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HK1252369A1 - 利用纳米颗粒治疗肿瘤的组合物和方法 - Google Patents

利用纳米颗粒治疗肿瘤的组合物和方法 Download PDF

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HK1252369A1
HK1252369A1 HK18111665.1A HK18111665A HK1252369A1 HK 1252369 A1 HK1252369 A1 HK 1252369A1 HK 18111665 A HK18111665 A HK 18111665A HK 1252369 A1 HK1252369 A1 HK 1252369A1
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phospholipid
taxol
nano
mice
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HK18111665.1A
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庄其穆
莊其穆
张启泰
張启泰
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友杏生技医药股份有限公司
友杏生技醫藥股份有限公司
建州生技医药有限公司
建州生技醫藥有限公司
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Description

利用纳米颗粒治疗肿瘤的组合物和方法
背景技术
卵巢癌是从卵巢产生的癌性生长。大多数(超过90％)卵巢癌被归类为″上皮的″，并且被认为是从卵巢的表面(上皮)产生。然而，一些证据表明输卯管也可能是一些卵巢癌的来源。由于卵巢和输卯管彼此密切相关，因此认为这些输卯管癌细胞可以模拟卵巢癌。其他类型的卵巢癌可能由卯细胞(生殖细胞肿瘤)或支持细胞引起。卵巢癌包括在妇科癌症类别中。
卵巢癌的治疗通常涉及化疗和手术，并且有时涉及放疗。手术治疗可能对于分化良好且限于卵巢的恶性肿瘤是足够的。对于限于卵巢的侵袭性更强的肿瘤，可能需要添加化疗。对于晚期疾病患者，手术缩减与联合化疗方案的组合是标准疗法。
对于已成功进行最佳减瘤的IIIC期上皮性卵巢腺癌患者，最近的一项临床试验表明，接受腹膜内(IP)化疗的患者的中位存活期显著更长。该临床试验中的患者报告了较低的IP化疗依从性，并且不到一半的患者接受了IP化疗的所有六个周期。尽管″退出″率很高，但该组整体上(包括没有完成IP化疗治疗的患者)比单独接受静脉内化疗的患者的平均存活时间更长。虽然已推荐IP化疗作为卵巢癌一线治疗的医护标准，但该建议的依据受到质疑，并且尚未成为III期或IV期卵巢癌的标准治疗。
结肠癌是最常见的癌症类型之一。腹膜扩散是结肠癌的末期。腹膜癌扩散是恶性腹水的最常见成因；来自恶性肿瘤细胞的流体的产生和泄漏导致细胞外流体渗入腹腔中。腹膜癌扩散是结肠癌患者死亡的主要原因之一。
纳米技术与常规化疗的组合已经产生了一种新的治疗策略，该治疗策略旨在使抗癌取得重大进展。目前在临床实践中使用的纳米颗粒(NP)，例如脂质体和白蛋白，旨在提高溶解度和功效，同时降低不良副作用。增强的渗透和滞留(EPR)效应正在成为纳米药物开发的金标准。
发明内容
在一个方面，本文提供了用于腹膜内治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在纳米颗粒中的抗癌剂，其中纳米颗粒的特征在于及时地缓慢释放抗癌剂，从而允许有效杀死肿瘤细胞。
在另一个方面，本文提供了用于通过区域递送治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在持续释放纳米颗粒中的抗癌剂，其中胸膜内施用该抗癌剂纳米颗粒。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度等同于特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1A-1F示出了持续释放脂质体紫杉醇的示例性特征和协同作用。(1A)通过透射电子显微术证实了脂质体的单层形态，该脂质体估计具有100nm的平均大小。(1B)体外药物溶出释放数据的数学处理表明，紫杉醇以每24小时30％或更低的速率从脂质体的释放遵循Higuchi释放动力学(时间的平方根，R2＝0.9864)，表明了具体的扩散控制模型。(1C)通过全身或区域递送的纳米泰素(Nano-Taxol)相比于的肿瘤内药物浓度。纳米泰素的区域递送达到了最高AUC0-∞。(1D)纳米泰素区域递送相比于泰素全身传递(目前针对卵巢癌的标准治疗)后，肿瘤凋亡测定的流式细胞术。前一组(75.2％)的凋亡明显高于后一组(23.3％)。(1E)Chou-Talalay图，即y轴上的联合指数相对于x轴上的效果水平(Fa)的图。六个实验点的药物联合指数均小于1，表明纳米药物与区域递送之间的协同效应。(1F)归一化的等效线图。阈值线以下的值表示协同组合。一式三份重复实验。
图2A-D示出了纳米泰素的区域递送的示例性治疗效果。(2A)治疗方案。每次治疗以基本药物10mg/kg/小鼠施用泰素和纳米泰素。(2B)治疗功效的评价。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×105个/小鼠)，并在第5天、第8天和第11天以指定剂量治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光成像。的区域递送显示出一定的功效。然而，纳米的区域递送显示出最佳的肿瘤杀伤功效。Cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)是紫杉醇的媒介物。EP，空颗粒。(2C)各组中总存活期的风险比。纳米泰素的区域递送显示出仅0.4的风险比(*，P＜0.05)。(2D)每组中的白细胞计数。纳米泰素组的区域递送与组的全身递送的平均白细胞计数没有统计学差异。一式三份重复实验。
图3A-D示出了纳米铂(Nano-platin)的区域递送的示例性治疗效果。(3A)治疗方案。每次治疗以基本药物5mg/kg/小鼠施用顺铂和纳米铂。(3B)治疗功效的评价。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×105个/小鼠)，并在第5天和第10天以指定剂量治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光成像。顺铂的区域递送显示出一定的治疗效果。然而，纳米铂的区域递送几乎没有显示出治疗效果。(3C)各组中总存活期的风险比。(3D)每组中的白细胞计数。一式三份重复实验。
图4A-D示出了纳米拓扑替康的区域递送的示例性治疗效果。(4A)治疗方案。每次治疗以基本药物10mg/kg/小鼠施用拓扑替康和纳米拓扑替康。(4B)治疗功效的评价。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×105个/小鼠)，并在第5天和第10天以指定剂量治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光成像。拓扑替康的区域递送显示出一定的治疗效果。然而，纳米拓扑替康的区域递送显示出最佳的治疗效果(*，P＜0.05)。(4C)各组中总存活期的风险比。(4D)每组中的白细胞计数。一式三份重复实验。
图5A-D示出了纳米多柔比星的区域递送的示例性治疗效果。(A)治疗方案。每次治疗以基本药物5mg/kg/小鼠施用多柔比星和纳米多柔比星。(B)治疗功效的评价。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×105个/小鼠)，并在第5天和第10天以指定剂量治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光成像。多柔比星的区域递送显示出一定的治疗效果。(C)各组中总存活期的风险比。(D)每组中的白细胞计数。一式三份重复实验。
图6A-D示出了的区域递送的示例性治疗效果。(A)治疗方案。每次治疗以基本药物10mg/kg/小鼠施用泰素和Abraxane。(B)治疗功效的评价。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×105个/小鼠)，并在第5天、第8天和第11天以指定剂量治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光成像。的区域递送显示出一定的功效。然而，的区域递送几乎没有显示出肿瘤杀伤功效。EP表示空颗粒(白蛋白)。(C)各组中总存活期的风险比。(D)每组中的白细胞计数。一式三份重复实验。
图7A-D示出了抑制重要器官转移的纳米泰素的区域递送的说明性效果。(7A)肝转移的控制。在第1天(d1)通过向小鼠脾中注射肿瘤细胞来诱发肝转移。指定组的小鼠在第8天(d8)、第11天(d11)和第14天(d14)接受治疗。在第18天(d18)取出肝。纳米泰素的区域递送(腹膜内)显示出对肝转移的最佳控制。示出了代表性的图。箭头指示肿瘤。(7B)肺转移的控制。在第1天(d1)通过向小鼠的尾静脉注射肿瘤细胞诱发肺转移。接受纳米泰素区域递送(腹膜内)的治疗的小鼠显示出对肺转移的最佳控制。(7C)采用纳米泰素的腹膜内递送或不采用纳米泰素的腹膜内递送(对照)治疗的腹膜后淋巴结转移的照片。(7D)采用或不采用纳米泰素腹膜内递送治疗的不同器官的总存活期的风险比分析。
图8A-H示出了发挥出更有效杀伤癌症干细胞作用的纳米泰素的区域递送的说明性结果。(8A)所治疗的肿瘤的肿瘤球形成能力。在第1天向小鼠植入ES-2细胞(2×106个/小鼠)，并在第5天、第8天和第11天以指定剂量治疗小鼠。在第14天取出每个指定组的肿瘤。将肿瘤解离成单细胞悬浮液，并在超低培养皿(ultralow dish)中培养10天。区域递送中的肿瘤几乎没有显示出微球形成，而其他三个治疗组(静脉内腹膜内静脉内纳米泰素)中的肿瘤显示出增加的微球形成。示出了代表性的图。(8B)肿瘤球形成的总结(平均值±SD)。(8C)Hoechst 33342染色细胞的流式细胞术分析和侧群细胞的鉴定。示出了侧群细胞的百分比。(D-G)针对以下各项的RT-PCR分析：干细胞标志物的表达(8D)，上皮-间质转化(EMT)驱动子的基因和上皮或间质表型的表达(8E)，肿瘤血管生成的基因(8F)，以及多药耐药性的基因(8G)。(8H)干细胞维持中的CXCR4/CXCL12轴。与对照组相比，在区域递送中的肿瘤显示出CXCR4/CXCL12表达的受损，而其他三个治疗组(静脉内腹膜内静脉内纳米泰素)中的肿瘤相比于对照组显示出增加的CXCR4/CXCL12表达。一式三份重复实验。
图9A-D示出了可以代替腹膜内热化疗的纳米泰素的区域递送的说明性结果。(9A)取出复发性肿瘤并提交用于对Hoechst 33342染色的侧群细胞进行流式细胞术分析。复发性肿瘤(3.6％，右图)中的侧群百分比明显高于原发性肿瘤(0.4％，左图)，表明复发性肿瘤含有更多的癌症干细胞。(9B)腹膜内热化疗的图示。描绘了流入口和流出口以及用来监测灌注期间小鼠的内部温度的肛门温度探针。用(10mg/kg)以3mL/min的速率向小鼠灌注1h。(9C)的腹膜内热化疗(HIPEC)和纳米泰素的腹膜内递送即使在含有复发性肿瘤细胞的情况下也能实现良好的肿瘤控制。(9D)HIPEC组中HIPEC的并发症较高，并呈现出肠梗阻或穿孔。在腹膜内纳米泰素组中没有出现并发症。一式三份重复实验。
图10提供了根据本发明的实践制备合适的纳米颗粒的指导。在两种极端条件(太松或太紧的偶联物)下，纳米药物产生不令人满意的肿瘤杀伤。太松的偶联物表现得像游离药物，其产生中等效果。太紧的偶联物几乎不产生效果。仅有持续释放纳米药物的及时区域递送产生令人满意的肿瘤杀伤。
图11示出了BLI与体外细胞生长之间的相关性。将指定细胞数的ES2-luc在24hr内在37s下接种到24孔培养皿中。24hr后，通过IVIS-50系统捕获BLI。
图12A-B示出了BLI与SCID小鼠中细胞生长之间的相关性。在第1天向小鼠植入ES2-luc细胞(5×105个/小鼠)。在指定的日期捕获BLI。一只小鼠在第17天死亡。
图13示出了纳米泰素或胶束泰素的肿瘤生长抑制的说明性结果。在第1天向小鼠接种ES2-luc细胞(5×105个/小鼠)，并在第5天、第8天和第11天用指定剂量的纳米泰素或胶束泰素进行治疗。在第4天(基线)和第14天捕获BLI。在IVIS分析前，一只小鼠在胶束泰素的静脉内和腹膜内给药后死亡。
图14提供了使用Xenogen IVIS-50和Living Image软件(Caliper LifeSciences)对图13的BLI结果的定量。数据以平均值±数据表示，N＝11(纳米泰素)，N＝10(胶束泰素)。
图15A-B示出了10mg/kg胶束泰素和10mg/kg纳米泰素治疗的肿瘤生长抑制结果。在第1天向小鼠植入ES2-luc细胞(5×105个/小鼠)，并且在第5天、第8天和第11天用10mg/kg的纳米泰素或胶束泰素治疗小鼠。在第4天(基线)和第14天捕获BLI。
图16A-G提供了荷瘤小鼠的腹腔的解剖图像。荷瘤小鼠显示出不同程度的腹水形成。A(对照组)和B(静脉内胶束泰素组)的解剖图显示出最严重的带血腹水。用胶束泰素或纳米泰素通过腹膜内治疗(C至G)后，形成的腹水少于A和B中的腹水。小鼠死亡后，解剖所有小鼠。(A、B在第19天；C、F、G在第21天；D、E在第26天)。
图17示出了使用IVIS系统的说明性腹水癌细胞。从图16A所示的对照组小鼠中收集腹水，并进行细胞培养。然后采用IVIS系统分析培养的细胞。细胞显示BLI信号，证明腹水含有人卵巢癌ES2-luc细胞。
图18示出了与图17相关的动物研究的小鼠体重的说明性结果。
图19示出了用胶束泰素或纳米泰素治疗后，腹膜内注射ES2-luc的小鼠模型的存活的说明性结果。在第1天将ES2-luc细胞(5胞(-5个细胞)接种到小鼠的腹腔中。在第5、8和11天施用作为媒介物对照的盐水(·)、静脉内胶束泰素(10mg/kg：ο)、腹膜内胶束泰素腹膜内纳米泰素(2mg/kg：Δ)、腹膜内纳米泰素腹膜内纳米泰素(10mg/kg：□)或腹膜内纳米泰素(20mg/kg：◆)，并分析存活时间(n＝11，纳米泰素组；n＝10，胶束泰素组)。该存活基于图13的小鼠。
图20示出了用10mg/kg胶束泰素或纳米泰素治疗后，腹膜内注射ES2-luc的小鼠模型的存活的说明性结果。在第1天将ES2-luc细胞(5胞(-5个细胞)接种到小鼠的腹腔中。在第5、8和11天施用作为媒介物对照的盐水(·)、腹膜内胶束泰素(10mg/kg：ο)、腹膜内纳米泰素并分析存活时间(对照组，n＝3；胶束泰素和纳米泰素组，n＝7)。该存活数据基于图15的小鼠的结果。
图21示出了BLI与体外细胞生长之间的相关性。将CT-26-luc细胞在24hr内在37s下以指定数目接种到24孔培养皿中。24hr后，通过IVIS-50系统捕获生物发光图像。
图22A-B示出了BLI与SCID小鼠中细胞生长之间的相关性。在第一天向小鼠植入CT-26-luc细胞(1×105个/小鼠)。在指定的日期捕获生物发光图像。
图23A示出了纳米泰素或PTX的肿瘤生长抑制的说明性结果。在第1天向小鼠接种CT-26-luc细胞(1×105个/小鼠)，并在第4天、第6天和第8天用指定剂量的纳米泰素或PTX进行治疗。在第4天(基线)和第14天捕获生物发光图像。
图23B提供了使用Xenogen IVIS-50和Living Image软件(Caliper LifeSciences)对图23A的BLI结果的定量。数据以平均值±数据表示，N＝8(纳米泰素)，N＝7(PTX和对照)。
图24示出了与图23A-B相关的动物研究的小鼠体重的说明性结果。
图25示出了用纳米泰素或PTX治疗后，腹膜内注射CT-26-luc的小鼠模型的存活的说明性结果。在第1天将CT-26-1uc细胞(1胞(25个细胞)接种到小鼠的腹腔中。在第4、6和8天施用作为媒介物对照的盐水(·)、静脉内10mg/kg PTX(ο)、腹膜内10mg/kg静脉内10mg/kg纳米泰素(Δ)、腹膜内10mg/kg纳米泰素并分析存活时间(对照组和PTX组，n＝7；纳米泰素组，n＝8)。该存活基于图23的小鼠。
具体实施方式
所有基于NP的药物均使用EPR效应作为指导原则。理论上，NP的使用应通过延长药物在系统循环中的半衰期来获得药代动力学优势。然而，尽管存在这种药代动力学优势和关于纳米技术的许多出版物和专利，但成功仍然仅限于几种纳米药物。此外，肿瘤靶向的药物递送领域的主要缺陷之一涉及EPR效应经常被高估和/或被误解的事实。
举例来说，虽然对于第一种被FDA批准的纳米药物聚乙二醇化脂质体多柔比星(DOXIL，Johnson&Johnson Pharmaceutical Research&Development，L.L.C.，Raritan，NJ；CAELYX，Schering-Plough Corporation，Kenilworth，NJ)，已经证实了增加的肿瘤积累，但对与游离多柔比星在治疗转移性乳腺癌方面进行比较的两个III期试验实际上并未将EPR效应转化为肿瘤反应率和总存活期在统计学上显著的改善。另一种被批准的纳米药物(一种基于EPR的白蛋白结合紫杉醇)需要使用比游离紫杉醇高50％的剂量来实现肿瘤反应率和无进展存活期，仍然没有实现转移性乳腺癌的总存活期的增加(65.0周相比于55.7周，P＝0.374)。此外，关键的III期研究导致批准用于治疗转移性非小细胞肺癌，与常规紫杉醇的11.2个月相比，的中位总存活期仅为12.1个月，仅有0.9个月的生存益处(P＝0.271)。由于总存活期仍然是药物结果评价的金标准，因此，对于大多数目前批准的纳米药物来说，利用EPR效应几乎不能转化为真正的抗肿瘤功效。
紫杉醇是用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和其他癌症的药物。紫杉醇是由美国国家癌症研究所资助的筛查计划(U.S.National Cancer Institute-fundedscreening program)发现的；从太平洋紫杉(Pacific yew)——短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的树皮中分离得到，因此其名称为″泰素(taxol)″。其由Bristol-MyersSquibb商业开发，通用名称已经改为″紫杉醇(paclitaxel)″，且商标变为泰素(Taxol)。其他商标包括临床医生有时使用缩写″PTX”代表紫杉醇，因为它不是唯一的标识符，因此不鼓励。因此，除非另有说明或描述，否则紫杉醇是指泰素(taxol)、泰素(Taxol)、PTX或与紫杉醇具有相同结构的其他名称。
区域化疗，例如腹膜内化疗，利用了腹膜-血浆曲线下面积与含肿瘤的腹腔的比例增加的药代动力学优势。区域化疗的合理应用的临床相关实例包括在卵巢癌患者中腹膜内递送顺铂(与全身隔室相比，腹腔暴露增加20倍)，以及氟尿苷的肝动脉输注(与门静脉输注药物相比，肿瘤药物水平高15倍)。然而，尽管存在这种药代动力学优势，但腹膜内治疗的临床应用已经由于小分子量药物从腹腔中的过早清除、缺乏靶标特异性以及药物向靶组织中的渗透较差而受到挑战。
纳米技术和区域化疗(即纳米药物的区域递送)的组合可以弥补彼此的局限性。这有潜在的几个优势。首先，纳米药物的区域递送可以具有区域化疗和NP组合的如先前所讨论的双重药代动力学优势。第二，用于区域递送的疏水性、水溶性差的化疗剂的应用具有一些严重问题，因为低水溶性导致弱吸收性和低生物利用度，纳米技术可以改善难溶性药物的水溶性，因此可支持更多的候选药物用于区域化疗。第三，一些常规药物如5-氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、紫杉醇和喜树碱的抗癌活性主要是细胞周期依赖性的，需要更长的暴露时间。纳米药物的持续释放功能可以解决这一固有的局限性。第四，快速清除通常通过常规化疗的区域递送来限制药物暴露，并且导致需要重复给药。并且进一步地，通过腹膜内递送的常规化疗腹腔中的高药物浓度通常引起局部毒性。纳米技术可以通过利用可以解决前述问题的持续释放能力来增强常规的区域化疗。
纳米技术与常规化疗的组合已经产生了一种新的治疗策略，该治疗策略旨在使抗癌取得重大进展。目前在临床实践中使用的纳米颗粒(NP)，例如脂质体和白蛋白，旨在提高溶解度和功效，同时降低不良副作用。增强的渗透和滞留(EPR)效应正在成为纳米药物开发的金标准。
为了加快药物开发的步伐，并研究是否绕过EPR效应可影响纳米药物的治疗功效，在这项研究中，测试了几种被批准或开发的纳米药物，包括脂质体紫杉醇(命名为纳米泰素，Industrial Technology Research Institute，Taiwan)、并入顺铂的聚合物胶束(命名为纳米铂，NanoCarrier Co.，Ltd.，Kashiwa，Japan)、聚合物胶束拓扑替康(命名为纳米拓扑替康，Taiwan Liposomal Company，Taiwan)、聚乙二醇化脂质体多柔比星(命名为纳米多柔比星，Doxil/Caelyx，Merck&Co.，Whitehouse Station，New Jersey，USA)和白蛋白结合紫杉醇(命名为Celgene，NJ，USA)。使用因素1(全身递送相比于区域递送)和因素2(游离药物相比于纳米药物)实施2-因素析因设计。对于每个析因设计，活性药物以等剂量给予。
进行用于腹膜内治疗例如卵巢癌、结肠癌或其他癌症的选定纳米颗粒递送的体内研究。
根据本发明的实践，通过将本文所述的纳米药物并入到促进持续药物释放的特殊设计的递送基质中，可以克服与抗癌剂的腹膜内化疗相关的缺点。提出示例性纳米药物，例如纳米泰素和胶束泰素，在腹膜内施用后抑制体内卵巢肿瘤的生长(参见例如实施例7)。在20mg/kg下，纳米泰素在11只小鼠的8只中显示出剂量依赖性抗肿瘤活性，并且几乎完全根除了腹腔中的卵巢癌。在10mg/kg下，11只小鼠中有3只发现肿瘤根除，并且11只小鼠中有8只肿瘤负荷减少。反应率为100％。
在人异种移植肿瘤小鼠模型中显示纳米泰素通过腹膜内施用有效地治疗卵巢癌(参见例如实施例7)。为了探究纳米泰素腹膜内施用在其他腹部癌症中的效果，研究了在结肠癌同源小鼠模型中通过腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)施用的纳米泰素的抗癌活性(参见例如实施例8)。发现纳米泰素在腹膜内施用后抑制了结肠癌CT-26-luc细胞在体内的生长。
在一些实施方案中，提供了用于腹膜内治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在纳米颗粒中的抗癌剂，其中纳米颗粒的特征在于及时地缓慢释放抗癌剂，从而允许有效杀死肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的特征在于基于体外溶出研究以每24小时30％或更低的速率缓慢释放抗癌剂。在一些实施方案中，所述癌症为卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌或结肠癌。在某些实施方案中，所述癌症为卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症为结肠癌。
在某些实施方案中，所述抗癌剂包括吉西他滨(gemcitabine)、伊达比星/阿糖胞苷、磷酸依托泊苷、格列卫、替莫唑胺、硼替佐米、来曲唑、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、紫杉醇、nab-紫杉醇、多西他赛、埃罗替尼、培美曲塞、培美曲塞/卡铂、紫杉醇/卡铂、来曲唑/环磷酰胺、替西罗莫司(temsirolimus)、贝伐珠单抗/替西罗莫司、依普利单抗(lpilimumab)、RAD001、帕唑帕尼、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212、PF-05212384/伊立替康、AZD2171、PF-04691502、环磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷/道诺霉素、替西罗莫司(tersirolimus)、埃罗替尼/替西罗莫司、卡培他滨、他莫昔芬、硼替佐米、曲妥珠单抗、多西他赛/卡培他滨、曲妥珠单抗/替吡法尼、替吡法尼/吉西他滨(gemcitabline)、拓普替康或其组合。在某些实施方案中，所述抗癌剂为紫杉醇。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒(抗癌剂封装在其内)包含：第一磷脂，该第一磷脂选自氢化的天然磷脂和具有长碳链(-(CH2)n-，其中n至少为14)的饱和磷脂，并且具有在40至74℃范围内的相转变温度Tg1；第二磷脂，其选自不饱和磷脂和具有短碳链(-(CH2)n-，其中n至多为14)的饱和磷脂，并且具有在-30至10℃范围内的相转变温度Tg2；有效地形成脂质体的脂质体形成物质，在该脂质体中第一磷脂与第二磷脂共存于两个不混溶的相中，并且产生若干个不连续的区域，并且其中第一磷脂与第二磷脂的摩尔比至少为3∶16；并且所述抗癌剂以至少20摩尔％的量并入脂质体中以形成配制的脂质体。在某些实施方案中，所述纳米颗粒具有在六个月或更长时间内保持至少约70％的并入效率的并入效率。在某些实施方案中，第一磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰酸(PA)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在某些实施方案中，第一磷脂选自氢化卯磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)和二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。本文所述的非排他性的示例性纳米颗粒为纳米泰素。
在一些实施方案中，本文公开的适合用于腹膜内治疗癌症的纳米颗粒包含一种或多种嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含疏水嵌段、与该疏水嵌段键合的亲水嵌段以及一种或多种两性离子。在某些实施方案中，具有一个正电荷和一个负电荷的两性离子与所述疏水嵌段的末端键合。在某些实施方案中，所述疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚戊内酯(PVL)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丁内酯(PBL)、聚乙交酯或聚丙内酯(PPL)；并且所述亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)或聚-γ-谷氨酸(PGA)。
在一些实施方案中，本文公开的适合用于腹膜内治疗癌症的纳米颗粒包含聚合物胶束(如胶束泰素)，该聚合物胶束包含下式的嵌段共聚物：其中R代表氢原子、C1-6烷基基团、苄基基团或酰基基团；且m和n各自独立地为10-100的整数。在某些实施方案中，所述聚合物胶束具有在约20nm至约1000nm范围内的直径。在某些实施方案中，所述聚合物胶束具有疏水内部和亲水表面。
在一些实施方案中，提供了用于通过区域递送治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在持续释放纳米颗粒中的抗癌剂，其中胸膜内施用该抗癌剂纳米颗粒。在某些实施方案中，所述癌症为卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌或结肠癌。在某些实施方案中，所述癌症是转移癌。在一些实施方案中，所述受试者在腹腔中具有严重的粘连。在某些实施方案中，所述抗癌剂为紫杉醇。
某些药学和医学术语
除非另有说明，否则本申请(包括说明书和权利要求书)中使用的以下术语具有以下给出的定义。必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如在本说明书和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示对象。除非另有说明，否则采用质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。在本申请中，除非另有说明，否则“或”或“和”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“包括”的使用并非限制性的。本文所用的章节标题仅仅是为了组织编排目的，而不应理解为限制所描述的主题。
如本文使用的，关于制剂、组合物或成分的术语“可接受的”意指对所治疗的受试者的一般健康没有持续的不利影响。
如本文使用的，术语“载体”是指促进化合物被引入细胞或组织中的相对无毒的化学化合物或试剂。
如本文使用的，术语“共同施用”或类似用语意在包括对一名患者施用多种选定的治疗剂，并且旨在包括通过相同或不同的给药途径或者在相同或不同的时间施用多种药剂的治疗方案。
术语“稀释剂”是指用于在递送前稀释目的化合物的化学化合物。稀释剂也可用于稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。本领域中利用溶解于缓冲的溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。
如本文使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以在一定程度上缓解所治疗的疾病或状况的一种或多种症状的药剂或化合物的给药量。结果可以是疾病的指征、症状或病因的减轻和/或缓解，或者是生物系统的任何其他期望的变化。例如，用于治疗性应用的“有效量”是包含本文公开的化合物的组合物的量，该量是导致疾病症状的临床上显著的减轻所需要的。在任何单独情况下，适当的“有效”量可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定。
如本文使用的，术语“增强”意指所需效果在效力或持续时间上的提高或延长。因此，关于增强治疗剂的效果，术语“增强”是指在效力或持续时间上提高或延长其他治疗剂对系统的效果的能力。如本文使用的，“增强有效量”是指足以增强另一种治疗剂在所需系统中的效果的量。
如本文使用的术语“药物组合”意指通过混合或组合超过一种活性成分而得到的产物，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”意指将活性成分例如封装在本文所述的纳米颗粒中的抗癌剂和联合药剂以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指将活性成分例如封装在本文所述的纳米颗粒中的抗癌剂和联合药剂作为单独的实体同时、并行地或顺序地施用于患者，而没有具体的间隔时间限制，其中这样的施用在患者体内提供这两种化合物的有效水平。后者也应用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种活性成分的施用。
术语“药物组合物”是指封装在本文所述的纳米颗粒中的抗癌剂与诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂等其他化学组分的混合物。药物组合物有利于将化合物施用于生物体。本领域中存在多种施用化合物的技术，包括但不限于：静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、经眼、经肺和局部施用。
术语“受试者”或“患者”包括哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳纲的任何成员：人，非人灵长类动物，如黑猩猩以及其他猿和猴物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。在一个实施方案中，该哺乳动物是人。
如本文使用的，术语“治疗”或“处理”包括预防性地和/或治疗性地缓解、消除或改善疾病或状况的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或状况，例如阻止疾病或状况的发展、缓解疾病或状况、使疾病或状况消退、缓解由疾病或状况引起的病状，或者终止疾病或状况的症状。
药物制剂
在一些实施方案中，提供了根据US 7,485,320、US 8,124,128和US 8,420,119(每个文献均通过引用并入本文用于此类公开)的实践制备的包含治疗有效量的紫杉醇纳米颗粒的药物组合物。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含封装在纳米颗粒内的抗癌剂(例如紫杉醇)，该纳米颗粒包含：第一磷脂，该第一磷脂选自氢化的天然磷脂和具有长碳链(-(CH2)n-，其中n至少为14)的饱和磷脂，并且具有在40至74℃范围内的相转变温度Tg1；第二磷脂，其选自不饱和磷脂和具有短碳链(-(CH2)n-，其中n至多为14)的饱和磷脂，并且具有在-30至10℃范围内的相转变温度Tg2；有效地形成脂质体的脂质体形成物质，在该脂质体中第一磷脂和第二磷脂共存于两个不混溶的相中，并且产生若干个不连续的区域，并且其中第一磷脂与第二磷脂的摩尔比为至少3∶16；并且所述抗癌剂以至少20摩尔％的量并入脂质体中以形成配制的脂质体。在某些实施方案中，配制的纳米颗粒具有在六个月或更长时间内保持至少约70％的并入效率的并入效率。在某些实施方案中，第一磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰酸(PA)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在某些实施方案中，第一磷脂选自氢化卯磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)和二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。本文所述的非排他性的示例性纳米颗粒为纳米泰素。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含封装在所述纳米颗粒内的抗癌剂(如紫杉醇)，该纳米颗粒包含一种或多种嵌段共聚物，该嵌段共聚物含有疏水嵌段、与疏水嵌段键合的亲水嵌段以及仅一种两性离子，其中该两性离子(具有一个正电荷和一个负电荷)与所述疏水嵌段的末端键合；所述疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚戊内酯(PVL)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丁内酯(PBL)、聚乙交酯或聚丙内酯(PPL)；并且所述亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)或聚-γ-谷氨酸(PGA)。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含封装在聚合物胶束(如胶束泰素)内的抗癌剂(例如紫杉醇)，该聚合物胶束包含下式的嵌段共聚物：其中R代表氢原子、C1-6烷基基团、苄基基团或酰基基团；并且可相同或不同的m和n各自为10-100的整数。
例如，所述抗癌剂可为吉西他滨、伊达比星/阿糖胞苷、磷酸依托泊苷、格列卫、替莫唑胺、硼替佐米、来曲唑、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、紫杉醇、nab-紫杉醇、多西他赛、埃罗替尼、培美曲塞、培美曲塞/卡铂、紫杉醇/卡铂、来曲唑/环磷酰胺、替西罗莫司、贝伐珠单抗/替西罗莫司、依普利单抗、RAD001、帕唑帕尼、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212、PF-05212384/伊立替康、AZD2171、PF-04691502、环磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷/道诺霉素、替西罗莫司、埃罗替尼/替西罗莫司、卡培他滨、他莫昔芬、硼替佐米、曲妥珠单抗、多西他赛/卡培他滨、曲妥珠单抗/替吡法尼、替吡法尼/吉西他滨、拓普替康(tootecan)或其组合。本领域技术人员将容易根据本发明实践选择合适的其他抗癌剂。在某些实施方案中，所述抗癌剂为紫杉醇。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含封装在合适的纳米颗粒(如纳米泰素)或聚合物胶束(如胶束泰素)中的任何抗癌剂，其中所述抗癌剂及时地持续释放，从而允许基于图10有效杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明的紫杉醇纳米颗粒包含封装在任何合适的纳米颗粒(如纳米泰素)或聚合物胶束(如胶束泰素)中的紫杉醇，其中紫杉醇及时地持续释放，从而允许基于图10有效杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，纳米颗粒的特征在于基于透析以每8小时30％或更低的速率缓慢释放抗癌剂。参见US 8,420,119的实施例(例如，图1和表2)。
如本文使用的，在一些实施方案中提供的药物组合物是指本发明的纳米颗粒与其他化学组分如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。在某些实施方案中，该药物组合物有助于将化合物施用于生物体。在一些实施方案中，为实施本文提供的治疗或使用方法，将治疗有效量的本文所述的纳米颗粒以药物组合物的形式施用于患有待治疗的疾病或状况的哺乳动物。在特定实施方案中，该哺乳动物是人。在某些实施方案中，治疗有效量根据疾病的严重程度、受试者的年龄及相对健康状况、所使用的抗癌剂的效力以及其他因素而变化。本文所述的纳米颗粒单独使用，或与一种或多种作为混合物组分的治疗剂联合使用。
用于制备包含本文所述的本发明纳米颗粒的组合物的方法包括将纳米颗粒与一种或多种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体一起配制，以形成固体、半固体或液体。本文所述的药物组合物的形式包括液体溶液或悬浮液，适于使用前在液体中制成溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳液。这些组合物任选地也含有少量的无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。
药物组合物还任选地包含增溶剂，以有助于本发明的纳米颗粒的溶解度。术语“增溶剂”通常包括导致形成药剂的胶束溶液或真溶液的试剂。某些可接受的非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯80，可用作增溶剂，也可使用眼部可接受的二醇、聚二醇(例如聚乙二醇400)和二醇醚。
此外，在一些实施方案中的药物组合物任选地包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括：酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。以维持组合物的pH处于可接受范围内所需的量包含这样的酸、碱和缓冲液。
此外，药物组合物任选地以使组合物的摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量包含一种或多种盐。这样的盐包括含有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
其他药物组合物任选地包含一种或多种防腐剂，用以抑制微生物的活性。合适的防腐剂包括：含汞物质，如硼酸苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定化的二氧化氯；以及季铵化合物，如苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲胺和氯化十六烷基吡啶。
另外的其他药物组合物包含一种或多种表面活性剂，用以增强物理稳定性或用于其他目的。示例性的合适的非离子型表面活性剂包括：聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇10(octoxynol 10)、辛苯昔醇40。
另外其他的药物组合物可包含一种或多种抗氧化剂，用以在需要时增强化学稳定性。仅举例来说，合适的抗氧化剂包括抗坏血酸和焦亚硫酸钠。
在某些实施方案中，药物组合物水性悬浮液被包装于不可重新封闭的单剂量容器中。或者，使用可重新封闭的多剂量容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。
在某些实施方案中，本文所述的制剂包含一种或多种抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基化合物和/或其他普通稳定剂。这样的稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v的甘油，(b)约0.1％至约1％w/v的甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v的单硫代甘油，(d)约1mM至约10mM的EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v的抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v的聚山梨酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v的聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(1)多硫酸戊聚糖酯及其他类肝素，(m)二价阳离子如镁离子和锌离子；或(n)它们的组合。
联合治疗的总体考虑
通常，本文所述的组合物和(在基于本文所述的作用模式采用联合治疗的实施方案中)其他药剂无需在同一药物组合物中进行施用，并且在一些实施方案中，由于物理及化学特性不同，它们通过不同的途径给药。在一些实施方案中，根据确立的方案进行初始给药，而后由熟练的临床医生基于所观察到的效果改变剂量、给药方式及给药时间。
在一些实施方案中，当药物在治疗组合中使用时，治疗有效剂量发生变化。联合治疗进一步包括在不同的时间开始和结束的定期治疗，以便帮助对患者的临床处理。对于本文所述的联合治疗，共同施用的化合物的剂量根据所使用的联合药物的类型，所使用的具体药物，所治疗的疾病、病症或状况等而变化。
应当理解，在一些实施方案中，根据多种因素改变用于治疗、预防或改善寻求缓解的状况的剂量方案。这些因素包括受试者所患的病症，以及受试者的年龄、体重、性别、饮食及医疗状况。因此，在其他实施方案中，实际使用的剂量方案变化很大，且因此偏离本文所述的剂量方案。
实施例
实施例1.用于产生肿瘤的动物模型和细胞系的制备
在第0天(d0)将人卵巢癌细胞系ES-2(每只小鼠2×105个细胞，ATCC号CRL-1978)单次腹膜内注射入5周龄的SCID小鼠(CB.17 scid/scid)中，以开始产生肿瘤，这在3周内经由腹胀和恶性腹水得到证实。动物购自台北的实验室动物育种研究中心(NationalLaboratory Animal Breeding and Research Center，Taipei)，并保存在台北退伍军人医院(Taipei Veterans Hospital)(台湾，台北)的肿瘤动物设施中。遵照机构动物保健法规(institutional animal health care regulations)使用动物，并且所有的动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。当出现痛苦体征，包括皮毛起皱、呼吸频率快、蜷缩姿势、活动性降低以及腹水逐渐形成时，在终点对荷瘤小鼠施以安乐死。对小鼠组进行治疗。使用因素1(全身递送相比于区域递送)和因素2(游离药物相比于纳米药物)实施2-因素析因设计。对于每个析因设计，活性药物以等剂量给予。若干种被批准或正在开发的纳米药物，包括示例性紫杉醇纳米颗粒(例如，命名为纳米泰素的脂质体紫杉醇，Industrial Technology Research Institute，Taiwan)、并入顺铂的聚合物胶束(命名为纳米铂，NanoCarrier Co.，Ltd.，Kashiwa，Japan)、聚合物胶束拓扑替康(命名为纳米拓扑替康，Taiwan Liposomal Company，Taiwan)、聚乙二醇化脂质体多柔比星(命名为纳米多柔比星，Doxil/Caelyx，Merck&Co.，Whitehouse Station，New Jersey，USA)和白蛋白结合紫杉醇(命名为Celgene，NJ，USA)。基于初步研究，给予每种配对药物(游离药物和纳米药物)给药方案的最大耐受剂量。通过尾静脉注射诱发肺转移，而通过脾注射诱发肝转移，并通过子宫内注射肿瘤细胞诱发腹膜后淋巴转移。每种纳米药物的组成可以从每种纳米药物的来源中找到，并且基于每种纳米药物的来源。例如，所接受的纳米泰素包括氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯。
实施例2.在肿瘤组织中的紫杉醇测定
通过HPLC进行的紫杉醇纳米颗粒的体外释放动力学
使用透析法在室温下进行示例性紫杉醇纳米颗粒(例如，紫杉醇从脂质体)释放的测定，并与从没有采用任何纳米颗粒处理的紫杉醇(″游离紫杉醇″)的释放进行比较。在PBS(pH 7.4)中重建冷冻干燥的脂质体制成1.5mg/mL的紫杉醇后，将各脂质体分散体(0.1mL)的等分试样置于透析管(MWCO 6000-8000，Gene Bio-Application Ltd.，Israel)中并密封。之后，将管浸入200mL释放介质，即含有0.1％(v/v)吐温80的PBS(pH 7.4)中以维持沉降条件。在使用磁力搅拌器以300rpm搅拌释放介质的同时，在24小时内以预定的时间间隔从释放介质中取出样品(0.5mL)，再用相同体积的新鲜介质再填充。经乙腈适当稀释后通过HPLC测定紫杉醇的浓度，而无需进一步处理。
在Agilent 1100系列色谱系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)上进行紫杉醇浓度的分析。使用由SecurityGuardTM串联烧结过滤器(in-linefilter frit)(Torrance，CA，USA)保护的来自Grace(Grace，MA)的C18AltimaTM柱(4.6mmID，150mm；5μm)实现色谱分离。流动相由水、甲醇和乙腈(25∶35∶40，v/v)组成。将流动相通过0.45μm过滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)进行过滤，并在分析前进行脱气。在环境温度下以1.0mL/min的流速运行高效液相色谱(HPLC)系统，并在230nm的波长下进行曲线下面积峰值的定量分析，且整个色谱运行时间为8min。用于紫杉醇定量的校准曲线在紫杉醇的标准浓度范围50-50,000ng/mL内呈线性，相关系数为R2＝0.999。检测限为50ng/mL。
在本实验中，纳米泰素用作主要的试验药物以具有持续释放功能。示出了该药物的透射电子显微镜照片(参见图1A)。应用动力学方程模型，通过使用零阶、一阶和Higuchi方程数学处理释放曲线来计算释放过程(T.Higuchi，Rate of release of medicamentsfrom ointment bases containing drugs in suspension，Journal of pharmaceuticalsciences，50(1961)874-875)。对于Higuchi方程，获得了较高的相关系数，表明基于体外药物溶出研究的游离药物的释放被发现是持续释放的，并且主要由每24小时30％或更低的速率的扩散控制机制所驱动，因为曲线显示了高线性度，相关系数(R2)值为0.9864(图1B)，如在其他已知的脂质体产品中所见。在纳米泰素区域递送组中观察到增加的肿瘤内药物浓度曲线下面积(图1C)和凋亡(图1D)。
实施例3.通过Chou-Talalay法确定纳米药物区域递送的协同作用
存在用于评估协同作用的六个剂量水平。为了计算组合药物效应，采用Chou-Talalay的联合指数(CI)-等效线图方法。观察示例性紫杉醇纳米颗粒(例如纳米泰素)的区域递送以确定组合效应，而纳米泰素的全身递送或游离紫杉醇的区域递送被认为是单一效应。Chou-Talalay法包括通过使用中效方程绘制倍增稀释浓度的每种药剂及其组合的剂量-效应曲线，计算实验效果与累加效应的预测效果的差异有多大。CI＝1、＜1和＞1分别表示累加效应、协同作用和拮抗作用。可以在不同的效果和不同的剂量水平下确定CI值，并且可以通过使用Compusyn软件自动生成等效线图。
显示药物联合指数的Fa-CI图均小于1，表明纳米泰素的区域递送相比于单独的药物(纳米泰素的全身递送或游离泰素的区域递送)产生协同的肿瘤杀伤(图1E)。此外，不同组合比的组合的归一化等效线图也证实了协同的肿瘤杀伤效果(图1F)。
接下来，测定协同肿瘤杀伤效果是否可以转化为真实的肿瘤杀伤。在治疗方案(图2A)下，持续释放的纳米泰素的区域递送展现出比任何治疗方法更好的肿瘤杀伤(图2B)。纳米拓扑替康的区域递送也显示出相同的治疗效果(图4)。然而，纳米铂(图3)、纳米多柔比星(图5)和(图6)的区域递送没有显示出这样的治疗益处。值得注意的是，在本研究中，(图2B)、顺铂(图3)、拓扑替康(图4)和多柔比星(图5)的腹膜内递送确实显示出一定的治疗益处，这与各自对应的人体试验的结果类似(参见，例如，D.S.Alberts，P.Y.Liu，E.V.Hannigan，R.O′Toole，S.D.Williams，J.A.Young，E.W.Franklin，D.L.Clarke-Pearson，V.K.Malviya，B.DuBeshter，Intraperitoneal cisplatin plusintravenous cyclophosphamide versus intravenous cisplatin plus intravenouscyclophosphamide for stage III ovarian cancer，The New England journal ofmedicine，335(1996)1950-1955.-28；D.K.Armstrong，B.Bundy，L.Wenzel，H.Q.Huang，R.Baergen，S.Lele，L.J.Copeland，J.L.Walker，R.A.Burger，G.Gynecologic Oncology，Intraperitoneal cisplatin and pachtaxel 1n ovarian cancer，The New Englandjournal of medicine，354(2006)34-43；H.G.Muntz，T.W.Malpass，K.F.McGonigle，M.D.Robertson，P.L.Weiden，Phase 2 study of intraperitoneal topotecan asconsolidation chemotherapy in ovarian and primary peritoneal carcinoma，Cancer，113(2008)490-496；G.Delgado，R.K.Potkul，J.A.Treat，G.S.Lewandowski，J.F.Barter，D.Forst，A.Rahman，A phase I/II study of intraperitoneallyadministered doxorubicin entrapped in cardiolipin liposomes in patients withovarian cancer，American joumal of obstetrics and gynecology，160(1989)812-817；discussion 817-819)。
经深入观察，本发明证实与各自对应的游离药物相比，纳米药物的全身递送(例如，利用EPR效应)没有显示出治疗益处，表明利用EPR效应几乎不能转化为真正的治疗效果。此外，虽然所有游离药物的区域递送均显示出一定的治疗效果，但并非所有纳米药物的区域递送都显示出治疗效果(纳米泰素和纳米拓扑替康显示治疗效果，但纳米多柔比星和不显示)，表明纳米多柔比星和的游离药物与NP形成太稳定的偶联物，而不能及时地释放游离药物以控制腹膜内的肿瘤。因此，不是所有的纳米药物都适用于区域治疗。
总存活期的风险比表明，纳米泰素的区域递送赋予了最长的存活期(图2C)。各个治疗组之间白细胞计数的减少没有统计学上的差异(图2D)。
在一些实施方案中，提供了持续释放纳米药物的区域递送的方法，其中所述纳米药物抑制重要器官转移。
虽然直接腹膜内传播是非常常见的，但卵巢癌也可能通过淋巴管和造血途径转移。尽管目前存在全身递送的标准治疗，但由此导致的重要器官转移(例如肝或肺)的影响是毁灭性的，且预后极差。与的全身递送相比，纳米泰素的腹膜内递送显著抑制了肿瘤向肝的转移(图7A)。
由于根据本发明的实践，发现纳米泰素的区域递送具有明显的卵巢癌肿瘤杀伤作用，因此将本发明纳米颗粒的区域递送应用于其他癌症如肺转移的治疗。例如，肺转移的动物研究(小鼠模型)显示纳米泰素的胸膜内递送产生了对肺转移的最佳控制(图7B)。相比之下，全身递送的当前标准治疗显示出令人不满意的肿瘤控制。虽然的胸膜内递送显示了一定的治疗功效，但根据本发明实践的纳米泰素的区域递送优于的区域递送。目前，尽管存在标准的全身治疗，但卵巢癌向肺的转移仍然具有较差的预后。纳米泰素的胸膜内递送显示了令人满意的肺转移抑制，甚至对腹膜内转移的抑制。
不受任何理论的约束，基于本文所述的发现，纳米药物的区域递送可以被视为纳米药物向储器的递送。根据本发明的实践，例如一旦储器由于腹腔(人体内最大的腔)中的癌扩散引起的严重的粘连而失效，则胸腔可以代替腹腔作为储器用于纳米药物的递送。游离药物从储器的持续释放有效地控制了局部肿瘤(如肺转移)，而且也控制了远处转移(如腹膜内转移)。
已知晚期卵巢癌患者中淋巴结转移的存在表明预后不良。目前，除了全身递送外，还没有针对淋巴结转移的其他特异性治疗，并且手术去除腹膜后淋巴结作为最大细胞减灭的一部分的作用尚不清楚(E.Halkia，J.Spiliotis，P.Sugarbaker，Diagnosisand management of peritoneal metastases from ovarian cancer，Gastroenterologyresearch and practice，2012(2012)541842)。基于本文所述的发现，在控制淋巴结转移方面，纳米泰素的腹膜内递送优于的全身递送(图7C)。总存活期的风险比分析进一步证明纳米的区域递送对控制向这些重要器官的转移有显著的治疗效果(图7D)。
根据本发明，示例性紫杉醇纳米颗粒显示出对腹膜后淋巴结转移和肝转移的良好控制。例如，在通过在第1天(d1)向子宫内注射肿瘤细胞诱发小鼠的肝转移，并且小鼠在第8天、第11天和第14天接受治疗，在第18天将小鼠处死的动物模型中，纳米的区域递送(腹膜内)显示了对腹膜后淋巴结转移的最佳控制(图7D)。
在一些实施方案中，提供了用于通过区域递送来治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在持续释放纳米颗粒中的抗癌剂(如纳米泰素、胶束泰素)，其中胸膜内施用该抗癌剂纳米颗粒。在某些实施方案中，所述癌症为转移癌。
在一些实施方案中，紫杉醇纳米颗粒如纳米泰素的区域递送发挥对癌症干细胞的更有效杀伤。
癌症干细胞(CSC)被认为是可能在复发中起到不可或缺的作用的关键肿瘤起始细胞。独特的分子机制允许其耐受大多数化疗。CSC的消耗或CSC分子特征的抑制可以减少复发并改善临床结果(参见，例如，Nguyen等人，“Cancer stem cells：an evolvingconcept，”Nature reviews.Cancer，12(2012)133-143)。癌细胞在治疗后也可能经历适应性改变，从而加重耐药性。在上皮癌中，这些适应性变化可能至少部分地涉及上皮至间质的转化(EMT)。有趣的是，EMT可引发向CSC样表型的逆转，从而提供了EMT、CSC和耐药性之间的关联。
持续释放纳米泰素的区域递送对肿瘤球形成(图8A和8B)和侧群(图8C)的控制最佳。还发现，与其他研究发现相似，泰素的系统和区域递送均增加了肿瘤球形成和侧群，表明了在常规化疗后在肿瘤微环境中常见的CSC增加。值得注意的是，如本文所述，纳米泰素的区域递送压倒性地抑制了肿瘤微环境中的干细胞标志物(图8D)、EMT驱动子和表型(图8E)、血管生成信号(图8F)和多药耐药信号(图8G)。
在一些实施方案中，提供了持续释放纳米药物的区域递送的方法，其中所述纳米药物显示出与腹膜内热化疗(HIPEC)等同的功效。
腹膜癌扩散代表卵巢癌腹膜内热化疗(HIPEC)治疗的主要指征之一。腹膜癌扩散还是胃癌患者最常见的复发形式(15-40％)，并且是结肠癌患者复发的第二种形式。在一些情况下，不受任何特定理论的束缚，在腹膜空间内联合热疗和化疗剂的最重要的药理学原理是更深入的药物渗透。在一些研究中已证明HIPEC增加无进展存活期和总存活期(参见，例如，T.D.Yan，D.Black，R.Savady，P.H.Sugarbaker，A systematic review on theefficacy of cytoreductive surgery and perioperative intraperitonealchemotherapy for pseudomyxoma peritonei.Annals of surgical oncology，14(2007)484-492；T.D.Yan，D.Black，R.Savady，P.H.Sugarbaker，Systematic review on theefficacy of cytoreductive surgery combined with perioperative intraperitonealchemotherapy for peritoneal carcinomatosis from colorectal carcinoma，Journalof clinical oncology：official journal of the American Society of ClinicalOncology，24(2006)4011-4019)。然而，HIPEC程序是耗时的，并且需要护理和医血人员的更多努力，并可能引发潜在的危及生命的并发症。大多数系列的常见并发症是消化瘘，无论是吻合口瘘的形式还是远离吻合口线的肠穿孔的形式。
为了比较纳米泰素的区域递送(其耗时更少，且更省力)与HIPEC，开发了复发性卵巢癌模型来模拟腹膜癌扩散。通过Hoechst 33342染色进行的流式细胞术分析显示复发性肿瘤的侧群百分比高于原发性肿瘤(图9A)，表明复发性肿瘤的化学抗性更强。描绘了HIPEC的程序(图9B)。已经证明，纳米泰素的区域递送和HIPEC具有相当的治疗功效(图9C)，前者显示较少的毒性(图5D)。因此，持续释放功能显示了与热疗相当的功效。
基于本文所述，通过纳米药物的全身递送来利用EPR效应显示出差的治疗功效。虽然EPR效应是肿瘤微环境中的确定现象，但与等剂量的相应游离药物相比，利用这种效应不会产生显著的治疗功效。相比之下，在肿瘤控制方面，通过利用持续释放功能经纳米药物(例如，本文所述的纳米颗粒)的区域递送来绕过EPR效应远优于全身递送。
然而，不是每一种纳米药物都适合于区域递送。
根据本发明的实践，通过区域递送的一些纳米药物没有显示出更好的肿瘤杀伤(例如本研究中的纳米铂、纳米多柔比星和)是由于游离药物与纳米颗粒的共价或非共价偶联物的稳定相互作用(即紧密结合)以及因此导致的不能及时地释放游离药物。例如，某些纳米药物的区域递送在一种极端条件下释放游离药物太快，使得纳米药物表现得像是游离药物(纳米颗粒没有益处或功效)；在另一种极端条件下，纳米药物释放游离药物太慢，导致不抑制或较少地抑制肿瘤生长。只有在这两种极端条件之间具有及时持续释放功能的那些纳米药物才可有效杀死肿瘤细胞(参见图10)。
实施例4：针对卵巢癌治疗的剂量反应研究
本研究按照大学动物实验伦理准则(University ethical guidelines onanimal experimentation)进行，并遵循美国国家卫生研究院(US National Institutesof Health)出版的实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)(NIH出版号85-23，1996年修订)。对动物设施的温度(22±1℃)和湿度(60±5％)进行良好控制，且保持12h/12h光-暗循环，并随意获取食物和水。该研究在用纳米泰素或胶束泰素治疗的5周龄的雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中进行。使用了癌细胞系ES2/luc。
根据下表对小鼠进行分组。每组有15只小鼠以收集至少10个数据点。
程序：
通过已知的方法对小鼠诱发卵巢癌。当小鼠六周龄时，在第0天(D0)进行ES2/luc(在100μl HBSS中的5×105个细胞)的腹膜内注射。在引入癌细胞的第4天(D4)，测量每只小鼠的光谱以评估肿瘤细胞生长。在第8天(D8)和第11天(D11)，使用不同剂量的纳米泰素和胶束泰素按照上表治疗小鼠。
在第14天(D14)，使用光谱再次测量每只小鼠的肿瘤细胞生长以评估每只小鼠的治疗。持续监测每组的存活率。
实施例5：结肠癌和胃癌实验
本研究按照大学动物实验伦理准则进行，并遵循美国国家卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(NIH出版号85-23，1996年修订)。该研究在用纳米泰素或胶束泰素治疗的5周龄的雌性SCID小鼠中进行。使用了癌细胞系HT-29-luc(结肠癌细胞系)和NCI-N87-luc 2-GFP(胃癌细胞系)。
根据下表对小鼠进行分组。每组有15只小鼠以收集至少10个数据点。
HT-29-luc NCl-N87-luc 2-GFP
15 15
程序：
通过已知的方法对小鼠诱发结肠癌和胃癌。当小鼠六周龄时，在第0天(D0)进行HT-29-luc或NCI-N87-luc 2-GFP细胞系(在100μl HBSS中的1×106个细胞)的腹膜内注射。在合适的时机，例如引入癌细胞的第4天(D4)，测量每只小鼠的光谱(通过体外图像系统)。在第二合适的时机，例如在第8天(D8)和第11天(D11)，使用不同剂量的纳米泰素和胶束泰素按照上表治疗小鼠。
在第14天(D14)或其他合适的时间，对每只小鼠再次测量光谱，并评估小鼠结肠癌或胃癌的治疗。持续监测每组的存活率。
实施例6：纳米泰素与游离紫杉醇之间的结肠癌治疗比较
本研究按照大学动物实验伦理准则进行，并遵循美国国家卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(NIH出版号85-23，1996年修订)。该研究在用纳米泰素或游离紫杉醇治疗的5周龄的雌性SCID小鼠中进行。使用了癌细胞系HT-29-luc(结肠癌细胞系)。
根据下表对小鼠进行分组(共5组)。每组有15只小鼠以收集至少10个数据点。
通过已知的方法对小鼠诱发结肠癌肿瘤。当小鼠六周龄时，在第0天(D0)进行HT-29-luc细胞系(在100μl HBSS中的1×106个细胞)的腹膜内注射。在合适的时机，例如引入癌细胞的第11天(D11)，测量每只小鼠的光谱。在第12天(D12)、第15天(D15)和第18天(D18)，通过不同的药物递送途径(腹膜内或静脉内)用10mg/kg的纳米泰素或紫杉醇治疗小鼠。21天(D21)后，通过IVIS系统评估纳米泰素或紫杉醇对肿瘤细胞生长的有效性。记录小鼠的存活期。
实施例7：纳米泰素和胶束泰素在卵巢癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性的评价
在美国，上皮性卵巢癌是第二常见的妇科恶性肿瘤，并且是妇科癌症死亡的首要原因。2014年，估计21,980例卵巢癌新发病例和14270例卵巢癌死亡病例将在美国发生(2014年美国癌症协会(American Cancer Society))。大多数卵巢癌患者在门诊首次访视时出现III期或IV期疾病。在台湾，根据NHRI的报告(2011年)，每年估计有1000例卵巢癌新发病例。
区域化疗，例如腹膜内化疗，具有腹膜-血浆曲线下面积与含肿瘤的腹腔的比例增加的药代动力学优势(Lancet Oncol.2003；Nat Rev Clin Oncol.2010)。尽管存在这种药代动力学优势，但腹膜内治疗的临床应用已经由于小分子量药物从腹腔的过早清除、缺乏靶标特异性以及药物向靶组织内的渗透较差而受到挑战(Nat Rev Cancer.2006)。理论上，通过将药物并入到促进持续药物释放的特殊设计的递送基质中，可以克服与抗癌剂的腹膜内化疗相关的缺点。药物在腹腔中的持续释放会导致增强细胞在延长的时间段内暴露于抗癌剂，并将可能导致有效的细胞杀伤。Tamura和同事观察到，在荷有腹膜肿瘤的小鼠中，在聚(D，L-乳酸)微球中的抗癌药物的腹膜内施用诱导持续的肿瘤生长抑制以及延长的存活时间(Eur J Pharm Biopharm.2002)。
本研究旨在使用异种移植肿瘤小鼠模型研究不同剂量的纳米泰素和胶束泰素通过腹膜内或静脉内途径对卵巢癌的治疗。
研究设计：
为了评估这些纳米颗粒药物在腹膜内播散性卵巢癌的治疗中是否有效，在SCID小鼠中通过腹膜内注射(i.p.)将ES2-luc细胞接种到腹腔中。通过使用IVIS系统测量生物发光图像(BLI)来确定肿瘤细胞生长。当肿瘤播散(通过发光活性判断)达到基线时，开始治疗。用2、5、10和20mg/kg的纳米泰素通过腹膜内或用10mg/kg的胶束泰素通过静脉内和腹膜内(每3天一次，3个剂量)治疗小鼠。在第14天(D14)，通过BLI的降低来评估纳米泰素或胶束泰素的抗肿瘤活性。记录这些动物的存活期。
实验程序
将指定细胞数的ES2-luc细胞在24hr内在37℃下接种到24孔培养皿中。24hr后，通过IVIS-50系统捕获BLI。发光活性与细胞生长之间的相关性在图11中示出。
五周龄的雌性SCID小鼠(CB.17SCID/SCID)购自台北的实验室动物育种研究中心，并保存在台北退伍军人总医院(Taipei Veterans General Hospital)(台湾，台北)的肿瘤学动物设施中。遵照机构动物保健法规使用动物。
在第0天(D0)对SCID小鼠(6周)腹膜内注射在100μl opti-MEM中的5×105个ES2-luc细胞。4天(D4)后，通过使用IVIS系统测量BLI来确定肿瘤细胞生长(基线)。给予对照组100μl的0.9％氯化钠注射液。每组BLI在治疗前进行归一化。在第5天(D5)、第8天(D8)和第11天(D11)，用媒介物，2、5、10和20mg/kg的纳米泰素通过腹膜内和10mg/kg的胶束泰素通过静脉内和腹膜内来治疗小鼠。在第14天(D14)，通过BLI的降低来评估纳米泰素或胶束泰素的抗肿瘤活性。单独监测动物直到死亡以进行存活期评估。
生物发光图像(BLI)测量
用IVIS-50系统(Xenogen，Alameda，CA)对小鼠进行成像。在第1天向小鼠植入ES2-luc细胞(5×105个/小鼠)。在指定的日期捕获BLI。一只小鼠在第17天死亡。生物发光图像(BLI)与动物中细胞生长之间的相关性在图12A-B中示出。
统计分析
结果以至少三次实验的平均值±标准偏差给出。总存活期被定义为从肿瘤植入日期到死亡日期的时间，并以Kaplan-Meier生存曲线呈现。
肿瘤生长评估
在腹膜内注射后，纳米泰素以剂量依赖性方式抑制卵巢肿瘤生长(图13和图14)。20mg/kg的纳米泰素几乎完全根除了11只小鼠中8只小鼠的腹腔中的卵巢癌(图13)。11中小鼠中2只小鼠的肿瘤负荷减少了50％以上。10mg/kg的纳米泰素根除了11只小鼠中3只小鼠的腹腔中的肿瘤(图13)，并且11只小鼠中8只小鼠的肿瘤负荷减少了50％以上。与对照相比，2mg/kg和5mg/kg的纳米泰素也具有抗肿瘤活性(图13)。肿瘤生长抑制(TGI)在20mg/kg时达到100％，而在2mg/kg时大于95％(图13和图14)。在腹膜内而非静脉内施用后，胶束泰素也抑制卵巢癌ES2细胞的生长。腹膜内施用后TGI为98％(图13和图14)。
为了再次确认胶束泰素和纳米泰素在腹膜内注射后的肿瘤抑制效果，进行了第二次实验(图15A-B)，并且时间表与上述相同。腹膜内注射后，纳米泰素和胶束泰素抑制卵巢肿瘤生长。10mg/kg的纳米泰素根除了7只小鼠中2只小鼠的腹腔中的肿瘤，并且7只小鼠中5只小鼠的肿瘤负荷降低。用胶束泰素治疗发现类似的结果。在10mg/kg纳米泰素和10mg/kg胶束泰素腹膜内治疗的小鼠中，TGI达到近100％(图15A-B)。
为了证明发光是由ES2-luc细胞产生的，在死亡当天解剖小鼠。如图16所示，接受对照的一只小鼠(16A)和静脉内接受胶束泰素的一只小鼠(16B)具有最严重的腹水。收集对照小鼠(16A)的腹水，并进行细胞培养。然后采用IVIS系统分析培养的细胞。细胞显示BLI，证明腹水含有人卵巢癌ES2-luc细胞(图17)。用胶束泰素或纳米泰素通过腹膜内治疗后(图16C至16G)，发现腹水随着剂量的增加而减少。
本研究中的所有治疗都不会显著改变动物的体重，如图18所示。
存活期评估
在接种5×105个ES2-luc细胞后，对照小鼠的存活时间为21天(参见图19)。在静脉内施用10mg/kg的胶束泰素后，存活时间为21天。在腹膜内施用10mg/kg的胶束泰素，2、5、10和20mg/kg的纳米泰素后，存活时间分别为33天、32天、33天、45天和超过49天(图19)。与对照组相比，纳米泰素和胶束泰素的腹膜内施用均将存活时间延长了超过12天，但仅对照组与5、10和20mg/kg的纳米泰素治疗组之间的差异是显著的(p＜0.05)。与腹膜内10mg/kg的胶束泰素相比，10mg/kg和20mg/kg纳米泰素的腹膜内施用将存活时间显著延长了12天(p＜0.05)(图19)。
对照组与静脉内10mg/kg胶束泰素组的中位存活期为19天。在腹膜内施用10mg/kg的胶束泰素，2、5、10和20mg/kg的纳米泰素后，中位存活期分别为28天、27天、29天、37天和37天(图19)。
在后续实验中，在接种5×105个ES2-luc细胞后，对照小鼠的存活时间为19天。在腹膜内施用10mg/kg的胶束泰素和10mg/kg的纳米泰素后，存活时间分别为30天和38天(图20)。相比于对照组，腹膜内纳米泰素和腹膜内胶束泰素均将存活时间延长了超过11天(p＜0.05)。与腹膜内10mg/kg胶束泰素相比，腹膜内10mg/kg纳米泰素将存活时间显著延长了8天(p＜0.05)(图20)。
对照、腹膜内10mg/kg胶束泰素和腹膜内10mg/kg纳米泰素的中位存活期分别为18天、27天和31天(图20)。
结论
纳米泰素和胶束泰素在腹膜内施用后均具有抗肿瘤活性。在20mg/kg下，纳米泰素在11只小鼠的8只小鼠中显示出剂量依赖的抗肿瘤活性，并且几乎完全根除了腹腔中的卵巢癌。在10mg/kg下，发现11只小鼠中的3只肿瘤根除，并且11只小鼠中的8只的肿瘤负荷降低。反应率为100％。因此，10mg/kg被认为是最小有效剂量。
因此，清楚地表明纳米泰素和胶束泰素均可以腹膜内治疗卵巢癌。
实施例8：纳米泰素在结肠癌同源小鼠模型中的抗肿瘤活性的评价
为了评估纳米泰素在治疗腹膜内播散性结肠癌中的有效性，在BALB/c小鼠中将CT-26-luc细胞通过腹膜内注射(i.p.)接种到腹腔中。通过使用IVIS系统测量生物发光图像(BLI)来确定肿瘤细胞的生长。当肿瘤播散(通过发光活性判断)达到基线时，开始治疗。用10mg/kg纳米泰素通过静脉内和腹膜内或用10mg/kg紫杉醇(PTX)通过静脉内和腹膜内(每2天一次，3个剂量)治疗小鼠。在第11天(D11)，通过BLI的降低来评估纳米泰素或PTX的抗肿瘤活性。记录这些动物的存活期。
将CT-26-luc细胞在24hr内在37℃下以指定的数目接种到24孔培养皿中。24hr后，通过IVIS-50系统捕获生物发光图像。发光活性与细胞生长之间的相关性在图21中示出。
准备
五周龄的雌性BALB/c小鼠购自台北的实验室动物育种研究中心，并保存在台北退伍军人总医院(台湾，台北)的肿瘤学动物设施中。遵照机构动物保健法规使用动物，并且所有的动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准。
以指定浓度给予每只小鼠约100μl(静脉内)和200μl(腹膜内)的纳米泰素或PTX。使用体重计算精确的给药体积。给予对照组100μl的0.9％氯化钠注射液。
在第0天(D0)对BALB/c小鼠(6周)腹膜内注射在250μl opti-MEM中的1×105个CT-26-luc细胞。4天(D4)后，通过使用IVIS系统测量发光活性来确定肿瘤细胞生长(基线)。各组生物发光图像(BLI)通过治疗前整个小鼠的平均BLI进行归一化。在第4天(D4)、第6天(D6)和第8天(D8)，用媒介物、10mg/kg的纳米泰素通过腹膜内和静脉内以及10mg/kg的PTX通过腹膜内和静脉内治疗小鼠。在第11天(D11)，通过发光活性的降低来评估纳米泰素或PTX的抗肿瘤活性。单独监测动物直到死亡以进行存活期评估。
用IVIS-50系统(Xenogen，Alameda，CA)对小鼠进行成像。生物发光图像(BLI)与动物细胞生长之间的相关性在图22A-B中示出。
统计分析：结果以至少三次实验的平均值±标准偏差给出。总存活期被定义为从肿瘤植入日期到死亡日期的时间，并以Kaplan-Meier生存曲线呈现。
结果和结论
肿瘤生长评估：
为了评价纳米泰素在结肠癌中的效果，建立了播散性结肠癌同源模型。BALB/c小鼠的BLT与CT-26-luc细胞生长之间的相关性在图22A-B中示出。在腹膜内而非静脉内注射后，纳米泰素抑制结肠肿瘤的生长(图23A-B)。以10mg/kg腹膜内施用的纳米泰素将8只小鼠中6只小鼠的肿瘤负荷降低了75％，但未发现肿瘤根除(图23B)。此外，如图23A-B所示，在腹膜内和静脉内施用后，PTX并不抑制结肠肿瘤的生长。
图24表明所有的治疗均不会显著改变动物的体重。
存活期
在接种1×105个CT-26-luc细胞后，对照小鼠的存活时间为27天(图24)。在静脉内施用10mg/kg PTX、10mg/kg纳米泰素及腹膜内施用10mg/kg PTX后，存活时间为27天(图24)。在腹膜内施用10mg/kg纳米泰素后，存活时间为40天(图24)。与对照组相比，10mg/kg纳米泰素的腹膜内施用将存活时间显著延长了13天(p＜0.05)。
对照组的中位存活期为24天。在静脉内或腹膜内施用10mg/kg PTX后，中位存活期分别为24天和26天。在静脉内或腹膜内施用10mg/kg纳米泰素后，中位存活期分别为26天和35天(图25)。仅在腹膜内施用后，纳米泰素抑制了结肠癌CT-26-luc细胞在体内的生长。腹膜内10mg/kg纳米泰素降低了8只小鼠中6只小鼠的肿瘤负荷，但未发现肿瘤根除。反应率为75％。
总之，10mg/kg的纳米泰素在腹膜内施用后，在结肠癌同源模型中显示出中等的抗肿瘤活性。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。
应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (20)

1.一种用于腹膜内治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在纳米颗粒中的抗癌剂，其中纳米颗粒的特征在于缓慢释放抗癌剂，以及时的方式，有效地杀死肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中纳米颗粒以每8小时30％或更低的速率缓慢释放抗癌剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒包含第一磷脂，该第一磷脂选自氢化的天然磷脂和具有长碳链(-(CH2)n-，其中n至少为14)的饱和磷脂，并且具有在40至74℃范围内的相转变温度Tg1；第二磷脂，其选自不饱和磷脂和具有短碳链(-(CH2)n-，其中n至多为14)的饱和磷脂，并且具有在-30至10℃范围内的相转变温度Tg2；有效地形成脂质体的脂质体形成物质，在该脂质体中第一磷脂与第二磷脂共存于两个不混溶的相中，并且产生若干个不连续的区域，并且其中第一磷脂与第二磷脂的摩尔比至少为3∶16；并且所述抗癌剂以至少20摩尔％的量并入脂质体中以形成配制的脂质体。
4.如权利要求3所述的方法，其中第一磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰酸(PA)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在某些实施方案中，第一磷脂选自氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)和二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含疏水嵌段、与该疏水嵌段键合的亲水嵌段以及一种或多种两性离子。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述疏水嵌段为聚己内酯(PCL)、聚戊内酯(PVL)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丁内酯(PBL)、聚乙交酯或聚丙内酯(PPL)；并且所述亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)或聚-γ-谷氨酸(PGA)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒包含聚合物胶束，该聚合物胶束包含下式的嵌段共聚物：其中R代表氢原子、C1-6烷基基团、苄基基团或酰基基团；且m和n各自独立地为10-100的整数。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述聚合物胶束具有在约20nm至约1000nm范围内的直径。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述抗癌剂选自吉西他滨、伊达比星/阿糖胞苷、磷酸依托泊苷、格列卫、替莫唑胺、硼替佐米、来曲唑、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、紫杉醇、nab-紫杉醇、多西他赛、埃罗替尼、培美曲塞、培美曲塞/卡铂、紫杉醇/卡铂、来曲唑/环磷酰胺、替西罗莫司、贝伐珠单抗/替西罗莫司、依普利单抗、RAD001、帕唑帕尼、FOLFIRI、BKM120、GSK1120212、PF-05212384/伊立替康、AZD2171、PF-04691502、环磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷/道诺霉素、替西罗莫司、埃罗替尼/替西罗莫司、卡培他滨、他莫昔芬、硼替佐米、曲妥珠单抗、多西他赛/卡培他滨、曲妥珠单抗/替吡法尼、替吡法尼/吉西他滨、拓普替康及其组合。
10.如权利要求3所述的方法，其中所述抗癌剂为紫杉醇。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述抗癌剂为紫杉醇。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌或结肠癌。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌或结肠癌。
14.一种通过区域递送治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向有需要的所述受试者施用封装在持续释放纳米颗粒中的抗癌剂，其中所述抗癌剂纳米颗粒于胸膜内施用。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述持续释放纳米颗粒包含第一磷脂，该第一磷脂选自氢化的天然磷脂和具有长碳链(-(CH2)n-，其中n至少为14)的饱和磷脂，并且具有在40至74℃范围内的相转变温度Tg1；第二磷脂，其选自不饱和磷脂和具有短碳链(-(CH2)n-，其中n至多为14)的饱和磷脂，并且具有在-30至10℃范围内的相转变温度Tg2；有效地形成脂质体的脂质体形成物质，在该脂质体中第一磷脂与第二磷脂共存于两个不混溶的相中，并且产生若干个不连续的区域，并且其中第一磷脂与第二磷脂的摩尔比至少为3∶16；并且所述抗癌剂以至少20摩尔％的量并入脂质体中以形成配制的脂质体。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述持续释放纳米颗粒包含聚合物胶束，该聚合物胶束包含下式的嵌段共聚物：其中R代表氢原子、C1-6烷基基团、苄基基团或酰基基团；且m和n各自独立地为10-100的整数。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌或结肠癌。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述癌症是转移癌。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者在腹腔中具有严重的粘连。
20.如权利要求15或16所述的方法，其中所述抗癌剂为紫杉醇。
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