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CN117700525B - 一种多肽改造体及其应用 - Google Patents

一种多肽改造体及其应用 Download PDF

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CN117700525B CN202410160373.9A CN202410160373A CN117700525B CN 117700525 B CN117700525 B CN 117700525B CN 202410160373 A CN202410160373 A CN 202410160373A CN 117700525 B CN117700525 B CN 117700525B
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Abstract

本发明属于检测试剂技术领域，涉及一种多肽改造体及其应用。β淀粉样蛋白多肽改造体包括肽段一、肽段二、位于肽段一和肽段二之间的肽段三，肽段一中含有如SEQ ID NO:9所示的序列，肽段二中含有如SEQ ID NO:18所示的序列，肽段三由非疏水性氨基酸组成，所述肽段一和肽段三之间、肽段二和肽段三之间均添加连接化合物。与原始多肽相比，本发明的多肽改造体的合成难度及成本降低，稳定性提升。与抗体的反应活性上，改造体与原始多肽一致，是更加优异的诊断试剂校准品原材料形式，有助于检测试剂盒的开发及广泛应用。

Description

一种多肽改造体及其应用
技术领域
本发明属于检测试剂技术领域，涉及一种多肽改造体及其应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆症的最主要的发病形式，是一种常见的神经退行性疾病。随着人口老龄化的加剧和寿命的延长，AD逐渐成为继癌症、心脏病和糖尿病后严重威胁人类健康的疾病之一，持续发展将引起严重的社会问题。近年来，淀粉样蛋白级联假说受到越来越多学者的认可，该假说认为脑内过量产生的β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)是引发AD的主要原因。Aβ是由β分泌酶和γ分泌酶剪切淀粉样前体蛋白APP形成，含有39-42个氨基酸残基，具有高度疏水性和自聚集能力。研究认为，Aβ1-40（Aβ40）在AD患者大脑内具有高含量，而Aβ1-42（Aβ42）聚集体具有高毒性。此外，当AD患者表现出临床症状前，血液中已经可检测Aβ40或Aβ42/Aβ40等标志物含量的变化。作为一种连续进展的疾病，更好的治疗效果依赖于更早期的诊断，靶向Aβ的早期诊断以及设计开发具有对AD的治疗有着重要的意义。
Aβ42、Aβ42/Aβ40标志物的检测试剂的开发，除了面临着高亲和力、高特异性抗体制备的难度，由于Aβ1-40或Aβ1-42校准品多肽具有高度疏水性和自聚集能力，校准品存在着稳定性问题。因此对于校准品多肽的氨基酸序列进行设计和改造，调整氨基酸序列在不影响与抗体反应活性的前提下，同时提高其稳定性，有助于检测试剂的更广泛应用。
发明内容
为优化β淀粉样蛋白如Aβ1-40、Aβ1-42校准品多肽稳定性，本发明提供了校准品多肽改造体，所得的改造体可长时间保持稳定，并且与抗体的反应活性与原始多肽一致，因此可用于制备AD诊断试剂校准品或AD诊断试剂盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了β淀粉样蛋白多肽改造体，多肽改造体包括肽段一、肽段二、位于肽段一和肽段二之间的肽段三，肽段一中含有DAEFR（SEQ ID NO:9），肽段二中含有VGGVV（SEQ ID NO:18），肽段三由非疏水性氨基酸组成，所述肽段一和肽段三之间、肽段二和肽段三之间均添加连接化合物。
在进一步的方案中，所述β淀粉样蛋白多肽改造体中的氨基酸均为D型氨基酸。
在进一步的方案中，上述β淀粉样蛋白多肽改造体中，肽段一的氨基酸序列可为DAEFR（SEQ ID NO:9）或DAEFRH（SEQ ID NO:10），肽段二的氨基酸序列可为VGGVVIA（SEQ IDNO:11）、MVGGVVIA（SEQ ID NO:12）、GLMVGGVV（SEQ ID NO:13）或IGLMVGGVV（SEQ ID NO:14），肽段三中含有D和E，肽段三的氨基酸序列具体可为DEDEDEDEDEDE（SEQ ID NO:15）或DDDEDDDEDDDE（SEQ ID NO:16），非疏水的连接化合物可为(PEG4)3、(CH2)6或GGGS（SEQ IDNO:17）。
在进一步的方案中，所述多肽改造体的氨基酸残基数小于β淀粉样蛋白多肽原始序列的氨基酸残基数。所述多肽改造体的结构为直链。
本发明又提供了Aβ1-42多肽改造体。Aβ1-42多肽改造体包括Aβ42-V1、Aβ42-V2和Aβ42-V3。所述Aβ42多肽改造体Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3由氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA（SEQ ID NO:1所示）的Aβ42原始多肽改造而成。
进一步地，Aβ42多肽改造体Aβ42-V1的氨基酸序列为DAEFR-(PEG4)3-DEDEDEDEDEDE-(PEG4)3-VGGVVIA（SEQ ID NO:3所示），氨基酸分子量为2832。
进一步地，Aβ42多肽改造体Aβ42-V2的氨基酸序列为DAEFRH-(CH2)6-DDDEDDDEDDDE-(CH2)6-MVGGVVIA（SEQ ID NO:4所示），氨基酸分子量为3117。
进一步地，Aβ42多肽改造体Aβ42-V3的氨基酸序列为DAEFRH-GGGS-DEDEDEDEDEDE-GGGS-MVGGVVIA（SEQ ID NO:5所示），氨基酸分子量为3705。
进一步地，所述Aβ42多肽改造体Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3的制备方法，包括以下步骤：根据上述Aβ42多肽改造体的氨基酸序列，采用多肽固相合成法进行化学合成，得到全序列。再用HPLC反相柱层析脱盐，得到所述的Aβ42多肽改造体。
本发明又提供了Aβ1-40多肽改造体。Aβ1-40多肽改造体包括Aβ40-V1、Aβ40-V2和Aβ40-V3。所述Aβ40多肽改造体Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3由氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV（SEQ ID NO:2所示）的Aβ40原始多肽改造而成。
进一步地，Aβ40多肽改造体Aβ40-V1的氨基酸序列为DAEFR-(PEG4)3-DEDEDEDEDEDE-(PEG4)3-GLMVGGVV（SEQ ID NO:6所示），氨基酸分子量为3001。
进一步地，Aβ40多肽改造体Aβ40-V2的氨基酸序列为DAEFRH-(CH2)6-DDDEDDDEDDDE-(CH2)6-IGLMVGGVV（SEQ ID NO:7所示），氨基酸分子量为3222。
进一步地，Aβ40多肽改造体Aβ40-V3的氨基酸序列为DAEFRH-GGGS-DEDEDEDEDEDE-GGGS-IGLMVGGVV（SEQ ID NO:8所示），氨基酸分子量为3810。
进一步地，所述Aβ40多肽改造体Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3的制备方法，包括以下步骤：根据上述Aβ40多肽改造体的氨基酸序列，采用多肽固相合成法进行化学合成，得到全序列。再用HPLC反相柱层析脱盐，得到所述的Aβ40多肽改造体。
另外，本发明还提供了将上述β淀粉样蛋白多肽改造体用于制备阿尔兹海默症诊断试剂校准品，在具体应用时，阿尔兹海默症诊断试剂校准品可只有Aβ42多肽改造体或只有Aβ40多肽改造体，或者阿尔兹海默症诊断试剂校准品既包括Aβ42多肽改造体又包括Aβ40多肽改造体。在使用Aβ42多肽改造体作为阿尔兹海默症诊断试剂校准品时，可以使用Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3中的至少一种，在使用Aβ40多肽改造体作为阿尔兹海默症诊断试剂校准品时，可以使用Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3中的至少一种。
本发明的有益效果：
本发明在β淀粉样蛋白多肽如Aβ1-42、Aβ1-40原始多肽序列的基础上，为获得合成难度及成本更低，稳定性更好的多肽改造体，对原始氨基酸序列进行了改造。改造手段包括氨基酸替换、亲水聚合物添加等，并得到多个多肽改造体。与原始多肽相比，改造体的合成难度及成本降低，稳定性提升。除此之外，与抗体的反应活性上，改造体与原始多肽一致，是更加优异的诊断试剂校准品原材料形式，有助于检测试剂盒的开发及广泛应用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为Aβ42-原始作为校准品的校准曲线。
图2为Aβ42-V1作为校准品的校准曲线。
图3为Aβ42-V2作为校准品的校准曲线。
图4为Aβ42-V3作为校准品的校准曲线。
图5为Aβ40-原始作为校准品的校准曲线。
图6为Aβ40-V1作为校准品的校准曲线。
图7为Aβ40-V2作为校准品的校准曲线。
图8为Aβ40-V3作为校准品的校准曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例中所用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞购自购自北京北纳创联生物技术研究院，BALB/c 小鼠购自苏州恒新晨生物医药有限公司。
实施例1 Aβ42多肽改造体的制备
人β淀粉样蛋白Aβ42多肽含有42个氨基酸残基，原始氨基酸全序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。
根据Aβ42多肽的原始氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了Aβ42多肽的三种改造体，其中改造体Aβ42-V1的氨基酸序列为DAEFR-(PEG4)3-DEDEDEDEDEDE-(PEG4)3-VG
GVVIA，含有24个氨基酸残基；改造体Aβ42-V2的氨基酸序列为DAEFRH-(CH2)6-DDDE
DDDEDDDE-(CH2)6-MVGGVVIA，含有26个氨基酸残基；改造体Aβ42-V3的氨基酸序列为DAEFRH-GGGS-DEDEDEDEDEDE-GGGS-MVGGVVIA，含有34个氨基酸残基。所有氨基酸均为D型氨基酸。
上述3种Aβ42多肽改造体的制备具体为：
（1）根据上述Aβ42多肽改造体的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐；
（2）然后采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对（1）中得到的多肽进行分子量测定；
（3）接着用高效液相层析HPLC方法对（1）中纯化的多肽进行纯度鉴定。
测定结果为：
Aβ42多肽改造体Aβ42-V1氨基酸分子量2832，为直链小肽，纯度＞98%；
Aβ42多肽改造体Aβ42-V2氨基酸分子量3117，为直链小肽，纯度＞98%；
Aβ42多肽改造体Aβ42-V3氨基酸分子量3705，为直链小肽，纯度＞98%。
实施例2 Aβ40多肽改造体的制备
人β淀粉样蛋白Aβ40多肽含有40个氨基酸残基，原始氨基酸全序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV。
根据Aβ40多肽的原始氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了Aβ40多肽的三种改造体，其中改造体Aβ40-V1的氨基酸序列为DAEFR-(PEG4)3-DEDEDEDEDEDE-(PEG4)3-GL
MVGGVV，含有25个氨基酸残基；改造体Aβ40-V2的氨基酸序列为DAEFRH-(CH2)6-DD
DEDDDEDDDE-(CH2)6-IGLMVGGVV，含有27个氨基酸残基；改造体Aβ40-V3的氨基酸序列为DAEFRH-GGGS-DEDEDEDEDEDE-GGGS-IGLMVGGVV，含有35个氨基酸残基。所有氨基酸均为D型氨基酸。
上述3种Aβ40多肽改造体的制备具体为：
（1）根据上述Aβ40多肽改造体的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐；
（2）然后采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对（1）中得到的多肽进行分子量测定；
（3）接着用高效液相层析HPLC方法对（1）中得到的纯化的多肽进行纯度鉴定。
测定结果为：
Aβ40多肽改造体Aβ40-V1氨基酸分子量3001，为直链小肽，纯度＞98%；
Aβ40多肽改造体Aβ40-V2氨基酸分子量3222，为直链小肽，纯度＞98%；
Aβ40多肽改造体Aβ40-V3氨基酸分子量3810，为直链小肽，纯度＞98%。
实施例3 Aβ42多肽改造体与抗体反应活性验证
用Aβ（37-42）合成多肽（序列为：GGVVIA）和Aβ（1-5）合成多肽（序列为：DAEFR）分别免疫3批BALB/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50µg抗原，共免疫3次。加强免疫后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，对阳性杂交瘤细胞株进行3次亚克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞2株，杂交瘤细胞株A特异性识别多肽Aβ（1-5）序列（作为Aβ40和Aβ42检测抗体），杂交瘤细胞株B特异性识别多肽Aβ（37-42）序列（作为Aβ42捕获抗体）。10-12周BALB/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约1×106~2×106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。应用Protein G对2种小鼠腹水进行纯化，并将纯化后抗体进行SDS-PAGE水平纯度验证。结果显示2种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90%。对两种抗体效价验证表明，两种抗体效价均为1：128000。
采用ELISA法进行反应活性测定。具体的，分别以0.1μg/mL的Aβ42原始多肽（Aβ42-原始）、改造体Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100μL体积4℃过夜包被微孔板，2倍梯度稀释上述自制的Aβ42捕获抗体和Aβ42检测抗体后分别加入微孔板，37℃反应1小时。洗板后加入羊抗鼠IgG-HRP（50ng/mL）。反应1小时后洗板3次，显色读值。从表1的结果可以看出，在与Aβ42捕获抗体或检测抗体的反应中，改造体Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3与原始Aβ42多肽的活性一致。
表1 Aβ42多肽改造体与Aβ42捕获抗体或Aβ42检测抗体的反应活性
实施例4 Aβ40多肽改造体与抗体反应活性验证
用Aβ（35-40）合成多肽（序列为：MVGGVV）免疫3批BALB/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50µg抗原，共免疫3次。加强免疫后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，对阳性杂交瘤细胞株进行3次亚克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株C，特异性识别Aβ（35-40）序列（作为Aβ40捕获抗体）。10-12周BALB/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约1×106~2×106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。应用Protein G对小鼠腹水进行纯化，并将纯化后抗体进行SDS-PAGE水平纯度验证。结果显示抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90%。对抗体效价验证表明，两种抗体效价均为1：128000。
采用ELISA法进行反应活性测定。具体的，分别以0.1μg/mL的Aβ40原始多肽（Aβ40-原始）、改造体Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100μL体积4℃过夜包被微孔板，2倍梯度稀释上述自制的Aβ40捕获抗体和Aβ40检测抗体后分别加入微孔板37℃反应1小时。洗板后加入羊抗鼠IgG-HRP（50ng/mL），反应1小时后洗板3次，显色读值。从表2的结果可以看出，在与Aβ40捕获抗体和检测抗体的反应上，改造体Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3与原始Aβ40多肽的活性一致。
表2 Aβ40多肽改造体与Aβ40捕获抗体或Aβ40检测抗体的反应活性
实施例5 多肽改造体作为校准品样本检测验证
Aβ42检测体系：方法学模式为双抗夹心法，检测仪器为科斯迈磁微粒化学发光仪。具体为：向仪器中依次加入50μL的生物素标记的Aβ42捕获抗体、50μL样品（不同浓度的校准品或被测样本）、50μL的Aβ42检测抗体，反应20min后洗涤3次，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入100μL化学发光预激发液、100μL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度。根据校准品的浓度和发光强度（如表3所示）绘制校准曲线。并根据校准曲线、被测样本的发光强度计算出被测样品的Aβ42含量。校准曲线线性范围1~1024pg/mL，附图1-4分别为Aβ42-原始、Aβ42-V1、Aβ42-V2、Aβ42-V3作为校准品的校准曲线，其中，Y轴代表发光值对数值，X轴代表Aβ42校准品浓度的对数值。
表3
Aβ40检测体系：方法学模式为双抗夹心法。具体为：向仪器中依次加入50μL 的生物素标记的Aβ40捕获抗体、50μL样品（不同浓度的校准品或被测样本）、50μL的Aβ40检测抗体，反应20min后洗涤3次，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入100μL化学发光预激发液、100μL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光值。根据校准品的浓度对数值和发光值对数值（如表4所示）绘制校准曲线。并根据校准曲线、被测样本的发光强度值计算出被测样品的Aβ40含量。校准曲线线性范围10~2430pg/mL，附图5-8分别为Aβ40-原始、Aβ40-V1、Aβ40-V2、Aβ40-V3作为校准品的校准曲线，其中，Y轴代表发光值对数值，X轴代表Aβ40校准品浓度的对数值。
表4
样本检测验证：收集确诊的阿尔兹海默症（AD）样本50例、认知功能障碍（MCI）样本50例、认知正常样本（CU）50例及其他痴呆样本（non-AD）50例，使用不同形式的多肽做为校准品，评价样本检测结果的一致性。结果表明，多肽改造体作为校准品与原始多肽相比，在样本检测性能上具有高度一致性，如表5和表6所示。
表5
表6
实施例6 Aβ42多肽改造体作为校准品稳定性验证
将Aβ42原始多肽及多肽改造体校准品在2~8℃条件下存储14个月，考察14个月内的质量变化情况。分别在0、1、3、6、10、14个月检测校准品，考察各个浓度点与对照（0月）相比发光值变化情况，若相对偏差＜15%，则判定稳定性合格。从表7的结果可以看出，Aβ42原始多肽在第1个月已经开始出现不稳定，与对照发光值偏差在-18.1~-15.8%。从表8、表9和表10可以看出，三种Aβ42多肽改造体稳定性合格，保存14个月后Aβ42-V1与对照发光值偏差在-0.3~0.9%，小于15%；保存14个月后Aβ42-V2与对照发光强度值偏差在-1.0~0.8%，小于15%；保存14个月后Aβ42-V3与对照发光值偏差在-0.8~0.5%，小于15%。
表7
表8
表9
表10
实施例7 Aβ40多肽改造体作为校准品稳定性验证
将Aβ40原始多肽及多肽改造体校准品在2~8℃条件下存储14个月，考察14个月内的质量变化情况。分别在0、1、3、6、10、14个月检测校准品，考察各个浓度点与对照（0月）相比发光值变化情况，相对偏差＜15%，则判定稳定性合格。从表11的结果可以看出，Aβ40原始多肽在第1个月已经开始出现不稳定，与对照发光值偏差在-16.0~-17.0%。如表12、表13和表14所示，三种Aβ40多肽改造体稳定性合格，保存14个月后Aβ40-V1与对照发光值偏差在-0.2~1.2%，小于15%；保存14个月后Aβ40-V2与对照发光值偏差在-0.1~0.8%，小于15%；保存14个月后Aβ40-V3与对照发光值偏差在-0.5~0.1%，小于15%。
表11
表12
表13
表14
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1. β淀粉样蛋白多肽改造体，其特征在于，所述多肽改造体包括肽段一、肽段二、位于肽段一和肽段二之间的肽段三，所述肽段一和肽段三之间、肽段二和肽段三之间均添加连接化合物；所述肽段一的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示；所述肽段二的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示；肽段三的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示；所述连接化合物为(PEG4)3、(CH2)6或如SEQID NO:17所示。
2. 根据权利要求1所述的β淀粉样蛋白多肽改造体，其特征在于，所述β淀粉样蛋白为SEQ ID NO:1所示的Aβ1-42多肽或SEQ ID NO:2所示的Aβ1-40多肽。
3. 根据权利要求1所述的β淀粉样蛋白多肽改造体，其特征在于，Aβ42多肽改造体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
4. 根据权利要求1所述的β淀粉样蛋白多肽改造体，其特征在于，Aβ40多肽改造体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的β淀粉样蛋白多肽改造体，其特征在于，所述β淀粉样蛋白多肽改造体的制备方法包括：
根据所述的β淀粉样蛋白多肽改造体的氨基酸序列，采用多肽固相合成法进行化学合成，得到全序列，再用HPLC反相柱层析脱盐，得到所述的β淀粉样蛋白多肽改造体。
6.权利要求1-4任一项所述的β淀粉样蛋白多肽改造体在制备阿尔兹海默症诊断试剂校准品中的应用。
7.一种阿尔兹海默症诊断试剂校准品，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的β淀粉样蛋白多肽改造体制备而成。
8.权利要求1-4任一项所述的β淀粉样蛋白多肽改造体在制备阿尔兹海默症诊断试剂盒中的应用。
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