RS20080388A - Lečenje malignih bolesti - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na lipozome koji obuhvataju inkapsulirani oksaliplatin i postupke za proizvodnju inkapsuliranog oksaliplatina. Pronalazak se, isto tako, odnosi na lipozome koji obuhvataju oksaliplatin i druge antikancerske lekove. Lipozomi pronalaska mogu se koristiti u tretmanima kancera.

Description

lećenjŽmali<g>nih bolesti

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na lipozom koji sadrži inkapsulirani oksaliplatin i na postupke za izradu inkapsuliranog oksaliplatina. Oksaliplatinski lipozom može biti korišćen za uništavanje kancerskih ćelija u raznim malignim bolestima čoveka i životinje. Pronalazak se, takođe, odnosi na lipozome, koji sadrže oksaliplatin i drugi antikancerski lek.

Stanje tehnike

Imunoterapija, vakcine, inhibitori angiogeneze, inhibitori telomeraze, izazivači apoptoze, terapije signalnom transdukciom, genska terapija i brojne ciljane terapije za kancer obećavajući su arsenali u borbi protiv malignih bolesti, ali nije prikazana njihova delotvornost u kliničkim okvirima. Istraživanje kancera prolazi opsežna ulaganja; ipak, petogodišnje relativno preživljavanje od četiri glavna kancera (dojke, pluća, kolorektalni kancer i kancer prostate) nije mnogo izmenjeno u poslednjih 25 godina. Heterogeničnost tumora u okviru iste individue delimično je odgovorna za neuspeh ciljanih terapija (Miklos, 2005). Zbog toga, klasična hemioterapija i hormonske teapije (za kancere dojke i prostate) zajedno sa zračenjem i hirurškom intervencijom, ostaju glavna terapijska uporišta za ogromnu većinu pacijenata sa malignim bolestima.

Međutim, unapređenje u odstranjivanju i ciljanju tumora sa već postojećim hemioterapeutskim lekovima, korišćenjem nanotehnologije, obezbeđuje alternativni tretman. Oksaliplatin je antineoplastični agens sa molekulskom formulom CgHi4N204Pt i hemijskim nazivom cis-[( 1 R,2R)-1,2-cikloheksandiamin-N,N] [oksalato(2-)-0,0]platina. Njegova hemijska struktura je prikazana ispod.

Struktura oksaliplatina

Korišćenje oksaliplatina u terapiji raka unapredilo je pristup kanceru, posebno kolorektalnom kanceru. Uspešnost oksaliplatina leži u njegovoj sposobnosti da indukuje oštećenje DNK, što dovodi do masivnih privlačenja, kao i unakrsnih veza kako unutar-tako i između-vlakana (Takahara et al, 1995), ali isto tako i u njegovoj sposobnosti da izazove apoptozu (Boulikas i Vougiouka, 2003). Atom platine u oksaliplatinu obrazuje 1,2-intravlaknaste unakrsne veze između dva susedna ostatka gvanozina, savijajući dvostruki heliks za približno 30 stepeni u odnosu na glavni žleb. Oksaliplatin ima diaminocikloheksanski (DACH) ligandni nosač, koji nije moguće hidrolizo vati i, koji je sačuvan u finalnim citotoksičnim metabolitima leka. Njegova reakcija sa DNK i drugim makromolekulima odvija se putem hidrolize jedne ili obe karboksilestarske grupe oksalata, koje napuštaju monoprivlačnu vezu DACH platine ili bifunkcionalnu unakrsnu vezu DACH-platina. Izgleda da unutrašnje hemijske i sterične karakteristike privlačenja DACH-platina doprinose pomanjkanju unakrsne otpornosti sa cisplatinom (prikazano u Di Francesco et al, 2002). Alkalna hidroliza oksaliplatina daje oksalato monodentatni kompleks (pKa 7.23) i dihidratizovani kompleks oksaliplatina u dva uzastopna koraka. Smatra se da monodentatni intermedijer brzo reaguje sa endogenim jedinjenjima (Jerremalm et al, 2003). Prikazane su kristalne strukture oksaliplatina, vezane za DNK dodekamerni dupleks sa sekvencom 5'-d(CCTCTGGTCTCC); atom platine formira 1,2-intravlaknastu unakrsnu vezu između dva susedna ostatka gvanozina, savijajući dvostruki heliks za približno 30 stepeni u odnosu na glavno udubljenje. Kristalografijom je dobijena strukturna potvrda važnosti hiralnosti prilikom posredovanja u interakciji između oksaliplatina i dupleksa DNK (Springler et al, 2001).

Međutim, uprkos njegovim prednostima, upotreba oksaliplatina je povezana sa jedinstvenim modelom sporednih nepoželjnih efekata, koji uključuju neurotoksičnost, hematološku toksičnost i toksičnost prema gastrointestinalnom traktu. Za pacijente postoji značajan rizik od neutropenije stepena 3/4. Mučnina i povraćanje su uglavnom blagi do umereni. Nefrotoksičnost je blaga i omogućuje primenu oksaliplatina bez hidratacije. Ponekad se mogu zapaziti ozbiljni sporedni nepoželjni efekti, kao što je tubularna nekroza.

Dalje, zapažena je ćelijska rezistencija na slobodni oksaliplatin, koja sprečava potencijalnu efikasnost slobodnog oksaliplatina. Rezistencija se razvija klonalnom ekspanzijom tumorske ćelije, koja ima prednost i koja može da raste u prisustvu oksaliplatina. Pretpostavlja se da postoji nekoliko mehanizama, koji objašnjavaju razvijanje rezistencije na oksaliplatin u tumorima pacijenata: 1. Rezistentne ćelije su razvile mehanizam za ograničavanje transporta oksaliplatina kroz njihovu ćelijsku membranu, ograničavajući tako nivoe leka unutar ćelija. Ovo je najvažniji mehanizam, kojim tumorske ćelije stiču otpornost na oksaliplatin. Lipozomalna inkapsulacija oksaliplatina, koja je ovde opisana, zaobilazi ovaj mehanizam rezistencije na oksaliplatin, zbog fuzogenog lipida DPPG u lipozomalnoj formulaciji inkapsuliranog oksaliplatina i zbog nanočestične veličine leka (prosečno 100 nm), koju tumor, u poređenju sa normalnim ćelijama, brzo fagocituje. 2. Rezistentne ćelije imaju više nivoe glutationa, metalotioneina ili drugih jedinjenja, koja detoksikuju oksaliplatin. 3. Rezistentne ćelije su razvile brže zaceljivanje lezija DNK nakon oksaliplatinskog oštećenja. 4. Pretpostavlja se da su drugi mehanizmi rezistencije povezani sa signalizacijom mitohondrijalnih ili nuklearnih puteva apoptoze, koji su odgovorni za rešenost oštećene ćelije da se podvrgne apoptozi ili da popravi oštećenje; odluka o popravci oštećenja je ona koja će dovesti do akumulacije mutacija na nivou DNK, koje će, dalje, izmeniti fenotip tumorskog klona (hromozomski prekidi koji će dovesti do translokacija i drugih hromozomskih aberacija).

Iz tih razloga, glavni izazov jeste razvijanje alternativnih pristupa, koji pokazuju manju toksičnost i veću delotvornost, u odnosu na primenu oksaliplatina kao slobodnog leka. Razvoj takvih alternativa mogao bi resiti nekolicinu problema u terapiji kancera.

Lipozomi su mikroskopske vezikule, izgrađene od fosfolipidnog dvostrukog sloja, koji mogu inkapsulirati aktivne lekove Lipozomalni lekovi su obećavajuća nanosredstva za oslobađanje leka. Pokazalo se da lipozomalno inkapsulirani cisplatin (koji prodaje Regulon Inc., Mountain View, CA, US 6,511,676 kao TM Lipoplatin®) smanjuje nefrotoksičnost i neurotoksičnost cisplatina, dok ciljano deluje na tumore nakon sistemskog oslobađanja kod pacijenata.

Oksaliplatin je lek, čiji se spektar aktivnosti, mehanizmi dejstva i rezistencija razlikuju od istih svojstava cisplatina. Oksaliplatinske lezije privlačenja su ispravljene sistemom popravke nukleotidne ekscizije. Oksaliplatin je detoksikovan enzimima povezanim sa glutationom (GSH). ERCC1 i XPA ekspresije su pretpostavke senzitivnosti oksaliplatina in vitro u šest kolona ćelijskih nizova (Arnould et al, 2003). Pokazano je da oksaliplatin ima bolju efikasnost od cisplatina prema kolorektalnim kancerima.

Cisplatin i oksaliplatin imaju suštinske strukturne razlike, koje dovode do različitih sporednih efekata u toku hemioterapije.

Struktura cisplatina

Na primer, sporedni nepoželjni efekti cisplatina su: nefrotoksičnost, periferna neuropatija, ototoksičnost i ozbiljna gastrointesinalna toksičnost.

(za reference, vidi McKeage MJ: Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf 13: 228-44, 1995, Hanigan MH i Devarajan P: Cisplatin nephrotoxicity: molecular mechanisms. Cancer Ther 1, 47-61, 2003).

Postoji potreba za smanjivanjem poteškoća tokom primene oksaliplatina, kako bi se redukovala visoka toksičnost slobodnog oksaliplatina, kada se koristi u terapiji, kao i potreba za ciljanim dejstvom na tumore i za obezbeđivanjem efikasnog lečenja pacijenata, koji imaju tumore, rezistentne na hemioterapiju.

Dalje, kao različiti lekovi, izgleda da imaju bolju efikasnost u borbi protiv različitih kancerskih ćelija i s obzirom na poziciju, i stepen i anatomiju maligniteta postoji potreba da budu sposobni i primenjivi simultano na način, koji je delotvorniji od primene jednog leka ili gena u kombinovanoj terapiji.

Cilj ovog pronalaska jeste rešavanje ili barem ublažavanje ovih poteškoća, putem inkapsuliranja oksaliplatina i, u drugom aspektu, oksaliplatina i drugog antikancerskog leka u lipozom. Na ovaj način se povećava efikasnost leka.

Izlaganje suštine pronalaska

Ovaj pronalazak obezbeđuje lipozome, koji sadrže inkapsulirani oksaliplatin i imaju različitu smešu lipida u svojoj spoljašnjoj i unutrašnjoj membrani, i postupke za izradu takvih lipozoma. Lipozomi sadrže lipidni molekul sa negativno nabijenom (anjonskom) glavnom grupom. Pronalazak, takođe, obezbeđuje lipozome, u kojima je inkapsuliran oksaliplatin i drugi lek, i postupke za izradu takvih lipozoma. Dalje, data je upotreba takvih lipozoma u tretmanu malignih bolesti.

U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za oblikovanje micele, koja sadrži oksaliplatin, postupak koji obuhvata sjedinjavanje efektivne količine oksaliplatina i negativno nabijenog fosfatidil glicerol lipida sa rastvaračem.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, koji uključuje sjedinjavanje oksaliplatinske micele, u skladu sa pronalaskom, sa prethodno formiranim lipozomom ili lipidima.

U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, koji obuhvata sledeće korake: a) oblikovanje micele, koja sadrži oksaliplatin, sjedinjavanjem efektivne količine oksaliplatina i negativno nabijenog fosfatidil glicerolskog lipida sa rastvaračem i b) spajanje navedene oksaliplatinske micele sa prethodno obrazovanim lipozomom ili lipidima.

U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na micelu, koja sadrži efektivnu količinu oksaliplatina i negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipid.

U petom aspektu, pronalazak se odnosi na lipozom, koji sadrži efektivnu količinu oksaliplatina, pri čemu unutrašnji i spoljašnji sloj lipozoma sadrži različite lipide. Drugi aspekti pronalaska odnose se na upotrebu lipozoma u tretmanu malignih bolesti i na postupak za lečenje malignih bolesti primenom lipozoma.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na lipozom, koji sadrži efektivnu količinu oksaliplatina i drugi antikancerski lek.

U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na lipozom, koji sadrži efektivnu količinu oksaliplatina i antikancerski gen.

Pronalazak, takođe, obezbeđuje režim primene farmaceutskih formulacija pronalaska, t.j. lipozoma.

U daljem srodnom aspektu, pronalazak se odnosi na kombinovanu terapiju, koja uključuje primenu efektivne količine gemcitabina i lipozoma, koji inkapsulira efektivnu količinu cisplatina. Takođe je data upotreba lipozoma, koji ima inkapsulirani cisplatin, u izradi leka za lečenje humanih pacijenata, koji pate od kancera, kao i postupak za lečenje maligne bolesti, kombinovanom terapijom, koja uključuje primenu navedenog lipozoma i gemcitabina.

Detaljanopis

Ovaj pronalazak će, sada, biti dalje opisan. U odlomcima, koji slede, detaljnije su definisani različiti aspekti pronalaska. Svaki, tako defmisan, aspekt može biti povezan sa bilo kojim drugim aspektom ili aspektima, ukoliko nije jasno naznačeno drugačije. Posebno, bilo koja karakteristika, koja je označena kao poželjna ili povoljna, može biti povezana sa bilo kojom drugom karakteristikom ili karakteristikama, za koje je navedeno da su poželjne ili korisne.

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak inkapsuliranja oksaliplatina u lipozome, koji imaju u svojoj unutrašnjoj membrani lipidnu smešu, koja se razlikuje od one u spoljašnjoj membrani dvostrukog sloja.

U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak obrazovanja micele, koja sadrži oksaliplatin, postupak koji obuhvata sjedinjavanje efektivne količine oksaliplatina i negativno nabijenog lipida sa rastvorom rastvarača. Lipid je karakterisan time što sadrži negativno nabijenu (anjonsku) glavnu grupu. Poželjno, lipid je fosfatidil glicerol lipid.

Poželjno, rastvarač je etanol. Međutim, i drugi rastvarači, koji su poznati stručnom licu, kao što je ugljovodonični rastvarač, isto tako mogu biti korišćeni. Drugi pogodan rastvarač može biti metanol.

Kao što je ovde korišćen, izraz oksaliplatin se odnosi na oksaliplatin i na bilo koje analoge ili derivate oksaliplatina. Lipozomski inkapsuliran oksaliplatin pronalaska ovde je, takođe, naveden pod svojim komercijalnim imenom LIPOXAL®.

Izraz negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipid, u skladu sa pronalaskom, odnosi se na negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipid ili njihov derivat. Ovi lipidi su karakterisani time što sadrže negativno nabijenu (anjonsku) glavnu grupu. Stoga je izraz korišćen da bi opisao bilo koji lipid, koji ima sposobnost da obrazuje micele i koji ima mrežu negativno nabijene glavne grupe. Negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipid, u skladu sa različitim aspektima pronalaska, može biti odabran od: dipalmitoil fosfatidil glicerola (DPPG), dimiristol fosfatidil glicerola (DMPG), diaproil fosfatidil glicerola (DCPG), distearoil fosfatidil glicerola (DSPG) ili dioleil fosfatidil glicerola (DOPG). U poželjnom ostvarenju, negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipid je DPPG.

Rastvor etanola, u skladu sa pronalaskom, poželjno je 20 do 40%-tni, poželjno otprilike 30%-tni etanol. Molarni odnos oksaliplatina prema negativno nabijenom fosfatidil glicerol lipiduje u rasponu od 1:1 do 1:2. Poželjno, odnos je 1:1.

Tako, u skladu sa jednim ostvarenjem prvog aspekta pronalaska, oksaliplatin je pomešan sa DPPG, u molarnom odnosu 1:1 do 1:2 u 20-40% etanolu, u prisustvu pufera, kao što je amonijum sulfat (10-200 mM), ili Tris-pufer (10-100 mM), ili natrijum fosfatni pufer (10-200 mM) na pH 6.5-8.0, da bi se postigla konačna koncentracija oksaliplatina od oko 5 mg/ml. Smeša je zagrevana na 30-60 stepeni Celzijusa i inkubirana tokom 20 minuta do 3 h. Pod ovim uslovima, pozitivno nabijene imino grupe na molekulu oksaliplatina su dovedene u interakciju sa negativno nabijenim grupama na molekulu DPPG, obrazujući reverzne micele u etanolnim rastvorima.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, koji uključuje sjedinjavanje oksaliplatinske micele, u skladu sa pronalaskom, sa prethodno formiranim lipozomom ili lipidima.

U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, koji obuhvata sledeće korake: c) obrazovanje micele, koja sadrži oksaliplatin, sjedinjavanjem efektivne količine oksaliplatina i negativno nabijenog fosfatidil glicerol lipida sa rastvaračem i d) spajanje navedene oksaliplatinske micele sa prethodno obrazovanim lipozomom ili lipidima.

U jednom ostvarenju postupaka, micela je pomešana sa prethodno formiranim lipozomom.

Prethodno formirani lipozom ili lipidi su korišćeni u postupcima pronalaska i zbog toga, lipozom pronalaska može sadržavati negativno i/ili pozitivno nabijene lipide, kao što su fosfolipidi. Mnogi fosfolipidi mogu biti korišćeni u ovom pronalasku. Na primer, fosfatidilholini, fosfatidiletanolamini, distearoilfosfatidil-etanolamin, fosfatidilserini, fosfatidilinozitoli, lizofosfatidilholini, fosfatidilgliceroli, sfingomijelini ili fosfatidna kiselina mogu naći upotrebu u ovom pronalasku. Takođe, mogu biti korišćeni ceramid ili drugi lipidni derivati. Da bi se modifikovala stabilnost ili permeabilnost lipidne membrane, mogu se dodati dodatne lipofilne komponente, kao što su, primera radi, holesterol ili drugi steroid, stearilamin, fosfatidna kiselina, dicetil fosfat, tokoferol ili ekstrakti lanolina.

Lipidi mogu biti odabrani, ali bez ograničenja, od: DDAB, dimetildioktadecil amonijum bromida; DMRIE: N-[l -(2,3-dimiristiloksi)propil]-N,N-dimetil-N-(2-hidroksietil) amonijum bromida; DMTAP: l,2-dimiristoil-3-trimetilamonijum propana; DOGS: dioktadecilamidoglicilspermina; DOTAP: N-(l-(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorida; DOTMA: N-[l-(2,3-dioleiloksi)propil]-n,n,n-trimetilamonijum hlorida; DPTAP: l,2-dipalmitoil-3-trimetilamonijum propana; DSTAP: l,2-disteroiI-3-trimetilamonijum propana.

U jednom ostvarenju pronalaska, oksaliplatin lipozomi sadrže DPPG, holesterol i HSPC (hidrogenizovani soja fosfatidil holin). Svrha navedene inkapsulacije je da smanji nepoželjne sporedne reakcije citotoksičnih agenasa, bez smanjivanja efikasnosti.

Lipozomalni preparat pronalaska može, takođe, sadržavati amonijumovu so, kao što je amonijum hlorid, amonijum sulfat ili bilo koja druga amonijumova so.

Negativno nabijeni fosfatidil glicerol lipidi, u skladu sa pronalaskom, koji su korišćeni za obrazovanje micele i koji su deo membrane lipozoma, obezbeđuju prednost time što pojačavaju permeabilnost ćelijske membrane za oslobađanje leka u citozol. Lipozom se tako, može spojiti sa membranom ćelije i osloboditi svoje sadržaje u unutrašnjost ćelije. Ove osobine su nazvane fuzogenim. Zbog toga, zbog ovih fuzogenih karakteristika i fagocitnog mehanizma, lipozomalne formulacije oksaliplatina, u skladu sa pronalaskom, u stanju su da prolaze kroz ćelijsku membranu tumorske ćelije i i tako, nađu primenu u lečenju tumora, koji su rezistentni na oksaliplatin ili tumora rezistentnih na lekove.

U skladu sa drugim ostvarenjem, stvaranje kompleksa u navedenom lipozomu oksaliplatina sa negativno nabijenim fosfatidil glicerol lipidima dovodi do veoma visoke (50-100%) efikasnosti inkapsulacije, uz minimiziranje gubitka leka tokom izrade proizvoda.

Postupak za inkapsulaciju, u skladu sa pronalaskom, baziranje na obrazovanju reverznih micela između oksaliplatina i negativno nabijenih molekula lipida, kao što je, ovde, opisano. Reverzne micele se drže elektrostatskom interakcijom između pozitivno nabijenih amino grupa oksaliplatina i negativno nabijenih fosfatnih grupa fosfatidil glicerol lipida, na primer DPPG, i usmeravaju njihove hidrofobne lance fosfatidil glicerol lipida prema etanolnom rastvoru, obuhvatajući tako, molekule oksaliplatina. Reverzne micele oksaliplatin-fosfatidil glicerol lipida se konvertuju u lipozome njihovim mešanjem sa prethodno izrađenim lipozomima ili lipidima, nakon ovog može slediti dijaliza i ekstruzija kroz membrane, kako bi se uklonio etanol, ili razblaživanje sa vodom, ekstruzija kroz filtre, sa ili bez koncentrisanja filtracijom pod visokim pritiskom. Ovo dovodi do hvatanja i inkapsuliranja oksaliplatina u veoma visokom prinosu. Lipidna smeša lipozoma, tokom postupka izrade određuje u velikoj meri, lipidnu smešu spoljašnje površine nanočestice.

U jednom ostvarenju različitih aspekata pronalaska, može se dodati omotač, koji omogućava lipozomu pronalaska da izbegne nadzor imunog sistema. Poželjno, omotač je polimer. Omotač može biti dodat u stadijumu lipozoma ili post-inserciono na oformljeno nanosredstvo. Zato, lipozomi pronalaska mogu sadržavati takav omotač. Polimeri, koji mogu biti korišćeni, u skladu sa pronalaskom, obuhvataju: polietilen glikol (PEG), polimetiletilen glikol, polihidroksipropilen glikol, polipropilen glikol, polimetilpropilen glikol, polihidroksipropilen oksid, polioksialkilene, polietaramine. Dodatni polimeri uključuju: polivinilpirolidon, polivinilmetiletar, polimetiloksazolin, polietiloksazolin, polihidroksipropiloksazolin, polihidroksipropilmetakrilamid, polimetakrilamid, polidimetilakrilamid, polihidroksipropilmetakrilat, polihidroksietilakrilat, hidroksimetilcelulozu, hidroksietilcelulozu, polietilenglikol i poliaspartamid, hijaluronsku kiselinu. Poželjni polimer je PEG. Na primer, distearoilfosfatidiletanolamin se može derivatizovati sa PEG-om, da bi se dobio PEG-derivatizovani distearoilfosfatidiletanolamin (PEG-DSPE). Polimeri mogu biti upotrebljeni kao homopolimeri ili kao blok ili nasumični kopolimeri.

Lipozomalna oksaliplatinska nanosredstva, izložena u ovom pronalasku, mogu izbeći nadzor imunog sistema zbog polimernog omotača, mogu cirkulisati tokom produženih perioda u telesnim tečnostima, mogu se preraspodeliti iz tkivnih pulova u tumore i mogu se koncentrisati prevashodno u solidnim tumorima i metastazama nakon intravenske injekcije životinjama i ljudima, izlivanjem kroz ugrožene krvne sudove, koji imaju nedostatke u svom endotelu, tokom procesa neoangiogeneze.

Prednost postupka inkapsulacije, koji je opisan u ovom pronalasku, jeste to što će lek u lipozomskom nanosredstvu zauzeti primarne tumore i metastaze, prvenstveno izlivanjem kroz napuklu tumorsku vaskulaturu i tako imati poboljšanu antikancersku aktivnost. Fuzogeni lipid DPPG pojačava fuziju nanočestica sa membranom tumorske ćelije, dok je viši prihvat lipozomalnog oksaliplatina, takođe, povećan podložnošću tumorskih ćelija fagocitozi.

Dalje, ligand može biti konjugovan sa polimernim omotačem lipozoma pronalaska.

Na primer, ligand može biti peptid, primera radi, antitelo. Peptidi mogu biti umetnuti postinserciono, na primer, u vidu peptid-PEG-DSPE konjugata. Peptidi, u skladu sa pronalaskom, uključuju, ali bez ograničenja, one koji su dobijem iz endostatina, antitrombina, anastelina, angiostatina, PEX, pigmentnog faktora, poreklom iz endotela, trombospondina (TSP)-l i -2 primarnih struktura i one, koji su u stanju da izvrše dvostruku antikancersku aktivnost: onu koja se odnosi na ograničavanje tumorske angiogeneze preko, primera radi, 27-aminokiselinskog peptida, koji odgovara NH2-terminalnom domenu endostatina, vezanom na PEG-DSPE (Slika 17) i, takođe, vršeći antitumorsku aktivnost iz oksaliplatinskih molekula, inkapsuliranih u navedeni antiangiogenezni lipozom, koji nosi peptid.

Poželjan peptid je endostatin. Endostatin, 20-kDa C-terminalni proteolitički fragment nekolagenog domena 1 (NO) kolagena XVIII proteina osnovne membrane, inhibira ćelijsku proliferaciju i migraciju i endogeni je inhibitor tumorske angiogeneze i tumorskog rasta. Glavni problem u usklađivanju mnogih, prikazanih in vitro efekata endostatina je manjak receptora visokog afiniteta. Hronična izloženost endostatinu blokira proliferaciju endotelnih ćelija i migraciju i indukuje apoptozu endotelnih ćelija, inhibirajući, na taj način angiogenezu; endostatin je stimulisao akutnu fosforilaciju endotelne sintaze azotnog oksida (eNOS) na Seri 16, Ser617, Ser635 i Seri 179, i defosforilaciju na Thr497 u kultivisanim ćelijama goveđeg endotela aorte, događaja, povezanih sa aktivacijom eNOS-a. U stvari, azotni oksid (NO) podupire angiogenezu. Kratkotrajna izloženost endotelne ćelije endostatinu, međutim, za razliku od dugotrajne izloženosti koja je anti-angiogena, može biti pro-angiogena (Li et al, 2005). 27-aminokiselinski peptid, koji odgovara NH2-terminalnom domenu endostatina, podstakao je njegovu potpunu antiangiogenu aktivnost i imao snažno antitumorsko dejstvo; tri histidina, koji su odgovorni za vezivanje cinka, najhitniji su za antikancerska svojstva peptida (Tjin Tham Sjin et al, 2005, Tjin Tham Sjin RM, Satchi-Fainaro R, Birsner AE, Ramanujam VM, Folkman J, Javaherian K. 27-aminokiselinski sintetski peptid, koji odgovara NH2-terminalnom domenu endostatina za vezivanje cinka, odgovoran je za njegovu antitumorsku aktivnost (Cancer Res. 2005 1. maj; 65(9):3656-63. Li C, Harris MB, Venema VJ, Venema RC. Endostatin indukuje akutni endotelni azot oksid i oslobađanje prostaciklina. Biochem Biophvs Res Commun. 2005 15. april;329(3):873-8).

Peptidni Ugandi se dobijaju izborom peptidnih biblioteka za ligande, koji mogu ući u interakciju, specifično sa epitopima peptida, dobijenim iz tumor-specifičnih antigena, koji su nadekspresovani na površini tumorske ćelije, a što je stručnjacima u prethodnoj oblasti lako izvodljivo. Pričvršćivanje ovih peptida za kraj PEG-a, što je hemijski prikazano na Slici 17, daje liposome sa inkapsuliranim oksaliplatinom, koji su u stanju da se usmere na specifične tumore. Tabela 1 dijagramski oslikava tumorske antigene, iz kojih peptidi, izloženi spoljašnjoj površini ćelije, mogu biti dobijeni, sintetisani i korišćeni za dobijanje peptidnih Uganda iz biblioteka nasumičnih peptida, a koji imaju visoki afinitet za tumorski antigen. Takvi peptidni Ugandi su, zatim kovalentno vezani za molekul lipid-polimer, na primer PEG-DSPE molekul, koji je umetnut na česticu lipozoma.

Ostali Ugandi mogu biti odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: transferin, folna kiselina, hijaluronska kiselina, lanci šećera, kao što je galaktoza ili manoza, monoklonalno antitelo, piridoksal fosfat, vitamin BI2, sialil Lewis X, epidermalni faktor rasta, bazni faktor rasta fibroblasta, faktor rasta vaskularnog endotela, adhezioni molekul vaskularne ćelije (VCAM-1), intracelularni adhezioni molekul (ICAM-1), trombocitni endotelni adhezioni molekul (PECAM-1), peptid Arg-Gly-Asp (RGD) ili peptid Asp-Gly-Arg (NGR) i Fab' fragment monoklonalnog antitela.

U jednom ostvarenju, lipozomalne oksaliplatinske čestice su modifikovane na njihovoj površini sa konjugatima PEG-DSPE-folat, koji se umeću, nakon obrazovanja čestice lipozoma, da bi se čestice usmerile na folatne receptore, koje nadekspresuju tumori. Peptidi, koji su usmereni prema tumorskim antigenima, takođe mogu biti dodati na kraj polimera, na primer PEG-polimera za multifunkcionalizaciju, dajući nanočesticama svojstvo da ciljano deluju na specifične tumore, koji nadekspresuju specifične površinske antigene.

U jednom ostvarenju, čestice lipozomalnog oksaliplatina su, takođe, modifikovane sa folnom kiselinom, koja usmerava oksaliplatinske lipo-nano-čestice ka ovarijalnim (i drugim) malignim ćelijama, koje nadekspresuju folatne receptore.

U drugom ostvarenju, lipozomalne oksaliplatinske čestice su isto tako, modifikovane sa Her2/neu ligandima, koji usmeravaju oksaliplatinske nano-čestice ka malignim ćelijama dojke, koje nadekspresuju Her2/neu.

Lipozomalne formulcije oksaliplatina, u skladu sa pronalaskom, prevazilaze problem rezistencije na slobodni oksaliplatin, izazvan smanjenim preuzimanjem leka u rezistentnim tumorima. Zbog toga, formulacije imaju primenu u lečenju oksaliplatin-rezistentnih tumora. Lipozomalne formulacije oksaliplatina, u skladu sa pronalaskom, takođe pokazuju profil niže toksičnosti u odnosu na oksaliplatin kao slobodan lek (slobodni oksaliplatin) u humanim kliničkim ispitivanjima, prema različitim solidnim malignitetima. Dalje, budući da se spektar sporednih efekata ovih lipozomalnih formulacija oksaliplatina razlikuje od onih kod slobodnog oksaliplatina, a i mehanizam ulaska u tumorske ćelije je takođe različit, lipozomalne formulacije oksaliplatina, u skladu sa pronalaskom, mogu imati prednosti u kliničkoj primeni kod ne-mikrocelularnog raka pluća, raka dojke, raka jajnika, raka glave i vrata, kod metastatskog raka prostate i kod nekolicine drugih solidnih tumora, pored kolorektalnih i želučanih kancera.

U jednom ostvarenju, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin pronalaska može sniziti nivoe bilirubina (Slika 2) ili metastaza na kostima (Slika 3) kod lečenih pacijenata.

U drugom ostvarenju, ovde opisani lipozomalni preparati, mogu biti korišćeni nakon intavenske infuzije, da bi se smanjili sporedni efekti oksaliplatina, posebno gastrointestinalna toksičnost i toksičnost od strane drugih ko-inkapsuliranih lekova.

Lipozomalni preparati, u skladu sa pronalaskom, mogu biti usmereni prevashodno na humane tumore i njihove metastaze.

Tako se, u daljem aspektu, pronalazak odnosi na lipozom, koji sadrži oksaliplatin, kao što je ovde opisano, da bi se koristio kao lek.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu lipozoma, koji ima inkapsulirani oksaliplatin, u proizvodnji leka za lečenje raka.

Pronalazak se, takođe, odnosi na postupak lečenja raka, koji obuhvata primenu pacijentu lipozoma, koji ima inkapsulirani oksaliplatin, u skladu sa pronalaskom.

Mogu se lečiti različiti tipovi raka, uključujući kolorektalni kancer, rak želuca, rak gušterače, rak dojke, ne-mikrocelularni rak pluća, rak jajnika, rak glave i vrata, rak prostate, testikularni, intestinalni, ezofagusni ili urotelijalni kancer. Poželjno, lečenje se odnosi na kolorektalni, želučani ili pankreatični kancer.

Lipozom se primenjuje nedeljno putem intravenske infuzije u dozi od 100 do 350 mg/m<2>. Poželjno, primenjuje se u dozi od 300 mg/m<2>, a druge poželjne doze su 100 mg/m<2>, 150 mg/m<2>, 200 mg/m<2>ili 250 mg/m<2>. U jednom ostvarenju, primena se ostvaruje u 2 do 5 ciklusa. Svaki ciklus traje 8 do 12 nedelja sa jednom do dve nedelje odmora. Poželjno, nedeljna intravenska infuzija traje 3 sata.

U drugom ostvarenju, primena je upravo dvonedeljna.

Ovi režimi primene, koji su prethodno opisani, mogu se, takođe, koristiti kada se oksaliplatin primenjuje u vidu kombinovane terapije, kao što je ovde opisana.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za izradu micela i/ili liposoma, koji sadrže dva antikancerska leka, oksaliplatin i drugi lek. Postupak je kao što je ovde opisan u vezi sa izradom oksaliplatinskih lipozoma, ali obuhvata korak uključivanja drugog antikancerskog leka u micelu ili lipozom.

Tako, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na lipozome, koji sadrže inkapsulirani oksaliplatin i drugi antikancerski lek. Lekovi su, na taj način, inkapsulirani u okviru istog lipozoma. Ovaj način ima prednost zbog toga što oni mogu biti oslobođeni zajedno prema cilju dejstva. Takođe je moguće, a u okviru je cilja pronalaska, da se uključi više nego jedan drugi antikancerski lek u lipozom.

U jednom ostvarenju, najmanje dva antikancerska leka sa različitim mehanizmima dejstva uključena su u isti lipozom u skladu sa pronalaskom. Tako, tumorska ćelija može biti ciljana pomoću dva nezavisna mehanizma, što vodi boljoj kliničkoj uspešnosti.

Drugi antikancerski lek može biti odabran od jedinjenja, kao što su: jedinjenja platine (kao što je cisplatin, karboplatin), antimetabolitni lekovi (kao što je 5-fluorouracil, citarabin, gemcitabin, pentostatin i metotreksat), antraciklinski lek, koji ciljano deluje na DNK (kao što je doksorubicin i epirubicin), lekovi koji ciljano deluju na DNK ili lekovi koji ciljano deluju na topoizomeraze ili drugi hemioterapeutski lekovi.

U poželjnom ostvarenju, drugi lek je odabran od: cisplatina, docetaksela, paklitaksela, gemcitabina, navelbina, doksorubicina, irinotekana, SN-38, gemcitabina ili 5-fluorodeoksiuridina.

Uključivanjem dva leka u isti lipozom, moguće je da se koriste manje doze svakog leka nego kada se svaki lek primenjuje sam. Dva leka mogu delovati na sinergistički način, nanoseći tako više štete tumorskoj ćeliji, sa manje sporednih efekata.

U drugom poželjnom ostvarenju, cisplatini i oksaliplatin su koinkapsulirani u istoj čestici lipozoma. Tako, na istu tumorsku ćeliju može biti dejstvovano simultano, i cisplatinom i oksaliplatinom. Sporedni efekti cisplatina (nefrotoksičnost, neurotoksičnost, mučnina/povraćanje) se razlikuju od sporednih efekata lipozomalnog cisplatina

(hematološka toksičnost). Sporedni efekti oksaliplatina takođe se razlikuju od sporednih efekata lipozomalnog oksaliplatina (neuropatija). Tako, ista tumorska ćelija može biti ciljana pomoću najmanje dva nezavisna mehanizma, dok na drugi način (ukoliko se ne primenjuju inkapsulirani u istom lipozomu), dva leka (oksaliplatin i cisplatin) bi najverovatnije delovala tako da svaki cilja različitu ćeliju. Pored toga, primena kombinacije različitih lekova, inkapsuliranih u istom lipozomu, pruža mogućnost korišćenja manjih doza, da bi se postigla efikasnost, pri čemu se, na taj način, izbegava ili smanjuje toksičnost lekova. Određenije rečeno, pronalazači su utvrdili da smanjivanjem doze oksaliplatina, sporedni efekat neurotoksičnosti može biti ograničen, dok smanjivanjem doze cisplatina sporedni efekat mijelotoksičnosti može biti ograničen. Kao rezultat, postoji poboljšanje profila neurotoksičnosti i mijelotoksičnosti primenjenog lipozomalnog oksaliplatina, odnosno lipozomalnog cisplatina, dok je, u isto vreme, moguće da se postignu ista ili veća oštećenja na tumorima, nakon sistemske primene. Zbog toga, kombinacija cisplatina i oksaliplatina u istom lipozomu, omogućuje primenu svakog navedenog leka u manjim dozama, pod uslovima kada su sporedni neželjeni efekti lipozomalnih lekova čak više minimizirani.

U drugom ostvarenju, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin pronalaska je sjedinjen sa lekom doksorubicinom (DOX) koji je inkapsuliran u istoj lipozomalnoj oksaliplatinskoj čestici, kao oksaliplatin, a kao što je opisano u postupcima pronalaska. Neočekivano, pronalazači su utvrdili da ovo može smanjiti dozu oksaliplatina i, sledstveno tome, neurotoksičnost primenjenog lipozomalnog oksaliplatina, dok se, isto tako, redukuje doza DOX-a. Na ovaj način se smanjuje kardiotoksičnost i drugi sporedni efekti DOX-a, dok, se na tumorima, izaziva isto ili veće oštećenje.

U drugom ostvarenju, lipozom sadrži oksaliplatin i 5-fluorouracil. Oksaliplatin u kombinaciji sa 5-fluorouracilom nedavno je odobren za korišćenje u lečenju metastatskog kolorektalnog kancera. Međutim, postoje ozbiljni problemi pri primeni takvih lekova, uglavnom zbog značajnih sporednih efekata oba leka, koji se minimiziraju korišćenjem njihovih lipozomalnih inkapsulacija, kao što je opisano u pronalasku. Dalje, kombinovanjem lekova, kao što je ovde opisano, povećana je efikasnost lečenja. Pronalazak se, takođe, odnosi na inkapsulaciju oksaliplatina i antikancerskog gena u istom lipozomu. Tako, lipozomi, u skladu sa pronalaskom, mogu sadržavati oksaliplatin i antikancerski gen. Korišćeni antikancerski geni uključuju, ali se njima ne ograničavaju, p53, IL-2, IL-12, angiostatin i onkostatin.

U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na kombinovanu terapiju, u kojoj se oksaliplatin primenjuje zajedno sa drugim lekom ili genom, kao što je ovde naznačeno, pri čemu su oba leka inkapsulirana u istom lipozomu. Iz tih razloga, lipozomi, koji sadrže oksaliplatin i drugi antikancerski lek ili gen, mogu biti korišćeni u proizvodnji leka za lečenje raka ili u postupku lečenja raka. Dalje, pronalazak se odnosi na prvu medicinsku upotrebu kombinovanih lipozoma.

Stručno lice će proceniti da režimi primene i dozaže komponenti variraju u odnosu na prisustvo drugog leka. Može biti upotrebljena dozaža i raspon doza kao za oksaliplatin, kao što je ovde opisano. Pored toga, režim primene kombinovanog lipozoma može biti kao što je opisan ovde za oksaliplatin.

U jednom ostvarenju, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin pronalaska je dat pacijentima, koji boluju od raka, u dozi od 150-300 mg/m<2>nedeljno (dani 1,8, 15) tokom 12 nedelja, u vidu monoterapije ili u kombinaciji sa 1 g/m<2>gemcitabina u dane 1, 8 u ciklusima od 21 dan, ili u kombinaciji sa docetakselom, paklitakselom, irinotekanom.

U srodnom aspektu, pronalazak je usmeren na lipozomalno inkapsulirani cisplatin, u kome je cisplatin inkapsuliran u kombinaciji sa drugim antikancerskim lekovima, kao što je ovde definisano. Cisplatin može, zbog toga, biti sjedinjen u istoj čestici lipozoma sa bilo kojim od antikancerskih lekova: paklitakselom, docetakselom, irinotekanom, SN-38, gemcitabinom, 5-fluorodeoksiuridinom. Prednost je u tome što ista tumorska ćelija biva simultano napadnuta cisplatinom i ovim drugim lekom, čime se postiže mnogo efikasnije uništavanje, zbog toga što su uključena dva nezavisna molekularna mehanizma. Na primer, cisplatin će podstaći mitohondrijalnu i nuklearnu signalizaciju za apoptozu, kao i unakrsno vezanje DNK, zaustavljajući replikaciju, dok će docetaksel delovati na polimerizaciju tubulina.

Pogodno, lipozomalno inkapsulirani cisplatin je inkapsuliran u isti lipozom u kombinaciji sa gemcitabinom, korišćenjem postupaka, kao što su ovde opisani.

U drugom aspektu, lipozom pronalaska, koji sadrži oksaliplatin, može biti primenjen zajedno sa drugim antikancerskim lekom, ali drugi lek ne čini deo istog lipozoma. Drugi lek je kao što je ovde opisan, a poželjno je odabran od cisplatina, docetaksela, paklitaksela, gemcitabina, navelbina, doksurubicina, irinotekana, SN-38, gemcitabina ili 5 -fluorodeoksiuridina.

Pored toga, u posebnom aspektu, pronalazak se odnosi na primenu Lipoplatina® u kombinaciji sa gemcitabinom. Zbog toga je kombinovana terapija Lipoplatina® i gemcitabina cilj pronalaska. Takođe je data upotreba Lipoplatina® u izradi leka za lečenje humanih pacijenata, koji imaju rak, putem kombinovane terapije, koja uključuje primenu Lipoplatina® i drugog leka, koji nije inkapsuliran u istom lipozomu.

Drugi lek može biti primenjen istovremeno kad i Lipoplatin® ili u različito vreme.

Poželjno, drugi lek je gemcitabin, a primena vodi kliničkom poboljšanju. Poželjno, tretirani kancer je kancer gušterače, ali i drugi kanceri, kao što je kolorektalni kancer, rak želuca, rak dojke, ne-mikrocelularni rak pluća, rak jajnika, rak glave i vrata, rak prostate, rak testisa, intestinalni kancer, kancer mokraćne bešike, ezofagusni ili urotelijalni kancer, mogu, isto tako, biti lečeni. Dozaža, korišćena za gemcitabin je 800 do 1000 mg/m , poželjno 1000 mg/m<2>. Doza lipoplatina je 100 do 125 mg/m<2>, poželjno 100 mg/m<2>.

Primena Lipoplatina® i gemcitabina je intravenska. Lipoplatin® se poželjno daje u vidu 8 satne IV infuzije svake dve nedelje (dan 1 i dan 15). Gemcitabin se poželjno daje u vidu 60 min iv infuzije svake dve nedelje. Primena jedinjenja može biti i u ciklusima od 4 nedelje.

Pronalazak je dalje ilustrovan u odnosu na slike i primere, koji slede. Primeri pokazuju da primena lipozoma oksaliplatina vodi kliničkom poboljšanju, t.j., ima klinički efekat u tretmanu raka. Primer II pokazuje da primena Lipoplatina® i gemcitabina obezbeđuje kliničke pogodnosti, vodeći, tako, kliničkom poboljšanju.

Opis slika

Slika 1: Šematsko predstavljanje lipozomalnog oksaliplatina, prikazanog u vidu žutih pravougaonika. Lipidni molekuli su naslikani sa sferičnim hidrofilnim vrhovima. Crveni nasumični lanci na površini čestice predstavljaju molekule PEG-a, koje daju čestici sposobnost da izbegne razaranje od strane makrofaga u jetri, opsonizaciju (interakciju sa serumskim proteinima i drugim makromolekulima) u krvi i sposobnost izlivanja u solidne tumore i metastaze nakon sistemskog oslobađanja (takođe njegove male veličine od 100 nm).

Slika 2: Smanjivanje nivoa bilirubina kod pacijenta (TK) sa kolorektalnim kancerom i metastazama u jetri. Pacijent je upao u hepatičnu komu zbog veoma visokih koncentracija bilirubina u krvi (50 mg/100 ml). Injekcija lipozomalnog oksaliplatina u dozama od 200 mg/m<2>u danu 1, danu 8, danu 15 i danu 22, dovela je do progresivnog smanjenja ukupnog bilirubina od 50 do 12 mg/m<2.>Ovo, najverovatnije proizlazi iz smanjivanja jetrenih metastaza, koje zapušavaju bilijarni trakt. Dalji tretmani u danima 31 i 37 ne zaustavljaju progresiju bolesti, kako se može zaključiti iz koncentracija bilirubina.

Slika 3: Smanjivanje metastaza na kostima nakon monoterapije sa lipozomalnim oksaliplatinom. Pacijent (EK) koji boluje od raka želuca i metastaza na kostima tretiranje sa 150 mg/m<2>svakih 7 dana, tokom 10 nedelja. Postoji značajno poboljšanje kvaliteta života, mnogo manje bolova, manje korišćenja analgetika, a pacijenti su bili u stanju da obavljaju svoje dnevne poslove.

Slika 4: Koinkapsulacija cisplatina i oksaliplatina u istu česticu lipozoma i dalja postinserciona modifikacija čestica sa peptid-PEG-LIPID konjugatima, da bi se oni usmerili ka specifičnim tipovima ćelija sa površinskim receptorima, koje prepoznaju peptidi ili Ugandi. Šema, takođe, opisuje peptidne lance (crvena boja), koji su dodati na krajeve molekula PEG-a za multifunkcionalizaciju čestica lipozoma i njihovo prevashodno usmeravanje na specifične tumore. U ovom slučaju, specifične tumorske antigene prepoznaje peptidni deo na površini lipozoma. Na primer, peptidni epitopi epidermalnog faktora rasta, koji su u stanju da se vežu za deo EGFR-a, izložen na spoljašnjoj površini, usmerava navedene lipozome na tumore, koji nadekspresuju EGFR. Slika 5A: pokazuje maksimalne nivoe od -14 mg ukupne platine/ml plazme nakon lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa -8 mg ukupne platina/ml plazme nakon oksaliplatina, a oni su postignuti nakon 20 minuta za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin i nakon 10 minuta za oksaliplatin.

Slika 5B: pokazuje da nivoi ukupne platine u plazmi pacova padaju na nulu -100 h nakon injekcije slobodnog oksaliplatina.

Slika 6A: pokazuje nivoe ukupne platine u plazmi pacova kod životinja, koje su takođe tretirane Lipoplatinom®.

Slika 7A: pokazuje nivoe ukupne platine u tkivu bubrega, kod životinja, koje su tretirane u toku 5 sati i

Slika 7B pokazuje isto za tretman tokom 190 sati.

Slika 8A: pokazuje nivoe ukupne platine u tkivu jetre, kod životinja, koje su tretirane tokom 5 sati i

Slika 8B pokazuje isto za tretman tokom 190 sati.

Slike 9A i 9B: pokazuju nivoe ukupne platine u tkivu slezine, kod životinja, koje su tretirane tokom 190 sati.

Slika 10A: pokazuje distribuciju ukupne platine u tkivu pacova, kod životinja, tretiranih i slobodnim oksaliplatinom i lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom tokom 5 sati i Slika 10B, Slike 11A i 11B su grafički prikazi pacova, koji su ponovljeno (11 puta) tretirani lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom.

Slika 12 je grafički prikaz pacova, koji su ponovljeno (6 puta) tretirani lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom.

Slika 13: Lipoksal može indukovati potpuno iščezavanje humanih kancera dojke kod miševa, nakon 6 intravenskih injekcija sa 4-dnevnim intervalima u dozama od 16 mg/Kg. Oksaliplatin u svojoj MTD (maksimalna tolerisana doza) može izazvati samo umanjivanje, a ne iščezavanje humanih tumora dojke kod miševa.

Slika 14: Doza od 16 mg/Kg lipozomalnog oksaliplatina (Lipoksal) je najefikasnija u iskorenjivanju raka dojke u ksenograftovima miša, Oksaliplatin u svojoj maksimalno tolerisanoj dozi od 4 mg/Kg ima manju antikancersku efikasnost u ovom mišjem modelu, a nakon čega je sledi doza od 5 mg/Kg lipoksala.

Slike 15 i 16 pokazuju rezultate kliničkih ispitivanja lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina.

Slika 17: Hemijska procedura za kuplovanje peptida na PEG-DSPE.

Primeri

PRIMER I

Izrada lipozoma

Oksaliplatin je pomešan sa DPPG (dipalmitoil fosfatidil glicerolom) ili drugim negativno-nabijenim lipidnim molekulima u molarnom odnosu 1:1 u 30% etanolu, 0.1 M Tris HC1, pH 7,5, sa 5 mg/ml finalnog oksaliplatina u prisustvu rastvora etanola u koncentraciji od 20-40% i pod temperaturnim uslovima od 30-60 stepeni Celzijusa, u prisustvu amonijum sulfata (10-200 mM), Tris pufera (10-100 mM) ili natrijum fosfatnog pufera (10-200 mM), na pH 6.5-8.0 i inkubiran je tokom 20 minuta-3 sata. Pod ovim uslovima, pozitivno nabijene imino grupe na molekulu oksaliplatina dovedene su u interakciju sa negativno nabijenim grupama na molekulu DPPG, obrazujući u etanolnim rastvorima reverzne micele (vidi, takođe, Lipoplatin US patent 6,511,676). Nastale reverzne micele oksaliplatin-DPPG su zatim konvertovane u lipozome, koji inkapsuliraju monosloj oksaliplatin-DPPG-a, brzim mešanjem sa prethodno obrazovanim lipozomima, sastavljenim od holesterola, fosfatidil holina, mPEG-DSPE (polietilen glikol - distearoil fosfatidil etanolamin), nakon čega je sledi dijaliza prema slanom rastvoru i ekstruzija kroz membrane za veličinu čestica od 80-120 nm u dijametru. To je lipidna smeša od dodatih lipozoma, koja određuje smešu spoljašnje površine konačne formulacije oksaliplatina (Slika 1).

PRIMER II

A. Preliminarno kliničko iskustvo sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom

I.A. Studije na životinjama

Studije na životinjama, izvedene od maja 2003. do decembra 2004. u SAD, Francuskoj, Švajcarskoj i Grčkoj (Pasterov institut, Atina) na ksenograftovima miša, u nezavisnim laboratorij ama, pokazale su bolju terapeutsku efikasnost lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u poređenju sa samim oksaliplatinom, kao i niži profil toksičnosti, a pokazale su i da je bio bolje tolerisan kod miševa i pacova, u poređenju sa slobodnim lekom oksaliplatinom. Dalje, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin mogao bi izazvati potpuno iščezavanje ili smanjivanje različitih humanih kancera kod miševa, nakon 6-8 intravenskih injekcija, putem tretmana koji je efikasniji i manje toksičan od onog sa oksaliplatinom.

Lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin je pokazao indukovanje potpunog iščezavanja humanih kancera dojke kod miševa, nakon 6 intravenskih injekcija u 4-dnevnim intervalima, u dozama od 16 mg/Kg. Sa druge strane, oksaliplatin slobodni lek u svojoj MTD (maksimalna tolerisana doza) može izazvati jedino smanjenje, a ne iščezavanje tumora.

Miševi, kojima je injicirano 5 mg/Kg slobodnog oksaliplatina uginuli su od toksičnosti, pa je doza smanjena na 4 mg/Kg. Doza lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina bila je 16 mg/Kg i.v., a toksičnost je manja od toksičnosti 4 mg/Kg slobodnog oksaliplatina. Antikancerska efikasnost slobodnog oksaliplatina, u dozi 4 mg/Kg, bila je niža od one koju pokazuje lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin u dozi 16 mg/Kg, kod životinja sa humanim tumorima.

U navedenom razmatranju prikazane su studije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina na životinjama. Intraperitonealna (i.p.) injekcija pacovima lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina ili slobodnog oksaliplatina, kao kontrole, korišćena je za praćenje tkivne biodistribucije od 10 minuta do 7 dana posle injekcije. Maksimalni nivoi ukupne platine (Pt) u plazm,i sa dozom od 15 mg/Kg, bili su 14.0 mg/ml plazme nakon injekcije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa koncentracijom od 7.5 mg/ml plazme nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom; ove koncentracije su postignute 10-15 minuta nakon injekcije. U tkivu bubrega zapaženo je ponašanje slično farmakokinetičkom ponašanju u plazmi; plazma i bubreg imali su najviše koncentracije platine između svih tkiva, koja su ispitivana tokom prvih 20 minuta nakon injekcije. Tkivo slezine pokazuje više nego dvostruko veće nivoe platine nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom, u poređenju sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom u istoj doznoj koncentraciji, tokom produženog perioda od 40—190 h posle injekcije. U sledećih 11 ponovljenih davanja lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina pacovima, slezina pokazuje začuđujuće visoke koncentracije ukupne Pt među svim ispitivanim tkivima (80 mg/g tkiva). Jetra pokazuje sličnu farmakokinetiku akumulacije Pt, kao funkciju vremena nakon davanja slobodnog oksaliplatina prema tretmanu lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom. Lipoplatin®, poređenja radi, pokazivao je slično farmakokinetičko ponašanje kao lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin u bubregu pacova u vremenu od 10 minuta do 7 dana, ali farmakokinetika u jetri je bila slična kod ova dva leka sve do 4 h, a tokom perioda od 7 dana nađena je veća akumulacija lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa Lipoplatinom®. Kompletnom biohemijskom analizom i brojenjem krvnih ćelija kod pacova ustanovljeno je da je lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin pokazao manju mijelotoksičnost, u poređenju sa slobodnim oksaliplatinom. SGOT transaminaza, alkalna fosfataza, bilirubin, kreatinin, urea u krvi i koncentracije mokraćne kiseline u krvi bili su normalni, u skladu sa odsustvom hepatotoksičnosti ili nefrotoksičnosti, koje bi potekle od lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina kod pacova. Podaci pokazuju mnogo duže zadržavanje lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u tkivima pacova, što odgovara njegovoj lipozomalno PEGilovanoj formulaciji, i niži profil toksičnosti.

Injekcije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina pacovima za farmakokinetičke studije

Za farmakokinetičke studije korišćeno je 20 ženki Wistar pacova, starosti 2-3 meseca, prosečne telesne težine 150 g. Pacovima je, u intraperitonealnu šupljinu, injicirana suspenzija od 3 mg/ml lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, dajući konačnu dozu od 15 mg/Kg. Korišćene su dve životinje u svakoj vremenskoj tački. Životinje su žrtvovane u~7 min, 20 min, 1.5 h, 3.75 h, 24 h, 40 h, 90 h i 170-180 h nakon injekcije. Krv je sakupljena u heparinizirane Eppendorf epruvete i centrifugirana. Koncentracije ukupne platine u plazmi su određene korišćenjem plamene atomske apsorpcije (AA700 Perkin Elmer).

Ponovljene injekcije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina pacovima za histološke studije

Zanimalo nas je utvrđivanje oštećenja različitih tkiva nakon ponovljenih injekcija lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina do njegove maksimalno tolerisane doze kod pacova.

Biohemijske i hematološke analize toksičnosti, koja potiče od lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, kod pacova

Pacovima je, u intraperitonealnu šupljinu, injicirana suspenzija od 3 mg/ml lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, dajući konačnu dozu od 15 ili 30 mg/Kg. U krvi pacova, korišćenoj za farmakokinetičke studije u plazmi, takođe su analizirane (7 dana posle injekcije) funkcije kostne srži, bubrežne, jetrene i gastrointestinalne funkcije u nezavisnim mikrobiološkim laboratorij ama. Ispitivani parametri bili su: hemoglobin, hematokrit, leukociti, granulociti, trombociti, SGOT transaminaza, SGPT transaminaza, alkalna fosfataza, ukupni bilirubin, urea, mokraćna kiselina i kreatinin.

Rezultati

Toksikologija lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina kod pacova

Pacovima su injicirani slobodni oksaliplatin ili lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin do konačne doze od 15 ili 30 mg/Kg. Grupa sa 30 mg/Kg oksaliplatina ozbiljno je gubila apetit i pokazala je ozbiljne gubitke težine; u grupi sa 30 mg/Kg oksaliplatina postoji 33%-tni gubitak težine 7 dana posle tretmana; prosečna težina svih životinja pala je od 150 g do prosečno 100 g nakon 7 dana. Suprotno tome, životinje, kojima je injicirana ista doza od 30 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, pokazale su samo 10% smanjenja težine (od prosečno 150 g do konačno 135 g 7. dana).

7 dana posle injekcije, od životinja, tretiranih sa 15 mg/Kg, uzeta je krv u heparinizirane ili ne-heparinizirane epruvete i data u nezavisne kliničke laboratorije na kompletne biohemijske i hematološke analize. Korišćene su dve životinje po grupi. Tabela 1 prikazuje prošek dva merenja. Grupa sa 15 mg/Kg oksaliplatina pokazuje pad leukocita do 800,000/mm<3>(stepen 4 toksičnosti prema WHO) u poređenju sa 3,400,000/mm<3>(stepen 1 toksičnosti) za grupu, koja je tretirana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom. Zato, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin ne izaziva opsežnije

smanjenje broja leukocita u poređenju sa slobodnim oksaliplatinom. Nivoi trombocita su, takođe, bili smanjeni u većem stepenu kod korišćenja oksaliplatina u poređenju sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom. U oba tretmana, koncentracije hemoglobina su bile blizu normale. Iz tih razloga, čini se da je mijelotoksičnost oba leka pre usmerena na leukocite i trombocite nego na procese eritropoeze. SGOT transaminaza je bila povišena kod korišćenja oba leka u skladu sa stepenom 2 hepatotoksičnosti; međutim, koncentracije SGPT transaminaze i alkalne fosfataze nisu bile promenjene; koncentracije bilirubina, ureje u krvi i kreatinina nisu bili pogođene (iako su koncentracije mokraćne kiseline pale), u skladu sa odsustvom nefrotoksičnosti, izazvane ili slobodnim oksaloplatinom ili lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom kod pacova, nakon i.p. primene.

Farmakokinetika kod pacova

Pacovima je, u intraperitonealnu šupljinu, injiciran direktno iz matičnog rastvora od 3 mg/ml, lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin ili 3 mg/ml slobodnog oksaliplatina u 5% dekstroze do konačne doze od 15 mg/Kg i.p. lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina ili oksaliplatina. U različitim vremenskim tačkama posle injiciranja, uzeta je krv, izdvojena je plazma i izmerene su koncentracije ukupne platine za farmakokinetičke studije. Slika 5A pokazuje maksimalne nivoe od -14 mg ukupne platine/ml plazme nakon davanja lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa -8 mg ukupne platine/ml plazme nakon davanja slobodnog oksaliplatina, koji se postižu nakon 20 minuta za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin i nakon 10 minuta za slobodni oksaliplatin. Nakon približno 45 min, obe grupe su pokazale slične nivoe ukupne platine (~5 mg ukupne platine/ml plazme), dok su 4-5 h nakon injiciranja dobijeni nivoi ispod 1 mg ukupne platine/ml plazme za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin, u poređenju sa - 2 mg ukupne platine/ml plazme za slobodni oksaliplatin. Nakon 40 h nivoi ukupne platine u plazmi pacova pali su na nulu za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin i na - 1 mg ukupne platine/ml plazme za slobodni oksaliplatin; nivoi ukupne platine u plazmi pacova postigli su nulu na -100 h nakon injekcije slobodnog oksaliplatina (Slika 5B).

Srednji farmakokinetički parametri za ukupnu platinu, izračunati za dozu od 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina (Lipoxal®) ili slobodnog oksaliplatina prikazani su u Tabeli 2.

AUC, određen korišćenjem linearnog trapezoidnog metoda sa ekstrapolacijom do neizmernog (Gibaldi et al, 1982 Gibaldi M, Perrier D: Noncompartmental analysis based on the statistical moment theory. In Pharmacokinetics, Gibaldi M, Perrier D (eds), pp 409-417, 2<nd>edn. Marcel Dekker: New York, 1982.) bio je 53.7 mg.h/ml za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin u poređenju sa 74.4 mg.h/ml za oksaliplatin.

Maksimalna koncentracija ukupne platine postignuta u plazmi (Cmax) bila je 14.0 mg/ml za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin, u poređenju sa 7.6 mg/ml za slobodni oksaliplatin. Ukupni telesni klirens (Cl) bio je 0.28 ml/g.h za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin, u poređenju sa 0.20 ml/g.h za slobodni oksaliplatin. Ovo je izračunato iz Cl=Di.v./AUC, gde je Di.v. i.p. doza lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina ili slobodnog oksaliplatina, a AUC je odgovarajuća površina ispod krive za ovu specifičnu dozu.

Konstanta eliminacione brzine (Kel) bila je 0.07 h-1 za za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin. Ovo je izračunato linearnom regresionom analizom logaritamske krive plazmatska koncentracija-vreme, pomoću formule Kel=[Ln(Cpl)-Ln(Cp2)]/(t2-tl), gde su ti i t2 polazne i završne vremenske tačke merenja, a Cpl i Cp2 polazne i završne koncentracije ukupne platine u plazmi za ti, odnosno t2.

Polu-vreme eliminacije (tl/2) je bilo 10.2 h za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin. Ovo je izračunato pomoću formule: tl/2=0.693 (1/Kel). 1/Kel je srednje vreme zadržavanja (MRT), statistička moment analogija sa polu-vremenom tl/2 (Gibaldi et al, 1982).

Nivoi ukupne platine u plazmi pacova, takođe su određeni kod životinja tretiranih Lipoplatinom®, različitim lekom lipozomalne platine, koji je trenutno u fazi III evaluacije (Stathopoulos et al, 2005). Lipozomalni cisplatin, Lipoplatin®, dat je u dozi od 30 mg/Kg i.p. Maksimalne koncentracije bile su -17 mg ukupne platine/ml plazme nakon doze od 30 mg/Kg lipoplatina, a postignute su 20 minuta nakon injekcije u vremenskom okviru, sličnom lipozomalno inkapsuliranom oksaliplatinu (Slika 6A). Cisplatin, kao kontrola, takođe je dat i.p. pacovima, u svoj maksimalno tolerisanoj dozi od 5 mg/Kg; maksimalne koncentracije bile su -7.5 mg ukupne platine/ml plazme nakon primene cisplatina, a postignute su 10 minuta nakon injekcije u sličnom vremenskom okviru kao oksaliplatin. Sva četiri leka pokazala su paralelno farmakokinetičko ponašanje nakon -1.5 h posle injekcije; međutim, 5 h nakon injekcije Lipoplatina® postignuto je -2.5 mg ukupne platine/ml plazme zatim, oksaliplatin sa 2.0 mg ukupne platine/ml plazme, cisplatin sa -1.5 mg ukupne platine/ml plazme i lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin sa

-1.0 mg ukupne platine/ml plazme.

Biodistribucija ukupne platine u tkivima pacova nakon i.p. infuzije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina ili slobodnog oksaliplatina

Praćenje distribucije platinskog leka u tkivima miša ili pacova korisno je zbog tačnosti rezultata i relativno jednostavne analize platine atomskom apsorpcijom.

Koncentracije platine u bubregu: Maksimalna količina ukupne platine u bubregu bila je 13.7 mg/g tkiva nakon doze od 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa -10.5 mg/g tkiva nakon doze od 15 mg/K oksaliplatina, a postignuta je 7-20 minuta od injiciranja (Slika 7A). Međutim, nakon oko 4 h, nivoi Pt u bubregu postigli su minimum od 4.8 mg/g tkiva nakon davanja oksaliplatina, a blago su porasli na 6.9 mg/g tkiva 167 h nakon injiciranja. Nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom nalazi se, takođe, minimum od -1 mg/g tkiva ukupne Pt u bubregu, postignut -20 h nakon injekcije, koji blago raste do 2.5 mg/g tkiva 188 h nakon injekcije. Zato, bubrezi pokazuju oko 3 puta veće koncentracije Pt nakon davanja oksaliplatina u poređenju sa tretmanom istom dozom lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina nakon -7 dana od injekcije (Slika 7B).

Poređenja radi, Lipoplatin® u dozi od 30 mg/Kg postigao je maksimalne koncentracije u bubregu od 34 mg/g tkiva, u odnosu na 10 mg/g tkiva nakon doze od 5 mg/Kg cisplatina. Farmakokinetika u bubregu pokazuje sličnost u ponašanju između Lipoplatina® i lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina. Maksimumi su 34, odnosno 14 mg/g tkiva za dozu od 30 mg/Kg Lipoplatina®, odnosno za dozu od 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina. Ovo govori u prilog sličnosti biodistribucije u bubregu ova dva leka, koji dele zajedničku okosnicu, ali se razlikuju prema leku, koji sadržavaju u svojoj unutrašnjosti i prema tumorima, na koje oni ciljano deluju. Nakon 120 h nivoi ukupne platine u bubregu su 5 mg/g tkiva za dozu od 30 mg/Kg Lipoplatina®, u poređenju sa -2.5 mg/g tkiva za dozu od 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina (Slika 3B). Nakon -140 h posle injekcije, ukupna platina je -7 mg/g tkiva nakon doze od 15 mg/Kg slobodnog oksaliplatina, u poređenju sa -4 mg/g tkiva nakon doze od 5 mg/Kg cisplatina (Slika 3B).

Zaključak:

Koncentracije Pt u bubrezima bile su najveće od svih tkiva pacova posle 7 dana zatim, jetri i slezini.

Nivoi platine u jetri:

Ukupna platina u jetri nakon doze od 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina bilaje 3.5 mg/g tkiva, postignuta je nakon -7-10 minuta od i.p. infuzije, sa naglim padom na 2.5 nakon 20 minuta, nakon čega je održavana u toku 5 h (Slika 8A). Suprotno tome, infuzija slobodnog oksaliplatina u intraperitonealnu šupljinu pacova, u istoj dozi, proizvela je slične nivoe ukupne platine u jetri (3.0-3.5 mg/g tkiva), koji su postignuti nakon otprilike 30 minuta od infuzije, održavani su tokom 2 h, a zatim su postepeno smanjivani do 1.5 mg/g tkiva nakon 5 h (Slika 4A). Za razliku od plazme, u kojoj nivoi platine padaju na nulu nakon otprilike 40 h, u jetri se nalazi akumulacija platine od -2 mg/g tkiva 170-190 h nakon tretmana sa oba leka, sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom i sa slobodnim oksaliplatinom (Slika 8B).

Poređenja radi, ukupna platina u jetri nakon doze od 30 mg/Kg Lipoplatina® bila je 7 mg/g tkiva, održavana je tokom~5 h (Slika 8A), pala je na 4.5 nakon -12 h, povećala se na f\ ^ nolmn 1A. h i nr>ct<p>r\<p>no emnnm/nln An ^ ^ nnVnn 190 h ffiliVfiATX\Picnlntin i<p>> nakon 20 minuta, koji je održavan tokom 5 h (Slika 4A), a zatim je postepeno padao na 1 u vremenu od 24 h do 150 h (Slika 8B).

Ukupna platina u slezini: Maksimalna količina ukupne platine u slezini bila je 3.2 mg/g tkiva nakon primene lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u dozi od 15 mg/Kg, u poređenju sa~5.2 mg/g tkiva nakon primene oksaliplatina u dozi od 15 mg/Kg, a postignuta je 15-20 minuta od injiciranja (slika 9A). Sve do~5 h nakon injiciranja, postoji blago smanjenje na -2 i -4 mg/g tkiva nakon primene lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, odnosno oksaliplatina. Nakon toga se nalazi povećanje koncentracije ukupne platine u slezini, nakon davanja lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina sve do -45 h na -4.5 mg/g tkiva, a zatim opadanje do -2 mg/g tkiva nakon 190 h. Obrnuto, nakon infuzije solobodnog oksaliplatina, u slezini se nalazi kontinuirana akumulacija ukupne platine, koja postiže nivo od 18.5 mg/g tkiva nakon 168 h (slika 9B). Ovo je praćeno silnim gubitkom težine slezine nakon 7 dana, po svoj prilici kao posledica apoptotične smrti splenocita, zbog toksičnosti slobodnog oksaliplatina. Faktički, kod miša sa prosečnom telesnom težinom od 150 g pre studije, konačna telesna težina nakon 7 dana bila je 109 g, a težina slezine je bila 0.188 g.

Postojala je kongestija (akumulacija krvi) u slezini životinja, koje su tretirane lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom.

Međutim, nakon približno 1 h, nivoi Pt u bubregu bili su viši nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom nego nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom; oni su postigli minimum nakon 12-24 h (5 mg/g tkiva nakon tretmana oksaliplatinom, 1 mg/g tkiva nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom) i počeli su ponovno da rastu; 170 h nakon injekcije, tkivo bubrega je pokazalo 7 mg Pt/g tkiva nakon tretmana oksaliplatinom i 2.5 mg Pt/g tkiva nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (Slika 5B).

Uporedna merenja ukupne platine u svim tkivima pacova, izvršena nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom ili slobodnim oksaliplatinom sažeto su prikazana na Slici 10. Plazmatski nivoi ukupne platine 20 minuta nakon injekcije od 15 mg/Kg oksaliplatina postigli su najveći nivo ukupne platine (14.2 mg/ml) između svih tkiva; tkivo bubrega imalo je komparativno visok nivo nakon~10 minuta od i.p. injekcije lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina (13.8 mg/ml) (Slika 10A). Sledeći nivoi uključuju nivo platine u bubregu nakon davanja oksaliplatina i plazmatski nivo nakon davanja oksaliplatina. Izgleda da je sledeći veći nivo u slezini (5 mg/g tkiva nakon primene 15 mg/Kg oksaliplatina), nivo koji kontinuirano raste i postaje najviši nakon 24 h i čak još viši nakon 170 h (18.5 mg/g tkiva). Prema tome, ukupno uzevši, slezina konačno akumulira najviši nivo platine nakon tretmana oksaliplatinom. S obzirom na navedeno, razlika između akumulacije platine u slezini nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom ili lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom je očigledna (Slika 10B).

Maksimalni nivoi platine (u mg Pt/ml plazme ili po gramu tkiva) u tkivima pacova (postignuti nakon 7-20 minuta), posle i.p. injekcije 4 leka (ND, nije određeno).

Bubreg, slezina i jetra imaju značajne nivoe Pt 5-7 dana nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom.

Slezina, bubreg, pluća i jetra imaju značajne nivoe Pt 5-7 dana nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom.

Bubreg, slezina i jetra imaju značajne nivoe Pt 5-7 dana nakon tretmana Lipoplatinom®. Bubreg, slezina i jetra imaju značajne nivoe Pt 5-7 dana nakon tretmana cisplatinom.

Podaci pokazuju da nakon i.p. tretmana sa 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u poređenju sa i.p. tretmanom sa 15 mg/Kg slobodnog oksaliplatina: 1. plazmatski nivoi ukupne platine su 14 mg/ml plazme nakon davanja lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, plazmatski nivoi ukupne platine su 7.6 mg/ml plazme nakon tretmana oksaliplatinom Maksimumi su postignuti nakon oko 7-20 minuta od i.p. injekcije Ovo pokazuje dužu cirkulaciju lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u poređenju sa oksaliplatinom 2. Nivoi u bubregu su viši sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (14 mg/g tkiva) u poređenju sa slobodnim oksaliplatinom (11 mg/g) u početnih 15 minuta od injiciranja, ali nakon 1.5 h i posle toga nivoi u bubregu postaju viši sa slobodnim oksaliplatinom (6.7 mg/g tkiva) u poređenju sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (2.3 mg/g) nakon 1.5 h. 3. Nivoi u slezini su viši sa slobodnim oksaliplatinom (3.8 mg/g tkiva) u poređenju sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (1.8 mg/g) 1.5 h nakon injekcije.

4. Nivoi u srcu su komparabilni i niski među oba leka.

Nivoi platine u plazmi: Maksimalna količina ukupne platine u plazmi je 14 mg/ml nakon i.p. tretmana sa 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina, u poređenju sa -7.5 mg/ml tkiva nakon tretmana sa 15 mg/Kg oksaliplatina, a postignuta je 7-20 minuta nakon injiciranja (Slika 10A). Međutim, nakon približno 1 h, nivoi Pt u plazmi postaju viši nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom nego nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom, i održavaju se tokom ostatka krive sve do 50 h, kada nivoi Pt za lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin postaju nula i sve do -100 h, kada nivoi Pt postaju nula za slobodni oksaliplatin.

Nivoi platine u bubregu: Maksimalna količina ukupne platine u bubregu je 13.5 mg/g tkiva nakon tretmana sa 15 mg/Kg lipoksala u poređenju sa -10.5 mg/g tkiva nakon tretmana sa 15 mg/Kg oksaliplatina, a postignuta je 15-20 minuta nakon injiciranja (Slika 10A). Međutim, nakon oko 4 h nivoi Pt u bubregu postižu minimum od 4.8 mg/g tkiva nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom i blago rastu do 6.9 g/g tkiva 167 h nakon injiciranja. Nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom nalazi se, takođe, minimum od -1 mg/g tkiva ukupne Pt u bubregu, koji se postiže -20 h nakon injekcije, kada blago raste do 2.5 mg/g tkiva nakon 188 h. Prema tome, bubrezi pokazuju otprilike 3 puta više nivoe Pt nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom u poređenju sa tretmanom istom dozom lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina -7 dana nakon injekcije. Od svih tkiva pacova, nivoi Pt su najviši u bubrezima 7 dana nakon tretmana, a zatim slede jetra i slezina.

Nivoi platine u slezini: Maksimalna količina ukupne platine u slezini je 14 mg/g tkiva nakon tretmana sa 15 mg/Kg lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u poređenju sa -7 mg/g tkiva nakon tretmana sa 15 mg/Kg slobodnog oksaliplatina, a postignuta je 15-20 minuta nakon injiciranja (Slika 10A). Međutim, nakon otprilike 1 h nivoi Pt u bubregu su viši nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom nego nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom, minimum pokazuju oko 12-24 h (5 mg/g tkiva nakon tretmana oksaliplatinom, lmg/g tkiva nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom) i ponovno započinje porast; 170 h nakon injiciranja tkivo bubrega pokazuje nivo od 7 mg Pt/g tkiva nakon tretmana slobodnim oksaliplatinom i 2.5 mg Pt/g tkiva nakon tretmana lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (Slika 10A).

Tretman lekom, koji dovodi do razlika u težini i redukcije u veličini tkiva

Životinje, koje su tretirane lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (15 mg/kg) i slobodnim oksaliplatinom (15 mg/kg) i žrtvovane 7.8 i 7 dana nakon i.p. injekcije leka, pokazuju nekoliko velikih razlika u gubitku ukupne težine i težine pojedinih organa.

Tabela 5. Redukcija telesne težine, kao posledica kaheksije nakon tretmana oksaliplatinom. Životinje, tretirane uporednim dozama lipozomalnog oksaliplatina pokazuju manju redukciju celokupne težine ili težine organa. Izgleda daje slezina tkivo, najviše zahvaćeno slobodnim oksaliplatinom.

Životinje, tretirane slobodnim oksaliplatinom, pokazuju, 7 dana nakon primene leka, veliki gubitak težine, za koji je utvrđeno da je veći od 40 gr ukupne telesne težine u vreme tretmana. Dalje, postoji značajna redukcija veličine tkiva slezine, koja je odraz ekstremno visokih vrednosti koncentracije Pt (18.5 mg Pt/g tkiva).

Gubitak apetita nakon primene slobodnog oksaliplatina i toksičnost leka, doveli su do gubitka težine i smanjenja veličine slezine; ovi fenomeni, zapaženi su kod životinja, žrtvovanih 7 dana nakon primene leka, i zbog toga su pokazali visoke vrednosti koncentracije Pt u tkivnim graficima slobodnog oksaliplatina 7 dana nakon I.P. injekcije.

Može se smatrati da se istovetan učinak odnosi i na ostala tkiva, dokle god su vrednosti koncentracije Pt u svim tkivnim graficima slobodnog oksaliplatina (jetra, pluća, srce, slezina, bubreg) u vremenskoj tački: 7 dana, pokazivale porast.

Miševi, kojima je injicirano 5 mg/Kg oksaliplatina, uginuli su od toksičnosti, a doza je snižena na 4 mg/Kg. Doza lipoksala je bila 16 mg/Kg i.v., a toksičnost je bila niža nego kod 4 mg/Kg oksaliplatina. Antikancerska efikasnost doze od 4 mg/Kg oksaliplatina je bila niža od one koju pokazuje lipoksal u dozi od 16 mg/Kg, kod životinja sa humanim tumorima.

PRIMER 2B

A Faza I kliničke studije

Cilj studije bio je a) da se procene sporedne neželjene reakcije i da se detektuje doza, koja limitira toksičnost (DLT) kao i maksimalna tolerisana doza (MTD) lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina. Pacijenti i postupci: Ukupno, 27 pacijenata sa uznapredovalom bolešću bilo je uključeno u studiju. Svi pacijenti su prethodno lečeni standardnom hemioterapijom, u skladu sa utvrđenim protokolom. Pri pristupanju ovom ispitivanju svi su bili u stanju rekurentne ili progresivne bolesti. Svi pacijenti su imali maligne bolesti gastrointestinalnog trakta stadijuma IV (kolorektalni, želučani i pankeatični kanceri). Postavili smo šest različitih doznih nivoa lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina i najmanje 3 pacijenta su bila uključena u svaki nivo. Dozni nivoi su bili: 1) 100 mg/m<2>2)150 mg/m<2>3) 200 mg/m<2>4) 250 mg/m<2>5) 300 mg/m<2>6) 350 mg/m<2>. Osam dodatnih pacijenata je tretirano sa 300 mg/m<2>kao MTD-om. Tretman je izvođen jednom nedeljno tokom tri uzastopne nedelje, s ponavljanjem svake 4 nedelje. Rezultati: Nisu zapaženi ozbiljniji sporedni neželjeni efekti u prva četiri dozna nivoa (100-250 mg/m<2>). Na nivoima 5 i 6 zapaženi su blaga mijelotoksičnost i mučnina. Najčešća sporedna neželjena reakcija bila je periferna neuropatija stepena II, a primećena je kod 4 pacijenta, koji su tretirani dozom od 350 mg/m . Iz tih razloga, ocenili smo daje nivo od 350 mg/m<2>DLT, a da je nivo od 300 mg/m<2>MTD. Od 27 pacijenata, troje je pokazalo parcijalni odgovor, a 18 pacijenata je imalo stabilnu bolest tokom 4 meseca, raspon medijane (2-9). Zaključak: U ovoj Fazi I studije, utvrdili smo da je najčešća toksičnost periferna neuropatija pri doznim nivoima od 300 i 350 mg/m<2>. Lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin se dobro podnosi i značajno smanjuje sve druge sporedne efekte slobodnog oksaliplatina, posebno mijelotoksičnost i toksičnost prema G.I. traktu.

Ovi preliminarni rezultati pokazali su odgovarajuću efikasnost kod prethodno lečenih pacijenata.

Navedena studija bila je kliničko ispitivanje sa lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom (Lipoxal®) sa sledećim primarnim ciljevima: a) da se definiše doza, koja limitira toksičnost (DLT) i maksimalna tolerisana doza (MTD) povećavanih doza nedeljno primenjivanog lipoksala, b) da se utvrdi profil toksičnosti i farmakokinetika monoterapije lipoksalom kod prethodno tretiranih pacijenata sa uznapredovalim kancerima G.I. trakta. Sekundarni ciljevi bili su efikasnost i preživljavanje.

Pacijenti i postupci

Studija je bila faza I kohortnog ispitivanje lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina sa rastućim dozama. Protokol studije je izložio i odobrio naš Institutional Rewiew Board. Pacijenti su pročitali prijavljeni dokument o pristanku, koji zadovoljava sve institucionalne zahteve i potpisali ga, kao uslov za svoju registraciju.

Kriterij umi izbora

Od svih pacijenata je zahtevano da zadovolje sledeće kriterijume: potvrđena histološka ili citološka dijagnoza raka, najmanje jedna bolest koju je moguće dvodimenzionalno meriti ili proceniti, karakteristike WHO status 0-2, očekivano preživljavanje veće od 3 meseca, prethodni tretman standardnom hemioterapijom ili hemioterapijom prve linije i, u vreme uključivanja, refraktornost na bilo koji prethodni citotoksični tretman. Pacijenti su bili izabrani ukoliko su imali dva ili više prethodnih tretmana, pod uslovom da su najmanje 3 meseca bili bez tretmana.

Procena

Od izabranih pacijenata, starijih od 18 godina, zahtevalo se da imaju odgovarajuće hematološke, bubrežne i jetrene funkcije, defmisane kao: WBC broj 3.5x109/1, apsolutni broj neutrofila 1.5x109/1, broj trombocita 100x109/1, nivo hemoglobina 9 g/dl, koncentracija ukupnog bilirubina 1.5 mg/dl, ALT i AST dvostruko veće od gornjeg limita u odsustvu jetrenih metastaza ili pet puta više od gornjeg limita u slučaju dokumenovanih jetrenih metastaza, i nivo kreatinina od 1.5 mg/dl. Istorija bolesti, fizikalni pregled, procena vitalnih znakova, elektrokardiogram, pregled pluća i abdomena kompjuterizovanom tomografijom (ili ultrazvukom) izvršeni su pre tretmana. Tokom tretmana (1 dan pre svakog tretmana) urađeni su krvna slika, urea i šećer u krvi, kreatinin u serumu, ispitivanja mokraćne kiseline i EKG. Procene CT snimaka urađene su nakon najmanje osmonedeljnih infuzija leka ili ranije - kod pogresije bolesti.

Tretman

Karakteristike leka: Dat je u dozi 3 mg/ml, 50 ml po staklenoj bočici. 150 mg oksaliplatina po staklenoj bočici Lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin čuva se na 4 stepena Celzijusa, neproziran izgled. Karakteristika lipozomalnog leka: Lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin je razblažen u 1 lt 5% dekstroze i davan je putem 3 satne intravenske infuzije jednom nedeljno tokom 8 uzastopnih nedelja. U slučaju sporednih neželjenih efekata, a posebno mijelotoksičnosti ili neurotoksičnosti, primena tretmana bi se odložila za jednu nedelju. Nije potrebna pre- ili post- hidratacija. Nije planirano profilaktičko davanje drugih lekova, kao što su antiemetici ili antialergici. U slučaju mučnine ili povraćanja kao pomoć bi bili dati antiemetici (Ondasetron) ili antialergici (deksametazon).

U sudijama na životinjama, koje prethode, doza od približno 400 mg/m<2>do 600 mg/m<2>bila je definisana kao MTD. Kod ljudi smo odlučili da počnemo sa dozom od 100 mg/m<2>za nivo jedan. Odlučili smo da doza raste za 50 mg/m<2>po nivou. U tabeli 1 predstavljen je porast doza lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatin po grupi pacijenata.

Toksičnost, povezana sa lekom, procenjivana je tokom svakog ciklusa terapije i stepenovana je u skladu sa kriterijumima WHO. DLT je definisana kao bilo koja toksičnost stepena 3 ili 4, sa brojem neutrofila <500 mm , povezana sa groznicom, koja traje duže od 72 sata, kod 50% pacijenata. Druga toksičnost stepena III i posebno neurotoksičnost, takođe, je smatrana DLT-om, ukoliko je zapažena kod najmanje 50% pacijenata. Jedan dozni nivo niže od DLT defmisan je kao MTD. Grupe od minimum tri pacijenta, određene su za uključivanje u svaki dozni nivo. Povećavanje doze na sledeći viši nivo preduzeto je nakon što su sva tri pacijenta primila prvi ciklus terapije sa prethodnom dozom, i svaki je posmatran tokom najmanje 3 nedelje bez evidencije o DLT. Dodatna dva pacijenta uključena su u dati dozni nivo, ukoliko je prvi pacijent tog nivoa doživeo DLT, u prvom 3-nedeljnom periodu tretmana. Tretman je prekinut u slučaju pojave DLT, a pacijent je stavljen na nivo ispod.

Farmakokinetika

Za farmakokinetičku studiju pacijentima je uzeta krv u sledeće sate: 0 (pre infuzije leka i od početka infuzije 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120 (5 dana) i 168 (7 dana) sati. 3 ml krvi uzeto je u epruvete sa EDTA ili heparinom, a zatim je krv centrifugirana i ohlađena na 2°C i eventulno poslata u laboratoriju, da bi se odredili nivoi ukupne platine. Korišćen je uzorak od 5 pacijenata. Nivoi platine (ukupni i serumski ultrafiltrati) izmereni su atomskom apsorpcijom (Perkin Elmer AA 700 Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometer na Regulon A.E.). Merenja su bila na određenim doznim nivoima... (200 mg i 300 mg/m<2>): površina ispod krive plazmatska koncentracija-vreme (AUC), Cmax (maksimalna konceracija ukupne platine u serumu). Ukupni telesni klirens (Cl) izračunat je iz CL=Div/AUC, gde je Div intravenska doza Lipoplatina®, a AUC je srazmerna površina ispod krive za specifičnu dozu. Kel (konstanta eliminacione brzine) je izračunata linearnom regresionom analizom logaritamske krive plazmatska koncentracija-vreme, pomoću formule Kel=[Ln(Cpl)-Ln(Cp2)]/(t2-tl), gde su ti i t2 polazne i završne vremenske tačke merenja, a Cpl i Cp2 polazne i završne koncentracije ukupne platine u serumu za ti, odnosno t2.

tl/2 (polu-vreme eliminacije) je izračunato pomoću formule tl/2=0.693 (1/Kel). 1/Kel je MRT (srednje vreme boravljenja), statistička moment analogija sa polu-vremenom tl/2 (Gibaldi et al, 1982). U stvari, MRT predstavlja vreme potrebno za eliminisanje 63.2% primenjene doze.

Rezultati

Pacijenti

Karakteristike pacijenata prikazane su u tabeli 5. Uključeno je ukupno 27 pacijenata. Godine 32-78, medijana godina 62, muškaraca 18, žena 9. P.S. 0-2. Svi pacijenti su prethodno lečeni hemioterapijom. Prethodni tretmani po tumoru.

Toksičnost

Toksičnost lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina prema G.I. traktu bila je neznatna. Bez antiemetika (Ondosetron) primećeni su mučnina i blago povraćanje. Ali sa ondasetronom nisu primećeni mučnina i povraćanje. Takođe, nije bilo dijareje. Umerena mijelotoksičnost (neutropenija) stepena I zapažena je samo kod 2 pacijenta (%) sa najvećom datom dozom (350 mg/m<2>). Nisu primećeni hepatotoksičnost, renalna toksičnost, kardiotoksičnost niti alopecija. Kod 3 pacijenta primećena je blaga astenija. Glavni sporedni efekat bila je neurotoksičnost, koja je viđana nakon najmanje 3 infuzije agenasa, a bila je stepena I na 3. i 4. nivou, stepena 2 na 5. nivou, i stepena 2 kod 100% pacijenata na 6.nivou.

Na osnovu ovih rezultata, neurotoksičnost stepena III smatrana je dozom limitirane toksičnosti, koja je primećena kod 100% pacijenata, tretiranih sa 350 mg/m<2>lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina. Jedna doza ispod 300 mg/m<2>definisana je kao maksimum tolerisane doze (MTD). U tabeli 5, prikazano je povećanje doze lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina i broj pacijenata, tretiranih na svakom od šest nivoa.

Farmakokinetika: Rezultati su predstavljeni u tabeli 7 i na Slikama 15 i 16. Utvrđeno je daje polu vreme koncentracije oksaliplatina u plazmi bilo 24 sata, a ekskrecija u urinu je nastavljena tokom 7 dana.

Saglasnost sa tretmanom

Ukupan broj od 104 infuzije (ciklusi) primenjeni su sa medijanom od 4 ciklusa po pacijentu (u rasponu od 2-15). Srednji interval između ciklusa bio je 7 dana. Intenzitet doze bio je 100% od planiranog. Nijednom pacijentu se nije desilo odlaganje tretmana, jer nije utvrđena hematološka toksičnost stepena III ili IV. Samo pacijenti, koji su primali dozu od 350 mg/m<2>, nakon najviše 4 ili 5 infuzija (ciklusa) imali su dvonedeljne intervale pre nego su klasifikovani u nižu dozu od 300 mg/m . Neki pacijenti su prekinuli tretman zbog progresije bolesti nakon 4-6 ciklusa. Ovo je primenjeno kod 17 pacijenata (62.9%). Dvanaest pacijenata je bilo još živo na kraju studije (44.4%). Uzroci smrti su bili progresija bolesti.

Odgovori na tretman

Odgovori su bili analizirani na bazi plana-za-lečenje. Nije bilo kompletnih odgovora. 3 pacijenta od 27 (11.1%) pokazali su parcijalni odgovor. Od ovih pacijenata 2 su bila sa rakom želuca, jedan sa pleuralnim izlivom, a drugi sa metastazama na kostima; treći je bio pacijent sa metastazama na jetri, poteklim od karcinoma kolona. Utvrđivanje parcijalnog odgovora zasnovano je na CT-snimku za prvog pacijenta, za drugog pacijenta na bazi snimka kosti, a za trećeg pacijenta na bazi CT-snimka i nivoa bilirubina u serumu. Prikazane su dve slike: slika 1 snimak kosti pre i nakon tretmana za drugog pacijenta i kriva serumskog nivoa bilirubina kod trećeg pacijenta. Izuzetno, treći pacijent je tretiran dok je serumski bilirubin bio 51 mg/dl; nivo bilirubina je nakon 2 tretmana pao na 8 mg/dl i trajao je tokom 5 nedelja.

Trajanje odgovora je bilo 4, 7, odnosno 2 meseca za svakog pacijenta. 18 pacijenata pokazalo je stabilnu bolest (66.66%) sa srednjim trajanjem od 4 meseca (raspon 2-9 meseci). 5 pacijenata moglo bi biti klasifikovano, u skladu sa klasifikacijom, koja više nije validna, kao slabi odgovori. 6 pacijenata je pokazalo progresiju bolesti. U slučaju sva 3 odgovora, postoji, takođe, smanjenje za 50% ili više markera CA-19-9. Isto tako, nivo karakteristika statusa bio je poboljšan od 2 na 1 kod sva 3 odgovora.

Zaključak

Lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin je bio testiran u ovom ispitivanju (primer) kao monoterapija (pojedinačni tretman) kod pacijenata sa uznapredovalim rakom gastrointestinalnog sistema. Svi pacijenti su bili prethodno lečeni standardnim tretmanom, a svi uključeni kolorektalni pacijenti bili su, takođe, tretirani slobodnim oksaliplatinom. Ovaj tretman lipozomalno inkapsuliranim oksaliplatinom prethodno je bio testiran jedino u prekliničkim studijama. Prethodno nisu bila izvršena druga klinička ispitivanja. Ovo ispitivanje je bilo bazirano na podacima prekliničkih studija i na iskustvu i podacima za ne-lipozomalni (slobodni) oksaliplatin. Ovaj poslednji je uglavnom pomagao u fokusiranju našeg tekućeg ispitivanja na procenu sličnosti ili razlika između lipozomalno inkapsuliranog oksaliplatina u odnosu na nezaštićeni (slobodni) oksaliplatin. Pokazalo se da su sporedni efekti na G.I. trakt i hematološki status znatno smanjeni. Jedini neželjeni sporedni efekat, koji preostaje bez bilo kakve razlike - bilo kakvog smanjenja, bio je neurotoksičnost. Ona se viđa često, više ili manje analogno sa povećanjem doze agensa i deluje kao jedini ili glavni kriterij um za definisanje doze, koja limitira toksičnost. Doza definisana kao MTD bila je doza od 300 mg/m<2>, koja se primenjuje nedeljno. Postojala je isto tako, dodatna neurotoksičnost, koja se, takođe, dešava sa ne-lipozomalnim oksaliplatinom (ref). S obzirom na efikasnost, 11% obima odgovora, koji su zapaženi kod prethodno tretiranih pacijenata, koji su pokazali refraktornost prethodno utvrđenih tumora mogli bi imati neko značenje za buduća ispitivanja u kombinovanom hemioterapijskom modalitetu. Takođe je važno naglasiti da tipovi kancera, koji su odabrani za ovo ispitivanje, nisu od najsenzitivnijih na hemioterapiju.

Ova studija je ustanovila MTD i potrebna su dalja istraživanja, posebno u kombinaciji sa drugim agensima.

Kao rezultat, ovaj primer pokazuje da je lipozomalno inkapsulirani oksaliplatin dobro tolerisan agens. Doza od 300 mg/m<2>je definisana kao MTD. U poređenju sa nezaštićenom formom oksaliplatina, toksičnosti prema G.I. i kostnoj srži u velikoj meri su smanjene. Jedini neželjeni sporedni efekat, koji preostaje je neurotoksičnost, koja definiše DLT.

Tip kancera: želudac, Stadijum: IVPre tretmana Lipoksalom

7dana nakon 4. infuzije lipoksalaKrv za ove parametre je uzeta za biohemijsko ispitivanje 2/11/2004

FUNKCIJA KOSTNE SRŽI

7dana nakon 9. infuzije lipoksala

FUNKCIJA KOSTNE SRŽI

MOKRAĆNA KISELINA ( mg%)3.5

7 dana nakon 12. infuzije lipoksala

FUNKCIJA KOSTNE SRŽI

7dana nakon 16. infuzije lipoksala

FUNKCIJA KOSTNE SRŽI

FUNKCIJA BUBREGA

PRIMER III

LIPOZOMALNI CISPLATIN U KOMBINACIJI SA GEMCITABINOM KOD

PRETHODNO LEĆENIH PACIJENATA SA UZNAPREDOVALIM RAKOM

GUŠTERAČE: FAZA I- II STUDIJE

Svrha: Ovde opisano ispitivanje jeste faza I-II studije, koja je bazirana na novom lipozomalno inkapsuliranom cisplatinu (proizveden pod komercijalnim imenom Lipoplatin®, od strane regulon Inc. Mountain View, CA). Pređašnji preklinički i klinički podaci (Faza I farmakokinetike) vodili su ka istraživanju modaliteta kombinovanog tretmana, koji uključuje Lipoplatin® i gemcitabin.

Pacijenti i postupci: Doza gemcitabina držana je standardno na 1000 mg/m<2>, a doza lipoplatina je povećana od 25 mg/m<2>do 125 mg/m<2>. Tretman je primenjen na prethodno lečenim pacijentima sa uznapredovalim rakom gušterače, koji su bili refraktorni na prethodnu hemioterapiji, koja je uključivala gemcitabin.

Rezultati: Doza od 125 mg/m<2>Lipoplatina® definisana je kao doza, koja limitira (DLT) toksičnost, a doza od 100 mg/m<2>kao maksimalno tolerisana doza (MTD) u kombinaciji sa 1000 mg/m gemcitabina. Preliminarni podaci o stepenu objektivnog odgovora pokazali su parcijalni odgovor kod 2/24 pacijenata (8.3%), stabilnost bolesti kod 14 pacijenata (58.3%) za srednju dužinu trajanja od 3 meseca (raspon 2-7 meseci) i kliničko poboljšanje kod 8 pacijenata (33.3%).

Zaključak: Lipozomalno inkapsulirani cisplatin je ne-toksičan agens, koji je alternativa nezaštićenom cisplatinu. U kombinaciji sa gemcitabinom, ima MTD od 100 mg/m<2>i pokazuje obećavajuću efikasnost kod refraktornog raka pankreasa.

Cisplatin, (cis-PtCl2(NH3)2) se širom sveta koristi za tretman kancera testisa i jajnika kao i tumora mokraćne bešike, glave, vrata, pluća i gastrointestinalnog trakta i mnogih drugih. 1-7 Iako veoma efikasan prema ovim tumorima, cisplatin je povezan sa ozbiljnim sporednim efektima, koji uključuju nefrotoksičnost, 8 ototoksičnost, neurotoksičnost, mučninu i povraćanje. 7-9 Karboplatin, analog cisplatina, značajno je manje toksičan prema bubrezima i nervnom sistemu od cisplatina i uzrokuje manje mučnine i povraćanja, dok uopšteno (i izvesno za kancer jajnika i ne-mikrocelularni rak pluća), zadržava ekvivalentnu antitumorsku aktivnost. Međutim, hematološki neželjeni sporedni efekti su mnogo češći sa karboplatinom nego sa cisplatinom (10,11).

Gemcitabin (pod komercijalnim imenom Gemzar®, Eli Lily, Indianapolis, IN), nukleozidni analog, primenjuje se u kombinaciji sa cisplatinom, kao tretman prve linije kod pacijenata sa inoperabilnim, lokalno uznapredovalim (stadijum III A ili IIIB) ili metastatskim (stadijum IV) ne-mikrocelulranim rakom pluća, i kao frontalni tretman kod pacijenata sa lokalno uznapredovalim (neresektabilni stadijum III) ili metastatskim

(stadijum IIIB, IV) adenokarcinomom gušterače. 12-14 Glavna sporedna neželjena reakcija je mijelotoksičnost. Prednost korišćenja kombinacija gemcitabina sa platinom pripisuje se inhibiciji sintetskih puteva DNK, uključenih u reparaciju platina-DNK privlačenja. Gemcitabin i cisplatin deluju sinergistički, pojačavajući obrazovanje platina-DNK privlačenja i indukujući koncentrisanje i promene u pulovima ribonukleotida i deoksiribonukleotida u ćelijskim nizovima kancera jajnika, koji su zavisni od kombinacije (15).

Prethodne studije Lipoplatina® (Regulon Inc., Mountain View, CA) pokazale su: niži profil toksičnosti, sposobnost da se koncentrišu u tumorima i izbegnu ćelije imunološkog sistema i makrofage, laganu brzinu klirensa iz bubrega, osobine dugog cirkulisanja u telesnim tečnostima, polu-vreme od 36 h u krvi i obećavajuću terapeutsku efikasnost. 16 U ovoj Fazi I-II studije pokušali smo da istražimo terapeutsku efikasnost i profil toksičnosti lipoplatin-gemcitabin kombinacije, koja je davana svakih 14 dana pacijentima sa prethodno tretiranim rakom gušterače u uznapredovalom stepenu. Naši primarni ciljevi bili su da se utvrdi toksičnost i maksimum tolerisane doze (MTD), a naši sekundarni ciljevi bili su da se utvrdi stepen odgovora i klinička prednost.

PACIJENTI I POSTUPCI

Pacijenti sa >18 godina, sa histološki ili citološki potvrđenim adenokarcinomom gušterače i dvodimenzionalno merljivom bolešću, koji su bili podvrgnuti prethodnom tretmanu hemioterapijom i koji su imali rekurentnu bolest ili bolest koja nije davala odgovor na tretman, uključeni su u studiju. Drugi kriterijumi, na osnovu kojih su birani, uključivali su karakteristike statusa (PS) Svetske zdrastvene organizacije (WHO) od 0-2, očekivano preživljavanje od najmanje 3 meseca, adekvatne rezerve kostne srži (broj granulocita >l,500/dl, broj trombocita >120,000/dl), normalne testove bubrežne funkcije (koncentracija kreatinina u serumu < 1.2 mg/dl) i jetrene funkcije (koncentracija ukupnog bilirubina u serumu < 3 mg/dl, pod uslovom da su serumske transaminaze i proteini u serumu normalni), normalna srčana funkcija bez istorije klinički nestabilne angine pektoris ili infarkta miokarda, ili kongestivne srčane slabosti u prethodnih 6 meseci, i bez zahvaćenosti centralnog nervnog sistema. Dozvoljena je prethodna hirurška intervencija, pod uslovom da je izvršena pre najmanje 3 meseca. Pacijenti sa aktivnom infekcijom, malnutricijom ili drugim primarnim tumorom (izuzev za ne-melanomski kožni epiteliom ili in situ karcinom cerviksa) isključeni su iz studije. Svi pacijenti su dali svoje pisano saopštenje o pristanku na učešće u studiji.

PLAN TRETMANA

Plan je bio da se kombinuje Lipoplatin® sa gemcitabinom. Lipoplatin®, nabavljen posredstvom Regulon Inc., primenjen je u vidu 8 h i.v. infuzije, 1. i 15. dana; 8 sati je odabrano da bi se mogli kontrolisati mogući sporedni neželjeni efekti, na osnovu našeg iskustva u fazi I ispitivanja. Gemcitabin je dat u vidu 60 min i.v. infuzije u 500 ml normalnog slanog rastvora u danima 1 i 15 u dozi od 1000 mg/m , a ciklusi su ponavljani svake 4 nedelje (28 dana). Infuzije u danima 1 i 15 smatrane su kao 1 ciklus. Pod uslovom da su se zadovoljavajuće oporavili od sporednih neželjenih efekata, povezanih sa lekom, svi pacijenti su podvrgnuti standardnom antiemetskom tretmanu sa ondansetronom. Nije dozvoljena profilaktička primena rekombinantnog faktora koji simuliše kolonije humanih granulocita (rhG-CSF). U slučajevima neutropenije stepena 3, ovi pacijenti bi primali uzastopne infuzije 6 mg pegfilgrastima, 6. i 7. dana, a tretman bi bio odložen za jednu nedelju. Tretman je primenjivan tokom najmanje tri ciklusa ili dok bolest ne progredira. Studija je bila kohortno ispitivanje faze I/II, s povećanjem doze Lipoplatina® i gemcitabina. Njeni ciljevi su bili da se utvrdi doza koja limitira toksičnost (DLT) kombinacije i da se definiše maksimum tolerisane doze (MTD) kao preporučena doza za fazu II i da se sakupe preliminarni podaci o efikasnosti leka kod prethodno lečenih pacijenata sa rakom gušterače. Mijelotoksičnost kod korišćenja Lipoplatina®, u vidu pojedinačnog agensa, smatrana je blagom u prethodnoj fazi I studije. 16 Počeli smo sa niskom dozom Lipoplatina®, u kombinaciji sa gemcitabinom, koji je mijelotoksični agens, uglavnom kako bismo odredili stepen sporedne neželjene reakcije kostne srži. Polazna doza Lipoplatina® bila je 25 mg/m<2>, i povećana je za 25 mg/m<2>po dozno nivou (Tabela 1). Protokol je odobrio Etički i Naučni komitet bolnice.

Kriterijumi za prilagođavanje doze bazirani su na hematološkim parametrima. U slučajevima febrilne neutropenije stepena 3 ili 4, uzastopni ciklusi su ponovljeni uz profilaktičku primenu pegfilgrastima, kao što je prethodno opisano. U slučajevima febrilne neutropenije ili neutropenije stepena 3 ili 4, uprkos primeni rhG-CSF, doze gemcitabina i Lipoplatina su smanjene za 25% u infuziji sledećeg tretmana. U slučajevima trombocitopenije stepena 3 ili 4, koja traje > 5 dana, doze oba leka takođe su smanjene za 25%. Toksičnost je stepenovana u skladu sa vodičem WHO.

EVALUACIJA PACIJENTA

Evaluacija pre tretmana uključivala je kompletnu istoriju bolesti i fizikalni nalaz, kompletnu krvnu sliku, uključujući diferencijaciju leukocita i broj trombocita, standardni biohemijski profil (i klirens kreatinina, kada je to potrebno), određivanja serumskog karcinoembrionalnog antigena (CEA) i CA 19-9, elektrokardiogram, rendgenski snimak grudnog koša, ultrazvuk gornjeg abdomena i snimke grudnog koša, gornjeg i donjeg abdomena kompjuterizovanom tomografijom (CT). Ako postoji klinička indikacija, mogu su izvesti i dodatne studije snimanja. Jednom nedeljno je rađena kompletna krvna slika i diferencijacija leukocita; u slučaju neutropenije stepena 3 ili 4, ili trombocitopenije stepena 4, dnevno je rađena kompletna krvna slika sa diferencijalnom leukocitnom formulom, sve dok apsolutni broj granulocita nije bio > 1,000/dl, a broj trombocita > 75,000/dl. Detaljno medicinsko i fizikalno ispitivanje urađeno je pre svakog tretmana, kako bi se dokumentovali simptomi bolesti i toksičnosti tretmana. Svakih 6 nedelja urađeni su biohemijski testovi, EKG, određivanja CEA i CA 19-9 u serumu i rendgenski snimci grudnog koša, a neurološka procena je izvršena kliničkim ispitivanjem. Lezije su izmerene nakon svakog ciklusa, ukoliko ih je moguće proceniti fizikalnim pregledom ili rendgenskim snimkom grudnog koša; lezije, procenjene ultrazvukom ili CT snimcima, evaluirane su nakon tri hemioterapijska ciklusa.

DEFINICIJA ODGOVORA

Kompletan odgovor (CR) je definisan kao iščezavanje svake bolesti, koja se može izmeriti ili proceniti, znakova, simptoma i biohemijskih promena, povezanih sa tumorom, tokom najmanje 4 nedelje, tokom kog vremena se ne smeju pojaviti nove lezije. Parcijalni odgovor (PR) je definisan kao >50% smanjenja u zbiru proizvoda perpendikularnih dijametara svih merljivih lezija, u poređenju sa merenjima pre tretmana, koji traju najmanje 4 nedelje, tokom kog vremena se ne smeju pojaviti nove lezije, niti uvećati postojeće lezije. Za jetrene lezije, zahtevano je smanjenje od >30% zbira izmerenih razdaljina od kostalne margine na srednjoj klavikularnoj liniji i hifoidnog nastavka na rubu jetre. Stabilna bolest (SD) je definisana kao <50% smanjenja i <25% povećanja u zbiru proizvoda dva perpendikularna dijametra svih izmerenih lezija, i kao odsustvo pojave novih lezija tokom 8 nedelja. Progresivna bolest (PD) je definisana kao povećanja proizvoda dva perpendikularna dijametra bilo koje merljive lezije za >25% iznad veličine, koja je prisutna pri ulasku u studiju, ili za pacijente, koji imaju odgovor, veličine u vreme maksimuma regresije i pojavljivanja novih područja maligne bolesti. Povećanje bilirubina bez oporavka nakon endoskopske retrogradne holedoho-pankreatografije (ERCP) ili stavljanja stenta smatrano je progresijom bolesti. Dvo-stepeno pogoršanje u performans statusu, >10% gubitka težine pre tretmana ili pojačavanje simptoma, nisu, sami po sebi, određivali progresiju bolesti; međutim, pojava ovih poteškoća bila je praćena novom evaluacijom stepena bolesti. Svi odgovori trebali su se održavati tokom najmanje 4 nedelje i biti potvrđeni od strane nezavisnog panela radiologa.

REZULTATI

Demografija pacijenata

Od januara 2003. do decembra 2004., u studiju su uključena 24 pacijenta (11 muškaraca, 13 žena; srednja starost od 66 godina, raspon 47-80 godina). Karakteristike pacijenata prikazane su u Tabeli 2. WHO karakteristika statusa bila je 0 kod 4.2% pacijenata, 1 kod 45.8% i 2 kod 50% pacijenata. Velika većina pacijenata bila je stadijuma IV (79.2%). Svi pacijenti su prethodno bili podvrgnuti hemioterapiji; jedanaest pacijenata sa gemcitabinom u vidu tretmana pojedinačnim agensom i 13 sa gemcitabinom u kombinaciji sa irinotekanom.

Jačina doze

Pacijenti u primili 36 tretmana (108 infuzija svake dve nedelje), a srednji broj tretmana je bio 2 (raspon 1-5). Od 24 pacijenta, 10 pacijenata je završilo 3 tretmana. Nije bilo smanjenja doze za jedan ili drugi lek, a pacijenti su primili 99.5% planirane jačine doze (raspon 93-100) za svaki lek sve do četvrtog nivoa dozaže.

Toksičnost

Nije zapažena neurotoksičnost ili renalna toksičnost. Prolazni abdominalni bol, koji je trajao 2-4 minuta, i koji je prolazio sam po sebi, utvrđen je kod 10/24 pacijenata, na početku infuzije Lipoplatina®. Kod 2 od 4 pacijenta na petom nivou dozaže, utvrđena je mijelotoksičnost stepena 3. Nije viđena febrilna neutropenija. Toksičnost je prikazana u Tabelama 3 i 4. Peti nivo dozaže (125 mg/m<2>lipoplatina i 1000 mg/m<2>gemcitabina) ocenjen je kao DLT, a dozni nivo 4 kao MTD. Dodatna četiri pacijenta su tretirana na četvrtom nivou dozaže.

Odgovor na tretman

Određivanje merljivog odgovora kompjuterizovanom tomografijom izvela su dva nezavisna radiologa i dva iskusna onkologa. Nisu utvrđeni kompletni odgovori. PR su postiguti kod 2 pacijenta (8.3%), sa trajanjem od 6 i 5 meseci. Stabilna bolest je utvrđena kod 14 pacijenata (58.3%) sa medijanom trajanja od 3 meseca (raspon 2-7 meseci). Klinička dobrobit, uglavnom zbog smanjenja bola, viđena je kod 8 pacijenata (33.3%). Na kraju studije, 7 pacijenata (29.2%) još je bilo živo. Medijana preživljavanja od početka tretmana druge-linije bila je 4 meseca (raspon 2-8+ meseci).

Zaključak

Ovaj novi lipozomalno inkapsulirani cisplatin (Lipoplatin®) ima za cilj pre svega izbegavanje renalne toksičnosti, koja se često viđa kod primene cisplatina, dok se u isto vreme proizvodi istovetna efikasnost. Farmakokinetika Lipoplatina® razlikuje se od one cisplatina, kao što se pokazalo u studijama na životinjama, kao i kliničkim ispitivanjima na pacijentima. 16 Smanjenje toksičnosti jeste glavna prednost, koja se pokazala u slučaju primene Lipoplatina® kao pojedinačnog agensa. U ovoj fazi I-II ispitivanja, toksičnost i efikasnost su razmatrani primenjivanjem Lipoplatina® u kombinaciji sa gemcitabinom, agensom, čija toksičnost je dobro definisana, posebno kada se kombinuje sa drugim agensima.5 Kombinacija cisplatin-gemcitabin je korišćena slično kao za lečenje ne-mikrocelularnog raka pluća, urotelijalnog i pankreasnog kancera. 5, 7, 12 Izgleda da podaci iz ovog ispitivanja ukazuju na prednost veoma niske toksičnosti. Primena kombinacije svake dve nedelje, dobro se podnosi sve do doze od 100 mg/m<2>Lipoplatina®, kada se gemcitabin održava na standardnoj dozi od 1000 mg/m<2>. Pri dozi od 125 mg/m<2>Lipoplatina®, mijelotoksičnost postiže stepenove 3 i 4, i zato se ova doza ocenjuje kao DLT. Doza od 100 mg/m Lipoplatina® i 1 gr/m gemcitabina ocenjena je kao MTD. Kombinacijom lekova postignut je objektivan odgovor kod 8.33% pacijenata, stabilnost bolesti kod 58.3%, a ublažavanje bolova kod 33.3%. Kada se uzme u obzir da su svi pacijenti imali refraktornu bolest ili je bolest bila u progresiji, dok su bili na prethodnom tretmanu koji uključuje gemcitabin, ovde proizvedeni stepen odgovora pripisao bi se dodavanju Lipoplatina®.

Lipozomalno inkapsulirani cisplatin u kombinaciji sa gemcitabinom, primenjen svake dve nedelje, kod prethodno lečenih pacijenata sa uznapredovalim rakom pankreasa, ima MTD od 100 mg/m<2>, odosno 1000 mg/m<2.>Ovo je dobro tolerisani tretman sa obećavajućim znacima efikasnosti.

REFERENCE

1. Rosenberg B: Platinum complexes for the treatment of cancer: why the search goes on, In Lippert B (ed): Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug. Zurich, Verlag Helvetica Chimica Acta, 1999, pp 3 2. Sorenson C, Eastman A: Mechanism of cis-diamminedichloroplatinum (Il)-induced cytotoxicity: role of G2 arrest and DNA double-strand breaks. Cancer Res 48: 4484-8,1988 3. Einhorn LH, Williams SD, Loehrer PJ, et al: Evaluation of optimal duration of chemotherapy in favorable prognosis disseminated germ cell tumors: a Southeastern Cancer Study group protocol. J Clin Oncol 7(3): 387-91, 1989 4. Aabo K, Adams M, Adnitt P, et al: Chemotherapy in advanced ovarian cancer: four systematic meta-analysis of individual patient data from 37 randomized trials. Br J Cancer 78:1479-87, 1998 5. Kaufman D, Raghavan D, Carducci M, et al: Phase II trial of gemcitabine plus cisplatin in patients with metastatic urothelial cancer. J Clin Oncol 18(9): 1921-7, 2000 6. Pignon JP, Bourhis J, Domenge C, et al: Chemotherapy added to locoregional treatment for head and neck squamous-cell carcinoma: three meta-analyses of updated individual data. Lancet 355:949-955, 2000 7. Non-Small-Cell Lung Cancer Collaborative Group: Chemotherapy in non-small-cell lung cancer, a meta-analysis using updated data on individual patients from 52 randomized clinical trials. Br Med J 311:899-909, 1995 8. Hayes D, Cvitkovic E, Golfey R, et al: High dose cis-platinum diaminedichloride: amelioration of renal toxicity by mannitol diuresis. Cancer 39(4): 1372-8, 1977 9. Gandara DR, Nahhas NA, Adelson MD, et al: Randomized placebo-controlled multicenter evaluation of diethyldithiocarbamate for chemoprotection against cisplatin-induced toxicities. J Clin Oncol 13:490-496, 1995 10. Sculier JP, Lafitte JJ, Lecomte J, et al: European Lung Cancer Working Party: A three-arm phase III randomized trial comparing combinations of platinum derivatives ifosfamide and/or gemcitabine in stage IV non-small-cell lung cancer. Ann Oncol 13:874-882, 2002 11. Tognoni A, Pensa F, Vaira F, et al: A dose finding study of carboplatin and gemcitabine in advanced non-small-cell lung cancer. J Chemother 14:296-300, 2002 12. Burris HA 3<rd>, Moore MJ, Anderson J, et al: Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: A randomized trial. J Clin Oncol 15:2403-2413, 1997 13. Heinemann V, Wilke H, Mergenthaler HG, et al: Gemcitabine and cisplatin in the treatment of advanced and metastatic pancreatic cancer. Ann Oncol 11:1399-1403, 200 14. Stathopoulos GP, Rigatos SK, Dimopoulos MA et al: Treatment of pancreatic cancer with a combination of irinotecan (CPT-11) and gemcitabine: A multicenter phase II study of the Greek Cooperative Group for Pancreatic Cancer. Ann Oncol 14:388-394, 2003 15. Van Moorsel CJ, Smid K, Voorn DA, et al: Effect of gemcitabine and cis-platinum combinations on ribonucleotide and deoxyribonucleotide pools in ovarian cancer cell lines. Int J Oncol 22:201-207, 2003 16. Stathopoulos GP, Boulikas T, Vougiouka M, et al: Pharmacokinetics and adverse reactions of a new liposomal cisplatin (Lipoplatin): Phase I study. Oncology Reports 13: 589-595, 2005. 17. Miller AB, Hoogstraten B, Staquet M, Winkler A: (WHO) Reporting results of cancer treatment. Cancer, 47(1): 207-214,1981 Histologija dobro-diferencirani 3 12.5 umereno-diferencirani 12 50.0 slabo-diferencirani 9 37.5 Prethodno lečenje Gemcitabin 1 g/m2 dani 1, 8, 15/ svake 4 nedelje 11 45.8 gemcitabin 900 mg/m2 + dani 1, 8/ svake 3 nedelje + 13 54.2 Irinotekan 300 mg/m2 dani 8/ svake 3 nedelje

Tabela 3. Hematološka toksičnost Dozni nivo Lipoplatina Toksičnost Gemcitabina Maksimum toksičnosti mg/m2mg/m2 Br. pacijenata Toksičnost (stepen) Tip Prvi 25 1000—Drugi 50 1000—Treći 75 1000—Četvrti 100 1000 2/4* 2-3 neutropenia Peti 125 1000 2/4 3-4 neutropenia<*>originalna 4 pacijenta

Tabela 4. Ne-hematološka toksičnost Doziranje Stepen 1 Stepen 2 Stepen 3 Stepen 4 Nivo n(%) n(%) n(%) n (%) Mučnina 5 (20.8)—Povraćanje 2 (8.3)-—Alopecija 14 (58.3)—-Umor 8 (33.3)—Dijareja 2 (8.3)—Kardiotoksičnost—Neurotoksičnost 3 (12.5)-—Nefrotoksičnost—Epizode tromboze 4 (16.7)—

Claims (67)

1. Postupak za formiranje micele koja sadrži oksaliplatin, naznačen time što je to postupak koji obuhvata kombinovanje efektivne količine oksaliplatina i negativno naelektrisanog fosfatidil glicerol lipida sa rastvaračem.

2. Postupak, kao u patentnom zahtevu 1,naznačen time što je rastvarač etanol i prisutan je od 20 do 40%.

3. Postupak, kao u patentnom zahtevu 1 ili 2,naznačen time što je negativno naelektrisan fosfatidil glicerol lipid dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG), dimiristol fosfatidil glicerol (DMPG), diaproil fosfatidil glicerol (DCPG), distearoil fosfatidil glicerol (DSPG) ili dioleil fosfatidil glicerol (DOPG).

4. Postupak, kao u patentnom zahtevu 3,naznačen time što je negativno naelektrisan fosfatidil glicerol lipid DPPG.

5. Postupak, kao u prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je molarni odnos oksaliplatina prema negativno naelektrisanom fosfatidil glicerol lipidu 1 : 1 do 2 : 1.

6. Postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, naznačen time što obuhvata kombinovanje micele oksaliplatina, kako je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, sa prethodno obrazovanim lipozom ili lipidima.

7. Postupak, kao u patentnom zahtevu 6, naznačen time što prethodno obrazovani lipozom ili lipidi uključuju negativno i/ili pozitivno naelektrisane lipide.

8. Postupak, kao u patentnom zahtevu 7, n a z n a č e n time što su lipidi fosfolipidi ili njihovi derivati.

9. Postupak, kao u patentnom zahtevu 8,naznačen time što je lipid DDAB, dimetildioktadecil amonijum bromid; DMRIE: N-[l-(2,3-dimiristiloksi)propil]-N,N-dimetil-N-(2-hidroksietil) amonijum bromid; DMTAP: l,2-dimiristoil-3-trimetilamonijum propan; DOGS: dioktadecilamidoglicilspermin; DOTAP: N-(l-(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid; DOTMA: N-[l-(2,3-dioleiloksi)propil]-n,n,n-trimetilamonijum hlorid; DPTAP: l,2-dipalmitoil-3-trimetilamonijum propan ili DSTAP: 1,2-disteroil-3-trimetilamonijum propan.

10. Postupak, kao u patentnom zahtevu 7, naznačen time što lipozom obuhvata jedan ili više: holesterol, fosfatidil holin, fosfatidiletanolamin, hidrogenizovani sojin fosfatidilholin ili ceramid.

11. Postupak, kao u patentnom zahtevu 10, naznačen time što prethodno obrazovani lipozom dalje obuhvata amonijum so.

12. Postupak za inkapsuliranje oksaliplatina u lipozom, naznačen time što obuhvata sledeće korake: e) formiranje micele koja uključuje oksaliplatin kombinovanjem efektivne količine oksaliplatina i negativno naelektrisanog fosfatidil glicerol lipida sa rastvaračem i f) kombinovanje navedene micele oksaliplatina sa prethodno formiranim lipozomom ili lipidima.

13. Postupak, kao u patentnom zahtevu 12, n a z n a č e n time što je rastvarač etanol i što je prisutan od 20 do 40%.

14. Postupak, kao u patentnom zahtevu 12 ili 13,naznačen time što je negativno naelektrisan fosfatidil glicerol lipid DPPG, DMPG, DCPG, DSPG ili DOPG.

15. Postupak, kao u patentnom zahtevu 14, naznačen time što je negativno naelektrisan fosfatidil glicerol lipid DPPG.

16. Postupak, kao u bilo kom od patentnih zahteva 12 do 15, naznačen time što je molarni odnos oksaliplatina prema negativno naelektrisanom fosfatidil glicerol lipidu 1 : 1 do 2 : 1.

17. Postupak, kao u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 16, naznačen time što dalje obuhvata oblaganje površine membrane lipozoma sa polimerom.

18. Postupak, kao u patentnom zahtevu 17, n a z n a č e n time što je ligand konjugovan sa polimerom.

19. Postupak, kao u patentnom zahtevu 18,naznačen time što je ligand sposoban da usmeri lipozom na specifičan tip ćelija sa površinskim receptorima koje ligand prepoznaje.

20. Postupak, kao u patentnom zahtevu 18 ili 19, n a z n a č e n time što je ligand peptid.

21. Postupak, kao u patentnom zahtevu 19, naznačen time što je ligand odabran od: epidermalnog faktora rasta ili njegovog epitopa, endostatina, antitrombina, anastelina, angiostatina, PEX ili pigmentnog faktora epitelijalnog porekla.

22. Postupak, kao u prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što dalje uključuje još jedan antitumorski lek u miceli ili lipozomu.

23. Postupak, kao u patentnom zahtevu 22, n a z n a č e n time što je lek odabran od: cisplatina, paklitaksela, SN-38, docetaksela, irinotekana, 5-fluorodeoksiuridina ili doksorubicina.

24. Micela, naznačena time što se dobija postupkom, kao u patentnim zahtevima 1 do 5.

25. Micela, naznačena time što obuhvata efektivnu količinu oksaliplatina i negativno nalelektrisan fosfatidil glicerol lipid.

26. Micela, kao u patentnom zahtevu 25, n a z n a č e n a time što je fosfatidil glicerol lipid DPPG.

27. Micela, kao u bilo kom od patentnih zahteva 25 do 26, n a z n a č e n a time što dalje obuhvata drugi antikancerski lek.

28. Micela, kao u patentnom zahtevu 27, n a z n a č e n a time što je lek odabran od: cisplatina, paklitaksela, SN-38, docetaksela, irinotekana, 5-fluorodeoksiuridina ili doksorubicina.

29. Lipozom koji obuhvata oksaliplatin, naznačen time što je dobijen postupkom, kao u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 23.

30. Lipozom koji obuhvata efektivnu količinu oksaliplatina, naznačen time što unutrašnji i spoljašnji sloj lipozoma sadrže različite lipide.

31. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 30, naznačen time što sadrži negativno naelektrisan fosfatidil glicerol lipid.

32. Micela, kao u patentnom zahtevu 31,naznačena time što je fosfatidil glicerol lipid DPPG.

33. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 32,naznačen time što dalje obuhvata jedan ili više: holesterol, fosfatidil holin, fosfatidiletanolamin, hidrogenizovani sojin fosfatidilholin, ceramid.

34. Lipozom, kao u patentnim zahtevima 30 do 33, n a z n a č e n time što je površina lipozoma obložena sa omotačem koji omogućava lipozomu da izbegne nadzor imunog sistema.

35. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 34, n a z n a č e n time što je omotač polimer.

36. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 35, n a z n a č e n time što je polimer PEG.

37. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 35 ili 36, n a z n a č e n time što je ligand konjugovan sa polimerom.

38. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 37,naznačen time što ligand može usmeriti lipozom na specifičan tip ćelije koja ima površinske receptore koje ligand prepoznaje.

39. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 37 ili 38, n a z n a č e n time što je ligand peptid.

40. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 37, n a z n a č e n time što je ligand odabran od: epidermalnog faktora rasta ili njegovog epitopa, endostatina, antitrombina, anastelina, angiostatina, PEX ili pigmentnog faktora epitelijalnog porekla.

41. Lipozom, kao u bilo kom od patentnih zahteva 28 do 40, n a z n a č e n time što lipozom ima veličinu čestice od 80-120 nm.

42. Lipozom, kao u patentnim zahtevima 28 do 38, koji dalje obuhvata efektivnu količinu drugog antikancerskog leka, naznačen time što su oksaliplatin i drugi lek inkapsulirani u istom lipozomu.

43. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 39, n a z n a č e n time što je antikancerski lek odabran od: cisplatina, docetaksela, paklitaksela, gemcitabina, navelbina, doksorubicina, irinotekana, SN-38, gemcitabina ili 5-fluorodeoksiuridina.

44. Lipozom, kao u patentnim zahtevima 28 do 38, koji dalje obuhvata efektivnu količinu antikancerskog gena, naznačen time što su oksaliplatin i drugi lek inkapsulirani u istom lipozomu.

45. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 44, naznačen time što je antikancerski gen p53, IL-2, IL-12, angiostatin i onkostatin.

46. Lipozom, kao u patentnim zahtevima 27 do 45, n a z n a č e n time što je za upotrebu kao lek za kancer.

47. Upotreba lipozoma, kao u bilo kom od patentnih zahteva 27 do 45, naznačena time što je za proizvodnju leka za lečenje kancera.

48. Postupak lečenja kancera, naznačen time što obuhvata primenjivanje lipozoma, kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 27 do 45.

49. Upotreba postupka, kao u patentnom zahtevu 46 ili 47, n a z n a č e n a time što se lipozom primenjuje nedeljno ili dvonedeljno intravenskom infuzijom 3 sata i što je oksaliplatin prisutan u dozi od 100 do 350 mg/m<2>.

50. Upotreba postupka, kao u patentnom zahtevu 48, n a z n a č e n a time što je doza: 100, 150, 200, 250 ili 300 mg/m<2>.

51. Upotreba postupka, kao u patentnom zahtevu 49, n a z n a č e n a time što je doza 300 mg/m<2>.

52. Upotreba postupka, kao u patentnim zahtevima 48 do 50, n a z n a č e n a t i m e što je infuzija 3 satna infuzija jednom nedeljno.

53. Upotreba postupka, kao u patentnim zahtevima 48 do 51,naznačena time što je primenjivanje u 2 do 4 ciklusa, svaki ciklus je u trajanju otprilike 8 nedelja i praćen jednom nedeljom pauze između ciklusa.

54. Upotreba postupka, kao u patentnim zahtevima 48 do 51,naznačena time što je kancer izdvojen od: kolorektalnog kancera, želudačnog, kancera pankreasa, mokraćne bešike, kancera dojki, kolorektalnog, želudačnog, ezofagealnog, pankreasnog, urotelijalnog, ne-mikrocelularnog plućnog, dojki, prostate, glave i vrata, melanoma, testikularnog ili ovarijalnog kancera.

55. Upotreba postupka, kao u patentnom zahtevu 53,naznačena time što je kancer kolorektalni, želudačni ili kancer pankreasa.

56. Lipozom, naznačen time što obuhvata delotvornu količinu oksaliplatina i drugog antikancerskog leka ili antikancerskog genskog leka i fosfatidil glicerol lipid sa negativnim naelektrisanjem.

57. Kombinovana terapija, naznačena time što obuhvata primenjivanje lipozoma koji inkapsulira delotvornu količinu oksaliplatina i inkapsulira drugi antikancerski lek ili antikancerski genski lek.

58. Lipozom, kao u patentnom zahtevu 55 ili 56, n a z n a č e n time što je lek odabran od: cisplatina, paklitaksela, SN-38, docetaksela, irinotekana, 5-fluorodeoksiuridina ili doksorubicina.

59. Kombinovana terapija, naznačena time što obuhvata primenjivanje delotvorne količine gemcitabina i lipozoma koji inkapsulira delotvornu količinu cisplatina.

60. Kombinovana terapija, kao u patentnom zahtevu 58, naznačena time što gemcitabin ne čini deo lipozoma cisplatina.

61. Kombinovana terapija, kao u patentnim zahtevima 58 ili 60, naznačena time što se gemcitabin primenjuje u isto vreme kao lipozom cisplatina.

62. Kombinovana terapija, kao u patentnim zahtevima 58 ili 60, naznačena time što se gemcitabin primenjuje u različito vreme od lipozoma cisplatina.

63. Kombinovana terapija, kao u bilo kom od patentnih zahteva 58 do 62, naznačena time što je kancer: kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer dojki, kancer pluća koji nije mikrocelularni, kancer jajnika, kanceri glave i vrata, kancer prostate, testikularni, intestinalni kancer, kancer mokraćne bešike, ezofagijalni ili urotelijalni.

64. Kombinovana terapija, kao u bilo kom od patentnih zahteva 58 do 63,naznačena time što se gemcitabin primenjuje u dozi od 800 do 1000 mg/m .

65. Kombinovana terapija, kao u patentnom zahtevu 64, n a z n a č e n a time što se gemcitabin primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 1000 mg/m<2>.

66. Kombinovana terapija, kao u patentnom zahtevu 64 ili 65, n a z n a č e n a time što se gemcitabin primenjuje kao 60 minutna iv infuzija svake druge nedelje.

67. Kombinovana terapija, kao u bilo kom od patentnih zahteva 58 do 66, naznačena time što se lipozom cisplatina primenjuje intravenoznom infuzijom u dozi od 100 do 125 mg/m<2.>68. Kombinovana terapija, kao u patentnom zahtevu 67, n a z n a č e n a time što se lipozom cisplatina primenjuje kao 8 satna IV infuzija svake druge nedelje.