[go: up one dir, main page]

PL204623B1 - Oligosacharydy, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz ich zastosowanie - Google Patents

Oligosacharydy, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz ich zastosowanie

Info

Publication number
PL204623B1
PL204623B1 PL363052A PL36305200A PL204623B1 PL 204623 B1 PL204623 B1 PL 204623B1 PL 363052 A PL363052 A PL 363052A PL 36305200 A PL36305200 A PL 36305200A PL 204623 B1 PL204623 B1 PL 204623B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
oligosaccharides
formula
sodium
mixture
hydroxide
Prior art date
Application number
PL363052A
Other languages
English (en)
Other versions
PL363052A1 (pl
Inventor
Pierre Mourier
Elisabeth Perrin
Christian Viskov
Jean-Marie Stutzmann
Florence Wahl
Original Assignee
Aventis Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Sa filed Critical Aventis Pharma Sa
Publication of PL363052A1 publication Critical patent/PL363052A1/pl
Publication of PL204623B1 publication Critical patent/PL204623B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy oligosacharydów o wzorze:
ich mieszanin, ich diastereoizomerów, sposobu ich wytwarzania, zawierających je kompozycji farmaceutycznych oraz ich zastosowania.
Siarczany disacharydów mające koniec redukujący o strukturze 1,6-anhydro zostały opisane przez H.P.Wessela, J. Carbohydrate Chemistry, 11(8), 1039-1052 (1992); nie przypisano im żadnej aktywności farmakologicznej.
Siarczany trisacharydów zawierające ugrupowanie 1,6-anhydro również zostały opisane w opisie patentowym EP 84999 i przez Y.Ichikawę i in., Carbohydr.Res.,141,273-282 (1985) jako związki pośrednie przy wytwarzaniu wyższych oligosacharydów. Te trisacharydy mają małą aktywność anty-Xa.
Przedmiotem wynalazku są oligosacharydy o wzorze:
w którym n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 6, R1, R2, R3 i R6 oznaczają grupę SO3M, R4 oznacza atom wodoru i R5 oznacza atom wodoru lub grupę SO3M i M oznacza atom sodu, wapnia, magnezu lub potasu, mieszanina tych oligosacharydów i ich diastereoizomerów.
Korzystnie, wynalazek obejmuje oligosacharydy o wzorze (I) w których n jest równe 0 i M oznacza atom sodu, i mieszaninę ich diastereoizomerów.
Korzystnie, wynalazek dotyczy oligosacharydów o wzorze (I) w których n oznacza 1, R5 oznacza grupę SO3M i M oznacza atom sodu, i mieszaninę ich diastereoizomerów.
Korzystnie, wynalazek obejmuje oligosacharydy o wzorze (I) w których w których n oznacza 2, R5 oznacza grupę SO3M i M oznacza atom sodu, i mieszanina ich diastereoizomerów.
Korzystnie, wynalazek obejmuje oligosacharydy o wzorze (I) w których n oznacza 2, i M oznacza atom sodu, i mieszaninę ich diastereoizomerów.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I) w którym działa się wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub czwartorzędowym wodorotlenkiem amoniowym na oligosacharydy o wzorze:
PL 204 623 B1
w którym n oznacza liczbę całkowitą 0-6, R1, R2, R3 i R6, oznaczają grupę SO3M, R4 oznacza atom wodoru i R5 oznacza atom wodoru lub grupę SO3M i M oznacza atom sodu, wapnia, magnezu lub potasu, lub ich mieszaninę i wyodrębnia się oligosacharydy albo ich mieszaniny.
Korzystnie, prowadzi się reakcję w środowisku wodnym w temperaturze 40-80°C przy pH 10-13.
Korzystnie, stosuje się 1-5% roztwór wodny wodorotlenku metalu alkalicznego lub czwartorzędowego wodorotlenku amoniowego.
Korzystnie, prowadzi się reakcję w temperaturze 60-70°C.
Korzystnie, stosuje się pH reakcji 11-12,5.
Korzystnie, stosuje się wodorotlenek metalu alkalicznego lub czwartorzędowy wodorotlenek amoniowy, będący wodorotlenkiem sodu, wodorotlenkiem potasu, wodorotlenkiem litu, wodorotlenkiem cezu lub wodorotlenkiem tetrabutyloamoniowym.
Wynalazek obejmuje także, kompozycję farmaceutyczną zawierającą jako substancję aktywną co najmniej jeden oligosacharyd o wzorze (I).
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligosacharydów o wzorze (I) do wytwarzania leku przydatnego do zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, wynikającym z produkcji tlenku azotu (NO).
Korzystnie, oligosacharydy o wzorze (I) są stosowane do wytwarzania leków przydatnych do zapobiegania lub leczenia niedokrwienia mózgu, niedokrwienia serca lub naczyń obwodowych, zapalenia kości i stawów, urazów ośrodkowego układu nerwowego, urazów czaszki, kręgów, czaszkowokręgowych, stwardnienia rozsianego, bólów neuropatycznych i neuropatii obwodowych, chorób motoneuronowych, stwardnienia bocznego z zanikiem mięśni, neuro-AIDS, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona.
Te oligosacharydy obejmują więc parzystą liczbę sacharydów.
W procesie wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I) ilość wodorotlenku metalu alkalicznego lub czwartorzędowego wodorotlenku amoniowego powinna być wystarczająca, aby pH środowiska reakcyjnego pozostawało stałe podczas całego czasu reakcji. Jest więc konieczne ciągłe dodawanie wodorotlenku metalu alkalicznego lub czwartorzędowego wodorotlenku amoniowego w ciągu całej reakcji.
Korzystnie wodorotlenek metalu alkalicznego lub czwartorzędowy wodorotlenek amoniowy jest w postaci 1-5% wodnego roztworu.
Reakcja zachodzi korzystnie w temperaturze 60-70°C.
Korzystnie pH reakcji wynosi 11-12,5.
Reakcję kończy zakwaszenie środowiska reakcyjnego np. przez dodanie kwaśnej żywicy, takiej jak żywica Amberlit IR120® (Fluka).
Oligosacharydy o wzorze (I) można ewentualnie oczyścić przez chromatografię permeacyjną na żelu typu poliakrylamid-agaroza, jak sprzedawany pod nazwą handlową Ultrogel ACA202® (Biosepra) według protokołu opisanego poniżej dla rozdzielania oligosacharydów pośrednich o wzorze (II). Oligosacharydy o wzorze (I), w którym n oznacza 0 lub 1, można też ewentualnie oczyścić na kolumnie z tlenkiem glinu, stosując jako eluent mieszaninę woda-etanol.
Oligosacharydy pośrednie o wzorze (II) i ich mieszaniny można otrzymać przez rozdzielanie przez chromatografię na żelu mieszaniny oligosacharydów (III), uzyskanej przez depolimeryzację enzymatyczną heparyny lub depolimeryzację zasadową estru benzylowego heparyny lub estru benzylowego heparyny półsyntetycznej.
PL 204 623 B1
Tę chromatografię prowadzi się na kolumnach wypełnionych żelem typu poliakrylamid-agaroza, jak sprzedawany pod nazwą handlową Ultrogel ACA202® (Biosepra). Korzystnie stosuje się baterię kolumn z żelem poliakrylamid-agaroza. Ilość użytych kolumn jest przystosowana do objętości żelu i rozdzielanych oligosacharydów. Mieszaninę eluuje się roztworem zawierającym bufor fosforanowy i chlorek sodu. Korzystnie roztwór buforu fosforanowego jest roztworem o 0,02 mola/litr NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7), zawierającym 0,1 mola/litr chlorku sodu. Detekcję różnych frakcji wykonuje się na drodze spektrometrii UV (254 nm) i jonowej (IBF). Tak otrzymane frakcje można następnie ewentualnie oczyścić np. przez chromatografię SAX (strong anion exchange) zgodnie z metodami znanymi fachowcom, a zwłaszcza według metod opisanych przez K.G.Rice i R.J.Linhardta, Carbohydrate Research, 190, 219-233(1989), A.Larnkjaera, S.H.Hansena i P.B.Ostergaarda, Carbohydrate Research, 266, 37-52(1995) i w opisie patentowym WO90/01501 (przykład 2). Frakcje następnie są liofilizowane, potem odsolone na kolumnie wypełnionej żelem, takiej jak kolumna z żelem Sephadex G10® (Pharmacia Biochemicals).
Gdy oczyszczania nie wykonuje się przez chromatografię SAX, liofilizaty można ewentualnie oczyścić przez wytrącenie zwykłe lub frakcjonowane według metody opisanej w opisie patentowym FR 2548672. Ogólnie biorąc działa się według następującego protokołu:
Liofilizowaną frakcję do oczyszczenia rozpuszcza się w temperaturze 25°C w około dziesięciu objętościach wody destylowanej. Przez dodanie metanolu lub etanolu wytrąca się żądany oligosacharyd, kontrolując jego wzbogacanie przez chromatografię CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa). Dodatek metanolu lub etanolu określa się w zależności od czystości i żądanej wydajności wymienionego oligosacharydu. Również tę operację można wykonać w kilku kolejnych etapach, wychodząc z roztworu początkowego liofilizatu. W tym celu dodaje się środek powodujący nierozpuszczalność (metanol lub etanol) w małych porcjach i otrzymany osad oddziela się po każdym dodaniu. Tak wytworzone osady analizuje się przez chromatografię CLHP. Zależnie od czystości i żądanej wydajności zbiera się właściwe frakcje osadu.
Dla produktów pośrednich o wzorze (II), w których n = 0, 1 lub 2, korzystnie jest wychodzić z mieszaniny (III) otrzymanej przez depolimeryzację enzymatyczną .
Ta depolimeryzacja zachodzi przy użyciu heparynazy 1 (EC 4.2.2.7) w roztworze buforu fosforanowego o pH 7, w obecności chlorku sodu i BSA (albumina z serum bydlęcego), w temperaturze 10-18°C, korzystnie 15°C, w ciągu 8-10 dni, korzystnie 9 dni. Depolimeryzację kończy się np. przez ogrzewanie środowiska reakcyjnego w temperaturze 100°C w ciągu 2 minut i mieszaninę uzyskuje się przez liofilizację. Korzystne jest stosowanie 7UI heparynazy na 25 g heparyny. Roztwór buforu fosforanowego zawiera generalnie 0,05 mola/litr NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7) w obecności 0,1 mola/litr chlorku sodu. Stężenie BSA wynosi generalnie 2%.
Dla produktów pośrednich o wzorze (II), w których n = 0, 1, 2, 3 lub 4, korzystnie jest wychodzić z mieszaniny (III) uzyskanej przez depolimeryzację estru benzylowego heparyny.
Ester benzylowy heparyny można wytworzyć zgodnie z metodami opisanymi w opisach patentowych US 5389618, EP 40144, FR 2548672. Stopień estryfikacji wynosi korzystnie 50-100%. Korzystnie wynosi on 70-90%.
Depolimeryzacja zachodzi w środowisku wodnym, przy użyciu wodorotlenku metalu alkalicznego (np. wodorotlenku litu, wodorotlenku sodu, wodorotlenku potasu lub wodorotlenku cezu) lub czwartorzędowego wodorotlenku amoniowego (np. wodorotlenku tetrabutyloamoniowego), korzystnie o stężeniu molowym 0,1-0,2 mola/litr, w temperaturze 40-80°C w ciągu 5-120 minut. Korzystnie działa się 5-15 minut w temperaturze 60-70°C roztworem zawierającym 0,15 mola/litr wodorotlenku sodu. Reakcję depolimeryzacji zatrzymuje się przez zobojętnienie dodatkiem kwasu, takiego jak kwas octowy. Po dodaniu 10% (ciężar na objętość) octanu sodu mieszaninę oligosacharydów wytrąca się przez dodanie metanolu, korzystnie 2 objętości na 1 objętość środowiska reakcyjnego i odsącza się.
Mieszaninę oligosacharydów otrzymaną po chemicznej depolimeryzacji w postaci wodnego roztworu, wzbogaca się przez ultrafiltrację przez membrany z odpowiednim nominalnym progiem odcięcia (typu Pellicon z celulozy regenerowanej sprzedawane przez Millipore); typ membrany dostosowuje się zależnie od typu odzyskiwanych wzbogaconych oligosacharydów. Dla oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 0, stosuje się membranę z nominalnym progiem odcięcia 1 kDa, dla oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 1, stosuje się membranę 1 kDa lub 3 kDa, dla oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 2, stosuje się membranę 3 kDa, dla oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 3 lub 4, stosuje się membranę 5 kDa. W ciągu tej operacji odzyskuje się tę część roztworu, która przeszła przez membranę, a odrzuca pozostałość. Tak więc frakcja produktu wzbogaconego może stanowić
PL 204 623 B1
10-50% początkowej mieszaniny oligosacharydów, zatrzymując co najmniej 80% żądanego oligosacharydu.
Dla produktów pośrednich o wzorze (II), w których n = 0-6, korzystnie jest wychodzić z mieszaniny (III) uzyskanej przez depolimeryzację estru benzylowego siarczanu polisacharydu półsyntetycznego. Ester benzylowy siarczanu polisacharydu półsyntetycznego wytwarza się z siarczanów polisacharydów półsyntetycznych otrzymanych z polisacharydu K5 i według metod opisanych w opisach patentowych WO 94/29352 i WO 96/14425. Warunki estryfikacji, depolimeryzacji i odzyskiwania są takie same jak opisane poprzednio dla estru benzylowego heparyny.
We wszystkich poprzednich sposobach początkowa heparyna może pochodzić ze świni, owcy, kozy lub bydła i może pochodzić ze śluzu, płuc lub skóry zwierząt. Korzystnie stosuje się heparynę ze śluzu świni, owcy lub płuc wołu, a jeszcze korzystniej ze śluzu świni.
Oligosacharydy o wzorze (I) wykazują właściwości przeciwzapalne i można je więc stosować do zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, wynikającym z produkcji substancji cytotoksycznych, takich jak monotlenek azotu (NO), którego postać indukująca jest uwalniana zwłaszcza przez neutrofile lub makrofagi, gdy one migrują i są aktywowane na poziomie tkanki. Aktywacja, migracja, adhezja i infiltracja neutrofilów zachodzi na poziomie stref tkankowych niedokrwionych podczas niedrożności lub skurczu tętnicy unaczyniającej tę tkankę. Te nie-dokrwienia mogą powstawać albo na poziomie mózgowym (przypadek naczyń mózgowych) albo na poziomie mięśnia sercowego (zawał mięśnia sercowego), lub na poziomie dolnych kończyn (niedokrwienia zwane obwodowymi). Oligosacharydów o wzorze (I) można więc używać do zapobiegania i/lub leczenia chorób neurodegeneratywnych, w których stany zapalne mózgu odgrywają niszczącą rolę, mogącą doprowadzić do śmierci, wśród których można wymienić niedokrwienie mózgu, niedokrwienie serca (zawał mięśnia sercowego), niedokrwienie obwodowe, urazy ośrodkowego układu nerwowego i zwłaszcza urazy czaszki, kręgów, czaszkowo-kręgowe, stwardnienie rozsiane, bóle neuropatyczne i neuropatie obwodowe, choroby motoneuronów, w nich stwardnienie boczne z zanikiem mięśni, neuro-AIDS, chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona i pląsawicę Huntingtona oraz niektóre postacie zapalenia kości i stawów szczególnie z umiejscowieniem w stawach.
Aktywność przeciwzapalną tych produktów ukazano in vivo w teście wytwarzania NOx (azotyn i azotan) wywoł anego przez lipopolisacharyd (LPS), pochodzą cy z E.coli wedł ug protokoł u opisanego przez M.Yamashitę i in., Eur.J. Pharmacol., 338, 2, 151-158(1997) lub J.E.Shellito i in., Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,13,1,45-53(1995). Samcom myszy CD1 (Charles River, 25-35g) wstrzyknięto w T0 dożylnie dawkę 0,5 mg/kg oligosacharydu, w T+15 minut podskórnie 1 lub 2 mg/kg oligosacharydu. W T+30 minut podano 100 mg/kg lipopolisacharydu (LPS) pochodzącego z E.coli (Sigma L3129, serotyp 0127:B8).W T+ 3 godziny wstrzyknięto znów podskórnie 1 lub 2 mg/kg oligosacharydu. W T+5 godzin 30 minut pobrano próbkę krwi przez punkcję oka i okreś lono stężenia NOx (azotyn i azotan) w plazmie metodą kolometryczną Griessa po zredukowaniu azotanu do azotynu przez reduktazę azotanową w sposób następujący: 12 μΐ próbki plazmy zmieszano z 88 μΐ wody zdejonizowanej i inkubowano w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia z 40 μl buforu fosforanowego (0,31 M, pH 7,5), 20 μl β-NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotyno-amidoadeninowego) (0,86 mM), 20 μl FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) (0,11 mM) i 20 μl reduktazy azotanowej (2U/ml) (Boehringer Mannheim). Dodano 10 μ! ZnSO4 (1 M) w celu wtrącenia białek i po wymieszaniu próbki odwirowano przy 20 000 g w ciągu 5 minut. Na koniec 50 μl supernatantu inkubowano 10 minut w temperaturze otoczenia ze 100 μl reagenta Griessa (1% sulfanilamid w 1% mieszaninie kwas fosforowy/naftyloetylenodiamina w wodzie zdejonizowanej (objętościowo). Gęstości optyczne odczytano w 540 nm przy użyciu spektrofotometru z mikropłytkami; każdy punkt określano 2 razy. KNO3 i HaNO2 używano jako wzorzec dla metody kolorymetrycznej.
W tym teście oligosacharydy według wynalazku hamowały ponad 50% tworzenia NOx.
Spośród korzystnych oligosacharydów o wzorze (I) można zwłaszcza wymienić oligosacharydy, w których:
- n jest równe 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu i mieszaninę jego diastereoizomerów
- n jest równe 1, R1, R2, R3, R5, R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu i mieszaninę jego diastereoizomerów
- n jest równe 2, R1, R2, R3, R5, R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu i mieszaninę jego diastereoizomerów
PL 204 623 B1
- n jest równe 2, R1, R2, R3, R6 oznaczają grupę SO3Na, R5 oznacza atom wodoru lub grupę
SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu i mieszaninę jego diastereoizomerów (pochodna 1,6-anhydro Δ^-^-Ι^).
Następujące przykłady są reprezentatywne dla wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I) i produktów pośrednich.
W tych przykładach oznaczenia skrótów są następujące:
AIs: (kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heksenopiranozylouronowy)-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranoza, sól tetrasodowa lub też AUAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S
Is: (kwas 2-sulfo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranoza, sól tetrasodowa lub też a-L-IdoAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S lIs: (kwas a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranoza, sól trisodowa lub też a-L-IdoAp-(1 >4)-a-D-GlcNp2S6S
IIIs: (kwas 2-sulfo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-a-D-glukopiranoza, sól trisodowa lub też a-L-IdoAp2S-(1 >4)-a-D-GlcNp2S
IdoAp: kwas idopiranozylouronowy
GlcNp: 2-deoksy-2-aminoglukopiranoza
ΔUAp: kwas 4-deoksy-a-L-treo-heksenopiranozylouronowy
S: siarczan
Przykłady wytwarzania mieszanin o wzorze (II)
P r z y k ł a d A. Wytwarzanie oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 0, 1 i 2 przez depolimeryzację enzymatyczną i rozdzielanie
Rozpuszczono 25 g heparyny w 250 ml roztworu buforu fosforanowego, zawierającego 0,05 mola/litr NaH2PO4/Na2HPO4 (pH=7), 0,2 mola/litr chlorku sodu i 2% BSA (albumina z surowicy bydlęcej). Do mieszaniny wprowadzono 7UI heparynazy I (EC 4.2.2.2.7, otrzymany roztwór ochłodzono w temperaturze 15°C i potem utrzymywano w tej temperaturze w ciągu całego czasu reakcji depolimeryzacji. Postęp reakcji śledzono, pobierając jednakowe próbki rozłożone w czasie i analizowane przez chromatografię permeacyjną na żelu. Po upływie 9 dni reakcję enzymatyczną zakończono, ogrzewając środowisko reakcyjne w temperaturze 100°C w ciągu 2 minut. Ochłodzoną mieszaninę następnie liofilizowano. Otrzymano tak mieszaninę oligosacharydów (III).
Otrzymaną mieszaninę oligosacharydów (III) potem chromatografowano według następującej metody: chromatografię prowadzono na kolumnach wypełnionych żelem poliakrylamidagaroza znanym pod nazwą Ultrogel ACA 202 i eluowano mieszaninę roztworem zawierającym bufor fosforanowy (0,02 mola/litr NaH2PO4/Na2HPO4) pH = 7 i 0,1 mola/litr chlorku sodu. Detekcję prowadzono na drodze spektrofotometrii UV (254 nm) i jonowej (IBF). Produkty można ewentualnie oczyścić przez chromatografię SAX (strong anion exchange) lub przez frakcjonowane wytrącanie według metody opisanej w opisie patentowym FR 2548672. Frakcje uzyskanego produktu są liofilizowane, potem odsolone na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G10R (Pharmacia Biochemicals).
Tą metodą otrzymano 3 g disacharydu Is, 1100 mg mieszaniny heksasacharydu zawierającej typowo 55% pochodnej Δ^-Is-Is, 35% Δ^-^-^ i 10% Δ^-^-Η^. Tę ostatnią mieszaninę można oczyszczać metodami znanymi fachowcowi w celu rozdzielenia każdego ze składników lub użyć jako taką do przekształcenia w pochodne 1,6-anhydro o wzorze (I). Należy zaznaczyć, że podczas tego przekształcenia heksasacharyd Δ^-^-Ν^ nie może prowadzić do tworzenia związków o wzorze (I).
P r z y k ł a d B. Wytwarzanie oligosacharydów o wzorze (II), w których n = 0, 1, 2, 3 lub 4 przez depolimeryzację estru benzylowego heparyny i rozdzielanie a - Wytwarzanie estru benzylowego heparyny
Ester benzylowy heparyny wytworzono według przykładu 3 opisu patentowego US 5,389,618.
b - Depolimeryzacja
Rozpuszczono 100 g estru benzylowego heparyny w 1,9 litra wody zdemineralizowanej. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przy mieszaniu. Po uzyskaniu homogenicznego roztworu wprowadzono do niego jednorazowo około 35 ml 23% roztworu wodorotlenku sodu. Po 10 minutach reakcji roztwór ochłodzono i zobojętniono 80 ml około 2N roztworu kwasu octowego. Do tego roztworu dodano 10% (ciężar na objętość) octanu sodu. Mieszaninę oligosacharydów wytrącono, dodając około 2 objętości metanolu. Osad oddzielono przez filtrację, przemyto metanolem w dwóch porcjach, potem suszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C. Po wysuszeniu otrzymano 73,8 g mieszaniny oligosacharydów (II).
PL 204 623 B1 c - Wzbogacanie w oligosacharyd, w którym n = 1
Rozpuszczono 30 g mieszaniny oligosacharydów otrzymanej uprzednio w około 35 objętościach wody. Roztwór ten poddano ultrafiltracji przez membranę 3 kDa (Pellicon). Po odebraniu 600 ml roztworu, który przeszedł przez membranę, rozcieńczono pozostałość 500 ml wody. Operację kontynuowano do przejścia dodatkowych 450 ml roztworu, który przeszedł przez membranę. Połączono obie frakcje roztworu, który przeszedł przez membranę, po czym zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 6,1 g żółtawego stałego ciała białego. Analiza ciała stałego przez chromatografię permeacyjno-żelową wykazała, że zawiera ono około 30% oligosacharydu o wzorze (II), w którym n = 1.
d - Frakcjonowanie mieszanin oligosacharydów poddanych ultrafiltracji
Wzbogaconą mieszaninę frakcjonowano na kolumnach wypełnionych żelem poliakrylamid-agaroza znanym pod nazwą Ultrogel ACA 202 (stosowano 4 kolumny szeregowe o średnicy 10 cm i wysokoś ci 50 cm). 5 g mieszaniny wzbogaconej przez ultrafiltrację rozpuszczono w 25 ml wody, potem eluowano roztworem 0,2 mola/litr chlorku sodu z szybkością 5 ml/minutę. Odebrano na dole kolumny frakcje po 25 ml. Detekcję produktów prowadzono na drodze spektrofotometrii UV (254 nm) i jonowej (IBF). Frakcje produktu, w którym n = 1 odzyskano, liofilizowano, potem odsolono na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G10. Po liofizacji otrzymano 1 g tetrasacharydu zawierającego typowo 70% pochodnej Δ^-Is o wzorze (II) (R1, R2, R3, R5, R6 = SO3Na; R4 = H i M = Na). Pochodną Δ^-Is można ewentualnie oczyszczać przez chromatografię SAX (strong anion exchange) lub według korzystnego aspektu przez frakcjonowane wytrącanie zgodnie z metodą opisaną w opisie patentowym FR 2548672.
P r z y k ł a d 1
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 66°C wprowadzono 5 ml roztworu 0,0063 mola/litr wodorotlenku sodu. Wtedy zmierzono pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,35). Przy mieszaniu dodano do niego jednorazowo 30 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznacza grupę SO3Na i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,35, dodając w sposób ciągły roztwór 0,5 mola/litr wodorotlenku sodu. Po 10 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku sodu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Wtedy doprowadzono pH roztworu do 6-7, dodając żywicę Amberlit IR120. Mieszaninę przesączono przez membranę Whatman GF/B, potem zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (2,7 kPa), w temperaturze około 25°C. Do produktu dodano 0,5 ml wody destylowanej, po czym liofilizowano. Otrzymano tak 29 mg mieszaniny diastereoizomerów oligosacharydu o wzorze (I), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu [(kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranozylouronowy-(1 >4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfo-amino-p-D-mannopiranoza, sól trisodowa): Widmo protonowe w D2O, 400 MHz, T=298 K, δ w ppm: 3,15 (1H, s, H2), 3,75(2H, m, H6 i H3), 3,88(1H, m, H4), 4,20(1H, d, J=8Hz, H6) , 4,22(1H, t, J=5Hz, H3'), 4,58(1H, m, H2'), 4,75(1H, m, H5), 5,53 (1H, s, H1), 5,60(1H,dd,J=6 i 1Hz,H1'), 6,03(1 H,d,J=5Hz, H4'); (kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-Ltreo-heks-4-enopiranozylouronowy-(1 >4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-p-D-glukopiranoza, sól trisodowa): Widmo protonowe w D2O, 400 MHz, T=298 K, δ w ppm: 3,34 (1H,dd,J=7 i 2Hz,H2), 3,72(1H,t,J=8Hz,H6), 3,90(1H,m,H3), 4,03(1H,s,H4), 4,20(1H,d,J=8Hz,H6), 4,23(1H,t,J=5Hz,H3'), 4,58(1H,m,H2'), 4,78(1H,m,H5), 5,50 (1H,s,H1), 5,60(1H,dd,J=6 i 1Hz, H1'), 6,03(1H,d,J=5Hz,H4')].
P r z y k ł a d 2
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 62°C, wprowadzono 33,3 ml roztworu 0,0063 mola/litr wodorotlenku sodu. Wtedy zmierzono pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,15). Dodano do niego przy mieszaniu jednorazowo 200 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 1, R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,15, dodając w sposób ciągły roztwór 0,5 mola/litr wodorotlenku sodu. Po 12 godzinach, przerwano dodawanie wodorotlenku sodu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Wtedy pH roztworu doprowadzono do 6-7, dodając żywicę Amberlit IR120. Mieszaninę przesączono przez membranę Whatman GF/B, potem zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (2,7 kPa), w temperaturze około 25°C. Do produktu dodano 3 ml wody destylowanej, po czym liofilizowano. Otrzymano tak 230 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n równa się 1, R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoizomerów [(kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranozylouronowy-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1^-4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-e-D-mannopiranoza, sól
PL 204 623 B1 heptasodowa): Widmo protonowe w D2O, 400 MHz, T=298 K, δ w ppm: 3,15(1H,s,H2), 3,25(1H,m,H2), 3,60(1H,m,H3), między 3,70 i 4,70(14H, masyw, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5',
H4/H5/H6, H2'/H3'), 4,75(1H, m,H5), między 5,20 i 5,40(2H,m,H1' i H1), 5,45(1H, m, H1'), 5,56 (1H,m,H1), 5,94(1H,d,J=5Hz,H4); (kwas 4-deoksy-2-O-sulfo -a-L-treo-heks-4-enopiranozylouronowy(1 >4)-2-deoksy-2-sulfo-amino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4), kwas-2-O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1 >4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-e-D-glukopiranoza sól heptasodowa): Widmo protonowe w D2O, 400 MHz, T-298 K, δ w ppm: 3,25(1H,m,H2), 3,42(1H,dd,J=4 i 1Hz, H2), 3,60(1H,m,H3), między 3,70 i 4,70(14H, masyw, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4/H5/H6, H2'/H3'), 4,75 (1H,m,H5), między 5,20 i 5,40(2H,m,H1' i H1), 5,45(1H,m,H1'), 5,52(1H,m,H1), 5,94(1H,d,J=5Hz, H4)].
P r z y k ł a d 3
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 62°C, wprowadzono 16,7 ml roztworu 0,0063 mola/litr wodorotlenku sodu. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,7). Dodano do niego przy mieszaniu jednorazowo 100 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 2, R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,7, dodając w sposób ciągły roztwór 0,5 mola/litr wodorotlenku sodu. Po 10 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku sodu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Wtedy pH roztworu doprowadzono do 6-7, dodając żywicę Amberlit IR120. Mieszaninę przesączono przez membranę Whatman GF/B, potem zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (2,7 kPa) w temperaturze około 25°C. Do produktu dodano 3 ml wody destylowanej, po czym liofilizowano. Otrzymano tak 108 mg oligosacharydu o wzorze (I), w którym n równa się 2, R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu, w postaci mieszaniny diastereoizomerów. Zauważono A - F cukry konstytutywne heksasacharydów, przy czym A oznacza resztę 1,6-anhydro i F resztę nienasyconego kwasu uronowego.
[(kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranozylouronowy-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-(O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1 >4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-e-D-mannopiranoza, sól undekasodowa): Widmo protonowe w D2O, 600 MHz, T=298 K, δ w ppm: 3,15(1H,s,H2(A)), 3,25(2H,m,H2(C+E)); 3,60(2H,m,H3(C+E)), między 3,65 i 4,50 (19H, masyw, H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/H5(C+E)/-H6(A+C+E)), 4,60(1H,s, H2(F)), 4,80(3H,m,H5(A+B+D), 5,18(1H, s,H1(D)), 5,30(1H,s, H1(B)), 5,34(1H,d,H1(C)), 5,36(1H,d, H1(E)), 5,46(1H,s, H1(F)), 5,57(1H,s,H1(A)), 5,95(1H,d,J=5Hz, H4(F));(kwas 4-deoksy-2-O-sulfo-a-L-treo-heks-4-enopiranozylouronowy-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1 >4)-2-deoksy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glukopiranozylo-(1 >4)-kwas 2-O-sulfo-a-L-idopyranozylouronowy-(1 >4)-1,6-anhydro-2-deoksy-2-sulfoamino-e-D-glukopiranoza, sól undekasodowa): Widmo protonowe w D2O, 600 MHz, T=298 K, δ w ppm: 3,25(2H,m, H2(C+E)) 3,42(1H,m,H2(A)), 3,60(2H,m,H3(C+E)), między 3,65 i 4,50 (19H, masyw, H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/H5(C+E)/H6(A+C+E)), 4,60 (1H,s, H2(F)), 4,80(3H,m, H5(A+B+D), 5,18(1H,s,H1(D)), 5,31 (1H, s,H1(B)), 5,34 (1H, d, H1(C)), 5,36(1H,d, H1(E)), 5,46(1H,s,H1(F)), 5,52(1H,s,H1(A)), 5,95,d,J=5Hz, H4(F))].
P r z y k ł a d 4
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 62°C, wprowadzono 4 ml roztworu 0,0316 mola/litr wodorotlenku sodu. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,8). Dodano do niego jednorazowo przy mieszaniu 100,8 mg mieszaniny oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 2, zawierającej 55% pochodnej Δ^-Is-Is (R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu), 35% Δ^-^-^ (R1, R2, R3, i R6 oznaczają grupę SO3Na, R5 oznacza albo grupę SO3Na lub atom wodoru, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu) i 10% Δ^-^-Η^ (R1, R2, R3, R5 i Rg oznaczają grupę SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu, przy czym grupa SO3M węgla C6 jest zastąpiona przez atom wodoru). Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,8, dodając w sposób ciągły roztwór wodorotlenku sodu o 0,5 mola/litr. Po 11 godzinach, przerwano dodawanie wodorotlenku sodu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Wtedy doprowadzono pH roztworu do 6-7, dodając żywicę Amberlit IR120. Mieszaninę przesączono przez membranę Whatman GF/B, potem zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem (2,7 kPa) w temperaturze około 25°C. Do produktu dodano 1,5 ml wody destylowanej, po czym liofilizowano. Otrzymano tak 110 mg mieszaniny oligosacharydu o wzorze (I), w którym n równa się 2, zawierającej zwłaszcza pochodną 1,6-anhydro Δ^-Is-Is (R1, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę
PL 204 623 B1
SO3Na, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu) i pochodną 1,6-anhydro Δ^-^-Ι^^-ι, R2, R3, R5 i R6 oznaczają grupę SO3Na, R5 oznacza albo grupę SO3Na lub atom wodoru, R4 oznacza atom wodoru i M oznacza atom sodu). Analiza CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa) metodą pary jonowej pozwoliła na śledzenie przekształcenia na pochodne o wzorze (I). W tym wypadku oznaczenie CLHP ukazało, że przekształcenie wykonano dla pochodnych Δ^-Is-Is, Δ^-^-^.
P r z y k ł a d 5
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 66°C, wprowadzono 8,6 ml roztworu wodorotlenku litu o 0,025 mola/litr. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,68). Dodano do niego jednorazowo przy mieszaniu 50 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,68, dodając w sposób ciągły roztwór wodorotlenku litu o 0,466 mola/litr. Po 8 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku litu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Analiza CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa) metodą pary jonowej pozwoliła na śledzenie przekształcenia na pochodną o wzorze (I), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu lub litu. W tym wypadku oznaczenie CLHP ukazało, że przekształcenie wykonano w 100%. Wydajność obliczona przez wzorcowanie zewnętrzne wyniosła 81,2%.
P r z y k ł a d 6
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 66°C, wprowadzono 8,3 ml roztworu wodorotlenku potasu o 0,0063 mola/litr. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 11,1). Dodano do niego jednorazowo przy mieszaniu 50 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 11,1, dodając w sposób ciągły roztwór wodorotlenku potasu o 0,515 mola/litr. Po 24 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku potasu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Analiza CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa) metodą pary jonowej pozwoliła na przeprowadzenie przekształcenia w pochodną o wzorze (I), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu lub potasu. W tym wypadku oznaczenie CLHP pokazało, że przekształcenie wykonano w 100%. Wydajność obliczona przez wzorcowanie zewnętrzne wyniosła 75,6%.
P r z y k ł a d 7
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 66°C, wprowadzono 8,3 ml roztworu wodorotlenku cezu o 0,0063 mola/litr. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH - 10,75). Przy mieszaniu dodano do niego jednorazowo 50 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 10,75, dodając w sposób ciągły roztwór wodorotlenku cezu o 0,476 mola/litr. Po 20 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku cezu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Analiza CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa) metodą pary jonowej pozwoliła na śledzenie przekształcenia na pochodną o wzorze (I), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu lub cezu. W tym wypadku oznaczenie CLHP pokazało, że przekształcenie wykonano w 90,3%. Wydajność obliczona przez wzorcowanie zewnętrzne wyniosła 73%.
P r z y k ł a d 8
Do reaktora utrzymywanego w temperaturze 66°C wprowadzono 8,3 ml roztworu wodorotlenku tetrabutyloamoniowego o 0,0063 mola/litr. Zmierzono wtedy pH roztworu i przyjęto jako wartość docelową (pH = 10,95). Przy mieszaniu dodano do niego jednorazowo 50 mg oligosacharydu o wzorze (II), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu. Wtedy pH wyregulowano i utrzymywano pH 10,95, dodając w sposób ciągły roztwór wodorotlenku tetrabutylooamoniowego o 0,521 mola/litr. Po 16 godzinach przerwano dodawanie wodorotlenku cezu i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 25°C. Analiza CLHP (wysokosprawna chromatografia cieczowa) metodą pary jonowej pozwoliła na śledzenie przekształcenia na pochodną o wzorze (I), w którym n równa się 0, R1 i R6 oznaczają grupę SO3Na i M oznacza atom sodu lub grupę tetrabutylamoniową. W tym wypadku oznaczenie CLHP pokazało, że przekształcenie wykonano w 96,7%. Wydajność obliczona przez wzorcowanie zewnętrzne wyniosła 65%.
Leki według wynalazku zawierają jako substancję aktywną co najmniej jeden oligosacharyd o wzorze (I) lub mieszaninę oligosacharydów o wzorze (I) w postaci kompozycji, w której jest on połączony z każdym innym produktem zgodnym farmaceutycznie, który może być obojętny lub aktywny fizjologicznie. Leki według wynalazku można stosować dożylnie, podskórnie, doustnie, doodbytniczo, miejscowo lub przez wziewanie (inhalacja).
PL 204 623 B1
Kompozycje sterylne do podawania dożylnego lub podskórnego są generalnie roztworami wodnymi. Kompozycje te mogą też zawierać adiuwanty, w szczególności środki zwilżające, izotonizujące, emulgujące, rozpraszające i stabilizatory. Sterylizację można wykonać kilkoma sposobami np. przez filtrację odkażającą, włączając do kompozycji środki sterylizujące, przez napromieniowanie. Można je też wytworzyć w postaci stałych sterylnych kompozycji, które można rozpuścić w momencie użycia w sterylnej wodzie lub każdym innym sterylnym środowisku do wstrzyknięć.
Jako kompozycje stałe do podawania doustnego można stosować tabletki, pigułki, proszki (kapsułki żelatynowe, opłatki) lub granulki. W tych kompozycjach substancja aktywna zostaje zmieszana z jednym lub kilkoma obojętnymi rozcieńczalnikami, takimi jak skrobia, celuloza, sacharoza, laktoza lub krzemionka w strumieniu argonu. Kompozycje te mogą też zawierać substancje inne niż rozcieńczalniki np. jeden lub kilka środków poślizgowych, jak stearynian magnezu lub talk, środek sprzyjający doustnej absorpcji, barwnik, powłokę (drażetki) lub lakier.
Jako kompozycje ciekłe do podawania doustnego można stosować roztwory, zawiesiny, emulsje, syropy i eliksiry dopuszczalne farmaceutycznie, zawierające obojętne rozcieńczalniki, jak woda, etanol, glicerol, oleje roślinne lub olej parafinowy. Kompozycje te mogą zawierać substancje inne niż rozcieńczalniki np. produkty zwilżające, środki słodzące, zagęstniki, środki zapachowe lub stabilizatory.
Kompozycje do podawania doodbytniczego są czopkami lub kapsułkami doodbytniczymi, które zawierają poza substancją czynną zaróbki, jak masło kakaowe, glicerydy półsyntetyczne lub glikole polietylenowe.
Kompozycje do podawania miejscowego mogą być np. kremami, lotionami, płynami do oczu, płynami do ust, kroplami do nosa lub aerozolami.
Dawki zależą od poszukiwanego efektu, okresu leczenia i stosowanej drogi podawania; wynoszą one generalnie 0,5-10 mg na kg dziennie drogą podskórną czyli 3-60 mg dziennie dla dorosłego o ciężarze 60 kg.
Ogólnie biorąc lekarz ustali odpowiednie dawkowanie zależnie od wieku, ciężaru i wszystkich innych czynników właściwych dla leczonego pacjenta.
Wynalazek dotyczy również metody zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, wynikającym z produkcji substancji cytotoksycznnych, takich jak monotlenek azotu (NO). Oligosacharydów o wzorze (I) można więc używać do zapobiegania i/lub leczenia chorób neurodegeneratywnych, w których stany zapalne mózgu odgrywają niszczącą rolę, mogącą doprowadzić do śmierci, wśród których można wymienić niedokrwienie ośrodkowego układu nerwowego, niedokrwienie mózgu, niedokrwienie siatkówki i ślimaka, niedokrwienie serca (zawał mięśnia sercowego), niedokrwienie obwodowe, urazy ośrodkowego układu nerwowego i zwłaszcza urazy czaszki, kręgów, czaszkowo-kręgowe, urazy siatkówki i ślimaka, stwardnienie rozsiane, bóle neuropatyczne i neuropatie obwodowe, choroby motoneuronowe, a w nich stwardnienie boczne z zanikiem mięśni, neuro-AIDS, chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona i pląsawicę Huntingtona oraz niektóre postacie zapalenia kości i stawów szczególnie z umiejscowieniem w stawach.

Claims (15)

1. Oligosacharydy o wzorze:
COOM
ÓR or3
NHR2
COOM
OR5
NHRg (i)
PL 204 623 B1 w którym n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 0 do 6, R1, R2, R3 i R6, oznaczają grupę SO3M, R4 oznacza atom wodoru i R5 oznacza atom wodoru lub grupę SO3M i M oznacza atom sodu, wapnia, magnezu lub potasu, mieszanina tych oligosacharydów i ich diastereoizomerów.
2. Oligosacharydy o wzorze (I) według zastrz. 1, w których n jest równe 0 i M oznacza atom sodu, i mieszanina ich diastereoizomerów.
3. Oligosacharydy o wzorze (I) według zastrz. 1, w których n oznacza 1, R5 oznacza grupę SO3M i M oznacza atom sodu, i mieszanina ich diastereoizomerów.
4. Oligosacharydy o wzorze (I) według zastrz. 1, w których n oznacza 2, R5 oznacza grupę SO3M i M oznacza atom sodu, i mieszanina ich diastereoizomerów.
5. Oligosacharydy o wzorze (I) według zastrz. 1, w których n oznacza 2, i M oznacza atom sodu, i mieszanina ich diastereoizomerów.
6. Sposób wytwarzania oligosacharydów o wzorze (I) według zastrz. 1, znamienny tym, że działa się wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub czwartorzędowym wodorotlenkiem amoniowym na oligosacharydy o wzorze:
w którym n oznacza liczbę całkowitą 0-6, R1, R2, R3, R6 i oznaczają grupę SO3M, R4 oznacza atom wodoru i R5 oznacza atom wodoru lub grupę SO3M i M oznacza atom sodu, wapnia, magnezu lub potasu, lub ich mieszaninę i wyodrębnia się oligosacharydy albo ich mieszaniny.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że prowadzi się reakcję w środowisku wodnym w temperaturze 40-80°C przy pH 10-13.
8. Sposób według jednego z zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się 1-5% roztwór wodny wodorotlenku metalu alkalicznego lub czwartorzędowego wodorotlenku amoniowego.
9. Sposób według jednego z zastrz. 6-8, znamienny tym, że prowadzi się reakcję w temperaturze 60-70°C.
10. Sposób według jednego z zastrz. 6-9, znamienny tym, że stosuje się pH reakcji 11-12,5.
11. Sposób według zastrz. 6-10, znamienny tym, że stosuje się wodorotlenek metalu alkalicznego lub czwartorzędowy wodorotlenek amoniowy, będący wodorotlenkiem sodu, wodorotlenkiem potasu, wodorotlenkiem litu, wodorotlenkiem cezu lub wodorotlenkiem tetrabutyloamoniowym.
12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako substancję aktywną co najmniej jeden oligosacharyd określony w zastrz. 1.
13. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako substancję aktywną co najmniej jeden oligosacharyd określony w zastrz. 1-5.
14. Zastosowanie oligosacharydów o wzorze (I) określonym w zaostrz. 1-5 do wytwarzania leku przydatnego do zapobiegania lub leczenia chorób związanych z procesem zapalnym, wynikającym z produkcji tlenku azotu (NO).
15. Zastosowanie oligosacharydów o wzorze (I) według zastrz. 14 do wytwarzania leków przydatnych do zapobiegania lub leczenia niedokrwienia mózgu, niedokrwienia serca lub naczyń obwodowych, zapalenia kości i stawów, urazów ośrodkowego układu nerwowego, urazów czaszki, kręgów, czaszkowo-kręgowych, stwardnienia rozsianego, bólów neuropatycznych i neuropatii obwodowych, chorób motoneuronowych, stwardnienia bocznego z zanikiem mięśni, neuro-AIDS, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i pląsawicy Huntingtona.
PL363052A 1999-10-22 2000-10-18 Oligosacharydy, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz ich zastosowanie PL204623B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9913182A FR2800074B1 (fr) 1999-10-22 1999-10-22 Nouveaux oligosaccharides, leur preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant
PCT/FR2000/002897 WO2001029055A2 (fr) 1999-10-22 2000-10-18 Nouveaux oligosaccharides, leur preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL363052A1 PL363052A1 (pl) 2004-11-15
PL204623B1 true PL204623B1 (pl) 2010-01-29

Family

ID=9551218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL363052A PL204623B1 (pl) 1999-10-22 2000-10-18 Oligosacharydy, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz ich zastosowanie

Country Status (30)

Country Link
EP (1) EP1226148B1 (pl)
JP (1) JP4733329B2 (pl)
KR (2) KR100872215B1 (pl)
CN (1) CN1241932C (pl)
AT (1) ATE534656T1 (pl)
AU (1) AU781414B2 (pl)
BR (1) BR0014939A (pl)
CA (1) CA2388369C (pl)
CY (1) CY1112274T1 (pl)
CZ (1) CZ303255B6 (pl)
DK (1) DK1226148T3 (pl)
EA (1) EA004046B1 (pl)
EE (1) EE05091B1 (pl)
ES (1) ES2376409T3 (pl)
FR (1) FR2800074B1 (pl)
HR (1) HRP20020330A2 (pl)
HU (1) HU229385B1 (pl)
IL (2) IL149154A0 (pl)
ME (1) MEP9309A (pl)
MX (1) MXPA02003945A (pl)
NO (1) NO323409B1 (pl)
NZ (1) NZ518539A (pl)
PL (1) PL204623B1 (pl)
PT (1) PT1226148E (pl)
RS (1) RS50829B (pl)
SK (1) SK287459B6 (pl)
TR (1) TR200201102T2 (pl)
UA (1) UA72545C2 (pl)
WO (1) WO2001029055A2 (pl)
ZA (1) ZA200203102B (pl)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4676048B2 (ja) * 2000-07-10 2011-04-27 生化学工業株式会社 脱髄性疾患処置剤
DE50105650D1 (de) * 2000-12-16 2005-04-21 Aventis Pharma Gmbh Verwendung von niedermolekularen heparin zur behandlung von osteoarthrose
DE10121003A1 (de) 2001-04-28 2002-12-19 Aventis Pharma Gmbh Anthranilsäureamide, Verfahren zur Herstellung, ihrer Verwendung als Medikament sowie sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen
US7575886B2 (en) 2002-03-11 2009-08-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Analysis of sulfated polysaccharides
FR2844808B1 (fr) * 2002-09-23 2005-02-25 Aventis Pharma Sa Methode de determination de groupements specifiques constituant les heparines ou les heparines de bas poids moleculaire
US20040171819A1 (en) 2002-10-10 2004-09-02 Aventis Pharma S.A. Mixtures of polysaccharides derived from heparin, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7511026B2 (en) * 2003-03-25 2009-03-31 Seikagaku Corporation Therapeutic agent for nerve damage
FR2857971B1 (fr) * 2003-07-24 2005-08-26 Aventis Pharma Sa Melanges d'oligosaccharides derives d'heparine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant
US7956046B2 (en) * 2003-07-24 2011-06-07 Aventis Pharma S.A. Oligosaccharide mixtures derived from heparin, preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them
US20050186679A1 (en) * 2004-02-24 2005-08-25 Christian Viskov Method for determining specific groups constituting heparins or low molecular weight heparins
EP1580197A1 (en) * 2004-03-24 2005-09-28 Aventis Pharma S.A. Method for quantitatively determining specific groups constituting heparins or low molecular wieght heparins using HPLC
EP1582531A1 (en) 2004-03-24 2005-10-05 Aventis Pharma S.A. Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products
DE102005017799A1 (de) * 2005-04-18 2006-10-19 Abbott Gmbh & Co. Kg Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Neuritenwachstum-kontrollierenden Nogo-Rezeptors
US8101733B1 (en) 2006-06-27 2012-01-24 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of evaluating mixtures of polysaccharides
US7790466B1 (en) 2007-01-26 2010-09-07 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by chain profiles or chain mapping
US7968082B1 (en) 2007-01-26 2011-06-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by NMR
US9139876B1 (en) 2007-05-03 2015-09-22 Momenta Pharmacueticals, Inc. Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin
EP2256138A1 (en) 2009-05-05 2010-12-01 Sanofi-Aventis Novel acylated 1,6-anhhydro decasaccharide and its use as antithrombotic agent
FR2949115B1 (fr) * 2009-08-14 2012-11-02 Sanofi Aventis OLIGOSACCHARIDES N-SULFATES ACTIVATEURS DES RECEPTEURS DES FGFs, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
FR2949114B1 (fr) * 2009-08-14 2011-08-26 Sanofi Aventis OCTASACCHARIDES N-ACYLES ACTIVATEURS DES RECEPTEURS DES FGFs, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
CN102791742B (zh) 2010-01-19 2014-12-24 动量制药公司 评价肝素制剂
WO2012115952A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
CN102864191A (zh) * 2011-12-16 2013-01-09 深圳市海普瑞药业股份有限公司 肝素双糖混合物及其制备方法和应用
CN104910217B (zh) * 2015-06-19 2018-04-17 天津红日药业股份有限公司 用于磺达肝癸钠质量控制的参比化合物
CZ308106B6 (cs) * 2016-06-27 2020-01-08 Contipro A.S. Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
CN110092848A (zh) * 2019-05-14 2019-08-06 山东辰龙药业有限公司 一种贝米肝素钠的制备方法
CN119708089A (zh) * 2023-09-27 2025-03-28 南开大学 一种磺酸化三糖及其制备方法和治疗应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2519987A1 (fr) * 1982-01-15 1983-07-22 Choay Sa Trisaccharides a structures d-glucosamine, acide d-glucuronique, d-glucosamine et leur preparation
AU563351C (en) * 1982-01-15 2003-06-19 Glaxo Group Limited Synthesis of oligosaccharides
FR2764511B1 (fr) * 1997-06-13 2000-09-08 Sanofi Sa Compositions pour le traitement et la prevention de la thrombose arterielle et utilisation d'un inhibiteur du facteur xa seul et/ou en combinaison avec un antiagregant plaquettaire
JP4166851B2 (ja) * 1997-09-29 2008-10-15 生化学工業株式会社 新規虚血・再灌流障害抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
FR2800074A1 (fr) 2001-04-27
CN1379781A (zh) 2002-11-13
CA2388369C (fr) 2011-02-01
PL363052A1 (pl) 2004-11-15
WO2001029055A3 (fr) 2002-02-14
CY1112274T1 (el) 2015-12-09
MXPA02003945A (es) 2002-10-23
KR100778166B1 (ko) 2007-11-27
NO20021859L (no) 2002-06-13
SK5272002A3 (en) 2002-08-06
SK287459B6 (sk) 2010-10-07
HRP20020330B1 (pl) 2013-01-31
IL149154A (en) 2008-04-13
IL149154A0 (en) 2002-11-10
BR0014939A (pt) 2002-06-18
DK1226148T3 (da) 2012-03-19
MEP9309A (en) 2011-12-20
ES2376409T3 (es) 2012-03-13
NO20021859D0 (no) 2002-04-19
CZ303255B6 (cs) 2012-06-27
EA004046B1 (ru) 2003-12-25
CZ20021385A3 (cs) 2002-07-17
HUP0203821A2 (hu) 2003-04-28
JP4733329B2 (ja) 2011-07-27
AU7930200A (en) 2001-04-30
ZA200203102B (en) 2003-09-23
EE200200208A (et) 2003-06-16
TR200201102T2 (tr) 2002-12-23
EA200200479A1 (ru) 2002-10-31
HU229385B1 (en) 2013-11-28
RS50829B (sr) 2010-08-31
KR100872215B1 (ko) 2008-12-05
CA2388369A1 (fr) 2001-04-26
NO323409B1 (no) 2007-04-30
HUP0203821A3 (en) 2003-10-28
EE05091B1 (et) 2008-10-15
FR2800074B1 (fr) 2001-12-21
KR20070087263A (ko) 2007-08-27
NZ518539A (en) 2004-10-29
PT1226148E (pt) 2012-01-24
KR20020063881A (ko) 2002-08-05
HRP20020330A2 (en) 2004-04-30
EP1226148B1 (fr) 2011-11-23
YU29802A (sh) 2006-01-16
CN1241932C (zh) 2006-02-15
UA72545C2 (uk) 2005-03-15
WO2001029055A2 (fr) 2001-04-26
JP2003512385A (ja) 2003-04-02
AU781414B2 (en) 2005-05-19
ATE534656T1 (de) 2011-12-15
HK1050535A1 (en) 2003-06-27
EP1226148A2 (fr) 2002-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL204623B1 (pl) Oligosacharydy, sposób ich wytwarzania, kompozycje farmaceutyczne zawierające je oraz ich zastosowanie
HUP0203021A2 (hu) Eljárás reakciókésleltetett poliuretán-keményhabanyagok előállítására
US6617316B1 (en) Oligosaccharides, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6608042B2 (en) Pharmaceutical compositions containing oligosaccharides, the novel oligosaccharides and preparation thereof
AU782713B2 (en) Pharmaceutical compositions containing oligosaccharides and preparation thereof
JPH08217785A (ja) 硫酸化フルオロアルキルラミナリペンタオシド及びそれを有効成分とする抗ウイルス剤
HK1056564B (en) Pharmaceutical compositions containing oligosaccharides and preparation thereof
KR20050024339A (ko) 엔-아실-(에피)케이5-아민-오-황산염-유도체 생산방법 및그 생성물
KR20050024349A (ko) 매우 높은 황산화도를 가진 케이5 폴리사카라이드의에피머화된 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20141018