RS49705B - Raspršivać bez pogonskih gasova koji sadrže preparat za aerosol sa biološki aktivnim makromolekulima i postupak za pripremanje odgovarajućih aerosola - Google Patents

Description

Pronalazak se odnosi na postupak za pripremanje aerosola za inhalativnu primenu sa proteinima i drugim biološki aktivnim makromolekulima, kao i na raspršivač bez pogonskih gasova koji sadrži preparat za pripremanje takvog aerosola, a naročito preparat sa visoko koncentrovanim rastvorom insulina za inhalativnu primenu za lečenje dijabetesa.

Primena medicinskih materija u vidu aerosola koji se može inhalirati je već dugo poznata. Takvi aerosoli služe ne samo za lečenje bolesti disajnih puteva kao što je astma, već se oni takođe primenjuju i onda kada kao organi za resorpciju služe pluća ili sluzokoža nosa. Često se ovim putem može dobiti tako visok nivo aktivne materije u krvi da se na taj način mogu lečiti bolesti i u drugim oblastima tela. Aerosoli koji se mogu inhalirati takođe mogu služiti i kao vakcine.

Za pripremu aerosola u praksi se koristi više postupaka. Suspenzije ili rastvori aktivne materije raspršavaju se uz pomoć pogonskih gasova ili se aktivna materija u vidu mikroniziranog praha vrtloži u vazduhu koji se udiše ili se, konačno, vodeni rastvori raspršuju uz pomoć raspršivača (razmagljivača).

Međutim, kod molekula složene građe, kao što su npr. interferoni, raspršivanje vodenog rastvora može lako dovesti do nepoželjnog smanjenja aktivnosti aktivne materije, verovatno usled sila smicanja i zagrevanja. Verovatno je da u ovom procesu izvesnu ulogu igra npr. obrazovanje manje aktivnih proteinskih agregata. A. Y. Ip i njegove kolege u svom članku "Stabilitv of recombinant consensus interferon to air-jet and ultrasonic nebulisation (Stabilnost rekombinantnog konsenzusa interferona pri mlaznom i nadzvučnom razmagljivanju) J.Pharm. Sci. 84: 1210- 1214, [1995], opisuju primere stvaranja agregata interferona posle ultrazvučnog ili mlaznog razmagljivanja (raspršivanja), sa gubitkom biološke aktivnosti interferona kao posledicom toga. Takođe, i ako razbijanje biomolekula (biološki aktivnih makromolekula) nije potpuno, ovde opisano smanjenje aktivnosti je važno, jer ono prouzrokuje povećanu potrošnju biomolekula, koji su eventualno i skupi, i doziranje aktivnog medicinskog preparata po jednom hodu uređaja postaje netačno. Ovo gubljenje aktivnosti molekula složene građe tokom dobijanja aerosola nije ograničeno samo na interferon, već se ono javlja u većoj ili manjoj meri i tokom pretvaranja u aerosol drugih proteina (vidi npr. Niven et al., Pharm Res. 12: 53- 59,

[1995]) i biomolekula.

Pored tehničke pripreme aerosola koji sadrže biomolekule neophodan je još jedan drugi korak, da bi se biomolekuli apsorbovali u plućima. Pluća odraslog čoveka imaju veliku apsorpcionu površinu, ali ona su se pokazala i kao višestruka prepreka za pulmonarnu apsorpciju biomolekula. Posle udisaja kroz nos ili usta vazduh, koji sa sobom nosi aerosol, ide u traheje i onda preko sve manjih bronhija i bronhiola u alveole. Alveole imaju mnogo veću površinu nego traheje, bronhi i bronhiole zajedno. One su glavna apsorpciona zona, ne samo za kiseonik, već i za biološki aktivne makromolekule. Da bi se iz vazduha zadržali u krvotoku, molekuli moraju da prođu kroz alveolarni epitel, kapilarni endotel i intersticijalni prostor između ova dva sloja ćelija koji sadrži limfu. Ovo se može odvijati putem aktivnih ili pasivnih transportnih procesa. Ćelije iz pomenuta dva sloja ćelija leže priljubljene jedne uz druge, tako da biološki makromolekuli najveće veličine (kao što su npr. proteini) mnogo sporije prolaze kroz ovu prepreku nego manji molekuli. Proces prolaženja kroz alveolarni epitel i kapilarni endotel odvija se u konkurenciji sa drugim biološkim procesima koji dovode do razbijanja biomolekula. Bronhoalveolaraa tečnost sadrži egzoproteaze (vidi npr. Wall DA i Lanutti A. T. "High levels of exopeptidase activitv are present in rat and canine bronchoalveolar lavage fluid"

(Visoki nivoi aktivnosti egzopeptidaze su prisutni u bronhoalveolarnoj točnosti pacova i pasa dobijenoj ispiranjem) Int J. Pharm. 97:171-181, [1993]). Ona takođe sadrži makrofage, koji inhalirane čestice proteina elirninišu pomoću fagocitoze. Ovi makrofagi migriraju ka bazi grane bronhija, gde oni putem mukozilijarnog mehanizma za čišćenje (Clearance Mechanismus) dolaze iz pluća. Oni onda mogu da migriraju u limfotok. Dalje, na makrofage može fiziološki da deluje protein koji je aerosoliziran, npr. interferon može da aktivira alveolarne makrofage. Migracija aktiviranih makrofaga predstavlja sledeći mehanizam za širenje sistemskog dejstva inhaliranih proteina. Kompleksnost ovog procesa znači da su rezultati eksperimenata sa aerosolima sa jednim tipom proteina samo ograničeno primenljivi na drugi tip proteina. Male razlike između interferona mogu, na primer, imati jasan uticaj na njihovu susceptibilnost protiv mehanizma degradacije u plućima (vidi Bocci et al "Pulmonarv catabolism of interferons: alveolar absorption of 125-labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss of biological activitv" (Plućni katabolizam interferona: alveolarna apsorpcija 125-markiranog humanog interferona alfa praćena je sa delimičnim gubitkom biološke aktivnosti), Antiviral research 4:211- 220, [1984]).

Proteini i drugi biološki makromolekuli mogu doduše biti u principu raspršeni, ali se ovo raspršivanje po pravilu odvija uz gubitak aktivnosti. Cilj predmetnog pronalaska je da se ostvari postupak za dobijanje aerosola koji se može inhalirati, sa biološki aktivnim makromolekulima, naročito proteinima, a bez značajnog gubitka aktivnosti pri raspršivanju.

Nova generacija raspršivača (razmagljivača) primene bez pogonskih gasova opisana je u US patentu 5,497,944, čiji ceo sadržaj je ovde inkorporiran kao referenca. Posebna prednost raspršivača koji je tamo opisan je da je izbačena upotreba pogonskih gasova, naročito fluorohlorougljovodonika.

Dalje razvijeni primer izvođenja raspršivača koji je tamo opisan, izložen je u PCT/EP 96/04351 = WO 97/12687. Izloženi pronalazak kakav je prikazan na tamo opisanoj Fig. 6 (Respimat<®>), kao i u pripadajućem opisu, ovde je inkorporiran kao referenca. Raspršivač koji je tamo opisan može biti prvenstveno primenjen za dobijanje aerosola koji se može inhalirati sa biološki aktivnim makromolekulima prema pronalasku. Raspršivač koji je tamo opisan može biti naročito primenjen za inhalativnu primenu insulina. Zahvaljujući njegovoj podesnoj veličini, pacijent ovaj uređaj može uvek nositi sa sobom. Raspršivačem koji je tamo opisan zapremina koja je definisana rastvorom koji sadrži aktivnu materiju (prvenstveno oko 15 mikrolitara) se raspršuje pod dejstvom visokog pritiska kroz male mlaznice, tako da se stvara aerosol koji se može inhalirati sa česticama čija srednja veličina je između 3 i 10 mikrometara. Za inhalativnu primenu insulina podesan je raspršivač koji može raspršivati između 10 i 50 mikrolitara preparata za dobijanje aerosola u kapljice koje se mogu inhalirati po jednoj primeni.

Od posebnog značaja za dobijanje aerosola prema pronalasku je primena raspršivača koji je opisan u gore navedenom patentu, odnosno prijavi patenta za raspršivanje bez pogonskih gasova rastvora aktivne materije, koji sadrži proteine ili druge biološki aktivne makromolekule.

U osnovi tamo opisani ručni razmagljivač (raspršivač, veličine oko 10 cm) se sastoji od gornjeg dela kućišta, kućišta pumpe, mlaznice, ustavljačkog nateznog mehanizma (mehanizma za blokiranje), kućišta opruge, opruge i spremišne posude, koji je naznačen: - kućištem pumpe, koje je pričvršćeno u gornjem delu kućišta, i koje na jednom svom kraju nosi telo mlaznice sa mlaznicom, ti. sklop mlaznice,

- šupljim klipom sa telom ventila,

- pogonskom prirubnicom, u kojoj je učvršćen šuplji klip, i koja se nalazi u gornjem delu kućišta, - ustavljačko nateznim mehanizmom, koji se nalazi u gornjem delu kućišta,

- kućištem opruge sa oprugom koja je postavljena u njemu koje je

obrtno uležišteno na gornjem delu kućišta pomoću obrtnog ležaja,

- donjim delom kućišta, koji je postavljen na kućište opruge u

aksijalnom smeru.

ŠVuplji klip sa telom ventila prema WO 97/12687 odgovara onome kod opisanog uređaja. On se delimično pruža u cilindar kućišta pumpe i postavljen je u cilindru aksijalno pomerljivo. Posebno se uzimaju u obzir Fig. 1- 4 - naročito Fig. 3 - i tome pripadajući opis. Šuplji klip sa telom ventila izdaje na svojoj strani visokog pritiska u vremenskom trenutku oslobađanja opruge sa pritiskom od 5 do 60 MPa (oko 50 do 600 bar), prvenstveno 10 do 60 MPa (oko 100 do 600 bar), na fluid odmerenu dozu rastvora aktivne materije.

Telo ventila je prvenstveno postavljeno na kraju šupljeg cilindra, koji je okrenut telu mlaznice.

Mlaznica u telu mlaznice je prvenstveno mikrostrukturisana, ti. izrađena pomoću mikrotehnike. Mikrostrukturisano telo mlaznice je opisano, na primer, u WO 94/07607, čiji ceo sadržaj je ovde inkorporiran kao referenca.

Telo mlaznice sastoji se npr. od dve, jedne sa drugom povezane ploče od stakla i/ili silicijuma, od kojih najmanje jedna ploča ima jedan ili više mikrostrukturisanih kanala, koji povezuju ulaznu stranu mlaznice sa izlaznom stranom mlaznice. Na izlaznoj strani mlaznice je izveden najmanje jedan okrugli ili neokrugli otvor, koji je manji ili jednak 10 um.

Smerovi mlazeva iz mlaznica u telu mlaznice mogu se pružati paralelno jedan drugom ili biti nagnuti jedan u odnosu na drugi. Kod tela mlaznice sa najmanje dva otvora mlaznice na izlaznoj strani smerovi mlazeva mogu biti nagnuti pod uglom od 20 stepeni do 160 stepeni jedan u odnosu na drugi, prvenstveno pod uglom od 60 do 150 stepeni. Smerovi mlazeva se susreću u okolini otvora mlaznice.

Ustavljačko natezni mehanizam ima jednu oprugu, prvenstveno cilindričnu zavojnu pritisnu oprugu, kao akumulator za mehaničku energiju. Opruga deluje na pogonsku prirubnicu kao opružni element, čije pomeranje je određeno položajem ustavljačkog elementa. Putanja pogonske prirubnice je precizno ograničena pomoću jednog gornjeg i jednog donjeg graničnika. Opruga je prvenstveno napregnuta pomoću prenosnika za prenos snage, npr. prenosnika sa vijkom i navrtkom, pod dejstvom spoljašnjeg obrtnog momenta koji se stvara pri obrtanju gornjeg dela kućišta u odnosu na kućište opruge postavljeno u donjem delu kućišta. U ovom slučaju gornji deo kućišta i pogonska prirubnica imaju jednostepeni ili višestepeni mehanizam sa dejstvom klina.

Ustavljački element sa umetnutom ustavljačkom prirubnicom je prstenastog oblika da bi se mogao postaviti oko pogonske prirubnice. On se sastoji npr. od jednog radijalnog elastično deformabilnog prstena izrađenog od plastičnog materijala ili metala. Prsten je postavljen u jednoj ravni upravno na osu raspršivanja. Posle naprezanja opruge ustavljačka prirubnica se gura na putanju pogonske prirubnice i time sprečava otpuštanje opruge. Ustavljački element se oslobađa (isključuje pomoću jednog dugmeta. Dugme za oslobađanje je povezano sa ustavljačkim elementom ili je izvedeno integralno sa njim. Radi oslobađanja ustavljačkog nateznog mehanizma dugme za oslobađanje se pomera paralelno ravni prstena i prvenstveno upravo u raspršivač, a pri tome se deformabilni prsten deformiše u ravni prstena. Detalji konstrukcije ustavljačko nateznog mehanizma opisani su u WO 97/20590.

Donji deo kućišta se pomera u aksijalnom smeru pomoću kućišta opruge i pokriva uležištenje, prenosnik navojnog vretena i spremišnu posudu za fluid.

Pri radu raspršivača gornji deo kućišta se obrće u odnosu na donji deo kućišta, pri čemu donji deo kućišta povlači sa sobom kućište opruge. Pri tome se opruga pomoću prenosnika sa vijkom i navrtkom sabija i napreže i ustavljački mehanizam se automatski ustavlja. Ugao obrtanja je prvenstveno celobrojni umnožak od 360 stepeni, npr. 180 stepeni. Istovremeno sa naprezanjem opruge pomera se nagnuti O^osi) deo u gornjem delu kućišta po zadatoj putanji, dok se šuplji klip povlači nazad u unutrašnjost cilindra u kućištu pumpe, čime se deo količine fluida usisava iz spremišne posude u komoru visokog pritiska, ispred mlaznice.

U datom slučaju u raspršivač se može umetati, jedna posle druge, više izmenljivih spremišnih posuda koje sadrže fluid za raspršivanje, i onda ga koristiti. Spremišna posuda sadrži vodeni preparat za aerosol prema pronalasku.

Vršenje raspršivanja počinje lakim pritiskom na dugme za oslobađanje. Pri tome ustavljački mehanizam oslobađa put pogonskom delu. Napregnuta opruga gura klip u cilindar kućišta pumpe. Fluid izlazi iz mlaznice raspršivača u raspršenom obliku. Dalji detalji konstrukcije opisani su u PCT prijavama WO 97/12683 i WO 97/20590, čiji ceo sadržaj je ovde inkorporiran kao referenca.

Sastavni delovi raspršivača (razmagljivača) izrađeni su od podesnog materijala koji odgovara njegovoj funkciji. Kućište raspršivača i - sve dok to dozvoljava njihova funkcija - takođe i drugi delovi, prvenstveno su izrađeni od plastičnog materijala, npr. postupkom livenja brizganjem. Za medicinske svrhe primenjuju se fiziološki provereni materijali.

Raspršivač koji je opisan u WO 97/12687 se koristi npr. za dobijanje medicinskih aerosola bez primene pogonskih gasova. Na taj način se dobija aerosol koji se može inhalirati sa srednjom veličinom kapljica od oko 5 um.

Na Fig. 4 a/b, koje su identične sa Fig. 6 a/b iz WO 97/12687, prikazan je raspršivač (Respimat<®>) sa kojim se vodeni preparat za aerosol prema pronalasku može podesno inhalirati. Fig. 4 prikazuje uzdužni presek kroz raspršivač sa napregnutom oprugom, dok Fig. 4b prikazuje uzdužni presek kroz raspršivač sa otpuštenom oprugom.

Gornji deo (51) kućišta sadrži kućište (52) pumpe, na čijem kraju je postavljen držač (53) za mlaznicu za raspršivanje. U držaču se nalazi telo (54) mlaznice i filter (55). Šuplji klip (57), koji je pričvršćen u pogonskoj prirubnici (56) ustavljačko nateznog mehanizma, pruža se delimično u cilindar kućišta pumpe. Na svom kraju šuplji klip nosi telo (58) ventila. Šuplji klip je zaptiven pomoću zaptivke (59). Unutar gornjeg dela kućišta nalazi se graničnik (60) na koji naleže pogonska prirubnica kada je opruga otpuštena. Na pogonskoj prirubnici nalazi se graničnik (61), na koji pogonska prirubnica naleže kada je opruga napregnuta. Posle naprezanja opruge ustavljački element (62) se gura između graničnika (61) i oslonca (63) u gornjem delu kućišta. Dugme (64) za oslobađanje je povezano sa ustavljačkim elementom. Gornji deo kućišta se završava delom (65) za stavljanje u usta i zatvara se sa zaštitnim poklopcem koji se može nataći na njega.

Kućište (67) opruge sa pritisnom oprugom (68) je obrtno uležišteno pomoću uskočnog ispusta (69) i obrtnog ležaja u gornjem delu kućišta. Pomoću kućišta opruge gura se donji deo (70) kućišta. Unutar kućišta opruge nalazi se izmenljiva spremišna posuda (71) za fluid (72) koji se raspršuje. Spremišna posuda je zatvorena sa čepom (73), kroz koji se šuplji klip pruža u spremišnu posudu i svojim krajem je uronjen u fluid (zalihu rastvora aktivne materije).

U omotaču kućišta opruge postavljeno je navojno vreteno (74) za mehanički podeoni (koračni) rad. Na kraju navojnog vretena, koji je okrenut gornjem delu kućišta, nalazi se pogonski točkić (75). Na navojnom vretenu nalazi se zaustavljač (76).

Gore opisani raspršivač je podesan za raspršivanje preparata za aerosol prema pronalasku u aerosol koji je podesan za inhalaciju.

Efikasnost uređaja za raspršivanje može biti testirana uin vitrosistemu u kome se raspršuje rastvor proteina i dobijena magla se hvata u takozvanu "klopku"

(vidi Fig. 1). Aktivnost proteina u rezervoaru (a) za aerosol se upoređuje sa aktivnošću uhvaćene tečnosti (b), npr. uz pomoć imuno proba ili uz pomoć proba biološke efektivnosti proteina. Ovaj eksperiment dopušta ocenjivanje stepena raspršivanja proteina pomoću raspršivača. Jedan drugi parametar kvaliteta aerosola

je takozvani udeo koji se može inhalirati, koji je ovde definisan kao udeo kapljica magle (spreja) sa srednjim izmerenim aerodinamičkim prečnikom (Mapmedianen aerodynamischen Durchmesser, skr. MMAD) manjim od 5,8 nm. Udeo koji se može inhalirati može biti izmeren pomoću Andersenovog impaktora. Za dobru apsorpciju proteina važno je ne samo da se postigne raspršivanje bez značajnog gubitka aktivnosti, već i da se generiše aerosol sa dobrim udelom koji se može inhalirati (oko 60%). Aerosol sa MMAD koji je manji od 5,8 um naravno da je podesniji da stigne do alveola, gde su njegove šanse da bude apsorbovan jasno veće. Efikasnost uređaja za raspršivanje takođe može biti testiranau in vivosistemu, pri čemu su u ovom slučaju u igri faktori kao susceptibilnost protiv plućnih proteaza. Kao primer jednogin vivotest sistema može biti pas, kome se daje magla (sprej) koji sadrži proteine preko trahealnog tubusa. Krvne probe se uzimaju u uzastopnim vremenskim razmacima i nakon toga se meri nivo proteina u plazmi imunološkim ili biološkim postupcima.

Podesni raspršivači su već opisani u gore pomenutim US patentnom spisu 5,497,944 i prijavi patenta WO 97/12687, naročito na Fig. 6 a/b (sada 4 a/b). Prvenstveni sklop mlaznice za raspršivanje vodenog preparata za aerosol sa biološki aktivnim makromolekulima prema pronalasku prikazan je na Fig. 8 US patentnog spisa.

Pokazalo se iznenađujućim da je gore opisani raspršivač bez primene pogonskih gasova, kojim se unapred određena količina - na primer 15 mikrolitara - preparata za aerosol raspršuje pod visokim pritiskom od između 100 i 500 bara kroz najmanje jednu mlaznicu sa hidrauličnim prečnikom od 1 do 12 mikrometara, tako da se stvaraju kapljice koje se mogu inhalirati sa srednjom veličinom čestica koja je manja od 10 mikrometara, veoma podesan za raspršivanje tečnog preparata za aerosol od proteina i drugih makromolekula, jer on može da raspršuje jednu široku paletu proteina bez značajnog gubitka aktivnosti. Pri tome je prvenstveni sklop mlaznice onakav kakav je dat na Fig. 8 gore navedenog US patentnog spisa.

Posebno iznenađujuća je sposobnost raspršivača ovakve konstrukcije da raspršuje interferone, koji bi se inače mogli raspršivati samo sa znatnim gubitkom aktivnosti. Dalje je iznenađujuća posebno visoka aktivnost interferona omega posle raspršivanja sa ovim uređajem, ne samoin vitroveć takođe iin vivoekperimentima.

Dalja prednost opisanog postupka je njegovo iznenađujuće svojstvo da može takođe da raspršuje visoko koncentrovane rastvore biološki aktivnih makromolekula bez značajnog gubitka aktivnosti. Upotreba visoko koncentrovanih rastvora omogućava primenu uređaja, koji je dovoljno mali da bi se mogao nositi stalno u tašni ili džepu. Raspršivač koji je prikazan na Fig. 4 ispunjava ove pretpostavke i omogućava raspršivanje visoko koncentrovanih rastvora biološki aktivnih molekula.

Na primer, takvi uređaji su posebno podesni da omoguće dijabetičarima inhalativno samolečenje sa insulinom. Prvenstveno se primenjuju visoko koncentrovani vodeni rastvori sa koncentracijom od 20 do 90 mg/ml insulina i posebno prvenstveno rastvori insulina sa 30 do 60 mg/ml insulina. Prema veličini rezervoara za raspršivače koji stoje na raspolaganju podesni su rastvori koji sadrže insulin u koncentraciji od više od 25 mg/ml, prvenstveno više od 30 mg/ml, da bi se mogla inhalirati terapeutski efektivna količina insulina pomoću ručnog uređaja, kao što je gore opisani uređaj. Inhalativna primena insulina omogućava brzo dejstvo aktivne materije, tako da pacijent može sam sebi dati, na primer, neposredno posle obroka količinu koja mu je potrebna. Mala veličina Respimat<®>, omogućava, na primer, pacijentu da uređaj stalno nosi sa sobom.

Respimat<®>(Fig. 6uW0 97/12687) raspolaže, zahvaljujući komori za doziranje, sa konstantnom zapreminom, koja omogućava pacijentu, da odredi dozu insulina koja mu je potrebna putem broja hodova (udara) i da je inhalira. Osim broja hodova, doziranje insulina se određuje i pomoću koncentracije rastvora insulina u spremišnoj posudi (72). Ona može, na primer, da iznosi između 25 i 90 mg/ml, prvenstveno visoko koncentrovanog rastvora od oko 30 mg/ ml i više.

Postupci za dobijanje visoko koncentrovanog rastvora insulina opisani su na primer u WO prijavi 83/00288 (PCT/DK 82/00068) i 83/03054 (PCT/DK 83/00024) čiji ceo sadržaj je ovde inkorporiran kao referenca.

Preparat za aerosol prema pronalasku koji sadrži insulin i koji se daje pomoću gore opisanog uređaja, ne sme da prekorači dinamičku viskoznost od preko 160010"<6>Pa s, jer bi udeo koji se može inhalirati dobijenog spreja opao ispod prihvatljive vrednosti. Prvenstveni su rastvori insulina, koji imaju granicu viskoznosti do 120010"<6>, a naročito prvenstveno do 110010"6 Pas (Paskal sekundi). U slučaju potrebe može se upotrebiti voda kao rastvarač, da bi se smanjila viskoznost rastvora medicinskog preparata. Ovo može biti postignuto, na primer, i dodavanjem etanola. Udeo etanola u vodenoj formulaciji može iznositi, na primer, do 50%, a prvenstveno je udeo 30 %.

Prvenstveno preparat za dobijanje aerosola ima viskoznost do 1600- IO"<6>Pa s, pri čemu je područje od 900 do 110010"<6>posebno prvenstveno. Dalje su prvenstveni preparati za aerosole, čiji vodeni rastvori imaju viskoznost između 900 i 160010-<6>Pa s, pri čemu su vodeni rastvori sa viskoznosti u području od 950 do 130010-<6>Pa s posebno prvenstveni.

Sledeći cilj predmetnog pronalaska je da se ostvari preparat za aerosol koji bi bio podesan za primenu u opisanom postupku.

Predmet pronalaska su dalje preparati za aerosole u obliku vodenih rastvora, koji sadrže kao aktivnu materiju biološki aktivne makromolekule, naročito proteine ili peptide u količini između 3 mg/ml i 100 mg/ml, prvenstveno između 25 i 100 mg/ml.

Pokazalo se iznenađujućim da se opisanim postupkom prema pronalasku mogu raspršivati visoko viskozni rastvori makromolekula u kapljice koje se mogu inhalirati sa podesnom veličinom kapljica. Ovo omogućava davanje većih količina aktivnih materija po jednoj primeni i na taj način se povećava terapeutska efektivnost makromolekula pri inhalativnoj terapiji.

Prema postupku prema pronalasku mogu biti primenjeni vodeni preparati za aerosol koji sadrže makromolekule (na primer albumin) do viskoznosti od 1600-10"6 Pa s. Pri viskoznosti od 150010"<6>Pa s još je utvrđen udeo koji se može inhalirati do 32 %.

Prvenstveni su rastvori makromolekula više viskoznosti, koji imaju viskoznost od oko 11001O<6>Pa s. Kod takvih rastvora postignut je udeo kapljica koje sadrže aktivnu materiju koji se može inhalirati od oko 60 %. Date granične viskoznosti su dobijene sa Ostwaldovim viskozimetrom prema postupku koji je poznat iz literature. Radi poređenja, viskoznost vode iznosi 894-10-<6>Pas (izmereno na temperaturi od 25° C).

Da bi ilustrovali prednosti postupka prema predmetnom pronalasku u nastavku će biti opisani sledećiin vitoiin vivoeksperimenti sa rastvorom interferona omega.

In vitroeksperiment sa Respimatom<®>i interferonom ome<g>a

Rezervoar Respimat<®>uređaja (a) napunjen je sa 5 mg/mi rastvora interferona omega (u 50 raM trinatrijum citrata, 150 mM NaCl, formulisanim na pH 5,5). Uređaj je aktiviran i raspršena je zapremina od oko 12,9 ul (jedan hod) u struju vazduha od 28 l/min. Raspršeni rastvor je uhvaćen u klopku (Fig. 1). Interferon omega je određen u rastvoru u rezervoaru i u rastvoru uhvaćenom u klopku imunološki pomoću ELISA-e i biološki putem zaustavljanja razaranja A549 ćelija inficiranih encefalomiokarditis virusom. Imunološko određivanje interferona je relativno jednostavno. Objavljena istraživanja sa raspršenim proteinima u većini slučajeva su ograničena na imunološka merenja. Dodatna biološka merenja su ipak mnogo važnija, jer su ona posebno osetljiva i terapeutski relevantan metod za kvalifikovanje razaranja proteina. Ona ne daju uvek isti rezultat kao fiziko-hemijske ili imunološke metode, jer molekul može izgubiti biološku aktivnost (sposobnost), i bez toga da se izmeni njegova veza sa antitelom.

U tri eksperimenta, koji se odnose na rastvor na izlazu, ponovo je nađeno 84 %, 77 % i 98 % interferona koji se mogu imunološki identifikovati u rastvoru (b) iz klopke. Biološka merenja sa istim rastvorima dala su 54 %, 47% i 81 % ponovnog nalaženja interferona koji se može biološki identifikovati u rastvoru (b) iz klopke. Ovaj jako visoki udeo pokazuje, da raspršivanje pomoću Respimat uređaja uništava samo relativno mali deo aktivnosti. Magla (sprej) is Respimat uređaja, kao što je gore opisano, takođe se usmerava u jedan Andersenov impaktor pomoću struje vazduha (28 l/min.). Izmeren je udeo čestica sa veličinom manjom od 5,8 um ("udeo koji se može inhalirati"). Udeo koji se može inhalirati odgovara vrednosti od 70 %

(imunološka merenja). Proteini, kao što su interferoni, često su formulisani sa albuminom humanog seruma ("Human serum albumin") da bi se obezbedila dalja zaštita osetljivih interferona. Formulacija, kao što je gore navedena, ali sa dodatnim albuminom humanog seruma (0,5 %) takođe je testirana. U tri eksperimenta koji se odnose na rastvor na izlazu, na isti način ponovo su nađeni 83 %, 83 % i 79 % interferona koji se mogu imunološki identifikovati u rastvoru (b) iz klopke. Udeo koji se može inhalirati (imunološka merenja) bio je 67 %. U daljem nastavku rastvorom interferona omega sa koncentracijom od 53 mg/ml napunjen je rezervoar Respimat uređaja i neposredno posle toga je raspršen. U četiri eksperimenta koji se odnose na rastvor na izlazu, ponovo su nađeni, 100 %, 60 %, 68 % i 72 % interferona koji se mogu imunološki identifikovati u rastvoru (b) iz klopke. Biološka merenja sa istim rastvorima dala su 95 %, 98 96, 61 % i 83 % ponovnog nalaženja interferona koji se mogu biološki identifikovati u rastvoru (b) iz klopke. Ovakvo visoko ponovno nalaženje pokazuje da se pomoću Respimat uređaja takođe mogu raspršivati koncentrovani rastvori proteina, a da pri tome ne dođe do prekomernog gubitka aktivnosti interferona.

In vivo eksperimentisa Respimatom<®>i interferonom omega

Interferon omega je davan inhalativno i intravenski u odvojenim eksperimentima istom psu. Meren je nivo interferona u krvi u različitim vremenskim trenucima imunološki i biološki. Dalje je meren nivo neopterina u krvi. Neopterin je marker za imunoaktivnost, a njega oslobađaju makrofagi posle oslobađanja interferona

(vidi Fuchs et al "Neopterin, biochemistrv and clinical use as a marker for cellular immune reactions" (Neopterin, biohemijska i klinička upotreba kao markera za ćelijske imune reakcije), Int Arch. Allergy Appl. Immunol. 101: 1-6, [1993]). Merenje nivoa neopterina služi za kvalifikovanje efektivnosti interferona.

Davanje interferona kod psa usledilo je pod pentobarbituratnom narkozom posle prethodne osnovne narkoze. Životinja je intubirana i đisala je veštački (disanje sa kontrolisanom zapreminom: zapremina u minuti 4 l/min, frekvencija 10 hodova/min). Ukupno 20 hodova je dato Respimat uređajem. Svaki hod je davan od početka udisaja. Posle faze udisanja davano je 5 sekundi pauze pre izdisaja. Pre sledećeg davanja interferona omega životinji su dozvoljena dva ciklusa disanja bez ikakvih drugih uticaja. Uzeta je krv za serum i heparinska plazma pre davanja interferona i u različitim vremenskim trenucima do 14 dana posle davanja interferona. Interferon omega u heparinskoj plazmi je određen imunološki pomoću ELISA-e i biološki putem zaustavljanja razaranja A549 ćelija inficiranih sa encefalomiokarditis virusom. Serum neopterina je određen imunološki. Fig. 2 prikazuje imunološki (Fig. 2a) i biološki (Fig. 2b) izmerene nivoe interferona omega posle 20 hodova sa interferonom omega iz Respimat uređaja. Iznenađujućim se pokazao veoma visok nivo seruma neopterina izmeren posle inhalativnog davanja. Uin vitroeksperimentima izdata masa rastvora po jednom koraku Respimat uređaja je odgovarala prosečno 12,8 mg/po hodu. Zato se moglo očekivati da kod rastvora od 5 mg/ml sa 20 hodova Respimata<®>bude dato oko 1,28 mg interferona. Merenja neopterina posle davanja ove količine dala su jasno više i dugotrajnije nivoe, nego merenja neopterina posle davanja 0,32 mg interferona intravenski. Fig. 3 prikazuje ovaj rezultat Visoki nivo neopterina služi kao dokaz da davanje interferona Respimatom može dovesti do dobrog biološkog efekta. Prednosti Respimat uređaja za raspršivanje biološki aktivnih makromolekula nisu ograničene samo na interferone, kao što pokazuje drugi primer.

In vitroeksperimenti sa Respimatom<®>i mangan su<p>eroksid dismutazom

Uređaj za raspršivanje test materije i njemu pripadajuća klopka bili su onakvi kao što je prikazano na Fig. 1. U ovom eksperimentu rezervoar (a) Respimat uređaja napunjen je sa 3,3 mg/ml mangan superoksid dismutaze (MnSOD) u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru (PBS). Uređaj je aktiviran i zapremina od oko 13 um (jedan hod) je raspršena u struju vazduha od 28 l/min. Tačna raspršena količina je gravimetrijski određena (merenja u tri eksperimenta koji su sledili jedan za drugim: 12,8,13,7 i 14,3 mg). Raspršeni rastvor je uhvaćen u klopku (b). Sadržina ove klopke bila je 20 ml PBS. Pored toga dodato je 2 ml 5 % goveđeg seruma albumina, da bi se stabilizovali proteini u klopci. MnSOD u rezervoaru za rastvor i u rastvoru uhvaćenom u klopku, određen je imunološki pomoću ELISA-e i enzimski pomoću redukcije superoksid mangana sa ksantin/ksanitn-oksidaznom reakcijom. U tri eksperimenta izmereno je 78 %, 89 % i 83 % MnSOD koji se mogao imunološki identifikovati iz raspršenog rastvora koji je u klopci (b). To ukazuje da nema merljivog gubitka enzimske aktivnosti posle raspršivanja. Udeo koji se može inhalirati (imunološka merenja) bio je 61 %.

U sledećem primeru opisano je pripremanje preparata za aerosol prema pronalasku koji sadrži insulin kao aktivnu materiju.

Priprema rastvora insulina i punienie raspršivača

175 mg kristalizovanog (natrijumova so) goveđeg insulina (koji odgovara 4462,6 I.E. prema navodu proizvođača) bilo je rastvoreno u 3,5 ml sterilne prečišćene (destilovane) vode (Seralpur<®>voda). Neposredno posle toga je uz malo mešanja

uvedeno 8,5 ul ra-krezola (što odgovara 8,65 mg) i 7,53 fenola rastvorenog u 100 (im sterilne, prečišćene (destilovane) vode. Ovom rastvoru je dodato 365 ul jednog rastvora od 5 mg/ml ZnCl2(što odgovara masenom udelu od 0,5 % cinka u odnosu na primenjenu količinu insulina) i podešena je pH vrednostna 7,4 sa 0,2 N NaOH. Zapremina smeše je dopunjena do 5 ml sa sterilnom, prečišćenom (destilovanom) vodom i filtrirana je kroz sterilni filter sa mikroporama (veličina pora 0,22 um). 4,5 ml preparata za aerosol uvedeno je u spremišnu posudu (72 na

Fig. 4) raspršivača (Respimata). Posuda je zatvorena sa poklopcem i zatim je posuda spojena sa uređajem.

Tako dobijeni preparat za aerosol imao je koncentraciju od 35 mg/ml insulina, pri čemu je viskoznost ovog rastvora iznosila oko 102010"<6>Pa s.

In vivoeksperiment sa Respimatom<®>i visoko koncentrovanim rastvorom insulina

Primena insulina kod psa usledila je pod pentobarbituratnom narkozom koja je sledila posle prethodne osnovne narkoze. Životinja je intubirana i disala je veštački kao i ranije. Dato je ukupno 6 hodova sa rastvorom insulina Respimat uređajem. Svaki hod je davan od početka udisaja. Između faze udisanja i izdisanja bila je pauza od 5 sekundi. Pre sledećeg davanja insulina životinji su dozvoljavana dva ciklusa disanja bez ikakvih drugih uticaja. Krv je uzimana 1 sat pre davanja, istovremeno sa davanjem i u različitim trenucima posle više od 8 sati. Nivo glikoze u krvi je u svežoj krvi meren metodom Trascha, Kollera i Tritschlera (Klein. Chem. 30; 969,

[1984]) uz pomoć Refletron<®>uređaja (Boeringer Mannheim). Iznenađujuće se pokazalo nađeno dobro biološko dejstvo i sa ovim visoko koncentrovanim rastvorom insulina (opadanje nivoa glikoze u krvi posle inhalativnog davanja insulina). Fig. 5 prikazuje ovaj rezultat Vodeni preparat za pripremanje aerosola prema pronalasku može u slučaju potrebe sadržati, osim aktivne materije i vode, još rastvarača, kao što je npr. etanol. Količina etanola je ograničena u zavisnosti od svojstva rastvorljivosti aktivne materije, pošto se pri visokim koncentracijama aktivne materije mogu istaložiti iz preparata za aerosol. Pored stabilizovanja rastvora, kao, na primer, farmaceutski prihvatljivim konzervansima, kao što su npr. etanol, fenol, krezol ili paraben, mogu se primeniti i farmaceutski prihvatljive kiseline, baze ili puferi za podešavanje pH vrednosti ili jedan ili više adjuvanata iz grupe koja obuhvata površinski aktivne materije, kao što su surfaktanti, emulgatori i/ili poboljšavači prodiranja. Za stabilizovanje rastvora ili poboljšanje kvaliteta aerosola moguće je dodavanje materija za stvaranje helata metala - kao što je npr. EDTA. Za poboljšanje rastvorljivosti i/ili stabilizaciju aktivne materije u preparatu za aerosol mogu biti dodate amino kiseline, kao što je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina (asparagin, glutamin) i naročito prolin.

Pored interferona, superoksida dismutaze i insulina, sledeće aktivne materije predstavljaju prvenstvene aktivne materije za medicinski preparat prema pronalasku:

antisens (genski inhibirajući) oligonukleotidi

oreksini

eritropoetin

faktor - alfa nekroze tumora

faktor - beta nekroze tumora

GM - CSF ("Granulocvte - macrophage colonv stimulating factor" - faktor za stimulaciju kolonija granulocita - makrofaga)

aneksini

kalcitonin

leptini

paratirin

fragment paratirina

interleukini, kao što su interleukin 2, interleukin 10, interleukin 12 rastvorljivi ICAM ("Intercellular adhesion molecule" - molekul međućelijske adhezije)

somatostatin

somatotropin

tPA ('Tissue plasminogen activator" - aktivator plazminogenskog tkiva) TNK-tPA

tumorima pridruženi antigeni &ao što su peptidi, belančevine ili DNK) peptidni bradikininski antagonisti

urodilatin

GHRH ("Growth hormone realising hormone" - hormon za oslobađanje hormona rasta)

CRF ("Corticotropin releasing factor" - faktor oslobađanja kortikotropina)

EMAPII

heparin

rastvorljivi receptori interleukina, kao što je sIL -1 receptor vakcine, kao što su vakcina protiv hepatitisa ili vakcina protiv malih boginja antises (genski inhibirajući) polinukleotidi,

faktori transkripcije.

Claims (29)

1. Raspršivač bez pogonskih gasova koji sadrži preparat za aerosol u obliku rastvora sa vodom ili smešom vode i etanola kao rastvaračem, koji sadrži aktivnu materiju u koncentraciji između 25 i 100 mg/ml, koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od: antisens (genski inhibirajuće) oligonukleotida oreksina eritropoetina faktora - alfa nekroze tumora faktora - beta nekroze tumora GM - CSF ("Granulocvte - macrophage colony stimulating factor" - faktor za stimulaciju kolonija granulocita - makrofaga) aneksina kalcitonina leptina paratirina fragmenta paratirina interleukina kao što su interleukin 2, interleukin 10, interleukin 12 insulina superoksid dismutaze interferona rastvorljivog ICAM ("Intercellular adhesion molecule" - molekul međućeli-jske adhezije) somatostatina somatotropina tPA (Tissue plasminogen activator" - aktivator plazminogenskog tkiva) TNK-tPA tumora pridruženih antigena (kao što su peptidi, belančevine ili DNK) peptidnih bradikininskih antagonista urodilatina GHPvH ("Growth hormone realising hormone" - hormon za oslobađanje hormona rasta) CRF ("Corticotropin releasing factor" - faktor oslobađanja kortikotropina) EMAPII heparina rastvorljivih receptora interleukina, kao što je sIL-1 receptor vakcina, kao što su vakcina protiv hepatitisa ili vakcina protiv malih boginja antisens (genski inhibirajuće) polinukleotida, faktora transkripcije, pri čemu je raspršivač bez pogonskih gasova prilagođen za odmeravanje terapeutski delotvorne pojedinačne doze preparata za aerosol u mernoj komori i njeno raspršivanje pod visokim pritiskom između 100 i 500 bar kroz najmanje jednu mlaznicu sa hidrauličnim prečnikom od 1 do 12 um tako da se stvaraju kapljice koje se mogu inhalirati, sa srednjom veličinom čestica koja je manja od 10 um.

2. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što je aktivna materija insulin.

3. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 2, naznačen time, što se insulin kao aktivna materija primenjuje u koncentraciji od 25 do 60 mg/ml.

4. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 2, naznačen time, što se insulin kao aktivna materija primenjuje u koncentraciji većoj od 30 mg/ml.

5. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 2, naznačen time, što se insulin kao aktivna materija primenjuje u koncentraciji od 30 do 60 mg/ml.

6. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 2, naznačen time, što se insulin kao aktivna materija primenjuje u koncentraciji od 33 do 40 mg/ml.

7. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što je aktivna materija superoksid dismutaza.

8. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što je aktivna materija interferon.

9. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što je aktivna materija interferon omega.

10. Raspršivač bez pogonskih gasova prema jednom od zahteva 1 do 9, naznačen time, što preparat za aerosol sadrži jedan ili više adjuvanata iz grupe koja obuhvata površinski aktivne materije, kao što su surfaktanti, emulgatori, stabilizatori, poboljšavači prodiranja i/ili konzervansi.

11. Raspršivač bez pogonskih gasova prema jednom od zahteva 1 do 10, naznačen time, što preparat za aerosol sadrži amino kiselinu.

12. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 11, naznačen time, što preparat za aerosol sadrži prolin, asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu za poboljšanje rastvorljivosti ili stabilnosti aktivne materije.

13. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što preparat za aerosol ima viskoznost do 1600 10"<6>Pa s na temperaturi od 25°C, mereno Osvaldovim viskozimetrom.

14. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što preparat za aerosol ima viskoznost između 900 IO"<6>i 1600 -IO"<6>Pas na temperaturi od 25°C, mereno Osvaldovim viskozimetrom.

15. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što preparat za aerosol ima viskoznost između 900 10"<6>i 1100 IO"<6>Pa s na temperaturi od 25°C, mereno Osvaldovim viskozimetrom.

16. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 1, naznačen time, što preparat za aerosol ima viskoznost između 950 -10"<6>i 1300 -IO"<6>Pas na temperaturi od 25°C, mereno Osvaldovim viskozimetrom.

17. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 13 ili 15, naznačen time, što je aktivna materija superoksid dismutaza.

18. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 13 ili 15, naznačen time, što je aktivna materija interferon, a prvenstveno interferon omega.

19. Raspršivač bez pogonskih gasova prema zahtevu 13 ili 15, naznačen time, što je aktivna materija insulin.

20. Raspršivač bez pogonskih gasova prema jednom od zahteva 1 do 19, naznačen time, što je taj raspršivač dovoljno mali da bi se mogao nositi stalno u tašni ili džepu.

21. Raspršivač bez pogonskih gasova prema jednom od zahteva 1 do 19, naznačen time, što raspršivač ima telo mlaznice sa dve mlaznice koje su usmerene tako da se dva mlaza susreću na takav način da se preparat za aerosolraspršuje.

22. Postupak za pripremanje aerosola bez pogonskih gasova za inhalativnu primenu, naznačen time, što se u raspršivaču bez pogonskih gasova terapeutski delotvorna pojedinačna doza preparata za aerosol, prema jednom od zahteva 1 do 20, odmerava u mernoj komori i raspršuje pod visokim pritiskom između 100 i 500 bara kroz najmanje jednu mlaznicu sa hidrauličnim prečnikom od 1 do 12 um tako da se stvaraju kapljice koje se mogu inhalirati, sa srednjom veličinom čestica koja je manja od 10 um.

23. Postupak prema zahtevu 22, naznačen time, što se preparat za aerosol raspršuje u periodu između 1 i 2 sekunde.

24. Postupak prema jednom od zahteva 22 ili 23, naznačen time, što delotvorna pojedinačna doza iznosi između 10 i 20 mikrolitara.

25. Postupak prema jednom od zahteva 22 do 24, naznačen time, što raspršivač ima telo mlaznice sa dve mlaznice koje su usmerene tako da se dva mlaza susreću na takav način da se preparat za aerosol raspršuje.

26. Postupak prema jednom od zahteva 22 do 25, naznačen time, što je aktivna materija insulin.

27. Postupak prema zahtevu 26, naznačen time, što je koncentracija insulina između 25 i 60 mg/ml, a prvenstveno između 30 i 40 mg/ml.

28. Primena raspršivača bez pogonskih gasova prema jednom od zahteva 1 do 21 koji sadrži preparat za aerosol prema jednom od zahteva 1 do 21 za pripremanje aerosola sa srednjom veličinom čestica koja je manja od 10 um.

29. Primena prema zahtevu 27, naznačena time, što je preparat za aerosol koji se primenjuje vodeni rastvor koji sadrži više od 25 mg/ml insulina, a prvenstveno više od 30 mg/ml insulina, još poželjnije od 30 do 60 mg/ml insulina, te posebno poželjno od 33 do 40 mg/ml insulina.