RS51699B

RS51699B - Beta-amiloid-analog-t-ćelijski-epitop vakcina

Info

Publication number: RS51699B
Application number: YU13304A
Authority: RS
Inventors: Peter Birk Rasmussen; Martin Roland Jensen; Klaus Gregorius Nielsen; Peter Koefoed; Florence Dal Degan
Original assignee: H.Lundbeck A/S.
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2011-10-31
Also published as: CO5560581A2; EP1420815A2; EA200600974A1; EA011610B1; KR20040044465A; HUP0400669A2; IS7133A; KR20100086520A; CY1105737T1; MXPA04001467A; JP2009280582A; YU13304A; EA007533B1; AU2007249087A1; PL369099A1; NZ530940A; KR101057488B1; BR0212047A; AU2010212381A1; CN101675992A

Abstract

Imunogen koji je:a) poliamino kiselina dužine 72 amino kiseline, koja se sastoji od Aβ (1-12) fragmenta, zatim slede amino kiselinski ostaci P30 epitopa tetanus toksoida SEQ ID No.6, zatim sledi Aβ (1-12) fragment, zatim aminokiselinski ostaci P2 epitopa tetanus toksoida SEQ ID No. 4, pa zatim fragment Aβ (1-12), gde je Aβ (1-12) fragment označen aminokiselinskim brojevima u odnosu na amino kiselinu 1 iz Aβ-43 fragmenta datog aminokiselinskim ostacima 672-714 SEQ ID No.2 ;b) konjugat koji sadrži polihidroksipolimernu osnovu za koju je posebno spojena poliamino kiselina kao što je definisano u a) ilic) nukleinska kiselina koja kodira poliamino kiselinu kao što je definisano u a) ilid) nepatogeni mikroorganizam ili virus koji nosi fragment nulekinske kiselinekoji kodira i eksprimira poliamino kiselinu kao što je definisano u a);za upotrebu kao lek za lečenje, prevenciju ili poboljšanje Alzheimerove bolesti kod životinja ili drugih bolesti okarakterisanih taloženjem amiloida.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na unapređenje terapije i prevencije Alchajmerove bolesti (AD) i drugih bolesti koje karakteriše nakupljanje amiloida, npr. bolesti koje karakterišu amiloidne naslage u centralnom nervnom sistemu (CNS). Posebno, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za nishodnu regulaciju (neželjenih) naslaga amiloida omogućavanjem proizvodnje antitela protiv odgovarajućeg proteina (APP ili Ap) ili njegovih komponenti kod subjekata koji pate ili mogu oboleti od bolesti čija patologija uključuje nakupljanje amiloida. Pronalazak takođe daje postupke za proizvodnju polipeptida koji su korisni u ovom postupku kao i modifikovane polipeptide kao takve. Ovim pronalaskom su obuhvaćeni i fragmenti nukleinskih kiselina koji kodiraju modifikovane polipeptide kao i vektori koji usvajaju ove fragmente nukleinskih kiselina i ćelije domaćini i ćelijske linije transformisane njima. Konačno, ovaj pronalazak takođe daje novi tip konjugovanog peptidnog imunogena.

OSNOVAPRONALASKA

Amiloidoza je vanćelijsko nakupljanje nerastvorljivih proteinskih fibrila što vodi ka oštećenju tkiva i bolesti (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Fibrili se formiraju kada se proteini i peptidi normalne rastvorljivosti međusobno povezuju na abnormalan način (Kelly, 1997).

Amiloid je povezan sa različitim ozbiljnim bolestima uključujući sistemsku amiloidozu, AD, diabetes kod odraslih, Parkinsonovu bolest, Hantington-ovu bolest, fronto-temporalnu demenciju i prenosive sunđeraste encefalopatije (kuru i Creutzfeldt-Jacob bolest kod ljudi i svrab i BSE kod ovaca i stoke, respektivno) povezane sa prionima, a izgleda da je formiranje amiloidnih plaka kod na primer Alchajmerove bolesti blisko povezano sa napredovanjem bolesti kod ljudi. U životinjskim modelima je pokazano da prekomerna ekspresija, ili ekspresija modifikovanih oblika, proteina koji se nalaze u naslagama, kao što je (3-amiloidni protein, izaziva različite simptome bolesti, npr. simptome slične Alchajmerovoj bolesti. Ne postoji poseban tretman za sprečavanje nagomilavanje amiloida i ove bolesti su obično fatalne.

Podjedinice amiloidnih fibrila mogu biti divljeg tipa, varijante ili fragmentisani proteini, a slični fibrili se mogu formiratiin vitrood oligopeptida i denaturisanih proteina (Bradburv et al., 1960; Filshie et al., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Priroda polipeptidne komponente fibrila određuje karakter amiloidoze. Uprkos velikim razlikama u veličini, nativnoj strukturi i funkciji amiloidnih proteina, svi amiloidni fibrili su neodređene dužine, negranati, 70 do 120 A u prečniku i karakteristično se boje sa Congo crvenim (Pepys, 1996). Karakteristični su za unakrsnu-p strukturu (Pauling & Corey, 1951) gde je polipeptidni lanac organizovan u p-ploče. lako amiloidni proteini imaju veoma različite prekursorske strukture, svi se mogu podvrgnuti strukturnoj konverziji, možda duž istog puta, do neregularno savijenog oblika koji je gradivni blok heliks protofilamenta p-nabrane ploče.

Ova karakteristična struktura vlakana vodi ka amiloidozama koje se nazivaju P-fibriloze (Glenner, 1980a, b), a protein fibrila AD je nazvan p-protein pre nego što je bila poznata njegova sekundarna struktura (Glenner & Wong, 1984). Karakteristična difrakciona šema unakrsne-p, zajedno sa izgledom i bojom fibrila su sada prihvaćena obeležja amiloida i sugerišu da fibrili, iako su formirani od prilično različitih proteinskih prekursora, imaju izvestan stepen međusobne strukturne sličnosti i čine strukturnu superfamiliju, nezavisno od prirode njihovih prekursorskih proteina (Šunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CFJ Mol Biol 1997 Oct 31; 273(3):729-739).

Jedna od najraširenijih i dobro poznatih bolesti kod koje se pretpostavlja da amiloidne naslage u centralnom nervnom sistemu imaju centralnu ulogu u napredovanju bolesti je AD (Alchajmerova bolest).

AD (Alchajmerova bolest)

Alchajmerova bolest (AD) ireverzibilni, progresivni poremećaj mozga koji se javlja postepeno i kao rezultat ima gubitak pamćenja, promene ponašanja i ličnosti i opadanje mentalnih sposobnosti. Ovi gubici su povezani sa odumiranjem ćelija mozga i razaranjem veza između njih. Tok ove bolesti se razlikuje od osobe do osobe, kao i stopa propadanja. U prošeku, pacijenti koji pate od AD žive 8 do 10 godina posle dijagnoze, iako bolest može da traje i do 20 godina.

AD napreduje po stadijumima, od rane, umerene zaboravnosti do teškog gubitka mentalne funkcije. Ovaj gubitak je poznat kao demencija. Kod većine ljudi sa AD, simptomi se prvo pojavljuju posle 60 godina, ali raniji početak nije redak. Najraniji simptomi često obuhvataju gubitak pamćenja nedavnih događaja, pogrešno rasuđivanje i promene ličnosti. Često, ljudi u početnim stadijumima AD razmišljaju manje jasno i zaboravljaju imena bliskih osoba i uobičajenih predmeta. Kasnije u toku bolesti, ti ljudi mogu da zaborave kako da obavljaju čak i jednostavne zadatke. Najzad, ljudi sa AD gube svu sposobnost mišljenja i postaju zavisni od drugih ljudi za svakodnevnu negu. Konačno, bolest toliko onesposobljava da su pacijenti vezani za krevet i podložni za razvoj drugih bolesti i infekcija. U najčešćem slučaju, ljudi koji pate od AD umiru od upale pluća.

lako se rizik od razvoja AD povećava sa starošću, simptomi Ad i demencije nisu deo normalnog starenja. AD i drugi dementni poremećaji su izazvani bolestima koje pogađaju mozak. Kod normalnog starenja, nervne ćelije u mozgu se ne gube u velikom broju. Nasuprot tome, AD prekida tri glavna procesa: komunikaciju nervnih ćelija, metabolizam i obnavljanje. Ovaj prekid konačno izaziva prestanak funkcionisanja mnogih nervnih ćelija, gubitak njihovih veza sa drugim nervnim ćelijama i njihovu smrt.

Prvo, AD uništava neurone u delovima mozga koji kontrolišu pamćenje, posebno u hipokampusu i sa njim povezanim strukturama. Kako nervne ćelije u hipokampusu prestaju da ispravno funkcionišu, kratkotrajna memorija opada i često počinje da opada sposobnost da se obave laki i poznati zadaci. AD takođe napada cerebralni korteks, posebno delove koji su odgovorni za jezik i zaključivanje. Konačno, obuhvaćeni su mnogi drugi delovi mozga, svi ovi regioni mozga atrofiraju (skupljaju se) i pacijenti koji pate od AD postaju vezani za krevet, nesposobni da kontrolišu izlučivanje telesnih tečnosti, potpuno bespomoćni i ne reaguju na spoljni svet (izvor: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).

Uticaj AD

AD je najčešći uzrok demencije među ljudima starosti od 65 godina i starijih. Ona predstavlja glavni zdravstveni problem zbog svog velikog uticaja na pojedince, porodice, sistem zdravtsvene zaštite i društvo kao celinu. Naučnici procenjuju da do 4 miliona ljudi trenutno pati od te bolesti, a ukupni broj obolelih osoba u određenoj populaciji se udvostručuje svakih 5 godina pre starosti od 65 godina. Takođe se procenjuje da će se približno 360000 novih slučajeva (incidencija) javiti svake godine, iako će se ovaj broj povećavati kako populacija stari (Brookmeverera/.,1998).

AD stavlja na društvo težak ekonomski teret. Skorija studija u SAD je procenila da su godišnji troškovi brige za jednog AD pacijenta 18408 $ za pacijenta sa blagom AD, 30096 $ za pacijenta sa umerenom AD i 36132 $ za pacijenta a teškom AD. Procenjeno je da je godišnji nacionalni trošak brige za pacijente koji pate od AD u SAD malo iznad 50 milijardi dolara (Leonera/.,1998).

Približno 4 miliona amerikanaca su starosti od 85 godina ili stariji i u većini industrijalizovanih zemalja, ova starosna grupa je jedan od segmenata populacije sa najbržim rastom. Procenjeno je da će u SAD ova grupa dostići broj blizu 8.5 miliona do 2030. godine; neki stručnjaci koji proučavaju populacione trendove sugerišu da bi taj broj mogao da bude čak i veći. Kako sve veći broj ljudi živi duže, broj ljudi koji su pogođeni bolestima starenja, uključujući AD, nastaviće da raste. Na primer, neke studije pokazuju da skoro pola svih ljudi starosti 85 i više godina imaju neki oblik demencije. (National Institute on Aging Progress Report on alzheimer's Disease, 1999).

Glavne osobine AD

Dve abnormalne strukture u mozgu su obeležja AD: amiloidne plake i neurofibrilarni spletovi (NFT). Plake su guste, velikim delom nerastvorljive naslage proteina i ćelijskog materijala izvan i oko neurona mozga. Spletovi su nerastvorljiva uvijena vlakna koja se stvaraju u unutrašnjosti neurona. Postoje dva tipa AD: porodična AD (FAD), koja prati izvestan obrazac nasleđivanja i sporadična AD, gde se ne vidi očigledan obrazac nasleđivanja. Zbog razlika u starosti kada se javlja početak AD, AD je opisana kao oblik sa ranim početkom (javlja se kod osoba mlađih od 65 godina) ili sa kasnim početkom (javlja se kod osoba starosti 65 godina i starijih). AD sa ranim početkom je redak (oko 10 procenata slučajeva) i generalno pogađa ljude starosti od 30 do 60. Neki oblici AD sa ranim početkom su nasleđeni i pojavljuju se u porodicama. AD sa ranim početkom takođe napreduje brže od češćeg oblika sa kasnim početkom.

Sve FAD koje su do sada poznate imaju rani početak i poznato je da je 50 procenata slučajeva FAD izazvano oštećenjima u tri gena koji su locirani na tri različita hromozoma. To su mutacije u APP genu na hromozomu 21; mutacije u genu na hromozomu 14, sa nazivom prezenilin 1; i mutacije u genu na hromozomu 1, sa nazivom prezenilin 2. Međutim, još uvek nema dokaza da bilo koja od ovih mutacija igra glavnu ulogu kod češćeg, sporadičnog ili ne-porodičnog oblika AD sa kasnim početkom. (National Institute on Aging Progres Report on Alzheimer's Disease, 1999).

Amiloidne plake

Kod AD, amiloidne plake se prvo razvijaju u delovima mozga koji se koristi za pamćenje i druge kognitivne funkcije. Amiloidne plake se većinom sastoje od nerastvorljivih naslaga beta amiloida (nadalje označen Ap) - proteinskog fragmenta većeg proteina nazvanog amiloidni prekursorski protein (APP, čija je amino kiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 2) - pomešanog sa delovima neurona i sa ne-nervnim ćelijama kao što su mikroglija i astrociti. Nije poznato da li amiloidne plake same čine glavni uzrok AD ili da li su one sporedni proizvod procesa AD. U svakom slučaju, promene u APP proteinu mogu da izazovu AD, kao što je pokazano kod naslednog oblika AD koji je izazvan mutacijama u APP genu, a formiranje Ap plaka izgleda da je blisko povezano sa napredovanjem bolesti kod ljudi (Lippa C. F.

etal. 1998).

APP

APP je jedan od mnogih proteina koji su povezani sa ćelijskim membranama. Pošto je formiran, APP se ugrađuje u membranu nervne ćelije, delimično unutar i delimično izvan ćelije. Skorije studije koje su koristile transgene miševe pokazuju da APP izgleda da igra važnu ulogu u rastu i preživljavanju neurona. Na primer, izvesni oblici i količine APP mogu da zaštite neurone i od kratkotrajnog i od dugotrajnog oštećenja i mogu učiniti oštećene neurone sposobnijim za obnavljanje i mogu pomoći da delovi neurona rastu brže posle povrede mozga.

Dok je APP ugrađen u ćelijsku membranu, proteaze deluju na određena mesta u APP, cepajući ga u proteinske fragmente. Jedna proteaza pomaže cepanje APP da bi se formirao A(3, a druga proteaza čepa APP u sredini amiloidnog fragmenta tako da se Ap ne može formirati. Formirani Ap je u dve različite dužine, kraći od 40 (ili 41) amino kiselina Ap koji je relativno rastvorljiv i sporo stvara agregate i nešto duži, od 42 amino kiseline "lepljiv" Ap koji brzo formira nerastvorljive grumenove. Dok se Ap formira, još uvek nije tačno poznato kako se on kreće kroz ili oko nervnih ćelija. U krajnjim stadijumima ovih procesa, "lepljivi" Ap se nagomilava u dugačke filamente izvan ćelije i zajedno sa fragmentima mrtvih i umirućih neurona i sa mikroglijom i astrocitima formira plake koje su karakteristične za AD u tkivu mozga. Postoje izvesni dokazi da mutacije u APP čine verovatnijim da se Ap odseče od APP prekursora, čime se izaziva formiranje ili potpunijeg Ap ili relativno "lepljivijeg" oblika. Takođe izgleda da mutacije u prezenilin genima mogu da doprinesu degeneraciji neurona na najmanje dva načina: modifikacijom proizvodnje Ap ili direktnijim izazivanjem smrti ćelija. Drugi istraživači sugerišu da mutirani prezenilini 1 i 2 mogu biti uključeni u ubrzavanje apoptoze.

Može se očekivati da se kako bolest napreduje, formira sve više plaka, popunjavajući sve veći deo mozga. Studije sugerišu da se Ap može nagomilavati i razdvajati istovremeno, u vidu određenog dinamičkog ekvilibrijuma. Ovo povećava nadu da postoji mogućnost da se plake razlože čak i posle njihovog formiranja.

(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).

Veruje se da je Ap toksičan za neurone. U studijama kulture tkiva, istraživači su primetili povećanje smrtnosti neurona u hipokampusu koji su konstruisani tako da prekomerno eksprimiraju mutirane oblike huamnog APP u poređenju sa neuronima koji prekomerno eksprimiraju normalni humani APP (Luoet al.,1999).

Dalje, u životinjskim modelima pokazano je da prekomerna ekspresija ili ekspresija modifikovanih oblika Ap proteina izaziva simptome slične onima kod Alchajmerove bolesti, (Hsiao K.etal.,1998).

Uzimajući u obzir da povećano formiranje Ap, njegovo nagomilavanje u plake i rezultujuća neurotoksičnost može dovesti do AD, od terapeutskog interesa je da se istraže uslovi pod kojima nagomilavanje Ap u plake može biti usporeno ili čak blokirano.

Prezenilini

Mutacije u prezenilinu-1 (S-180) čine skoro 50% svih slučajeva porodične AD sa ranim početkom (FAD). Identifikovano je oko 30 mutacija koje dovode do AD. Početak AD varira sa mutacijama. Mutacije u prezenilinu-2 čine mnogo manji deo slučajeva FAD, ali su još uvek značajan faktor. Nije poznato da li su prezenilini uključeni u sporadičnu ne-porodničnu AD. Funkcija prezenilina nije poznata, ali izgleda da su uključeni u obradu APP da bi se dobio Ap-42 (duži lepljiviji oblik peptida, SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714) s obzirom da pacijenti koji pate od AD sa prezenilin mutacijama imaju povećane nivoe ovog peptida. Nije jasno da li prezenilini takođe imaju ulogu u izazivanju formiranja NFT. Neki sugerišu da prezenilini mogu takođe imati direktniju ulogu u degeneraciji neurona i smrti neurona. Prezeninil-1 se nalazi na hromozomu 14, dok je prezenilin-2 povezan za hromozom 1. Ako osoba poseduje mutiranu verziju samo jednog od ovih gena skoro je sigurno da će se kod te osobe razviti AD sa ranim početkom.

Postoji izvesna nesigurnost oko toga da li je pezenilin-1 identičan sa hipotetičkom gama-sekretazom koja je uključena u obradu APP (Naruše et al., 1998).

Apolipoprotein E

Apolipoprotein E je obično povezan sa holesterolom, ali je takođe nađen u plakama i spletovima u mozgovima sa AD. Dok izgleda da aleli 1-3 nisu uključeni u AD postoji značajna korelacija između prisustva APOE-s4 alela i razvoja kasnog AD (Strittmatter et al., 1993). To je, međutim, faktor rizika i nije direktan uzrok kao što je to slučaj za mutacije prezenilina i APP i nije ograničen na porodičnu AD.

Načini na koje APOE-e4 protein povećava verovatnoću razvoja AD nisu poznati sa sigurnošću, ali jedna moguća teorija je da on olakšava stvaranje Ap što doprinosi snižavanju starosne granice za početak AD, iii prisustvo ili odsustvo određenih APOE alela može da utiče na način na koji neuroni odgovaraju na povredu (Buttini et al., 1999).

Takođe je pokazano da je Apo A1 amiloigeničan. Intaktni apo A1 može sam po sebi da formira fibrile nalik-amiloiduin vitrokoji su pozitivni na Congo crveno (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, VVisnievvski KE, Frangione B).

Čini se da postoje neki kontradiktorni rezultati koji ukazuju da postoji pozitivan efekat APOE-e4 alela u smanjivanju simptoma mentalnog gubitka, u poređenju sa drugim alelima (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurologv 41).

Neurofibrilarni spletovi

Ovo drugo obeležje AD se sastoji od abnormalnih skupina uvijenih niti koje su nađene unutar nervnih ćelija. Glavni sastavni deo spletova je jedan oblik proteina zvanog tau (t). U centralnom nervnom sistemu, tau proteini su najpoznatiji zbog njihove sposobnosti da se vezuju i pomažu prilikom stabilizacije mikrotubula, koje su jedan od sastavnih delova ćelijske unutrašnje potporne strukture, ili skeleta. Međutim, kod AD tau je hemijski promenjen i kao takav ne može više stabilizovati mikrotubule, čime dolazi do njihovog raspadanja. Ovo raspadanje transportnog sistema može isprva da dovede do grešaka u komunikaciji između nervnih ćelija,a kasnije može dovesti do smrti neurona.

Kod AD, hemijski promenjen tau se uvrće u parne spiralne filamente - dve niti tau koje su uvijene jedna oko druge. Ovi filamenti su glavna supstanca nađena u neurofibrilarnim spletovima. U jednoj skorijoj studiji, istraživači su našli neurofibrilarne promene kod manje od 6 procenata neurona u određenom delu hipokampusa kod zdravih mozgova, kod više od 43 procenata od ovih neurona kod ljudi koji su umrli sa blagom AD i kod 71 procenata ovih neurona kod ljudi koji su umrli sa teškom AD. Kada je studiran gubitak neurna, nađeno je slično napredovanje. Dokaz ovog tipa podržava ideju da formiranje spletova i gubitak neurona napreduju zajedno u toku AD. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).

Tauopatije i spletovi

Nekoliko neurodegenerativnih bolesti, osim AD, karakteriše nakupljanje tau u nerastvorljivim filamentima u neuronima i giiji, što vodi do disfunkcije i smrti. Vrlo skoro, nekoliko grupa istraživača, koji su proučavali porodice sa čitavim nizom razlilitih naslednih demencija, osim AD, su našli prve mutacije u tau genu na hromozomu 17 (Clarketal.,1998; Huttonetal.,1998; Poorkajet al.,1998; Spillantiniet al.,1998). U ovim porodicama, mutacije u tau genu izazivaju smrt neurona i demenciju. Ovi poremećaji koji imaju neke zajedničke osobine sa AD, ali se razlikuju u nekoliko važnih aspekata, označeni su zajedničkim imenom "fronto temporalna demencija i parkinsonizam povezani za hromozom 17" (FTDP-17). To su bolesti kao što su Parkinsonova bolest, neki oblici amiotrofne lateralne skleroze (ALS), kortikobazalna degeneracija, progresivna supranukleama paraliza i Pick-ova bolest, a sve ove bolesti karakteriše abnormalno nagomilavanje tau proteina.

Druge neurološke bolesti slične AD

Između AD i drugih neuroloških bolesti postoje važne paralele, uključujući tu bolesti izazvane prionima (kao što je kuru, Creutzfeldt-Jacob bolest i goveđi sunđerasti encefalitis), Parkinsonovu bolest, Hantingtonovu bolest i fronto-temporalnu demenciju. Sve ove bolesti obuhvataju naslage abnormalnih proteina u mozgu. AD i bolesti uzrokovane prionima izazivaju demenciju i smrt, a obe su povezane sa formiranjem nerastvorljivih amiloidnih fibrila, ali od membranskih proteina koji se međusobno razlikuju.

Naučnici koji proučavaju Parkinsonovu bolest, drugi najčešći neurodegenerativni poremećaj posle AD, su otkrili prvi gen vezan za bolest. Ovaj gen kodira protein pod imenom sinuklein, koji je, što je interesantno, nađen takođe u amiloidnim plakama u mozgu pacijenata koji pate od AD (Lavedan C, 1998, Genome Res. 8(9): 871-80). Istraživači su takođe otkrili da genetička oštećenja kod Hantingtonove bolesti, sledećem progresivnom neurodegenerativnom poremećaju koji izaziva demenciju, dovode do toga da se Hantingtonov protein formira u nerastvorljive fibrile veoma slične AB fibrilima AD i proteinskim fibrilama bolesti izazvanih prionima, (Scherzinger E,et al.,1999, PNAS U.S.A. 96(8): 4604-9).

Naučnici su takođe otkrili novi gen, koji je kada je mutiran, odgovoran za britansku porodičnu demenciju (FBD), retku naslednu bolest koja izaziva teške poremećaje kretanja i progresivnu demenciju sličnu onoj koja je viđena kod AD. U biohemijskoj analizi amiloidnih fibrila koji su nađeni u FBD plakama, nađen je jedinstven peptid nazvan Abri (Vidaler al.,1999). Mutacija na određenoj tački duž ovog gena dovodi do proizvodnje Bri proteina koji je duži nego što je to normalno.

ABri peptid, koji je isečen iz mutiranog kraja Bri proteina je nagomilan u obliku amiloidnih fibrila. Smatralo se da ove plake vode ka neuralnoj disfunkciji i demenciji koje karakterišu FBD.

Imunizacija sa AB

Imuni sistem će normalno učestvovati u čišćenju stranog proteina i proteinskih partikula u organizmu, ali se naslage povezane sa gorepomenutim bolestima većinom sastoje od sopstvenih proteina, čime se uloga imunog sistema u kontroli ovih bolesti čini manje očiglednom. Dalje, naslage se nalaze u posebnom delu (CNS) koji su normalno odvojeni od imunog sistema, gde obe činjenice sugerišu da bi bilo koji pristup koji obuhvata vakcinu ili imunoterapeutski pristup bili neuspešni.

I pored toga, naučnici su skoro pokušali da izvrše imunizaciju miševa sa vakcinom koja je sastavljena od heterolognog humanog AB i supstance za koju je poznato da ekscitira imuni sistem (Schenket al.,1999 i WO 99/27944). Vakcina je testirana u parcijalnom modelu AD kod transgenog miša sa humanim mutiranim genom za APP koji je umetnut u DNK miša. Miševi su u toku starenja proizveli modifikovani APP protein i razvili su amiloidne plake. Ovaj mišji model je upotrebljen za testiranje da li vakcinacija protiv modifikovanbog transgenog humanog APP ima uticaj na stvaranje plaka. U prvom eksperimentu, jednoj grupi transgenih miševa su davane injekcije vakcine jednom mesečno počevši od 6 nedelja starosti i završavajući sa 11 meseci. Druga grupa transgenih miševa nije primila injkecije i služila je kao kontrolna grupa. Sa 13 meseci starosti, miševi u kontrolnoj grupi su imali plake koje su pokrivale 2 do 6 procenata njihovih mozgova. Nasuprot tome, imunizovani miševi zapravo nisu imali plake.

U drugom eksperimentu, istraživači su počeli sa injekcijama u starosti od 11 meseci, kada su se neke plake već razvile. U toku vremenskog perioda od 7 meseci, kontrolni transgeni miševi su imali povećanje od 17 puta u količini plaka u njihovim mozgovima, dok su oni miševi koji su primili vakcinu imali 99% smanjenje u poređenju sa kontrolnim transgenim miševima starosti 18 meseci. Kod nekih miševa, neke od naslaga plaka koje su ranije postojale izgleda da su uklonjene pomoću tretmana. Takođe je nađeno da su se druga oštećenja vezana za plake, kao što su inflamacija i abnormalni procesi nervnih ćelija, smanjili kao rezultat imunzacije.

Gorenavedeno je prema tome preliminarna studija kod miševa i na primer, naučnici bi trebalo da pronađu da li vakcinisani miševi ostaju zdravi u pogledu drugih karakteristika i da li pamćenje kod vakcinisanih miševa ostaje normalno. Dalje, zbog toga što model nije kompletan prikaz AD (životinje ne razvijaju neurofibrilarne spletove niti izumiru mnogi od njihovih neurona), biće neophodne dodatne studije da bi se odredilo da li ljudi imaju sličnu ili različitu reakciju u odnosu na miševe. Sledeće pitanje koje bi trebalo da se razmatra je to da li postupak možda može "lečiti" amiolidne naslage, ali ne uspeva da zaustavi razvoj demencije.

Tehnička pitanja takođe predstavljaju glavne izazove. Na primer malo je verovatno da je čak moguće, korišćenjem ove tehnologije, stvaranje vakcine koja omogućava da se kod ljudi formiraju antitela protiv svojih sopstvenih proteina. Prema tome, biće potrebno resiti brojna pitanja bezbednosti i efikasnosti pre razmatranja bilo kakvih testova kod ljudi.

Rad koji su dali Schenket al.prema tome pokazuje da ako je bilo moguće da se stvori snažan imuni odgovor na sopstvene proteine u proteinskim naslagama u centralnom nervnom sistemu kao što su plake formirane kod AD, moguće je i da se spreči formiranje naslaga i da se po mogućstvu očiste već formirane plake.

Skorije, klinička ispitivanja korišćenjem gore-razmatranih Ap vakcina su okončana kao posledica štetnih efekata: kod određenog broja vakcinisanih subjekata se razvio hronični encefalitis koji može biti posledica nekontrolisanog autoimuniteta protiv Ap u CNS-u.

CILJ PRONALASKA

Cilj ovog pronalaska je da se obezbede nove terapije protiv stanja koje karakteriše nagomilavanje amiloida, kao što je AD. Dodatni cilj je da se razvije autovakcina protiv amiloida, da bi se dobio novi tretman za AD i za druge patološke poremećaje koji obuhvataju nagomilavanje amiloida.

REZIME PRONALASKA

Ovde je opisana upotreba tehnologije autovakcinacije za stvaranje snažnih imunih odgovora protiv APP i Ap koji su u suprotnom ne-imunogeni. Takođe je opisano pripremanje takvih vakcina za prevenciju, moguće lečenje ili ublažavanje simptoma takvih bolesti koje su povezane sa amiloidnim naslagama.

Prema tome, u svom najširem i najuopštenijem smislu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak zain vivonishodnu regulaciju amiloidnog prekursorskog proteina (APP) ili beta amiloida (Ap) kod životinja, uključujući čoveka, gde postupak obuhvata omogućavanje prikazivanja imunom sistemu životinje imunogeno efikasne količine najmanje jednog analoga APP ili Ap koji uključuje u istom molekulu najmanje jedan B-ćelijski epitop od APP i/ili Ap i najmanje jedan epitop za T-pomoćne ćelije (THepitopa) tako da imunizacija životinje sa analogom izaziva proizvodnju antitela protiv životinjskih analoga APP ili AB, gde je analog

a) poliamino kiselina koja se sastoji od najmanje jedne kopije podsekvence ostataka 672-714 u SEQ ID NO: 2, gde je strani THepitop ugrađen pomoću amino

kiselinske adicije i/ili insercije i/ili delecije i/ili supstitucije, gde je podsekvenca izabrana iz grupe koju čine ostaci 1-42, ostaci 1-40, ostaci 1-39, ostaci 1-35, ostaci 1-34, ostaci 1-28, ostaci 1-12, ostaci 1-5, ostaci 13-28, ostaci 13-35, ostaci 17-28, ostaci 25-35, ostaci 35-40, ostaci 36-42 i ostaci 35-42 amino kiselinske sekvence koja se sastoji od amino kiselinskih ostataka 673-714 SEQ ID NO: 2; i/iii

b) poliamino kiselina koja sadrži strani THepitop i raskinutu APP ili Ap sekvencu tako da analog ne obuhvata bilo koju podsekvencu SEQ ID NO: 2 koja se

produktivno vezuje za MHC klasu II molekula koji započinju odgovor T-ćelija; i/ili

c) poliamino kiselina koja sadrži strani THepitop i amino kiseline izvedene iz APP ili Ap i sadrži 1 pojedinačan metioninski ostatak lociran na C-terminusu analoga,

gde su ostali metioninski ostaci u APP ili Ap i u stranom THepitopu supsituisani ili deletirani, a poželjno su supstituisani leucinom ili izoleucinom; i/ili

d) konjugat koji sadrži polihidroksipolimernu osnovu za koju je posebno spojena poliamino kiselina kao što je određeno u a) i/ili poliamino kiselina kao što je

određeno u b) i/ili poliamino kiselina kao što je određeno u c); i/ili

e) konjugat koji sadrži polihidroksipolimernu osnovu za koju su posebno spojeni 1) strani THepitop i 2) poliamino kiselina izabrana iz grupe koju čine

podsekvence kao što je određeno u a), prekinuta sekvenca APP ili Ap kao što je određeno u b) i amino kiselinska sekvenca izvedena iz APP ili Ap koja sadrži 1 pojedinačan ostatak metionina lociran na C-kraju, gde su ostali metioninski ostaci u APP ili Ap i u stranom THepitopu supstituisani ili deletirani, a poželjno su supstituisani leucinom ili izoleucinom.

Zastupnik za ovaj pronalazak je prethodno podneo međunarodnu prijavu patenta usmerenu na bezbedne strategije vakcinisanja protiv amiloidogenih polipeptida kao što su APP i Ap, pogledati WO 01/62284. Ova prijava nije objavljenja na datum podnošenja ove prijave i dodatno ne sadrži detalje koji se tiču gorepomenutih korisnih analoga APP i AB.

Pronalazak se takođe odnosi na analoge APP i ABkao i na nukleinsko kiselinske fragmente koji kodiraju njihove podgrupe. Deo pronalaska su takođe i imunogene kompozicije koje sadrže analoge fragmenata nukleinskih kiselina.

LEGENDA ZA SLIKE

Slika 1: Šematski opis Autovac varijanti izvedenih od amiloidnog prekursorskog proteina sa ciljem da se stvore odgovori antitela na Ap protein Ap-43 (ili C-100). APP je prikazan šematski na vrhu slike i preostala šematska konstrukcija prikazuje da su modeli epitopa P2 i P30 supstituisani ili inserirani u različite odsečke APP. Na slici, crna polja označavaju APP signalnu sekvencu, truglasta šrafura je vanćelijski deo APP, tamna vertikalna šrafura je transmembranski domen APP, svetla vertikalna šrafura je unutarćelijski domen APP, krupna kosa šrafura označava P30 epitop, a fina kosa šrafura označava P2 epitop. Pravougaonik sa punom linijom označava Ap-42/43, a pravougaonik sa punom linijom i pravougaonik sa isprekidanom linijom zajedno označavaju C-100. "Abeta" označava Ap.

Slika 2: Šematski opis oblika sitnteze u opštem slučaju primenljivih imunogenih konjugata. Peptid A (bilo koja antigena sekvenca, npr. Ap sekvenca koja je ovde pisana) i peptid B (amino kiselinska sekvenca uključujući strani T-pomoćni epitop) su sintetisani i pomešani. Posle njihovog spajanja sa pogodnim aktiviranim polihidroksipolimerom, peptidi A i B su vezani preko aktivacione grupe u odnosu koji odgovara početnom odnosu ove dve supstance u peptidnoj smeši. Pogledati Primer 4 za detalje.

DETALJNO OTKRIĆE PRONALASKA

Definicije

U sledećem tekstu određen broj termina koji su korišćeni u ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima biće detaljno definisan i objašnjen da bi se razjasnila oblast i veze pronalaska.

Termini "amiloid" i "amiloidni protein" koji se ovde naizmenično koriste označavaju klasu proteinskih negranatih fibrila neodređene dužine. Amiloidni fibrili pokazuju karakteristično bojenje sa kongo crvenim i imaju unakrsnu-B strukturu u kojoj je polipeptidni lanac organizovan u p-ploče. Amiloid je u opštem slučaju izveden od amiloidogenih proteina koji imaju veoma različite strukture prekursora, ali koji podležu strukturalnoj konverziji do neregularno savijenog oblika koji predstavlja gradivni blok heiiks protofilamenta p-nabrane ploče. U normalnom slučaju, prečnik amiloidnih fibrila varira između oko 70 do oko 120 A.

Termin "amiloidogeni protein" označava polipeptid koji je uključen u formiranje amiloidnih naslaga, ili tako što je taj polipeptid deo naslaga kao takvih ili tako što je deo puta biosinteze koji vodi ka formiranju naslaga. Dakle, primeri amiloidogenih proteina su APP i Ap, ali takođe i proteini koji su uključeni u njihov metabolizam mogu biti amiloidogeni proteini.

'Amiloidni polipeptid" ovde označava polipeptide koji sadrže amino kiselinsku sekvencu gorerazmatranih amiloidogenih proteina koji su dobijeni od ljudi ili drugih sisara (ili njihove fragmente koji dele značajnu količinu B-ćelijskih epitopa sa intaktnim amiloidogenim proteinom) - amiloidogeni polipeptid može prema tome npr. da sadrži bitne delove prekursora za amiloidogeni polipeptid (u slučaju Ap, jedan mogući amiloidni polipeptid može biti izveden od APP). U okviru ovog termina uključeni su i neglikozilovani oblici amiloidogenih polipeptida koji su pripremljeni u prokariotskom sistemu kao što su to oblici koji imaju promenljive obrasce glikozilacije kao posledica upotrebe npr. kvasca ili drugih ne-sisarskih eukariotskih ekspresionih sistema. Potrebno je, međutim, naglasiti da termin "amiloidogeni polipeptid" označava da je polipeptid o kome se radi u normalnom slučaju ne-imunogen kada se daje životinji koju bi trebalo tretirati. Drugim rečima, amiloidogeni polipeptid je

sopstveni protein ili je analog takvog sopstvenog proteina koji u normalnom slučaju neće podstaći imuni odgovor protiv amiloidogena životinje o kojoj se radi.

"Analog" je molekul izveden od APP ili AB koji ima jednu ili nekoliko promena u svojoj molekularnoj strukturi. Takva promena može npr. biti u obliku fuzije APP ili Ap poliamino kiselina sa pogodnim fuzionim partnerom (tj. promena u primarnoj strukturi koja isključivo obuhvata C- i/ili N-terminalne adicije amino kiselinskih ostataka) i/ili može biti u obliku insercija i/ili delecija i/ili supstitucija u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida. Terminom su takođe obuhvaćeni molekuli izvedeni od APP ili Ap, pogledati diskusiju navedenu u daljem tekstu o modifikacijama APP i Ap. U nekim slučajevima analog mode biti konstruisan tako da bude manje sposoban ili čak nesposoban da izazove stvaranje antitela protiv normalnog prekursorskog proteina (jednog ili više) amiloida, čime se izbegava neželjeno mešanje sa (fiziološki normalnim) ne-nagomilanim oblikom polipeptida koji je prekursor amiloidnog proteina.

Potrebno je istaći da upotreba kseno-analoga (npr. pseći i svinjski analog) humanog APP ili Ap kao vakcine može biti zamišljena tako da se proizvede željeni imunitet protiv APP ili Ap. Takva upotreba kseno-analoga za imunizaciju se takođe smatra delom pronalaska.

Termin "polipeptid" u ovom kontekstu označava i kratke peptide od 2 do 10 amino kiselinskih ostataka, oligopeptide od 11 do 100 amino kiselinskih ostataka i polipeptide od više od 100 amino kiselinskih ostataka. Dalje, termin takođe obuhvata proteine, tj. funkcionalne biomolekule koji sadrže najmanje jedan polipeptid; kada sadrži najmanje dva polipeptida, oni mogu formirati komplekse, mogu biti kovalentno vezani ili mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid (polipeptidi) u proteinu može biti glikozilovan i/ili lipidovan i/ili može da sadrži prostetične grupe. Takođe, termin "poliamino kiselina" je ekvivalentan terminu "polipeptid".

Termini "T-limfocit" i "T-ćelija" će se koristiti naizmenično za limfocite timusnog porekla koji su odgovorni za različite ćelijski posredovane imune odgovore kao i za pomoćnu aktivnost kod humoralnog ćelijskog odgovora. Tome slično, termini "B-limfocit" i "B-ćelija" će se upotrebljavati naizmenično za limfocite koji proizvode antitela.

Termin "sekvenca" označava bilo koji uzastopni niz od najmanje 3 amino kiseline ili, kada je relevantno, od najmanje 3 nukleotida, koji su izvedeni direktno od amiloidne amino kiselinske sekvence koja se prirodno javlja ili od nukleinsko kiselinske sekvence, respektivno.

Termin "životinja" u datom kontekstu uopšteno označava vrstu životinja (poželjno sisarsku), kao što suHomo sapiens, Canis domesticus,itd. i ne predstavlja samo jednu pojedinačnu životinju. Međutim, termin takođe označava populaciju takve životinjske vrste, s obzirom da je važno da svi pojedinci koji su imunizovani prema postupku pronalaska imaju u značajnom stepenu isti APP ili Ap omogućavajući imunizaciju životinja sa istim imunogenom (imunogenima). Tehničarima će biti jasno da je životinja u datom kontekstu živo biće koje poseduje imuni sistem. Poželjno je da je životinja kičmenjak, kao što je sisar.

Termin" in vivonishodna regulacija APP ili Ap" ovde označava smanjenje ukupne količine nagomilanog amiloidnog proteina (ili amiloida kao takvog) u živom organizmu relevantnog tipa. Nishodna regulacija se može dobiti pomoću nekoliko mehanizama: od njih najjednostavniji je mehanizam prostog mešanja sa amiloidom preko vezivanja antitela tako da se spreči neregularna agregacija. Međutim, unutar ovog pronalaska je takođe i to da vezivanje antitela ima za posledicu da ćelije čistači (kao što su makrofagi i druge fagocitarne ćelije) uklanjanju amiloid i da antitela interaguju sa drugim amiloidogenim polipeptidima koji vode formiranju amiloida. Dodatna mogućnost je da antitela vezuju Ap van CNS, čime se efikasno uklanja Ap iz CNS preko principa modela za procenu ravnotežnog vezivanja liganda i receptora.

Namera je da Izraz "omogućavanje prikazivanja ... imunom sistemu" označava da je imuni sistem životinje aktiviran imunogenom reakcijom na kontrolisan način. Kao što će biti jasno na osnovu daljeg razmatranja, takva reakcija se može postići na različite načine od kojih su najvažniji vakcinacija sa polipeptidom koji sadrži "farmaceutike" (tj. vakcina koja je primenjena u cilju iečenja ili olakšavanja simptoma tekuće bolesti) ili vakcinacijom sa "farmaceutikom" nukleinske kiseline. Važno je postići kontakt imunokompetentnih ćelija u životinji sa antigenom na imunološki efikasan način, pri čemu je za inventivnost koja je u osnovi ovog pronalaska od manje važnosti način na koji je to postignuto.

Termin "imunološki efektivna količina" ima svoje uobičajeno tehničko značenje, tj. količina imunogena koja je sposobna da izazove imuni odgovor koji u značajnom stepenu angažuje patogene agense koji imaju zajedničke imunološke karakteristike sa imunogenom.

Kada se koristi izraz da je APP ili AB "modifikovan" to znači da je izvršena hemijska modifikacija polipeptida na APP ili Ap. Takva modifikacija može, na primer, biti derivatizacija (npr., alkilacija) određenih aminokiselinskih ostataka u sekvenci, ali kao što će biti jasno na osnovu otkrića u daljem tekstu, poželjne modifikacije obuhvataju promene primarne strukture aminokiselinske sekvence.

Kada se razmatra "autotolerancija na APP ili Ap" podrazumeva se da pošto je polipeptid sopstveni protein u populaciji koju treba vakcinisati, normalne individue u populaciji ne razvijaju imuni odgovor na polipeptid; ne može se isključiti da pojedine individue u životinjskoj populaciji mogu proizvesti antitela na nativni polipeptid, npr., kao deo autoimunog poremećaja. U svakom slučaju, životinja će normalno biti autotolerantna samo na svoj sopstveni APP ili Ap, ali ne može biti isključeno da će pomenuta životinja tolerisati i analoge izvedene iz drugih životinjskih vrsta ili iz populacije koja ima drugačiji fenotip.

"Strani T-ćelijski epitop" (ili "strani T-limfocit epitop) je peptid koji je sposoban da se veže za MHC molekul i koji stimuliše T-ćelije kod životinjskih vrsta. Poželjni strani T-ćelijski epitopi u pronalasku su "raznorodni" epitopi, tj. epitopi koji se vezuju za značajan deo određene klase MHC molekula u životinjskoj vrsti ili populaciji. Poznat je veoma mali broj takvih raznorodnih epitopa koji će biti razmatrani u daljem tekstu. Raznorodni T-ćelijski epitopi označeni su i kao "univerzalni" T-ćelijski epitopi. Potrebno je napomenuti da, da bi u što je mogućem većem delu životinjske populacije imunogeni koji su korišćeni u skaldu sa ovim pronalaskom bili efikasni, može biti neophodno 1) ubacivanje nekoliko stranih T-ćelijskih epitopa u isti analog ili 2) pripremanje nekoliko analoga pri čemu svaki analog ima različit umetnuti raznorodni epitop. Takođe treba naglasiti da koncept stranih T-ćelijskih epitopa takođe obuhvata korišćenje kriptičnih T-epitopa, tj. epitopa koji su izvedeni od sopstvenog proteina i koji izazivaju imunogeni odgovor kada su u izolovanom obliku i nisu deo sopstvenog proteina koji je u pitanju.

"Strani epitop T-pomoćnih limfocita" (strani THepitop) je strani T-ćelijski epitop koji vezuje MHC molekul klase II i može biti prikazan na površini antigen-prikazujuće ćelije (APC) vezan za MHC molekul II klase.

"Funkcionalni deo" (bio)molekula u datom kontekstu označava deo molekula koji je odgovoran za najmanje jedan od biohemijskih i fizioloških efekata koji pokazuje molekul. U praksi je dobro poznato da mnogi enzimi i drugi efektorni molekuli imaju aktivno mesto koje je odgovorno za efekte koje pokazuje molekul o kome se radi. Drugi delovi molekula mogu da služe za stabilizaciju ili povećanje rastvorljivosti i prema tome se mogu izostaviti ako stabilizacija i povećanje rastvorljivosti nisu važni u kontekstu određenog oblika ovog pronalaska. Na primer, moguće je da se koriste određeni citokini kao modifikujuća grupa u APP ili Ap (pogledati detaljno razmatranje u daljem tekstu) i u takvom slučaju, pitanje stabilnosti može biti nevažno s obzirom da spajanje za APP ili Ap može da obezbedi neophodnu stabilnost.

Termin "adjuvant" ima svoje uobičajeno značenje u tehnici pripremanja vakcina, tj. "adjuvant" je supstanca ili kompozicija materije koja 1) nije sama po sebi sposobna da izgradi specifičan imuni odgovor protiv imunogena vakcine, ali koja je 2) ipak sposobna da pojača imuni odgovor protiv imunogena. Ili, drugim rečima, vakcinacija sa samim adjuvantom ne obezbeđuje imuni odgovor protiv imunogena, vakcinacija imunogenom može ili ne mora dati imuni odgovor protiv imunogena, ali kombinacija vakcine sa imunogenom i adjuvantom izaziva imuni odgovor protiv imunogena, gde je taj odgovor jači od odgovora koji je izazvan samim imunogenom.

"Ciljanje" molekula u datom kontekstu označava situaciju gde će se molekul posle uvođenja u životinju pretežno javiti u određenom tkivu (tkivima) ili će se pretežno povezati sa izvesnim ćeijama ili tipovima ćelija. Efekat se može postići na čitav niz načina uključujući formulaciju molekula u kompoziciju koja olakšava ciljanu primenu (targeting) ili uvođenjem grupa u molekul koje olakšavaju ciljanu primenu.

"Stimulacija imunog sistema" označava da supstanca ili kompozicija supstance pokazuje opšti, ne-specifičan imunostimulatorni efekat. Čitav niz adjuvanata i supstanci za koje se pretpostavlja da su adjuvanti (kao što su izvesni citokini) poseduje sposobnost stimulisanja imunog sistema. Rezultat korišćenja

imunostimulatornog agensa je povećana "budnost" imunog sistema, što znači da istovremena ili naknadna imunizacija imunogenom izaziva značajno efikasniji imuni odgovor u poređenju sa izolovanom upotrebom imunogena.

"Produktivno vezivanje" označava vezivanje peptida za MHC molekul (Klasa I ili II) tako da postaje sposoban da stimuliše T-ćelije koje aktiviraju ćeliju koja prikazuje peptid vezan za MHC molekul. Na primer, za peptid vezan za molekul MHC Klase II na površini APC se kaže da je produktivno vezan ako će ovaj APC stimulisati THćeliju koja se vezuje za prikazani peptid-MHC Klase II kompleks.

Poželjni oblici amiloidne nishodne regulacije

Poželjno je da je analog upotrebljen kao imunogen u postupku pronalaska modifikovani molekul APP ili AB, gde je prisutna najmanje jedna promena u amino kiselinskoj sekvenci APP ili AB, s obzirom da su na ovaj način znatno povećane šanse da se obezbedi svo neophodno narušavanje autotolerantnosti - ovo je npr. očigledno iz rezultata koji su prikazani u Primeru 2, gde je imunizacija sa divljim tipom AB upoređivana sa imunizacijom sa AB varijantom molekula. Pokazano je (u Dalum Iet al.,1996, J. Immunol. 157: 4796-4804) da su potencijalno samo-reaktivni B-iimfociti koji prepoznaju sopstvene proteine fiziološki prisutni kod normalnih individua. Međutim, da bi se ovi T-limfociti indukovali da stvarno proizvode antitela koja mogu da reaguju sa relevantnim sopstvenim proteinima, potrebna je pomoć T-pomoćnih limfocita koji proizvode citokin (THćelije ili TH-limfociti). U normalnom slučaju ova pomoć nije obezbeđena zbog toga što T-limfociti u opštem slučaju ne prepoznaju epitope T-ćelija koji su izvedeni od sopstvenih proteina kada su predstavljeni od strane ćelija koje prikazuju antigen (APC). Međutim, obezbeđivanjem "stranog" elementa u sopstvenom proteinu (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-ćelije koje prepoznaju strani element su aktivirane kao posledica prepoznavanja stranog epitopa na APC (kao što je, početno, mononuklearna ćelija). Poliklonalni B-limfociti (koji su takođe APC) sposobni da prepoznaju sopstvene epitope na modifikovanom sopstvenom proteinu takođe internalizuju antigen i zatim prikazuju njegov strani epitop (epitope) T-ćelija, a aktivirani T-limfociti kasnije obezbeđuju pomoć u vidu citokina ovim autoreaktivnim poliklonalnim B-limfocitima. S obzirom da antitela koja su proizveli poliklonalni B-limfociti mogu da reaguju sa različitim epitopima na modifikovanom polipeptidu. uključujući one koji su takođe prisutni u nativnom polipeptidu, indukovano je antitelo koje može unakrsno reagovati sa ne-modifikovanim sopstvenim proteinom. U zaključku, T-limfociti se mogu navesti da se ponašaju tako kao da je populacija poliklonalnih B-limfocita prepoznala u celini strani antigen, pri čemu je ustvari domaćinu stran samo umetnuti epitop (epitopi). Na ovaj način, indukovana su antitela koja su sposobna da unakrsno reaguju sa ne-modifikovanim sopstvenim antigenima.

U praksi je poznato nekoliko načina modifikacije peptidnog sopstvenog antigena da bi se ostvario prekid autotolerancije. Ipak je poželjno da analog prema ovom pronalasku obuhvata sledeće - uvedena je najmanje jedna prva grupa koja utiče na ciljanu primenu modifikovanog mokelula na antigen-prikazujuću ćeliju (APC), i/ili

- uvedena je najmanje jedna druga grupa koja stimuliše imuni sistem, i/ili

- uvedena je najmanje jedna treća grupa koja optimizuje prikazivanje analoga imunom sistemu.

Međutim, sve ove modifikacije bi trebalo izvesti uz istovremeno održavanje značane frakcije originalnih epitopa B-limfocita u APP ili AB, s obzirom da je time povećano prepoznavanje nativnog molekula od strane B-limfocita.

U jednom poželjnom obliku, bočne grupe (u obliku stranih epitopa T-ćelija ili gorepomenutoih prvih, drugih i trećih grupa) su uvedene kovalentno ili ne-kovalentno. Ovo znači da su nizovi amino kiselinskih ostataka koji su izvedeni iz APP ili Ap derivatizovani bez promene primane amino kiselinske sekvence, ili namanje bez uvođenja promena u peptidne veze između pojedinačnih amino kiselina u lancu.

Alternativno, a i poželjno, oblik koristi amino kiselinsku supstituciju i/ili deleciju i/ili inserciju i/ili adiciju (koji se mogu postići pomoću rekombinacije ili peptidne sinteze; modifikacije koje obuhvataju duže nizove amino kiselina mogu dovesti do fuzionih polipeptida). Jedna posebno poželjna verzija ovog oblika je tehnika koja je opisana u WO 95/05849, gde je dat postupak za nishodnu regulaciju sopstvenog proteina imunizacijom sa analozima sopstvenog proteina gde je određen broj amino kiselinskih sekvenci supstituisan sa odgovarajućim brojem amino kiselinskih sekvenci, gde svaka od tih sekvenci sadrži strani imunodominantni epitop T-ćelija, uz istovremeno održavanje celokupne tercijarne strukture sopstvenog proteina u analogu. Za ovaj pronalazak, je međutim dovoljno ako modifikacija (bilo da je to insercija, adicija, delecija ili supstitucija) daje strani epitop T-ćelija i istovremeno može da sačuva značajan broj epitopa B-ćelija u APP ili AB. Međutim, da bi se dobila maksimalna efikasnost izazvanog imunog odgovora, poželjno je da je očuvana celokupna tercijalma struktura APP ili AB u modifikovanom molekulu.

U nekim slučajevima, poželjno je da su APP ili Ap ili njihovi fragmenti mutirani. Posebno su poželjne supstitucione vraijante gde je metionin na položaju 35 u Ap-43 supstituisan, poželjno sa leucinom ili izoleucinom, ili je jednostavno deletiran. Posebno poželjni anaiozi sadrže jedan pojedinačan metionin koji je lociran na C-kraju, bilo zbog toga što se on prirodno javlja u amiloidogenom polipeptidu ili stranom THepitopu, ili zbog toga što je on inseriran ili dodat. Stoga, takođe je poželjno da deo analoga koji obuhvata strani THepitop nema metionin, sa izuzetkom mogućeg C-terminalnog položaja metionina.

Glavni razlog za uklanjanje svih osim jednog metionina je taj što postaje moguće da se rekombinantno pripreme multimerni anaiozi koji se kasnije mogu iseći cijanbromidom i tako daju pojedinačne analoge. Prednost ovoga je olakšavanje rekombinantne proizvodnje.

Ustvari, u opštem slučaju je poželjno da svi anaiozi APP ili Ap koji su upotrebljeni prema ovom pronalasku imaju zajedničku osobinu da obuhvataju jedan metionin koji je postavljen kao C-terminalna amino kiselina u analogu i da su ostali metionini ili u amiloidogenom polipeptidu ili u stranom THepitopu deletirani ili supstituisani sa drugom amino kiselinu.

Još jedna zanimljiva mutacija je delecija ili supstitucija fenilalanina na poziciji 19 u Ap-43, a posebno je poželjno da je ta mutacija supstitucija ovog fenilalaninskog ostatka sa prolinom.

Druge zanimljive poliamino kiseline koje bi se trebalo koristiti u analozima su odsečeni delovi Ap-43 proteina. One se takođe mogu koristiti u imunogenim analozima prema ovom pronalasku. Posebno su poželjno odsečci Ap (1-42), Ap (1-40), AB (1-39), AB (1-35), AB (1-34), AB (1-34), Ap (1-28), Ap (1-12), Ap (1-5), Ap (13-28), Ap (13-35), Ap (17-28), Ap (25-35), Ap (35-40), Ap (36-42) i Ap (35-42) (gde brojevi u zagradama označavaju amino kiselinske nizove Ap-43 koji grade određen fragment - Ap (35-40) je npr. identičan amino kiselinama 706-711 u SEQ ID NO: 2). Sve ove varijante sa odsečenim delovima Ap-43 se mogu formirati sa Ap fragmentima koji su ovde opisani, posebno sa varijantama 9, 10, 11, 12 i 13 pomenutim u Primeru 1.

Sledeća formula opisuje molekularne konstrukte koji su generalno pokriveni pronalaskom: - gde su -amiloidei-amiloidexx epitop B-ćelija koji sadrže podsekvence APP ili Ap koje su nezavisno identične ili ne-identične i koje mogu da sadrže ili da ne sadrže strane bočne grupe, x je ceo broj >3, n1-nx su x celi brojevi >0 (najmanje jedan je >1), MODi-MODxsu x modifikacije uvedene između sačuvanih epitopa B-ćelija, aSi-sxsu x celi brojevi >0 (najmanje jedan je >1 ukoliko nijedna bočna grupa nije uvedena u amiloidexsekvence). Prema tome, uzimajući u obzir opšta funkcionalna ograničenja za imunogenost konstrukata, pronalazak omogućava sve vrste permutacija originalne sekvence APP ili Ap, kao i sve vrste njihovih modifikacija. Prema tome, pronalaksom su obuhvaćeni modifikovani APP ili Ap dobijeni izostavljanjem delova sekvence koja npr. pokazuje neželjene efektein vivoili izostavljanjem delova koji su normalno unutarćelijski i prema tome daju neželjene imunološke reakcije.

Jedna poželjna verzija konstrukata koji su navedeni u prethodnom tekstu su, kada se mogu primeniti, oni gde epitop B-ćelija koji sadrži sekvencu amiolidnog proteina nije izložen vanćelijskoj sredini u prekursorskom polipeptidu od koga je izveden amiloid. Takvim izborom epitopa, osigurano je da se ne stvaraju antitela koja će moći da reaguju sa ćelijama koje proizvode prekursor i time imuni odgovor koji se stvara postaje ograničen na imuni odgovor protiv neželjenih naslaga amiloida. U ovom slučaju će biti npr. Izvodljivo da se indukuje imunitet protiv epitopa APP ili Ap koji su samo izloženi ekstraćelijskoj fazi kada su oslobođeni bilo kakvog spajanja za ćelije od kojih su proizvedeni.

Zadržavanje značajne frakcije epitopa B-ćelija ili čak celokupne tercijarne strukture proteina koji je podvrgnut modifikacijama kao što je to ovde opisano se može postići na nekoliko različitih načina. Jedan od načina je da se jednostavno pripremi poliklonalni antiserum usmeren protiv polipeptida o kome je reč (npr. antiserum pripremljen u zecu) i da se kasnije upotrebi ovaj antiserum kao test reagens (npr. u kom petiti vn oj ELISA) protiv modifikovanih proteina koji su proizvedeni. Smatra se da modifikovane verzije (anaiozi) koje reaguju do istog stepena sa antiserumom kao što to čini APP ili AB moraju imati istu ukupnu tercijarnu strukturu kao APP ili AB, pri čemu se za analoge koji pokazuju ograničenu (ali još uvek značajnu i specifičnu) reaktivnost sa takvim antiserumom smatra da imaju zadržanu značajnu frakciju originalnih B-ćelijskih epitopa.

Alternativno, mogu se pripremiti monoklonalna antitela koji mogu da reaguju sa distinktnim epitopima na APP ili Ap i upotrebiti kao test panel. Ovaj pristup ima prednost u tome što omogućava 1) mapiranje epitopa na APP ili Ap i 2) mapiranje epitopa koji su zadržani u pripremljenim analozima.

Naravno, treći pristup bi bio da se odredi 3-dimenzionalna struktura APP ili Ap ili njihovog biološki aktivnog fragmenta (pogledati prethodnoj tekst) i da se ona uporedi sa korektnom trodimenzionanom strukturom pripremljenih analoga. Trodimenzionalna struktura se može odrediti pomoću studija difrakcije X-zraka i NMR-spektroskopije. Dodatne informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu mogu do izvesne mere da se dobiju iz studija cirkularnog dihroizma čija je prednost u tome što u manjoj meri zahtevaju polipeptid u čistom obliku (pri čemu difrakcija X-zraka zahteva kristalizovan polipeptid, a NMR zahteva izotopske varijante polipeptida) da bi se obezbedile korisne informacije o tercijarnoj strukturi datog molekula. Međutim, u krajnjem slučaju difrakcija X-zraka i/ili NMR su neophodni da bi se dobili konkluzivni podaci s obzirom da cirkularni dihroizam može obezbediti samo indirektan dokaz ispravnosti trodimenzionalne strukture preko informacija o elementima sekundarne strukture.

Jedan poželjan oblik pronalaska koristi višestruke prikaze epitopa B-ćelija APP ili AB (tj. formula I gde je najmanje jedan B-ćelijski epitop prisutan u dva položaja). Ovaj efekat se može postići na različite načine, npr. jednostavnim pripremanjem fuzionih polipeptida koji sadrže strukturu (polipeptid izveden iz APP ili Ap)m, gde je m ceo broj >2 i zatim uvođenjem modifikacija koje su ovde razmatrane u najmanje jednu sekvencu APP ili Ap. Poželjno je da uvedene modifikacije obuhvataju najmanje jednu duplikaciju epitopa B-ćelija i/ili uvođenje haptena. Ovi oblici koji uključuju višestruke prikaze izbranih epitopa su posebno poželjni u situacijama gde jedva da su manji delovi APP ili Ap korisni kao gradivni delovi vakcine.

Kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, uvođenje stranog epitopa T-ćelija može se postići uvođenjem najmanje jedne amino kiselinske insercije, adicije, delecije ili supstitucije. Naravno, normalna situacija bi bila uvođenje više od jedne promene u amino kiselinskoj sekvenci (npr. insercija ili supstitucija sa kompletnim T-ćelijskim epitopom), ali važan cilj koji je potrebno postići je da će analog, kada je obrađen antigen prikazujućom ćelijom (APC) dati takav strani imunodominantni T-ćelijski epitop prikazan u kontekstu MHC Klase II molekula na površini APC. Prema tome, ako amino kiselinska sekvenca APP ili Ap u odgovarajućim položajima sadrži određen broj amino kiselinskih ostataka koiji se takođe mogu naći u stranom THepitopu tada se uvođenje stranog THepitopa može postići obezbeđivanjem preostalih amino kiselina stranog epitopa pomoću amino kiselinske insercije, adicije, delecije i supstitucije. Drugim rečima, nije neophodno da se uvede kompletan THepitop insercijom ili supstitucijom da bi se ispunila svrha ovog pronalaska.

Poželjno je da je broj amino kiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili adicija najmanje 2, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercija, supstitucija, adicija ili delecija. Dalje je poželjno da broj amino kiselinskih insercija, supstitucija, adicija ili delecija nije veći od 150, kao što je najviše 100, najviše 90, najviše 80 i najviše 70. Posebno je poželjno da broj supstitucija, insercija.delecija ili adicija ne prelazi 60, a posebno taj broj ne bi trebalo da prelazi 50 ili čak 40. Najpoželjniji je broj koji nije iznad 30. U pogledu amino kiselinskih adicija, potrebno je naglasiti da je njihov broj, kada je dobijeni konstrukt u obliku fuzionog polipeptida, često znatno veći od 150.

Poželjni oblici pronalaska obuhvataju modifikacije uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantnog T-ćelijskog epitopa. Podrazumeva se da pitanje imune dominantnosti T-ćelijskog epitopa zavisi od životinjske vrste o kojoj se radi. Kao što je ovde korišćen, termin "imunodominantnost" se jednostavno odnosi na epitope koji kod vakcinisanih individua/populacija daju značajan imuni odgovor, ali dobro je poznata činjenica da T-ćeljski epitop koji je imunodominantan kod jedne individue/populacije nije neophodno imunodominantan kod druge individue iste vrste, čak iako može biti sposoban da veže MHC-II molekule kod druge individue. Stoga, za upotrebu u ovom pronalasku, imunodominantni T-ćelijski epitop je T-ćelijski epitop koji će biti efikasan u obezbeđivanju T-ćelijske pomoći kada je prisutan u antigenu. U tipičnom slučaju, imunodominantni T-ćelijski epitopi imaju bitnu osobinu da će gotovo uvek biti prikazani vezani za molekul MHC Klase II, nezavisno od polipeptida gde se javljaju.

Sledeće, bitno je pitanje MHC restriktivnosti T-ćelijskih epitopa. Uopšteno, T-ćelijski epitopi koji se prirodno javljaju su MHC restriktivni, tj. izvesni peptidi koji grade T-ćelijski epitop će se efikasno vezati samo za podgrupu molekula MHC Klase II. Ovo zauzvrat ima taj efekat da će u mnogim slučajevima upotreba jednog specifičnog T-ćelijskog epitopa dati komponentu vakcine koja je efikasna samo u delu populacije i u zavisnosti od veličine tog dela, može biti neophodno uključivanje više T-ćelijskih epitopa u istom molekulu, ili alternativno pripremanje vakcina sa više komponenata gde su komponente varijante APP ili AB koje se međusobno razlikuju po prirodi uvedenog T-ćelijskog epitopa.

Ako je MHC restriktivnost upotrebljenih T-ćelija u potpunosti nepoznata (na primer u situaciji gde vakcinisana životinja ima slabo definisan MHC sastav), deo populacije koji je pokriven specifičnom kompozicijom vakcine se može izračunati pomoću sledeće formule

- gde je p, učestalost u populaciji individua koje su odgovorile na /'*' strani T-ćelijski epitop prisutan u kompoziciji vakcine, a n je ukupan broj stranih T-ćelijskih

epitopa u kompoziciji vakcine. Prema tome, kompozicija vakcine koja sadrži 3 strana T-ćelijska epitopa koji imaju učestalost odgovora u populaciji od 0.8, 0.7 i 0.6, respektivno, će dati -tj. 97.6 procenata populacije će statistički izgraditi MHC-II posredovan odgovor na vakcinu.

Gorenavedena formula se ne primenjuje u situacijama kada je poznat više ili manje tačan restrikcioni obrazac upotrebljenih peptida. Ako se, na primer izvestan peptid vezuje samo za humane MHC-II molekule koje kodiraju HLA-DR aleli DR1, DR3, DR5 i DR7, tada će se upotrebom ovog peptida zajedno sa drugim peptidom koji vezuje preostale MHC-II molekule koje kodiraju HLA-DR aleli postići 100% pokrivenost u populaciji koja je u pitanju. Slično tome, ako drugi peptid vezuje samo DR3 i DR5, dodavanje ovog peptida uopšte neće povećati pokrivenost. Ako se izračunavanje populacionog odgovora bazira samo na MHC restriktivnosti T-ćelijskih epitopa u vakcini, minimalni deo populacije koji je pokriven specifičnom kompozicijom vakcine se može odrediti pomoću sledeće formule:

- gde je <py je zbir učestalosti u populaciji alelskih haplotipova koji kodiraju MHC molekule koji vezuju bilo koji od T-ćelijskih epitopa u vakcini i kojipripadaju j* omod 3 poznata HLA lokusa (DP, DR i DQ); u praksi se prvo određuje koji MHC molekuli će prepoznati svaki T-ćelijski epitop u vakcini i nakon toga su navedeni po tipu (DP, DR i DQ) - tada, pojedinačne učestalosti različitih navedenih alelskih haplotipova su sabrane za svaki tip, čime se dobija91,92i93-Može se desiti da vrednost p, u formuli II prevazilazi odgovarajuću teoretsku vrednostn,\

- gde je vy zbir učestalosti u populaciji alelskih haplotipova koji kodiraju MHC molekule koji vezuju /* T-ćelijski epitop u vakcini i koji pripadaju /om od 3 poznata HLA lokusa (DP, DR i DQ). Ovo znači da je u 1-/7; populacije učestalost individua koje

daju odgovor frezidualnu =( p,- Ui)/^- ni).Prema tome, formula III se može podesiti tako da se dobije formula V: - gde je izraz 1-/rezidualnu jednak nuli ako je negativan. Potrebno je naglasiti da formula V zahteva da su svi epitopi mapirani za haplotipove naspram istih grupa haplotipova.

Prema tome, kada se vrši izbor T-ćelijskih epitopa koji će se uvesti u analog, važno je da se uključi svo dostupno znanje o epitopima: 1) učestalost individua koje daju odgovor u populaciji za svaki epitop, 2) MHC restriktivni podaci i 3) učestalost relevantnih haplotipova u populaciji.

Postoji čitav niz "raznorodnih" T-ćelijskih epitopa koji se prirodno javljaju koji su aktivni kod velikog broja individua životinjske vrste ili populacije životinja i oni se poželjno uvode u vakcinu čime se smanjuje potreba za velikim brojem različitih analoga u istoj vakcini.

Raznorodni epitop može biti, na osnovu pronalaska, humani T-ćelijski epitop koji se prirodno javlja kao što su epitopi iz toksoida tetanusa (npr. P2 i P30 epitopi), toksoid difterije, hemaglutinin virusa gripa (HA) i CS antigenP. falciparum.

Tokom godina identifikovan je čitav niz drugih raznorodnih T-ćelijskih epitopa. Posebno su identifikovani peptidi koji su sposobni da vežu veliki deo HLA-DR molekula koje kodiraju različiti HLA-DR aleli i svi se ovi T-ćelijski epitopi mogu uvesti u analoge upotrebljene prema ovom pronalasku. Uporediti, epitopi koji su razmatrani u sledećim referencama i koji su takođe ovde uključeni na osnovu reference: WO 98/23635 (Frazer IHer al.,dodeljena Universitv of Oueensland); Southvvood Set al.,1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia Fet al.,1988, Nature 336: 778-780; Chicz RMer a/.,1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer Jer al.,1993, Celi 74: 197-203; i Falk Ket al.,1994, Immunogenetics 39: 230-242. Poslednja referenca se takođe bavi HLA-DQ i -DP ligandima. Svi epitopi koji su navedeni u ovih 5 referenci su od važnosti kao kandidat prirodnih epitopa koji će se koristiti u ovom pronalasku, kao što su to epitopi koji sa njima imaju zajedničke regione.

Alternativno, epitop može biti bilo koji veštački T-ćelijski epitop koji je sposoban da veže veliki deo molekula MHC Klase II. U ovom kontekstu epitopi pan

DR peptida ("PADRE") koji su opisani u WO 95/07707 i u odgovarajućem radu koji su dali Alexander Jera/.,1994, Immunitv 1: 751-761 (oba otkrića su ovde uključena na osnovu reference) zanimljivi su kandidati za epitope koji će se koristiti prema ovom pronalasku. Potrebno je naglsiti da najefikasniji PADRE peptidi dati u ovim radovima nose D-amino kiseline na C- i N-krajevima da bi se poboljšala stabilnost prilikom primene. Međutim, ovaj pronalazak primarno potpomaže ugrađivanje relevantnih epitopa kao deo analoga koji bi trebalo kasnije da se enzimatski razloži unutar lizozomalnog kompartmenta APC da bi se omogućio kasniji prikaz u kontekstu MHC-II molekula i prema tome nije svrsishodna inkorporacija D-amino kiselina u epitope upotrebljene u ovom pronalasku.

Posebno poželjan PADRE peptid je peptid koji poseduje amino kiselinsku sekvencu AKFVAAVVTLKAAA (SEQ ID NO: 17) ili njegovu imunološki efikasnu podsekvencu. Ovaj, kao i drugi epitopi kojima takođe nedostaje MCH restriktivnost su poželjni T-ćelijski epitopi koji bi trebalo da su prisutni u analozima upotrebljenim u postupku pronalaska. Takvi super-raznorodni epitopi će omogućiti najjednostavnije oblike pronalaska gde je samo jedan analog prikazan imunom sistemu vakcinisane životinje.

Kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, modifikacija APP i AB može takođe obuhvatiti uvođenje prve grupe koja navodi modifikovani amiloidogeni polipeptid do APC ili B-limfocita. Na primer, prva grupa može biti specifičan vezujući partner za specifičan površinski antigen B-limfocita ili za površinski antigen specifičan za APC. Mmnogi takvi specifični površinski antigeni su poznati u tehnici. Na primer, grupa može biti ugljeni hidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, druga grupa može biti hapten. Kao prva grupa se takođe može upotrebiti i fragment antitela koji specifično prepoznaje površinski molekul na APC ili limfocitima (površinski molekul može npr. biti FGy receptor makrofaga i monocita, kao što je FCyRI ili, altrnativno bilo koji drugi specifični površinski marker kao što je CD40 ili CTLA-4). Potrebno je naglasiti da se svi ovi primeri ciljanih molekula mogu upotrebiti kao deo adjuvanta, pogledati u daljem tekstu.

Kao alternativa ili dodatak ciljanom navođenju analoga do izvesnog ćelijskog tipa da bi se postigao pojačani imuni odgovor, moguće je povećati nivo osetljivosti imunog sistema obuhvatanjem gorepomenute druge grupe koja stimuliše imuni sistem. Tipični primeri takvih drugih grupa su citokini i proteini toplotnog šoka ili prateći molekuli, kao i njihovi efikasni delovi.

Pogodni citokini koji će se koristiti prema pronalasku su oni koji će u normalnom slučaju takođe funkcionisati kao adjuvanti u kompoziciji vakcine, tj. na primer interferon y (IFN-y), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) i stimulišući faktor kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF); alternativno, funkcionalni deo molekula citokina može biti dovoljan kao druga grupa. U vezi upotrebe takvih citokina kao adjuvanata, pogledati razmatranje u daljem u tekstu.

Na osnovu pronalaska, pogodni proteini toplotnog šoka ili prateći molekuli upotrebljeni kao druga grupa mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (takođe poznat kao gp96, pogledati VVearsch PAet al.,1998, Biochemistrv 37: 5709-19) i CRT (kalretikulin).

Alternativno, druga grupa može biti toksin, kao što je lizteriolicin (LLO), lipid A i termo-labilan enterotoksin. Takođe, zanimljive mogućnosti su određen broj mikobakterijalnih derivata kao što su MDP (muramildipeptid), CFA (kompletan Freund-ov adjuvant) i diestri trehaloze TDM i TDE.

Takođe, važan oblik pronalaska je mogućnost uvođenja treće grupe koja pojačava prikazivanje analoga imunom sistemu. U tehnici je prikazano nekoliko primera po ovom principu. Na primer, poznato je da se mesto palmitolil lipidacije na proteinu OspABorrelia burgdorferimože koristiti u cilju dobijanja polipeptida koji je sam sebi ađuvant (pogledati npr. WO 96/40718) - izgleda da lipidovani proteini formiraju strukture koje su slične micelama sa jezgrom koje se sastoji od delova mesta za lipidaciju polipeptida i preostalih delova molekula koji vire iz jezgra, rezultirajući u višestrukim prikazima antigenih determinanti. Prema tome, poželjne oblike pronalaska predstavlja korišćenje ovog i sličnih pristupa upotrebom različitih lipidacionih mesta (npr. miristil grupe, farnezil grupe, geranil-geranil grupe, GPI-anchor i n-acil diglicerid grupe), posebno s obzirom da je obezbeđivanje takvog lipidacionog mesta u rekombinantno proizvedenom proteinu relativno jednostavno i zahteva samo upotrebu npr. signalne sekvence koja se prirodno javlja kao fuzionog partnera za analog. Sledeća mogućnost je upotreba Cd3 fragmenta faktora C3 komplementa ili samog C3 (cf. Dempsevet al.,1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

Alternativni oblik pronalaska koji takođe daje poželjni prikaz višestrukih (npr. najmanje 2) kopija važnih epitopskih regiona APP ili AB imunom sistemu je kovalentno spajanje analoga za izvesne molekule, tj. varijante d i e pomenute u prethodnom tekstu. Na primer, mogu se koristiti polimeri, npr. ugljeni hidrati kao što je dekstran, pogledati npr. Lees Aet al.,1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, ali su takođe manoza ili manan korisne alternative Integralni membranski proteini iz npr. E. coli i drugih bakterija su takođe korisni konjugacioni partneri. Tradicionalni molekuli nosači kao što su hemocijanin iz prilepka (KLH), toksoid tetanusa, toksoid difterije i goveđi serum albumin (BSA) takođe su poželjni i korisni konjugacioni partneri.

Poželjni oblici kovalentnog vezivanja materijala koji je izveden od APP i Ap za polihidroksipolimere kao što su ugljeni hidrati obuhvataju upotrebu najmanje jednog peptida koji je izveden od APP ili Ap i najmanje jednog stranog T-pomoćnog epitopa koji su posebno spojeni za polihidorkispolimer (tj. strani T-pomoćni epitop i amino kiselijnska sekvenca izvedena od APP ili Ap nisu međusobno fuzionisani, već su pre vezani za polihidroksipolimer koji zatim služi kao osnova nosača). Ponovo, takav oblik je najpoželjniji kada je pogodan B-ćelijski epitop koji nosi regione peptida izvedenih od APP ili Ap izgrađen pomoću kratkih peptidnih nizova - ovo je zbog toga što ovaj pristup predstavlja veoma pogodan način za postizanje višestrukih prikaza izabranih epitopa u dobijenom imunogenom agensu. To je, međutim, takođe moguće jednostavnim spajanjem analoga koji su ovde već opisani sa polihidroksipolimernom osnovom, tj. da materijal izveden od APP ili Ap nije vezan za osnovu odvojeno od stranih THepitopa.

Posebno je poželjno da se spajanje stranog T-pomoćnog epitopa i (poli)peptida koji je izveden od APP ili Ap obavlja preko amidne veze koja se može raskinuti peptidazom. Ova strategija omogućuje preuzimanje i istovremenu obradu konjugata od strane APC, a zatim i prikazivanje T-ćelijskog epitopa u kontekstu MHC Klase II.

Jedan od načina za postizanje spajanja peptida (i peptida koji je izveden od APP ili AB kao i stranog epitpa) je da se pogodan polihidroksipolimer aktivira pomoću trezil (trifluoroetilsulfonil) grupa ili pomoću drugih pogodnih aktivacionih grupa kao što su maleimido, p-nitrofenilhloroformat (za aktivaciju OH grupa i formiranje peptidne veze između peptida i polihidroksipolimera) i tozil (p-toluensulfonil). Npr. moguće je pripremiti aktivirane polisaharide kao što je opisano u WO 00/05316 i US 5,874,469 (obe ovde uključene na osnovu reference) i spojiti ih sa peptidima ili amino kiselinskim sekvencama koji su izvedeni od APP ili Ap kao i sa T-ćelijskim epitopima koji su pripremljeni pomoću konvencionalnih tehnika čvrste ili tečne faze peptide sinteze. Dobijeni proizvod se sastoji od polihidroksipolimerne osnove (npr. dekstranske osnove) koja ima poliamino kiseline izvedene od APP ili Ap i od stranih T-ćelijskih epitopa koje su za nju vezane preko njihovih N-terminusa ili drugih dostupnih azotnih grupa. Ukoliko je poželjno, moguće je da sintetisati APP ili Ap peptide tako da se zaštite sve dostupne amino grupe osim jedne na N-terminusu, zatim da se dobijeni zaštićeni peptidi vežu za trezilovanu grupu dekstrana i konačno da se izvrši deprotekcija dobijenog konjugata Specifičan primer ovog pristupa je opisan u primerima u daljem tekstu.

Umesto korišćenja polisahardnih molekula koji su rastvorljivi u vodi kao što je smartrano u WO 00/05316 i US 5,874,469, podjednako je moguće da se upotrebe unakrsno vezani polisaharidni molekuli, čime se dobija partikularni konjugat između polipeptida i polisaharida - veruje se da ovo vodi ka poboljšanom prikazu polipeptida imunom sistemu, s obzirom da su postignuta dva cilja, naime dobijanje efekta lokalnog depoa kada se konjugat injektira i dobijanje partikula koje su privlačne mete za APC. Pristup korišćenju takvog partikularnog sistema je takođe detaljno dat u primerima.

Razmatranja u osnovi izbora površine gde se uvode modifikacije u APP ili Ap su a) očuvanje poznatih i predviđenih B-ćelijskih epitopa, b) očuvanje tercijarne strukture, c) izbegavanje B-ćelijskih epitopa koji su prisutni na "ćelijama proizvođačima" itd. U bilo kom stepenu, kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, relativno je lako izvršiti skrining grupe analoga koji su podvrgnuti uvođenju T-ćelijskog epitopa na različite položaje.

S obzirom da najpoželjniji oblici ovog pronalaska obuhvataju nishodnu regulaciju humanog Ap, kao posledica toga poželjno je da je APP ili Ap polipeptid razmatran u prethodnom tekstu humani Ap polipeptid. U ovom obliku, posebno je poželjno da je APP ili Ap polipeptid modifikovan supstitucijom najmanje jedne amino kiselinske sekvence u SEQ ID NO: 2 sa najmanje jednom amino kiselinskom sekvencom iste ili različite dužine koja sadrži strani THepitop. Poželjni primeri modifikovanih amiloidogenih APP ili Ap su šematski prikazani na SI. 1 korišćenjem P2 i P30 epitopa kao primera. Argumentacija za takve konstrukte je detaljno razmatrana u primerima.

Posebno, amino kiselinska sekvenca koja sadrži (ili kompletira) THkoja je uvedena u SEQ ID NO: 2 može se uvesti na bilo koju amino kiselinu u SEQ ID NO: 2. To jest, uvođenje je moguće posle bilo kojih amino kiselina 1-770, ali poželjno posle bilo kojih od amino kiselina 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 u SEQ ID NO: 2. Ovo se može kombinovati sa delecijom bilo koje ili svih amino kiselina 1-671, ili bilo koje ili svih amino kiselina 715-770. Dalje, kada se koristi tehnika supstitucije bilo koja od amino kiselina 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 u SEQ ID NO: 2 može se izbaciti u kombinaciji sa uvođenjem.

Sledeći oblik ovog pronalaska je prikaz analoga koji ne obuhvataju bilo koju podsekvencu SEQ ID NO: 2 koja se produktivno vezuje za molekule MHC klase II inicirajući odgovor T-ćelija.

Argumentacija za takvu strategiju za formiranje imunogena koji angažuje imuni sistem u smislu pokretanja npr. anti-Ap imunog odgovora je sledeća: Naglašeno je da kada se imunizacija vrši sa bogato zastupljenim analognim proteinima kao što je Ap formulisan u adjuvantu koji je dovoljno snažan da prekine toleranciju tela na autologne proteine, postoji opasnost da se kod nekih vakcinisanih individua izazvani imuni odgovor ne može prekinuti jednostavnim prekidom imunizacije. Ovo je zbog toga što je imuni odgovor kod tih individua najverovatnije izazvan nativnim THepitopom autolognog proteina što kao štetan efekat ima to da će protein koji poseduju vakcinisane individue biti sposoban da funkcioniše kao imunizujući agens: autoimuno stanje je prema tome uspostavljeno.

Prema znanju pronalazača nikada nije primećeno da poželjni postupci koji obuhvataju upotrebu stranih THepitpa proizvode ovaj efekat, zbog toga što je autoimuni odgovor izazvan stranim THepitopom i u više navrata pronazači su pokazali da izazvani imuni odgovor dobijen poželjnom tehnologijom stvarno opada posle prestanka imunizacija. Međutim, teoriski se ovo može ostvariti kod malog broja individua čiji bi imuni odgovor takođe bio izazvan autolognim THepitopom relevantnog autoproteina protiv koga je individua imunizovana - ovo je posebno važno kada se razmatraju autoproteini koji su relativno bogato zastupljeni, kao što je AB, pri čemu su drugi terapeutski relevantni autoproteini prisutni samo lokalno ili u tako niskim količinama u telu, da "samo-imunizacioni efekat" nije moguć. Veoma jednostavan način da se ovo izbegne je stoga da se izbegne uključivanje peptidnih sekvenci u imunogenu koje mogu da služe kao THepitopi (i s obzirom da peptidi koji su kraći od oko 9 amino kiselina ne mogu da služe kao THepitopi, upotreba kraćih fragmenata je jednostavan i podesan pristup). Prema tome, ovaj oblik pronalaska takođe služi kao osiguranje da imunogen ne obuhvata peptidne sekvence ciljnih APP ili AB koje mogu da služe kao "samo-stimulišući THepitopi" uključujući sekvence koje sadrže samo konzervativne supstitucije u sekvenci ciljnog proteina koja može u suprotnom da funkcioniše kao Thepitop.

Poželjni oblici prikaza analoga APP ili AB imunom sistemu obuhvataju upotrebu himernog peptida koji sadrži najmanje jedan peptid izveden od APP ili Ap, koji se ne vezuje produktivno za molekule MHC Klase II, kao i najmanje jednog stranog T-pomoćnog epitopa. Dalje, poželjno je da peptid izveden od APP ili Ap sadrži B-ćelijski epitop. Posebno je povoljno da su kod imunogenog analoga amino kiselinske sekvence koje sadrže jedan ili više B-ćelijskih epitopa predstavljene bilo kao kontinuirana sekvenca ili kao sekvenca koja obuhvata umetnute delove, gde umetnuti delovi sadrže strane T-pomoćne epitope.

Ponovo, takav oblik je najpoželjniji kada je pogodan B-ćelijski epitop koji nosi regione APP ili AB sastavljen od kratkih peptidnih nizova koji ni na koji način ne bi bili sposobni da se produktivno vežu za molekul MHC Klase II. Izabrani B-ćelijski epitop ili epitopi amiloidogenog polipeptida bi prema tome trebalo da sadrži najviše 9 uzastopnih amino kiselina SEQ ID NO: 2. Poželjni su kraći peoptidi, kao što su oni koji imaju najviše 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 uzastopnih amino kiselina iz amino kiselnske sekvence amiloidogenog polipeptida.

Poželjno je da analog sadrži najmanje jednu podsekvencu SEQ ID NO: 2 tako da se svaka takva jedna podsekvenca nezavisno sastoji od amino kiselinskih nizova iz APP ili Ap izabranih iz grupe koju se sastoji od 9 uzastopnih amino kiselina, 8 uzastopnih amino kiselina, 7 uzastopnih amino kiselina, 6 uzastopnih amino kiselina, 5 uzastopnih amino kiselina, 4 uzastopne amino kiseline i 3 uzastopne amino kiseline.

Posebno je poželjno da uzastopne amino kiseline počinju na amino kiselinskom ostatku iz grupe koja se sastoji od ostataka 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 SEQ ID NO: 2.

Vakcinacija proteinom/peptidom; formulacija i primena analoga

Kada se postiže prikaz analoga imunom sistemu životinje preko njegove primene na životinju, formulacija polipeptida sledi principe koji su opšte poznati u tehnici.

Pripremanje vakcina koje sadrže peptidne sekvence kao aktivne sastojke je generalno dobro shvaćena u tehnici, kao što je navedeno u primerima u U.S. Patents 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; i 4,578,770, svi uključeni na osnovu reference. U tipičnom slučaju, takve vakcine se pripremaju na takav način da da se mogu injektiraju bilo kao tečni rastvori ili suspenzije; čvrsti oblici pogodni za rastvaranje ili za suspendovanje u tečnosti pre injektiranja se takođe mogu pripremiti. Preparacija se takođe može emulzifikovati. Aktivni imunogeni sastojak je često pomešan sa inertnim puniocima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Pogodni inertni punioci su, na primer, voda, slani rastvor, dekstroza, glicerol, etanol, ili tome slično, kao i njihove kombinacije. Pored toga, ukoliko je poželjno, vakcina može sadržati manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulzifikujući agensi, pH puferujući agensi, ili adjuvanti koji povećavaju efikasnost vakcina; pogledati detaljno razmatranje o adjuvantima dato u daljem tekstu.

Vakcine se konvencionalno primenjuju parenteralno, injekcijom, na primer, bilo subkutano, intrakutano ili intramuskularno. Dodatne formulacije koje su pogodne za druge načine primene obuhvataju supozitorije i u nekim slučajevima, oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonealne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakranijalne formulacije. Za supozitorije, tradicionalna vezujuća sredstva i nosači mogu da obuhvataju, na primer, polialkalenglikole ili trigliceride; takve supozitorije se mogu formirati iz smeša koje sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0.5% do 10%, poželjno 1-2%o. Oralne formulacije obuhvataju takve normalno korišćene inertne punioce kao što su, na primer, farmaceutske gradacije manitola, laktoze, škroba, magnezijumstearata, natrijum saharin, celuloze, magnezijumkarbonata i tome slično. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa produženim oslobađanjem ili praškova i sadrže 10-95% aktivnog sastojka, poželjno 25-70%. Za oralne formulacije, toksin kolere je zanimljiv partner za formulaciju (i takođe mogući konjugacioni partner).

Polipeptidi se mogu formulisati u vakcinu kao neutralni ili slani oblici. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele soli (formirane sa slobodnim amino grupama peptida) i koje su formirane sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili takve organske kiseline kao što su sirćetna, oksalna, vinska, fenilglikolna i tome slično. Soli formirane sa slobodnim karboksil grupama se takođe mogu izvesti od neorganskih baza kao što su, na primer, hidroksidi natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma ili feri hidroksidi i od takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i tome slično.

Vakcine se primenjuju na način koji je kompatibilan sa formulacijama dozaže i u takvoj količini da budu terapeutski efikasne i imunogene. Količina koja se primenjuje zavisi od subjekta koji se tretira, uključujući, npr., kapacitet imunog sistema individue da izgradi imuni odgovor i stepena željene zaštite. Pogodni opseg dozaže je reda veličine od nekoliko stotina mikrograma aktivnog sastojka po vakcinaciji sa poželjnim opsegom od oko 0.1 ug do 2000\ xg(čak su razmatrane veće količine u opsegu 1-1 Omg), kao što je u opsegu od oko 0.5 ug do 1000 u.g, poželjno u opsegu od 1\ xgdo 500 ug i posebno u opsegu od oko 10 (ig do 100 ug,. Pogodni režimi za početnu primenu i naknadne imunizacije su takođe varijabilni ali su tipizirani početnom primenom iza koje slede naknadne inokulacije ili druge primene.

Način primene može varirati u širokim granicama. Primenljiv je bilo koji od konvencionalnih postupaka za primenu vakcine. Oni obuhvataju oralnu primenu na čvrstoj fiziološki prihvatljivoj bazi ili u fiziološki prihvatljivoj disperziji, parenteralno, injekcijom ili tome slično. Dozaža vakcine će zavisiti od načina primene i variraće prema starosti osobe koja se vakciniše i od formulacije antigena.

Neki od polipeptida vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali za neke ili druge imuni odgovor će biti pojačan ako vakcina dodatno sadrži adjuvant.

Poznati su različiti postupci za postizanje efekta adjuvanta za vakcinu. Opšti principi i postupci su detaljno dati u "The Theorv and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6 i takođe u "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis Ger al.,(eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obe ovim obuhvaćene na osnovu reference.

Posebno je poželjna upotreba adjuvanta za koji se može pokazati da olakšava prekid autotolerantnosti prema autoantigenima; ustvari, ovo je od posebne važnosti u slučajevima gde je nemodifikovani amiloidogeni polipeptid upotrebljen kao aktivni sastojak u autovakcini. Ne-ograničavajući primeri pogodnih adjuvanata su izabrani iz grupe koja se sastoji od adjuvanta koji podstiču imuni sistem; imunog modulirajućeg adjuvanta kao što su toksin, citokin i mikobakterijski derivat; uljane formulacije; polimer; adjuvant koji formira micele; saponin; imunostimulišući kompleks matriks (ISCOM matriks); partikula; DDA; aluminijumski adjuvanti; DNK adjuvanti; y-inulin; i inkapsulirajući adjuvant. Uopšteno potrebno je naglasiti da su otkrića iz prethodnog teksta koja se odnose na jedinjenja i agense koji su korisni kao prve, druge i treće grupe u analozima takođe se odnose uz odgovarajuće izmene na njihovu upotrebu u adjuvantu vakcine iz pronalaska.

Moguća je primena adjuvanata koja obuhvata upotrebu agenasa kao što je aluminijumhidroksid ili fosfat (alum), koji se obično upotrebljava kao 0.005 do 0.1 procenti rastvor u puferisanom slanom rastvoru, mešanje sa sintetičkim polimerima šećera (npr. Carbopol®) koja se koristi kao 0.25 procentni rastvor, agregacija proteina u vakcini pomoću toplotnog tretmana sa temperaturama koje se kreću u opsegu između 70° do 101°C za 30 sekundi do 2 minuta respektivno i takođe agregacija pomoću unakrsno-vezujućih agenasa. Takođe se može koristiti agregacija reaktivacijom sa antitelima koja su tretirana peptidom (Fab fragmenti) do albumina, smeša sa bakterijskim ćelijama kao što jeC. parvumili endotoksini ili lipopolisaharidne komponente gram-negativnih bakterija, emulzije u fiziološki prihvatljivim uljanim nosačima kao što je manid mono-oleat (Aracel A) ili emulzija sa 20 procentim rastvorom perfluorougljovodonika (Fluosol-DA) upotrebijena kao blok zamena. Takođe je poželjna smeša sa uljima kao što je skvalen i IFA.

Na osnovu pronalaska DDA (dimetildioktadecilamonijumbromid) je zanimljiv kandidat za adjuvant kao što su DNK i y-inulin, ali takođe i Freund-ovi kompletani ili nekompletni adjuvanti kao iquillajasaponini kao što su QuilA i QS21 zanimljivi kao RIBI. Dodatne mogućnosti su monofosforil lipid A (MPL), gorepomenuti C3 i C3d i muramil peptid (MDP).

Takođe je poznato da formulacije lipozoma daju efekte adjuvanta i prema tome lipozomni adjuvanti su poželjni na osnovu pronalaska.

Prema pronalasku takođe su poželjni izbori imunostimulirajući kompleks matriks tip (ISCOM® matriks) adjuvanata, posebno s obzirom da je pokazano da je ovaj tip adjuvanata sposoban da ushodno reguliše ekspresiju MHC Klase II od strane APC. ISCOM® matriks se sastoji od (izborno frakcionisanih) saponina (triterpenoida) izQuillaja saponaria,holesterola i fosfolipida. Kada se meša sa imunogenim proteinom, dobijena partikularna formulacija je ono što je poznato kao ISCOM partikula gde saponin čini 60-70% w/w, holesterol i fosfolipid 10-15% w/w i protein 10-15% w/w. Detalji koji se odnose na kompoziciju i upotrebu imunostimulatornih kompleksa se mogu npr. naći u gorepomenutim priručnicima koji se bave adjuvantima, ali takođe i Morein Bet al.,1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 kao i Mitchell GF, 1996, Immunol. And Celi Biol. 74: 8-25 (obe ovde uključene na osnovu reference) daju korisna uputstva za pripremanje kompletnih imunostimulirajućih kompleksa.

Sledeća veoma zanimljiva (i prema tome poželjna) mogućnost postizanja efekta adjuvanta je upotreba tehnike koja je opisana u Gosselinet al.,1992 (koja je ovim uključena na osnovu reference). Ukratko, prikaz relevantnog antigena kao što je antigen iz ovog pronalaska može se pojačati konjugacijom antigena sa antitelom (ili fragmentima antitela koji se vezuju za antigen) na FCy receptore na monocitima/makofagama. Pokazano je da posebno konjugati između antigena i anti-FCyRI pojačavaju imunogenost u svrhu vakcinacije.

Druge mogućnosti obuhvataju upotrebu ciljnih i imunomodulirajućih supstanci (tj. citokina) pomenutih u prethodnom tekstu kao kandidata za prve i druge grupe u modifikovanim vakcinama amiloidogenih polipeptida. S tim u vezi, mogućnosti su takođe i sintetički induktori citokina kao što je poli l:C.

Pogodni mikobakterijski derivati su izabrani iz grupe koja se sastoji od muramilpeptida, kompletnog Freund-ovog adjuvanta, RIBI i diestra trehaloze kao što su TDM i TDE.

Pogodni imunistimulirajući adjuvanti su izabrani iz grupe koja se sastoji od CD40 liganda i CD40 antitela ili njihovih fragmenata koji se specifično vezuju (pogledati diskusija iz prethodnog teksta), manoze, Fab fragmenta i CTLA-4.

Pogodni polimerni adjuvanti su izabrani iz grupe koja se sastoji od ugljenog hidrata kao što su dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastičnog polimera kao što su; i lateksa kao što su kuglice lateksa.

Još jedan zanimljiv način modulacije imunog odgovora je uključivanje imunogena (izborno zajedno sa adjuvantima i farmaceutski prihvatljivim nosačima i prenosiocima) u "virtualni limfni čvor" (VLN) (zakonom zaštićeni medicinski instrument razvijen u ImmunoTherapv, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tanak cevast instrument) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Ubacivanje VLN pod kožu stvara mesto sterilne inflamacije sa porastom citokina i hemokina. T-ćelije i B-ćelije kao i APC brzo odgovaraju na signale opasnosti, dolaze na mesto upale i sakupljaju se unutar poroznog matriksa VLN. Pokazano je da je neophodna doza antigena potrebna za formiranje imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita obezbeđena vakcinacijom korišćenjem VLN prevazilazi konvencionalne imunizacije korišćenjem Ribi kao adjuvanta. Tehnologija je između ostalog ukratko opisana u Gelber Cet al.,1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smali Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", u: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12<th>- 15<th>1998, Seascape Resort, Apots, California".

U mnogim slučajevima je pokazano da mikropartikularna formulacija vakcina povećava imunogenost proteinskih antigena i prema tome predstavlja sledeći poželjan oblik pronalaska. Mikropartikule su formirane bilo kao ko-formulacije antigena sa polimerom, lipidom, ugljenim hidradom ili drugim molekulima koji su pogodni za formiranje partikula, ili mikropartikule mogu biti homogene partikule koje se sastoje samo od antigena.

Primeri mikropartikula baziranih na polimeru suDartikule bazirane na PLGA i PVP (Gupta, R.K. et al., 1998) gde su polimer i antigen kondenzovani u čvrstu partikulu. Partikule bazirane na lipidu se mogu formirati kao micele lipida (takozvani lipozomi) sa antigenom unutar micele (Pietrobon, P.J. 1995). Partikule bazirane na ugljenim hidratima su u tipičnom slučaju formirane od pogodnog razgradljivog ugljenog hidrata kao što je škrob ili hitosan. Ugljeni hidrat i antigen su pomešani i kondenzovani u partikule u postupku koji je sličan onom koji je upotrebljen za polimerne partikule (Kas, H.S. et al., 1997).

Partikule koje se sastoje samo od antigena se mogu formirati pomoću različitih tehnika sušenja rasprašivanjem i zamrzavanjem. Posebno pogodna za svrhe ovog pronalaska je super kritična fluidna tehnologija koja je upotrebljena za stvaranje jednoobraznih partikula kontrolisane veličine (York, P. 1999 & Shekunov, B. et al., 1999).

Očekuje se da se vakcina primenjuje 1-6 puta godišnje, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 puta godišnje na individuu kojoj je to potrebno. Ranije je pokazano da memorijski efekat imuniteta koji je izazvan upotrebom poželjnih autovakcina prema pronalasku nije trajan i prema tome imuni sistem zahteva da periodično bude izazvan sa amiloidogenim polipeptidom ili modifikovanim amiloidogenim polipeptidima.

Kao posledica genetičke varijacije, različite individue mogu reagovati imunim odgovorima različite jačine na isti polipeptid. Prema tome, vakcina na osnovu pronalaska može sadržati nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuni odgovor, pogledati takođe diskusiju iz prethodnog teksta koja se bavi izborom uvođenja stranog T-ćelijskog epiotpa. Vakcina može sadržati dva ili više polipeptida, gde su svi polipeptidi kao što je definisano u prethodnom tekstu.

Kao posledica toga vakcina može sadržati 3-20 različitih modifikovanih ili nemodifikovanih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida.

Nukleinsko kiselinska vakcinacija

Kao alternativa klasičnoj primeni vakcine bazirane na peptidima, tehnologija nukleinsko kiselinske vakcinacije (takođe poznata kao "nukleinsko kiselinska imunizacija", "genetička imunizacija" i "genska imunizacija") daje određen broj privlačnih karakteristika.

Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, nukleinsko kiselinska vakcinacija ne zahteva izvor koji koristi masovnu proizvodnju imunogenog agensa (npr. u obliku fermentacije u industrijskom opsegu mikroorganizama koji proizvode modifikovane amiloidogene polipeptide). Dalje, ne postoji potreba za prečišćavanjem u posebnim uređajima i šemom za ponovno strukturno pakovanje imunogena. I konačno, s obzirom da se nukleinsko kiselinska vakcinacija oslanja na biohemijski aparat vakcinisane individue da bi se proizveo ekspresioni proizvod uvedene nukelinske kiseline, očekuje se da će se javiti optimalna post-translaciona obrada ekspresionog proizvoda; ovo je posebno važno u slučaju autovakcinacije, s obzirom da bi, kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, trebalo sačuvati značajnu frakciju originalnih B-ćelijskih epitopa u modifikovanom molekulu i s obzirom da se B-ćelijski epitopi u principu mogu izgraditi od delova bilo kog (bio)molekula (npr. ugljenog hidrata, lipida, proteina itd.). Prema tome, nativni obrazci glikozilacije i lipidacije imunogena mogu biti od velike važnosti za ukupnu imunogenost, a ovo je najbolje osigurano time da domaćin proizvodi imunogen.

Prema tome, poželjan oblik varijanti a-c pronalaska obuhvata postizanje prikaza analoga imunom sistemu uvođenjem nukelinske kiseline (kiselina) koja kodira analog, u životinjske ćelije i time dobijanjemin vivoekspresije uvedene nukleinske kiseline (kiselina) od strane ćelija.

U ovom obliku, uvedena nukleinska kiselina je poželjno DNK koja može biti u obliku gole DNK, DNK formulisane u lipozomima, DNK uključene u virusni vektor, DNK formulisane sa proteinom ili polipeptidom koji olakšava transinfekciju, DNK formulisane sa proteinom za ciljanje ili polipeptidom, DNK formulisane sa agensima koji talože kalcijum, DNK spojene za inertni molekul nosač, DNK inkapsulirane u polimer, npr. u PLGA (pogledati tehnologiju mikroinkapsulacije opisanu u WO 98/31398) ili u hitin ili hitosan i DNK formulisane sa adjuvantom. U ovom kontekstu naglašeno je da se praktično sva razmatranja koja se odnose na upotrebu adjuvanata u tradicionalnoj formualciji vakcine primenjuju za formulaciju DNK vakcina. Prema tome, sva otkrića koja su ovde data koja se odnose na upotrebu adjuvanata u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidu primenjuju se uz odgovarajuće izmene za njihovu upotrebu u tehnologiji nukelinsko kiselinske vakcinacije.

Kako za puteve primene i šeme primene vakcina baziranih na polipeptidu koji su detaljno razmatrani u prethodnom tekstu, ona su takođe primenljiva za nukelinsko kiselinske vakcine pronalaska i sva razmatranja iz prethodnog teksta koja se odnose na puteve primene i šeme primene za polipeptide primenjuju uz odgovarajuće izmene na nukleinske kiseline. Ovome bi trebalo dodati to da se nukleinsko kiselinske vakcine mogu pogodno primeniti intravenozno ili intraarterijski. Dalje, dobro je poznato u praksi da se nukleinsko kiselinske vakcine mogu primeniti upotrebom takozvanog genskog topa i prema tome ovaj i ekvivalentni načini primene se takođe smatraju delom ovog pronalaska. Konačno, takođe je saopšteno da upotreba VLN u primeni nukleinskih kiselina proizvodi dobre rezultate i prema tome ovaj poseban način primene je posebno poželjan.

Dalje, nukleinska kiselina (kiseline) koja je upotrebljena kao imunizacioni agens mogu da sadrže regione koji kodiraju prvu, drugu i/ili treću grupu, npr. u obliku imunomodulirajućih supstanci koje su opisane u prethodnom tekstu kao što su citokini koji su razmatrani kao korisni adjuvanti. Poželjna verzija ovog oblika obuhvata posedovanje kodirajućeg regiona za analog i kodirajućeg regiona za imunomodulator u različitim okvirima čitanja ili najmanje pod kontrolom različitih promotora. Na taj način je izbegnuto da se analog ili epitop proizvodi kao fuzioni partner za imunomodulator. Alternativno, mogu se upotrebiti dva posebna nukleotidna fragmenta, ali ovo je manje poželjno zbog prednosti osigurane ko-ekspresije kada su oba kodirajuća regiona nalaze i u istom molekulu.

Na osnovu toga, pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju za indukovanje proizvodnje antitela protiv APP ili AB, gde kompozicija sadrži - nukleinsko kiselinski fragment ili vektor pronalaska (pogledati razmatranje vektora u daljem tekstu) i - farmaceutski i imunološki prihvatljiv prenosioc i/ili nosač i/ili adjuvant kao što je razmatrano u prethodnom tekstu.

Pod normalnim okolnostima, nukleinska kiselina koja kodira varijante je uvedena u obliku vektora gde je ekspresija pod kontrolom virusnog promotora. Za detaljnije razmatranje vektora na osnovu pronalaska, pogledati razmatranje u daljem tekstu. Takođe, detaljna otkrića koja se odnose na formulaciju i upotrebu nukleinsko kiselinskih vakcina su dostupni, pogledati Donnellv JJet al,1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnellv JJet al.,1997, Life Sciences 60: 163-172. Obe publikacije su uključene ovde na osnovu reference.

Žive vakcine

Treća alternativa za postizanje prikaza analoga kao što su oni definisani u varijantama a-c imunom sistemu je upotreba tehnologije živih vakcina. Kod žive vakcinacije, prikaz imunom sistemu je postignut primenom, na životinju, ne-patogenih mikroorganizama koji su transformisani fragmentom nukleinske kiseline koji kodira analog ili koji su transformisani vektorom koji sadrži takav fragment nukleinske kiseline. Ne-patogeni mikroorganizam može biti bilo koji pogodan oslabljeni bakterijski soj (oslabljen pasažom ili uklanjanjem patogenih ekspresionih produkata pomoću tehnologije rekombinantne DNK), npr.Mycobacterium bovisBCG., ne-patogeniStreptococcusspp.,E. coli, Salmonellaspp.,Vibrio cholerae, Shigella,itd. Revizije koje se bave pripremanjem dostupnih živih vakcina se mogu npr. naći u Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 i vValker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, obe uključene na osnovu reference.

Za detalje o nukleinsko kiselinskim fragmentima i vektorima koji su upotrebljeni u takvim živim vakcinama, pogledati diskusiju u daljem tekstu.

Kao alternativa bakterijskim živim vakcinama, nukleinsko kiselinski fragment pronalaska koji je razmatran u daljem tekstu se može ugraditi u ne-virulentnu virusnu vakcinu kao što je soj vakcinije ili bilo kog drugog pogodnog poxvirusa.

U normalnom slučaju, ne-patogeni mikroorganizam ili virus je primenjen samo jednom na životinju, ali u izvesnim slučajevima može biti neophodno da se mikroorganizam primeni više od jednog puta u toku života da bi se održao zaštitni imunitet. Čak je razmatrano da će imunizacione šeme kao one što su detaljno prikazane u prethodnom tekstu za polipeptidnu vakcinaciju biti korisne kada se koriste žive ili virusne vakcine.

Alternativno, živa ili virusna vakcinacija je spojena sa ranijom ili kasnijom polipeptidnom i/ili nukleinsko kiselinskom vakcinacijom. Na primer, moguće je da se primarna imunizacija postigne sa živom ili virusnom vakcinom iza koje slede naknadne aktivirajuće imunizacije korišćenjem polipeptidnog ili nukleinsko kiselinskog pristupa.

Mikroorganizam ili virus se može transformisati sa nukleinskom kiselinom (kiselinama) koja sadrži regione koji kodiraju prvu, drugu i/ili treću grupu, npr. u obliku imunomodulirajućih supstanci koje su opisane u prethodnom tekstu kao što su citokini razmatrani kao korisni adjuvanti. Poželjna verzija ovog oblika obuhvata posedovanje kodirajućeg regiona za analog i kodirajućeg regiona za imunomodulator u različitim okvirima čitanja ili bar pod kontrolom različitih promotora. Na taj način izbegnuto je da su analog ili epitopi proizvedeni kao fuzioni partneri za imunomodulator. Alternativno, kao agensi za transformaciju se mogu upotrebiti dva posebna nukleotidna fragmenta. Naravno, posedovanje prve i/ili druge i/ili treće grupe u istom okviru čitanja može da obezbedi ekspresioni proizvod, analog pronalaska i takav oblik je posebno poželjan na osnovu ovog pronalaska.

Upotreba postupka pronalaska u lečenju bolesti

Kao što se može shvatiti iz razmatranja u prethodnom tekstu, obezbeđivanje postupka pronalaska omogućava kontrolu bolesti koje karakterišu amiloidne naslage. U ovom kontekstu, AD je ključni ciljevi za postupak pronalaska, ali takođe i druge bolesti koje karakterišu amiloidne naslage koje sadrže AB su mogući ciljevi. Prema tome, važan oblik postupka pronalaska za nishodnu aktivnost amiloidne aktivnosti obuhvata lečenje i/ili prevenciju i/ili poboljšanje stanja AD ili drugih bolesti koje karakterišu amiloidne naslage, gde taj postupak obuhvata nishodno-regulišući APP ili AB na osnovu postupka pronalaska do te mere da je količina amiloida značajno smanjena.

Posebno je poželjno da se smanjenjem količine amiloida postiže inverzija ravnoteže između formiranja amiloida i razgradnje/uklanjanja amiloida, tj. da stopa razgradnje/uklanjanja amiloida prevazilazi stopu formiranja amiloida. Pažljivom kontrolom broja imunizacija i imunološkog uticaja imunizacija na individue kome je ona potrebna bilo bi moguće ostvariti ravnotežu tokom vremena koja rezultira u neto smanjenju amiloidnih naslaga bez pojave težih štetnih efekata.

Alternativno, ako se kod individue pomoću postupka pronalaska ne mogu ukloniti ili smanjiti postojeće amiloidne naslage, postupak pronalaska se može upotrebiti za dobijanje klinički značajnog smanjenja u formiranju novog amiloida, čime se značajno produžava vreme u kome bolesti ne izaziva gubitak sposobnosti. Trebalo bi da bude moguće praćenje stope stvaranja naslaga amiloida bilo merenjem koncentracije amiloida u serumu (za koju se veruje da je u ravnoteži sa nakupljenim materijalom) ili korišćenjem "positron-emission tomographv" (PET) skeninga, pogledati Small GW,et al.,1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70-78.

Druge bolesti i stanja kod kojih se mogu upotrebiti ovde data sredstva i postupci za lečenje ili poboljšanje su na anlogan način pomenute u prethodnom tekstu u "Osnova pronalaska" ili su navedene u daljem tekstu u delu sa naslovom "druge amiloidne bolesti i proteini vezani sa njima".

Peptidi, polipeptidi i kompozicije pronalaska

Kao što se može shvatiti iz prethodnog teksta, ovaj pronalazak je zasnovan na konceptu imunizacije individua protiv APP ili AB antigena da bi se dobila smanjena količina amiloidnih naslaga koje su vezane za patologiju. Poželjan način za obezbeđivanje takve imunizacije je upotreba analoga koji su ovde opisani, čime se obezbeđuju molekuli koji ranije nisu dati u tehnici.

Veruje se da su anaiozi koji se ovde razmatraju sami po sebi inventivni i prema tome važan deo pronalaska pripada analogu kao što je opisano u prethodnom tekstu. Prema tome, bilo koje otkriće koje je ovde predstavljeno i koje pripada modifikovanom APP ili AB je važno za svrhu opisivanja amiloidogenih analoga pronalaska i bilo koja takva otkrića primenjuju se uz odgovarajuće izmene za opis ovih analoga.

Potrebno je naglasiti da poželjni modifikovani molekuli APP ili AB sadrže modifikacije koje daju polipeptid koji ima identičnost sekvenci od najmanje 70% sa APP ili AB ili sa njihovom podsekvencom od najmanje 10 amino kiselina dužine. Poželjne su veće identičnosti sekvenci, npr. najmanje 75% ili čak najmanje 80, 85, 90, ili 95%. Identičnost sekvenci za proteine i nukleinske kiseline se može izračunati kao{ Nref-A/d,/)x100/A/ref,gde jeNdifukupan broj ne-identičnih ostataka u dve sekvence kada su međusobno poravnate i gde jeNrefbroj ostataka u jednoj od sekvenci. Prema tome, DNK sekvenca AGTCAGTC će imati identičnost sekvence od 75% sa sekvencom AATCAATC (Ndif=2 i Nref=8).

Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje su korisne u praksi postupka pronalaska. Prema tome, pronalazak se posebno odnosi na imunogenu kompoziciju koja sadrži imunogeno efikasnu količinu analoga kao što je opisano u prethodnom tekstu, gde pomenuta kompozicija dodatno sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljiv razblaživač i/ili prenosioc i/ili nosač i/ili inertni punioc i izborno adjuvant. Drugim rečima, ovaj deo pronalaska se bavi formulacijama analoga, u suštini kao što je opisano u prethodnom tekstu. Izbor adjuvanata, nosača i prenosioca je u skladu sa onim što je razmatrano u prethodnom tekstu koji se odnosi na formulacije modifikovanog i nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida za upotrebu u postupku pronalaska za nishodnu reagulaciju APP ili Ap.

Polipeptidi su pripremljeni na osnovu postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Duži peptidi su u normalno pripremljeni pomoću tehnologije rekombinantnog gena uključujući uvođenje nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira analog u pogodan vektor, transformacije pogodne ćelije domaćina vektorom, ekspresije nukleinsko kiselinske sekvence od strane ćelije domaćina, rekuperacije ekspresionog proizvoda iz ćelija domaćina ili supernatanta njihove kulture i kasnijeg prečišćavanja i izborne modifikacije, npr. ponovno savijanje ili derivatizacija.

Kraći peptidi se poželjno pripremaju pomoću dobro-poznatih tehnika čvrste- ili tečne-faze peptidne sinteze. Međutim, skoriji napredak u ovoj tehnologiji je omogućio proizvodnju polipeptida i proteina u punoj dužini i prema tome unutar delokruga ovog pronalaska je takođe i pripremanje dugih konstrukata sintetičkim putem.

Nu kleinsko kiselinski fragmenti i vektori pronalaska

Iz gorenavedenog otkrića se može shvatiti da se poliamino kiselinski anaiozi mogu pripremiti pomoću tehnologije rekombinantnih gena, ali takođe pomoću hemijske sinteze ili semisinteze; poslednje dve opcije su posebno važne kada se modifikacija sastoji u spajanju za proteinske nosače (kao što su KLH, toksoid difterije, toksoid tetanusa i BSA) i ne-proteinske molekule kao što su ugljeno hidratni polimeri i naravno takođe kada modifikacija sadrži adiciju bočnih lanaca ili bočnih grupa peptidnom lancu koji je izveden od APP ili AB.

U svrhu tehnologije rekombinantnog gena i naravno takođe u svrhu nukleinsko kiselinske imunizacije, nukleinsko kiselinski fragmenti koji kodiraju analoge su važni hemijski proizvodi. Prema tome, važan deo pronalaska se odnosi na nukleinsko kiselinski fragment koji kodira analog pronalaska, tj. polipeptid izveden od APP ili Ap koji sadrži ili prirodnu sekvencu kojoj je dodat ili u koju je umetnut fuzioni partner ili, poželjno polipeptid koji je izveden od APP ili Ap gde je uveden strani T-ćelijski epitop pomoću insercije i/ili adicije, poželjno pomoću supstitucije i/ili delecije. Nukleinsko kiselinski fragmenti pronalaska su ili fragmenti DNK ili fragmenti RNK.

Nukleinsko kiselinski fragmenti pronalaska će se normalno umetnuti u pogodne vektore da bi se formirali klonirajući ili ekspresioni vektori koji nose nukleinsko kiselinske fragmente pronalaska; takvi novi vektori su takođe deo pronalaska. Detalji koji se bave konstrukcijom ovih vektora pronalaska će se razmatrati u kontekstu transformisanih ćelija i mikroorganizama u daljem tekstu. Vektori mogu, u zavisnosti od svrhe i tipa primene, biti u obliku plazmida, faga, kozmida, mini-hromozoma, ili virusa, ali, takođe važan vektor je i gola DNK koja se eksprimira samo privremeno u izvesnim ćelijama. Poželjni klonirajući i ekspresioni vektori pronalaska su sposobni da obave autonomnu repilakciju, čime se obezbeđuje veliki broj kopija za ekspresiju na visokom-nivou ili replikaciju na visokom nivou za naknadno kloniranje.

Opšti opis vektora pronalaska obuhvata sledeće karakteristike u smeru 5'~>3' i u operativnom vezivanju: promotor za vođenje ekspresije nukleinsko kiselinskog fragmenta pronalaska, izborno nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira vodeći peptid koji omogućava izlučivanje (u vanćelijsku fazu ili, tamo gde se može primeniti, u periplazmu) ili ugrađivanje u membranu polipeptidnog fragmenta, nukleinsko kiselinski fragment pronalaska i izborno nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira terminator. Kada se operiše sa ekspresionim vektorima u sojevima producenata ili ćelijskim linijama producenata, radi genetičke stabilnosti transformisane ćelije je poželjno da je vektor kada se ugrađuje u ćeliju domaćina ugrađen u genom ćelije domaćina. Nasuprot tome, kada se radi sa vektorima koji se koriste za postizanjein vivoekspresije u životinji (tj. kada se koristi vektor u DNK vakcinaciji) zbog sigurnosti je poželjno da vektor nije sposoban da se ugradi u genom ćelije domaćina; u tipičnom slučaju upotrebljeni su gola DNK ili ne-ugrađeni virusni vektori, čiji su izbori dobro poznati tehničarima.

Vektori pronalaska su upotrebljeni da bi transformisali ćelije domaćine tako da proizvode analog pronalaska. Takve transformisane ćelije, koje su takođe deo pronalaska, mogu biti kultivisane ćelije ili ćelijske linije upotrebljene za propagaciju nukleinsko kiselinskih fragmenata i vektora pronalaska, ili upotrebljene za rekombinantnu proizvodnju analoga pronalaska. Alternativno, transformisane ćelije mogu biti pogodni sojevi živih vakcina gde je nukleinsko kiselinski fragment (jedna pojedinačna ili višestruka kopija) umetnuta tako da se postigne izlučivanje ili ugrađivanje u bakterijsku membranu ili ćelijski zid analoga.

Poželjne transformisane ćelije pronalaska su mikroorganizmi kao što su bakterije (kao što su vrsteEscherichia[npr.E. coli], Bacillus[npr.Bacillus subtilis], Salmonella,iliMycobacterium[poželjno ne-patogena, npr.M. bovisBCG]), kvasci (kao što jeSaccharomyces cerevisiae)i protozoe. Alternativno, transformisane ćelije su izvedene od višećelijskih organizama kao što su gljive, insekatske ćelije, biljne ćelije, ili sisarske ćelije. Najpoželjnije su ćelije izvedene od čoveka, pogledati razmatranje o ćelijskim linijama i vektorima u daljem tekstu. Skoriji rezultati su pokazali velika očekivanja od upotrebe komercijalno dostupne ćelijske linijeDrosophila melanogaster(Schneider 2 (S2) ćelijska linija i vektorski sistem dostupni od Invitrogen) za rekombinantnu proizvodnju polipeptida u laboratoriji prijavioca i prema tome ovaj ekspresioni sistem je posebno poželjan.

U svrhu kloniranja i/ili optimizovane ekspresije poželjno je da je transformisana ćelija sposobna da replikuje nukleinsko kiselinski fragment pronalaska. Ćelije koje eksprimiraju nukleinsko kiselinski fragment su poželjni korisni oblici pronalaska; one se mogu upotrebiti za na-veliko i na-malo pripremanje analoga pronalaska ili, u slučaju ne-patogenih bakterija, kao gradivni sastojci vakcine u živoj vakcini.

Kada se anaiozi pronalaska proizvode pomoću transformisanih ćelija, pogodno je, mada daleko od neophodnog, da je ekspresioni proizvod ili izvezen van podloge za kulturu ili prenesen na površinu transformisane ćelije.

Kada je identifikovana efikasna ćelija producent poželjno je, da se na osnovu nje, uspostavi stabilna ćelijska linija koja nosi vektor pronalaska i koja eksprimira nukleinsko kiselinski fragment koji kodira modifikovani amiloidogeni polipeptid. Poželjno, ova stabilna ćelijska linija luči ili nosi analog pronalaska, čime se olakšava njegovo prečišćavanje.

Uopšteno, plazmidni vektori koji sadrže replikon ili kontrolne sekvence koje su izvedene od vrsta koje su kompatibilne sa ćelijom domaćinom su upotrebljeni u vezi sa domaćinima. Vektor obično nosi replikaciono mesto, kao i markirajuće sekvence koje su sposobne da obezbede fenotipski izbor u transformisanim ćelijama. Na primer,E. colije u tipičnom slučaju transformisana korišćenjem pBR322, plazmida koji je izveden iz vrsteE. coli(pogledati, npr., Bolivaret al.,1977). pBR322 plazmid sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin i time omogućuje laku identifikaciju transformisanih ćelija. pBR lazmid, ili drugi mikrobijani plazmid ili fag moraju takođe da sadrže, ili se moraju modifikovati da bi sadržali, promotore koje mogu upotrebiti prokariotski sistemi za ekspresiju.

Ovi promotori najčešće korišćeni u konstrukciji rekombinantne DNK obuhvataju promotorske sisteme B-laktamaze (penicilinaze) i laktoze (Chang et al., 1978; Itakuraer al.,1977; Goeddeler al.,1979) i promotorski sistem triptofana (trp)

(Goeddelet al.,1979; EP-A-0 036 776). Dok su ovi najčešće korišćeni, drugi mikrobijalni promotori su otkriveni i korišćeni, a detalji koji se bave njihovim nukleotidnim sekvencama su objavljeni, omogućavajući obučenom tehničaru da ih funkcionalno veže sa plazmidnim vektorima (Siebvvenlistet al.,1980). Izvesni geni iz prokariota se mogu efikasno eksprimirati uE. coliod njihovih sopstvenih promotorskih sekvenci, uklanjajući potrebu za dodavanje još jednog promotora na veštački način.

Pored prokariota, takođe se mogu koristiti i eukariotski mikrobi, kao što su kvasci i ovde bi promotor trebalo da je sposoban da vodi ekspresiju.Saccharomyces cerevisiase,ili kvasac koji obično koriste pekari je najčešće upotrebljavan među eukariotiskim mikroorganizmima, iako je često dostupan određen broj drugih sojeva. Za ekspresijuSaccharomycesobično se koristi na primer plazmid Yrp7 (Stinchcomber al.,1979; Kingsmanet al.,1979; Tschemperet al.,1980). Ovaj plazmid već sadrži trpi gen koji daje selekcioni marker za mutantni soj kvasca kojima nedostaje sposobnost da rastu u triptofanu na primer ATCC No. 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisustvo trpi lezije kao karakteristike genoma kvaščeve ćelije domaćina tada obezbeđuje efikasnu sredinu za detektovanje transformacije rastom u odsustvu triptofana.

Pogodne pokretačke sekvence u kvaščevim vektorima obuhvataju promotore za 3-fosfogliceratkinazu (Hitzmanet al.,1980) ili druge glikolitičke enzime (Hesset al.,1968; Hollandet al.,1978), kao što su enolaza, giiceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozofosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza. Kod konstruisanja pogodnih ekspresionih plazmida, terminacione sekvence povezane sa ovim genima su takođe vezane u ekspresioni vektor 3' od sekvence za koja treba da se eksprimira da bi se obezbedila poliadenilacija mRNK i terminacija.

Drugi promotori, koji imaju dodatnu prednost transkripcije koja je kontrolisana uslovima rasta su promotorski region za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, degradirajući enzimi povezani sa metabolizmom azota i gorepomenuta gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza i enzimi odgovorni za korišćenje maltoze i galaktoze. Poželjan je bilo koji vektor koji sadrži promotor kompatibilan sa kvascima, početno mesto replikacije i terminacione sekvence.

Kao domaćini se pored mikroorganizama mogu koristiti takođe i kulture ćelija izvedene iz višećelijskih organizama. U principu, sa bilo kojom takvom ćelijskom kulturom je moguće raditi, bio da se radi o kultiri ćelija kičmenjaka ili beskičmenjaka. Međutim, najveće zanimanje je bilo za ćelije kičmenjaka, a propagacija kičmenjačkih ćelija u kulturi (kulturi tkiva) je postala rutinski postupak poslednjih godina (Tissue Culture, 1973). Primeri takvih korisnih ćelijskih linija domaćina su VERO i HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO) i VV138, BHK, COS-7 293, ćelijeSpodoptera frugiperda(SF) (komercijalno dostupne kao kompletni ekspresioni sistemi u između ostalog Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. i u Invitrogen) i MDCK ćelijske linije. U ovom pronalasku, posebno poželjna ćelijska linija je S2dostupna od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Nethetlands.

Ekspresioni vektori za takve ćelije obično obuhvataju (ako je neophodno) početno mesto replikacije, promotor lociran ispred gena koji će se eksprimirati, zajedno sa bilo kojim neophodnim mestima za vezivanje ribozoma, RNK mestima za splajsovanje, poliadenilacionim mestom i sekvence terinatora transkripcije.

Za upotrebu u sisarskim ćelijama, kontrolne funkcije na ekspresionim vektorima često obezbeđuje virusni materijal. Na primer, često korišćeni promotori su izvedeni od polvoma virusa, Adenovirusa 2 i najčešće Simian Virusa 40 (SV40). Rani i kasni promotori SV40 virusa su posebno korisni zbog toga što su oba ta promotora lako dobijena iz virusa kao fragment koji takođe sadrži SV40 virusni origin replikacije (Fierset al.,1978). Manji i veći SV40 fragmenti se takođe mogu upotrebiti, pod uslovom da je tu uključena sekvenca od približno 250 bp koja se pruža odHind\\\mesta premaBg\\mestu koje je locirano u virusnom oridžinu (početnom mestu) replikacije. Dalje, takođe je moguće, a često i poželjno, da se koriste promotor ili kontrolne sekvence koji su normalno vezani za željenu gensku sekvencu, pod uslovom da su takve kontrolne sekvence kompatibilne sa sistemima ćelije domaćina.

Oridžin replikacije se može obezbediti ili konstrukcijom vektora koji će da obuhvata egzogeni oridžin, kao što se može izvesti od SV40 ili drugog virusa (npr., Polvoma, Adeno, VSV, BPV) ili se može obezbediti pomoću mehanizma hromozomalne replikacije ćelije domaćina.

Identifikacija korisnih analoga

Tehničarima će biti jasno da neće sve moguće varijante ili modifikacije APP ili Ap koji se prirodno javljaju biti sposobne da izazovu pojavu antitela u životinji koja mogu unakrsno da reaguju sa prirodnim oblikom. Međutim, nije teško postaviti efikasan standardni test za modifikovane amiloidogene molekule koji ispunjavaju minimalne zahteve za imunološku reaktivnost koja je ovde razmatrana. Prema tome, moguće je koristiti postupak za identifikaciju modifikovanog amiloidogenog polipeptida koji je sposoban da indukuje antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida u životinjskoj vrsti gde je nemodifikovani amiloidogeni polipeptid (ne-imunogen) sopstveni protein, gde taj postupak obuhvata

-pripremanje, pomoću peptidne sinteze ili tehnika genetičkog inženjeringa, grupe uzajamno odvojenih analoga pronalaska gde su amino kiseline adirane u, inserirane u, deletirane iz ili supstituiane u amino kiselinsku sekvencu u APP ili Ap životinjske vrste čime se stvaraju amino kiselinske sekvence u grupi koja sadrži T-ćelijske epitope koji su strani za životinjsu vrstu, ili pripremanjem grupe nukleinsko kiselnskih fragmenata koji kodiraju grupu uzajamno različitih analoga, -testiranjem članova grupe analoga ili nukleijnsko kiselinskih fragmenata na njihovu sposobnost da izazovu proizvodnju antitela od strane životinsje vrste protiv nemodifikovanog APP ili Ap, i -identifikacijom i izbornom izolacijom člana (članova) grupe analoga koji značajno indukuje proizvodnju antitela protiv nemodifikovanog APP ili Ap u vrsti ili identifikacijom i izbornom izolacijom polipeptidnih ekspresionih proizvoda koje kodiraju članovi grupe nukleinsko kiselinskih fragmenata koji značajno indukuju proizvodnju antitela protiv nemodifikovanog APP ili Ap u životinjskim vrstama.

U ovom kontekstu, "grupa uzajamno različitih modifikovanih amiloidogenih polipeptida" je skupina ne-identičnih analoga koji su npr. izabrani na osnovu kriterijuma razmatranih u prethodnom tekstu (npr. u kombinaciji sa studijama cirkularnog dihroizma, NMR spektra i/ili obrazaca difrekcije X-zraka). Grupa se može sastojati od samo nekoliko članova, ali smatra se da ta grupa može sadržati nekoliko stotina članova.

Test članova grupe se može konačno izvestiin vivo,ali moguće je primeniti i određen brojin vitrotestova koji smanjuju broj modifikovanih molekula koji mogu poslužiti pronalaska.

S obzirom da je cilj uvođenja stranih T-ćelijskih epitopa da T-pomoćne ćelije pomognu odgovru B-ćelija, preduslov je da je T-ćelijska proliferacija indukovana analogom. Proliferacija T-ćelija se može testirati standardizovanim proliferacionim analizamain vitro.Ukratko, uzorak obogaćen T-ćelijama je dobijen iz subjekta i zatim je čuvan u kulturi. Kultivisane T-ćelije su dovedene u dodir sa APC subjekta koji su prethodno preuzele modifikovani molekul i obradile ga tako da prikaže svoje T-ćelijske epitope. Proliferacija T-ćelija je praćena i upoređivana sa pogodnom kontrolom (npr. T-ćelije u kulturi dovedene u dodir sa APC koje su obradile intaktni, nativni amiloidogeni polipeptid). Alternativno, proliferacija se može meriti određivanjem koncentracije relevantnih citokina koje oslobađaju T-ćelije kao odgovor na njihovo prepoznavanje stranih T-ćelija.

S obzirom da postoji visoka verovatnoća da je najmanje jedan analog bilo kog tipa grupe sposoban da indukuje proizvodnju antitela protiv APP ili Ap, moguće je pripremiti imunogenu kompoziciju koja sadrži najmanje jedan analog koji je sposoban da indukuje antitela protiv nemodifikovanog APP ili Ap u životinjskoj vsrti gde je nemodifikovani APP ili Ap sopstveni protein, gde postupak sadrži mešanje člana (članova) grupe koji značajno izaziva proizvodnju antitela u životinjskoj vrsti koja mogu da reaguju sa APP ili Ap sa farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili prenosiocem i/ili razblaživačem i/ili inertnim puniocem, izborno u kombinaciji a najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvantom.

Goreopisani testovi polipeptidnih grupa se pogodno mogu izvesti početnim pripremanjem određenog broja uzajamno različitih nukelinsko kiselinskih sekvenci ili vektora pronalaska, njihovim umetanjem u odgovorajuće ekspresione vektore, transformacijom pogodnih ćelija domaćina (ili domaćine životinje) sa vektorima i postizanje ekspresije nukelinsko kiselinskih sekvenci pronalaska. Iza ovih koraka može uslediti izolacija ekspresionih proizvoda. Poželjno je da su nukleinsko kiselinske sekvence i/ili vektori pripremljeni pomoću postupaka koji obuhvataju tehnike moleklularne amplifikacije kao što je PCR ili pomoću nukleinsko kiselinske sinteze.

Specifična amiloidogena ciljna mesta

Pored proteina, najčešće povezani sa Alchajmerovom bolešću, APP, ApoE4 i Tau, postoji duga lista drugih proteina koji su na izvestan način povezani za AD, bilo preko njihovog direktnog prisustva u plakama ili spletovima AD mozgova ili preko njihove očigledne genetičke povezanosti sa povećanim rizikom od razvoja AD. Većina, ako ne i svi, od ovih antigena su zajedno sa gorerazmatranim AB, APP, prezenilinom i ApoE4, pretpostavljeni ciljni proteini u izvesnom obliku ovog pronalaska. Ova pretpostavljena ciljna mesta su već temeljno razmatrana u WO 01/62284. Prema tome, ova pretpostavljena ciljna mesta će se ovde samo ukratko pomenuti, pri čemu se detaljnije osnovno razmatranje može naći u WO 01/62282 koja je ovim uključena na osnovu reference: Alfal-antihimotripsin (ACT); Alfa2-makroglobulin; ABAD (alkohol dehidrogenaza koja vezuje Ap-peptid); APLP1 i -2 (amiloidni prekursor kao protein 1 i -2); AMY117; Bax; Bc1-2; Bleomicinhidrolaza; BRI/ABRI; Hromogranin A; Klusterin/apoJ; CRF (faktor za oslobađanje kortikotropina) vezujući protein; EDTF (endotelijalni-izveden toksični faktor); Heparansulfatproteoglikani; medijatorni protein-2 odgovora na humani kolapsin; Huntingtin (protein Huntington-ove bolesti); ICAM-I; IL-6; Antigen CD68 vezan za lizozom; P21 ras; PLC-delta 1 (fosfolipaza C izoenzim delta 1); Serumska amiloidna P komponenta (SAP); Sinaptofizin; Sinuklein (alfa-sinuklein ili NACP); i TGF-b1 (transformišući faktor rasta b1).

Ovde opisana sredstva i postupci za nishodnu regulaciju APP ili AB mogu se kombinovati sa terapijama, npr. aktivnom specifičnom imunoterpaijom, protiv bilo kog od ovih drugih amiloidogenih polipeptida.

Nezavisno od Alchajmerove bolesti, pogodano ciljno mesto za ovde opisanu tehnologiju bi bila i cerebralna amiloidna angiopatija.

Smatra se da bi većina postupaka za imunizaciju protiv APP ili AB trebalo da bude ograničena na imunizaciju koja utiče na pojavu antitela koja mogu unakrsno da reaguju sa nativnim APP ili AB I pored toga, u nekim slučajevima bilo bi zanimljivo indukovati ćelijski imunitet u obliku CTL odgovora protiv ćelija koje prikazuju MHC Klase I epitope iz amiloidogenih polipeptida - ovo može biti celishodno u onim slučajevima gde smanjenje broja ćelija koje proizvode APP ili AB ne dovodi do ozbiljnih štetnih efekata. U takvim slučajevima gde se žele CTL odgovori, poželjno je koristiti postupke iz WO 00/20027 za prijavioce. Otkrića ova dva dokumenta su ovim uključena na osnovu reference.

NOSAČI IMUNOGENA

Molekuli koji sadrže T pomoćni epitop i APP ili Ap peptide koji predstavljaju ili obuhvataju B-ćelijske epitope kovalentno vezane za ne-imunogeni polimerni molekul koji se ponaša kao prenosioc, npr. multivalentni aktivirani poli-hidroksipolimer, će, kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, funkcionisati kao molekul vakcine koji sadrži samo imunološki važne delove, mogu se dobiti i predstavljaju zanimljive oblike varijanti d i e koje su date u prethodnom tekstu. Raznorodni ili takozvani univerzalni T-ćelijski epitopi se mogu upotrebiti ako je npr. ciljno mesto za vakcinu sopstveni antigen kao što je APP ili Ap. Dalje, elementi koji pojačavaju imunološki odgovor bi takođe mogli biti zajedno spojeni sa prenosiocem i da se tako ponašaju kao adjuvant. Takvi elementi bi mogli biti manoza, tuftsin, muramildipeptid, CpG regioni itd. U tom slučaju, naknadna formulacija adjuvanata vakcine bi mogla biti nepotrebna i proizvod bi se mogao primenjivati u čistoj vodi ili slanom rastvoru.

Spajanjem epitopa citotoksične T-ćelije (CTL) sa T-pomoćnim epitopima bilo bi moguće stvaranje CTL specifične za antigen od koga je CTL epitop izveden. Elementi koji potpomažu preuzimanje proizvoda u citosolu, kao što je manoza, iz APC, npr. makrofaga, bi se takođe mogli zajedno spojiti za prenosioc sa CTL- i T pomoćnim epitopom i pojačati CTL odgovor.

Odnos B-ćelijskih epitopa i T-pomoćnih epitopa (P2 i P30) u konačnom proizvodu se može menjati variranjem koncentracije ovih peptida u koraku sinteze. Kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, imunogeni molekul može biti obeležen sa npr. manozom, tuftsinom, CpG-regionima ili drugim imunostimulirajućim supstancama (ovde opisane) njihovim dodavanjem, ako je neophodno korišćenjem npr. aminovanih derivata supstanci, u karbonatni pufer u koraku sinteze.

Ako je nerastvorljivi aktivirani polihidroksipolimer upotrebljen za spajanje peptida koji sadrže APP ili Ap B-ćelijski epitop i T-pomoćne epitope, to se može, kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, izvesti kao sinteza čvrste faze i krajnji proizvod se može sakupiti i prečistiti ispiranjem i filtracijom. Elementi koje bi trebalo spojiti sa polihidroksipolimerom (peptidi, obeleživači, itd.) koji je aktiviran trezilom se mogu dodati u polihidroksipolimer na niskom pH, npr. pH 4-5 i omogućiti da se pasivnom difuzijom podjednako rasporede u "gelu". Kasnije, pH se može podići do pH 9-10 da bi se započela reakcija primarnih amino grupa na peptidima i obeleživača sa trezil grupama na polihidroksi polimeru. Posle spajanja peptida i npr. imunstimulirajućih elemenata gel je samleven tako da formira partikule pogodne veličine za imunizaciju.

Takav imunogen prema tome obuhvata

a) najmanje jednu prvu amino kiselinsku sekvencu koja je izvedena od APP ili Ap, gde najmanje jedna prva amino kiselinska sekvenca sadrži najmanje jedan B-ćelijski i/ili najmanje jedan CTL epitop, i b) najmanje jednu drugu amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata strani T pomoćni ćelijski epitop,

gde je svaka od najmanje prve i najmanje druge amino kiselinske sekvence spojena sa farmaceutski prihvatljivim aktiviranim polihidroksipolimernim nosačem.

Da bi se amino kiselinske sekvence spojile sa polihidroksipolimerom normalno je neophodno da se polihidroksipolimer "aktivira" sa pogodnom reaktivnom grupom koja može da formira neophodnu vezu sa amino kiselinskim sekvencama.

Termin "polihidroksipolimer" ima isto značenje kao u WO 00/05316, tj. polihidroksipolimer može da ima sasvim iste karakteristike kao što je specifično prikazano u toj prijavi. Prema tome, polihidroksipolimer može biti rastvorljiv ili nerastvorljiv u vodi (prema tome zahteva različite korake sinteze u toku pripremanja imunogena). Polihidroksipolimer se može izabrati iz polihidroksi jedinjenja koja se prirodno javljaju i sintetičkih polihidroksi jedinjenja.

Specifični i poželjni polihidroksipolimeri su polisaharidi izabrani od acetana, amilopektina, gume agar-agar, agaroze, alginata, gume arabike, agensi dobijeni iz crvenih algi, celoloze, ciklodekstrina, dekstrana, furcelarana, galaktomanana, želatina, ghatti (indijska smola), glukana, glikogena, guara, karaje, glukomanan/A, smola rogača, manana, pektina, psiliuma, pululana, škroba, tamarina, tragant, ksantana, ksilana i ksiloglukana. Dekstran je posebno poželjan.

Međutim, polihidroksipolimer se takođe može izabrati iz grupe koju čine visoko granati poli(etilenimin) (PEI), tetratienilen vinilen, Kevlar (dugi lanci poli-parafeniltereftalamida), Poli(uretani), Poli(siloksani), polidimetilsiloksan, silikon, Poli(metilmetakrilat) (PMMA), Poli(vinilalkhol), Poli(vinilpirolidon), Poli(2-hidroksietilmetakrilat), Poli(N-vinilpirolidon), Poli(vinilalkohol), Poli(akrilna kiselina), Politetrafluoroetilen (PTFE), Poliakrilamid, Poli(etilen-ko-vinilacetat), Poli(etilenglikol) i derivati, Poli(metakrilna kiselina), Polilaktidi (PLA), Poliglikolidi (PGA), Poli(laktid-ko-glikolidi) (PLGA), Polianhidridi i Poliortoestri.

(Težinska) prosečna molekularna težina polihidroksipolimera koji je u pitanju (tj. pre aktivacije) je tipično najmanje 1000, kao što je najmanje 2000, poželjno u opsegu 2500-2000000, poželjnije u opsegu od 3000-1000000, posebno u opsegu od 5000-500000. U primerima je pokazano da su polihidroksipolimeri koji imaju prosečnu molekularnu težinu u opsegu od 10000-200000 posebno povoljni.

Polihidroksipolimer je poželjno rastvorljiv u vodi do količine od najmanje 10 mg/ml, poželjno najmanje 25 mg/ml, kao što je najmanje 50 mg/ml, posebno najmanje 100 mg/ml, kao što je najmanje 150 mg/ml na sobnoj temperaturi. Poznato je da dekstran, čak i kada je aktiviran kao što je ovde opisano, ispunjava zahteve u vezi rastvorljivosti u vodi.

Za neke od najzanimljivijih polihidroksipolimera, odnos između C (atoma ugljenika) i OH grupa (hidroksi grupa) neaktiviranih polihidroksipolimera (tj. nativnog polihidroksipolimera pre aktivacije) je u opsegu od 1.3 do 2.5, kao što je 1.5-2.3, poželjno 1.6-2.1, posebno 1.85-2.05. Bez vezivanja za bilo koju specifičnu teoriju, veruje se da takav C/OH odnos neaktiviranog polihidroksipolimera predstavlja visoko povoljan nivo hidrofilnosti. Polivinilalkohol i polisaharidi su primeri polihidroksipolimera koji ispunjavaju ovaj zahtev. Veruje se da bi gorepomenuti odnos trebalo da bude otprilike isti za aktivirani polihidroksipolimer kao što bi aktivacioni odnos trebalo da bude relativno nizak.

Termin "polihidroksipolimerni nosač" označava deo imunogena koji nosi amino kiselinske sekvence. Kao opšte pravilo, polihidroksipolimerni nosač ima svoje spoljne granice gde bi se amino kiselinske sekvence mogle odcepiti pomoću peptidaze, npr. u antigen prikazujućoj ćeliji koja obrađuje imunogen. Prema tome, polihidroksipolimerni nosač može biti polihidroksipolimer sa aktivacionom grupom, gde se veza između aktivacione grupe i amino kiselinske sekvence može otcepiti pomoću peptidaze u APC, ili polihidroksilni nosač može biti polihidroksipolimer sa aktivacionom grupom i npr. linkerom kao što je L-amino kiselina ili izvestan broj D-amino kiselina, gde se zadnji deo linkera može vezati za amino kiselinske sekvence i može se otcepiti pomoću peptidaze u APC.

Kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, polihidroksipolimeri nose funkcionalne grupe (aktivacione grupe), koje olakšavaju vezivanje peptida za nosač. U praksi je poznat veliki broj primenljivih funkcionalnih grupa, npr. trezil (trifluoroetilsulfonil), maleimido, p-nitrofenilhloroformat, cijanobromid, tozil (p-toluensulfonil), trifilil (trifluorometansulfonil), pentafluorobenzensulfonil i vinilsulfon grupe. Poželjni primeri funkcionalnih grupa unutar ovog pronalaska su trezil, maleimido, tozil, triflil, pentafluorobenzensulfonil, p-nitrofenilhloroformat i vinilsulfon grupe, među kojima su posebno poželjne trezil, maleimido i tozil grupe.

Polihidroksipoolimeri aktivirani trezilom se mogu pripremiti korišćenjem trezilhlorida kao što je opisano za aktivaciju dekstrana u Primeru 1 u WO 00/05316 ili kao što je opisano u Gregorius et al., J. Immunol. Meth. 181 (1995) 65-73.

Polihidroksipolimeri aktivirani maleimidom se mogu pripremiti korišćenjem p-maleimidofenilizocijanata kao što je opisano za aktivaciju dekstrana u Primeru 3 WO 00/05316. Alternativno, maleimido grupe bi se mogle uvesti u polihidroksipolimer, kao što je dekstran, derivatizacijom polihidroksipolimera koji je aktiviran trezilom (kao što je dekstran aktiviran trezilom (TAD)) sa diaminskim jedinjenjem u višku (uopšteno H2N-CnH2n-NH2, gde je n 1-20, poželjno 1-8), npr. 1,3-diamniopropan, a zatim da reaguje sa amino grupama koje su uvedene u TAD reagensima kao što su sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), sulfo-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1 -karboksilat (sulfo-SMCC), sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (SMPB), sulfo-sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (sulfo-SMPB), N-y-maleimidobutiriloksi-sukcinimid estar (GMBS) ili N-Y-maleimidobutiriloksi-sulfosukcinimid estar. lako različiti reagensi i putevi za aktivaciju formalno daju neznatno različite proizvode aktivirane maleimidom u odnosu na vezu između maleimido funkcionalne grupe i ostatka ishodne hidroksi grupe na kojoj se izvodi aktivacija, svi i svaki od njih se smatraju "polihidroksipolimerima koji su aktivirani maleimidom".

Polihidroksipolimeri aktivirani tozilom se mogu pripremiti korišćenjem tozlhlorida kao što je opisano za aktivaciju dekstrana u Primeru 2 u WO 00/05316. Polihidroksipolimeri aktivirani triflilom i pentafluorobenzensulfonilom su pripremljeni kao anaiozi aktivirani tozilom ili trezilom, npr. korišćenjem odgovarajućih kiselih hlorida.

Polihidroksipolimer aktiviran cijanobromidom se može pripremiti reakcijom polihidroksipolimera a cijanobromidom korišćenjem konvencionalnih postupaka. Dobijene funkcionalne grupe su normalno cijanatni estri sa dve hidroksi grupe polihidroksipolimera.

Stepen aktivacije se može izraziti kao odnos između slobodnih hidroksi grupa i aktivacionih grupa (tj. funkcionalizovanih hidroksi grupa). Veruje se da bi odnos između slobodnih hidroksi grupa polihidroksipolimera i aktivacionih grupa trebalo da bude između 250:1 i 4:1 da bi se dobila povoljna ravnoteža između hidrofilnosti i reaktivnosti polihidroksipolimera. Poželjno je da je taj odnos između 100:1 i 6:1, poželjnije između 60:1 i 8:1, posebno između 40:1 i 10:1.

Posebno zanimljivi aktivirani polihidroksipolimeri za korišćenje u ovom postupku za proizvodnju opšte primenljivog imunogena na osnovu pronalaska su polisaharidi aktivirani trezilom, tozilom i sa maleimido, posebno dekstran aktiviran trezilom (TAD), dekstran aktiviran tozilom (TosAD) i dekstran aktiviran sa maleimido

(MAD).

Poželjno je da se veza između polihidroksipolimernog nosača i amino kiselinske sekvence može raskinuti pomoću peptidaze, npr. kako je peptidaza aktivna u obradi antigena u APC. Zbog toga je poželjno da su najmanje prva i najmanje druga amino kiselinska sekvenca spojene za aktivirani polihidroksipolimerni nosač preko amidne veze ili peptidne veze. Posebno je poželjno da svaka najmanje prva i najmanje druga amino kiselinska sekvenca obezbeđuju azotnu grupu njihove odgovorajuće amidne veze.

Polihidroksipolimerni nosač može biti u znatnom stepenu oslobođen amino kiselinskih ostataka, zahtevajući da aktivaciona grupa obezbedi deo veze koja se može raskinuti peptidazom, ali kao stoje pomenuto u prethodnom tkstu, nosač može jednostavno da obuhvata spejser uključujući najmanje jednu L-amino kiselinu. I pored toga, najmanje prva i najmanje druga amino kiselinska sekvenca su normalno vezane za aktiviranu verziju polihidroksipolimera preko azota na N-terminusu amino kiselinske sekvence.

Goreopisani opšte primenljiv imunogen ovog pronalaska se može upotrebiti u postupcima imunizacije u suštini kao što je ovde opisano za polipeptidne vakcine. To jest, sva otkrića koja se odnose na dozaže, način primene i formulaciju polipeptidfnih vakcina za nishodnu regulaciju amiloidogenih polipeptida koji su ovde razmatrani primenjiva su uz odgovarajuće izmene na opšte primenljive imunogene.

OPŠTE PRIMENLJIVA NEŠKODLJIVA TEHNOLOGIJA VAKCINACIJE

Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, jedan poželjan oblik ovog pronalaska zahteva upotrebu varijanti amiloidogenih polipeptida koji nisu sposobni da obezbede sopstveno izvedene THepitope koji mogu da pokrenuti imuni odgovor protiv amiloidogenog polipeptida.

Međutim, pronalazači ovog pronalaska veruju da je ova strategija za projektovanje autoimunih vakcina i za postizanje autoimuniteta, opšte primenljiva tehnologija koja je sama po sebi inventivna. Ovo je naročito korisno u slučajevima gde je sopstveni antigen predviđen za nishodnu regulaciju dovoljno zastupljen u telu, tako da je moguća autostimulacija imunog odgovora. Prema tome, sva gorenavedena otkrića ovog oblika utoliko ukoliko se odnose na ostvarivanje autoimunog odgovora na APP ili AB primenljiva su uz odgovarajuće izmene na imunizaciju protiv drugih sopstvenih polipeptida, posebno onhih koji su prisutni u dovoljnim količinama da bi se održao imuni odgovor u obliku nekontrolisanog anutoimunog stanja zbog toga što autologni THepitopi relevantnih sopstvenih polipeptida pokreću imuni odgovor.

PRIMER 1

Auto vakcinacioni pristup za imunizaciju protiv AD

Činjenica da miševi bez Ap proteina ne pokazuju bilo kakvu abnormalnost ili štetne sporedne efekte, sugeriše to da će uklanjanje ili snižavanje količina Ap biti neškodljivo, Zheng H. (1996).

Objavljeni eksperimenti gde su transgene životinje imunizovane protiv transgenog humanog Ap proteina sugerišu da ako je bilo moguće da se prekine samo tolerancija, nishodna regulacija Ap se može dobiti pomoću auto-reaktivnih antitela. Ovi eksperimenti dalje sugerišu da bi takva nishodna regulacija Ap proteina i sprečila formiranje plaka i čak očistila već formirane Ap plake iz mozga, pogledati Schenk et al. (1999). Ali, tradicionalno nije moguće da se dobiju antitela protiv sopstvenih proteina.

Objavljeni podaci prema tome ne daju sredstva za prekidanje prave samo-toleranacije prema pravim sopstvenim proteinima. Niti ti podaci daju informaciju o tome kako osigurati da imuna reakcija bude usmerena samo ili pretežno prema Ap naslagama, a ne prema prekursorskom proteinu Ap (APP) koji je vezan za ćelijsku membranu, ako se ovo smatra neophodnim. Imuni odgovor koji je stvoren korišćenjem postojeće tehnologije bi verovatno stvorio imuni odgovor prema sopstvenim proteinima na neregulisan način tako da se može stvoriti neželjena preterana auto-reaktivnost prema delovima Ap proteina. Prema tome, korišćenje postojećih imunizacionih strategija će najverovatnije biti nemoćno da stvori snažne imune odgovore prema sopstvenim proteinima i osim toga neće biti bezbedno kao posledica potencijalne snažne unakrsne reaktivnosti prema APP vezanom za membranu koji je prisutan na velikom broju ćelija u CNS-u.

Ovaj pronalazak obezbeđuje sredstva za efikasno stvaranje snažno regulisanog imunog odgovora prema pravim sopstvenim proteinima koji bi potencijalno mogli formirati plake i izazvati ozbiljnu bolest u CNS-u ili u drugim delovima tela. Bezbezdna i efikasna humana AB proteinska terapeutska vakcina će se razviti korišćenjem ove tehnologije za tretman AD.

U svetlu ovoga, moguće je predvideti da bi se AD, bolest za koju je predviđeno da će ozbiljno narušiti sistem zdravstvene zaštite u sledećem veku, mogla izlečiti, ili da bi takve opisane vakcine mogle najmanje da izgrade efikasan terapeutski pristup za lečenje simptoma i progresiju ove bolesti. Ova tehnika predstavlja u potpunosti novi imunološki pristup za zaustavljanje nagomilavanja amiloida kod AD i takođe drugih neuroloških bolesti.

U sledećoj tabeli, naznačeno je 35 razmatranih konstrukata. Sve pozicije date u tabeli su date u odnosu na početni metionin u APP (prva amino kiselina u SEQ ID NO: 2) i obuhvataju i početnu i završnu amino kiselinu, npr. fragment 672-714 obuhvata i amino kiselinu 672 i 714. Početne i završne pozicije za P2 i P30 ukazuju da epitop supstituiše deo APP fragmenta na pozicijama koje su naznačene (obe pozicije uključene u supstituciju) - u većini konstrukata, gde uvedeni epitopi supstituišu fragment dužine epitopa. Zvezdice u tabeli imaju sledeće značenje:<*>) Samo jedna pozicija za P2 i P30 ukazuje da je epitop umetnut u derivat APP na poziciji koja je naznačena (epitop počinje na amino kiselini koja je C-terminalno susedna datoj poziciji).<**>) Konstrukcija 34 sadrži tri identična APP fragmenta koji su odvojeni sa P30 i P2, respektivno.<***>) Konstrukcija 35 sadrži devet identičnih APP fragmenata koji su odvojeni naizmeničnim P30 i P2 epitopima.

Deo APP, protiv koga je najzanimljivije stvoriti odgovor, je A8 jezgro peptida od 43 amino kiseline (Ap-43, odgovara SEQ ID NO: 2, ostaci 672-714) koji je glavni sastavni deo amiloidnih plaka u AD mozgovima. Ovaj APP fragment je deo svih gorenavedenih kontrukcija.

Varijante 1 i 2 sadrže deo APP uzvodno od AB-43 gde su postavljeni model epitopi P2 i P30. Varijante 1 i 3-8 sve sadrže C-100 fragment za koji je pokazano da je neurotoksičan - C-100 fragment odgovara amino kiselinskim ostacima 714-770 iz SEQ ID NO: 2. U varijantama 3-5 epitopi supstituišu deo C-100 fragmenta, dok su varijante 6-8 inserirane u C-100.

Varijante 9-35 sadrže samo AB-43 protein jezgra. U varijantama 9-13, P2 i P30 su fuzionisani za bilo koji kraj AB-43; u 14-21 P2 i P30 supstituišu deo Ap-43; u 22-32 P2 i P30 su inserirani u Ap-43; 34 sadrži tri identična Ap-43 fragmenta razdvojena sa P30 i P2, respektivno; 35 sadrži 9 Ap-43 ponovaka razdvojena sa naizmeničnim P2 i P30 epitopima.

Odsečeni delovi gorerazmatranog Ap-43 proteina se takođe mogu upotrebiti u imunogenim analozima na osnovu ovog pronalaska. Posebno su poželjni odsečci Ap (1-42), Ap (1-40), Ap (1-39), Ap (1-35), Ap (1-34), Ap (1-34), Ap (1-28), Ap (1-12), Ap (1-5), Ap (13-28), Ap (13-35), Ap (17-28), Ap (25-35), Ap (35-40), Ap (36-42) i Ap (35-42) (gde brojevi u zagradama označavaju amino kiselinske nizove Ap-43 koji grade određeni fragment - Ap (35-40) je npr. identičan amino kiselinama 706-711 u SEQ ID NO: 2). Sve ove varijante sa odsečenim delovima Ap-43 se mogu formirati sa Ap fragmentima koji su ovde opisani, posebno sa varijantama 9, 10, 11, 12 i 13.

U nekim slučajevima, poželjno je da su Ap-43 ili njegovi fragmenti mutirani. Posebno su poželjne supstitucione varijante gde je metionin na poziciji 35 u Ap-43 supstituisan, poželjno sa leucinom ili izoleucinom, ili jednostavno deletiran. Posebno poželjni anaiozi sadrže jedan metionin koji je lociran na C-terminusu, bilo zbog toga što se on prirodno javlja u amiloidogenom polipeptidu ili stranom THepitopu, ili zbog toga što je on inseriran ili adiran. Prema tome, takođe je poželjno da je deo analoga koji obuhvata strani THepitop bez metionina, sa izuzetkom moguće C-terminalne lokacije metionina.

Ustvari, generalno je poželjno da svi anaiozi APP ili AB koji su upotrebljeni prema ovom pronalasku imaju zajedničku osobinu da obuhvataju samo jedan metionin koji je postavljen kao C-terminalna amino kiselina u analogu i da su ostali metionini u bilo kom amiloidogenom polipeptidu ili stranom THepitopu deletirani ili supsituisani sa drugom amino kiselinom.

Jedna dodatna zanimljiva mutacija je delecija ili supstitucija fenilaianina na poziciji 19 u Ap-43, a posebno je poželjno da je mutacija supstitucija ovog fenilalaninskog ostatka sa prolinom.

Sledeća tabela dalje daje grupu posebno poželjnih konstrukata koji operišu sa odsečcima ili mutacijama Ap-43:

U ovoj tabeli, Ap segment upotrebljen u molekulu je naznačen amino kiselinskim brojevima u odnosu na aa 1 iz Ap (1-42/43) molekula, tj. 1-28 označava da je fragment 1-28 iz Ap (1-42/43) upotrebljen u molekulu. Ako su upotrebljena dva ili više različitih segmenata, oba su naznačena u tabeli, tj 1-12 (a) + 13-28 (b) označava da su oba fragmenta i 1-12 fragment i 13-28 fragment iz Ap (1-42/43) upotrebljeni u molekulu.

Takođe, ako je isti segment prisutan u više od jedne kopije u konstrukciji to je naznačeno u tabeli, tj. 1-12 (x 3) pokazuje da je fragment 1-12 iz Ap (1-42/43) prisutan u tri kopije u konstrukciji.

Dalje, pozicija AB fragmenta u molekulu je prikazana amino kiselinskim pozicijama u odnosu na prvu amino kiselinu molekula, tj. 22-49 pokazuje da je Ap fragment o kome se radi postavljen od amino kiseline 22 do amino kiseline 49 u molekulu, pri čemu su oba ta položaja obuhvaćena. Pozicije P2 i P30 epitopa su na isti način prikazane. Ako su u molekulu upotrebljena dva ili više fragmenata Ap, sve njihove pozicije su prikazane, tj. 1-12 (a) + 49-64 (b) označava da je fragment (a) postavljen od aa 1-12 u molekulu i fragment (b) od aa 49-64.

Dalje, ako je u molekulu prisutno više od jedne kopije istog fragmenta, pozicije za sve kopije su prikazane, tj. 1-12, 34-45, 61-72 pokazuje da su tri kopije Ap fragmenta postavljene od pozicija 1-12, 34-45 i 61-72, respektivno, u molekulu.

Konačno, oznake ukupne dužine za svaki molekul obuhvataju i Ap fragment (fragmente) i P2 i P30 epitope.

Varijanta 42 sadrži dve amino kiselinske supstitucije na pozicijama 19 (phe u pro) i 35 (met u lys) kao što je naznačeno u koloni koja prikazuje Ap fragmente.

Pogledati SI. 1 i gorenavedene tabele oko detalja o posebnim pitanjima oko uvođenja stranih T-ćelijskih epitopa.

Jedan dodatni tip konstrukta je posebno poželjan. S obzirom da je cilj ovog pronalaska da se izbegne razaranje ćelija koje proizvode APP pri čemu je uklanjanje Ap poželjno, čini se mogućim da se pripreme konstrukti autovakcine koji sadrže samo delove Ap koji nisu izloženi vanćelijskoj fazi kada se nalaze u APP. Prema tome, takvi konstrukti bi trebalo da sadrže najmanje jedan B-ćelijski epitop izveden od amino kiselinskog fragmenta koji je određen amino kiselinama 700-714 u SEQ ID NO: 2. S obzirom da je takav katak polipeptidni fragment predviđen da bude samo slabo imunogen poželjno je da se takav konstrukt autovakcine sastoji od nekoliko kopija B-ćelijskog epitopa, npr. u obliku konstrukta koji ima strukturu prikazanu u Formuli I u detaljnom prikazu ovog pronalaska, pogledati gore. U toj verziji Formule I, termini amiloidei-amiloidexsu x B-ćelijski epitop koji sadrži amino kiselinske sekvence izvedene od amino kiselina 700-714 iz SEQ ID NO: 2. Poželjna alternativa je gorenavedena mogućnost spajanja amiloidogenog (poli)peptida i izabranog stranog T-pomoćnog epitopa preko amidne veze za polisaharidni molekul nosač - na ovaj način višestruki prikazi "slabog" epitopa koji se sastoji od amino kiselina 700-714 iz SEQ ID NO: 2 postaju mogući, a takođe postaje moguće da se izabere optimalan odnos između B-ćelijskih i T-ćelijskih epitopa.

PRIMER 2

Imunizacija transgenih miševa sa Af3 i modifikovanim proteinima na osnovu

pronalaska

Konstrukcija DNK koja kodira hAB43+-34. hAB43+-34 gen je konstruisan u nekoliko koraka. Prvo je formiran PCR fragment sa prajmerima ME#801 (SEQ ID NO: 10) i ME#802 (SEQ D NO: 11) korišćenjem prajmera ME#800 (SEQ OD NO: 9) kao šablona. ME#800 kodira humani abeta-43 fragment sa £.colioptimizovanim kodonima. ME#801 i ME#802 dodaju fragmentu odgovarajuća restrikciona mesta.

PCR fragment je prečišćen, razložen saNco\iHind\\\,ponovo prečišćen i kloniran u pET28b+E. coliekspresioni vektor koji je razložen i prečišćen sa A/col-Hind\\\.Dobijeni plazmid koji kodira divlji tip humanog Ap-43 je označen kao pAB1.

U sledećem koraku T-pomoćni epitop, P2, je dodat C-terminusu molekula. Prajmer ME#806 (SEQ ID NO: 12) sadrži sekvencu koja kodira P2 epitop i tako stvara fuziju P2 i Abeta-43 PCR-reakcijom.

Kloniranje je izvedeno stvaranjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#178 (SEQ ID NO: 8) i ME#806 korišćenjem pAB1 kao šablona. Fragment je prečišćen, razložen saNco\iHind\\\,ponovo prečišćen i kloniran u pET28b+ vektor koji je razložen i prečišćen saNco\- Hind\\\.Dobijeni plazmid je označen kao pAB2.

Na analogan način je pripremljen drugi plazmid koji sadrži sekvence koja kodira Ap-43 sa drugim T pomoćnim epitopom, P30, koji je dodat N-terminusu. Ovo je ostvareno stvaranjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#105 (SEQ ID NO: 7) i ME#807 (SEQ ID NO: 13) korišćenjem pAB1 kao šablona.

Fragment je prečišćen, razložen sa A/col iHind\\\,ponovo prečišćen i kloniran u pET28b+ vektor koji je razložen i prečišćen saNco\- Hind\\\.Dobijeni plazmid je označen kao pAB3.

U trećem koraku, drugi Ap-43 ponovak je C-terminalno dodfat P2 epitopu plazmida pAB2 pomoću prajmera ME#809 (SEQ ID NO: 14). ME#809 istovremeno stvara BamH\ mesto neposredno iza Ap-43 ponovka. PCR fragment je formiran sa prajmerima ME#178 i ME#809 korišćenjem pAB2 kao šablona. Fragment je razložen sa A/col iHind\\\,prečišćen i kloniran u pET28b+ vektor koji je razložen i prečišćen sa/vcol-H/nđlll.Ovaj plazmid je označen kao pAB4.

Konačno, P30 epitop - Ap-43 ponavljajuća sekvenca iz pAB3 je klonirana u pAB4 plazmid. Ovo je ostvareno stvaranjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#811 (SEQ ID NO: 16) i ME#105 korišćenjem pAB3 kao šablona. Fragment je prečišćen i upotrebljen kao prajmer u naknadnom PCR-u sa ME#810 (SEQ ID NO: 15) korišćenjem pAB3 kao šablona. Dobijeni fragment je prečišćen, razložen sa BamH\ iHind\\\i kloniran u pAB4 plazmid koji je razložen i prečišćen saBamH\- Hind\\\.Dobijeni plazmid, pAB5, kodira hAB43+-34molekul.

Svi postupci PCR-a i kloniranja su u suštini obavljeni kao što je opisano u Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. 1989 "Molecular cloning: a laboratorv manual". 2<nd>. Ed. Cold spring Harbor Laboratorv, N.Y.

Za sve postupke kloniranja upotrebljene suE. coliK-12 ćelije, soj Top-10 F'

(Stratagene, USA). PAT28b+ vektor se prodaje u Novagen, USA. Svi prajmeri su sintetisani u DNK Technologv, Denmark.

Ekspresija i prečišćavanje hAB43+-34. hAB43+-34 protein koji kodira pAB5 je eksprimiran u BL21-Gold (Novagen)E. colićelijama kao što su opisali dobavljači pET28b+ sistema (Novagen).

Eksprimiran hAB43+-34 protein je prečišćen do više od 85% čistoće ispiranjem inkluzionih tela, a zatim katjon-izmenjivačkom hromatografijom korišćenjem BioCad radne stanice za prečišćavanje (PerSeptive Biosvstems, USA) u prisustvu 6 M uree. Urea je zatim uklonjena postupnom dijalizom u rastvoru u kome se količina uree smanjuje. Krajnji pufer je bio 10 mM Tris, pH 8.5.

Imunizaciona studija. Za studiju su upotrebljeni miševi koji su transgeni za humani APP (Alchajmerov prekursorski protein). Ovi miševi, nazvanii TgRND8+, eksprimiraju mutirani oblik APP koji ima za rezultat visoku koncentraciju Ap-40 i Ap-42 u mozgovima miševa (Janus, C.er al.).

Miševi (8-10 miševa po grupi) su imunizovani sa ili Abeta-42 (SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714, sintetisan pomoću standardne Fmoc strategije) ili hAB43+-34varijante (konstrukt 34 u tabeli u Primeru 1, proizveden rekombinantno) četiri puta u intervalima od dve nedelje. Doze su bile ili 100 mg za AB ili 50 mg za hAB43+-34. Miševima je uzimana krv na dan 43 (posle tri injekcije) i posle dana 52 (posle četiri injekcije) i serumi su upotrebljeni za određivanje nivoa anti-Ap-42 specifičnih titara korišćenjem direktne Ap-42 ELISA.

Sledeća tabela pokazuje prosečne relativne anti-Abeta-42 titre.

Kao što će postati jasno, titri antitela koji su dobijeni kada se vrši imunizacija sa hAB43+-34 Ap varijantom su približno 4 puta i 7.5 puta viši posle 3 i 4 imunizacije, respektivno, nego što su titri dobijeni kada se koristi nepromenjen divlji tip Ap-42 kao imunogen. Ova činjenica je dalje razmatrana, kada se uzme u obzir činjenica da je količina varijante koja je upotrebljena za imunizaciju bila samo 50% količine sekvence divljeg tipa koja je upotrebljena za imunizaciju.

PRIMER 3

Sinteza Ap peptidne kopolimerne vakcine korišćenjem aktiviranog poli-

hidroksipolimera kao unakrsno- vezujućeg agensa.

Uvođenje.Tradicionalna vakcina konjugat se sastoji od (poli)peptida koji je kovalentno vezan za protein nosač. Peptid sadrži B-ćelijski epitop (epitope) i protein nosač koji daje T-ćelijske epitope. Međutim, većina proteinskog nosača će normalno biti nevažna kao izvor za T-ćelijske epitope, s obzirom da manji deo ukupne sekvence sadrži relevantne T-pomoćne epitope. Takvi epitopi se mogu definisati i sintetisati kao peptidi npr. 12-15 amino kiselina. Ako su ovi peptidi kovalentno vezani za peptide koji sadrže B-ćelijske epitope, npr. preko multivalentnog aktiviranog poli-hidroksipolimera, može se dobiti molekul vakcine koji sadrži samo relevantne delove. Dalje je moguće dobiti konjugat vakcine koji sadrži optimizovani odnos između B-ćelijskih i T-ćelijskih epitopa.

Sinteza aktiviranog poli-hidroksipolimera.Poli-hidroksipolimeri kao što su dekstran, škrob, agaroza, itd. se mogu aktivirati sa 2,2,2-trifluoroetansulfonilhlorid (trezilhlorid), bilo pomoću homogene sinteze (dekstran) rastvorene u N-metilpirolidinon (NMP) ili pomoću heterogene sinteze (skob, agaroza, unakrsno-vezani dekstran) u npr. acetonu.

225 ml suvog N-metilpirolidinona (NMP) je dodato pod suvim uslovima u dekstran koji je sušen zamrzavanjem i koji je rastvorljiv u vodi (4.5 g, 83 mmol, klinički stepen, Mw (avg) 78000) u posudu sa okruglim dnom od 500 ml koja je snabdevena magnetnom mešalicom. Posuda je postavljena u uljano kupatilo na 60°C uz magnetno mešanje. Temperatura je povišena do 92°C u toku 20 minuta. Kada je dekstran rastvoren posuda je odmah uklonjena iz uljanog kupatila i temperatura u kupatilu je snižena do 40°C. Posuda je postavljena u uljano kupatilo i dalje uz magnetno mešanje, a trezilhlorid (2.764 ml, 25 mmol) je u kapima dodavan. Posle 15 minuta, u kapima je dodavan suvi piridin (anhidrovan, 2.020 ml, 25 mmol). Posuda je uklonjena iz uljanog kupatila i mešana 1 čas na sobnoj temperaturi. Proizvod (Dekstran aktiviran trezilom, TAD) je istaložen u 1200 ml hladnog etanola (99.9%). Supernatant je dekantovan i precipitat je sakupljen u 50 ml polipropilenske epruvete u centrifugi na 2000 rpm. Talog je rastvoren u 50 ml 0.5% sirćetne kiseline, dijaliziran 2 puta sa 5000 ml 0.5% sirćetne kiseline i osušen zamrzavanjem. TAD se može čuvati kao prašak osušen zamrzavanjem na -20°C.

Nerastvorljiv poli-hidroksipolimer, kao što je agaroza ili unakrsno vezani dekstran može biti aktiviran trezilom stvaranjem suspenzije poli-hidroksipolimera u npr. acetonu i izvođenjem sinteze kao sinteze čvrste faze. Aktivirani poli-hidroksipolimer se može sakupiti filtracijom. Pogodni postupci su objavljeni u npr. Nilsson K and Mosback K (1987), Methods in Enzymology 135, p. 67, i u Hermansson GTer al.(1992), u "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, Inc., p. 87.

Sinteza A Beta Peptidnih kopolimernih vakcina.TAD (10 mg) je rastvoren u 100 ul H20 i 1000 ul karbonatnog pufera, pH 9.6, koji sadrži 5 mg Ap-42 (SEQ ID

NO: 2, ostaci 673-714) i dodato mu je 2.5 mg P2 (SEQ ID NO: 4) i 2.5 mg P30 (SEQ ID NO: 6). Ap-42 i P2 i P30 peptidi sadrže zaštićene grupe lizina: one su u obliku grupa lizina koje su zaštićene sa 1-(4,4-di-metil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)etilom (Dde). Peptidi su pripremljeni pomoću standardne Fmoc tehnologije, gde je konvencionalni Fmoc-Lys(Boc)-OH supstituisan sa Fmoc-Lys(Dde)-OH (dobijen iz Novabiochem, kataloški broj 04-12-1121), tj. e-amino grupa u lizinu je zaštićena sa Dde umesto Boe.

PH vrednost je merena i podešena do 9.6 korišćenjem 1 M HCI. Posle 2.5 časa na sobnoj temperaturi, krajnjoj koncentraciji hidrazina od 8% je dodat hidrazin iz 80% rastvora i rastvor je inkubiran još 30 minuta na sobnoj temperaturi i odmah iza toga je izvršeno sušenje zamrzavanjem. Proizvod koji je osušen zamrzavanjem je rastvoren u H20 i ekstenzivno dijaliziran sa H20 pre krajnjeg sušenja zamrzavanjem.

Odnos između B-ćelijskih epitopa (Ap) i T-pomoćnih epitopa (P2 i P30) u krajnjem proizvodu se može menjati korišćenjem različitih koncentracija ovih peptida u koraku sinteze. Dalje, krajnji proizvod se može obeležiti sa npr. manozom (tako da se ciljano usmeri konjugat ka APC) dodavanjem aminovane manoze u karbonatni pufer u koraku sinteze.

Ako je nerastvorljivi aktivirani poli-hidroksipolimer upotrebljen za spajanje peptida koji sadrže B-ćelijski epitop i T-pomoćne epitope, spajanje za polimer se može izvesti kao snteza čvrste faze i krajnji proizvod je sakupljen i prečišćen ispiranjem i fiitracijom.

Kao što je pomenuto u opštem opisu, ovde opisan pristup za pripremanje vakcine bazirane na peptidu se može primeniti na bilo koji drugi polipeptidni antigen gd bi bilo pogodno da se pripremi čisto sintetička peptidna vakcina i gde polipeptidni antigen o kome se radi obezbeđuje dovoljnu imunogenost u jednom peptidu:

PRIMER 4

Sinteza peptidnih kopolimernih vakcina

TAD (10 mg) je rastvoren u 100 ul H20 i 1000\ i\karbonatnog pufera, pH 9.6, koji sadrži 1-5 mg peptida A (bilo koji imunogeni peptid od interesa) i dodato mu je 1-5 mg P2 (P2 epitop toksoida difterije) i 1-5 mg P30 (P30 epitop toksoida difterije). pH vrednost je merena i podešena do 9.6 korišćenjem 0.1 M HCI. Posle 2.5 časa na sobnoj temperaturi rastvor je odmah osušen zamrzavanjem. Proizvod koji je osušen zamrzavanjem je rastvoren u H20 i ekstenzivno dijaliziran sa H2O ili je so odstranjena na gel filtracionoj koloni pre krajnjeg sušenja zamrzavanjem. U slučaju da peptidi imaju lizin u sekvenci e-amin u bočnom lancu lizna bi trebalo da se zaštiti sa Dde korišćenjem Fmoc-Lys(Dde)-OH derivata u sintezi (Gregorius and Theisen 2001, podneto). Posle spajanja, hidrazin iz 80% rastvora je dodat u krajnju koncentraciju hidrazina između 1-20% i rastvor je inkubiran još 30 minuta na sobnoj temperaturi, odmah posle toga je sušen zamrzavanjem i ekstenzivno dijaliziran sa H20 ili je so odstranjena na gel filtracionoj koloni pre krajnjeg sušenja zamrzavanjem. Princip je dat u šematskom obliku na SI. 2.

Takve imunogene su koristili pronalazači sa C-terminalnim fragmentom proteina izBorrelia burgdorferiOspC kao "peptid A" i epitop toksoida difterije (P2 ili P30) kao peptid B. Rezultati imunizacionih studija sa ovim imunogenom su otkrili da su samo imunogen pronalaska uključujući OspC fragment i strani epitop difterije koji se podudaraju sa MHC haplotipom vakcinisanih miševa bili sposobni da indukuju antitela koja mogu da reaguju sa OspC u ovim miševima. Nasuprot tome, molekul koji sadrži samo OspC peptid je bio nesposoban da indukuje proizvodnju antitela što isto važi i za smešu 2 imunogena gde jedan od njih sadrži OspC, a drugi sadrži epitop. Prema tome se može zaključiti da je uključenje u isti polihidroksipolimerni nosač superiorno, ako ne i neophodno, da bi se indukovala proizvodnja antitela protiv kratkog peptidnog haptena kao OspC.

SEKVENCE - TERMINI

Novel Method For Dovvn-Regulation of Amvloid - Novi postupak za nishodnu regulaciju amiloida

Mise feature - različite karakterisitike

Nucleotides eneoding transmembrane region - nukleotidi koji kodiraju transmembranski region

Nucleotides eneoding C-100 - nukleotidi koji kodiraju C-100

DNA eneoding P2 epitope - DNK koja kodira P2 epitop

DNA eneoding P30 epitope - DNK koja kodira P30 epitop

Svnthetic PCR primer - sintetički PCR prajmer

Svnthetic HLA DR binding seguence - Sintetička sekvenca koja vezuje HLA DR

Claims

1. Imunogen koji je: a) poliamino kiselina dužine 72 amino kiseline, koja se sastoji od AS (1-12) fragmenta, zatim slede amino kiselinski ostaci P30 epitopa tetanus toksoida SEQ ID No.6, zatim sledi Ap (1-12) fragment, zatim aminokiselinski ostaci P2 epitopa tetanus toksoida SEQ ID No. 4, pa zatim fragment Ap (1-12), gde je AB (1-12) fragment označen aminokiselinskim brojevima u odnosu na amino kiselinu 1 iz AB-43 fragmenta datog aminokiselinskim ostacima 672-714 SEQ ID No.2 ; b) konjugat koji sadrži polihidroksipolimernu osnovu za koju je posebno spojena poliamino kiselina kao što je definisano u a) ili c) nukleinska kiselina koja kodira poliamino kiselinu kao što je definisano u a) ili d) nepatogeni mikroorganizam ili virus koji nosi fragment nulekinske kiseline koji kodira i eksprimira poliamino kiselinu kao što je definisano u a); za upotrebu kao lek za lečenje, prevenciju ili poboljšanje Alzheimerove bolesti kod životinja ili drugih bolesti okarakterisanih taloženjem amiloida.

2. Imunogen prema zahtevu 1, naznačen time, što lečenje, prevencija ili poboljšanje označava administraciju efikasne količine poliamino kiseline životinji na način odabran od parenteralnog kao što su intrakutani, subkutani i intramusklurani načini; peritonealni; oralni; bukalni; sublingvalni; epiduralni; spinalni; analni; i intrakranijalni način.

3. Imunogen prema zahtevu 2, naznačen time, što je efikasna količina između 0.5ug i 2000 ug poliamino kiseline.

4. Imunogen prema jednom od zahteva 1-3 varijanta c), naznačen time, što lečenje, prevencija ili poboljšanje označava uvođenje nukelinske kiseline (nukleinskih kiselina) koje kodiraju poliamino kiselina u životinjske ćelije i obavljajući takoin vivoćelijsku ekspresiju uvedene nukleinske kiseline (nukleinskih kiselina).

5. Imunogen prema zahtevu 4, naznačen time, što je uvedena nukleinska kiselina (kiseline) odabrana od ogoljene DNK, DNK formulisane sa naelektrisanim ili nenaelektrisanim lipidima, DNK formulisane u lipozomima, DNK uključene u virusni vektor, DNK formulisane sa proteinom ili polipeptidom koji olakšava transinfekciju, DNK formulisane sa ciljanim proteinom ili polipeptidom, DNK formulisane sa agensima za taloženje kalcijuma, DNK spojene za inertni molekui nosač, DNK inkapsulirane u hitin ili hitosan i DNK formulisane sa adjuvansom

6. Imunogen prema jednom od zahteva 2-5, naznačen time, što lečenje, prevencija ili poboljšanje označava najmanje jednu primenu/uvođenje godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 6 i najmanje 12 primena/uvođenja.

7. Imunogen prema jednom od prethodnih zahteva, naznačen time, što lečenje, prevencija ili poboljšanje označava nishodnu regulaciju APP ili Ap do te mere da je ukupna količina amiloida smanjena ili da je kliničkim značajno smanjena brzina formiranja amiloida.

8. Imunogena kompozicija koja sadrži imunogeno efikasnu količinu poliamino kiseline prema zahtevu 1, naznačena time, što kompozicija dodatno sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili vehikulum i po i zboru adjuvans

9. Fragment nukleinske kiseline koji kodira poliamino kiselinu prema zahtevu 1.

10. Vektor koji nosi fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 9, naznačen time, što je vektor koji je sposoban za autonomnu replikaciju.

11. Vektor prema zahtevu 10 koji je odabran iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, kozmida, minihromozoma i virusa

12. Vektor prema jednom od zahteva 10-11 koji, kada se uvede u ćeliju domaćina, je sposoban ili nije sposoban da se integriše u genom ćelije domaćina.

13. Izolovana transformisana ćelija koja nosi vektor jednom od zahteva 10-12, kao što je izolovana transformisana ćelija koja je sposobna da replicira nukleinsko kiselinski fragment prema zahtevu 9.

14 Izolovana transformisana ćelija prema zahtevu 13, koja je mikroorganizam izabran od bakterije, kvasca, protozoe, ili ćelija izvedena od višećelijskog organizma odabran od gljivice, ćelije insekata kao što je S2ili SF ćelija, biljne ćelije i ćelije sisara.

15. Izolovana transformisana ćelija prema zahtevu 13 ili 14, koja eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 9, kao što je izlovana transformisana ćelija, koja luči ili nosi na svojoj površini, poliamino kiselinu prema zahtevu 1.

16. Imunogen prema zahtevu 1, varijanta d), naznačen time, što što lečenje, prevencija ili poboljšanje označava jadministraciju ne-patogenog mikroorganizma ili virusa koji nosi fragment nukleinske kiseline koji kodira i eksprimira poliamino kiselinu.

17. Kompozicija za podsticanje proizvodnje antitela protiv amiloida, naznačena time, što kompozicija sadrži - fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 9 ili vektor prema jednom od zahteva 10-12, i - farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili vehikulum i/ili adjuvans.

18. Stabilna ćelijska linija koja nosi vektor prema jednom od zahteva 10-12 i koja eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 9 i koja po izboru izlučuje ili na svojoj površini nosi poliamino kiselinu prema zahtevu 1.