PL205780B1 - Sposób radioaktywnego znakowania skoniugowanego z chelatorem przeciwciała anty-CD20, test wiązania i test wiązania kompetytywnego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

1. Dziedzina techniki

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu radioaktywnego znakowania skoniugowanego z chelatorem przeciwciała anty-CD20, testu wiązania i testu wiązania kompetytywnego dla oceny efektywności terapeutycznych przeciwciał. Sposób ten i testy służą do leczenia/obrazowania nowotworów i komórek nowotworowych.

2. Stan techniki

Układ immunologiczny kręgowców (na przykład, naczelnych obejmujących ludzi, małpy wąskonose i szerokonose) obejmuje szereg narządów i typów komórek, które ewoluowały w kierunku dokładnego i specyficznego rozpoznawania obcych mikroorganizmów („antygenów”), dostających się do gospodarza-kręgowca, oraz specyficznie wiążących się z takimi mikroorganizmami. Limfocyty, jak również inne typy komórek, są krytyczne dla układu immunologicznego. Limfocyty są wytwarzane w grasicy, śledzionie i szpiku kostnym (dorośli) i stanowią około 30% wszystkich białych ciałek krwi obecnych w układzie krążenia ludzi (małp).

Istnieją dwa główne podtypy populacji limfocytów: komórki T i komórki B. Komórki T są odpowiedzialne za odporność komórkową, podczas gdy komórki B są odpowiedzialne za produkcję przeciwciał (odporność humoralna). Jednakże, komórki T i B są uważane za zależne od siebie - w typowej odpowiedzi immunologicznej komórki T są aktywowane gdy receptor komórek T wiąże się z fragmentami antygenu, które są związane z glikoproteinami głównego kompleksu zgodności tkankowej („MHC”), na powierzchni komórki prezentującej antygen; tego rodzaju aktywacja powoduje uwolnienie biologicznych mediatorów („interleukin”) które, w istocie, stymulują komórki B do różnicowania się i produkcji przeciwciał („immunoglobulin”) przeciwko antygenowi.

Każda komórka B wewnątrz gospodarza produkuje inne przeciwciało na swojej powierzchni a zatem jedna komórka B będzie produkowała przeciwciało specyficzne dla jednego antygenu, podczas gdy inna komórka B będzie produkowała przeciwciało specyficzne dla innego antygenu. Dlatego też, limfocyty B są zmienne, i ta zmienność jest krytyczna dla układu immunologicznego. U ludzi, każda komórka B może wyprodukować niezwykłą liczbę przeciwciał (tj. około 10⁷ do 10⁸). Tego rodzaju produkcja przeciwciał zatrzymuje się zazwyczaj (lub zasadniczo zatrzymuje się) gdy obcy antygen ulega neutralizacji. Czasami jednak proliferacja szczególnej komórki B będzie się stale utrzymywać, prowadząc do nowotworu zwanego „chłoniakiem komórek B”.

Zarówno komórki B jak i T zawierają białka powierzchniowe, które mogą być używane jako „markery” do różnicowania i identyfikacji. Jednym z takich markerów komórek B jest antygen ograniczonego różnicowania ludzkich limfocytów B - Bp35 oznaczany jako „CD20”. CD20 ulega ekspresji w trakcie wczesnego rozwoju komórek pre-B i pozostaje aż do różnicowania w komórki plazmatyczne. Cząsteczka CD20 może regulować etap aktywacji wymagany do rozpoczęcia cyklu komórkowego oraz różnicowania i zazwyczaj ulega ekspresji na wysokim poziomie w nowotworowych („rakowych”) komórkach B. Z definicji, CD20 jest obecny zarówno na „normalnych” jak i „złośliwych” komórkach B, tj. komórkach, których stała proliferacja może prowadzić do chłoniaka z komórek B. A zatem, antygen powierzchniowy, CD20 może służyć jako antygen „identyfikujący” chłoniaki komórek B.

Zasadniczo, takie „identyfikowanie” może zachodzić w następujący sposób: przeciwciało specyficzne dla np., antygenu powierzchniowego CD20 komórek B, jest podawane pacjentowi. Przeciwciała anty-CD20 specyficznie wiążą się z antygenem powierzchniowym CD20 komórek normalnych oraz nowotworowych; przeciwciało anty-CD20 związane z antygenem powierzchniowym może prowadzić do destrukcji i zubożenia nowotworowych komórek B. Dodatkowo, czynniki chemiczne lub znaczniki radioaktywne posiadające zdolność do niszczenia komórek nowotworowych mogą być skoniugowane z przeciwciałem anty-CD20, w taki sposób, że czynnik ten jest „dostarczany” specyficznie do przykładowo, nowotworowych komórek B. Bez względu na sposób, pierwszorzędowym celem jest zniszczenie nowotworu: specyficzne podejście będzie określone na podstawie zastosowanego przeciwciała anty-CD20; tym samym, dostępne sposoby identyfikacji antygenu CD20 będą się znacząco różnić.

Przykładowo przedstawione mogą zostać próby identyfikacji antygenu powierzchniowego CD20. Mysie przeciwciało monoklonalne 1F5 (anty-CD20) było podawane przez ciągły wlew dożylny pacjentom z chłoniakiem komórek B. Do usunięcia krążących komórek nowotworowych wymagane były ekstremalnie wysokie poziomy 1F5 (>2 gram), a wyniki były określane jako „przejściowe”. Press i wsp., „Monoclonal Antibody 1F5 (Anty-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas”. Blood 69/2:584-591 (1987).

PL 205 780 B1

Potencjalnym problemem tego sposobu jest to, że przeciwciała monoklonalne, inne niż ludzkie (np. mysie przeciwciała monoklonalne) zazwyczaj są pozbawione takich funkcji jak ludzkie przeciwciała, tj. nie są, między innymi, zdolne do pośredniczenia w lizie zależnej od dopełniacza lub lizie ludzkich komórek w cytotoksyczności zależnej od przeciwciał bądź fagocytozie kierowanej przez receptor Fc. Co więcej, przeciwciała inne niż ludzkie mogą być rozpoznawane przez ludzkiego gospodarza jako obce białka; tym samym kolejne iniekcje mogą prowadzić do indukcji odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do szkodliwych reakcji nadwrażliwości. Nazywane jest to ludzką odpowiedzią przeciwko mysim przeciwciałom lub „HAMA”. Dodatkowo, te faktycznie „obce” przeciwciała mogą być atakowane przez system gospodarza i w efekcie neutralizowane zanim osiągną miejsce docelowe.

Limfocyty i komórki chłoniaków są dziedzicznie wrażliwe na radioterapię. A zatem, nowotwory komórek B są atrakcyjnymi celami dla radioimmunoterapii (RTT) z kilku powodów: lokalna emisja promieniowania jonizującego wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał może zabijać komórki zarówno pozbawione docelowego antygenu (np. CD20) jak i nie pozbawione tego docelowego antygenu w bezpośrednim sąsiedztwie przeciwciała związanego z przeciwciałem; promieniowanie penetrujące, tj. emitery beta mogą znosić problem ograniczonego dostępu do przeciwciała w dużych lub unaczynionych nowotworach oraz zredukowana może zostać całkowita ilość wymaganego przeciwciała.

Radioizotop emituje cząstki, które mogą uszkadzać komórkowe DNA w stopniu uniemożliwiającym zadziałanie komórkowych systemów naprawy i kontynuowanie życia komórki; a zatem, jeśli komórki docelowe są nowotworami, radioaktywny znacznik może zabijać komórkę nowotworową. Przeciwciała wyznakowane radioaktywnie, z definicji, dotyczą zastosowania substancji radioaktywnej, która może wymagać środków zachowawczych zarówno dla pacjenta (tj. możliwej transplantacji szpiku kostnego) jak również dla pracownika służby zdrowia (tj. konieczności zachowania wysokiej ostrożności przy pracy z radioaktywnością). A zatem, sposobem poprawy zdolności mysich przeciwciał monoklonalnych do leczenia chorób limfocytów B jest skoniugowanie radioaktywnego znacznika z przeciwciał em, w taki sposób, ż e znacznik lub toksyna jest zlokalizowana w miejscu nowotworu. Toksyny (tj. czynniki chemioterapeutyczne takie jak doksyrubicyna lub mitomycyna C) mogą również zostać skoniugowane z przeciwciałami. Patrz, na przykład, opublikowany opis patentowy WO 92/07466 (14 maja 1992).

Przeciwciała „chimeryczne” tj. przeciwciała zawierające fragmenty z dwóch lub więcej różnych gatunków (np. myszy i człowieka) stanowią alternatywę dla przeciwciał „koniugowanych”. Stworzono mysie/ludzkie przeciwciała chimeryczne oraz wykazano ich zdolność wiązania, przypominającą charakterystykę przeciwciała wyjściowego oraz funkcje efektorowe związane z regionem stałym ludzkiego przeciwciała. Patrz, np. Cabilly i wsp., U.S. Patent 4,816,567; Shoemaker i wsp., U.S. Patent 4,978,745; Beavers I wsp., U.S. Patent 4,975.369; i Boss i wsp., U.S. Patent 4,816,397, z których wszystkie są włączone poprzez odniesienie. Zazwyczaj, wszystkie te chimeryczne przeciwciała są konstruowane poprzez przygotowanie biblioteki genomowego DNA wyekstrahowanego z wcześniej istniejących mysich hybrydom. Nishhnura i wsp. (1987) Cancer Research 47: 999. Biblioteka jest następnie przeszukiwana pod względem regionów zmiennych genów łańcuchów lekkich i ciężkich wykazujących właściwy wzór rearanżacji fragmentu przeciwciała. Sklonowane regiony zmienne są następnie ligowane do wektora ekspresyjnego zawierającego sklonowane kasetki odpowiednich łańcuchów lekkich lub ciężkich ludzkiego genu regionu stałego. Chimeryczny gen ulega następnie ekspresji w wybranej linii komórkowej, zazwyczaj mysiej linii szpiczaka.

Przykładowo, Liu, A.Y., i wsp., „Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity”, J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), opisuje mysie/ludzkie przeciwciało himeryczne skierowane wobec antygenowi CD20. Patrz, również WO 88/04936. Jednakże, nie dostarczono informacji na temat zdolności, powinowactwa lub praktycznego zastosowania przeciwciał chimerycznych Liu w odniesieniu do leczenia chorób limfocytów B.

Należy też zauważyć, że testy funkcjonalne in vitro (np. liza zależna od dopełniacza - CDC), cytotoksyczność zależna od przeciwciał („ADCC”) nie mogą w sposób przekazywalny zapewnić jakiemukolwiek przeciwciału zdolności do niszczenia lub likwidowania komórki docelowej niosącej specyficzny antygen. Patrz, na przykład, Robinson, R.D., i wsp., „Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities”, Hum, Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991) (chimeryczne przeciwciała mysio-ludzkie mające niewykrywalną aktywność ADCC). A zatem, potencjalna wydajność przeciwciała może być prawdziwie określona jedynie na podstawie eksperymentów in vivo. Do tego stopnia, porównywalne wnioski 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967, włączone tutaj w całości przez odniesienie, przedstawiają wyznakowane radioaktywnie koniugaty

PL 205 780 B1 anty-CD20 służące do diagnostycznego „obrazowania” chłoniaków komórek B przed podaniem terapeutycznego przeciwciała. Koniugat „In2B8” składa się z mysiego przeciwciała monoklonalnego, 2B8, specyficznego wobec ludzkiego antygenu CD20 połączonego z Indem [111] (¹¹¹In) poprzez bifunkcjonalny chelator, tj. MX-DTPA (kwas dietyloenetriaminepentaoctowy), który zawiera mieszaninę 1:1 1-izotiocyjanatobenzylo-3-metylo-DTPA oraz 1-metylo-3-izotiocjanatobenzylo-DTPA. Ind-[111] został wybrany jako znacznik radioaktywny ponieważ emituje promieniowanie gamma oraz ma zastosowanie jako czynnik obrazujący. Patenty odnoszące się do chelatora i koniugatów chelatora są znane fachowcom. Przykładowo, patent U.S. No. 4,831,175 Gansowa jest poświęcony wielopodstawionym chelatom kwasu dietyloenetriaminepentaoctowego oraz zawierającym go koniugatom białkowym oraz sposobom ich przygotowania U.S. Patent Nos. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, oraz 5,124,471 Gansowa również dotyczy wielopodstawionych chelatów DTPA. Wybrano specyficzny bifunkcjonalny chelator użyty do ułatwienia chelatacji w zgłoszeniach 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967, posiadający wysokie powinowactwo dla trójwartościowych metali oraz wykazujący zwiększony stosunek wchłaniania nowotwór-nienowotwór, zwiększone wchłanianie do kości, oraz większą retencję radioizotopu w miejscach docelowych in vivo, tj. miejscach chłoniaka komórek B. Jednakże, istnieją inne bifunkcjonalne chelatory znane fachowcom i mogą również być korzystne w terapii nowotworowej. W zgłoszeniach 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967 zawarte są również wyznakowane radioaktywnie przeciwciała do identyfikacji i destrukcji chłoniaków komórek B i komórek nowotworowych. W szczególności, koniugat Y2B8 zawiera to samo przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD20, 2B8 połączone z itrem-[90] (⁹⁰Y) poprzez ten sam bifunkcjonalny chelator. Radioizotop ten został wybrany z kilku powodów. 64-godzinny okres półtrwania ⁹⁰Y jest wystarczająco długi aby pozwolić przeciwciału na akumulację w guzie, oraz podobnie jak ¹³¹I jest on czystym emiterem beta o wysokiej energii bez towarzyszą cego podczas rozpadu promieniowania gamma, o zasięgu 100 do 1000 średnich komórek. Minimalna ilość penetrującej radioaktywności umożliwia na podanie pacjentowi przeciwciał znakowanych ⁹⁰Y. Co więcej, do zabicia komórki nie jest wymagana internalizacja, a lokalna emisja promieniowania jonizującego powinna być letalna dla przylegających komórek nowotworowych pozbawionych antygenu docelowego.

Ponieważ radionuklid ⁹⁰Y został połączony z przeciwciałem 2B8 przy użyciu tej samej cząsteczki bifunkcjonalnego chelatora MX-DTPA, koniugat Y2B8 posiada wszystkie wspomniane powyżej korzyści, np., zwiększoną retencję radioizotopu w miejscu docelowym (nowotwór). Jednakże, inaczej niż ¹³¹In, nie może zostać zastosowany do celów obrazowania przy braku współtowarzyszącego promieniowania gamma. A zatem, diagnostyczny radioizotop „obrazowy”, taki jak ¹³¹In może zostać zastosowany do określania lokalizacji i relatywnej wielkości nowotworu przed podaniem terapeutycznych chimerycznych przeciwciał znakowanych ¹³¹In celem redukcji nowotworu. Dodatkowo, znakowane Indem przeciwciało umożliwia pomiar dozymetryczny.

W zależ noś ci od zastosowanego przeciwciał a, tj. jako czynnika diagnostycznego lub terapeutycznego zastosowane mogą zostać inne radioizotopy znane fachowcom. Przykładowo, radioizotopy stosowane w praktyce klinicznej obejmują, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁹⁹Tc, ⁶⁷Ga, jak również ¹¹¹In. Przeciwciała znakowano również różnymi radioizotopami stosowanymi w immunoterapii docelowej (Peirersz i wsp. (1987). Koniugaty przeciwciał monoklonalnych były stosowane do diagnostyki i leczenia nowotworów Immunol. Cell Biol. 65: 111-125). Te radioizotopy obejmują ¹⁸⁸Re oraz ¹⁸⁶Re jak również ⁹⁰Y oraz w mniejszym stopniu ¹⁹⁹Au oraz ⁶⁷Cu. I-[131] był również stosowany do celów terapeutycznych. Patent US. No. 5,460,785 dostarcza listy takich izotopów oraz jest tutaj włączony poprzez odniesienie.

Jak podano we zgłoszeniach 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967 podawanie wyznakowanego radioaktywnie koniugatu Y2B8, jak również niewyznakowanego chimerycznego przeciwciała anty-CD20, prowadziło do redukcji nowotworu w myszach posiadających nowotwór limfoblastyczny komórek B. Co więcej, kliniczne badania u ludzi wykazały znaczące zmniejszenie komórek B u pacjentów z chłoniakami, którym podawano chimeryczne przeciwciało anty-CD20. W rzeczywistości, chimera 2B8 została ostatnio zgłoszona pierwszym, narodowym, zaakceptowanym przez FDA przeciwciałem monoklonalnym pod nazwą Rituxan®. A zatem, wykazano, że co najmniej jedno chimeryczne przeciwciało anty-CD20 wykazuje terapeutyczną skuteczność w leczeniu chłoniaków komórek B.

Dodatkowo, zgłoszenie U.S. No. 08/475,813 dotyczy sekwencyjnego podawania Rituxanu®, chimery anty-CD20, razem lub osobno ze znakowanym itrem lub indem, mysim przeciwciałem monoklonalnym. Chociaż zastosowane w tych połączonych terapiach przeciwciała wyznakowane radioaktywnie są przeciwciałami mysimi, początkowe leczenie chimerycznym anty-CD20 zmniejsza populacje limfocytów B, w taki sposób, że zmniejszona zostaje odpowiedź HAMA, tym samym ułatwiając działanie łączonego zestawu diagnostycznego lub terapeutycznego.

PL 205 780 B1

A zatem, w odniesieniu do łączonej immunoterapii, mysie przeciwciała mogą znaleźć szczególne zastosowanie jako czynniki diagnostyczne. Co więcej, w zgłoszeniu US 08/475,813 wykazano, że efektywna dawka terapeutyczna znakowanego itrem przeciwciała anty-CD20 po podaniu Rituxanu® wystarcza do (a) usunięcia jakichkolwiek pozostających krążących limfocytów B nie usuniętych przez chimeryczne przeciwciało anty-CD20; (b) rozpoczęcia usuwania komórek B z węzłów chłonnych lub (c) rozpoczęcia usuwania komórek B z innych tkanek.

A zatem, skoniugowanie znaczników radioaktywnych z przeciwciałami terapeutycznymi wobec nowotworów dostarcza cennego narzędzia klinicznego, mogącego być zastosowanym do osiągnięcia potencjalnej wydajności terapeutycznej tych przeciwciał, stworzenia odczynników diagnostycznych celem monitorowania postępu leczenia oraz dostarczenia dodatkowych czynników terapeutycznych, które mogą być zastosowane do wzmocnienia początkowego potencjału anty-nowotworowego przeciwciała chimerycznego. Wziąwszy pod uwagę podaną wydajność przeciwciała anty-CD20 w leczeniu chłoniaka nie-Hodgkina oraz znaną wrażliwość limfocytów na promieniowanie, korzystnym byłoby uczynienie takich przeciwciał terapeutycznych przeciwciałami komercyjnie dostępnymi w postaci zestawu, który może zostać łatwo zmodyfikowany znacznikiem radioaktywnym oraz podawany bezpośrednio pacjentowi w środowisku klinicznym.

Chociaż istnieje wiele sposobów i odczynników stosowanych do znakowania przeciwciał, brakuje nośników do umieszczania tych odczynników w środowisku klinicznym, w sposób umożliwiający łatwą produkcję oraz podawanie pacjentowi zanim dojdzie do znaczącego rozpadu znacznika radioaktywnego lub znaczącego rozpadu przeciwciała spowodowanego znacznikiem radioaktywnym. Brak takich odpowiednich środków do komercjalizacji tej cennej technologii może wynikać z niskiej wydajności inkorporacji wykazanej przy pomocy znanych protokołów znakowania oraz następującej po reakcji znakowania potrzebie oczyszczania odczynnika na kolumnie. Brak takich zestawów może również po części wynikać z poprzedniego braku dostępu do czystych komercyjnych radioizotopów zdolnych do wytworzenia wydajnie wyznakowanych produktów bez konieczności następującego po nim oczyszczania. Alternatywnie, przyczyną dla której takie zestawy są generalnie niedostępne jest faktyczny brak przeciwciał zdolnych do osiągnięcia akceptacji lub wydajności w leczeniu chłoniaków u ludzi posiadanej przez Rituxan®.

Przykładowo, jak dyskutowano w patencie U.S. 4,636,380, społeczność naukowców uważa, że znalezienie klinicznego zastosowania radiofarmaceutyku musi wymagać długiego i starannego procesu separacji oraz oczyszczania. W rzeczywistości, wstrzyknięcie pacjentowi nie związanego znacznika radioaktywnego nie byłoby korzystnym. Potrzeba etapów dodatkowego oczyszczania czyni proces znakowania radioaktywnego przeciwciał czymś niemożliwym w środowisku klinicznym, w szczególności dla lekarzy nie posiadających ani czasu ani sprzętu do oczyszczania środków terapeutycznych.

Co więcej, znakowane radioaktywnie białka mogą być niestabilne, w szczególności te wyznakowane radiolitycznymi izotopami takimi jak ⁹⁰Y, mającymi tendencję do powodowania uszkodzenia przeciwciała w miarę jak dłużej znajdują się w jego bezpośrednim sąsiedztwie. W efekcie taka radioliza powoduje niedostateczną wydajność terapeutyczną w związku z utratą znacznika radioaktywnego i/lub zredukowanym wiązaniem się z docelowym antygenem oraz może prowadzić do niepożądanej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko zdenaturowanemu białku. Jednak bez sprzętu do oczyszczania i znakowania na miejscu, klinicyści nie mają wyboru i muszą zamawiać już wyznakowane przeciwciała terapeutyczne lub znakować je w odpowiednim ośrodku oraz transportować przed podaniem pacjentowi. Wszystkie te manipulacje dodają cennego czasu upływającego pomiędzy znakowaniem i podaniem, prowadząc tym samym do niestabilności terapeutyku i w efekcie zmniejszając użyteczność zestawu do znakowania w środowisku klinicznym.

Próbowano również usprawnić zestaw do znakowania radioaktywnego przeciwciała, które byłoby wystarczająco doskonałe aby pominąć etap oczyszczania. Przykładowo, Cytogen wprowadził ostatnio komercyjny zestaw do znakowania radioaktywnego mysich przeciwciał monoklinalnych skierowanych wobec związanej z nowotworami glikoproteinie TAG-72. Jednakże, przeciwciało Cytogenu szczególnie nie odpowiada formule zestawu ponieważ wykazuje tendencję do tworzenia strontów podczas przechowywania, które muszą być później usuwane poprzez filtrowanie. Co więcej, przeciwciało Cytogenu powoduje niepożądane reakcje u pacjentów związane z odpowiedzią HAMA.

Inne zastrzeżone protokoły znakowania radioaktywnego, nie odpowiadają formatowi zestawu poprzez konieczność oddzielnego etapu oczyszczania, Richardson i wsp. (1987). Optymalizacja i produkcja serii zestawów znakowanego DTPA przeciwciała do rutynowego stosowania w immunoscyntygrafii ¹¹¹In - Nuc. Med. Commun. 8: 347-356; Chinol i Hnatowich (1987) Generator-produced yttrium-[90]

PL 205 780 B1 for radioimmunotherapy. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470). Jednakże, tego rodzaju protokoły nie osiągają poziomu włączenia znamiennego dla zawartych tutaj protokołów, które posiadają wydajność włączenia co najmniej 95%. Taki poziom włączenia dostarcza dodatkowej korzyści zwiększonego bezpieczeństwa, wynikającej ze wstrzyknięcia niezwiązanego przeciwciała pacjentowi jako skutek niskiego poziomu wchłaniania radioaktywności.

Protokoły zawarte w zestawach niniejszego wynalazku pozwalają na szybkie znakowanie, które może być wykonane w ciągu około godziny lub zaledwie pięciu minut, w zależności od znacznika. Co więcej, protokoły zestawów niniejszego wynalazku mają wydajność znakowania ponad 95%, tym samym nie ma potrzeby dalszego oczyszczania. Pomijając konieczność dalszego oczyszczania, okres półtrwania znacznika oraz integralność przeciwciała jest zarezerwowana dla celu terapeutycznego, dla którego jest ono znakowane.

Niniejszy wniosek zawiera stosowne zestawy oraz sposoby, w których przeciwciała diagnostyczne i terapeutyczne mogą być znakowane radioaktywnie i podawane pacjentowi w wydajny, powtarzalny i wygodny sposób. Zestawy niniejszego wynalazku zmieniają proces znakowania radioaktywnego przeciwciała w wystandaryzowany, pozbawiony kłopotu proces, który znacznie ułatwia protokół leczenia pacjenta. Niniejszy zestaw posiada korzystniejsze od poprzednich cechy w taki sposób, że określone zostały optymalne parametry do znakowania i podawania terapeutyku lub diagnostyki, redukując tym samym koszty. Ponieważ opisane tutaj zestawy dostarczają optymalnych parametrów w zależności od znacznika, zastosowanie zestawu przeznaczonego do określonego znacznika zminimalizuje również samozniszczenie, tj. proces towarzyszący zastosowaniu niewłaściwego zestawu dla określonego znacznika. Unikanie samozniszczenia w rezultacie prowadzi do optymalnej wydajności znakowania. Co więcej, protokoły przez sterylne, wolne od pirogenów składniki zawarte w każdym zestawie stanowią łatwy sposób, ponieważ pominięta jest sterylizacja, usuwanie pirogenów oraz oczyszczanie po znakowaniu.

3. Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób radioaktywnego znakowania skoniugowanego z chelatorem przeciwciał a anty-CD20 dla podawania pacjentowi, polegają cy na tym, ż e: i) miesza się skoniugowane z chelatorem przeciwciało z roztworem zawierającym znacznik radioaktywny do wytworzenia mieszaniny; (ii) inkubuje się mieszaninę przez korzystną ilość czasu w korzystnych warunkach temperatury, pH i warunkach buforowych dla wytworzenia radioaktywnego przeciwciała, przy czym przeciwciało to ma więcej niż 95% włączonej radioaktywności; korzystną immunoreaktywność, taką, że może ono być podawane bezpośrednio pacjentowi bez dalszego oczyszczania ze znacznika radioaktywnego, który nie został włączony, i (iii) rozcieńcza się znakowane przeciwciało do odpowiedniego stężenia w preparacie buforu.

W sposobie wedł ug wynalazku korzystnym przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało anty-CD20. Bardziej korzystnie, przeciwciało anty-CD20 jest 2B8-MX-DTPA.

Preparat buforu w sposobie według wynalazku korzystnie zawiera sól fizjologiczną, radioprotektant i nie skoniugowany chelator. Radioprotektant w sposobie według wynalazku korzystnie wybiera się z grupy składającej się z albuminy surowicy ludzkiej (HSA), askorbinianu, kwasu askorbinowego, fenolu, siarczanów, glutationu, cysteiny, kwasu gentyzynowego, kwasu nikotynowego, askorbylo palmitynianu, HOP(:0)H2-, glicerolu, sulfotlenku formaldehydo-sodowego, Na2S2O5, Na2S2O3 oraz SO2. W sposób według wynalazku nieskoniugowanym chelatorem korzystnie jest DTPA lub EDTA.

Roztwór zawierający znacznik radioaktywny przed zmieszaniem go z przeciwciałem skoniugowanym z chelatorem powinien mieć pH ustawiane na około 3 do 6. pH jest ustawiane roztworem octanu sodu o niskiej zawartości jonów metali, a octan sodu ma stężenie około 10 do 1000 mM.

Korzystnie w sposobie według wynalazku znacznikiem radioaktywnym jest chlorek ¹¹¹ln.

Objętość roztworu zawierającego znacznik radioaktywny korzystnie wynosi około 4-6 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności roztworu w czasie znakowania.

W korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku okoł o 1 ml przeciwciała skoniugowanego z chelatorem w stężeniu okoł o 0,5 do 30 mg/ml jest mieszane z roztworem do znakowania, a mieszanina jest inkubowana od około 30 sekund do 60 minut. Preparat bufor jest dodawany w ilości niezbędnej do osiągnięcia końcowej objętości od około 10 ml do około 50 ml.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku znacznikiem radioaktywnym jest chlorek ⁹⁰Y. Objętość roztworu zawierającego ten znacznik radioaktywny wynosi korzystnie pomiędzy 5 do 100 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności w czasie znakowania, bardziej korzystnie objęPL 205 780 B1 tość roztworu zawierającego znacznik radioaktywny wynosi około 45 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności roztworu w czasie znakowania.

W kolejnym korzystnym wykonaniu przeciwciało skoniugowane z MX-DTPA w stężeniu około 0,5 do 30 mg/ml miesza się z roztworem do znakowania radioaktywnego, a następnie prowadzi się korzystnie inkubację tej mieszaniny przez czas pomiędzy około 30 sekund do 60 minut.

W sposobie wedł ug wynalazku preparat buforu jest dodawany w iloś ci niezbę dnej do osią gnię cia końcowej objętości od około 10 ml do około 50 ml.

Przedmiotem wynalazku jest również test wiązania dla oznaczania procentu wiązania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z komórką docelową, składający się z:

(i) wyznakowania radioaktywnego przeciwciała jak zdefiniowano powyżej, wytwarzając znakowane radioaktywnie przeciwciało; (ii) mieszania i inkubowania co najmniej jednej porcji wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z co najmniej jedną porcją pozytywnych antygenowo komórek; (iii) mieszania i inkubacji co najmniej jednej porcji znakowanego radioaktywnie przeciwciała identycznej jak w etapie (ii) z co najmniej jedną porcją roztworu buforowego do rozcień czania o tej samej obję toś ci jak porcja pozytywnych antygenowo komórek w etapie (i) jako kontroli, a następnie (iv) osadzenia komórek przez wirowanie, (v) pomiaru radioaktywności w supernatancie osadzonych komórek oraz w kontroli oraz (vi) porównania ilości radioaktywności w supernatancie komórek z ilością radioaktywności w kontroli.

W teś cie wią zania wedł ug wynalazku, przeciwciał o jest przeciwciałem anty-CD20, korzystnie przeciwciałem anty-CD20 jest 2B8.

W teś cie wią zania, korzystnym wspomnianym antygenem jest CD20, a komórki pozytywne wobec CD20 są komórkami SB (ATCC # CCL 120).

W innym korzystnym rozwią zaniu test wią zania wedł ug wynalazku ponadto obejmuje:

(i) mieszanie co najmniej jednej porcji wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z co najmniej jedną porcją antygenowo-negatywnych komórek; (ii) osadzenia antygenowo-negatywnych komórek poprzez wirowanie; (iv) pomiar radioaktywności w supernatancie osadzonych antygenowo-negatywnych komórek; i (v) porównanie ilości radioaktywności supernatantu antygenowo-negatywnych komórek z ilością radioaktywności supernatantu antygenowo-pozytywnych komórek i kontroli.

Wspomniane antygenowo-negatywne komórki, korzystnie są komórkami CD20-negatywnymi, a bardziej korzystnie są komórkami HSB (ATCC # CCL 120.1).

Przedmiotem wynalazku jest również test wiązania kompetytywnego dla oceny powinowactwa testowanego przeciwciała do komórki docelowej, obejmujący:

(i) przygotowanie kontrolnego przeciwciała znakowanego rutenem; (ii) przygotowanie znakowanego radioaktywnie testowanego przeciwciała sposobem według wynalazku jak zdefiniowano powyżej, (iii) inkubację wzrastających ilości testowanego przeciwciała oraz wzrastających ilości nie znakowanego przeciwciała kontrolnego ze stałym stężeniem utrwalonych, żywych lub liofilizowanych komórek pozytywnych antygenowo oraz śladowymi ilościami znakowanego rutenem przeciwciała kontrolnego, gdzie każde osobne stężenie testowanego przeciwciała oraz każde osobne stężenie przeciwciała kontrolnego znajdują się w innej, oddzielnej probówce; (iv) oznaczanie ilości wiązania w każdej probówce reakcyjnej w oparciu o względną elektrochemiluminescencję (ECL) przy użyciu sprzętu ORIGEN; oraz (v) obliczenie średniej wartości powinowactwa testowanego przeciwciała.

W teście kompetytywnego wiązania według wynalazku, przeciwciała kontrolne i testowane korzystnie są przeciwciałami anty-CD20, a komórki antygenowo pozytywne są komórkami CD20-pozytywnymi, najbardziej zaś korzystnie komórki antygenowo-pozytywne są komórkami SB (ATCC # CCL 120).

W oparciu o niniejszy wynalazek można utworzyć zestaw do radioaktywnego znakowania przeciwciała diagnostycznego lub terapeutycznego składający się z co najmniej (i) probówki zawierającej skoniugowane z chelatorem przeciwciało, (ii) probówki zawierającej bufor do stabilizacji i podawania radioaktywnego przeciwciała oraz (iii) instrukcji do znakowania radioaktywnego przeciwciała, gdzie wspomniane probówki są dostarczone w takiej ilości i takim stężeniu, że jeśli zostaną połączone ze znacznikiem radioaktywnym o odpowiedniej czystości i aktywności zgodnie z instrukcjami do zestawu, nie jest wymagane dalsze oczyszczanie wyznakowanego przeciwciała przed podaniem wspomnianemu pacjentowi. Co więcej, przy zachowaniu zgodności znakowania z instrukcjami do zestawu oraz wystarczającą aktywnością i czystością radioizotopu, tego rodzaju włączenie radioizotopu może osiągnąć poziom 95% a nawet 98% i wyższy.

Przeciwciało zawarte w zestawie może być przeciwciałem anty-CD20. Przeciwciało jest dostarczane w formie, w której jest połączone z bifunkcjonalnym chelatorem, ewentualnie skoniugowane z MX-DTPA, ale zastosowane mog ą zostać też inne chelatory takie jak fenylo- lub benzylo-koniugo8

PL 205 780 B1 wany DTPA, cykloheksylo-DTPA, pochodne EDTA i DOTA. Chelator może być jakimkolwiek chelatorem, który jest bifunkcjonalny, tj. posiada co najmniej dwa miejsca wiązania (co najmniej jedno miejsce do chelatowania jonu metalu i co najmniej jedno miejsce do związania liganda białkowego).

W zależ noś ci od zastosowanego przeciwciał a, skoniugowane przeciwciał o jest zazwyczaj dostarczane w stężeniu 0,5 do 30 mg/ml, korzystnie 2 mg/ml. Objętość skoniugowanego przeciwciała będzie zależała od stężenia i ilości wymaganego do optymalnego znakowania radioizotopu. Jednakże, skoniugowane przeciwciało jest dostarczane w takiej objętości i stężeniu, że całkowita objętość jest dodawana do probówki reakcyjnej używając sterylnej strzykawki i techniki aseptycznej. Pozwala to na zwiększenie powtarzalności i łatwości użycia. Wszystkie odczynniki zestawu zawarte tutaj są sterylne i wolne od pirogenów, oraz specyficznie zaprojektowane dla ł atwości i szybkoś ci przejś cia od przygotowania przeciwciała do podawania go. Przy niektórych znacznikach nie jest wymagane sprawdzanie wydajności włączania.

Szczególnie użytecznym składnikiem zestawu jest bufor, stabilizujący przeciwko efektom radiolizy oraz stabilizujący przy podaniu znakowanego radioaktywnie przeciwciała pacjentowi. Bufor jest farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem służącym zarówno jako rozcieńczalnik jak i bufor do podawania. Chociaż do podawania terapeutycznych lub diagnostycznych przeciwciał pacjentowi zastosowany może zostać jakikolwiek akceptowalny rozcieńczalnik, bufor niniejszego wynalazku jest w szczególności odpowiedni do podawania wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał.

Przykładowo, bufor zawiera radioprotektant taki jak ludzka albumina surowicza (HSA) lub askorbinian, które minimalizują radiolizę itru i, w mniejszym stopniu, indu. Inne znane fachowcom radioprotektanty mogą również zostać zastosowane w buforze tj. wychwytywacze wolnych rodników (fenol, siarczany, glutation, cysteina, kwas gentyzynowy, kwas nikotynowy, palmitynian askorbinianu, HOP(:0)H2, glicerol, sulfotlenek formaldehydo-sodowy, Na2S2O5, Na2S2O3 oraz SO2, itp.).

Podczas gdy radioprotektanty są zazwyczaj stosowane w buforach celem ochrony przed radiolizą, możliwa jest również dalsza ochrona przy użyciu radioprotektantu również w buforze reakcyjnym. Nie wykonywano tego wcześniej, tj. w odniesieniu do HSA, z powodu obecności metali, które mogłyby zakłócać proces znakowania. Jednakże, możliwym jest „oczyszczenie” HSA przy użyciu złoża chelatującego w taki sposób, że może on zostać zamieszczony w buforze reakcyjnym. Askorbinian i inne radioprotektanty mogą również być poddawane tej procedurze celem usunięcia zanieczyszczających metali.

Bufor w sposobie według niniejszego wynalazku zawiera również nadmiar nieskoniugowanego chelatora. Celem dołączenia nadmiaru nieskoniugowanego chelatora jest to, że nieskoniugowany chelator służy do wychwytywania u pacjenta jakiegokolwiek niezwiązanego z białkiem znacznika radioaktywnego i wpływa na wydzielenie radioizotopu usuwając tym samym wchłanianie izotopów odkładających się w kościach. Przykładowo, jeśli przeciwciało z zestawu jest skoniugowane z chelatorem DTPA, nadmiar DTPA lub jakiegokolwiek chelatora może być zawarty w buforze. Bufor ten jest korzystnie dostarczony w objętości, która może być w całości przeniesiona do probówki reakcyjnej. Jak opisano powyżej, prowadzi to do wzrostu łatwości użycia oraz powtarzalności ponieważ nie muszą być odmierzane i przenoszone dokładne objętości.

Korzystny bufor to bufor fosforanowy lub sól fizjologiczna, zawierający albuminę ludzkiego osocza oraz DTPA. Albumina ludzkiego osocza ma stężenie około 1 do 25% (w/v), a korzystniej stężenie około 7,5% (w/v). Stężenie DTPA wynosi korzystnie około 1 mM. Jako alternatywa do albuminy ludzkiego osocza zastosowany może zostać askorbinian, który stosowany jest zazwyczaj w stężeniu około 1 do 100 mg/ml. Choć zastosowane może zostać również szersze spektrum stężeń z zachowaniem bezpieczeństwa pacjenta.

Przeciwciało z zestawu do znakowania radioaktywnego jest łatwo znakowane radioizotopem dzięki bifunkcjonalnemu chelatorowi zgodnie ze sposobem wynalazku. Dla dalszej prostoty w tym względzie, zestaw może również zawierać probówkę z buforem do ustawiania pH roztworu radioizotopu oraz sterylną szklaną probówkę reakcyjną do wykonywania znakowania oraz rozpuszczania wyznakowanego radioktywnie przeciwciała w buforze. 10 ml probówka reakcyjna jest zazwyczaj wystarczająca ale probówki o objętości od 5 do 20 ml też mogą również zostać użyte. Bufor jest korzystnie roztworem octanu sodu o niskiej zawartości metali, w stężeniu 10 do 1000 mM, najkorzystniej 50 mM.

Specyficzny zestaw zawiera przeciwciało skoniugowane MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA. 2B8 jest przeciwciałem anty-CD20 wykazującym wpływ na zanik komórek B po podaniu pacjentom z chłoniakiem. Jednakże, stanie się widocznym dla fachowca, że zestaw do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku może zostać zoptymalizowany do znakowania innymi niż przeciwciała anty-CD20, lub jakimikolwiek innymi przeciwciałami, które zostały skoniugowane z DTPA lub innym poliwalentnym

PL 205 780 B1 chelatorem. Korzystny zestaw niniejszego wynalazku może zawierać co najmniej (i) probówkę zawierającą przeciwciało 2B8 skoniugowane z MX-DTPA w roztworze lub zliofilizowane oraz (ii) probówkę zawierającą bufor do podawania znakowanego radioaktywnie przeciwciała pacjentowi. Korzystny zestaw zawiera (iii) bufor do ustawiania pH oraz (iv) probówkę reakcyjną. Alternatywnie, i bardziej korzystnie, bufor jest dostarczany w probówce reakcyjnej, eliminując tym samym etapy pomiaru i przenoszenia buforu oraz zwiększając prostotę, dokładność i sterylność składników zestawu. Jednakże, inne rozwiązania tez są możliwe, tj. jeśli najpierw bufor jest dodawany do probówki z izotopem to zbuforowany izotop jest wówczas przenoszony do probówki reakcyjnej. W tym przypadku powinna być dostarczona probówka reakcyjna z odpowiednią ilością przeciwciała.

Alternatywnie, probówka izotop/bufor może być wystarczająco duża po to aby mogła pomieścić dodatek koniugatu przeciwciała, tj. bezpośrednio do probówki producenta. To eliminuje potrzebę probówki reakcyjnej.

Jak opisano powyżej, inna preferowana konfiguracja zestawu jest taka, w której sama probówka reakcyjna zawiera potrzebną objętość skoniugowanego przeciwciała (tj. 1 lub 1,5 ml ¹¹¹In oraz ⁹⁰Y, odpowiednio). Przeciwciało może zostać dostarczone w buforze, który zapewnia odpowiednie pH do znakowania zgodnie ze specyficznie wykorzystywanym izotopem (tj. pH 3-6 ¹¹¹In oraz pH 3-5 dla ⁹⁰Y). Zastosowane mogą zostać różne bufory, w zależności od izotopu (tj. octan sodu dla ⁹⁰Y, cytrynian sodu dla ¹¹¹In). pH i skład buforu może się również różnić w zależności od natury mającego być wyznakowanym liganda (tj. znakowane peptydy wytrzymują < pH 3). Zasadniczo zatem, izotop może zostać przeniesiony bezpośrednio do probówki reakcyjnej, podobnie jak bufor. Ograniczone użycie zestawu do probówki reakcyjnej powinno zwiększyć powtarzalność i prostotę, w a dalszej kolejności zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia podczas manipulacji składnikami zestawu. Zestawy do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku w dalszej kolejności zawierają radioizotop, który może zostać zamówiony oddzielnie u odpowiedniego dostarczyciela. Korzystne radioizotopy niniejszego wynalazku to chlorek ¹¹¹In oraz chlorek ⁹⁰Y w HCl chociaż zawarte tutaj sposoby nie ograniczają się do tych izotopów. Fachowcom znane są inne radioizotopy stosowane do obrazowania, tj., jak opisano w U.S. 4,634,586, 5,460,785 i 5,766,571, które są zawarte tutaj w całości poprzez włączenie. Ind [111] jest w szczególności korzystny do obrazowania nowotworów komórek B zaś emitery beta takie jak ⁹⁰Y są szczególnie użyteczne jako czynniki radioterapeutyczne. Do koniugowania przeciwciała w zależności od chelatora mogą zostać zastosowane inne radioizotopy odpowiednie dla tych lub innych celów, tj., emitery alfa.

Przy odpowiedniej wydajności połączonych schematów terapeutycznych zawartych w U.S. No. 08/475,813, w dalszej kolejności zestaw zawiera oddzielną probówkę chimerycznego przeciwciała, tj. Rituxanu®, podawanego przed lub po wyznakowanym radioaktywnie anty-CD20. Jeśli chimeryczne przeciwciało jest podawane przed wyznakowanym radioaktywnie przeciwciałem, odpowiedź HAMA, która ogólnie może się pojawić w odpowiedzi na podanie mysiego przeciwciała anty-CD20 może w sposób znaczący zmniejszyć się, tym samym zwiększając terapeutyczną korzyść stosowania znakowanych radioaktywnie mysich przeciwciała. Co więcej, przy użyciu chimerycznego anty-CD20 celem zlikwidowania krążących komórek B, obrazy diagnostyczne otrzymywane z przeciwciałami znakowanymi ⁹⁰Y mogą być znacznie jaśniejsze.

Powinno być również oczywistym, że zarówno wyznakowane radioaktywnie przeciwciało diagnostyczne oraz wyznakowane radioaktywnie przeciwciało terapeutyczne mogą być użyte razem w połączonym schemacie terapeutycznym, przed lub po przeciwciele terapeutycznym celem wizualizacji wielkości nowotworu przed i po leczeniem. W tym przypadku, zestaw niniejszego wynalazku może zawierać oddzielne, być może oznaczone innym kolorem, probówki z buforem specyficznie dostosowanym do wymaganego optymalnego pH do radioaktywnego znakowania przeciwciał. Taki system powinien zapewniać, że do każdego znakowania zostanie użyty odpowiedni bufor oraz zapewnić klinicyście tę samą łatwość w wyznakowaniu obydwu przeciwciał jeśli zakupione zostały obydwa zestawy. Taki zestaw w efekcie łączy komponenty dwóch zestawów do znakowania radioaktywnego.

Składniki zestawu do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku są dostarczone w odpowiednim stężeniu i pH w taki sposób, że łatwo jest utrzymać sterylność przed podaniem przeciwciała i nie ma potrzeby dodatkowych podłóż lub buforów. Jednakże, dla fachowca będzie widocznym, że niektóre z odczynników mogą zostać przygotowane, wysterylizowane i badane na sterylność na miejscu. A zatem, zapewnione są wariacje zestawu wynalazku z zależności od budżetu i preferencji konsumenta.

PL 205 780 B1

Zestaw do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku może zostać zastosowany z sposobie znakowania radioaktywnego przeciwciała skoniugowanego z chelatorem celem podawania pacjentowi. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sposób taki składa się z, (i) wymieszania przeciwciała skoniugowanego z chelatorem z roztworem zawierającym radioizotop; (ii) inkubacji mieszaniny w odpowiedniej temperaturze oraz (iii) rozcieńczenia wyznakowanego przeciwciała do odpowiedniego stężenia w buforze, w taki sposób, że wyznakowane radioaktywnie przeciwciało może być podawane bezpośrednio pacjentowi bez dalszego oczyszczania.

Najkorzystniej, przeciwciało jest przeciwciałem anty-CD20, i w szczególności, przeciwciało anty-CD20 może być 2B8. Przeciwciało może być skoniugowane z jakimkolwiek odpowiednim chelatorem, tj., MX-DTPA, CHX-DTPA, fenylo- lub benzylo-DTPA, DOTA, pochodne EDTA, itd. Preferowany jest MX-DTPA. Metody wykonywania koniugacji przeciwciała są znane fachowcom (Kozak i wsp. (1989); Mirzadeh i wsp. (1990), Brachbiel i wsp. (1986)).

Twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że sposób radioaktywnego znakowania przeciwciała skoniugowanego z chelatorem działał najlepiej w roztworze zawierającym znacznik radioaktywny i o pH pomiędzy około 3,0 a 6,0, najkorzystniej około 4,2 zanim zostanie zmieszany z przeciwciałem skoniugowanym z chelatorem. Do ustawiania pH jest szczególnie korzystny octan sodu o niskiej zawartości metali choć zastosowane mogą zostać również inne roztwory. Korzystnie, octan sodu ma stężenie pomiędzy 10 a 1000 mM, a najkorzystniej 50 mM.

Gdy radioizotop jest chlorkiem ¹¹¹In, objętość ¹¹¹In, która powinna być zastosowana do przygotowania pojedynczej dawki do podania wynosi zazwyczaj około 5,5 mCi podzieloną przez stężenie radioaktywności w czasie znakowania. Dla podawania pacjentowi, typowa dawka diagnostyczna ¹¹¹In ma około 2 do 10 mCi. Ilość octanu sodu stosowanego do ustawiania pH zmienia się w zależności od stężenia octanu sodu oraz roztworu będącego nośnikiem izotopu, i tym samym może być całkiem szerokie. Gdy stężenie octanu sodu wynosi 50 mM, ilość wymagana do ustawienia pH to zazwyczaj 1,2 objętości użytego ¹¹¹In, choć zastosowane mogą być również większe objętości. Trzeba zauważyć, że najistotniejszy jest stosunek octanu sodu do HCl oraz, że ilość użytego octanu sodu będzie się zmieniała w zależności od ilości i stężenia HCl w buforze. Około 1 ml przeciwciała skoniugowanego z chelatorem w stężeniu 2 mg/ml jest następnie mieszana z radioaktywnym roztworem octanu sodu przez około 30 minut, lub przez czas wymagany do osiągnięcia optymalnego wyznakowania przeciwciała. Ten czas może się wahać od około 30 sekund do około 60 minut. Następnie dodawany jest bufor w ilości potrzebnej do osiągnięcia końcowej objętości około 10 ml.

Optymalny czas wymagany do wyznakowania przeciwciała może się różnić w zależności od przeciwciała, danego znacznika radioaktywnego oraz zastosowanego koniugatu. Ważnym czynnikiem w optymalizacji czasu potrzebnego do znakowania radioaktywnego jest stosunek chelatora do przeciwciała, które ma być wyznakowane. Przykładowo, stosunek chelator do przeciwciała musi być wystarczająco wysoki celem osiągnięcia terapeutycznie korzystnego poziomu inkorporacji, tj., 90 do 95% w zależności od radioizotopu ale nie może być zbyt wysoki aby zachowana była strukturalna integralność lub immunoreaktywność przeciwciała. Wymaga to pewnego procesu zrównoważenia, który w pewnych przypadkach może prowadzić do niższego poziomu skoniugowanego chelatora oraz dłuższych czasów znakowania. Przykładowo, dla 2B8 i MX-DTPA, wykazano, że znakowanie może być osiągnięte w ciągu pięciu minut dla ¹¹¹In ze stosunkiem molarnym chelatora do przeciwciała jedynie około 1,5 do 1. Nie jest zatem koniecznym, aby zwiększać stosunek chelatora do przeciwciała, ponieważ osiągnięty został pożądany poziom radioinkorporacji. Co więcej, zwiększenie ilości koniugowanego chelatora nie jest korzystne ponieważ może to wpłynąć na immunoreaktywność przeciwciała. Tego rodzaju parametry powinny być empirycznie wyznaczone dla innych przeciwciał przy projektowaniu zestawów podobnych do tych opisanych w niniejszym wynalazku.

Jeśli radioizotop ⁹⁰Y jest chlorkiem, objętość chlorku ⁹⁰Y potrzebnego do przygotowania pojedynczej dawki zazwyczaj waha się od pomiędzy około 10 do 50 mCi i wynosi korzystnie około 45 mCi, podzielony przez stężenie radioaktywności w czasie znakowania. Ilość octanu sodu użytego do ustawienia pH zależy od stężenia octanu sodu oraz stężenia nośnika izotopu i może tym samym być całkiem szerokie. Jeśli stężenie octanu sodu wynosi 50 mM a ⁹⁰Y jest dostarczany w 50 mM HCL, ilość wymagana do ustawienia pH zazwyczaj wynosi około 1,2 raza objętości użytego ⁹⁰Y. Około 1,5 ml przeciwciała skoniugowanego z chelatorem w stężeniu 2 mg/ml jest następnie mieszana z wyznakowanym radioaktywnie roztworem octanu oraz inkubowna około 5 minut lub przez czas konieczny do

PL 205 780 B1 otrzymania optymalnego znakowania przeciwciała. Ten okres czasu może się wahać od około 30 sekund do 60 minut. Bufor jest dodawany w ilości wystarczającej do osiągnięcia całkowitej końcowej objętości około 10 ml.

Korzystnie, sposób znakowania radioaktywnego wynalazku jest wykonywany przy użyciu opisanego tutaj zestawu do znakowania radioaktywnego. Jednakże, widocznym dla fachowca jest fakt, że korzystne składniki oraz warunki są jedynie wskazówkami dla praktycznej strony wynalazku i mogą zostać zmienione do pewnego stopnia poprzez odpowiednią optymalizację. Warunki, które różnią się od tych preferowanych, jednak wciąż umożliwiają osiągnięcie celu wynalazku są uważane za znajdujące się w zakresie niniejszego wynalazku.

Zestaw do znakowania radioaktywnego może zostać dostarczony z odpowiednimi odczynnikami służącymi do weryfikacji powinowactwa wiązania przeciwciała po znakowaniu radioaktywnym. W takim przypadku, zestaw wynalazku moż e być również stosowany do okre ś lania procentu wią zania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała do komórki docelowej przed podaniem przeciwciała pacjentowi. Twórcy niniejszego wynalazku odkryli również, że zawarty zestaw testowy do wiązania może być użyteczny do testowania powinowactwa jakiegokolwiek przeciwciała dla którego niedostępny jest oczyszczony antygen. Zgodnie z tym, składniki testu wiązania mogą być również sprzedawane jako od-zielne składniki.

Ogólnie, zestaw wiązania i znakowania radioaktywnego zawiera (i) co najmniej jedną probówkę liofilizowanych komórek produkujących antygen rozpoznawany przez przeciwciało wynalazku; (ii) probówkę zawierającą przeciwciało skoniugowane z chelatorem; (iii) probówkę zawierającą bufor oraz (iv) instrukcję do znakowania radioaktywnego przeciwciała w taki sposób, że przeciwciało może być bezpośrednio podawane pacjentowi bez potrzeby oczyszczania. Jak opisano powyżej, zestaw do znakowania radioaktywnego może również zawierać probówkę zawierającą bufor do ustawiania pH radioizotopu oraz sterylną szklaną probówkę. Korzystnie, bufor jest pozbawionym jonów metali roztworem octanu sodu o stężeniu około 10 do 1000 mM, zaś szklana probówka ma objętość co najmniej 5 ml. Przeciwciało jest korzystnie przeciwciałem anty-CD20, a chelatorem jest korzystnie MX-DTPA. Jak opisano poprzednio, zastosowane mogą zostać inne chelatory. Preferowanym skoniugowanym przeciwciałem jest 2B8-MX-DTPA, chociaż wyznakowane może zostać jakiekolwiek skoniugowane przeciwciało i badane pod kątem powinowactwa. Bufor jest zbuforowana fosforanem solą fizjologiczną zawierającą radioprotektant oraz nieskoniugowany chelator jak opisano powyżej oraz dodatkowo, dodany lub nie może zostać izotop będący chlorkiem ⁹⁰Y. Inne radioizotopy mogą zostać zastosowane w zależności od chelatora. Różnica pomię dzy zestawem testowym/znakowania opisanym powyż ej polega na dodaniu pozytywnych względem antygenu komórek służących jako substrat docelowy do testowania powinowactwa przeciwciała. Jeśli antygenem jest CD20, oferowanymi komórkami pozytywnymi CD-20 są komórki SB (ATCC # CCL 120) ale zastosowane mogą zostać jakiekolwiek pozytywne komórki CD20. Test wiązania oraz znakowania radioaktywnego może w dalszej kolejności zawierać negatywne pod względem antygenu komórki stosowane jako kontrola negatywna. Preferowanymi CD-20 negatywnymi komórkami są komórki HSB (ATCC # CCL 120.1) ale zastosowane mogą zostać jakiekolwiek komórki negatywne pod względem CD20.

Połączony zestaw do znakowania radioaktywnego oraz testowania wiązania może w dalszej kolejności zawierać probówkę chimerycznego przeciwciała anty-CD20 ulegającego znakowaniu dla celów połączonego schematu terapeutycznego lub do usuwania peryferyjnych komórek B przez obrazowaniem. Tego rodzaju oddzielne przeciwciało jest korzystnie Rituxanem®, ale może być jakimkolwiek przeciwciałem wpływającym na zabijanie komórek. W rzeczywistości, dwa różne typy przeciwciał mogą zostać połączone w jednym zestawie, tj. przeciwciała skierowane przeciwko dwóm różnym antygenom komórek B, jeśli połączona terapia służy identyfikacji tego samego typu komórek, tj., chłoniaka komórek B.

Tak jak składniki zestawu mogą być użyte do znakowania innych przeciwciał, przygotowane mogą zostać inne przeciwciała służące do testowania powinowactwa przeciwciała w zależności od antygenu docelowego. Jednakże, dla przeciwciał anty-CD20 test wiązania oraz znakowania radioaktywnego według niniejszego wynalazku jest w szczególności odpowiedni do komercyjnego zastosowania ponieważ komórki występują w postaci zliofilizowanej. Pozwala to na weryfikacje powinowactwa przeciwciała i sprawdzenie powinowactwa przeciwciała w sposób prosty, systematyczny oraz usuwa wydatki związane z prowadzeniem hodowli tkankowej. Zliofilizowane komórki są zazwyczaj dostarczane w postaci porcji około 0,5 i 500 x 10⁶ komórek na probówkę zgodnie ze sposobem wynalazku.

PL 205 780 B1

Możliwym jest, że niektóre ośrodki laboratoryjne będą preferowały zamówienie przeciwciał, które zostało już wyznakowane, w którym to przypadku taki ośrodek będzie potrzebował odczynników do testowania wiązania celem upewnienia się, że przeciwciała zachowają powinowactwo wiązania. W tym przypadku, niniejszy wynalazek dostarcza również zestawu do testowania wiązania celem określenia procentu wiązania znakowanego radioaktywnie przeciwciała do jego komórki docelowej. Zestaw taki zawiera co najmniej jedną probówkę utrwalonych i/lub zliofilizowanych komórek pozytywnych pod względem antygenu oraz może opcjonalnie zawierać komórki negatywne pod względem antygenu do testowania wiązania oraz do znakowania radioaktywnego. Co więcej, powinno być widocznym, że zmiany w takim kicie mogą dotyczyć nieznakowanego przeciwciała kontrolnego do testowania specyficzności wiązania przeciwciała konsumenta na drodze kompetetywnego wiązania.

Jeśli antygenem jest CD20, komórki pozytywne na CD20 są korzystnie komórkami SB (ATCC # CCL 120) zaś negatywne pod względem CD20 komórki są korzystnie komórkami HSB (ATCC # CCL 120.1), które są dostarczone w postaci zliofilizowanej w porcjach pomiędzy 0,5 a 50 x 10⁶ komórek. W tym przypadku, przeciwciało jest korzystnie koniugatem MX-DTPA 2B8 wyznakowanym ¹¹¹In lub ⁹⁰Y.

W obliczu dodatkowych zawartych tutaj wykonań wynalazku, powinno być zaznaczonym, że jedną z korzyści zestawu do znakowania radioaktywnego oraz sposobu według niniejszego wynalazku jest to, że nie jest wymagany żaden dodatkowy etap oczyszczania a wyznakowane radioaktywnie przeciwciało może być podawane pacjentowi bezpośrednio, tym samym oszczędzając cenny czas oraz zmniejszając stabilność przeciwciała. Tym samym, dla klinicysty pożądanym może być testowanie lub weryfikowanie specyficzności wiązania oraz powinowactwa wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała przed podaniem, test taki może być pominięty w odniesieniu do poszczególnych radioizotopów jeśli stabilność przeciwciała oraz zahamowanie radiolizy mają szczególne znaczenie, tak jak w przypadku itru. Dostarczając zestawu, w którym testowane może być powinowactwo wiązania oraz jego specyficzność, niniejsi twórcy sugerują, że tego rodzaju testy są absolutnie konieczne w sposobach według wynalazku lub opartych na nich zestawach. Opcja testowania działania takiego przeciwciwciała jest całkowicie w gestii klinicysty.

Niniejsi twórcy stwierdzili również, że sposób zastosowany do przygotowania utrwalonych i zliofilizowanych komórek do testów wiązania według niniejszego wynalazku jest w szczególności korzystny do przygotowywania komórek do zestawów komercyjnych. Komórki mogą być utrwalane przed liofilizacją celem poprawienia struktury/stabilności. W szczególności, komórki posiadają wysoką powtarzalność jeśli są stosowane do testów wiązania przeciwciała.

W przeprowadzeniu sposobu według wynalazku ważny jest etap przygotowywania zliofilizowanych komórek składający się z (i) zebrania komórek w gęstości 0,5 do 2 x 10⁶ komórek na mililitr poprzez wirowanie; (ii) przemywania komórek co najmniej jeden raz w zrównoważonym roztworze soli, tj. HBSS; (iii) rozpuszczania żwirowanych komórek w buforze liofilizacyjnym zawierającym zrównoważony roztwór soli z nośnikiem białkowym oraz co najmniej jednym typem cukru; (iv) umieszczenia porcji zawieszonych komórek w probówce wirówkowej lub szklanej oraz (v) liofilizacji komórek 1296 godz., korzystnie 24-72 godz., przy około 30-60 millitorach. Sposób jest w szczególności odpowiedni do przygotowania zliofilizowanych komórek, gdzie wspomniane komórki są komórkami SB (ATCC # CCL 120) lub HSB (ATCC # CCL 120.1), jednak moż e być również zastosowany wobec innych typów komórek.

Bufor zawiera albuminę surowicy bydlęcej jako białko nośnikowe w stężeniu 1% (w/v) oraz mannitol w stężeniu 10%. Jednakże, zastosowane mogą zostać również inne białka nośnikowe, tj. HSA, oraz inne cukry. Komórki zbierano poprzez wirowanie przy prędkości 1300 rpm, i dodawano roztwór soli HBSS (zbalansowany roztwór soli Hanksa). Komórki są zawieszane w stężeniu 50 x 10⁶ komórek na ml. Powyższe warunki mogą być nieco zmodyfikowane bez znaczącego poświęcania żywotności komórek. Co więcej, powyższe warunki mogą być uzupełnione przez dodatkowe procedury opracowane do optymalizacji procesu dla większych ilości komórek, np. tangential flow do filtracji do przeniesienia komórek do buforu liofilizacyjnego. Zestawy do testowania wiązania mogą zostać użyte do badania powinowactwa wiązania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała. Tego rodzaju test jest również przedmiotem niniejszego wynalazku. Test wiązania do określenia procentu wiązania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała do komórki docelowej ogólnie składa się z następujących etapów: (i) zmieszania co najmniej jednej porcji wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z co najmniej jedną porcją pozytywnych antygenowo komórek; (ii) zmieszania co najmniej porcji znakowanego radioaktywnie przeciwciała z tą samą objętością komórek pozytywnych względem antygenu jak w (i) jako

PL 205 780 B1 kontroli; (iii) osadzenia komórek przez wirowanie; (iv) pomiaru radioaktywności w supernatancie żwirowanych komórek oraz kontroli oraz (v) porównania radioaktywności w supernatancie komórek z ilością radioaktywności w kontroli.

Ponieważ zestawy do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku zawierają opcjonalnie chlorek ¹¹¹Yn lub chlorek ⁹⁰Y. Jeśli ¹¹¹In ulega wyznakowaniu, radioaktywność w próbkach testowych jest mierzona przy użyciu licznika gamma. Jeśli ⁹⁰Y jest znacznikiem, radioaktywność jest mierzona przy użyciu licznika scyntylacyjnego, choć zastosowany mógłby być licznik gamma.

Do testów wiązania według niniejszego wynalazku korzystnym przeciwciałem jest anty-CD20, zaś anty-CD20 jest korzystnie 2B8, gdzie 2B8 jest znakowane przy użyciu zestawu do znakowania radioaktywnego niniejszego wynalazku. Jednakże, testowane może być jakiekolwiek znakowane radioaktywnie przeciwciało pod warunkiem, że dostępne są komórki produkujące określony antygen. Jeśli antygenem jest CD20 preferowanymi komórkami są SB (ATCC # CCL 120), jednakże, test może być również zoptymalizowany i wykonywany z jakikolwiek znakowanym radioaktywnie przeciwciałem oraz odpowiednią komórką docelową.

Bufor do rozcieńczeń stosowany do testu powinien utrzymywać wiązanie przeciwciała tj. bufor fizjologiczny, zawierający białko nośnikowe, np. BSA celem zminimalizowania niespecyficznego wiązania do komórek. Chociaż probówka z buforem do rozcieńczeń służy jako kontrola, zastosowana może być również dalsza kontrola w postaci negatywnych wobec antygenu komórek. W tym przypadku, test wiązania w dalszej kolejności składa się z następujących etapów: (i) zmieszania co najmniej jednej porcji negatywnych względem antygenu komórek; (ii) zwirowania negatywnych względem antygenu komórek poprzez wirowanie; (iv) pomiaru radioaktywności w supernatancie oraz (v) porównywania ilości radioaktywności w komórkach negatywnych względem antygenu z ilością radioaktywności w supernatancie komórek pozytywnych względem antygenu oraz kontroli. Porównanie radioaktywności otrzymanej z tej probówki wobec buforu do rozcieńczeń będzie służyło jako pomiar ilości niespecyficznego wiązania z komórkami pozytywnymi względem antygenu. Jeśli antygenem jest CD20, komórki pozytywne względem CD-20 są komórkami SB, komórkami negatywnymi względem CD20 są korzystnie komórki HSB (ATCC if CCL 120.1).

Jak opisano powyżej, zliofilizowane komórki dostarczają prostego, wydajnego i powtarzalnego standardu do testowania wydajności wiązania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała. A zatem, test wiązania niniejszego wynalazku jest korzystnie wykonywany przy użyciu zliofilizowanych komórek zawartych w teście wiązania według niniejszego wynalazku. Dodatkowo, testy znakowania radioaktywnego według niniejszego wynalazku mogą być połączone z testami wiązania, gdzie wspomniane przeciwciało jest najpierw znakowane sposobem znakowania skoniugowanego z chelatorem przeciwciała jak opisano w niniejszym wynalazku. Najkorzystniej, test wiązania niniejszego wynalazku jest wykonywany przy użyciu opisanego tutaj jednego z testów wiązania oraz zestawów do znakowania radioaktywnego.

Zaistnieć mogą okoliczności, w których powinowactwo przeciwciała może być testowane lub potwierdzone ale nie zostaje dołączony znacznik radioaktywny. Przykładowo, w pewnych warunkach, tj. przy zakłóceniach, korzystne może być testowanie powinowactwa przeciwciała przed testowaniem. W takim przypadku, niniejszy wynalazek zawiera również kompetycyjny test wiązania dla określenia powinowactwa testowanego przeciwciała wobec komórki docelowej, składający się z: (i) przygotowania kontrolnego przeciwciała znakowanego rutenem; (ii) przygotowania znakowanego radioaktywnie przeciwciała zgodnie ze sposobem według wynalazku (iii) inkubacji wzrastających ilości nieznakowanego kontrolnego przeciwciała ze stałym stężeniem komórek docelowych oraz śladowymi ilościami znakowanego rutenem przeciwciała, gdzie każde stężenie testowanego przeciwciała oraz każde stężenie przeciwciała kontrolnego znajduje się w innej, oddzielnej probówce, odpowiednio; (iv) określenia wielkości wiązania w każdej probówce reakcyjnej w oparciu o względną elektrochemiluminescencję (ECL) przy użyciu sprzętu ORIGEN; oraz (v) obliczenia średniej wartości powinowactwa testowanego przeciwciała. Wartość średniego powinowactwa może być wyliczona z wartości EC50 oraz znanego stężenia śladowego przeciwciała przy użyciu metody Muller (J. Immunological Methods (1980) 34:345) lub jakiejkolwiek innej odpowiedniej metody. Test ten może być również stosowany do testowania powinowactwa znakowanych radioaktywnie przeciwciał lub jakiegokolwiek przeciwciała dla którego nie można oczyścić antygenu, a jako źródło antygenu wymagane są komórki. Utrwalone, liofilizowane komórki w niniejszym wynalazku mogą być zastosowane jako komórki docelowe. Jeśli wykonywany jest test wiązania kompetytywnego według niniejszego wynalazku celem testowania powinowactwa przeciwciał anty-CD20, przeciwciałem kontrolnym może być 2B8, lub jakiekolwiek inne przeciwciało anty14

PL 205 780 B1

-CD20. Przeciwciało kontrolne może być przeciwciałem skoniugowanym z chelatorem. Testowane przeciwciało może być również koniugatem chelatu z przeciwciałem kontrolnym. Alternatywnie, testowane przeciwciało może być innym przeciwciałem anty-CD20, którego powinowactwo wiązania do CD20 jest porównywalne do 2B8. Jednakże, test może być zaadaptowany do użycia z przeciwciałami mającymi inne specyficzności, jeśli dostępne są odpowiednie komórki docelowe.

W testach wią zania kompetytywnego według niniejszego wynalazku, preferowanymi komórkami docelowymi są komórki pozytywne względem CD20-pozytywnych komórek, korzystnie komórek SB (ATCC # CCL 120), a bardziej korzystnie zawieszone zliofilizowane komórki SB przygotowane zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku. Użyte mogą również zostać komórki zliofilizowane za pomocą innych metod lub komórki utrwalone. Przeciwciało znakowane rutenem jest zazwyczaj przygotowywane w procesie składającym się z inkubacji przeciwciała z chelatorem estru N-hydroksybursztynianu rutenu (II) bis-pirymidyny (TAG-NHS), choć możliwe są również inne sposoby znakowania przeciwciał. Do znakowania, przeciwciało kontrolne oraz TAG-NHS są korzystnie inkubowane w stosunku molarnym około 1:15.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku na podstawie następujących figur:

4. Krótki opis rysunków

Figura 1. Immunoreaktywność natywnych przeciwciał 2B8 porównywano w stosunku do dostępnych komercyjnie przeciwciał anty-CD20 B1 (Coulter) i Leu 16 (Becton Dickinson) w teście radioimmunologicznym bezpośredniego współzawodniczenia z wykorzystaniem przeciwciał znakowanych ¹²⁵¹-B1. Pozytywne antygenowo komórki SB (100,000) dodawano do każdego dołka na płytkach z filtrami V&P; 10 ng znakowanych radioaktywnie B1 mieszano z różnymi stężeniami nie wyznakowanych kompetycyjnych przeciwciał po czym zawiesinę dodawano do komórek. Przeciwciała inkubowano z komórkami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; pomiary wykonywano w trzech powtórzeniach. Następnie, dołki płukano, suszono i wykonywano radiografię na filtrze. Uzyskane wyniki odnoszono do radioaktywnego tła i stanowią one średnią trzech powtórzeń.

Figura 2. Wzrost zawartości niezwiązanych przeciwciał 2B8 analizowano w celu określenia możliwości ich wiązania do ludzkich komórek B (SB) przy wykorzystaniu analizy FACS. Porównanie wykonano z dostępnymi komercyjnie monoklonalnymi przeciwciałami anty-CD20 (B1) i z dwoma odrębnymi izotypami przeciwciał. Kozie przeciwciała skierowane przeciwko mysim IgG-FITC F(ab)'a wykorzystywano jako przeciwciało drugorzędowe. Wyniki pokazują, że 2B8 są swoiste w stosunku do antygenu CD20 i lepiej wiążą się z tym antygenem niż przeciwciała B1.

Figura 3. Ludzkie komórki B (SB) inkubowano ze wzrastającą ilością znakowanych izotopem ¹¹¹I -2B8. Próby w trzech powtórzeniach inkubowano przez godzinę po czym radioaktywność związaną z komórkami określano po naniesieniu ich na filtr. Analiza Scatchard'a pozwala na wyliczenie stałej powinowactwa równej 4,3 x 10'⁹ M.

Figura 4. Immunoreaktywność natywnego 2B8, 2B8-MX-DTPA i B1. Przeciwciało B1 znakowano radioaktywnie jak opisano w rozdziale Metody. 10 ng wyznakowanych radioaktywnie B1 mieszano ze wzrastającymi stężeniami kompetytora, po czym takie zawiesiny dodawano do dołków V&P zawierających 100,000 antygenowo pozytywnych komórek SB; wszystkie pomiary przeprowadzano w trzech powtórzeniach. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, dołki intensywnie płukano. Następnie, filtry suszono a związaną z nimi radioaktywność określano przez pomiar promieniowania gamma; wszystkie wartości odnoszono do tła. Pokazane wyniki stanowią średnią trzech powtórzeń.

Figura 5. Przeciwciała 2B8 rozcieńczano do końcowego stężenia 10 mg/ml w soli fizjologicznej lub soli fizjologicznej zawierającej 10 mM glicynę-HCl, pH 6,8. Próbki w dwóch powtórzeniach mieszano w zakręcanych probówkach, zalewano ciekłym azotem i zakręcano. Próby inkubowano w 4°C lub 30°C przez 12 tygodni; immunoreaktywność próbek określono raz w tygodniu. Nie obserwowano utraty immunoreaktywności w żadnej z prób zawierających przeciwciała 2B8 w ciągu 12 tygodni badań. Przedstawiono immunoreaktywność w 1 tygodniu (fig. 5A), 6 tygodniu (fig. 5B) i 12 tygodniu (fig. 5C).

Figura 6. Test wiązania dla określenia immunoreaktywności znakowanego izotopem ¹¹¹In- koniugatu 2B8-MX-DTPA inkubowanego w PBS o pH 7,4 zawierającego 50 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej (48 godz. inkubacja). Figura 6A) Stałą ilość radioaktywnie wyznakowanego przeciwciała (5 ng/ml) inkubowano z wzrastającą objętością komórek SB (20 x 10⁶ cells/ml). Stopień radioaktywności (cpm) związanych komórek wykreślano w stosunku do dodanej objętości zawiesiny komórek. Figura 6B) Określano całkowitą zastosowaną radioaktywność w stosunku do radioaktywności związanej (AT/B). Liniowa eksptrapolacja pozwoliła na wyliczenie y-odcięta (0,997). Przybliżenie y-odcięta x 100 dała wartość immunoreaktywności 100% przy swobodnym dostępie antygenu.

PL 205 780 B1

Figura 7. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelach Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 μΐ (ścieżki 1,2), 10 μΐ (ścieżki 5,6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez 15 minut w temperaturze pokojowej i fotografowano.

Figura 8. Densytometryczny scan w czasie zero autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y - koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 μl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 96,2%.

Figura 9. Densytometryczny scan 48 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez 15 minut w temperaturze pokojowe i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 95,5%.

Figura 10. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE wyznakowanych izotopem ⁹⁰Y koniugatów- 2B8-MX-DTPA inkubowanych w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 50 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej. W odpowiednim czasie, próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelach Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 gl (ścieżki 1, 2), 10 gl (ścieżki 3, 4), i 20 gl (ścieżki 5, 6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez 15 minut w temperaturze pokojowej i fotografowano. (Ważne: 48 godzinne autoradiogramy otrzymano korzystając ze wzmacniających ekranów prowadzących do bardziej intensywnego sygnału porównywanego z sygnałem autoradiogramu w czasie zero).

Figura 11. Densytometryczny scan autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 50 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na żelu 4-20% Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#3) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 95,9%.

Figura 12. Densytometryczny scan 48 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 50 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 97,0% (połączone obszary pików # 2, 3 i 4).

Figura 13. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE wyznakowanych izotopem ⁹⁰Y koniugatów- 2B8-MX-DTPA inkubowanych w 37°C w surowicy ludzkiej. W odpowiednim czasie, próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 gl (ścieżki 1, 2), 10 gl (ścieżki 3, 4) i 20 gl (ścieżki 5, 6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i fotografowano.

Figura 14. Densytometryczny scan w czasie zero autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 97,9%.

Figura 15. Densytometryczny scan 98 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y - koniugatu - 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żele wystawiano na promienio16

PL 205 780 B1 wanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 94,7%.

Figura 16. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE wyznakowanych izotopem ¹¹¹ln koniugatów- 2B8-MX-DTPA inkubowanych w 37°C w surowicy ludzkiej. W odpowiednim czasie, próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelach Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 μΐ ( ścieżki 1,2), 10 μΐ (ścieżki 3, 4) i 20 μΐ ( ścieżki 5, 6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 16-20 godzin w temperaturze pokojowej i fotografowano.

Figura 17. Densytometryczny scan w czasie zero autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ¹¹¹In koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 μl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 16-20 godzin w temperaturze pokojowej w jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#3) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 95,3%.

Figura 18. Densytometryczny scan 96 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ¹¹¹In koniugatu- 2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 gl, 10 gl, i 20 gl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 16-20 godzin w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#3) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 94,0%.

Figura 19. Makaki małpy immunizowano dożylnie co 48 godzin, w sumie wykonano 7 iniekcji; podawane ilości dawek są pokazane. Poziomy krążących komórek T i B określano przez analizę FACS z użyciem przeciwciał anty-CD2 (komórki T), anty-Mo-IgG (2B8), anty-CD20 (Leu 16) i anty- ludzkieIgG (komórki B). Nie zaobserwowano żadnego wpływu na poziom krążących komórek T. (V grupa zwierząt otrzymała pojedynczą dawkę).

Figura 20. Odzyskiwanie poziomu krążących komórek B u zwierząt otrzymujących 2B8 badano poprzez analizę FACS z użyciem znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał opisanych krótko na figurze. 19. Zwierząt z grupy III i IV nie kontrolowano jako, że poddane zostały eutanazji w dniu 13.

Figura 21. Makaki immunizowano dożylnie wyznakowanym izotopem ⁹⁰Y koniugatem-2B8-MX-DTPA który przygotowano z 2B8-MX-DTPA o klinicznym stopniu czystości. Zwierzęta immunizowano co 48 godzin w ilościach dawek pokazanych powyżej, w sumie wykonano 7 iniekcji. W 0, 2, 7, 10 i 14 dniu małpy skrwawiono oraz określano poziom krążących komórek B, dodatkowo wykonano analizę osocza (w 10 dniu nie badano surowicy na zawartość komórek B). W trakcie trwania badań nie zaobserwowano odchyleń innych niż obniżenie całkowitej zawartości limfocytów u wszystkich zwierząt za wyjątkiem pojedynczych przypadków z II grupy.

Figura 22. Zanikanie mysich przeciwciał 2B8 anty-CD20 otrzymanych z makaków określano w teście ELISA wykonując pojedynczą iniekcję 10 mg/kg w dniu zero. Jak pokazano na panelu A, przeciwciało wykazywało wartość β ½ około 4, 5 dnia. Zanikanie przeciwciała 2B8 i koniugatu MX-DTPA z systemu krążenia myszy BALB/c jest pokazane na panelu B. Myszy immunizowano dożylnie natywnym lub skoniugowanym przeciwciałem 2B8 w ilości 25 gg po czym próbki krwi pobierano w różnym czasie do 264 godzin po immunizacji; następnie surowicę analizowano w immunoenzymatycznym teście z wykorzystaniem komórek SB jako czynnika wychwytującego. Zarówno natywne jak i skoniugowane przeciwciała wykazywały zanikanie ok. 8,75 dnia.

Figura 23. 20 myszy BALB/c immunizowano używając 1,1 gCi wyznakowanego radioaktywnie koniugatu (100 gl) przygotowanego w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 50 mg/ml HSA. Grupy pięciu myszy każda poddawano eutanazji w 1, 24, 48 i 72 godzinie po czym krew i różne tkanki preparowano i analizowano na radioaktywność związaną.

Figura 24. 20 myszy BALB/c immunizowano dożylnie używając ok. 1,0 gCi (w 100 gl) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu przygotowanego w 1 x PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 m MDPA. Grupy pięciu myszy każda poddawano eutanazji w 1, 24, 48 i 72 godzinie po czym krew i różne tkanki preparowano i analizowano na radioaktywność związaną.

Figura 25. Bezgrasicze myszy mające nowotwory Ramos komórek B immunizowano dożylnie używając 24 gCi wyznakowanego izotopem ¹¹¹-In koniugatu-2B8-MX-DTPA i grupy trzech myszy każdą poddawano eutanazji w 0, 24, 48 i 72 godzinie. Po czym preparowano tkanki i określano związaną radioaktywność, procent podanej dawki na gram tkanki został określony i pokazany jak wcześniej.

PL 205 780 B1

Figura 26. Test wiązania dla określenia immunoreaktywności „mix-&-shoot” wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 50-75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej (48 godzinna inkubacja). Panel A) Stałą ilość wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y przeciwciała (ok. 1 ng/ml) inkubowano ze wzrastającą ilością komórek SB. Stopień radioaktywności (cpm) wiązania do komórek był określany w stosunku do stężenia komórek. Panel B) Określano całkowitą zastosowaną radioaktywność w stosunku do radioaktywności związanej (AT/B). Liniowa eksptrapolacja pozwoliła na wyliczenie y-odcięta (1.139). Przybliżenie y-odcięta x 100 dała wartość immunoreaktywności 87,9% przy swobodnym dostępie antygenu. Brak wiązania obserwowano w stosunku do negatywnych- CD-20 komórek (HSB).

Figura 27. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE wyznakowanych izotopem ⁹⁰Y koniugatów-2B8-MX-DTPA inkubowanych w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. W odpowiednim czasie, próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelach Tris-glicyna w warunkach nieredukujących i denaturujących (SDS). Próby nanoszono po 5 μΐ (ścieżki 1,2), 10 μl (ścieżki 5, 6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i fotografowano.

Figura 28. Densytometryczny scan w czasie zero autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y - koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 pl, 10 μl i 20 μl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 96,1%.

Figura 29. Densytometryczny scan 48 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w 4°C w PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 pl, 10 pl i 20 pl w dwóch powtórzeniach. Żel wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 94,1%.

Figura 30. Autoradiogramy otrzymane po analizie SDS-PAGE „mix-&-shoot” wyznakowanych izotopem ⁹⁰Y - koniugatów-2B8-MX-DTPA inkubowanych w 37°C w surowicy ludzkiej. W odpowiednim czasie, próby rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próby nanoszono po 5 pl L (ścieżki 1, 2), 10 pl (ścieżki 3, 4), i 20 pl (ścieżki 5, 6). Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i fotografowano.

Figura 31. Densytometryczny scan w czasie zero autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE „mix-&-shoot” wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 pl, 10 pl i 20 pl w dwóch powtórzeniach. Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 89,1%.

Figura 32. Densytometryczny scan 72 godzinnego autoradiogramu otrzymanego po analizie SDS-PAGE „mix-&-shoot” wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y - koniugatu-2B8-MX-DTPA inkubowanego w 37°C w surowicy ludzkiej. Próbę rozdzielano elektroforetycznie na 4-20% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących. Próbę nanoszono po 5 pl, 10 pl i 20 pl w dwóch powtórzeniach. Żele wystawiano na promieniowanie Roentgena przez ok. 15 minut w temperaturze pokojowej i jedną ze ścieżek skanowano przy użyciu densytometru. Relatywny obszar piku (#2) wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wynosi 88,8%.

Figura 33. 20 myszy BALB/c mice immunizowano dożylnie używając 5 pCi wyznakowanego izotopem ⁹⁰Y koniugatu- 2B8-MX-DTPA przygotowanego w 1 x PBS o pH 7,4 z dodatkiem 75 mg/ml surowiczej albuminy ludzkiej i 1 mM DTPA. Grupy pięciu myszy każda poddawano eutanazji w 1, 24, 48 i 72 godzinie po czym ich krew i różne tkanki preparowano i analizowano związaną radioaktywność.

Figura 34. Wzrastające ilości otrzymanego z CHO znakowanego przeciwciała 2B8 inkubowano w stałym stężeniu ze świeżo wyizolowanymi komórkami B CD20-positive (SB) lub komórkami T CD20-negative (HSB). Przeciwciała wiążące się do komórek badano przeprowadzając analizę FACS z użyciem kozich przeciwciał anty- mysie IgG-FTTC F(ab)'2 jak opisano powyżej.

PL 205 780 B1

Porównanie wykonano używając różnych izotypów przeciwciała (S004). Jak pokazano, tylko przeciwciała otrzymane z CHO wykazywały zdolność wiązania komórek SB CD20-pozytywnych.

Figura 35. Immunoreaktywność 2B8 otrzymanych z CHO w stosunku do przeciwciał 2B8-49 produkowanych w linii komórkowej hybrydoma porównywano bezpośrednio w teście ORIGEN. Wzrastające ilości przeciwciał inkubowano ze stałym stężeniem komórek B (SB) CD20-positive i śladową ilością wyznakowanych ruthenium CHO 2B8. Po 3 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, wiązanie wyrażano jako relatywną elektrochemiluminescencję (ECL), określaną przy użyciu aparatury ORIGEN jak opisano w Materiałach i Metodach. Prezentowane wartości stanowią średnią z dwóch powtórzeń. Wyliczona średnia dla CHO 2B8 i 2B8-49 wynosi odpowiednio 1,3 x 10^-10 M i 2,5 x 10^-10 M. Dla porównania stosowano różny izotyp przeciwciała (S004).

Figura 36. Wiązanie koniugatu 2B8-MX-DTPA przygotowanego z 2B8 otrzymanych z CHO w odniesieniu do nieskoniugowanych przeciwciał porównywano bezpośrednio w teście ORIGEN. Koniugaty przygotowywano przez inkubację 2B8 z MX-DTPA przez 8, 17 i 24 godzinny przed usunięciem nieprzereagowanego chelatu. W celu oszacowania wiązania, przeciwciała inkubowano ze stałym stężeniem komórek B (SB) CD20-popozytywne i śladową ilością wyznakowanych ruthenium CHO 2B8. Po 3 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, wiązanie wyrażono jako względną elektrochemiluminescencję (ECL), określoną przy użyciu aparatury ORIGEN jak opisano w Materiałach i Metodach. Prezentowane wartości stanowią średnią z dwóch powtórzeń. Przygotowane koniugaty wykazywały podobne wiązanie jak nieskoniugowane przeciwciała 2B8.

Figura 37. A) Komórki SB płukano i doprowadzano do gęstości 90 x 10⁶ kom/ml w buforze (1X PBS, pH 7,4 z dodatkiem 1% (w/v) surowiczej albuminy bydlęcej. Wzrastające stężenia komórek inkubowano przez 3 godziny z 7,5 ng/ml In2B8 przygotowano z wykorzystaniem 2B8-MX-DTPA seria 0165A. B) podwójny odwrócony wykres stężenia komórek vs. związana/całkowita radioaktywność (B/AT). Immunoreaktywność określano jako 1/y-odcięta x 100. Immunoreaktywność i stała korelacji (R) wynosiły odpowiednio 80,6% i 0,981%.

Figura 38. A) Komórki SB płukano i doprowadzano do gęstości 90 x 10⁶ kom/ml w buforze (1X PBS, pH 7,4 z dodatkiem 1% (w/v) surowiczej albuminy bydlęcej. Wzrastające stężenia komórek inkubowano przez 3 godziny z 2 ng/ml Y2B8 przygotowanych przy użyciu 2B8-MX-DTPA seria ff 0165A. B) podwójny odwrócony wykres stężenia komórek vs. związana/całkowita radioaktywność (B/AT). Immunoreaktywność określano jako 1/y-odcięta x 100. Immunoreaktywność i stała korelacji (R) wynosiły odpowiednio 72,2% i 0,999%.

5. Szczegółowy opis badań

Definicje

Jeśli nie definiowano w inny sposób, wszystkie używane techniki i terminy naukowe mają to samo znaczenie powszechnie rozumiane przez fachowców. Metody i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych powyżej mogą być używane w praktyce lub testowaniu niniejszego wynalazku, wykorzystywane metody i materiały zostały opisane. Dla celu niniejszego wynalazku poniżej zdefiniowano następujące terminy.

Niska zawartość metali - dotyczy reagentów wykorzystywanych do redukcji zanieczyszczenia metalami do poziomu który nie oddziaływuje na włączanie radioaktywności.

Antygenowo pozytywny - oznacza ekspresję antygenu który jest rozpoznawany i wiązany przez swoiste przeciwciała.

% włączania radioaktywności - dotyczy ilości radioaktywnego znacznika z reakcji znakowania który jest skoniugowany z przeciwciałem w stosunku do całkowitej ilości początkowo dodanej do reakcji radioaktywności, % wiązania - dotyczy ilości przeciwciała z próby które wiąże się swoiście lub nieswoiście z docelowym antygenem, % immunoreaktywności lub swoistego wiązania - dotyczy ilości przeciwciała z próby, które swoiście wiąże docelowy antygen.

Przeciwciało diagnostyczne - dotyczy przeciwciała wyznakowanego radioaktywnie izotopem tj. ¹¹¹I, które może mieć wartość diagnostyczną w odniesieniu zarówno do komórek nowotworowych jak i antygenowo pozytywnych.

Przeciwciało terapeutyczne - dotyczy przeciwciała skoniugowanego z radioaktywnymi znacznikami alpha lub beta (tj. ⁹⁰Y) które mogą wpływać na zabijanie komórki kiedy zwiążą one docelowy antygen.

PL 205 780 B1

Opis wynalazku

Przedkliniczne badania mysich, monoklonalnych przeciwciał 2B8 anty-CD20, skoniugowanych 2B8, wyznakowanych izotopami ¹¹¹ln i ⁹⁰Y 2B8

I. Materiały i Metody wykorzystywane w badaniach mysich monoklonalnych przeciwciał 2B8 anty-CD20, koniugatu 2B8-MX-DTPA, wyznakowanych izotopem ¹¹¹In 2B8-MX-DTPA i oczyszczonego na HPLC ⁹⁰Y -MX-DTPA.

A. Materiały

1. Komórki

Ludzkie linie komórkowe SB i HSB otrzymano z American Type Culture Collection i hodowano w RPMI-1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej. Linia komórkowa SB CD-20+ jest linią komórek limfoblastycznych B otrzymaną z krwi obwodowej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną (1). Negatywna antygenowo linia komórkowa HSB jest linią komórek limfoblastycznych T wyprowadzoną z nowotworów indukowanych u nowonarodzonych chomików syryjskich (2). Mysią linię komórkową szpiczaka SP2/0 podobnie utrzymywano w RPMI-1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej.

2. Przeciwciała

Przeciwciała anty-CD20 B1 i Leu 16 otrzymano odpowiednio z Coulter Immunology i Becton/Dickinson. Wyznakowane izotopem ¹²⁵In kozie przeciwciała skierowane przeciwko mysim IgG i kozie przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim IgG otrzymano z ICN. Kozie F(ab')2 antymysie IgG otrzymano z Cappel.

3. Odczynniki

Kompletne i niekompletne adjuwanty Freunda otrzymano z Sigma Chemical Company. Glikol polietylenowy, stężony HAT i stężony HT otrzymano z Boehringer Mannheim. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) otrzymano z Sigma Chemical Company, chlorek Indu-[111] oraz chlorek ⁹⁰Y otrzymano z Amersham lub NEN Dupont. Chlorek itru-[89] otrzymano z Aldrich Chemical Company. Pozostałe odczynniki otrzymano ze standartowych źródeł.

Odczynniki stosowane w protokołach do koniugacji i radioaktywnego znakowania obrabiano celem usunięcia jonów metali ciężkich, które mogłyby współzawodniczyć z izotopem podczas etapu znakowania. Odczynniki obrabiano typowo poprzez przepuszczenie roztworów przez kolumnę Chelex 100 z podłożem jonowymiennym (BioRad Industries) lub obrabianie całej serii przez dodanie Chelex 100 do przygotowywanych roztworów. Wodę nie zanieczyszczoną metalami, otrzymaną z Milli-Q lub wodę do irygacji (WFIr) używano w trakcie wszystkich przygotowań. Wolne od metali roztwory sterylizowano i zbierano do sterylnych plastikowych pojemników.

B. Metody

1. Produkcja i badanie przez RIA supernatantów hybrydomy 2B8.

myszy BALB/c immunizowano 20 milionami komórek SB zawieszonych w PBS z dodatkiem kompletnego adjuwantu Freunda. Komórki podawano zwierzętom zastrzykiem, zarówno s.c i i.p w wielu miejscach. Po 2 tygodniach od ostatniego cyklu myszy immunizowano po raz drugi komórkami SB w niekompletnym adjuwancie Freunda.

Następnie, immunizację prowadzono w schemacie tygodniowym komórkami SB zawieszonymi w PBS. Myszy immunizowano przez okres od 6 tygodni do 4 miesięcy.

Dwoje zwierząt w odpowiednim czasie poddawano eutanazji przez przerwanie rdzenia kręgowego i usuwano ich śledziony celem fuzji z mysimi komórkami szpiczaka SP2/0. Zwierzęta wybierano bazując na zdolności surowicy otrzymanej po immunizacji do efektywnego hamowania wiązania się wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał B1 anty-CD20 do ludzkich komórek SB. Trzy dni przed każdą fuzją wybrane zwierzęta dostawały jedną dożylną iniekcję (żyła ogonowa) 20 milionów komórek SB w PBS. Po eutanazji w aseptycznych warunkach usuwano śledziony a splenocyty łączono z komórkami SP2/0 w stosunku 5:1 (splenocyty:SP2/0). Połączone komórki płukano w płynie do hodowli tkankowych i nanoszono na 96 dołkową płytkę zawierającą wybiórcze podłoże HAT. Po 10-14 dniach hybrydomy badano przez hamowanie radioimmunologicznego testu używając przeciwciał B1.

Badanie produkowanych przez hybrydy przeciwciał anty-CD20 wykonano przy użyciu ustalonych metod radioimmunologicznych. Krótko, przeciwciała B1 anty-CD20 otrzymano przez chromatografię powinowactwa białka A. 15 mikrogramów oczyszczonych przeciwciał łączono z ¹²⁵I przez krótką oksydację w obecności Iodobeads (Pierce Chemical Co.), zgodnie z protokołem producenta. Wyznakowane radioaktywnie przeciwciała na złożu przechowywano w buforze (PBS o pH 7,4, z dodatkiem 0,2% żelatyny, 0,02% azydku sodu i 1,0% BSA). 10 nanogramów wyznakowanych radioaktywnie

PL 205 780 B1 przeciwciał nanoszono do każdego dołka uprzednio blokowanych filtrów (bufor blokujący: rozcieńczony bufor z dodatkiem 10% FBS) z 50 μΐ supernatantu hybrydomy z testowanych studzienek i 100,000 komórek SB zawieszano w 50 μl buforu. Zawiesiny inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki płukano dokładnie w buforze płuczącym (PBS o pH 7,4 z dodatkiem 0,2% żelatyny i 0,02% azydku sodu) na V&P Scientific a filtry zawierające związane komórki SB przenoszono do licznika promieniowania gamma. Dołki zawierające tylko podłoże HAT i wyznakowane przeciwciała B1 były używane jako kontrola tła a identyczne dołki zawierające komórki SB były stosowane jako kontrola pozytywna. Zahamowanie kontroli zawierających wyznakowane radioaktywne B1 oraz różne ilości niewyznakowanego przeciwciała B1 wahające się od 2 μg to 2 ng.

2. Cytometria przepływowa

a. Linie komórkowe

Wstępne badania cytometryczne wykonywano na supernantach z kultur hybrydomy 2B8. Tysiąc mikrolitów supernatantu hybrydomy inkubowano z komórkami SB przez jedną godzinę w temperaturze otoczenia; następnie dodawano przeciwciała drugorzędowe (kozie F(ab') anty-mysie IgG; Cappel), użyte w rozcieńczeniu 1/400 i kontynuowano inkubację przez 1 godzinę w ciemności. Komórki płukano 5 krotnie. Kontrole zawierały wyłącznie komórki (bez pierwotnych lub wtórnych przeciwciał) o ustalonej autofluorescencji, komórki z wtórnymi przeciwciałami wyłącznie do oznaczenia niespecyficznego wiązania i powszechnie dostępny koniugat izotiocyjanianu fluoresceiny B1 (B1-FITC) dla populacji kontrolnej CD20.

W niektórych eksperymentach koniugowano wiązano fluoresceinę do oczyszczonego przeciwciała 2B8 poprzez reakcję z grupami aminowymi izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Krótko, przeciwciała 2B8 (1,2 mg/ml) inkubowano w 0,1 M buforze węglanu sodu o pH 9,5 z 150-200 μg FITC na mg białka. Roztwór inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a powstający koniugat 2B8-FITC oczyszczano na kolumnach Sephadex G-25. Inne odczynniki użyte w tych badaniach, takie jak B1 i Leu 16, łącznie z fluoresceiną nabyto bezpośrednio w Coulter lub Becton Dickinson.

Analizowane komórki zebrano i trzykrotnie płukano w PBS zawierającym 0,2% BSA i 0,1% azydek sodu. Żywotność określono przy użyciu błękitu trypanu, z uwzględnieniem wymaganej żywotności >90%. Stężenie komórek doprowadzono do 3 milionów na ml oraz dodawano po 50 μl do studzienek 96 dołkowej płytki. Do odpowiednich dołków dodawano przeciwciała pierwszorzędowe (50 μθ a mieszaninę inkubowano przez 30 min do 1 h w temperaturze pokojowej; następnie komórki płukano 5 razy w 200 μl/dołek PBS zawierającym 0,2% BSA i 0,02% azydku sodu. Komórki wirowano w wirówce Sorvall na płytkach przy 1300 RPM przez 1 min a następnie usuwano supernatant przez delikatne „trzepanie” płytek. Przeciwciała drugorzędowe dodawano i inkubowano przez dodatkowe 30 minut do 1 h w ciemności i w temperaturze pokojowej; następnie dołki płukano, tak jak opisano powyżej. Na końcu, do każdej próbki dodano 200 μl buforu utrwalającego (0,15 M chlorek sodu zawierający 1% paraformaldehydu, pH 7,4) i potraktowane komórki przenoszono do 12 x 75 mm probówek do analizy.

b. Całkowita krew z małp

Po usunięciu plazmy, komórki płukano dwukrotnie przez wirowanie i rozpuszczano w HBSS. Do rozpuszczonych komórek dodano cielęcej surowicy płodowej (2 ml). Następnie po tysiąc mikrolitrów rozpuszczonych komórek rozdzielano do każdej z 6, 15 ml stożkowych probówek wirówkowych.

Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie dodawano następująco:

Probówka #1: Mysie anty-CD2-FITC (AMAC), 2,5 μg/ml, 5μg;

Probówka #2: Kozie anty-Ludzkie IGM-FITC (Fisher) 2,5 μg/ml, 5 μg;

Probówka #3: Kozie anty-mysie IgG-RPE (Fisher) 2,5 μg/ml, 5 μg;

Probówka #4: Kozie anty-Ludzkie IgM-FITC + Kozie anty-mysie IgG-RPE (zaabsorbowany), 2,5 μg/ml, 5 μg;

Probówka #5: anty-Ludzkie CD20-FITC (anty-leu 16, Becton Dickinson), 5 μg;

Probówka #6: same komórki (autofluorescencja).

Wyznakowane przeciwciała i komórki wirowano przez 2 min przy 1500 rpm celem zmieszania komórek i przeciwciał, po czym wszystkie 6 próbek umieszczano na lodzie i inkubowano przez 30 min. Następnie probówki wyjmowano z lodu i dodawano do nich bufor lizujący (podgrzany do 37°C) do objętości 12 ml. Dalej próbki inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej i wirowano w 4°C przy 1500 rpm, po czym usuwano z nich supernatant. Następnie dwukrotnie płukano osad komórkowy, w buforze do znakowania (PBS zawierający 1% BSA i 0,05% azydku sodu).

W dalszej kolejności, komórki utrwalono przez dodanie do probówki 0,5 ml buforu utrwalającego (0,15 M chlorek sodu, pH 7,4, zawierający 1% paraformaldehyd) i analizowano w Becton Dickinson

PL 205 780 B1

FACScan, przy użyciu autokompensacji i prekalibracji za pomocą Calibrite beads. Zieloną fluorescencję pochodzącą od fluoresceiny mierzono na FL1, a czerwoną fluorescencję pochodzącą od fikoerytryny mierzono na FL2. Dane liczbowe wyrażono w formie logarytmów. Żywa populacja limfocytów identyfikowana była wstępnie na podstawie ugięcia świata w osi wiązki światła lasera (FSC) vs rozproszenie światła prostopadłe do wiązki światła (SSC) w postaci mapy bitowej. Całkowita populacja limfocytów była identyfikowana poprzez wybramkowanie wszystkich pozostałych cząstek. Następnie fluorescencję wykazywały tylko specyficzne cząstki, które znajdowały się wewnątrz obramkowanego pola.

Dla badań farmakologicznych i toksykologicznych wysokich dawek, wstępne badania poziomu limfocytów wyznaczono dla każdej małpy i wykorzystano to jako wartość wzorcową. Obliczono procent komórek T i B, oraz stosunek T:B i wykorzystywano jako stopień deplecji. Wstępnie badaną populację komórek B policzono z Leu16 i przeciwciałami anty-ludzkimi IgM.

Po iniekcji małpom 2B8, gdy antygen CD20 był nasycony 2B8, procent komórek B w całej populacji określono w przybliżeniu przy użyciu koziego anty-ludzkiego IgM-FITC, anty-mysiego IgG-RPE a podwójnie wyznakowana populacja, zawierała oba markery. Podwójne znakowanie populacji użyto do uzyskania wartości, przy której całość 2B8 z krwi obwodowej zwierząt było oczyszczone. Procent komórek T w całej populacji limfocytów oszacowano przy użyciu anty-CD2-FITC. Dane były uśredniane z trzech pomiarów 10000 cząstek wykonywanych na każdej próbce.

W każ dej próbce krwi oznaczono komórki, a nastę pnie wyliczono subpopulacje komórek T i B w cał ej populacji limfocytów. Okreś lono również stosunek komórek T:B. Zanik komórek B był oznaczony jako procent redukcji komórek B w stosunku do pierwotnego poziomu komórek B dla każdej małpy osobno.

3. Znakowanie radioaktywnym jodem i immunoprecypitacja CD20

Sto milionów komórek SB podzielono na dwie równe części po powierzchniowym wyznakowaniu jodem ¹²⁵I oraz Iodobeads (Pierce Chemicals Co.). Komórki płukano wielokrotnie przez wirowanie, aż do doprowadzenia poziomu radioaktywności w supernatancie równego z tłem. Sto mikrogramów 2B8 lub przeciwciał B1 (Coulter Immunology) dodano do każdej z dwóch próbek z określonymi komórkami B. Przeciwciała i komórki SB inkubowano przez noc a następnie płukano trzy razy przez wirowanie, aż usunięto wszystkie niezwiązane przeciwciała. Osad komórkowy zawierający zarówno 2B8, jak i B1 lizowano i rozpuszczano przez dodanie detergentu 1% NP-40 w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, po czym inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie, roztwór, wirowano w wirówce przy wysokich obrotach przez 30 min, a uzyskany supernatant przeniesiono do nowych probówek. Do każdej probówki dodawano Sefarozę - białko A (300 μΐ) a złoże odzyskiwano poprzez wirowanie. Sefaroza białko A była następnie płukana 20 razy, aż do usunięcia niespecyficznie przyłączonych białek wyznakowanych jodem. Kiedy stopień radioaktywności kulek wobec supernatantu osiągną L wartość 100, osad rozpuszczano w próbce buforu SDS PAGE i ogrzewano do wrzenia. Po ochłodzeniu, w przybliżeniu 15,000 cpm każdego z roztworów nakładano na studzienki 10% żelu poliakrylamidowego. Wyznakowane standardy niskiej masy molekularnej (BioRad Inc.) dodano do rozdzielenia i wykorzystano do oceny masy molekularnej. Białka rozdzielano elektroforetycznie, żel osuszono i poddano i eksponowano wobec kliszy rentgenowskiej przez 24 godziny w -70°C; następnie klisza była wywoływana i analizowana.

4. Analiza Scatchard'a wiązania 2B8

Oczyszczony 2B8 oceniano pod względem widocznego powinowactwa za pomocą analizy Scatchard'a. Znakowany substancją radioaktywną 2B8 był przygotowany poprzez reakcję z ¹²⁵I w obecności Iodobeads. Następnie, po usunięciu wolnego jodu, przeciwciała, znakowane substancją radioaktywną inkubowano w różnych stężeniach, w dwóch powtórzeniach, od 5000 ng na studzienkę do 35 ng/studzienkę, wraz z 10,000 komórkami SB. Ilość przeciwciał wiążących się z komórkami określano ze specyficznej aktywności komórek 2B8 wyznakowanych ¹²⁵I. Stosunek związanego/wolnego przeciwciała był porównywany wobec molarnego stężenia związanego przeciwciała, zaś stała powinowactwa była określona ze stosunku osi X i Y.

5. Przygotowanie 2B8-MX-DTPA

a. Źródło MX-DTPA

Przed niektórymi badaniami przedklinicznymi, znakowany węglanem 14 kwas 1-izotiocyjaniatobenzylo-3-metylodwuetyloaminopentooctowy (MX-DTPA) był dostarczony jako suchy proszek przez Dr Otto Gansow z Narodowego Instytutu Zdrowia i przechowywany w postaci odwodnionej w 4°C, w warunkach chroniących przed światłem. Wyjściowe roztwory chelatu przygotowano z wody Milli-Q, zaś stężenie określano przez pomiar radioaktywności przy użyciu specyficznej aktywności związku.

PL 205 780 B1

Wyjściowe roztwory miały generalnie 2-5 mM i były przechowywane w -70°C w probówkach polipropylenowych. Dla innych badań MX-DTPA otrzymano z Coulter Immunology w postaci soli dwusodowej w wodzie oraz przechowywano w -70°C.

a) Utrzymanie stanu wolnego od metali

Używając odczynników wolnych od metali, wszystkie manipulacje z odczynnikami były wykonane w celu zminimalizowania możliwości zanieczyszczenia metalami. W miarę możliwości używano polipropylenowe, plastikowe pojemniki, takie jak: kolby, zlewki oraz cylindry z podziałką. Przed użyciem myto je w Alconox i intensywnie płukano w wodzie Milli-Q. Dodatkowo, aby dokładnie odmierzyć małe objętości używano wolnych od metali końcówek. Dla odmierzenia większych objętości odczynników używano sterylnych, plastikowych serologicznych pipet (dostępny rozmiar od 1 do 25 ml). Reakcje zazwyczaj przeprowadzano w polipropylanowych probówkach z zakręcanym korkiem (Sardstedt Industries; pojemność 1,5 ml) lub polipropylanowych probówkach konikalnych (Costar; 15 ml i 50 μΐ). Podczas dializy używano jednorazowych rękawiczek chirurgicznych, przepłukanych wcześniej w wodzie Milli-Q.

c. Przygotowanie przeciwciał

Mysie przeciwciała 2B8 anty-CD20 oczyszczano z nasączy chromatografią QAE oraz białka A. Dla późniejszych eksperymentów oczyszczano 2B8 z supernatantów z bioreaktorów stosując taki sam proces oczyszczania. Przeciwciała z bioreaktorów przeznaczano do komercjalizacji w zastępstwie przeciwciał otrzymanych z CHO, jak opisano w przykładzie 2.

Przeciwciała przygotowano do koniugacji poprzez przeniesienie ich do wolnego od metalu 50 mM bicyna-NaOH, pH 8,6, zawierającego 150 mM NaCl, przy użyciu dializy lub poprzez ciągłą wymianę buforu. W niektórych badaniach, wymiana buforu była wykonywana przy użyciu kolejnych ultrafiltracji na Centricon 30 (Amicon), z filtrami (30,000 DMWCO). Generalnie, na jednostkę filtru, dodano 50-200 μl białka (10 mg/ml) oraz 2 ml buforu bucynowego. Filtry wirowano w 4°C, z wykorzystaniem rotoru Sorval SS-34, przy 6,000 rpm przez 45 min. Objętość nadsączu była zbliżona do 50-100 pl. Proces ten powtórzono dwa razy, z tym samym filtrem. Objętość przeniesiono do 1,5 ml polipropylenowych probówek z zakręcanym korkiem, zmierzono zawartość białka, rozcieńczono do 10,0 mg/ml i przechowywano w 4°C przed użyciem do koniugacji. W niektórych badaniach białko było przenoszone do 50 mM cytrynianu sodu, pH 5,5 zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% azydku sodu przy użyciu schematu opisanego powyżej.

d. Protokół koniugacji

Koniugacja 2B8 z MX-DTPA została wykonywana w probówkach polipropylenowych w temperaturze pokojowej. Zamrożone roztwory wyjściowe MX-DTPA rozmrażano tuż przed użyciem. Zazwyczaj poddawano reakcji 50-200 pl przeciwciał 10 mg/ml z chelatem przy w stosunku molarnym chelatu do białka równym 4:1. Reakcję rozpoczynano przez dodanie wyjściowego roztworu chelatu i delikatne mieszanie; koniugację prowadzono całą noc, zwykle przez 14 do 20 h w temperaturze otoczenia. Nie przereagowany chelat usuwano z koniugatu przez dializę lub przy użyciu kolejnych ultrafiltracji, tak jak opisano powyżej, i przenoszono do wolnego od metalu fizjologicznego roztworu soli (0,9,% w/v) zawierającego 0,05% azydku sodu. Białko o ustalonym stężeniu 10 mg/ml, przechowywano przed znakowaniem w 4°C w probówkach polipropylenowych.

e. Określanie włączania chelatu

Włączanie chelatu określano poprzez pomiar scyntylacji oraz porównanie wartości otrzymanych dla oczyszczonego koniugatu do specyficznej aktywności wyznaczonej względem chelatu znakowanego węglem-[14]. Dla późniejszych badań, w których użyto nieradioaktywnego chelatu otrzymanego z Coulter Immunology przyłączanie chelatu mierzono przez inkubację koniugatu z nadmiarem roztworu radioaktywnego nośnika ⁹⁰Y o znanej koncentracji i specyficznej aktywności.

Krótko, roztwór wyjściowy chlorku itru o znanej koncentracji, był przygotowany w wolnym od metalu 0,05 N HCl do którego dodano pozbawiony nośnika ⁹⁰Y, (sól chlorkowa). Porcja tego roztworu poddana została analizie w liczniku scyntylacyjnym celem określenia dokładnej specyficznej aktywności tego odczynnika. Do probówki polipropylenowej dodawano ilość chlorku itru równą trzykrotnej liczbie molowej chelatu mającej się przyłączyć do przeciwciała, zwykle dodawano 2 mol/mol przeciwciał, a pH doprowadzano do 4,0 - 4,5 używając 2 M octanu sodowego. Następnie dodano przeciwciała i mieszaninę inkubowano przez 15 - 20 minut w temperaturze pokojowej. Prowadzoną reakcję zatrzymano przez dodanie 20 mM EDTA aż do końcowego stężenia równego 1 mM, a pH roztworu ustawiano na pH 6 za pomocą 2 M octanu sodowego.

Po 5 minutach inkubacji cała objętość była oczyszczona poprzez wysokosprawną chromatografię wymienną jak opisano poniżej. Frakcje zawierające wymyte białka łączono, określano ich stężenie

PL 205 780 B1 i oznaczano radioaktywność dla próbki. Przyłączanie chelatu obliczano używając specyficznej aktywności preparatu chlorku ⁹⁰Y oraz stężenia białka.

f. Immunoreaktywność 2B8-MX-DTPA

Immunoreaktywność koniugatu 2B8 mierzono używając testu ELISA. Komórki SB w średniej fazie logarytmicznej pobierano z hodowli poprzez wirowanie i dwukrotne płukanie w 1 x HBSS. Komórki rozcieńczono do objętości 1-2 x 10⁶ kom/ml w HBSS i porcjami rozprowadzono do 96-dołkowych polistyrenowych płytek, po 50,000 - 100,00 kom/dołek. Płytki suszono w próżni przez 2 godz., w 40 - 45°C, aż do przytwierdzenia się komórek do podłoża. Płytki do czasu użycia przechowywano w -20°C. Tuż przed użyciem do analizy płytki ogrzewano do temperatury pokojowej, następnie utrwalano w 1X PBS, pH 7,2-7,4, zawierającym 1% BSA (2h). Próbki, które były przeznaczone do analizy rozpuszczano w 1X PBS/1% BSA, rozprowadzano na płytce i rozcieńczano (1:2) kolejno tym samym buforem. Po godzinnej inkubacji w temperaturze otoczenia, płytki płukano trzykrotnie w 1X PBS. Przeciwciała drugorzędowe(kozie anty-mysie IgG1-specyficzny koniugat HRP) (50 gl) dodawano do dołków (rozpuszczone 1:1500 w 1X PBS/1% BSA) i inkubowano przez 1 h w temperaturze otoczenia. Płytki płukano czterokrotnie w 1X PBS, następnie poprzez dodawano roztwór substratu ABTS (50 mM cytrynian sodu, pH 4,5 zawierający 0,01% ATBS i 0,001% H2O2). Po 15-30 min płytki odczytywano przy 405 nm. Do testów monitorowania niespecyficznego wiązania używano negatywnych pod względem antygenowym komórek HSB. Immunoreaktywność koniugatu określano poprzez nakreślenie wartości absorbancji wobec odpowiedniego stopnia rozcieńczenia i porównanie do wartości uzyskanych przy użyciu naturalnych przeciwciał (reprezentujących 100% immunoreaktywności), testowanych na tej samej płytce. Porównywano wartości części liniowej kilku profili i określano wartości średnie.

g. Stabilność in vitro natywnych 2B8 i 2B8-MX-DTPA

Do 12-tygodniowych pomiarów stabilności przeciwciał i koniugatu, porcje przeciwciał 2B8 i 2B8-MX-DTPA zawieszano w naturalnym roztworze soli fizjologicznej, albo w roztworze soli fizjologicznej zawierającym 10 mM glicyna-HCl, pH 6,8. Podwójną serię próbek inkubowano, zarówno w 4°C, jak i w 30°C oraz oznaczano cotygodniowo, przy użyciu następujących metod: SDS-PAGE (zarówno redukujący, jak i nieredukujący), immunoreaktywność w teście aktywności całej komórki, przy użyciu, albo komórek SB (pozytywne antygenowo) lub HSB (negatywne antygenowo) jako wychwytywaczy, i elektroforezy pulsowej (pH 3-10). Dodatkowo, efektywność znakowania koniugatu substancją radioaktywną była oznaczona w 4, 8 i 12 tygodniu, poprzez znakowanie koniugatu radioaktywnym ⁹⁰Y oraz analizę produktu SDS-PAGE i analizę autoradiograficzną. Ostatecznie w czasie oddzielnych badań 2B8-MX-DTPA inkubowano w 4°C i 30°C przez 10 tygodni, po czym znakowano radioaktywnym ⁹⁰Y i oceniano, badając biodystrybucję w myszach BALB/c, jak opisano poniżej.

h. Badania immunohistologiczne

Badania immunohistologiczne, zarówno naturalnych, jak i skoniugowanych (2B8-MX-DTPA) przeciwciał wykonano w IMPATH Laboratories, używając skrawków ludzkich tkanek utrwalonych w acetonie. Przeciwciało było oczyszczane supernatantów z bioreaktora hollow-fiber poprzez chromatografię na białku A i Sepharose Q. Koniugat o klinicznym stopniu czystości był przygotowany przy użyciu MX-DTPA pochodzącego z Coulter Immunology, według schematu opisanego powyżej.

i. Immunoreaktywność i znakowanie substancją radioaktywną in vitro 2B-MX-DTPA

W niektórych eksperymentach, do analizy niezwiązanych 2B-MX-DTPA używano testu ELISA. W późniejszych eksperymentach, immunoreaktywność koniugatów znakowanych przez ¹¹¹ln i ⁹⁰Y (każdy przygotowany w IDEC Pharmaceuticals lub alternatywnie w MPI Pharmacy Services, Inc.) określano, używając zmodyfikowanej wersji testu wiązania całej komórki opisanego przez Lindmo (3). Krótko, zwiększające się stężenia średniej fazy logarytmicznej pozytywnych antygenowo komórek SB lub antygenowo-negatywnych komórek HSB [20-30 x 10⁶ kom/ml w buforze rozcieńczającym (PBS, pH 7,4 zawierający 1% BSA, 0,1% żelatyny i 0,02% azydku sodu) dodawano do probówek w duplikacie. Koniugat znakowany radioaktywnie rozpuszczano w buforze rozcieńczającym do końcowego stężenia przeciwciał 1-5 ng/ml i do każdej probówki dodano po 0,35 ml. Następnie, po okresie 75-90 minutowej inkubacji komórki osadzono przez wirowanie a supernatant zbierano. Radioaktywność pozostałej w supernatancie frakcji zliczano w liczniku gamma lub w liczniku scyntylacyjnym. Dane były określone jako stosunek całkowitej radioaktywności podzielonej przez radioaktywność związana z komórkami przez odwrotność liczby komórek na każdą próbę. Oś y stanowi frakcję immunoreaktywną.

j. Stabilność in vitro znakowanego radioaktywnie 2B8-MX-DTPA w ludzkiej surowicy

Stabilność in vitro znakowanych przez ¹¹¹ln i ⁹⁰Y 2B-MX-DTPA określono poprzez inkubację ludzkiej surowicy w 37°C przez 96 h. Przeciwciała po koniugacji przygotowano i znakowano radioak24

PL 205 780 B1

111 90 tywnie, używając ¹¹¹In (zasada „mix-i-shoot”) lub ⁹⁰Y, tak jak opisano powyżej. Specyficzna aktywność koniugatu znakowanego ¹¹¹In i ⁹⁰Y wynosiła 2,5 i 14,6 mCi/mg; znakowane radioaktywnie koniugaty zawieszano w buforze zawierającym 75 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) oraz 1 mM DTPA (koniugat znakowany itrem) lub w buforze zawierającym 50 mg/ml HSA (koniugat znakowany jodem). Znakowane koniugaty rozcieńczono 1:10 z użyciem normalnej surowicy ludzkiej (nie inaktywowanej ciepłem) i rozdzielano aseptycznie do sterylnych, zakręcanych probówek; probówki inkubowano w 37°C przez okres do 96 godzin. W określonym czasie pobierano próbki koniugatu i analizowano na redukującym SDS-PAGE w 4-20% żelu, następnie poprzez autoradiografię i chromatografię cienkowarstwową.

k. Stabilność in vitro klinicznie spreparowanego ¹¹¹In-2B8-MX-DTPA

Koniugat 2B8-MX-DTPA znakowano radioaktywnie przez ¹¹¹In oraz użyto bez oczyszczania na HPLC (zasada „mix-i-shoot”). Znakowane substancją radioaktywną przeciwciało rozcieńczono w PBS, a następnie dodawano albuminę surowicy ludzkiej (HSA) do uzyskania końcowego stężenia 50 mg/ml. Specyficzna aktywność oznaczonego izotopowo koniugatu wynosiła 2,2 mCi/mg N, a następnie koniugat inkubowano w 4°C przez 48 godz., a porcje analizowano w czasie 0,24 godz. i 48 godz., przy użyciu nieredukującego SDS-PAGE w 4-20% żelu, następnie przez autoradiografię oraz przez chromatografię cienkowarstwową. Immunoreaktywność podczas każdego pomiaru była szacowana przy użyciu testu zawiesiny całych komórek, według metody opisanej powyżej, w paragrafie 1.

l. Stabilność in vitro klinicznie przygotowanych ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA.

Koniugat 2B8-MX-DTPA był znakowany radioaktywnie przez ⁹⁰Y i oczyszczany chromatografią wymienną na HPLC przy użyciu 1XPBS, jako buforu elucyjnego. Oznaczone substancją radioaktywną frakcje koniugatu zostały połączone, następnie dodawano albuminę surowicy ludzkiej oraz DTPA, do końcowego stężenia 75 mg/ml i 1 mM. Specyficzna aktywność określonego, znakowanego substancją radioaktywną koniugatu wynosiła 14,6 mCi/mg. Koniugat następnie inkubowano w 4°C przez 48 godz. i analizowano w czasie 0,24 godz. i 48 godz., przy użyciu nieredukującego SDS-PAGE w 4-20% żelu, kolejno przez autoradiografię i chromatografię cienkowarstwową. Immunoreaktywność podczas każdego pomiaru była szacowana przy użyciu zawiesiny całych komórek, według metody opisanej powyżej w paragrafie 1.

2. Badania na zwierzętach

a) Badania farmakologiczne i toksykologiczne wysokich dawek u naczelnych, przy użyciu 2B8

Przeciwciała 2B8 oceniano w badaniu farmakologicznym wysokich dawek, zgodnie z przepisami GLP przygotowanymi w White Sands Research Center (Study Number 920111). Wykorzystano dorosłe osobniki małp Macaca fascicularis (makaki); każda badana grupa składała się z jednego samca i jednej samicy. Przeciwciała wstrzykiwano dożylnie co 48 godzin, do czasu całkowitej liczby siedmiu iniekcji. Badanie składało się z pięciu grup: Grupa I (fizjologiczny roztwór soli); Grupa II (0,6 mg/kg); Grupa III (2,5 mg/kg); Grupa IV (10 mg/kg) i Grupa V (10 mg/kg w dniu 0).

Przed rozpoczęciem badania, krew pobrano od wszystkich 10 zwierząt i używano do określenia tła oraz początkowej populacji komórek B. Wszystkie następne kolejne próbki krwi były pobierane przed każdym wstrzyknięciem przeciwciała. Grupy III i IV w 13 dniu poddawano eutanazji celem pełnej nekropsji i histopatologii.

Zwierzęta z Grup I, II i V były skrwawiane w dniu 0, 1, 3, 13, 21, 37 i 52; szacunkowo 5 ml całko-witej krwi było pobierane do heparynowanych probówek. Krew trzymano w 4°C i analizowano w ciągu 24 godz. Krew od każdego zwierzęcia wirowano przy 2000 rpm przez 5 minut, a następnie supernatant osocza usuwano, celem zbadania poziomu 2B8 w surowicy metodą RIA (zobacz procedura RIA dla specyficznych metod badawczych). Osadzony materiał zawierający czerwone i białe ciałka krwi roz-cieńczano w FCS, w celu analizy FACS.

b. Badania farmakokinetyczne z użyciem 2B8 i 2B8-MX-DTPA

Średni czas półtrwania w surowicy dla 2B8 u makaków był określony przy użyciu zwierząt z Grupy V. Kozie anty-mysie IgG1 (Fisher Scientific) rozcieńczano do 2,0 gg na ml w 10 mM buforu boranowego, pH 9,6, a następnie dodawano po 50 gl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Przeciwciała pozostawiono celem związania się do płytki, podczas całonocnej inkubacji w 4°C, lub przez 2 godz., w temperaturze otoczenia. Każda płytka była blokowana przez 30 minut w temperaturze otoczenia, wraz z 150 gl PBS na studzienkę, zawierającym 1% BSA. Płytki płukano wodą destylowaną, a surowicę i osocze dodawano potrójnie do pojedynczych studzienek w początkowym rozcieńczeniu 1:100, następnie w seryjnych rozcieńczeniach 1:2. Oczyszczony 2B8 dodano do surowicy przed skrwawieniem oraz rozcieńczono do użycia jako standardowe krzywe, zaczynając od 0,5 mg/ml. Próbki rozcieńczano 1:100 a następnie rozcieńczono seryjnie, tak jak inne próbki. Płytki inkubowano przez 1 godz.,

PL 205 780 B1 w temperaturze otoczenia i płukano 4 razy wodą destylowaną. Następnie dodano przeciwciało drugorzędowe (kozi anty-mysi IgG1-HRPO) w rozcieńczeniu 1:4000 i inkubowano w temperaturze otoczenia przez dodatkową godzinę. Płytki ponownie płukano w wodzie destylowanej i dodawano 0,1 ml substratu peroksydazy, zawierającego nadtlenek wodoru. Barwa rozwijała się w reakcji trwającej 20 minut; następnie określoną absorbancję przy 405 nm, używając czytnika mikropłytek ELISA. Wyniki przedstawiono w gg przeciwciała na ml surowicy.

Dodatkowo, oznaczano wartość β t_/2 2B8 i 2B8-MX-DTPA u myszy BALB/c. Nieskoniugowany 2B8 przechowywany w -70°C w 1X PBS, pH 7,4/10% glicerolu, był odmrażany, rozcieńczany do 0,5 mg/ml i sterylnie filtrowany. Skoniugowane przeciwciała przygotowano według następującego, standardowego schematu, ale z chelatem znakowanym węglem 14; przyłączony chelat wynosił 1,5 mg/ml przeciwciała. Oczyszczony koniugat rozcieńczano do 0,5 mg/ml w normalnym roztworze soli fizjologicznej (0,9%), sterylnie filtrowano i przechowywano w 4°C wraz z naturalnymi przeciwciałami, do czasu ich użycia.

Sześcio - ośmio tygodniowym myszom wstrzyknięto 100 μl oczyszczonych przeciwciał 2B8, w stężeniu 250 μg/ml. Myszy były następnie skrwawiane przez oczodoły w różnych okresach czasu wahających się od 0 do 264 godzin a ich surowice analizowane na obecność natywnego i skoniugowanego przeciwciała 2B8 w teście aktywności całej komórki, używając pozytywnych pod względem antygenu komórek B linii SB, jako wychwytywacza. Otrzymane dane przedstawiono jako stężenie 2B8 lub 2B8-MX-DTPA odwrotnie proporcjonalne do czasu; z tych wyników utworzono liniowy wykres regresji, a spadek użyto do określenia wartości β t/.

c. Badania farmakologiczno/toksykologiczne [89]-Y-2B8-MX-DTPA u makaków

2B8-MX-DTPA niosący itr -[89] był przygotowywany według protokołu opisanego do włączania ⁹⁰Y, z wyjątkiem niezastosowania oczyszczania przez HPLC. Nieradioaktywny-niosący metal koniugat był rozpuszczany w 1XPBS zawierającym 75 mg/ml HSA oraz 1 mM DTPA i oceniany w badaniu GLP numer 920611 w White Sands Research Center. Każda z czterech grup małp zawierała jednego samca i jedną samicę. Zwierzętom podawano dożylnie co 48 godzin 7 zastrzyków z następującymi ilościami leku: grupa I (sól fizjologiczna); grupa II (0,003 mg/kg); grupa III (0,03 mg/kg); oraz grupa IV (0,3 mg/kg). Zwierzęta kontrolowano w trakcie badania poprzez określanie ciężaru ciała i pomiar temperatury, poboru żywności i wody, wydalania, badano chemię surowicy, urynolizę oraz wykonywano hematologię i badanie bezpośrednie. Zwierzęta w grupach I do IV były skrwawiane przez zastrzykiem w dniu 0, 2, 7, 10 oraz 14 a krew analizowana pod względem poziomu krążących komórek B poprzez analizę FACS.

d. Biodystrybucja wyznakowanego radioaktywnie 2B8-MX-DTPA

We wstępnym badaniu wyznakowany ¹¹¹In 2B8-MX-DTPA był oceniany pod względem biodystrybucji w tkankach w sześcio-ośmio-tygodniowych myszach BALB/c. Znakowany radioaktywnie koniugat był przygotowywany przy użyciu 2B8-MX-DTPA o klinicznym stopniu czystości zgodnie z opisanym powyżej protokołem „mix i shoot”. Specyficzna aktywność koniugatu wynosiła 2,3 mCi/mg, a koniugat był rozcieńczany w PBS, pH 7,4 zawierającym 50 mg/ml HSA. Myszom wstrzykiwano dożylnie 100 μl znakowanego ¹¹¹In 2B8-MX-DTPA (około 21 μ^) a grupy trzech myszy uśmiercano porzez przerwanie rdzenia kręgowego w 0, 24, 48, i 72 godzinie. Po zabiciu, celem analizy pobierano ogon, serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, mięśnie oraz kość udową, które przemywano i ważono, pobierano również próbkę krwi. Radioaktywność związaną z każdą próbką była określana poprzez pomiar promieniowania gamma, a następnie określano procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki. Nie próbowano odejmować aktywności związanej z krwią obecną w każdym narządzie.

W oddzielnym protokole, porcje 2B8-MX-DTPA inkubowane w 4°C i 30°C przez 10 tygodni znakowano radioaktywnie ¹¹¹In do specyficznej aktywności 2,1 mCi/mg dla obu preparatów. Koniugaty te były następnie używane do badań biodystrybucji u myszy jak opisano powyżej.

Do pomiarów dozymetrycznych, 2B8-MX-DTPA był znakowany radioaktywnie ¹¹¹In do specyficznej aktywności 2,3 mCi/mg a około 1,1 μ Ci było wstrzykiwane każdej z myszy 20 BALB/c. Następnie, każda z pięciu grup myszy była poddawana eutanazji w 1, 24, 48 i 72 godzinie a ich narządy usuwane i przygotowywane do analizy; pobierano również mocz i kość udową i analizowane w 24-72 odcinkach czasowych.

Stosując podobny schemat, 2B8-MX-DTPA był również znakowany ⁹⁰Y a jego biologiczna dystrybucja oceniana w myszach BALB/c przez okres 72 godzin. Po oczyszczaniu na chromatografii HPLC z wykluczeniem wielkości, czterem grupom każda po pięć myszy wstrzykiwano dożylnie około 1 gCi klinicznie spreparowanego koniugatu (specyficzna aktywność: 12,2 mCi/mg); następnie, grupy te były pod26

PL 205 780 B1 dawane eutanazji w 1, 24, 48 i 72 godzinie a ich narządy i tkanki analizowane jak opisano powyżej. Radioaktywność związana z każdą tkanką była określana poprzez pomiar energii bremstrahlung za pomocą licznika promieniowania gamma. Wartości aktywności były następnie wyrażane jako procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki lub procent wstrzykniętej dawki na narząd. Podczas gdy narządy i inne tkanki przemywano wielokrotnie celem usunięcia zbędnej krwi, narządów nie poddawano reperfuzji. A zatem, aktywność w narządach nie była odejmowana od aktywności związanej z obecną wewnątrz krwią.

e. Lokalizacja wyznakowanego ¹¹¹In 2B8-MX-DTPA w nowotworach

Lokalizacja wyznakowanego ¹¹¹In 2B8-MX-DTPA była określana w bezgrasiczych myszach mających nowotwory Ramos komórek B. Sześcio do ośmiotygodniowe myszy bezgrasicze były poddawane zastrzykom podskórnym (lewy tylny bok) 0,1 ml RPMI-1640 zawierającym 1,2 x 10⁷ komórek nowotworowych Ramos, które zaadaptowano wcześniej do wzrostu w myszach. Nowotwory rozwijały się w ciągu dwóch tygodni i wahały się jeśli chodzi o masę od 0,07 do 1,1 gramów. Myszom podawano dożylnie 100 gl znakowanego ¹¹¹ln 2B8-MX-DTPA (16,7 gCi) zaś grupy po trzy myszy każda były poddawane eutanazji poprzez przerwanie rdzenia kręgowego w 0, 24, 48, i 72 godzinie. Po zabiciu, celem analizy pobierano ogon, serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, mięśnie oraz kość udową, które przemywano i ważono, pobierano również próbkę krwi. Radioaktywność związana z każdą próbką była określana poprzez pomiar promieniowania gamma, a następnie określano procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki.

3. Pomiary dozymetryczne

Przy użyciu danych o biodystrybucji otrzymanych z myszy BALB/c, którym wstrzykiwano wyznakowany ¹¹¹In lub ⁹⁰Y 2B8-MX-DTPA (tabele 1-4 oraz 5-8), oceniono dawkę radioaktywności wchłoniętej z dawki 1,0 mCi podawanej pacjentowi o 70 kg przy użyciu sformalizowanego podejścia Medical Internal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. Biologiczne okresy półtrwania dla wyznakowanych radioaktywnie koniugatów były określane na podstawie dawki wstrzykniętej na organ określonej na podstawie danych o biodystrybucji dla każdego radioimmunokoniugatu. Dla niektórych tkanek, np. krwi, uważa się, że biologiczny rozpad radiokoniugatu odpowiadał modelowi dwu-przedziałowemu z ekspotencjalnym rozpadem z tych przedziałów. Dla innych tkanek, np. wątroby, gdzie poziomy aktywności pozostawały te same w trakcie całego 72-godzinnego badania biodystrybucji, założono, że biologiczny okres półtrwania był bardzo długi i wynosił 1000 godzin.

T a b e l a 1

Dystrybucja aktywności w 1,0 godzinie po iniekcji I.V. ¹¹¹In-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/g	% ID per narząd
Krew	1,47 ± 0,17	40,3 ± 5,32	58,4 ± 3,1
Serce	0,087 ± 0,01	5,88 ± 0,76	0,51 ± 0,05
Płuca (2)	0,149 ± 0,01	14,2 ± 1,4	2,10 ± 0,17
Nerka (2)	0,127 ± 0,02	9,82 ± 0,86	1,22 ± 0,12
Wątroba	1,06 ± 0,20	10,32 ± 1,58	10,76 ± 1,93
Śledziona	0,090 ± 0,01	6,94 ± 1,17	0,61 ± 0,03
Mięśnie	8,39 ± 0,98	0,70 ± 0,25	5,67 ± 1,35
Kość	3,15 ± 0,35	2,97 ± 0,71	9,10 ± 1,09
Skórka	3,15 ± 0,35	0,96 ± 0,29	3,0 ± 1,12
Układ pokarmowy	2,58 ± 0,31	6,10 ± 2,00	7,80 ± 1,80
Mocz	-	-	-
Stolec	-	-	-
Suma		99,04 ± 4,8

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 20,97+2,46 gram

PL 205 780 B1

T a b e l a 2

Dystrybucja aktywności w 24 godzinie po iniekcji I.V. ¹¹¹In-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Krew	1,47 ± 0,07	21,97 ± 1,87	32,22 ± 1,35
Serce	0,128 ± 0,03	4,02 ± 0,23	0,38 ± 0,01
Płuca (2)	0,152 ± 0,02	7,90 ± 1,61	1,20 ± 0,18
Nerka (2)	0,128 ± 0,01	5,94 ± 0,40	0,76 ± 0,04
Wątroba	1,11 ± 0,10	10,08 ± 1,83	11,20 ± 2,23
Śledziona	0,082 ± 0,01	5,04 ± 0,75	0,40 ± 0,02
Mięśnie	8,41 ± 0,38	1,24 ± 0,05	10,44 ± 0,76
Kość	3,15 ± 0,14	2,02 ± 0,33	6,31 ± 0,81
Skóra	3,15 ± 0,14	3,75 ± 0,39	11,77 ± 1,09
Układ pokarmowy	2,91 ± 0,27	4,50 ± 0,52	6,65 ± 0,56
Mocz	-	-	0,98
Stolec	-	-	2,54
Suma		87,10± 1,68

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 21,03 ± 0,94 g

T a b e l a 3

Dystrybucja aktywności w 48 godzinie po iniekcji I.V. ¹¹¹In-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/g	% ID na organ
Krew	1,45 ± 0,13	22,41 ± 3,95	31,90 ± 2,89
Serce	0,090 ± 0,01	4,05 ± 0,94	0,36 ± 0,06
Płuca (2)	0,155 ± 0,02	8,45 ± 0,53	1,31 ± 0,19
Nerka (2)	0,125 ± 0,01	6,16 ±1,15	0,76 ± 0,07
Wątroba	1,040 ± 0,11	9,41 ± 2,33	9,84 ± 3,18
Śledziona	0,082 ± 0,01	5,32 ± 0,71	0,48 ± 0,11
Mięśnie	8,26 ± 0,77	1,42 ± 0,58	11,62 ± 4,67
Kość	3,10 ± 0,29	2,08 ± 0,16	6,41 ± 0,44
Skóra	3,10 ± 0,29	3,43 ± 0,59	10,54 ± 1,69
Układ pokarmowy	2,96 ± 0,20	5,05 ± 0,63	7,46 ± 0,60
Mocz	-	-	1,46
Stolec	-	-	6,41
Suma		87,10 ± 1,68

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 20,65 ± 1,93

PL 205 780 B1

T a b e l a 4

Dystrybucja aktywności w 72 godzinie po iniekcji I.V. ¹¹¹In-2B8-DTPA normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/g	% ID na organ
Krew	1,52 ± 0,06	18,97 ±1,31	28,51 ± 2,03
Serce	0,094 ± 0,01	3,71 ± 0,31	0,35 ± 0,04
Płuco (2)	0,161 ± 0,01	7,60 ± 0,30	1,18 ± 0,09
Nerka (2)	0,135 ± 0,01	5,55 ± 0,53	0,76 ± 0,09
Wątroba	1,11 ±0,11	9,90 ± 1,77	11,00 ± 2,03
Śledziona	0,095 ± 0,01	5,12 ± 0,75	0,48 ± 0,04
Mięśnie	8,58 ± 0,34	1,04 ± 0,09	8,95 ± 0,68
Kość	3,22 ± 0,12	1,73 ± 0,34	6,04 ± 0,51
Skóra	3,22 ± 0,12	3,16 ± 0,60	10,19 ± 2,03
Układ pokarmowy	2,79 ± 0,19	4,53 ± 0,83	6,37 ± 1,38
Mocz	-	-	2,49
Stolec	-	-	11,50
Suma		87,80 + 4,79

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 21,46 ± 0,84 g

T a b e l a 5

Dystrybucja aktywności w 1,0 godzinie po iniekcji I.V. ⁹⁰Y-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/ g	% ID na organ
Krew	1,27 ± 0,06	39,23 ± 2,45	49,77 ± 1,72
Serce	0,086 ± 0,01	5,80 ± 0,84	0,50 ± 0,09
Płuco (2)	0,137 ± 0,01	12,11 ± 1,08	1,66 ± 0,17
Nerka (2)	0,120 ± 0,01	10,23 ± 1,30	1,15 ± 0,12
Wątroba	0,921 ± 0,05	12,12 ± 1,72	11,17 ± 1,66
Śledziona	0,080 ± 0,01	9,27 ± 0,46	0,74 ± 0,07
Mięśnie	7,27 ± 0,32	0,78 ± 0,13	5,72 ± 1,05
Kość	2,73 ± 0,12	4,35 ± 0,39	11,89 ± 1,47
Skóra	2,73 ± 0,12	2,12 ± 0,78	5,82 ± 2,24
Układ pokarmowy	2,22 ± 0,06	3,52 ± 1,12	4,22 ± 0,84
Mocz	-	-	-
Stolec	-	-	-
Suma		94,85 ± 3,47

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 18,17 g ± 0,81 g

PL 205 780 B1

T a b e l a 6

Dystrybucja aktywności w 24 godzinie po iniekcji I.V. ⁹⁰Y-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/ g	% ID na organ
Krew	1,517 ± 0,090	8,35 ± 2,547	12,83 ± 4,60
Serce	0,092 ± 0,005	2,63 ± 0,142	0,240 ± 0,006
Płuco	0,141 ± 0,005	4,56 ± 0,393	0,644 ± 0,047
Nerka	0,138 ± 0,007	5,63 ± 0,222	0,779 ± 0,040
Wątroba	0,438 ± 0,098	5,22 ± 0,335	2,259 ± 0,399
Śledziona	0,081 ± 0,003	4,23 ± 0,180	0,345 ± 0,011
Mięśnie	8,668 ± 0,514	0,976 ± 0,164	8,55 ± 1,945
Kość	3,246 ± 0,186	1,326 ± 0,102	4,289 ± 0,154

Liczba myszy = 3 Średnia waga = 21,671 ± 1,11 g

T a b e l a 7

Dystrybucja aktywności w 48 godzinie po iniekcji I.V. ⁹⁰Y-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/g	% ID na organ
Krew	1,33 ± 0,06	17,34 ± 2,0	23,03 ± 1,95
Serce	0,088 ± 0,01	3,56 ± 0,31	0,31 ± 0,04
Płuco (2)	0,139 ± 0,01	7,54 ± 0,88	1,05 ± 0,15
Nerka (2)	0,122 ± 0,01	6,53 ± 0,42	0,79 ± 0,01
Wątroba	0,968 ± 0,04	9,05 ± 1,70	8,92 ± 1,57
Śledziona	0,087 ± 0,01	6,52 ±1,13	0,57 ± 0,07
Mięśnie	7,26 ± 0,36	1,05 ± 0,18	8,01±1,17
Kość	2,86 ± 0,14	3,34 ± 0,42	9,53 ± 1,08
Skóra	2,86 ± 0,14	4,13 ± 0,76	11,75 ± 1,82
Układ pokarmowy	2,84 ± 0,19	2,74 ± 0,34	3,80 ± 0,30
Mocz	-	-	4,29
Stolec	-	-	7,67
TOTAL		79,72 ± 3,23

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 19,07 + 0,91g

PL 205 780 B1

T a b e l a 8

Dystrybucja aktywności w 72 godzinie po iniekcji I.V. ⁹⁰Y-2B8-DTPA do normalnych myszy BALB/c

Średnia wartość ± SD
Próbka	Waga organu [g]	% ID/g	% ID na organ
Krew	1,35 ± 0,02	15,40 ±1,63	20,71 ± 2,13
Serce	0,088 ± 0,01	3,12 ± 0,24	0,28 ± 0,01
Płuco (2)	0,142 ± 0,01	8,23 ± 1,05	1,17 ± 0,20
Nerka (2)	0,123 ± 0,01	6,45 ± 0,57	0,79 ± 0,07
Wątroba	0,02 ± 0,06	8,39 ± 1,04	8,58 ± 1,31
Śledziona	0,103 ± 0,01	5,90 ± 1,19	0,59 ± 0,08
Mięśnie	7,68 ± 0,11	1,01 ± 0,15	7,73 ± 1,05
Kość	2,88 ± 0,05	3,20 ± 0,25	9,20 ± 0,61
Skóra	2,88 ± 0,05	3,97 ± 0,49	11,42 ± 1,36
Układ pokarmowy	2,86 ± 0,18	2,90 ± 0,65	4,06 ± 0,93
Mocz	-	-	3,00
Stolec	-	-	11,08
Suma	78,62 ±

Liczba myszy = 5 Średnia waga = 19,21 ± 0,27

W podobny sposób określone lub wyliczone zostały inne wartości biologicznego okresu półtrwania przy użyciu standardowego równania do obliczenia ekspotencjalnego rozpadu t. Po określeniu tych wartości, zmienne Tue, Te1, Te2 A1, A2, oraz A, zamieszczone w tabelach 9 i 10, były określane dla każdego wyznakowanego radioaktywnie koniugatu przy użyciu równań zamieszczonych na górze tabelek (wartości wejściowe). Wartości te, jak również te pokazane w następujących tabelkach były wyliczane przy użyciu programu napisanego w Symphony spreadsheet (Lotus Development Corp.) przez Mr. Phillip Hagan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center, La Jolla, CA 92161.

PL 205 780 B1

Tabela

WĄTROBA 2.78E-04 11.000% 0.00% 1000 0 2.7ΒΕ-04 63.2 U.U lUUU/.b U.U iUUU PŁUCA 2.78E-04 2.100% 1.20% 30 1000 2.78E-04 20.8 63.2 627.9 1091.7 1720 INNE TKANKI (TOTAL) 2.78E-04 0.000%

PL 205 780 B1

PL 205 780 B1

Tabela 10

PL 205 780 B1

PL 205 780 B1

Korzystając z Całkowitej Skumulowanej Aktywności (A) wartości z tabel 0 i 10 oraz wartości S z MIRD Pamphlet Number 11 (tabele 11, 12, 13 oraz 14) wartości zaabsorbowanej radioaktywności określono dla każdego znakowanego radioaktywnie koniugatu przedstawionych tkanek (tabele 15, 16, 17 i 18). W określaniu całkowitych dawek radioaktywności dla koniugatów znakowanych Indem, przedstawionych w tabeli 19, własna dawka danego organu była sumowana z dawką zaabsorbowaną produkowaną w sąsiadujących narządach i tkankach. Jednakże, przy przeliczaniu dawek radioaktywności przypisywanych znakowanemu itrem koniugatowi (tabela 20), brak jest pewnych wartości dla podanych tkanek (np. nadnerczy). Wynika to z krótszej drogi wyzwalanej cząstki 13, w odniesieniu do długości drogi emitowanej cząstki g, tym samym prowadząc do pomijanej aktywności sąsiednich tkanek oraz braku danych biodystrybucji.

PL 205 780 B1

Tabela 11

Gl (LLI ŚCIANA) 7.1E-07 2.2E-05 3.8E-06 2.4E-05 9.5E-06 4.7E-04 2.5E-06 7.3E-07 3.0E-07 5.2E-06

PL 205 780 B1

ORGANY ŹRÓDŁOWE

φ

Φ

φ

Φ

φ

Φ

φ

Φ

Φ

φ

Φ

φ

Φ

Φ

-H

Ή β

Ο I

ο |

ο

ο |

ο

ο t

Ο (

ο [

o I

O 1

o

o

o 1

Φ β

'W Ο

W

te

ώ

te

ω

W

βϋ

ω

w

te

te

te

te

β 0ί

• Η

03

te

ιη

te

s>

ιη

Φ

Φ

ro

Φ

β Λί H Ρ

£

•Φ

te

ιη

r*

Φ

φ

03

O)

te

te

Lf)

Φ

φ

β*

φ

φ

te

φ

Φ

Φ

00

Φ

te

Φ

ο

ο

Ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

o

o

o

O

O I

0

ώ

ώ

W

ώ

ώ

ώ

ώ

Μ

W

te

te

w

te

β

ι>

ο

00

φ

ο

C0

H

Ch

Φ

00

Ch

rM

»

•

>

•

•

•

1

03

Lf)

CU

03

0*

Η

«#

te

ί>

-τ-

I>

m

03

flj Λ

ΙΓΙ

Μ*

Φ

φ

φ

φ

φ

Φ

Φ

r-

Γ*

Φ

Φ

ο

Ο

Ο

ο

ο

ο

ο.

Ο

O

o

O

O

O

ο Μ

ώ

ώ

ώ

ά

ώ

κ

ώ

ώ

W

ώ

te

w

te

-Ρ

Οί

te

οο

γ4

ή

03

φ

co

ιη

03

OJ

Φ

ftf

*

»

«

<

«

•

»

&

Η

Η

«ψ

m

r-4

Η

r-

OJ

03

Φ

Γ-1

Φ

ίΠ

φ

Φ

φ

Φ

Φ

Φ

in

0*

te

Φ

Φ

Ο

Ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

Ο

o

o

o

o

O

~ri Μ

ώ

ώ

te

ώ

ώ

1 W

Μ

ώ

3

ώ

1 te

w

te

U

03

03.

ίΓ>

φ

Φ

Ο

C0

00

O

I-|

Φ

φ

*

•

*

•

•

53

>>Ί

ιη

Η

Οί

<h

Φ

03

Η

OJ

η

03

te

Φ

Ο

00

0*

ιη

φ

Φ

Φ

Φ

φ

φ

00

LD

LO

«Η β

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

Ο

Ο

o

ο

O

O

O

ο 'C0

•Ν 0>

W

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

Μ

ώ

1

te

te

1 te

te

φ

β

co

φ

ί*3

03

tH

φ

te

i—1

Ch

β

Λ4

<

»

•

*

*

•

*

*

«

•

Η

Ο

Οί

00

03

W

Φ

φ

Οί

4—

Ol

ιη

03

OJ

Φ

Φ

φ

5>

φ

Φ

φ

φ

φ

Φ

θ'

CO

Lf)

Φ

Ο

ο

Ο

ο

Ο

ο

ο

ο

o

ο

o

O

O

Ό W

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

ώ

Μ

w

ώ

te

t W

te

Φ

Ο

η

00

η

Η

φ

Η

03

03

Ln

Φ

co

β Η

00

ι>

00

ch

μ*

φ

Ο

σ\

te

cd

Φ

Φ

φ

Γ-

ιη

φ

m

Φ

Φ

Φ

φ

CD

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

O

ο

o

Lf)

Φ

Ό <ΰ

| RS χ

Ο

i te

ί te

I W

t te

ι te

I Κ

f Κί

1 κ

t te

t te

i te

O

o 1

γΜ

Φ

03

φ

ιη

rH

co

φ

Η

Φ

ο

Ch

te

te

Λ!

0

β

α

•

»

♦

'

•

Η

*

1

cn

te

β

α

Η

•σ

σ)

ιη

ο

Η

*ł<

φ

Φ

Η

φ

03

l>

Λ!

Φ

φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Ł0

ί>

te

Φ

Φ

ο

ο

ο

Ο

ο

Ο

Ο

Ο

O

ο

o

O

o

Ό

Ό 4?

ώ

1 βά

ώ

ώ

ώ

ώ

ά

ώ

ώ

te

te

te

1 W

Φ

tM

w

ch

03

ο

φ

φ

θ'

w

¢0

m

rH

β ΙΗ

Ο •Ν

Η

Φ

ιη

Γ-ί

φ

Η

CQ

te

te

Ol

Φ

<ϋ

Ο

[--..

00

Φ

φ

φ

r-

Φ

te

co

Lf)

Φ

Ν Μ

Ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

O

Ο

o

O

O

•ϋ φ γη Χί w υ

J Μ

ί te

1 te

ώ

ώ

ώ

j

ω

te

ώ

te

te

ω

ιη

te

03

te

φ

φ

φ

0*

Φ

««φ

03

Ch

03

ρ ο η α

03

φ

00

ιη

φ

03

03

Η

θ'

te

ϊβ

Φ

(ϋ Ν

Φ

Φ

ιη

ιη

Φ

φ

φ

Φ

Φ

Φ

tn

0*

te

o

O

υ Μ

ο

ο

Ο

ο

ο

Ο

Ο

Ο

o

Ο

o

w

ώ

Φ <-<

1 Μ

ώ

Μ

3 te

ώ

Μ

ώ

ώ

te

te

W

co

φ

*9 β s

ι>

ιη

Φ

€0

03

Φ

ω ο

te

Lf)

φ

te

Η

Ο

Ch

β*

τβ

ΟΙ

Γ~

03

te

Ρ

Q

o

g

jz Ο

te

a

,ί

SK

o

H

V r-i

te

Η

U

3)

te

O

Ο

Ν

&

<-χ

Ź

g

te

Ο

Ο

S

Ε4

*$5

s

H

*d

'w'

(—ł

Μ

o

α

H

3

Η

.2

Μ

{Η

K

>*

g

ί*»

w

ο 2

κ

Μ

W

Ρί

tS3

P2J

te

U

C

β β σι

te

ο

Η

te

ω*

S

!□

Cd

Q

U

M

te

Η

te

Λ

(3

Μ

Φ

Ν

\C

te

te

§

O

IV

«Τ

ω

Ν

{Ζ

£

Pi

te

&

ο

§

SS

CU

W

Η

>Φ

Ρ

Cf

'W

te

s

LITERATURA - MIRD PAMPHLET NO. 11. PAGE 164

PL 205 780 B1

ZAADSORBOWANA DAWKA NA JEDNOSTKĘ SKUMULOWANEJ AKTYWNOŚCI (RAD/UCI-H)

INNE TKANKI 6.3E-06 5.7E-06 (MIĘŚNIE)

PL 205 780 B1

	Φ
	P			kD	kO	kO	kO	kD	kO	kD	kD
	Ή S			ο	O	o	o	o	o	o	o
	0 A4	ο Α-|		ω	ω	W	ώ	W	w	W	W
		fi		ο	co		00	cn	Ol	co	00
	fi
	O	υ		ο-		co	kO		Lfł	θ'	Lfł
	fi			00	o·	kD	θ'	Ch	ro	03	kD
	u			ο	o	O	o	o	o	O	O
	N □			ώ	ώ	ώ	W	W	ώ	ω	ώ
	p			Lf)	o	lt>	Lfł	co	00		ro
	fi										•
	H			OJ	co	OJ	ro	co	m	Ol	Lf)
				ο	θ'	kD	co	ro	σ\	o	kD
				ο	o	O	o	o	o	o	O
	fi M			+ w	1 w	1 W	1 W	1 w	1 W	+ ω	1 W
	U fi •fi			ο	ł-d	σ\	O	ko	ro	o	kD
			ό	Ol		00	co	CO	o	Lf)
	fi
	fi			ko	m	kD		0«		kD	kD
	0			ο	o	o	o	o	O	o	O
	N O			ώ	W	ώ	ώ	ώ	ώ	ώ	W
	Φ			θ'	H	Lfł	ł-f	o		Ol	ko
	r-d			*							»
	'0)			Τ—I	kD	rd	en	05	co	r-i	kD
				kD	kO	tn	kO	kD	kD		kD
				Ο	O	o	o	o	o	kD	O
	fi			W	W	w	1 W	1 w	ω	O ta	W
	'0				t>	P	r*			Ol	CO
	44						•		*
	w		fi	rd	rd	co	rd	co	OJ	i-d	ro
			Ρ	<ο	kD	kD	kD	kD	kD	kD	kD
			ra 05 fi	ο	O	o	O	o	O	o	O
			Ρ Ν 0 U	ώ	ω	ώ	ώ	w	ώ	ώ	ώ
			Ρ Ρ	OJ	W	ro	o	cn	00	co	σ»
			ra fi1 η σι	Ο)	Ol	Ol	Ol	rd	OJ	rd	Lfł
w		Ρ		kD	u?	kD	kD	ko	kD	kD	kD
s o		0)		Ο	o	o	o	o	O	O	O
Q		φ	Ρ fi 0 Ρ	ω	) W	1 w	w	w	W	W	W
Ό		44	Ρ -Η	04	w	ro	o	co	00	CO
oi		Ν	ra Λ
'N		W	Η Ν	ΟΙ	co	OJ	Ol	rd	05	rd	Lf)
										kD
										O
				ko	kD	ko	kO	kD	kD	1	kD
			*?	ο	O	o	o	O	o	U3 0*	o
§			44 Ρ -Γ-) φ	Η	w	H	w	W	ω		K
s			Λ Ν	ο-	σ»	o		o	OJ	kD
Pi			ν υ		•						*
O			C0 —'	θ'		OJ	Ol	rd	OJ	•	kD
	fi			kD	CO	kD	Lf)	O	r*	kD	kD
	44 ρ			ο	O	o	o	o	o	O	O
	ra			ω	ω	w	ώ	w	w	ώ	ω
	Ν			ο	kO	ro	OJ	H	Lf)	o	Lf)
	Η Η			Γ~ΐ	rd	rd	kD	05		rd	θ'
				οι	ko	kD	ko	O	co	Lfł	u>
	Ή			ο	o	o	o	O	O	O	o
	44				1	1	1		I	|	1
	•Η			w	w	W	w	w	ω	W	w
	'!—>			ο	Lfł	M1	kD	o	in	Lf)	t>
	fi •fi			rd	rd	rd	rd	ó	OJ	kD	θ'
										O	o
		8								>
									tó
		Β								o g	H o
		φ								o
		υ								£	w
		0					2		<	—	H
		τί		i-d			O		U		b
					H		H		>«		s
		£·		hd	ω		tsł		N	o	o
		κ fi ώ		£3	r>	2	Q	2	U	ł-d
			Η	tSJ	Ό	W	u	OŚ	o
		Ρ		<·	Pi		.-3	>	<		1¾
		ο			E-<	ω	Ό0	b	H	§	u

PL 205 780 B1

ZAADSORBOWANA DAWKA NA JEDNOSTKĘ SKUMULOWANEJ AKTYWNOŚCI (RAD/UCI-H)

SZPIK (CZERWONY)

PL 205 780 B1

LITERATURA - MIRD PAMPHLET NO. 11, STR. 144

PL 205 780 B1

ZAADSORBOWANA DAWKA NA JEDNOSTKĘ SKUMULOWANEJ AKTYWNOŚCI (RAD/UCI-H)

LITERATURA - MIRD PAMPHLET NO. 11. STR. 145

PL 205 780 B1

Ρ ω

ró <ύ JJ Ν ο υ Ρ Ρ ω frf Η ξη <ύ

Ρ rO Ο Ρ Ρ -Η ω η Μ Ν

Λί Ρ •η φ a ν Ν ϋ C0 —

2η ζ

ο ο

Φ
Ρ		ιο	lo	lo	LO	LO	LD	lo	10
Ή 3		ο	ο	o	o	O	o	o	o
0 0 •V γΜ		W	w	ω	w	w	w	ώ	ώ
γΗ (Ό		00	00	00	00	00	00	co	co
Φ -Η Ο U		CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN
Π3							CN		lo
ϋ							O		o
(>Ί							I		1
Ν Ο							W		W
ρ		Ο	o	o	o	O	σ»	O	co
<ΰ
Η		Ο	o	o	o	o	σ>	O	CN
						CN			LO
						O			O
Φ Ρ						W			1 W
Ό		ο	o	o	o	Γ-	o	O	co
Φ*
β>		ο	o	o	o	LO	o	o	CN
Φ
β					CN				LO
Ο					o				O
•Η
Ν Ό					w				W
φ		ο	o	o	t—ł	O	o	o	CO
Ή
Ό3		ο	o	o	rJ	O	o	o	CN
									LO
				o					O
Φ ρ				1 H					1 W
Ό		ο	o	<0	o	O	o	o	co
Λί
W		ο	o	Γ	o	O	o	o	CN
									LO
									O
									ω
		ο	o	o	o	o	o	o	00
		ο	o	o	o	o	o	o	CN
									LO
									O
									W
		ο	o	o	o	o	o	o	00
		ο	o	o	o	o	o	o	CN
Ρ									LO
Φ									O
<—1									1
Φ -Η X		ο	o	o	o	o	o	o	ω co
Ν
ω		ο	o	o	o	o	o	o	CN
Φ			CN						LO
λ;			o						O
Ρ									1
w 0			ω						ω
Ν		ο	o	o	o	o	o	o	co
Μ Η		ο	CN	o	o	o	o	o	CN
		i—1							LO
Ή		ο							O
Λί									I
Ρ β		ώ							ω
•1—1		00	o	o	o	o	o	o	co
Φ β)		I—i	o	o	o	o	o	o	CN
								g	O
	Φ							tó
	£							ϋ	H
	ι—ł							a	U
	Φ							o
	ϋ							a	W
	0		<c		&			—	H
	τ3	ι-ι	2		o		o		y
					H			<
	>1	H	ω	d	Od		N	u	g
	β Φ σι ρ	Ε	!=>	2	Q	2	o	H
		N	o	ω	ρ		O	|M
			w		>		<c
	ο		H	w	'cn			s	U

LITERATURA - MIRD PAMPHLET NO. 11, STR. 145

PL 205 780 B1

Tabela 15

INNE TKANKI O.OE+OO 3.0E-04 6.0E-04 1.5E-03 1.8E-03 2.0E-03 1.8E-03 3.4E-02 7.6E-03 3.7E-01 (MIĘSNIE)

PL 205 780 B1

ORGANY ŹRÓDŁOWE

PL 205 780 B1

PL 205 780 B1

GI (ULI ŚCIANA) O.OE O. OE O.OE O.OE 2.0E-02 1.5E-02 2.2E-03 O.OE O.OE

PL 205 780 B1

Organy docelowe Jajniki Trzustka ORGANY ŹRÓDŁOWE

PL 205 780 B1

ORGANY ŹRÓDŁOWE

CHRZĄSTKA O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO 2.4E-01 3.1E-02 1.7E-03 O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO

PL 205 780 B1

ZRODŁ

PL 205 780 B1

Tabela 17

GI (LLI O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OB+OO O.OE+OO 1.8E+G0 O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO

OKRĘNICY)

PL 205 780 B1

Organy docelowe Nadnercza Treść Nerki Wątroba Płuca

PL 205 780 B1

PL 205 780 B1

				ο	ο	ο	ο	ο	ο
		-Η		ο	ο	ο	ο	ο	ο
		Λί		+	+	+	+	+	+
	Φ	β		ω	m	ω	w	ω	w
	β	Π5		Ο	ο	ο	ο	ο	i—1
	β	λ:
	Η	4J		ο	ο	ο	ο	6	ι—1
				ο	Ο	ο	ο	CN	Ο
				ο	ο	ο	ο	Ο	ο
	π3			+	+	+	+	1	+
	ο			ω	ω	ω	ω	ω	ω
	β			ο	ο	ο	ο	σ\	ο
	γΜ
	α.			ο	ο	ο	ο	CN	6
	β			ο	ο	ο	ο	Γ-1	ο
	X)			ο	ο	Ο	ο	ο	ο
	Ο			+	+	+	+	1	+
	β			w	ω	W	w	ω	ω
	X			Ο	ο	ο	Ο	CN	ο
	ctf
	!S			Ο	ο	ο	Ο	CN	ο
				ο	ο	ο	ο	ΓΊ	ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
	•Η			+	+	+	+	1	+
	Λί			Μ	ω	ω	ω	ω	ω
	β			Ο	ο	ο	ο	ι>	ο
	<ϋ
				Ο	ο	ο	6	ΓΟ	6
				ο	Ο	ο	ο	η	ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
				+	+	+	+	1	+
				Η	ω	ω	w	ω	ω
				Ο	ο	ο	Ο	γ4	ο
				Ο	6	ο	Ο	st*	ό
				ο	ο	ο	ο	η	ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
			ό	+	+	+	+	I	+
			'C0	W	ω	W	w	W	W
			φ	Ο	ο	Ο	Ο	ΙΟ	ο
			β ο	•				•
			Η ·ό	ο	ο	Ο	6	ΓΠ	6
ω				ο	ο	ο	ο	ΓΠ	ο
£				ο	ο	ο	ο	ο	ο
ο			ό	+	+	+	+	1	+
			'03	ω	ω	ω	ω	ω	ω
α			φ	ο	ο	ο	ο	10	ο
Ό			β υ
ιΧ			η h>	6	ό	ο	ο		ο
'(S3
>»	γΜ	κβ	Π3
	Λ4	0	0	ο	ο	ο	ο	ΓΠ	ο
Γ Π	D	£	X	ο	ο	ο	ο	ο	ο
υ (Κ		β	'U Ό	+	+	+	+	1	+
(-Μ		(ΰ	'CO oj	ω	ω	ω	κ	ω	ω
ο		Λί	Φ Γβ	ο	ο	ο	Ο	10	ο
		0	β Ο
		CU	Εη ·Ν	ο	ο	ο	ό	Γ*	6
		ίΰ
		Ν		ο	ο	ο	ο		ο
		β		ο	ο	ο	ο	ο	ο
	ό	φ		+	+	+	+	1	+
	'C0	X		ω	ω	ω	ω	ω	ω
	φ	ϋ		ο	ο	ο	ο	Γ*	ο
	β	φ·
	Η	α		ο	ο	ο	ο	γΗ	ό
	Π5
	Ν
	Ο			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	β			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	Φ			+	+	+	+	+	+
	β			W	ω	Η	ω	ω	ω
	Ό			Ο	ο	Ο	ο	Ο	ο
	(ϋ S			6	ο	Ο	ο	ο	ό
		φ						Ρ	ο
								>	04
		0
		r—ł						ο	Η
		Φ						s	α
		Φ						ο
		0						53	Η
		Ό			ζ				Η
					ο		υ		Η
		ϊβ			Η		>4		5
		β			Ν	<	Ν	υ	Ο
		π3		2	α	2	Ο	Μ	Μ
		σ>		Ό	w	Α		υ	04
		β			χ
		ο		ω	'CO	•ώ	Η	*	υ

PL 205 780 B1

Tabela 18

PŁUCA O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO O.OE+OO

PL 205 780 B1

ORGANY ŹRÓDŁOWE

O o + W O d	o o + W O d	o o 4 W o d	o o 4 PO o d	o o + KI O d	o o 4 KI o o
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4*	4	4	4	4	4
KI	W	W	K$	Ki	Ki
O	O	O	O	o	o
d	o	o	d	o	o
o	o	o	o	o	o
o	o	O	o	o	o
4·	4	+	4	4	4
		W	Kt		£3
o	O	O	o	o	O
O	d	o	d	d	O
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4«	+	4	4	4	4
	K3	KI	K3	«	K3
O	O	o	o	o	O
d	O	d	d	d	d
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4	4	4	4	4	+
M	ω	W	KI	KI	w
O	o	O	o	o	o
O	d	O	d	d	o
o	o	o	o	o	σ
o	o	o	o	o	o
4	4	4	4	4	4
w	W	W	KI	DJ	W
H	r4	00	co	i—ł	i—t
M		r·	t>	n	Γ0
O	o	o	o	o	O
O	o	o	o	o	o
4«	4	4	4	-i*	4
ki	KI	Ki	KI	K3	KI
o	O	O	o	O	o
d	d	o	d	d	d
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4*	4	4	4*	4	4
K3	Łz3	K3	W	w	KS
O	O	O	o	O	O
O	O	O	o	O	O
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4	+	4	4	4	4
K,	W	W	PO	KI	KI
O	o	O	O	o	o
d	o	o	d	o	o
o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o
4	4	4	4	4	4
w	KI	W	W	KI	KI
o	O	o	o	o	O
d	O	o	d	d	d

>4

CO

3

KI

<

O

w

<—V

ES5

a

s

o

►3

O

pi

σι

w

w

ΡΠ

w

M

ΚΓ

u

H

co

N

O

i4

H

M

O

N

O

U

4S3

H

£

W

E-i

•—f

'***'

2

O

—*

<

Q

&

»

H

O

O

M

K

2

w

KI

£“i

CU

£·*

H

*

H

P

co

CO

ESI

tS3

CO

co

K5

w

CO

K3

M

M

CO

CO

Ki

SP

O

O

£3

W

KI

Ki

55

KI

Pi

R

ESI

£4

Pi

p<

'O

W

Pi

Pi

&

H

fH

3

co

H

CO

o

w

PL 205 780 B1

	φ
	4->
	•Η			ο	Ο	ο	ο	ο	ο
				ο	ο	Ο	ο	ο	ο
	0 ο			+	+	+	+	4-	+
	44 γΜ			ω	ω	ω	w	W	Η
	ρη φ			ο	ο	ο	ο	Ο	Ο
	Φ ·η			*
	υ υ			ο	6	ο	ο	ό	6
	φ
	υ			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	ίχ			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	Ν			+	+	+	4·	4-	4-
	υ			ω	ω	w	ω	ω	ω
	β			ο	Ο	ο	ο	ο	Ο
	Φ
	Η			ο	Ο	ο	6	6	Ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
	Φ			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	β			+	+	+	+	4-	4-
	Ό			W	W	ω	ω	Μ	W
	Φ t—ν			ο	ο	ο	ο	Ο	Ο
	1 j			ο	6	6	6	6	6
	Φ
	β
	0			ο	ο	ο	ο	ο	<Ν
	•Η			Ο	ο	ο	ο	ο	σ
	Ν			+	+	+	+	4-	t
	Ό			w	ω	ω	ω		ω
	Φ			ο	Ο	ο	ο	Ο	ΓΠ
	Γ-1
	'03			6	Ο\	6	6	Ο	04
				τβ	ο	ο	ο	ο	r4
				ο	ο	ο	ο	ο	Ο
	Φ			+	+	+	4-	4-	+
	β			ω	ω	ω	W	ω	W
	Ό			ο	ο	ο	Ο	ο	00
	44
	03			r4	ο	ο	6	ό	ΓΠ
			Φ
			-Ρ
			ίθ	Ο	ο	ο	ο	ο	r-i
		φ	φ	Ο	ο	ο	ο	ο	Ο
		4J	Ν	+	4-	+	+	4-	1
		0	υ	ω	W	ω	W	W	W
		4J	Ό	ο	Ο	Ο	Ο	Ο	00
		ω	Φ		•			•
		H	tn	ό	ο	6	6	ο	ΓΠ
&3	-β
&	Φ			ο	ο	ο	ο	ο	ο
Ο	»—1	Φ		ο	ο	ο	ο	ο	ο
Ρ3	Φ	4J	Φ	+	4-	+	+	4-	+
G	•Η	Ο	Ρ	W	W	w	Μ	Ω	w
Ό	X	Ρ	•Η	Ο	ο	Ο	Ο	Ο	ο
	Ν	ω	Ό					»
'tSJ	03	1-1	Ν	Ο	6	Ο	6	Ο	Ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
				ο	ο	ο	ο	ο	ο
		44	β	+	+	+	+	4-	4-
		•Η	Φ	£3	W	ω	W	W	ω
Ο		α.	Ν	Ο	ο	ο	Ο	Ο	ο
tó		Ν	υ		•		•	*
Ο		ω		6	ο	6	Ο	ο	ο
	Φ
	44			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	-U			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	ω			+	4-	+	4-	4-	4-
	β			ω	ω	ω	Μ	w	Κ
	Ν			ο	ο	ο	Ο	ο	Ο
	β							>
	Η			6	6	ό	Ο	ο	Ο
	Ή			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	44			ο	ο	ο	ο	ο	ο
	Ή			+	+	+	+	+	+
	β			w	ω	ω	W	ω	w
	•η			Ο	ο	ο	Ο	Ο	ο
	Φ
	t3			6	ο	6	ο	6	ό
									ο
	Φ							ο
								>	<
	0							tó	Η
	γ—1							ο	u
	φ
	u							ο
	ο							S	w
	Ό								Η
					ο		ο		Η
	>Ί				Μ		5*
	β				εχ)		Ν	ο	ο
	φ			2	G	ί2	U	Η	&
	Cn			Ά	ω	Ω	Ή	Ο	P?
	β			&		§		<c	<
	Ο			03	'03	ł-j	Η		ο

PL 205 780 B1

T a b e l a 19

Pomiary dozymetryczne powstające z podawania znakowanego ¹¹¹In 2B8-MX w standardowemu człowiekowi (70 kg) oraz oparte na zwierzęcych danych biodystrybucji przez 72 godziny po wstrzyknięciu

ILOŚĆ AKTYWNOŚCI=	DAWKA 1000 mikrocurie/pacjent
	Ra		Ra
NADNERCZA	0,493	JAJNIKI	0,387
ŚCIANA PĘCHERZA	0,348	TRZUSTKA	0,362
ŚCIANA ŻOŁĄDKA	0,412	SZKIELET
JELITO CIENKIE	0,434	ISTOTA ZBITA	0,474
ŚCIANA JG	0,533	ISTOTA GĄBCZASTA	0,474
ŚCIANA OKRĘŻNICY	0,505	SZPIK (CZERWONY)	0,602
NERKI	0,625	SZPIK (ŻÓŁTY)	0,602
WĄTROBA	1,533	CHRZĄSTKA	0,474
PŁUCA	0,582	INNE SKŁADNIKI	0,474
INNE TKANKI		SKÓRA	0,564
MIĘSNIE		ŚLEDZIONA	0,854
TKANKA TŁUSZCZOWA		JĄDRA	0,239
KREW		TARCZYCA	0,276
MÓZG		MACICA (NONGRVD)	0,473
SERCE		CAŁKOWITE CIAŁO	0,417

Ref: A Schema for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. ofNucl. Med./Suppl. #1, 2/68

Obliczeń dokonywano korzystając z Spreadsheet Template in Symphony (Lotus Development Corporation) stworzonych przez Phillip L. Hagan, MS Nuclear Medicine Service VA Hospital San Diego, CA 92161

T a b e l a 20

Pomiary dozymetryczne powstające z podawania znakowanego ⁹⁰Y 2B8-MX w standardowemu człowiekowi (70 kg) oraz oparte na zwierzęcych danych biodystrybucji przez 72 godziny po wstrzyknięciu.

ILOŚĆ AKTYWNOŚCI=	Ra	DAWKA 1000 mikrocurie/pacjent	Ra
NADNERCZA	0,000	JAJNIKI	0,000
ŚCIANA PĘCHERZA	0,271	TRZUSTKA	0,000
ŚCIANA ŻOŁĄDKA	0,356	SZKIELET
JELITO CIENKIE	0,504	ISTOTA ZBITA	3,138
ŚCIANA JG	1,150	ISTOTA GĄBCZASTA	3,138
ŚCIANA OKRĘŻNICY	1,772	SZPIK (CZERWONY)	7,776
NERKI	8,366	SZPIK (ŻÓŁTY)	7,776
WĄTROBA	8,575	CHRZĄSTKA	3,138
PŁUCA	2,079	INNE SKŁADNIKI	3,138
INNE TKANKI		SKÓRA	10,69
MIĘSNIE	2,716	ŚLEDZIONA	8,965
TK. TŁUSZCZOWA	2,716	JĄDRA	0,000

PL 205 780 B1 cd. tabeli 20

KREW	2,716	TARCZYCA	0,000
MÓZG	2,716	MACICA (NONGRVD)	0,304
SERCE	2,176	CAŁKOWITE CIAŁO	1,854

Ref: A Schema for Absorbed-dose Calculation for Biologically Uistributed Radionuclides, MIRD J. ofNucl. Med./Suppl. ffl, 2/68

Obliczeń dokonywano korzystając z Spreadsheet Template in Symphony (Lotus Development Corporation) stworzonych przez Phillip L. Hagan, MS Nuclear Medicine Service VA Hospital San

Diego, CA 92161

1. II. Wyniki

A. Badania in vitro z 2B8 i 2B8-MX-DTPA

1. Wytwarzanie i charakteryzowanie przeciwciała 2B8 anty-CD20

W sumie dziewięć fuzji dało w wyniku trzy hybrydomy, wytwarzające przeciwciała skutecznie współzawodniczące z wyznakowanym radiologicznie przeciwciałem Coulter B1. W każdym przypadku hybrydomę ekspandowano na płytkę 24-zagłębieniową. Pierwsze dwa przeciwciała izolowane z fuzji 3 i 4 izotypowano i oba zidentyfikowano jako IgM. Co do trzeciego przeciwciała, wytworzonego w fuzji 5 i oznaczonego jako 2B8, ustalono, że jest to izotyp IgGl kappa i dobrano go do dalszych badań. Klon 2B8.HII ekspandowano i umieszczono w miejscu długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Klon 2B8.HII subklonowano do wytworzenia klonu 2B8.HII.G3 i ponownie do wytworzenia klonu 2B8.HII.G3.G9. Klon ten ekspandowano do dalszych badań, a przeciwciało oczyszczono chromatografią powinowactwa do białka A.

Badania kompetycyjne z zastosowaniem niewyznakowanych 2B8, B1 i Leu 16 i wyznakowanego Coulter B1 wykazały, że 2B8 było zdolne do hamowania wiązania B1 do CD20 skuteczniej, niż takie samo stężenie B1 lub Leu 16 (fig. 1). Podobne wyniki uzyskano (dane nieprzedstawione) w badaniu kompetycyjnym z zastosowaniem 2B8 sprzężonego z FITC, natywnego B1 i nie mających związku z tematem niniejszego wynalazku przeciwciał UPC-10 i S-003 (odpowiednio, izotypy IgG 2a i 1).

Bezpośrednie wiązanie z komórkowym przeciwciałem CD20 przez przeciwciała 2B8 i B1 porównywano analizą FACS z zastosowaniem CD20-dodatnich komórek SB i CD20-ujemnych komórek HSB. Wyniki przedstawione na fig. 2 wskazują, że porównywalne ilości przeciwciał, więcej 2B8 niż B1, uległy związaniu z komórkami SB. W odniesieniu do nie mających związku z tematem niniejszego wynalazku przeciwciał nie obserwowano znamiennego wiązania z komórkami SB. Dla każdego odczynnika stosowanego z komórkami HSB obserwowano jedynie fluorescencję tła. Wyniki te potwierdzają swoistość interakcji 2B8 z antygenem CD20 i sugerują, że 2B8 może mieć większe powinowactwo do antygenu powierzchni komórki, niż B1.

W celu ustalenia widocznego powinowactwa 2B8, oczyszczone przeciwciało wyznakowano radiologicznie ¹²⁵I i inkubowano wyznakowane przeciwciało we wzrastającym stężeniu z antygenododatnimi komórkami SB; oznaczano radioaktywność związaną z komórkami po 1-godzinnym okresie inkubacji (fig. 3). Wyniki sugerują, że przeciwciało 2B8 wiąże się z antygenem CD20 ze stałą widocznego przeciwciała 4,3 x 10^-9 M.

Badania cytometrii przepływowej prawidłowych ludzkich limfocytów krwi obwodowej wskazują, że 2B8 było swoiste dla limfocytów B i nie reagowało z innymi typami limfocytów (na przykład z limfocytami T, monocytami, makrofagami). 2B8 wyznakowane FITC porównywano z B1-FITC i Leu 16-FITC, stosując tę samą populację limfocytów ludzkich. Wyniki ukazane w tabeli 21 wskazują, że 2B8 reagowało z około 14% limfocytów krwi obwodowej w porównaniu z około 12% Leu 16 i 11% B1. Populacja limfocytów w oparciu o inny marker limfocytów B (CD-19) liczyła od 11 do 14%. I wreszcie, po inkubacji ludzkich limfocytów krwi obwodowej z 2B8 i B1 lub Leu 16, i następnie barwieniu kontrastowym markerem CD19 (Becton/Dickinson) podwójnie barwiąca się populacja limfocytów B liczyła 9% przy 2B8 i 10% przy B1 lub Leu 16. Wyniki te potwierdzają podobieństwo tych odczynników.

PL 205 780 B1

T a b e l a 21

Porównanie wiązania 2B8 z ludzkimi limfocytami krwi obwodowej z innymi odczynnikami swoistymi dla limfocytów B i T

Marker przeciwciała
A. Barwienie pojedyncze	Odsetek bramkowanych limfocytów CD45
Brak (autofluorescencja)	0
B1-FITC (Coulter Immunology IgG2a, k)	11
Leu 16-FITC (Becton Dickinson, IgGl, k)	12
2B8-FITC (EDEC, IgG1, k)	14
B72.3-FITC (IgG1, K, kontrola)	4
Anty-CD4-FITC (Coulter Immunology)	37
Anty-CD3-FITC (Becton Dickinson)	59
Anty-CD19-RPE (Becton Dickinson)	11
Anty-CD19-FITC (Becton Dickinson)	14
B. Barwienie podwójne
B1-FITC/anty CD19-RPE	10
Leu16-FITC/anty CD19-RPE	10
2B8 FITC/anty CD19-RPE	9
Anty-CD19 FITC/anty CD19-RPE	13
B1-FITC/anty Hu Ig RPE	10
2B8-FITC/anty Hu Ig RPE	10
B72.3-FITC/anty Hu Ig RPE	2
Leucogate Simultest	99

W wyniku immunoprecypitacji wyznakowanego radiologicznie antygenu komórkowego CD20 przez 2B8 lub B1 uzyskano precypitację nierozróżnialnych dubletowych rodzajów białek o masie cząsteczkowej około 33 i 35 kD (dane nieprzedstawione).

2. Wytwarzanie i charakterystyka 2B8-MX-DTPA

Wytworzono koniugat 2B8-MX-DTPA poprzez poddanie reakcji przeciwciała z nadmiarem w stosunku molowym 4:1 kwasu izotiocyjanianobenzylo-3-metylodietyleno-triaminopentaoctowego (4). Typowo, wprowadzano 1-2 mole chelatu MX-DTPA na mol przeciwciała 2B8. Jak to ukazano w wynikach przedstawionych na fig. 4, koniugat 2B8-MTX-DTPA nie wykazywał widocznego spadku immunoreaktywności w stosunku do natywnego 2B8, jako że zarówno natywne, jak i sprzężone przeciwciała 2B8 wykazywały zupełnie identyczny profil hamowania B1: wartość IC50 dla 2B8 i 2B8-MTX-DTPA wynosiła, 125 odpowiednio, 3 i 4 μg/ml. Wyniki te uzyskano z zastosowaniem wyznakowanego I przeciwciała B1 w teście radioimmunologicznym na całych komórkach, wykonanym z użyciem komórek SB. Podobne

125 wyniki uzyskano stosując 2B8 lub 2B8-MTX-DTPA jako inhibitory wiązania 2B8 wyznakowanego ¹²⁵I 125 z komórkami SB; zarówno 2B8, jak i jego koniugat 2B8-MTX-DTPA hamowały wiązanie ¹²⁵I-2B8 z komórkami SB w stężeniu wynoszącym około 3-4 μg/ml (dane nieprzedstawione).

W celu oceny stabilności in vitro natywnego przeciwciała 2B8 i koniugatu 2B8-MTX-DTPA, inkubowano próbki w soli fizjologicznej lub soli zawierającej 10 mM glicyny-HCl, o pH 6,8, w temperaturze 4°C i 30°C przez 12 tygodni, i próbki oceniano co tydzień z zastosowaniem następujących testów: immunoreaktywność w teście immunologicznym enzymów w całej komórce, SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących, i elektroforeza żelowa z ogniskowaniem izoelektrycznym. O ile w testach immunoreaktywności nie stwierdzono zmniejszenia rozpoznawania antygenu przez próbki przeciwciał inkubowane przy obu wartościach temperatury (fig. 5), zakres ogniskowania izoelektrycznego dla przeciwciała (pH 7,30-8,40 w tygodniu zero), stabilny w temperaturze 4°C, wykazywał

PL 205 780 B1 zmniejszenie o 0,2 jednostki pH w temperaturze 30°C po tygodniu szóstym (tabela 22). Wynik ten może być jednak niejednoznaczny, ponieważ pozostaje w zakresie błędu doświadczalnego dla testu.

30

CN 00 1 ΙΓ) CN ID

r— CN X χ ϊΉ

LO 00 CO 1 en en LO

r— 04 00 1 σ Lf)

LO σ r- 1 Lf) co Lf)

CN en co 1 Lf) σ Lf)

ii—1 CN CO 1 ID 00 LO

00 Γ~ί 00 1 en en LD

on r“i OD 1 LO en LO

en rH CO 1 en σ Lf)

co ,—1 co 1 o σ Lf)

2Β8-ΜΧ

X h0 o

CO i tf) en LO

CO l o LO

r-ł

M

o

LO

CN

O

CN

LO

ŁO

LO

r-

LD

CM

CN

CM

00

m

CN

en

en

on

CN

CN

X

k

χ

CM

X

k

k

X

X

X

X

X.

k

X

co

CO

CO

X

co

co

co

co

co

00

co

co

CO

S

1

1

1

co

i

1

1

1

1

1

i

1

1

1

o

CN

CN

1

en

o

Lf)

Lf)

LD

on

CD

en

o

co

X

CO

CO

O

o

en

σ

00

σ

CO

en

CO

σ

σ

m

1-0

X

k

k

X»

X

k

k

X

X

X

X

k

CN

o

LO

CD

CD

LO

LO

Lf)

Lf)

Lf)

Lf)

LO

LO

Lf)

Lf)

O

en

CO

M

LO

Γ—

C—

LD

lf)

LO

[~~

OO

CN

en

en

00

CN

CN

en

on

CN

rH

k

..

CM

X

k

k

X

X

X

k

X

CO

OD

x

co

CO

CO

co

00

00

CO

CO

1

1

00

1

1

1

1

1

1

1

1

1

σι

CN

1

en

o

Lf)

LO

on

LO

en

o

00

en

O

o

en

σ

00

CO

en

en

σ

σ

m

<

k

k

X

X

k

k

X

X

X

k

CN

co

CO

co

LO

LO

Lf)

Lf)

Lf)

LO

LO

Lf)

Lf)

τ—ł

CD

o

CO

CN

Γ—

Lf)

LO

LO

io

Lf)

LD

sr

CM

CN

M

en

CM

m

CN

CN

en

on

en

CN

X

k

k

CM

X

k

k

X

X

X

X

k.

k

X

co

00

CD

χ

CO

co

CO

CO

co

CD

co

CO

CD

£

i

1

1

co

1

1

1

1

1

i

1

1

1

1

o

σι

X

1

en

o

Lf)

CN

LO

on

LO

en

o

00

P

co

co

o

o

en

σ

00

O

00

en

en

σ

σ

co

X

k

k

X

X

k

k

X

X

X

X

k

k

CN

co

LO

co

co

LO

ŁO

LO

Lf)

LD

Lf)

un

LO

Lf)

LO

m

«χ^

en

CO

CN

CN

px

o

r-

en

t—1

CN

00

CM

CM

en

rH

M

on

CM

rH

rN

k

X

X

X

*.

k

X

X

X

k

k

O

CO

00

CO

co

co

00

00

00

co

co

CO

en

1

1

t

i

1

1

1

1

1

1

1

LD

LO

00

co

Γ'

o

[~x

en

CD

σ

OD

X

M

00

00

en

CN

r-4

00

rH

1—i

CQ

XI

k

X

X

X

k

k

X

X

X

k

k

CN

o

Γ—

Γ—

r-

Γ-

Γ—

r-

fx

r-

r-

r-

Γ-

X

Γ-

rH

o

en

ιο

CN

r~

Lf)

LO

LO

r-

LO

ΟΟ

hO

ΟΟ

CO

CM

00

en

CN

CN

en

CM

on

Ϊ—ł

O

X

k

X

X

X

k

X

X

X

X

X

X

k

co

OD

σ>

00

co

00

CO

00

00

00

co

CO

co

m

i

1

l

I

i

1

f

1

1

i

i

i

1

LO

CD

LO

o

CD

Γ-

r-

Lf)

o

ϊ—1

CD

O

LD

Cl

co

m

*sF

fO

ΓΟ

CN

en

SJ*

CM

CN

EH

CO

X

k

X

X

X

k

X

X

X

X

X

X

k

O 1

CN

r—

r-

Γ-

Γ—

r—

r-

r-

Γ-Χ

Γ-

r-

r—

r-

fk.

1 PS

EH

r~

ST

LO

sr

Lf)

r-

CN

ΙΟ

LO

r-

r-

00

s

CN

óo

00

CM

CN

CN

en

m

CM

CM

,-1

1

k

X

x

X

k

X

X

X

X

X

X

k

co

O

co

co

co

CD

CO

co

00

00

CO

co

co

CO

ffl

CO

1

i

1

i

1

1

1

1

i

1

I

1

CN

CN

m

00

co

σ

o

Γ~

LD

MO

en

co

M

\

co

X

m

00

00

CN

CN

r-4

CN

OM

Γ—1

t—1

O

CO

CO

<

X

x

X

X

X

X

X

X

X

k

PQ

CN

co

r—

r—

Γ-

r—

Γ-

r-

r-

Γ-

Γ-

r-

Γ-

Γ-

CN

H

X!

Γ-

m

r-

•LO

lD

CN

CN

σ

όη

r-

r-

ΟΟ

O,

ΟΟ

CN

CM

00

CM

CN

r-f

en

CN

LO

CM

CM

rH

CO

X

k

X

X

X

k

X

X

X

X

X

X

k

o

co

CO

co

eo

co

co

CO

00

CD

oo

CD

CO

00

•H

<P

1

1

i

i

i

1

1

1

i

1

1

i

1

β

LO

oc

co

r-

co

σ

«sr

σ

(O

en

LO

o

LD

CN

rc5

co

sr

en

co

00

CN

CN

en

Γ0

CM

CN

CN

3

co

X

k

X

X

X

k

X

X

X

χ

**

X

k

0

CN

Γ—

ο-

r-

r-

r-

r-

r-

r~

Γ-

[—

Γ-

Γ-

(ϋ

e

,—i

s

0)

w

X)

Ό

Π3

O

'£

H

CL

0)

•H

N

Ό

>

o

rM

CN

o

χ

CM

(Ό

ST

LO

LD

r-

ΟΟ

en

rH

rM

PL 205 780 B1

Sporządzono próbki natywnego 2B8 i 2B8-MX-DTPA w różnych buforach i inkubowano w temperaturze 40 lub 30°C przez 12 tygodni. W tym czasie przeprowadzono wiele testów, w tym znaczenie punktu izoelektrycznego. Powyższe wartości ukazują zakres punktu izoelektrycznego dla natywnego i sprzężonego przeciwciała, inkubowanego w każdej z temperatur, w każdym z preparatów, i dla każdego z 12 tygodni w czasie badania stabilności. Nagłówki oznaczają: 2B8 4 SAL - 2B8 inkubowane w temperaturze 4°C w soli fizjologicznej; 2B8 30 SAL - 2B8 inkubowane w temperaturze 30°C w soli fizjologicznej; 2B8 4 GLY - 2B8 inkubowane w temperaturze 4°C w soli fizjologicznej zawierającej 10 mM glicyny; 2B8 30 GLY - 2B8 inkubowane w temperaturze 30°C w soli fizjologicznej zawierającej 10 mM glicyny; 2B8-MX 4 SAL - 2B8-MX-DTPA (koniugat) inkubowany w temperaturze 4°C w soli fizjologicznej; 2B8-MX 30 SAL - koniugat inkubowany w temperaturze 30°C w soli fizjologicznej; 2B8-MX 4 GLY koniugat inkubowany w temperaturze 4°C w soli fizjologicznej zawierającej 10 nM glicyny, i 2B8-MX 30 GLY - koniugat inkubowany w temperaturze 30°C w soli fizjologicznej zawierającej 10 nM glicyny.

I wreszcie, przy zastosowaniu nieredukującej SDS-PAGE, próbki przeciwciał w temperaturze 30°C wykazywały obecność agregatów o dużej masie cząsteczkowej po tygodniu 1 (tabela 23). Analiza densytometryczna żeli wykazała, że agregaty stanowiły od 8 do 17% próbek (tabela 23). Jednakże przy analizie tych próbek przez redukcję SDS-PAGE, nie stwierdzono obecności cząstek o dużej masie cząsteczkowej, sugerujących tworzenie się agregatów przeciwciał kowalencyjnych w temperaturze 30°C. Tu również nie obserwowano zmniejszenia immunoreaktywności.

T a b e l a 23 Stabilność 2B8 in vitro

A. Obrazy densytometryczne nieredukujących żeli SDS

Próbka	Odsetek
Duża m. cz.	Monomer	Mała m. cz.
Odnośnik	0	100,00	0
12 tyg. (4°C) sól fizjologiczna	0	95,42	4,58
12 tyg. (4°C) glicyna	0	100,00	0
12 tyg. (30°C) sól fizjologiczna	7,63	83,34	9,03
12 tyg. (30=C) glicyna	16,70	72,11	11,18

B. Obrazy densytometryczne redukujących żeli SDS

Próbka	Odsetek
Duża m. cz.	Monomer	Mała m. cz.
Odnośnik	0	100,00	0
12 tyg. (30°C) sól fizjologiczna	0	100,00	0
12 tyg. (30°C) glicyna	0	10,00	0

W czasie tego badania stabilności próbki 2B8-MX-DTPA, inkubowano zarówno w temperarze 4°C, jak i 30°C, badano również pod kątem włączania metali radioaktywnych z zastosowaniem ⁹⁰Y. Próbki badane w tygodniach 4, 8 i 12 włączyły >90% ⁹⁰Y, niezależnie od temperatury inkubacji.

I wreszcie, w odrębnym badaniu, próbki 2B8-MX-DTPA, inkubowanego w temperaturze 4°C i 30°C przez 10 tygodni, wyznakowano radioaktywnie ¹¹¹In i oceniano ich biodystrybucję w tkance u myszy BALB/c. Koniugaty z obu temperatur inkubacji dały w wyniku podobną biodystrybucję (dane nieprzedstawione). Ponadto uzyskane wyniki były podobne do wyników biodystrybucji, uzyskanych u myszy BALB/c z zastosowaniem koniugatu wyznakowanego ¹¹¹I, przechowywanego w temperaturze 4°C (zobacz niżej).

111 90

Stwierdzono, że protokoły znakowania radioaktywnego zarówno dla ¹¹¹I, jak i ⁹⁰Y, były odtwa111 90 rzalne. Typowo uzyskano włączenie znacznika radioaktywnego >95% dla ¹¹¹I i >90% dla ⁹⁰Y. Swoista 111 90 aktywność dla koniugatów wyznakowanych ¹¹¹I i ⁹⁰Y pozostawała rutynowo w zakresie, odpowiednio, 2-3 i 10-15 mCi/mg przeciwciała. W początkowym rozwoju protokołów znakowania radioaktywnego

PL 205 780 B1

111 90 ¹¹¹I i ⁹⁰Y, z wyznakowanych radioaktywnie 2B8-MX-DTPA usunięto niepołączone w kompleksy radioizotopy z zastosowaniem chromatografii żelowej permeacyjnej HPLC. W późniejszych doświadczeniach wyeliminowano oczyszczanie HPLC koniugatu znakowanego indem z uwagi na duże (>95%) włączanie znacznika radioaktywnego, uzyskiwane przy zastosowaniu tego izotopu.

Immunoreaktywność preparatów 2B8-MX-DTPA, wyznakowanych ¹¹¹I i ⁹⁰Y, analizowano metodą Lindmo (3). Stwierdzono, że 2B8-MX-DTPA wyznakowany ¹¹¹In jest 100% immunoreaktywny (fig. 6), a koniugat wyznakowany ⁹⁰Y jest 60% immunoreaktywny (dane nieprzedstawione).

3. Charakterystyka 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ¹¹¹I i ⁹⁰Y

Doświadczenia wstępne z koniugatem wyznakowanym ⁹⁰Y wykazały, że do istotnego rozpadu przeciwciał i zmniejszenia immunoreaktywności dochodzi przy swoistej aktywności >10 mCi/mg przeciwciała. Tak więc opracowano preparat służący minimalizacji wpływu radiolizy. Oceniano liczbę wymiataczy wolnych rodników o małej masie cząsteczkowej i stwierdzono, że najbardziej skuteczna w zakresie zachowania integralności i immunoreaktywności przeciwciał była ludzka albumina surowicy (HSA) w dużym stężeniu (fig. 7-9).

Przeciwciało wyznakowane ⁹⁰Y wytworzono w 1 x PBS, pH 7,4, zawierającym 75 mg/ml HSA; dodano również kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) do końcowego stężenia 1 mM, aby zapewnić, że wszystkie atomy ⁹⁰Y, które mogłyby odłączyć się od przeciwciał, ulegną chelatacji. Oceniano rozpad 2B8-MX-DTPA, wyznakowanego radiologicznie do aktywności swoistej 14,6 mCi/mg, w 0 i 48 godzin, stosując SDS-PAGE i autoradiografię. Fig. 8 i 9 ukazują, że przeciwciało wyznakowane radioaktywnie nie wykazywało istotnego rozpadu przez czas 48 godzin po inkubacji w temperaturze 4°C. Analiza z zastosowaniem natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej wykazała, że utrata ⁹⁰Y wynosiła mniej niż 2% w czasie 48 godzinnej inkubacji (tabela 24). Immunoreaktywność była również względnie stała przy 60% (tabela 24).

T a b e l a 24

Stabilność ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA w postaci preparatu do stosowania klinicznego

Czas (godzin w temperaturze 4°C)	Odsetek radioaktywności związanej z koniugatem	Odsetek immunoreaktywności
0	97,2	62
24	96,2	60
48	96,2	60

Z wyznakowanego radioaktywnie koniugatu (14,6 mCi/mg aktywności swoistej) wytworzono preparat w PBS, pH 7,4, zawierający 75 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy i 1 MM DTPA i próbki inkubowano w temperaturze 4°C. Stabilność koniugatu analizowano w punktach czasowych, wyznaczonych przez SDS-PAGE i autoradiografię, chromatografię cienkowarstwową i test wiązania całych komórek. Wyniki wykazują, że około 96% metalu radioaktywnego pozostało związane z koniugatem po 48 godzinach w temperaturze 4°C, i że immunoreaktywność przeciwciała pozostała stała na poziomie około 60%.

111

Przeprowadzono również badania z wytworzeniem preparatu z koniugatu wyznakowanego ¹¹¹In; aktywność swoista wynosiła 2,2 mCi/mg. Wyznakowane przeciwciało oceniano w 1X PBS, pH 7,4, zawierającym 50 mg/ml HSA. Fig. 10 przedstawia zdjęcia autoradiogramów dla czasu zero i dla próbek inkubowanych przez 48 godzin: analiza densytometryczna autoradiogramów wskazuje, że nie doszło do rozpadu wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała w czasie trwania badania (fig. 11, 12). Natychmiastowa analiza technika chromatografii cienkowarstwowej próbek wykazała nieobecność zmniejszenia się poziomu ¹¹¹In (tabela 25); ponadto immunoreaktywność utrzymywała się na poziomie około 100% (tabela 25).

Tabela 25

Stabilność ¹¹¹In-2B8-MX-DTPA w postaci preparatu do stosowania klinicznego

Czas (godzin w temperaturze 4°C)	Odsetek radioaktywności związanej z koniugatem	Odsetek immunoreaktywności
0	94,0	105
24	96,5	104
48	96,0	100

PL 205 780 B1

Z wyznakowanego radioaktywnie koniugatu (2,2 mCi/mg aktywności swoistej) wytworzono preparat w PBS, pH 7,4, zawierający 50 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy i 1 MM DTPA i próbki inkubowano w temperaturze 4°C. Stabilność koniugatu analizowano w SDS-PAGE i przez autoradiografię, chromatografię cienkowarstwową i test wiązania całych komórek. Wyniki wykazują, że około 96% znacznika radioaktywnego pozostało związane z koniugatem po 48 godzinach w temperaturze 4°C, i że immunoreaktywność przeciwciała pozostała stała na poziomie około 100%.

Przy inkubacji preparatu 2B8-MX-DTPA do zastosowania klinicznego, wyznakowanego radiologicznie ⁹⁰Y do aktywności swoistej 14,6 mCi/mg, przez 96 godzin w temperaturze 37°C w surowicy ludzkiej i analizie przez nieredukującą SDS-PAGE i autoradiografię, w czasie inkubacji utracono mniej niż 4% radioizotopu. Obrazy densytometyczne autoradiogramów w czasie 0 i 96 h nie wykazywały znamiennego rozpadu koniugatu wyznakowanego radioaktywnie (fig. 13-15). Wyniki te potwierdzono analizami metodą analitycznej chromatografii cienkowarstwowej próbek z czasu zero i po 96 h inkubacji (tabela 26). W sumie wyniki te sugerują, że koniugat wyznakowany itrem jest stabilny w warunkach stosowanych w tym badaniu. Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu koniugatu 2B8-MX-DTPA, wyznakowanego ¹¹¹In (fig. 16-18).

T a b e l a 26

Analiza metodą analitycznej chromatografii cienkowarstwowej koniugatu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA, inkubowanego w surowicy ludzkiej przez 96 godzin w temperaturze 37°C

Czas (godziny) w temperaturze 37°C	Odsetek radioaktywności związanej z koniugatem
0	95,1
24	95,2
48	93,2
72	92,0
96	91,4

Próbki surowicy ludzkiej, zawierające ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA (aktywność swoista 14,6 mCi/mg) analizowano w punktach czasowych, wyznaczonych przez nałożenie kropli 1 μl rozcieńczenia próbek w stosunku 1:20 na paski natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej; próbki analizowano w trzech egzemplarzach. Paski chromatograficzne rozwinięto poprzez chromatografię wstępującą w 10% roztworze octanu amonowego w metanolu:wodzie (1:1, % obj.), wysuszono i przecięto na pół w poprzek. Następnie oznaczono radioaktywność związaną z górną i dolną połową każdego paska i obliczono odsetek radioaktywności związanej z koniugatem (wolne cząstki metalu radioaktywnego migrują z frontem rozpuszczalnika, natomiast radioaktywność związana z białkami pozostaje w punkcie wyjścia). Przedstawiono średnią każdego oznaczenia radioaktywności związanej z koniugatem.

B. Badania na zwierzętach

1. Badania właściwości farmakologicznych/toksykologicznych dużych dawek 2B8 i 2B8-MX-DTPA

W badaniu GLP, przeprowadzonym w Ośrodku Badawczym White Sands (nr badania 920111), makakom podawano dożylne wstrzyknięcia różnych dawek 2B8. Przed każdym wstrzyknięciem pobierano próbki krwi i krew poddawano obróbce celem oceny cytometrii przepływowej populacji limfocytów (tabela 27).

T a b e l a 27

Populacje limfocytów B Naczelnych, oznaczone cytometrią przepływową, po wlewie mysiego przeciwciała monoklonalnego 2B8 anty-CD20

	Nr zwierzęcia	Dawka	Dzień	Limfocyty Ba,b	% zmniejszenia
1	2	3	4	5	6
Grupa I	452	Sól fizjologiczna	0	20,1	0
			1	18,3	9
			7	21,6	0
			13	14,6	27
			38	15,5	23
			52	18,6	7

PL 205 780 B1 cd. tabeli 27

1	2	3	4	5	6
	424	Sól fizjologiczna	0	12,4	0
			1	11,6	6
			7	11,2	10
			13	8,4	32
			38	7,7	38
			52	13,1	0
Grupa II	540	0,6 mg/kg	0	13,1	0
			1	7,1	54
			7	6,0	63
			13	5,7	65
			38	10,8	33
	804	0,6 mg/kg	0	17,6	0
			1	8,3	53
			7	6,1	65
			13	6,6	62
			38	5,1	71
			52	5,2	68
Grupa III	701	2,5 mg/kg	0	21,6	0
			1	10,7	50
			7	3,0	86
			13	10,7	50
	754	2,5 mg/kg	0	19,9	0
			1	11,2	44
			7	10,5	47
			13	9,0	55
Grupa IV	782	10 mg/kg	0	15,9	0
			1	3,0	81
			7	3,5	78
			13	6,5	59
	164	10 mg/kg	0	17,7	0
			1	8,4	47
			7	7,9	50
			13	7,7	42
Grupa V	705	10 mg/kg	0	17,2	0
			1	5,2	70
			7	1,3	69
			13	8,2	52
			38	17,1	1
			52	13,3	22

PL 205 780 B1 cd. tabeli 27

1	2	3	4	5	6
	716		0	34,7	0
			1	18,6	46
			7	8,1	77
			13	3,5	90
			38	6,9	80
			52	9,2	61

^aodsetek całkowitej liczby limfocytów ^bpopulacja limfocytów B, oceniana ilościowo podwójnie barwionymi odczynnikami znacznikowymi skierowanymi przeciwko mysim IGG-RPE + ludzkim IG-FITC (przeciwciało skierowane przeciwko mysiej IgG RPE wykrywa CD20 zablokowane 2B8, a przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiej IgG FITC wykrywa Ig powierzchniowe limfocytów b myszy).

Zwierzętom z grup I-IV wykonywano wstrzyknięcia co 48 godzin - w sumie siedem wstrzyknięć; zwierzętom w grupie V wykonano jedno wstrzyknięcie w dniu 0. Zwierzęta z grup III i IV uśmiercono w dniu 14.

Nie odnotowano żadnych znamiennych działań farmakotoksycznych, związanych z podawaniem przeciwciała 2B8 anty-CD20, w odniesieniu do żadnego parametru klinicznego, ocenianego w trakcie badania lub po jego zakończeniu. Podobnie, nie stwierdzono nieprawidłowości w czasie analizy różnych próbek histopatologicznych, pobranych od zwierząt z grup III i IV.

Czas trwania badania wynosił 14 dni i zwierzęta oceniano w czasie badania w następujących kategoriach: obserwacja kliniczna, masa ciała, temperatura ciała, przyjmowanie pokarmu i wody, wydalanie stolca, wyniki badań biochemicznych surowicy krwi, morfologii krwi obwodowej, badania ogólnego moczu i badania fizykalnego. Dodatkowo, od zwierząt z każdej grupy pobierano próbki krwi w dniach 0, 1, 7 i 13 i krew analizowano pod katem poziomu przeciwciał (2B8) i limfocytów T i B w surowicy. W dniu 13 zwierzęta z grup III i IV uśmiercono i badano wybrane tkanki w mikroskopie świetlnym po sporządzeniu preparatu z próbki. Oceniano następujące tkanki: serce, śledzionę, wątrobę, nerki, płuca, korę mózgu, rdzeń kręgowy, węzły chłonne, żołądek, jelito kręte, okrężnicę, mięśnie szkieletowe, jądra/jajniki, trzustkę i szpik kostny.

W analizie krwi od zwierząt leczonych pod kątem poziomu krążących limfocytów B i T, zwierzęta z grup II-V wykazywały >50% zmniejszenie poziomu krążących limfocytów B do dnia 13 (fig. 19); podawanie przeciwciał nie wywierało wpływu na poziom limfocytów T (dane nieprzedstawione). We wszystkich grupach otrzymujących 2B8 stwierdzano nasycenie limfocytów B i nadmiar przeciwciał w osoczu (nie przedstawiono). Zwierzęta z grupy V, które otrzymały pojedynczą dawkę 10 mg/kg 2B8, również wykazywały zmniejszenie poziomu krążących limfocytów B, równe zmniejszeniu obserwowanemu u zwierząt z pozostałych grup.

Zwierzęta z grup I, II i V badano do dnia 52 (fig. 20). Poziom limfocytów B powrócił do >70% normy do dnia 38, z wyjątkiem jednego zwierzęcia w grupie II (PRO804) i jednego zwierzęcia w grupie V (PRO716). Poziom krążących limfocytów B u tych zwierząt pozostawał na poziomie około 40% normy po 52 dniach.

Oprócz tego badania oceniano działanie farmakotoksyczne ⁸⁹Y-2B8-MX-DTPA u makaków w badaniu GLP, przeprowadzonym w Ośrodku Badawczym White Sands (nr badania 920611). Koniugat o czystości odpowiedniej do badań klinicznych nałożono na nieradioaktywne ⁸⁹Y. Z koniugatu obciążonego itrem wytworzono preparat w PBS o pH 6,8, zawierający 75 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA (preparat kliniczny) i podawano go dożylnie, jak to opisano w rozdziale „Metody”.

Jak to przedstawiono w wynikach z fig. 21, wyznakowany ⁸⁹Y 2B8-MX-DTPA wywierał niewielki wpływ, lub w ogóle nie wywierał wpływu, na krążące limfocyty B u tych zwierząt, niezależnie od podawanej dawki. Ponadto poza ogólnym zmniejszeniem liczby limfocytów (20-43%), nie stwierdzono istotnych nieprawidłowości w odniesieniu do żadnego z badanych parametrów klinicznych, włączając w to badania biochemiczne surowicy, badanie ogólne moczu, masę ciał i temperaturę.

2. Badania farmakokinetyczne z 2B8 i 2B8-MX-DTPA

Jak to opisano powyżej, zwierzęta w grupie V badania GLP otrzymały jedną dawkę 10,0 mg/kg 2B8. Analiza danych metodą regresji liniowej sugeruje, że natywne przeciwciało zostało wyeliminowane z krążenia tych małp z wartością β ty wynoszącą około 4,5 dnia. W podobnym badaniu z użyciem myszy BALB/c, wartość β ty dla natywnego i sprzężonego 2B8, oznaczona metodą analizy regresji

PL 205 780 B1 liniowej (nie przedstawiono) wynosiła 8,75 dnia (fig. 22). Wyniki te sugerują, że sprzężenie 2B8 nie wywierało wpływu na jego eliminację z organizmu myszy BALB/c.

3. Badania dystrybucji biologicznej i umiejscowienia guza z użyciem wyznakowanego radiologicznie 2B8-MX-DTPA

W oparciu o wstępne doświadczenia dotyczące dystrybucji biologicznej, opisane powyżej (rozdział 2d), sprzężone 2B8 wy znakowano radiologicznie ¹¹¹In do aktywności swoistej 2,3 mCi/mg i około 1,1 pCi wstrzyknięto każdej z dwudziestu myszy BALB/c w celu określenia dystrybucji biologicznej materiału wyznakowanego radioaktywnie. Następnie uśmiercono grupy po pięć myszy po 1, 24, 48 i 72 godzinach i ich narządy i części skóry, mięśni i kości usunięto i poddano obróbce celem analizy. Ponadto pobrano próbki moczu i kału i analizowano je dla punktów czasowych 24-72 godzin. Poziom radioaktywności we krwi zmniejszył się z 40,3% wstrzykniętej dawki na gram po 1 godzinie do 18,9% po 72 godzinach (tabele 1-4; fig. 23). Wartość dla serca, nerek, mięśni i śledziony pozostawała w zakresie 0,7-9,8% przez cały czas trwania doświadczenia. Poziom radioaktywności w płucach zmniejszył się z 14,2% po 1 godzinie do 7,6% po 72 godzinach; podobnie odpowiednie wartości wstrzykniętej dawki na gram wynosiły 10,3 i 9,9%. Dane te zastosowano do oznaczania szacunkowej dawki pochłoniętego promieniowania ¹¹¹In-2B8-MX-DTPA (tabela 19).

Oceniano dystrybucję biologiczną koniugatu wyznakowanego ⁹⁰Y o aktywności swoistej 12,2 mCi/mg przeciwciała u myszy BALB/c. Uzyskano ponad 90% włączenie radioaktywności i wyznakowane radioaktywnie przeciwciało oczyszczano w HPLC. Oceniano odkładanie się radioaktywności w najważniejszych narządach oraz w skórze, mięśniach, kościach, moczu i kale w czasie 72 godzin i wyrażono je jako odsetek wstrzykniętej dawki/g tkanki. Wyniki przedstawione w tabelach 5-8 i na fig. 24 dowodzą, że podczas gdy poziom radioaktywności związanej z krwią zmniejszył się z około 39,2% wstrzykniętej dawki na gram po 1 godzinie do około 15,4% po 72 godzinach, to poziom radioaktywności związanej z ogonem, sercem, nerkami, mięśniami i śledzioną pozostał w zasadzie stały na poziomie 10,2% lub mniej przez cały czas trwania doświadczenia. Co istotne, radioaktywność związana z kośćmi wynosiła od 4,4% wstrzykniętej dawki na gram kości po 1 godzinie do 3,2% po 72 godzinach. W sumie wyniki te sugerują, że niewielka ilość itru była połączona z koniugatem, i że niewielka ilość wolnego metalu radioaktywnego uwalniała się w trakcie badania. Dane te zastosowano do oznaczania szacunkowej pochłoniętej dawki promieniowania dla ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA.

Do badań umiejscowienia guzów, wytworzono 2B8-MX-DTPA i wyznakowano ¹¹¹In do aktywności swoistej 2,7 mCi/mg. Następnie wstrzyknięto 100 pl wyznakowanego koniugatu (około 24 pCi) każdej z 12 myszy bez grasicy z guzami Ramos z limfocytów B. Masa guzów wynosiła od 0,1 do 1,0 grama. W punktach czasowych 0, 24, 48 i 72 godziny po wstrzyknięciu usuwano 50 pl krwi przez nakłucie za oczodołem, myszy uśmiercano przez zwichnięcie kręgów szyjnych i usuwano ogon, serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, mięśnie, kość udową i guz. Po obróbce i zważeniu tkanek oznaczano radioaktywność związaną z poszczególnymi próbkami tkanek z zastosowaniem licznika gamma i wartości wyrażano w postaci odsetka wstrzykniętej dawki na gram.

Wyniki (fig. 25) dowodzą, że w czasie trwania doświadczenia stężenie ¹¹¹In-2B8-MX-DTPA w guzach rosło w sposób stabilny. Po 72 godzinach w guzie kumulowało się 13% wstrzykniętej dawki. Poziom we krwi, przeciwnie, spadał w czasie doświadczenia z ponad 30% w czasie zero do 13% po 72 godzinach. Wszystkie inne tkanki (z wyjątkiem tkanki mięśniowej) zawierały od 1,3 do 6,0% wstrzykniętej dawki na gram tkanki na koniec doświadczenia; tkanka mięśniowa zawierała około 13% wstrzykniętej dawki na gram.

C. Dozymetria

Sumaryczne dane dozymetryczne, pochodzące z badań nad dystrybucją biologiczną u zdrowych myszy BALB/c, przedstawione w tabelach 19 i 20, dla, odpowiednio, koniugatów wyznakowanych indem i itrem, pozostają w zgodności z danymi przedstawionymi w piśmiennictwie przy porównaniu na milikiur wstrzykniętej dawki (5) i sugerują, że koniugaty 2B8, wyznakowane zarówno itrem, jak i indem, można bezpiecznie oceniać pod kątem skuteczności klinicznej u chorych z chłoniakami.

D. Toksykologia

1. 2B8: badanie ogólnego bezpieczeństwa pojedynczej dawki

Myszom i świnkom morskim podano dootrzewnowo pojedynczą dawkę 2B8 (odpowiednio, 0,5 ml lub 5,0 ml) i obserwowano je przez 7 dni. Nie stwierdzono jawnych objawów toksycznego działania.

2. 2B8 i 2B8-MX-DTPA: badania immunohistochemiczne z tkankami ludzkimi

Oceniano reaktywność tkankową mysiego przeciwciała monoklonalnego 2B8 z zastosowaniem zestawu 32 różnych tkanek ludzkich, utrwalonych acetonem. Przeciwciało 2B8 reaguje z antygenem

PL 205 780 B1 anty-CD20, które ma bardzo ograniczony wzorzec dystrybucji tkankowej, i obserwuje się je tylko w podgrupie komórek w tkankach limfoidalnych, także pochodzenia krwiotwórczego.

W węźle chłonnym immunoreaktywność obserwowano w populacji dojrzałych korowych limfocytów B, jak również komórek proliferujących w ośrodkach rozrodczych. Dodatnią reaktywność obserwowano również we krwi obwodowej, obszarach limfocytów B w migdałkach, białej miazdze śledziony i w 40-70% limfocytów rdzeniowych w grasicy. Dodatnią reaktywność obserwowano również w kryptach blaszki właściwej (kępkach Peyera) jelita grubego. I wreszcie, agregaty, czyli rozproszone komórki limfoidalne w zrębie różnych narządów, takich jak pęcherz moczowy, sutek, szyjka macicy, przełyk, płuca, ślinianki przyuszne, gruczoł krokowy, jelito cienkie i żołądek, były również dodatnie w reakcji na przeciwciało 2B8.

Wszystkie komórki nabłonka jednowarstwowego, jak również nabłonka wielowarstwowego i płaskiego różnych narządów, okazały się niereaktywne. Podobnie, nie obserwowano reaktywności dla komórek neuroektodermalnych, w tym komórek mózgu, rdzenia kręgowego i nerwów obwodowych. Elementy mezenchymy, takie jak komórki mięśni szkieletowych i gładkich, fibroblasty, komórki śródbłonka i wielojądrzaste komórki zapalne, również okazały się ujemne.

Reaktywność tkankową koniugatu 2B8-MX-DTPA oceniano z zastosowaniem zestawu szesnastu tkanek ludzkich, utrwalonych w acetonie. Jak to uprzednio wykazano dla przeciwciała natywnego, koniugat 2B8-MX-DTPA rozpoznawał antygen CD20, wykazujący wysoce ograniczony wzorzec dystrybucji, jako że wykrywano go jedynie w podgrupie komórek pochodzenia limfoidalnego. W węźle chłonnym immunoreaktywność obserwowano w populacji limfocytów B. Silną reaktywność stwierdzano w białej miazdze śledziony i w limfocytach rdzeniowych grasicy. Immunoreaktywność obserwowano również w rozproszonych limfocytach w pęcherzu moczowym, sercu, jelicie grubym, wątrobie, płucach i macicy, i przypisano ją obecności komórek zapalnych w tych tkankach. Jak to opisano dla przeciwciała natywnego (powyżej), nie obserwowano reaktywności dla komórek neuroektodermalnych ani dla elementów mezenchymy.

III. Omówienie

Mysie monoklonalne przeciwciało 2B8 anty-CD20, wytwarzane przez klon o tym samym oznaczeniu, wykazuje powinowactwo do antygenu CD20 limfocytów B, które może być wyższe, niż obserwowane dla przeciwciała B1, jak to stwierdzono testami współzawodnictwa z zastosowaniem przeciwciał o znanej swoistości dla antygenu CD20, i analizą Scatcharda. Ponadto dane z immunoprecypitacji sugerują, że antygen strącany przez 2B8 wydaje się tym samym antygenem, co strącany przez B1, jako że oba przeciwciała strącają dublet o względnej masie cząsteczkowej 33 i 35 kD. Analiza cytofluorograficzna swoistości przeciwciała 2B8 dla limfocytów krwi obwodowej wykazuje, że przeciwciało reaguje swoiście z limfocytami B i nie wykazuje reaktywności z limfocytami T ani innymi typami limfocytów. Wreszcie, wstępne dane na temat stabilności wskazują, że przeciwciało jest stabilne w temperaturze 30°C przez 12 tygodni bez utraty immunoreaktywności.

Po sprzężeniu przeciwciała 2B8 z kwasem metylobenzylodietylenotriaminopentaoctowym (MX-DTPA), nie stwierdzano absolutnie żadnego zmniejszenia immunoreaktywności, w stosunku do przeciwciała natywnego. Ponadto znakowanie radioaktywne koniugatu ¹¹¹In lub ⁹⁰Y dało wyznakowane koniugaty o immunoreaktywności, odpowiednio, 100% i 60%. Badania stabilności koniugatów wyznakowanych ¹¹¹In lub ⁹⁰Y, inkubowanych w surowicy ludzkiej przez 96 godzin w temperaturze 37°C wskazują na pomijalną utratę metalu radioaktywnego w czasie badania, co sugeruje, że koniugaty będą stabilne po zastosowaniu klinicznym.

Badania umiejscowienia guza u myszy bez grasicy z zastosowaniem wyznakowanego indem preparatu 2B8-MX-DTPA, wykazały, że do komórek guza w czasie trwania badania przyłączało się coraz więcej koniugatu, bez nienormalnego gromadzenia w innych tkankach. Ponadto, szacunkowe dane dozymetryczne z badań dystrybucji biologicznej pozostają w zgodności z danymi publikowanymi w piśmiennictwie. I wreszcie, badania reaktywności krzyżowej tkanek ludzkich z przeciwciałami natywnymi i sprzężonymi wskazują, że oba przeciwciała rozpoznają antygen z wysoce ograniczoną dystrybucją tkankową, reagując jedynie z podgrupą komórek w tkankach limfoidalnych, w tym także pochodzenia krwiotwórczego. Wyniki te razem sugerują, że sprzężenie nie zmienia swoistości tkankowej przeciwciała, i że wyznakowane radioaktywnie koniugaty są stabilne in vitro i rozpoznają antygen CD20 obecny na powierzchni guzów, uzyskanych doświadczalnie u myszy bez grasicy.

Przy stosowaniu 2B8 w badaniach właściwości farmakologicznych/toksykologicznych wysokich dawek, przeciwciało nie powodowało żadnego istotnego działania farmakotoksycznego w odniesieniu do żadnego z ocenianych parametrów, ani w czasie badania, ani po jego zakończeniu. Podobnie, nie

PL 205 780 B1 zaobserwowano nieprawidłowości w czasie analizy różnych próbek histopatologicznych, badanych w mikroskopii świetlnej. Nieoczekiwanie wszystkie zastosowane dawki przeciwciała spowodowały zaznaczone zmniejszenie poziomu krążących limfocytów B. Poziom krążących limfocytów B powracał jednak do poziomu w przybliżeniu prawidłowego po zaprzestaniu podawania przeciwciał. W grupie małp, które otrzymały pojedynczą dawkę (Grupa V), przeciwciało natywne ulegało usunięciu z krążenia, przy czym widoczna wartość β ty₂ wynosiła około 4,5 dnia. Zgodnie z przewidywaniami, gdy to badanie farmakokinetyczne przeprowadzono u myszy BALB/c, przeciwciało 2B8 ulegało usunięciu z krążenia z wartością β ty₂ 8,75 dnia. Tak więc dane te w sumie wskazują, że przeciwciało natywne może również spowodować pewne działanie kliniczne przy podawaniu jako dodatek do koniugatów wyznakowanych radioaktywnie.

W sumie nasze dane wskazują, że przeciwciało wysokiego powinowactwa 2B8 i jego koniugat MX-DTPA wykazują ograniczony wzorzec reaktywności w tkance ludzkiej. Ponadto u Naczelnych przeciwciało natywne jest nietoksyczne i powoduje przejściowe usuwanie limfocytów B; jednakże po usunięciu przeciwciała z krążenia poziom limfocytów B dość szybko wraca do normy. Dodatkowo koniugaty 2B8-MX-DTPA, wyznakowane indem i itrem, okazały się stabilne in vitro, nie wykazując zmniejszenia ilości metalu radioaktywnego w czasie długotrwałej inkubacji w surowicy ludzkiej. Wreszcie szacunki dawek promieniowania, pochodzące z dystrybucji biologicznej 2B8-MX-DTPA wyznakowanych ⁹⁰Y lub ¹¹¹In u myszy BALB/c, pozostają w zgodności, na milikiur wstrzykniętej dawki, z szacunkami dawki pochodzącymi z badań klinicznych u ludzi z zastosowaniem sprzężonych przeciwciał przeciwstawnego idiotypu, wyznakowanych radioaktywnie tymi izotopami.

IV. Podsumowanie rozwoju przedklinicznego protokołu znakowania radioaktywnego „mix-&-shoot” do wytwarzania ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA

A. Wprowadzenie

Wyznakowane ⁹⁰Y mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD20 (2B8) oceniano w badaniu klinicznym fazy I w leczeniu nawrotu chłoniaka z limfocytów B. W oryginalnym protokole, stosowanym do wytwarzania przeciwciała wyznakowanego itrem, zastosowano etap chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) do usunięcia radioizotopu niezwiązanego z białkami przed wytworzeniem preparatu i podaniem go pacjentom. Niestety proces ten jest szczególnie czasochłonny, powodując dłuższą ekspozycję przeciwciała na radioizotop w stanie niezabezpieczonym. Powoduje to zwiększenie radiolizy przeciwciała z jednoczesnym zmniejszeniem immunoreaktywności. Dodatkowo duża pracochłonność procesu utrudnia wytworzenie więcej niż jednej dawki dziennie w aptece radiologicznej. Uproszczenie procesu przyspieszyłoby zastosowanie w ośrodku klinicznym, zamiast korzystania z usług NIPI Pharmacy Services jako apteki radiologicznej.

Zgodnie z tym opracowano zmodyfikowaną procedurę znakowania radioaktywnego, zwaną metodą „mix-and-shoot” („zmieszaj i wstrzykuj”), umożliwiającą ominięcie konieczności wykonania oczyszczania HPLC przy utrzymaniu wysokiego stopnia włączania znacznika radioaktywnego i ulepszonego zachowywania immunoreaktywności. Badania stabilności in vitro, jak również badania dystrybucji biologicznej u myszy wykazały, że przeciwciało wyznakowane radioaktywnie, wytworzone z zastosowaniem metody „mix-and-shoot”, jest porównywalne z materiałem wytwarzanym z zastosowaniem obecnych procesów HPLC. Wyniki tych badań przedklinicznych wskazują, że ten nowy protokół „mix-and-shoot” można stosować do wytwarzania 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, odpowiedniego do zastosowania w badaniach klinicznych.

B. Materiały i metody

Materiały

1. Komórki

Ludzkie komórki linii limfoblastycznej S.C. (CD20-dodatnie) i HSB (CD20-ujemne) uzyskano z American Type Culture Collection i przechowywano w RPMI-1640, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i uzupełnionym glutaminą.

2. Przeciwciała

Przeciwciało 2B8 oczyścił Wydział Wytwarzania z nadsączu bioreaktora włókien kapilarnych, stosując sposób uprzednio opisany w IND (BB-IND 4850/4851).

3. Dodatkowe odczynniki

Chlorek itru-[90] nabyto w firmie Amersham. Wszystkie inne odczynniki uzyskano ze źródeł opisanych w cytowanych poniżej załączonych raportach. Odczynniki stosowane do protokołów znakowania radioaktywnego poddano obróbce celem usunięcia zanieczyszczających jonów metali ciężkich, które mogłyby współzawodniczyć z radioizotopami w etapie znakowania radioaktywnego (zob. rozdział „Meto70

PL 205 780 B1 dy”). Odczynnik wytworzono zgodnie z warunkami GMP w wydziale Wytwarzania IDEC zgodnie z ustalonym regulaminem wytwarzania serii produkcyjnej.

Metody

1. Wytwarzanie 2B8-MX-DTPA

MX-DTPA o czystości umożliwiającej zastosowanie go do badań klinicznych uzyskano z Coulter Immunology jako sól dwusodową w wodzie i przechowywano w temperaturze -70°C. W badaniach tych zastosowano dwie różne serie koniugatu: obie w postaci preparatu w soli fizjologicznej w stężeniu 10 mg/ml. Koniugaty nalewano do jałowych 2 ml strzykawek polipropylenowych i przechowywano w temperaturze 2-8°C.

2. Utrzymanie warunków wolnych od metali

Przeprowadzono wszelkie manipulacje odczynnikami dla zminimalizowania możliwości zanieczyszczenia metalami. Stosowano pojemniki plastykowe z polipropylenu lub polistyrenu, takie jak kolby, zlewki i menzury. Przepłukano je Alconoxem i obficie przepłukano wodą Milli-Q lub wodą do irygacji (WFIr) przed użyciem. Do dokładnej manipulacji małymi objętościami zastosowano bezmetalowe końce pipet. Większą objętością odczynników manipulowano z zastosowaniem jałowych, plastykowych pipet serologicznych. Reakcje korzystnie prowadzono w 1,8 ml zakręcanych probówkach mikrofugowych z polipropylenu.

3. Oznaczenie włączania znacznika radioaktywnego

Oznaczano włączanie znacznika radioaktywnego, stosując błyskawiczną chromatografię cienkowarstwową (ITLC) w trzech egzemplarzach według SOP SP-13-008. Ogólnie protokół był następujący: wyznakowany radioaktywnie koniugat rozcieńczono w stosunku 1:20 w IX PBS, zawierającym 1 mM DTPA lub 5 mM EDTA, następnie nakroplono 1 gl w odległości 1,5 cm od jednego końca paska papieru ITLC SG o wymiarach 1 x 5 cm (Gelman Sciences). Papier rozwinięto stosując 10% octan amonowy w metanolu:wodzie (1:1 obj.). Paski wysuszono, przecięto w poprzek na pół i oznaczono radioaktywność związaną z każdą sekcją, oznaczoną przez zliczanie scyntylacyjne. Radioaktywność związaną z dolną połową paska (radioaktywność związaną z białkami) wyrażano jako odsetek radioaktywności całkowitej, oznaczonej przez zsumowanie wartości dla połówek górnej i dolnej.

4. Protokół „mix-and-shoot” dla 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90]

Przeciwciała wyznakowano wolnym od nośnika chlorkiem ⁹⁰Y produkcji Amersham w 0,04 M HCl. Próbkę radioizotopu (10-20 mCi/mg przeciwciała) przeniesiono do probówki polipropylenowej i dodano 0,02X objętość wolnego od metalu 2 M octanu sodowego celem doprowadzenia pH roztworu do wartości 3,6. Natychmiast dodano 2B8-NaDTPA (0,3 mg; 10,0 mg/ml w soli fizjologicznej) i roztwór delikatnie zmieszano. Roztwór sprawdzono papierkiem pH dla potwierdzenia pH 3,8-4,1 i inkubowano przez 5 minut. Reakcję przerwano poprzez przeniesienie mieszaniny reakcyjnej do oddzielnej probówki polipropylenowej, zawierającej 1XPBS z 75 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy (HSA) i 1 mM kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA) i delikatnie zmieszano. Wyznakowane radioaktywnie przeciwciało przechowywano w temperaturze 2-8°C.

Określono aktywność swoistą, mierząc radioaktywność odpowiedniej próbki koniugatu wyznakowanego radioaktywnie. Wartość tę skorygowano pod kątem skuteczności licznika, powiązano ze stężeniem białka w koniugacie, oznaczono przez absorbancję przy 280 nm i wyrażono w postaci mCi/mg białka.

5. Immunoreaktywność in vitro 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90]

Oznaczano immunoreaktywność koniugatu wyznakowanego ⁹⁰Y, stosując SOP nr SP13-009, w oparciu o zmodyfikowaną wersję testu wiązania całych komórek, opisanego przez Lindmo. Do podwójnych zestawów 1,5 ml probówek polipropylenowych dodawano w rosnącym stężeniu fazy logarytmicznej CD20-dodatnie komórki SB lub CD20-ujemne komórki HSB; końcowa objętość komórek - 0,40 ml. Wyznakowany radioaktywnie koniugat rozcieńczono do końcowego stężenia przeciwciała 1-2,5 ng/ml i do każdej probówki dodano 0,35 ml. Po 90 minutach inkubacji z komórek wytworzono grudki przez odwirowanie i zebrano nadsącz. Radioaktywność pozostałą we frakcjach nadsączu oznaczono licznikiem scyntylacyjnym. Z danych sporządzono wykres, przy czym ukazano je jako iloraz całkowitej radioaktywności dodanej podzielonej przez radioaktywność związaną z komórkami w stosunku do odwrotności liczby komórek na probówkę. Odcięcie osi y odpowiada frakcji immunoreaktywnej.

6. Stabilność in vitro 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90] w postaci preparatu do stosowania klinicznego

Koniugat 2B8-MX-DTPA wyznakowano ⁹⁰Y i wytworzono z niego preparat w sposób opisany w powyższym protokole „mix-and-shoot”. Wytworzono dwie partie koniugatu wyznakowanego radioaktywnie: jedną partię wykorzystano do oceny stabilności włączania znacznika radioaktywnego, a drugą

PL 205 780 B1 do oceny zatrzymywania immunoreaktywności. Koniugaty w postaci preparatów inkubowano w temperaturze 4°C przez 48 godzin i analizowano próbki w czasie 0, 24 h i 48 h z zastosowaniem nieredukującego SDS-PAGE i autoradiografii. Oceniano immunoreaktywność w każdym z punktów czasowych, stosując wyżej opisany test.

7. Stabilność in vitro 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90] w surowicy ludzkiej

Oceniano stabilność 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90] poprzez inkubację w surowicy ludzkiej w temperaturze 37°C przez czas do 72 godzin. Sprzężone przeciwciało znakowano radioaktywnie itrem-[90] i wytwarzano z niego preparat w sposób opisany powyżej. Koniugat wyznakowany radioaktywnie rozcieńczano w stosunku 1:10 prawidłową surowicą ludzką (nie inaktywowaną cieplnie) i próbki inkubowano w probówkach plastykowych w temperaturze 37°C. W wybranych punktach czasowych próbki usuwano i analizowano nieredukującym SDS-PAGE i autoradiografią.

8. Dystrybucja biologiczna 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90]

Oceniano 2B8-MX-DTPA wyznakowany itrem-[90] pod kątem dystrybucji biologicznej w tkankach u myszy BALB/c w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni. Z wyznakowanego radioaktywnie koniugatu wytworzono preparat według powyższego opisu. Myszom wstrzyknięto dożylnie 5 gCi 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, i grupy po pięć myszy uśmiercono po dniach 1, 24, 48 i 72 godzinach. Po uśmierceniu pobrano ogon, serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, mięśnie i kość udową, przepłukano je i zważono: pobrano również do analizy próbkę krwi i skóry. Oznaczono radioaktywność związaną z poszczególnymi próbkami tkanek poprzez pomiar promieniowania hamowania z zastosowaniem licznika gamma i odsetka wstrzykniętej dawki na gram tkanki i odsetka wstrzykniętej dawki na narząd, w którym dokonywany jest pomiar.

9. Dozymetria

Dane na temat dystrybucji biologicznej, uzyskane z wykorzystaniem myszy, którym wstrzyknięto 2B8-MX-DTPA wyznakowany ⁹⁰Y, zastosowano do obliczenia szacunkowych dawek promieniowania wchłoniętego z dawki 1,0 mCi, podawanej pacjentowi o masie ciała 70 kg. Szacunki przeprowadzono sposobami przyjętymi przez Komitet Medycznej Wewnętrznej Dawki Promieniowania (Medical Internal Radiation Dose (MIRD) Towarzystwa Fizyki Jądrowej. Obliczenia te wykonał p. Phillip Hagan, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center, La Jolla, CA 92161, Stany Zjednoczone.

10. Walidacja protokołu wytwarzania dawek klinicznych 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90] (por. raport Działu Badań i Rozwoju pod tytułem „Walidacja Protokołu Znakowania Radioaktywnego” „Mix-and-Shoot do Wytwarzania Dawek Klinicznych 2B8-MX-DTPA ⁹⁰Y, autor: P. Chinn, z datą 22 kwietnia 1994).

C. Wyniki

1. Wytwarzanie 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90] z zastosowaniem protokołu „mix-and-shoot”

Doświadczenia wstępne, oceniające kinetykę reakcji znakowania radioaktywnego z 2B8-MX-DTPA i ⁹⁰Y wykazały, że w pH 3,6-4,0 dla czasu reakcji od 5 do 10 minut 95% radioizotopu uległo włączeniu. Powtarzalność tego włączania znacznika radioaktywnego (95,7% ± 1,7%) potwierdzono następnie w badaniu walidacyjnym protokołu powiększenia skali (por. raport Działu Badań i Rozwoju pod tytułem „Walidacja Protokołu Znakowania Radioaktywnego” „Mix-and-Shoot do Wytwarzania Dawek Klinicznych 2B8-MX-DTPA ⁹⁰Y, autor: P. Chinn, z datą 22 kwietnia 1994). Wytwarzanie 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y z zastosowaniem tego protokołu „mix-and-shoot pozwoliło uzyskać produkt porównywalny z produktem wytwarzanym sposobem HPLC (zob. BB-IND 4850/4851). Stwierdzono, że protokół znakowania radioaktywnego jest powtarzalny z aktywnością swoistą, pozostającą typowo w zakresie od 10 do 15 mCi/mg przeciwciała.

Immunoreaktywność 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, wytworzonego z zastosowaniem tego protokołu, była typowo większa od 70%, w porównaniu z 55-60% obserwowanymi dla walidacji dla protokołu HPLC (fig. 26). Różnica ta jest prawdopodobnie spowodowana zmniejszeniem efektu radiolizy z powodu skrócenia czasu inkubacji w protokole „mix-and-shoot. Wynik był typowy i, jak to omówiono poniżej, reprezentatywny dla walidacji protokołów zwiększania skali dla wytwarzania dawek klinicznych koniugatów znakowanych radioaktywnie.

2. Stabilność in vitro 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y

Wstępne doświadczenia z niezabezpieczonym wyznakowanym ⁹⁰Y koniugatem przeciwciała, wytworzonym z zastosowaniem procesu HPLC, wykazało, że radioliza powoduje znamienny rozpad przeciwciała i utratę immunoreaktywności. Tak więc wytworzono bufor preparatu dla zminimalizowania

PL 205 780 B1 efektów radiolizy. Wykazano skuteczność ludzkiej albuminy surowicy (HSA) w zakresie minimalizacji rozpadu przeciwciał spowodowanego radioliza. Dokonano oceny z zastosowaniem wyznakowanego radio aktywnie koniugatu, wytworzonego metodą „mix-and-shoot, dla potwierdzenia skuteczności preparatu w minimalizacji radiolizy. Z przeciwciała wyznakowanego ⁹⁰Y, wyznakowanego radioaktywnie do aktywności swoistej 14,5 mCi/mg przeciwciała, wytworzono preparat w 1X PBS, pH 7,4, zawierającym 75 mg/ml HSA i 1 mM DTPA. Rozpad koniugatu 2B8-MX-DTPA oceniano po 0, 24 i 48 godzinach z zastosowaniem SDS-PAGE i autoradiografii. Fig. 2, 3 i 4 ukazują, że wyznakowany radioaktywnie koniugat nie wykazywał istotnego rozpadu w czasie 48 godzinnego okresu inkubacji w temperaturze 4°C. Analiza metodą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej nie wykazała utraty ⁹⁰Y w czasie 48 godzinnej inkubacji: wyniki te potwierdziła analiza SDS-PAGE/autoradiograficzna (tabela 28). Immunoreaktywność również była względnie stała na poziomie >88% (tabela 29).

T a b e l a 28

Stabilność 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, wytworzonego metodą „mix-and-shoot, w ludzkiej albuminie surowicy, zawierającej PBS, i w DTPA

	Odsetek radioaktywności związanej z koniugatem
Czas (h)	ITLC	SDS/PGE
0	92,9	96,0
24	95,5	95,4
48	91,3	94,6

T a b e l a 29

Immunoreaktywność 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, wytworzonego metodą „mix-and-shoot, w ludzkiej albuminie surowicy, zawierającej PBS, i w DTPA

Czas (godzin w temperaturze 4°C)	Odsetek immunoreaktywności
0	87, 9
24	88,5
48	90, 4

2B8-MX-DTPA wyznakowany ⁹⁰Y, w postaci preparatu do zastosowania klinicznego, o swoistej aktywności 15,7 mCi/mg, inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37°C w surowicy ludzkiej. Próbki analizowane przez nieredukującą SDS-PAGE i autoradiografię (fig. 30) nie wykazały utraty radiolizotopu w czasie okresu inkubacji (tabela 30). Obrazy densytometryczne autoradiogramów w czasie 0 i 72 godzin nie wykazały znaczącego rozpadu koniugatu wyznakowanego radioaktywnie (fig. 31 i 32).

Wyniki te potwierdzono w analizach metodą chromatografii cienkowarstwowej (tabela 30). Należy zauważyć, że włączanie znacznika radioaktywnego dla przeciwciała stosowanego w tym badaniu było mniejsze, niż włączanie uzyskiwane w badaniach walidacyjnych protokołu znakowania. To mniejsze włączanie znacznika było spowodowane gorszą jakością partii chlorku ⁹⁰Y, zastosowanego do tego konkretnego preparatu przeciwciała wyznakowanego radioaktywnie. Mniejsze włączanie znacznika radioaktywnego nie zmienia wniosku, że wyznakowany itrem koniugat, wytworzony metodą „mix-and-shoot”, jest stabilny w tych warunkach inkubacji.

T a b e l a 30

Stabilność koniugatu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA inkubowanego w surowicy ludzkiej

	Odsetek radioaktywności związanej z koniugatem
Czas (godzin w temperaturze 37°C)	ITLC	SDS/PGE/autoradiografia
0	85,7	88,8
24	76,4	90,0
72	87,6	88,7

PL 205 780 B1

Próbki surowicy ludzkiej, zawierającej ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA (aktywność swoista 15,7 mCi/mg) analizowano pod kątem niezwiązanego z białkami ⁹⁰Y w przedstawionych punktach czasowych z zastosowaniem pasków błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej i SDS-PAGE/autoradiografii.

3. Badania dystrybucji biologicznej z 2B8-MX-DTPA wyznakowanym itrem-[90]

Oceniano dystrybucję biologiczną koniugatu wyznakowanego ⁹⁰Y, o aktywności swoistej 11,5 mCi/mg i włączaniu znacznika radioaktywnego >95%, u myszy BALB/c. Oceniano odkładanie się radioaktywności w najważniejszych narządach oraz w skórze, mięśniach, kościach, moczu i kale w czasie 72 godzin i wyrażono je jako odsetek wstrzykniętej dawki/g tkanki i jako odsetek wstrzykniętej dawki na narząd. Wyniki przedstawione w tabelach 31-34 i na fig. 33 dowodzą, że poziom radioaktywności związanej z krwią zmniejszył się z około 43% wstrzykniętej dawki na gram (%ID/g) po 1 godzinie do około 16% po 72 godzinach; po 24 godzinach i później poziom radioaktywności związanej z sercem, nerkami i śledzioną pozostał w zasadzie stały na poziomie 4-8%. W przypadku płuc i wątroby radioaktywność zmniejszyła się z 10-12% po 1 godzinie do 8-10% po 72 godzinach. W przypadku skóry radioaktywność pozostawała na względnie stałym poziomie około 3% od 24 h do 72 h. Radioaktywność w przewodzie pokarmowym utrzymywała się na stałym poziomie 0,5-1% od 24 h do 72 h. Radioaktywność mięśni pozostawała na poziomie około 0,6% przez czas trwania badania. Wychwyt radioaktywności przez kość udową pozostawał na poziomie poniżej 4% we wszystkich punktach czasowych, wskazując, że ilość wolnego itru w preparacie koniugatu była pomijalna i że w ilość wolnego metalu radioaktywnego, uwolnionego w czasie badania, była niewielka.

T a b e l a 31

Dystrybucja aktywności 1,0 godziny po wstrzyknięciu i.v. ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA zdrowym myszom BALB/c

Wartość średnia ± SD
Próbka	Masa narządu (gramy)	% ID/gram	% ID/narząd
Krew	1,37 ± 0,053	42,74 ± 0,78	58,52 ± 1,74
Serce	0,101 ± 0,01	8,03 ± 3,33	0,82 ± 0,37
Płuca (2)	0,126 ± 0,01	12,44 ± 0,94	1,56 ± 0,05
Nerka (1)	0,129 ± 0,01	7,81 ± 1,24	0,997 ± 0,10
Wątroba	0,899 ± 0,07	10,08 ± 1,28	9,01 ± 0,52
Śledziona	0,077 ± 0,004	10,74 ± 0,96	0,823 ± 0,04
Mięśnie	7,83 ± 0,28	0,44 ± 0,08	3,43 ± 0,51
Kości	2,94 ± 0,11	3,44 ± 0,57	10,11 ± 1,80
Skóra	2,94 ± 0,11	1,46 ± 0,58	4,24 ± 1,57
Przewód pokarmowy	2,33 ± 0,08	1,02 ± 0,19	2,36 ± 0,35
Mocz	-	-	-
Kał	-	-	-
	Razem	94,66 ± 3,47

Liczba myszy = 3

Średnia masa ciała = 19,58 gramów ± 0,71 grama

T a b e l a 32

Dystrybucja aktywności 24 godziny po wstrzyknięciu i.v. ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA zdrowym myszom BALB/c

Wartość średnia ± SD
Próbka	Masa narz ądu (gramy)	% ID/gram	% ID/narząd
1	2	3	4
Krew	1,55 ± 0,12	19,77 ± 2,42	30,77 ± 6,04
Serce	0,105 ± 0,01	4,44 ± 0,55	0,47 ± 0,08

PL 205 780 B1 cd. tabeli 32

1	2	3	4
Płuca (2)	0,127 ± 0,02	8,78 ± 1,61	1,11 ± 0,21
Nerka (1)	0,139 ± 0,01	5,02 ± 0,52	0,69 ± 0,05
Wątroba	0,966 ± 0,09	8, 62 ± 2,73	8,20 ± 1,97
Śledziona	0,083 ± 0,01	6,75 ± 1,27	0,55 ± 0,064
Mięśnie	8,83 ± 0,69	0,692 ± 0,01	6,12 ± 0,52
Kości	3,31 ± 0,26	2,24 ± 0,31	7,47 ± 1,53
Skóra	3,31 ± 0,26	3,33 ± 0,76	10,88 ± 1,76
Przewód pokarmowy	2,89 ± 0,43	0,73 ± 0,09	1,02 ± 0,35
Mocz	-	-	2,31
Kał	-	-	1,23
		Razem	73,52 ± 6,18%

Liczba myszy = 3

Średnia masa ciała = 22,09 ± 1,73 grama

T a b e l a 33

Dystrybucja aktywności w 48 godzin po wstrzyknięciu i.v. ⁹⁰Y-2B8-MX-DTA zdrowym myszom BALB/c

Wartość średnia ± SD
Próbka	Masa narządu (gramy)	% ID/gram	% ID/narząd
Krew	1,50 ± 0,14	14,97 ± 5,77	22,53 ± 8,48
Serce	0,104 ± 0,01	3,99 ± 1,43	0,415 ± 0,16
Płuca (2)	0,122 ± 0,02	8,41 ± 1,57	1,04 ± 0,31
Nerka (1)	0,124 ± 0,01	3,99 ± 1,62	0,49 ± 0,19
Wątroba	0,966 ± 0,13	6,12 ± 3,21	5,69 ± 2,25
Śledziona	0,079 ± 0,01	6,05 ± 2,38	0,46 ± 0,16
Mięśnie	8,59 ± 0,82	0,54 ± 0,19	4,67 ± 1,67
Kości	3,22 ± 0,31	2,07 ± 0,84	6,65 ± 2,56
Skóra	3,22 ± 0,31	2,30 ± 0,70	7,34 ± 1,95
Przewód pokarmowy	2,63 ± 0,40	0,652 ± 0,30	1,67 ± 0,64
Mocz	-	-	2,83
Kał	-	-	2,06
		Razem	57,28 ± 17,60

Liczba myszy = 3

Średnia masa ciała = 21,48 ± 2,05 grama

T a b e l a 34

Dystrybucja aktywności w 72 godziny po wstrzyknięciu i.v. ⁹⁰Y-2B8-MX-DTA zdrowym myszom BALB/c

Wartość średnia ± SD
Próbka	Masa narządu (gramy)	% ID/gram	% ID/narząd
1	2	3	4
Krew	1,45 ± 0,07	15,87 ± 4,81	23,14 ± 7,26
Serce	0,093 ± 0,01	4,16 ± 1,27	0,392 ± 0,13

PL 205 780 B1 cd. tabela 34

1	2	3	4
Płuca (2)	0,123 ± 0,02	10,67 ± 3,79	1,30 ± 0,45
Nerka (1)	0,123 ± 0,01	4,79 ± 1,03	0,596 ± 0,16
Wątroba	0,876 ± 0,07	7,26 ± 1,79	6,39 ± 1,76
Śledziona	0,081 ± 0,01	7,37 ± 2,34	0,584 ± 0,16
Mięśnie	8,30 ± 0,39	0,67 ± 0,13	5,58 ± 1,22
Kości	3,11 ± 0,15	2,58 ± 0,51	8,05 ± 1,76
Skóra	3,11 ± 0,15	3,09 ± 0,82	9,66 ± 2,68
Przewód pokarmowy	2,59 ± 0,20	0,79 ± 0,18	2,05 ± 0,53
Mocz	-	-	3,56
Kał	-	-	2,82
	Razem	65,47 ± 14,0

Liczba myszy = 3

Średnia masa ciała = 20,76 ± 0,97 grama

4. Dozymetria

Dawki pochłoniętego promieniowania dla „standardowego” człowieka o masie ciała 70 kg, obliczone dla koniugatu wyznakowanego ⁹⁰Y z zastosowaniem danych dystrybucji biologicznej u myszy (wartości % ID/narząd w tabelach 31-34) przedstawiono w tabeli 35. Dane te są porównywalne z wynikami uzyskanymi uprzednio przy użyciu 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y i metody znakowania radioaktywnego HPLC.

T a b e l a 35

Szacunkowa ocena dozymetrii promieniowania po podaniu 2B8-MX wyznakowanego itrem-[90], o jednolitej dystrybucji u standardowego człowieka (70 kg) i w oparciu o dane dystrybucji u zwierząt w 72 godziny po wstrzyknięciu

Ilość aktywności = 1000 gCi/pacjenta	Dawka [radów]
1	2
Nadnercza	0,534
Ściana pęcherza moczowego	0,534
Ściana żołądka	0,534
Jelito cienkie	1,158
Ściana górnego odcinka jelita grubego	1,657
Ściana dolnego odcinka jelita grubego	2,380
Nerki	7,015
Wątroba	7,149
Płuca	2,157
Inne tkanki
Mięśniowa	2,646
Tłuszczowa	2,646
Krew	2,646
Mózg	2,112
Serce	2,646
Jajniki	0,534

PL 205 780 B1 cd. tabela 35

1	2
Trzustka	0,534
Kości
Warstwa korowa kości	1,466
Kość beleczkowata	1,466
Szpik kostny (czerwony)	4,452
Szpik kostny (żółty)	2,096
Chrząstka	1,466
Inne składniki	1,466
Skóra	6,603
Śledziona	4,973
Jądra	0,534
Tarczyca	0,534
Macica (nieciężarna)	0,767
Całe ciało	1,755

Według: „A Schema for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides”, MIRD J. of Nucl. Med./supl. 1, 2/68.

Obliczenia wykonano z zastosowaniem szablonu arkusza kalkulacyjnego w Symphony (Lotus Development Corporation), stworzonego przez Philipa L. Hagana, MS, Nuclear Medicine Service, VA Hospital, San Diego, CA 92161, Stany Zjednoczone.

5. Walidacja protokołu wytwarzania dawek klinicznych 2B8-MX-DTPA wyznakowanego itrem-[90]

Firma MPI Pharmacy Services, Inc. przygotowała w sumie dziesięć zestawów walidacyjnych. Wyniki badania każdego z zestawów przedstawiono w tabeli 36. Obliczono średnią wartość dla wyniku każdego testu i odnotowano odchylenie standardowe, gdy miało to zastosowanie. W celu oceny zmienności procesu spowodowanej różnicą czasu znakowania, zestawy 1-8 wytworzono z zastosowaniem 10-minutowego czasu znakowania, a zestawy 9 i 10 - z zastosowaniem 5 minutowego czasu znakowania. W oparciu o wyniki testów dla dziesięciu zestawów walidacyjnych, ustalono wyszczególnienie uwalniania. Wyszczególnienie uwalniania przedstawiono w tabeli 37.

PL 205 780 B1

-Ρ

-Ρ

-Ρ ft ι—I ω

χ

Ρ

Η (V

Τ5

X!

υ >1

X >1 (Τι

Η

Ω

I

X m

>1 >1

Ό

-Η

Ν

Ό

Ό

4-)

X

ft

+1

+1

+1

+1

+1

Η

04

90

Ρ

(Ό

Ο

00

Γ-

X

L47

Τ—1

Γ-

ο

Τ-1

Τ-1

Τ-1

00

ω

κ.

00

κ.

Ο

ar

γ~4

ο

00

co

ΟΊ

Ρ

αΤ

ο

147

γ“i

'G0

Γ-

cn

V

+1

ΟΊ

,—ι

Ο

ο

1-β

ο

Τ-1

Ο

U7

C4

90

L47

τ—1

U7

σ)

04

Γ-

S.

ο

Ο

ο

C0

ο

η

ο

τ—1

LO

V

σ

ο

τ—1

τ—1

LO

00

,-1

00

τ—1

LO

τ—1

00

147

«κ

τ—1

04

κ

00

Ο

Γ-

κ.

rH

σι

00

V

σ

Ο

τ—1

τ—1

147

00

ar

00

147

00

αο

Τ-i

κ.

ο

ΟΊ

00

Ο

<Ο

τ—i

00

γ~-

V

ΟΊ

ο

Ο

τ—1

LO

00

L0

04

σ

σ

90

07

S.

Ο

Ο

σ

ο

LO

ν

ν

τ—1

Γ-

Γ-

V

σ

Ο

τ—1

τ—1

LO

σ

C4

04

σ

τ—1

147

Ο

Κ.

,—1

147

κ.

00

ο

ΟΤ

κ.

«Κ

00

<Ό

<ο

V

σ

Ο

τ—1

τ—1

LO

04

αΤ

<ο

τ—1

Γ-

07

Τ—1

00

Τ—1

LT7

ο

Ο

ar

Τ-1

147

(Ώ

V

σ

Ο

τ—1

Γ—i

LO

04

00

00

,-1

Ο

00

<ο

τ—1

00

00

Ο

Ο

90

•κ

<<

ατ

V

ΟΊ

ο

r-i

σ>

LO

04

00

Γ~

τ—1

L0

00

00

04

κ.

<

ο

σι

Τ-1

ο

07

τ—1

η

Γ-

V

σΊ

ο

ο

τ—1

147

C4

σ

00

τ—1

ο

Ο

00

Ο

ν

τ—1

00

<<

X

00

ο

Γ-

04

ο

C4

σι

V

σ

Ο

Τ—1

τ—1

cn

X

L47

υ

04

04

>1

00

Τ—1

LO

00

04

Ο

ΰ

κ

κ

τ—1

04

κ.

ft

04

ο

Γ

X

ο

MO

τ—1

ο-

V

σ

ο

Τ—(

τ—1

χ

•Η

ft

u

ft

Ρ

-w

X

Ν

ο

w

>,

Ρ

ο

X

•Η

12

to

'W

ο

>1

ω

ο

5

S.

+J

ft

ft

Ρ

f-M

Ρ

W

X

Ρ

Ή

S

ft

5

-Ρ

(t

^0

Ρ

ft

rd

>1

Ό

ο

ω

Μ

ft

X

X

ω

υ

X

'W

ο

Ρ

X

—.

Ν

•r-|

X

Ή

5

X

1-)

ο

tn

χΐ

ο

Ο

1-1

u

Ρ

ft

Ρ

Η

1—1

ft

g

Ρ

g

η

Ρ

X

g

rtf

Ν

ο

ω

υ

g

ο

S

I

Ρ

ο

rV|

u

Ή

•Ν

ω

•Η

Ή

Ή

TS

£

Ό

Ρ

2

ft

Ό

α>

Ν

σ

X

ο

X

ω

Ρ

&

Ρ

ω

Ρ

ft

X

Ρ

g

ft

g

X

g

ft

ο\ο

Ή

ω

ο\°

Ν

Ρ

ω

X

”—

cd

<

PL 205 780 B1

T a b e l a 37

Wyszczególnienie uwalniania dla 2B8-MX-DTPA wytworzonego metodą „mix-and-shoot”, wyznakowanego 90Y

Test	Wyszczególnienie	Metoda
Immunoreaktywność	> 60%	RIA
Endotoksyna	< 5 EU/ml	LAL
Włączanie znacznika radioaktywnego	> 90%	ITLC
Stężenie przeciwciała	0,075-0,150 mg/ml	A280
Stężenie radioaktywności1	> 6,0 mCi/ml	Kalibracja dawki
Aktywność swoista1 przeciwciała	> 9,0 mCi/mg	A280/kalibracja dawki
Całkowita radioaktywność w fiolce1	> 6,0 mCi	Kalibracja dawki
pH	6,0-8,0	Papierek pH
Stężenie białka całkowitego	65-85 mg/ml	A280
Badanie jałowości 1(kalibracja czasu zero)	zaliczony	CFR 610,12

D. Omówienie

W oryginalnym protokole znakowania radioaktywnego do wytwarzania wyznakowanego ⁹⁰Y 2B8-MTX-DTPA stosowano szczególnie pracochłonny i czasochłonny etap oczyszczania HPLC do usuwania niezwiązanego z białkami ⁹⁰Y z preparatu. W celu uproszczenia tego procesu i nadania mu większej przydatności do zastosowania klinicznego czyniono wysiłki w kierunku wyeliminowania etapu HPLC na korzyść protokołu nazwanego „mix-and-shoot”. Celem było wykrycie warunków znakowania radioaktywnego, które spowodowałyby bardzo znaczne włączanie radioaktywnego izotopu do koniugatu, pozwalając uniknąć konieczności przeprowadzania etapu oczyszczania. Odkryto, że >95% włączania znacznika radioaktywnego można było uzyskać przy pH 3,6 przy inkubacji trwającej od pięciu do dziesięciu minut. Dodatkową korzyścią z zastosowania tego protokołu było zwiększone zatrzymywanie immunoreaktywności (>70%), prawdopodobnie z powodu krótszego czasu ekspozycji przeciwciała na radioizotop o wysokiej energii przed dodaniem ludzkiej albuminy surowicy, zapewniającej ochronę przed radiolizą. To zatrzymywanie immunoreaktywności jest korzystniejsze od obserwowanego uprzednio przy zastosowaniu metody HPLC.

W badaniach stabilności z koniugatem wyznakowanym ⁹⁰Y, wytworzonym z zastosowaniem protokołu „mix-and-shoot”, inkubowanym w buforze (1X PBS, zawierającym 75 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA) przez czas do 48 godzin w temperaturze 4°C, nie wykazano zmniejszenia poziomu radioizotopu i wykazano całkowite zachowanie immunoreaktywności. Badania stabilności, prowadzone z ludzką albuminą surowicy przez 72 godziny w temperaturze 37°C, również wskazywały na minimalną utratę radioizotopu. Te wyniki badania stabilności są porównywalne z wynikami uzyskiwanymi poprzednio dla koniugatu wyznakowanego radioaktywnie z zastosowaniem protokołu HPLC.

Dystrybucja biologiczna u myszy BALB/c z zastosowaniem koniugatu wyznakowanego ⁹⁰Y, wytworzonego metodą „mix-and-shoot”, nie wykazała nieprawidłowego odkładania się w tkankach. Wyniki te wskazują, że wyznakowane radioaktywnie przeciwciało nie było istotnie zmienione, tak aby to w znaczący sposób wpływało na charakterystykę przeciwciała in vivo. Wyniki te są również porównywalne z wynikami uzyskanymi uprzednio z wyznakowanym radioaktywnie koniugatem, wytworzonym z zastosowaniem metody HPLC znakowania radioaktywnego (zob. BB-IND 4850/4851). Szacunki dozymetryczne dla „standardowego człowieka o masie ciała 70 kg, wyliczone na podstawie danych dystrybucji biologicznej dla myszy, są zgodne z danymi uzyskanymi przy użyciu wyznakowanego radioaktywnie koniugatu, wytworzonego z zastosowaniem procedury HPLC (zob. BB-IND 4850/4851). Dodatkowo, wyniki dozymetrii są porównywalne z wynikami uzyskanymi dla pacjentów włączonych do trwającego badania klinicznego (badanie IDEC nr 1315), przy porównaniu na milikiur wstrzykniętej dawki. Dla sześciu pacjentów uczestniczących w badaniu średnia wartość (radów ± SD) dla całego ciała, serca, wątroby i śledziony wynosiła, odpowiednio, 1,40 ± 0,57, 10,50 ± 4,68, 9,89 ± 8,91 i 9,75 ± 6,00.

PL 205 780 B1

Przed zastosowaniem protokołu znakowania „mix-and-shoot” do wytwarzania ⁹⁰Y-2B8-MTX-DTPA, nadającego się do zastosowania klinicznego, niezbędna była ocena powtarzalności protokołu. Tak więc wytworzono dziesięć zestawów walidacyjnych z zastosowaniem różnej ilości chlorku ⁹⁰Y. Dla dziesięciu otrzymanych zestawów wartość immunoreaktywności, uzyskanej z zastosowaniem metody „mix-and-shoot”, pozostawała w zakresie od 60,6% do 93,3%, przy czym średnia wynosiła 74,5%, a mediana 72,1%. To zatrzymywanie radioaktywności jest znamiennie lepsze, niż wartość około 60%, uzyskiwana poprzednio z zastosowaniem obecnej metody HPLC (zakres 54,9%-65,1%; średnia 60,2%). Średnie włączanie znacznika dla dziesięciu zestawów wynosiło 95,7% (zakres od 93,5% do 97,5%). Wartość ta jest porównywalna z wartością obserwowaną uprzednio dla metody HPLC (zakres od 91,7% do 93,7% i średnia 93,1%). Również wyniki badania endotoksyn, stężenia radioaktywności, aktywności swoistej, całkowitej radioaktywności fiolki, całkowitego stężenia białka, pH i jałowości były porównywalne dla dziesięciu zestawów. Wyniki te w sumie potwierdziły powtarzalność metody „mix-and-shoot. Ponadto ocenialiśmy zmienność procesu, spowodowaną różnym czasem znakowania, prowadząc reakcje przez 5 i 10 minut. Ponieważ dla obu czasów reakcji nie odnotowano istotnych różnic, zdecydowano, że w końcowym protokole będzie stosowany krótszy czas inkubacji.

E. Podsumowanie

Opracowaliśmy procedurę znakowania, zwaną metodą „mix-and-shoot”, do wytwarzania dawek klinicznych 2B8-MTX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, co pozwala uniknąć konieczności wykonywania tak jak obecnie etapu chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) w celu usunięcia radioizotopu niezwiązanego z białkami. Protokół uproszczony eliminuje ten pracochłonny etap oczyszczania, utrzymując wysoki poziom włączania znacznika radioaktywnego (>70%). Stwierdzono, że wyznakowany radioaktywnie koniugat w postaci preparatu klinicznego jest stabilny in vitro przy inkubacji w temperaturze 4°C przez 48 godzin, w oparciu o zatrzymywanie radioizotopu i immunoreaktywności. Dodatkowowy znakowany radioaktywnie koniugat był stabilny przy inkubacji w surowicy ludzkiej w temperaturze 37°C przez 72 godziny. Badania dystrybucji biologicznej u myszy BALB/c nie wykazały obecności nieprawidłowych złogów w tkankach, w tym również w tkance kostnej. Szacunki pochłoniętych dawek promieniowania dla „standardowego” człowieka o masie ciała 70 kg były porównywalne z uzyskanymi w trwają cym badaniu klinicznym z zastosowaniem 2B8-MTX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y. Wyniki tych badań wskazują, że wyznakowany ⁹⁰Y 2B8-MTX-DTPA, wytworzony metodą „mix-and-shoot”, jest porównywalny z wytworzonym z zastosowaniem konwencjonalnego procesu HPLC. Walidacja protokołu ze zwiększeniem skali wskazuje, że ten nowy protokół „mix-and-shoot” można stosować do wytwarzania 2B8-MTX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, nadającego się do zastosowania w badaniach klinicznych.

Szczegółowy opis korzystnych wykonań

P r z y k ł a d 1.

Włączanie znacznika radioaktywnego - zestawy i testy

I. Streszczenie

Jednym z celów niniejszego wynalazku było opracowanie protokołu zestawów do znakowania radioaktywnego do wytwarzania 2B8-MTX-DTPA wyznakowanego ¹¹¹In i ⁹⁰Y (odpowiednio, In2B8 i Y2B8) i ustalenie wyszczególnienia uwalniania dla produktów klinicznych. Protokoły zestawów znakowania radioaktywnego są powtarzalne w odniesieniu do włączania radioaktywnego i wiązania z antygeno-dodatnimi komórkami SB i wskazują na to, że zestawy do znakowania radioaktywnego nadają się do wykorzystania w badaniach klinicznych. Zaleca się, aby wyszczególnienia uwalniania In2B8 i Y2B8 dla włączania znacznika radioaktywnego i wiązania ustalać, odpowiednio, dla >95% i >70%.

II. Wprowadzenie

Wyznakowane ⁹⁰Y mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD20 (Y2B8) ocenia się obecnie w badaniach klinicznych w leczeniu nawrotów chłoniaka z limfocytów B. Izotop itrowy nie posiada składnika gamma, co powoduje, że nie nadaje się on do układów obrazujących. Tak więc 2B8-MTX-DTPA wyznakowane ¹¹¹In (In2B8) będzie stosowane do oceny umiejscowienia guza i dozymetrii u pacjentów przed lub po leczeniu środkiem terapeutycznym wyznakowanym itrem. Poprzez zastosowanie obecnie dostępnych protokołów wytwarzania Y2B8 i In2B8, zwanych metodami „mix-and-shoot”, uzyskuje się wyznakowane radioaktywnie przeciwciała, nadające się do badań klinicznych. Uproszczenie procesu znakowania ułatwiłoby przygotowanie dawki w warunkach klinicznych.

Nowy zestaw do znakowania radioaktywnego korzystnie składa się z czterech składników: 1) 2B8-MTX-DTPA w soli fizjologicznej o niskiej zawartości metali w stężeniu 2 mg/ml 2) 50 mM octanu sodowego, stosowanego do doprowadzania roztworu radioizotopu do odpowiedniego dla znakowania pH 3) buforu (1X PBS, pH 7,4, zawierający 7,5% ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA) 4) pus80

PL 205 780 B1 tych 10 ml fiolek szklanych (fiolka reakcyjna). Wszystkie składniki przebadano pod kątem jałowości i apirogenności.

W niniejszym raporcie podsumowano walidację tego zestawu do znakowania radioaktywnego, prostego i łatwego w użyciu, pozwalającego uzyskać wyznakowane radioaktywnie przeciwciała o >95% włączaniu znacznika radioaktywnego i dopuszczalne zatrzymywanie komórek antygeno-dodatnich. Dla produktów klinicznych zaleca się wyszczególnienia badania uwalniania.

III. Materiały i metody badania włączania znacznika radioaktywnego

A. Odczynniki w zestawach do znakowania radioaktywnego

1. 2B8-MTX-DTPA, IDEC; partia nr 082395RM2

2. 50 mM octanu sodowego o niskiej zawartości metalu, IDEC; nr partii 082395RM3

3. Bufor (1XPBS, pH 7,4, zawierający 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA),

IDEC, nr partii 082395RM1

4. Fiolka reakcyjna, 10 ml, IDEC

B. Materiały i sprzęt

1. Zestaw do włączania znacznika radioaktywnego Biodex Tec-Control, nr kat. 151-770

2. Rękawiczki - bez talku

3. Jałowe strzykawki polipropylenowe

4. Jałowe igły do strzykawek

5. Małe probówki z otworem; 1,5 ml

C. Metody

1. Wytwarzanie Y2B8 i In2B8 z zastosowaniem zestawów do znakowania radioaktywnego

Wytworzono odczynniki do zestawów i nalano je do fiolek szklanych z przegródkami. Fiolki z borokrzemianu typu I (2 lub 10 ml) przepłukano jałową wodą do wstrzyknięć (WFI) i wyjałowiono w autoklawie przed napełnieniem. Przegrody z gumy butylowej przepłukano jałową WFI i wyjałowiono w autoklawie przed zastosowaniem. Odczynniki nalano ręcznie i umieszczono w pomieszczeniu klasy 100 i zbadano pod kątem pirogenności i jałowości metodami USP.

a. Wytwarzanie In2B8

Dodatkowe odczynniki

1. Ind-[111]: sól chlorkowa, beznośnikowa, w HCI.

Środki ostrożności:

1. Wszystkie etapy korzystnie jest wykonywać techniką aseptyczną

2. Składniki zestawu do znakowania radioaktywnego należy przed zastosowaniem doprowadzić do temperatury pokojowej

3. Produkt końcowy powinno się podać pacjentowi w ciągu 8 godzin od ukończenia poniższego etapu 9.

Protokół znakowania radioaktywnego In2B8

Procedura

1. Objętość ¹¹¹InCl3, którą należy dodać do fiolki reakcyjnej, obliczono w następujący sposób: a. stężenie radioaktywności w momencie znakowania radioaktywnego w mCi/ml:

C0 = stężenie radioaktywności w momencie kalibracji (zob. Certyfikat Analizy producenta)

Δt = zmiana w czasie (liczba dodatnia oznacza moment po kalibracji, liczba ujemna moment przed kalibracją).

Stężenie radioaktywności w momencie znakowania =

Co e0,0103( ΔΌ

b. objętość ¹¹¹InCl3 do dodania do fiolki reakcyjnej:

5,5mCi

SRMZ = objęto^sc do dodania do fiolki reakcyjnej.(SRMZ -SRMZ) stężenie radioaktywności w momencie znakowania.

2. Objętość 50 mM octanu sodowego do dodania do fiolki reakcyjnej obliczono w następujący sposób:

objętość ¹¹¹InCl3 dodana (etap 1b) x (1,2) = objętość 50 mM octanu sodowego do dodania.

3. Przegrody fiolki reakcyjnej i 50 mM fiolki przetarto alkoholem. Obliczoną objętość 50 mM octanu sodowego (etap 2) przeniesiono do fiolki reakcyjnej z zastosowaniem strzykawki 1 cm³.

PL 205 780 B1

4. Przegrodę źródła ¹¹¹InCl3 przetarto alkoholem. Fiolkę odpowietrzono igłą zaopatrzoną w jałowy filtr 0,2 gm. Jałową strzykawką 1 cm³ przeniesiono potrzebną objętość (etap 1b) ¹¹¹InCl₃ do fiolki reakcyjnej. Zawartość fiolki zmieszano poprzez kilkakrotne obrócenie fiolki.

5. Przegrodę fiolki z 2B8-MX-DTPA przetarto alkoholem. Jałową strzykawką 1 cm³ powoli przeniesiono 1,0 ml 2B8-MX-DTPA do fiolki reakcyjnej. Zawartość fiolki zmieszano poprzez kilkakrotne obrócenie fiolki.

6. Reakcję pozostawiono na 30 minut ± 5 minut w temperaturze otoczenia.

7. Obliczono całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej, dodając objętość dodanej objętości ¹¹¹InCl3 (etap 4), dodaną objętość 50 mM octanu sodowego (etap 3) i objętość dodanego 2B8-MX-DTPA (etap 5).

8. Obliczono objętość bufora do dodania do fiolki reakcyjnej celem otrzymania końcowej objętości 10 ml poprzez odjęcie całkowitej ilości obliczonej dla etapu 7 od ilości obliczonej dla etapu 10.

9. Fiolkę z buforem przetarto alkoholem i fiolkę odpowietrzono. Ze względu na lepkość buforu fiolkę reakcyjną odpowietrzono igłą zaopatrzoną w filtr strzykawkowy 0,2 gm. Objętość buforu, obliczoną w etapie 8, przeniesiono do fiolki reakcyjnej za pomocą jałowej strzykawki 10 cm³, zaopatrzonej w igłę o odpowiedniej średnicy. Z fiolki reakcyjnej usunięto igłę odpowietrzającą i fiolkę zmieszano przez kilkakrotne odwracanie (produkt końcowy). Fiolkę tę inkubowano na co najmniej 5 minut przed wykonaniem „testu włączania znacznika radioaktywnego”. Zabarwienie roztworu było bursztynowe i fiolka była pełna, co potwierdza fakt dodania buforu.

10. Zmierzono radioaktywność całkowitą produktu końcowego z zastosowaniem odpowiedniego zestawu instrumentów dla pomiaru ¹¹¹In.

11. Produkt końcowy złożono natychmiast do przechowywania w temperaturze 2-8°C celem wykonania „testu wiązania” i „testu włączania znacznika radioaktywnego”.

b. Wytwarzanie Y2B8

Dodatkowe odczynniki:

1. Itr-[90]: chlorek, bez nośnika, w HCl.

Środki ostrożności:

1. Wszystkie etapy należy wykonywać techniką aseptyczną.

2. Składniki zestawu do znakowania radioaktywnego należy przed zastosowaniem doprowadzić do temperatury pokojowej.

3. Produkt końcowy powinno się podać pacjentowi w ciągu 8 godzin od ukończenia poniższego etapu 8.

Protokół znakowania radioaktywnego Y2B8

1. Objętość ⁹⁰YCl3, którą należy dodać do fiolki reakcyjnej, obliczono w następujący sposób:

a. stężenie radioaktywności w momencie znakowania radioaktywnego w mCi/ml:

C0 = stężenie radioaktywności w momencie kalibracji (zob. Certyfikat Analizy producenta)

Δt = zmiana w czasie (liczba dodatnia oznacza moment po kalibracji, liczba ujemna moment przed kalibracją).

Stężenie radioaktywności w momencie znakowania =-—e0,0108( ΔΌ

b. objętość ⁹⁰YCl3 do dodania do fiolki reakcyjnej:

45mCi

SRMZ = objętość do dodania do fiolki reakcyjnej.(SRMZ - stężenie radioaktywności w momencie znakowania.

2. Objętość 50 mM octanu sodowego do dodania do fiolki reakcyjnej obliczono w następujący sposób:

a. dla ⁹⁰YCl3 w 0,040 M HCl (Amersham) objętość ⁹⁰YCl3 (etap 1b) x (0,8) = objętość octanu sodowego do dodania

b. dla ⁹⁰YCl3 w 0,050 M HCl (Nordion) objętość ⁹⁰YCI3 (etap 1b) x (1,0) = objętość octanu sodowego do dodania

3. Przegrody fiolki reakcyjnej i fiolki z octanem sodowym przetarto alkoholem. Obliczoną (etap 1a lub 1b) objętość 50 mM octanu sodowego (etap 2) przeniesiono do fiolki reakcyjnej z zastosowaniem strzykawki 1 cm³.

4. Przegrodę źródła ⁹⁰YCl3 przetarto alkoholem. Fiolkę odpowietrzono igłą zaopatrzoną w jałowy filtr 0,2 gm. Jałową strzykawką 1 cm³ przeniesiono potrzebną objętość (etap 1b) ⁹⁰YCl3 do fiolki reakcyjnej. Zawartość fiolki zmieszano poprzez kilkakrotne obrócenie fiolki.

PL 205 780 B1

5. Przegrodę fiolki z 2B8-MX-DTPA przetarto alkoholem. Jałową strzykawką 3 cm³ przeniesiono 1,5 ml 2B8-MX-DTPA do fiolki reakcyjnej. Zawartość fiolki zmieszano poprzez kilkakrotne obrócenie fiolki.

6. Obliczono całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej, dodając ilość dodanego objętości chlorku Y-90 (etap 4), dodaną objętość 50 mM octanu sodowego (etap 3) i objętość dodanego 2B8-MX-DTPA (etap 5).

7. Obliczono objętość bufora do dodania do fiolki reakcyjnej celem otrzymania końcowej objętości 10 ml poprzez odjęcie całkowitej ilości obliczonej dla etapu 6 od ilości obliczonej dla etapu 10.

8. Fiolkę z buforem przetarto alkoholem i fiolkę odpowietrzono. Ze względu na lepkość buforu fiolkę reakcyjną odpowietrzono igłą zaopatrzoną w filtr strzykawkowy 0,2 μm. Objętość buforu, obliczoną w etapie 7, przeniesiono do fiolki reakcyjnej za pomocą jałowej strzykawki 10 cm³, zaopatrzonej w igłę o odpowiedniej średnicy. Z fiolki reakcyjnej usunięto igłę odpowietrzającą i fiolkę zmieszano przez kilkakrotne odwracanie (produkt końcowy). Fiolkę tę inkubowano na co najmniej 5 minut przed wykonaniem „testu włączania znacznika radioaktywnego”. Zabarwienie roztworu było bursztynowe i fiolka była pełna, co potwierdza fakt dodania buforu.

9. Zmierzono radioaktywność całkowitą produktu końcowego z zastosowaniem odpowiedniego zestawu instrumentów dla pomiaru ⁹⁰Y.

10. Produkt końcowy złożono natychmiast do przechowywania w temperaturze 2-8°C aż do wykorzystania w celu podania pacjentowi.

11. Badanie immunoreaktywności:

Stosując strzykawkę 1 ml, 0,1 ml usunięto aseptycznie z fiolki reakcyjnej i przeniesiono do oddzielnej 1,5 ml zakręcanej probówki. Probówkę natychmiast złożono do przechowywania w temperaturze 2-8°C celem wykonania „testu wiązania” i „testu włączania znacznika radioaktywnego”.

Walidację protokołów zestawów znakowania radioaktywnego przeprowadzono w IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA, Stany Zjednoczone), MD Anderson Health Center (Houston, TX, Stany Zjednoczone), Mayo Clinic (Rochester, MN, Stany Zjednoczone) i City of Hope (Duarte, CA, Stany Zjednoczone). Wszystkie składniki zestawów, włączając w to 2B8-MX-DTPA o jakości do stosowania klinicznego, wytworzyła firma IDEC Pharmaceuticals zgodnie z zasadami GMP (Właściwe Warunki Wytwarzania według przepisów federalnych) i stwierdzono, że są one jałowe i apirogenne.

Przeciwciała wyznakowane radioaktywnie wytworzono w 1X PBS, zawierającym 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy (HSA; jakość do zastosowania klinicznego; Baxter-Hyland) i 1 mM DTPA. Wyniki testów uwalniania, wykonanych dla każdej partii walidowanej, opisano poniżej.

Pięciu operatorów wytworzyło sześć partii walidacyjnych In2B8 i Y2B8. Partie te oznaczono w następujący sposób i wykonano w następujących ośrodkach:

In2B8:

- IDEC Pharmaceuticals

- IDEC Pharmaceuticals

- IDEC Pharmaceuticals

- MD Anderson Health Center

- Mayo Clinic

- City of Hope

Y2B8:

- IDEC Pharmaceuticals

- IDEC Pharmaceuticals

- IDEC Pharmaceuticals

- MD Anderson Health Center

- Mayo Clinic

- City of Hope

2. Wytwarzanie liofilizowanych komórek SB i HSB

Ludzkie linie komórkowe SB (CD20-dodatnie) i HSB (CD20-ujemne) uzyskano z American Type Culture Collection i hodowano w kolbach T z zastosowaniem RPMI-1640, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, uzupełnionej 2% glutaminą. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2. Komórki typowo dzielono 1:2 codziennie i zbierano w ilości 0,5-2,5 x 10⁶ komórek/ml i przy żywotności >80%. Określano stężenie komórek przy użyciu hematocytometru i ich żywotność metodą wyłączania błękitu trypanowego.

PL 205 780 B1

Komórki zebrano w temperaturze otoczenia z gęstością 0,5-2 x 10⁶ komórek/ml poprzez odwirowanie (1300 obr./min w wirówce Sorvall) i przepłukano dwukrotnie 1 x HBSS. Komórki w grudkach ponownie zawieszono do stężenie 50 x 10⁶ komórek/ml w 1 x HBSS, zawierającym 1% (masa/obj.) bydlęcej albuminy surowicy (BSA) i 10% mannitu (bufor liofilizacji), 0,5 ml nalano do 1,5 ml polipropylenowych probówek mikrofugowych z uszczelkami w kształcie litery „o” i przechowywano w temperaturze -70°C, i liofilizowano przez noc przy 30-60 militorach. Probówki z liofilizowanymi komórkami przechowywano w stanie wysuszonym w temperaturze 2-8°C i ponownie rozpuszczono w jałowej wodzie celem wykonania testu; probówki komórek liofilizowanych w probówkach mikrofugowych przechowywano ze środkiem suszącym.

3. Testy analityczne

Poniżej opisano metody analityczne, stosowane do walidacji partii In2B8 i Y2B8. Dla każdej walidowanej partii przeprowadzono następujące testy:

1. Test wiązania z zastosowaniem liofilizowanych komórek SB.

2. Test włączania radioaktywnego Y2B8/In2B8 z zastosowaniem zestawu Bioder.

а. Testy wiązania

Procentowe wiązanie oceniane było przez każdego operatora z zastosowaniem liofilizowanych CD20-dodatnich komórek SB według następujących protokołów, odpowiednio, dla In2B8 i Y2B8. Testy te są szybką i skuteczną metodą potwierdzania, że wyznakowane radioaktywnie przeciwciało nadal rozpoznaje CD20 jako antygen. W jednym ośrodku klinicznym oceniano również CD20-ujemne komórki HSB. Liofilizowane komórki wytwarzano i przechowywano według powyższego sposobu, „Wytwarzanie liofilizowanych komórek SB i HSB”.

i. Test wiązania In2B8

Dodatkowe odczynniki

1. Ind[111]-2B8-MX-DTPA.

2. Liofilizowane komórki SB: trzy probówki, zawierające 25 x 10⁶ komórek/probówkę.

3. Liofilizowane komórki HSB: trzy probówki, zawierające 25 x 10⁶ komórek/probówkę.

4. Jałowa woda do irygacji lub jałowa woda do wstrzyknięć.

5. Bufor do rozcieńczania (1 x PBS, pH 7,2-7,4, zawierający 1% bydlęcą albuminę surowicy (BSA0 i 0,02% azydku sodowego przefiltrowanego przez filtr 0,2 gm i przechowywanego w temperaturze pokojowej.

б. Szklane lub plastykowe probówki testowe do zliczania radioaktywności.

Procedura

Początek badania (część nie radioaktywna)

1. Wytworzono trzy probówki liofilizowanych komórek SB i HSB.

2. Do każdej probówki dodano objętość 0,5 ml SWFI (jałowej wody do wstrzyknięć) i probówki mieszano aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.

3. Cztery puste 1,5 ml probówki mikrofugowe. Do trzech probówek dodano 0,5 ml buforu do rozcieńczania: stanowiły one kontrolę bez komórek.

4. Do ostatniej 1,5 ml probówki mikrofugowej dodano 0,99 ml bufora do rozcieńczania; tę probówkę wyznakowano 1:100.

5. Uzyskano 50 ml jałową probówkę polipropylenową z zakrętką i dodano do niej 10 ml buforu do rozcieńczania.

Początek badania (część radioaktywna)

1. Uzyskano wyznakowane radioaktywnie przeciwciało, przechowywane w temperaturze 2-8°C.

2. Pobrano objętość 0,01 ml za pomocą P20 i dodano do 1,5 ml probówki mikrofugowej, zawierającej 0,99 ml buforu do rozcieńczania (rozcieńczenie 1:100). Koniuszek przepłukano i probówkę delikatnie zmieszano.

3. Pobrano objętość 0,20 ml za pomocą P20 z probówki z rozcieńczeniem 1:100 i dodano do stożkowatej probówki, zawierającej 10 ml buforu do rozcieńczania. Probówkę dokładnie zmieszano.

Protokół testu

1. Do wszystkich probówek dodano objętość 0,50 ml rozcieńczonego ¹¹¹In2B82B8-MX-DTPA.

2. Na wszystkich probówkach nakrętki dokładnie zakręcono i probówki mieszano ciągle przez 60 minut.

3. Po 60 minutach inkubacji w temperaturze otoczenia wszystkie probówki odwirowywano przez 5 minut z przyśpieszeniem co najmniej 2000 g.

PL 205 780 B1

4. Objętość 0,75 ml każdego nadsączu przeniesiono do probówek odpowiednio do instrumentu zliczającego.

5. Radioaktywność w probówkach zliczano licznikiem gamma, dostosowując do poziomu tła. ii. Test wiązania Y2B8

Dodatkowe odczynniki

1. ⁹⁰Y2B8-MX-DTPA.

2. Liofilizowane komórki SB.

3. Jałowa woda do irygacji lub jałowa woda do wstrzyknięć.

4. Bufor do rozcieńczania (1 x PBS, pH 7,2-7,4, zawierający 1% bydlęcej albuminy surowicy (BSA) i 0,02% azydku sodowego).

Procedura

Wytwarzanie próbki przeciwciała wyznakowanego radioaktywnie

1. Uzyskano wyznakowane radioaktywnie przeciwciało, przechowywane w temperaturze 2-8°C.

2. Pobrano objętość 10 μl za pomocą P20 i dodano do 1,5 ml probówki mikrofugowej, zawierającej 990 μl buforu do rozcieńczania (rozcieńczenie 1:100). Koniuszek przepłukano i probówkę delikatnie zmieszano.

3. Uzyskano 50 ml jałową probówkę polipropylenową i przeniesiono do niej 10 ml buforu do rozcieńczania, stosując 10 ml pipetę serologiczną.

4. Pobrano objętość 35 μl za pomocą P200 z probówki z rozcieńczeniem 1:100 i dodano do stożkowatej probówki, zawierającej 10 ml buforu do rozcieńczania. Zmieszano dokładnie.

Wytwarzanie liofilizowanych komórek

1. Uzyskano trzy probówki liofilizowanych komórek SB.

2. Do każdej probówki dodano objętość 0,5 ml SWFI, i probówki zmieszano aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

3. Uzyskano trzy puste 1,5 ml probówki mifrofugowe: do trzech probówek dodano 0,5 ml buforu do rozcieńczania, i stanowiły one kontrole bez komórek.

Protokół testu

1. Do każdej probówki dodano objętość 0,5 ml rozcieńczonego ⁹⁰Y2B8.

2. Probówki umieszczono na końcu nad mieszaczem na 45 minut, po upewnieniu się, że zakrętki zostały dokładnie zakręcone.

3. Po 45 minutowej inkubacji w temperaturze otoczenia komórki zbito w grudki przez mikroodwirowanie przez 5 minut.

4. Objętość 0,8 ml nadsączu przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych.

5. Do każdej fiolki dodano koktajl scyntylacyjny.

6. Określono ilość radioaktywności w każdej fiolce z zastosowaniem licznika scyntylacyjnego, dostosowanego do poziomu tła.

b. Test włączania znacznika radioaktywnego

Określono odsetek włączania znacznika radioaktywnego po przez błyskawiczną chromatografię cienkowarstwową (ITLC) z zastosowaniem zestawu radiochromatograficznego Biodex TecControl według następującego protokołu:

Dodatkowe materiały i sprzęt

1. 2B8-MX-DTPA wyznakowane ¹¹¹In lub ⁹⁰Y.

2. Probówki do zliczania radioaktywnych pasków TLC.

3. Nożyczki.

₃

4. Jałowa strzykawka 1 cm³.

5. Jałowe igły, 26G.

6. Licznik gamma lub licznik scyntylacyjny.

Pipetor

Procedura

1. Najpierw należy przeczytać w całości Instrukcję Obsługi Biodex.

2. Każdą wyznakowaną radioaktywnie próbkę w trzech egzemplarzach badano zgodnie z instrukcjami do zestawu: rozwijano jeden pasek na fiolkę.

3. Do nakroplenia wyznakowanej radioaktywnie próbki na pasek chromatograficzny, stosowano pipetor - nakraplano 1 μl na linię początkową. Zamiast tego można nakraplać jedną małą kroplę z igły 26G, przyłączonej do strzykawki 1 cm³.

PL 205 780 B1

4. Każdą sekcję zliczano pod kątem radioaktywności odpowiednim licznikiem, to znaczy licznikiem gamma w przypadku ¹¹¹In i licznikiem scyntylacyjnym dla ⁹⁰Y, dostosowując do poziomu tła.

5. Postępowano zgodnie z instrukcjami Biodex w celu obliczenia odsetka wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała.

IV. Wyniki

Wyniki badania dla każdej walidowanej partii In2B8 lub Y2B8 podsumowano w tabelach 38 i 39.

T a b e l a 38

Wyniki testu uwalniania dla walidacji Y2B8
Nr partii	% włączania znacznika radioaktywnego	% wiązania
1	99,5	78,6
2	99,3	87,0
3	99,4	85,9
4	99,2	81,8
5	99,2	79,6
6	96,3	80,8
	Średnia = 98,8	Średnia = 82,3
	Odchylenie standardowe = 1,24%	Odchylanie standardowe = 3,4%
	CV = 1,25%	CV = 4,2%

T a b e l a 39

Wyniki testu uwalniania dla walidowanych partii In2B8

Nr partii	% włączania znacznika radioaktywnego	% wiązania
1	99,4	86,2
2	98,7	86,8
3	99,3	85,8
4	98,3	86,7
5	99,0	82,1
6	99,3	83,0
	Średnia = 99,0	Średnia = 85,2
	Odchylenie standardowe = 0,43%	Odchylenie standardowe = 2,06%
	CV = 1,25%	CV = 2,42%

V. Omówienie i wnioski

W celu uproszczenia obecnych metod znakowania radioaktywnego dla In2B8 i Y2B8, opracowano czteroskładnikowy zestaw. Stężenie octanu sodowego i 2B8-MX-DTPA zmniejszono, odpowiednio, do 50 mM i 2 mg/ml, dla umożliwienia przenoszenia dokładnie określonej objętości z zastosowaniem strzykawek. Wszystkie składniki zestawu, korzystnie, nałożono do szklanych fiolek z przegródką i badano pod kątem jałowości i pirogenności w IDEC przed wysłaniem do ośrodków, eliminując w ten sposób konieczność wykonywania tych testów w ośrodkach klinicznych. W ośrodku klinicznym wszystkich manipulacji z odczynnikami dokonuje się z użyciem jałowych strzykawek i igieł. Tak więc stosowanie się do techniki aseptycznej, jak zwykle w warunkach apteki radiologicznej, zapewnia to, że wyznakowane radioaktywnie przeciwciała, przetworzone w preparat, nadają się do podawania pacjentom.

Oceniano powtarzalność i odporność protokołów znakowania radioaktywnego dla In2B8 i Y2B8, wykonując kilka testów walidacyjnych z zastosowaniem różnych partii obu radioizotopów. Dla sześciu wytworzonych partii walidacyjnych In2B8 wiązanie wynosiło od 82,1% do 86,8% ze średnią 85,1%; wartość włączania znacznika radioaktywnego wynosiła około 99% (zakres od 98,3% do 99,4%). Dla

PL 205 780 B1 sześciu wytworzonych partii walidacyjnych Y2B8, procentowe wiązanie wynosiło od 78,6% do 87% ze średnią 82,3%. Średnia wartość włączania znacznika radioaktywnego dla Y2B8 wynosiła 98,8% (zakres od 96,3% do 99,5%). Wyniki te w sumie potwierdzają powtarzalność i odporność metod zestawów znakowania radioaktywnego do wytwarzania zarówno In2B8, jak i Y2B8. W oparciu o te wyniki walidacji zaleca się, aby ustalić wyszczególnienie warunków wydawania preparatów dla włączania znacznika radioaktywnego i wiązania, odpowiednio, na >95% i >70% dla In2B8 i Y2B8.

Dodatkowo, z uwagi na coraz większą łatwość zastosowania i zmniejszenie możliwości pomyłek w czasie wytwarzania, zaleca się, aby do badań przed wydaniem In2B8 i Y2B8 do ośrodków klinicznych stosować procentowe wiązanie z zastosowaniem liofilizowanych komórek CD20-dodatnich i włączania znacznika radioaktywnego.

Podsumowując, wyniki te razem wskazują, że In2B8 i Y2B8, wytworzone z zastosowaniem zestawu do znakowania radioaktywnego, nadają się do zastosowania w warunkach klinicznych. Dodatkowo dla obu znakowanych radioaktywnie przeciwciał ustala się wyszczególnienie warunków wydawania, odzwierciedlające wyniki kilku serii badań walidacyjnych, prowadzonych przez pięciu różnych operatorów.

P r z y k ł a d 2

Włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie - zestawy i testy

I. Podsumowanie

Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD20, oznaczone 2B8, klonowano w komórkach CHO dla uzyskania linii komórkowej o dużej ekspresji. Swoistość pochodzących z CHO przeciwciał dla CD20-dodatnich komórek ludzkich wykazano w analizie FACS i wiązaniu kompetycyjnym. Dla ludzkich limfocytów T obserwowano pomijalne wiązanie. Określono, że powinowactwo przeciwciała do komórek CD20-dodatnich wynosi 1,3 x 10^-1 M, stosując test wiązania kompetycyjnego. Przeciwciało poddano reakcji ze środkiem chelatującym MX-DTPA do wytworzenia koniugatu - 2B8-MX-DTPA - z pomijalną utratą immunoreaktywności (wartość powinowactwa wynosiła 4,4 x 10^-1). Optymalne sprzężenie chelatora, oznaczone przez pomiar włączania radioaktywnego ¹¹¹In, uzyskano po ośmiu godzinach reakcji. Optymalizowano protokoły znakowania radioaktywnego dla 2B8-MX-DTPA dla ⁹⁰Y lub ¹¹¹In w odniesieniu do pH i czasu inkubacji dla zapewnienia maksymalnego włączania znacznika radioaktywnego (>95%) i zachowywania immunoreaktywności (70%). Wydano zalecenia odnośnie wyszczególnienia wydawania In2B8 i Y2B8, wytwarzanych z zastosowaniem pochodzącego z CHO 2B8-MX-DTPA, do badań klinicznych, w odniesieniu do włączania znacznika radioaktywnego (>95%) i wiązania z liofilizowanymi i ponownie zawieszonymi ludzkimi komórkami CD20-dodatnimi (70%). W sumie wyniki te wskazują na to, że 2B8-MX-DTPA pochodzące z CHO nadaje się do zastosowania w badaniach klinicznych.

II. Wprowadzenie

Uprzednio stosowane przeciwciało 2B8 wytworzono w bioreaktorze włókien kapilarnych. W celu zmniejszenia kosztów wytwarzania tego przeciwciała, dokonano jego klonowania i ekspresji w komórkach CHO celem uzyskania linii komórkowej o dużej ekspresji produkcji. Przykład ten opisuje wyniki charakteryzowania in vitro przeciwciała 2B8, pochodzącego z CHO, przeciwciała sprzężonego (2B8-MX-DTPA) i produktów przeciwciała wyznakowanych ⁹⁰Y i ¹¹¹In, wytworzonych z zastosowaniem klinicznych protokołów zestawów do znakowania radioaktywnego.

III. Materiały i metody

A. Odczynniki

Ludzkie linie komórkowe SB (CD20-dodatnie) i HSB (CD20-ujemne) uzyskano z American Type Culture Collection i hodowano w kolbach T z zastosowaniem RPMI-1640, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, uzupełnionej 2% glutaminą. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37°C i atmosferze 5% CO2. Komórki typowo dzielono codziennie w stosunku 1:2 i zbierano ze stężeniem 0,5-2,5 x 10⁶ komórek/ml i z żywotnością >80%. Określono stężenie komórek z zastosowaniem hematocytometru i określono żywotność metodą wyłączania błękitu trypanowego. Dokładne informacje na temat partii komórek zawarto w Notatniku nr 1553 i w segregatorze zatytułowanym „Cell Activity Logbook 1995 & 1996”, autorstwa Ron Morena.

Pochodzące z CHO 2B8 wytwarzano zgodnie z zasadami GMP z fabryce IDEC. Z przeciwciała wytworzono preparat w soli fizjologicznej o niskiej zawartości metalu w stężeniu 11,5 mg/ml. Za pomocą SDS-PAGE stwierdzono jednorodność przeciwciał. Wytworzono 2B8-MX-DTPA zgodnie z warunkami GMP i PSBR-043, z 2B8 pochodzących z CHO, i wytworzono z nich preparat w soli fizjologicznej o niskim stężeniu metalu, w stężeniu 2 mg/ml (partia nr 0165A i 0165B).

PL 205 780 B1

Chlorek ¹¹¹In o czystości do zastosowania w farmacji nabyto w Amersham (Wielka Brytania) lub Cyclotron Products Inc. (Coral Gables, FL, Stany Zjednoczone). Chlorek itru[90] uzyskano z Amersham (Wielka Brytania), Nordion International (Kanatta, Kanada) lub Pacific Northwest National Laboratory (Richland, WA, Stany Zjednoczone). MX-DTPA, wytworzone zgodnie z zasadami GMP, uzyskano z Hauser Chemical (Boulder, CO, Stany Zjednoczone). Sól trójsodowowapniową kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA) o czystości nadającej się do zastosowania klinicznego uzyskano z Heyl (Berlin, Niemcy). TAG-NHS uzyskano z IGEN Inc. (Rockville, MD, Stany Zjednoczone). Paciorki z mysimi anty-CD19 nabyto w Dynal Inc. (Lake Success, NY, Stany Zjednoczone). Kozie przeciwciała F(ab')2, skierowane przeciwko przeciwciałom mysim, wyznakowane FITC, nabyto w Jackson ImmunoResearch.

Odczynniki wymagające usunięcia zanieczyszczających metali ciężkich potraktowano w partii Chelex 100 (BioRad Industries) lub Chelating Sepharose (Pharmacia) poprzez przepuszczenie roztworów przez kolumnę. Roztwory podstawowe o niskiej zawartości metalu rozcieńczono jałową wodą do irygacji (SWFIr). Roztwory przechowywano w jałowych pojemnikach plastykowych.

Dodatkowe odczynniki opisano poniżej dla konkretnych metod.

B. Materiały i sprzęt

1. Origen Analyzer, IGEN Inc., model nr 1100-1000; IDEC nr 1492.

2. Licznik scyntylacyjny Top-Count; Packard; model nr A9912; nr IDEC 1329.

3. Licznik gamma; Isodata, model nr 20-10, nr IDEC 0628.

4. Zestaw radiochromatograficzny Tec-Control, Biodex, model nr 151-770.

5. Liofilizator; Virtis; model Freezemobile 12; nr IDEC 0458 IDEC.

Dodatkowe materiały i sprzęt opisano poniżej dla konkretnych metod.

C. Metody

1. Wytwarzanie liofilizowanych komórek SB i HSB

Komórki hodowano w sposób opisany powyżej i zebrano w temperaturze otoczenia z gęstością komórek 0,5-2 x 10⁶ komórek/ml poprzez odwirowanie 91300 obr./min w wirówce Sorvall) i przepłukano dwukrotnie 1 x HBSS. Komórki w grudkach ponownie zawieszono do stężenie 50 x 10⁶ komórek/ml w 1 x HBSS, zawierającym 1% (masa/obj.) bydlęcej albuminy surowicy (BSA) i 10% (masa/obj.) mannitu (bufor liofilizacyjny), 0,5 ml nalano do 1,5 ml polipropylenowych probówek mikrofugowych z uszczelkami w kształcie litery o i przechowywano w temperaturze -70°C, i liofilizowano przez noc przy 30-60 militorów. Probówki liofilizowanych komórek przechowywano w stanie wysuszonym w temperaturze 2-8°C i ponownie rozpuszczono w jałowej wodzie do testów; probówki komórek liofilizowanych w probówkach mikrofugowych przechowywano ze środkiem suszącym.

2. Analiza wiązania FACS

Oznaczono bezpośrednie wiązanie przeciwciał z ludzkimi limfocytami B poprzez cytometrię przepływową. Przeciwciała w rosnącym stężeniu inkubowano w 1 x PBS, pH 7,2, zawierającym 1% (masa/obj.) BSA (bufor wiążący) z 5 x 10⁶ komórek CD20-dodatnich (SB) lub CD20-ujemnych (HSB) przez 30 minut na lodzie. Komórki przepłukano przez odwirowanie, ponownie zawieszono w buforze wiążącym i inkubowano z wyznakowanym FITC kozim przeciwciałem, skierowanym przeciwko mysiemu F(ab'2) przez 30 minut na lodzie. Po inkubacji z odczynnikiem wtórnym komórki przemyto przez odwirowanie i ponownie zawieszono w 1 x PBS, zawierającym 1,1% (obj.) formaldehydu w celu utrwalenia komórek. Określono średnią intensywność fluorescencji z zastosowaniem cytometrii przepływowej.

3. Testy wiązania kompetycyjnego

Określono immunoreaktywność 2B8 i 2B8-MX-DTPA przez kompetycyjne wiązanie z CD20-dodatnimi komórkami SB z zastosowaniem metody elektrochemiluminescencji ORIGEN (Leland i Powell). Komórki SB fazy logarytmicznej zebrano z hodowli i przepłukano dwukrotnie 1 x HBSS. Komórki rozcieńczono w 1 x PBS, pH 7,2, zawierającym 1% (masa/obj.) bydlęcej albuminy surowicy. W niektórych doświadczeniach stosowano liofilizowane komórki po ponownym zawieszeniu w jałowej wodzie.

Wytworzono wyznakowane rutenem przeciwciało wskaźnikowe, inkubując pochodzące z CHO 2B8 (partia nr 165) w 1 x PBS, pH 7,2, z chelatorem tris-bipirydynowym estru N-hydroksybursztynimidowego rutenu (II) (TAG-NHS) w stosunku molowym 15:1 TAG-NHS do przeciwciała. Po 1 h inkubacji w temperaturze otoczenia, przy ochronie przed światłem, reakcję przerwano glicyną na 10 minut. Usunięto nieprzereagowane TAG poprzez chromatografię wykluczenia ze względu na wielkość z zastosowaniem kolumny Pharmacia PD-10, zrównoważonej 1 x PBS. Oznaczono stężenie białka z zastosowaniem testu białkowego Bradford. Oznaczono włączanie TAG poprzez pomiar absorbancji przy 455 nm. Obliczono, że stosunek molowy TAG do białka wynosi 3,0.

PL 205 780 B1

Testy prowadzono w probówkach polipropylenowych 12 x 75 mm. Różną ilość przeciwciał kompetycyjnych (0,002-17 gg/ml) inkubowano w 1 x PBS, pH 7,2, zawierającym 1% (masa/obj.) BSA z 0,08 gg/ml CHO 2B8, wyznakowanego TAG, 0,08 mg/ml paciorków z anty-CD19 i 167000 komórek/ml. Po inkubacji w temperaturze otoczenia z orbitalnym mieszaniem przez 3 godziny, oznaczono elektrochemiluminescencję (ECL) z zastosowaniem instrumentu ORIGEN. Określono średnią wartość ECL dla podwójnych próbek i sporządzono wykres w stosunku do stężenia przeciwciał kompetycyjnych z zastosowaniem oprogramowania Kaleidagraph. W przypadku niektórych doświadczeń sporządzono wykres hamowania procentowego. Dokonano dostosowania krzywych kompetycji i określenia wartości EC 50 (stężenie przeciwciał, dające 50% maksymalnego wiązania) z zastosowaniem następującego 4-parametrowego programu:

y = ((m1-m4)/(1+(m0/m3^Am2))+m4;m1=;m2=;m3=;m4=m0 = zmienna niezależna m1 = reakcja sygnału zero we względnych jednostkach ECL m2 = parametr zakrzywienia m3 = EC50 w gg/ml m4 = reakcja sygnału maksymalnego we względnych jednostkach ECL.

Obliczono średnie wartości powinowactwa z wartości EC50 i znane stężenie przeciwciała wskaźnikowego z zastosowaniem metody Mullera.

4. Wytwarzanie 2B8-MX-DTPA

Środek chelatujący, kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3-metylodietylenotetraminopentaoctowy (MX-DTPA) dostarczono w postaci suchego proszku (wolny kwas) i przechowywano w stanie wysuszonym w temperaturze -20°C lub -70°C. Około 3 mg przeciwciała 2B8 CHO w soli fizjologicznej o niskiej zawartości metalu dostosowano do pH 8,6 przez dodanie jednej dziesiątej objętości 50 mM boranu sodowego, pH 8,6. Przeciwciało w stężeniu 10-11 mg/ml inkubowano w stosunku molowym MX-DTPA do białka, wynoszącym 4:1, przez dodanie MX-DTPA rozpuszczonego w 50 mM boranu sodowego, pH 8,6. Po inkubacji w temperaturze otoczenia (2-24 h) usunięto z koniugatu nieprzereagowany chelator poprzez wielokrotną diafiltrację w soli fizjologicznej o niskiej zawartości metalu z zastosowaniem filtrów spinowych Centricon-30.

5. Wytwarzanie In2B8 i Y2B8

Wytworzono In2B8 z zastosowaniem protokołu zestawu do znakowania radioaktywnego, jak to opisano. Przeciwciało wyznakowane z aktywnością swoistą 3 mCi/mg i wytworzono z niego preparat o stężeniu 0,2 mg/ml. Pokrótce, 0,5-2 mCi chlorku ¹¹¹In przeniesiono do probówki mikrofugowej bez metalu i doprowadzono do pH około 4,2 z zastosowaniem 1,2 x objętości 50 mM octanu sodowego o niskiej zawartości metalu. Do roztworu octanu indu dodano 2B8-MX-DTPA w stężeniu 2 mg/ml i po inkubacji w temperaturze otoczenia przez 30 minut z wyznakowanego przeciwciała sporządzono preparat 0,2 mg/ml w 1 x PBS, pH 7,2, zawierający 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA (4% - 6% końcowego stężenia HSA). Wszystkie próbki badano pod kątem włączania znacznika radioaktywnego w trzech egzemplarzach; wartość wynosiła >95%.

Wytworzono również Y2B8 z zastosowaniem wersji na małą skalę protokołu zestawu do znakowania radioaktywnego, opisanego w przykładzie 1. Przeciwciało wyznakowano z aktywnością swoistą 15 mCi/mg i sporządzono z niego preparat 0,3 mg/ml. Pokrótce, 0,5-2 mCi chlorku ⁹⁰Y przeniesiono do probówki mikrofugowej bez metalu i pH doprowadzono do wartości około 4,2, stosując 1,2 x objętość 50 mM octanu sodowego o niskiej zawartości metalu. Do roztworu octanu ⁹⁰Y dodano 2B8-MX-DTPA w stężeniu 2 mg/ml i po inkubacji w temperaturze otoczenia przez 5 minut, z wyznakowanego przeciwciała sporządzono roztwór w stężeniu 0,3 mg/ml w 1 x PBS, pH 7,2, zawierający 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA (końcowe stężenie HSA 4% - 6%). Wszystkie próbki badano pod kątem włączania znacznika radioaktywnego w trzech egzemplarzach; wartości wynosiły >95%.

Obliczono stężenie radioaktywności końcowego wyznakowanego radioaktywnie produktu w oparciu o ilość radioaktywności dodanej do mieszaniny reakcyjnej i w odniesieniu do Certyfikatu Analizy radioizotopu. Stężenie przeciwciał w mieszaninie reakcyjnej przerwanej reakcji obliczano ze znanej ilości dodanego przeciwciała.

Do badań kinetycznych znakowania radioaktywnego, oceniających wpływ pH na włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie, dostosowano pH mieszanin reakcyjnych poprzez dodanie różnej ilości 50 mM octanu sodowego o niskiej zawartości metalu (0,8-2,2 x objętość roztworu radioizotopu).

6. Oznaczanie włączania radioaktywnego In2B8 i Y2B8

Oznaczano ilość radioaktywności związanej z koniugatami (włączanie znacznika radioaktywnego) w końcowych produktach lub próbkach do inkubacji z zastosowaniem dostępnego w handlu zePL 205 780 B1 stawu produkcji Biodex (Zestaw do radiochromatografii TecControl, zob. przykład 1). Ogólnie 1 μl próbek badanych nałożono w dwóch lub trzech egzemplarzach mikropipetą i rozwinięto zgodnie z instrukcją Biodex. Zliczano połówki pasków pod kątem radioaktywności w probówkach szklanych z zastosowaniem licznika gamma Isodata lub licznika scyntylacyjnego Packard Top Count, jak to opisano poniżej. Włączanie znacznika radioaktywnego obliczano dzieląc ilość radioaktywności w górnej połowie paska przez całkowitą radioaktywność wykrywaną zarówno w górnej, jak i dolnej połowie paska. Wartość tę wyrażano jako odsetek i określano wartość średnią.

7. Oznaczanie immunoreaktywności In2B8 i Y2B8

Immunoreaktywność oznaczano sposobem Lindmo i wsp. i w sposób opisany powyżej w przykładzie 1.

8. Test wiązania bezpośredniego dla In2B8 i Y2B8

Te same protokoły, co opisane, stosowano do oznaczenia wiązania z CD20-dodatnimi komórkami SB, odpowiednio, dla In2B8 i Y2B8. In2B8 i Y2B8 wytworzono w sposób opisany powyżej. Do testu próbki In2B8 lub Y2B8 rozcieńczono z testowym buforem do rozcieńczania (1 x PBS, pH 7,2, zawierający 1% (masa/obj.) bydlęcej albuminy surowicy (BSA) do stężenia, odpowiednio, 40 ng/ml i 11 ng/ml.

Komórki antygenowo dodatnie (SB) i antygenowo ujemne (HBS) utrzymywano w RPMI 1640, uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą w temperaturze 37°C i atmosferze 5% CO2. Komórki (żywotność >90%, oznaczana metodą wyłączania błękitu trypanowego) zebrano w temperaturze otoczenia z gęstością komórek 0,5-2 x 10⁶/ml przez odwirowanie (1300 obr./min w wirówce Sorvall) i przepłukano dwukrotnie 50 ml 1 x HBSS. Komórki w grudkach zawieszono ponownie do stężenia 50 x 10⁶ komórek/ml w schłodzonym wstępnie 1 x HBSS, zawierającym 1% (masa/obj.) bydlęcej albuminy surowicy (BSA) i 10% (masa/obj.) mannicie (bufor liofilizacyjny). Zawiesiny komórek umieszczono w 1,5 ml polipropylenowych probówkach mikrofugowych z uszczelkami w kształcie litery o w stężeniu 50 x 10⁶ komórek/ml (0,5 ml na probówkę) i liofilizowano przez noc przy 30-60 militorach. Liofilizowane komórki przechowywano w stanie wysuszonym w temperaturze 2-8°C i ponownie zawieszono w jałowej wodzie celem wykonania testów.

Liofilizowane komórki SB i HSB w 1,5 ml probówkach polipropylenowych ponownie zawieszono w stężeniu 50 x 10⁶ komórek/ml stosując jałową wodę. Do komórek dodano rozcieńczone In2B8 lub Y2B8, w trzech egzemplarzach, i inkubowano, odpowiednio, przez 45-60 minut z mieszaniem typu koniec na koniec w temperaturze otoczenia. Po inkubacji z komórek wytworzono grudkę przez odwirowanie i oznaczono związaną z komórkami radioaktywność przez zliczanie próbek z licznika gamma Isodata lub liczniku scyntylacyjnym Packard Top Count, jak to opisano poniżej. Radioaktywność związaną (bound - B) z komórkami obliczono, odejmując radioaktywność niezwiązaną (nadsącz) od całkowitej dodanej radioaktywności. Oznaczono całkowitą radioaktywność z radioaktywności zliczonej w probówkach bez komórek. Obliczono procentowe wiązanie, wyrażając ilość związaną jako odsetek liczby całkowitej.

9. Pomiar radioaktywności

Zliczano próbki włączania znacznika radioaktywnego przez 1 minutę z zastosowaniem licznika gamma Isodata. Licznik ustawiono na okno energetyczne 100-500 KeV i tło doprowadzono do zera bezpośrednio przed użyciem do próbek z zastosowaniem ¹¹¹In. Licznik gamma Isodata zastosowano także do zliczania pasków ITLC z nakroplonym ⁹⁰Y. Okna energetyczne dla wykrywania promieniowania hamowania wynosiły 100-1000 KeV.

Do testów wiązania próbki ⁹⁰Y przeniesiono do 24-zagłębieniowych płytek i koktajlu MicroScint 40 i zliczano w Packard TopCount przez 1 minutę z zastosowaniem ustawienia energii na minimum i maksimum. Zliczano próbki indu-[111] przez 1 minutę, stosując licznik gamma Isodata. Licznik ustawiono na okno energetyczne 100-500 KeV i tło doprowadzono do zera bezpośrednio przed użyciem.

10. Wyszczególnienie warunków uwalniania dla dawek klinicznych In2B8 i Y2B8

Ustalono wyszczególnienie warunków uwalniania dla włączania znacznika radioaktywnego i wiązania z komórkami CD20-dodatnimi, wytwarzając po sześć dawek In2B8 i Y2B8 z zastosowaniem dwóch partii 2B8-MX-DTPA o czystości do zastosowania klinicznego (partia nr 0219 i 0220), wytworzonych według niniejszego wynalazku i napełnianych zgodnie z zasadami GMP. Testy uwalniania przeprowadzono w sposób opisany powyżej.

IV. Wyniki

A. Charakterystyka 2B8 pochodzącego z CHO

Stosując analizę cytometrii przepływowej wykazano, że 2B8 CHO wiąże się bezpośrednio z CD20-dodatnimi komórkami SB bez wiązania się z CD20-ujemnymi komórkami HSB (fig. 34). Nie odnoto90

PL 205 780 B1 wano istotnego wiązania z komórkami SB ani HSB dla nie mającego znaczenia dla stanu wiedzy izotypu (γ1κ) przeciwciała (S004).

Wiązanie 2B8 CHO z komórkami CD20-dodatnimi oceniano w testach współzawodnictwa z zastosowaniem układu detekcji chemiluminescencyjnej ORIGEN. Liofilizowane i ponownie zawieszone antygenowo-dodatnie komórki SB inkubowano z rosnącą ilością przeciwciała bf w obecności wyznakowanego rutenem wskaźnika 2B8 CHO. Wyniki wykazały, że 2B8 CHO hamuje wiązanie z komórkami CD20-dodatnimi w takim samym stopniu, jak przeciwciało pochodzące z bioreaktora włókien kapilarnych (2B8-49) (fig. 35). Wartości EC50 oznaczono graficznie i zastosowano metodę Mullera (1980) do obliczenia średnich wartości powinowactwa. Ustalono, że powinowactwo 2B8 CHO wynosi 1,3 x 10^-10 M; przeciwciało 2B8 pochodzące z bioreaktora włókien kapilarnych dało wartość powinowactwa 2,5 x 10^-10 M. Wiązanie nieswoiste było pomijalne, czego dowodzi brak współzawodnictwa z nie mającym znaczenia dla wynalazku izotypem przeciwciała - S004.

B. Charakterystyka 2B8-MX-DTPA pochodzącego z CHO

Wytworzono koniugat 2B8 (2B8-MX-DTPA) z zastosowaniem protokołu podobnego do protokołu stosowanego dla uprzednio scharakteryzowanych 2B8-9. Reakcje przeprowadzono z zastosowaniem około 3 mg przeciwciała i stosunku molowego 4:1 chelatora do przeciwciała. Oceniano czas inkubacji 2, 4, 8, 17 i 24 godzin w celu ustalenia czasu reakcji, dającego dopuszczalne zatrzymywanie wiązania z komórkami CD20-dodatnimi i duże włączanie ¹¹¹In. Krzywe wiązania kompetycyjnego, porównujące koniugat 2B8 CHO z koniugatem 2B8-MX-DTPA CHO poddanym reakcji przez 8-24 godziny były podobne, co wskazuje, że proces sprzęgania nie zmienił w istotny sposób wiązania przeciwciała z antygenem CD20 (fig. 36). Przy zastosowaniu wartości EC50, oznaczonej graficznie (fig. 36), stałe powinowactwa dla niesprzężonych i sprzężonych przeciwciał wynosiły od 2,3 x 10^-10 do 5,9 z 10^-10 M (tabela 40).

Włączanie znacznika radioaktywnego wynosiło >95% dla czasu sprzęgania 8-24 h (tabela 30).

T a b e l a 40

Wpływ czasu reakcji sprzęgania na włączanie znacznika radioaktywnego i immunoreaktywność 2B8-MX-DTPA CHO

Czas inkubacji (h)	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Powinowactwo (M)
0	Nie wykonano	2,3 x 10'10
2	83,5	Nie wykonano
4	90,5	Nie wykonano
8	96,1	5,9 x 10'10
17	97,3	5,9 x 10'10
24	98,8	4,4 x 10'10

C. Charakterystyka In2B8 i Y2B8 wytwarzanego z 2B8-MX-DTPA pochodzącego z CHO

Wytworzono 2B8-MX-DTPA CHO, wyznakowane indem-[111] (In2B8) z zastosowaniem protokołu zestawu znakowania radioaktywnego na małą skalę, uprzednio opisanego dla przeciwciała pochodzącego z bioreaktora włókien kapilarnych (przykład 1). Pokrótce, sprzężone przeciwciało (2B8-MX-DTPA pochodzące z CHO; partia nr 0165A) inkubowano z octanem ¹¹¹In we wskazanym pH przez 30 minut w temperaturze otoczenia. Wytworzono mieszaniny reakcyjne z PBS, pH 7,2, zawierające 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA. Preparaty próbek In2B8 badano pod kątem włączania znacznika radioaktywnego z zastosowaniem błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej. Oznaczono wiązanie In2B8 do komórek CD20-dodatnich z zastosowaniem liofilizowanych i ponownie zawieszonych komórek SB. Dla porównania, koniugat wytworzony z przeciwciała wytwarzanego przez hybrydoma (2B8-49) inkubowano z octanem ¹¹¹In przez 30 minut w pH 4,2 (warunki uprzednio ustalone dla tego przeciwciała).

Wykonano badania kinetyczne celem ustalenia warunków znakowania, zapewniających maksymalne zatrzymywanie wiązania komórek CD20-dodatnich i duże włączanie znacznika radioaktywnego (tabele 41 i 42). Sprzężone przeciwciało (2B8-MX-DTPA pochodzące z CHO) inkubowano w temperaturze otoczenia z octanem ¹¹¹In w pH 4,2 przez wskazany czas (tabela 42).

PL 205 780 B1

T a b e l a 41

Kinetyka znakowania radioaktywnego In2B8: wpływ pH na włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie z komórkami CD20-dodatnimi

pH reakcji	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Wiązanie (%)
3,0	97,7	85,3
3,7	98,5	83,9
4,0	98,6	84,1
4,3	98,0	84,0
4,6	98,9	83,4
Kontrola (2B8-49)	99,3	86,5

T a b e l a 42

Kinetyka znakowania radioaktywnego In2B8: wpływ czasu inkubacji na włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie z komórkami CD20-dodatnimi

	Czas inkubacji (min)	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Wiązanie (%)
pH 2,9	15	97,2	85,3
30	99,1	85,2
45	97,2	84,8
pH 4,6	15	99,0	87,2
30	97,2	86,8
45	99,4	86,3
Kontrola (2B8-49)		99,4	87,8

Wyniki wykazały, że dla zakresu pH od 3,0 do 4,6 i 30 minutowego czasu inkubacji osiągano >97% włączanie radioizotopu przy zachowaniu wiązania na poziomie około 84%. Włączanie znacznika radioaktywnego i wartość wiązania były niezmienne dla czasu inkubacji od 15 do 45 minut dla reakcji w pH 2,9-4,6 (tabela 42). Wyniki były porównywalne z wynikami uzyskanymi z zastosowaniem przeciwciała 2B8-49 (tabele 41 i 42).

Wytworzono przeciwciało wyznakowane itrem-[90], inkubując sprzężone przeciwciało (2B8-MX-DTPA pochodzące z CHO) z octanem ⁹⁰Y we wskazanym pH przez 5 minut w temperaturze otoczenia. Z mieszanin reakcyjnych wytwarzano preparat w PBS, pH 7,2, zawierającym 7,5% (masa/obj.) ludzkiej albuminy surowicy i 1 mM DTPA. Na tak wytworzonych próbkach Y2B8 przeprowadzono testy na włączanie znacznika radioaktywnego z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej. Oznaczono wiązanie Y2B8 do komórek CD20-dodatnich, stosując liofilizowane i ponownie zawieszone komórki SB. Dla porównania, koniugat wytworzony z przeciwciała wytwarzanego przez hybrydoma (2B8-49) inkubowano z octanem ⁹⁰Y przez 5 min w pH 4,2 (warunki uprzednio ustalone dla tego przeciwciała).

Przeprowadzono podobne badania kinetyczne dla oceny wytwarzania przeciwciała znakowanego ⁹⁰Y (Y2B8). Dla reakcji znakowania radioaktywnego w zakresie pH 3,9-4,7 przy czasie inkubacji 5 min, włączanie znacznika radioaktywnego wynosiło >96% przy >80% zatrzymywaniu komórek CD20-dodatnich (tabela 43). Podobne wyniki uzyskano dla czasu inkubacji 3, 5 i 10 minut dla zakresu pH 2,9-4,6 (tabela 44). Następnie sprzężone przeciwciało (2B8-MX-DTPA pochodzące z CHO) inkubowano w temperaturze otoczenia z octanem ⁹⁰Y w pH 4,2 przez wskazany czas (tabela 44). Wyniki były porównywalne z wynikami uzyskanymi z zastosowaniem przeciwciała 2B8-49 (tabele 43 i 44).

PL 205 780 B1

T a b e l a 43

Kinetyka znakowania radioaktywnego Y2B8: wpływ pH na włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie z komórkami CD20-dodatnimi

pH reakcji	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Wiązanie (%)
3,9	98,4	80,7
4,2	97,8	81,0
4,4	96,1	80,0
4,6	97,0	80,2
4,7	97,4	80,6
Kontrola (2B8-49)	99,3	82,6

T a b e l a 44

Kinetyka znakowania radioaktywnego Y2B8: wpływ czasu na włączanie znacznika radioaktywnego i wiązanie z komórkami CD20-dodatnimi

	Czas inkubacji (min)	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Wiązanie (%)
pH 3,9	3	97,0	82,0
5	98,9	82,1
10	99,2	82,3
pH 4,7	3	97,2	82,5
5	96,7	81,8
10	97,6	81,5
Kontrola (2B8-49)	99,2	84,2

Oznaczono immunoreaktywność dla In2B8 i Y2B8, wytworzonych z 2B8 CHO, z zastosowaniem metody Lindmo i wsp. Inkubowano rosnącą ilość świeżo zebranych komórek SB CD20-dodatnich z ustaloną ilością In2B8 lub Y2B8 w warunkach nadmiaru antygenu. Odwrotna analiza danych wiązania umożliwiła określenie immunoreaktywności wynoszącej, odpowiednio, 80,6% i 72,2% dla In2B8 i Y2B8 (fig. 37 i 38).

D. Wyszczególnienie uwalniania dla In2B8 i Y2B8 pochodzących z CHO

Zastosowano dwie partie zestawów do znakowania radioaktywnego In2B8/Y2B8 o czystości nadającej się do zastosowania klinicznego do wytworzenia sześciu partii In2B8 i sześciu partii Y2B8. Wytworzono In2B8 i Y2B8 z zastosowaniem wersji na małą skalę protokołów znakowania radioaktywnego, stosowanych obecnie w badaniach klinicznych. Każdą partię znakowanego radioaktywnie 2B8-MX-DTPA badano pod kątem włączania znacznika radioaktywnego i wiązania z ludzkimi komórkami CD20-dodatnimi (SB) i CD20-ujemnymi (HSB). Wyniki te podsumowano w tabelach 45 i 46. Dla sześciu wytworzonych partii In2B8 włączanie znacznika radioaktywnego wynosiło od 98,9% do 99,3% ze średnią 99,1%. Wiązanie komórek CD20-dodatnich wynosiło od 81,9% do 85,1% ze średnią 83,6%; wiązanie komórek CD20-ujemnych wynosiło <4%. Dla sześciu wytworzonych partii Y2B8 włączanie znacznika radioaktywnego wynosiło od 81,4% do 82,7% ze średnią 81,9%; wiązanie z komórkami CD20-ujemnymi wynosiło <8%.

T a b e l a 45

Wyniki testu uwalniania dla pochodzącego z CHO In2B8, wytworzonego z zastosowaniem protokołu zestawu do znakowania radioaktywnego

		Wiązanie (%)
Seria	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Komórki SB	Komórki HSB
1	2	3	4
1 (partia nr 0219)	99,1	81,9	2,8
2 (partia nr 0219)	99,3	83,2	2,8
3 (partia nr 0219)	99,2	83,6	3,7

PL 205 780 B1 cd. tabeli 45

1	2	3	4
4 (partia nr 0220)	99,0	83,8	2,6
5 (partia nr 0220)	98,9	84,1	2,6
6 (partia nr 0220)	98,9	85,1	3,3
	Średnia = 99,1%	Średnia = 83,6%	Średnia =2,9%
	SD = 0,2%	SD = 1,1%	SD = 0,4%

T a b e l a 46

Wyniki testu uwalniania dla pochodzącego z CHO Y2B8, wytworzonego z zastosowaniem protokołu zestawu do znakowania radioaktywnego

Seria	Włączanie znacznika radioaktywnego (%)	Wiązanie (%)
Komórki SB	Komórki HSB
1 (partia nr 0219)	98,7	82,1	7,4
2 (partia nr 0219)	98,6	82,7	0,7
3 (partia nr 0219)	98,3	82,2	7,2
4 (partia nr 0220)	97,4	81,8	1,7
5 (partia nr 0220)	97,6	81,4	2,2
6 (partia nr 0220)	98,4	81,4	1,1
	Średnia = 98,2%	Średnia = 81,9%	Średnia = 3,4%
	SD = 0,5%	SD = 0,5%	SD = 3,1%

V. Dyskusja i wnioski

Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD20 (2B8), klonowane i uległe ekspresji w komórkach CHO (2B8 pochodzące z CHO) utrzymuje swoistość względem ludzkich komórek CD20-dodatnich, jak na to wskazuje FACS i analiza wiązania kompetycyjnego. Wiązanie z ludzkimi limfocytami T było minimalne.

Ustalono, że powinowactwo przeciwciała do ludzkich komórek CD20-dodatnich wynosi 1,3 x 10^-10 M, sto-10 sując test wiązania kompetycyjnego. Stosując ten sam test uzyskano wartość powinowactwa 2,5 x 10^-10 M dla przeciwciała 2B8 pochodzącego z bioreaktora włókien kapilarnych.

Przeciwciało 2B8 CHO poddano reakcji z MX-DTPA, tworząc koniugat - 2B8-MX-DTPA, utrzymując korzystne zatrzymywanie immunoreaktywności. Ustalono optymalne włączanie chelatora, mierząc włączanie znacznika radioaktywnego ¹¹¹In i osiągnięto je po ośmiu godzinach inkubacji w temperaturze otoczenia. Optymalizowano protokoły znakowania radioaktywnego dla koniugatu 2B8-MX-DTPA

111 dla ⁹⁰Y lub ¹¹¹In w odniesieniu do pH i czasu inkubacji dla zapewnienia maksymalnego włączania znacznika radioaktywnego i zatrzymywania immunoreaktywności.

Wyniki kilku preparatów In2B8 i Y2B8 dowodzą powtarzalności protokołu znakowania radioaktywnego stosowanego do wytwarzania dawek do użytku klinicznego. W oparciu o te wyniki znakowania radioaktywnego sugeruje się ustalenie wyszczególnienia wydawania dla włączania znacznika radioaktywnego i wiązania, z zastosowaniem komórek CD20-dodatnich, odpowiednio, na >95% i >70%. W sumie wyniki te dowodzą porównywalności 2B8 pochodzącego z CHO i 2B8-49 pochodzącego z bioreaktora włókien kapilarnych, i wskazują na to, że 2B8-MX-DTPA pochodzący z CHO nadaje się do zastosowania w badaniach klinicznych.

Na koniec, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób znakowania, określany jako metoda „mix-and-shoot”, do wytwarzania klinicznych dawek wyznakowanych radioaktywnie przeciwciał, pozwalający uniknąć konieczności stosowanego obecnie etapu chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) dla usuwania radioizotopu niezwiązanego z białkami. Uproszczony protokół eliminuje pracochłonny etap oczyszczania przy utrzymaniu wysokiego poziomu włączania radioizotopu (>95%) i ulepszonego zatrzymywania immunoreaktywności (>70%). Stwierdzono, że wyznakowany radioak94

PL 205 780 B1 tywnie koniugat w postaci preparatu do stosowania klinicznego jest stabilny in vitro przy inkubacji w temperaturze 4°C przez 48 godzin, w oparciu o zatrzymywanie radioizotopu i immunoreaktywności. Dodatkowo znakowany radioaktywnie koniugat był stabilny przy inkubacji w surowicy ludzkiej w temperaturze 37°C przez 72 godziny. Badania dystrybucji biologicznej u myszy BALB/c nie wykazały nieprawidłowego odkładania się w tkankach ani istotnej akumulacji w kościach. Szacunki pochłoniętych dawek promieniowania dla „standardowego” człowieka o masie ciała 70 kg były porównywalne z danymi uzyskanymi w trwających badaniach klinicznych z zastosowaniem 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y. Wyniki tych badań wykazały, że 2B8-MX-DTPA wyznakowany ⁹⁰Y, wytworzony metodą „mix-and-shoot”, był porównywalny z wytworzonym w konwencjonalnym procesie HPLC. Walidacja protokołu zwiększania skali do wytwarzania wyznakowanego radioaktywnie koniugatu o czystości nadającej się do zastosowania klinicznego wykazała, że sposób był powtarzalny, a produkt porównywalny z wytwarzanym obecną metodą HPLC. Wyniki tych badań przedklinicznych wskazują, że ten nowy protokół „mix-and-shoot” można stosować do wytwarzania 2B8-MX-DTPA wyznakowanego ⁹⁰Y, nadającego się do zastosowania w badaniach klinicznych.

Piśmiennictwo

1. Adams, R.A., Flowers, A., i Davis, B.J. Direct Implantation and Transplantation of Human Acute Lymphoblastic Leukemia in Hamsters, SB-2. Cancer Research 28: 1121-1125, 1968.

2. Adams, R.A. Formal Discussion: The Role of Transplantation in the Experimenial Investigation of Human Leukemia and Lymphoma. Cancer Res. 27(1): 2479-2482, 1967.

3. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedoroko, J. i Buran, P.A., J., Immunol. Methods, 72: 77, 1984.

4. Kozak, R.W., Raubitschek, A., Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Junghaus, R., Gansow, O.A. i Waldmann, T.A., Cancer Res. (1989) 49:2639-2644.

5. Parker, B.A., Halpern, S.E., Miller, R.A., Hupf, H., Shawler, D.L., Collins, H.A., Amox, D., White, CA. i Royston, I. N. Eng. J. Med., złożono do druku.

6. Leland, J.K. i Powell, M.J.J. (1990) Electrochem. Soc. 137, 3127.

7. Muller, R. J. Immunological Methods (1980) 34, 345.

8. Mirzadeh, S., Brechbiel, M. W., Atcher, R. W. i Gansow, O.A. (1990), Bioconjugate Chemistry 1(1), 59.

9. Brechbiel, M. W., Gansow, O.A., Atcher, R.W, Sclom, J., Esteban, J, Simpson, D.E. i Colcher, D. (1986) 25, 2772.

Claims (32)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób radioaktywnego znakowania skoniugowanego z chelatorem przeciwciała anty-CD20 dla podawania pacjentowi, znamienny tym, że:

   (i) miesza się skoniugowane z chelatorem przeciwciało z roztworem zawierającym znacznik radioaktywny do wytworzenia mieszaniny;

   (ii) inkubuje się mieszaninę przez korzystną ilość czasu w korzystnych warunkach temperatury, pH i warunkach buforowych dla wytworzenia radioaktywnego przeciwciała, przy czym przeciwciało to ma więcej niż 95% włączonej radioaktywności; korzystną immunoreaktywność, taką, że może ono być podawane bezpośrednio pacjentowi bez dalszego oczyszczania ze znacznika radioaktywnego, który nie został włączony, i (iii) rozcieńcza się znakowane przeciwciało do odpowiedniego stężenia w preparacie buforu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało to jest monoklonalnym przeciwciałem anty-CD20.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało anty-CD20 jest 2B8-MX-DTPA.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat buforu zawiera sól fizjologiczną, radioprotektant i nie skoniugowany chelator.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że radioprotektant jest wybrany z grupy składającej się z albuminy surowicy ludzkiej (HSA), askorbinianu, kwasu askorbinowego, fenolu, siarczanów, glutationu, cysteiny, kwasu gentyzynowego, kwasu nikotynowego, askorbylo palmitynianu, HOP(:0)H2, glicerolu, sulfotlenku formaldehydosodowego, Na2S2O5, Na2S2O3 oraz SO2.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że nieskoniugowanym chelatorem jest DTPA lub EDTA.

   PL 205 780 B1
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zawierający znacznik radioaktywny przed zmieszaniem go z przeciwciałem skoniugowanym z chelatorem ma pH ustawiane na około 3 do 6.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że pH jest ustawiane roztworem octanu sodu o niskiej zawartości jonów metali.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że octan sodu ma stężenie około 10 do 1000 mM.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znacznikiem radioaktywnym jest chlorek ¹¹¹In.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że objętość roztworu zawierającego znacznik radioaktywny jest około 4-6 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności roztworu w czasie znakowania.
12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że około 1 ml przeciwciała skoniugowanego z chelatorem w stężeniu około 0,5 do 3 0 mg/ml jest mieszane z roztworem do znakowania.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że mieszanina jest inkubowana od około 30 sekund do 60 minut.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że preparat bufor jest dodawany w ilości niezbędnej do osiągnięcia końcowej objętości od około 10 ml do około 50 ml.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znacznikiem radioaktywnym jest chlorek ⁹⁰Y.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że objętość roztworu zawierającego znacznik radioaktywny jest pomiędzy 5 do 100 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności w czasie znakowania.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że objętość roztworu zawierającego znacznik radioaktywny jest około 45 mCi podzielone przez stężenie radioaktywności roztworu w czasie znakowania.
18. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że od 1 do 2 ml skoniugowanego z MX-DTPA przeciwciała w stężeniu około 0,5 do 30 mg/ml jest mieszane z roztworem do znakowania radioaktywnego.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że mieszanina jest inkubowana przez czas pomiędzy około 30 sekund do 60 minut.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że preparat buforu jest dodawany w ilości niezbędnej do osiągnięcia końcowej objętości od około 10 ml do około 50 ml.
21. 21. Test wiązania dla oznaczania procentu wiązania wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z komórką docelową, składający się z:

    (i) wyznakowania radioaktywnego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1, wytwarzając znakowane radioaktywnie przeciwciało;

    (ii) mieszania i inkubowania co najmniej jednej porcji wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z co najmniej jedną porcją pozytywnych antygenowo komórek;

    (iii) mieszania i inkubacji co najmniej jednej porcji znakowanego radioaktywnie przeciwciała identycznej jak w etapie (ii) z co najmniej jedną porcją roztworu buforowego do rozcieńczania o tej samej objętości jak porcja pozytywnych antygenowo komórek w etapie (i) jako kontroli;

    (iv) osadzenia komórek przez wirowanie;

    (v) pomiaru radioaktywności w supernatancie osadzonych komórek oraz w kontroli oraz (vi) porównania ilości radioaktywności w supernatancie komórek z ilością radioaktywności w kontroli.
22. 22. Test wiązania według zastrz. 21, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem anty-CD20.
23. 23. Test wiązania według zastrz. 22, znamienny tym, że przeciwciałem anty-CD20 jest 2B8.
24. 24. Test wiązania według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomnianym antygenem jest CD20.
25. 25. Test wiązania według zastrz. 24, znamienny tym, że wspomniane komórki pozytywne wobec CD20 są komórkami SB (ATCC # CCL 120).
26. 26. Test wiązania według zastrz. 21, znamienny tym, że ponadto obejmuje:

    (i) mieszanie co najmniej jednej porcji wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała z co najmniej jedną porcją antygenowo-negatywnych komórek;

    (ii) osadzenia antygenowo-negatywnych komórek poprzez wirowanie;

    (iii) pomiaru radioaktywności w supernatancie osadzonych antygenowo-negatywnych komórek; i (iv) porównanie ilości radioaktywności w supernatantcie antygenowo-negatywnych komórek z ilością radioaktywności w supernatancie antygenowo-pozytywnych komórek i kontroli.

    PL 205 780 B1
27. 27. Test wiązania według zastrz. 26, znamienny tym, że wspomniane antygenowo-negatywne komórki są komórkami CD20-negatywnymi.
28. 28. Test wiązania według zastrz. 27, znamienny tym, że wspomniane antygenowo-negatywne komórki CD20 są komórkami HSB (ATCC # CCL 120.1).
29. 29. Test wiązania kompetytywnego dla oceny powinowactwa testowanego przeciwciała do komórki docelowej, obejmujący:

    (i) przygotowanie kontrolnego przeciwciała znakowanego rutenem;

    (ii) przygotowanie znakowanego radioaktywnie testowanego przeciwciała sposobem jak zdefiniowano w zastrz. 1;

    (iii) inkubację wzrastających ilości testowanego przeciwciała oraz wzrastających ilości nieznakowanego przeciwciała kontrolnego ze stałym stężeniem utrwalonych, żywych lub liofilizowanych komórek pozytywnych antygenowo oraz śladowymi ilościami znakowanego rutenem przeciwciała kontrolnego, gdzie każde osobne stężenie testowanego przeciwciała oraz każde osobne stężenie przeciwciała kontrolnego znajdują się w innej, oddzielnej probówce;

    (iv) oznaczanie ilości wiązania w każdej probówce reakcyjnej w oparciu o względną elektrochemiluminescencję (ECL) przy użyciu sprzętu ORIGEN; oraz (v) obliczenie średniej wartości powinowactwa testowanego przeciwciała.
30. 30. Test kompetytywnego wiązania według zastrz. 29, znamienny tym, że przeciwciała kontrolne i testowane są przeciwciałami anty-CD20.
31. 31. Test kompetytywnego wiązania według zastrz. 29, znamienny tym, że komórki antygenowo pozytywne są komórkami pozytywnymi C20-pozytywnymi.
32. 32. Test kompetytywnego wiązania według zastrz. 31, znamienny tym, że komórkami antygenowo-pozytywnymi są komórki SB (ATCC # CCL 120).