja predmetnog pronalaska može biti kombinovan sa ogledom vezivanja predmetnog pronalaska, gde je antitelo prvo obeleženo metodom obeležavanja helator-konjugovano antitelo kao što je opisano u predmetnom pronalasku. Najpoželjnije je da se ogled vezivanja predmetnog pronalaska izvede koristeći jedan od ogleda vezivanja i kitove za radiobeležavanje opisane ovde.

Mogu biti neki slučajevi gde afinitet antitela mora biti testiran ili verifikovan ali radio-obeleživač nije bio pričvršćen. Na primer, pod određenim okolnostima, tj., uklanjanje problema, može biti probitačno testirati afinitet vezivanja antiteta pre radioobeležavanja. Za takav slučaj, predmetni pronalazak takođe sadrži ogled za kompetitivno vezivanje za utvrđivanje afiniteta test antitela u odnosu na ciljnu ćeliju, sadržeći (i) pripremanje rutenijum-obeleženog kontrolnog antitela koristeći poznato antitelo specifično za isti antigen; (ii) inkubiranje povećanih količina test antitela i povećavanje količina neobeleženog kontrolnog antitela sa fiksnom koncentracijom ciljnih ćelija i količinama u tragovima rutenijum-obeleženog antitela gde je svaka razdvojena koncenta-rcija test antitela i svaka razdvojena koncentracija kontrolnog antitela u odvojenim tubama, respektivno; (iii) determinisanje količine vezivanja u svakoj reakcionoj tubi bazirano na relativnoj elektrohemiluminescenciji (ECL) koristeći ORIGEN instrument; i (iv) izračunavanje prosečnne vrednosti afiniteta test antitela. Prosečna vrednost afiniteta može biti izračunata iz EC50 vrednosti i poznate koncentracije tragova antitela koristeći metod Muller-a (J. Immunological Methods

(1980) 34:345) ili bilo koji drugi prikladan metod. Mora se zabeležiti da ovaj ogled može takođe biti upotrebljen da se testira afinitet radioobeleženih antitela, ili bilo kojeg antitela za koji antigen ne može biti prečišćen i potrebne su ćelije kao izvor antigena. Fiksirane, liofilizirane ćelije predmetnog pronalaska mogu se takođe upotrebiti kao ciljne ćelije,

Kada se izvodi kompetitivni ogled vezivanja predmetnog pronalaska da se testira afinitet ant-CD20 antitela, kontrolno antitelo može biti 2B8, ili bilo koje drugo nekonjugovano anti-CD20 antitelo. Test antitelo može biti takođe biti helator-konjugat kontrolnog antitelo. Alternativno, test antitelo može biti drugo anti-CD20 antitelo čiji afinitet vezivanja za CD20 u poređenju sa 2B8 je od interesa. Međutim, ogled može biti prilagođen za upotrebu sa antitelima koja imaju druge specifičnosti sve dok su dostupne odgovarajuće ciljne ćelije.

U ogledu kompetitivnog vezivanja predmetnog pronalaska, poželjne ciljne ćelije su CD20-pozitivne ćelije, još poželjnije su SB ćelije (ATCC # CCL 120), i još poželjnije su resuspendovane liofilizirane SB ćelije pripremljene prema metodu predmetnog pronalaska. Takođe mogu biti upotrebljene ćelije liofilizirane pomoću drugih metoda ili fiksirane ćelije. Rutenijum-obeleženo antitelo obično se priprema procesom koji sadrži inkubiranje kontrolnog antitela sa N-hidroksisukcinimid estrom rutenijum (II) tris-bipiridin helatora (TAG-NHS), premda drugi poznati metodi obeležavanja antitela su takođe zamišljeni. Za obeležavanje, kontrolno antitelo i TAG-NHS su preferentno inkubirani u molamom odnosu oko 1:15.

Ti i drugi aspekti predmetnog pronalaska biće lakše shvaćeni pozivanjem na sledeće slike, primere i opis pronalaska.

4. Kratak opis slika

Slika 1. Imunoreaktivnost prirodnog 2B8 je upoređena sa komercijalno dostupnim anti-CD20 antitelima B1 (Coulter) i Leu 16 (Becton Dickinson) putem direktne kompeticije u radioimunoogledu koristeći<125>l-obeležen B1. Antigen-pozitivne SB ćelije (100,000) su dodane svakom bunarčiću V&P filter ploča; 10 ng radioobeleženog B1 je pomešano sa različitim koncentracijama neobeleženog kompetitora i mešavina je dodana ćelijama. Antitela su inkubirana sa ćelijama tokom jednog časa na temperaturi ambijenta; određivanja su izvršene u triplikatu. Nakon toga, bunarčići su isprani, osušeni i određena je radioaktivnost vezana za filter. Prikazani podaci su korigovani u odnosu na radioaktivnost pozadine i predstavljaju srednje vrednosti trostrukih određivanja.

Slika 2. Povećane količine nekonjugovanog 2B8 su analizirane za vezivanje za humane B-ćelije (SB) koristeći FACS analizu. Poređenja su urađena sa komercijalno dostupnim anti-CD20 monoklonalnim antitelom (B1) i sa dva irelevantna izotop antitela. Kozje anti-miš IgG-FITC F(ab)'zje upotrebljeno kao sekundarni reagens. Rezultati pokazuju da je 2B8 specifičan za CD20 antigen i da pokazuje veći afinitet vezivanja od B1.

Slika 3. Humane B-ćelije (SB) su inkubirane sa povećanim količinama<125>l-obeleženog 2B8. Utrostručeni uzorci su inkubi<p>ani tokm jednog časa i radioaktivnost vezana za ćelije je određena nakon filtracije da se sakupe ćelije. Scatchard analiza je omogućila izračunavanje konstante očiglednog afiniteta 4.3 X 10"<9>M.

Slika 4. Imunoreaktivnost prirodnog 2B8, 2B8-MX-DTPA i B1. B1 antitelo je radio-obeleženo kao što je opisano u odeljku Metodi. Deset nanograma radioobeleženog B1 je pomešano sa povećanim koncentracijama kompetitora i mešavina je dodana bunarčićima V&P filter ploča koje su sadržale 100,000 antigen-pozitivnih SB ćelija svaki; sva određivanja su izvedena u triplikatu. Nakon jednog časa inkubacije na temperaturi ambijenta, bunarčići su ekstenzi-vno isprani. Nakon toga, filteri su osušeni i vezana radioaktivnost određena putem gama brojanja; sve vrednosti su korigovane za pozadinu. Pokazane vrednosti su srednje vrednosti trostrukih određivanja.

Slika 5. Antitelo 2B8 je formulisano u konačnoj koncentraciji od 10 mg/mL u normalnom slanom rastvoru ili norrmalnom slanom rastvoru koji sadrži 10 mM glicin-HCI, pH 6.8. Duplicirani setovi uzoraka su zatim stavljeni u vijale sa čepom-zavrtnjem, vijali su očišćeni azotom i poklo-pljeni. Uzorci su zatim inkubirani na 4°C ili 30°C tokom 12 nedelja; imunoreaktivnost uzoraka je određivana nedeljno. Nije zapažen gubitak imunoreaktivnosti sa bilo kojim od 2B8 uzoraka tokom 12 nedelja ispitivanja. Prikazana je imunoreaktivnost prve nedelje (slika 5A), šeste nedelje (slika 5B) i dvanaeste nedelje (slika 5C).

Slika 6. Ogled vezivanja za određivanje imunoreaktivnosti<111>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog u PBS-u, pH 7.4 koji sadrži 50 mg/mL humanog serum albumina (48 časova inkubiranja). Slika 6A) Konstantna količina radioobeleženog antitela (5 ng/mL) je inkubirano sa povećanim zapreminama SB ćelija (20 x 10<6>ćelija/mL). Količina radioaktivnosti (cpm) vezane za ćelije je plotovana u odnosu na zapreminu dodane suspenzije ćelija. Slika 6B) Ukupna primenjena radioaktivnost u odnosu na vezanu radioaktivnost (AT/B) je plotovana). Linearna ekstra-polacija omogućila je izračunavanje y-odsečka (0.997). Recipročna vrednost v-odsečaka X 100 dala je prinos imunoreaktivnosti vrednost od 100% pri beskonačnom višku antigena.

Slika 7. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 4°C u PBS-u, pH 7.4 koji sadrži 75 mg/mL humanog serum albumina i 1mM DTPA. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove, denaturisane uslove (SDS). Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2) 10pL (putevi 5,6). Gelovi su izloženi filmu za x-zrake oko 15 minuta na temperaturi ambijenta i fotografisani.

Slika 8. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS, pH 7.4 koji sadrži 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 96.2%.

Slika 9. Densitometrijski pregled autoradiograma 48 časova dobijenog iz SDS-PAGE analize ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS, pH 7.4 koji sadrži 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 95.5%.

Slika 10. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize<111>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 4°C u PBS-u, pH 7.4 koji sadrži 50 mg/mL humanog serum albumina. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2) , 10 pL (putevi 3,4) i 20 pL (putevi 5,6) u dupliciranim bunarčićima. Gelovi su izloženi filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i fotografisani (Napomena: autoradiogram 48 časova je dobijen ko-risteći pojačane rezultate skrinova u mnogo intenzivnijem signalu autoradiograma nultog vremena).

Slika 11. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize 1,,ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS, pH 7.4 koji sadrži 50 mg/mL humanog serum albumina. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bu-narčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#3) bila je 95.9%.

Slika 12. Densitometrijski pregled autoradiograma 48 časova dobijenog iz SDS-PAGE analize,<11>ln-obe!eženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS, pH 7.4 koji sadrži 50 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog konjugata (#2) bila je 97.0% (kombinovane površine pikova #2,3 i 4).

Slika 13. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize<90>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 37°C u humanom serumu. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2) , 10 pL (putevi 3,4) i 20 pL (putevi 5,6). Gelovi su izloženi filmu za x-zrake pri-bližno 15 minuta na temperaturi ambijenta i fotografisani.

Slika 14. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize "V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20<p>L u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 97.9%.

Slika 15. Densitometrijski pregled autoradiograma 98 časova dobijenog iz SDS-PAGE analize "V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 94.7%. '

Slika 16. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize<m>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 37°C u humanom serumu. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2) , 10 pL (putevi 3,4) i 20 pL (putevi 5,6). Gelovi su izloženi filmu za x-zrake pri-bližno 16-20 časova na temperaturi ambijenta i fotografisani.

Slika 17. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize<111>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 16-20 časova na temperaturi ambijenta i i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#3) bila je 95.3%.

Slika 18. Densitometrijski pregled autoradiograma 98 časova dobijenog iz SDS-PAGE analize<nt>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 16-20 časova na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#3) bila je 94.0%.

Slika 19. Cinamologi majmuni injekcirani su intravenski svakih 48 časova sa ukupno sedam inekcija; date količine su prikazane. Cirkulišući nivoi T- i B-ćelija su određeni pomoću FACS analize koristeći anti-CD20 (T-ćelije), anti-Mo-lgG (2B8), anti-CD20 (Leu 16) i anti-humani-IgG (B-ćelije). Nije zapaženo delovanje na cirkulišućim nivoima T-ćelija. (U grupi V životinjama je data jedna doza).

Slika 20. Obnavljanje nivoa cirkulišućih B-ćelija kod životinja koje su primile 2B8 nakon čega je sledila FACS analiza pomoću fluorescentno-obeleženih antitela opisanih u kratkom opisu slike 19. Životinje u grupama III i IV bile su posmatrane nakon što su žrtvovane trinaestog dana.

Slika 21. Cinamologi majmuni injekcirani su intravenski sa<89>Y-2B8-MX-DTPA koji je bio pripremljen koristeći klinički čist 2B8-MX-DTPA. Životinje su dozirane ukupno sedam doza svakih 48 časova u količinama prikazanim gore. U danima 0, 2, 7, 10 i 14 majmuni su iskrvareni procenjena je serum hemijska hematologija nivoa cirkulišućih B ćelija (desetog dana serumi nisu analizirani na sadržaj B-ćelija). Sem smanjenja ukupnog broja limfocota kod svih životinja, sem jedne jedinke iz grupe II, nisu zapažene značajne abnormalnosti tokom toka ispitivanja.

Slika 22. Čišćenje mišjeg anti-CD20 antitela 2B8 iz cinamologih majmuna određeno je sa ELISA nakon jedne injekcije od 10 mg/kg nultog dana. Kao što je prikazano na panelu A, antitelo se pokazivalo na P t1/2vrednosti približno 4.5 dana. Čišćenje 2B8 antitela i njegovog MX-DTPA konjugata iz cirkulacije BALB/c miševa prikazano je na panelu B. Miševi su intravenski injektirani sa 25 pg prirodnog konjugata 2B8 i uzorci krvi su uzeti u različitim vremenima sve do 264 časa nakon injekcije; serumi su nakon toga analizirani enzimskim imunoogledom koristeći SB ćelije kao agens zarobljavanja. I prirodna i konjugovana antitela prikazala su vrednosti čišćenja od 8.75 dana.

Slika 23. Dvadest BALB/c miševa je injicirano svaki sa 1,1 pCi radioobeleženog konjugata (100 pL) formulisanog u PBS, pH 7.4, koji je sadržao 50 mg/mL: HSA. Grupe od po pet miševa su žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa i zatim su krv i druga tkiva pripremljeni za analizu vezane radioaktivnosti.

Slika 24. Dvadest BALB/c miševa je injicirano intravenozno sa oko 1,0 pCi (u 100 pL) radioobeleženog konjugata formulisanog u 1 X PBS, pH 7.4, koji je sadržao 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DPA. Grupe od po pet miševa su žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa i zatim su krv i druga tkiva pripremljeni za analizu vezane radioaktivnosti.

Slika 25. Atimični miševi sa Ramos tumorima B-ćelija su injektirani intravenozno sa oko 24 pCi<1l1>ln-2B8-MX-DTPA i grupe od po tri miša su žrtvovane u 0, 24, 48 i 72 časa. Nakon pripreme tkiva i određivanja vezane radioaktivnosti procenat injicirane doze po gramu tkiva su određene i plotovane kao što je prikazano.

Slika 26. Ogled vezivanja za određivanje imunoreaktivnosti "mix-&-shoot" ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog u PBS-u, pH 7.4 koji je sadržao 50-75 mg/mL humanog serum albumina (inkubacija 48 časova). Panel A) konstantna količina ^V-obeleženog antitela (približno 1 ng/ml) je inkubirana sa povećanim količinama SB ćelija. Količina radioaktivnosti (cpm) vezana za ćelije je plotovana u odnosu na koncentraciju ćelija. Panel B) Ukupna primenjena radioaktivnost<90>Y preko vezane radioaktivnosti (AT/B) je plotovana. Linearna ekstarpolacija omogućila je izračunavanje y-odsečka (1.139). Recipročnost od y-odsečka X 100 donela je vrednosti imunoreaktivnosti od 87.0% u beskonačnom višku antigena. Nije zapaženo vezivanje sa CD20-nega-tivnim ćelijama (HSB).

Slika 27. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize<9C>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 4°C u PBS-u, pH 7,4 koji su sadržali 75 mg/mL humanog serum albumina i 1mM

DTPA. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove, denaturišuće uslove (SDS) . Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2) i 10 pL (putevi 5,6). Gelovi su izloženi filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i fotografisani.

Slika 28. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize "Vobeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS-u, pH 7,4 koji su sadržali 75 mg/mL humanog serum albumina i 1mM DTPA. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radio-obeleženog pika konjugata (#2) bila je 96.1%.

Slika 29. Densitometrijski pregled autoradiograma 48 časova dobijenog iz SDS-PAGE analize '"V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 4°C u PBS-u, pH 7,4 koji su sadržali 75 mg/mL humanog serum albumina i 1mM DTPA.. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5<p>L, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radio-obeleženog pika konjugata (#2) bila je 94.1%.

Slika 30. Autoradiogrami dobijeni iz SDS-PAGE analize "mix-&-shoot" '"V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubirani na 37°C u humanom serumu. U naznačenim vremenima, uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelovima koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL (putevi 1,2), 10 pL (putevi 3,4) i 20 pL (putevi 5,6). Gelovi su izloženi filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i fotografisani.

Slika 31. Densitometrijski pregled autoradiograma nultog vremena dobijenog iz SDS-PAGE analize "mix-&-shoot" ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je pregledan koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 89.1%.

Slika 32. Densitometrijski pregled autoradiograma 72 časa dobijenog iz SDS-PAGE analize "mix-&-shoot" '"V-obeleženog 2B8-MX-DTPA inkubiranog na 37°C u humanom serumu. Uzorak je podvrgnut elektroforezi na 4-20% tris-glicin gelu koristeći ne-redukovane uslove. Uzorci su napunjeni na 5 pL, 10 pL i 20 pL u dupliciranim bunarčićima. Gel je izložen filmu za x-zrake približno 15 minuta na temperaturi ambijenta i jedan od puteva je skeniran koristeći densitometar. Relativna površina radioobeleženog pika konjugata (#2) bila je 88.8%.

Slika 33. Dvadest BALB/c miševa je injicirano intravenozno sa 5 pCi "'V-obeleženog 2B8-MX-DTPA formulisanog u 1 X PBS, pH 7.4, koji je sadržao 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Grupe od po pet miševa su žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa i zatim su krv i druga tkiva pripremljeni za analizu vezane radioaktivnosti.

Slika 34. Povećane količine CHO-dobijenih obeleženih 2B8 antitela su inkubirane sa fiksiranim koncentracijama sveže prikupljenih CD20-pozitivnih B-ćelija (SB) ili CD20-negativnim T-ćelijama (HSB). Vezivanje antitela za ćelije je kvantifikovano putem FACS analize koristeći kozji anti-mišji IgG-FITC F(ab)'2kako što je ovde opisano. Poređenja su napravljena u odnosu na irelevantni izotop antitelo (S004). Samo CHO-izvedeno 2B8 antitelo je pokazalo primetno vezivanje za CD20-pozitivne ćelije.

Slika 35. Imunoreaktivnost iz CHO-izvedenog 2B8 je upoređena sa 2B8-49 roditeljskim antitelom produkovanim u ćelijskoj liniji hibridoma direktnom kompeticijom u ORIGEN ogledu. Povećane količine antitela su inkubirane sa fiksiranim koncentracijama CD20-pozitivnih B-ćelija (SB) i u količinama u tragovima sa rutenijum-obeleženim CHO 2B8. Nakon inkubacije od tri časa na temperaturi ambijenta, vezivanje, izraženo kao relativna elektrohemiluminescencija (ECL), je određena koristeći ORIGEN instrument kako je to opisano u Materijalu i metodama. Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti dvostrukih određivanja. Izračunato je da su prosečane konstante afiniteta za CHO 2B8 i 2B8-49 1.3 X 10"3 M i 2.5 X 10"<10>M, respektivno. U poređenje je uključeno irelevantno izotop antitelo (S004).

Slika 36. Vezivanje 2B8-MX-DTPA konjugata pripremljenih iz CHO-izvedenog 2B8 je upoređeno sa nekonjugovanim antitelom direktnom kompeticijom u OROGEN ogledu. Konjugati su pripremljeni inkubiranjem 2B8 sa MX-DTPA za 8, 17 i 24 časa pre uklanjanja ne reagovanog helata. Za procenjvanje vezivanja, antitela su inkubirana sa sa fiksiranim koncentracijama CD20-pozitivnih B-ćelija (SB) i u količinama u tragovima sa rutenijum-obeleženim CHO 2B8. Nakon inkubacije od tri časa na temperaturi ambijenta, vezivanje, izraženo kao relativna elektrohemiluminescencija (ECL), je određena koristeći ORIGEN instrument kako je to opisano u Materijalu i metodama. Vrednosti predstavljaju srednje vrednosti dvostrukih određivanja. Preparacije konjugata pokazale su slično vezivanje u poređenju sa ne konjugovanim 2B8 antitelom.

Slika 37. A) SB ćelije su isprane i resuspendovane do 90 X 10<6>ćelija /mL sa puferom za razblaživanje (1X PBS, pH 7.4, koji je sadržao 1% (w/v) goveđeg serum albumina). Povećane koncentracije ćelija su inkubirane tokom 3 časa sa 7.5 ng/mL ln2B8 pripremljenog koristeći 2B8-MX-DTPA lot 0165A. B) Dvostruko-inverzni plot koncentracije ćelija u odnosu na vezanu radioaktivnost/ukupna radioaktivnost (B/AT). Imunoreaktivnost je izračunata kao 1/y-odsečak x 100. Vrednosti imunoreaktivnosti i koeficijenta korelacije (R) bile su 80.6% i 0.981, respektivno.

Slika 38. A) SB ćelije su isprane i resuspendovane do 90 X 10<6>ćelija /mL sa puferom za razblaživanje (1X PBS, pH 7.4, koji je sadržao 1% (w/v) goveđeg serum albumina). Povećane koncentracije ćelija su inkubirane tokom 3 časa sa 2 ng/mL Y2B8 pripremljenog ko-risteći 2B8-MX-DTPA lot 0165A. B) Dvostruko-inverzni plot koncentracije ćelija u odnosu na vezanu radioaktivnost/ukupna radioaktivnost (B/AT). Imunoreaktivnost je izračunata kao 1/y-odsečak x 100. Vrednosti imunoreaktivnosti i koeficijenta korelacije (R) bile su 72.2% i 0.999, respektivno.

5. Detaljan opis pronalaska

Definicije

Ukoliko nisu definisani drugačije, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste znače isto kao i termini koji su uobičajeno shvaćeni od strane onih koji imaju prosečnu iskustvo u oblasti kojoj pripada pronalazak. Premda se u praksi ili testitarnju predmetnog pronalaska mogu upotrebiti bilo koji metodi i materijali slični iii ekvivalentni onima opisanim ovde, preferirani metodi i materijali su opisani. Za potrebe predmetnog pronalaska sledeći termini su definisani dole.

manji sadržaj metala - odnosi se na reagens tretiran da redukuje kontaminaciju metalom do nivoa koji ne utiče na radioinkorporaciju

antigen pozitivan - znači eksperimira antigen koji je prepoznat od strane određenog anti-tela pronalaska na takav način da je antitelo sposobno za vezivanje.

% radioinkorporacije - odnosi se na količinu radioobeleživača iz reakcije radio-obeležavanja koji je konjugovan za antitelo relativno u odnosu na ukupnu količinu radio-obeleživača inicijalno dodanog u reakciju.

% vezivanja - odnosi se na količinu antitela iz uzorka koja se vezuje za ciljni antigen, sa ili bez specifičnosti.

% imunoreaktivnosti ili specifičnost vezivanja - odnosi se na količinu uzorka antitela koja se vezuje za ciljni antigen sa specifičnošću.

dijagnostičko antitelo - odnosi se na antitelo konjugovano za radioobeleživač kao što je ?') koji može uticati na dijagnostičko oslikavanje tumora i antigen pozitivnih ćelija.

terapeutsko antitelo - odnosi se na antitelo konjugovano za alfa ili beta emitujuće radio-obeleživače (kao što je<ao>Y) koji može delovati na ubijanje ćelija kada se vezuje za ciljni antigen.

OPIS PRONALASKA

Pre-klinički razvitakmišjegmonoklonalnoganti-CD20 antitela 2B8, konjugovanog2B8,111ln i<90>Y-obeleženog 2B8I.Materijal i metode za razvitak mišjeg monoklonalnog anti-CD20 antitela 2B8,

konjugata 2B8-MX-DTPA,11'ln-obeleženog2B8-MX-DTPAiHPLC-prečišćenog90Y-MX-DTPA

A. Materijali.

1. Ćelije.

Humane ćelijske linije SB i HSB su dobijene od American Type Culture Collection i kultivisane u RPMI-1640 koji je sadržao 10% fetalni goveđi serum. CD20-pozitina SB ćelijska linija je B limfoblastoidna ćelijska linija izvedena iz podkožne periferne krvi pacetna sa akutnom limfo-blastičnom leukemijom (1). Antigen-negativna ćelijska linija HSB je T limfoblastoidna ćelijska linija razvijena iz tumora indukovanih kod novorođenih siriskih hrčaka (2). Mišja ćelijska linija mieloma SP2/0 je slično držana u RPMI-1640 koji je sadržao 10% fetalni goveđi serum.

2. Antitela

Anti-CD20 antitela B1 i Leu 16 su nabavljeni od Coulter !mmunology and Becton/Dickinson, respektivno.Antitela<125>l-obeleženi koziji anti-miš IgG i koziji ant-humani IgG su dobijena od ICN. Koziji F(ab')2 anti-mišiji IgG je dobijen od Cappel.

3. Reagensi

Freund-ovi kompletni i nekomplementni adjuvansi su nabavljeni od Sigma Chemical Company. Polietilen glikol, HAT koncentrat i HT koncentrat dobijeni su od Boehringer Mannhein. Fluorescin izotiocijanat (FITC) je dobijen od Sigma Chemical Company. Indijum-[111] hlorid i<X>Yhlorid su dobijeni od Amersham ili NEN Dupont. ltrijum-[89] hlorid je dobijen od Aldrich Chemical Company. Svi ostali reagensi su dobijeni iz standardnih izvora.

Reagensi korišćeni za konjugaciju i protokol radioobeležavanja su izvedeni da se ukloni kontaminacija jonima teških metala, koji mogu biti u kompeticiji sa radioizotopima tokom koraka radioobeležavanja. Reagensi su tipično procesovani propuštanjem rastvora kroz kolonu od Chelex 100 jonoizmenjivačke smole (BioRad Industries) ili procesovanjem kroz dozator dodavanjem Chelex 100 pripremljenom rastvoru. Voda koja je sadržala niže metale, bilo Milli-Q-prečišćena iii voda za navodnjavanje (VVFIr) je upotrebljena u svim preparacijama i razblaživanjima. Rastvori bez metala su sterilno filtrirani i sakupljeni u sterilnim plastičnim kontejnerima.

B. Metodi.

1. Produkcija i skrining 2B8 supernatanta hibridoma putem RIA

Deset BALB/c miševa je imunizovano sa 20 miliona SB ćelija suspendovanih u PBS-u koji je sadržao Freund-ov kompletni adjuvans. Ćelije su injekcirane i s.c i i.p na mnogim mestima na životinji. Nakon 2 nedelje perioda odmaranja miševi su injekcirani drugi put sa SB ćelijama emulzifikovanim u Freund-ovom nekompletnom adjuvansu. Uzastopno imunizaciono pobuđivanje je izvedeno nedeljnom procedurom sa SB ćelijama suspendovanim u PBS-u. Miševi su imunizovani tokom perioda od 6 nedelja do 4 meseca.

Dve životinje su istovremeno žrtvovane cervikalnom dislokacijom i njihove slezine su uklonjene za fuziju sa mijelomom SP2/0 miša. Životinje su odabrane na osnovu sposobnosti post-imunog seruma da efektivno inhibira vezivanje radioobeleženog Coulter B1 anti-CD20 antitela za humane SB ćelije. Tri dana pre svake fuzije odabranim životinjama data je najmanje jedna intravenozna (repna vena) injekcija od 20 miliona SB ćelija u PBS-u. Nakon žrtvovanja slezine su uklonjene pod aseptičkim uslovima i splenocite su fuzionisane sa SP2/0 ćelijama u razmeri od 5:1 (splenocite:SP2/0). Fuzionisane ćelije su isprane u medijumu za kulturu ćelija i prenesene na ploču od 96 bunarčića sa HAT selekcionim medijumom. Hibridomi su pregledani inhibicionim radioimuno ogledom koristeći Coulter B1 antitelo nakon 10-14 dana.

Pregledanje hibrida koji su izlučivali anti-CD20 antitelo je izvedeno koristeći postojeće metode radioimuno ogleda. Ukratko, Coulter B1 anti-CD20 antitelo je prečišćeno putem protein A afinitetne hromatografije. Pedeset mikrograma prečišćenog antitela je vezano za 1251 putem kratke oksidacije u prisustvu lodobeads (Pierce Chemical Co.), sledeći proceduru proizvođača. Radioobeleženo antitelo je desalinizovano na amberlit smoli i čuvano u puferu za razblaživanje (PBS, pH 7.4, sa 0.2% želatina, 0.02% natrijum azida i 1.0% BSA). Deset nanograma radioobeleženog antitela je stavljeno u svaki bunarčić prethodno blokirane filter ploče ogleda (pufer za blokiranje: pufer za razblaživanje sa 10% FBS) zajedno sa 50 pL supernatanta hibridoma iz test bunarčića i 100,000 SB ćelija suspendovanih u 50 pL pufera za razblaživanje. Suspenzija je inkubirana 1 sat na temperaturi ambijenta. Ploče su sasvim isprane sa puferom za ispiranje (PBS, pH 7.4, sa 0.2% želatina i 0.02% natrijum azida) na V&P Scientific vakum priključku i filter dna koja su sadržala zarobljene SB ćelije su prenesena u gama brojač. Bunarčići koji su sadržali samo HAT medijum i obeleženo B1 antitelo su upotrebljeni kao kontrola pozadine i identični bunarčići koji su sadržali SB ćelije upotrebljeni su kao pozitivane kontrole. Kontrole inhibicije sadržale su radioobeležene B1 i različite količine neobeleženog B1 antitela u rasponu od 2 pg do 2 ng.

2. Ispitivanja flovv citometrijom

a. Ćelijskelinije

Preliminarna ispitivanja flovv citometrijom obavljena su sa supernatantima iz 2B8 kultura hibridoma. Sto mikrolitara supernatanta hibridoma je inkubirano sa SB ćelijama jedan čas na temperaturi ambijenta; sekundarno antitelo (kozji F(ab')2 anti-mišji IgG; Cappel), korišćen na 1/400 razblaženju, je dodano nakon toga i inhibicija je produžena tokom 1 časa u mraku. Ćelije su isprane 5 puta. Kontrole su uključile samo ćelije (bez primarnih ili sekundaenih antitela) od kojeih je određena autofluorescencija, ćelije sa sekundarnim antitelom samo da se odredi ne-specifično vezivanje i komercijalno dostupni fluorescin izotiocijanat-konjugovani B1 (B1-FITC) za CD20 populacionu kontrolu.

Za neke eksperimente, fluorescin je vezan za prečišćeno 2B8 antitelo kroz reakciju amino grupa sa fluorescin izotiocijanatom (FITC). Ukratko, 2B8 antitelo (1.2 mg/mL) je inkubirano u pH 9.5, 0.1 M natrijum karbonatnom puferu sa 150-200 pg FITC po mg proteina. Rastvor je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 2 časa i nastali 2B8-FITC konjugat je prečišćen na Sephadex G-25 koloni. Drugi reagensi upotrebljini u tim studijama, kao što su B1 i Leu 16, su nabavljeni kao fluorescin konjugati direktno od Coulter ili Becton Dickinson.

Ćelije koje je trebalo analizirati su prikupljene i isprane tri puta sa PBS-om sa 0.2% BSA

i 0.1% natrijum azida, Vijabilnost je determinisana pomoću tripan plavo isključivanja sa zahtevima vijabiliteta od >90%. Koncentracije ćelija su doterane do 3 miliona po ml sa 50pL dodanih po bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića sa U-dnom. Primarno antitelo (50pL) je dodano odgovarajućim bunarčićima i mešavina je inkubirana tokom 30 minuta do 1 čas na temperaturi ambijenta; nakon toga ćelije su isprane 5 puta sa 200 pL/bunarčiću PBS-a sa 0.2% BSA i 0.02% natrijum azida. Ćelije su centrifugirane na pločama na 1300 RPM tokom 1 minuta u Sorvall centrifugi i supernatant je uklonjen pažljivo "udarajući" ploče. Sekundarno antitelo, ako je potrebno, je dodano i inkubirano dodatnih 30 minuta do 1 časa na ambijentalnoj temperaturi u marku; banarčići su isprani kao i gore. Konačno, 200 pL pufera za fiksiranje (0.15 M natrijum hlorida sa 1% paraformaldehida, pH 7.4) je dodano svakom uzorku i tretirane ćelije prenesene u 12X75 mm tube za analizu.

b. Cela krv od cinomologih majmuna.

Nakon uklanjanja plazme, ćelije su isprane dva puta centrifugiranjem i resuspendovane u HBSS. Fetalni goveđi serum (2 mL) je dodan i ćelije su resuspendovane. Sto mikrolitara suspendovanih ćelija je zatim distribuirano u svaku od tuba za centrifugiranje od 6, 15 ml. Fluorescentno-obeležena monoklonalna antitela su dodana kako sledi: Tuba #1: Mišji anti-CD2-FITC (AMAC), 2.5 pg/mL, 5pg;

Tuba #2: kozji anti-humani IGM-FITC (Fisher), 2.5pg/mL, 5pg;

Tuba #3: kozji anti-mišji IgG-RPE (Fisher) 2.5pg/mL, 5pg;

Tuba #4: kozji anti-humani IGM-FITC + kozji anti-mišji IgG-RPE (apsorbovan) 2.5pg/mL, 5pg;

Tuba #5: anti-humani CD20-FITC (anti-Leu 16, Becton Dickinson), 5pg;

Tuba #6: Samo ćelije (auto-fluorescencija).

Obeležena antitela i ćelije su centrifugirani 2 minuta na 1500 rpm da se pomešaju ćelije

i antitela i svih 6 uzoraka su zatim stavljeni na led i inkubirani 30 minuta. Nakon toga tube su uklonjene sa leda i dodan je lizing pufer (prethodno zagrejan na 37°C) u zapremini od 12 mL. Uzorci su tada inkubirani 15 minuta na sobnoj temperaturi, centrifugirani 5 minuta na 4°C na 1500 rpm i supernatant je uklonjen. Taloži ćelija su zatim dva puta isprani puferom za obeležavanje (PBS sa 1% BSA i 0.05 natrijum azida).

Nakon toga ćelije su fiksirane dodavanjem 0.5 mL puferea za fiksaciju (0.15 M natrijum hlorid, pH 7.4, sa 1% paraformaldehida) po tubi i analizirani na Becton Dickinson FACScan instrumentu koristeći autokompenzaciju i prekalibraciju sa Calibrite perlama. Merena je zelena fluorescencija iz fluorescina u FL1 modu i crvena flurescencija iz fikoreterina je merena u FL2 modu. Podaci su prikazani u formi logaritma. Populacija vijabilnih limfocita je inicijalno identifikovana upravno u odnosu na prav ugao rasipanjem svetlosti na krivi bitmape. Ukupna populacija limfocita je zatim izolovana propuštanjem svih ostalih događaja. Uzastopna merenja fluorescencije prikazala su samo one specifične događaje koji su se odigrali unutar dobijenih oblasti.

Za ispitivanja farmakologije/toksikologije visokih doza određeni su niovoi limfocita pre ispitivanjaza svakog cinamologog majmuna i upotrebljeni kao polazne vrednosti. Procenat T- i B-ćelija i T:B odnosi su izračunati i upotrebljeni kao reference iscrpljivanja. Populacija B ćelija pre-ispitivanja je označena sa Leu 16 i anti-humani IgM antitela.

Naokon injektiranja 2B8 u majmune, kada je CD20 antigen zasićen sa 2B8, procenat B ćelija u ukupnoj populaciji je bio približno određen pomoću kozjeg anti-humanog IgM-FITC, anti-mišjeg IgG-RPE i dvosrukog bojenja populacije koja sadži ova dva markera. Dvostruko bojenje populacije je upotrebljeno za kvantifikovanje dok 2B8 nije očišćen iz periferne krvi životinja. Procenat T ćelija u ukupnoj populaciji limfocita procenjen je koristeći anti-CD2-FITC. Podaci su uprosečeni od tri, 10,000 merenja događaja napravljenih sa svakim uzorkom. Ćelije od svakog označenog uzorka krvi su procenjene naknadno, nabrojiviši u svakom slučaju subpopulacije T- i B-ćelija sa ukupnom populacijom limfocita. Takođe su ispitani odnosi T:B. Iscrpljivanje B-ćelija je izračunato kao procenat redukcije B-ćelija relativno u odnosu na originalne nivoe B-ćelija za svakog pojedinačnog majmuna.

3. Radiojodinizacija i imunotaloženje CD20

Sto miliona SB ćelija je podeljeno na dva jednaka dela nakon površinske jodinizacije sa<125>l i lodobeads (Pierce Chemical Co.). Ćelije su isprane više puta centrifugiranjem sve dok se nivoi radioaktivnosti u supernatantu nisu vratili na nivo pozadine. Sto mikrograma 2B8 ili B1 (Coulter Immunologv) antitela je dodano ma kojem od dva uzorka obeleženih B ćelija. Antitela i SB ćilije su inkubirani preko noći i zatim isprane tri puta putem centrifugiranja sve dok svo nevezano antitelo nije uklonjeno. Taloži ćelija koji su sadržalli vezane 2B8 i B1 su zatim lizirani i ekstrahovani dodavanjem 1% NP-40 deterdženta u 0.1 M tris-HCI, pH 8.0, praćenim inkubacijom na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Ekstrakt je centrifugiran u mikrofugi na visokoj brzini 30 minuta i supernatanti su preneseni u nove tube. U svaku tubu je dodan protein A-Sepharose (300 pL) i smola je oborena centrifugiranjem. Protein A-Sepharose je zatim ispran 20 puta da se ukloni ne specifično vezan jodinirani protein. Kada je peria-supernatant odnos radioaktivnosti dostigao vrednost 100, talog je ekstrahovan sa SDS PAGE puferom uzorka i zagrejan do ključanja. Nakon hlađenja, približno 15,000 cpm svakog ekstrakta je dodano u bunarčiće 10% poliakrilamidnog gela. Prethodno obojeni standard male molekularne težine (BioRad Inc.) dodan je odvojenim bunarčićima i upotrebljen za procenu molekularne težine. Proteini su razdvojeni elektroforezom i gel je osušen i izložen ploči filma za X-zrake tokom 24 časa na -70°C; nakon toga film je razvijen i analiziran.

4. Scatchard analiza 2B8 vezivanja

Prečišćeni 2B8 je procenjen za očigledan afinitet putem Scatchard analize. Radioobeleženi 2B8 je pripremljen reakcijom sa<125>l u prisustvu lodobeads. Nakon uklanjanja slobodnog jodina radioobeleženo antitelo je inkubirano u različitim koncentracijama, u duplikatu, u rasponu od 5000 ng po bunarčiću do 35 ng/bunarčić sa 10,000 SB ćelija. Količina vezivanja antitela za ćelije je izračunata iz specifične aktivnosti "<25>l-obeleženog 2B8. Odnos vezano/slobodno antitelo je plotovan u odnosu na molarnu koncentraciju vezanog antitela i konstanta očiglednog afiniteta je određena iz odnosa odsečaka osa X i Y.

5. Pripremanje 2B8- MX- DTPA

a. Izvor MX- DTPA

Za neka pre-klinička ispitivanja, ugljenik-14-obeleženi 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilentriaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je obezbeđen kao suva čvrsta materija od Dr. Otto Gansow u Nacionalnom zdravstvenom institutu i čuvan na suvom na4°C zaštićen odsvetla. Štok rastvori helata su pripremljeni u Milli-Q vodi i koncentraciji određenoj procenjivanjem radioaktivnosti i koristeći specifičnu aktivnost jedinjenja. Štok rastvori generalno su bili 2-5 mM i čuvani su na -70°C u polipropilenskim tubama. Za druga ispitivanja, MX-DTPA je dobijen od Coulter Immunologv kao dinatrijumova so u vodi i čuvan na -70 °C.

b. Održavanje uslova bez metala

U dodatku na korišćenje reagenasa bez metala, rukovanje reagensima je izvođeno tako da se minimizuje kontaminacija metalom. Kada je moguće, plastični polipropilenski kontejneri kao što su flaše, pehari i graduisani cilindri su upotrebljavani. Oni su isprani sa Alconox i iscrpno isprani sa Milli-Q vodom pre upotrebe. U dodatku, nastavci za pipete bez metala (BioRad) su upotrebljeni za precizan rad sa malim zapreminama. Radi preciznog rukovanja sa većim zapreminama reagenasa upotrebljene su sterilne, plastične serološke pipete (dostupne u veličinama od 1 do 25 mL). Reakcije su prigodno izvedene u polipropilenskim tubama za mikrofuge sa poklopcem sa zavrtnjem (Sardstedt Industries; 1.5 mL kapacitet) ili polipropilenske konične tube (Costar; 15 mL i 50 pL). Kada se rukovalo sa tubama za dijalizu nošene su hirurške rukavice za jednokratnu upotrebu, prethodno isprane sa Milli-Q vodom.

c. Pripremanje antitela

Mišje anti-CD20 antitelo 2B8 je inicijalno prečišćeno iz ascitesa putem Protein A i QAE hromatografije. Za kasniji eksperiment 2B8 je prečišćeno iz supernatanata iz bioreaktora šupljih-vlakana koristeći isti proces prečišćavanja. Antitelo izvedeno iz šuplih-vlakana je zamenjeno za komercijalne svrhe CHO-izvedenim antitelom opisanim u primeru 2.

Antitelo je pripremljeno za konjugaciju prenošenjem u bicine-NaOH od 50 mM, bez metala, pH 8.6, sa 150 mM NaCI, korisreći dijalizu ili repetitivnu razmenu pufera. U nekim ispitivanjima, razmena pufera bila je postignuta pomoću repetitivne ultrafiltarcije sa Centricon 30 (Amicon) spin filterima (30,000D MVVCO). Generalno, 50-200 pL proteina (10 mg/mL) je dodano filter jedinici i 2 mL bicine pufera je dodano. Filter je centrifugiran na 4°C u Sorval SS-34 rotoru na 6,000 rpm tokom 45 minuta. Preostala zapremina bila je oko 50-1 OOpL. Taj proces je ponovljen dva puta sa istim filterom. Ostatak je prenesen u polipropilensku tubu od 1.5 mL sa poklopcem sa zavrtnjem, i procenjen na protein, razblažen do 10.0 mg/mL i čuvana na 4°C dok nije upotrebljena za konjugaciju. Za neka ispitivanja protein je prenesen u 50 mM natrijum citrat, pH 5.5 sa 150 mM NaCI i 0.05% natrijum azida koristeći isti protokol opisan gore.

d. Protokol konjugacije

Konjugacija 2B8 sa MX-DTPA je izvedena u polipropilenskim tubama na temperaturi ambijenta, Zamrznuti štok rastvori MX-DTPA su odmrznuti neposredno pre upotrebe. Tipično, 50-200pL antitela na 10 mg/mL je reagovalo sa helatom u molarnom odnosu helat prema proteinu 4:1. Reakcije su započete dodavanjem helat štok rastvora i laganim mešanjem; ostavljeno je da se konjugacija produži preko noći, generalno 14 do 20 časova, na temperaturi ambijenta. Nereagovani helat je uklonjen iz konjugata dijalizom ili repetitivnim ultrafiltriranjem, kao što je gore opisano, u normalni slani rastvor bez metala (0.9% w/v) sa 0.05% natrijum azida. Koncentracija proteina je doterana do 10 mg/mL i sačuvana na 4°C u polipropilenskoj tubi do radioobeležavanja.

e. Određivanje ugradnje helata

Inkorporacija helata je određena scintilacionim brojanjem i poređenjem dobijenih vrednosti sa prečišćenim konjugatom u odnosu na specifičnu aktivnost ugljenik-[14]-obeleženih helata. Za kasnija istraživanja, u kojm su upotrebljeni ne-radioaktivni helati dobijeni od Coulter Immunologv, inkorporacija helata je procenjena inkubiranjem konjugata sa viškom rastvora radioaktivnog nosačaXYpoznate koncentracije i specifične aktivnosti.

Ukratko, pripremljen je štok rastvor itrijum hlorida poznate koncentracije u 0.05 N HCI bez metala kojem je dodat<X>Ybez nosača (so hlorida). Alikvot tog rastvora je analiziran tečnim scintilacionim brojanjem da se odredi tačna specifična aktivnost reagensa. Zapremina itrium hlorid reagensa jednaka 3-puta broju mola helata za koji se očekuje da će biti pričvršćen za antitelo, tipično 2 mol/mol antitela je dodano u polipropilenske tube i pH je doteran do 4.0-4.5 sa 2 M natrijum acetatom. Konjugovano antitelo je dodano nakon toga i mešavina je inkubirana 15-30 minuta na temperaturi ambijenta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 20 mM EDTA do konačne koncentracije od 1 mM i pH rastvora je doteran do približno pH 6 sa 2 M natrijum acetata.

Nakon 5 minuta inkubacije cela zapremina je prečišćena hromatografijom visokih-performansi bez ograničenja u veličini koja je opisana niže. Isprane frakcije sa proteinom su kombinovane, koncentracija proteina je određena i alikvot je ispitan na radioaktivnost. Inkorporacija helata je izračunata koristeći specifičnu aktivnost preparacije<X>Yhlorida i koncentracije proteina.

f. Imunoreaktivnost 2B8- MX- DTPA

Imunoreaktivnost konjugovanog 2B8 je procenjena koristeći ELISA celih ćelija. SB ćelije srednje logaritamske faze prikupljene su iz kulture centrifugiranjem i isprane dva puta sa 1XHBSS. Ćelije su razblažene do 1-2 X 10<6>ćelija/mL u HBSS i aloquot-ovane u polistirenske mikrolitar ploče sa 96 bunarčića 50,000-100,000 ćelija/bunarčić. Ploče su osušene u vakumu tokm 2 časa na 40-45°C da se ćelije fiksiraju za plastiku. Ploče su čuvane suve na -20 °C sve do upotrebe. Za ogled, neposredno pre upotrebe, ploče su zagrejane do temperature ambijenta, zatim blokirane sa 1X PBS, pH 7.2-7.4 sa 1% BSA (2č). Uzorci za ogled su razblaženi u 1X PBS/1% BSA, naneseni na ploču i serijski razblaženi (1:2) u istom puferu. Nakon inkubiranja ploča tokom 1 časa na temperaturi ambijenta, ploče su isprane tri puta sa 1XPBS. Sekundarno antitelo (kozji anti-miš lgG1-specifični HRP konjugat) (50pL) je dodano u bunarčiće (1:1500 razblaženje u 1XPBS/1% BSA) i inkubirano 1 čas na temperaturi ambijenta. Ploče su isprane četiri puta sa 1X PBS praćeno dodavanjem ABTS rastvora supstrata (50 mM natrijum citrata, pH 4.5 sa 0.01% ATBS i 0.001% H202). Ploče su očitane na 405 nm nakon 15-30 minuta inkubacije. Antigen-negativne HSB ćelije su uključene u ogled da se prati ne-specifično vezivanje. Imunoreaktivnost konjugata je izračunata plotovanjem vrednosti apsorpcije u odnosu na dotični faktor razblaživanja i njihovim poređenjem sa vrednostima dobijenim koristeći prirodno antitelo (koje predstavlja 100% imunoreaktivnosti) testirano na istoj ploči. Nekoliko vrednosti na linearnom delu profila titracije je upoređeno i određena je srednja vrednost.

g. Stabilnost prirodnog 2B8 i 2B8- MX- DTPAin vitro

Za to 12-nedeljno procenjivanje stabilnosti antitela i konjugata, formulisani su alikvot-i 2B8 antitela i 2B8-MX-DTPA u njihovom normalnom slanom rastvoru ili normalnom slanom rastvoru koji sadrži 10 mM glicin-HCI, pH 6.8. Dvostruki setovi uzoraka inkubirani su na4°C i 30°C i uzorci su procenjivani nedeljno koristeći sledeće metode: SDS-PAGE (i redukujući i neredukujući), imunoogled imunoreaktivnosti enzima cele-ćelije pomoću ili SB (antigen pozitivnih) ili HSB (antigen-negativnih) ćelija kao uhvaćenih, elektroforeza na izoelektričnom fokusirajućem gelu (pH raspon, 3-10). U dodatku, efikasnost radioobeležavanja konjugata je procenjena na 4, 8 i12 nedelja putem radioobeležavanja konjugata sa<X>Yi analiziranja produkta putem SDS-PAGE i autoradiografskom analizom. Konačno, u odvojenoj studiji, alikvot-i 2B8-MX-DTPA su inkubirani na 4°C i 30°C tokom 10 nedelja, radioobeleženi sa 111 In i procenjeni u ispitivanju biodistribucije kod BALB/c miševa kako je niže opisano.

h. Imunohistološke studije

Imunohistološke studije i sa prirodnim i sa konjugovanim (2B8-MX-DTPA) antitelima obavljene su pomoću IMPATH laboratorija koristeći sekcije humanog tkiva fiksirane acetonom. Antitelo je prečišćeno iz supernatanta iz bioreaktora sa šupljim vlaknima pomoću hromatografije na protein A i Q Sepharose. Konjugati kliničkog kvaliteta pripremljeni su koristeći MX-DTPA iz Coulter Immunologv prema protokolu opisanom gore.

i. Imunoreaktivnost radioobeleženog 2B8- MX- DTPAin vitro

Za neke eksperimente upotrebljen je protokol ELISA celih ćelija za neobeležene 2B8-MX-DTPA. U kasnijim eksperimentima, imunoreaktivnost 111ln i ^V-obeleženih konjugata (svaki pripremljen na IDEC Pharmaceuticals ili alternativno na MPI Pharmacv Services, Inc.) je određena koristeći modifikovanu verziju u ogledu vezivanja cele-ćelije opisanom od Lindmo (3). Ukratko, povećane koncentracije srednje-logaritamske faze, antigen-pozitivnih SB ćelija ili antigen-negativnih HSB ćelija [20-30 X 10<6>ćelija/mL u puferu za razblaživanje (PBS, pH 7.4 sa 1% BSA, 0.1% želatin i, 0.02% natrijum azida)] su dodane dupliciranim setovima tuba. Radioobeleženi konjugat je razblažen do konačne koncentracije antitela od 1-5 ng/mL sa puferom za razblaživanje i 0.35 mL je dodano u svaku tubu. Nakon 75-90 minuta inkubacionog perioda na temperaturi ambijenta ćelije su oborene centrifugiranjem i sakupljeni su supernatanti. Radioaktivnost koja je preostala u frakciji supernatanta je određena gama ili scintilacionim brojačem. Podaci su plotovani kao količnik dodane ukupne radioaktivnosti podeljen sa radioaktivnosti vezanom za ćelije, u odnosu na inverziju broja ćelija po tubi. Odsečak y ose predstavlja imunoreaktivnu frakciju.

j. Stabilnost radioobeleženog 2B8- MX- DTPA u humanom serumuin vitro

In vitrostabilnost 111ln- i "V-obeleženog 2B8-MX-DTPA je određena inkubiranjem humanog seruma na 37°C tokom 96 časova. Pripremljeno je konjugovano antitelo i radioobeleženo sa 111 In ("mix-and-shoot" protokol) ili<W>Y kao što je opisano gore. Specifične aktivnosti<m>ln i<9>°Y-obeleženih konjugata bile su 2.5 i 14.6 mCi/mg, respektivno; radioobeleženi konjugati su suspendovani u puferu koji sadrži 75 mg/mL humanog serum albumina (HSA) i 1mM DTPA (itrijum-obeležen konjugat) ili puferu koji sadrži 50 mg/mL HSA (indijum-obeležen konjugat). Radioobeleženi konjugati su razblaženi 1:10 sa normalnim humanim serumom (inaktiviran bez toplote) i alikvot-i su aseptično stavljeni u sterilne poklopljene tube; te tube su zatim inkubirane na 37°C u periodu od 96 časova. U selekcionisanim vremenima uzorci konjugata uklonjeni su i analizirani sa ne redukovanom SDS-PAGE u 4-20% nagnutim gelovima praćenim autoradiografijom i instant tankoslojnom hromatografijom.

k. Stabilnost klinički- formulisanog " 1ln- 2B8- MX- DTPAin vitro

2B8-MX-DTPA konjugat je radioobeležen sa 111ln i upotrebljen bez prečišćavanja sa HPLC ("mix na shoot" protokol). Radioobeleženo antitelo je razblaženo u PBS-u i humanom serum albuminu (HSA) dodano u konačnoj koncentraciji od 50 mg/mL. Specifična aktivnost formulisanog radioobeleženog konjugata bila je 2.2 mCi/mg. Formulisani konjugat je nakon toga inkubiran na 4°C tokom 48 časova i alikvot-i su analizirani u vremenima od 0, 24 i 48 časova pomoću ne-redukovane SDS-PAGE u 4-20% nagnutom gelu praćenom autoradiografijom i

instant tankoslojnom hromatografijom. Imunoreaktivnost u svakoj vremeskoj tački je procenjena pomoću ogleda suspenzije celih ćelija opisanom u odeljku 1 gore.

I. In vitro stabilnost klinički- formulisanog 90Y- 2B8- MX- DTPA

2B8-MX-DTPA konjugat je radioobeležen sa<X>Yi prečišćen hromatografijom sa isključenom veličinom na HPLC pomoću 1X PBS kao puferom za ispiranje. Frakcije radioobeleženog konjugata su pulovane u humani serum albumin i DTPA i dodane u konačnoj koncentraciji od 75 mg/mL i 1 mM, respektivno. Specifična aktivnost formulisanog radioobeleženog konjugata bila je 14.6 mCi/mg. Formulisani konjugat je nakon toga inkubiran na 4°C tokom 48 časova i alikvot-i analizirani u vremenima od 0, 24 i 48 časova pomoću ne-redukovane SDS-PAGE u 4-20% nagnutom gelu praćenom autoradiografijom i instant tankoslojnom hromatografijom. Imunoreaktivnost u svakoj vremeskoj tački je procenjena pomoću ogleda suspenzije celih ćelija opisanom u odeljku 1 gore.

2. Izučavanja na životinjama

a. Ispitivanje visokim dozama farmakologija/ toksikologija primata pomoću 2B8

Antitelo 2B8 je procenjeno studijom farmakologije visokih doza izvršene pod GLP pravilima na VVhite Sands Research Center (ispitivanje broj 920111). Upotrebljeni su odrasli Macaca fascicularis (cinomologi) majmuni; svaka ispitivana grupa sastojala se od jednog mužjaka i jedne ženke. Antitelo je injicirano intravenski svakih 48 časova ukupno sedam injekcija. Ispitivanje je obuhvatilo pet grupa: grupa I (rastvor soli); grupa II (0.6 mg/kg); grupa III (2.5 mg/kg); grupa IV (10 mg/kg); i grupa V (10 mg/kg samo nultog dana).

Pre početka ispitivanja, krv je dobijena od svih 10 životinja i upotrebljena da se odredi pozadina reagensa i početne populacije B ćelija. Svi uzastopni uzorci krvi su iscrpljeni pre svake injekcije antitela. Grupe III i IV žrtvovane su 13-og dana radi kompletne nekroskopije i histopatologije.

Životinje u grupama I, II i V su izkrvarene u danima 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 i 52; približno 5 mL cele krvi je isceđeno u heparinizovane tube. Cela krv je čuvana na 4°C i analizirana u okviru 24 časa. Krv svake životinje je centrifugirana na 2000 rpm tokom 5 minuta i plazma supernatanta je uklonjena da se odrede nivoi 2B8 u serumu pomoću RIA (vidi RIA proceduru za specifične metode određivanja). Oboreni materijal koji je sadržao PBL i RBC je resuspendovan u FCS radi FACS analiza.

b. Farmakokinetičke studije sa 2B8 i 2B8- MX- DTPA

Određen je srednji poluživot serum beta od 2B8 kod cinamologih majmuna koristeći životinje grupe V (gore). Kozji anti-miš lgG1 (Fisher Scientific) je razblažen do 2.0 pg po ml u 10 mM boratnog pufera, pH 9.6 i 50 pL je dodano u svaki bunarćić ploče sa 96-bunarčića. Pušteno je da se antitelo veže za ploču tokom inkubiranja preko noći na 4°C ili tokom 2 časa na temperaturi ambijenta. Svaka ploča je blokirana tokom 30 minuta na temperaturi ambijenta sa 150 pL PBS sa 1% BSA po bunarčiću. Ploče su isprane destilovanom vodom i uzorci serumske plazme su primenjeni na svaki pojedinačni bunarčić u triplikatu u početnom razblaženju 1:100 praćenim serijskim razblaženjima 1:2. Prečišćeni 2B8 je dodan u prethodno iskrvarenom serumu i razblažen za upotrebu po standardnoj krivi sa 0.5 mg/mL; uzorci su razblaženi 1:100 i zatim serijski razblaženi kao i drugi uzorci. Ploče su inkubirane tokom1časa na temperaturi ambijenta i isprane 4 puta sa destilovanom vodom. Sekundarni reagens (kozji ant-miš igG1-HRPO) je zatim dodan u razblaženju 1:4000 i inkubiran na temperaturi ambijenta dodatni sat. Ploče su ponovo isprane u destilovanoj vodi dodan je 0.1 mL supstrata peroksidaze koji je sadržao vodonik peroksid. Ostavljeno ja da se iz reakcije razvije boja tokom 20 minuta; nakon toga apsorpcija je određena na 405 nm pomoću mikro poloče ELISA čitača. Rezultati su plotovani u pg antitela po mL seruma.

U dodatku,<p>n/2vrednosti 2B8 i 2B8-MX-DTPA su određene kod BALB/c miševa. Nekonjugovana 2B8 čuvana na -70°C u 1X PBS, pH 7.4/10% glicerol odmrznuta su, razblažena do 0.5 mg/mL i sterilno filtrirana. Konjugovano antitelo je pripremljeno sledeći standardne protokole ali bez ugljenik-[14]-obeleženog helata; inkorporacija helata bila je 1.5 mol/mol antitela. Prečišćeni konjugat je razblažen do 0.5 mg/mL u noramlnom slanom rastvoru (0.9%), sterilno filtriran i čuvan na 4°C sa prirodnim antitelom do upotrebe.

Miševi stari šest do osam nedelja injekcirani su sa 100 pL prečišćenog 2B8 antitela u koncentraciji od 250 pg/mL. Zatim su miševi iskrvareni retroorbitalnom punkturom u različitim vremenima u rasponu od 0 do 264 časa i serumi su analizirani na prisustvo prirodnog i konjugovanog 2B8 antitela imunoogledom enzima celih ćeija pomoću antigen-pozitivne B-ćelijske linije SB kao zarobljivača. Dobijeni podaci su plotovani kao koncentracije 2B8 ili 2B8-MX-DTPA u vremenu; iz tih rezultata generisan je plot linearne regresije i nagib je upotrebljen da se odrede Pl1ffi vrednosti.

c. Farmakološko/ toksikološka studija [ 89l- Y- 2B8- MX- DTPA kod cinamologih

majmuna

ltrijum-[89]-nosač 2B8-MX-DTPA je pripremljen putem protokola opisanog za inserciju<W>Y, sem što nije upotrebljeno HPLC prečišćavanje. Ne-radioaktivni materijal, metal koji je nosio konjugat je formulisan u 1X PBS sa 75 mg/mL HSA i 1 mM DTPA i procenjen u GLP studiji broj 920611 u VVhite Sands Research Center. U svaku od četiri grupe uključeni su po jedan mužjak i jedna ženka majmuna. Životinje su injekcirane intravenski svakih 48 časova za ukupno 7 injekcija sa sledećim količinama leka: grupa I (rastvor soli); grupa II (0.003 mg/kg); grupa III (0.03 mg/kg); i grupa IV (0.3 mg/kg). Životinje su procenjene tokom studije određivanjem telesne težine i temperatura, uzimanja hrane i vode, eliminacije, hernije seruma, hematologije, urinolize i fizičkih ispitivanja. Životinje u grupama I do IV iskrvarene su pre infuzije u danima 0, 2, 7, 10 i 14 i krv je analizirana za cirkulišuće nivoe B-ćelija putem FACS analiza.

d. Biodistribucija radioobeleženog 2B8- MX- DTPA

U preliminarnom istraživanju 111ln-obeleženi 2B8-MX-DTPA je procenjen u odnosu na tkivnu biodistribuciju kod BALB/c miševa starih šest do osam nedelja. Radioobeleženi konjugat je pripremljen koristeći 2B8-MX-DTPA kliničkog kvaliteta pomoću "mix-and-shoot" protokola opisanog gore. Specifična aktivnost konjugata bila je 2.3 mCi/mg i konjugat je formulisan u PBS-u, pH 7.4 sa 50 mg/mL HSA. Miševi su intravenozno injicirani sa 100 pL ,l1ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA (približno 21 pCi) i grupe od po tri miša su žrtvovane cervikalnom dislokacijom u 0, 24, 48 i 72 časa. Nakon žrtvovanja, rep, srce, pluća, jetra, bubreg, slezina, mišići i femur su uklonjeni, isprani, izmereni; takođe je za analizu uzet uzorak krvi. Radioaktivnost vezana za svaki primerak određena je gama brojanjem i nakon toga je određen procenat injektirane doze po gramu tkiva. Nije napravljen pokušaj da se odbije doprinos aktivnosti koji čini krv vezana sa pojedinačnim organima.

U odvojenom protokolu, alikvot-i 2B8-MX-DTPA inkubirani na 4°C i 30°C 10 nedelja su obeleženi sa<111>ln do specifične aktivnosti od 2.1 mCi/mg za obe preparacije. Zatim su konjugati upotrebljeni u studijama biodistrbucije kod miševa kako je to opisano gore.

Za doziometrijska određivanja, 2B8-MX-DTPA je radioobeleženasa11<1>ln do specifične aktivnosti od 2.3 mCi/mg i približno 1.1 pCi je injicirano svakom od 20 BALB/c miševa. Nakon toga, grupe od po pet miševa svaka su žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa i njihovi organi su uklonjeni i pripremljeni za analizu. Sem toga, delovi kože, mišića i kostiju su uklonjeni i procesovani za analizu; takođe su sakupljeni urin i feces i analizirani u vremenskim tačkama od 24-72 časa.

Koristeći sličan pristup, 2B8-MX-DTPA je takođe radioobeležen saXYi njegova biološka distribucija je procenjena kod BALB/c miševa nakon perioda vremena od 72 časa. Nakon prečišćavanja sa HPLC hromatogravijom isključene veličine, četiri grupe, svaka sa pet miševa, su injicirane intravenski sa približno 1 pCi klinički-formulisanog konjugata (specifična aktivnost: 12.2 mCi/mg); grupe su zatim žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa i njihovi organi i tkiva su analizirani kao što je opisano gore. Radioaktivnost vezana za svako tkivo primeraka je određena merenjem bremstrahlung energije sa gama scintilacionim brojačem. Zatim su vrednosti aktivnosti prikazane kao procenat injicirane doze po gramu tkiva ili procenat injicirane doze po organu. Dok su organi i druga tkiva više puta ispirani da se ukloni višak krvi, organi nisu prelivani. Prema tome od vrednosti aktivnosti organa nije oduzeta aktivnost nastala interno vezanom krvi.

e. Lokalizacija u tumoru 111ln- obeleženog 2B8- MX- DTPA

Lokalizacija radioobeleženog 2B8-MX-DTPA određena je kod atimičnih miševa koji su imali Ramos tumore B-ćelija. Atimični miševi stari šest do osam nedelja subkutano su injicirani (leva slabina) sa 0.1 mL RPMI-1640 sa 1.2 X 10<7>ćelija Ramos tumora koje su bile prethodno adaptirane da rastu kod atimičnih miševa. Tumori nastaju u toku dve nedelje i imaju raspon težine od 0.07 do 1.1 gram. Miševi su injicirani intravenski sa 100 pL<111>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA (16.7 pCi) grupe od tri miša su žrtvovane cervikalnom dislokacijom u 0, 24, 48 i 72 časa. Nakon žrtvovanja rep, srce, pluća, jetra, bubreg, slezina, mišići, femur i tumor su uklonjeni, isprani, izmereni; za analizu je takođe uzet uzorak krvi. Radioaktivnost vezana za svaki primerak određena je gama brojanjem i nakon toga je određen procenat injektirane doze po gramu tkiva.

3. Doziometrijska izračunavanja

Koristeći podatke za biodistribuciju dobijene sa BALB/c miševima injekciranim ili sa,<11>ln ili sa ^V-obeleženim 2B8-MX-DTPA (tabele 1-4 i 5-8), procene apsorbovane radijacione doze iz 1.0 mCi date doze pacijentu od 70 kg izračunate su koristeći pristup formulisan od strane Medical Internal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Societv of Nuclear Medicine. Biološki poluživoti radioobeleženih konjugata određeni su iz svake injicirane doze po organu, vrednosti određene iz podataka za biodistribuciju za svaki radioimuno konjugat. Za neka tkiva, npr., krv, procenjeno je da je biološko raspadanje radiokonjugata pratilo model dva-odeljka sa eksponencijalnim raspadanjem iz tih komponenti. Za druga tkiva, npr., jetru, čiji su nivoi aktivnosti ostali približno konstantni tokom 72 časa ispitivanja biodistribucije, procenjeno je da je biološki polu-život bio veoma dugačak i pripisana mu je vrednost 1000 časova.

Na sličan način, druge vrednosti biološkog polu-života su procenjene ili izračunate koristeći standardnu jednačinu za izračunavanje t1/2za eksponencijalno raspadanje. Kada su jednom vrednosti određene, varijable Tue, Tel, Te2,<A>1( A2i A, popisane u tabelama 9 i 10 određene su za svaki radioobeleženi konjugat koristeći jednačinu datu na vrhu svih tabela (izlazne varijable). Te vrednosti, kao i one prikazane na uzastopnim tabelama, izračunate su koristeći program napisan u Svmphonv spreadsheet (Lotus Development Corp.) od strane Mr. Philip Hagan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center, LA Jolla, CA 92161.

Koristeći ukupnu kumulativnu aktivnost (A) vrednosti iz tabela 9 i 10, i S vrednosti dobijene od MIRD Pamphlet broj 11 (tabele 11 i 12, i 13 i 14), doze apsorbovane radijacije određene su za svaki od radioobeleženih konjugata za nabrojana tkiva (tabele 15, 16, 17 i 18). U određivanju sažetka porcenjenih doza zračenja za indijum-obeležene konjugate date u tabeli 19, njegova-doza datog organa je sabrana sa apsorbovanom dozom proizvedenom aktivnošću u susednim organim ili tkivima. Međutim, u izračunavanju procena doze zračenja vrednosti pripisane itrijum-obeleženom konjugatu (tabela 20), neke od vrednosti su odsutne za nabrojana tkiva (npr., nadbubrežne žlezde). To je zbog karće dužine puta oslobođenih čestica 13, relativno u odnosu na dužinu-puta emitovane g čestice, obezbeđujući tako zanemarljiv doprinos aktivnosti od susednih tkiva i odsustvo primarne biodistribucije podataka za ta tkiva.

II. Rezultati

A .Ispitivanja sa 2B8 i 2B8- MX- DTPAin vitro

1_. Produkcija i karakterizacija anti- CD20 antitela 2B8

Ukupno devet fuzija rezultiralo je sa tri hibridoma koji su produkovali antitela koja su efektivno konkurisala radioobeleženom Coulter B1 antitelu. U svakom slučaju, hibridomi su rašireni na ploču sa 24 bunarčića. Prva dva antitela koja su izolovana iz fuzija 3 i 4 su izotipirana i oba identifikovana kao IgM. Treće antitelo, produkovano u fuziji 5 i označeno kao 2B8, je determinisano kao lgG1 kapa izotop i izabrano je za studije neprekidnosti. Klon 2B8.H11 je raširen i stavljen za dugotrajno čuvanje u tečni azot. Klon 2B8.H11 je subkloniran da produkuje klon 2B8.H11.G3 i ponovo da produkuje klon 2B8.H11.G3.G9. Taj klon je raširen radi daljih istraživanja i antitelo je prečišćeno sa protein A afinitetnom hromatografijom.

Ogled kompeticije pomoću neobeleženih 2B8 i Leu 16 i radioobeleženog Coulter B1 pokazao je da je 2B8 bio u stanju da inhibira vezivanje B1 za CD20 efikasnije nego podjednaka koncentracija bilo B1 bilo Leu 16 (slika 1). Slični rezultai su dobijeni (podaci nisu prikazani) u ispitivanju kompeticije pomoću FITC-konjugovanog 2B8, nativnog B1 i irelevantnih antitela UPC-10 i S-003 (IgG 2a i izotopa 1, respektivno).

Direktno vezivanje ćelijskog CD20 antigena pomoću 2B8 i B1 antitela je upoređeno putem FACS analiza koristeći CD20-pozitivne SB ćelije i CD-20 negatibne HSB ćelije. Rezultati prikazani na slici 2 ukazuju da je u odnosu na komparativne količine antitela za SB ćelije bilo vezano više 2B8 nego B1. Nije zapaženo značajno vezivanje SB ćelija sa irelevantnim antitelima. Zapažena je samo fluorescencija pozadine sa bilo kojim reagensom koristeći HSB ćelije. Ovi rezultati potvrđuju specifičnost interakcije 2B8 sa CD20 antigenom i sugerišu da 2B8 može imati viši afinitet za ćelije površine antigena od B1.

Da se odredi vidljiv afinitet 2B8, prečišćeno antitelo je radioobeleženo sa,<25>l i povećane koncentracije obeleženog antitela su inkubirane sa antigen-pozitivnim SB ćelijama; radioaktivnost asocirana sa ćelijom je određena nakon 1 časa inkubacionog perida (slika 3). Rezultati sugerišu da se 2B8 antitelo vezuje za CD20 antigen sa konstantom jasnog afiniteta od 4.3 X 10"<9>M.

Flow citometrijske studije sa limfocitima normalne humane periferne krvi ukazuje da je 2B8 bio specifičan za B-ćelije i nije reagovalo sa drugim tipovima limfocita (npr., T-ćelije, monocite, makrofage). FITC-obeleženo 2B8 je upoređeno sa B1-FITC i Leu 16-FITC koristeći istu populaciju humanih limfocita. Rezultati prikazani na tabeli 21 ukazuju da je 2B8 reagovao sa približno 14 procenata limfocita periferne krvi u odnosu na 12 procenata za Leu 16 i 11 procenata za B1. Populacija limfocita bazirana na drugom markeru B limfocita (CD-19) bila je između 11 i 14 procenata. Konačno, kada su humani limfociti periferne krvi inkubirani sa 2B8 i bilo B1 ili Leu 16 i zatim obojeni za brojanje sa CD19 markerom (Becton/Dickinson) dvostruko bojena populacija B limfocita bila je 9 procenata sa 2B8 i 10 procenata sa bilo B1 ili Leu 16. Ovi rezultati potvrđuju sličnost ovih reagenasa.

Tabela 21

Poređenje vezivanja 2B8 za limfocite humane periferne krvi sa drugim B- i T-limfocit specifičnim reagensima

Marker antitela

A. Jedno bojenje Procenat CD45 propuštenih limfocita

Ništa (autofluorescencija) 0

B1-FITC (Coulter Immunologv, (lgG2a,k) 11

Leu 16-FITC (Becton Dickinson, lgG1,k) 12

2B8-FITC (EDEC, IgGI.k) 14

B72.3-FITC (lgG1,k irelevantna kontrola) 4

Anti-CD4-FITC (Coulter lmmunology) 37

Anti-CD3-FITC (Becton Dickinson) 59

Anti-CD19-RPE (Becton Dickinson) 11

Anti-CD19-FITC (Becton Dickinson) 14

B. Dvostruko bojenje

B1-FITC/anti CD19-RPE 10

Leu 16-FITC/anti CD19-RPE 10

2B8 FITC/anti CD19-RPE 9

anti CD19-FITC/anti CD19-RPE 13

B1-FITC/anti Hu Ig RPE 10

2B8-FITC/anti Hu Ig RPE 10

b72.3-FITC/anti Hu Ig RPE 2

Leucogate Simultest 99

Imunoprecipitacija radioobeleženog ćelijskog antigena CD20 sa bilo 2B8 ili B1 rezultirala je precipitacijom duplih proteinskih vrsta koje se ne mogu razlikovati, sa molekulskim težinama od približno 33 i 35 KD (podaci nisu prikazani).

2. Produkcija i karakterizacija 2B8- MX- DTPA

2B8-MX-DTPA konjugat je produkovan reagovanjem antitela sa 4:1 molarnog viška izotiocijanatobenzil-3-metildietilen-triaminpentasirćetnom kiselinom (4). Tipično, 1-2 mola MX-DTPA helata je uvedeno po molu 2B8 antitela. Kako je prikazanim u rezultatima prezentiranim na slici 4, 2B8-MX-DTPA konjugat nije pokazivao jasan gubitak imunoreaktivnosti,vis a visnativni 2B8, kao i nativna i konjugovana 2B8 antitela pokazivala su gotovo identične B1 inhibicione profile; IC50 vrednosti za 2B8 i 2B8-MX-DTPA bile su približno 3 i 4 pg/mL, respektivno. Ti rezultati su dobijeni koristeći,<25>l-obeleženo B1 antitelo u radioimunoogledu celih ćelija izvedenom koristeći SB ćelije. Slični rezultati su dobijeni koristeći 2B8 ili 2B8-MX-DTPA kao inhibitora12Sl-obeleženog 2B8 vezivanja za SB ćelije; i 2B8 i njegov MX-DTPA konjugat inhibirali su,<25>I-2B8 vezivanje SB ćelija u koncentracijama od približno 3-4 pg/mL (podaci nisu prikazani).

Da se utvrdi stabilnostin vitroprirodnog 2B8 antitela i 2B8-MX-DTPA konjugata, uzorci u normalnom rastvoru soli ili slanom rastvoru sa 10 mM glicin-HCI, pH 6.8, su inkubirani na 4°C i 30°C tokom 12 nedelja • i alikvot-i su procenjivani nedeljno koristeći sledeće oglede: imunoreaktivnost pomoću enzimskog imunoogleda celih ćelija, SDS-PAGE u redukujućim i ne-redukujućim uslovima i elektroforezu na izoelktrično fokusiranom gelu. Dok ogled imunoreaktivnosti nije detektovao gubitak prepoznavanja antigena od strane antitela uzoraka inkubiranih na bilo kojoj od temperatura (slika 5), raspon izoelektričnog fokusiranja antitela (pH 7.30-8.40 nulte nedelje), koji je bio stabilan na 4°C, pokazuje opadanje od 0.2 pH jedinice na 30°C nakon šest nedelja (tabela 22). Međutim, pošto je to ograničenje eksperimentalne greške ogleda, taj rezultat može biti dvosmislen.

Konačno, koristeći ne redukujući SDS-PAGE, uzorci antitela sa 30°C pokazivali su više molekulske težine agregata nakon 1 nedelje (tabela 23). Densitometrijske analize gelova ukazale su da agregati predstavljaju između 8 i 17% od uzoraka (tabela 23). Međutim, kada su ti uzorci analizirani pomoću redukovane SDS-PAGE, nisu nađeni dokazi primeraka visokih molekulskih težina, sugerišući formiranje kovalentnih agregata antitela na 30°C. Ponovo, nije zapažen gubitak imunoreaktivnosti.

Za vreme trajanja ispitivanja stabilnosti, uzorci 2B8-MX-DTPA, inkubirani na 4°C i na 30°C takođe su testirani na inkorporaciju radiometala koristeći<X>Y. Uzorci procenjeni nakon 4, 8

i 12 nedelja inkorporirali su >90%<90>Y, bez obzira na temperaturu inkubiranja.

Konačno, u posebnoj studiji, alikvot-i 2B8-MX-DTPA inkubirani na 4°C i na 30°C tokom 10 nedelja su radioobeleženui sa<111>ln i njihova biodistribucija u tkivima određena je kod BALB/c miševa. Konjugati iz obe temperatutre konjugacije produkovali su slične bidistribucije (podaci nisu prikazani). Štaviše, dobijeni rezultati bili su slični rezultatima biodistribucije dobijenim kod BALB/c miševa koristeći<111>l-obeleženi konjugat čuvan na 4°C (vidi dole).

Utvrđeno je da su protokoli za radioobeležavanje<111>ln i<X>Yponovljivi. Tipično, dobijene su radioinkorporacije od >95% za<111>ln i >90% za<X>Y.Specifične aktivnosti za<111>l- i 90Y-obeležene konjugate bile su rutinski u rasponu od 2-3 i 10-15 mCi/mg antitela, respektivno. U početnom razvitku protokola radioobeležavanja<111>l i<90>Y, uklonjeni su nekompleksovani radioizotopi iz radioobeleženoog 2B8-MX-DTPA koristeći HPLC hromatogarfiju zasićenog gela. U kasnijim eksperimentima, prečišćavanje sa HPLC indijum-obeleženog konjugata eliminisano je zbog dobijenih visokih radioinkorporacija (>95%) sa tim izotopom.

Imunoreaktivnost<111>ln i<M>Y-obeleženih preparacija 2B8-MX-DTPA su analizirane metodom Lindmo (3). Pronađeno je da je<111>ln obeleženi 2B8-MX-DTPA 100% imunoreaktivan (slika 6) i 9CY-obeleženi konjugat je određen da ima 60% imunoreaktivnosti (podaci nisu prikazani).

3. Karakaterizacija 1" ln- i ^- obeleženog 2B8- MX- DTPA

Preliminarni eksperimenti sa<90>Y-obeleženim konjugatom pokazali su da se dogodila značajna degradacija antitela i gubitak imunoreaktivnosti na specifičnim aktivnostima >10 mCi/mg antitela. Prema tome, razvijena je formulacija da minimizira efekte radiolize. Dok je za jedan broj čistača slobodnih radikala niske molekulske težine utvrđeno da su efektivni, najefektivnije u čuvanju integriteta antitela i imunoreaktivnosti je humani serum albumin (HSA) (slike 7-9).

^-obeleženo antitelo je formulisano u 1 X PBS-u, pH 7.4 sa 75 mg/mL HSA; takođe je dodana dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) finalnoj koncentraciji od 1 mM da se osigura , da bilo koji<90>Y, koji može biti izgubljen iz antitela, bude helatiran. Degradacija 2B8-MX-DTPA, radioobeleženog na specifičnu aktivnost od 14.6 mCi/mg je procenjena na 0 i 48 časova koristeći SDS-PAGE i autoradiografiju. Slike 8 i 9 pokazuju da radioobeleženo antitelo ne pokazuje zanačajnu degradaciju nakon perioda od 48 časova kada se inkubira na 4°C. Analiza uz pomoć instant tankoslojne hromatografije pokazala je da je gubitak<90>Y bio manji od 2% tokom 48 časova inkubacije (tabela 24). Imunoreaktivnost je takođe bila relativno konstantna na 60% (tabela 24).

Radioobeleženi konjugati (1.6 mCi/mg specifične aktivnosti) su formulisani u PBS, pH 7.4, koji sadrže 75 mg/mL humani serum albumin i 1 MM DTPA i alikvote inkubirane na 4°C. Stabilnost konjugata je analizirana u vremenima prikazanim u SDS-PAGE i autoradiografijom, instant tankoslojnom hromatografijom i putem ogleda slepljivanja celih-ćelija. Rezultati pokazuju da se približno 96% radiometala preostalih asociralo sa konjugatom posle 48 časova na 4°C, i da imunoradioaktivnost antitela ostaje konstantna približno 60%.

Formulaciona ispitivanja izvedena su takođe sa 111ln-obeleženim konjugatom; specifična aktivnost bila je 2.2 mCi/mg. Radioobeleženo antitelo je procenjeno u 1X PBS-u, pH 7.4 sa 50 mg/mL HSA. Slika 10 pokazuje fotografije autoradiograma za inkubirane uzorke u nula i 48 časova; denzitometrijska analiza autoradiograma ukazuje da nije bilo degradacije radioobeleženog antitela za vreme toka ispitivanja (slike 11, 12). Instant tankoslojna hromatografska analiza uzoraka nije pokazala gubitak ,11ln (tabela 25); štaviše, imunoreaktivnost se održala na približno 100% (tabela 25).

Radioobeleženi konjugati (2.2 mCi/mg specifične aktivnosti) su formulisani u PBS, pH 7.4, koji sadrže 50 mg/mL humani serum na 4°C. Stabilnost konjugata je analizirana SDS-PAGE i autoradiografijom, instant tankoslojnom hromatografijom i putem ogleda slepljivanja celih-ćelija. Rezultati pokazuju da je preostalo približno 96% radiometala vezano sa konjugatom posle 48 časova na 4°C, i da imunoradioaktivnost antitela ostaje konstantna približno 100%.

Kada je klinički-formulisana preparacija 2B8-MX-DTPA, radioobeležena sa XY do specifične aktivnosti 14.6 mCi/mg, inkubirana tokom 96 časova na 37°C u humanom serumu i analizirana sa ne-redukujućim SDS-PAGE i autoradiografijom, izgubljeno je manje od 4% radioizotopa tokom trajanja inkubacionog perioda. Densitometrijski pregledi autoradiograma u nultom vremenu i 96 časova ukazali su na nepostojanje značajne degradacije radioobeleženog konjugata (slike 13-15). Ti reziltati potvrđeni analitičkom tankoslojnom hromatografskom analizom nultog i 96 časovnog uzoraka (tabela 26). Uzeti zajedno ovi rezultati sugerišu da je itrijum-obeleženi konjugat stabilan pod uslovima upotrebljenim u ovom istraživanju. Slični rezultati dobijeni su sa<111>ln obeleženim 2B8-MX-DTPA konjugatom (slike 16-18).

Uzorci humanog seruma koji sadrže<90>Y-2B8-MX-DTPA (specifična aktivnost 14.6 mCi/mg) su analizirani u vremenima prikazanim obeležavanjem 1 pl 1:20 razblaženja uzoraka na tankim trakama instant tankoslojne hromatografije: uzorci su analizirani u triplikatu. Tanke hromatografske trake su razvijene uzlaznom hromatografijom u 10% amonijum acetata u metano!:voda (1:1; v/v), osušene i uzdužno prepolovljene. Radoaktivnost asocirana sa gornjim i donjim polovinama svake tanke trake je zatim određena i procenat konjugat-vezane radioaktivnosti je izračunat. (Slobodni radiometal migrira sa frontom rastvarača dok protein-vezana radioaktivnost ostaje na početku.) Prikazane su srednje vrednosti svakog određivanja konjugat-vezane radioaktivnosti.

B. Ispitivanja na životinjama

1. Farmakološke/ toksikološke studije sa visokih doza 2B8 i 2B8- MX- DTPA

U GLP ispitivanju izvedenom u VVhite Sands Research Center (Studija broj 920111), cinamologim majmunima data je intravenska injekcija različitih doza 2B8. Uzorci krvi uzeti su pre svake nove injekcije i krv je procesovana za procenu flow citometrijom populacija limfocita (tabela 27).

Životinje u grupama I do IV su injektovane svakih 48 časova sa ukupno sedam injekcija; životinje u grupi V su injektovane jednom 0 dana. Životinje u grupama lil i IV su žrtvovane 14. dana.

Nisu zapaženi značajni farmakološki efekti vezani za davanje anti-CD20 antitela 2B8 ni na jednom kliničkom parametru procenjenom tokom trajanja istraživanja. Slično, nisu zapažene abnormalnosti tokom analize različitih histopatoloških primeraka dobijenih od životinja iz grupa III i IV.

Trajanje ispitivanja bilo je 14 dana i životinje su procenjene tokom ispitivanja u sledećim kategorijama: klinička zapažanja, telesna težina, telesna temperatura, uzimanje hrane i vode, eliminacija fecesa, hernija seruma, hematologija, urinoliza i fizička ispitivanja. Sem toga, životinje u svakoj grupi su iskrvarene u danima 0, 1, 7 i 13 i krv je analizirana na nivoe serumskog antitela (2B8) i za nivoe T- i B-ćelija. Trinaestog dana životinje u grupama III i IV su žrtvovane i izabrana tkiva su ispitana svetlosnom mikroskopijom nakon pripreme preparata. Procenjena tkiva bila su: srce, slezina, jetra, bubreg, pluća, cerbralni korteks, kičmena moždina, limfni čvor, stomak, ileum, crevo, skeletni mišić, testis/ovarijum, pankreas i koštana srž.

Kada je krv od tretiranih životinja analizirana za nivoe cirkulišućih T- i B-ćelija, životinje u grupama II do V pokazale su >50% gubitka cirkuličućih B-ćelija tokom 13-og dana (slika 19); davanje antitela nema efekta na nivoe T-ćelija (podaci nisu prikazani). Sve grupe koje su primile 2B8 pokazale su zasićenje B-ćelija i višak antitela u plazmi (nije prikazano). Životinje u grupi V, koje su primile jednu dozu od 10.0 mg/kg 2B8, takođe su pokazale redukciju u nivoima cirkulišućih B-ćelija ekvivalntno onoj zapaženoj kod životinja iz drugih grupa.

Životinje u grupama I, II i V su ispitivane do 52. dana (slika 20). Nivoi B-ćelija vratili su se do >70% normalnog 38. dana, sem kod jedne životinje iz grupe II (PRO804) i jedne životinje iz grupe V (PR0716). Nivoi cirkulišućih B-ćelija kod tih životinja ostali su približno 40% od normalnih nivoa nakon 52. dana.

U dodatku na ovo istraživanje, farmakološki efekti<89>Y-2B8-MX-DTPA su procenjeni na cinomolognim majmunima u GLP istraživanju izvedenom na VVhite Sands Research Center (studija br. 920611). Konjugat kliničkog kvaliteta napunjen je sa ne radioaktivnim<39>Y. Konjugati koji su nosili itrijum formulisani su u PBS-u, pH 6.8 sa 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA (klinička formulacija) i dati intravenski kao što je to opisano u odeljku Metodi.

Kao što to pokazuju rezultati na slici 21,<89>Y-obeležena 2B8-MX-DTPA ima malo ili ništa efekata na cirkulišuće B-ćelije kod tih životinja, bez obzira na datu dozu. U dodatku, sem generalnog iscrpljivanja limfocita (20-43%) nisu nađene značajne abnormalnosti ni u jednom procenjenom kliničkom parametru, uključujući herniju seruma, urinolizu, telesnu težinu i temperature.

2. Farmakokinetičko ispitivanje sa 2B8 i 2B8- MX- DTPA

Kao što je gore opisano, životinje u grui V GLP ispitivanja primile su pojedinačnu dozu od 10.0 mg/kg 2B8. Analiza linearne regresije ukazuje da je prirodno antitelo očišćeno iz cirkulacije kod tih majmuna sa p t1/2vrednosti za približno 4.5 dana. U sličnom istraživanju pomoću BALB/c miševa, P t1/2vrednosti za prirodne i konjugovane 2B8 su određeni analizom linearne regresije (nije prikazano) da budu 8.75 dana (slika 22). Ovi rezultati sugerišu da konjugati 2B8 nemaju efekta na njihovo čišćenje kod BALB/c miševa.

3. Biodistribucija i ispitivanje mesta lokalizacije tumora sa radioobeleženim 2B8-MX- DTPA

Na osnovu eksperimenta preliminarne biodistribucije opisanog gore (odeljak 2d), konjugovani 2B8 je radioobeležen sa<111>ln do specifične aktivnosti od 2.3 mCi/mg i približno1.1pCi je injicirano svakom od 20 BALB/c miševa da se odredi biodistribucija radioobeleženog materijala. Nakon toga, grupe od po pet miševa svaka, žrtvovane su u 1, 24, 48 i 72 časa i njihovi organi i deo kože, mišića i skeleta su uklonjeni i procesovani za analizu. Sem toga, sakupljeni su urin i feces i analizirani u vremenskim tačkama 24-72 časa. Nivoi radioaktivnosti u krvi nakapanoj od 40.3% injekcirane doze po gramu od 1 časa do 18.9% od 72 časa (tabele 1-4; slika 23). Vrednosti za srce, bubreg, mišiće i slezinu ostale su u rasponu od 0.7-9.8% tokom eksperimenta. Nivoi radioaktivnosti nađeni u plućima opadali su od 14.2% u prvom satu do 7.6% u 72 času; slično su respektivne injektirane doze za jetru po gramu bile 10.3% i 9.9%. Ovi podaci su upotrebljeni u određivanju procena zračenja absorbovane doze<11>,ln-2B8-MX-DTPA (tabela 19).

Biodistribucija ^V-obeleženog konjugata, koji ima specifičnu aktivnost od 12.2 mCi/mg antitela, procenjena je kod BALB/c miševa. Radioinkorporacije od >90% su dobijene i radioobeleženo antitelo je prečišćeno pomoću HPLC. Izbacivanje radioaktivnsosti je procenjeno u glavnim organoma i koži, mišićima, skeletu i urinu i fecesu nakon 72 časa i izraženo kao procenat injekcirane doze/g tkiva. Rezultati prikazani u tebelama 5-8 i slici 24 pokazuju da dok nivoi radioaktivnosti vezani sa iskapanom krvi od približno 39.2% injekcirane doze po gramu u 1 času do približno 15.4% nakon 72 časa; nivoi radioaktivnosti vezani sa repom, srcem, bubregom, mišićima i slezinom ostali su prilično konstantni na 10.2% ili manje tokom eksperimenta. Važno je da je radioaktivnost vezana sa kosturom bila u rasponu od 4.4% injekcirane doze po gramu kosti u 1. času do 3.2% u 72. času. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugerišu da je malo slobodnog itrijuma vezano sa konjugatom i malo slobodnih radiometala je oslobođeno tokom trajanja kursa ispitivanja. Ovi podaci su upotrebljeni pri određivanju procena zračenja absorbovane doze<90>Y-2B8-MX-DTPA (tabela 20).

Za ispitivanje lokalizacije tumora, 2B8-MX-DTPA je pripremljen i radioobeležen sa<l11>ln do specifične aktivnosti od 2.7 mCi/mg. Sto mikrolitara obeleženog konjugata (približno 24 pCi) je nakon toga injicirano svakom od 12 atimičnih miševa koji su imali Ramos tumore B-ćelija. Tumori su bili u rasponu težine od 0.1 do 1.0 grama. U vremenskim tačkama od 0, 24, 48 i 72 časa nakon injekcije, 50pL krvi je uklonjeno putem retro-orbitalne punkture, miševi su žrtvovani cervikalnom dislokacijom i rep, srce, pluća, jetra, bubreg, slezina, mišić, femur i tumor su uklonjeni. Nakon procesovanja i merenja tkiva, određena je radioaktivnost vezana sa tkivom svakog primerka koristeći gama brojač i vrednosti su izražene kao procenat injekcirane doze po gramu.

Rezultati (slika 25) pokazuju da su tumorske koncentracije<ni>ln-2B8-MX-DTPA ravnomerno porasle tokom trajanja eksperimenta. Trinaest procenata injekcirane doze je akumulirano u tumoru nakon 72 časa. Nasuprot tome nivoi u krvi pali su za vreme eksperimenta sa preko 30% u nultom vremenu na 13% nakon 72 časa. Sva druga tkiva (sem mišića) sadržala su između 1.3 i 6% injekcirane doze po gramu tkiva na kraju eksperimenta; mišićno tkivo sadržalo je približno 13% injekcirane doze po gramu.

C. Doziometrija

Sumarizovani doziometrijski podaci dobijeni iz studija distribucije kod normalnih BALB/c miševa prikazani su na tabelama 19 i 20, za indijum- i itrijum-obeležene konjugate, respektivno, su u saglasnosti sa podacima prikazanim u literaturi kada se uporede po milikiriju injektirane doze (5) i sugerišu da i itrijum i indijum-obeleženi konjugati 2B8 mogu biti sigurno procenjeni za kliničku efikasnost kod pacijenata sa limfomima.

D. Toksikologija

1. 2B8: Test generalne sigurnosti pojedinačne doze

Miševima i morskim prasićima data je pojedinačna intraperitonealna doza 2B8 (0.5 mL ili 5.0 mL, respektivno) i posmatrani su sedam dana. Nisu zapaženi jasni znakovi toksičnosti.

2. 2B8 i 2B8- MX- DTPA: Imunohistološka ispitivanja sa humanim tkivima

Reaktivnost tkiva mišjeg monoklonalnog antitela 2B8 je procenjena koristeći panel od 32 različita humana tkiva fiksirana u acetonu. 2B8 antitelo reaguje sa anti-CD20 antigenom koji ima vrlo ograničen put distribucije u tkivima, s obzirom da je zapažen samo u podskupu ćelija u limfoidnim tkivima uključujući ona hemopoetskog porekla.

U limfnom čvoru, imunoreaktivnost je zapažena u populaciji zrelih kortikalnih B-limfocita kao i proliferišućih ćelija u germinalnim centrima. Pozitivna reaktivnost je takođe zapažena u perifernoj krvi, područjima B-ćelija tonzila, beloj pulpi slezine i sa 40-70% medularnih limfocita nađenih u timusu. Pozitivna reaktivnost je takođe viđena u folikulima lamina propria (Pever's Patches) velikog intestinuma. Konačno, takođe su sa antitelom 2B8 bili pozitivni agregati razbacanih limfoidnih ćelija u stromi različitih organa, uključujući bešiku, grudi, cerviks, jednjak, pluća, parotidu, prostatu, mali intestinum i želudac.

Sve jednostavne epitelijalne ćelije, kao i slojeviti epitelijum i skvamozni epitelijum različitih organa, bili su ne reaktivni. Slično, ne reaktivnost je zapažena u neuroektodermalnim ćelijama, uključujući one u mozgu, kičmenoj moždini i perifernim nervima. Takođe je nađeno da su negativni mezenhimalni elementi, kao što su skeletne ćelije i ćelije glatke muskulature, fibroblasti, endotelijalne ćelije i polimorfonuklearne inflamatorne ćelije.

Tkivna reaktivnost 2B8-MX-DTPA konjugata je procenjena koristeći panel od šesnaest različitih humanih tkiva koja su bila fiksirana u acetonu. Kao što je to bilo prethodno pokazano sa prirodnim antitelom, 2B8-MX-DTPA konjugat je prepoznao CD20 antigen koji je pokazivao jako ograničen put distribucije s obzirom da je nađen samo u subpopulaciji ćelija limfoidnog porekla. U limfnom čvoru, imunoreaktivnost je zapažena u populaciji B-ćelija. Jaka reaktivnost je viđena u beloj pulpi slezine i u medularnim limfocitima timusa. Imunoreaktivnost je takođe zapažena u rasutim limfocitima u bešici, srcu, velikom intestinumu, jetri, plućima i uterusu i bila je pripisana prisustvu inflamatornih ćelija prisutnih u tim tkivima. Kao što je opisano za prirodno antitelo (gore), nije zapažena reaktivnost sa neuroektodermalnim ćelijama ili sa mezenhimalnim elementima.

III. Diskusija

Mišje monoklonalno anti-CD20 antitelo 2B8, produkovano od strane klona sa istom oznakom, pokazuje afinitet za antigen CD20 B-ćelija, koji može biti viši od onog zapaženog za B1 antitelo, kako je to određeno kompeticijom sa antitelima poznate specifičnosti za CD20 antigen, i pomoću Scatchard analize. Dalje, podaci imunotaloženjenja sugerišu da antigen istaložen sa 2B8 izgleda da je isti antigen kao i onaj istaložen sa B1, pošto su oba antitela istaložila duplo sa relativnom molekulskom težinom od 33 i 35 KD. Citofluorografska analiza specifičnosti 2B8 antitela za limfocite periferne krvi pokazuje da antitelo reaguje specifično sa B-ćelijama i nema pokazane reaktivnosti sa T-ćelijama ili drugim tipovima limfocita. Konačno, podaci o preliminarnoj stabilnosti sugerišu da je antitelo stabilno na 30°C tokom 12 nedelja bez gubitka imunoreaktivnosti.

Kada je 2B8 antitelo konjugovano sa metilbenzil dietilentriaminpentasirećetnom kiselinom (MX-DTPA), nije zapažena gotovo nikakva redukcija imunoreaktivnosti, relativno u odnosu na prirodno antitelo. Dalje, radioobeležavanje konjugata bilo sa<111>ln ili ?Y produkuje obeležene konjugate sa imnunoreaktivnošću od 100% i 60% respektivno. Ispitivanja stabilnosti<111>ln iliXY-obeleženih konjugata inkubiranih u humanom serumu tokom 96 časova na 37°C ukazuje na zanemarljiv gubitak radiometala tokom trajanja ispitivanja, sugerišući da će konjugati biti stabilni kada se klinički koriste.

Ispitivanja lokalizacije tumora kod atimičnih miševa pomoću indijum-obeleženog preparata 2B8-MX-DTPA pokazala su da se povećane količine konjugata vezuju za ćelije tumora tokom trajanja eksperimenta bez neuobičajene akumulacije u drugim tkivima. Štaviše, doziometrijske procene izvedene iz ispitivanja biodistribucije su u skladu sa podacima publikovanim u literaturi. Konačno, ispitivanja unakrsne reaktivnosti humanog tkiva sa prirodnim i konjugovanim antitelima indicirala su da oba antitela prepoznaju antigen sa visoko ograničenom distribucijom u tkivima, ragujući samo sa subpopulacijama ćelija limfoidnih tkiva, uključujući one hematopoetičnog porekla. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugerišu da konjugacija ne narušava tkivnu specifičnost antitela i da su radioobeleženi konjugati stabilni in vivo i da prepoznaju antigen CD20 prisutan na površini tumora eksperimentalno produkovanih kod atimičnih miševa.

Kada je 2B8 upotrebljen u ispitivanjima farmakologija/toksikologija visokih doza, antitelo nije produkovalo značajne farmakotoksične efekte na bilo kom od procenjenih parametara, bilo tokom ili nakon ispitivanja.- Slično tome, nisu zabelečene abnormalnosti tokom analize različitih histopatoloških preparata ispiatnih svetlosnom mikroskopijom. Iznenađujuće, sve upotrebljene doze antitela produkovale su zapaženo iscrpljivanje cirkulišućih B-ćelija. Nivoi cirkulišućih B-ćelija, međutim, vraćaju se na približno normalne nivoe kada je davanje antitela prekinuto. U grupi majmuna sa pojedinačnom dozom (grupa V) prirodno antitelo očistilo se iz cirkulacije sa jasnom P t1/2vrednosti od približno 4.5 dana. Predvidljivo, kada je farmakokonetička studija urađena kod BALB/c miševa 2B8 antitelo je očišćeno sa p t1/2vrednosti od 8.75 dana. Prema tome, uzeti zajedno, ovi podaci sugerišu da nativno antitelo može takođe obezbediti neke kliničke efekte kada se daje kao dopuna radioobeleženim konjugatima.

Ukupno naši podaci ukazuju da visok afinitet 2B8 antitela i negovog MX-DTPA konjugata pokazuje ograničen put reaktivnosti u humanom tkivu. Štaviše, kod primata, prirodno antitelo je ne-toksično i produkuje prolazno čišćenje B-ćelija; međutim, kada je jednom antitelo očišćeno iz cirkulacije nivoi B-ćelija vraćaju se razumno brzo. Sem toga, indijum- i itijum-obeleženi-MX-DTPA konjugati pokazali su se stabilnimin vitro,ne pokazujući gubitak radiometala tokom produženog inkubiranja u humanom serumu. Konačno, procenjena doza radioakumulacije izvedena iz biodistribucije<90>Y- ili,<11>ln-obeleženog 2B8-MX-DTPA kod BALB/c miševa su u saglasnosti, po milikiriju injecirane doze, sa procenama doze izvedene iz humanih kliničkih studija koristeći konjugate anti-zajedničkog idiotipa antitela radioobeležernog sa tim izotopima.

IV. SAŽETAK PREKLINIČKOG RAZVITKA "MIX-&-SHOOT" PROTOKOLA ZA

RADIOOBELEŽAVANJE<90>Y-2B8-MX-DTPA

A. Uvod

<90>Y-obeleženo mišje monoklonalno anti-CD20 antitelo (2B8) procenjeno je u fazi I kliničkog trijala za tretman povratnog limfoma B-ćelija. Originalni protokol upotrebljen za pripremanje itrijum-obeleženog antitela koristio je korak tečne hromatografije visokog režima (HPLC) za uklanjanje ne-proteinski vezanog radioizotopa pre formulacije i davanja pacijentima. Nažalost, taj proces je posebno dugotrajan, i rezultira dužem izlaganju antitela radioizotopu u nezaštićenom stanju. To rezultira povećanom radiolizom antitela pratećenom opadanjem

imunoreaktivnosti. Sem toga, komplikovani aspekt procesa čini teškim da se pripremi više od jedne doze dnevno u radiofarmaciji. Pojednostavljenje procesa će ubrzati implementaciju u klinici kao alternativa korišćenju NIPI Pharmacv Services kao radiofarmaciju.

Shodno tome, razvijena je izmenjena procedura radioobeležavanja pozivajući se na "mix-and-shoot" metod, koji izbegava potrebu za HPLC prečišćavanjem dok istovremeno održava visoku radioinkorporaciju i poboljšano zadržavanje imunoreaktivnosti. Ispitivanja stabilnostiin vitrokao i studije biodistribucije kod miševa pokazala su da radioobeleženo antitelo pripremljeno koristeći "mix-and-shoot" metod je uporedljivo sa materijalom proizvedenim u današnjim HPLC procesima. Rezultati ovih prekliničkih studija ukazuju da novi "mix-and-shoot" protokol može biti upotrebljen da se pripreme<90>Y-obeležena 2B8-MX-DTPA pogodna za kliničke trijale.

B. Materijali i metodi

Materijali

1. Ćelije

Humane limfoblastične ćelijske linije SB (CD20 pozitivne) i HSB (CD20 negativne;) dobijene su od American Type Culture Collection i održavane u RPMI-1640 sa 10% goveđeg seruma i snabdevene sa glutaminom.

2. Antitela

2B8 antitelo je prečišćeno od strane Manufacturing departmenta iz supernatanta iz bioreaktora sa šupljim vlaknima koristeći prethodno opisane protokole u IND (BB-IND 4850/4851).

3. Dodatni reagensi

ltrijum-[90] hlorid je dobijen od Amersham-a. Svi drugi reagensi dobijeni su iz izvora opisanih u priključenim izveštajima citiranim dole. Reagensi korišćeni za protokole radioobeležavanja procesovani su da se uklpne kontaminirajući joni teških metala koji mogu konkurisati sa radioizotopima tokom koraka radioobeležavanja (vidi odeljak Metodi). Reagensi su napravljeni u GMP uslovima od IDEC's Manufacturing department na osnovu utvrđenog Batch Production Records.

Metodi

1. Pripremanje 2B8- D4X- DTPA

MX-DTPA kliničkog kvaliteta dobijena je od Coulter lmmunology kao dinatrijumova so u vodi i čuvana je na -70°C. Konjugat (2B8-MX-DTPA) je pripremljen od strane Manufacturing department-a. Dve različite gomile konjugata upotrebljene su u ovim istraživanjima; obe su obezbeđene u normalnom slanom rastvoru u 10 mg/mL. Konjugat je napunjen u sterilne polipropilenske brizgalice od 2 mL i čuvan na 2-8°C.

2. Održavanje uslova sa niskim sadržajem metala

Sve manipulacije sa reagensima izvedene su tako da se umanji mogućnost kontaminacije metalima. Korišćeni su polipropilenski ili polistirenski plastični kontejneri kao što su flaše, pehari i graduisani cilindri. Pre upotrebe oni su oprani sa Alconox i iscrpno isprani sa Milli-Q vodom ili vodom za navodnjavanje (VVFIr). Nastavci za pipete bez metala (BioRad) upotrebljeni su da se pouzdano rukuje sa malim količinama. Veće zapremine reagensa manipulisane su koristeći sterilne, plastične, serološke pipete. Reakcije su prigodno izvođene u 1.8 mL mikro tubama sa poklopcem na zavrtanj napravljenim od polipropilena.

3. Određivanje radioinkorporacije

Radioinkorporacija je određena koristeći instant tankoslojnu hromatografiju (ITLC) u triplikatu prema SOP SP-13-008. Generalno, protokol je bio sledeći: radioobeleženi konjugat je razblažen 1:20 u 1X PBS-u sa 1mM DTPA ili 5 mM EDTA, zatim 1p-L nanet 1.5 cm od jednog kraja od 1 x 5 cm trake ITLC papira (Gelman Sciences). Papir je zatim razvijen koristeći 10% amonijum acetat u metanol:voda (1:1; v/v). Trake su osušene, isečene na pola unakrst i pomoću scintilacionog brojanja određena je vezana radioaktivnost svakog dela. Radioaktivnost vezana sa donjom polovinom trake (radioaktivnost vezana za protein) je iskazana kao procenat ukupne radioaktivnosti određene sabiranjem zapremina i gornje i donje polovine.

4. " Mix- and- shoot" protokol za itrijum- r90~ l- obeleženi 2B8- MX- DTPA

Antitela su radioobeležena sa<X>Yhloridom bez nosača obezbeđenog od Amersham u 0.04 M HCI. Alikvot radioizotopa (10-20 mCi/mg antitela) je prenesen u propilensku tubu i 0.02X zapremine 2 M natrijum acetata bez metala je dodano da se rastvor dotera do pH 3.6. 2B8-NaDTPA (0.3 mg; 10.0 mg/mL u normalnom slanom rastvoru) je odmah dodano i rastvor je pažljivo pomešan. Rastvor je proveren sa pH papirom da se potvrdi pH od 3.8-4.1 i inkubiran 5 minuta. Reakcija je zaustavljena prenošenjem reakcione mešavine u odvojene polipropilenske tube sa 1XPBS-om sa 75 mg/mL humanog serum albumina (HSA) i 1 mM dietilentriaminpentasi-rćetnom kiselinom (DTPA) i lagano pomešan. Radioobeleženo antitelo je čuvano na 2-8°C.

Specifična aktivnost je određena merenjem radioaktivnosti odgovarajućeg alikvot-a radioobeleženog konjugata. Ta vrednost je korigovana za efikasnost brojanja, u zavisnosti od koncentracije proteina konjugata, određene apsorpcijom na 280 nm i izražena kao mCi/mg proteina.

5. Imunoreaktivnost itijum- r90l- 2B8- MX- DTPAin vitro

Imunoreaktivnost ^V-obeleženog konjugata određena je koristeći SOP #SP13-009 baziranog na izmenjenoj verziji ogleda vezivanja celih ćelija opisanog od strane Lindmo. Povećavajući koncentraciju logaritamske faze, CD20-pozitivne SB ćelije iii CD20-negativne HSB ćelije su dodane u dvostrukim setovima polipropilenskih tuba od 1.5 mL; konačna koncentracija ćelija, 0.40 mL. Radioobeleženi konjugat je razblažen do konačne koncentracije antitela od 1-2.5 ng/mL i 0.35 mL je dodano svakoj tubi. Nakon 90 minuta inkubacije ćelije su oborene centrifugiranjem i prikupljeni su supernatanti. Radioaktivnost preostala u frakciji supernatanta je određena scintilacionm brojačem. Podaci su plotovani kao količnik ukupne dodane radioaktivnosti podeljene radioaktivnošću vezanom za ćelije u odnosu na inverziju ćelijskog broja po tubi. Odsečak ose predstavlja imunoreaktivnu frakciju.

6. Stabilnost klinički- formulisanog itrijum- f90]- 2B8- MX- DTPAin vitro

2B8-MX-DTPA konjugat je radioobeležen sa ?Y i formulisan kao što je opisano u "mix-and-shoot" protokolu datom gore. Pripremljene su dve gomile radioobeleženog konjugata; jedna gomila je bila upotrebljena za procenjivanje stabilnosti radioinkorporacije a druga gomila je upotrebljena da se proceni zadržavanje imunoreaktivnosti. Formulisani konjugati su inkubirani na 4°C tokom 48 časova i alikvot-ovi su analizirani u vremenima od 0, 24 i 48 časova koristeći ne-redukovani SDS-PAGE i autoradiografiju. Imunoreaktivnost u svakoj vremenskoj tački je procenjena koristeći gore opisani ogled.

7. Stabilnost itriium- f90l- 2B8- MX- DTPA u humanom serumuin vitro

Stabilnost ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA je procenjena inkubiranjem u humanom serumu na 37°C sve do 72 časa. Konjugovano antitelo je radioobeleženo sa itrijum-[90] i formulisano kao što je gore opisano. Radioobeleženi konjugat je razblažen 1:10 sa normalnim humanim serumom (ne-inaktiviranim toplotom) i alikvot-ovi su inkubirani u plastičnim tubama na 37°C. Uzorci su uklonjeni u selekcionisanim vremenima i analizirani koristeći ne-redukovani SDS-PAGE i autoradiografiju.

8. Biodistribucija itriium-[ 90l- 2B8- MX- DTPA

ltrijum-[90]-obeležen 2B8-MX-DTPA je procenjen na distribuciju u tkivima kod BALB/c miševa starih osam do deset nedelja. Radioobeleženi konjugat pripremljen je i formulisan kao što je opisano gore. Miševi su intravenski injecirani sa 5 pCi ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA i grupe od pet miševa su žrtvovane u 1, 24, 48 i 72 časa. Nakon žrtvovanja, rep, srce, pluća, jetra, bubreg, slezina, mišić, femur, su uklonjeni, isprani, izmereni; uzorak kn/i i kože je takođe uklonjen radi analize. Radioaktivnost vezana za svako tkivo određena je merenjem bremstrahlung zračenja koristeći gama brojač i određen je procenat injektirane doze po gramu tkiva i procenat injektirane doze po organu.

9. Doziometrija

Podaci o biodistribuciji dobijeni koristeći miševe injekcirane sa ^V-obeleženim 2B8-MX-DTPA upotrebljeni su da se izračunaju procene doza zračenja apsorbovanih od 1.0 mCi doza datih pacijentu od 70 kg. Procene su napravljene u skladu sa metodima prilagođenim od strane Medical Internal Tradiation Dose (MIRD) Committee od Societv of Nuclear Medicine. Ta izračunavanja obavio je Mr. Philip Hagan, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center, La Jolla, CA 92161.

10. Provera valjanosti protokola za pripremanje kliničkih doza ltrijum- r90"|- 2B8- MX-DTPA

(Referenca R&D objavljen naslov "Provera valjanosti Mix-and-Shoot"

Protokol radioobeležavanja za pripremanje kliničkih doza<90>Y-2B8-MX-DTPA; autor, P. Chinn; datum 22. april, 1994).

C. Rezultati

1. Pripremanje ltrijum-[ 90l- obeleženoq- 2B8- MX- DTPA pomoću " mix-&- shoot" protokola

Preliminarni eksperimenti procenjivanja kinetike reakcije radioobeležavanja sa 2B8-MX-DTPA i<xy>pokazala su da je na pH 3.6-4.0, 95% radioizotopa inkorporirano u reakcionom vremenu od 5 do 10 minuta. Ponovljivost te radioinkorporacije (95.7%±1.7%) je naknadno potvrđena ispitivanjem valjanosti protokolom odmeravanja (Referenca R&D izveštaj pod naslovom "Provera valjanosti "mix-and-shoot" protokola za radioobeležavanje za pripremanje kliničkih doza "Vobeleženog 2B8-MX-DTPA"; autor, P. Chinn; datum 22. april 1994). Pripremanje<M>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA koristeći "mix-and-shoot" protokol dalo je produkt koji je bio uporedljiv sa onim produkovanim sa HPLC metodom (vidi BB-IND 4850/4851). Nađeno je da je protokol radioobeležavanja ponovljiv sa specifičnim aktivitetima tipično u rasponu od 10do 15 mCi/mg antitela.

Imunoreaktivnost ^V-obeleženog 2B8-MX-DTPA pripremljenog korsteći protokol bila je tipično veća od 70% u poređenju sa 55-60% zapaženih pri proceni valjanosti za HPLC protokol (slika 26). Ova razlika je verovatno zbog redukovanog efekta radiolize zbog radukovanog vremena inkubiranja sa "mix-and-shoot" protokolom. Rezultat je bio tipičan i, kao što je to diskutovano niže, bio je predstavnik procena validnosti u protokolu odmeravanja za pripremanje kliničke doze radioobeleženog konjugata.

2. Stabilnost ^ V- obeleženog 2B8- MX- DTPAin vitro

Preliminarni eksperimenti sa nezaštićenim ^V-obeleženim konjugatom antitela pripremljenim koristeći HPLC procese pokazali su da je radioliza uzrokovala značajnu degradaciju antitela i gubitak imunoreaktivnosti. Prema tome, razvijen je formulacioni pufer da se minimizuju efekti radiolize. Pokazano je da je humani serum albumin (HSA) efektivan u smanjivanju degradacije antitela zbog radiolize. Procena je bila napravljena sa radioobeleženim konjugatom pripremljenim "mix-&-shoot" metodom da se potvrdi efektivnost formulacije u minimizovanju radiolize. ^V-obeleženo antitelo, radioobeleženo sa specifičnim aktivitetom od 14.5 mCi/mg antitela je formulisano u 1X PBS-u pH 7.4 sa 75 mg/mL HSA i 1 mM DTPA. Degradacija konjugata 2B8-MX-DTPA je procenjena u 0, 24 i 48 časova koristeći SDS-PAGE i autoradiografiju. Slike 2, 3 i 4 pokazuju da radioobeleženi konjugat pokazuje značajnu degradaciju nakon perioda vremena od 48 časova kada je inkubiran na 4°C. Instant tankoslojna hromatografska analiza pokazala je da nema gubitka<X>Y tokom 48 časova inkubacije; ti rezultati su potvrđeni sa SDS-PAGE/autoradiografska analiza (tabela 28). Imunoreaktivnost je takođe bila relativno konstantna na >88% (tabela 29).

Klinički formulisani<90>Y-obeleženi 2B8-MX-DTPA pri specifičnoj aktivnosti od 15.7 mCi/mg je inkubiran tokom 72 časa na 37°C u humanom serumu. Uzorci analizirani putem ne-redukujućeg SDS-PAGE i autoradiografijom (slika 30) nisu pokazali gubitak radioizotopa tokom trajanja inkubacionog perioda (tabela 30). Densitometrijski pregledovi autoradiograma u nultom vremenu i 72 časa nisu indicirali značajnu degradaciju radioobeleženog konjugata (slike 31 i 32). Ti rezultati su potvrđeni tankoslojnom hromatografskom analizom (tabela 30). Mora se primetiti da je rad ioin korpo racija antitela upotrebljenog u ovom ispitivanju bila niža od one dobijene u ispitivanjima valjanosti protokla obeležavanja. Ta manja rad ioin korpo racija bila je zbog redukovanog kvaliteta dozatora<X>Yhlorida upotrebljenog za ovu određenu preparaciju radioobeleženog antitela. Niža radioinkorporacija nije narušila zaključak da je itrijum-obeleženi konjugat pripremljen sa "mix-and-shoot" metodom stabilan pod tim inkubacionim uslovima.

Uzorci humanog seruma koji su sadržali<90>Y-2B8-MX-DTPA (specifična aktivnost 15.7 mCi/mg) su analizirani za ne-proteinsko vezivanje<90>Y u prikazanim vremenima putem instant tankoslojne hromatografije traka i SDS-PAGE/autoradiografiju.

3. Ispitivanja biodistribucije sa itrijum-[ 90l 2B8- MX- DTPA

Biodistribucija ^V-obeleženog konjugata sa specifičnim , aktivitetom od 11.5 mCi/mg antitela i radioinkorporacijom od >95%, je procenjena kod BALB/c miševa. Odlaganje radioaktivnosti u tkivima je procenjeno za glavne organe, kožu, mišić, skelet, urin i feces nakon 72 časa i izraženo kao procenat injekcirane doze po gramu tkiva i kao procenat injekcirane doze po organu. Rezultati prikazani u tabelama 31-34 i slici 33 pokazuju da nivoi radioaktivnosti vezani za krv su opali od približno 43% injekcirane doze po gramu (%ID/g) u prvom času do približno 16% nakon 72 časa; u 24 času i kasnije, nivoi radioaktivnosti vezanih sa srcem, bubregom i slezinom ostali su jako konstantni na 4-8%. Za pluća i jetru, radioaktivnost je opala od 10-12% u prvom času do 8%-10% u 72 času. Za kožu radioaktivnost je bila relativno konstanta na približno 3% od 24 časa do 72 časa. Radioaktivnost u gastrointestinalnom traktu bila je konstantna na 0.5-1% od 24 časa do 72 časa. Radioaktivnost za mišić ostala je približno 0.6% tokom trajanja ispitivanja. Uzimanje radioaktivnosti od strane femura (kostur) ostalo je manje od 4% u svim tačkama vremena ukazujući da je količina slobodnog itrijuma u preparaciji konjugata bila beznačajna i da je malo slobodnog radiometala oslobođeno tokom trajanja ispitivanja.

4. Doziometrija

Apsorbovane doze zračenja za "standard" čoveka od 70 kg izračunate za '"V-obeleženi konjugat koristeći podatke biodistribucije za miša (%ID/vrednosti za organ u tabelama 31-34) prikazane su na tabeli 35. Ovi rezultati su uporedljivi sa prethodno dobijenim rezultatima sa* °Y-obeleženim 2B8-MX-DTPA pripremljenim koristeći HPLC metod radioobeležavanja.

5. Valjanost protokola za pripremanje kliničkih doza itrijum- F90l- 2B8- MX- DTPA

Ukupno deset gomila za procenu valjanosti je pripremljeno u MPI Pharmacv Services, Inc. Rezultati testiranja svake gomile sumarizovani su na tabeli 36. Izračunata je srednja vrednost za svaki rezultat testa i zapažene standardne devijacije bile su odgovarajuće. Da se proceni varijabilnost procesa uzrokovana različitim vremenima obeležavanja, gomile #1 do #8 pripremljene su koristeći vreme obeležavanja od 10 minuta; gomile #9 i #10 pripremljene su koristeći reakciono vreme od 5 minuta. Na osnovu rezultata testa za deset gomila valjanosti, specifikacije oslobađanja su utvrđene. Specifikacije oslobađanja sumarizovane su u tabeli 37.

D. Diskusija

Originalni protokol radioobeležavanja za pripremanje ^-obeleženog 2B8-MX—DTPA koristi posebno težak i dugotrajn korak prečišćavanja HPLC-om da se iz preparacije ukloni ne-protein vezujući<M>Y. S ciljem da se pojednostavi taj proces i napravi pristupačnijim za upotrebu u klinici, napori su usmereni na eliminisanje koraka HPLC-a u korist onog što je nazvano "mix-and-shoot" protokol. Cilj je bio da se identifikuju uslovi radioobeležavanja koji će rezultirati vrlo visokom inkorporacijom izotopa u konjugatu, izbegavajući tako potrebu za korakom prečišćavanja. Otkriveno je da >95% radioinkorporacije može biti dobijeno na pH 3.6 sa inkubacijom od pet do deset minuta. Sem toga korist od ovog protokola je bilo povećanje zadržavanja imunoreaktivnosti (>70%), verovatno zahvaljujući kraćem vremenu izlaganja antitela visokoj energiji radioizotopa pre dodavanja humanog serum albumina što obezbeđuje zaštitu od radiolize. To zadržavanje imunoreaktivnosti je superiorno u odnosu na ono prethodno zapaženo kada je korišćen HPLC metod.

Ispitivanje stabilnosti sa ^V-obeleženim konjugatom pripremljenim koristeći "mix-and-shoot" protokol inkubiranim u formulacionom puferu (1XPBS sa 75 mg/mL humanog serum albumina i 1 mM DTPA) sve do 48 č na 4°C, pokazalo je da nema gubitka radioizotopa i da je zadržavanje imunoreaktivnosti kompletno. Ispitivanja stabilnosti rađena sa humanim serumom tokom 72 časa na 37°C takođe su ukazala na minimalan gubitak radioizotopa. Ti rezultati stabilnosti su uporedljivi sa onima prethodno viđenim sa konjugatima radiobeležnim koristeći HPLC protokol.

Biodistribucija sa ^V-obeleženim konjugatom pripremljenim protokolom "mix-and-shoot" kod BALB/c miševa ukazala je da ne postoji neuobičajeno odlaganje u tkivima. Ti rezultati sugerišu da radioobeleženo antitelo nije bilo značajno narušeno tako da dramatično deluje na karakteristike antitelain vivo.Ti rezultati su takođe komparativni sa onima prethodno dobijenim sa radioobeleženim konjugatima pripremljenim koristeći metod HPLC radioobeležavanja (vidi BB-IND 4850/4851). Doziometrijske procene za "standard" čoveka od 70 kg izračunate iz biodistribucije podataka za miša su u saglasnosti sa onima dobijenim sa konjugatom obeleženim koristeći HPLC proceduru (vidi BB-IND 4850/4851). Sem toga, rezultati doziometrije uporedljivi su sa rezultatima dobijenim za pacijente uključene u trijal koji je u toku (IDEC studija # 13.15), kada se porede po milikiriju injektirane doze. Za šest pacijenata u ovoj studiji, srednje vrednosti (rad ± SD) za celo telo, srce, jetru i slezinu bile su 1.40 ± 0.57, 10.50 ± 4.68, 9.89 ± 8.91 i 9.75 ± 6.00, respektivno.

Pre uvođenja "mix-and-shoot" protokola za obeležavanje za pripremu<90>Y-2B8-MX-DTPA kliničkog kvaliteta, bilo je neophodno da se ustanovi ponovljivost protokola. Prema tome, pripremljene su gomile za potvrđivanje koristeći različite količine<90>Y hlorida. Za deset pripremljenih gomila, vrednosti dobijene koristeći "mix-and-shoot" metod bile su u rasponu od60.6% do 93.3% sa srednjom vrednosti od 74.5% i medijanom od 72.1%. To zadržavanje imunoreaktivnosti je značajno bolje nego približno 60% prethodno dobijenog koristeći tekući HPLC metod (raspon od 54.9% do 65.1; srednja vrednost 60.2%). Prosečna radioinkorporacija za deset gomila bila je 95.75 (93.5% do 97.5%). Ova vrednost je uporedljiva sa onom prethodno viđenoj sa HPLC metodom (raspon od 91.7% do 93.7% i srednja vrednost 93.1%). Takođe, razultati za endotoksin, koncentraciju antitela, koncentaciju radioaktivnosti, specifični aktivitet, ukupnu radioaktivnost vijala, ukupnu koncentraciju proteina, pH i sterilnost bili su uporedljivi za deset gomila. Zajedno, ti rezultati potvrđuju ponovljivost "mix-and-shoot" metoda. Sem toga, mi smo procenili varijabilnost procesa zbog različitih vremena obeležavanja izvodeći reakcije za 5 i 10 minuta. S obzirom da nisu bile zapažene značajne razlike za dva reakciona vremena, odlučeno je da se kraće inkubaciono vreme koristi u protokolu.

E.Sažetak

Mi smo razvili proceduru za obeležavanje, naznačenu kao "mix-and-shoot" metod, za pripremanje kliničkih doza<M>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA koji izbegava potrebu za tekućim korakom korišćenja tečne hromatografije visokoh performansi (HPLC) za uklanjanje ne-protein vezanog radioizotopa. Pojednostavljeni protokol eliminiše taj mučan korak prečišćavanja dok istovremeno zadržava visoke nivoe inkorporacije radioizotopa (>95%) i popravlja zadržavanje imunoreaktivnosti (>70%). Utvrđeno je da je klinički-formulisani radioobeleženi konjugat stabilanin vitrokada se inkubira na 4°C tokom 48 časova na osnovu zadržavanja radioizotopa i imunoreaktivnosti. Sem toga, radioobeleženi konjugat bio je stabilan kada je inkubiran u humanom serumu na 37°C tokom 72 časa. Ispitivanja biodistribucije kod BALB/c miševa pokazala su da nema neuobičjenih deponovanja u tkivima, uključujući kostur. Procene apsorbovane doze zračenja kod "standarda" čoveka od 70 kg bile su uporedljive sa onima dobijenim u tekućim kliničkim trijalima koristeći<90>Y-obeleženi 2B8-MX-DTPA produkovan "mix-and-shoot" protokolom, bile su uporedljive sa onima koje su pripremljene koristeći konvencionalni HPLC proces. Potvrđivanje protokola odmeravanja za pripremanje radioobeleženog konjugata kliničkog kvaliteta pokazalo je da je metod ponovljiv i da je produkt uporedljiv sa onim produkovanim koristeći tekući HPLC metod. Rezultati ovih pre-kliničkih ispitivanja ukazuju da ovaj novi "mix-and-shoot" protokol može biti upotrebljen za pripremanje<90>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA pogodnog za upotrebu u kliničkim trijalima.

Detaljan opis preferiranih oblika

Primer 1. Kitovi za radioinkorporaciju i ogledi

I. Sažetak

Cilj predmetnog pronalaska bio je da se pronađe protokole za kit za radioobeležavanje za pripremanje<11>'In i<90>Y-obeleženog 2B8-MX-DTPA (ln2B8 i Y2B8, respektivno) i da se utvrde specifikacije oslobađanja za kliničke produkte. Protokoli za kitove za radioobeležavanje su ponovljivi u odnosu na radioinkorporaciju i vezivanje za antigen-pozitivne SB ćelije i ukazuje na prigodnost kita za radioobeležavanje za upotrebu u kliničkim trijalima. Preporučuje se da ln2B8 i Y2B8 specifikacije oslobađanja za radioinkorporaciju i vezivanje budu utvrđene na D95% i D70%, respektivno.

II. Uvod

<90>Y-obeleženo mišje monoklonalno anti-CD20 antitelo (Y2B8) tekuće je evaluirano u kliničkim trijalima za tretman povraćenih limfoma B-ćelija. Izotop itrijuma nema gama komponentu što ga čini nepogodnim za sisteme oslikavanja. Prema tome,<1>"ln obeleženi 2B8-MX-DTPA (ln2B8) biće korišćen da se utvrdi lokalizacija tumora i doziometrija kod pacijenta pre ili nakon tretmana sa itrijum-obeleženim terapeutikom. Protokol koji se tekuće koristi za pripremanje Y2B8 i ln2B8, označen kao "mix-and-shoot" metodi, produkuje radioobeležena antitela pogodna za klinička ispitivanja. Međutim, pojednostavljenje procesa obeležavanja ubrzaće pripremanje doze u kliničkom okruženju.

Novi kit za radioobeležavanje preferentno je sastavljen od četiri komponente: 1.) 2B8-MX-DTPA u normalnom slanom rastvoru sa malim sadržajem metala na 2 mg/mL, 2.) 50 mM natrijum acetata upotrebljenog da se rastvor radioizotopa dotera na odgovarajući pH za obeležavanje, 3.) formulacioni pufer (1X PBS, pH 7.4 sa 7.5% humanog serum albumina i 1 mM DTPA), 4.) prazan stakleni vijal od 10 mL (reakcioni vijal). Sve komponente su testirano sterilne i bez pirogena.

Ovaj izveštaj sumarizuje proveru vrednosti kita za radioobeležavanje koji je jednostavan i lak za upotrebu i koji daje radioobeležena antitela sa >95% radioinkorporacije i prihvatljivo zadržavanje vezivanja za antigen-pozitivne ćelije. Specifikacije testiranja oslobađanja preporučuju se za kliničke produkte.

III. Materijal i metodi za radioinkorporaciju

A. Reagensi u kitu za radioobeležavanje

1. 2B8-MX-DTPA, IDEC; lot# 082395RM2

2. 50 mM natrijum acetata, mali sadržaj metala, IDEC; lot# 082395RM3

3. Formulacioni pufer (1X PBS, pH 7.4 sa 75% (w/v) humanog serum albumina i 1 mM DTPA), IDEC, lot# 082395RM1

4. Reakcioni vijal, 10 mL, IDEC

B. Materijal i oprema

1 Biodex Tec-Control Radioincorporation Kit, Cat.#151-770

2 Rukavice: bez pudera

3 Sterilne polipropilenske siringe

4 Sterilne igle za siringe

5 Male tube sa poklopcima; 1.5 ml

C. Metodi

1. Pripremanje Y2B8 i ln2B8 koristeći kit za radioobeležavanje

Reagensi kita pripremljeni su i napunjeni u staklene vijale sa pregradom. Borosilikatni vijali tip I (2 ili 10 mL) isprani su sa sterilnom vodom za injekcije (WFI) i autoklavirani pre punjenja. Pregrada od butil gume je isprana sa sterilnim WFI i autoklavirana pre upotrebe. Reagensi su ručno napunjeni i stavljeni u Class 100 sobu i testirani za pirogenost i sterilnost koristeći USP metode.

a. Preparacija ln2B8

Dodatni reagensi:

1. Indijum-[111 ]: hlorid so, bez nosača, u HCI.

Upozorenja:

1. Svi koraci preferentno se izvode koristeći aseptične tehnike.

2. Komponente kita za radiobeležavanje moraju da se ostave da se zagreju do sobne temperature pre upotrebe. 3. Konačni produkt mora se davati pacijentu unutar 8 časova kompletiranja koraka 9 niže.

Protokol za radioobeležavanje ln2B8

Procedura

1. Zapremina11<1>lnCI3koja treba da se doda u reakcioni vijal izračunata je na sledeći način:

a. Koncentracija radioaktivnosti u vremenu radioobeležavanja u mCi/ml:

C0= Koncentracija radioaktivnosti u vreme kalibracije (vidi sertifikat analize proizvođača).

At = Pramena u vremenu (pozitivan broj u post kalibraciji, negativan broj je pre kalibracija).

b. Zapremina11<1>lnCI3koja treba da se doda reakcionom vijalu: 2. Zapremina 50 mM natrijum acetata koja treba da se doda reakcionom vijalu izračunata je na sledeći način: Zapremina,<11>lnCI3koja treba da se doda (korak 1b) X (1.2) = zapremina 50 mM natrijum acetata koja treba da se doda 3. Pregrada reakcionog vijala i vijal sa 50 mM natrijum acetata je izbrisana alkoholom. Koristeći siringu 1 cc, izračunata zapremina 50 mM natrijum acetata (korak 2) je prenesena u reakcioni vijal. 4. Pregrada11<1>lnCI3izvora je izbrisana alkoholom. Vijal je otvoren sa iglom snabdevenom sa sterilnim filterom od 0.2 pm. Koristeći sterilnu siringu od 1 cc, potrebna zapremina (korak 1b) 111 lnCI3 je prenesena u reakcioni vijal. Vijal je promešan obrtanjem nekoliko puta. 5. Pregrada 2B8-MX-DTPA vijala je izbrisana alkoholom. Koristeći sterilnu siringu od 1 cc, 1.0 mL 2B8-MX-DTPA polako preneseno u reakcioni vijal. Vijal je promešan obrtanjem nekoliko

puta.

6. Reakcija je ostavljena da traje 30 minuta ± 5 minuta na temperatuir ambijenta.

7. Ukupna zapremina reakcione mešavine izračunata je dodavanjem zajedno zapremine dodatog,<l1>lnCI3(korak 4), zapremine dodatog 50 mM natrijum acetata (korak 3) i zapremine dodatog 2B8-MX-DTPA (korak 5). 8. Zapremina formulacionog pufera koju treba dodati reakcionom vijalu da se dobije konačna zapremina od 10 mL je izračunata oduzimanjem ukupne količine izračunate u koracima 7 do 10. 9. Vijal za formulacioni pufer izbrisan je alkoholom i vijal je otvoren. Zahvaljujući viskoznosti formulacionog pufera, reakcioni vijal je otvoren sa iglom snabdevenom sa filterom za siringu od 0.2 pm. Koristeći sterilnu siringu od 10 cc, snabdevenu sa odgovarajućom iglom, zapremina formulacionog pufera izračunata u koraku 8 je prenesena u reakcioni vijal. Igla za otvaranje je uklonjena iz reakcionog vijala i vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta (konačni produkt). Ovaj vijal je inkubiran najmanje 5 minuta pre obavljanja "ogleda inkorporacije". Boja rastvora bila je žuta i vijal je bio pun, potvrđujući da je dodan formulacioni pufer. 10. Ukupna radioaktivnost vijala konačnog produkta izmerena je koristeći odgovarajući set instrumenata za merenje<111>ln.

11. Konačni produkt je odmah čuvan na 2°C-8°C za "ogled vezivanja".

b. Pripremanje Y2B8

Dopdatni reagensi:

1. ltrijum-[90]: hloridna so, bez nosača u HCL.

Upozorenja:

1. Svi koraci preferentno se izvode koristeći aseptične tehnike.

2. Komponente kita za radiobeležavanje moraju da se ostave da se zagreju do sobne temperature pre upotrebe. 3. Konačni produkt mora se davati pacijentu unutar 8 časova kompletiranja koraka 8 niže.

Protokol za radioobeležavanje Y2B8

1. Zapremina '"VCL, koja treba da se doda u reakcioni vijal izračunata je na sledeći način:

a. Koncentracija radioaktivnosti u vremenu radioobeležavanja:

C0= Koncentracija radioaktivnosti u vreme kalibracije (vidi sertifikat analize proizvođača).

At = Promena u vremenu (pozitivan broj u post kalibraciji, negativan broj je pre kalibracija).

b. Zapremina<30>YCI3koja treba da se doda reakcionom vijalu: 2. Zapremina 50 mM natrijum acetata koja treba da se doda reakcionom vijalu izračunata je na sledeći način:

a. Za<M>YCI3u 0.040 M HCI (Amersham):

Zapremina<90>YCI3(korak 1 b) x (0.8) = zapremina natrijm acetata koja treba da se doda

b. Za "VCL, u 0.045 M HCI (Nordion):

Zapremina ^CL, (korak 1b) X (1.0) = zapremina natrijum acetata koja treba da se doda. 3. Pregrada reakcionog vijala i vijal natrijum acetata je izbrisana alkoholom. Koristeći siringu 1 cc, izračunata zapremina (korak 1a ili 1b) od 50 mM natrijum acetata (korak 2) je prenesena u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta. 4. Pregrada 90YCI3 izvora je izbrisana alkoholom. Vijal je otvoren sa iglom snabdevenom sa sterilnim filterom od 0.2 pm. Koristeći sterilnu siringu od 1 cc, potrebna zapremina (korak 1b) 90YCI3 je prenesena u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta. 5. Pregrada 2B8-MX-DTPA vijala je izbrisana alkoholom. Koristeći sterilnu siringu od 3 cc, 1.5 mL 2B8-MX-DTPA polako preneseno u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko

puta.

6. Ukupna zapremina reakcione mešavine izračunata je dodavanjem količine dodatog Y-90 hlorida (korak 4), plus količina od 50 mM dodatog natrijum acetata (korak 3) plus količina dodatog 2B8-MX-DTPA (korak 5). 7. Zapremina formulacionog pufera koju treba dodati reakcionom vijalu da se dobije konačna zapremina od 10 mL je izračunata oduzimanjem ukupne količine izračunate u koracima 6 do 10. 8. Vijal za formulacioni pufer izbrisan je alkoholom i vijal je otvoren. Zahvaljujući viskoznosti formulacionog pufera, reakcioni vijal je otvoren sa iglom snabdevenom sa filterom za siringu od 0.2 pm. Koristeći sterilnu siringu od 10 cc, snabdevenu sa odgovarajućom iglom, zapremina formulacionog pufera izračunata u koraku 7 je prenesena u reakcioni vijal. Igla za otvaranje je uklonjena iz reakcionog vijala i vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta (konačni produkt). Ovaj vijal je inkubiran najmanje 5 minuta pre obavljanja "ogleda inkorporacije". Boja rastvora bila je amber i vijal je bio pun, potvrđujući da je dodan formulacioni pufer. 9. Ukupna radioaktivnost vijala konačnog produkta izmerena je koristeći odgovarajući set instrumenata za merenje 90Y.

10. Konačni produkt je odmah čuvan na 2°C-8°C dok nije bio potreban za davanje pacijentu.

11. Test imunoaktivnosti:

Koristeći sirngu od 1mL, aseptično je uklonjen 0.1 mL iz reakcionog vijala i prenesen u odvojenu tubu sa poklopcem na zavrtanje od 1.5 mL. Tuba je odmah čuvana na 2°C-8°C za "ogled vezivanja" i "ogled radioinkorporacije.

Proveravanje valjanosti protokola za kit za radioobeležavanje je obavljeno na IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Huston, TX), Mavo Clinic (Rochester, MN) i Cyty of Hope (Duarte, CA). Sve komponente kita, uključujući 2B8-MX-DTPA kliničkig kvaliteta, pripremljene su od strane IDEC Pharmaceuticals pod GMP uslovima (uslovi dobre proizvodnje prema federalnim pravilima) i proverena im je sterilnost i otsustvo pirogena. Radioobeležena antitela su formulisana sa 1X PBS sa 7.5% (w/v) humanog serum albumina (HSA; klinički kvalitet; Baxter-Hyland) i 1 mM DTPA. Rezultati testa oslobađanja obavljeni na svakoj gomili za potvrđivanje opisani su niže.

Šest gomila za potvrđivanje svaka sa ln2B8 i Y2B8 pripremljene su od strane pet operatora. Ove gomile su dizajnirane na sledeći način i izvedene sa sledećom opremom:

ln2B8:

#1: IDEC Pharmaceuticals

#2: IDEC Pharmaceuticals

#3: IDEC Pharmaceuticals

#4 MD Anderson Health Center

#5 Mayo Clinic

#6: City of Hope

Y2B8:

#1: IDEC Pharmaceuticals

#2: IDEC Pharmaceuticals

#3: IDEC Pharmaceuticals

#4 MD Anderson Health Center

#5 Mayo Clinic

#6: City of Hope

2. Pripremanje liofoliziranih SB i HSB ćelija

Humane ćelijske linije SB (CD20-pozitivne) i HSB (CD20-negativne) dobijene su od American Type Culture Collection i kultivisane u T-posudama koristeći RPMI-1640 sa 10% fetalnog kravljeg seruma snabdevenog sa 2% glutamina. Kulture su držane na 37°C i 5% C02. Ćelije se tipično razdvajaju 1:2 svakog drugog dana i prikupljaju na 0.5-2.5 x 10<5>ćelija/mL i vijabilitetima od >80%. Koncentracijie ćelija određene su koristeći hemacitometar a vijabilnost je određena isključivanjem tripan plavog.

Ćelije su prikupljene na temperaturi ambijenta pri gustini ćelija od 0.5-2 X 10<6>ćelija/mL centrifugiranjem (1300 rpm u Sorvall centrifugi) i isprane dva puta sa 1X HBSS. Oborene ćelije su resuspendovane do 50 x 10<6>Ćelija/mL u 1X HBSS sa 1% (w/v) goveđeg serum albumina (BSA) i 10% (w/v) manitola (liofilizirani pufer), 0.5 mL rasejano u 1.5 mL polipropilenske tube za mikrofuge sa o-prstenom i "čuvane na -70°C, i liofilizirane preko noći na 30 - 60 militora. Tube sa liofiliziranim ćelijama čuvane su isušene na 2 - 8°C i rekonstituisane u sterilnoj vodi za ogled; tube ćelija liofiiiziranih u tubama za mikrofugu čuvane su sa isušivačem.

3. Analitički ogledi

Analitički metodi koji su korišćeni da se ispita valjanost gomila od ln2B8 i Y2B8 opisani su dole. Sledeći ogledi su izvedeni za svaku gomilu za potvrđivanje:

1. Ogled vezivanja koristeći liofilizirane SB ćelije

2. Y2B8/ln2B8 ogled radioinkorporacije koristeći Biodex Kit

a. Ogled vezivanja

Procenat vezivanja je utvrđen od strane svakog operatora koristeći liofilizirane CD20 pozitive SB ćelije prema sledećem od protokla koji slede za ln2B8 i Y2B8, respektivno. Ti ogledi obezbeđuju brz i efektan metod potvrđivanja da radioobeleženo antitelo još uvek prepoznaje CD20 kao antigen. Na jednom kliničkom mestu, CD20-negativne HSB ćelije procenjene su takođe. Liofilizirane ćelije pripremljene su i čuvane prema gornjem metodu, "Pripremanje liofiiiziranih SB i HSB ćelija".

i; Ogled vezivanjaln2B8

Dodatni reagensi:

1. lndijum-[111]-2B8-MX-DTPA

2. Liofilizirane SB ćelije; tri tube sa 25 X 10<6>ćelija/tuba

3. Liofilizirane HSB ćelije; tri tube sa 25 X 10<ž>ćelija/tuba

4. Sterilna voda za navodnjavanje ili sterilna voda za injekcije.

5. Pufer za razblaživanje (1X PBS, pH 7.2 - 7.4 sa 1% goveđeg serum albumina (BSA) i 0.02% natrijum azida 0.2 pm filtriranim i čuvanim na sobnoj temperaturi

6. Staklene ili plastične test tube za brojanje radioaktivnosti.

Procedura:

Okruženje ogleda (ne-radioaktivna oprema)

1. Dobijene su tri tube liofiiiziranih SB i HSB ćelija.

2. Zapremina od 0.50 mL SWFI (sterilna voda za injekcije) je dodana u svaku tubu i tube su mućkane dok nije dobijena homogena suspenzija. 3. Četiri prazne tube za mikrofuge od 1.5 mL. Tri od tuba od 0.50 mL pufera za razblaživanje je dodano, predstavljajući kontrolu bez ćelija. 4. U drugu tubu za mikrofuge od 1.5 mL dodano je 0.99 mL pufera za razblaživanje; ta tuba je obeležena 1:100. 5. Dobijena je sterilna polipropilenska tuba za mikrofugu od 50 mL sa poklopcem i u tubu je dodano 10 mL pufera za razblaživanje.

Okruženje ogleda (radioaktivna oprema)

1. Dobijeno radioaktivno antitelo čuvano je na 2° - 8°C.

2. Zapremina od 0.01 mL je uklonjena sa P20 i dodana u tubu za mikrofugu od 1.5 mL koja je sadržala 0.99 mL pufera za razblaživanje (1:100 razblaženje). Nastavak je ispran i tuba je lagano promućkana da se izmeša. 3. Zapremina od 0.20 mL je uklonjena sa P200 iz tube sa 1:100 razblaženjem i dodana u konusnu tubu sa 10 mL pufera za razblaživanje. Tube su energično promešane.

Protokol ogleda

1. Svim tubama dodana je zapremina od 0.50 mL razblaženog111ln2B8-MX-DTPA.

2. Poklopci su sigurnosno zatvoreni na svim tubama i tube su lagano promućkane tokom

60 minuta.

3. Nakon 60 minuta inkubacije na temperaturi ambijenta, sve tube su centrifugirane tokom

5 minuta na najmanje 2000 g.

4. Zapremina od 0.75 mL svakog supernatanta je prenesena u odgovarajuće tube za merni instrument. 5. Radioaktivnost u tubama je izbrojana koristeći gama brijač, doteran u odnosu na pozadinu.

ii. Ogled vezivanja Y2B8

Dodatni reagensi

1.<90>Y-2B8-MX-DTPA

2. Liofilizirane SB ćelije

3. Sterilna voda za navodnjavanje ili sterilna voda za injekcije.

4. Pufer za razblaživanje (1X PBS, pH 7.2 - 7.4 sa 1% goveđeg serum albumina (BSA) i 0. 02. natrijum azida)

Procedura:

Preparacija uzorka radioobeleženog antitela

1. Dobijeno radioobeleženo antitelo čuvano je na 2° - 8°C.

2. Zapremina od 10 pL je uklonjena sa P20 i dodana u tubu za mikrofugu od 1.5 mL sa 990 pL pufera za razblaživanje (1:100) razblaženje. Nastavak je ispran i tuba je lagano izmućkana. 3. Dobijena je sterilna polipropilenska tuba od 50 mL za polopcem i 10 mL pufera za razblaživanje je dodano koristeći serološku pipetu od 10 mL. 4. Zapremina od 35 pL je uklonjena sa P200 iz tube sa razblaženjem 1:100 i dodana u konusnu tubu sa 10 mL pufera za razblaživanje. Snažno promešaj.

Preparacija liofiiiziranih ćelija

1. Dobijene su tri tube liofiiiziranih SB ćelija.

2. Svakoj tubi je dodana zapremina od 0.5 mL SWFI, i tube su izmučkane sve dok se nije dobila suspenzija pojedinačnih ćelija. 3. Dobijene su tri prazne tube za mikrofuge od 1.5 mL; u tri tube dodano je 0.5 mL pufera za razblaživanje koje su predstavljale kontrolu bez ćelija.

Protokol ogleda

1. Zapremina od 0.5 mL razblaženog<90>Y-MX-DTPA je dodan svakoj tubi.

2. Tube su stavljene na kraj nakon miksiranja od 45 minuta, nakon pravljenja sigurnosne kape su sigurnosno pričvršćene. 3. Nakon 45 minuta inkubiranja na temperaturi ambijenta, ćelije su oborene mikrocentrifugiranjem tokom 5 minuta.

4. Zapremina od 0.8 mL supernatanta je prenesena u sintilacione vijale.

5. Svakom vijalu dodan je scintilacioni koktel.

6. Količina radioaktivnosti svakog vijala određena je koristeći scintilacioni brojač, doteran za pozadinu.

b. Ogled radioinkorporacije

Procenat radioinkorporacije određen je instant tankoslojnom hromatografijom (ITLC) koristeći Biodex Tec-Control Radiochromatografic Kit prema sledećem protokolu:

Dodatni materijali i oprema:

1. '"In- ili<90>Y-radioobeležen 2B8-MX-DTPA

2. Tube za brojanje radioaktivnih TLC traka

3. Makazice

4. Sterilne siringe, 1 cc

5. Sterilne igle, 26G

6. Gama brojač ili scintilacioni brojač

7. Pipetor

Procedura:

1. Prvo se mora pročitati kompletno uputstvo za rad Biodex-a.

2. Svaki radioobeleženi uzorak je testiran u triplikatu prema uputstvu za kit; razvijena je jedna traka po vijalu. 3. Da se nanese radioaktivni uzorak na hromatografsku traku upotrebljen je pipetor da se na početnu liniju nanese 1 pL. Alternativno, može biti naneta jedna mala kap raspršena iz 26G igle pričvršćena za sterilnu 1 cc siringu. 4. Svaka sekcija je prebrajana za aktivnost koristeći odgovarajući brojač, tj., gama brojač za<11l>ln i scintilacioni brojač za30Y,doteran za pozadinu.

5. Praćene su instrukcije Biodex-a za izračunavanje procenta radioobeleženog antitela.

IV Rezultati

Rezultati testiranja svake grupe za procenu vrednosti ln2B8 i Y2B8 sumarizovani su u tabelama 38 i 39.

V Diskusija i zaključci

Da se pojednostave tekući metodi za radioobeležavanje ln2B8 i Y2B8 razvijen je četvorokomponenti kit. Koncentracije natrijum acetata i 2B8-MX-DTPA su redukovane na 50 mM i 2 mg/mL, respektivno, da se omogući pouzdan transfer zapremine pomoću siringa. Sve komponente kita su preferentno napunjene u staklene vijale sa pregradom i pre oslobađanja testirane na sterilnost i pirogenost putem IDEC, eliminišući tako potrebu da se ti testovi obave na klinikama. Na licu mesta, manipulisanje svim reagensima izvedeno je koristeći sterilne siringe i igle. Prema tome, pridržavanje aseptičkih tehnika koje se uobičajeno nalaze u radiofarmakološkom okruženju, obezbeđuje da radioobeležena i formulisana anti-tela budu pogodna za davanje pacijentu.

Ponovljivost i izdržljivost protokola za radioobeležavanje ln2B8 i Y2B8 su procenjene izvođenjem nekoliko ispitivanja valjanosti koristeći različite ' gomile svakog radioizotopa. Za šest pripremljenih gomila za potvrđivanje ln2B8, vezivanje je bilo u rasponu od 82.1% do 86.8% sa srednjom vrednosti od 85.1%; vrednosti radioinkorporacije bile su približno 99% (raspon 98.3%-99.4%). Za šest pripremljenih gomila za potvrđivanje Y2B8, dobijeni procenat vezivanja bio je u rasponu od 78.6% do 87.0% sa srednjom vrednosti 82.3%. vrednosti radioinkorporacije za Y2B8 imale su srednju vrednost 98.8% (raspon 96.3%-99.5%). Ovi rezultati zajedno potvrđuju ponovljivost i izdržljivost metoda kita za radioobeležavanje za pripremanje i ln2B8 i Y2B8. Na osnovu ovih rezultata ispitibanja valjanosti, preporučeno je da se specifikacije oslobađanja za rdioinkorporaciju i vezivanje ustanove na >95% i >70%, respektivno, za ln2B8 i Y2B8.

Sem toga, zbog povećane jednostavnosti upotrebe i redukovane mogućnosti grešaka tokom preparacije, preporučeno je da procenat vezivanja koristeći liofilizirane CD20-pozitivne ćelije i radioinkorporaciju se upotrebi za test oslobađanja ln2B8 i Y2B8 na klinici.

Sumarizovano, ovi rezultati zajedno ukazuju da su ln2B8 i Y2B8, pripremljeni koristeći kit za radioobležavanje pogodni za uporebu u kliničkom okruženju. Sem toga, za radioobeležavanje oba antitela, ustanovljene su specifikacije za oslobađanje koje odražavaju rezultate nekoliko ispitivanja valjanosti od strane pet različitih operatora.

Primer 2. Radioinkorporacija i vezivanje - kitovi i ogledi

I. Sažetak.

Mišje anti-CD20 monoklonalno antitelo označeno 2B8 klonirano je u CHO ćelijama da se dobije ćelijska linija sa visokom ekspresijom. Specifičnost CHO-izvedeneog antitela za za CD20-pozitivne humane ćelije pokazana je pomoću FACS analiza i kompetitivnog vezivanja. Zapaženo je zanemarljivo vezivanje za humane T-ćelije. Koristeći ogled vezivanja određeno je da je afinitet antitela za CD20-pozitivne ćelije 1.3 X 10'<10>M. Antitelo je reagovano sa helatirajućim agensom MX-DTPA da formira konjugat, 2B8-MX-DTPA, sa zanemarljivim gubitkom imunoreaktivnosti (vrednost afiniteta bila je 4.4 X 10'<10>M). Optimalna konjugacija helatora, određena merenjem radioinkorporacije<111>ln, dostignuta je osam časova nakon reakcije. Protokoli za radioobeležavanje 2B8-MX-DTPA optimizovani su za<X>Yili 111 In u odnosu na pH i vreme inkubacije da se obezbedi maksimalna radioinkorporacija (>95%) i zadržavanje imunoreaktivnosti (>70%). Specifikacije oslobađanja za ln2B8 i Y2B8 pripremljene koristeći CHO-izvedene 2B8-MX-DTPA u kliničkim trijalima preporučene su za radioinkorporaciju (>95%) i vezivanje za liofilizirane i rekonstituisane CD20-pozitivne humane ćelije (>70%). Ovi rezultati uzeti zajedno ukazuju pogodnost CHO-izvedenog 2B8-MX-DTPA za upotrebu u kliničkim trijalima.

II. Uvod

2B8 antitelo, prethodno upotrebljeno, produkovano je u bioreaktorima sa šupljim vlaknima. Da se redukuju troškovi proizvodnje ovog antitela, ono je klonirano i eksprimirano u CHO ćelijama da se dobije ćelijska linija visoke ekspresivnosti. Ovaj primer opisuje rezultatein vitrokarakterizacije CHO-izvedenog 2B8 antitela, konjugovanog antitela (2B8-MX-DTPA) i ?Y i ,11ln - obeleženog antitela produkata pripremljenih koristeći kliničke protokole kita za radioobeležavanje.

III. Materijali i metodi

A; Reagesti

Humane ćelijske linije SB (CD20-pozitivne) i HSB (CD20-negativne) dobijene su od American Type Culture Collection i kultivisane u T-posudama koristeći RPMI-1640 sa 10% fetalnog goveđeg seruma snabdevenog sa 2% glutamina. Kulture su održavane na 37°C i 5% C02. Ćelije su obično razdvajane 1:2 svakog drugog dana i prikupljene na 0.5-2.5 x 10<6>ćelija/mL i vijabilnosti od >80%. Koncentracije ćelija određene su koristeći hemacitometar a vijabilnost je određena isključivanjem tripan plavog. Posebna informacija o gomilama ćelija zabeležena je u Notebook# 1553 i u binderu pod naslovom "Dnevnik aktivnosti ćelije 1995 & 1996", koji je napisao Ron Morena.

CHO-izvedeno 2B8 je produkovano u GMP uslovima u IDEC-ovoj proizvodnoj opremi. Antitelo je formulisano u normalnom slanom rastvoru sa malim sadržajem metala na 11.5 mg/ml. Određeno je da je antitelo homogeno pomoću SDS-PAGE. 2B8-MX-DTPA je produkovan u GMP uslovima prema PSBR-043 iz CHO-izvedenog 2B8 i formulisan u rastvoru sa malim sadržajem metala na 2 mg/mL (gomile # 0165A i 0165B).

<111>ln farmaceutskog kvaliteta je obezbeđen od Amersham (U.K.) ili Cvclotron Products Inc. (Coral Gables, FL). Itrijum[90] hlorid je dobijen od Amersham (U.K.), Nordion International (Kanatta, Canada), ili Pacific Northvvest National Llaboratory (Richland, WA). MX-DTPA pripremljen pod GMP dobijen je od Hauser Chemical (Boulder, CO). Kalcijum trinatrijum dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) kliničkog kvaliteta dobijena je od Heyl (Berlin, Germany). TAG-NHS je dobijen od IGEN Inc. (Rockville, MD). Mišje anti-CDl9 perlice su

nabavljene Dynal Inc. (Lake Success, NY). Kozji anti-miš FITC-obeleženi F(ab')2nabavljen je od Jackson ImmunoResearch.

Reagensi koji su zahtevali uklanjanje kontaminirajućih teških metala tretirani su dozatorom sa Chelex100 (BioRad Industries) ili sa Chelating Sepharose (Pharmacia) propuštanjem rastvora kroz kolonu. Rastvori sa malim sadržajem metala razblaženi su sa Sterile VVater for Irrigation (SVVFIr). Rastvori su čuvani u sterilnim plastičnim kontejnerima.

Dole su opisani dodatni reagensi za specifične metode.

B. Materijali i oprema

1. Origen Analvzer; IGEN Inc. Model # 1100-1000; IDEC #1492

2. Top-Count scintilacioni brojač; Packard, Model #A9912; IDEC #1329

3. Gama brojač; Isodata, Model # 20-10; IDEC #0628

4. TEC-Control radiohromatografski kit, Biodex, Model #151-770

5. Lvophilizer; Virtis, Model Freezemobile 12; IDEC #0458

Za specifične metode opisani su dodatni materijali i oprema.

C. Metodi

1_. Pripremanje liofilizovanih SB i HSB ćelija

Ćelije su kultivisane kao što je to gore opisano i prikupljene na temperaturi ambijenta pri ćelijskoj gustini od 0.5-2 X 10<6>Ćelija/mL centrifugiranjem (1300 rpm u Sorvall centrifugi) i isprane dva puta sa 1XHBSS. Oborene ćelije su resuspendovane do 50 x 10<6>ćelija/ml u 1X HBSS sa 1% (w/v) goveđeg serum albumina (BSA) i 10% (w/v) manitola (pufer za liofiliziranje), 0.5 mL raspršene u tube za mikrofugu od 1.5 mL sa o-prstenovima i čuvane na -70°C i liofilizirane preko noći na 30 - 60 militora. Tube sa liofiliziranim ćelijama su čuvane isušene na 2 - 8°C i rekonstituisane u sterilnoj vodi za ogled; tube ćelija liofiiiziranih u tubama za mikrofuge čuvane su sa isušivačem.

2. FACS analiza vezivanja

Direktno vezivanje za humane B-ćelije je određeno flow citometrijom Povećane koncentracije antitela inkubirane su u 1X PBS, pH 7.2, sa 1% (w/v) BSA (pufer za vezivanje) sa 5 X 10<6>CD20-pozitivnih (SB) ili CD20-negativnih (HSB) ćelija tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane centrifugiranjem, resuspendovane u puferu za vezivanje i inkubirane sa FITC-obeleženim kozjim anti-miš F(ab') 30 minuta na ledu. Nakon inkubiranja sa sekundarnim reagensom ćelije su isprane centrifugiranjem i resuspendovane u 1X PBS sa 1.1% (v/v) formaldehida da se fiksiraju ćelije. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije određena je flow citometrijom.

3. Ogled kompetitivnog vezivanja

Imunoreaktivnost 2B8 i 2B8-MX-DTPA je određena kompetitivnom vezivanjem za CD20-pozitivne ćelije koristeći ORIGEN elektrohemiluminiscentni metod (Leland i Povvell). SB ćelije u log-fazi prikupljene su iz kulture i dva puta isprane sa 1XHBSS. Ćelije su razblažene u 1X PBS pH 7.2 sa 1% (w/v) goveđeg serum albumina. U nekim eksperimentima, su upotrebljene liofilizirane ćelije nakon rekonstitucije sa sterilnom vodom.

Tragačko rutenijum-obeleženo antitelo je pripremljeno inkubiranjem iz CHO-izvedenog 2B8 (gomila#165) u1X PBS, pH 7.2 sa N-hidroksisukcinimid estrom od rutenijum (II) tris-bipridin helatorom (TAG-NHS) pri 15:1 molarnom odnosu TAG-NHS prema antitelu. Nakon 1 časa inkubacije na temperaturi ambijenta, zaštićenim od svetla, reakcija je prekinuta sa glicinom 10 min. Ne reagovani TAG je uklonjen hromatografijom isključene veličine koristeći Pharmacia PD-10 kolonu uravnoteženu sa 1X PBS-om. Koncentracija proteina određena je koristeći Bradford ogled za proteine. Inkoropracija TAG-a je određena merenjem apsorbovanosti na 455 nm. Izračunato je da je molarni odnos TAG-a prema proteinu 3.0.

Ogledi su izvedeni u polipropilenskim tubama od 12 X 75 mm . Različite količine konkurišućeg antitela (0.002 - 17 ug/mL) inkubirane su u 1X PBS-u, pH 7.2, sa 1% (w/v) BSA sa 0.8 ug/mL TAG-obeleženog CHO 2B8, 0.08 mg/mL anti-CD19 perlica i 167,000 ćelija/mL. Nakon inkubiranja na temperaturi ambijenta sa orbitalnim mešanjem tokom 3 časa, određena je relativna elektrohemiluminescencija (ECL) koristeći ORIGEN instrument. Određena je srednja vrednost ECL za udvostručene uzorke i plotovana je u odnosu na koncentracije konkurišućeg antitela koristeće Kaleidagraph softver. Za neke eksperimente, plotovan je procenat inhibicije. Kompeticione krive su fitovane i EC 50 vrednosti (koncentracije antitela koje daju 50% maksimalnog vezivanja) određene koristeći sledeći 4-parametarski program:

y = ((m1-m4)/(1+(m0/m3)<A>m2))+m4;ml=;m2=;m3=;m4=

mO = nezavisna varijabla

m1 = odgovor nultog signala u relativnim ECL jedinicama

m2 = parametar zakrivljenosti

m3 = EC50 u ug/mL

m4 = signal maksimalnog odgovora u relativnim ECL jedinicama

Prosečne vrednosti afiniteta izračunate su iz EC50 vrednosti i poznate koncentracije tragova antitela koristeći metod Muller-a.

4. Pripremanje 2B8- MX- DTPA

Helatirajući agens, 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilentriaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je obezbeđena kao suvi puder (bez kiseline) i čuvana isušena na -20°C ili -70°C. Približno 3 mg CHO 2B8 antitela u normalnom rastvoru soli sa malim sadržajem metala je doterano do pH 8.6 dodavanjem jedne desetine zapremine 50 mM natrijum borata, pH 8.6. Antitelo na 10-11 mg/mL je inkubirano pri molarnom odnosu 4:1 MX-DTPA prema proteinu dodavanjem MX-DTPA rastvorenog u 50 mM natrijum borata, pH 8.6. Nakon inkubiranja na temperaturi ambijenta (2 do 24 časa), nereagovani helator je uklonjen iz konjugata pomoću ponovljive dijafiltracije u normalnom rastvoru soli sa malim sadržajem metala koristeći Centricon filtere od 30 obrtaja.

5. Pripremanje ln2B8 i Y2B8

ln2B8 je pripremljen koristeći protokol kita za radioobeležavanje kako je ovde opisano. Antitelo je obeleženo sa posebnim aktivitetom od 3 mCi/mg i formulisano na 0.2 mg/mL. Ukratko, 0.5 do 2mCi,<n>ln hlorida je preneto u tube za mikrofuge bez metala i doterano na približno pH 4.2 koristeći 1,2X zapreminu 50 mM natrijum acetata sa malim sadržajem metala. 2B8-MX-DTPA u 2 mg/mL je dodan rastvoru indijum acetata i nakon inkubiranja na temperaturi ambijenta tokom 30 minuta obeleženo antitelo je formulisano u 0.2 mg/mL u 1X PBS, pH 7.2 sa 7.5% (w/v) humanog serum albumina i 1mM DTPA (4% do 6% konačna koncentracija HSA). Svi uzorci su testirani za radioinkorporaciju u triplikatu, vrednosti su bile >95%.

Y2B8 je takođe pripremljen koristeći verziju kita malog-opsega za radioobeležavanje, opisanu u primeru 1. Antitelo je obeleženo sa posebnim aktivitetom od 15 mCi/mg i formulisano na 0.3 mg/mL. Ukratko,0.5do 2 mCi WY hlorida je preneto u tube za mikrofuge bez metala i doterano na približno pH 4.2 koristeći 1,2X zapreminu 50 mM natrijum acetata sa malim sadržajem metala. 2B8-MX-DTPA u 2 mg/mL je dodan rastvoru<90>Y acetata i nakon inkubiranja na temperaturi ambijenta tokom 5 minuta obeleženo antitelo je formulisano u 0.3 mg/mL u 1X PBS, pH 7.2 sa 7.5% (w/v) humanog serum albumina i 1mM DTPA (4% do 6% konačna koncentracija HSA). Svi uzorci su testirani za radioinkorporaciju u triplikatu, vrednosti su bile

>95%.

Koncentracije radioaktivnosti konačno radioobeleženog produkta izračunate su na osnovu količine radioaktivnosti dodate reakcionoj mešavini i u odnosu na Certificate of Analvsis za radioizotope. Koncentracije antitela mešavine prekinute reakcije izračunate su iz poznate količine dodatog antitela.

Za ispitivanje kinetike radioobeležavanja efekt pH na radioinkorporaciju i vezivanje, pH reakcionih mešavina je doteran dodavanjem različitih količina 50 mM natrijum acetata sa malim sadržajem metala (0.8 do 2.2X zapremina rastvora radioizotopa).

6; Određivanje radioinkorporacije za ln2B8 i Y2B8

Količina radioaktiviteta vezanog sa konjugatima (radioinkorporacija) u konačnim produktima ili inkubiranim uzorcima je određena koristeći komercijalno dostupan kit proizveden od Biodex (Tec-Control Radiochromatogarafic Kit; vidi primer 1). Generalno, 1<p>L test uzoraka primenjeno je u duplikatu ili triplikatu koristeći mikropipetor i rezvijeno prema Biodex-ovom dodatku uputstva. Polovine traka izbrojane su u odnosu na radioaktivnost u staklenim tubama koristeći Isodata gama brojač ili Packard Top Count scintilacioni brojač opisan dole. Radioobeležena inkorporacija izračunata je deljenjem količine radioaktivnosti u gornjoj polovini trake sa ukupnom radioaktivnošću nađenoj i na gornjoj i na donjoj polovini. Ta vrednost je izražena kao procenat određene srednje vrednosti.

7. ' Određivanje imunoreaktivnosti ln2B8 i Y2B8

Imunoreaktivnost je određena koristeći metod Lindimo i sar. i kao što je gore opisano u primeru 1.

8. Ogled direktnog vezivanja za ln2B8 i Y2B8

Isti protokoli kao što su opisani ovde upotrebljeni su da se odredi vezivanje za CD20-pozitivne SB ćelije za ln2B8 i Y2B8, respektivno. ln2B8 i Y2B8 bili su pripremljeni i formulisani kao što je opisano gore. Za ogled, uzorci ln2B8 i Y2B8 razblaženi su sa oglednim puferom za razblaživanje (1XPBS, pH 7.2, sa 1% (w/v) goveđeg serum albumina (BSA)) do 40 ng/mL i 11 ng/mL, respektivno.

Antigen-pozitivne (SB) i antigen-negativne (HSB) ćelije održavane su na RPMI 1640 dopunjenim sa 10% fetalnog seruma na 37°C i 5% C02. Ćelije (vijabilnost >90% određena isključivanjem tripan plavog) su prikupljene na temperaturi ambijenta pri gustini ćelija od 0.5-2 x 10<6>ćelija/mL centrifugiranjem (1300 rpm u Sorvall centrifugi) i isprane dva puta sa 50 mL 1X PBS-a. Istaložene ćelije su resuspendovane do 50 x 10<6>ćelija/mL, isprane u 1X PBS sa1%

(w/v) goveđeg serum albumina (BSA) i 10% (w/v) manitola (liofilizirani pufer). Suspenzije ćelija su suspendovane u polipropilneskim tubama za mikrofuge sa o-prstenom od 1.5 mL na 50 X 10<6>Ćelija/mL (0.5 mL po tubi) i liofilizirane preko noći na 30 do 60 militora. Liofilizirane ćelije su čauvane isušene na 2 - 8°C i rekonstituisane sa sterilnom vodom za oglede.

Liofilizirane SB i HSB ćelije u polipropilneskim tubama od 1.5 mL su rekonstituisane do 50 X 10<6>ćelija/mL koristeći sterilnu vodu. Ćelijama su dodani su razblaženi !n2B8 i Y2B8 u triplikatu i inkubirani 45 do 60 minuta sa mešanjem kraj-preko-kraja na temperaturi ambijenta, respektivno. Nakon inkubacije, ćelije su oborene centrifugiranjem i ćelijski-vezana radioaktivnost određena brojanjem uzoraka u Isodata Gamma Counter ili Packard Top Count scintilacionom brojaču kao što je niže opisano. Vezivanje radioaktivnosti (B) za ćelije izračunato je oduzimanjem nevezane radioaktivnosti (supernatant) od ukupne dodane radioaktivnosti. Ukupna radioaktivnost je određena iz radioaktivnosti izbrojane u tubama bez ćelija. Procenat vezivanja izračunat je izražavanjem brojanja vezivanja kao procenta ukupnih brojanja.

9. Merenje radioaktivnosti

Uzorci radioinkorporacije brojani su za 1 minut koristeći Isodata gama brojač. Brojač je postavljen za prozore energije od 100-500 KeV i pozadina je doterana na nulu neposredno pre upotrebe uzoraka koristeći<m>ln. Isodata gama brojač je takođe upotrebljen za brojanje ITLC traka koje su imale<X>Ytačke na sebi. Energetski prolazi za detektovanje bremstruling zračenja bili su 100 - 1000 KeV.

Za ogled vezivanja<X>Yuzorci su preneti na ploču sa 24 bunarčića i MicroScint koktel i brojani na Packard Top Count za 1 minut koristeći maksimalno i minimalno energetsko<;>okruženje. Uzorci indijum-[111] prebrajani su za 1 minut koristeći Isodata gama brojač. Brojač je postavljen za prozore energije od 100-500 KeV i pozadina je doterana na nulu pre upotrebe.

10. Specifikacije oslobađanja za kliničke doze ln2B8 i Y2B8

Specifikacije oslobađanja za radioinkorporaciju i vezivanje za CD20-pozitivne ćelije utvrđene su pripremanjem šest doza i od ln2B8 i Y2B8 koristeći dve gomile kliničke čistoće 2B8-MX-DTPA (gomile* 0219 i 0220) pripremljene prema predmetnom pronalasku i napunjene pod GMP uslovima. Ogledi oslobađanja izvedeni su kao što je opisano gore.

IV. Rezultati

A. Karakterizacija CHO- izvedenog 2B8

Koristeći flow citometrijsku analizu pokazano je da se CHO 2B8 direktno vezuje za CD20-pozitivne SB ćelije bez vezivanja za CD20-negativne HSB ćelije (slika 34). Nije zapaženo značajno vezivanje za SB ili HSB ćelije irelevantnog izotopa (y1k) antitela (S004).

Vezivanje CHO 2B8 za CD20-pozitivne ćelije je procenjeno u ogledu kompeticije koristeći ORIGEN hemiluminescentni sistem detekcije. Liofilizirane i rekonstituisane antigen-pozitivne SB ćelije inkubirane su sa povećanim količinama bf antitela u prisustvu rutenijum-obeleženog CHO 2B8 tragača. Rezultati su pokazali da CHO 2B8 inhibira vezivanje za CD20-pozitivne ćelije u istom obimu kao antitelo izvedeno iz bioreaktora sa šupljim vlaknima (2B8-49) (slika 35). EC50 vrednosti su određene grafički i upotrebljen je metod Muller-a (1980) da se izračunaju prosečne vrednosti afiniteta. Određeno je da je afinitet za CHO 2B8 1.3 X 10'<1C>M; 2B8 antitelo izvedeno iz bioreaktora sa šupljim vlaknima dalo je afinitet od 2.5 10'<10>M. Ne-specifično vezivanje bilo je zanemarljivo kao je to pokazao nedostatak kompeticije sa irelevantnim izotop antitelom, S004.

B. Karakterizacija CHO- izvedenog 2B8- MX- DTPA

2B8 konjugat (2B8-MX-DTPA) je pripremljen koristeći protokol sličan onom upotrebljenom za prethodno okarakterisani 2B8-49. Reakcije su izvedene koristeći približno 3 mg antitela i 4:1 molarni odnos helatora prema antitelu. Inkubaciona vremena od 2, 4, 8, 17 i 24 časa

procenjena su da se odredi reakciono vreme koje daje prihvatljivo zadržavanje vezivanja za CD20 pozitivne ćelije i visoku radioinkorporaciju sa<l11>ln. Krive kompetitivnog vezivanja koje porede CHO 2B8 sa CHO 2B8-MX-DTPA konjugatom reagovanog tokom 8-24 časa bile su slične, ukazujući da konjugacioni procesi nisu značajno narušili vezivanje antitela za CD20 antigen (slika 36). Koristeći EC 50 vrednosti određene grafički (slika 36), konstante afiniteta za nekonjugovana i konjugovana antitela bile su u rasponu 2.3 X 10 '° M do 5.9 X 10'<10>(tabela 40). Radioinkorporacija je bila >95% za vremena konjugovanja od 8 do 24 časa (tabela 30).

C. Karakterizacija ln2B8 i Y2B8 pripremljenih od CHO- izvedenog 2B8- MX- DTPA

lndijum-[111]-obeleženi CHO 2B8-MX-DTPA (ln2B8) pripremljen je koristeći protokol kita za obeležavanje malog obima opisnog prethodno za antitelo dobijeno iz bioreaktora sa šupljim vlaknima (primer 1). Ukratko, konjugovano antitelo (CHO-izveden 2B8-MX-DTPA; lot#0165A) je inkubirano sa<111>ln acetatom na naznačenom pH tokom 30 minuta na temperaturi ambijenta. Reakcione mešavine su formulisane sa PBS-om, pH 7.2, sa 7.5% (w/v) humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Formulisani uzorci ln2B8 su ispitani na radioinkorporaciju koristeći instant tankoslojnu hromatografiju. Vezivanje ln2B8 za CD20-pozitivne ćelije određeno je koristeći liofilizirane i rekonstituisane SB ćelije. Radi poređenja, konjugat pripremljen od antitela produkovanog od hibridoma (2B8-49) inkubiran je sa<in>ln acetatom tokom 30 minuta na pH 4.2 (prethodno utvrđeni uslovi za ovo antitelo).

Studije kinetike su izvedene da se odrede uslovi obeležavanja koji obezbeđuju maksimalno zadržavanje vezivanja za CD20-pozitivne ćelije i visoku radioinkorporaciju (tabele 41 i 42). Konjugovano antitelo (CHO-izveden 2B8-MX-DTPA) je inkubirano na temperaturi ambijenta sa,<11>l acetatom na pH 4.2 u naznačenim vremenima (tabela 42).

Rezultati su pokazali da je za raspon pH od 3.0 do 4.6 i inkubaciono vreme od 30 minuta dotignuto >97% radioinkorporacije radioizotopa dok je održavanje vezivanja bilo približno 84%. Vrednosti radioinkorporacije i vezivanja nisu varirale za vremena inkubacije od 15 do 45 minuta za reakcije na pH 2.9 do 4.6 (tabela 42). Rezultati su bili uporedljivi sa onima dobijenim koristeći 2B8-49 antitelo (tabele 41 i 42).

Itrijum-[90]-obeležno antitelo pripremljeno je inkubiranjem konjugovanog antitela (CHO-izveden 2B8-MX-DTPA) sa MY acetatom na naznačenom pH za 5 minuta na temperaturi ambijenta. Reakciona mešavine su formulisane u PBS-u, pH 7.2 sa 7.5% (w/v) humanog serum albumina i 1 mM DTPA. Formulisani uzorci Y2B8 ispitani su na radioinkorporaciju instant tankoslojnom hromatografijom. Vezivanje Y2B8 za CD20-pozitivne ćelije određeno je koristeći liofilizirane i rekonstituisane SB ćelije. Radi poređenja, konjugat pripremljen od antitela produkovanog od hibridoma (2B8-49) inkubiran je sa<90>Y acetatom tokom 5 minuta na pH 4.2 (prethodno utvrđeni uslovi za ovo antitelo).

Slične kinetičke studije izvedene su da se proceni preparacija ^V-obeleženog antitela (Y2B8). Za reakcije radioobeležavanja u rasponu pH od 3.9 do 4.7 u inkubacionom vremenu od 5 minuta, radioinkorporacija je bila >96% sa >80% zadržavanja vezivanja za CD20-pozitivne ćelije (tabela 43). Slični rezultati dobijeni su za inkubaciona vremena 3, 5, i 10 minuta za raspon pH od 2.9 do 4.6 (tabela 44). Zatim je konjugovano antitelo (CHO-izveden 2B8-MX-DTPA) inkubirano na temperaturi ambijenta sa<90>Y acetatom na pH 4.2 za naznačena vremena (tabela 44). Rezultai su bili uporedljivi sa onima dobijenim koristeći 2B8-49 antitelo (tabele 43 i 44).

Imunoreaktivnosti za ln2B8 i Y2B8 pripremljenih od CHO 2B8 određene su koristeći metod Lindmo i sar. Povećane količine sveže prikupljenih CD20-pozitivnih SB ćelija su inkubirane sa fiksiranim količinama ln2B8 ili Y2B8 u uslovima antigena u višku. Recipročna plot analiza podataka vezivanja omogućila je određivanje imunoreaktivnosti od 80.6% i 72.2% za ln2B8 i Y2B8, respektivno (slike 37 i 38).

D. Specifikacije oslobađanja za CHO- izvedene 2B8- MX- DTPA

Dve gomile ln2B8/Y2B8 kliničkog kvaliteta kitova za radioobeležavanje upotrebljena su da se pripremi šest gomila svaka sa ln2B8 i Y2B8. ln2B8 i Y2B8 pripremljeni su koristeći protokol za obeležavanje verzije male razmere koji se trenutno koriste u kliničkim trijalima. Svaka gomila radioobeleženog 2B8-MX-DTPA je testirana za radioinkorporaciju i vezivanje za CD20-pozitivne (SB) i CD20-negativne (HSB) humane ćelije. Ti rezultati su sumarizovani u tabelama 45 i 46. Za šest pripremljenih gomila ln2B8, radioinkorporacija je bila u rasponu od 98.9% do 99.3% sa srednjom vrednosti 99.1%. Vezivanje CD20-pozitivnih ćelija bio je u rasponu od 81.9% do 85.1% sa srednjom vrednosti 83.6%; vezivanje za CD-negativne ćelije bilo je <4%. Za šest pripremljenih gomila Y2B8 radioinkorporacija je bila u rasponu od 97.49% do 98.7% sa srednjom vrednosti 98.2%. Vezivanje CD20-pozitivnih ćelija bio je u rasponu od 81.4% do 82.71% sa srednjom vrednosti 81.9%; vezivanje za CD-negativne ćelije bilo je <8%.

V. Diskusija i zaključci

Anti-CD mišje monoklonalno antitelo (2B8) klonirano i eksprimirano u CHO ćelijama (CHO-izvedeni 2B8) zadržava specifičnost za CD20 pozitivne humane ćelije kao što je to pokazano pomoću FACS i ogleda kompetitivnog vezivanja. Vezivanje za humane T ćelije bilo je minimalno. Određeno je da je afinitet antitela za humane CD20-pozitivne ćelije 1.3 X 10'<10>M koristeći ogled kompetitivnog vezivanja. Koristeći isti ogled, 2B8 antitelo dobijeno iz bioreaktora sa šupljim vlaknima dalo je vrednosrti afiniteta od 2.5 X 10 '° M.

CHO 2B8 antitelo je reagovano sa MX-DTPA da se formira konjugat 2B8-MX-DTPA, održavajući pogodno zadržavanje imunoreaktivnosti. Optimalna inkorporacija helatora određena je merenjem radioinkorporacije sa<1>"ln i dostignuta je nakon osam časova inkubiranja na temperaturi ambijenta. Protokol radioobeležavanja za 2B8-MX-DTPA konjugat bili su optimizovani za90Yi<111>ln u odnosu na pH i vreme inkubacije da se obezbedi maksimalna radioinkorporacija i zadržavanje imnuoreaktivnosti.

Rezultati nekoliko preparacija ln2B8 i Y2B8 pokazuju ponovljivost protokola radioobeležavanja koji je upotrebljen da se pripreme kliničke doze. Na osnovu tih rezultata radioobeležavanja sugerisano je da se specifikacije oslobađanja za radioinkorporaciju i vezivanje, koristeći liofilizirane CD20-pozitivne ćelije, utvrde na >95% i >70%, respektivno. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da uporedljivost CHO-izvedenog 2B8 i 2B8-49 izvedenog iz šuplih vlakana ukazuje prigodnost CHO-izvedenog 2B8-MX-DTPA za upotrebu u kliničkim trijalima.

Konačno, predmetni pronalazak obelodanjuje proceduru obeležavanja, označenu kao "mix-and-shoot" metod, za pripremanje kliničkih doza radioobeleženih antitela koja uklanja potrebu koraka upotrebe tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) za uklanjanje ne-protein vezanog radioizotopa. Pojednostavljeni protokol eliminiše taj težak korak prečišćavanja održavajući istovremeno visok nivo inkorporacije radioizotopa (>95%) i poboljšano zadržavanje imunoreaktivnosti (>70%). Na osnovu zadržavanja radioizotopa i imunoreaktivnosti nađeno je da je klinički-formulisan radioobeležni konjugat stabilanin vitrokada se inkubira na 4°C tokom 48 časova. Sem toga, radioobeleženi konjugat bio je stabilan kada je inkubiran u humanom serumu na 37°C tokom 72 časa. Ispitivanja biodistribucije kod BALB/c miševa pokazala su da nema neuobičajenog deponovanja u tkivima i da nema značajne akumulacije u kosturu. Procene apsorbovanih doza zračenja za "standard" od 70 kg čoveka bile su uporedljive sa onima dobijenim u tekućim kliničkim trijalima koristeći<90>Y-obeleženi 2B8-MX-DTPA. Rezultati ovih ispitivanja pokazali su da je<90>Y-obeleženi 2B8-MX-DTPA produkovan koristeći "mix-and-shoot" protokol uporedljiv sa onim pripremljenim koristeći konvencionalni HPLC proces. Procenjivanje valjanosti protokola odmeravanja za pripremanje radioobeleženog konjugata kliničkog kvaliteta pokazalo je da je metod bio ponovljiv i da je produkt bio uporedljiv onom produkovanom koristeći tekući HPLC metod. Rezultati tih pre-kliničkih studija ukazuju da ovaj novi "mix-and-shoot" protokol može biti upotrebljen da se pripremi<90>Y-obeleženi 2B8-MX-DTPA pogodan zakliničke trijale.

Reference

Svaki od sledećih citata je ovde inkorporiran referencom.

1. Adams, R.A., Flowers, A., and Daviš, B.J. Direktna implantacija i transplantacija humane akutne limfoblastične leukemije kod hrčaka, SB-2. Cancer Research 28: 1121-1125, 1968. 2. Adams, R.A. Formalna diskusija: Uloga transplantacije u eksperimentalnim istraživanjima humanih leukemija i limfoma. Cancer Res. 27(1): 2479-2482, 1967. 3. Lindimo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedoroko, J., and Bunn, P.A., J. Immunol. Methods, 72: 77-1984. 4. Kozak, R.W. Raubitschek, A., Mirzadeh, S., brechbiel, M.VV., Junghaus, R., Gansovv, O.A., and VValdmann, T.A. Cancer Res. (1989) 49:2639-2644. 5. Parker, B.A. Halpern, S.E., Miller, R.A., Hupf, K, Shavvler, D.L., Collins, H.A., Amox, D., VVhite, CA. and Rovston, I.N. Eng. J. Med., (primljeno)

6. Leland, J.K. and Povvell, M.J. J. (1990) Electrochem. Soc. 137, 3127.

7. Muller, RJ. Immunological Methods (1980) 34, 345.

8. Mirzadeh, S., Brechbiel, M.VV., Atcher, R.W. and Gansovv, O.A. (1990) Bioconjugate Chemistrv 1(1), 59. 9. Brechbiel, M.W., Gansovv, O.A., Atcher, R.VV., Selom, J., Esteban, J., Simpson, D.E. and Colcher, D. (1986) 25, 2772.

Claims (9)

1. Postupak za radioaktivno obeležavanje antitela konjugovanog za helator pomoću<in>In,naznačen timešto se dobija radioaktivno obeleženo antitelo u kliničkoj formulaciji koja može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljih koraka za prečišćavanje kojima se uklanja neugrađeni radioaktivni obeleživač, koji podrazumeva: (i) mešanje helator-konjugovanog antitela sa rastvorom koji sadrži<m>In, gde je zapreminska količina rastvora koji sadrži<ni>In 5,5 mCi podeljena sa koncentracijom radioaktivnosti u vreme obeležavanja, te dalje gde je pH vrednost rastvora koji sadrži mIn podešena na 3 do 6 pre nego što se pomeša sa helator-konjugovanim antitelom. (ii) inkubiranje mešavine 30 minuta da se dobije radioaktivno obeleženo antitelo kod koga je ugradnja radioaktivnog obeleživača veća od 95%, tako da radioaktivno obeleženo antitelo može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača; i (iii) razblaživanje obeleženog antitela do odgovarajuće koncentracije u puferu za formulaciju koji sadrži fiziološki rastvor soli, sredstvo za zaštitu od radioaktivnog zračenja, te nekonjugovani bifunkcionalni helator, kako bi se dobila klinička formulacija takva, da navedena klinička formulacija koja sadrži navedeno radioaktivno obeleženo antitelo može da se primeni direktno kod pacijenta bez daljih koraka prečišćavanja kojima se uklanja neugrađeni radioaktivni obeleživač.

2. Postupak prema zahtevu 1,naznačen timešto je antitelo anti-CD20 antitelo.

3. Postupak prema zahtevu 1,naznačen timešto je radioprotektant selekcionisan iz grupe koja se sastoji od humanog serum albumina (HSA), askorbata, askorbinske kiseline, fenola, sulfita, glutationa, cisteina, gentisične kiseline, nikotinske kiseline, askorbil palmita, HOP(:0)H2, glicerola, natrijum formaldehid sulfoksilata, Na2S20s, Na2S203i S02.

4. Postupak prema zahtevu 1,naznačen timešto je nekonjugovani helator DTPA.

5. Postupak prema zahtevu 1,naznačen timešto je pH rastvora koji sadrži 11 'in doteran sa rastvorom niži metal natrijum acetat.

6. Postupak prema zahtevu 5,naznačen timešto je natrijum acetat u koncentraciji od 10 do 1000 mM.

7. Postupak prema zahtevu 1,naznačen timestoje "'in obezbeđen u obliku rastvora koji sadrži U1ln hlorid.

8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što je 1 ml helator-konjugovanog antitela u konstrukciji od 0.5 do 30 mg/ml pomešano sa rastvorom za radioobeležavanje.

9. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time što se pufer za formulaciju dodaje u količini koja je neophodna da se postigne ukupna zapremina kliničke formulacije od 10 ml do 50 ml.