RS50743B

RS50743B - Proizvodnja rekombinantnih faktora koagulacije krvi u humanim ćelijama

Info

Publication number: RS50743B
Application number: YUP-710/02A
Authority: RS
Inventors: Charlotte Hauser; Andrea Hörster; Carola Schröder; Michael Lehnerer
Original assignee: OCTAPHARMA BIOPHARMACEUTICALS GmbH.
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2010-08-31
Also published as: US20040023333A1; NO20024475L; HRP20020767B1; HUP0300588A3; EA200201008A1; BE2014C077I2; US7572619B2; IL151857A; AU5471501A; YU71002A; BG65930B1; CZ20023166A3; KR20030011079A; BG107152A; NO330910B1; NZ521732A; HUP0300588A2; DK1266006T3; EP1460131A2; HU228091B1

Abstract

Faktor VIII mutein, naznačen time, stoje u njemu B-domen između pozicija Arg740 i Glu1649 zamenjen Arg-bogatim linker peptidom koji ima bar 3 Arg ostatka i sadrži 10 do 25 ostataka amino kiselina, pri čemu je numeracija kod pomenutog faktora VIII u odnosu na sekvencu zrelog faktora VIII divljeg tipa dat u SEQ ID N0:2.Prijava sadrži još 6 zavisnih i 13 nezavisnih patentnih zahteva.

Description

Uvod

Priloženi pronalazak se odnosi na poboljšani način proizvodnje rekombinantnih humanih faktora koagulacije krvi, naročito faktora VIII i faktora IX, korišćenjem imortalizovanih humanih ćelijskih linija sa stabilnom ekspresijom proteina aktivatora viralne transkripcije i koje nose vektor koji ima promoter funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktor koagulacije krvi, ukoliko pomenuti promoter nije viralni promoter koji se stimuliše pomenutim proteinima aktivatorima viralne transkripcije; imortalizovane humane ćelijske linije koje nose pomenuti vektor; faktor VIII muteina koji je naročito pogodan za pomenuti način proizvodnje; farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata takve faktore VIII muteina i korišćenje takvih faktora VIII muteina za pripremanje medikamenata za tretiranje hemofilije.

Stanje tehnike

Hemofiličari pate od hemoragičnog morbiditeta koji je uzrokovan poremećenom funkcijom proteinskih komponenata u kaskadi koagulacije krvi. U zavisnosti od pogođenog faktora zgrušavanja mogu se razlikovati dve vrste hemofilije. Kod obe je zajedničko sprečavanje pretvaranja rastvorljivogbrinogenau nerastvorljivifibrin- ugrušak.One su recesivne X-hromozomski povezane genetičke bolesti koje pogađaju uglavnom muški deo populacije.

Hemofilija A zahvata 1-2 osobe u 10.000 muškaraca. Uzrokovana je manjkom ili potpunim odsustvom faktora VIII, vrlo velikim glikoproteinom (oko 330 kDa (Furie, B., Furie B.C.,Celf(1988) 53, 505-518)), koji predstavlja važan element u kaskadi koagulacije krvi. Polipeptidna sekvenca može se podeliti na tri regiona, N-terminalni region sačinjen od takozvanih A1 i A2 domena, centralnog B-domen regiona i C-terminalnog regiona sačinjenog od A3, C1 i C2 domena. U koagulaciji krvi faktor VIII se pojavljuje kao inaktivni prekursor. On je čvrsto i ne-kovalentnim vezama povezan sa von VVillebrand Faktorom (vWF), koji ima ulogu stabilizirajućeg nosača proteina. Proteolitično cepanje faktora VIII trombinom na tri specifična mesta (740, 372, 1689) vodi do njegovog odvajanja od vWF i oslobađa se prokoagulantna funkcija unutar kaskade. U svojoj aktivnoj formi faktor VIII funkcioniše kao kofaktor za faktor IXa, na taj način ubrzavajući proteolitičku aktivaciju faktora X u nekoliko dimenzija. Hemofilija B se pojavljuje kod oko 1 u 25,000 muškaraca. Ona se karakteriše nedostatkom faktora IX serin proteaze (Božični, Christmas faktor). Ovaj 415 aminokiselinski polipeptid sintetiše se u jetri kao 56 kDA glikoprotein. U cilju održavanja njegove prave fukcije potreban korak je posttranslaciona karboksilacija koja se pojavljuje samo u prisustvu vitamina K.

Tretiranje oba tipa poremećaja krvarenja tradicionalno uključuje infuziju humanog, dobijenog iz plazme, proteina, koncentrata faktora VIII ili faktora IX. Mada ovaj način predstavlja efikasnu terapiju za hemofiličare on nosi rizik prenošenja različitih agenasa infekcije, kao što su virusi koji uzrokuju hepatitis ili SIDA-u, ili faktore tromboembolije. Alternativno je opisano nekoliko tehnika rekombinantne DNK za proizvodnju faktora koagulacije. U tu svrhu izolovane su odgovarajuće cDNK divljeg tipa faktora VIII i faktora IX i klonirane u pogodne vektore ekspresije (EP-A-160457; WO-A-86/01961, U.S. Patenti 4,770,999, 5,521,070 i 5,521,070).

U slučaju faktora VIII rekombinantna ekspresija subjedinica za proizvodnju kompleksa koji pokazuju koagulantnu aktivnost poznata je u struci ( npr., iz EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, VVO-91/07490, WO-95/13300 U.S. Patenti 5,045,455 i 5,789,203). Štaviše, opisana je ekspresija nepotpunih cDNK-verzija u kojima delimično ili potpuno izostaje sekvenca koja kodira visoko glikozilovani B-domen (npr., u VVO-86/06101, VVO-87/04187, VVO-88/00381,

EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, U.S. Patenti 4,868,112 i 4,980,456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 i VVO-91/09112). Nedavno su uvedene odabrane tačkaste mutacije koje inhibiraju proteolitičku inaktivaciju faktora VIII aktiviranim proteinom C ili redukuju imunogenost koja dovodi do formiranja inhibitornih antitela kod tretiranih pacijenata (npr., U.S. Patenti 5,859,204, 5,422,260 i 5,451,521, WO-97/49725 i VVO-99/29848).

Rekombinantni faktori koagulacije obično su izolovani iz medijuma stabilno transficiranih eukariotskih i poželjno ćelijskih linija sisara. Bilo je međutim uobičajeno da se upotrebljavaju ne-humane ćelijske linije u načinima proizvodnje što je prikazano u referencama koje su ranije ovde pomenute u cilju isključenja rizika kopurifikacije nekih činilaca infekcija koji se mogu skloniti i ekspresovati u humanim ćelijama.

Ipak, naročito za faktor VIII, korišćenje ne-humanih ćelijskih linija nailazi na pojedine nedostatke. Na primer, objavljen je nezadovoljavajući nivo sekrecije ekspresiranog proteina u medijum. Ovo se može desiti zbog neznatnih promena u okviru različitih tipova sisarskih ćelija što se tiče intraćelijskih puteva za translaciju i modifikaciju proteina, što takođe može imati efekat na biološku aktivnost ekspresiranog proteina. S druge strane, postojala je zabrinutost da su terapijski proteini pročišćeni iz ne-humanih ekspresionih sistema zaraženi sa ćelijskim komponentama koje mogu izazvati antigenske reakcije kod pacijenta.

Štaviše, proteini koji se ekspresiraju u ne-humanim ekspresionim sistemima mogu imati ne-humane glikozirajuće modele koji mogu dovesti do antigenih reakcija kod pacijenata. Ipak, biološka stabilnost i efikasnost faktora zgrušavanja veoma mnogo je pod uticajem njihovih N-glikozilatnih modela. Naročito su važni periferni i terminalni monosaharidi, zato što se detektuju specifičnim receptorima iz ćelija koje su odgovorne za njihovu degradaciju. Faktori zgrušavanja nose kao terminalne monosaharide ostatke sialične kiseline. Promene u sastavu sialične kiseline u antenama glikoproteina kao na primer faktora zgrušavanja mogu rezultirati u

heterogenim glikozilatnim modelima. Tako, biološka stabilnost i efikasnost su krucijalno uključeni kada se pojavi modifikacija. Stoga, vrlo je važno u proizvodnji rekombinantnih faktora zgrušavanja proceniti uticaj glikozilacije iz ne-humanih ćelijskih linija nasuprot humanim ćelijskim linijama. Uopšteno govoreći, izgleda prihvatljivo da su humane ćelijske linije više kvalifikovane za proizvodnju rekombinantnih faktora zgrušavanja od ne-humanih. Razlog ove predpostavke je da verovatno neki strani oligosaharid neće biti inkorporisan u oligosaharidnu polovinu za vreme sinteze rekombinantnih faktora.

S druge strane, opšti načini za visok nivo ekspresije proteina željenog gena uključuju imortalizovane, stabilno transficirane ćelijske linije sisara koje ekspresuju proteine aktivatore viralne transkripcije već su neko vreme dostupni (npr., U.S. Patent 5,712,119). Nadalje, ove ćelijske linije su transformisane vektorskim konstruktom u kome je pogodan promotor viralne transkripcije u operativnoj vezi sa DNK sekvencom koja definiše određeni gen, proteini aktivatori transkripcije aktiviraju promotor viralne transkripcije i na taj način iniciraju ekspresiju određenog gena. Ponovo, postojala je zabrinutost da proteini aktivatori transkripcije ekspresovani u ovim ćelijskim linijama mogu dovesti do kontaminacije ciljnog terapeutskog proteina.

U svetlu svega predhodnog, još uvek postoji potreba za efektivnim načinom proizvodnje humanih faktora zgrušavanja krvi.

Iznenađujuće je da je pronađeno da se ne-kontaminirani faktori zgrušavanja krvi mogu dobiti sa gorepomenutim dugoživućim humanim ćelijskim linijama. Naročito, dugoživuće ćelijske linije - ukoliko nose vektor koji ima promotor koji je funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktore zgrušavanja i uprkos činjenici da promotor nije viralni promotor koji je stimulisan pomenutim proteinima aktivatorima transkripcije - sposobne su za ekspresiju faktora zgrušavanja krvi. U kombinaciji sa pogodnim protokolima za prečišćavanje proteina i inaktivaciju virusa ovaj način predstavlja efektni sistem za proizvodnju bezbednih i visoko aktivnih rekombinantnih faktora zgrušavanja krvi u terapijske svrhe kod ljudi. Štaviše, nađeno je da su naročito faktor VIII muteini specijalno stabilni na proteolitičku inaktivaciju i to omogućuje da budu podvrgnuti strogim protokolima inaktivacije virusa.

Opispronalaska

Priloženi pronalazak daje

(1) način proizvodnje rekombinantnih humanih faktora zgrušavanja krvi

koji obuhavata

(a) kultivaciju dugoživućih humanih ćelijskih linija koje stabilno ekspresuju najmanje jedan protein aktivator viralne transkripcije i nose vektor koji ima promotor funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktor zgrušavanja humane krvi, ukoliko pomenuti promotor nije viralni promotor koji se stimuliše pomenutim najmanje jednim proteinom aktivatorom viralne transkripcije, i (b) isolaciju faktora zgrušavanja krvi iz kulture; (2) preferencijalnu realizaciju načina definisanog pod (1) iznad, gde je faktor zgrušavanja ljudske krvi faktor VIII ili njegov mutein; (3) preferencijalnu realizaciju načina definisanog pod (2) iznad, gde je

faktor VIII mutein sa najmanje jednom od sledećih mutacija:

(a) Val na mestu 162 zamenjen je drugim neutralnim amino kiselinskim ostatkom, (b) Ser na mestu 2011 zamenjen je drugim hidrofilnim aminokiselinskim

ostatkom,

(c) Val na mestu 2223 zamenjen je acidnim aminokiselinskim ostatkom,

i

(d) B-domen između mesta Arg740 i Glu1649 zamenjen je Arg bogatim vezujućim peptidom koji obuhvata 10 do 25, preferencijalno 14 do 20 aminokiselinskih ostataka, dok je numercija pomenutog faktora

VIII relativna u odnosu na sekvencu zrelog divljeg tipa faktora Vili

koja je prikazana na SEQ ID NO: 2;

(4) preferencijalnu realizaciju načina definisanog pod (1) gore, gde je faktor zgrušavanja ljudske krvi faktor IX ili njegov mutant; (5) dugoživuće linije humanih ćelija koje nose vektor koji kodira faktore zgrušavanja ljudske krvi kao što je već definisano u (1) i (4) gore; (6) faktor VIII mutein kako je definisan pod (3) gore; (7) DNK sekvencu koja kodira faktor VIII mutein kao što je definisano pod (6) gore; (8) Vektor koji obuhvata DNK kao što je definisano pod (7) gore; (9) Vektor definisan pod (8) gore što je vektor transfera gena; (10) Ćeliju koja je transformisama sa vektorom kao što je definisano pod (8) gore i/ili obuhvata DNK sekvencu koja je definisana pod (7); (11) Farmakološki sastav uglavnom of faktora VIII muteina kao što je definisano pod (6) gore ili vektora transfera gena kao što je definisano pod (9) gore; (12) Korišćenje faktora VIII muteina kao što je definisano u (6) gore ili vektora transfera gena kao što je definisano pod (9) gore za pripremanje lekova za tretman hemofilije; i (13) Način za tretman hemofilije koji obuhvata administraciju humnog hemofilijskog faktora VIII muteina kao što j definisano pod (6) gore ili vektorom transfera gena kao što je opisano pod (9) gore.

Opis slika

SI. 1. prikazuje fragmente korišćene za konstrukciju faktora VIII sa izbrisanim B-domenom (Primer 1).

SI. 2. prikazuje vektor pTGF8-1 8720 bp cirkularnu DNK, potpuno ista DNK sekvenca tako je data u SEK ID BR: 3 (za faktor VIII protein kodiran navedenom DNK sekvencom pogledati SEK ID BR: 4).

SI. 3A-opisuje preferencijalnu povezujuću sekvencu priloženog pronalaska

(SEKID BR: 9).

SI. 3b. prikazuje vreme koagulacije rekombinantne hFVIII kao što je utvrđeno u Primeru 6.

SI. 4. prikazuje uobičajenu molekulsku strukturu pTGF8-2hyg-s i pTGF8-3, 10698 bp cirkularnu DNK, potpuno ista DNK sekvenca tako je data u SEK ID BR: 12 i 14 (za faktor VIII protein kodiran pomenutom DNK sekvencom vidi SEK ID BR: 13 i 15 )

SI. 5 A. Prikazuje krivu kalibracije FVIII ELISA testa sto je opisano u Primeru 4.

SI. 5 B. opisuje rezultate određivanja koncentracije rekombinanta FVIII u filtratima različitih kultura kao što je opisano u Primeru 4.

SI. 6. prikazuje rezultate specifičnog imunofluorescentnog ogleda faktora VIII kao što je opisano u Primeru 8. Gornji red: 293T ćelije trajni prenosioci pTGF8-3, KLONA 49/19. Donji red: Negativna kontrola: ćelije koje ne prenose 293T. A i C: belo svetio, bez filtera; B i D: detekcija faktora VIII fluorescencijom, filter 550 nm.

Detaljan Opis Pronalaska

"Funkcionalno povezani" odnosi se na konfiguraciju vektora u kojoj je promotor lociran u vektoru takoda može da stimuliše transkripciju DNK sekvence koja kodira faktor zgrušavanja ljudske krvi. 'Ne funkcionalno povezani' odnosi se na konfiguraciju gde je promotor tako udaljen od sekvence ekspresovanog gena faktora zgrušavanja krvi da on ne može da stimuliše njegovu transkripciju.

"Gen" se odnosi na DNK sekvencu koja kodira polipeptid koji neobavezno može da uključi vodeće i prateće sekvence i introne i egzone.

"Vektor" se odnosi na bilo koji genetički konstrukt, kao što je plazmid, fag, kozmid, itd., koji je sposoban za replikaciju kada se poveže sa određenim kontrolnim elementima. Ovaj termin uključuje i kloniranje i ekspresione prenosioce. "Nosači vektora" označava obe, stabilne i privremene inkorporacije funkcionalnih DNK segmenata u ćeliju domaćina. Preferišu se , naravno, stabilne inkorporacije.

"Vektor genskog transfera" u saglasnosti sa priloženim pronalaskom uključuje vektor pogodan za gensku terapiju. Ovakav vektor obuhvata funkcionalne sekvence za željenu svrhu što je poznato u praksi.

Termin "zreo" odnosi se na molekularnu strukturu datog proteina odmah posle njegove ćelijske sekrecije (npr., bez njegovog N-terminalnog polipeptida koji je signal za eksport).

"Promoter" se odnosi na region regulatornih sekvenci DNK za kontrolu transkripcije gena na koju se vezuju RNK polimeraze.

"Terapeutski efektna doza" farmakološkog sastava pronalaska odnosi se na dozu koja je efektna u tretmanu profilakse, na primer, doza koja doprinosi efektnom tretmanu ili redukciji simptoma hemofilije. Određivanje terapijski efektne doze je područje rada stručnih lica.

"Kodirati" ili "kodirajući" odnosi se na svojstvo sekvence nukleinske kiseline koja se transkribuje (u slučaju DNK) ili translatuje (u slučaju mRNK) u polipeptidin vitroiliin vivokada se nalazi pod kontrolom određene regulatorne sekvence.

Za svrhu ove aplikacije "ekspresija", "ekspresovanje" ili "izražavanje" odnosi se na transkripciju i translaciju gena koji kodira protein.

Priloženi pronalazak kao što je opisano ranije od (1) do (13) je nadalje opisan detaljnije. U saglasnosti sa realizacijom (1) pronalaska priložene aplikacije promotor funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktor zgrušavanja ljudske krvi nije virusni promotor koji je stimulisan najmanje jednim proteinom aktivatorom viralne transkripcije ekspresovanom u linijama imortalizovanih humanih ćelija.

Imortalizovane humane ćelije preferencijalno su imortalizovane ćelije bubrega, bešike, jetre, pluća, srčanug mišića, glatkih mišića, jajnika ili gastrointestinalne ćelije. Najpoželjnije je da su imortalizovane humane ćelije poreklom od humanih embrionalnih bubrežnih ćelija, a najbolje od ćelijske linije 293 T (ECACC: tsa201, ref. 96121229; DSM ACC2494).

Najmanje jedan protein aktivator transkripcije ekspresovan u imortalizovanim ćelijskim linijama ima Simian virus T antigen, adenovirus E1A ili E1B proteine, protein kodiran početnim regionom DNK sekvence goveđeg papiloma virusa i i herpes virus IE proteina. Bolje je ako dugoživuće ćelije ekspresuju najmanje dva proteina aktivatora viralne transkripcije, npr., osetljiv na temperaturu SV40 T antigen i adenovirus E1A protein (kao što je pomenuta ćelijska linija 293 T).

Promotor funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktor zgrušavanja ljudske krvi poželjo je da uključuje (i) viralne promotore koji nisu stimulisani aktivatorskim proteinom koji ima ekspresiju u imortalizovanim ćelijama kao što je definisano ranije (kao što su SV40 i CMV);

(ii) promotere domaćine (albumin)

(iii) tkivno specifične promotere (kao što je a-antitripsin za jetru).

Najbolji promotor u saglasnosti sa pronalaskom je CMV promoter (sve dok protein transkripcioni aktivator koji ima ekspresiju u imortalizovanim ćelijama nije stimulisan rečenim promotorom).

U saglasnosti sa pronalaskom vektor može da nosi još viralnih promotera koji se stimulišu pomenutim aktivatorskim proteinima viralne transkripcje, ali koji nisu funkcionalno povezani sa faktorom zgrušavanja krvi. Ovakvi viralni promotori izdvojeni su od promotera koji vode poreklo od adenovirusa, rous sarkoma virusa i citomegalovirusa. Vektor još može da ima jednu ili više sledećih funkcionalnih sekvenci: selekcionih markera, regulatornih sekvenci (npr. PRE), itd.

Faktor koagulacije ljudske krvi u skladu sa realizacijom (1) ovog pronalaska uključuje, ali nije limitiran na, faktor IX, faktor VIII, faktor VII, faktor V, von Willebrand-ov faktor (vWF) i slično.

U pretpostavljenoj realizaciji (2) ovog pronalaska, vektor obuhvata DNK sekvencu koja kodira faktor VIII ili takav mutein. Pošto je rekombinantni faktor IX uglavnom po strukturi identičan proteinu divljeg tipa izolovanom iz krvne plazme, napravljeno je nekoliko modifikovanih ekspresionih konstrukata faktora VIII za rekombinantnu ekspresiju. Uzimajući u obzir strukturu domena funkcionalnog polipeptida faktora VIII, značajna mesta za interakciju sa vWF su locirana u A3 domenu (amino kiseline 1680-1689) i u domenu C2 (Kaufman & Pipe,Haemophilia(1998) 4, 370-379). Cepanje posle 1689 predloženo je da bi se oslobodio faktor VIII od vWF i omogućilo faktoru VIII da reaguje sa naelektrisanim fosfolipidima. Pokazano je da su rekombinantni konstrukti faktora VIII bez mesta za vezivanja vWF naročito podložni proteolitičkom razlaganju kada se unesu u miša koji je deficijentan u faktoru VIII. Rekombinantna ekspresija skraćenih konstrukata faktora VIII u ćelijskim kulturama sisara pokazala je da potpuna delecija B-domena ne menja biološku aktivnost odgovarajućeg proteina sličnog faktoru VIII (Eaton i sar.,Biochemistry(1986) 25, 1343-8347). Nadalje, posmatran nivo ekspresije konstrukata koje su bez B-domena bio je znatno viši kada se uporedi sa faktorom VIII divljeg tipa zbog povećanog nivoa mRNK u ćelijama (Pittman i sar.,Blood(1993) 81, 2925-2935). Trenutno su na tržištu četiri proizvoda rekombinantnog faktora VIII (Recombinate<@>Baxter HealthCare; Kogenate<®>i Kogenate FS<@>Bayer Corporation and Refacto<®>Wyeth, Genetics Institute).

U pretpostavljenoj realizaciji (3) ovog pronalaska muteini faktora VIII imaju najmanje jednu od sledećih mutacija od (a) do (d): (a) Val na poziciji 162 zamenjen je ostatkom druge neutralne amino kiseline; (b) Ser na poziciji 2011 zamenjen je ostatkom druge hidrofilne amino kiseline; (c) Val na poziciji 2223 zamenjen je ostatkom kisele amino kiseline; i (d) B-domen između mesta Arg740 i Glu1649 zamenjen je Arg-bogatim vezujućim peptidom koji sadrži 10 do 25, još bolje 14 do 20 amino kiseliskih ostataka,

pri čemu je numeracija kod pomenutog faktora VIII relativna za sekvencu amino kiselina faktora VIII divljeg tipa prikazanog na SEK ID BR: 2 (gde sekvenca amino kiselina zrelog peptida ne uključuje signalni peptid od 19 amino kiselina, ali uključuje ceo B-domen (WO 99/29848)).

"Ostatak druge neutralne amino kiseline" u saglasnosti sa priloženim pronalaskom uključuje Gly, Ala, Leu, lle, Met i Pro i preferencijalno Ala. "Druga hidrofilna amino kiselina" uključuje Asn, Thr i Gln, preferencijalno Asn. Ostatak acidne amino kiseline izdvojen je od Glu i Asp i preferencijalno je Glu.

Među muteinima faktora VIII u realizaciji (3) bolje je da mutein faktora VIII ima najmanje jednu od mutacija (a), (b) i (c), još bolje najmanje jednu od mutacija (a) i (b), a najbolje sve tri mutacije od (a) do (c) koje su definisane u gornjem tekstu. Naročito je dobro da mutein ima sve tri mutacije V162A, S2011N i V2223E.

Takođe, DNK sekvenca koja sardži vektor realizacije (4) ovog pronalaska ima mutacije T485C, G6032A i T6668A srodne DNK sekvencama zrelog faktora VIII divljeg tipa u SEK ID BR:1. U preferencijalnoj realizaciji DNK sekvenca takođe sadrži mirujuću (tihu) mutaciju T6816C ( ponovo pomenuta numeracija je relativna za DNK sekvencu zrelog faktora VIII divljeg tipa).

Među muteinima faktora VIII realizacije (3) alternativno je bolje da mutein faktora VIII ima mutaciju (d) koja je već opisana u tekstu.

Bolji ekspresioni sistem ovog pronalaska koristi jedinstveni mutein faktora VIII kod koga - pored tačkastih mutacija od (a) do (c) koje su već opisane

- delimično ili potpuno izostaje njegov B-domen, preferencijalno je mutein u kome je B-domen između pozicije R740 i E1649 zamenjen

karakterističnim Arg-bogatim amino kiselinskim proretkom kao što je definisano ranije pod (d).

"Arg-bogati" u saglasnosti sa priloženim pronalaskom znači da rečeni proredak ima najmanje 3, bolje najmanje 4 Arg ostatka. U najboljoj realizaciji pomenuti proredak sastoji se od osam amino kiselina B-domena divljeg tipa stoje praćeno sa osam amino kisleina promenljivog domena (videti SI. 5A, SEK ID BR: 9). U takvim konstruktima koji imaju modifikacije u B-domenu što je opisano ranije u tekstu predloženo mesto za vezivanje vWF ostaje nepromenjeno da bi se izbegla neposredno proteolitičko razlaganje izlučenog faktora VIII u medijumu ćelijske kulture ili kasnije u krvi tretiranih pacijenata. Samo posle specifične aktivacije koja predstavlja cepanje trombina faktor VIII biće oslobođen iz vWF. cDNK za preferirani faktor VIII konstruisana je sastavljanjem četiri DNK fragmenta, kao što je opisano u Primeru 1.

Protein realizacije (3) ovog pronalaska može sadržati dodatne N- ili C-terminalne sekvence koje uključuju, ali nisu limitirane na, prirodne eksport signal peptide ( koji odgovaraju ostatcima amino kiselina -19 do -1 proteina prikazanim na SEK ID BR 4, 13 i 15) ili fragmente ili njihove analoge, veštačke peptide (npr., oligo-His-dodatak za visoku sposobnost prečišćavanja) i slično.

Najviše preferirani vektor za ekspresiju faktora VIII je vektor pTGF8-1 prikazan na SI. 2. DNK sekvenca pomenutog vektora prikazana je u SEK ID BR: 3, i obuhvata svih pet mutacija o kojima se već u tekstu govorilo (mutacije T485C, G6032A, T6668A i T6816C (ovde: T1217C, G4088A, T4724A i T4872C) i DNK sekvence koje kodiraju B-domen spojnicu SEQ ID NO: 9) i i kodiraju mutein faktora VIII prikazan na SEQ ID NO: 4.

Nadalje, najviše preferirani vektori su pTGF8-2hyg-s i pTGF8-3, uobičajene molekulske strukture što je prikazano na SI. 4.

pTGF8-2hyg-s prikazan na SEK ID BR: 12 sadrži tihe mutacije samo T6816C, što rezultuje u tome da mutein faktora VIII ima substituciju u B-domenu po spojnom peptidu SEK ID BR: 9, ali nema daljih promena u primarnoj strukturi proteina koje se odnose na sekvencu divljeg tipa SEK ID BR. 2.

pTGF8-3 prikazan na SEK ID BR: 14 sadrži mutacije T485C, T6668A i T6816C, što dovodi do toga da mutein faktora VIII pokazuju substitucije amino kiselina V162A i V2223E koje se odnose na SEK ID BR. 2 kao dodatak substitucijama B-domena, što je opisano ranije u tekstu.

U slučaju proizvodnje faktora VIII, kultivacije se izvodi u prisustvu von Willebrand-ovog faktora. Von Willebrand-ov faktor se naročito koristi u količinama od 10 do 100, mnogo bolje u količinama 50 do 60 mol vWF po molu faktora VIII (u kultivacionom medijumu i/ili rastvoru faktora VIII za vreme procedure prečišćavanja (vidi niže).

U pretpostavljenoj realizaciji (4) priloženog pronalaska faktor zgrušavanja ljudske krvi je faktor IX ili njegov mutein, najbolje divlji tip faktora IX prikazan na SEK ID BR: 5. Pogodni muteini faktora IX uključuju tačkasto mutirane i skraćene forme faktora IX. Najbolji vektor za ekspresiju faktora IX su vektori pTGFG36 i pTG36hyg prikazani na SI. 3 i Si. 4, respektivno.

U slučaju proizvodnje faktora IX, kultivacija se najbolje izvodi u prisustvu vitamina K koji može biti prisutan u količinama 0.1 do 100 ug/ml kultivacionog medijuma, još bolje u količinama od 1 do 20 pg/ml kultivacionog mediuma.

Ovaj način u saglasnosti sa realizacijom (1) ovog pronalaska nadalje uključuje korake (c) prečišćavanje faktora zgrušavanja krvi izolovanog u koraku (b) i/ili (d) podvrgavanje faktora zgrušavanja krvi izolovanog u koraku (b) ili prečišćenog u koraku (c) tretmanu virusne inaktivacije.

Pogodni koraci prečišćavanja uključuju načine koji su bili poznati u struci da maksimiziraju prinos čistog, stabilnog i visoko aktivnog proizvoda i izdvojene su iz imunoafinitivne hromatografije, anjonsko izmenjivačke hromatografije, format isključujuće hromatografije, itd. i njihovih kombinacija. Detaljni protokoli za prečišćavanje faktora koagulacije ljudske krvne plazme su, npr., prikazani u VVO93/15105, EP0813597, VVO96/40883 i W0 96/15140/50. Oni se lako mogu prilagoditi specifičnim zahtevima koji su potrebni da bi se izolovali rekombinantni faktori VIII i IX. Za faktor IX napravljen je efektivni protokol koji ima korak precipitacije amonijum sulfata praćen DEAE i HIC tentakularnom hromatografijom kao i heparin afinitetnom hromatografijom (US5919909). Količina i aktivnost prečišćenog proteina za vreme i posle procedure prečišćavanja može se pratiti ELISA testom i koagulacionim probama.

Da bi se prevazišli problemi moguće infektivne kontaminacije u uzorcima prečišćenog proteina ili u proizvodu direktno dobijenom iz supernatanta ćelijske kulture koja sadrži izlučene rekombinantne proteine po izboru, uzorci i/ili kultivacioni površinski sloj može da se tretira procedurama za virusnu inaktivaciju što uključuje toplotni tretman (suv ili u zečnom stanju, sa ili bez dodataka hemijskih substanci uključujući proteazne inhibitore). Posle virusne inaktivacije sledeči korak prečišćavanja za uklanjanje hemijskih substanci može biti potreban. Naročito, za faktor VIII koji je izolovan iz krvne plazme virus-inaktivisan protein visoke čistoće dobijen je anjon izmenjivačkom hromatografijom (VV093/15105). Nadalje, nekoliko procesa za proizvodnju ne-infektivnih koagulacionih faktora visokog stepena čistoće iz krvne plazme ili drugog biološkog izvora već je objavljeno. Lipidom obloženi virusi su efektno inaktivirani tretiranjem potencijalno infektivnog materijala sa hidrofobnom fazom formirajući dvo-fazni sistem, iz koga se stalno uklanja deo nerastvorljiv u vodi. Sledeća prednost dokazano je da je komplementna hidrofobnom faznom tretmanu simultano ili sekvencijalno sa tretmanom sa ne-jonski biokompatibilnim deterdžentima i dialkilnim ili trialkilnim fosfatima (WO 9636369, EP0131740, US 6,007,979). Ne-lipidno obloženi virusi zahtevaju inaktivacione protokole koji se sastoje od tretmana sa ne-jonskim deterdžentima što je praćeno zagrevanjem (60-65°C) od nekoliko časova (VV094/17834).

U svetlu navedenih rezultata veruje se da je kombinacija efektivnog sistema ekspresije proteina bazirana na linijama humanih ćelija zajedno sa oprobanim nečinima za inaktivaciju potencijalno opasnih infektivnih agenasa služi kao siguran i jednostavan korisnički sistem za proizvodnju rekombinantnih faktora zgrušavanja.

Štaviše, u saglasnosti sa realizacijom (6) ovog pronalska dobijen je superiorni mutant faktora VIII. Mutant fakora VIII može biti deo farmakološkog satava, može se koristiti za pripremanje lekova za tretiranje hemofilije i može se primeniti na načine tretiranja hemofilije (otelovljenje (11) do (13) pronalaska). Pomenuti farmakološki sastavi i pomenuti lekovi mogu sadržati faktor VIII u terapeutski efektnoj dozi, npr., of 50 do 500 ug (sa 200 ng faktora VIII što odgovara jednoj Internacionalnoj Jedinici (IU). U zavisnosti od tipa hemofilije, pacijent prima godišnju dozu faktora VIII od ne više od 200,000 IU, što se obično daje u nedeljnim ili dvonedeljnim dozama.

Farmakološki sastav, lekovi ili priprema u načinima za tretman hemofilije u realizacijama (11) i (13) sadrži terapijski efektnu dozu muteina faktora VIII realizacije (6) ili vektor genskog transfera realizacije (9). U cilju prvog, nadalje on može obuhvatiti farmakološki prihvatljive aditive uključujući humani serum albumin (HSA; najbolje oko 1 mg/ml rastvora); neorganske soli kao što je CaCI2(najbolje 2-5 mM), amino kiseline kao što su glicin, lizin i histidin (preferancijalno 2 i 5 mM); disaharide kao što su shahroza ili trehaloze (najbolje 0.4 i 1M); itd. Pripremanje može biti vodeno ili ne-vodeno. U poslednjem slučaju osnovna komponenta je glicerol i/ili polietilen glikol (PEG.300). Pripremanje takođe može biti u suvoj formi (da se rastvori u željenom rastvaraču zgodnom za administraciju.

Kao što je već rečeno, vektor genskog transfera u saglasnosti sa realizacijom (9) ovog pronalska može takodje biti deo farmakološkog sastava, može se koristiti za pripremanje medikamenta za tretman hemofilije i može se primeniti na načine za tretiranje hemofilije (realizacije (11) do (13) ovog pronalaska). Navedeni farmakološki sastav i lekovi mogu dalje obuhvatiti pogodnu matriks, npr., lipidi ili hormoni opisani u WO 00/49147 (već ovde opisan i inkorporisan referencma). Farmakološki sastav ili lekovi koji obuhvataju vektor genskog transfera ili vektor genskog transfera priloženoh pronalaska ovog pronalaska mogu se primeniti oralno, intravenski, intramuskulaturno, subkutano, površinski, preko mukoze (uključujući usni i nazalni sprej) ili genski pištolj. Oralna primena je mnogo bolja (npr., u mikronizovanoj hormonskoj disperziji).

Mutein faktora VIII realizacije (6) ovog pronalaska najbolje je definisan sa referencom gornje realizacije (3). Navedeni FVIII mutein može da se dalje priprema standardnim rekombinantnim tehnikama, npr., načinom koji uključuje

(a) kultivaciju ćelija domaćina transformisanih sa vektorom realizacije (8) i/ili uključujući DNA realizaciju (7) (što takođe uključuje kultivaciju imortalizovanih humanih ćelijskih linija koje stabilno ekspresuju najmanje jedan protein aktivator viralne transkripcije i noseći vektor koji sadrži promoter viralne transkripcije funkcionalno vezan za DNA kodirajuću sekvencu za faktor koagulacije humane krvi, gde je navedeni viralni promoter stimulisan od strane najmanje jednog navedenog proteina aktivatora viralne transkripcije); i (b) izolovanje faktora koagulacije krvi iz čorbe kulture. Pogodne besmrtne humane ćelije, proteini aktivatori

transkripcije i viralni promoteri su oni pomenuti ranije. Besmrtne humanje ćelijske linije iskorišćene navedenim načinom poželjno izražavaju dva proteina aktivatora viralne transkripcije, najpoželjnije SV40 T antigen senzitivan na temperaturu i adenovirus E1A protein. Način može dalje obuhvatati ranije opisane korake prečišćavanja i virusne inaktivacije (c) i (d).

Komercijalno dostupna ćelijska linija 293 T (ECACC; tsa201, ref. 96121229) je doponovana kod DMSY (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschvveig, Germanv) na dan 20-og februara 2001 godine pod depozitnim brojem DSM ACC2494.

Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima.

Primeri

Primer 1 - Kloniranje faktora VIII: Sekvenca za rekombinantni faktor VIII je dobijena reverznom transkripcijom kompletnog humanog hepatocelularnog RNK pula. Potom su četiri fragmenta (1/2, 3/4, 5/6, 7/8) povećana standardnim PCR upotrebom prajmera oblikovanih da sadrže restrikcione položaje. Da bi se podesili zajedno fragmenti 3/4 i 5/6 fragment Smal/Sall iz plazmida pBSFVIII3/4 se umeće u Sali položaj pBSFVII5/6 da bi se dobio pBSFVIII3/6. Dalje, fragment 3/6 se dobija isecanjem pBSFVIII3/6 sa Xhol/BspHI i delimično sa Alw44l. Ovaj fragment i fragment Pstl/Alw44l od pBSFVIII1/2 se povezuju u jednom koraku u kičmu vektora pBSFVIII1/2 isecanog sa Pstl i Xhol i ovako dajući pBSFVIIH/6, Fragment 7/8 se dobija isecanjem pBSFVIII7/8 sa Smal i delimično sa Mva12691 i povezivanjem u pBSFVIIM/6 isečak sa Xhol i Mva 12691 dajući dizanje na pBSFVIII1/8. Konačno fragment Smal/Xhol iz pBSFM.11/8 se umeće neposredno u položaj Sali Oktagen Vektora pTGFG67 (proizvodnja navedenog vektora je objavljena u PCT/EP00/01368) rezultirajući eukariotskom ekspresionom genu za humani faktor VIII pTGF8-1 (videti slike 1 i 2). Rezultirajući vektor kodira faktor VIII mutein koji sadrži mutacije V162A, S2011N i V2223E.

Izolovanje humanog faktora VIII cDNK i proizvodnja odgovarajućeg vektora ekspresije kako bi okvir za čitanje korespondirao sa humanim faktorom IX divljeg tipa je dato u PCT/EP00/01368 (n.pr., vektor pTG36hyg

-?.azaft-na-?Het-?-

Primer 2 - Linije humanih ćelija za ekspresiju proteina: Poželjna ćelijska linija je tsA201 (ECACC Ref.: 96121229) koja je transformisana embrionalna humana ćelijska linija bubrega (293, ECACC Broj 85120602) koja stabilno ekspresuje SV40 osetljiv na temperaturu T antigen (J. Membrane Biol. 1996; 152: 39; Gene 1995;156:235; PNAS USA 1994;91:12785; Pflugers Arch. 1994;427:136; J. Gen. Phvsioi. 1994;104:507; BioTechniques 1993;15:906). Druga imena za ovu ćelijsku liniju uključuju 293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7:379) i 293T. Ove slične epitelu ćelijske linije upotrebljavaju se u različitim ogledima funkcionalne ekspresije i objavljeno je da proizvode visoke nivoe rekombinantnih proteina. Mogu se kultivisati u DMEM sa dodatkom 2mM glutamina i 10% FCS. Za efikasnu proizvodnju faktora IX, medijum može biti modifikovan dodavanjem do 100 ^ig/mL vitamina K (US4770999).

Da bi se uprostilo prečišćavanje ekspresovanog polipeptida, ćelije se mogu kultivisati u oslobođenom od seruma ili oslobođenom od proteina medijumu koji sadrži pogodne dodatke. Iz razloga stabilnosti izlučeni faktor VIII zahteva prisustvo vvVF u medijumu (US5198349). Takođe je objavljeno dodavanje lipoproteina, fosfolipida, poliglikola, metala u tragovima, heparina, ne-jonskog površinski aktivnih sredstava ili ciklodekstrina (EP0254076, US5679549, US5198349, US5250421, US5576194, EP0872487, VV094/11525, US5378612).

Primer 3 - Transficiranje kalcijumfosfatom 293T ćelija radi prolazne

proizvodnje faktora VIII i IX: Sastavljene 293T ćelije su postavljene na ploče pri niskoj gustini u sudove veličine 10 cm u kojim se nalazi 6 mL DMEM/10% FCS (10 {.ig/mL vitamina K za FIX) dan pre transficiranja. Transficiranje se obavlja grubo u skladu sa Chen i Okayama-orn (Mol. Cell Biol., 7:2745 (1987)). 12fxg plazmida pTGF8-1 se transficiraju za proizvodnju faktora VIII a pTGFG36 za proizvodnju faktora IX. Šest sati nakon transficiranja medijum se menja svežim i površinski sloj se ubira tri dana posle transficiranja i ili se dalje prečišćava ili analizira bez daljeg prečišćavanja putem ELISA-e ili coagulometrije (videti primere 5 i 6).

Primer 4 - Određivanje FVIII koncentracije putem ELISA- e:

Nivoi humanog rekombinantnog faktora VIII u površinskom sloju transficiranih 293T ćelija se utvrđuju putem ELISA-e upotrebom prečišćenog poliklonalnog ovčjeg anti FVIII: C preparat (F8C-EIA-C, Afinitv Biologicals) -kao dobijeno antitelo. Oblaganje se obavlja u trajanju od dva sata u vlažnoj komori na 22°C. Ploče (Dynex, lmmulon-4) se presvlače sa 100^L 100 puta razblaženog antitela u puferu za oblaganje (50 mM natrijumkarbonat pH 9,6). Pranje ploča četiri puta (Encore 2000, Merck) sa PBS-Tween<®>(0,1% v/v) je dovoljno da blokira ne-specifične interakcije. Posle svakog daljeg koraka pranje je neophodno da bi se eleminisali nevezani proteini. 100uL svakog uzorka filtrata kulture koji se izvlače iz različitih 293T klonova stabilno transficiranih sa pTGF8-3 nakon 48 h inkubacije se doda svakom bazenčiću. Razblaženi Flll standardi (kućni standard, Octapharma) su sačinjeni u puferu za razblaživanje (HBS-BSA-EDTA-Tween<®>) i inkubiraju se tokom 60 minuta pri 100ui<_>po bazenčiću. Za kolorimetrijsku reakciju, 5 mg O-Fenilendiamin (P-6912, Sigma) tablete se rastvori u 12 ml_ substrat pufera kratko pre upotrebe i kompletira se sa 12fiL 30% H20, 150uL ovog rastvora substrata se dodaje svakom bazenčiću i kolorimetrijski zapisi se naprave u MRX čitaču (Dynex) pri 490 nm nakon 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi u mraku i reakcija se zaustavlja dodavanjem 50\ iL2,5 M H2S04svakom bazenčiću. Rezultati se izračunavaju linearnom regresijom standardne koncentracije prema standardnoj meri absorbcije (Slika 5A) i dati su sumarno na Slici 5b.

Primer 5: Detektovanje aktivnosti humanog faktora VIII koagulacije

Aktivnost koagulacije humanog rekombinantnog faktora VIII u površinskim slojevima ćelijske kulture 293T ćelija (transficiranih taloženjem kalcijumfosfata sa pTGF8-1 kako je to opisano u Primeru 3) je utvrđeno na sledeći način: Aktivnost koagulacije se ogleda na osnovu ogleda parcijalnog vremena tromboplastina upotrebom aktivacije Cefalinom (fosfatidil etanolamin) sa manualnim instrumentom koagulacije (ML-2, Instrumentation Laboratories). Za proučavanje, 100faL nerazblaženog površinskog sloja sa transficiranih 293T-ćelija, 100^iL plazme sa nedostatkom (Progen) i 100^iL Cefalina (Instrumentation Laboratories) se inkubiraju 5 minuta na 37°C. Koagulacija počinje dodavanjem 100^L CaCI2. Koagulaciono vreme uzorka se upoređuje sa normalnom plazmom. Rezultati su dati sumarno na Slici 3B. Kako se može videti sa Slike 3B, ćelijski površinski sloj sa ćelija transficiranih sa pTGF8-1 pokazuju koagulacionu aktivnost uporedivu sa normalnom plazmom dok ne transficirane ćelije daju vrednost ekvivalentnu plazmi kojoj nedostaje faktor VIII.

Primer 6 - Viralna inaktivaciia:

Viralna inaktivacija se obavlja u skladu sa postupkom iz U.S. Patent No. 6,007,979. Naime, rastvoru potencijalno infektivnog proteina dodaju se po redu sledeća jedinjenja, sa mešanjem: 1. 0,2 mL Tween® 80 i 0,06 ml_ TNBP se dodaju u 19,74 mL rastvora ili 2. 0,2 mL Triton® X-100 i 0,2 mL TNBP se dodaju u 19,6 mL rastvora. 1 mL Ricinusovog ulja se dodaje preparatima 1 i 2 koji se onda intenzivno ekstrakuju na sobnoj temperaturi jedan sat.

Centrifugiranje se obavlja u oba slučaja radi odvajanja faza. Za kontrolu infektivnosti, uzorci od 1 mL svaki se više puta uzimaju iz vodene frakcije.

Primer 7 - Utvrđivanje ćelijskih linija koje stabilno ekspresuju faktor VIII: Poželjni vektor pTGF8-1 obuhvata konstrukte za prolaznu ekspresiju faktora VIII u mamalnim ćelijama. Da bi se omogućio metod odabiranja za stabilno transficirani ćelijski klon, kaseta za higromicin-B-fosfotransferazu (Hindlll-Mva 12601 fragment od TK-Hyg, Clontech) je podklonirana u Smal položaj koji je prisutan u vektoru. Rezultirajući konstrukti (pTGF8-1-hig) tada obuhvata incisekspresione kasete za humani faktor Vili sa CMV-promoterom i SV40-poliadenilacioni signal i higromicin-B-fosfotransferaza ekspresionu kasetu sa HSV timidin kinaza promoterom i HSV timidin kinaza poliadenilacionim signalom.

Vektori pTGF8-2hig-s i pTGF8-3 (Slika4, SEK ID Brojevi: 12 i 14) su derivati pTGF8-1hig, i u toj tački mutacije V162A, S2011N i V2223E (pTHF8-2hig-s) i S2011N (pTGF8-3) se vraćaju sekvenci divljeg tipa putem PCR- zavisnog metoda upotrebom OuikChange<®>protokola (Stratagene).

Gore pomenuti konstrukti dozvoljavaju uspostavljanje stabilno ekspresovanih ćelijskih linija putem transfekcije kalcijumfosfatom i potonjim odabiranjem za otpornost na higromicin. Dodatno plazmidi sadrže odgovarajući progesteron elemenat (PRE).

Prvo se mora utvrditi kritična koncentracija antibiotika za efektivno odabiranje stabilno transficiranih 293T ćelija. U ovu svrhu ćelije se stavljaju na pleče pri niskom razblaživanju i uzgajaju u prisustvu 10 do 800ng/mL higromicina B. Posle dve nedelje na 200 jig/mL ili više ni jedna ćelije ne raste, pa je tako ova koncentracija izabrana za odabiranje stabilno transficiranih ćelija.

Tipično transficiranje se obavlja u sudovima od 10 cm sa 293T ćelijama podeljenim dan ranije u odnosu 1:15. Upotrebom metoda kalcijumfosfat taloženja (Biotechniques 1988 6:7 632-638) 12^ig plazmida po sudu se transficira i dva dana kasnije medijum se zamenjuje sa svežim koji sadrži 200 (ig/mL higromicin B. Posle 2-3 nedelje odabiranja medijum se testira putem ELISA-e (videti Primer 4) na prisustvo faktora VIII.

Pozitivni klonovi se izoluju i prebacuju na ploću sa 24 bazenčića. Posle pretraživanja putem ELISA-e i utvrđivanja aktivnosti pozitivni klonovi se podvrgavaju u još dva kruga podkloniranju pa proširivanju i onda se oni koji su alikvoti zamrzavaju za dalju upotrebu i karakterizaciju.

Primer 8: Dokaz fenotipske uniformnosti stabilno transficiranih ćelija

putem in situ imunofluorescentne detekcije ekspresije faktora VIII:

Sve, 5 x 107 ćelije stabilno transficirane sa pTGF8-3 (klon 49/19) i netransficirane 293T ćelije (negativna kontrola) iz adhezionih kultura u DMEM + 9,1% FBS se odvajaju iz sudova u kojima je kultura tripsinacijom, operu se nekoliko puta i resuspenduju u 5 mL PBS pufera. 2f.iL ovih ćelijskih suspenzija se prenosi na sterilne mikroskopske staklene slajdove i inkubira na sobnoj temperaturi sve dok sva tečnost ne ispari. Ćelije se fiksiraju u 70% etanolu tokom 10 minuta i suše 5 minuta na sobnoj temperaturi. Slajdovi se blokiraju naspram nespecifične detekcije putem inkubacije u 10% rastvor FBS u PBS puferu. Primarno antitelo (sh antiFVIII: C F8C-EIA-C, Affinity Biologicals) se razblažuje 100 puta sa PBS puferom koji sadrži 10% FBS i 0,1% saponina i inkubira 60 minuta na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori za inkubaciju. Posle intenzivnog pranja sa PBS, razblaživanje 100 puta sekundarnog antitela (rb anti sh CY3 konjugat 313-165-003, Jackson ImmunoResearch) se priprema i inkubira na gore opisani način. Potom, mikroskopski preparat se intenzivno pere i pokriva slojem 50% glicerina i pokrivnim staklom. Ćelije se vizuelizuju putem bele svetlosti i putom fluorescentne mikroskopije (emisija na 570 nm).

Rezultati su predstavljeni na Slici 6.

Claims

1. Faktor VIII mutein, naznačen time, što je u njemu B-domen između pozicija Arg740 i Glu1649 zamenjen Arg-bogatim linker peptidom koji ima bar 3 Arg ostatka i sadrži 10 do 25 ostataka amino kiselina, pri čemu je numeracija kod pomenutog faktora VIII u odnosu na sekvencu zrelog faktora VIII divljeg tipa dat u SEQ ID NO:2.

2. Faktor VIII mutein iz Zahteva 1, naznačen time, što faktor VIII mutein sadrži bar jednu od sledećih dodatnih mutacija (a), (b) i (c): (a) Val na poziciji 162 zamenjen je ostatkom neutralne amino kiseline odabranim od Gly, Ala, Leu, Ile, Met i Pro; (b) Ser na poziciji 2011 zamenjen je ostatkom hidrofilne amino kiseline odabranim od Asn, Thr i Gln; i (c) Val na poziciji 2223 zamenjen je ostatkom kisele amino kiseline odabranim od Glu i Asp.

3. Faktor VIII mutein iz Zahteva 2, naznačen time, što sadrži bar jednu od mutacija (a) i (b).

4. Faktor VIII mutein iz Zahteva 2, naznačen time, što sadrži sve tri mutacije (a), (b) i (c).

5. Faktor VIII mutein prema bilo kom od Zahteva 2 do 4, naznačen time, što je u mutaciji (a) Val na poziciji 162 zamenjen sa Ala, u mutaciji (b) Ser na poziciji 2011 zamenjen sa Asn, i/ili u mutaciji (c) Val na poziciji 2223 zamenjen sa Glu.

6. Faktor VIII mutein prema bilo kom od Zahteva 1 do 5, naznačen time, što Arg-bogati linker peptid ima 14 do 20 ostataka amino kiseline.

7. Faktor VIII mutein prema bilo kom od Zahteva 1 do 6, naznačen time, što se linker sastoji od: sekvence amino kiseline SFSONSRH, i/ili sekvence amino kiseline QAYRYRRG.

8. Faktor VIII mutein iz Zahteva 7, naznačen time, što linker sadrži sekvencu SFSQNSRHQAYRYRRG.

9. Faktor VIII mutein iz Zahteva 1, naznačen time, što se sastoji od amino kiselina 1 do 1440 iz SEQ ID NO:4, 13 ili 15.

10. DNK sekvenca, naznačena time, što kodira faktor VIII mutein kako je definisano u bilo kom od Zahteva 1 do 9.

11. DNK sekvenca iz Zahteva 10, naznačena time, što ima bar jednu od mutacija T485C, G6032A i T6668A u odnosu na DNK sekvencu zrelog faktora VIII divljeg tipa datu u SEQ ID NO: 1, poželjno DNK sekvenca se sastoji od sve tri navedene mutacije.

12. Vektor, naznačen time, što obuhvata DNK kako je definisano u Zahtevima 10 ili 11.

13. Vektor iz Zahteva 12, naznačen time, što je pTGF8-1, pTGT8-2hyg-s ili pTGF8-3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 3, 12 i 14, respektivno.

14. Vektor iz Zahteva 12, naznačen time, što je vektor transfera gena.

15. Izolovana ćelija domaćina, naznačena time, što je transformisana sa vektorom kako je definisano u Zahtevu 12 i/ili što sadrži DNK sekvencu kako je definisano u Zahtevu 10.

16. Postupak za dobijanje faktor VIII muteina kako je difinisan u bilo kom od Zahteva 1 do 9, naznačen time, što se sastoji od: (a) gajenja transformisane ćelije domaćina kako je difinisana u Zahtevu 15; i (b) izolovanja faktor VIII muteina iz hranljivog medijuma kulture.

17. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži faktor VIII mutein kako je definisano u bilo kojem od zahteva 1 do 9 ili vektor transfera gena kako je definisano u Zahtevu 14.

18. Upotreba faktor VIII muteina kako je definisano u bilo kojem od zahteva 1 do 9 ili vektora transfera gena kako je definisano u Zahtevu 14 za pripremanje medikamenta za lečenje hemofilije, poželjno za lečenje hemofilije A.

19. Postupak iz Zahteva 16, naznačen time, što se sastoji od (a) kultivisanja imortalizovane humane ćelijske linije koja stabilno ekspresuje Simian virus T antigen i nosi vektor koji sadrži CMV promoter funkcionalno povezan sa DNK sekvencom koja kodira faktor VIII mutein.

20. Postupak iz Zahteva 19, naznačen time, što je imortalizovana humana ćelijska linija imortalizovana ćelija bubrega, bešike, jetre, pluća, srčanog mišića, glatkih mišića, jajnika ili gastrointestinalne ćelije.