CZ303929B6 - Mutein faktoru VIII, odpovídající DNA sekvence, vektor a hostitelská bunka, farmaceutická kompozice, zpusob produkce muteinu a imortalizovaná lidská bunecná linie - Google Patents

Abstract

Mutein faktoru VIII, v nemz je doména B mezi pozicemi Arg740 a Glu1649 nahrazena peptidovým linkerem bohatým na arginin se sekvencí Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly, kde císlování faktoru VIII je vztazeno k maturní sekvenci faktoru VIII divokého typu ukázané v SEQ ID NO:2. DNA sekvence kódující tento mutein, vektor obsahující tuto DNA a hostitelská bunka transformovaná tímto vektorem. Farmaceutická kompozice obsahující tento mutein nebo vektor. Pouzití tohoto muteinu nebo vektoru pro prenos genu pro výrobu léciva pro lécení hemofilie, zejména hemofilie A. Zpusob produkce tohoto muteinu, který zahrnuje (a) kultivaci výse uvedených transformovaných hostitelských bunek a (b) izolaci muteinu z kultivacního media. Imortalizovaná lidská bunecná linie stabilne exprimující alespon jeden virový transkripcní aktivátorový protein a nesoucí výse uvedený vektor.

Description

Mutein faktoru VIII, odpovídající DNA sekvence, vektor a hostitelská buňka, farmaceutická kompozice, způsob produkce muteinu a imortalizovaná lidská buněčná linie

Oblast techniky

Vynález se týká muteinu faktoru VIII, DNA sekvence kódující tento mutein, vektoru obsahující tuto DNA a hostitelské buňky transformované tímto vektorem. Dále se týká farmaceutické kompozice obsahující tento mutein nebo vektor, použití tohoto muteinu nebo vektoru pro přenos genu pro výrobu léčiva pro léčení hemofilie, zejména hemofilie A, způsobu produkce tohoto muteinu a imortalizované lidské buněčné linie stabilně exprimující alespoň jeden virový transkripční aktivátorový protein a nesoucí výše uvedený vektor.

Vynález souvisí se zlepšením způsobu výroby rekombinantních krev srážejících faktorů, jako jsou faktory Vlil a IX, konkrétně faktoru Vlil, využívající imortalizovanou lidskou buněčnou linii, která stabilně exprimuje virové transkripční aktivátorové proteiny a nese vektor obsahující promotor funkčně spojený se sekvencí DNA kódující tento faktor, za předpokladu, že řečeným promotorem není virový promotor stimulovaný řečenými virovými transkripčními aktivátorovými proteiny.

Dosavadní stav techniky

Hemofilici trpí krvácením způsobeným porušením funkce proteinových komponent v kaskádě srážení krve. V závislosti na postiženém koagulačním faktoru mohou být rozlišeny dva typy hemofilie. U obou je společné, že mají potlačenou přeměnu rozpustného fibrinogenu na nerozpustný síť tvořící fibrin. Jsou to recesivní genetická onemocnění spojená s chromosomem X, která se vyskytují zejména u mužské populace.

Hemofilie A se vyskytuje u 1 až 2 jednotlivců z 10 000 mužů. Je způsobena nedostatečností nebo nepřítomností faktoru VIII, značně velkého glykoproteinu (Mr přibližně 330 kDa (Furrie B., Fúrie B. C., Cell (1988) 53, 505-518)), který představuje důležitý prvek koagulační kaskády. Polypeptidová sekvence může být rozdělena do tří oblastí, N-terminální oblast, oblast sestávající z tak zvaných Al a A2 domén a centrální oblasti B-domény a C-terminální oblasti složené z A3, Cl a C2 domén. Koagulační faktor VIII se v krvi vyskytuje jako neaktivní prekursor. Je těsně a nekovalentně vázán k von Williebrandovu Faktoru (vWF), který působí jako stabilizující nosičový protein. Proteolytické štěpení faktoru VIII trombinem ve třech specifických pozicích (740, 372, 1689) vede kjeho disociaci od vWF a uvolnění prokoagulační funkce v kaskádě. Ve své aktivní formě působí faktor VIII jako kofaktor pro faktor IXa, čímž urychluje proteolytickou aktivaci faktoru X o několik řádů. Hemofilie B se vyskytuje přibližně u 1 z 25 000 mužů. Je charakterizována ztrátou serinové proteasy faktoru IX (Christmas factor). Tento polypeptid, obsahující 415 aminokyselin je syntetizován v játrech jako 56 KDa glykoprotein. Pro dosažení jeho správné funkce je nezbytný posttranslační karboxylační krok, který probíhá pouze za přítomnosti vitaminu K.

Léčba obou typů poruch krvácivosti tradičně zahrnuje infúze koncentrátů lidského plazmového proteinu faktoru Vlil nebo faktoru IX. Ačkoliv tato metoda představuje pro hemofiliky účinnou terapii, nese s sebou riziko spojené s přenosem řady infekčních činitelů, jako jsou viry způsobující žloutenku nebo AIDS, nebo tromboembolické faktory. Další popsanou technikou pro výrobu koagulačních faktorů je několik rekombinantních DNA technik. Pro tento účel byly odpovídající cDNA divokého typu faktoru VIII a faktoru IX izolovány a klonovány do vhodných expresních vektorů (EP-A-160457; WO-A-86/01961, Patenty US 4 770 999, 5 521 070 a 5 521 070).

V případě faktoru Vílí je v oboru známá (např. z EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-050073Č, WO-91/07490, WO-95/13300 Patenty US 5 045 455 a 5 789 203) rekombinantní exprese podCZ 303929 Β6 jednotek pro výrobu komplexů vykazujících koagulační aktivitu. Kromě toho byla popsána (např. v WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, Patenty US 4 868 112 a 4 980 456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 a WO-91/09122) exprese zkrácených cDNA verzí, s částečným nebo úplným odstraněním sekvence kódující vysoce glykosylovanou doménu B. Nedávno byla vnesena řada vybraných bodových mutací za účelem inhibovat proteolytickou inaktivaci faktoru Vlil aktivovaným proteinem C nebo za účelem snížení imunogenity v důsledku tvorby inhibičních protilátek léčených pacientů (např. Patenty US 5 859 204, 5 422 260 a 5 451 521, WO-97/49725 a WO99/29848).

Rekombinantní koagulační faktory jsou obvykle izolovány z média stabilně transfekovaných eukaryotických a přednostně savčích buněčných linií. Byla to ovšem běžná praxe, že se při způsobech výroby, zahrnutých ve zde uvedených referencích, používaly nelidské buněčné linie z důvodu vyhnutí se riziku kopurifikace některých infekčních činitelů, které by mohly být exprimovány nebo přítomny v lidských buňkách.

Zvláště pro faktor XIII však použití nelidské buněčné linie představuje určité nevýhody. Byla například publikována neuspokojivá hladina sekrece exprimovaného proteinu do média. To může být způsobeno nepatrnými rozdíly mezi různými typy savčích buněk týkající se intracelulárních drah pro translaci a modifikaci proteinu, které mohou mít vliv na biologickou aktivitu exprimovaného polypeptidu. Nehledě na to, byly zde určité obavy, že proteiny určené pro terapii purifikované z nelidských expresních systémů jsou kontaminovány buněčnými složkami, které mohou zvýšit antigenní reakce u pacientů.

Kromě toho, proteiny exprimované nelidskými expresními systémy mohou mít způsob glykosylace odlišný od lidského, který může zvýšit antigenní reakce u pacientů. Biologická stabilita a účinnost koagulačních faktorů je však značně ovlivněna způsobem jejich N-glykosylace. Zvláště jsou důležité periferní a terminální monosacharidy, protože ty jsou detekovány specifickými receptory buněk, které jsou zodpovědné za jejich degradaci. Koagulační faktory nesou jako terminální monosacharidy zbytky kyseliny sialové. Modifikace ve složení sialových kyselin na koncích glykoproteinů například u koagulačních faktorů může mít za následek heterogenní giykosylaci. Proto tedy, v případě modifikace hraje biologická stabilita a účinnost klíčovou roli. Je tedy důležité uvážit výrobu rekombinantních koagulačních faktorů a odhadnout vliv glykosylace nelidských produkujících buněčných linií ve srovnání s lidskými buněčnými liniemi. Obecně řečeno, je možné, že lidské buněčné linie jsou pro produkci rekombinantních koagulačních faktorů způsobilejší než ty nelidské. Důvod pro tuto domněnku spočívá v tom, že pravděpodobně žádný nepatřičný oligosacharid nebude inkorporován do oligosacharidové části během syntézy rekombinantních faktorů.

Na druhé straně už nějaký čas jsou k dispozici obecné metody pro vysokou hladinu exprese proteinu příslušného genu zahrnující imortalizované, stabilně transfekované savčí buněčné linie, exprimující virové transkripční aktivátorové proteiny (např. Patent US 5 712 119). Dále jsou tyto buněčné linie transformovány vektorovým konstruktem, kde je vhodný virový transkripční promotor účinně spojen s DNA sekvencí kódující žádaný gen, transkripční aktivátorové proteiny aktivují virový transkripční promotor a tím dochází k iniciaci exprese žádaného genu. Byly zde opět obavy, že transkripční aktivátorové proteiny exprimované těmito buněčnými liniemi mohou přispět ke kontaminaci cílového terapeutického proteinu.

Vzhledem k tomu, co bylo uvedeno výše, bylo nutné najít účinný způsob produkce lidských krev srážejících faktorů.

Překvapivě bylo zjištěno, že nekontaminované krev srážející faktory mohou být získány výše uvedenými imortalizovanými lidskými buněčnými liniemi. Zejména, imortalizované buněčné linie - nesou-li vektor obsahující promotor funkčně spojený s DNA sekvencí kódující krev srážející faktor a navzdory skutečnosti, že tento promotor není virový promotor, který je stimulován

- 2 CZ 303929 B6 řečenými virovými transkripčními aktivátorovými proteiny - jsou schopné exprese krev srážejícího faktoru. Ve spojení s protokoly pro vhodnou purifikaci proteinu a inaktivaci viru, poskytuje tento způsob účinný systém pro produkci bezpečných a vysoce aktivních krev srážejících faktorů pro terapeutické aplikace na lidech. Kromě toho bylo zjištěno, že zejména mutanty faktoru VIII jsou výjimečně stabilní proti proteolytické inaktivaci, a proto mohou být vystaveny protokolům virové inaktivace.

Podstata vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je mutein faktoru VIII, v němž je doména B mezi pozicemi Arg740 a Glul649 nahrazena peptidovým linkerem bohatým, na Arg se sekvencí SEQ ID NO: 9

Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly,

10 15 kde číslování faktoru Vlil je vzhledem k maturní sekvenci faktoru VIII divokého typu ukázané v SEQ IDNO:2.

Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména ii) mutein faktoru VIII podle provedení i) vykazující přídavně alespoň jednu z následujících mutací (a) až (c):

(a) Val v pozici 162 je nahrazen neutrálním aminokyselinovým zbytkem vybraným z Gly, Ala, Leu, Ile, Met a Pro;

(b) Ser v pozici 2011 je nahrazen hydrofilním aminokyselinovým zbytkem vybraným z Asn, Thr a Gin;

(c) Val v pozici 2223 je nahrazen kyselým aminokyselinovým zbytkem vybraným z Glu a Asp;

iii) mutein faktoru VIII podle provedení ii) vykazující alespoň jednu z mutací (a) a (b);

iv) mutein faktoru VIII podle provedení ii), vykazující všechny tři mutace (a), (b) a (c);

v) mutein podle kteréhokoliv z provedení ii) až iv), kde v mutaci (a) je Val v pozici 162 nahrazen Ala, v mutaci (b) je Ser v pozici 2011 nahrazen Asn, a/nebo v mutaci (c) je Val nahrazen Glu; a vi) mutein faktoru VIII podle provedení i), který zahrnuje aminokyseliny od 1 do 1440 sekvence SEQ ID NO: 4, 13 nebo 15.

Dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu vii)) DNA sekvence kódující mutein faktoru VIII, podle kteréhokoliv z provedení i) až vi).

V přednostním provedení tohoto aspektu vynálezu (provedení viii)) má DNA sekvence podle provedení vii) alespoň jednu z mutací T485C, G6032A a T6668A, vzhledem k DNA sekvenci maturního faktoru VIII divokého typu SEQ ID NO: 1, přičemž sekvence DNA přednostně obsahuje všechny tři výše uvedené mutace.

Dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu ix)) vektor obsahující DNA podle provedení vynálezu vii) nebo viii).

-3 CZ 303929 B6

Vektorem podle provedení ix) je přednostně (provedení vynálezu x) pTGF8-l se sekvencí SEQ ID NO: 3, pTGT8-2hyg-s se sekvencí SEQ ID NO: 12 nebo pTGF-3 se sekvencí SEQ ID NO: 14.

Vektorem podle provedení ix) je také přednostně (provedení vynálezu xi) vektor pro přenos genu.

Dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu xii)) hostitelská buňka transformovaná vektorem podle provedení ix) a/nebo zahrnující sekvenci DNA podle provedení vii).

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu xiii)) farmaceutická kompozice, která obsahuje mutein faktoru Vlil podle kteréhokoliv z provedení i) až vi) nebo vektor pro přenos genu podle provedení xi).

Jiným aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu xiv)) použití muteinu faktoru VIII podle kteréhokoliv z provedení i) až vi) nebo vektoru pro přenos genu podle provedení xi) pro výrobu léčiva pro léčení hemofilie, zejména hemofilie A.

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu xv)) mutein faktoru Vlil podle kteréhokoliv z provedení i) až vi) nebo vektor pro přenos genu podle provedení xi) pro použití pro léčení hemofilie, zejména hemofilie A, podáváním lidským hemofilikům.

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu je (provedení vynálezu xvi)) způsob produkce muteinu faktoru Vílí podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), který zahrnuje (a) kultivaci transformovaných hostitelských buněk podle provedení xii) a (b) izolaci muteinu faktoru VIII z kultivačního média.

Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména xvii) způsob podle provedení xvi), který v kroku (a) zahrnuje kultivaci imortalizované lidské buněčné linie stabilně exprimující T antigen opičího viru a nesoucí vektor, který obsahuje promotor CMV funkčně spojený se sekvencí DNA kódující mutein faktoru VIII;

xviii) způsob podle provedení xvii), kde imortalizovanou lidskou buněčnou linií jsou imortalizované buňky ledvin, močového měchýře, jater, plic, srdečního svalu, hladkého svalstva, vaječníků nebo gastrointestinálního traktu;

xix) způsob podle provedení xviii), kde imortalizovanou lidskou buněčnou linií je buněčná linie 293T (DSM ACC2494);

xx) způsob podle kteréhokoliv z provedení xvii) až xix), kde vektor dále zahrnuje selekční markér a/nebo regulační sekvence;

xxi) způsob podle kteréhokoliv z provedení xvii) až xx), při němž se kultivace provádí za přítomnosti von Willebrandova faktoru vWF); a xxii) způsob podle kteréhokoli z provedení xvi) až xxi), který dále zahrnuje (c) purifikaci muteinu faktoru Vlil izolovaného v kroku (b), a/nebo (d) vystavení muteinu faktoru Vlil izolovaného v kroku (b) nebo purifikovaného v kroku (c) úpravě pro inaktivaci viru.

-4CZ 303929 B6

Konečně je ještě dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení xxiii)) imortalizovaná lidská buněčná linie stabilně exprimující alespoň jeden virový transkripční aktivátorový protein a nesoucí vektor kódující mutein faktoru VIII podle kteréhokoliv z provedení i) až vi).

V dalším popisu může být vynález objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Přehled obr, na výkresech

Obr. 1 ukazuje použité fragmenty pro konstrukci faktoru Vlil s odstraněnou B-doménou (Příklad 1).

Obr. 2 ukazuje vektor pTGF8-l, kruhová DNA obsahující 8720 párů bází (pb), jeho přesná DNA sekvence je v SEQ ID NO:3 (pro proteinovou sekvenci faktoru VIII kódovanou řečenou DNA sekvencí viz SEQ ID NO:4).

Obr. 3 ukazuje vektor pTGFG36, kruhová DNA obsahující 5753 pb, jeho přesná DNA sekvence je dána v SEQ ID NO: 6 (báze 689-2071 v SEQ ID NO: 6 kódující proteinový faktor IX).

Obr. 4 ukazuje vektor pTG36hyg, kruhová DNA obsahující 8124 pb

Obr. 5A znázorňuje přednostní sekvenci linkeru předkládaného vynálezu (SEQ ID NO: 9).

Obr. 5B ukazuje čas koagulace rekombinantního hFVIII, jak je ukázáno v Příkladu 6.

Obr. 6 ukazuje běžnou molekulární strukturu pTGF8-2hyg-s a pTGF8-3, kruhová DNA obsahující 10698 pb, jeho přesné sekvence jsou dány v SEQ ID NO: 12 a 14 (proteinový faktor Vili kódovaný řečenou sekvencí viz SEQ ID NO: 13 a 15).

Obr. 7A ukazuje kalibrační křivku FVII1 ELISA, jak je popsáno v Příkladu 5.

Obr. 7B znázorňuje výsledky stanovení koncentrací FV1II v různých kultivačních filtrátech, jak je popsáno v Příkladu 5.

Obr. 8 ukazuje výsledky specifického imunofluorescenčního stanovení faktoru VIII, jak je popsáno v příkladu 9. Horní řádek: 293T buňky stabilně transfekovány pTGF8-3, klon 49/19. Spodní řádek: negativní kontrola: netransfekované 293T buňky. A a C: bílé světlo, bez filtru; B a D: fluorescenční detekce faktoru Vlil, filtr 550 nm.

Obr. 9 ukazuje vliv tepelné inkubace na aktivitu FIX ve filtrované kultuře, jak je popsáno v příkladu 10.

Obr. 10 ukazuje závislost exprese aktivního rekombinantního faktoru IX na přítomnosti vitaminu K v kultivačním médiu.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

„Funkčně spojené“ označuje uspořádání vektoru, kde promotor je ve vektoru umístěn takovým způsobem, že může stimulovat transkripci DNA sekvence kódující lidský krev srážející faktor. „Nefunkčně spojené“ označuje uspořádání, kde promotor je umístěn tak vzdáleně od sekvence exprimovaného genu pro krev srážející faktor, že nemůže stimulovat jeho transkripci.

-5CZ 303929 Β6 „Gen“ označuje DNA sekvenci kódující polypeptid, někdy obsahující vedoucí a koncovou sekvenci a introny a exony.

„Vektor“ označuje jakýkoli genetický konstrukt, jako je plasmid, fág, kosmid, atd., který, v případě, zeje spojen s vhodnými kontrolními prvky, je schopen replikace. Termín zahrnuje klonovací a expresní prostředky.

„Nesení vektoru“ zahrnuje jak stabilní tak i transientní inkorporaci funkčních DNA segmentů do hostitelské buňky. Stabilní inkorporace je ale přednostní.

„Vektor pro přenos genu“ zahrnuje, ve shodě s předkládaným vynálezem, vektor vhodný pro genovou terapii. Takový vektor obsahuje funkční sekvence pro žádané účely, jak je v oboru známo.

Termín „maturní“ označuje molekulovou strukturu daného proteinu přímo po jeho buněčné sekreci (tj. odstranění jeho N-terminálního exportního polypeptidového signálu).

„Promotor označuje regulační oblast DNA sekvence kontrolující transkripci genu, ke kterému se váže RNA polymerasa.

„Terapeuticky účinná dávka“ farmaceutické směsi vynálezu označuje dávku účinnou pro léčbu nebo profylaxi, například dávka, která poskytuje účinnou léčbu nebo snížení symptomů hemofilie. Stanovení terapeuticky účinné dávky je v kompetenci odborníka zkušeného v oboru.

„Kóduje“ nebo „kódující“ označuje vlastnost sekvence nukleové kyseliny být transkribována (v případě DNA) nebo translatována (v případě mRNA) do polypeptidů in vitro nebo in vivo, je-li umístěna pod kontrolu příslušné regulační sekvence.

Pro účel této přihlášky „exprimovat“, „exprimující“ nebo „exprese“ označuje transkripci a translaci genu kódujícího protein.

Předkládaný vynález, jak je popsáno výše v (1) až (13), je detailnější popsán níže. V souladu s formou (1) vynálezu předkládané přihlášky promotor funkčně spojený s DNA sekvencí, kódující lidský krev srážející faktor, není virovým promotorem, který je stimulovaný alespoň jedním transkripčním aktivátorovým proteinem exprimovaným imortalizovanou lidskou buněčnou linií.

Imortalizovaná lidská buněčná linie jsou přednostně imortalizované buňky ledvin, močového měchýře, jater, plic, srdečního svalu, hladkého svalu, vaječníků nebo buňky gastrointestinální. Přednostněji je imortalizovaná lidská buněčná linie odvozena od lidských embryonálních ledvinových buněk a nej přednostněji je to buněčná linie 293 T (ECACC:tsa201, cit.96121229; DSM ACC2494).

Alespoň jeden transkripční aktivátorový protein exprimovaný imortalizovanou buněčnou linií zahrnuje T antigen opičího viru, adenovirové proteiny El A nebo E1B, DNA sekvenci proteinu časné oblasti hovězího papilomaviru a proteiny IE herpes viru. Přednostně imortalizované buňky exprimují alespoň dva virové transkripční aktivátorové proteiny, např. teplotně senzitivní SV40 T antigen a adenovirový EA1 protein (tak jako výše uvedená buněčná linie 293 T).

Promotor funkčně spojený s DNA sekvencí kódující lidský krev srážející faktor přednostně zahrnuje (i) virové promotory, které nejsou stimulovány aktivátorovým proteinem exprimovaným imortalizovanými buňkami, jak je definováno výše (jako SV 40 a CMV);

-6CZ 303929 B6 (ii) konstitutivní hostitelské promotory (albumin); a (iii) tkáňově specifické promotory (jako α-antitrypsin pro játra). Nejpřednostnější promotor je podle vynálezu CMV promotor (zatímco transkripční aktivátorový protein exprimovaný imortalizovanými buňkami nestimuluje řečený promotor).

Podle vynálezu může vektor nést další virové promotory, které jsou stimulovány řečenými transkripčními aktivátorovými proteiny, ale které nejsou funkčně spojeny s krev srážejícím faktorem. Takové virové promotory jsou vybrány z promotorů odvozených od adenoviru, Rous Sarcoma viru a cytomegaloviru. Vektor může dále obsahovat jednu nebo více z následujících funkčních sekvencí: selektivní markéry, regulační sekvence (např. PRE), atd.

Lidský krev srážející faktor podle formy (1) vynálezu zahrnuje, ale není tím omezen na, faktor IX, faktor XIII, faktor VII, faktor V, von Willebrandtův faktor (vWF) a podobné.

V přednostní formě (2) vynálezu, vektor zahrnuje DNA sekvenci kódující faktor VIII nebo jeho mutant. Zatímco rekombinantní faktor IX je obecně identický s proteinem divokého typu izolovaného z krevní plasmy, pro rekombinantní expresi bylo navrženo několik expresních vektorů obsahujících modifikovaný faktor VIII. Vzhledem ke struktuře domény funkčního polypeptidu faktoru Vlil jsou lokalizována důležitá interakční místa s vWF v A3-doméně (aminokyseliny 1680-1689), a v C2-doméně (Kaufman & Pipe, Haemophilia (1998) 4, 370-379). Bylo navrženo štěpení za 1689 pro uvolnění faktoru VIII od vWF a pro umožnění faktoru VIII interagovat s nabitými fosfolipidy. Bylo ukázáno, že konstrukty rekombinantního faktoru VIII, které nemají vWF-vazebné místo, jsou extrémně náchylné k proteolytickému štěpení, když jsou vpraveny do myší deficientních pro faktor VIII. Rekombinantní exprese konstruktů obsahujících zkrácený faktor VIII v savčích buněčných kulturách ukázala, že kompletním odstraněním B-domény se nezmění biologická aktivita příslušného proteinu podobného faktoru VIII (Eaton a kol., Biochemistry (1986), 25, 8343-8347). Pozorovaná rychlost exprese u konstruktů s delecemi v Bdoméně byla navíc značně vyšší v porovnání s faktorem divokého typu, a to díky zvýšení hladiny mRNA v buňkách (Pittman a kol., Blood (1993) 81,2925-2935). V současné době jsou na trhu čtyři produkty rekombinantních faktorů Vlil (Recombinate® Baxter Healthcare; Kogenate® a Kogenate FS® Bayer Corporation a Refacto® Wyeth, Genetics Institute).

V přednostní formě (3) vynálezu mutant faktoru VIII má alespoň jednu z následujících mutací (a) až (d):

(a) Val v pozici 162 byl nahrazen jiným neutrálním aminokyselinovým zbytkem;

(b) Ser v pozici 2011 byl nahrazen jiným hydrofilním aminokyselinovým zbytkem;

(c) Val v pozici 2223 byl nahrazen kyselým aminokyselinovým zbytkem, a (d) B-doména mezi pozicemi Arg740 a Glul649 byla nahrazena linkerovým peptidem bohatým na Arg, zahrnujícím 10 až 25, přednostně 14 až 20 aminokyselinových zbytků, kde očíslování řečeného faktoru VIII je vzhledem k matumí sekvenci faktoru VIII divokého typu ukázané v SEQ ID NO:2 (aminokyselinová sekvence maturního peptidu nezahrnuje 19 aminokyselinový signální peptid, ale zahrnuje celou B-doménu (WO/99/29848)).

„Jiný neutrální aminokyselinový zbytek“ podle předkládaného vynálezu zahrnuje Gly, Ala, Leu, lle, Met a Pro a přednostní je Ala. „Jiná hydrofilní aminokyselina“ zahrnuje Asn, Thr a Gin a přednostní je Asn. Kyselé aminokyselinové zbytky jsou vybrány z Glu a Asp a přednostní je Glu.

Mezi mutanty faktoru VIII formy (3) je přednostní, aby mutant faktoru Vlil měl alespoň jednu z mutací (a), (b) a (c), přednostnější je alespoň jedna z mutací (a) a (b), a nejpřednostnější všech-7CZ 303929 Β6 ny tři mutace (a) až (e), jak je definováno výše. Zejména je přednostní, aby mutant obsahoval všechny tři mutace VI62A, S201 IN a V2223E.

Ze stejného důvodu, má vektorová DNA sekvence formy (4) vynálezu mutace T485C, G6032A aT6668A vzhledem k DNA sekvenci maturního faktoru Vlil divokého typu ukázané v SEQ ID NO:1. V přednostní formě obsahuje DNA sekvence také tichou mutaci T6816C (znovu řečené očíslování je vzhledem k DNA sekvenci faktoru VIII divokého typu).

Mezi mutanty faktoru VIII formy (3) je alternativně upřednostňováno, aby mutant faktoru VIII měl mutaci, jak je definováno výše.

Přednostní expresní systém vynálezu využívá jedinečného mutantu faktoru VIII, který - kromě bodové mutace (a) až (c), jak zde bylo definováno dříve - částečně nebo úplně postrádá svou B-doménu, přednostně mutant, kde B-doména mezi pozicemi R.740 a El649 je nahrazena charakteristickým aminokyselinovým ramínkem bohatým na Arg, jak je výše definováno v (d). „Bohatý na Arg“ podle předkládaného vynálezu znamená, že řečené raménko (spacer) zahrnuje alespoň 3 a přednostně alespoň 4 Arg zbytky. V nejpřednostnější formě sestává řečený raménkový peptid z osmi aminokyselin B-domény divokého typu následovaných osmi aminokyselinami variabilní domény (viz Obr. 5A, SQ ID NO:9) V takovém konstruktu s modifikacemi B-domény diskutovanými zde dříve, zůstává navržené vWF-vazebné místo nezměněno, aby se zabránilo okamžitému proteolytickému štěpení sekretovaného faktoru VIII v buněčném kultivačním médiu nebo později léčených pacientů. Faktor VIII bude od vWF uvolněn pouze po specifické aktivaci štěpením trombinem. cDNA pro přednostní faktor VIII byla konstruována spojením čtyř DNA fragmentů, např., jak je popsáno v Příkladu 1.

Protein formy (3) vynálezu může zahrnovat další N- a C-terminální sekvence zahrnující, ale nejsou tím omezeny na, přirozený exportní signální peptid (odpovídající aminokyselinovým zbytkům -19 až -1 proteinů ukázaných v SEQ ID NOs 4, 13 a 15) nebo jeho fragment nebo analog, umělé peptidy (např. oligo-His-kotva pro vysoce afinitní purifikaci) a podobné.

Nej přednostnější vektor pro expresi faktoru VIII je vektor pTGF-8 ukázaný na Obr. 2. DNA sekvence řečeného vektoru je ukázána v SEQ ID NO: 3, a ta zahrnuje všech pět mutací popsaných zde dříve (mutanty T485C, G6032A, T6668 a T6816C (zde:T1217C, G4088A, T4724A a T4872C) a DNA sekvence kódující linker B-domény SEQ ID NO: 9) a kóduje mutant faktoru Vlil znázorněný v SEQ ID NO: 4.

Další nejpřednostnější vektory jsou pTGF8-2hyg-s a pTGF8-3, jejichž běžná molekulová struktura je znázorněná na Obr. 6. pTGF8-2hyg-s, ukázán v SEQ ID NO: 12, obsahující pouze tichou mutací T6818C, má za výsledek mutant faktoru VIII, který má nahrazenou B—doménu linkerovým peptidem SEQ ID NO: 9, ale nemá žádnou další změnu v primární struktuře vzhledem k sekvenci divokého typu SEQ ID NO: 2.

pTGF8-3, ukázán v SEQ ID NO: 14, obsahující mutace T485C, T6668A a T6816C, má za výsledek mutant faktoru VIII, který vykazuje aminokyselinové náhrady V162A a V2223E vzhledem k SEQ ID NO. 2, kromě náhrady B-domény, jak je popsáno výše.

V případě produkce faktoru VIII je kultivace prováděna za přítomnosti von Willebrandova faktoru, von Willebrandův faktor je přednostně použit v množství od 10 do 100, přednostněji od 50 do 60 mol vWF na mol faktoru VIII (v kultivačním médiu anebo v roztoku faktoru Vili během purifikační procedury (viz níže)).

V přednostní formě (4) předkládaného vynálezu lidský krev srážející faktor je faktor IX nebo jeho mutant, přednostně je divoký typ faktoru IX ukázán v SEQ ID NO: 5. Vhodné mutanty faktoru IX zahrnují bodové mutace a zkrácené formy faktoru IX. Nej přednostnější vektor pro expresí faktoru IX je vektor pTGFG36, ukázán na Obr. 3, a vektor pTG36hyg, ukázán na Obr. 4.

-8CZ 303929 B6

V případě produkce faktoru IX, je kultivace přednostně prováděna za přítomnosti vitaminu K, který může být přítomen v množství od 0,1 do 100 pg/ml kultivačního média, přednostněji od 1 do 20 pg/ml kultivačního média.

Způsob podle formy (1) vynálezu dále zahrnuje kroky (c) purifikace krev srážejícího faktoru izolovaného v kroku (b) nebo (d) vystavení krev srážejícího faktoru izolovaného v kroku (b) nebo purifikovaného v kroku (c) inaktivaci viru.

Vhodné purifikační kroky zahrnují způsoby, které jsou známy v oboru, pro maximalizaci výtěžku čistého, stabilního a vysoce aktivního produktu a jsou vybrány z metod; imunoafinitní chromatografie, ionexová chromatografie na anexu, gelová chromatografie, atd. a jejich kombinace. Detailní purifikační protokoly pro koagulační faktory z lidské krevní plazmy jsou např. uvedeny v WO93/15105, EP0813597, WO96/40883 a WO 96/15140/50. Tyto protokoly mohou být lehce adaptovány pro specifické požadavky potřebné pro izolaci rekombinantních faktorů VIII a IX. Účinný protokol pro faktor IX obsahuje precipitaci síranem amonným, následovanou DEAE a HIC (Hydrophobic interaction chromatography) pseudoafinitní chromatografií a také afinitní chromatografií na heparinu (US 5919909). Kvantita a aktivita purifikovaného proteinu během a po purifikační proceduře může být monitorována pomocí ELISA a koagulačními testy.

Pro překonání problémů možných infekčních kontaminací ve vzorcích purifikovaného proteinu nebo v produktu přímo získaném ze supematantu buněčné kultury obsahující vybraný sekretovaný rekombinantní protein, vzorky anebo supematant kultury mohou být upraveny procedurami pro inaktivaci viru, které zahrnují tepelnou úpravu (suchou nebo vlhkou, s nebo bez přidání chemických látek včetně inhibitorů proteas). Zvláště pro faktor Vili izolovaný z krevní plasmy bylo popsáno (WO 93/15105) znovuzískání vysoce purifikovaného proteinu, neobsahujícího aktivní virus, aniontovou iontoměničovou chromatografií. Kromě toho, bylo také popsáno několik postupů pro produkci vysoce purifikovaných, neinfekčních koagulačních faktorů z krevní plazmy nebo jiných biologických zdrojů. Lipidy obalené viry jsou účinně inaktivovány úpravou potenciálního infekčního materiálu hydrofobní fází, tvořící dvoufázový systém, ze kterého je ve vodě nerozpustná část následně odstraněna. Další výhoda byla v doplnění hydrofobní fáze úpravy, současně nebo následně s úpravou, neiontovými bifunkční detergenty a dialkyl nebo trialkylfosfáty (WO 9636369, EP 0131740, US 6 007 979). Neobalené viry vyžadují inaktivacní protokoly sestávající z úpravy neiontovými rozpouštědly následované zahřátím (60 až 65 °C) po několik hodin (WO 94/17834).

Z toho, co bylo uvedeno výše, se usuzuje, že kombinace účinného expresního systému založeného na lidské buněčné linii společně s potvrzenými způsoby inaktivace potenciálně nebezpečných infekčních činitelů, slouží jako bezpečný a jednoduchý systém pro produkci rekombinantních koagulačních faktorů.

Navíc, podle formy (6) vynálezu je poskytnut vynikající mutant faktoru VIII. Řečený mutant faktoru VIII může být součástí farmaceutických směsí, může být použit pro přípravu léků pro léčbu hemofilie a může být aplikován ve způsobech léčby hemofilie (formy (11) až (13) vynálezu). Shora uvedené farmaceutické směsi a shora uvedené léky mohou zahrnovat faktor VIII v terapeuticky účinných dávkách, např., od 50 do 500 pg (200 ng faktoru VIII odpovídá jedné mezinárodní jednotce (International Unit IU)). V závislosti na typu hemofilie, obdrží pacient roční dávku faktoru VIII až do 200 000 IU, kteráje obvykle podávána v dávkách jednou nebo dvakrát týdně.

Farmaceutické směsi, léky nebo preparáty aplikované ve způsobech léčby hemofilie forem (11) až (13), obsahují terapeuticky účinnou dávku mutantu faktoru VIII formy (6) nebo vektor pro přenos genu formy (9). V případě prvně jmenovaného může dále zahrnovat farmaceuticky přijatelné přísady včetně lidského sérového albuminu (HSA; přednostně roztok přibližně 1 mg/ml); anorganické soli jako CaCU (přednostně 2 až 5 mM), aminokyseliny jako glycin, lysin a histidin

-9CZ 303929 Β6 (přednostně 0,1 až 1M na aminokyselinu); disacharidy jako sacharosa anebo trehalosa (přednostně 0,4 až 1 M); organické soli jako Na-citrát (přednostně do 50mM); atd. Preparáty mohou být vodné nebo nevodné. Ve druhém případě je hlavní složkou glycerol anebo polyethylenglykol (např. PEG-300). Preparáty mohou být v suché formě, (aby se daly rozpustit v potřebném rozpouštědle před podáním).

Jak bylo vysvětleno výše, vektor pro přenos genu v souladu s formou (9) vynálezu může být také součástí farmaceutických směsí, může být použit pro přípravu léků pro léčbu hemofilie a může být aplikován ve způsobech léčby hemofilie (formy (11) až (13) vynálezu). Řečené farmaceutické směsi nebo léky mohou dále zahrnovat vhodné složky jako např. lipidy nebo hormony jak je diskutováno v WO 00/49147 (jehož výsledky jsou zde vloženy referencí). Farmaceutická směs nebo lék zahrnující vektor pro přenos genu nebo vektor pro přenos genu předkládaného vynálezu mohou být podávány orálně, nitrožilně, nitrosvalově, podkožně, místně, přes sliznice (včetně ústní a nosní) nebo pomocí genového děla. Orální podávání (např., v mikromleté hormonální disperzi) je přednostní.

Mutant faktoru VIII formy (6) vynálezu je přednostní, jak je definováno referencí formy (3) uvedené výše. Řečený mutant FV11I může být dále připraven standardními rekombinantními technikami, např. způsobem zahrnujícím (a) kultivaci hostitelských buněk transformovaných vektorem formy (8) anebo zahrnující DNA formy (7) (která zahrnuje kultivaci imortalizované buněčné linie stabilně exprimující alespoň jeden virový transkripční aktivátorový protein a nesoucí vektor obsahující virový transkripční promotor funkčně spojený s DNA sekvencí, kódující lidský krev srážející faktor, kde řečení virový promotor je stimulovaný řečeným, alespoň jedním, virovým transkripčním proteinovým aktivátorem); a (b) izolaci krev srážejícího faktoru z kultivačního média. Vhodné imortalizované buněčné linie, transkripční proteinové aktivátory a virové promotory jsou ty, které jsou zde uvedeny výše. Imortalizovaná buněčná linie využívá v určeném způsobu přednostně exprese dvou virových transkri pěních aktivátorových proteinů, nej přednostněji teplotně senzitivního SV40 T antigenu aElA proteinu adenoviru. Způsob může dále zahrnovat purifikací a inaktivaci viru, kroky (c) a (d), popsané zde výše.

Komerčně dostupná buněčná linie 293 T (ECACC: tsa201, cit. 96121229) byla zařazena do DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Germany) dne 20. února 2001, pod depozičním číslem DSM ACC2494.

Vynález je dále doložen následujícími příklady.

Příklady

Příklad 1 - Klonování faktoru VIII:

Sekvence pro rekombinantní faktor VIII byla získána reverzní transkripcí z celkové hepatocelulární RNA. Pomocí standardního PCR byly amplifikovány čtyři fragmenty (1/2, 3/4, 5/6, 7/8) použitím primerů navržených tak, aby nesly restrikční místa. Pro začlenění dohromady fragmentů 3/4 a 5/6 fragment, Smal/Sall zplazmidu pBSFVIII3/4 byl vložen tupě do Sáli místa pBSFVI15/6 za vzniku pBSFVIII3/6. Dále, fragment 3/6 byl získán štěpením pBSFVIII3/6 pomocí Xhol/BspHl a parciálně Alw441. Tento fragment a Pstl/Alw441 fragment z pBSFVIIIl/2 byly jednokrokově ligovány do vektoru pBSFVIIIl/2, štěpeného Pstl a Xhol, a tímto způsobem vznikl pBSFVIII 1/6. Fragment 7/8 byl získán štěpením pBSFVIII7/8 pomocí Smál a parciálně Mval269I a ligován do pBSFVIIIl/6, štěpeného Xhol aMval269I za vzniku pBSFVIIIl/8.

- 10CZ 303929 B6

Nakonec fragment Smal/Xhol z pBSFVIH 1/8 byl vložen tupě do Sáli místa ve vektoru Octagerie vector pTGFG67 (konstrukce řečeného vektoru je zahrnuta v PCT/EP00/01368), což mělo za výsledek eukaryotický expresní vektor pro lidský faktor VIII pTGF8-l (viz obrázky 1 a 2). Výsledný vektor kóduje mutant faktoru Vlil, obsahující mutace V12A, S201 IN a V2223E.

Příklad 2 - Klonování faktoru IX:

Vektor pUC19 (MBI Fermentas) byl štěpen Xbal, upraven Klenowovým fragmentem a znovu ligován. Tento vektor, nesoucí deleci Xbal místa, byl poté štěpen EcoRI, upraven Klenowovým fragmentem a znovu ligován, aby se dosáhlo delece EcoRI místa. Pro vnesení Xbal místa do Sací místa tohoto vektoru byl štěpen Sací, upraven T4 DNA polymerasou, defosforylován alkalickou fosfatasou a ligován spolu s Xbal linkerem CTCTAGAG (Biolabs # 1032). Další Xbal místo bylo vloženo štěpením nově vytvořeného vektoru pomocí HindlII, upravením Klenowem, defosforylací alkalickou fosfatásou a ligací společně s Xbal-linkerem CTCTAGAG (Biolabs # 1032). Tento vektor byl nazván pUC19/X.

Za účelem zrušit Xbal místo ve vektoru phGFP-S65T (Clontech) byl tento vektor štěpen Xbal, upraven Klenowem a religován za vzniku vektoru pGFP/0. Po štěpení pGFP/0 enzymem Mlul byl izolován fragment 2,3 kbp dlouhý obsahující GFP gen, který byl upraven Klenowovým enzymem a štěpen BamHÍ. Tento fragment byl štěpen Sáli, upraven Klenowovým enzymem a štěpen BamHI. Výsledný vektor byl nazván pTGFGl.

Oligonukleotidy (Metabion PRE-S (5'-GGG GTA CCA GCT TCG

TAG	CTA	GAA	CAT	CAT	GTT	CTG	GGA	TAT	CAG CTT CGT AGC	TAG	AAC
ATC	ATG	TTC	TGG	TAC	CCC-	•3';	SEQ	ID NO: 10} a PRE-AS	(5'-	-GGG
GTA	CCA	GAA	CAT	GAT	GTT	CTA	GCT	ACG	AAG CTG ATA TCC	CAG	AAC
ATG	ATG	TTC	TAG	CTA	CGA	AGC	TGG	TAC	CCC-3'; SEQ ID	NO:	11)

byly hybridizovány a pomocí kinásové reakce fosforylovány za vzniku insertu PRE(ds).

Vektor pTGFGl byl štěpen EcoO109I, upraven Klenowovým enzymem a defosforylován alkalickou fosfatasou. Poté byl ligován společně s PRE(ds) insertem za vzniku vektoru pTGFG5.

Vektor pUC19 (MBI Fermentas) byl štěpen Sáli, upraven Klenowovým enzymem a defosforylován alkalickou fosfatasou. Poté byl ligován do Notl-linkeru GCGGCCGC (Biolabs # 1045) za vzniku vektoru pUC19/N.

cDNA faktoru IX byla amplifikována z lidské jatemí cDNA (Clontech) použitím dvou primerů, které zahrnují startovací a terminační kodón otevřeného čtecího rámce faktoru IX za vzniku fragmentu dlouhého 1387 pb, který obsahuje celý otevřený čtecí rámec. Pro usnadnění klonování byly na konci každého primeru vloženy restrikční místa pro EcoRI (proti směru) a BamHI (po směru). Amplifikace byla provedena pomocí Pwo DNA-polymerasy (Boehringer Mannheim) v 50μ1 reakčním objemu [lOmM Tris HCI pH 8,85, 25mM KC1, 5mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄] s 30 inkubačními cykly 1 min při 96 °C, 1 min při 60 °C, 2 min při 72 °C, následované závěrečnou extenzí 10 min při 72 °C.

Reakční produkty byly ligovány do EcoRI a BamHI míst ve vektoru pUC19 a transformovány do E.coli DH5-ct. Byly vybrány pozitivní klony. Sekvence byly potvrzeny sekvenováním (Amersham) z obou konců použitím značených primerů (IR-700) a automatickou analýzou LiCor sekvenačním systémem (MWG, Biotech).

Byly použity následující primery:

GGAATTCCGCAAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGC (proti směru ;

SEQ. ID. NO: 16)

CGCGGATCCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC (po směru;

SEQ.ID.NO: 17)

Fragment dlouhý 1,4 kb obsahující otevřený čtecí rámec lidského koagulačního faktoru IX, izolovaný z lidské cDNA knihovny, byl vložen do Pstl místa shora uvedeného připraveného vektoru pUC19/N, který byl štěpen Pstl, upraven T4 polymerasou a defosforylován alkalickou fosfatasou. Z výsledného vektoru pUC19/N-FIX byl dvojitým štěpením pomocí HindllI a Notl vyštěpen 1,4 kb fragment obsahující otevřený čtecí rámec lidského koagulačního faktoru IX. Tento fragment byl ligován do 4,3 kb fragmentu vektoru pTGTG5 štěpeného dvěma enzymy, HindllI a Notl, za vzniku vektoru pTGFG36, ukázaného na Obr. 3. Tento vektor je přednostní pro přenos expresní kazety kódující faktor IX do buňky, ajeho DNA sekvence je poskytnuta v SEQ ID NO: 6.

Příklad 3 - Lidská buněčná linie pro expresi proteinu:

Přednostní buněčná linie je tsA201 (ECACC Ref.: 96121229), což je transformovaná embryonální lidská ledvinová buněčná linie (293, ECACC Číslo 85120602) stabilně exprimující SV40 teplotně-senzitivní T antigen (J. Membrane Biol. 1996; 152: 39; Gene 1995; 156:235; PNAS USA 1994; 91:12785; Pflugers Arch. 1994; 427:136; J. Gen. Physiol. 1994; 104: 507; BioTechniques 1993; 15:906). Další názvy pro tuto buněčnou linii zahrnují 293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7: 379) a 293T. Tato epitelu podobná buněčná linie byla použita v různých funkčních expresních testech a byla publikována produkce vysokých hladin rekombinantních proteinů. Mohou být kultivovány v DMEM doplněném 2mM glutaminem a 10% FCS. Pro účinnou produkci faktoru IX, může být médium modifikováno přídavkem vitaminu Kaž do 100 pg/ml (US 4770999).

Pro zjednodušení purifikace exprimovaného polypeptidu, mohou být buňky kultivovány v médiu bez séra nebo v médiu bez proteinů, obsahující vhodné doplňky. Z důvodu stability vyžaduje sekretovaný faktor VIII přítomnost vWF v médiu (US 5198349). Byl také publikován přídavek lipoproteinů, fosfolipidů, polyglykolů, stopové množství kovů, heparinu, neionogenních surfaktantů nebo cyklodextrinu (EP 0254076, US 5679549, US 5198349, US 5250421, US 5576194, EP 0872487, WO 94/11525, US 5378612).

Příklad 4 - Transfekce 293T buněk fosforečnanem vápenatým pro transientní produkci faktoru VIII a IX:

Den před transfekci byly konfluentní 293T buňky nasazeny na 10 ml misky o nízké hustotě v 6 ml DMEM/10% FCS (10 pg/ml vitamin K pro FIX). Transfekce byla zhruba provedena podle Chen a Okayama (Mol. Cell. Biol., 7: 2745 (1987)). 12 pg plasmidů pTGF8-l bylo transfekováno pro produkci faktoru VIII a pTGFG36 pro produkci faktoru IX. Šest hodin po transfekci bylo médium nahrazeno čerstvým a supematant byl sklizen tři dny po transfekci a byl buď dále purifikován nebo byl bez další purifikace analyzován pomocí ELISA nebo koagulometrie (viz Příklady 5 a 6).

- 12CZ 303929 B6

Příklad 5 - ELISA Stanovení koncentrace FIX a FVIII:

Faktor IX: Hladiny lidského faktoru IX v supernatantu transfekovaných 293T buněk byly stanoveny pomocí ELISA za použití kozích polyklonálních protilátek proti lidskému FIX (Enzyme Research Laboratories). Všechny inkubace byly prováděny dvě hodiny ve vlhké komůrce při 22 °C. Misky (Dynex, Immulon-4) byly pokryty 100 μΐ 8,8 pg protilátky/ml pufru pro zakotvení. Za těchto popsaných podmínek není nutné blokování. Pro zablokování nespecifických interakcí je dostatečně čtyřnásobné promytí misek (Encore 2000, Merck) roztokem PBS-Tween® (0,1% v/v).

Po každém dalším kroku je nezbytné promývání, aby se odstranily nenavázané proteiny. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ supernatantu upraveného přídavkem 10 μΐ ÍOmM PMSF a 10 μΐ 0,11M citrátu sodného. Ředění vzorků a standardu (lidský faktor IX, house standard, Octapharma) bylo provedeno v ředícím pufru (HBS-BSA-EDTA-Tween®) a inkubováno 100 μΐ/jamku. Detekční protilátkou byla peroxidasou značená kozí polyklonální anti-FIX protilátka (Enzyme Research Laboratories) o koncentraci 1 pg protilátky/ml ředícího pufru a inkubována 100 μΐ/jamku. Jako substrát bylo do každé jamky přidáno 150 pl ABTS (Roche), kolorimetrická reakce byla detekována při 405 nm po 1-2 hodinách. Výsledky byly spočítány lineární regresí koncentrace standardu oproti absorbanci standardu a byly shrnuty do následující tabulky:

Počet buněk	Koncentrace faktoru	Koagulační čas
[/ml]	IX [ng/ml]	Es]
2,1 x 105	36	45
8,7 x 106	20	79

Normální plasma: 37-39 s

Plasma deficientní na faktor IX: 137-140 s

Faktor VIII: Hladina lidského rekombinantního faktoru VIII v kultivačním filtrátu transfekovaných 293T buněk byla stanovena pomocí ELISA použitím afinitně purifikované polyklonální ovčí proti FVIII protilátky: C preparát (F8C-EIA-C, Affinily Biologicals). Navázání bylo prováděno 2 hodiny ve vlhkých komůrkách při 22 °C. Misky (Dynex, Immulon-4) byly potaženy 100 μΐ 100 x naředěné protilátky v pufru pro zakotvení (50mM uhličitan sodný pH 9,6). Čtyřnásobné promytí misek (Encore 2000, Merck) PBS-Tween® (0,1% v/v) bylo dostatečné pro zablokování nespecifických interakcí.

Po každém dalším kroku bylo nutné promytí pro odstranění nenavázaných proteinů. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ každého vzorku filtrátu kultury odebrané z různých 293T klonů stabilně transfekovaných pTGF8-3 po 48 hodinách. Ředění standardu FVIII (house standard, Octapharma) bylo provedeno v ředícím pufru (HBS-BSA-EDTA-Tween®) a inkubováno 100 μΐ/jamku. Pro detekci bylo připravené ředění peroxidasou značené polyklonální anti—FVIII (F8C-EIA-D, Affinity Biologicals) protilátky, 100 μΐ/jamku, inkubováno 60 minut. Pro kolorimetrickou reakci byla krátce před použitím rozpuštěna 5 mg tableta O-Fenylendiaminu (P-6912, Sigma) ve 12 ml substrátového pufru a doplněno 12 μΐ 30% H₂O₂. 150 μΐ tohoto substrátového roztoku bylo přidáno ke každé jamce a kolorimetrické zaznamenání bylo provedeno MRX čtečkou (Dynex) při 490 nm po 10 minutách inkubace při laboratorní teplotě ve tmě a po zastavení reakce přídavkem 50 μΐ 2,5M H₂SO₄ ke každé jamce. Výsledky byly spočítány lineární regresí koncentrací standardu oproti absorbancím standardu (Obr. 7 A) ajsou shrnuty v Obr. 7 B.

- 13 CZ 303929 B6

Příklad 6: Detekce aktivity lidského koagulačního faktoru Vlil a faktoru IX

Koagulační aktivita lidského rekombinantního faktoru VIII v supernatantech buněčné kultury 293T buněk (transfekovaných precipitací fosforečnanem vápenatým s pTGF8-l, jak je popsáno v Příkladu 4) byla stanovena následovně:

Koagulační aktivita byla testována na základě testu částečného tromboplastinového času použitím aktivace kefalinu (fosfatidylethanolamin) manuálním koagulačním přístrojem (ML-2, Instrumentation Laboratories). Pro analýzu bylo 100 μΙ nezředěného supernatantu z transfekovaných 293 T buněk, 100 μΙ deficientní plasmy (Progen) a 100 μΙ Kefalinu (Instrumentation Laboratories) inkubováno 5 minut při 37 °C. Koagulace byla zahájena přídavkem 100 μΙ CaCl₂. Čas koagulace vzorku byl porovnán s normální plasmou. Výsledky jsou shrnuty na Obr. 5B. Jak je zřejmé z Obr. 5B, buněčný supernatant z buněk transfekovaných pTGF8-l vykazuje koagulační aktivitu srovnatelnou s normální plasmou, zatímco netransfekované buňky dávají hodnotu rovnocennou plasmě bez faktoru VIII.

Podobný test je prováděn s faktorem IX. Výsledky jsou ukázány v Tabulce Příkladu 5. Pro závislost exprese na přítomnosti vitaminu K viz Obr. 10.

Příklad 7 - Inaktivace viru:

Inaktivace viru byla provedena v souladu se způsobem Patentu US 6 007 979. Jmenovitě, k potenciálnímu infekčnímu proteinovému roztoku byly za míchání postupně přidány následující sloučeniny:

1. 0,2 ml Tween® 80 a 0,06 ml TNBP bylo přidáno k 19,74 ml roztoku nebo

2. 0,2 ml Triton X-100 a 0,2 ml TNBP bylo přidáno k 19,6 ml roztoku.

ml ricinového oleje byl přidán k preparátům 1 a 2, které byly poté intenzivně extrahovány 1 hodinu při laboratorní teplotě.

Pro oddělení fáze byla v každém případě použita centrifugace. Pro kontrolu infektivity byly opakovaně odebrány 1 ml vzorky z vodných frakcí.

Příklad 8 - Zavedení buněčné linie stabilně exprimující faktor VIII a faktor IX:

Přednostní vektory pTGF8-l a pTGTG36 zahrnují konstrukty pro transientní expresi faktoru Vlil (vektor pTGF8-l) a faktoru IX (vektor pTGFG36), v savčích buňkách. Pro umožnění způsobu selekce pro stabilně transfekovaný buněčný klon byla do Smál místa, přítomného v obou vektorech, klonována kazeta pro hygromycin-B-fosfotransferasu (fragment HindlII-Mva 12601 zTK-Hyg, Clontech). Výsledné konstrukty (pTGF8-l-hyg a pTG36hyg) potom zahrnují in cis expresní kazety pro lidský faktor VIII nebo faktor IX s CMV promotorem a SV40 polyadenylačním signálem a hygromycin-B-fosfotransferasovou kazetu s HSV thymidinkinasovým promotorem a HSV thymidinkinasovým polyadenylačním signálem (viz Obr. 4).

Vektory pTGF8-2hyg-s a pTGF8-3 (Obr. 6, SEQ ID NO: 12 a 14) jsou deriváty pTGF8-lhyg, vtom, že bodové mutace V162A, S2011N a V2223E (pTGF8-2hyg-s) a S201 lN(pTGF8-3) byly změněny na sekvence divokého typu pomocí PCR metody použitím QuickChange protokolu (Stratagene).

Kódující sekvence pro koagulační faktory může být nahrazena jakoukoli vybranou genovou sekvencí. Tyto konstrukty dovolují zavedení stabilně exprimujících buněčných linií pomocí

- 14CZ 303929 B6 transfekce fosforečnanem vápenatým a následnou selekci pomocí hygromycinové rezistence. Navíc plasmidy obsahují element reagující na progesteron (PRE - progesterone responsive element). V pokusech transientní transfekce s pTG36TG36hyg je produkce aktivního faktoru IX okolo 40 ng na ml kultivačního media, jak může být ukázáno pomocí ELISA a koagulometrickým testem (víz příklady 5 a 6).

Pro produkci faktoru IX byly 293T buňky kultivovány v DMEM doplněného 10% FCS a vitaminem K 10 pg/ml (patent US: 4 770 999; viz také Obr. 10). Nejdříve musí být zavedena kritická koncentrace antibiotik pro účinnou selekci stabilně transfekovaných 293T buněk. Pro tento účel byly buňky nasazeny v nízkém naředění a rostly v přítomnosti hygromycinu B od 10 do 800 pg/ml. Po dvou týdnech při 200 pg/ml nebo vyšší nerostly žádné buňky, takže tato koncentrace byla vybrána pro selekci stabilně transfekovaných buněk.

Typická transfekce byla prováděna v 10 cm miskách s 293T buňkami rozdělenými den před tím v poměru 1:15. Použitím metody precipitace fosforečnanu vápenatého (Biotechniques 1988 6: 7 632-638) bylo transfekováno 12 pg plasmidu na misku a o dva dny později bylo medium vyměněno za nové obsahující 200 pg/ml hygromycinu B. Po dvou až třech týdnech selekce bylo medium testováno pomocí ELISA (viz příklad 5) pro přítomnost faktoru VIII nebo IX. Pozitivní klony byly izolovány a přeneseny do 24 jamkové misky. Po testování provedeném pomocí ELISA a po stanovení aktivity byly pozitivní klony vystaveny dalším dvěma cyklům klonování a poté rozmnoženy a jejich alikvoty byly zamraženy pro další použití a charakterizaci.

Příklad 9: důkaz fenotypové shody stabilně transfekovaných buněk pomocí in šitu imunofluorescenční detekce faktoru VIII:

Každé, 5 5x10⁷ 293T buňky stabilně transfekované pTGF8-3 (klon 49/19) a netransfekované 293T buňky (negativní kontrola) z adhezních kultur v DMEM + 9,1% FBS byly z kultivačních misek odděleny trypsinací, několikrát promyty a resuspendovány v 5 ml PBS pufru.

μΐ těchto buněčných suspenzí byly přeneseny na sterilní mikroskopické sklíčko a byly inkubovány při laboratorní teplotě do vypaření veškeré tekutiny. Buňky byly 10 min fixovány v 70% ethanolu a sušeny 5 min při laboratorní teplotě. Sklíčka byla blokována proti nespecifické detekci inkubací v zředěném 10% FBS v PBS pufru. Primární protilátka (sh anti FVII1: C FVIIIC-EIAC, Affinity Biologicals) byla naředěna stokrát pomocí PBS pufru obsahujícím 10 % FBS a 0,1% saponin a inkubována při laboratorní teplotě 60 min ve vlhké inkubační komůrce. Po důkladném promytí PBS bylo připraveno stonásobné ředění sekundární protilátky (rb anti sh CY3 konjugát 313-165-003, Jackson ImmunoResearch) a inkubována podobně, jak je popsáno výše. Následně byl mikroskopický preparát intenzivně promyt a pokryt vrstvou 50% glycerolu a krycím sklíčkem. Buňky byly vizualizovány bílým světlem a pomocí fluorescenčního mikroskopu (emise při 570 nm). Výsledky jsou znázorněny na Obr. 8.

Příklad 10: test teplotní stability rekombinantního faktoru IX v kultivačním filtrátu:

Kultivační filtrát sklizený z 293T buněk 48 h po transientní transfekci pTGF36 za přítomnosti vitaminu K 100 pg/ml a skladovaný při -80 °C po sedm dnů, byl rychle roztaven, rozdělen do 7 500 μΐ alikvotů, které byly poté podrobeny následujícím teplotním inkubacím:

- 15 CZ 303929 B6

vzorek	Teplota (°C)	Cas (min)
1	0	240
2	20	30
3	20	60
4	20	240
5	37	30
6	37	60
7	37	240

Vzorky byly ochlazeny na ledu, byla stanovena aktivita FIX, jak je naznačeno v příkladu 6 (dvojitá stanovení). Výsledky jsou ukázány v tabulce 9. Aktivita zůstává téměř stabilní během inkubačních podmínek do 240 min při 37 °C.

Seznam sekvencí <110> Octagene GmbH < 120> Produkce rekombinantních krev srážejících faktorů v lidských buněčných liniích <130> 010613wo/JH/ml <140>

<141>

<160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6996 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(6996) <400> 1

gcc Ala 1

acc Thr

aga Arg

aga tac tac ctg

ggt Gly

gca gtg gaa ctg tea tgg gac tat

48

Axg

Tyr Tyr Leu 5

Ala Val Glu 10

Leu Ser

Trp Asp Tyr 15

atg

caa

agt

gat

ctc

ggt

gag

ctg

cct

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

cct

96

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

20

25

30

aga

gtg

cca

aaa

tet

ttt

cca

ttc

aac

acc

tea

gtc

gtg

tac

aaa

aag

144

- 16CZ 303929 B6

Arg Val

Pro Lys Ser Phe Pro Phe

Asn Thr Ser Val Val 45

Tyr

Lys

Lys

35

40

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gtt

cac

Ctt

ttc

aac

atc

gct

aag

cca

192

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

Leu

Phe

Asn

Ile

Ala

Lys

Pro

50

55

60

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

cta

ggt

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

240

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

Glu

Val

65

70

75

80

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

Ctt

aag

aac

atg

gct

tcc

cat

cct

gtc

288

Tyr Asp

Thr

Val

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

85

90

95

agt

ctt

cat

gct

gtt

ggt

gta

tcc

tac

tgg

aaa

gct

tet

gag

gga

gct

336

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

100

105

110

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

384

Glu

Tyr Asp Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp Asp

Lys

Val

115

120

125

ttc

cct

ggt

gga

agc

cat

aca

tat

gtc

tgg

cacf

gtc

ctg

aaa

gag

aat

432

Phe

Pro

Gly

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

130

135

140

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

ctt

acc

tac

tea

tat

ctt

tet

480

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

145

150

155

160

cat

gtg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

tea

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

528

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Leu

165

170

175

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

576

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

180

185

190

- 17CZ 303929 B6

cac aaa ttt ata cta

ctt Leu

ttt Phe

gct gta ttt gat gaa ggg aaa agt

tgg Trp

624

His

Lys

Phe 195

Ile

Leu

Ala 200

Val

Phe Asp

Glu

Gly 205

Lys

Ser

cac

tea

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg

atg

cag

gat

agg

gat

gct

gca

tet

672

His

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ala

Ser

210

215

220

gct

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

720

Ala

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

225

230

235

240

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

agg

aaa

tea

gtc

tat

tgg

cat

768

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

245

250

255

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

gtg

cac

tea

ata

ttc

ctc

gaa

816

Val

Ile

Gly

Met

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu

Val

His

Ser

Ile

Phe

Leu

Glu

260

265

270

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

ege

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

864

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

Ile

275

280

285

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

gct

caa

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

912

Ser

Pro

Ile

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

290

295

300

cag

ttt

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

960

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

305

310

315

320

gaa

gct

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

cca

gag

gaa

ccc

caa

cta

ega

1008

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

325

330

335

atg

aaa

aat

aat

gaa

gaa

gcg

gaa

gac

tat

gat

gat

gat

ctt

act

gat

1056

- 18CZ 303929 B6

Met

Lys

Asn

Asn 340

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp 345

Tyr Asp

Asp

Asp

Leu 350

Thr

Asp

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

gat

gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

1104

Ser

Glu

Met 355

Asp

Val

Val

Arg

Phe 360

Asp Asp Asp

Asn

Ser 365

Pro

Ser

Phe

atc

caa

att

ege

tea

gtt

gcc

aag

aag

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

1152

Ile

Gin 370

Ile

Arg

Ser

Val

Ala 375

Lys

Lys

His

Pro

Lys 380

Thr

Trp

Val

His

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

1200

Tyr 385

Ile

Ala

Ala

Glu

Glu 390

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr 395

Ala

Pro

Leu

Val

Leu 400

gcc

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

1248

Ala

Pro

Asp

Asp Arg 405

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin 410

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly 415

Pro

cag

cgg

att

ggt agg

aag

tac

aaa

aaa

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

1296

Gin

Arg

Ile

Gly Arg 420

Lys

Tyr

Lys

Lys 425

val

Arg

Phe

Met

Ala 430

Tyr

Thr

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

att

cag

cat

gaa

tea

gga

atc

1344

Asp

Glu

Thr 435

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu 440

Ala

Ile

Glrt

His

Glu 445

Ser

Gly

Ile

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

1392

Leu

Gly 450

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly 455

Glu

Val

Gly

Asp

Thr 460

Leu

Leu

Ile

Ile

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

1440

Phe 465

Lya

Asn

Gin

Ala

Ser 470

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile 475

Tyr

Pro

His

Gly

Ile 480

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tea

agg

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

1488

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

485 490 495

- 19CZ 303929 B6

cat ttg aag gat

ttt cca att ctg cca gga gaa ata ttc

aaa tat Lys Tyr 510

aaa Lys

1536

His

Leu

Lys Asp 500

Phe

Pro

lle

Leu

Pro 505

Gly

Glu

lle Phe

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

act

aaa

tca

gat

cct

cgg

tgc

1584

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

515

520

525

ctg

acc

ege

tat

tac

tet

agt

ttc

gtt

aat

atg

gag

aga

gat

cta

get

1632

Leu

Thr

Arg

Tyr Tyr

Ser

Ser

Phe

Val

Asn

Met

Glu

Arg Asp

Leu

Ala

530

535

540

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

1680

Ser

Gly

Leu

lle

Gly

Pro

Leu

Leu

lle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

545

550

555

560

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

1728

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

lle

Met

Ser

Asp

Lys Arg

Asn

Val

lle

Leu

Phe

565

570

575

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

age

tgg

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

1776

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

lle

Gin

580

585

590

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

cag

ctt

gag

gat

cca

gag

ttc

1824

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

595

600

605

caa

gcc

tec

aac

atc

atg

cac

age

atc

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

1872

Gin

Ala

Ser

Asn

lle

Met

His

Ser

lle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

610

615

620

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

1920

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

lle

Leu

625

630

635

640

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

tet

gtc

ttc

ttc

tet

gga

tat

1968

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin 645

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser 650

Val

Phe

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

cta

ttc

cca

2016

Thr

Phe

Lys

His 660

Lys

Met

Val

Tyr

Glu 665

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Pro

ttc

tca

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

tcg

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

2064

Phe

Ser

Gly 675

Glu

Thr

Val

Phe

Met 680

Ser

Met

Glu

Asn

Pro 685

Gly

Leu

Trp

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttt

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gcc

2112

Ile

Leu 690

Gly

Cys

His

Asn

Ser 695

Asp

Phe

Arg

Asn.

Arg 700

Gly

Met

Thr

Ala

tta

ctg

aag

gtt

tet

agt

tgt

gac

aag

aac

act.

ggt

gat

tat

tac

gag

2160

Leu 705

Leu

Lys

Val

Ser

Ser 710

Cys Asp

Lys

Asn

Thr 715

Gly Asp

Tyr

Tyr

Glu 720

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tca

gca

tac

ttg

CtCf

agt

clelcl

aac

aat

gcc

2208

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp 725

Ile

Ser

Ala

Tyr

Leu 730

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn 735

Ala

att

gaa

cca

aga

age

ttc

tcc

cag

aat

tca

aga

cac

cct

age

act

agg

2256

Ile

Glu

Pro

Arg 740

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn 745

Ser

Arg

His

Pro

Ser 750

Thr

Arg

caa

aag

caa

ttt

aat

gcc

acc

aca

att

cca

gaa

aat

gac

a ta

gag

aag

2304

Gin

Lys

Gin 755

Phe

Asn

Ala

Thr

Thr 760

Ile

Pro

Glu

Asn

Asp 765

Ile

Glu

Lys

act

gac

cct

tgg

ttt

gca

cac

aga

aca

cct

atg

cct

aaa

ata

caa

aat

2352

Thr

Asp 770

Pro

Trp

Phe

Ala

His 775

Arg

Thr

Pro

Met

Pro 780

Lys

Ile

Gin

Asn

gtc

tcc

tet

agt

gat

ttg

ttg

atg

ctc

ttg

ega

cag

agt

cct

act

cca

2400

Val 785

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu 790

Leu

Met

Leu

Leu

Arg 795

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro 800

-21 CZ 303929 B6

cat ggg cta tcc tta tet gat ctc caa gaa gcc aaa tat gag act ttt

2448

His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr

Phe

805

810

815

tet

gat

gat

cca

tea

cct

gga

gca

ata

gac

agt

aat

aac

age

ctg

tet

2496

Ser

Asp

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

Ile

Asp

Ser

Asn

Asn

Ser

Leu

Ser

820

825

830

gaa

atg

aca

cac

ttc

agg

cca

cag

ctc

cat

cac

agt

ggg

gac

atg

gta

2544

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

Leu

His

His

Ser

Gly Asp

Met

Val

835

840

845

ttt

acc

cct

gag

tea

ggc

ctc

caa

tta

aga

tta

aat

gag

aaa

ctg

ggg

2592

Phe

Thr

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Leu

Asn

Glu

Lys

Leu

Gly

850

855

860

aca

act

gca

gca

aca

gag

ttg

aag

aaa

ctt

gat

ttc

aaa

gtt

tet

agt

2640

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Phe

Lys

Val

Ser

Ser

865

870

875

880

aca

tea

aat

aat

ctg

att

tea

aca

att

cca

tea

gac

aat

ttg

gca

gca

2688

Thr

Ser

Asn

Asn

Leu

Ile

Ser

Thr

Ile

Pro

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala

Ala

885

890

895

ggt

act

gat

aat

aca

agt

tcc

tta

gga

ccc

cca

agt

atg

cca

gtt

cat

2736

Gly

Thr

Asp

Asn

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Pro

Pro

Ser

Met

Pro

Val

His

900

905

910

tat

gat

agt

caa

tta

gat

acc

act

cta

ttt

ggc

aaa

aag

tea

tet

ccc

2784

Tyr Asp

Ser

Gin

Leu

Asp

Thr

Thr

Leu

Phe

Gly

Lys

Lys

Ser

Ser

Pro

915

920

925

ctt

act

gag

tet

ggt

gga

cct

ctg

age

ttg

agt

gaa

gaa

aat

aat

gat

2832

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

Glu

Glu

Asn

Asn

Asp

930

935

940

tea

aag

ttg

tta

gaa

tea

ggt

tta

atg

aat

age

caa

gaa

agt

tea

tgg

2880

-22 CZ 303929 B6

ser Lys 945	Leu	Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp
950	955	960
gga aaa	aat	gta tcg tca aca	gag agt ggt agg	tta ttt aaa ggg aaa 2928
Gly Lys	Asn	Val Ser Ser Thr 965	Glu Ser Gly Arg 970	Leu Phe Lys Gly Lys 975
aga gct	cat	gga cct gct ttg	ttg act aaa gat	aat gcc tta ttc aaa 2976
Arg Ala	His	Gly Pro Ala Leu 980	Leu Thr Lys Asp 985	Asn Ala Leu Phe Lys 990
gtt agc	atc	tet ttg tta aag	aca aac aaa act	tcc aat aat tca gca 3024
val Ser	Ile 995	Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr 1000	Ser Asn Asn Ser Ala 1005
act aat	aga	aag act cac att	gat ggc cca tca	tta tta att gag aat 3072
Thr Asn 1010	Arg	Lys Thr His Ile 1015	Asp Gly Pro Ser	Leu Leu Ile Glu Asn .020
agt cca	tca	gtc tgg caa aat	ata tta gaa agt	gac act gag ttt aaa 3120
Ser Pro 1025	Ser	Val Trp Gin Asn 1030	Ile Leu Glu Ser 1035	Asp Thr Glu Phe Lys 1040
aaa gtg	aca	cct ttg att cat	gac aga atg ctt	atg gac aaa aat- gct 3168
Lys Val	Thr	Pro Leu Ile His 1045	Asp Arg Met Leu 1050	Met Asp Lys Asn Ala 1055
aca gct	ttg	agg cta aat cat	atg tca aat aaa	act act tca tca aaa 3216
Thr Ala	Leu Arg Leu Asn His 1060	Met Ser Asn Lys 1065	Thr Thr Ser Ser Lys 1070
aac atg	gaa	atg gtc caa cag	aaa aaa gag ggc	ccc att cca cca gat 3264
Asn Met Glu 1075	Met Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly 1080	Pro Ile Pro Pro Asp 1085
gca caa	aat	cca gat atg tcg ttc ttt aag atg	cta ttc ttg cca gaa 3312
Ala Gin 1090	Asn	Pro Asp Met Ser 1095	Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1100

tca gca agg	tgg ata caa Trp lle Gin 1110	agg act cat	gga aag aac tet ctg aac tet	3360
Ser Ala 1105	Arg	Arg Thr	His	Gly Lys 1115	Asn	Ser	Leu Asn Ser 1120
ggg caa	ggc	ccc agt cca	aag caa	tta	gta tec	tta	gga	cca gaa aaa	3408
Gly Gin	Gly	Pro Ser Pro 1125	Lys Gin	Leu	Val Ser 1130	Leu	Gly	Pro Glu Lys 1135
tet gtg	gaa	ggt cag aat	ttc ttg	tet	gag aaa	aac	aaa	gtg gta gta	3456
Ser Val	Glu	Gly Gin Asn 1140	Phe Leu	ser 1145	Glu Lys	Asn	Lys	Val Val Val 1150
gga aag	ggt	gaa ttt aca	aag gac	gta	gga ctc	aaa	gag	atg gtt ttt	3504
Gly Lys	Gly L155	Glu Phe Thr	Lys Asp 1160	Val	Gly Leu	Lys	Glu 1165	Met Val Phe
cca age	age	aga aac cta	ttt ctt	act	aac ttg	gat	aat	tta cat gaa	3552
Pro Ser 1170	Ser	Arg Asn Leu	Phe Leu 1175	Thr	Asn Leu	Asp 1180	Asn	Leu His Glu
aat aat	aca	cac aat caa	gaa aaa	aaa	att cag	gaa	gaa	ata gaa aag	3600
Asn Asn 1185	Thr	His Asn Gin 1190	Glu Lys	Lys	lle Gin 1195	Glu	Glu	lle Glu Lys 1200
aag gaa	aca	tta atc caa	gag aat	gta	gtt ttg	cct	cag	ata cat aca	3648
Lys Glu	Thr	Leu lle Gin	Glu Asn	Val	Val Leu	Pro	Gin	lle His Thr

1205 1210 1215

gtg Val

act Thr

ggc act aag aat

ttc atg aag aac ctt ttc tta ctg age act

3696

Gly Thr 1220

Lys

Asn

Phe

Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr

1225

1230

agg

caa

aat

gta

gaa

ggt

tca

tat

gag

ggg

gca

tat

get

cca

gta

ctt

3744

Arg

Gin

Asn

Val

Glu

Gly

ser

Tyr

Glu

Gly

Ala

Tyr

Ala

Pro

Val

Leu

1235

1240

1245

caa

gat

ttt

agg

tca

tta

aat

gat

tca

aca

aat

aga

aca

aag

aaa

cac

3792

-24CZ 303929 B6

Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys	His
1250	1255	1.260
aca gct cat	ttc tea aaa aaa ggg	gag gaa gaa aac ttg gaa ggc	ttg 38 4(
Thr Ala His	Phe Ser Lys Lys Gly	Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly	Leu
1265	1270	1275 1280
gga aat caa	acc aag caa att gta	gag aaa tat gca tgc acc aca	agg 3888
Gly Asn Gin	Thr Lys Gin Ile Val	Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr	Arg
	1285	1290 1295
ata tet cct	aat aca age cag cag	aat ttt gtc acg caa cgt agt	aag 3936
Ile Ser Pro	Asn Thr Ser Gin Gin	Asn Phe Val Thr Gin Arg Ser	Lys
1300 1305 1310
aga gct ttg	aaa caa ttc aga ctc	cca cta gaa gaa aca gaa ctt	gaa 3984
Arg Ala Leu	Lys Gin Phe Arg Leu	Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu	Glu
1315	1320	1325
aaa agg ata	att gtg gat gac acc	tea acc cag tgg tcc aaa aac	atg 4032
Lys Arg Ile	Ile Val Asp Asp Thr	Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn	Met
1330	1335	1340
aaa cat ttg	acc ccg age acc ctc	aca cag ata gac tac aat gag	aag 4080
Lys His Leu	Thr Pro Ser Thr Leu	Thr Gin Ile ňsp Tyr Asn Glu	Lys
1345	1350	1355 1360
gag aaa ggg	gcc att act cag tet	ccc tta tea gat tgc ctt acg	agg 4128
Glu Lys Gly	Ala Ile Thr Gin Ser	Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr	Arg
	1365	1370 1375
agt cat age	atc cct caa gca aat	aga tet cca tta ccc att gca	aag 4176
Ser His Ser	Ile Pro Gin Ala Asn	Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala	Lys
1380 1385 1390
gta tea tea	ttt cca tet att aga	cct ata tat ctg acc agg gtc	cta 4224
Val Ser Ser	Phe Pro Ser Ile Arg	Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val	Leu

1395 1400 1405

-25 CZ 303929 B6 ttc caa gac aac tet tet cat ctt cca gca gca tet tat aga aag aaa

4272

Phe Gin 1410

Asp

Asn

Ser

ser

His 1415

Leu

Pro

Ala

Ala

Ser 1420

Tyr Arg

Lys

Lys

gat tet

ggg

gtc

caa

gaa

age

agt

cat

ttc

tta

caa

gga

gcc

aaa

aaa

4320

Asp ser 1425

Gly

Val

Gin

Glu 1430

Ser

Ser

His

Phe

Leu 1435

Gin

Gly

Ala

Lys

Lys 1440

aat aac

ctt

tet

tta

gcc

att

eta

acc

ttg

gag

atg

act

ggt

gat

caa

4368

Asn Asn

Leu

Ser

Leu 1445

Ala

Ile

Leu

Thr

Leu 1450

Glu

Met

Thr

Gly Asp 1455

Gin

aga gag

gtt

ggc

tec

ctg

ggg

aca

agt

gcc

aca

aat

tea

gtc

aca

tac

4416

Arg Glu

Val

Gly 1460

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser 1465

Ala

Thr

Asn

Ser

Val 1470

Thr

Tyr

aag aaa

gtt

gag

aac

act

gtt

ctc

ccg

aaa

cca

gac

ttg

ccc

aaa

aca

4464

Lys Lys

Val 1475

Glu

Asn

Thr

Val

Leu 1480

Pro

Lys

Pro

Asp

Leu 1485

Pro

Lys

Thr

tet ggc

aaa

gtt

gaa

ttg

ctt

cca

aaa

gtt

cac

att

tat

cag

aag

gac

4512

Ser Gly 1490

Lys

Val

Glu

Leu

Leu 1495

Pro

Lys

Val

His

Ile 1500

Tyr

Gin

Lys

Asp

eta ttc

cct

acg

gaa

act

age

aat

ggg

tet

cct

ggc

cat

ctg

gat

ctc

4560

Leu Phe 1505

Pro

Thr

Glu

Thr 1510

Ser

Asn

Gly

Ser

Pro 1515

Gly

His

Leu

Asp

Leu 1520

gtg gaa

ggg

age

ctt

ctt

cag

gga

aca

gag

gga

gcg

att

aag

tgg

aat

4608

Val Glu

Gly

Ser Leu 1525

Leu

Gin

Gly

Thr Glu 1530

Gly

Ala

Ile

Lys Trp 1535

Asn

gaa gca

aac

aga

cct

gga

aaa

gtt

CCC

ttt

ctg

aga

gta

gca

aca

gaa

4656

Glu Ala

Asn Arg 1540

Pro

Gly

Lys

Val Pro 1545

Phe

Leu

Arg

Val Ala 1550

Thr

Glu

age tet

gca

aag

act

ccc

tec

aag

eta

ttg

gat

cct

ctt

get

tgg

gat

4704

-26CZ 303929 B6

Ser	Ser Ala Lys 1555	Thr Pro	Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp
1560	1565
aac	cac tat ggt	act cag	ata cca	aaa gaa gag tgg aaa tcc caa gag 4752
Asn	His Tyr Gly	Thr Gin	Ile Pro	Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu
1570	1575	1580
aag	tca cca gaa	aaa aca	gct ttt	aag aaa aag gat acc att ttg tcc 4800
Lys	Ser Pro Glu	Lys Thr	Ala Phe	Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser
1585	1590		1595 1600
ctg	aac gct tgt	gaa agc	aat cat	gca ata gca gca ata aat gag gga 4848
Leu	Asn Ala Cys	Glu Ser	Asn His	Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly
	1605		1610 1615
caa	aat aag ccc	gaa ata	gaa gtc	acc tgg gca aag caa ggt agg act 4896
Gin	Asn Lys Pro	Glu Ile	Glu Val	Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr
	1620		1625 1630
gaa	agg ctg tgc	tet caa	aac cca	cca gtc ttg aaa ege cat caa cgg 4944
Glu	Arg Leu Cys	Ser Gin	Asn Pro	Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg
	1635		1640	1645
gaa	ata act cgt	act act	ctt cag	tca gat caa gag gaa att gac tat 4992
Glu	Ile Thr Arg	Thr Thr	Leu Gin	Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr
1650	1655	1660
gat gat acc ata	tca gtt	gaa atg	aag aag gaa gat ttt gac att tat 5040
Asp Asp Thr Ile	Ser Val	Glu Met	Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
1665	1670		1675 1680
gat	gag gat gaa	aat cag	agc ccc	ege agc ttt caa aag aaa aca ega 5088
Asp	Glu Asp Glu	Asn Gin	Ser Pro	Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg
	1685		1690 1695
cac	tat ttt att	gct gca	gtg gag	agg ctc tgg gat tat ggg atg agt 5136
His	Tyr Phe Ile	Ala Ala	Val Glu	Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser

1700 1705 1710

-27 CZ 303929 B6

5184

agc tcc

cca

cat

gtt

cta

aga

aac

agg

gct

cag

agt

ggc

agt

gtc

cct

Ser Ser

Pro 1715

His

Val

Leu

Arg Asn 1720

Arg

Ala

Gin

Ser

Gly 1725

Ser

Val

Pro

cag ttc

aag

aaa

gtt

gtt

ttc

cag

gaa

ttt

act

gat

ggc

tcc

ttt

act

Gin Phe 1730

Lys

Lys

Val

Val

Phe 1735

Gin

Glu

Phe

Thr

Asp 1740

Gly

Ser

Phe

Thr

cag ccc

tta

tac

cgt

gga

gaa

cta

aat

gaa

cat

ttg

gga

ctc

ctg

ggg

Gin Pro 1745

Leu

Tyr Arg

Gly 1750

Glu

Leu

Asn

Glu

His 1755

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly 1760

cca tat

ata

aga

gca

gaa

gtt

gaa

gat

aat

atc

atg

gta

act

ttc

aga

Pro Tyr

Tle

Arg Ala

Glu

Val

Glu

Asp

Asn

Tle

Met

Val

Thr

Phe

Arg

1765 1770 1775

5232

5280

5328

aat cag gcc tet cgt Asn Gin Ala Ser Arg	ccc tat tcc ttc tat tet agc	ctt att Leu Ile 1790	tet Ser	tat Tyr
Pro Tyr	Ser Phe 1785	Tyr Ser Ser
	1780
gag	gaa gat cag agg	caa gga	gca gaa	cct aga aaa	aac ttt	gtc	aag
Glu	Glu Asp Gin Arg	Gin Gly Ala Glu	Pro Arg Lys	Asn Phe	Val	Lys
	1795	1800		1805
cct	aat gaa acc aaa	act tac	ttt tgg	aaa gtg caa	cat cat	atg	gca
Pro	Asn Glu Thr Lys	Thr Tyr	Phe Trp	Lys Val Gin	His His	Met	Ala
	1810	1815		1820
ccc	act aaa gat gag	ttt gac	tgc aaa	gcc tgg gct	tat ttc	tet	gat
Pro	Thr Lys Asp Glu	Phe Asp	Cys Lys	Ala Trp Ala	Tyr Phe	Ser	Asp
1825 1830		1835		1840
gtt	gac ctg gaa aaa	gat gtg	cac tea	ggc ctg att	gga ccc	ctt	ctg
Val	Asp Leu Glu Lys	Asp Val	His Ser	Gly Leu Tle	Gly Pro	Leu	Leu
	1845		1850	1855
gtc	tgc cac act aac	aca ctg	aac cct	gct cat ggg	aga caa	gtg	aca

5376

5424

5472

5520

5568

5616

-28CZ 303929 B6

Val Cys His Thr Asn Thr	Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Val Thr
	1860	1865	1870
gta	cag gaa ttt gct ctg	ttt ttc acc	atc ttt gat gag acc aaa age 5664
Val	Gin Glu Phe Ala Leu	Phe Phe Thr	Ile Phe Asp Glu Thr Lys ser
	1875	1880	1885
tgg	tac ttc act gaa aat	atg gaa aga	aac tgc agg gct ccc tgc aat 5712
Trp	Tyr Phe Thr Glu Asn	Met Glu Arg	Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1890 1895	1900
atc	cag atg gaa gat ccc	act ttt aaa	gag aat tat ege ttc cat gca 5760
Ile	Gin Met Glu Asp Pro	Thr Phe Lys	Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
1905 1910		1915 1920
atc	aat ggc tac ata atg	gat aca cta	cct ggc tta gta atg gct cag 5808
Ile	Asn Gly Tyr Ile Met	Asp Thr Leu	Pro Gly Leu Val Met Ala Gin
	1925	1930 1935
gat	caa agg att ega tgg	tat ctg ctc	age atg ggc age aat gaa aac 5856
Asp	Gin Arg Ile Arg Trp	Tyr Leu Leu	Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
	1940	1945	1950
atc	cat tet att cat ttc	agt gga cat	gtg ttc act gta ega aaa aaa 5904
Ile	His Ser Ile His Phe	Ser Gly His	Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
	1955	1960	1965
gag	gag tat aaa atg gca	ctg tac aat	ctc tat cca ggt gtt ttt gag 5952
Glu	Glu Tyr Lys Met Ala	Leu Tyr Asn	Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu
1970 1975	1980
a ca	gtg gaa atg tta cca	tcc aaa gct	gga att tgg cgg gtg gaa tgc 6000
Thr	Val Glu Met Leu Pro	Ser Lys Ala	Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys
1985	1990		1995 2000
ctt	att ggc gag cat cta	cat gct ggg	atg age aca ctt ttt ctg gtg 6048
Leu	Ile Gly Glu His Leu	His Ala Gly	Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
	2005	2010 2015

-29CZ 303929 B6 tac agc aat aag tgt cag act ccc ctg gga atg gct tet gga cac att

Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His lle

2020 2025 2030 aga gat ttt cag att aca gct tea gga caa tat gga cag tgg gcc cca

Arg Asp Phe Gin lle Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro

2035 2040 2045 aag ctg gcc aga ctt cat tat tcc gga tea atc aat gcc tgg agc acc

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser lle Asn Ala Trp Ser Thr

2050 2055 2060 aag gag ccc ttt tet tgg atc aag gtg gat ctg ttg gca cca atg att

Lys Glu Pro Phe Ser Trp lle Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Mfet lle

2065 2070 2075 2080 att cac ggc atc aag acc cag ggt gcc cgt cag aag ttc tcc agc ctc lle His Gly lle Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu

2085 2090 2095 tac atc tet cag ttt atc atc atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg

Tyr lle Ser Gin Phe lle lle Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp

2100 2105 2110 cag act tat ega gga aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc

Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly

2115 2120 2125 aat gtg gat tea tet ggg ata aaa cac aat att ttt aac cct cca att

Asn Val Asp Ser Ser Gly lle Lys His Asn lle Phe Asn Pro Pro lle

2130 2135 2140 att gct ega tac atc cgt ttg cac cca act cat tat agc att ege agc

Xle Ala Arg Tyr lle Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser lle Arg Ser

2145 2150 2155 2160 act ctt ege atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc agc atg

6096

6144

6192

6240

6288

6336

6384

6432

6480

6528

-30CZ 303929 B6

Thr

Leu

Arg

Met Glu 2165

Leu

Met

Gly

Cys Asp 2170

Leu

Asn

Ser

Cys Ser 2175

Met

cca

ttg

gga

atg gag

agt

aaa

gca

ata tca

gat

gca

cag

att act

get

6576

Pro

Leu

Gly Met Glu 2180

Ser

Lys

Ala Ile Ser 2185

Asp

Ala

Gin Ile Thr 2190

Ala

tca

tcc

tac

ttt acc

aat

atg

ttt

gcc acc

tgg

tet

cct

tca aaa

get

6624

Ser

Ser Tyr 2195

Phe Thr

Asn

Met Phe 2200

Ala Thr

Trp

Ser Pro 2205

Ser Lys

Ala

ega

ctt

cac

ctc caa

ggg

agg

agt

aat gcc

tgg

aga

cct

cag gtg

aat

6672

Arg Leu 2210

His

Leu Gin

Gly Arg 2215

Ser

Asn Ala

Trp Arg 2220

Pro

Gin Val

Asn

aat

cca

aaa

gag tgg

ctg

caa

gtg

gac ttc

cag

aag

aca

atg aaa

gtc

6720

Asn Pro 2225

Lys

Glu Trp Leu 2230

Gin

Val

Asp Phe Gin 2235

Lys

Thr

Met Lys Val 2240

aca

gga

gta

act act

cag

gga

gta

aaa tet

ctg

ctt

acc

age atg

tat

6768

Thr

Gly

Val

Thr Thr 2245

Gin

Gly

Val

Lys Ser 2250

Leu.

Leu

Thr

Ser Met 2255

Tyr

gtg

aag

gag

ttc ctc

atc

tcc

age

agt caa

gat

ggc

cat

cag tgg

act

6816

Val

Lys

Glu Phe Leu 2260

Ile

Ser

Ser Ser Gin 2265

Asp

Gly

His Gin Trp 2270

Thr

ctc

ttt

ttt

cag aat

ggc

aaa

gta

aag gtt

ttt:

cag

gga

aat caa

gac

6864

Leu

Phe Phe 2275

Gin Asn

Gly

Lys Val 2280

Lys Val

Phe

Gin Gly 2285

Asn Gin

Asp

tcc

ttc

aca

cct gtg

gtg

aac

tet

cta gac

cca

ccg

tta

ctg act

ege

6912

Ser Phe 2290

Thr

Pro Val

Val Asn 2295

Ser

Leu Asp

Pro Pro 2300

Leu

Leu Thr

Arg

tac

ctt

ega

att cac

ccc

cag

agt

tgg gtg

cac

cag

att

gcc ctg

agg

6960

Tyr 2305

Leu

Arg

Ile His Pro 2310

Gin

Ser

Trp Val His 2315

Gin

Ile

Ala Leu Arg 2320

-31 CL 303929 B6 atg gag gtt ctg ggc tgc Met Glu Val Leu Gly Cys qag gca cag gac ctc tac Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

6996

2325

2330

<210>	2
<211>	2332
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	2

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 15 10 15

Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin Ala Glu Val

70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140

-32CZ 303929 B6

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

- 33 CZ 303929 B6

340

Ser Glu Met Asp Val Val 355

Ile Gin Ile Arg Ser Val 370

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu 385 390

Ala Pro Asp Asp Arg Ser 405

Gin Arg Ile Gly Arg Lys 420

Asp Glu Thr Phe Lys Thr 435

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr 450

Phe Lys Asn Gin Ala Ser 465 470

Thr Asp Val Arg Pro Leu 485

His Leu Lys Asp Phe Pro 500

Trp Thr Val Thr Val Glu 515

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser 530

345

Arg Phe Asp Asp Asp 360

Ala Lys Lys His Pro 375

Glu Asp Trp Asp Tyr 395

Tyr Lys Ser Gin Tyr 410

Tyr Lys Lys Val Arg 425

Arg Glu Ala Ile Gin 440

Gly Glu Val Gly Asp 455

Arg Pro Tyr Asn Ile 475

Tyr Ser Arg Arg Leu 490

Ile Leu Pro Gly Glu 505

Asp Gly Pro Thr Lys 520

Ser Phe Val Asn Met

535

350

Asn Ser Pro Ser Phe 365

Lys Thr Trp Val His 380

Ala Pro Leu Val Leu 400

Leu Asn Asn Gly Pro 415

Phe Met Ala Tyr Thr 430

His Glu Ser Gly Ile 445

Thr Leu Leu Ile Ile 460

Tyr Pro His Gly Ile 480

Pro Lys Gly Val Lys 495

Ile Phe Lys Tyr Lys 510

Ser Asp Pro Arg Cys 525

Glu Arg Asp Leu Ala 540

-34CZ 303929 B6

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605

Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620

Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670

Phe ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685

Ile Leu Gly cys His Asn ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Sex Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

740

745

750

-35CZ 303929 B6

Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr 755 760

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg 770 775

Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met 785 790

His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu 805

Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala 820

Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gin 835 840

Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gin 850 855

Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys 865 870

Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr 885

Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu 900

Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr 915 920

Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu 930 935

Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 765

Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 780

Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 795 800

Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 810 815

Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 825 830

Leu His His Ser Gly Asp Met Val 845

Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 860

Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 875 880

Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 890 895

Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 905 910

Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 925

Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 940

Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp

-36CZ 303929 B6

945	950	955	960
Gly Lys Asn. Val Ser Ser Thr Glu Ser	Gly Arg Leu	Phe Lys Gly Lys
	965	970	975
Arg	Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr	Lys Asp Asn	Ala Leu Phe Lys
	980 985		390
Val	Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn	Lys Thr ser	Asn Asn Ser Ala
	995 1000	1005
Thr	Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly	Pro Ser Leu	Leu Ile Glu Asn
1010 1015	1020
Ser	Pro Ser Val Trp Gin Asn ile Leu	Glu Ser Asp	Thr Glu Phe Lys
025	1030	1035	1040
Lys	Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg	Met Leu Met	Asp Lys Asn Ala
	1045 1050	1055
Thr	Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser	Asn Lys Thr	Thr Ser Ser Lys
	1060 1065		1070
Asn	Met Glu Met Val Gin Gin Lys Lys	Glu Gly Pro	Ile Pro Pro Asp
	1075 1080	1085
Ala	Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe	Lys Met Leu	Phe Leu Pro Glu
1090 1095	1100
Ser	Ala Arg Trp Ile Gin Arg Thr His	Gly Lys Asn	Ser Leu Asn Ser
105	1110	1115	1120
Gly	Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin Leu	Val Ser Leu	Gly Pro Glu Lys
	1125 1130	1135
Ser	Val Glu Gly Gin Asn Phe Leu Ser	Glu Lys Asn	Lys Val Val Val
	1140 1145		1150

-37CZ 303929 B6

Gly Lys Gly	Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe
1155	1160	1165
Pro Ser Ser 1170	Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn 1175	Leu Asp Asn Leu His Glu 1180
Asn Asn Thr 185	His Asn Gin Glu Lys Lys lle Gin Glu Glu lle Glu Lys 1190 1195 1200
Lys Glu Thr	Leu lle Gin Glu Asn Val Val 1205 1210	Leu Pro Gin lle His Thr 1215
Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn 1220 1225	Leu Phe Leu Leu Ser Thr 1230
Axg Gin Asn 1235	Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly 1240	Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1245
Gin Asp Phe 1250	Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr 1255	Asn Arg Thr Lys Lys His 1260
Thr Ala His 265	Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu 1270 1275 1280
Gly Asn Gin	Thr Lys Gin Xle Val Glu Lys 1285 1290	Tyr Ala Cys Thr Thr Arg 1295
lle Ser Pro Asn Thr ser Gin Gin Asn Phe 1300 1305	Val Thr Gin Arg Ser Lys 1310
Arg Ala Leu 1315	Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu 1320	Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1325
Lys Arg lle 1330	Tle Val Asp Asp Thr Ser Thr 1335	Gin Trp Ser Lys Asn Met 1340
Lys His Leu	Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin	lle Asp Tyr Asn Glu Lys

345 1350 1355 1360

-38CZ 303929 B6

Glu Lys Gly Ala Ile	Thr Gin Ser	Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg
	1365	1370	1375
Ser	His Ser Ile Pro	Gin Ala Asn Arg Ser	Pro Leu Pro Ile Ala Lys
	1380	1385	1390
Val	Ser Ser Phe Pro	Ser Ile Arg	Pro Ile	Tyr Leu Thr Arg Val Leu
	1395	1400		1405
Phe	Glrt Asp Asn Ser	Ser His Leu	Pro Ala	Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
1410	1415		1420
Asp	Ser Gly Val Gin	Glu Ser Ser	His Phe	Leu Gin Gly Ala Lys Lys
425	1430	1435 1440
Asn	Asn Leu Ser Leu	Ala Ile Leu	Thr Leu	Glu Met Thr Gly Asp Gin
	1445		1450	1455
Arg	Glu Val Gly Ser	Leu Gly Thr	Ser Ala	Thr Asn Ser Val Thr Tyr
	1460	1465	1470
Lys	Lys Val Glu Asn	Thr Val Leu	Pro Lys	Pro Asp Leu Pro Lys Thr
	1475	1480		1485
Ser	Gly Lys Val Glu	Leu Leu Pro	Lys Val	His Ile Tyr Gin Lys Asp
1490	1495		1500
Leu	Phe Pro Thr Glu	Thr Ser Asn	Gly Ser	Pro Gly His Leu Asp Leu
505	1510	1515 1520
Val	Glu Gly Ser Leu	Leu Gin Gly	Thr Glu	Gly Ala Ile Lys Trp Asn
	1525		1530	1535
Glu	Ala Asn Arg Pro	Gly Lys Val	Pro Phe	Leu Arg Val Ala Thr Glu
	1540	1545	1550
Ser	Ser Ala Lys Thr	Pro Ser Lys	Leu Leu	Asp Pro Leu Ala Trp Asp

-39CZ 303929 B6

1555 1560 1565

Asn His Tyr 1570	Gly Thr	Gin Ile Pro 1575	Lys Glu	Glu Trp 1580	Lys Ser	Gin	Glu
Lys Ser Pro 585	Glu Lys Thr Ala Phe 1590	Lys Lys Lys Asp 1595	Thr Ile	Leu Ser 1600
Leu Asn Ala	Cys Glu 1605	Ser Asn His	Ala Ile 1610	Ala Ala	Ile Asn Glu 1615	Gly
Gin Asn Lys Pro Glu 1620	Ile Glu Val Thr Trp 1625	Ala Lys	Gin Gly Arg 1630	Thr
Glu Arg Leu 1635	Cys Ser	Gin Asn Pro 1640	Pro Val	Leu Lys	Arg His 1645	Gin	Arg
Glu Ile Thr 1650	Arg Thr	Thr Leu Gin 1655	Ser Asp	Gin Glu 1660	Glu Ile	Asp	Tyr
Asp Asp Thr 665	Ile Ser Val Glu Met 1670	Lys Lys Glu Asp 1675	Phe Asp	Ile Tyr 1680
Asp Glu Asp	Glu Asn 1685	Gin Ser Pro	Arg Ser 1690	Phe Gin	Lys Lys Thr 1695	Arg
His Tyr Phe	Ile Ala L700	Ala Val Glu Arg Leu 1705	Trp Asp	Tyr Gly 1710	Met	Ser
Ser Ser Pro 1715	His Val	Leu Arg Asn 1720	Arg Ala	Gin Ser Gly Ser 1725	Val	Pro
Gin Phe Lys 1730	Lys Val	Val Phe Gin 1735	Glu Phe	Thr Asp 1740	Gly Ser	Phe	Thr
Gin Pro Leu 745	Tyr Arg Gly Glu Leu 1750	Asn Glu 1 _L	His Leu .755	Gly Leu	Leu Gly 1760

-40CZ 303929 B6

Pro Tyr Ile Arg Ala Glu	Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
	17 65	1770	1775
Asn Gin Ala	Ser Arg Pro	Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu	Ile Ser Tyr
1780	1785	1790
Glu Glu Asp	Gin Arg Gin	Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn	Phe Val Lys
1795		1800 1805
Pro Asn Glu	Thr Lys Thr	Tyr Phe Trp Lys Val Gin His	His Met Ala
1810	1815 1820
Pro Thr Lys	Asp Glu Phe	Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr	Phe Ser Asp
825	1830	1835	1840
Val Asp Leu	Glu Lys Asp	Val His Ser Gly Leu Ile Gly	Pro Leu Leu
	1845	1850	1855
Val Cys His	Thr Asn Thr	Leu Asn Pro Ala His Gly Arg	Gin Val Thr
1860	1865 1870
Val Gin Glu	Phe Ala Leu	Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu	Thr Lys Ser
1875		1880 1885
Trp Tyr Phe	Thr Glu Asn	Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala	Pro Cys Asn
1890	1895 1900
Ile Gin Met	Glu Asp Pro	Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg	Phe His Ala
905	1910	1915	1920
Ile Asn Gly	Tyr Ile Met	Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val	Met Ala Gin
	1925	1930	1935
Asp Gin Arg	Ile Arg Trp	Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser	Asn Glu Asn
1940	1945 1950
Ile His Ser	Ile His Phe	Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955		1960 1S65

-41 CZ 303929 B6

Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly	Val	Phe	Glu
1970	1975	1980
Thr Val Glu	Met Leu Pro Ser	Lys Ala Gly Ile Trp Arg	Val	Glu	Cys
985	1990	1995		2000
Leu Ile Gly	Glu His Leu His	Ala Gly Met Ser Thr Leu	Phe	Leu	Val
	2005	2010	2015
Tyr Ser Asn	Lys Cys Gin Thr	Pro Leu Gly Met Ala Ser	Gly	His	Ile
2020	2025 2030
Arg Asp Phe	Gin Ile Thr Ala	Ser Gly Gin Tyr Gly Gin	Trp	Ala	Pro
2035	2040 2045
Lys Leu Ala	Arg Leu His Tyr	Ser Gly Ser Ile Asn Ala	Trp	Ser	Thr
2050	2055	2060
Lys Glu Pro	Phe Ser Trp Ile	Lys Val Asp Leu Leu Ala	Pro	Met	Ile
065	2070	2075		2080
Ile His Gly	Ile Lys Thr Gin	Gly Ala Arg Gin Lys Phe	Ser	Ser	Leu
	2085	2090	2095
Tyr Ile Ser	Gin Phe Ile Ile	Met Tyr Ser Leu Asp Gly	Lys	Lys	Trp
2100	2105 2110
Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser	Thr Gly Thr Leu Met Val	Phe	Phe	Gly
2115	2120 2125
Asn Val Asp	Ser Ser Gly Ile	Lys His Asn Ile Phe Asn	Pro	Pro	Ile
2130	2135	2140
ile Ala Arg	Tyr ile Arg Leu	His pro Thr His Tyr Ser	Ile	Arg	Ser
145	2150	2155		2160
Thr Leu Arg	Met Glu Leu Met	Gly Cys Asp Leu Asn Ser	Cys	Ser	Met

-42CZ 303929 B6

	2165	2170	2175
Pro Leu Gly Met Glu Ser	Lys Ala Ile Ser Asp Ala	Gin Ile Thr Ala
2180	2185	2190
Ser Ser Tyr	Phe Thr Asn	Met Phe Ala Thr Trp ser	Pro Ser Lys Ala
2195		2200 2205
Arg Leu His	Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg	Pro Gin Val Asn
2210	2215 2220
Asn Pro Lys	Glu Trp Leu	Gin Val Asp Phe Gin Lys	Thr Met Lys Val
225	2230	2235	2240
Thr Gly Val	Thr Thr Gin	Gly Val Lys ser Leu Leu	Thr Ser Met Tyr
	2245	2250	2255
Val Lys Glu	Phe Leu Ile	Ser Ser Ser Gin Jlsp Gly	His Gin Trp Thr
2260	2265	2270
Leu Phe Phe	Gin Asn Gly	Lys Val Lys Val Phe Gin	Gly Asn Gin Asp
2275		2280 2285
Ser Phe Thr	Pro Val Val	Asn Ser Leu Asp Pro Pro	Leu Leu Thr Arg
2290	2295 2300
Tyr Leu Arg	Ile His Pro	Gin Ser Trp Val His Gin	Ile Ala Leu Arg
305	2310	2315	2320
Met Glu Val	Leu Gly Cys	Glu Ala Gin Asp Leu Tyr
	2325	2330

<210>	3
<211>	8720
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-l
<220>
<221>	CDS
<222>	(676)..(5052)

-43 CZ 303929 B6 <220>

<221> matpeptide <222> (733)..(5052) <400> 3

cgcgttgaca	ttgattattg	actagttatt	aatagtaatc	aattacgggg	tcattagttc	60
atagcccata	tatggagttc	cgcgttacat	aacttacggt	aaatggcccg	cctggctgac	120
cgcccaacga	cccccgccca	ttgacgtcaa	taatgacgta	tgttcccata	gtaacgccaa	180
tagggacttt	ccattgacgt	caatgggtgg	agtatttacg	gtaaactgcc	cacttggcag	240
tacatcaagt	gtatcatatg	ccaagtacgc	cccctattga	cgtcaatgac	ggtaaatggc	300
ccgcctggca	ttatgcccag	tacatgacct	tatgggactt	tcctacttgg	cagtacatct	360
acgtattagt	catcgctatt	accatggtga	tgcggttttg	gcagtacatc	aatgggcgtg	420
gatagcggtt	tgactcacgg	ggatttccaa	gtctccaccc	cattgacgtc	aatgggagtt	480
tgttttggca	ccaaaatcaa	cgggactttc	caaaatgtcg	taacaactcc	gccccattga	540
cgcaaatggg	cggtaggcgt	gtacggtggg	aggtctatat	aagcagagct	ctctggctaa	600
ctagagaacc	cactgcttac	tggcttatcg	aaattaatac	gactcactat	agggagaccc	660

aagcttgacc tcgag atg caa ata gag ctc tcc acc tgc ttc ttt ctg tgc 711 Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys

-15 -10

-44CZ 303929 B6

ctt Leu

ttg ega ttc tgc

ttt agt gcc acc aga aga

tac tac ctg ggt gca

759

Leu Arg -5

Phe Cys

Phe Ser Ala

Thr

Arg

Arg

Tyr 5

Tyr

Leu

Gly Ala

-1

1

gtg

gaa

ctg

tea

tgg

gac

tat

atg

caa

agt

gat

ctc

ggt

gag

ctg

cct

807

Val

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

10

15

20

25

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

cct

aga

gtg

cca

aaa

tet

ttt

cca

ttc

aac

855

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

35

40

acc

tea

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gat

cac

903

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

His

45

50

55

ctt

ttc

aac

atc

gct

aag

cca

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

cta

ggt

951

Leu

Phe

Asn

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

60

65

70

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

999

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr Asp

Thr

Val

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

75

80

85

aac

atg

gct

tcc

cat

cct

gtc

agt

ctt

cat

gct

gtt

ggt

gta

tcc

tac

1047

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

90

95

100

105

tgg

aaa

gct

tet

gag

gga

gct

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

1095

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

110

115

120

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

ttc

cct

ggt

gga

age

cat

aca

tat

gtc

1143

Glu

Lys

Glu

Asp

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

125

130

135

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

1191

Trp

Gin

Val 140

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 145

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 150

Pro

Leu

Cys

ctt

acc

tac

tca

tat

ctt

tet

cat

gcg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

1239

Leu

Thr 155

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 160

His

Ala

Asp

Leu

Val 165

Lys

Asp

Leu

Asn

tca

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

1287

Ser 170

Gly

Leu

lle

Gly

Ala 175

Leu

Leu

Val

Cys

Arg 180

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala 185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

cta

ctt

ttt

get

gta

1335

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin 190

Thr

Leu

His

Lys

Phe 195

lle

Leu

Leu

Phe

Ala 200

Val

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg atg

1383

Phe

Asp

Glu

Gly 205

Lys

Ser

Trp

His

Ser 210

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser 215

Leu

Met

cag

gat

agg

gat

get

gca

tet

get

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

1431

Gin

Asp

Arg 220

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala 225

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys 230

Met

His

Thr

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

1479

val

Asn 235

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 240

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 245

lle

Gly

Cys

His

agg

aaa

tca

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

1527

Arg 250

Lys

Ser

val

Tyr

Trp 255

His

Val

lle

Gly

Met 260

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu 265

gtg

cac

tca

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

1575

Val

His

Ser

lle

Phe 270

Leu

Glu

Gly

His

Thr 275

Phe

Leu

Val

Arg

Asn 280

His

cgc

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

get

caa

1623

Arg

Gin

Ala

Ser 285

Leu

Glu

lle

Ser

Pro 290

lle

Thr

Phe

Leu

Thr 295

Ala

Gin

-46CZ 303929 B6

aca ctc ttg atg gac ctt

gga cag Gly Gin 305

ttt cta ctg

ttt tgt cat atc tet

1671

Thr

Leu

Leu Met 300

Asp

Leu

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys 310

His

Ile

Ser

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

get

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

1719

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

315

320

325

cca

gag

gaa

CCC

caa

cta

ega

atg

aaa

aat

aat

gaa

gaa

gcg

gaa

gac

1767

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp

330

335

340

345

tat

gat

gat

gat

ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1815

Tyr Asp

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

gat gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

ege

tca

gtt

gcc

aag

aag

1863

Asp Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

val

Ala

Lys

Lys

365

370

375

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

1911

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ala

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

380

385

390

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

gcc

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

1959

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

395

400

405

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

aaa

2007

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

2055

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tca

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

2103

-47CZ 303929 B6

Ile

Gin

His

Glu 445

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly 450

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly 455

Glu

Val

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

agc

aga

cca

tat

2151

Gly Asp

Thr 460

Leu

Leu

Ile

Ile

Phe 465

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser 470

Arg

Pro

Tyr

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tca

agg

2199

Asn

Ile 475

Tyr

Pro

His

Gly

Ile 480

Thr

Asp

Val

Arg

Pro 485

Leu

Tyr

Ser

Arg

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

2247

Arg 490

Leu

Pro

Lys

Gly

Val 495

Lys

His

Leu

Lys

Asp 500

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro 505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

2295

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys 510

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val 515

Thr

Val

Glu

Asp

Gly 520

Pro

act

aaa

tca

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tat

tac

tet

agt

ttc

gtt

2343

Thr

Lys

Ser

Asp 525

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr 530

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser 535

Phe

Val

aat

atg

gag

aga

gat

cta

gct

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

2391

Asn

Met

Glu 540

Arg Asp

Leu

Ala

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Leu

Ile

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

2439

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin 565

Ile

Met

Ser

Asp

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

agc

tgg

2487

Lys Arg 570

Asn

Val

Ile

Leu 575

Phe

Ser

Val

Phe

Asp 580

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp 585

tac

cfcc

aca

gag

aat

ata

caa

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

gct

gga

gtg

2535

Tyr Leu

Thr

Glu

Asn 590

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu 595

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly 600

Val

-48CZ 303929 B6

cag ctt gag gat

cca gag ttc caa gcc tcc aac atc atg cac age atc

2583

Gin

Leu

Glu Asp 605

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile

610

615

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tea

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2631

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

620

625

630

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

2679

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

635

640

645

tet

gtc

ttc

ttc

tet

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2727

Ser

Val

Phe

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

650

655

660

665

gac

aca

ctc

acc

cta

ttc

cca

ttc

tea

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

tcg

2775

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

670

675

680

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tea

gac

ttt

2823

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu

Gly

Cys.

His

Asn

Ser

Asp

Phe

685

690

695

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gcc

tta

ctg

aag

gtt

tet

agt

tgt

gac

aag

2871

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

val

Ser

Ser

Cys

Asp

Lys

700

705

710

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tea

gca

tac

2919

Asn

Thr

Gly Asp

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Ala

Tyr

715

720

725

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

age

ttc

tcc

cag

aat

2967

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

730

735

740

745

tea

aga

cat

caa

gct

tat

ega

tac

cgt

ega

ggg

gaa

ata

act

cgt

act

3015

-49CL 303929 B6

Ser

Arg

His

Gin

Ala 750

Tyr Arg

Tyr Arg

Arg 755

Gly Glu

lle

Thr

Arg 760

Thr

act

ctt

cag

tca

gat

caa

gag

gaa

att

gac

tat gat

gat

acc

ata

tca

3063

Thr

Leu

Gin

Ser 765

Asp

Gin

Glu

Glu

Xle 770

Asp

Tyr Asp Asp

Thr 775

lle

Ser

gtt

gaa

atg

aag

aag

gaa

gat

ttt

gac

att

tat gat

gag

gat

gaa

aat

3111

Val

Glu

Met 780

Lys

Lys

Glu

Asp

Phe 785

Asp

lle

Tyr Asp

Glu 790

Asp

Glu

Asn

cag

age

ccc

ege

age

ttt

caa

aag

aaa

aca

ega cac

tat

ttt

att

get

3159

Gin

Ser 795

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin 800

Lys

Lys

Thr

Arg His 805

Tyr

Phe

lle

Ala

gca

gtg

gag

agg

ctc

tgg

gat

tat

ggg

atg

agt age

tcc

cca

cat

gtt

3207

Ala 810

Val

Glu

Arg

Leu

Trp Asp 815

Tyr

Gly

Met

Ser Ser 820

Ser

Pro

His

Val 825

cta

aga

aac

agg

get

cag

agt

ggc

agt

gtc

cct cag

ttc

aag

aaa

gtt

3255

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala 830

Gin

Ser

Gly

Ser

Val 835

Pro Gin

Phe

Lys

Lys 840

Val

gtt

ttc

cag

gaa

ttt

act

gat

ggc

tcc

ttt

act cag

ccc

tta

tac

cgt

3303

Val

Phe

Gin

Glu 845

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser 850

Phe

Thr Gin

Pro

Leu 855

Tyr Arg

gga

gaa

cta

aat

gaa

cat

ttg

gga

ctc

x-tg

ggg cca

tat

ata

aga

gca

3351

Gly

Glu

Leu 860

Asn

Glu

His

Leu

Gly 865

Leu

Leu

Gly Pro

Tyr 870

lle

Arg

Ala

gaa

gtt

gaa

gat

aat

atc

atg

gta

act

ttc

aga aat

cag

gcc

tet

cgt

3399

Glu

Val 875

Glu

Asp

Asn

lle

Met 880

Val

Thr

Phe

Arg Asn 885

Gin

Ala

Ser

Arg

ccc

tat

tcc

ttc

tat

tet

age

ctt

att

tet

tat gag

gaa

gat

cag

agg

3447

Pro 890

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser 895

Ser

Leu

lle

Ser

Tyr Glu 900

Glu

Asp

Gin

Arg 905

caa gga gca gaa cct aga aaa aac ttt gtc aag cct aat gaa acc aaa	3495
Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val	Lys	Pro	Asn	Glu	Thr Lys 920
	910	915
act	tac ttt tgg aaa gtg caa	cat cat atg	gca	ccc	act	aaa	gat gag	3543
Thr	Tyr Phe Trp Lys Val Gin 925	His His Met 930	Ala	Pro	Thr	Lys 935	Asp Glu
ttt	gac tgc aaa gcc tgg gct	tat ttc tet	gat	gtt	gac	ctg	gaa aaa	3591
Phe	Asp Cys Lys Ala Trp Ala 940	Tyr Phe Ser 945	Asp	Val	Asp 950	Leu	Glu Lys
gat	gtg cac tea ggc ctg att	gga ccc ctt	ctg	gtc	tgc	cac	act aac	3639
Asp	Val His Ser Gly Leu lle 955 960	Gly Pro Leu	Leu	Val 965	Cys	His	Thr Asn
aca	ctg aac cct gct cat ggg	aga caa gtg	aca	gta	cag	gaa	ttt gct	3687
Thr 970	Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Val 975	Thr 980	Val	Gin	Glu	Phe Ala 985
ctg	ttt ttc acc atc ttt gat	gag acc aaa	agc	tgg	tac	ttc	act gaa	3735
Leu	Phe Phe Thr lle Phe Asp 990	Glu Thr Lys 995	Ser	Trp	Tyr	Phe	Thr Glu 1000
aat	atg gaa aga aac tgc agg	gct ccc tgc	aat	atc	cag	atg	gaa gat	3783
Asn	Met Glu Arg Asn Cys Arg 1005	Ala Pro Cys 1010	Asn	Xle	Gin Met 1015	Glu Asp
ccc	act ttt aaa gag aat tat	ege ttc cat	gca	atc	aat	ggc	tac ata	3831
Pro	Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His 1020 1025	Ala	lle Asn 1030	Gly	Tyr lle
atg	gat aca cta cct ggc tta	gta atg gct	cag	gat	caa	agg	att ega	3879
Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1035 1040	Val Met Ala	Gin Asp 1045	Gin	Arg	Xle Arg
tgg tat ctg ctc agc atg ggc	agc aat gaa	aac	atc	cat	tet	att cat	3927

CL 303929 136

Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His
1050	1055	1060	1065
ttc agt gga cat	gtg ttc act	gta ega aaa aaa gag gag tat	aaa atg 3975
Phe Ser Gly His	Val Phe Thr	Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr	Lys Met
1070	1075 1080
gca ctg tac aat	ctc tat cca	ggt gtt ttt gag aca gtg gaa	atg tta 4023
Ala Leu Tyr Asn	Leu Tyr Pro	Gly Val Phe Glu Thr Val Glu	Met Leu
1085		1090 1095
cca tcc aaa get	gga att tgg	cgg gtg gaa tgc ctt att ggc	gag cat 4071
Pro Ser Lys Ala	Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly	Glu His
1100	1105 1110
cta cat get ggg	atg aac aca	ctt ttt ctg gtg tac age aat	aag tgt 4119
Leu His Ala Gly	Met Asn Thr	Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn	Lys cys
1115	1120	1125
cag act ccc ctg	gga atg get	tet gga cac att aga gat ttt	cag att 4167
Gin Thr Pro Leu	Gly Met Ala	Ser Gly His Ile Arg Asp Phe	Gin Ile
1130	1135	1140	1145
aca get tea gga	caa tat gga	cag tgg gcc cca aag ctg gcc	aga ctt 4215
Thr Ala Ser Gly	Gin Tyr Gly	Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala	Arg Leu
1150	1155 1160
cat tat tcc gga	tea atc aat	gcc tgg age acc aag gag ccc	ttt tet 4263
His Tyr Ser Gly	Ser Ile Asn	Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro	Phe Ser
1165		1170 1175
tgg atc aag gtg	gat ctg ttg	gca cca atg att att cac ggc	atc aag 4311
Trp Ile Lys Val	Asp Leu Leu	Ala Pro Met Ile Ile His Gly	Ile Lys
1180	1185 1190
acc cag ggt gcc	cgt cag aag	ttc tcc age ctc tac atc tet	cag ttt 4359
Thr Gin Gly Ala	Arg Gin Lys	Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser	Gin Phe

1195 1200 1205

-52CZ 303929 B6 atc atc atg tat agt ctt gat ggg aag aag tgg cag act tat ega gga 4407

Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly

1210 1215 1220 1225 aat tcc act gga acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tea tet 4455

Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn val Asp Ser Ser

1230 1235 1240

ggg	ata	aaa	cac	aat	att	ttt	aac	cct
Gly	Ile	Lys	His 1245	Asn	Ile	Phe	Asn	Pro 1250
cgt	ttg	cac	cca	act	cat	tat	age	att
Arg	Leu	His 1260	Pro	Thr	His	Tyr	Ser 1265	Ile
ttg	atg	ggc	tgt	gat	tta	aat	agt	tgc
Leu	Met	Gly	Cys	Asp	Leu	Asn	Ser	Cys

1275 1280

cca att	att	get	ega	tac	atc	4503
Pro Ile	Ile	Ala	Arg	Tyr	Ile
			1255

ege	age	act	ctt	ege	atg	gag	4551
Arg	Ser	Thr	Leu	Arg	Met	Glu

1270

age	atg	cca	ttg	gga	atg	gag	4599
Ser	Met	Pro	Leu	Gly	Met	Glu
		1285

agt aaa gca Ser Lys Ala 1290	ata Ile	tea gat Ser Asp 1295	gca cag att	act get tea tcc tac	ttt acc Phe Thr 1305	4647
Ala	Gin	Ile	Thr Ala 1300	Ser Ser	Tyr
aat atg ttt	gcc	acc tgg	tet	cct	tea	aaa get	ega ctt	cac	ctc caa	4695
Asn Met phe	Ala	Thr Trp	Ser	Pro	Ser	Lys Ala	Arg Leu	His	Leu Gin
	1310			1315		1320
ggg agg agt	aat	gcc tgg	aga	cct	cag	gag aat	aat cca	aaa	gag tgg	4743
Gly Arg Ser	Asn	Ala Trp	Arg	Pro	Gin	Glu Asn	Asn Pro	Lys	Glu Trp
1325			1330		1335
ctg caa gtg	gac	ttc cag	aag	aca	atg	aaa gtc	aca gga	gta	act act	4791
Leu Gin Val	Asp	Phe Gin	Lys	Thr	Met	Lys Val	Thr Gly	val	Thr Thr
1340			1345			1350
cag gga gta	aaa	tet ctg	Ctt	acc	age	atg tat	gtg aag	gag	ttc ctc	4839

- 53 CZ 303929 B6

Gin Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe	Leu
1355	1360	1365
atc tcc age agt caa	gat ggc	cat cag tgg acc ctc ttt ttt cag	aat
Ile Ser Ser Ser Gin	Asp Gly	His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin	Asn
1370 1375	1380 1385
ggc aaa gta aag gtt	ttt cag	gga aat caa gac tcc ttc aca cct	gtg
Gly Lys Val Lys Val	Phe Gin	Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro	Val
1390		1395 1400
gtg aac tet cta gac	cca ccg	tta ctg act ege tac ctt ega att	cac
Val Asn Ser Leu Asp	Pro Pro	Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile	His
1405		1410 1415
ccc cag agt tgg gtg	cac cag	att gcc ctg agg atg gag gtt ctg	ggc
Pro Gin Ser Trp Val	His Gin	Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu	Gly
1420	1425 1430

tgc gag gca cag gac ctc tac tgagcggccg cgactctact agaggatctt Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

1435 1440 tgtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta aagctctaag gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt

4887

4935

4983

5031

5082

5142

5202

5262

5322

5382

5442

5502

5562

-54CZ 303929 B6

tcttactcca	cacaggcata	gagtgtctgc	tattaataac	tatgctcaaa	aattgtgtac	5622
ctttagcttt	ttaatttgta	aaggggttaa	taaggaatat	ttgatgtata	gtgccttgac	5682
tagagatcat	aatcagccat	accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	5742
cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	5802
ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	5862
ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	ccaaactcat	caatgtatct	tatcatgtct	5922
ggatccccgg	gtaccctcta	gagcgaatta	attcactggc	cgtcgtttta	caacgtcgtg	5932
actgggaaaa	ccctggcgtt	acccaactta	atcgccttgc	agcacatccc	cctttcgcca	6042
gctggcgtaa	tagcgaagag	gcccgcaccg	atcgcccttc	ccaacagttg	cgcagcctga	6102
atggcgaatg	gcgcctgatg	cggtattttc	tccttacgca	tctgtgcggt	atttcacacc	6162
gcatatggtg	cactctcagt	acaatctgct	ctgatgccgc	atagttaagc	cagccccgac	6222
acccgccaac	acccgctgac	gcgccctgac	gggcttgtct	gctcccggca	tccgcttaca	6282
gacaagctgt	gaccgtctcc	gggagctgca	tgtgtcagag	gttttcaccg	tcatcaccga	6342
aacgcgcgag	acgaaagggg	gggtaccagc	ttcgtagcta	gaacatcatg	ttctgggata	6402
tcagcttcgt	agctagaaca	tcatgfctctg	gtacccccct	cgtgatacgc	ctatttttat	6462
aggttaatgt	catgataata	atggtttctt	agacgtcagg	tggcactttt	cggggaaatg	6522
tgcgcggaac	ccctatttgt	ttatttttct	aaatacattc	aaatatgtat	ccgctcatga	6532
gacaataacc	ctgataaatg	cttcaataat	attgaaaaag	gaagagtatg	agtattcaac	6642
atttccgtgt	cgcccttatt	cccttttttg	cggcattttg	ccttcctgtt	tttgctcacc	6702

-55CZ 303929 B6

cagaaacgct	ggtgaaagta	aaagatgctg	aagatcagtt	gggtgcacga	gtgggttaca	6762
tcgaactgga	tctcaacagc	ggtaagatcc	ttgagagttt	tcgccccgaa	gaacgttttc	6822
caatgatgag	cacttttaaa	gttctgctat	gtggcgcggt	attatcccgt	attgacgccg	6882
ggcaagagca	actcggtcgc	cgcatacact	attctcagaa	tgacttggtt	gagtactcac	6942
cagtcacaga	aaagcatctt	acggatggca	tgacagtaag	agaattatgc	agtgctgcca	7002
taaccatgag	tgataacact	gcggccaact	tacttctgac	aacgatcgga	ggaccgaagg	7062
agctaaccgc	ttttttgcac	aacatggggg	atcatgtaac	tcgccttgat	cgttgggaac	7122
cggagctgaa	tgaagccata	ccaaacgacg	agcgtgacac	cacgatgcct	gtagcaatgg	7182
caacaacgtt	gcgcaaacta	ttaactggcg	aactacttac	tctagcttcc	cggcaacaat	7242
taatagactg	gatggaggcg	gataaagttg	caggaccact	tctgcgctcg	gcccttccgg	7302
ctggctggtt	tattgctgat	aaatctggag	ccggtgagcg	tgggtctcgc	ggtatcattg	7362
cagcactggg	gccagatggt	aagccctccc	gtatcgtagt	tatctacacg acggggagtc	7422
aggcaactat	ggatgaacga	aatagacaga	tcgctgagat	aggtgcctca	ctgattaagc	7482
attggtaact	gtcagaccaa	gtttactcat	atatacttta	gattgattta	aaacttcatt	7542
tttaatttaa	aaggatctag	gtgaagatcc	tttttgataa	tctcatgacc	aaaatccctt	7602
aacgtgagtt	ttcgttccac	tgagcgtcag	accccgtaga	aaagatcaaa	ggatcttctt	7662
gagatccttt	ttttctgcgc	gtaatctgct	gcttgcaaac	aaaaaaacca	ccgctaccag	7722
cggtggtttg	tttgccggat	caagagctac	caactctttt	tccgaaggta	actggcttca	7782
gcagagcgca	gataccaaat	actgtcttct	agtgtagccg	tagttaggcc	accacttcaa	7842

-56CZ 303929 B6

gaactctgta	gcaccgccta	catacctcgc	tctgctaatc	ctgttaccag	tggctgctgc	7902
cagtggcgat	aagtcgtgtc	ttaccgggtt	ggactcaaga	cgatagttac	cggataaggc	7962
gcagcggtcg	ggctgaacgg	ggggttcgtg	cacacagccc	agcttggagc	gaacgaccta	8022
caccgaactg	agatacctac	agcgtgagct	atgagaaagc	gccacgcttc	ccgaagggag	8082
aaaggcggac	aggtatccgg	taagcggcag	ggtcggaaca	ggagagcgca	cgagggagct	8142
tccaggggga	aacgcctggt	atctttatag	tcctgtcggg	tttcgccacc	tctgacttga	8202
gcgtcgattt	ttgtgatgct	cgtcaggggg	gcggagccta	tggaaaaacg	ccagcaacgc	8262
ggccttttta	cggttcctgg	ccttttgctg	gccttttgct	cacatgttct	ttcctgcgtt	8322
atcccctgat	tctgtggata	accgtattac	cgcctttgag	tgagctgata	ccgctcgccg	8382
cagccgaacg	accgagcgca	gcgagtcagt	gagcgaggaa	gcggaagagc	gcccaatacg	8442
caaaccgcct	ctccccgcgc	gttggccgat	tcattaatgc	agctggcacg	acaggtttcc	8502
cgactggaaa	gcgggcagtg	agcgcaacgc	aattaatgtg	agttagctca	ctcattaggc	8562
accccaggct	ttacacttta	tgcttccggc	tcgtatgttg	tgtggaattg	tgagcggata	8622
acaatttcac	acaggaaaca	gctatgacca	tgattacgcc	aagctctcta	gagctctaga	8682
gctctagagc	tctagagagc	ttgcatgcct	gcaggtcg			8720

<210>	4
<211>	1459
<212>	PRT
<213>	umělá sekvence sapiens
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-l

- 57 CZ 303929 B6 <400> 4

Met Gin Ile

Cys Phe Ser -1

Trp Asp Tyr 15

Phe Pro Pro 30

Tyr Lys Lys

Ala Lys Pro

Ala Glu Val 80

His Pro Val 95

Glu Gly Ala 110

Asp Lys Val

Lys Glu Asn

Tyr Leu Ser 160

Gly Ala Leu

Glu Leu Ser Thr Cys -15

Ala Thr Arg Arg Tyr 1 5

Met Gin Ser Asp Leu 20

Arg Val Pro Lys Ser 35

Thr Leu Phe Val Glu

Arg Pro Pro Trp Met 65

Tyr Asp Thr Val Val 85

Ser Leu His Ala Val 100

Glu Tyr Asp Asp Gin 115

Phe Pro Gly Gly Ser 130

Gly Pro Met Ala Ser 145

His Ala Asp Leu Val 165

Leu Val Cys Arg Glu

Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg -10 -5

Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu 10

Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala

Phe Pro Phe Asn Thr ser Val

Phe Thr Asp His Leu Phe Asn 55 60

Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile 70 75

Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala 90

Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala 105

Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu 120

His Thr Tyr Val Trp Gin Val 135 140

Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr 150 155

Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 170

Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys

Phe

Ser

Arg

Val

Ile

Gin

Ser

Ser

Asp

125

Leu

Ser

Ile

Thr

-58CZ 303929 B6

175

Gin Thr Leu His Lys 190

Lys Ser Trp His Ser 210

Ala Ala Ser Ala Arg 225

Val Asn Arg Ser Leu 240

Tyr Trp His Val Ile 255

Phe Leu Glu Gly His 270

Leu Glu Ile Ser Pro 290

Asp Leu Gly Gin Phe 305

Asp Gly Met Glu Ala 320

Gin Leu Arg Met Lys 335

Leu Thr Asp Ser Glu 350

Pro Ser Phe Ile Gin

370

180

Phe Ile Leu Leu Phe 195

Glu Thr Lys Asn Ser 215

Ala Trp Pro Lys Met 230

Pro Gly Leu Ile Gly 245

Gly Met Gly Thr Thr 260

Thr Phe Leu Val Arg 275

Ile Thr Phe Leu Thr 295

Leu Leu Phe Cys His 310

Tyr Val Lys Val Asp 325

Asn Asn Glu Glu Ala 340

Met Asp Val Val Arg 355

Ile Arg Ser Val Ala 375

185

Ala Val Phe Asp Glu Gly 200 205

Leu Met Gin Asp Arg Asp 220

His Thr Val Asn Gly Tyr 235

Cys His Arg Lys Ser Val 250

Pro Glu Val His Ser Ile 265

Asn His Arg Gin Ala Ser 280 285 .Ala Gin Thr Leu Leu Met 300

Ile Ser Ser His Gin His 315

Ser Cys Pro Glu Glu Pro 330

Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 345

Phe Asp Asp Asp Asn Ser 360 365

Lys Lys His Pro Lys Thr 380

-59CL 303929 B6

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 385 390 395

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 400 405 410

Asn Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 415 420 425

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu

430 435 440 445

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

450 455 460

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 465 470 475

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 480 485 490

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 495 500 505

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

510 515 520 525

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

530 535 540

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 545 550 555

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 560 565 570

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 575 580 585

-60CZ 303929 B6

Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp

590 595 600 605

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

610 615 620

Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 625 630 635

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 640 645 650

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 655 660 665

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

670 675 680 685

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

690 695 700

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 705 710 715

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 720 725 730

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin 735 740 745

Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser

750 755 760 765

Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys

770 775 780

Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg

-61 CZ 303929 B6

785 790 795

Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg 800 805 810

Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 815 820 825

Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu 830 835 840 845

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 850 855 860

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 865 870 875

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 880 885 890

Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 895 900 905

Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp

910 915 920 925

Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

930 935 940

Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser 945 950 955

Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 960 965 970

Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 975 980 985

-62CZ 303929 B6

Ile 990	Phe	Asp Glu Thr Lys 995	Ser	Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg
1000	1005
Asn	Cys	Arg Ala Pro Cys 1010	Asn	Ile Gin Met Glu Asp 1015	Pro Thr Phe Lys 1020
Glu	Asn	Tyr Arg Phe His 1025	Ala	Ile Asn Gly Tyr Ile 1030	Met Asp Thr Leu 1035
Pro	Gly Leu Val Met Ala 1040	Gin	Asp Gin Arg Ile Arg L045	Trp Tyr Leu Leu 1050
Ser Met 1055	Gly Ser Asn Glu Asn 1060	Ile His Ser Ile His 1065	Phe Ser Gly His
Val 070	Phe	Thr val Arg Lys 1075	Lys	Glu Glu Tyr Lys Met 1080	Ala Leu Tyr Asn 1085
Leu	Tyr	Pro Gly Val Phe 1090	Glu	Thr Val Glu Met Leu 1095	Pro Ser Lys Ala 1100
Gly	Ile	Trp Arg Val Glu 1105	Cys	Leu Ile Gly Glu His 1110	Leu His Ala Gly 1115
Met	Asn Thr Leu Phe Leu 1120	Val Tyr Ser Asn Lys Cys 1125	Gin Thr Pro Leu 1130
Gly Met 1135	Ala Ser Gly His Ile 1140	Arg Asp Phe Gin Ile 1145	Thr Ala Ser Gly
Gin 150	Tyr	Gly Gin Trp Ala 1155	Pro	Lys Leu Ala Arg Leu 1160	His Tyr Ser Gly 1165
Ser	Ile	Asn Ala Trp Ser 1170	Thr	Lys Glu Pro Phe Ser 1175	Trp Ile Lys Val 1180
Asp	Leu	Leu Ala Pro Met 1185	Ile	Ile His Gly Ile Lys 1190	Thr Gin Gly Ala 1195

-63 CZ 303929 B6

Arg Gin Lys	Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe Ile	Ile	Met Tyr
	1200	1205	1210
Ser	Leu Asp	Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn	Ser	Thr Gly
1215	1220	1225
Thr	Leu Met	Val Phe Phe Gly Asn Val Asp	Ser Ser Gly	Ile	Lys His
230		1235 1240		1245
Asn	Ile Phe	Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg	Tyr Ile Arg	Leu	His Pro
		1250 1255		1260
Thr	His Tyr	Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg	Met Glu Leu	Met	Gly Cys
	1265 1270	1275
Asp	Leu Asn	Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly	Met Glu Ser	Lys	Ala Ile
	1280	1285	1290
Ser	Asp Ala	Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr	Phe Thr Asn	Met	Phe Ala
1295	1300	1305
Thr	Trp Ser	Pro Ser Lys Ala Arg Leu His	Leu Gin Gly Arg	Ser Asn
310		1315 1320		1325
Ala	Trp Arg	Pro Gin Glu Asn Asn Pro Lys	Glu Trp Leu	Gin	Val Asp
		1330 1335		1340
Phe	Gin Lys	Thr Met Lys Val Thr Gly Val	Thr Thr Gin Gly	Val Lys
	1345 1350	1355
Ser	Leu Leu	Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu	Phe Leu Ile	Ser	Ser Ser
	1360	1365	1370
Gin	Asp Gly	His Gin Trp Thr Leu Phe Phe	Gin Asn Gly	Lys	Val Lys
1375	1380	1385
Val	Phe Gin	Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr	Pro Val Val	Asn	Ser Leu

-64CZ 303929 B6

390 1395 1400 1405

Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gin Ser Trp 1410 1415 1420

Val His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin 1425 1430 1435

Asp Leu Tyr 1440 <210> 5 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Met Gin Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 15 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn .Acg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Val Asp Gly Asp Gin

90 95

Cys Glu Ser Asn Pro cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

-65CZ 303929 B6

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe 130 135 140

Cys Lys Asn ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190

Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gin Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gin Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285

His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290

295

300

-66CZ 303929 B6

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365

Leu Gin Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 460

	450	455
<210>	6
<211>	5753
<212>	DNA
<213>	umělá sekvence
<220>
<223>	popis umělé sekvence: pTGFG36

-67CZ 303929 B6 <400> 6

cgcgttgaca	ttgattattg	actagttatt	aatagtaatc	aattacgggg	tcattagttc	60
atagcccata	tatggagttc	cgcgttacat	aacttacggt	aaatggcceg	cctggctgac	120
cgcccaacga	cccccgccca	ttgacgtcaa	taatgacgta	tgttcccata	gtaacgccaa	180
tagggacttt	ccattgacgt	caatgggtgg	agtatttačg	gtaaactgcc	cacttggcag	240
tacatcaagt	gtatcatatg	ccaagtacgc	cccctattga	cgtcaatgac	ggtaaatggc	300
ccgcctggca	ttatgcccag	tacatgacct	tatgggactt	tcctacttgg	cagtacatct	360
acgtattagt	catcgctatt	accatggtga	tgcggttttg	gcagtacatc	aatgggcgtg	420
gatagcggtt	tgactcacgg	ggatttccaa	gtctccaccc	cattgacgtc	aatgggagtt	480
tgttttggca	ccaaaatcaa	cgggactttc	caaaatgtcg	taacaactcc	gccccattga	540
cgcaaatggg	cggtaggcgt	gtacggtggg	aggtctatat	aagcagagct	ctctggctaa	600
ctagagaacc	cactgcttac	tggcttatcg	aaattaatac	gactcactat	agggagaccc	660
aagcttgcat	gccaattccg	caaaggttat	gcagcgcgtg	aacatgatca	tggcagaatc	720
accaggcctc	atcaccatct	gccttttagg	atatctactc	agtgctgaat	gtacagtttt	780
tcttgatcat	gaaaacgcca	acaaaattct	gaatcggcca	aagaggtata	attcaggtaa	840
attggaagag	tttgttcaag	ggaaccttga	gagagaatgt	atggaagaaa	agtgtagttt	900
tgaagaagca	cgagaagttt	ttgaaaacac	tgaaagaaca	actgaatttt	ggaagcagta	960
tgttgatgga	gatcagtgtg	agtccaatcc	atgtttaaat	ggcggcagtt	gcaaggatga	1020
cattaattcc	tatgaatgtt	ggtgtccctt	tggatttgaa	ggaaagaact	gtgaattaga	1080
tgtaacatgt	aacattaaga	atggcagatg	cgagcagttt	tgtaaaaata	gtgctgataa	1140
caaggtggtt	tgctcctgta	ctgagggata	tcgacttgca	gaaaaccaga	agtcctgtga	1200
accagcagtg	ccatttccat	gtggaagagt	ttctgtttca	caaacttcta	agctcacccg	1260
tgctgagact	gtttttcctg	atgtggacta	tgtaaattct	actgaagctg	aaaccatttt	1320
ggataacatc	actcaaagca	cccaatcatt	taatgacttc	actcgggttg	ttggtggaga	1380
agatgccaaa	ccaggtcaat	tcccttggca	ggttgttttg	aatggtaaag	ttgatgcatt	1440
ctgtggaggc	tctatcgtta	atgaaaaatg	gattgtaact	gctgcccact	gtgttgaaac	1500
tggtgttaaa	attacagttg	tcgcaggtga	acataatatt	gaggagacag	aacatacaga	1560
gcaaaagcga	aatgtgattc	gaattattcc	tcaccacaac	tacaatgcag	ctattaataa	1620
gtacaaccat	gacattgccc	ttctggaact	ggacgaaccc	ttagtgctaa	acagctacgt	1680
tacacctatt	tgcattgctg	acaaggaata	cacgaacatc	ttcctcaaat	ttggatctgg	1740
ctatgtaagt	ggctggggaa	gacftcttcca	caaagggaga	tcagctttag	ttcttcagta	1800
ccttagagtt	ccacttgttg	accgagccac	atgtcttcga	tctacaaagt	tcaccatcta	1860
taacaacatg	ttctgtgctg	gcttccatga	aggaggtaga	gattcatgtc	aaggagatag	1920
tgggggaccc	catgttactg	aagtggaagg	gaccagtttc	ttaactggaa	ttattagctg	1980
gggtgaagag	tgtgcaatga	aaggcaaata	tggaatatat	accaaggtat	cccggtatgt	2040
caactggatt	aaggaaaaaa	caaagctcac	ttaatgggat	cggtcgagcg	gccgcgactc	2100
tactagagga	tctttgtgaa	ggaaccttac	ttctgtggtg	tgacataatt	ggacaaacta	2160

-68CZ 303929 B6 cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa 2220 ctactgattc taattgtttg tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag 2280 cagtggtgga atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt 2340 gatgatgagg ctactgctga ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta 2400 gaagacccca aggactttcc ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt 2460 aatagaactc ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac 2520 aagaaaatta tggaaaaata ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat 2580 aacatactgt tttttcttac tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct 2640 caaaaattgt gtacctttag ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg 2700 tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc 2760 tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 2820 tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 2880 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 2940 atcttatcat gtctggatcc ccgggtaccc tctagagcga attaattcac tggccgtcgt 3000 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 3060 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 3120 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 3180 cggtat.tt.ca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 3240 aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 3300 ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 3360 accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggggggtac cagcttcgta gctagaacat 3420 catgttctgg gatatcagct tcgtagctag aacatcatgt tctggtaccc ccctcgtgat 3480 acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 3540 ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 3600 gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 3660 tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 3720 tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 3780 acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 3840 cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 3900 ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 3960 ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 4020 atgcagtgct gcCataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 4080 cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 4140 tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 4200 gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 4260 ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 4320 ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 4380 tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 4440

-69CL 303929 136

cacgacgggg	agtcaggcaa	ctatggatga	acgaaataga	cagatcgctg	agataggtgc	4500
ctcactgatt	aagcattggt	aactgtcaga	ccaagtttac	tcatatatac	tttagattga	4560
tttaaaactt	catttttaat	ttaaaaggat	ctaggtgaag	atcctttttg	ataatctcat	4620
gaccaaaatc	ccttaacgtg	agttttcgtt	ccactgagcg	tcagaccccg	tagaaaagat	4680
caaaggatct	tcttgagatc	ctttttttct	gcgcgtaatc	tgctgcttgc	aaacaaaaaa	4740
accaccgcta	ccagcggtgg	tttgtttgcc	ggatcaagag	ctaccaactc	t ttt tcc gaa	4800
ggtaactggc	ttcagcagag	cgcagatacc	aaatactgtt	cttctagtgt	agccgtagtt	4860
aggccaccac	ttcaagaact	ctgtagcacc	gcctacatac	ctcgctctgc	taatcctgtt	4920
accagtggct	gctgccagtg	gcgataagtc	gtgtcttacc	gggttggact	caagacgata	4980
gttaccggat	aaggcgcagc	ggtcgggctg	aacggggggt	tcgtgcacac	agcccagctt	5040
ggagcgaacg	acctacaccg	aactgagata	cctacagcgt	gagctatgag	aaagcgccac	5100
gcttcccgaa	gggagaaagg	cggacaggta	tccggtaagc	ggcagggtcg	gaacaggaga	5160
gcgcacgagg	gagcttccag	ggggaaacgc	ctggtatctt	tatagtcctg	tcgggtttcg	5220
ccacctctga	cttgagcgtc	gattťttgtg	atgctcgtca	ggggggcgga	gcctatggaa	5280
aaacgccagc	aacgcggcct	ttttacggtt	cctggccttt	tgctggcctt	ttgctcacat	5340
gttctttcct	gcgttatccc	ctgattctgt	ggataaccgt	attaccgcct	ttgagtgagc	5400
tgataccgct	cgccgcagcc	gaacgaccga	gcgcagcgag	tcagtgagcg	aggaagcgga	5460
agagcgccca	atacgcaaac	cgcctctccc	cgcgcgttgg	ccgattcatt	aatgcagctg	5520
gcacgacagg	tttcccgact	ggaaagcggg	cagtgagcgc	aacgcaatta	atgtgagtta	5580
gctcactcat	taggcacccc	aggctttaca	ctttatgctt	ccggctcgta	tgttgtgtgg	5640
aattgtgagc	ggataacaat	ttcacacagg	aaacagctat	gaccatgatt	acgccaagct	5700
ctctagagct	ctagagctct	agagctctag	agagcttgca	tgcctgcagg	tcg	5753

<210>	7
<211>	8
<212>	PRT
<213>	umělá sekvence

<220>

<223> popis umělé sekvence: B-doména io peptidový linker <400> 7

Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>

<223> popis umělé sekvence: B-doména peptidový linker

- 70CZ 303929 B6 ιο

<400>	8	Gin Ala Tyr Arg 1
<210>	9
<211>	16
<212>	PRT
<213>	umělá sekvence
<220>
<223>	popis umělé sekvence: B-doména
	peptidový linker
<400>	9
Ser Phe Ser Gin	Asn Ser Arg His
	1	5
<210>	10
<211>	78
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	10

ggggtaccag cttcgtagct agaacatcat gttctgggat atcagcttcg tagctagaac 60 atcatgttct ggtacccc 78

<210>	11
<211>	78
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	11

ggggtaccag aacatgatgt tctagctacg aagctgatat cccagaacat gatgttctag 60 ctacgaagct ggtacccc 78

- 71 C/ 303929 B6 ιο

<210>	12
<21 1>	10698
<212>	DNA
<213>	umělá sekvence
<220>
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-2hyg-s
<220>
<221>	CDS
<222>	(676)..(5052)
<220>
<221>	mat peptide
<222>	(733)..(5052)
<400>	12

cgcgttgaca	ttgattattg	actagttatt	aatagtaatc	aattacgggg	tcattagttc	60
atagcccata	tatggagttc	cgcgttacat	aacttacggt	aaatggcccg	cctggctgac	120
cgcccaacga	cccccgccca	ttgacgtcaa	taatgacgta	tgttcccata	gtaacgccaa	180
tagggacttt	ccattgacgt	caatgggtgg	agtatttacg	gtaaactgcc	cacttggcag	240
tacatcaagt	gtatcatatg	ccaagtacgc	cccctattga	cgtcaatgac	ggtaaatggc	300
ccgcctggca	ttatgcccag	tacatgacct	tatgggactt	tcctacttgg	cagtacatct	360

-72CZ 303929 B6 acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttcr gcagtacatc aatgggcgtg 420 gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtetccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480 tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540 cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600 ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 660 aagcttgacc tcgag atg caa ata gag ctc tcc acc tgc ttc ttt ctg tgc 711 Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys

-15 -10

ctt ttg ega ttc tgc

ttt agt

gcc acc aga aga tac tac ctg

ggt gca Gly Ala

759

Leu

Leu

Arg Phe -5

Cys

Phe

Ser -1

Ala Thr 1

Arg Arg

Tyr 5

Tyr

Leu

gtg

gaa

ctg

tea

tgg

gac

tat

atg

caa

agt

gat

ctc

ggt

gag

ctg

cct

807

Val

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

10

15

20

25

gtg

gac

gca

aga

ttt

cCt

cct

aga

gtg

cca

aaa

tet

ttt

cca

ttc

aac

855

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

35

40

acc

tea

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gat

cac

903

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

His

45

50

55

ctt

ttc

aac

atc

gct

aag

□ca

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

cta

ggt

951

Leu

Phe

Asn

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

60

65

70

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

999

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

GlU

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

75

80

85

- 73 CZ 303929 B6

aac Asn 90

atg get tcc cat cct gtc agt ctt cat get gtt ggt gta tcc tac

1047

Met Ala Ser

His

Pro 95

Val

Ser Leu His

Ala 100

Val

Gly Val Ser Tyr 105

tgg

aaa

get

tet

gag

gga

get

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

1095

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr Asp Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

110

115

120

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

ttc

cct

ggt

gga

age

cat

aca

tat

gtc

1143

Glu

Lys

Glu

Asp

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

125

130

135

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

1191

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

140

145

150

ctt

acc

tac

tea

tat

ctt

tet

cat

gtg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

1239

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

155

160

165

tea

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

1287

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

170

175

180

185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

cta

ctt

ttt

get

gta

1335

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lys

Phe

Ile

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

190

195

200

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tea

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg

atg

1383

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

205

210

215

cag

gat

agg

gat

get

gca

tet

get

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

1431

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

220

225

230

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

1479

-74CZ 303929 B6

Val Asn Gly Tyr Val 235

Asn Arg 240

Ser Leu

Pro

Gly

Leu 245

lle

Gly

Cys

His

agg

aaa

tca

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg'

ggc

acc

act

cct

gaa

1527

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

Val

lle

Gly

Met.

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu

250

255

260

265

gtg

cac

tca

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

1575

Val

His

Ser

lle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

270

275

280

cgc

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

get

caa

1623

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

lle

Ser

Pro

lle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

285

290

295

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

cag

ttt

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

1671

Thr

Leu

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

lle

Ser

300

305

310

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

get

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

1719

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

315

320

325

cca

gag

gaa

ccc

caa

cta

ega

atg

aaa

aat

aat

gaa

gaa

gcg

gaa

gac

1767

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp

330

335

340

345

tat

gat

gat

gat

ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1815

Tyr Asp

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

gat

gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

cgc

tca

gtt

gcc

aag

aag

1863

Asp Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

lle

Gin

lle

Arg

Ser

Vál

Ala

Lys

Lys

365

370

375

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

1911

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

lle

Ala

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

380

385

390

- 75 CZ 303929 B6

gac Asp

tat Tyr 395

get Ala

ccc Pro

tta Leu

gtc Val

ctc gcc ccc gat gac aga agt tat

aaa Lys

agt Ser

1959

Leu Ala 400

Pro Asp

Asp

Arg 405

Ser

Tyr

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

aaa

2007

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

2055

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tea

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

2103

Ile

Gin

His

Glu

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

445

450

455

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

2151

Gly Asp

Thr

Leu

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

460

465

470

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tea

agg

2199

Asn

Ile

Tyr

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

475

480

485

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

2247

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

490

495

500

505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

2295

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

510

515

520

act

aaa

tea

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tat

tac

tet

agt

ttc

gtt

2343

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Phe

Val

525

530

535

aat

atg

gag

aga

gat

cta

get

tea

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

2391

-76CZ 303929 B6

Asn

Met

Glu 540

Arg Asp

Leu

Ala

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Leu

Ile

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

2439

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin 565

Ile

Met

Ser

Asp

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

age

tgg

2487

Lys 570

Arg

Asn

Val

Ile

Leu 575

Phe

Ser

Val

Phe

Asp 580

GlU

Asn

A,rg

Ser

Trp 585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

2535

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn 590

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu 595

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly 600

Val

cag

ctt

gag

gat

cca

gag

ttc

caa

gcc

tcc

aac

atc

atg

cac

age

atc

2583

Gin

Leu

Glu

Asp 605

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala 610

Ser

Asn

Ile

Met

His 615

Ser

Ile

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2631

A3n

Gly

Tyr 620

Val

Phe

Asp

Ser

Leu 625

Gin

Leu

Ser

Val

Cys 630

Leu

His

Glu

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

age

att

gga

gca

cág

act

gac

ttc

ctt

2679

Val

Ala 635

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu 640

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin 645

Thr

Asp

Phe

Leu

tet

gtc

ttc

ttc

tet

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2727

Ser 650

Val

Phe

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

Thr

Phe

Lys

His 660

Lys

Met

Val

Tyr

Glu 665

gac

aca

ctc

acc

cta

ttc

cca

ttc

tca

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

tcg

2775

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly 675

Glu

Thr

Val

Phe

Met 680

Ser

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttt

2823

Met

Glu

Asn

Pro 685

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu 690

Gly

Cys

His

Asn

Ser 695

Asp

Phe

-77CZ 303929 B6

cgg Arg

aac Asn

aga ggc atg

acc Thr

gcc tta

ctg aag gtt tet agt tgt gac aag

2871

Arg 700

Gly

Met

Ala

Leu 705

Leu

Lys

Val

Ser Ser 710

Cys

Asp

Lys

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tca

gca

tac

2919

Asn

Thr

Gly Asp

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Ala

Tyr

715

720

725

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

agc

ttc

tcc

cag

aat

2967

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

730

735

740

745

tca

aga

cat

caa

gct

tat

ega

tac

cgt

ega

ggg

gaa

ata

act

cgt

act

3015

Ser

Arg

His

Gin

Ala

Tyr

Arg

Tyr

Arg

Arg

Gly

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

750

755

760

act

ctt

cag

tca

gat

caa

gag

gaa

att

gac

tat

gat

gat

acc

ata

tca

3063

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

Glu

Glu

Ile

Asp

Tyr

Asp

Asp

Thr

Ile

Ser

765

770

775

gtt

gaa

atg

aag

aag

gaa

gat

ttt

gac

att

tat

gat

gag

gat

gaa

aat

3111

Val

Glu

Met

Lys

Lys

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr Asp

Glu

Asp

Glu

Asn

780

785

790

cag

agc

ccc

cgc

agc

ttt

caa

aag

aaa

aca

ega

cac

tat

ttt

att

gct

3159

Gin

Ser

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Lys

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

Ile

Ala

795

800

805

gca

gtg

gag

agg

ctc

tgg

gat

tat

ggg

atg

agt

agc

tcc

cca

cat

gtt

3207

Ala

Val

Glu

Arg

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

ser

Ser

Ser

Pro

His

val

810

815

820

825

cta

aga

aac

agg

gct

cag

agt

ggc

agt

gtc

cct

cag

ttc

aag

aaa

gtt

3255

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Gin

Phe

Lys

Lys

Val

830

835

840

gtt

ttc

cag

gaa

ttt

act

gat

ggc

tcc

ttt

act

cag

ccc

tta

tac

cgt

3303

Val

Phe

Gin

Glu 845

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser 850

Phe

Thr

Gin

Pro

Leu 855

Tyr Arg

gga

gaa

cta

aat

gaa

cat

ttg

gga

ctc

ctg

ggg

cca

tat

ata

aga

gca

3351

Gly

Glu

Leu 860

Asn

Glu

His

Leu

Gly 865

Leu

Leu

Gly

Pro

Tyr 870

Ile

Arg

Ala

gaa

gtt

gaa

gat

aat

atc

atg

gta

act

ttc

aga

aat

cag

gcc

tet

cgt

3399

Glu

Val 875

Glu

Asp

Asn

Ile

Met 880

Val

Thr

Phe

Arg

Asn 885

Gin

Ala

Ser

Arg

ccc

tat

tcc

ttc

tat

tet

agc

ctt

att

tet

tat

gag

gaa

gat

cag

agg

3447

Pro 890

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser 895

Ser

Leu

Ile

Ser

Tyr 900

Glu

Glu

Asp

Gin

Arg 905

caa

gga

gca

gaa

cct

aga

aaa

aac

ttt

gtc

aag

cct

aat

gaa

acc

aaa

3495

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro 910

Arg

Lys

Asn

Phe

Val 915

Lys

Pro

Asn

Glu

Thr 920

Lys

act

tac

ttt

tgg

aaa

gtg

caa

cat

cat

atg

gca

ccc

act

aaa

gat

gag

3543

Thr

Tyr

Phe

Trp 925

Lys

Val

Gin

His

His 930

Met

Ala

Pro

Thr

Lys 935

Asp

Glu

ttt

gac

tgc

aaa

gcc

tgg

gct

tat

ttc

tet

gat

gtt

gac

ctg

gaa

aaa

3591

Phe

Asp

Cys 940

Lys

Ala

Trp

Ala

Tyr 945

Phe

Ser

Asp

Val

Asp 950

Leu

Glu

Lys

gat

gtg

cac

tca

ggc

ctg

att

gga

ccc

ctt

ctg

gtc

tgc

cac

act

aac

3639

Asp

Val 955

His

Ser

Gly

Leu

Ile 960

Gly

Pro

Leu

Leu

val 965

Cys

His

Thr

Asn

aca

ctg

aac

cct

gct

cat

ggg

aga

caa

gtg

aca

gta

cag

gaa

ttt

gct

3687

Thr 970

Leu

Asn

Pro

Ala

His 975

Gly Arg

Gin

Val

Thr 980

Val

Gin

Glu

Phe

Ala 985

ctg

ttt

ttc

acc

atc

ttt

gat

gag

acc

aaa

agc

tgg

tac

ttc

act

gaa

3735

Leu

Phe

Phe

Thr

Ile 990

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys 995

Ser

Trp

Tyr

Phe Thr 1000

Glu

-79CZ 303929 B6 aat atg gaa aga aac tgc agg get ccc tgc aat atc cag atg gaa gat

Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn lle Gin Met Glu Asp

1005 1010 1015 ccc act ttt aaa gag aat tat ege ttc cat gca atc aat ggc tac ata

Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala lle Asn Gly Tyr lle

1020 1025 1030 atg gat aca cta cct ggc tta gta atg get cag gat caa agg att ega

Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asp Gin Arg lle Arg

1035 1040 1045 tgg tat ctg ctc age atg ggc age aat gaa aac atc cat tet att cat

Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn lle His Ser lle His

1050 1055 1060 1065 ttc agt gga cat gtg ttc act gta ega aaa aaa gag gag tat aaa atg

Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

1070 1075 1080 gca ctg tac aat ctc tat cca ggt gtt ttt gag aca gtg gaa atg tta

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu

1085 1090 1095 cca tcc aaa get gga att tgg cgg gtg gaa tgc ctt att ggc gag cat

Pro Ser Lys Ala Gly lle Trp Arg Val Glu Cys Leu lle Gly Glu His

1100 1105 1110 cta cat get ggg atg age aca ctt ttt ctg gtg tac age aat aag tgt

Leu His Ala Gly Met Set Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys

1115 1120 1125 cag act ccc ctg gga atg get tet gga cac att aga gat ttt cag att

Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His lle Arg Asp Phe Gin lle

1130 1135 1140 1145 aca get tca gga caa tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt

3783

3831

3879

3927

3975

4023

4071

4119

4167

4215

- 80CZ 303929 B6

Thr Ala Ser Gly Gin 1150	Tyr	Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu
1155	1160
cat tat tcc gga tea	atc	aat gcc tgg age	acc aag gag ccc ttt tet 4263
His Tyr Ser Gly Ser	Ile	Asn Ala Trp Ser	Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1165		1170	1175
tgg atc aag gtg gat	ctg	ttg gca cca atg	att att cac ggc atc aag 4311
Trp Ile Lys val Asp	Leu	Leu Ala Hro Met	Ile ile His Gly Ile Lys
1180		1185	1190
acc cag ggt gcc cgt	cag	aag ttc tcc age	Ctc tac atc tet cag ttt 4359
Thr Gin Gly Ala Arg	Gin	Lys Phe Ser Ser	Leu Tyr Ile Ser Gin Phe
1195	1200	1205
atc atc atg tat agt	ctt	gat ggg aag aag	tgg cag act tat ega gga 4407
Ile Ile Met Tyr Ser	Leu	Asp Gly Lys Lys	Trp Gin Thr Tyr Arg Gly
1210 1215	1220 1225
aat tcc act gga acc	tta	atg gtc ttc ttt	ggc aat gtg gat tea tet 4455
Asn Ser Thr Gly Thr	Leu	Met val Phe Phe	Gly Asn Val Asp Ser Ser
1230		1235	1240
ggg ata aaa cac aat	att	ttt aac cct cca	att att gct ega tac atc 4503
Gly Ile Lys His Asn	Ile	Phe Asn Pro Pro	Ile Ile Ala Arg Tyr Ile
1245		1250	1255
cgt ttg cac cca act	cat	tat age att ege	age act ctt ege atg gag 4551
Arg Leu His Pro Thr	His	Tyr Ser Ile Arg	Ser Thr Leu Arg Met Glu
1260		1265	1270
ttg atg ggc tgt gat	tta	aat agt tgc age	atg cca ttg gga atg gag 4599
Leu Met Gly Cys Asp	Leu	Asn Ser Cys Ser	Met Pro Leu Gly Met Glu
1275	1280	1285
agt aaa gca ata tea	gat	gca cag att act	gct tea tcc tac ttt acc 4647
Ser Lys Ala Ile Ser	Asp	Ala Gin Ile Thr	Ala Ser Ser Tyr Phe Thr

1290 1295 1300 1305

- 81 CZ 303929 B6

4695

aat

atg

ttt

gcc

acc

tgg

tet

cct

tca

aaa

gct

ega

ctt

cac

ctc

caa

Asn

Met

Phe

Ala

Thr 1310

Trp

Ser

Pro

Ser

Lys 1315

Ala

Arg

Leu

His

Leu 1320

Gin

ggg

agg

agt

aat

gcc

tgg

aga

cct

cag

gtg

aat

aat

cca

aaa

gag

tgg

Gly Arg

Ser

Asn 1325

Ala

Trp

Arg

Pro Gin 1330

Val

Asn

Asn

Pro Lys 1335

Glu

Trp

ctg

caa

gtg

gac

ttc

cag

aag

aca

atg

aaa

gtc

aca

gga

gta

act

act

Leu

Gin Val 1340

Asp

Phe

Gin

Lys Thr 1345

Met

Lys

Val

Thr Gly 1350

Val

Thr

Thr

cag

gga

gta

aaa

tet

ctg

ctt

acc

agc

atg

tat

gtg

aag

gag

ttc

ctc

Gin Gly 1355

Val

Lys

Ser

Leu Leu 1360

Thr

Ser

Met

Tyr Val 1365

Lys

Glu

Phe

Leu

4743

4791

4839 atc tcc agc agt caa gat ggc cat cag tgg acc ctc ttt ttt cag aat Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn 1370 1375 1380 1385

4887

ggc aaa	gta aag gtt ttt cag gga	aat caa Asn Gin 1395	gac Asp	tcc Ser	ttc Phe	aca cct Thr Pro 1400	gtg Val
Giv	Lys	Val	Lys Val 1390	Phe Gin Gly
gtg	aac	tet	cta gac	cca ccg tta	ctg act	ege	tac	ctt	ega att	cac
Val	Asn	Ser	Leu Asp	Pro Pro Leu	Leu Thr	Arg	Tyr	Leu	Arg Ile	His
		1405	1410			1415
ccc	cag	agt	tgg gtg	cac cag att	gcc ctg	agg	atg	gag gtt ctg	ggc
Pro	Gin	Ser	Trp Val	His Gin Ile	Ala Leu	Arg	Met	Glu	val Leu	Gly

1420 1425 1430

4935

4983

5031 tgc gag gca cag gac ctc tac tgagcggccg cgactctact agaggatctt Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

1435 1440 tgtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta

5082

5142

- 82 CZ 303929 B6

aagctctaag	gtaaatataa	aatttttaag	tgtataatgt	gttaaactac tgattctaat	5202
tgtttgtgta	ttttagattc	caacctatgg	aactgatgaa	tgggagcagt	ggtggaatgc	5262
ctttaatgag	gaaaacctgt	tttgctcaga	agaaatgcca	tctagtgatg	atgaggctac	5322
tgctgactct	caacattcta	ctcctccaaa	aaagaagaga	aaggtagaag	accccaagga	5382
ctttccttca	gaattgctaa	gttttttgag	tcatgctgtg	tttagtaata	gaactcttgc	5442
ttgctttgct	atttacacca	caaaggaaaa	agctgcactg	ctatacaaga	aaattatgga	5502
aaaatattct	gtaaccttta	taagtaggca	taacagttat	aatcataaca	tactgttttt	5562
tcttactcca	cacaggcata	gagtgtctgc	tattaataac	tatgctcaaa	aattgtgtac	5622
ctttagcttt	ttaatttgta	aaggggttaa	taaggaatat	ttgatgtata	gtgccttgac	5682:
tagagatcat	aatcagccat	accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	5742
cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	5802
ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	5862
ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	ccaaactcat	caatgtatct	tatcatgtct	5922
ggatcccccg	aacgccagca	agacgtagcc	cagcgcgtcg	gccccgagat	gcgccgcgtg	5982
cggctgctgg	agatggcgga	cgcgatggat	atgttctgcc	aagggttggt	ttgcgcattc	6042
acagttctcc	gcaagaattg	attggctcca	attcttggag	tggtgaatcc	gttagcgagg	6102
tgccgccctg	cttcatcccc	gtggcccgtt	gctcgcgttt	gctggcggtg tccccggaag	6162
aaatatattt	gcatgtcttt	agttctatga	tgacacaaac	cccgcccagc gtcttgtcat	6222
tggcgaattc	gaacacgcag	atgcagtcgg	ggcggcgcgg	tccgaggtcc	acttcgcata	6282

-83 CZ 303929 B6

ttaaggtgac	gcgtgtggcc	tcgaacaccg	agcgaccctg	cagcgacccg	cttaacagcg	6342
tcaacagcgt	gqcgcagatc	agcttgatat	gaaaaagcct	gaactcaccg	cgacgtctgt	6402
cgagaagttt	ctgatcgaaa	agttcgacag	cgtctccgac	ctgatgcagc	tctcggaggg	6462
cgaagaatct	cgtgctttca	gcttcgatgt	aggagggcgt	ggatatgtcc	tgcgggtaaa	6522
tagctgcgcc	gatggtttct	acaaagatcg	ttatgtttat	cggcactttg	catcggccgc	6582
gctcccgatt	ccggaagtgc	ttgacattgg	ggaattcagc	gagagcctga	cctattgcat	6642
ctcccgccgt	gcacagggtg	tcacgttgca	agacctgcct	gaaaccgaac	tgcccgctgt	6702
tctgcagccg	gtcgcggagg	ccatggatgc	gatcgctgcg	gccgatctta	gccagacgag	6762
cgggttcggc	ccattcggac	cgcaaggaat	cggtcaatac	actacatggc	gtgatttcat	6822
atgcgcgatt	gctgatcccc	atgtgtatca	ctggcaaact	gtgatggacg	acaccgtcag	6882
tgcgtccgtc	gcgcaggctc	tcgatgagct	gatgctttgg	gccgaggact	gccccgaagt	6942
ccggcacctc	gtgcacgcgg	atttcggctc	caacaatgtc	ctgacggaca	atggccgcat	7002
aacagcggtc	attgactgga	gcgaggcgat	gttcggggat	tcccaatacg	aggtcgccaa	7062
catcttcttc	tggaggccgt	ggttggcttg	tatggagcag	cagacgcgct	acttcgagcg	7122
gaggcatccg	gagcttgcag	gatcgccgcg	gctccgggcg	tatatgctcc	gcattggtct	7182
tgaccaactc	tatcagagct	tggttgacgg	caatttcgat	gatgcagctt	gggcgcaggg	7242
tcgatgcgac	gcaatcgtcc	gatccggagc	cgggactgtc	gggcgtacac	aaatcgcccg	7302
cagaagcgcg	gccgtctgga	ccgatggctg	tgtagaagta	ctcgccgata	gtggaaaccg	7362
acgccccagc	actcgtccgg	atcgggagat	gggggaggct	aactgaaaca	cggaaggaga	7422

-84CZ 303929 B6

caataccgga	aggaacccgc	gctatgaogg	caataaaaag	acagaataaa	acgcacgggt	7482
gttgggtcgt	ttgttcataa	acgcggggtt	cggtcccagg	gctggcactc	tgtcgatacc	7542
ccaccgagac	cccattgggg	ccaatacgcc	cgcgtttctt	ccttttcccc	accccacccc	7602.
ccaagttcgg	gtgaaggccc	agggctcgca	gccaacgtcg	gggcggcagg	ccctgccáta	7662
gccactggcc	ccgtgggtta	gggacggggt	cccccatggg	gaatggttta	tggttcgtgg	7722
gggttattat	tttgggcgtt	gcgtggggtc	aggtccacga	ctggactgag	cagacagacc	7782:
catggttttt	ggatggcctg	ggcatggacc	gcatgtactg	gcgcgacacg	aacaccgggc	7842
gtctgtggct	gccaaacacc	cccgaccccc	aaaaaccacc	gcgcggattt	ctggcgtgcc	7902
aagctgggta	ccctctagag	cgaattaatt	cactggccgt	cgttttacaa	cgtcgtgact	7962
gggaaaaccc	tggcgttacc	caacttaatc	gccttgcagc	acatccccct	ttcgccagct	8022
ggcataatag	cgaagaggcc	cgcaccgatc	gcccttccca	acagttgcgc	agcctgaatg	8082
gcgaatggcg	cctgatgcgg	tattttctcc	ttacgcatct	gtgcggtatt	tcacaccgca	8142
tatggtgcac	tctcagtaca	atctgctctg	atgccgcata	gttaagccag	ccccgacacc	8202
cgccaacacc	cgctgacgcg	ccctgacggg	cttgtctgct	cccggcatcc	gcttacagac	8262
aagctgtgac	cgtctccggg	agctgcatgt	gtcagaggtt	ttcaccgtca	tcaccgaaac	8322
gcgcgagacg	aaaggggggg	taccagcttc	gtagctagaa.	catcatgttc	tgggatatca	8382
gcttcgtagc	tagaacatca	tgttctggta	cccccctcgt.	gatacgccta	tttttatagg	8442
ttaatgtcat	gataataatg	gtttcttaga	cgtcaggtgg	cacttttcgg	ggaaatgtgc	8502
gcggaacccc	tatttgttta	tttttctaaa	tacattcaasi	tatgtatccg	ctcatgagac	8562

- 85 CZ 303929 B6

aataaccctg	ataaatgctt	caataatatt	gaaaaaggaa	gagtatgagt	attcaacatt	8622
tccgtgtcgc	ccttattccc	ttttttgcgg	cattttgcct	tcctgttttt	gctcacccag	8682
aaacgctggt	gaaagtaaaa	gatgctgaag	atcagttggg	tgcacgagtg	ggttacatcg	8742
aactggatct	caacagcggt	aagatccttg	agagttttcg	ccccgaagaa	cgttttccaa	8802
tgatgagcac	ttttaaagtt	ctgctatgtg	gcgcggtatt	atcccgtatt	gacgccgggc	8862
aagagcaact	cggtcgccgc	ataeactatt	ctcagaatga	cttggttgag	tactcaccag	8922
tcacagaaaa	gcatcttacg	gatggcatga	cagtaagaga	attatgcagt	gctgccataa	8982
ccatgagtga	taacactgcg	gccaacttac	ttctgacaac	gatcggagga	ccgaaggagc	9042
taaccgcttt	tttgcacaac	atgggggatc	atgtaactcg	ccttgatcgt	tgggaaccgg	9102
agctgaatga	agccatacca	aacgacgagc	gtgacaccac	gatgcctgta	gcaatggcaa	9162
caacgttgcg	caaactatta	actggcgaac	tacttactct	agcttcccgg	caacaattaa	9222
tagactggat	ggaggcggat	aaagttgcag	gaccacttct	gc.gctcggcc	cttccggctg	9282
gctggtttat	tgctgataaa	tctggagccg	gtgagcgtgg	gtctcgcggt	atcattgcag	9342
cactggggcc	agatggtaag	ccctcccgta	tcgtagttat	ctacacgacg	gggagtcagg	9402
caactatgga	tgaacgaaat	agacagatcg	ctgagatagg	tgcctcactg	attaagcatt	9462
ggtaactgtc	agaccaagtt	tactcatata	tactttagat	tgatttaaaa	cttcattttt	9522
aatttaaaag	gatctaggtg	aagatccttt	ttgataatct	catgaccaaa	atcccttaac	9582
gtgagttttc	gttccactga	gcgtcagacc	ccgtagaaaa	gatcaaagga	tcttcttgag	9642
atcctttttt	tctgcgcgta	atctgctgct	tgcaaacaaa	aaaaccaccg	ctaccagcgg	9702

-86CZ 303929 B6

tggtttgttt	gccggatcaa	gagctaccaa	ctctttttcc	gaaggtaact	ggcttcagca	9762
gagcgcagat	accaaatact	gttcttctag	tgtagccgta	gttaggccac	cacttcaaga	9822
actctgtagc	aCcgcctaca	tacctcgctc	tgctaatcct	gttaccagtg	gctgctgcca	9882
gtggcgataa	gtcgtgtctt	accgggttgg	actcaagacg	atagttaccg	gataaggcgc	9942
agcggtcggg	ctgaacgggg	ggttcgtgca	cacagcccag	cttggagcga	acgacctaca	10002
ccgaactgag	atacctacag	cgtgagctat	gagaaagcgc	cacgcttccc	gaagggagaa	10062
aggcggacag	gtatccggta	agcggcaggg	tcggaacagg	agagcgcacg	agggagcttc	10122
cagggggaaa	cgcctggtat ctttatagtc	ctgtcgggtt	tcgccacctc	tgacttgagc	10182
gtcgattttt	gtgatgctcg	tcaggggggc	ggagcctatg	gaaaaacgcc	agcaacgcgg	10242
cctttttacg	gttcctggcc	ttttgctggc	cttttgctca	catgttcttt	cctgcgttat	10302
cccctgattc	tgtggataac	cgtattaccg	cctttgagtg	agctgatacc	gctcgccgca	10362
gcegaacgac	cgagcgcagc	gagtcagtga	gcgaggaagc	ggaagagcgc	ccaatacgca	10422
aaccgcctct	ccccgcgcgt	tggccgattc	attaatgcag	ctggcacgac	aggtttcccg	10482
actggaaagc	gggcagtgag	cgcaacgcaa	ttaatgtgag	ttagctcact	cattaggcac	10542
cccaggcttt	acactttatg	cttccggctc	gtatgttgtg	tggaattgtg	agcggataac	10602
aatttcacac	aggaaacagc	fcatgaccatg	attacgccaa	gctctctaga	gctctagagc	10662
tctagagctc	tagagagctt	gcatgcctgc	aggtcg			10698

<210>	13
<211>	1459
<212>	PRT
<213>	umělá sekvence
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-2hyg-s

-87CZ 303929 B6 <400> 13

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe -15 -10 —5

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser -11 5 10

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu LeU Pro Val Asp Ala Arg 15 20 25

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 30 35 40 45

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 50 55 60

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin 65 70 75

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 80 85 90

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 95 100 105

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 110 115 120 125

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu 130 135 140

Lys Glu Asn Gly

Pro Met Ala

Ser Asp

Pro Leu Cys

Leu Thr Tyr Ser

145

1Š0

155

-88CZ 303929 B6

Tyr Leu Ser His Val 160

Gly Ala Leu Leu Val 175

Gin Thr Leu His Lys 190

Lys Ser Trp His Ser 210

Ala Ala Ser Ala Arg 225

Val Asn Arg Ser Leu 240

Tyr Trp His Val Ile 255

Phe Leu Glu Gly His 270

Leu Glu Ile Ser Pro

290

Asp Leu Gly Gin Phe 305

Asp Gly Met Glu Ala 320

Gin Leu Arg Met Lys 335

Leu Thr Asp Ser Glu 350

Asp Leu Val Lys Asp Leu 165

Cys Arg Glu Gly Ser Leu 180

Phe Ile Leu Leu Phe Ala 195 200

Glu Thr Lys Asn Ser Leu 215

Ala Trp Pro Lys Met His 230

Pro Gly Leu Ile Gly Cys 245

Gly Met Gly Thr Thr Pro 260

Thr Phe Leu Val Arg Asn 275 280

Ile Thr Phe Leu Thr Ala 295

Leu Leu Phe Cys His Ile 310

Tyr Val Lys Val Asp Ser 325

Asn Asn Glu Glu Ala Glu 340

Met Asp Val Val Arg Phe 355 360

Asn Ser Gly Leu Ile 170

Ala Lys Glu Lys Thr 185

Val Phe Asp Glu Gly 205

Met Gin Asp Arg Asp 220

Thr Val Asn Gly Tyr 235

His Arg Lys Ser Val 250

Glu Val His Ser Ile 265

His Arg Gin Ala Ser 285

Gin Thr Leu Leu Met

300

Ser Ser His Gin His 315

Cys Pro Glu Glu Pro 330

Asp Tyr Asp Asp Asp 345

Asp Asp Asp Asn Ser 365

-89CZ 303929 B6

Pro Ser Phe Ile Gin Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 370 375 380

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 385 390 395

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 400 405 410

Asn Gly Pro Gin Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 415 420 425

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gin His Glu

430 435 440 445

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

450 455 460

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 465 470 475

His Gly Ile Thr Asp val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 480 485 490

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 495 500 505

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

510 515 520 525

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

530 535 540

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 545 550 555

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

-90CZ 303929 B6

560

Ile Leu Phe Ser Val Phe 575

Asn Ile Gin Arg Phe Leu 590 595

Pro Glu Phe Gin Ala Ser 610

Phe Asp Ser Leu Gin Leu 625

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly 640

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys 655

Leu Phe Pro Phe Ser Gly 670 675

Gly Leu Trp Ile Leu Gly 690

Met Thr Ala Leu Leu Lys 705

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr 720

Asn Asn Ala Ile Glu Pro 735

Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg 750 755

565

Asp Glu Asn Arg Ser 580

Pro Asn Pro Ala Gly 600

Asn Ile Met His Ser 615

Ser Val Cys Leu His 630

Ala Gin Thr Asp Phe 645

His Lys Met Val Tyr 660

Glu Thr Val Phe Met 680 cys His Asn Ser Asp 695

Val Ser Ser Cys Asp 710

Glu Asp Ile Ser Ala 725

Arg Ser Phe Ser Gin 740

Gly Glu Ile Thr Arg 760

570

Trp Tyr Leu Thr Glu 585

Val Gin Leu Glu Asp 605

Ile Asn Gly Tyr Val 620

Glu Val Ala Tyr Trp 635

Leu Ser Val Phe Phe 650

Glu Asp Thr Leu Thr 665

Ser Met Glu Asn Pro 685

Phe Arg Asn Arg Gly 700

Lys Asn Thr Gly Asp 715

Tyr Leu Leu Ser Lys 730

Asn Ser Arg His Gin 745

Thr Thr Leu Gin Ser

765

Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys 770 775 780

Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg 785 790 795

Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg 800 805 810

Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 815 820 825

Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu

830 835 840 845

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn

850 855 860

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 865 870 875

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 880 885 890

Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 895 900 905

Pro Arg Lys Asn Phe Včil Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp

910 915 920 925

Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

930 935 940

Tkla Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val. His Ser 945 950 955

Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 960 965 970

-92CZ 303929 B6

Ala His	Gly	Arg	Gin	Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr
	975	980	985
lle 990	Phe	Asp	Glu	Thr	Lys Ser 995	Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg 1000 1005
Asn	Cys	Arg	Ala	Pro 1010	Cys Asn	lle Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1015 1020
Glu	Asn	Tyr Arg 1025	Phe	His Ala	lle Asn Gly Tyr lle Met Asp Thr Leu 1030 1035
Pro	Gly Leu 1040	val	Met	Ala Gin Asp Gin Arg lle Arg Trp Tyr Leu Leu 1045 1050
Ser Met 1055	Gly	Ser	Asn	Glu Asn 1060	lle His Ser lle His Phe Ser Gly His 1065
Val 070	Phe	Thr	Val	Arg Lys Lys 1075	Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1080 1085
Leu	Tyr	Pro	Gly Val 1090	Phe Glu	Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala 1095 1100
Gly	lle	Trp Arg 1105	Val	Glu Cys	Leu lle Gly Glu His Leu His Ala Gly 1110 1115
Met	Ser Thr 1120	Leu	Phe	Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 1125 1130
Gly Met 1135	Ala	Ser	Gly	His lle 1140	Arg Asp Phe Gin lle Thr Ala Ser Gly 1145
Gin 150	Tyr	Gly	Gin	Trp Ala Pro 1155	Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly 1160 1165
Ser	lle	Asn	Ala	Trp	Ser Thr	Lys Glu Pro Phe Ser Trp Xle Lys Val

-93 CL 303929 B6

1170 1175 1180

Asp	Leu	Leu Ala 1185	Pro	Met	Ile	Ile His 1190	Gly	Ile Lys Thr Gin 1195	Gly Ala
Arg	Gin Lys Phe 1200	Ser	Ser	Leu	Tyr Ile 1205	Ser	Gin Phe Ile Ile 1210	Met Tyr
Ser	Leu 1215	Asp Gly	Lys	Lys	Trp 1220	Gin Thr	Tyr	Arg Gly Asn Ser 1225	Thr Gly
Thr 230	Leu	Met Val	Phe Phe 1235	Gly	Asn Val	Asp Ser Ser Gly Ile 1240	Lys His 1245
Asn	Ile	Phe Asn Pro 1250	Pro	Ile	Ile Ala Arg 1255	Tyr Ile Arg Leu His Pro 1260
Thr	His	Tyr Ser 1265	Ile	Arg	Ser	Thr Leu 1270	Arg	Met Glu Leu Met 1275	Gly Cys
Asp	Leu Asn Ser 1280	Cys	Ser	Met Pro Leu 1285	Gly	Met Glu Ser Lys 1290	Ala Ile
Ser Asp 1295	Ala Gin	Ile	Thr	Ala 1300	Ser Ser	Tyr	Phe Thr Asn Met 1305	Phe Ala
Thr 310	Trp	Ser Pro	Ser Lys 1315	Ala	Arg Leu	His Leu Gin Gly Arg 1320	Ser Asn 1325
Ala	Trp	Arg Pro Gin 1330	Val	Asn	Asn Pro Lys 1335	Glu Trp Leu Gin Val Asp 1340
Phe	Gin	Lys Thr Met 1345	Lys	Val	Thr Gly Val 1350	Thr Thr Gin Gly Val Lys 1355
Ser	Leu	Leu Thr	Ser	Met	Tyr Val Lys	Glu	Phe Leu Ile Ser	Ser Ser

1360 1365 1370

-94CZ 303929 B6

Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys 1375 1380 1385

Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu
390	1395	1400	1405
Asp Pro	Pro Leu Leu Thr Arg 1410	Tyr Leu Arg Ile 1415	His Pro Gin Ser Trp 1420
Val His	Gin Ile Ala Leu Arg	Met Glu Val Leu	Gly Cys Glu Ala Gin

1425 1430 1435

Asp Leu Tyr 1440

<210>	14
<211>	10698
<212>	DNA
<213>	umělá sekvence
<220>
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-3
<220>
<221>	CDS
<222>	(676)..(5052)
<220>
<221>	mat_peptide
<222>	(733)..(5052)
<400>	14

cgcgtfcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg teattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt: aaatggcccg cctggctgac 120

-95CZ 303929 B6

cgcccaacga	cccccgccca	ttgacgtcaa	taatgacgta	tgttcccata	gtaacgccaa	180
tagggacttt	ccattgacgt	caatgggtgg	agtatttacg	gtaaactgcc	cacttggcag	240
tacatcaagt	gtatcatatg	ccaagtacgc	cccctattga	cgtcaatgac	ggtaaatggc	300
ccgcctggca	ttatgcccag	tacatgacct	tatgggactt	tcctacttgg	cagtacatct	360
acgtattagt	catcgctatt	accatggtga	tgcggttttg	gcagtacatc	aatgggcgtg	420
gatagcggtt	tgactcacgg	ggatttccaa	gtctccaccc	cattgacgtc	aatgggagtt	480
tgttttggca	ccaaaatcaa	cgggactttc	caaaatgtcg	taacaactcc	gccccattga	540
cgcaaatggg	cggtaggcgt	gtacggtggg	aggtctatat	aagcagagct	ctctggctaa	600
ctagagaacc	cactgcttac	tggcttatcg	aaattaatac	gactcactat	agggagacce	660

aagcttgacc tcgag atg caa ata gag ctc tcc acc tgc ttc ttt ctg tgc 711 Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys

-15 -10

ctt Leu

ttg ega ttc Leu Arg Phe -5

tgc Cys

ttt Phe

agt gcc acc aga aga tac tac

ctg ggt

gca Ala

759

Ser -1

Ala 1

Thr

Arg

Arg Tyr 5

Tyr

Leu

Gly

gtg

gaa

ctg

tca

tgg

gac

tat

atg

caa

agt

gat

ctc

ggt

gag

ctg

cct

807

Val

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

10

15

20

25

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

cct

aga

gtg

cca

aaa

tet

ttt

cca

ttc

aac

855

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

35

40

acc

tca

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gat

cac

903

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

His

45

50

55

ctt Leu

ttc aac atc gct aag

cca agg Pro Arg 65

cca Pro

ccc tgg atg ggt ctg cta

ggt Gly

951

Phe

Asn Ile Ala Lys 60

Pro Trp Met

Gly 70

Leu

Leu

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

999

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr Asp

Thr

Val

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

75

80

85

aac

atg

gct

tcc

cat

cct

gtc

agt

ctt

cat

gct

gtt

ggt

gta

tcc

tac

1047

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

90

95

100

105

tgg

aaa

gct

tet

gag

gga

gct

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

1095

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr Asp

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

110

115

120

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

ttc

cct

ggt

gga

agc

cat

aca

tat

gtc

1143

Glu

Lys

Glu

Asp

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

125

130

135

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

1191

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

140

145

150

ctt

acc

tac

tca

tat

ctt

tet

cat

g<=g

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

1239

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Ala

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

155

160

165

tca

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

1287

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

170

175

180

185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

cta

ctt

ttt

gct

gta

1335

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lys

Phe

Ile

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

190

195

200

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg

atg

1383

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

lys

Asn

Ser

Leu

Met

-97CZ 303929 B6

205 210 215

cag Gin

gat agg gat gct

gca Ala

tet gct cgg gcc tgg cct

aaa atg cac aca

1431

Asp

Arg 220

Asp Ala

Ser

Ala 225

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys 230

Met

His

Thr

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

1479

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

lle

Gly

Cys

His

235

240

245

agg

aaa

tea

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

1527

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

Val

lle

Gly

Met

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu

250

255

260

265

gtg

cac

tea

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

1575

Val

His

Ser

lle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

270

275

280

cgc

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

gct

caa

1623

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

lle

Ser

Pro

lle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

285

290

295

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

cag

ttt

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

1671

Thr

Leu

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

lle

Ser

300

305

310

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

gct

tat

gtc

aaa

gta

gac

agc

tgt

1719

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

cys

315

320

325

cca

gag

gaa

ccc

caa

cta

ega

atg

aaa

aat

aat

gaa

gaa

gcg

gaa

gac

1767

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp

330

335

340

345

tat

gat

gat

gat

Ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1815

Tyr

Asp Asp Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

-98CZ 303929 B6

gat Asp

gac aac tet

cct tcc

ttt atc caa att ege

tea Ser

gtt gcc aag

aag Lys

1863

Asp

Asn Ser 365

Pro

Ser

Phe Ile Gin 370

Ile

Arg

Val

Ala 375

Lys

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

1911

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ala

Ala

Glu

Glu

GlU

Asp

Trp

380

385

390

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

gcc

ccc

gat

gac:

aga

agt

tat

aaa

agt

1959

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

395

400

405

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

aaa

2007

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

2055

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tea

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

2103

Ile

Gin

His

Glu

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

445

450

455

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

2151

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn

Glri

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

460

465

470

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt;

cct

ttg

tat

tea

agg

2199

Asn

Ile

Tyr

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

475

480

485

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

2247

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

490

495

500

505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

2295

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

-99CZ 303929 B6

510 515 520

act aaa

tca gat cct cgg

tgc ctg acc Cys Leu Thr 530

ege Arg

tat tac tet agt

ttc Phe

gtt Val

2343

Thr

Lys

Ser

Asp Pro Arg 525

Tyr Tyr Ser

Ser 535

aat

atg

gag

aga

gat

cta

get

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

2391

Asn

Met

Glu

Arg Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Leu

Ile

540

545

550

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

2439

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Ile

Met

Ser

Asp

555

560

565

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

age

tgg

2487

Lys

Arg

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

570

575

580

585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

2535

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

590

595

600

cag

ctt

gag

gat

cca

gag

ttc

caa

gcc

tcc

aac

atc

atg

cac

age

atc

2583

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

605

610

615

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2631

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

620

625

630

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

2679

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

635

640

645

tet

gtc

ttc

ttc

tet

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2727

Ser

Val

Phe

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

650

655

660

665

- 100CZ 303929 B6

gac Asp

aca ctc acc

cta ttc

cca ttc Pro Phe

tea Ser

gga gaa act gtc ttc atg tcg

2775

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Gly 675

Glu Thr Val

Phe

Met Ser 680

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tea

gac

ttt

2823

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

685

690

695

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gcc

tta

ctg

aag

gtt

tet

agt

tgt

gac

aag

2871

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Ser

Cys

Asp

Lys

700

705

710

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tea

gca

tac

2919

Asn

Thr

Gly Asp

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Ala

Tyr

715

720

725

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

agc

ttc

tcc

cag

aat

2967

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

730

735

740

745

tea

aga

cat

caa

gct

tat

ega

tac

cgt

ega

ggg

gaa

ata

act

cgt

act

3015

Ser

Arg

His

Gin

Ala

Tyr

Arg

Tyr

Arg

Arg

Gly

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

750

755

760

act

ctt

cag

tea

gat

caa

gag

gaa

att

gac

tat

gat

gat

acc

ata

tea

3063

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

Glu

Glu

Ile

Asp

Tyr

Asp

Asp

Thr

ile

Ser

765

770

775

gtt

gaa

atg

aag

aag

gaa

gat

ttt

gac

att

tat

gat

gag

gat

gaa

aat

3111

Val

Glu

Met

Lys

Lys

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr

Asp

Glu

Asp

Glu

Asn

730

785

790

cag

agc

ccc

ege

agc

ttt

caa

aag

aaa

aca

ega

cac

tat

ttt

att

gct

3159

Gin

Ser

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Lys

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

Ile

Ala

795

800

805

gca

gtg

gag

agg

ctc

tgg

gat

tat

ggg

atg

agt

agc

tcc

cca

cat

gtt

3207

Ala

Val

Glu

Arg

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Ser

Ser

Pro

His

Val

- 101 CZ 303929 B6

810 815 820 825

cta Leu

aga aac

agg Arg

get cag

agt ggc agt gtc cct cag ttc aag aaa

gtt Val

3255

Arg

Asn

Ala 830

Gin

Ser Gly Ser

Val 835

Pro

Gin Phe

Lys

Lys 840

gtt

ttc

cag

gaa

ttt

act

gat ggc tcc

ttt

act

cag ccc

tta

tac

cgt

3303

Val

Phe

Gin

Glu 845

Phe

Thr

Asp Gly Ser 850

Phe

Thr

Gin Pro

Leu 855

Tyr Arg

gga

gaa

cta

aat

gaa

cat

ttg gga ctc

ctg

ggg

cca tat

ata

aga

gca

3351

Gly

Glu

Leu 860

Asn

Glu

His

Leu Gly Leu 865

Leu

Gly

Pro Tyr 870

Ile

Arg

Ala

gaa

gtt

gaa

gat

aat

atc

atg gta act

ttc

aga

aat cag

gcc

tet

cgt

3399

Glu

Val 875

Glu

Asp

Asn

Ile

Met Val Thr 880

Phe

Arg

Asn Gin 885

Ala

Ser

Arg

ccc

tat

tcc

ttc

tat

tet

age ctt att

tet

tat

gag gaa

gat

cag

agg

3447

Pro 890

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser 895

Ser Leu Ile

Ser

Tyr 900

Glu Glu

Asp

Gin

Arg 905

caa

gga

gca

gaa

cct

aga

aaa aac ttt

gtc

aag

cct aat

gaa

acc

aaa

3495

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro 910

Arg

Lys Asn Phe

Val 915

Lys

Pro Asn

Glu

Thr 920

Lys

act

tac

ttt

tgg

aaa

gtg

caa cat cat

atg

gca

ccc act

aaa

gat

gag

3543

Thr

Tyr

Phe

Trp 925

Lys

Val

Gin His His 930

Met

Ala

Pro Thr

Lys Asp 935

Glu

ttt

gac

tgc

aaa

gcc

tgg

get tat ttc

tet

gat

gtt gac

ctg

gaa

aaa

3591

Phe

Asp

Cys 940

Lys

Ala

Trp

Ala Tyr Phe 945

Ser

Asp

Val Asp 950

Leu

Glu

Lys

gat

gtg

cac

tea

ggc

ctg

att gga ccc

ctt

ctg

gtc tgc

cac

act

aac

3639

Asp

Val 955

His

Ser

Gly

Leu

Ile Gly Pro 960

Leu

Leu

Val Cys 965

His

Thr

Asn

- 102

aca Thr 970

ctg aac Leu Asn

cct gct

cat ggg His Gly 975

aga caa gtg

aca gta cag gaa

ttt Phe

gct Ala 985

3687

Pro

Ala

Arg

Gin

Val

Thr 980

Val

Gin

Glu

ctg

ttt ttc

acc

atc

ttt gat

gag

acc

aaa

age

tgg

tac

ttc

act

gaa

3735

Leu

Phe Phe

Thr

Ile 990

Phe Asp

Glu

Thr

Lys 995

Ser

Trp

Tyr

Phe Thr 1000

Glu

aat

atg gaa

aga

aac

tgc agg

gct

ccc

tgc

aat

atc

cag

atg

gaa

gat

3783

Asn

Met Glu

Arg L005

Asn

Cys Arg

Ala Pro 1010

Cys

Asn

Ile

Gin Met 1015

Glu

Asp

ccc

act ttt

aaa

gag

aat tat

ege

ttc

cat

gca

atc

aat

ggc

tac

ata

3831

Pro

Thr Phe 1020

Lys

Glu

Asn Tyr Arg 1025

Phe

His

Ala

Ile Asn 1030

Gly

Tyr

Ile

atg

gat aca

cta

cct

ggc tta

gta

atg

gct

cag

gat

caa

agg

att

ega

3879

Met Asp Thr 1035

Leu

Pro

Gly Leu 1040

Val

Met

Ala

Gin

Asp L045

Gin

Arg

Ile

Arg

tgg

tat ctg

ctc

age

atg ggc

age

aat

gaa

aac

atc

cat

tet

att

cat

3927

Trp Tyr Leu 1350

Leu

Ser Met Gly 1055

Ser

Asn

Glu Asn 1060

Ile

His

Ser

Ile His 1065

ttc

agt gga

cat

gtg

ttc act

gta

ega

aaa

aaa

gag

gag

tat

aaa

atg

3975

Phe

Ser Gly

His Val 1070

Phe Thr

Val

Arg Lys 1075

Lýs

Glu

Glu

Tyr Lys 1080

Met

gca

ctg tac

aat

ctc

tat cca

ggt

gtt

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg

tta

4023

Ala

Leu Tyr Asn 1085

Leu

Tyr Pro

Gly Val 1090

Phe

Glu

Thr

Val Glu 1095

Met

Leu

cca

tcc aaa

gct

gga

att tgg

cgg

gtg

gaa

tgc

ctt

att

ggc

gag

cat

4071

Pro

Ser Lys 1100

Ala

Gly

Ile Trp Arg 1105

Val

Glu

Cys

Leu Ile 1110

Gly

Glu

His

cta

cat gct

ggg

atg

age aca

ctt

ttt

ctg

gtg

tac

age

aat

aag

tgt

4119

Leu

His Ala

Gly

Met

Ser Thr

Leu

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

- 103

CL 303929 B6

1115	1120	1125
cag act ccc ctg gga	atg gct	tet gga cac att aga gat ttt cag att 4167
Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala	Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gin Ile
1130 1135	1140 1145
aca gct tca gga caa	tat gga	cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt 4215
Thr Ala Ser Gly Gin	Tyr Gly	Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu
1150		1155 1160
cat tat tcc gga tca	atc aat	gcc tgg agc acc aag gag ccc ttt tet 4263
His Tyr Ser Gly Ser	Ile Asn	Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1165		1170 1175
tgg atc aag gtg gat	ctg ttg	gca cca atg att att cac ggc atc aag 4311
Trp Ile Lys Val Asp	Leu Leu	Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys
1180	1185 1190
acc cag ggt gcc cgt	cag aag	ttc tcc agc ctc tac atc tet cag ttt 4359
Thr Gin Gly Ala Arg	Gin Lys	Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe
1195	1200	1205
atc atc atg tat agt	ctt gat	ggg aag aag tgg cag act tat ega gga 4407
Ile Ile Met Tyr Ser	Leu Asp	Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly
1210 1215	1220 1225
aat tcc act gga acc	tta atg	gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tca tet 4455
Asn Ser Thr Gly Thr	Leu Met	Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
1230		1235 1240
ggg ata aaa cac aat	att ttt	aac cct cca att att gct ega tac atc 4503
Gly Ile Lys His Asn	Ile Phe	Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile
1245		1250 1255
cgt ttg cac cca act	cat tat	agc att ege agc act ctt ege atg gag 4551
Arg Leu His Pro Thr	His Tyr	Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu
1260	1265 1270

- 104CZ 303929 B6 ttg atg ggc tgt gat tta aat agt tgc age atg cca ttg gga atg gag

Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu

1275 1280 1285 agt aaa gca ata tea gat gca cag att act gct tea tcc tac ttt acc

Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr

1290 1295 1300 1305 aat atg ttt gcc acc tgg tet cct tea aaa gct ega ctt cac ctc caa

Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin

1310 1315 1320 ggg agg agt aat gcc tgg aga cct cag gag aat aat cca aaa gag tgg

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Glu Asn Asn Pro Lys Glu Trp

1325 1330 1335 ctg caa gtg gac ttc cag aag aca atg aaa gtc aca gga gta act act

Leu Gin Val Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr

1340 1345 1350 cag gga gta aaa tet ctg ct;t acc age atg tat gtg aag gag ttc ctc

Gin Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu

1355 1360 1365 atc tcc age agt caa gat ggc cat cag tgg acc ctc ttt ttt cag aat

Ile Ser Ser Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn

1370 1375 1380 1385 ggc aaa gta aag gtt ttt cag gga aat caa gac tcc ttc aca cct gtg

Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val

1390 1395 1400 gtg aac tet cta gac cca ccg tta ctg act ege tac ctt ega att cac

Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His

1405 1410 1415 ccc cag agt tgg gtg cac cag att gcc ctg agg atg gag gtt ctg ggc

Pro Gin Ser Trp Val His Gin Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly

4599

4647

4695

4743

4791

4839

4887

4935

4983

5031

- 105 CZ 303929 B6

1420 1425 1430 tgc gag gca cag gac ctc tac tgagcggccg cgactctact agaggatctt 5082

Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

1435 1440

tgtgaaggaa	ccttacttct	gtggtgtgac	ataattggac	aaaetaccta	cagagattta	5142
aagctctaag	gtaaatataa	aatttttaag	tgtataatgt	gttaaactac	tgattctaat	5202
tgtttgtgta	ttttagattc	caacctatgg	aactgatgaa	tgggagcagt	ggtggaatgc	5262
ctttaatgag	gaaaacctgt	tttgctcaga	agaaatgcca	tctagtgatg	atgaggctac	5322
tgctgactct	caacattcta	ctcctccaaa	aaagaagaga	aaggtagaag	accccaagga	5382
ctttccttca	gaattgctaa	gttttttgag	tcatgctgtg	tttagtaata	gaactcttgc	5442
ttgctttgct	atttacacca	caaaggaaaa	agctgcactg	ctatacaaga	aaattatgga	5502
aaaatattct	gtaaccttta	taagtaggca	taacagttat	aatcataaca	tactgttttt	5562
tcttactcca	cacaggcata	gagtgtctgc	tattaataac	tatgctcaaa	aattgtgtac	5622
ctttagcttt	ttaatttgta	aaggggttaa	taaggaatat	ttgatgtata	gtgccttgac	5682
tagagatcat	aatcagccat	accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	5742
cacacctccc	cctgaacctg	aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	5802
ttgcagctta	taatggttac	aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	5862
ttttttcact	gcattctagt	tgtggtttgt	ccaaactcat	caatgtatct	tatcatgtct	5922
ggatcccccg	aacgccagca	agacgtagcc	cagcgcgtcg	gecccgagat	gcgccgcgtg	5982
cggctgctgg	agatggcgga	cgcgatggat	atgttctgcc	aagggttggt ttgcgcattc	6042

- 106CZ 303929 B6

acagttctcc	gcaagaattg	attggctcca	attcttggag	tggtgaatcc	gttagcgagg	6102
tgccgccctg	cttcatcccc	gtggcccgtt	gctcgcgttt	gctggcggtg	tccccggaag	6162
aaatatattt	gcatgtcttt	agttctatga	tgacacaaac	cccgcccagc	gtcttgtcat	6222
tggcgaattc	gaacacgcag	atgcagtcgg	ggcggcgcgg	tccgaggtcc	acttcgcata	6282
ttaaggtgac	gcgtgtggcc	tcgaacaccg	agcgaccctg	cagcgacccg	cttaacagcg	6342
tcaacagcgt	gccgcagatc	agcttgatat	gaaaaagcct	gaactcaccg	cgacgtctgt	6402
cgagaagttt	ctgatcgaaa	agttcgacag	cgtctccgac	ctgatgcagc	tctcggaggg	6462
cgaagaatct	cgtgctttca	gcttcgatgt	aggagggcgt	ggatatgtcc	tgcgggtaaa	6522
tagctgcgcc	gatggtttct	acaaagatcg	ttatgtttat	cggcactttg	catcggccgc	6582
gctcccgatt	ccggaagtgc	ttgacattgg	ggaattcagc	gagagcctga	cctattgcat	6642
ctcccgccgt	gcacagggtg	tcacgttgca	agacctgcct	gaaaccgaac	tgcccgctgt	6702
tctgcagccg	gtcgcggagg	ccatggatgc	gatcgctgcg	gccgatctta	gccagacgag	6762
cgggttcggc	ccattcggac	cgcaaggaat	cggtcaatac	actacatggc	gtgatttcat	6822
atgcgcgatt	gctgatcccc	atgtgtatca	ctggcaaact	gtgatggacg	acaccgtcag	6882
tgcgtccgtc	gcgcaggctc	tcgatgagct	gatgctttgg	gccgaggact	gccccgaagt	6942
ccggcacctc	gtgcacgcgg	atttcggctc	caácaatgtc	ctgacggaca	atggccgcat	7002
aacagcggtc	attgactgga	gcgaggcgat	gttcggggat	tcccaatacg	aggtcgccaa	7062
catcttcttc	tggaggccgt	ggttggcttg	tatggagcag	cagacgcgct	acttcgagcg	7122
gaggcatccg	gagcttgcag	gatcgccgcg	gctccgggcg	tatatgctcc	gcattggtct	7182

107CZ 303929 B6

tgaccaactc	tatcagagct	tggttgacgg	caatttcgat	gatgcagctt	gggcgcaggg	7242
tcgatgcgac	gcaatcgtcc	gatccggagc	cgggactgtc	gggcgtacac	aaatcgcccg	7302
cagaagcgcg	gccgtctgga	ccgatggctg	tgtagaagta	ctcgccgata	gtggaaaccg	7362
acgccccagc	actcgtccgg	atcgggagat	gggggaggct	aactgaaaca	cggaaggaga	7422
caataccgga	aggaacccgc	gctatgacgg	caataaaaag	acagaataaa	acgcacgggt	7482
gttgggtcgt	ttgttcataa	acgcggggtt	cggtcccagg	gctggcactc	tgtcgatacc	7542
ccaccgagac	cccattgggg	ccaatacgcc	cgcgtttctt	ccttttcccc	accccacccc	7602
ccaagttcgg	gtgaaggccc	agggctcgca	gccaacgtcg	gggcggcagg	ccctgccata	7662
gccactggcc	ccgtgggtta	gggacggggt	cccccatggg	gaatggttta	tggttcgtgg	7722
gggttattat	tttgggcgtt	gcgtggggtc	aggtccacga	ctggactgag	cagacagacc	7782
catggttttt	ggatggcctg	ggcatggacc	gcatgtactg	gcgcgacacg	aacaccgggc	7842
gtcčgtggct	gccaaacacc	cccgaccccc	aaaaaccacc	gcgcggattt	ctggcgtgcc	7902
aagctgggta	ccctctagag	cgaattaatt	cactggccgt	cgttttacaa	cgtcgtgact	7962
gggaaaaccc	tggcgttacc	caacttaatc	gccttgcagc	acatccccct	ttcgccagct	8022
ggcgtaatag	cgaagaggcc	cgcaccgatc	gcccttccca	acagttgcgc	agcctgaatg	8082
gcgaatggcg	cctgatgcgg	tattttctcc	ttacgcatct	gtgcggtatt	tcacaccgca	8142
tatggtgcac	tctcagtaca	atctgctctg	atgccgcata	gttaagccag	ccccgacacc	8202
cgccaacacc	cgctgacgcg	ccctgacggg	cttgtctgct	cccggcatcc	gcttacagac	8262
aagctgtgac	cgtctccggg agctgcatgt	gtcagaggtt	ttcaccgtca	tcaccgaaac	8322

- 108CZ 303929 B6

gcgcgagacg	aaaggggggg	taccagcttc	gtagctagaa	catcatgttc	tgggatatca	8382
gcttcgtagc	tagaacatca	tgttctggta	cccccctcgt	gatacgccta	tttttatagg	8442
ttaatgtcat	gataataatg	gtttcttaga	cgtcaggtgg	cacttttcgg	ggaaatgtgc	8502
gcggaacccc	tatttgttta	tttttctaaa	tacattcaaa	tatgtatccg	ctcatgagac	8562
aataaccctg	ataaatgctt	caataatatt	gaaaaaggaa	gagtatgagt	attcaacatt	8622
tccgtgtcgc	ccttattccc	ttttttgcgg	cattttgcct	tcctgttttt	gctcacccag	8682
aaacgctggt	gaaagtaaaa	gatgctgaag	atcagttggg	tgcacgagtg	ggttacatcg	8742
aactggatct	caacagcggt	aagatccttg	agagttttcg	ccccgaagaa	cgttttccaa	88 02
tgatgagcac	ttttaaagtt	ctgctatgtg	gcgcggtatt	atcccgtatt	gacgccgggc	8862
aagagcaact	cggtcgccgc	atacactatt	ctcagaatga	cttggttgag	tactcaccag	8922
tcacagaaaa	gcatcttacg	gatggcatga	cagtaagaga	attatgcagt	gctgccataa	8982
ccatgagtga	taacactgcg	gccaacttac	ttctgacaac	gatcggagga	ccgaaggagc	9042
taaccgcttt	tttgcacaac	atgggggatc	atgtaactcg	ccttgatcgt	tgggaaccgg	9102
agctgaatga	agccatacca	aacgacgagc	gtgacaccac	gatgcctgta	gcaatggcaa	9162
caacgttgcg	caaactatta	actggcgaac	tacttactct	agcttcccgg	caacaattaa	9222
tagactggat	ggaggcggat	aaagttgcag	gaccacttct	gcgctcggcc	cttccggctg	9282
gctggtttat	tgctgataaa	tctggagccg	gtgagcgtgg	gtctcgcggt	atcattgcag	9342
cactggggcc	agatggtaag	ccctcccgta	tcgtagttat	ctacacgacg	gggagtcagg	9402
caactatgga	tgaacgaaat	agacagatcg	ctgagatagg	tgcctcactg	attaagcatt	9462

109CL 303929 B6

ggtaactgtc	agaccaagtt	tactcatata	tactttaaat	tgatttaaaa	cttcattttt	9522
aatttaaaag	gatctaggtg	aagatccttt	ttgataatct	catgaccaaa	atcccttaac	9582
gtgagttttc	gttccactga	gcgtcagacc	ccgtagaaaa	gatcaaagga	tcttcttgag	9642
atcctttttt	tctgcgcgta	atctgctgct	tgcaaacaaa	aaaaccaccg	ctaccagcgg	9702
tggtttgttt	gccggatcaa	gagctaccaa	ctctttttcc	gaaggtaact	ggcttcagca	9762
gagcgcagat	accaaatact	gttcttctag	tgtagccgta	gttaggccac	cacttcaaga	9822
actctgtagc	accgcctaca	tacctcgctc	tgctaatcct	gttaccagtg	gctgctgcca	9882
gtggcgataa	gtcgtgtctt	accgggttgg	actcaagacg	atagttaccg	gataaggcgc	9942
agcggtcggg	ctgaacgggg	ggttcgtgca	cacagcccag	cttggagcga	acgacctaca	10002
ccgaactgag	atacctacag	cgtgagctat	gagaaagcgc	cacgcttccc	gaagggagaa	10062
aggcggacag	gtatccggta	agcggcaggg	tcggaacagg	agagcgcacg	agggagcttc	10122
cagggggaaa	cgcctggtat	ctttatagtc	ctgtcgggtt	tcgccacctc	tgacttgagc	10182
gtcgattttt	gtgatgctcg	tcaggggggc	ggagcctatg	gaaaaacgcc	agcaacgcgg	10242
cctttttacg	gttcctggcc	ttttgctggc	cttttgctca	catgttcttt	cctgcgttat	10302
cccctgattc	tgtggataac	cgtattaccg	cctttgagtg	agctgatacc	gctcgccgca	10362
gccgaacgac	cgagcgcagc	gagtcagtga	gcgággaagc	ggaagagcgc	ccaataegca	10422
aaccgcctct	ccccgcgcgt	tggccgattc	attaatgcag	ctggcacgac	aggtttcccg	10482
actggaaagc	gggcagtgag	cgcaacgcaa	ttaatgtgag	ttagctcact	cattaggcac	10542
cccaggcttt	acactttatg	cttccggctc	gtatgttgtg	tggaattgtg	agcggataac	10602

110CZ 303929 B6 aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctctaga gctctagagc 10662 tctagagctc tagagagctt gcatgcctgc aggtcg 10698

<210>	15
<211>	1459
<212>	PRT
<213>	umělá sekvence
<223>	popis umělé sekvence: pTGF8-3
<400>	15

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe -15 -10 -5

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser -11 5 10

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 15 20 25

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

35 40 45

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

55 60

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin 65 70 75

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 80 85 90

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 95 100 105

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 110 115 120 125

Asp Lys val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu 130 135 140

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 145 150 155

Tyr Leu Ser His Ala Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 160 165 170

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 175 180 185

Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

190 195 200 205

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp

210 215 220

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn. Gly Tyr 225 230 235

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 240 245 250

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 255 260 265

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser

270 275 280 285

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met

290 295 300

Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gin His 305 310 315

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

-112CZ 303929 B6

320

Gin Leu Arg Met Lys 335

Leu Thr Asp Ser Glu 350

Pro Ser Phe Ile Gin 370

Trp Val His Tyr Ile 385

Leu Val Leu Ala Pro 400

Asn Gly Pro Gin Arg 415

Ala Tyr Thr Asp Glu 430

Ser Gly Ile Leu Gly 450

Leu Ile ile Phe Lys 465

His Gly Ile Thr Asp 480

Gly Val Lys His Leu 495

Lys Tyr Lys Trp Thr 510

325

Asn Asn Glu Glu Ala Glu 340

Met Asp Val Val Arg Phe 355 360

Ile Arg Ser Val Ala Lys 375

Ala Ala Glu Glu Glu Asp 390

Asp Asp Arg Ser Tyr Lys 405

Ile Gly Arg Lys Tyr Lys 420

Thr Phe Lys Thr Arg Glu 435 440

Pro Leu Leu Tyr Gly Glu 455

Asn Gin Ala Ser Arg Pro 470

Val Arg Pro Leu Tyr Ser 485

Lys Asp Phe Pro Ile Leu 500

Val Thr Val Glu Asp Gly 515 520

330

Asp Tyr Asp Asp Asp 345

Asp Asp Asp Asn Ser 365

Lys His Pro Lys Thr 380

Trp Asp Tyr Ala Pro 395

Ser Gin Tyr Leu Asn

410

Lys Val Arg Phe Met 425

Ala Ile Gin His Glu 445

Val Gly Asp Thr Leu 460

Tyr Asn Ile Tyr Pro 475

Arg Arg Leu Pro Lys 490

Pro Gly Glu Ile Phe 505

Pro Thr Lys Ser Asp 525

-113CL 303929 B6

Pro Arg Cys Leu Thr 530

Asp Leu Ala Ser Gly 545

Ser Val Asp Gin Arg 560

Ile Leu Phe Ser Val 575

Asn Ile Gin Arg Phe

590

Arg Tyr Tyr Ser Ser 535

Leu Ile Gly Pro Leu 550

Gly Asn Gin Ile Met 565

Phe Asp Glu Asn Arg 580

Leu Pro Asn Pro Ala

595

Phe Val Asn Met Glu Arg 540

Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 555

Ser Asp Lys Arg Asn Val 570

Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 585

Gly Val Gin Leu Glu Asp 600 605

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 610 615 620

Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 625 630 635

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gin Thr Asp phe Leu Ser Val Phe Phe 640 645 650

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 655 660 665

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

670 675 680 685

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

690 695 700

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 705 710 715

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

720

725

730

-114CZ 303929 B6

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin 735 740 745

Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser

750 755 760 765

Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys

770 775 780

Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg 785 790 795

Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg 800 805 810

Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 815 820 825

Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Gin Glu

830 835 840 845

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn

850 855 860

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 865 870 875

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Set Arg Pro Tyr Ser Phe 880 885 890

Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 895 900 905

Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp

910 915 920 925

Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

-115CZ 303929 B6

930	935	940
Ala Trp Ala Tyr Phe 945	Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys 950	Asp Val His Ser 955
Gly Leu Ile Gly Pro 960	Leu Leu Val Cys His Thr Asn 965	Thr Leu Asn Pro 970
Ala His Gly Arg Gin 975	Val Thr Val Gin Glu Phe Ala 980 985	Leu Phe Phe Thr
Ile Phe Asp Glu Thr 990	Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 995 1000	Asn Met Glu Arg 1005
Asn Cys Arg Ala Pro 1010	Cys Asn Ile Gin Met Glu Asp 1015	Pro Thr Phe Lys 1020
Glu Asn Tyr Arg Phe 1025	His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile 1030	Met Asp Thr Leu 1035
Pro Gly Leu Val Met 1040	Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg 1045	Trp Tyr Leu Leu 1.050
Ser Met Gly Ser Asn 1055	Glu Asn Ile His Ser Ile His 1060 1065	Phe Ser Gly His
Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 070 1075 1080	Ala Leu Tyr Asn 1085
Leu Tyr Pro Gly Val 1090	Phe Glu Thr Val Glu Met Leu 1095	Pro Ser Lys Ala 1100
Gly Ile Trp Arg Val 1105	Glu Cys Leu Ile Gly Glu His 1110	Leu His Ala Gly 1115
Met Ser Thr Leu Phe 1120	Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 1125 1130

-116CZ 303929 B6

Gly Met Ala Ser Gly His Ile	Arg	Asp	Phe	Gin Ile 1145	Thr	Ala	Ser	Gly
1135	1140
Gin Tyr Gly	Gin Trp Ala Pro	Lys	Leu	Ala	Arg Leu	His	Tyr	Ser Gly
150	1155			1160				1165
Ser Ile Asn	Ala Trp Ser Thr	Lys	Glu	Pro	Phe Ser	Trp	Ile	Lys	Val
	1170		1175			1180
Asp Leu Leu	Ala Pro Met Ile	Ile	His	Gly	Ile Lys	Thr	Gin	Gly	Ala
1185	1190			1195
Arg Gin Lys	Phe Ser Ser Leu	Tyr	Ile	Ser	Gin Phe	Ile	Ile	Met	Tyr
1200	1205			1210
Ser Leu Asp	Gly Lys Lys Trp	Gin	Thr	Tyr Arg Gly	Asn	Ser	Thr	Gly
1215	1220				1225
Thr Leu Met	Val Phe Phe Gly	Asn	Val	Asp	Ser Ser	Gly	Ile	Lys	His
230	1235			1240			1245
flsn Ile Phe	Asn Pro Pro Ile	Ile	Ala	Arg	Tyr Ile	Arg	Leu	His	Pro
	1250		1255			1260
Thr His Tyr	Ser Ile Arg Ser	Thr	Leu	Arg	Met Glu	Leu	Met	Gly	Cys
1265	1270			1275
Asp Leu Asn	Ser Cys Ser Met	Pro	Leu	Gly	Met Glu	Ser Lys	Ala	Ile
1280	1285			1290
Ser Asp Ala	Gin Ile Thr Ala	Ser	Ser	Tyr	Phe Thr	Asn	Met	Phe	Ala
1295	1300				1305
Thr Trp Ser	Pro Ser Lys Ala	Arg	Leu	His	Leu Gin	Gly Arg	Ser	Asn
310	1315				1.320			1325
Ala Trp Arg	Pro Gin Glu Asn	Asn	Pro	Lys	Glu Trp	Leu	Gin	Val Asp

1330 1335 1340

-117CZ 303929 B6

Phe Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys
	1345	1350	1355
Ser	Leu Leu Thr Ser 1360	Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu 1365	Ile Ser Ser Ser 1370
Gin Asp Gly His Gin 1375	Trp THr Leu Phe Phe Gin Asn 1380 1385	Gly Lys Val Lys
Val 390	Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val 1395 1400	Val Asn Ser Leu 1405
Aáp	Pro Pro Leu Leu 1410	Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 1415	Pro Gin Ser Trp 1420
Vaí	His Gin Ile Ala	Leu Arg Met Glu Val Leu Gly	Cys Glu Ala Gin

1425 1430 1435

Asp Leu Tyr

	1440
<210> <211> <212> <213>	16 43 DNA umělá sekvence
<220> <223>	popis umělé sekvence: primer
<400>	16

ggaattccgc aaaggttatg cagcgcgtga acatgatcat ggc 43

15	<210> <211> <212> <213>	17 39 DNA umělá sekvence
20	<220> <223>	popis umělé sekvence: primer: primer
	<400>	17

cgcggatcca ttaagtgagc tttgtttttt ccttaatcc 39

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mutein faktoru VIII, v němž je doména B mezi pozicemi Arg740 a Glul649 nahrazena peptidovým linkerem bohatým na Arg se sekvencí SEQ ID NO: 9

   Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Gin Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly,

   15 10 15 kde číslování faktoru VIII je vzhledem k matumí sekvenci faktoru VIII divokého typu ukázané v SEQ IDNO:2.
2. 2. Mutein faktoru VIII podle nároku 1 vykazující přídavné alespoň jednu z následujících mutací (a) až (c):

   (a) Val v pozici 162 je nahrazen neutrálním aminokyselinovým zbytkem vybraným z Gly, Ala, Leu, Ile, Met a Pro;

   (b) Ser v pozici 2011 je nahrazen hydrofilním aminokyselinovým zbytkem vybraným z Asn, Thr a Gin;

   (c) Val v pozici 2223 je nahrazen kyselým aminokyselinovým zbytkem vybraným z Glu a Asp.
3. 3. Mutein faktoru VIII podle nároku 2, vykazující alespoň jednu z mutací (a) a (b).
4. 4. Mutein faktoru VIII podle nároku 2, vykazující všechny tři mutace (a), (b) a (c).
5. 5. Mutein podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, kde v mutaci (a) je Val v pozici 162 nahrazen Ala, v mutaci (b) je Ser v pozici 2011 nahrazen Asn, a/nebo v mutaci (c) je Val nahrazen Glu.
6. 6. Mutein faktoru VIII podle nároku 1, který zahrnuje aminokyseliny od 1 do 1440 sekvence SEQ ID NO: 4, 13 nebo 15.
7. 7. DNA sekvence kódující mutein faktoru VIII, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
8. 8. DNA sekvence podle nároku 7, která má alespoň jednu z mutací T485C, G6032A a T6668A, vzhledem k DNA sekvenci matumího faktoru VIII divokého typu SEQ ID NO: 1, přičemž sekvence DNA přednostně obsahuje všechny tři výše uvedené mutace.
9. 9. Vektor obsahující DNA podle nároku 7 nebo 8.
10. 10. Vektor podle nároku 9, kterým je pTGF8-l se sekvencí SEQ ID NO: 3, pTGT8-2hyg-s se sekvencí SEQ ID NO: 12 nebo pTGF8-3 se sekvencí SEQ ID NO: 14.
11. 11. Vektor podle nároku 9, kterým je vektor pro přenos genu.
12. 12. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 9, a/nebo zahrnující sekvenci DNA podle nároku 7.
13. 13. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje mutein faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo vektor pro přenos genu podle nároku 11.

    -119CL 303929 B6
14. 14. Použití muteinu faktoru Vlil podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo vektoru pro přenos genu podle nároku 11 pro výrobu léčiva pro léčení hemofilie, zejména hemofilie A.

    5
15. 15. Mutein faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo vektor pro přenos genu podle nároku 11 pro použití pro léčení hemofilie, zejména hemofilie A, podáváním lidským hemofilikům.
16. 16. Způsob produkce muteinu faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznaču10 jící se tím, že zahrnuje (a) kultivaci transformovaných hostitelských buněk podle nároku 12 a (b) izolaci muteinu faktoru VIII z kultivačního média.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že v kroku (a) zahrnuje kultivaci imortalizované lidské buněčné linie stabilně exprimující T antigen opičího viru a nesoucí vektor, který obsahuje promotor CMV funkčně spojený se sekvencí DNA kódující mutein faktoru Vlil.

    20
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že imortalizovaná lidská buněčná linie jsou imortalizované buňky ledvin, močového měchýře, jater, plic, srdečního svalu, hladkého svalstva, vaječníků nebo gastrointestinálního traktu.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že imortalizovanou lidskou

    25 buněčnou linií je buněčná linie 293T (DSM ACC2494).
20. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že vektor dále zahrnuje selekční markér a/nebo regulační sekvence.

    30
21. 21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až20, v y z n a č uj í c í se t í m , že kultivace se provádí za přítomnosti von Willebrandova faktoru (vWF).
22. 22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 21, vyznačující se tím, že dále zahrnuje (c) purifikaci muteinu faktoru VIII izolovaného v kroku (b), a/nebo (d) vystavení muteinu faktoru Vílí izolovaného v kroku (b) nebo purifikovaného v kroku (c) úpravě pro inaktivaci viru.
23. 23. Imortalizovaná lidská buněčná linie stabilně exprimující alespoň jeden virový transkripční aktivátorový protein a nesoucí vektor kódující mutein faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.