RS50829B

RS50829B - Novi oligosaharidi, njihova proizvodnja i farmaceutske kompozicije sa sadržajem istih

Info

Publication number: RS50829B
Application number: YUP-298/02A
Authority: RS
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov; Jean-Marie Stutzmann; Florence Wahl
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2010-08-31
Also published as: WO2001029055A3; MXPA02003945A; EA200200479A1; TR200201102T2; PL363052A1; PL204623B1; SK287459B6; HRP20020330B1; YU29802A; CY1112274T1; KR20020063881A; NO323409B1; DK1226148T3; KR100778166B1; IL149154A0; EE200200208A; PT1226148E; CZ303255B6; CZ20021385A3; ATE534656T1

Abstract

Oligosaharidi formule:i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera, naznačeni time stoje n ceo broj od 0 do 25, R1, R3, R4 i R5, isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal SO3M, R2 i R5, isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal SO3M ili COCH3, a M je natrijum, kalcijum, magnezijum ili kalijum.Prijava sadrži još 4 nazavisna i 9 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na oligosaharide formule :

njihove mešavine, njihove diastereoizomere, postupke za njihovu proizvodnju i farmaceutske kompozicije sa sadržajem istih.

Sulfati disaharida sa redukcionim krajem, strukture 1,6-anhidro opisani su od strane H.P. WESSEL-a, J. Carbohvdrate Chemistrv, 11(8), 1039-1052 (1992); nikakva farmaceutska aktivnost nije pomenuta u vezi istih.

Sulfati trisaharida, strukture 1,6-anhidro su takodje bili opisani u patentu EP84999 i od strane Y. ICHIKAWA i dr., Carbohvdr.Res., 141. 273-282 (1985), kao medjuproizvodi viših oligosaharida. Ovi trisaharidi poseduju slabu aktivnost anti-Xa.

U formuli (I) n je ceo broj od 0 do 25, Rh R3, R4i R5su isti ili različiti i predstavljaju jedan atom vodonika ili jedan radikal SO3M, R2i Rćsu isti ili različiti i predstavljaju jedan atom vodonika ili jedan radikal SO3M ih COCH3a M je natrijum, kalcijum, magnezijum ili kalijum.

Ovi oligosaharidi takodje sadrže i parni broj saharida.

U formuli (I), R» je, preporučljivo, atom vodonika.

Poželjno je daje n ceo broj izmedju 0 i 10, posebno 0 i 6 i sasvim posebno izmedju 1 i 6.

Oligosaharidi formule (I) mogu se pripremati dejstvom hidroksida alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma na oligosaharide formule:

u kojoj je n ceo broj od 0 do 25, Ri, R3, R, i R5su isti ili različiti i predstavljaju atom vodonika ili radikal SO3M, R2i R«su isti ili različiti, i predstavljaju atom vodonika ili radikal S03M ili COCH3, a M je natrijum, kalcijum, magnezijum ili kalijum, ili njihova mešavina.

Ova reakcija se vodi u vodenoj sredini, na temperaturi od 40 do 80°C, pri pH izmedju 10 i 13.

Kao hidroksid alkalnog metala, koji se može koristiti, mogu se pomenuti soda, potaša, litijum hidroksid i cezijum hidroksid.

Kao hidroksid kvaternernog amonijuma, koji se može koristiti, može se navesti hidroksid tetrabutil amonijuma.

Količina hidroksida alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma treba da bude dovoljna da pH reakcione sredine ostane stabilan tokom celog trajanja reakcije sa hidroksidom alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma. Potrebno je takodje da se dodaje stalno, tokom cele reakcije, hidroksid alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma.

Poželjno je daje hidroksid alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma u obliku vodenog 1 do 5 %-nog rastvora.

Poželjno je da se reakcija vodi na temperaturi izmedju 60 i 70°C.

Dobro je da se reakcioni pH održava od 11 do 12,5.

Reakcija se prekida zakišeljavanjem reakcione sredine, npr. dodavanjem kisele smole, kao stoje smola Amberlite IR 120<R>(Fluka).

Oligosaharidi formule (I) mogu se i prečišćavati po potrebi hromatografijom uz upotrebu gela tipa poliakrilamid-agaroza, kao što je onaj pod komercijalnim nazivom Ultrogel ACA202<R>(Biosepra), prema postupku opisanom niže, za razdvajanje medjuproizvoda oligosaharida formule (II). Oligosaharidi formule (I), kod kojih je n 0 ili 1, mogu se takodje eventualno prečišćavati u koloni sa silika gelom, sa eluentom u vidu mešavine voda-etanol.

Medjuproizvodi oligosaharida formule (II) i njihove mešavine, mogu se dobiti razdvajanjem pomoću hromatografije preko gela mešavine oligosaharida (III), dobijene enzimatskom đepolimerizacijom heparina ili baznom depolimerizacjom benzil estra heparina ili benzil estra heparina u hemisintezi.

Ova hromatografija se vodi kroz kolone napunjene gelom tipa poliakrilamid-agaroze, kao što je onaj pod komercijalnim nazivom Ultrogel ACA202<R>(Biosepra). Poželjno je da se koristi baterija kolona sa gelom poliakrilamid-agaroze. Broj upotrebljenih kolona se prilagodjava u funkciji zapremine, gela i oligosaharida, koji treba da se izdvajaju. Mešavina se eluira rastvorom sa sadržajem puferskog fosfata i natrijum hlorida. Preporučljivo je daje rastvor puferskog fosfata rastvor 0,02 mol/l NaH2P04/Na2HP04(pH 7), sa sadržajem 0,1 mol/l natrijum hlorida. Otkrivanje različitih frakcija vrši se UV spektrometrom (254 mm) i jonskim (IBF). Tako dobijene frakcije mogu se zatim eventualno prečišćavati npr, SAX (strong anion exchange = jaka razmena anjona) hromatografijom, postupkom poznatim stručnjaku, i posebno postupkom opisanim od strane K G. Rice i R J. Linhardt-a, Carbohvdrate Res., 190, 219-233 (1989), A. Larnkjaer, S.H. Hansen i P B. Ostergaard-a, Carbohydrate Res., 266, 37-52 (1995) i u patentu WO90/01501 (primer 2). Zatim se frakcije liofilizuju i posle toga desalinišu u koloni napunjenoj gelom kao što je gel za kolone Sephadex G10<R>(Pharmacia Biochemicals).

Ako prečišćavanje nije vršeno SAX hromatografijom, liofilizati se mogu eventualno prečišćavati jednostavnim taloženjem ili razdvojiti postupcima poznatim stručnjaku, a posebno postupkom opisanim u patentu FR2548672. Generalno, radi se prema sledećem protokolu: Liofilizovana frakcija za prečišćavanje se rastvara na 25°C u oko 10 zapremina destilovane vode. Dodavanjem metanola ili etanola, prouzrokuje se taloženje željenog oligosaharida, uz kontrolu CLHP (tečna hromatografija visokog učinka). Dodavanje metanola ili etanola se odredjuje u funkciji čistoće i željenog prinosa rečenog oligosaharida. Takođe, ovaj se postupak može realizovati u više uzastopnih faza, polazeći od rastvora početnog liofilizata. U tom cilju, dodaje se sredstvo protiv rastvaranja (metanol ili etanol) u malim udelima i izdvaja se posle svakog dodavanja dobijeni talog. Ovako pripremljeni taloži analiziraju se CLHP hromatografijom. Prema čistoći i željenom učinku, združuju se odgovarajuće sakupljene frakcije.

U pogledu medjuprorizvoda formule (II) kod kojih je n = 0, 1 ili 2, poželjno je da se podje od mešavine (III), dobijene enzimatskom depolimerizacijom.

Ova depolimerizacija vrši se pomoću heparinaze I (EC 4.2.2.7), u puferskom rastvoru fosfata sa pH 7, u prisustvu natrijum hlorida i BS A (albumina govedje krvi), na temperaturi izmedju 10 i 18°C, poželjno 15°C, tokom 8 do 10 dana, poželjno 9 dana. Depolimerizacija se zaustavlja, npr. zagrevanjem reakcione sredine do 100°C tokom 2 minuta i mešavina se rekuperiše liofilizacijom. Poželjno je da se koriste 7UI heparinaze I na 25 g heparina. Dodati rastvor fosfata sadrži uglavnom 0,05 mol/l NaH2P04/Na2HP04(pH 7) u prisustvu 0,1 mol/l natrijum hlorida. Koncentracija BSA je uglavnom 2%.

U pogledu medjuproizvoda formule (II), kod kojih je n = 0, 1, 2, 3 ili 4, preporučljivo je da se podje od mešavine (III), dobijene depolimerizacijom benzil estra heparina.

Benzil estar heparina se može pripremiti postupcima opisanim u patentima US5389618, EP40144, FR2548672. Nivo esterifikacije treba s preimućstvom da leži izmedju 50 i 100 %. Najbolje je da leži izmedju 70 i 90 %.

Depolimerizacija se obavlja u vodenoj sredini, pomoću hidroksida alkalnog metala (litijuma, natrijuma, kalijuma ili hidroksida cezijuma, npr.) ili pomoću hidroksida amonijuma (hidroksid tetrabutil amonijuma, na pr.), poželjno uz molarnost izmedju 0,1 i 0,2 mol/l, na temperaturi izmedju 40 i 80°C, tokom 5 do 120 minuta. Poželjni načinje da se radi 5 do 15 minuta, na temperaturi izmedju 60 i 70°C, sa rastvorom natrijum hidroksida od 0,15 mol/l. Reakcija depolimerizacije se zaustavlja neutralisanjem uz dodavanje neke kiseline, kao što je sirćetna. Posle dodatka 10 tež.% po zapremini natrijum acetata, mešavina oligosaharida se istaloži dodatkom metanola, poželjno 2 zapremine po 1 zapremini reakcione sredine, i profiltrira.

Prema jednom poželjnom vidu pronalaska, mešavina oligosaharida, dobijena posle hemijske depolimerizacije, u obliku vodenog rastvora, obogaćuje se ultrafiltracijom kroz membrane sa pragom prolaza koji nominalno odgovara (tipa Pellicon od regenerisane celuloze, koju prodaje Millipore); pri tome je tip membrane prilagodjen tipu obogaćenih oligosaharida koji se rekuperišu. Za oligosaharide (II), kod kojih je n = 0, koristiće se membrana sa nominalnim pragom prolaza od 1 kDa, za oligosaharide (II) kod kojih je n = 1, koristiće se membrana sa 1 kDa do 3 kDa, za oligosaharide (II) kod kojih je n = 2, koristiće se membrana sa 3 kD, a za oligosaharide (II), kod kojih je n = 3 ili 4, koristiće se membrana sa 5 kDa. Tokom ovoga rada, ono što prodje se rekuperiše, a ostatak se odbacuje. Tako, frakcija obogaćenog proizvoda može predstavljati 50 do 10% početne mešavine oligosaharida, pri čemu se sačuva bar 80% željenog oligosaharida.

Kod medjuproizvoda formule (II), kod kojih je n = 0 do 25, poželjno je poći od mešavine (III), dobijene depolimerizacijom benzil estra sulfata polisaharida iz polusinteze. Benzil estar sulfata polisaharida iz polusinteze priprema se polazeći od sulfata polisaharida iz polusinteze polazeći od polisaharida K5 i postupcima opisanim u patentima W094/29352 i W096/14425. Uslovi esterifikacije, depolimerizacije i rekuperacije su isti, kao oni prethodno opisani za benzil estar heparina.

Kod svih prethodno opisanih postupaka, početni heparin može biti svinjskog, govedjeg, kozjeg ili ovčijeg porekla i može voditi poreklo iz mukoze, pluća ili životinjske kože. Poželjna je upotreba heparina iz svinjske, ovčije ili mukoze iz govedjih pluća, i još poželjnije, iz svinjske mukoze.

Oligosaharidi formule (I) pokazuju anti-inflamatorne osobine i stoga se mogu koristiti u prevenciji i tretmanu oboljenja vezanih sa nekim zapaljenjskim procesom, koji implicira proizvodnju citotoksičnih supstanci, kao azot monksida (NO), čija se neprovodljiva forma oslobadja posebno od strane neutrofila ili makrofaga, pošto se isti kreću i aktivni su na nivou tkiva. Aktivacija, kretanje, vezivanje i infiltracija neutrofila dešavaju se na nivou ishemičnih zona tkiva posle nekog začepljenja ili nekog spazma neke arterije, koja vaskularizuje ovo tkivo. Ove ishemije se mogu desiti bilo na moždanom nivou (vaskularni moždani incident), bilo na nivou miokarda (infarkt miokarda), bilo na nivou donjih organa (nazvane periferne ishemije). Oligosaharidi formule (I) se zato mogu koristiti za prevenciju i/ili tretman neurodegenerativnih oboljenja, medju kojima zapaljenje mozga igra opasnu ulogu, koja može dovesti i do smrti, i medju kojima se mogu navesti moždane ishemije, ishemije miokarda (infarkt miokarda), periferne ishemije, povrede centralnog nervnog sistema i posebno povrede lobanje, kičme i spino-kranijuma, multiple skleroze, neuropatskih bolova i perifernih neuropatija, oboljenja motoneurona, medju kojima su lateralna amiotrofična skleroza, neuro-sida, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Huntingtonova horea i odredjeni oblici osteoartritisa, posebno na zglobovima.

Protivzapaljenjsko dejstvo ovih proizvoda prikazuje se in vivo testom proizvodnje NOx (nitrita i nitrata), izazvane jednim lipopolisaharidom (LPS), koji vodi poreklo od E. Coli, prema protokolu opisanom od M. YAMASHITA i dr. Eur.J.Pharmacol., 338,2, 151-158 (1997) ili J.E. SHELLITO i đr. Am. J. Respir. Cell .Mol.Biol., 13, 1,45-53(1995).

Daje se injekcijama muškim CDI miševima (Charles River, 25-35 g) u vremenu TO intravenozno doza od 0,5 mg/kg oligosaharida, u vremenu T+15 min., potkožno 1 ili 2 mg/kg oligosaharida. U vremenu T+30 min., daje se 100 mg/kg lipopolisaharida (LPS) dobijenog od E.Coli (Sigma L3129, serotip 0127.B8). U vremenu T+3 sata, ponovo se potkožnom injekcijom daje 1 do 2 mg/kg oligosaharida. Na T+5 sati 30 minuta, uzima se uzorak krvi punkcijom iz oka i koncentracija NOx (nitrita i nitrata) u plazmi se odredjuje kolorimetrijskom metodom Griess-a, posle smanjenja nitrata u nitritu reduktazom nitrata, na sledeći način: 12 ul uzorka plazme se pomeša sa 88 ul dejonizovane vode i inkubira preko noći 1 sat na temperaturi okoline sa 40 ul fosfatnog pufera (0,31 M, pH 7,5), 20 ul (3-NADPH (nikotinamid ađenin redukovanog dinukleotid fosfata) (0,86 M), 20 ul FDA (dinukleotid flavin adenina)

(0,11 mM) i 20 ul reduktaze nitrata (2U/ml), (Boehringer Mannheim). 10 ul ZnS04(IM) se doda radi taloženja proteina i posle mešanja uzorci se

centrifugiraju pri 20 000 obrtaja tokom 5 minuta. Na kraju, 50 ul supernatanta se inkubiraju 10 minuta na temperaturi okoline sa 100 ul Griess-ovog reagensa (sulfanilamid u 1 % i kiseloj smeši fosfor/naftiletilendiamina sa 0,1 % u dejonizovanoj vodi (zapr./zapr.)). Optičke gustine očitavane su na 540 nm mikroslojnim spektrofotometrom ; svaka tačka je odredjivana 2 puta. Koriste se KN03i NaN02kao standardi za kolorimetrijsku metodu.

U ovom testu, oligosaharidi prema ovom pronalasku su inhibirali stvaranje NOx-a za više od 50 %.

Medju poželjnim oligosaharidima formule (I), posebno treba navesti one kod kojih: - nje jednako 0, Rii Re predstavljaju radikal S03Na, aMje natrijum i mešavina njegovih diastereizomera, - nje jednako 1, Ri, R2, R3, R5, Rć predstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika, a M je natrijum i mešavina njegovih diastereoizomera, - nje jednako 2, Ri, R2, R3, R5, Rć predstavljaju radikal S03Na, Rije atom vodonika, a M je natrijum i mešavina njegovih diastereoizomera, -nje jednako 2, Ri, R2, R3Rćpredstavljaju radikal S03Na, R5je atom vodonika ili radikal S03Na, Rt je atom vodonika, a M je natrijum i mešavina njegovih diastereoizomera (derivat 1,6 anhidro AIs-Is-IIs).

Sledeći primeri prikazuju pripremanje oligosaharida formule (I) i njihovih medjuproizvoda.

U ovim primerima, skraćenice označavaju sledeće:

Ais : (4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-enopiranoziluronska kiselina)-(l —»4)-2-dezoksi-2-sulfoamino-6-0-sulfo~a-D-glukopiranoze, so njenog tetranatrijuma ili i AUA/?2S(l~*4)-a-D-GlcN/>S6S,

Is : (2-sulfo-a-L-idopiranoziluronskakiselina)-(l—*4)-2-dezoksi-2-sulfonamino-6-0-sulfo-a-D-glukopiranoze, so njenog tetranatrijuma ili i a-L-IdoAp2S-(l-*4)-a-D-GlcN/?S6S,

IIs : (a-L-idopiranoziluronska kiselina)-(l—>4)-2-dezoksi-2-sulfonamino-6-0-sulfo-a-D-glukopiranoze, so njenog trinatrijuma ili i a-L-IdoA/?-(l—*4)-a-D-GlcN/7S6S,

IIIs: (2-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina)-(l-+4)-2-dezoksi-2-sulfonamino-a-D-glukopiranoze, so njenog trinatrijuma ili i a-L-IđoAj?2S-(l—»4)-a-D-GlcN/;2S,

IdoAp: idopiranoziluronska kiselina,

GlcN/7:2-dezoksi-2-aminoglukopiranoza,

AUap: 4-dezoksi-a-L-treo-heks-enopiranoziluronska kiselina,

S : sulfat.

PRIMERI PRIPREMANJA MEŠAVINA FORMULE (II)

PRIMER A - pripremanje oligosaharida formule (II), kod kojih je n = 0,1 i 2, enzimatskom depolimeirzacijom i razdvajanjem

Rastvori se 25 g heparina u 250 ml puferskog fosfatnog rastvora sa sadržajem 0,05 mol/l NaH2P04/Na2HP04(pH = 7), 0,2 mol/l natrijum hlorida i 2 % BSA (albumina govedjeg seruma). U mešavinu se doda 7 Ul heparinaze I (EC 4.2.2.2.7), pa se dobijeni rastvor ohladi na 15°C i drži na toj temperaturi tokom cele reakcije depolimerizacije. Napredovanje reakcije se prati uzimanjem uzoraka iste količine i analizom hromatografijom preko gela. Posle 9 dana, enzimatska reakcija se zaustavlja zagrevanjem reakcione sredine na 100°C tokom dva minuta. Zatim se ohladjena mešavina liofilizuje. Tako se dobija mešavina oligosaharida (III).

Dobijena mešavina oligosaharida (III) se zatim hromatografiše sledećim postupkom: Hromatografija se vodi u kolonama napunjenim gelom poliakrilamid-agaroze, poznate pod nazivom Ultrogel ACA 202 i mešavina se eluira rastvorom sadržaja puferskog fosfata (0,02 mol/l NaHzPO+ZNaiHPOO pH = 7 i 0,1 mol/l natrijum hlorida. Otkrivanje se sprovodi UV spektrometrom (254 nm) i jonskim (IBF). Proizvodi se mogu po potrebi prečišćavati SAX hromatografijom (jaka razmena anjona) ili frakcionim taloženjem prema postupku iz patenta FR 2548672. Dobijene frakcije proizvoda se liofilizuju, a zatim desalinišu kroz kolonu napunjenu gelom Sephadex G10<R>(Pharmacia Biochemicals).

Ovim postupkom se dobija 3 g disaharida Is, 1100 mg jedne mešavine heksasaharida sa tipičnim sadržajem 55 % derivata AIs-Is-Is, 35 % AIs-Is-IIs i 10 % AIs-Is-IIIs. Ova poslednja mešavina se može prečišćavati postupcima poznatim stručnjaku, sa ciljem izdvajanja svakog od sastojaka, ili korišćenja onih koji se upotrebljavaju za prevodjenje u derivate 1,6 anhidro formule (I). Treba napomenuti da u toku prevodjenja heksasaharida AIs-Is-IIIs ne može doći do formiranja jedinjenja formule

(I)

PRIMER B - Pripremanje oligosaharida formule (II), kod kojih n = 0, 1, 2, 3 ili 4 depolimerizacijom benzil estra heparina i razdvajanjem

a - Pripremanje benzil estra heparina

Benzil estar heparina se priprema prema primeru 3 iz patenta US 5,389,618.

b - Depolimerizacija

Rastvori se 100 g benzil estra heparina u 1,9 1 demineralizovane vode. Mešavina se zagreje na 60°C bez mešanja. Posle dobijanja homogenog rastvora, odjednom se u isti ubaci oko 35 ml 23 %-nog rastvora natrijum hidroksida. Posle reakcije od 10 minuta, rastvor se ohladi i neutrališe rastvorom sirćetne kiseline sa oko 2N. Ovom rastvoru se zatim doda 10 % tež.%/zapr. natrijum acetata. Mešavina oligosaharida se istaloži dodavanjem oko 2 zapremine metanola. Talog se izdvoji filtracijom, opere u metanolu dva puta, a zatim osuši pod sniženim pritiskom na 50°C. Posle sušenja, dobija se 73,8 g mešavine oligosaharida (II).

c - Obogaćivanje oligosaharida sa n = 1

Rastvori se 30 g mešavine oligosaharida, dobijene prethodno u oko 35 zapremina vode. Ovaj rastvor se ultrafiltrira kroz membranu 3 kDa (Pellicon). Kada je izvučeno 600 ml procedjenog materijala, ostatak se razredi u 500 ml vode. Ovaj postupak se ponavlja, dok se ne dobije 450 ml dopunskog procedjenog materijala. Dve frakcije procedjenog materijala zgusnute su do suvog pod sniženim pritiskom. Dobija se 6,1 g žućkasto-bele čvrste materije. Analiza čvrste materije hromatografijom preko naznačenog gela pokazala je da ista sadrži oko 30 % oligosaharida formule (II) sa n = 1.

d - Razdvajanje mešavina ultrafiltriranih oligosaharida

Obogaćena mešavina se razdvaja u kolonama napunjenim gelom poliakrilamid-agaroze, poznate pod nazivom Ultrogel ACA 202 (koriste se 4 kolone prečnika 10 cm i visine 50 cm), vezane u seriji. 5 g mešavine obogaćene ultrafiltracijom rastvori se u 25 ml vode, a zatim se eluira rastvorom 0,2 mol/l natrijum hlorida brzinom 5 ml/minut. Po koloni se dobijaju frakcije od po 25 ml. Otkrivanje dobijenih proizvoda vrši se UV spektrometrom (254 nm) i jonskim (IBF). Dobijaju se frakcije za koje je n = 1, liofilizuju se, a zatim desalinišu u koloni napunjenoj gelom Sephadex G10. Posle liofilizacije, dobija se 1 g tetrasaharida sa tipičnim sadržajem 70 % derivata AIs-Is formule II (Ri, R2, R3, R5, Re = S03Na; R» = H, a M = Na). Derivat AIs-Is može po potrebi da bude i prečiaćen SAX hromatografijom (jaka razmena anjona) ili prema poželjnom vidu frakcionim taloženjem prema postupku opisanom u patentu FR 2548672.

PRIMER 1

U reaktor, održavan na 66°C, ubačeno je 5 ml rastvora natrijum hidroksida sa

0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora se tada meri i uzima za ciljnu vrednost (pH = 11,35). Uz mešanje, dodaje se odjednom 30 mg oligosaharida formule (II), kod kojeg je n = 0, Rii Rć označavaju radikal S03Na, a M je natrijum. Vrednost pH se onda podešava i održava na pH 11,35 stalnim dodavanjem rastvora natrijum hidroksida sa 0,5 mol/l. Posle 10 sati, prestaje se sa dodavanjem natrijum hidroksida i reakciona mešavina se hladi na 25°C.

Vrednosr pH rastvora se sada podesi na izmedju 6 i 7, dodavanjem smole Amberlite IR120. Mešavina se profiltrira kroz membranu Whatman GF/B, a zatim se zgusne pod sniženim pritiskom (2,7 kPa) na temperaturi od oko 25°C. Proizvod se izdvaja pomoću 0,5 ml destilovane vode, a zatim je liofilizovan. Tako se dobija 29 mg mešavine diastereoizomera oligosaharida formule (I), kod koga je n = 0, Rii R^označavaju radikal S03Na, aMje natrijum [(4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranoziluronska kiselina-(l—*4)-l,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfoamino-P-D-manopiranoze, so trinatrijuma): Protonski spektar za D20, 400 MHz, T=298K, 5 u ppm : 3,15 (IH, s, H2), 3,75 (2H, m, H6 i H3), 3,88 (IH, m, H4), 4,20 (IH, d, J=8Hz, H6), 4,22 (IH, t, J=5Hz, H3'), 4,58 (IH, m, H2'), 4,75 (IH, m, H5), 5,53 (IH, s, Hl), 5,60 (IH, dd, J=6 i 1Hz, Hl'), 6,03 (IH, d, J=5Hz, H4'); (4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranoziluronska kiselina)-(1^4)-l,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfoamino-p-D-sulfo-glikopiranoze, so trinatrijuma): Protonski spektar za D20, 400 MHz, T=298K, 5 u ppm : 3,34 (IH, dd, j=7 i 2Hz, H2), 3,72 (IH, t, J=8Hz, H6), 3,90 (IH, m, H3), 4,03 (IH, s, H4), 4,20 (IH, d, J=8Hz, H6), 4,23 (IH, t, J=5Hz, H3'), 4,58 (IH, m, H2'), 4,78 (IH, m, H5), 5,50 (IH, s, Hl), 5,60 (IH, dd, J=6 i 1Hz, Hl'), 6,03 (IH, d, J=5Hz, H4')].

PPJMER 2

U reaktor, održavan na 62°C, ubačeno je 33,3 ml rastvora natrijum hidroksida sa 0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 11,15). Uz mešanje, dodato je odjednom 200 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg n = 1, Rt, R2, R3, R5, Rćpredstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 11,15 dodavanjem rastvora natrijum hidroksida od 0,5 mol/l. Posle 12 sati, zaustavljeno je dodavanje natrijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Vrednost pH mešavine je tada podešena na izmedju 6 i 7 dodavanjem smole Amberlite IR120. Mešavina je profiltrirana kroz membranu Whatman GF7B, a zatim zgusnuta do suvog pod sniženim pritiskom (2,7 kPa) na temperaturi od oko 25°C. Proizvodu je dodato 3 ml destilovane vode, a zatim je liofilizovan. Tako je dobijeno 230 mg oligosaharida formule (I), kod kojeg je n = 1, Ri, R2, R3, R5, R5predstavljaju radikal SOjNa, R4 je atom vodonika a M je natrijum, u obliku mešavine diastereomera [(4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranozsiluronska kiselina-( 1 —*4)-2-dezoksi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glukopiranozil-( 1 —>4)-,2- 0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina-( 1 —>4)-1,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfonamino-p-D-manopiranoze, so heptanatrijuma) : Protonski spektar za D20, 400 MHz, T=298K, 5 u ppm: 3,15 (IH, s, H2,), 3,25 (IH, m, H2"), 3,60 (IH, m, H3"), izmedju 3,70 i 4,70 (14H, br., H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4"/H5"/H6", H2"'/H3"'), 4,75 (IH, m, H5), izmedju 5,20 i 5,40 (2H, m. Hl' i Hl"), 5,45 (lH,m, Hl'"), 5,56 (IH, m, Hl), 5,94 (IH, d, J=5Hz, H4); (4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranoziluronska kiselina)-( 1 —*4)-2-dezoksi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glukopiranozil-( 1 —>4)-,2- 0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina-( 1 —►4)-1,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfoamino-p-D-glukopiranoze, so heptanatrijuma); Protonski spektar za D20, 400 MHz, T=298K, 6 u ppm : 3,25 (IH, m, H2"), 3,42 (IH, dd, J=4 i 1Hz, H2), 3,60 (IH, m, H3"), izmedju 3,70 i 4,70 (14H, br., H3/H4/H6, H27H3'/H4'/H5', H4'7H5'7H6", H2"7H3"'), 4,75

(IH, m, H5), izmedju 5,20 i 5,40 (2H, m, Hl' i Hl"), 5,45 (IH, m, Hl"'), 5,52 (IH, m, Hl), 5,94 (IH, d, J=5Hz, H4)].

PRIMER 3

U reaktor, odžavan na 62°C, ubačeno je 16,7 ml rastvora natrijum hidroksida pri 0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 11,7). Uz mešanje, dodato je odjednom 100 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg n = 2, Ri, R2, R3, R5, Re predstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 11,7 dodavanjem jednog rastvora natrijum hidroksida od 0,5 mol/l. Posle 10 sati, zaustavljeno je dodavanje natrijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Vrednost pH mešavine je sada podešena na izmedju 6 i 7 dodavanjem smole Amberlite IR120. Mešavina je profiltrirana kroz membranu Whatman GF7B, a zatim zgusnuta do suvog pod sniženim pritiskom (2,7 kPa) na temperaturi oko 25°C. Proizvodu je dodato 3 ml destilovane vode, a zatim je Iiofilizovan. Tako je dobijeno 108 mg oligosaharida formule (I), kod kojeg je n = 2, Ru R2, R3, R5, Rćpredstavljaju radikal S03Na, Rije atom vodonika, a M je natrijum, u obliku mešavine diastereomera. Od A do F se zapažaju šećeri kao sastojci heksasaharida, od kojih je A ostatak ostatak 1,6-anhidro, a F ostatak nezasićene mokraćne kiseline. [(4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranoziluronska kiselina-( 1 —>4)- 2-dezoksi-2-sulfonamino-6-0-sulfo-a-D-glukopiranozil-(l—>4)- 2-0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina-(l —»-4)- 2-dezoksi-2-sulfoamino-6-(7-sulfo-a-D-glukopiranozil-(l—>4)-2- 0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina-( 1 —*4)-1,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfoamino-P-D-manopiranoze, so undekanatrijuma) : Protonski spektar za D20, 400 MHz, T=298K, 8 u ppm : 3,15 (IH, s, H2(A)), 3,25 (2H, m, H2(C+E)). 3,60 (2H,m,H3(C+E)), izmedju 3,65 i 4,50 (19H, br., H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/(H5(C+E)/H6(A+C+E)), 4,60 (IH, s, H2(F)), 4,80 (3H, m, H5(A+B+D), 5,18 (lH,s,Hl(D)), 5,30 (1H,S,H1(B)), 5,34 (IH, d, H1(C)), 5,36 (Hl, d, H1(E)), 5,46 (IH, s, H1(F)), 5,57 (IH, s, H1(A)), 5,95 (IH, d, J=5Hz, H4(F)); (4-dezoksi-2-0-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranoziluronska kiselina-( 1 —*4)-2-dezoksi-2-sulfoamino-6-(9-sulfo-a-D-glukopiranozna-( 1 —*4)-2- 0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina-( 1 —>-4)-2-dezoksi-2-sulfoamino-6-6>-sulfo-a-D-glukopiranozil-( 1 —>4)- 2-0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina)-( 1 ->4)-1,6-anhidro-2-dezoksi-2-sulfoamino-P-D-glukopiranoze, so undekanatrijuma); Protonski spektar za D2C-, 400 MHz, T=298K, 5 u ppm : 3,25 (2H, m, H2(C+E)), 3,42 (IH, m, H2(A)), 3,60 (2H, m, H3(C+E)), izmedju 3,65 i 4,50 (19H, br., H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/H5(C+E)/H6(A+C+E)), 4,60 (IH, s, H2(F)), 4,80 (3H, m, H5(A+B+D), 5,18 (IH, s, H1(D)), 5,31 (IH, s, H1(B)), 5,34 (IH, d, H1(C)), 5,36 (Hl, d, H1(E)), 5,46 (IH, s, H1(F)), 5,52 (IH, s, H1(A)), 5,95 (IH, d, J=5Hz, H4(F))].

PRIMER 4

U reaktor, odžavan na 62°C, ubačeno je 4 ml rastvora natrijum hidroksida sa 0,0316 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 11,8). Uz mešanje, dodato je odjednom 100,8 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg je n = 2, sa sadržajem 55% derivata AIs-ls-Is (Ri, R2, R3, R5, i Rspredstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika, a M je natrijum), 35% AIs-Is-IIs (Ri, R2, R3i Rj predstavljaju radikal S03Na, R5predstavlja bilo radikal S03Na ili atom vodonika, R4predstavlja atom vodonika, a M je natrijum), i 10% AIs-Is-IIIs (Ri, R2, R3, R5, i Re predstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika a M je natrijum, pri čemu je funkcija S03M ugljenika C6 zamenjena atomom vodonika). Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 11,8 dodavanjem rastvora natrijum hidroksida od 0,5 mol/l. Posle 11 sati, zaustavljeno je dodavanje natrijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Vrednost pH mešavine je tada podešena na izmedju 6 i 7 dodavanjem smole Amberlite IR120. Mešavina je profiltrirana kroz membranu Whatman GF/B, a zatim zgusnuta do suvog pod sniženim pritiskom (2,7 kPa) na temperaturi od oko 25°C. Proizvodu je dodato 1,5 ml destilovane vode, a zatim je liofilizovan. Tako je dobijeno 110 mg oligosaharida formule (1), kod kojeg je n = 2, sa sadržajem naročito derivata 1,6 anhidro AIs-ls-Is (Ri, R2, R3, R5, i Re predstavljaju radikal S03Na, R4 je atom vodonika, aMje natrijum) i derivata 1,6 anhidro AIs-Is-IIs (Ri, R2, R3i R«predstavljaju radikal S03Na, R5je radikal S03Na ili atom vodonika, R4 je atom vodonika a M je natrijum). Analiza CLHP (tečna hromatografija visokog učinka) u načinu rada sa parovima jona, omogućila je da se prati prevodjenje u derivate formule (I). U tom slučaju odredjivanje udela pomoću CLHP je pokazalo da se prevodjenje ostvaruje na derivatima AIs-ls-Is, AIs-Is-IIs.

PR1MER 5

U reaktor, odžavan na 66°C, ubačeno je 8,6 ml rastvora natrijum hidroksida sa

0,025 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 11,68). Uz mešanje, dodato je odjednom 50 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg je ti= 0, Ri i Re predstavljaju radikal SC^Na, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 11,68 dodavanjem rastvora litijum hidroksida od 0,466 mol/l. Posle 8 sati, zaustavljeno je dodavanje litijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Analiza CLHP (tečna hromatografija visokog učinka) u načinu rada sa parovima jona, omogućila je da se prati prevodjenje u derivate formule (I), kod kojih je n = 0, Ri i R; predstavljaju radikal SOjNa, a M je natrijum ili litijum. U tom slučaju odredjivanje udela pomoću CLHP je pokazalo da se prevodjenje ostvaruje sa 100 %. Prinos je prema spoljnoj kalibraciji izneo 81,2 %.

■

PR1MER 6

U reaktor, odžavan na 66°C, ubačeno je 8,3 ml rastvora natrijum hidroksida sa

0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH= 11,1). Uz mešanje, dodato je odjednom 50 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg je n = 0, Rii Repredstavljaju radikal SOjNa, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 11,1 dodavanjem jednog rastvora kalijum hidroksida od 0,515 mol/l. Posle 24 sata, zaustavljeno je dodavanje kalijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Analiza CLHP (tečna hromatografija visokog učinka) u načinu rada sa parovima jona,

omogućila je da se prati prevodjenje u derivate formule (1), kod kojih je n = 0, Ri i Repredstavljaju radikal S03Na, a M je natrijum ili kalijum. U tom slučaju odredjivanje udela pomoću CLHP je pokazalo da se prevodjenje ostvaruje sa 100 %. Prinos je prema spoljnoj kalibraciji izneo 75,6 %.

PRIMER 7

U reaktor, odžavan na 66°C, ubačeno je 8,3 ml rastvora cezijum hidroksida sa 0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 10,75). Uz mešanje, dodato je odjednom 50 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg je n = 0, Rii R<spredstavljaju radikal S03Na, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 10,75 dodavanjem rastvora cezijum hidroksida od 0,476 mol/l. Posle 20 sati, zaustavljeno je dodavanje cezijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Analiza CLHP (tečna hromatografija visokog učinka) u načinu rada sa parovima jona, omogućila je da se prati prevodjenje u derivate formule (I), kod kojih je n = 0, Rii R; predstavljaju radikal SC*3Na, a M je natrijum ili cezijum. U tom slučaju odredjivanje udela pomoću CLHP je pokazalo da se prevodjenje ostvaruje sa 90,3 %. Prinos je prema spoljnoj kalibraciji izneo 73 %.

PRIMER 8

U reaktor, odžavan na 66°C, ubačeno je 8,3 ml rastvora tetrabutilamonijum hidroksida sa 0,0063 mol/l. Vrednost pH rastvora je merena i uzeta kao ciljna vrednost (pH = 10,95). Uz mešanje, dodato je odjednom 50 mg oligosaharida formule (II) kod kojeg je n = 0, Rii R«predstavljaju radikal S03Na, a M je natrijum. Vrednost pH je podešavana i održavana na pH 10,95 dodavanjem rastvora tetrabutilamonijum hidroksida od 0,521 mol/l. Posle 16 sati, zaustavljeno je dodavanje tetrabutilamonijum hidroksida i reakciona mešavina je ohladjena na 25°C. Analiza CLHP (tečna hromatografija visokog učinka) u načinu rada sa parovima jona, omogućila je da se prati prevodjenje u derivate formule (I), kod kojih je n = 0, Rii R« predstavljaju radikal S03Na, a M je natrijum ili tetrabutilamonijum. U tom slučaju odredjivanje udela pomoću CLHP je pokazalo da se prevodjenje ostvaruje sa 96,7 %. Prinos je prema spoljnoj kalibraciji izneo 65%.

Lekovi prema ovom pronalasku podrazumevaju da aktivni sastojak sadrži bar jedan oligosaharid formule (I) ili mešavinu oligosaharida formule (I), u obliku kompozicije, u kojoj je zajedno sa bilo kojim kompatibilnim farmaceutskim proizvodom, koji može biti inertan ili fizioloaki aktivan. Lekovi prema ovom pronalasku mogu se davati intravenozno, potkožno, oralno, rektalno, lokalno ili u pluća (inhalacijom).

Sterilne kompozicije za intravenozno ili potkožno davanje su obično vodeni rastvori. Ove kompozicije mogu sadržavati i dodatke, posebno sredstva za vlaženje, izotoniranje, emulgiranje, dispergovanje i stabilizaciju. Sterilizacija se može sprovoditi na više načina, npr. aseptičkom filtracijom, ubacivanjem u kompoziciju stredstva za sterilizaciju, ozračivanjem. Takodje se mogu pripremati u obliku čvrstih sterilnih kompoizicija, koje se mogu rastvoriti u sterilnoj vodi ili svakoj drugoj sterilnoj sredini za injekcije, neposredno pre upotrebe.

Kao čvrste kompozicije za oralno davanje mogu se koristiti komprimati, pilule, praškovi (u želatinskim kapsulama ili kesicama) ili granule. Kod ovakvih kompozicija, aktivni sastojak se meša sa jednim ili više razredjivača, kao što je škrob, celuloza, saharoza, laktoza ili silicijum, u struji argona. Ove kompozicije mogu sadržavati i supstance različite od razredjivača, npr. jedan ili više podmazivača, kao što je magnezijum stearat ili talk, sredstva koja pomažu rastvaranje u ustima, boje, prevlake (dražeje) ili lepak.

Kao tečne kompozicije za oralno davanje, mogu se koristiti rastvori, suspenzije, emulzije, sirupi i farmaceutski prihvatljivi eliksiri sa sadržajem inertnih razredjivača, kao voda, etanol, glicerin, biljna ulja ili parafinsko ulje. Ove kompozicije mogu sadržavati i supstance, različite od razredjivača, npr. ovlaživače, zasladjivače, zgušnjivače, aromatizatore ili stabilizatore.

Kompozicije za rektalno davanje su supozitorije ili rektalne kapsule sa sadržajem, pored aktivnog sastojka, dodataka, kao što je kakao buter, polusintetički gliceridi ili polietilen glikoli.

Kompozicije za lokalno davanje mogu biti, npr., kremovi, losioni, melemi, želei, kapljice za nos ili aerosoli.

Doze zavise od željenog dejstva, trajanja tretmana i puta davanja; obično su u opsegu izmedju 0,5 i 10 mg po kg dnevno, pri davanju potkožnim putem odrasla osoba od 60 kg bi dobijala 3 do 60 mg dnevno.

U opštem slučaju, lekar će odredjivati odgovarajuće doziranje u funkciji starosnog doba, težine i svih drugih faktora pacijenta koji treba da bude tretiran.

Oligosaharidi formule (I) mogu se tako upotrebljavati za prevenciju i/ili tretman neurodegenerativnih oboljenja, medju kojima zapaljenje mozga igra opasnu ulogu, koja može dovesti do smrti, i medju kojima se mogu navesti ishemije centralnog nervnog sistema, moždane ishemije, ishemija očne mrežnjače i sočiva, srčane ishemije (infarkt miokarda), periferne ishemije, povrede centralnog nervnog sistema i posebno povrede lobanje, spino-kranijalne kičme, povrede očne mrežnjače i sočiva, skleroza diskova, neuropatski bolovi i periferne neuropatije, obolenja motoneurona, medju kojima su amiotrofna skleroza, neuro-sida, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Huntingtonova horea i odredjeni oblici osteoartritisa, posebno na zglobovima.

Claims

1. Oligosaharidi formule: i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera,naznačeni timešto je n ceo broj od 0 do 25, Rt, R3, R4i R5, isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal S03M, R2i Rć , isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal S03M ili COCH3, a M je natrijum, kalcijum, magnezijum ili kalijum.

2. Oligosaharidi formule (I) i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera prema zahtevu 1,naznačeni timešto R4predstavlja atom vodonika.

3. Oligosaharidi formule (I) i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera. prema jednom od zahteva 1 ili 2,naznačeni time,što je n ceo broj izmedju 0 i 10.

4. Oligosaharidi formule (I) i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera.prema jednom od zahteva 1 ili 2,naznačeni time,stoje n ceo broj izmedju 0 i 6.

5. Oligosaharidi formule (I) i mešavina ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera prema jednom od zahteva 1 ili 2,naznačeni time,što je n ceo broj izmedju 1 i 6.

6. Postupak za proizvodnju oligosaharida formule (I) ili mešavine ovih oligosaharida i njihovih diastereoizomera prema zahtevu 1,naznačen time,što se dovodi u reakciju hidroksid alkalnog metala ili kvaternenrnog amonijuma sa oligosaharidima formule : u kojima je n ceo broj od 0 do 25, Ri, R3, R4i R5, isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal SO3M, R2i R3, isti ili različiti, predstavljaju atom vodonika ili radikal SO3M ili COCH3, a M je natrijum, kalcijum, magnezijum ili kalijum, i ti oligosaharidi ili njihove mešavine se izdvajaju.

7. Postupak prema zhtevu 6, naznačen time, što se reakcija vodi u vodenoj sredini, na temperaturi od 40 do 80°C i pri vrednosti pH od 10 do 13.

8. Postupak prema zahtevu 6 ili 7, naznačen time, što se koristi 1 do 5%-ni vodeni rastvor hidroksida alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma.

9. Postupak prema zahtevima 6 do 8, naznačen time, što se reakcija vodi na temperaturi od 60 do 70°C.

10. Postupak prema zahtevima 6 do 9, naznačen time, stoje vrednost pH pri reakciji od 11 do 12,5.

11. Postupak prema zahtevima 6 do 10 ,naznačen time,što je hidroksid alkalnog metala ili kvaternernog amonijuma soda, potaša, hidroksid litijuma, cezijuma ili hidroksid tetrabutilamonijuma.

12. Farmaceutske kompozicije,naznačene time,što kao aktivni sastojak sadrže bar jedan oligosaharid prema Zahtevu 1.

13.Farmaceutske kompozicije, naznačenetime, što kao aktivni sastojak sadrže bar jedan oligosaharid prema jednom od zahteva 1 do 5.

14. Korišćenje oligosaharida formule (I) prema jednom od zahteva 1 do 5,naznačeno time,što se koriste za pripremanje lekova korisnih za prevenciju ili tretman moždanih, srčanih ili periferno-vaskularnih ishemija, osteoartritisa, povreda centralnog nervnog sistema, povreda lobanje, kičme i spino-kranijuma, multiple skleroze, neuropatskih bolova i perifernih neuropatija, obolenja motoneurona, lateralne amiotrome skleroze, neuro-side, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i Huntingtonove horee.