RS49533B - Interferonski konjugati - Google Patents

Abstract

Fiziološki aktivni pegilovani konjugat interferona α formule gde R i R' svaki za sebe predstavljaju C1-6alkil; X je NH ili O i gde n i n' zbirno iznose od 600 do 1500; i gde prosečna molekulska težina lanca polietilenglikola u pomenutom konjugatu iznosi od 26000 do 66000 daltona. Prijava sadrži još 9 zavisnih patentnih zahteva i 4 nezavisna patentna zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na fiziološki aktivan konjugat interferona alfa (IFNa) sa račvasto povezanim polietilenglikolom (PEG), postupak dobijanja konjugata i farmaceutske preparate koji sadrže konjugat (Int. Cl. 7.: A61K 47/48).

STANJE TEHNIKE

Interferon, precizinije interferon 2a, predstavlja farmakološki aktivan protein sa antivirusnim i antiproliferativnim dejstvom. Interferon se koristi, na primer u terapiji leukemije ćelija vlasi i Kapošijevog sarkoma, a pokazuje delotvornost i kod hepatitisa. U cilju poboljšanja stabilnosti i rastvorljivosti kao i smanjenja imunogenosti, farmaceutski aktivni proteini kao stoje interferon mogu se vezivati za polimer polietilen glikola (PEG).

Bioraspoloživost proteinskih lekova je često ograničena kratkim vremenom polu/.ivota u plazmi, što im onemogućava postizanje maksimalne kliničke aktivnosti. Posleđnjih godina, biomolekuli koji su konjugovani sa PEG pokazali su da poseduju korisne osobine sa aspekta kliničke upotrebe (Inada i dr. J. Bioact. and Compalible Polvmers 5, 343 (1990); Delgrado i dr., Critical Revievvs in Therapeutic Drug Carrier Svstems 9, 249 (1992); Katre, Advanced Drug Deliverv Systems 10, 91 (1993)). lMeđju njima su bolja fizička i termalna stabilnilnost, zaštita u odnosu na susceptibilnost od enzimske degradacije, povećanu rastvorljivost, duži in vivo cirkulirajući period poluživota, smanjeno oslobadjanje i poboljšana efikasnost. Primećeno je da račvasti konjugati PEG, poseduju povećanu vrednost pH i termalnu stabilnost i povećanu stabilnost prema proteolitičkoj digestiji u odnosu na linearne PEG konjugate. (EP-A 0 400 472 i Monfardini i dr., Bioconjugate Chem., 6, 62

(1995)). Ostale osobine PEG proteina su smanjena imunogeničnost i antigeničnost, kao i smanjena toksičnost. Ovo je primećeno, izmedju ostalog, kod G-CSF (Satake-Ishikavva i dr., Cell strueture and Function, 17, 157-160 (1992)), IL-2 (Katre i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487 (1987), TNF-a (Tsutsumi i dr., Jpn. J. Cancer Res., 85, 9(1994). IL-6 (Inoue i dr., J. Lab. Clin. Med. 124, 529, (1994)) i CD--IgG(Chamovv i dr., Bioconj. Chem. 5, 133 (1994).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Uočeno je da i u slučaju interferona, vezivanjem za PEG opada antivirusna aktivnost in vitro ali se povećava antiproliferativna aktivnost prema humanim ćelijama tumora. Tako pronalazak ovog novog konjugata interferona sa PEG ima neočekivane osobine koje se tiču antiproliferativnog svojstva, tako da deluje intezivinije od samog interferona i drugih konjugata interferona sa PEG. Pored toga stoje antiproliferativna aktivnost znatno unapredjena kod PEG-interferona a konjugata, redukcija antivirusne aktivnosti je ostala ista. Osim toga, predmet ovog pronalaska, konjugat PEG-interfcrona-a je nennugentj. ne podstiče stvaranje antitela.

Prema tome, pronalazak se odnosi na novu klasu PEG derivata interferona (IFNa). Kao što će se videti u delu teksta koji sledi ispod, konjugat koji je obuhvaćen ovim pronalaskom, ima račvastu PEG strukturu. Prednost račvastog PEG je u tome što omogućava vezivanje 2 linearna molekula PEG na jedno mesto povećavajući na taj način masu vezanog PEG bez povećavanja mesta vezivanja PEGilacije.

U poredjenju sa nemodifikovanim IFNa (IFNa bez vezanog PEG), konjugat ima produženo cirkulirajuće vreme poluživota i vreme zadržavanja u plazmi, smanjenu imunogenost, smanjeno oslobadjanje i povećanu antiproliferatvinu aktivnost koja je praćena smanjenom antivirusnom aktivnošću in vivo. U poredjenju sa ostalim PEG-IFNa- konjugatima, konjugat iz ovog pronalaska ima mnogo veću antiproliferativnu aktivnost, što nije proporcionalno povećanju ili smanjenju inteziteta osobina, i praktično nema nikakvu imunogenost.

Fiziološki aktivan PEG-IFNa konjugat obuhvaćen ovim pronalaskom ima formulu:

Konjugat iz ovog pronalaska ima istu primenu kao i IFNa, npr. antiproliterativnu. Naročito su konjugati PEG intcrferona-a iz ovog pronalaska korisni za lećenje oboljenja u vezi sa imunomodulatornim poremećajima poput neplazme kao što je na prinier leukemija ćelija vlasi, CML, Kapošijcv sarkom i infektivna oboljenja, na isti način na koji se IFNa (posebno !FNa2a) koristi za lečcnje ovih oboljenja. U sve to, konjugat, predmet ovog pronalaska, ima poboljšane osobine uključujući izuzetnu stabilnost, povećanu rastvroljivost, produžene vreme poliuživota u cirkulaciji i produženo vreme boravka u plazmi. Pored toga, antiproliferativna aktivnost ovih konjugata superiorna je u odnosu na IFNa. Kao što jc već pomenuto, kod konjugata je izrazito razdvojeno antivirusno i antiproliferativno dejstvo. Ova osobina je od dodatne koristi za poboljšanje željene aktivnosti konjugata i istovremeno smanjivanje ili eliminisanje neželjenih efekata. Akoje na primer. nepoželjno sporedno dejstvo vezano za antivirusnu aktivnost, njeno eliminisanje će ukloniti i neželjeno dejstvo dok se antiproliferativna aktivnost zadržava. Zbog toga ovaj pronalazak sadrži farmaceutske preparate na bazi supstanci ili njihovih soli koje imaju strukturu formule i i postupke njihovog dobijanja.

Farmaceutski preparati iz ovog pronalaska namenjeni su tretiranju i prevenciji bolesti, a sastoje se od konjugata interferona opšte formule I i terapijski inertnih ili prihvatljivih, netoksičnih pomoćnih sredstava. Farmaceutski preaparati koji ćc sc koristiti, formulišu se i doziraju na način koji se zasniva na praktičnim medicinskim iskustvima, karakteristikama poremećaja, opštem stanju pacijenata , načinu davanja i propisivanja proteinskog konjugata kao i na drugim činjenicama, koje su poznate kliničarima.

Traženi konjugat je fiziološki aktivni konjugat PEG-IFNa opšte formule;

gde R i R' svaki za sebe predstavljaju Ci.„alkil; X jc NH ili 0 (X predstavlja barem jednu od funkcionalnih grupa u molekulu IFNa koji je odabran od NH., ili OH); n i n" iznose od 600 do 1 500; i gde srednja molekulska težina lanca polietilenglikola u pomenutom konjugatu iznosi od 26000 do 66000 daltona. Konjugat formule I ima račv astu strukturu jer su dva lanca PEG vezana za protein samo jednom vezom.

Vrodnosti za n i n' su odabrane tako da rezultujuci konjugat formule 1. ima fiziološku aktivnost IFNa. izraženu u i sloj ili većoj meri, ili u vidu frakcije odgovarajuće aktivnosti za nemodifikovanu IFNa. n i n" (n i n mogu da budu isti ili različiti) predstavljali broj jedinica elilenglikola u PFG. Jedna jedinica PEG. OGI FCH; ima moickulsku težinu od 44 daltona. Molekulska tećina konjugata (izuzimajući molekulsku masu IFNa) zavisi od n i n\ Zbir n i ti' u konjugatu formule 1 je od 600 do 1 500. što proizvodi konjugat sa ukupnom prosečnom molekulskom težinom za 1'I Xi jedinice od 26000 do 66000 i najbolje od 35000 do 45000 daltona, a naročito 3900Udo 45000 daltona. gde je naročito poželjno da težina bude 40000 daltona. Poželjna suma za n i n' je je od 800 do 1200. sa prosečnom sumom od 850 do 1000. i gde poželjna vrednost sume iznosi 910. Ih n ili n' može da bude 420 ili 520. ili i jedan i drugi mogu da 420 ili 520, ili 455. Poželjni odnos za n i n' je od 0.5 do 1.5 sa naročito poželjnim odnosom od0.8 do 1.2. Molekulska težina od""oko "; gde izvestan broj označava daje unutar pogodnog opsega tog broja kako je odredjeno uobičajenim analitičkim tehnikama,

Takodjc je poželjan konjugat formule I gde IFNa može da bude lFNa2a, konjugat gde su R iI<V>metil, konjugat gde X predstavlja NH, i konjugat gde n insvaki za sebe ili oba mogu da budu 420 ili 520. Naročito je poželjan takav konjugat koji ima s\e gorepornenute karakteristike.

R i R" mogu da budu bilo koji alki i. gde alki! grupa može da ima od jedan do šest atoma kao što su metil. etil. izopropil. itd. Obuhvaćeni su račvasti alkili. Poželjni alkil je metil. I i pogledu PEG grupa formule I, R i R" mogu da imaju iste ili različite vrednosti.

Ir'No- (interferona") i njegove podvrste IFNaža označava prirodni ili rekombmantni protein, po mogućstvu humani, koji se dobija iz bilo kojeg uobičajenog izvora kao što su tkiva, sinteza proteina, ćelijska kultura sa prirodnim ili rekobinantnim ćelijama. Obuhvaćen je bilo koji od proteina koji ima aktivnost za IFNa, kao što su muteini ili ostali modilikovani proteini. Dobijanje i izolovanje IFNa iz prirodnog ililekombinantnih izvora dobro je poznato (Pestka, Arch. Biochem. Biophvs. 221. 1, (1^83)). Poželjni IFNa je IFNa2a, koji jeovde naveden, dobija se poznatim postupcima ( Pestka. Sci. Am. 249. 36 (1983); Evropski patent br. 43 980)

fiziološki aktivni konjugat formule 1 poseduje aktivnost za IFNa, pod čime se podrazumcva bilo koja t'rakcija ili veliki broj poznatih aktivnosti IFNa. kako je odredjeno različitim ogledima koji su poznati u stanju tehnike. Konjugali iz ovog pronalaska poseduju aktivnost za IFNa kako je pokazano antiproliferativnom aktivnošću prema ćelijama tumora i antivirusnu aktivnost prema ćelijama koje su zaražene virusom. One predstavljaju poznale aktivnosti IFNa Ta aktivnost konjugata može na primer. cla bude odredjena pomoću niže opisanih ogleda koji su dobro poznati stručnjacima (videti takodje Rubinstein i dr., J. Virol. 37, 755 (1981): Rorden i dr.. Canc. Res. 42, 4948 (1982)). Deo pronalaska odnosi se na konjugat formule 1 koji ima veću anliproliferativnu aktivnost i manju anitivirusnu aktivnost nego za ncmodifikovani IFNa.

Konjugat fomule ! dobija se kovalentnim vezivanjem IFNu za PEG koji se aktivira zamenom PEG hidroksil sa vezivnom grupom, fonniranjem reagensa koji je PEG derivat estra N'-hidroksi sukcinamida(naročito monometoksi PEG) tormule U. Reagcns može da se dobije uobičajenim postupcima (Mondafini i dr., kao gore). Vezivanje sc vrši preko amidne ili estarske veze. Kod jednog poželjnog konjugata, vezivanje se vrši preko amidne veze (X jc NH). Deo ovog pronalaska predstavlja postupak za povećanje antiproliferativne aktivnosti IFNa. pri čemu se smanjuje antivirusna aktivnost IFNa, vezivanjem IFNa kako je opisano gore za reagens formule II da bi se dobio PEG-IFN konjugat.

X predstavlja vezivno mesto na IFNa na kojem je PEG reagens formule II kovalentno vezan za IFNa. Reagensi se vezuju za primarne amino grupe (XH = NH2) lizina ili za N-terminalni kraj od IFNa. Reagensi takodje mogu da se vezuju za hidroksilnu grupu

<XH = OH) serina.

Reagens formule II (PEG2-NHS) u kojem su 2 od ukupnog broja lanaca monometoksi grupa (m-PEG) vezani za lizin, svaki za a i e amino grupe preko veza na karbamatima (uretan) i sa karboksilnom grupom lizina aktiviranom na sukcinimidil estru, može da se dobije uobičajenim postupcima, na osnovu poznatih postupaka (Monfardini i dr., videti gore) koji se mogu primeniti na reagens sa R.grupom koja predstavlja niži alkil,1koji ima željenu vrednost za n. Reagens se može nabaviti kod Shearvvater Polvmers Inc., (Huntsvillc, Alabama). Poželjna srednja vrednost za molekulsku težinu od PEG iznosi 20000 daltona. u odnosu na ukupnu težinu PEG od 40000 daltona u PEG2-NHS (ostale molekulske težine mogu da se dobiju uobičajenim postupcima variranjem vrednosti zanza PEG alkohole kop predstavljaju polazne materijale za reagens formule II).

Reagensi formule II mogu da se vezuju za IFNa uobičajenim postupcima. Reagens formule II prvo reaguje sa jednom ili više primarnih amino grupa (na primer na N-terminalnom kraju i bočnim lancima lizina) od IFNa (na primer IFNa2a) da bi se formirala veza i zmedju IFNa i polimernog lanca PEG. Reakcija pegilaeije odigrava se i zmedju PEG2-NHS i (ukoliko ih ima) slobodnih hidroksilnih grupa (na primer serma) IFNa da bi se formirala estarska veza. Reakcioni mehanizam je prikazan niže. PEG reagens se kombinuje sa IFNa u umereno baznoj sredini na niskoj temperaturi pod usiovima koji su pogodni za nukiieofiinu substituciju kojom se dobija konjugat formule I. Ovo je takodje prikazano u gore pomenutom mehanizmu reakcije.

Vezivanje reagensa za IFNa može da se vrši pomoću uobičajenih postupaka. Mogu se koristiti PEG bilo koje molekulske težine obuhvaćene ovih pronalaskom. Reakcioni

iislovi se mogu birati tako da se dobije željeni konjugat sa reagensom koji se veže za njega. Konjugat formule 1. koji ima jedan vezani reaktant formule II, odvaja se poznatim postupcima od nemodifikovanog IFNa i konjugata za koje je vezan više od jednog molekula reagensa. Postupci prečišćavanja kao što su katjonska jonoizmenjivačka hromatografjja, mogu biti primenjeni za razdvajanje konjugata na osnovu razlika u naelektrisanju i veoma su efikasne za razdvajanje konjugata prema molekulskim masama. Sadržaj frakcija dobijenih katjonskom jonoizmenjivačkom hromatografijom može se identilikovati na osnovu molekulske mase korišćenjem uobičajenih postupaka, na primer, masene spektroskopije, SDS-PAGE elektroforeze. ili ostalih postupaka za razdvajanje molekula prema molekulskim masama. Na taj način se identi likuje frakcija koja sadrži konjugal formule I oslobodjen od nemodifikovanog IFaa i konjugata kiselom hidrolizom, tako da broj molekula lizina u hidrolizatu ukazuje na broj PEG vezanih za protein, te tako može biti titvrdjen broj molekula reagenasa vezanih za konjugat.

Primeri koji slede služe kao dalja ilustracija datog pronalaska. IFNo.2a se koristi u ovim pnmerima. Ostale vrste IFNa takodje se mogu vezati za PEG postupcima koji su ovde potkrepljen; odgovarajućim primerima.

OPIS SLIKA

Slika 1: Antitumorska aktivnost za PEG2-IFNa!fa2a kod bczdlakih (nude) miševa kome su subkutano ugradjene humane A498 ćelije bubrega. 33-ćeg dana od početka ogleda, svim životinjama subkutano je implantirano 2 x 106 humanih A498 ćelija bubrega. Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina (10, 20, 40 ili 100 ug) IFN alfa 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, jedanput nedeljno u periodu od četiri nedelje.

Slika 2: Antitumorska aktivnost za PEG2-lFNalfa2a kod bczdlakih miševa kome su

.subkutano ugradjene humane A498 ćelije bubrega. 33-ćeg dana od početka ogleda, svim životinjama subkutano je implantirano 2 x 10° hum anih A498 ćelija bubrega. Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina ( 10. 20. 40 ili 100 ug) IFN alta 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, 3 puta nedeljno u periodu od četiri nedelje.

Slika 3: Antitumorska aktivnost za PEG2-lFNalfa2a kod bczdlakih miševa kome su

subkutano ugradjene humane ACHN ćelije bubrega. 25-tog dana od početka ogleda,svim životinjama subkutano jc implantirano 2x !0<6>humanih ACILNćelijabubrega.Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina (30. 60. 120 ili 300 pg) PFG2-IFN alfa 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, jedanput nedeljno u periodu od četiri nedelje.

Slika 4: Antitumorska aktivnost za IFNalfa2a kod bezdlakih miševa kome su subkutano ugradjene humane ACHN ćelije bubrega. 25-tog dana od početka ogleda, svim životinjama subkutano je implantirano 2 x IO6 humanih A498 ćelija bubrega. Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina (10. 20, 40 ili 100 ug) IFN alfa 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, tri puta nedeljno u periodu od pet nedelja.

Slika 5: Antitumorska aktivnost za PEG2-IFNalfa2a kod bczdlakih miševa kome su subkutano ugradjene humane G402 ćelije bubrega. 45-tog dana od početka ogleda, svim životinjama subkutano je implantirano 2 x 10<A>humanih G402 ćelija bubrega. Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina (30. 60, 120 ili 300 ug) IFN alfa 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, jedanput nedeljno u periodu od pet nedelja.

Slika 6: Antitumorska aktivnost za IFNalfa2a kod bezdlakih miševa kome su subkutano ugradjene humane G402 ćelije bubrega. 45-tog dana od početka ogleda, svim životinjama subkutano je implantirano 2 x 10<6>humanih G402 ćelija bubrega. Nultog dana ispitivanja je započeo tretman sa IFNalfa2a. Odredjena količina (10. 20. 40 ili 100 ug) IFN alfa 2a je davana subkutano u stranu slabine koja je suprotna onoj na kojoj je tumor, tri puta nedeljno u periodu od pet nedelja.

P rimer 1

Pripr ema ko nj imala Formule I

Materijali

Interferon n2a je pripremljen primenom poznatih metoda (Pestka, supra). Polietilen-glikol (PEG) reagens formule II je kupljen kod Shearvvater Polvmers, Inc. (Huntsviile. Ala). FractogeKK FMD CM 650(S) smola, sa veličinom čestica od 25 - 40 pm, nabavljen je od FM Separations (Gibbstovvn, MA). Koncentrovani (10x) puferski rastvor fosfata (PBS), pFI 7,3, kupljenje od BioVVhittaker (VValkersville, MD). Već izliveni gelovi za natrijum dodecii (laurel) sulfat/poliakrilamidnu gel elektroforezu (SDS-PAGF) i pribor za elektroforezu su nabavljeni od NOVEX-a (San Diego, CA). Koncentrovana 'Fast Stain' boja za bojenje proteina PEG konjugata na SDS-PAGE je ku<p>ljen od Zoion Research , Inc. (Newion, MA). Komplet za LAL endotoksinski test je kupljen od Associates of Cape cod, Inc. (Woods hole, MA). Svi drugi upotrebljeni reagensi su bili najvišeg mogućeg kvaliteta. Pacovi sa kanilom u jugularnoj veni i BDF-1 miševi su nabavljeni od Charles River Laboratories (\Vilmington. MA).

Eksperimentalni postupci

A. SMAIJ. SCAEF. priprema konjugata Formule I

Dvesto osam miligrama (5.2 umol) reagensa Formule II (prosečne MW od 40 000 daltona) je dodato u 50 mg (2,6 umol) IFNa u 10 ml 100 mM borata, pH 8,0. Finalni odnos proteina i reagensa je bio 1:2. Reakciona smesa je mesana dva sata na 4°C. Reakcija je zaustavljena podešavanjem pH na 4,5 glacijalnom sirćetnom kiselinom.

Reakciona smesa je razblažena 50 puta vodom, propuštena kroz 0,2u liker i nanesena na Amicon kolonu pakovanu sa 100 ml (3,2x13 cm) Fractogel-a EMD CM 650(S), pri protoku od 20 ml/min. Kolona je prethodno ekvilibrisana 10 mM amonijum-acetatom, pH 4,5. Fluat sa kolone je praćen merenjem UV apsorbancc na 280 nm. Kolona je zatim ispirana ekvilibracionim puferom sve dok sc UV apsorbanca nije spustila iui osnovnu liniju. PEG-IFN konjugati sa više od jednog reagensa Formule II (PEG-IFN oligomeri) su eluirani 40 mM amonijum-acetatom, pFI 4.5 a konjugat Formule 1 je eluiran 0.12 M NaCl u 40 mM amonijuin-acetatnom puferu. Nemodifikovani IFN koji je preostao u kolonije eluiran 0,5 M NaCl u istom puferu. Kolona je regenerisana ispiranjem 1.0 M NaCl. a zatim ispiranjem ekvilibracionim .puferom Pulovane frakcije konjugata Formule 1 su koncentrovane u Amicon ćeliji za. koncentrovanje sa mešanjem, preko YM10 membrane, do koncentracije od 1 mg/ml.

Katjonska smola Fractogel CM 650(S) korišćena za prečišćavanje je efikasno adsorbovala PEG i nemodifikovani IFN. Jačina adsorpcije je zavisila od stepena PP'Gilacije. Konjugati su se vezivali manje čvrsto od nemodifikovanog lFN-a. PEG-IFN oligomeri su eluirani 40 mM amonijum acetatom. dok je konjugat Formule I eluiran 0,12 M NaCl. Nemodifikovani IFN je eluiran 0,5 M NaCl. Sve preparacije su sadržale <5EU/mg endotoksina. Finalna preparacija je sadržala >99% konjugata Formule 1 i nije sadržala nemodifikovani IFN.

B. LARGE-SCALE priprema konjugata Formule I

Šest hiljada dvesto četrdeset miligrama (156 umol) reagensa Formule II (prosečne molekulske težine od 40 000 daltona) je rastvoreno u 63 ml lmM HCL na 4°C i brzo dodato u 125 ml rastvora koji sadrži 1000 mg (52 umol) interferona u 50 mM boratnom puferu, pH 9,0.

Finalni odnos protein/reagens je bio 1:3. a finalna proteinska koncentracija reakcione smese 5.3 mg/ml. Reakciona smesa je mešana 2 sata na 4<*>C. Reakcija je zaustavljena podešavanjem pH na 4.5 pomoću glacijalne sirćetne kiseline.

Reakciona smesa je razblažena 10 puta vodom i nanesena na kolonu pakovanu sa 600 ml Fractogel-a EMD CM 650(M), prethodno ekvilibrisanu 20 mM natrijum-acetatom, pll 4,5. pri linearnoj brzini od 1,3 cm/min. Kolona je ispirana ekvilibracionim puferom, a zatim 10 mM NaCl da bi se uklonili višak reagensa. nusprodukti reakcije i PEG-IFN oligomeri. Konjugat Formule I je eluiran ekvilibracionim puferom sa 200 mM NaCl. Nemodifikovani interferon jos uvek adsorbovan na koloni je uklonjen ispiranjem 0,75 M NaCl u ekvilibracionom puferu. Konjugat Formule I, eluiran pri vrednosti od 0,3-0,5 mg/ml je dalje koncenirovan i propušten kroz. dijafilter u finalni fonnulacioni pufer - 20 mM natrijum-acetat. pll 5.0. koji je sadržao 150 mM NaCl. Ukupan prinos konjugata Formule I je bio 40-45%

Prečišćeni PEG-IFN iz LARGE-SCAEE preparacijc se sastoji >99% od konjugata Formule 1. Prosečna molekulska težina konjugata Formule I iz. ovog primera je 62 000 daltona. uključujući molekulsku težinu IFNaža koja iznosi 19 241 daltona. i prosečnu molekulsku težinu reagensa koja je izmedju 40 000 i 45 000 daltona, oko 43 000 daltona.

Primer 2

Karaktcrizaci ja konjugata Formule I

Odredjivanje proteina

Koncentracija proteina je odredjivana pomoću A280vrednosti KO za 1 mg/ml rastvor IFNa a2a.

SDS-PAGE analiza

Konjugat je analiziran natrij um dodecil (lauril) sulfat/poliakrilamidnom (8-16%) gel elektroforezom. pod redukujućim uslovima, prema metodi Laemmli-ja (Nature 227;

680 (1970)). SDS-PAGE sa PEG-konjugatima je bojena proteinskom bojom Fast Siain (Zoion Research. Inc.) prema uputstvu za upotrebu proizvodjača.

Gdredjivanje nivoa endotoksina

Nivo endotoksina je odredjen LAL metodom, prema proizvođjačevom uputstvu za upotrebu. Sve preparacije su sadržale <5 EU/mg endotoksina.

P rimer 3

//;1' Urobi oaktivnost konju gata Formule I

Antiviralna aktivnost u govedjim bubrežnim ćelijama

//; viiroantiviralna aktivnost lFNa2a i konjugata Formule 1 pripremljenog kao u Primerti l.A. su odredjene u testu u ćelijskoj kulturi, gde su korišćene Madin-Darbv govedje (MDBK) bubrežne ćelije inficirane virusom vezikularnog stomatitisa (Rubinstein i sar.. supra). Vrednosti antiviralne aktivnosti su navedene u kabeli 1. zajedno sa njihovim odgovarajućim rezidualnim aktivnostima kao procenat početnog

IFN.

In vi troantiproliferativna aktivnost u humanim tumorskim ćelijama

In vitroantiproliferativna aktivnost je testirana na humanim Daudi (Burkitt-ov limfom) ćelijama, kao što su opisali Borden i sar. Humane Daudi ćelije su čuvane kao stacionarne suspenzione kulture u RPMI 1540 obogaćenom 10% fetalnim govedjim serumom i 2 mM glutaminom (Grand Island Biologicals. Grand Island, NY). Izvršen je skrining ćelija na mikoplazmu i ustanovljeno je njeno odsustvo. Ćelije (2 x IO<4>) su dodate u bunarčiće na mikrotitar pločama (Costar, MA) u 100 ul medijuma. Različite koncentracije lFN-a i konjugata Formule 1 pripremljenog kao u Primeru l.A. su dodate u bunarčiće u zapremini od 100 ul. Ploče su inkubirane 72 sata na 37"C u 5% C(K Pomoću pulsa električne struje ćelije su tretirane sa 0.25 uCi/bunarčić 4-1-limidinom (Ne\v Fngland nuelear, Boston, MA), šesnaest časova prc žetve ćelija. Ćelije su prikupljene na staklenim filtrima i izrnerene u tečnom scintilacionom brojaču Rezultati su izraženi kao % inhibicije izračunat pomoću formule:

% inhibicije"[ (A-IVAj x 100.

gde:

.A - cpm li kontrolnoj kulturi (ćelije inkubirane samo u medijumu)

B - cpm u eksperimentalnoj kulturi

Uzorci su bili analizirani u kvadriplikatu i standardna devijacija je bila manja od 20% srednje vrednosti svih slučajeva. Eksperimenti su radjeni barem dvaput sa uporedivim rezultatima.

Antiproliferativne aktivnosti (IC50) lFN-a i konjugata su navedene u Tabeli 2. Rezultati pokazuju da postoji povećanje antiproliferativne aktivnosti od 28 puta za konjugat Formule I u poredjenju sa onim kod IFN-a.

P rimer 4

1 armakokinetika

Ženski Sprague-Davvlev pacovi, sa hirurški uvedenom jugtilarnom kanilom. sa prosečnom iclesnom težinom od 240-260 g. sa zasebnim boravkom, imali su slobodan pristup hrani i vodi i živeli su u 1 2-satnom ciklusu svetla i mraka. U okviru 4-6 sati od dolaska, jugularne kanile su isprane PBS-om. Slcdećeg dana. nakon ispiranja sa 0,1 5-0,2 ml PBS-a, ubrizgano je 2x 10P jedinica IFNa u 0.2-0.4 ml PBS-a. što je praćeno ubrizgavanjem 0,15-0.2 ml PBS-a da bi se osiguralo daje kompletna količina leka unesena u životinju. Tako je je svaka životinja primila dozu od 8x10" IFNu jedinica/kg telesne težine.

Uzorci krvi su uzimani nakon 5. 15 i 30 minuta, kao i i. 3. 5, 12 i 24 sata nakon ubrizgavanja IFN-a i konjugata Formule F Na svim vremenskimlačkania. nakon odstranjivanja prvih 0.15 - 0.2 ml krvi. uziman je alikvot od 0.5 ml krvi pomoću nove igle kroz jugtilarnu kaniiu. Uzorci su prebačeni u epruvete za odvajanje seruma na sobnoj temperaturi. Kada su svi uzorci za vremenske tačke sakupljeni, epruvete su centrifugirane na 14 000 x g u hladjenoj Fppendorf centrifugi 10 minula. Odv ojeni serum je prebačen u 1,5 ml plastične epruvete za mikrofugu i zamrznut na - 80%'. do upotrebe u biološkom testu. Uzorci seruma su razblaženi na odgovarajući način i odredjena im je antiviralna aktivnost za svaku vremensku tačkti na već opisani način. Sa grafikona vremena nasuprot aktivnosti, odredjeni su terminalni polu-život konjugata Formule 1 i IFNa, koji su navedeni u Tabeli 3, i koji takodje uključuju vremena boravka u plazmi.

Primer 5

Imunogenost

Normalnim BDF-i miševima (po deset u grupi) su intraperitonealno jedamput dnevno pet puta nedeljno ubrizgavane različite preparacije interferona sa 300 000 jedinica antiviralne aktivnosti. Nekim miševima je takodje ubrizgan agregirani oblik lFNu2a. koji je veći imunogen od monomernog oblika. Uzorci krvi su uzimani 19 dana nakon poslednjeg ubrizgavanja i serum je ispitivan na neutralizujuća antitcla.

Kao što se vidi iz Tabele 4. miševi kojima je ubrizgan lFNu2a su stvorili neutralizujuća antitela i ovaj odgovor je bio znatno povećan kod miševa sa ubrizganim mterferonskim agregatima. Kod većine životinja sa ubrizganim konjugatom iz ovog pronalaska nisu detektovana antitela.

Primer 6

Antit umorska aktivnost In Vivo

In vivoantitumorska aktivnost konjugata Formule l (PEG2-IFNalfa2a) i nemodifikovanog PEG2-IFNa!fa2a su vrednovane putem odredjivanja njihove sposobnosti smanjivanja veličine različitih humanih tumorskih ćelija subkutano usadjenih kod miša. Rezultati su prikazani na Slikama 1-6.

Postupak: Atimični bezdlaki miševi (Harlan) su primili implant od 2 x 10<s>humanih renalnih A498 ćelija ispod leve zadnje slabine (Slike 1 i 2). humane renalne ACHN ćelije (Slike 3 i 4) ili humane renalne G402 ćelije (Slike 5 i 6). 3 do 6 nedelja je ostavljeno za uspostavljanje tumora, kao što je naznačeno. Kriterijum veličine za pnbvaćenost u okvir studije je bilo 0,05 do 0,5 kubnih centimetara. Miševima su davane ukupne ncdeljne doze PEG2-lFNalfa'2a ili nemodifikovanog !FNalfa2a od 30. 60. i 20 ili 300 u<g.>U slučaju PEG2-IFNalfa2a miševi su tretirani jedampt.it nedeljnolponedeljkom) sa 30. 60, 120 i 300 ug PEG2-lFNalfa2a po tretmanu. 1. slučaju nemodifikovanog IFNalfa2a miševi su bili tretirani tri puta nedeljno (ponedeljkom. sredom i petkom) sa 10. 20. 40 ili sa 100 ug lFNalfa2apo tretmanu. Trajanje tretmana je bilo 4 do 5 nedelja u zavisnosti od agresivnosti tumora. Zapremine tumora su mercne svakog ponedeljka pre tretmana.

Rezultati: PEG2-1 FNalfa2a je pokazao značajno smanjenje veličine A498 tumora u poredjenju sa nemodilikovanim !FNalfa2a za sve nivoe testiranih nedeljnih doza. sedmog, četrnaestog, dvadeset prvog i dvadeset osmog dana nakon početka tretmana (Slike 1 i 2). Tretman se nastavljao četiri nedelje. Sedam dana nakon prekida tretmana po tri miša iz svake grupe su bila žrtvovana. Kod tri misa tretirana sa PEG2-IINal<f>a2a nisu primećeni bilo kakvi ostaci tumora. Kod miševa tretiranih nemodilikovanim IINali'a2a težine A498 tumora su bile 1.28 g, 0.62 g i 1,60 g redom kod svakog od tri miša. Težine A498 tumora kod tri kontrolna miša su bile 2.32 g. 3.37 g. i 1.94 g. Nakon 80 dana od završetka četvoronedeljnog tretmana postojanje tumora je odredjivano palpacijom kod sedam miševa. Kod svih sedam miševa palpacijom je utvrdjeno odsustvo tumorskog tkiva.

PEG2-IFNalfa2a je pokazao značajno smanjenje u veličini ACHN tumora u poredjenju sa nemodifikovanim IFNalfa2a za nedeljne doze od 60, 120 i 300 ug, na 14 dana. 21 dan, 28 dana i 35 dana (Slike 3 i 4).

PEG2-IFNaifa2a je pokazao značajno smanjenje u veličini G402 tumora u poredjenju sa nemodifikovanim IFNalfa2a za nedeljne doze od 60 i 120 ug, na 14 dana, 21 dan, 28 dana i 35 dana (Slike 5 i 6).

Claims (14)

1. PATENTNI ZAHTEVI: 1. Fiziološki aktivni pegilovani konjugat interferona a formule gde R i R" svaki za sebe predstavljaju Ci.ćalkil; X je NH ili O i gde n i n' zbirno iznose od 600 do 1500; i gde prosečna molekulska težina lanca polietilenglikola u pomenutom konjugatu iznosi od 26000 do 66000 daltona.
2. 2. Konjugat iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što molekulska težina za jedinice polietilen glikola u pomenutom konjugatu iznosi od 35000 do 45000 daltona.
3. 3. Konjugat iz patentnog zahteva 2, naznačen time, što molekulska težina za jedinice polietilenglikola iznosi 40000 daltona.
4. 4. Konjugat iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što R i R' predstavljaju metil.
5. 5. Konjugat iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što X preedstavlja NH.
6. 6. Konjugat iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što je interferon a predstavlja interferon o.2a.
7. 7. Konjugat iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što zbir n. i m iznosi izmedju 850 i 1000 daltona.
8. S. Konjugat iz patentnog zahteva 1. naznačen time. što u njemu R i R" predstav ljaju metil; X je NH: interferon a je interferon a2a. i gde jedan ili oha n ; n' iznose 420.
9. 9 Konjugat i/patentnog zahteva 1. naznačen time. što R i R' predstavljaju metil: X je NH; interferon o je interferon ct2a: i gde jedan ili oba n i t<f>iznose 520
10. 10. Konjugat iz patentnog zahteva 1. naznačen time. što ima veću antiproliferativnu aktivnost u odnosu na interferon a i manju virusnu aktivnost u odnosu na interferon a.
11. 1 1. Postupak za proizvodnju pegilovanog interferona a sa pojačanim antiproliterativnim dejstvom i slabijom antivirusnim dejstvom u poredjenju sa interferonom a. gde se pomenuti postupak sastoji od kovalentnog vezivanja reagensa formule II

    gde su R. R\ n i n' defmisani u patentnom zahtevu 1, za interferon a da bi se dobio pegilovani konjugat interferona a.
12. 1 2. Farmaceutske kompozicije koja obuhvataju pegilovani konjugat interferona u kako je traženo prema bilo kojem patentnom zahtevu od 1 do 10 i terapeutski interni nosač.
13. 1 3. Farmaceutske kompozicije za lečenje ili profilaksu imunomodulatornih poremećaja kao što su neoplazme ili infektivna oboljenja, koje sadrže pegilovani konjugat interferona a kako je traženo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-10 i farmaceutski inertni nosač.
14. 14. Upotreba pegilovanog konjugata interferona a prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-10 za proizvodnju lekova za upotrebu u lečenju ili profilakse oboljenja.