RS20060066A

RS20060066A - Korišćenje antagonista angiotenzin ii receptora, osobito telmisartana, u cilju povećanja insulinske senzitivnosti

Info

Publication number: RS20060066A
Application number: YUP-2006/0066A
Authority: RS
Inventors: Michael Mark; Stefan Kauschke; Ulrich Kintscher; Michael Schupp; Thomas Unger
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh.,
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-07-24
Publication date: 2008-08-07
Also published as: SI1651213T2; EP1651213B2; US20050070594A1; CA2534006C; RS50793B; MEP51108A; WO2005011680A8; EA012600B1; HUE027274T2; ATE443519T1; CN101926997A; DK1651213T4; DE10335027A1; JP2007500677A; EA200900929A1; EP2119441A1; UA83854C2; DK1651213T3; NO20060938L; IL172693A

Abstract

Pronalazak se odnosi na korišćenje antagonista angiotenzin II receptora za lečenje ljudi kod kojih je dijagnostikovan tip 2 dijabetes melitusa ili kod kojih se sumnja na predijabetično stanje, za prevenciju dijabetesa ili za lečenje metaboličkog sindroma i rezistencije na insulin kod pacijenata sa normalnim krvnim pritiskom.

Description

Korišćenje antagonista angiotenzin II receptora, osobito telmisartana, u cilju povećanja insulinske senzitivnosti

Pronalazak se odnosi na oblast antagonista angiotenzin II receptora i odnosi se na njihovo korišćenje za lečenje ljudi kod kojih je je dijagnostikovan dijabetes ili kod kojih se sumnja na predijabetično stanje, za prevenciju dijabetesa ili za lečenje metaboličkog sindroma i rezistencije na insulin kod pacijenata sa normalnim krvnim pritiskom.

Tip 2 dijabetes melitus je ispoljavanje dve patofiziološke pojave, naime smanjene sekrecije insulina iz beta ćelija pankreasa i rezistencije na insulin u ciljanim organima jetre, skeletne muskulature i masnog tkiva. Po pravilu, postoji kompleksan poremećaj obe komponente. Oboljenje je dijagnostikovano kao istrajna hiperglikemija, odnosno koncentracija šećera u krvi nakon 10-12 sati gladovanja je iznad vrednosti od 125 mg glukoze po dl plazme. Kontrolisano lečenje ispoljavanja tip 2 dijabetesa se može postići korišćenjem jedinjenja iz kategorije tiazolidindiona (glitazona). Ova jedinjenja poboljšavaju korišćenje cirkulišućeg insulina i tako dovode do snižavanja nivoa šećera u krvi (insulinski senzitizeri). U isto vreme povećani nivoi insulina su smanjeni pomoću povratnih meahnizama i na taj način količina u pankreasu je ponovo postignuta. Insulinski senzitizeri kao što su troglitazon, roziglitazon ili pioglitazon razvijaju ovu aktivnost uz pomoć vezivanja za specifične nuklearne receptore poznate kao PPAR-gama (Peroksizomalni Proliferator Aktivirani Receptor). Oni deluju kao regulatori transkripcije za veliki broj gena koji su važni za metabolizam glukoze i lipida. Prema ovoj funkciji, PPAR-gama ligandi kao što su prostaglandini ili sintetički tiazolidindioni (glitazoni) mogu doprineti lečenju tip 2 dijabetesa. Jedan od glavnih mehanizama za sniženje glukoze pomoću PPAR-gama Uganda je indukcija diferencijacije adipocita. Povećana diferencijacija adipocita i preuredjenje masnog tkiva koji su izazvani pomoću PPAR-gama liganda dovodi do diverzije ili redistribucije slobodnih masnih kiselina iz skeletnih mišića u masno tkivo i na taj način do pojačavanja metabolizma glukoze u mišićima.

Kako u isto vreme, pacijent oboleo od tip 2 dijabetesa pokazuje znake koronarnog oboljenja srca u vreme dijagnoze, na primer, pojačano se sumnja da uzroci dijabetesa leže u kompleksnim metaboličkim poremećajima koji mogu biti posledica brojnih faktora rizika kao što su abnormalna tolerancija glukoze, povećani nivo šećera u gladovanju, insulinska rezistencija, visoki krvni pritisak, dislipidemija ili centripetalna gojaznost. Preovladavanje insulinske rezistencije je posebno izraženo kod pacijenata sa hipertrigliceridemijom i niskim HDL-holesterolom. Naznaka je data za pre-tip 2 dijabetes, metabolički sindrom, sindrom X ili sindrom insulinske rezistencije. U prvoj fazi smanjeni insulinski odgovor od strane ciljanih organa prouzrokuje povećanje u insulinskoj sekreciji u pankreasu u cilju održavanja nivoa šećera u krvi u normalnom opsegu. Nakon odredjenog broja godina suvišne ili pojačane produkcije insulina dolazi vreme kada sekrecija insulina iz beta ćelija ne može više da se povećava. Tada započinje faza abnormalne tolerancije glukoze. Telo ne može više da apsorbuje maksimalne glukozne vrednosti dovoljno brzo. Na kraju, ako nivo šećera u gladovanju ostane stalno visok, manifestuje se dijabetes.

WO 95/06410 opisuje korišćenje antagosnita angiotenzin II receptora za lečenje hroničnih inflamatornih oboljenja uključujući sistemska autoimuna oboljenja. Dijabetes je pomenut kao jedan od brojnih primera sistemskih autoimunih oboljenja. Autoimuna oboljenja uključuju tip 1 dijabetes melitus koji se javlja uglavnom kod mladih ljudi ispod 30 godina života sa genetskom predispozicijom, kod kojih se insulitis javlja pod uticajem različitih faktora sa daljom destrukcijom B ćelije tako da pankreas može da produkuje samo malo insulina ili ni malo. Tip 2 dijabetes melitus se ne smatra autoimunim oboljenjem.

Antagonisti angiotenzin II receptora se koriste za lečenje visokog krvnog pritiska i posledica ozleda kardiovaskularnih organa koje se dovode u vezu sa visokim krvnim pritiskom. U specijalističkoj literaturu se oni genralno kategorizuju kao metabolički neutralni. Poboljšanje insulinske senzitivnosti u modelu sa životinjama koje je izazvano pomoću aktivne supstance irbesartan je zabeleženo u Henriksenisar.(Hipertenzija 38: 884-90, 2001).

Cilj ovog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja se može koristiti i za lečenje manifestovanog tip 2 dijabetesa i za lečenje prvih znakova kompleksnog metaboličkog poremećaja predijabetesa i na taj način za prevenciju tip 2 dijabetes melitusa. U okviru polja ovog pronalaska je sada na iznenadjenje pronadjeno da nekoliko antagonista angiotenzin II receptora i njihove soli ne samo da deluju u smanjenju krvnog pritiska, na poznati način, već su takodje sposobni da pojačavaju ekspresiju gena u celularnom sistemu, transkripciju za koju je poznato daje regulisana sa PPAR-gama receptorom. To otvara nove terapijske mogućnosti u lečenju i prevenciji tip 2 dijabetesa, metaboličkog sindroma i insulinske rezistencije. U cilju da se obezbede uporedivi uslovi, ovaj efekat je ispitivan i kvantifikovan u okviru polja ovog pronalaska pomoću stabilno transformisane ćelijske linije (Primer 2). Ćelije koje su korišćenje su CHO ćelije koje su rezultat transformacije sa dve genske konstrukcije. Prva od ovih konstrukcija kodira za luciferazni gen izPhotinuspyralis(de Wet JR, Mol Cell Biol (1987) 7:725) koji je pod kontrolom sintetičkog promotera sa petostruko ponavljenim kvaščevim Gal4-vezujućim mestom (Banke genskih sekvenci AF058756). Druga konstrukcija kodira za fuzioni protein koji se sastoji od ligand vezujuće oblasti humanog PPAR-ga raMa 2 transkripcionog faktora (Banke genskih sekvenci U79012) i kvaščeve GAL4 DNK vezujuće oblast (Aminokiseline 1 -147; Sadowski I, Nucleic AcidsRes (1989) 17: 7539).

Indukcija transkripcije PPARgama-regulisanih gena je poznata iz korišćenja tiazolidindiona kao antidijabetskih lekova (na pr. roziglitazon) i izazvana je njihovim vezivanjem za PPARgama receptor i njegovom aktivacijom. U okviru polja test sistema koji je ovde korišćen efekat se može kvantifikovati kao indukovana aktivnost luciferaza transformisane ćelijske linije. Ista indukcija aktivnosti luciferaze se javlja sa antagonistima angiotenzin II receptora, suprotno očekivanjima, ne vezivanjem aktivne supstance za PPARgama receptor. Indukcija je posebno primetna za aktivnu supstancu telmisartan. Vezivanje na pr. telmisartana za PPARgama receptor se ne može detektovati u različitim test sistemima. Zbog toga je pretpostavljeno da povećanje afiniteta kofaktor proteina za PPARgama koje je prouzrokovano sa antagonistom angiotenzin II receptora kao što je telmisartan, takodje dovodi do regrutovanja kofaktor proteina ukoliko nije prisutan visoko-afinitetan sintetički PPARgama ligand. To zatim dovodi do aktivacije transkripcije gena koji je regulisan sa PPARgama receptorom, i ta aktivacija je posredovana sa ovim kofaktorima. Kako je indukcija ovih gena odgovorna za anti-dijabetsku aktivnost tiazolidindiona pretpostavlja se da indukcija istih gena sa antagonistima angiotenzin II receptora, kao što su telmisartan dovodi do uporedive anti-dijabetske aktivnosti. Prema tome, ove aktivne supstance su pogodne ne samo za lečenje visokog krvnog pritiska već i za lečenje i prevenciju tip 2 dijabetes melitusa.

Otkriće ovog novog efekta antagonista angiotenzin II receptora i njihovih soli znači da se mogu koristiti za proizvodnju farmaceutske kompozicije za lečenje ljiudi kod kojih je dijagnostikovan tip 2 dijabetes mellitus ili kod kojih se sumnja na predijabetično stanje, za prevenciju dijabetesa ili za lečenje metaboličkog sindroma i rezistencije na insulin kod pacijenata sa normalnim krvnim pritiskom. Oni su posebno pogodni za lečenje i prevenciju tip 2 dijabetesa i pre-tip 2 dijabetesa. To uključuje lečenje i prevenciju metaboličkog sindroma, sindroma X ili sindroma insulinske rezistencije. Kada se ovaj pronalazak odnosi na osobe kojima je potrebno lečenje, to se odnosi pre svega na lečenje i prevenciju kod ljudi, ali se aktivne supstance i kombinacije korišćenih aktivnih supstanci mogu takodje upotrebiti u veterinarskoj medicini kod sisara.

Tip 2 dijabetes melitus se manifestuje u nivou šerćera u gladovanju koji prelazi 125 mg glukoze po dl plazme; merenja vrednosti glukoze u krvi je standardna procedura u rutinskim medicinskim analizama. Ukoliko se izvodi test tolerancije glukoze, nivo šećera u krvi kod dijabetičara će biti u višku od 200 mg glukoze po dl plazme 2 sata nakon uzimanja 75 g glukoze na prazan stomak. U testu tolerancije glukoze 75 g glukoze se primenjuje oralno kod pacijenta koji se ispituje nakon 10 -12 sati gladovanja i nivo šećera u krvi se beleži neposredno pre uzimanja glukoze i 1 i 2 sata nakon njenog uzimanja. Kod zdravih subjekata nivo šećera u krvi pre uzimanja glukoze će biti izmedju 60 i 110 mg po dl plazme, manje nego 200 mg po dl 1 sat nakon uzimanja glukoze i manja od 140 mg po dl nakon 2 sata. Ako je nakon 2 sata vrednost izmedju 140 i 200 mg to se smatra kao abnormalna tolerancija glukoze.

Ukoliko se insulinska rezistencija može detektovati to je posebno jaka indikacija prisustva predijabetesa. Prema tome, može se desiti da u cilju održavanja homeostaze glukoze osobi treba 2 -3 puta više insulina nego drugoj osobi, bez toga da ima bilo kakvog direktnog patološkog značaja. Najsigurniji metod za odredjivanje insulinske rezistencije je test euglikemijske - hiperinsulinemijske spone. Odnos insulina prema glukozi je odredjen u okviru polja kombinovane insulin-glukoza infuzione tehnike. Nadjeno je daje prisutna insulinska rezistencija ukoliko je apsorpcija glukoze ispod 25 posto od ukupno ispitane populacije (SZO definicija). Prilično manje zahtevni u pogledu izvodjenja, od testa spone, su takozvani minimalni modeli u kojima, tokom intravenoznog testiranja tolerancije glukoze, koncentracije insulina i glukoze u krvi su merene u fiksiranim vremenskim intervalima iz kojih je izračunata insulinska rezistencija. Još jedan metod merenja je matematički HOMA model. Insulinska rezistencija se izračunava preko koncentracija glukoze u plazmi, u gladovanju i insulina u plazmi, u gladovanju. U ovom metodu nije moguće ustanoviti razliku izmedju hepatične i periferne insulinske rezistencije. Ovi procesi nisu stvarno pogodni za ocenjivanje insulinske rezistencije u svakodnevnoj praksi. Po pravilu, drugi parametri se koriste u svakodnevnoj kliničkoj praksi za ocenu insulinske rezistencije. Kao bolji metod, na primer, koristi se odredjivanje koncentracije triglicerida kod pacijenta, jer povećani nivoi triglicerida su u značajnoj korelaciji sa postojanjem insulinske rezistencije.

Za pojednostavljenje ponekad, u praksi se pretpostavlja da su ljudi insulin-rezistentni ako imaju najmanje 2 od sledećih karakteristika:

1) preteranu težinu ili gojaznost

2) visoki krvni pritisak

3) dislipidemiju (izmenjeni sadržaj ukupnih lipida u krvi)

4) ima najmanje jednog bliskog srodnika kod koga je dijagnostikovana abnormalna tolerancija glukoze ili tip 2 dijabetesa.

Preterana težina se smatra u slučajevima kada je Indeks telesne mase (ITM) izmedju 25 i 30 kg/m<2>, gde je ITM kvocijent telesne težine u kg i kvadrata visine u metrima. Kod gojaznosti vrednost ITM je veća od 30 kg/m<2>.

Odmah je vidljivo iz gornje definicije za insulinsku rezistenciju, da su hipotenzivni agensi pogodni i indikativni za lečenje ako, izmedju ostalih stvari, se nadje visoki krvni pritisak kod pacijenta. Jedan rezultat ovog pronalaska je da neki blokatori angiotenzin II receptora, a posebno telmisartan, su poželjni hipotenzivi sa aspekta njihovog svojstva PPAR-gama aktivacije, i da su pogodni za lečenje insulinske rezistencije čak kada krvni pritisak kod pacijenata nije visok već normalan. Prema tome, tip 2 dijabetičari se mogu lečiti sa telmisartanom u isto vreme sa primenom primarnog ili povratnog tretmana za dislipidemiju. Konvencionalno doziranje telmisartana značajno smanjuje nivoe LDLrholesterola u plazmi, u odnosu na ukupan holesterol i/ili trigliceride.

Kako se insulinska rezistencija posmatra kao stanje koje dovodi do gradualnog povećanja krvnog pritiska, tretman sa telmisartanom uprkos normalnom nivou krvnog pritiska se može po smatrati kao prevencija visokog krvnog pritiska.

Slične indikacije za predijabetes su ako se naidje na stanja metaboličkog sindroma, od kojih je glavna odlika insulinska rezistencija. Prema ATP IHINCEP Uputstvu (Izvršni pregled trećeg saopštenja Nacionalnog programa edukacije o holesterolu (NCEP) u Journal of the American Medical Association 285:2486 -2497,2001) metabolički sindrom je prisutan ako pacijent ima najmanje 3 od sledećih karakteristika: 1) Abdominalnu gojaznost, koja se definiše kao mera pojasne oblasti od > 40 inča ili 102 cm kod muškaraca i > 35 inča ili 94 cm kod žena

2) Nivo triglicerida > 150 mg/dl

3) Nivo HDLrholesterola < 40 mg/dl kod muškaraca

4) Visoki krvni pritisak > 130/> 85 mM Hg

5) Nivo šećera u krvi, u gladovanju od > 110 mg/dl

Iz ove definicije metaboličkog sindroma odmah je vidljivo da su hipotenzivi pogodni za lečenje ako je nadjeno da pacijent ima visoki krvni pritisak, izmedju ostalih stvari. Jedan rezultat ovog pronalaska je da neki blokatori angiotenzin II receptora, a posebno telmisartan, su poželjni hipotenzivi na račun svojstva PPAR-gama aktivacije, i da su pogodni za lečenje insulinske rezistencije čak i kada je nadjeno da pacijent nema visoki krvni pritisak. Pošto se kao metabolički sindrom takodje smatra i stanje koje uzrokuje gradualno povećanje krvnog pritiska, njegov tretman sa telmisartanom se takodje može posmatrati kao prevencija visokog krvnog pritiska, nasuprot normalnim nivoima krvnog pritiska.

Takodje postoje sumnje u predijabetes ukoliko je nivo šećera u krvi, u gladovanju, preko normalnog maksimalnog nivoa od 110 mg glukoze po dl plazme ali ne prelazi prag od 125 mg glukoze po dl plazme koji ukazuje na dijabetes. Još jedna indikacija za predijabetes je abnormalna tolerancija glukoze, odnosno nivo šećera u krvi od 140 -200 mg glukoze po dl plazme 2 sata nakon uzimanja 75 g glukoze posle gladovanja u okviru polja testiranja tolerancije glukoze.

Nivo triglicerida u krvi od više nego 150 mg/dl takodje ukazuje na prisustvo predijabetesa. Ova sumnja se potvrdjuje niskim nivoom HDL holesterola u krvi. Kod žena, nivoi ispod 40 mg po dl plazme se smatraju suviše niskim dok se kod muškaraca nivoi ispod 50 mg po dl plazme smatraju kao suviše niskim. Trigliceridi i HDL holesterol u krvi se takodje mogu odrediti uz pomoć standardnih metoda u medicinskim analizama koje su opisane na primer uThomas L (Editor): "Labor und Diagnose", TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt/Main, 2000. Sumnja na predijabetes se dalje potvrdjuje ako nivoi šećera u krvi u gladovanju takodje prelaze 110 mg glukoze po dl plazme. Ukoliko su izmereni nivoi u krvi u opsegu ovih graničnih vrednosti, odnos mere pojasne oblasti prema merama bedarne oblasti se može koristiti kao dodatna pomoć za donošenje odluke. Ukoliko odnos prelazi vrednost od 0,8 kod žena ili 1 kod muškaraca, tratman je indikovan.

Antagonisti angiotenzin II receptora su posebno indikovani za lečenje dijabetesa ili sumnjivog predijabetesa ukoliko takodje treba lečiti hipertenziju. Ovo je u slučaju kada sistolni krvni pritisak prelazi vrednost od 140 mM Hg i dijastolni krvni pritisak prelazi vrednost od 90 mM Hg. Ukoliko pacijent pati od manifestacije dijabetesa aktuelna je preporuka da sistolni krvni pritisak bude smanjen do nivoa ispod 130 mM Hg i da dijastolni krvni pritisak bude snižen do ispod 80 mM Hg. Da bi se dostigli ti nivoi može se preporučiti, u nekim slučajevima kombinovanje antagonista angiotenzin II receptora sa diureticima ili sa kalcijum antagonistom. Termin "diuretik" uključuje tiazid ili analoge tiazida kao što su hidrohlortiazid (HCTZ), klopamid, ksipamid ili hlortalidon, aldosteron antagoniste kao što su spironolakton ili eplerenon i takodje druge diuretike pogodne za lečenje visokog krvnog pritiska kao što su furosemid i piretanid, i njihove kombinacije sa amiloridom i triamterenom.

Ovaj pronalazak označava da za subjekte koji su lečeni od povećanog krvnog pritiska, antagonisti angiotenzin II receptora, kao što su telmisartan su indikovani kada god treba prevenirati razvoj dijabetesa ili kada ih treba lečiti od manifestacija dijabetesa.

U samo 10 % od svih slučajeva povišenog krvnog pritiska (sekundarna hipertenzija) je moguće odrediti identifikovani pravac kao što je na pr. oboljenje bubrega. Po pravilu, sekundarna hipertenzija se može lečiti tretiranjem i uklanjanjem uzroka. Medjutim, u skoro 90 % od svih slučajeva postoji primarna hipertenzija, za koju stvaran uzrok nije poznat i koja se zbog toga ne može direktno lečiti. Negativni efekti povišenog krvnog pritiska se mogu smanjiti uz pomoć menjanja načina života i ispravnim tretmanom. Interakcija različitih faktora rizika ili kombinovana pojava individualnih faktora rizika se javlja kao uzrok visokog krvnog pritiska. Posebno, kombinacija visokog krvnog pritiska sa poremećajima metabolizma masti i šećera se posmatra sa pojačanim obimom. Ovi poremećaji su često započinju neprimećeni ali se mogu prepoznati iz povećanog nivoa triglicerida i glukoze u krvi i nižeg nivoa HDL holesterola u krvi. U prilično odmakloj fazi oni se takodje mogu detektovati kroz sporo povećanje korpulencije. Ovi poremećaji se mogu objasniti sa povećanjem insulinske rezistencije. Sto je insulin manje efektivan to je više metabolizam masti i šećera poremećen. Kombinacija svih ovih poremećaja u poslednjim analizama povećavaju verovatnoću postojanja šećernog oboljenja - dijabetesa i prerane smrti od srčanog ili vaskularnog oboljenja.

Procene se zasnivaju na pretpostavci da, u onim delovima sveta gde je suvišno snabdevanje hranom, oko trećine odraslih su sa povišenim krvnim pritiskom i sa poremećajima metabolizma masti i šećera i da taj broj ima trend stalnog porasta. Zbog toga postoji potreba za lekovima koji su sposobni da pomognu u usporavanju ili zaustavljanju napredovanja gore pomenutih metaboličkih poremećaja u što ranijoj fazi i u isto vreme da otklone škodljive efekte povećanog krvnog pritiska na zdravlje.

Ovaj pronalazak takodje opisuje farmaceutsku kompoziciju koja se može koristiti i za lečenje hipertenzije i za lečenje manifestacija tip 2 dijabetesa ili prvih znaka kompleksnih metaboličkih poremećaja predijabetesa. Prema tome, pronalazak takodje uključuje prevenciju dijabetesa kod pacijenata koji su bili lečeni od visokog krvnog pritiska. Ako se za ovo u pravo vreme koristi pogodan antagonist angiotenzin II receptora kao što je telmisartan za kontrolu krvnog pritiska čim se pojavi jedan od gore pomenutih znaka predijabetesa, početak manifestacija tip 2 dijabetesa se može odložiti ili prevenirati.

Antagonisti angiotenzin II receptora koji su pogodni u okviru polja ovog pronalaska su jedinjenja za koja se vezivanje za PPARgama ligand vezujuću oblast može po pravilu pokazati uz pomoćin vitro testova(Primer 1), dok oni aktiviraju ekspresiju stabilno transfikovanog gena luciferaze na ćelijskom nivou, odnosno nakon dodavanja stabilno transformisane PPARgama reporter ćelijske linije u kultivacioni medijum (Primer 3).

Pogodni antagonisti angiotenzin II receptora takodje imaju sledeća svojstva:

• ne pokazujuin vitro vezivanjeza ligand vezujuće oblasti humanog PPARgama receptora, ali vode do • indukcije luciferazne aktivnosti kada se oni dodaju u kultivacioni medijum sa stabilno transformisanom PPARgama reporter ćelijskom linijom koja a) eksprimira fuzioni protein koji se sastoji od ligand vezujuće oblasti humanog PPARgama transkripcionog faktora i kvaščeve GAL4 DNK vezujuće oblasti i b) luciferazni gen koji je pod kontrolom petostruko ponovljenog kvaščevog Gal4 vezujućeg mesta.

Dobijanje PPARgama reporter ćelijske linije ove vrste je opisano u Primeru 2.

Ne postojiin vitro vezivanjeza ligand vezujuće oblasti humanog PPARgama 2 receptora ukoliko se ne može detektovati u AlphaScreen instrumentu (Ullmann EF i sar., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 5426 - 5430). Umesto Alpha Screen instrumenta, SPA analiza (Mukherjee R i sar., J Steroid Biochem Mol Biol (2002) 81:217 - 225) ili NMR ispitivanje Gohnson BA i sar., J Mol Biol (2000) 298:187 -194) se mogu takodje izvoditi. Po pravilu, vezivanje za receptor se ne može detektovati pomoću bilo koje od tih metoda.

Obimna lista antagonista angiotenzin II receptora se može naći na stranama 7 -18 u WO 95/26188. Antagonisti angiotenzin II receptora su opisani izmedju ostalog u EP-A-253310, EP-A-323841, EP-A-324377, EP-A-420237, EP-A-443983, EP-A-459136, EP-A-475206, EP-A-502314, EP-A-504888, EP-A-514198, WO 91/14679, WO 93/20816, US 4,355,040 i US 4,880,804. Oblici koji se često pominju su sartani, kao što su kandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan, olmesartan, tasosartan, telmisartan ili valsartan. Oni koji su posebno poželjni prema ovom pronalasku su irbesartan, losartan i telmisartan. Najbolji rezultati su jasno dobijeni sa telmisartanom i njegovim solima. Formulacije koje su proizvedene sadrže ekvivalent od 20 - 200 mg, poželjno 20,40,80,120,160 ili 200 mg slobodne kiseline aktivne supstance. Ukoliko se aktivna supstanca kombinuje sa HCTZ ili hlortalidonom, formulacija sadrži 10 - 50 mg, poželjno 50, 25 ili 12,5 mg diuretika.

Povoljna aktivnost pojedinačnog angiotenzin II antagonista koji je opisan u okviru polja ovog pronalaska je posebno zabeležena za aktivnu supstancu telmisartan. Ukoliko se javi korist ili potreba za korišćenjem nekog blokatora angiotenzin II receptora zajedno sa jednim ili više drugih terapeutskih aktivnih supstanci, telmisartan je poželjan blokator angiotenzin II receptora, pošto kombinuje sniženje krvnog pritiska i metaboličku aktivnost u jediničnoj aktivnoj supstanci, na pr. neku antidijabetsku aktivnost koja takodje pomaže u prevenciji dijabetesa. Iz tog razloga, preformulisane kombinacije aktivne supstance telmisartana sa HMG-Co A inhibitorima reduktaze kao što su simvastatin ili atorvastatin sačinjavaju glavni dalji razvoj u lečenju kardiovaskularnih, kardiopulmonarnih, pulmonarnih ili renalnih oboljenja, ali takodje i u lečenju dislipidemije, osteoporoze ili Alchajmera. Ovo se takodje primenjuje na kombinacije aktivne supstance telmisartana sa roziglitazonom ili pioglitazonom ili repaglinidom ili metforminom ili sa DPP4 inhibitorom u lečenju dijabetesa. Telmisartan se mora takodje smatrati kao poželjni RAS inhibitor u lečenju visokog krvnog pritiska sa inhibitorima renin-angiotenzin sistema (RAS) u kombinaciji sa kalcijum antagonistima kao što su amlodipin ili nifedipin ili neki aldosteron antagonistima kao što su spironolakton ili eplerenon. Kombinacija sa nekim aldosteron antagonistima kao što je eplerenon takodje predstavlja važan razvoj u lečenju ili prevenciji slabog srca ili srčanog napada.

Pored povišenog krvnog pritiska, poremećaji metabolizma lipida (dislipidemije) i dijabetes melitus takodje označavaju povećani razik od udara, sa rezultatom da telmisartan, takodje zajedno sa inhibitorima agregacije trombocita, kao što su klopidogrel ili dipiridamol i dodatna kombinacija sa acetilsalicilnom kiselinom (ASA), takodje čine poželjnu kombinaciju, posebno za prevenciju udara. U te svrhe dipiridamol se može koristiti u dozama od 50 do 750 mg, poželjno od 100 do 500 mg i posebno od 200 do 450 mg. ASA se može koristiti u dozama od 10 do 200 mg, poželjno od 25 do 100 mg i posebno od 30 do 75 mg.

Prema tome ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže telmisartan ili jednu od njegovih soli u kombinaciji sa

• amlodipinom ili nifedipinom,

• eplerenonom ili spironolaktonom,

• simvastatinom ili atorvastatinom,

• roziglitazonom ili pioglitazonom ili repaglinidom ili metforminom,

• dipiridamolom ili klopidogrelom, opciono kombinovanim sa acetilsalicilnom kiselinom,

• sulfonilureom,

• nekim antagonistom aldosterona,

• nekim inhibitorom HMG-Co A reduktaze,

• inhibitorom DPP4 ili

• inhibitorom agregacije trombocita,

i na njihovo dobijanje. Ove preformulisane kombinacije sa aktivnom supstancom su generalno inkorporisane sa jednim ili više pomoćnih sredstava za formulacije, kao što su manitol, sorbitol, ksilitol, saharoza, kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, laktoza, natrijumova so kroskarmeloze (natrijumova so celuloza karboksimetiletra, unakrsno povezana), krospovidon, natrijum škrob glikolat, hidroksipropilceluloza (nisko-supstituisana), kukuruzni škrob, polivinilpirolidon, kopolimeri vinilpirolidona sa drugim vinil derivatima (kopovidon), hidroksipropilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, mikrokristalna celuloza ili škrob, magnezijum stearat, natrijum stearilfumarat, talk, hidroksipropilmetilceluloza, karboksimetilceluloza, celuloza acetat ftalat, polivinil acetat, voda, voda/etanol, voda/glicerol, voda/sorbitol, voda/polietilenglikol, propilenglikol, cetilstearil alkohol, karboksimetilceluloza ili masne supstance kao što su čvrste masti ili njihove pogodne smeše, u konvencionalnim galenskim preparatima kao što su obične ili obložene tablete, kapsule, prahovi, suspenzije ili supozitorije.

Tablete se mogu dobiti na primer pomoću mešanja aktivne supstance ili supstance sa jednim ili više pomoćnih sredstava i zatim njihovim komprimovanjem. Tablete se mogu takodje sastojati od nekoliko slojeva. Primeri za pomoćna sredstva su

• inertni diluenti kao što su manitol, sorbitol, ksilitol, saharoza, kalcijum karbonat, kalcijum fosfat i laktoza; • dezintegratori kao što su natrijumova so kroskarmeloze (natrijumove soli celuloza karboksimetiletra, unakrsno vezane), krospovidon, natrijum škrob glikolat, hidroksipropilceluloza (nisko-supstituisana) i kukuruzni škrob; • vezujući agensi kao što su polivinilpirolidon, kopolimeri vinilpirolidona sa drugim vinil derivatima (kopovidon), hidroksipropilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, mikrokristalna celuloza ili škrob; • lubrikanti kao što su magnezijum stearat, natrijum stearil fumarat i talk; • agensi za postizanje odloženog otpuštanja, kao što su hidroksipropilmetilceluloza, karboksimeitlceluloza, celuloza acetat ftalat i polivinil acetat; i

• farmaceutski dozvoljene boje kao što su obojeni gvoždje oksidi.

Blokiranjem aldosterona smanjuje se mortalitet i morbiditet kod pacijenata sa izraženom slabošću srca. Ukoliko pacijenti koji su lečeni sa ACE inhibitorima, antagonistima angiotenzin receptora, diureticima ili beta-blokatorima za simptomatičnu slabost srca i otkazivanje leve komore, pate od miokardijalnog infarkta, može se videti da dodatno lečenje sa selektivnim blokatorom aldosterona, eplerenonom, popravlja njihove šanse za preživljavanje i vodi do smanjenja kasnijeg bolničkog lečenja (NEJM 348:1309-1321,2003). Grupa pacijenata koji su ispitivani takodje uključuje dijabetične pacijente koji imaju otkazivanje leve komore ali ne i simptomatičnu slabost srca, pošto je za ovu grupu pacijenata rizik od kardiovaskularnog oboljenja slična kao kod pacijenata sa otkazivanjem leve komore i simptomatičnom slabošću srca. Ukoliko se to uzme u obzir, otkriće antidijabetskih efekata kod blokatora angiotenzin II receptora, telmisartana, koji su opisani ovde, označavaju da njegovo kombinovanje sa eplerenonom nakon tretmana miokardijalnog infarkta je indikovano posebno kod pacijenata koji već pate od dijabetesa i u svakom slučaju dijabetske proteinurije kod kojih se sumnja da su pre dijabetičari. Ovaj pronalazak prema tome se takodje odnosi na farmaceutske formulacije u kojima su kombinovane dve aktivne supstance, telmisartan i eplerenon, na pr. jedan ekvivalent od 40 - 320 mg, poželjno 80 ili 160 mg telmisartana i jedan ekvivalent od 20 - 200 mg, poželjno 25 ili 50 mg eplerenona. Poželjna je formulacija koja se sastoji od dvoslojne tablete. Za lečenje pacijenata koji pokazuju simptome i dislipidemije (na pr. hipertrigliceridemija ili hiperholesterolemija) dodatna kombinacija sa agensima za snižavanje lipida, kao što su simvastatin ili atorvastatin u uobičajenim dozama od 2,5 - 40 mg, poželjno je od 5,10,15, 20, 25, 30, 35 ili 40 mg je često dobra ideja. Odgovarajuća formulacija sa telmisartanom, eplerenonom i atorvastatinom ili simvastinom može se proizvesti, na primer, u obliku troslojne tablete. Aktivna supstanca eplerenon se koristi, posebno, u mikronizovanom obliku sa veličinom D90čestica od 25 - 400 mikrona (WO 00/33847).

Metformin je isproban i testiran antidijabetični agens koji dostiže svoj glavni efekat uz pomoć snižavanja suvišne produkcije glukoze u jetri dijabetičara. U monitoringu lečenja dijabetes melitusa, vrednost HbAlc, proizvoda neenzimatske glikacije hemoglobin B lanca, je od izuzetne važnosti. Kako njegova produkcija esencijalno zavisi od nivoa šećera u krvi i od života eritrocita, HbAlc u smislu "memorije šećera u krvi" odslikava prosečne nivoe šećera u krvi u prethodne 4 - 6 nedelje. Dijabetični pacijenti čija vrednost HbAlc je konzistentno dobro regulisana uz pomoć intenzivnog dijabetičnog tretmana (odnosno, < 6,5 % od ukupnog hemoglobina u uzorku), su značajno bolje zaštićeni od dijabetične mikroangiopatije. Metformin sam dostiže prosečno poboljšanje u vrednosti HbAlc kod dijabetičara u vrednosti od 1,0 -1,5 %. Ovo smanjenje vrednosti HbAlC nije dovoljno kod svih dijabetičara da se dotigne željeni ciljani opseg od < 6,5 % a poželjno < 6 % HbAlc. Prema tome, dodatne terapeutske mere su neophodne za povećanje efekta metformina.

U okviru polja ovog pronalaska sa iznenadjenjem je ustanovljeno da telmisartan deluje kao aktivator PPAR-gama. Prema tome, telmisartan ima potencijal da poveća insulinsku senzitivnost u masnom, mišićnom i tkivu jetre i na taj način da snizi nivo šećera u krvi. To čini telmisartan posebno pogodnim kao partnerom u kombinovanju sa antidijabeticima kao što su metformin ili repaglinid (pomaže oslobadjanje insulina iz B-ćelija u pankreasu), pošto se njegov efekat zasniva na različitim principima i na taj način pogodno intenzivira efekte ovih aktivnih supstanci. Formulacije sa kombinacijama repaglinida i telmisartana sadrže, na primer, jedan ekvivalent od 0,25 do 5 mg, poželjno 0,25 do 2 mg, i najpoželjnije od 0,5 ili 1 ili 2 mg repaglinida i jedan ekvivalent od 40 do 320 mg, poželjno 80 ili 160 mg telmisartana.

Kombinacija sa telmisartanom i metforminom je posebno pogodna za gojazni tip 2 dijabetičara jer, s jedne strane, metformin za razliku od drugih oralnih antidijabetika ne dovodi do povećanja telesne težine, a sa druge strane, telmisartan smanjuje insulinsku rezistenciju kao važno svojstvo i uzrokuje povišenje nivoa šećera u krvi kod ovih tip 2 dijabetičara. Kod većine gojaznih tip 2 dijabetičara i takodje kod predijabetičara povišenje krvnog pritiska je detektovano što je takodje jedan od kriterijuma za metabolički sindrom. Za ovu grupu pacijenata telmisartan je poželjan antihipertenziv, jer on ima dodatna svojstva od kojih je to da, kao jedan insulinski senzitizer, medjusobno deluje pogodno sa isprobanim i testiranim antidijabeticima kao što su metformin, u cilju lečenja različitih aspekata oboljenja tip 2 dijabetesa, tip 2 predijabetesa ili metaboličkog sindroma ili insulinske rezistencije u isto vreme i na isti način. Pomoću dodatne primene telmisartana dodatno poboljšanje u vrednostima HbAlc u opsegu od 0,25 - 2 %, poželjno 0,25 -1 % i najpoželjnije od 0,25 - 0,5 % se može postići. Poboljšanje u vrednosti HbAlc koje je manje od 0,25 % od ukupnog hemoglobina predstavlja razuman doprinos lečenju tip 2 dijabetičara ali još uvek nije pouzdano moguće da se izmeri. Kako je UKPDS (United Kingdom Prospective Dijabetes Study) pokazao, sniženje povišenog krvnog pritiska je efikasno samo kao lečenje za sniženje nivoa šećera u krvi u smanjenju kasnijih komplikacija kod tip 2 dijabetičara kao što su nefropatije, neuropatije, retinopatije i sve makrovaskularne komplikacije. Prema tome, predložena kombinacija sa telmisartanom i metforminom predstavlja glavni doprinos za smanjenje ili čak prevenciju ozbiljnih posledica dijabetesa.

Formulacije sa kombinacijama metformina i telmisartana sadrže, na primer, jedan ekvivalent od 450 - 900 mg, poželjno 500 ili 850 mg metformina i jedan ekvivalent od 40 - 320 mg, poželjno 80 ili 160 mg telmisartana. Metformin hidrohlorid se rastvara lako i može se lako formulisati sa pomoćnim agensima kao što su agensi vezivanja i lubrikanti. Poželjna je formulacija koja se sastoji od dvoslojnih tableta. Kombinacija sa poželjnim količinama aktivne supstance i pomoćnih agenasa daje sledeće kompozicije:

Formulacije sa kombinacijama repaglinida i telmisartana sadrže, na primer, jedan ekvivalent od 0.25 do 5 mg, poželjno 0.25 do 2 mg, i najpoželjnije 0.5 ili 1 ili 2 mg repaglinida i jedan ekvivalent od 40 -320 mg, poželjno 80 ili 160 mg telmisartana.

Primeri:

Primer 1: Telmisartan, losartan i irbesartan se ne vezujuin vitroza

PPARgama ligand vezujuću oblast

Protein koji sadrži humanu PPARgama-ligand vezujuću oblast (LBD) je dobijen kao GST fuzioni protein uE. coliiprečišćen uz pomoć afinitetne hromatografije.

Za izvodjenje toga, DNK sekcija koja kodira za aminokiseline 205 -505 humanog PPARgama2 transkripcionog faktora (Banka gena U79012) je subkloniran preko dodatno uvedenih restrikciono isečenih mesta BamH I i Xho I u ekspresioni vektor pGEX4T-l (Amersham) i sekvenca u sekciji je praćena. Fuzioni protein je eksprimiran uE. coliso)BL21(DE3) koji se preporučuje za pGEX vektore nakon indukcije sa 0.2 mM IPTG u toku 4 sata na 25 °C. Bakterije su peletovane nakon indukcije i zamrznute u partijama u PBS, pH 7.4. Nakon otvaranja u francuskoj presi, rastvoreni GST-PPARgama-LBD-fuzioni protein je prečišćen korišćenjem GSTrap kolone (Pharmacia). Eluiranje je izvedeno uz pomoć dodavanja 20 mM redukovanog glutationa.

GST-PPARgama-LBD-proteinske frakcije su odsoljene korišćenjem HiTrap kolone za odsoljavanje (Pharmacia) i koncentracija proteina je odredjena korišćenjem standardne analize.

Protein koji sadrži humanu RXRalfa ligand vezujuću oblast (LBD) je dobijen kao His tag fuzioni protein uE. coliiprečišćen je uz pomoć afinitetne hromatografije.

Za izvodjenje toga DNK sekcija koja kodira za aminokiseline 220 - 461 humanog RXRalfa transkripcionog faktora (Banka gena NM_002957, nt 729-1457) je subklonirana preko dodatno uvedenih restrikciono isečenih mesta BamH I i Not I u ekspresioni vektor pET28c (Novagen) i sekvenca u sekciji je praćena. Fuzioni protein je eksprimiran uE. coliso]BL21(DE3) koji se preporučuje za pET vektore nakon indukcije sa 0,2 mM IPTG u toku 4 sata na 25 °C. Bakterije su peletirane nakon ekspresije i zamrznute u partijama u PBS, pH 7.4. Nakon otvaranja u francuskoj presi, rastvoreni His-RXRalfa -LBD-fuzioni protein je prečišćen korišćenjem HiTrap helatirajuće kolone (Pharmacia). Eluiranje je izvedeno korišćenjem koraka sa 500 mM imidazola. His-RXRalfa -LBD oroteinske frakciie su odsoljene korišćenjem HiTrap kolone za odsoljavanje (Pharmacia) i koncentracija proteina je odredjena korišćenjem standardne analize,

a) AlfaSkrin

Alfa Skrin analize su prvi put opisane u Ullmann EF i sar., Proc Natl Acad Sci USA (1994)

91: 5426 - 5430. Merenja izvedena u okviru polja ovog Primera su izvedena kako je opisano u Glickman TF i sar.. T Biomol Screen (2002) 7:3-10. Analitički pufer se sastoji od 25 mM Hepes pH 7.4,100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 % Tween-20,0.1 % BSA. 3 nM GST-PPARgama-LBD fuzionog proteina, 15 nM biotinilovanog LXXLL peptida iz kofaktora CBP (odgovara peptidu koji je opisan na strani 218 u Mukherjee R i sar., J Steroid Biochem Mol Biol (2002) 81: 217 -225 sa jednim dodatnim N-terminalnim cisteinom), i u svakom slučaju 10 p,g/ml čestica anti-GST-akceptora ili čestica streptavidin-donora (Applied Biosistemi) su inkubirani u ukupnoj zapremini od 12,5 [ i\ u prisustvu različitih koncentracija testirane supstance (u DMSO) u toku 4 sata na sobnoj temperaturi. Krajnja koncentracija DMSO u analizi je 1 %

(v/v). 1 % rastvor DMSO je korišćen kao šlepa proba (NSB). Merenje je izvedeno korišćenjem Packard uredjaja za merenje fuzije.

Za razliku od roziglitazona, PPARgama-agonista za koga je poznato iz literature da se vezuje u LBD, korišćenje povećane koncentracije telmisartana, losartana i irbesartana (koncentracija do 50 uM) ne dovodi do bilo kakve direktne aktivacije PPARgama-LBD i otuda do bilo kakve značajne regrutacije LXXLL peptida.

b) SPA Analiza

Opis SPA analitičkog formata se može naći u Mukheriee R i sar.. J Steroid Biochem Mol

Biol (2002) 81:217 - 225. Analitički pufer se sastoji od 20 mM Tris pH 7.5,25 mM KC1,10 mM DTTi 0.2 %Triton X-100.30 nM GST-PPARgama-LBD fuzionog proteina, 30 nM His-RXRalfa-LBD, anti-GST-antitela (1: 600, Amersham Pharmacia), 0.25 mg protein A SPA PVT čestica za vezivanje antitela (Amersham Pharmacia), 30 nM<3>H-obeleženog roziglitazona su inkubirani zajedno sa rastvorom testirane supstance u toku 5 sati na sobnoj temperaturi u ukupnoj zapremini od 100 ul. 10 uM neobeleženog roziglitazona je dodato kao šlepa proba (NSB) umesto radioaktivnog roziglitazona, i korišćeni rastvarač, na pr. DMSO, je dodat kao maksimalna vrednost (Bmaks) umesto testirane supstance.

Nakon inkubacije testirani preparati su centrifugirani u toku 5 minuta na 2000 rpm u Hettich Universal 30Rf centrifugi i mereni korišćenjem Packard TopCount NXT.

Za razliku od direktnog PPARgama-agonista koji se vezuju za PPARgama-LBD, nije došlo do, od koncentracije zavisnog izmeštanja radioaktivnog roziglitazona iz vezujuće grupacije čak ni u prisustvu veoma velikog viška telmisartana, losartana ili irbesartana.

c) NMR ispitivanja

Za razliku od direktnog PPARgama Uganda, na pr. rozigUtazona, nije došlo do interakcije

testirane supstance sa aminokiselinama u vezujućoj grupaciji tokom merenja<15>N TROSY spekta PPARgama-LBD u prisustvu testirane supstance telmisartana. Aminokiseline vezujuće grupacije imaju istu poziciju u prisustvu testiranih supstanci kao u odsustvu Uganda.

Primer 2: Dobijanje stabilno transformisane PPARgama reporter ćeUjske Unije

DNK sekcija koja kodira za aminokiseUne 205 - 505 humanog PPARgama2 transkripcionog faktora (koji odgovara nukleotidima 703-1605 iz Banke genskih sekvenci U79012) je inkorporisana u multipU klonirano mesto vektora pFA-CMV (Stratagen) preko dodatno uvedenih restrikcijom isečenih mesta BamH I i Hind III i sekvenca je verifikovana. Dobijeni plazmid pFA-CMV/hPPARgama2-LBD kodira za N-terminal iz PPARgama-LBD u istom okviru čitanja za Gal4 DNK vezujuću oblast. Pored toga, plazmid kodira za rezistenciju na neomicin.

Ćelijska linija CHO-K1 (ATCC CCL-61) je kotransficirana sa plazmidima pFA-CMV/hPPARgama2-LBD i pFR-Luc (Stratagen). pFR-Luc kodira za luciferazni gen pod kontrolom petostruko ponovljenog kvaščevog Gal4 vezujućeg mesta. Transfekcija je izvedena sa lipofektaminom 2000 prema instrukciji proizvodjača.

Nakon transfekcije, ćelije su kultivisane u medijumu (Ham's F12 sa 10 % fetalnog telećeg seruma) u prisustvu 0.5 mg/ml G-418. Nakon šest dana kultivacije, ćeUje su pasažirane i držane u kulturi u toku dodatnih 10 dana. Dobijene kolonije rezistentne na neomicin su odabrane pod mikroskopom i transferisane u mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića i kultivisane. Dobijene su različito transformisane ćelijske linije sa plazmidima koji se u njima nalaze (na pr. klon br. 10,11,13 i td.), koje su držane u kultivacionom medijumu.

Ćelijske linije su posmatrane na inducibilnost luciferaznog gena korišćenjem PPARgama agonista, na pr. roziglitazona, i na reakciju sa povećanim signalom luciferaze koji su stimulisani pomoću PPARgama agonista.

Primer 3: Telmisartan, losartan i irbesartan aktivacija PPARgama na

ćelijskom nivou

CHO-K1 ćelijska linija koja je dobijena iz transformisanog klona 11 iz Primera 2 je zasejana u mikrotitarsku ploču sa ravnim dnom i sa 96 bunarčića sa gustinom od 3 x IO<4>

ćelija/200 ul/po bunarčiću i kultivisana preko noći u Ham's F-12 medijumu sa 10 % fetalnog telećeg seruma i 0.5 mg/ml G-418. Nakon 24 sata medijum je zamenjen sa onim koji ne sadrži G-418.

Testirane supstance su dovedene do 100 puta od željene koncentracije sa pogodnim rastvaračem, na pr. DMSO, i razblažene 1:100 sa medijumom i postavljene u ploču za kultivaciju ćelija. Korišćeni rastvarač, na pr. DMSO, je korišćen kao šlepa proba u istoj koncentraciji.

24 sata nakon dodavanja supstance, supernatanti su odbačeni i ćelije su isprane dva puta sa 150 ul pufera za ispiranje (25 mM Tricina, 16.3 mM MgS04, pH 7.8). Nakon koraka ispiranja, 50 jal pufera za ispiranje sa 150 jal luciferaznog analitičkog pufera (25 mM Tricina, 0.5 mM EDTA, 0.54 mM NaTPP, 16.3 mM MgS04,1.2 mM ATP, 0.05 mM luciferina, 56.8 mM 2-merkaptoetanola, 0.1 %Trition X-100, pH 7.8) su dodati u svaki testirani preparat Luminescencija je merena nakon pet minuta čekanja, korišćenjem Packard TopCount NXT. Luciferazna aktivnost je dobijena uz pomoć integralisanja relativne luciferazne jedinice (RLU) u prvih deset sekundi nakon početka merenja.

Antagonist angiotenzin II receptora, telmisartan dovodi do posebno potentne aktivacije PPARgama puta u PPARgama reporter ćelijskoj liniji. Do aktivacija pomoću drugih antagonista angiotenzin II receptora, kao što su losartan i irbesartan dolazi samo pri većoj testiranoj koncentraciji i to u manjem obimu.

Primer 4: Eksperimenti sa 3T3-L1 adipocitima i PC12W ćelijama

3T3-L1 mišiji preadipociti su kultivisani u DMEM (Dulbecco's modifikovan eagle medijum) sa 10 % fetalnog telećeg seruma (FBS). PC12W ćelije su kultivisane u DMEM sa 5 % FBS i 10 % konjskog seruma. U oba slučaja medijum sadrži 1 % penicilin / streptomicin. Diferencijacija adipocita je indukovana 2 -3 dana nakon ćelijskog slivanja pomoću dodavanja rastvora za diferenciranje. Ovaj rastvor sadrži

1 fmiol/L deksametazona,

0.5 mMol/L 3-izobutil-l-metilksantina,

1,67 umol/L insulina, i

10 % FBS.

Za poredjenje, diferencijacija je takodje indukovana sa rastvorom za diferenciranje koji dodatno sadrži telmisartan. Nakon 48 sata (dan 2) medijum je zamenjen sa DMEM koji sadrži 10 % FBS i 1.67 ^imol/L insulina ili 10 % FBS i 1.67^mol/L insulina i telmisartana. Zatim su ćelije stimulisane u toku dodatnih 48 sati pre nego su finalno analizirane (dan 4).

Akumulacija lipida u 3T3 - L1 adipocitima

Ćelije su isprane sa PBS i fiksirane sa 3.7 % formaldehidnim rastvorom u toku 2 minuta. Nakon fiksiranja, ćelije su bojene u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa 0.5 % stok rastvora Oil Red-0 u izopropanolu rastvorenom u razmeri 3 :2 sa vodom. Nakon ispiranja, ćelije su posmatrane pod svetlosnim mikroskopom. 10 (amol/L telmisartana dovodi do povećane akumulacije lipida koja je učinjena vidljivom uz pomoć pojačanog bojenja sa Oil Red-O. Diferencijacija 3T3-L1 adipocita je takodje potpomognuta sa telmisartanom.

Stimulacija ekspresije aP2 u 3T3 - L1 ćelijama

Izolacija RNK, reverzna transkripcija i kvantifikacija ekspresije gena su izvedeni korišćenjem jednog ABI7000 sistema za detekciju sekvenci u realno vremenskoj PCR analizi (opisano u Janke i sar., Diabetes 51:1699 -707,2002). Endogena kontrola koja je korišćena za realno vremensku PCR analizu sadrži grupu gena 18S rRNK i hipoksantin guanin fosforibozil transferaze (hprt).

Dobijena indukcija je zavisna od koncentracije telmisartana koji je korišćen. 10 (^mol/L telmisartana stimuliše ekspresiju adipogenog marker gena Adipoza Protein 2 (aP2) u 3T3-Ll ćelijama sa faktorom od 3.1 ± 0.3 (p < 0.01). Pomoću poredjenja, koncentracija 10^mol/L PPARgama liganda pioglitazona stimuliše ekspresiju aP2 sa faktorom od 4.5 ± 1 (p<0.01).

Analize transkripcionog reportera

U cilju ispitivanja da li indukcija adipogeneze uz pomoć telmisartana je rezultat stimulacije PPARgama aktivnosti, eksperimenti transfekcije su izvedeni sa PPRE (PPAR Response Element) Reporter konstrukcijama. Prolazna transfekcija i analize luciferaze koje su korišćene su opisane u Kintscher i sar., Circ Res. 91: e35 -44,2002.3T3-L1 adipociti (dan 4) ili PC12W ćelije su transficirane sa Lipofektaminom 2000 (Invitrogen) u prisustvu 1 ug (za 3T3-L1 ćelije) ili 50 ng (za PC12W ćelije) reporter konstrukcije, PPARgama2 i RXRalfa ekspresionih vektora i 10 ng Renila Luciferaza Reporter kontrolnog vektora. Reporter konstrukcija je spoj 3xAcil-CoA oksidaze PPAR Response Elementa (PPRE) saTk-luciferazom. PPARgama2 i RXRalfa ekspresioni vektori koji su korišćeni, odgovaraju vektorima koji su opisani u Elbrecht i sar., Biochem Biophvs Res Com 224:431 - 437,1996

i Joseph i sar., J Biol Chem 277(13): 11019 -11025,2002. Luciferaza Reporter kontrolni vektor je plazmid pRL-CMV (Promega). Nakon 4 sata transfekcioni medijum je zamenjen sa DMEM sa 10 % FBS koji dodamo sadrži telmisartan, pioglitazon ili nosač DMSO. Luciferazna aktivnost je merena nakon 24 sata.

Tretman 3T3- L1 adipocita sa 10^mol/L telmisartana dovodi do indukcije transkripcione aktivnosti PPARgama sa faktorom od 3.4 ± 0.9 (p < 0.05) u poredjenju sa indukcijom sa faktorom od 5.2 ± 1.1 uz pomoć 10 \ xmo\/ L pioglitazona.

PC12W ćelije su ATrreceptor-deficitne. PPARgama 2 i njegov heterodimerni partner RXRalfa su prekomerno eksprimirani u PC12W ćelijama i PPARgama-zavisna transkripcija je merena u prisustvu i odsustvu 10 umol/L telmisartana ili pioglitazona. Kako PC12W ćelije ne eksprimiraju PPARgama, nije izmerena regulacija PPARgama aktivnosti u odsustvu egzogenih PPARgama2 / RXRalfa. Nakon prekomerne ekspresije PPARgama 2 / RXRalfa heterodimera, medjutim, telmisartan takodje indukuje PPARgama aktivnost sa faktorom od 1.9 ± 0.4 (p < 0.05) u ATi-receptor-deficitnim PC12W ćelijama. Pomoću poredjenja, pioglitazon indukuje PPARgama aktivnost sa faktorom od 4.2 ± 1.4 (p < 0.01). Ovo pokazuje da aktivacija PPARgama aktivnosti uz pomoć telmisartana se odvija nezavisno od blokiranja ATj-receptora.

Podaci takodje pokazuju da koncentracije telmisartana koje su neophodne u cilju stimulacije PPARgama aktivnosti se mogu postići u krvi plazme pacijenata koji su tretirani sa telmisartanom za visoki krvni pritisak. To znači da lečenje visokog krvnog pritiska sa telmisartanom takodje je sposobno da poboljšava insulinsku senzitivnost, koja ima pozitivan efekat na nivo šećera u krvi.

Primer 5: Primeri formulacija

Tablete 3

Hidrohlortiazid, natrijumove soli telmisartana, sorbitol i crveni gvoždje oksid su izmešani u blenderu sa slobodnim padom, prevedeni preko 0.8 mm sita i, nakon dodavanja magnezijum stearata, procesirani u blenderu sa slobodnim padom kako bi se dobila praškasta smeša. Ova kombinacija aktivnih supstanci i pomoćnih agenasa je zatim komprimovana sa pogodnom presom za tablete (na pr. Korsch EKO ili Fette P1200) za oblikovanje tableta. Tablete sa sledećom kompozicijom su dobijene, količina natrijumovih soli telmisartana koje se nalaze u svakoj tableti odgovaraju količini od 80 mg slobodne kiseline telmisartana.

Natrijumove soli telmisartana u tabletama iz tri serije su rastvorene u 900 ml 0,1 M fosfatnog pufera, pH 7,5, sa sadržajima od 92 + 1.5 %, 96 ± 1.8 96 i 100 + 1.0 %, respektivno, nakon 30 minuta mešanja (75 rpm). Hidrohlortiazid se rastvara u 900 ml 0,1 M HC1

(100 rpm) nakon 30 minuta sa sadržajima od 69 ± 6.3 %, 72 ± 2.1 % i 78 ± 1.8 %, respektivno.

Claims

1. Korišćenje antagonista angiotenzin II receptora ili jedne od njegovih soli za dobijanje farmaceutske kompozicije za lečenje ljudi kod kojih je dijagnostikovan tip 2 dijabetes melitusa ili kod kojih se sumnja na predijabetično stanje, za prevenciju dijabetesa ili za lečenje metaboličkog sindroma i rezistencije na insulin kod pacijenata sa normalnim krvnim pritiskom.

2. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo šećera u krvi, u gladovanju, prelazi 125 mg glukoze po dl plazme.

3. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo šećera u krvi, u gladovanju je 110-125 mg glukoze po dl plazme.

4. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo šećera u krvi, od više nego 200 mg glukoze po dl plazme je izmeren 2 sata nakon uzimanja 75 g glukoze na prazan stomak.

5. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo šećera u krvi od 140 -200 mg glukoze po dl plazme je izmeren 2 sata nakon uzimanja 75 g glukoze na prazan stomak.

6. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo triglicerida u krvi prelazi 150 mg/dl.

7. Korišćenje prema zahtevu 6, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo HDL u krvi je manji od 40 mg po dl plazme kod žena i manji od 50 mg po dl plazme kod muškaraca.

8. Korišćenje prema zahtevima 6 i 7, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, nivo šećera u krvi, u gladovanju prelazi 110 mg glukoza po dl plazme.

9. Korišćenje prema zahtevima 1 - 8, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, sistolni krvni pritisak prelazi vrednost od 140 mM Hg i dijastolni krvni pritisak prelazi vrednost od 90 mM Hg.

10. Korišćenje prema zahtevima 1,2 i 4, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, sistolni krvni pritisak prelazi vrednost od 130 mM Hg i dijastolni krvni pritisak prelazi vrednost od 80 mM Hg.

11. Korišćenje prema zahtevima 1 -10, naznačeno time, što kod subjekata koji su tretirani, proporcija mera pojasne oblasti prema merama bedarne oblasti prelazi vrednost od 0,8 kod žena i vrednost od 1 kod muškaraca.

12. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što antagonist angiotenzin II receptora ima svojstvo da aktivira ekspresiju stabilno transficiranog luciferaznog gena nakon dodavanja stabilno transformisane PPARgama reporter ćelijske linije u medijum za kultivaciju, bez vezivanjain vitrozaPPARgama ligand vezujuću oblast.

13. Korišćenje prema zahtevu 12, naznačeno time, što antagonist angiotenzin II receptora ne pokazuje bilo kakvo vezivanjein vitroza ligand vezujuće oblasti u humanom PPARgama receptom dok antagonist angiotenzin II receptora vodi do indukcije luciferazne aktivnosti kada se doda u medijum za kultivaciju stabilno transformisane ćelijske linije koja eksprimira za fuzioni protein koji se sastoji od ligand vezujuće oblasti humanog PPARgama transkripcionog faktora i kvaščeve GAL4 DNK vezujuće oblasti i sadrži luciferazni gen pod kontrolom petostruko ponovljenog kvaščevog Gal4 vezujućeg mesta.

14. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što antagonist angiotenzin II receptora je aktivna supstanca telmisartan.

15. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što formulacija farmaceutske kompozicije sadrži 20 -200 mg telmisartana.

16. Korišćenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što antagonist angiotenzin II receptora je kombinovan sa diuretikom.

17. Korišćenje prema zahtevu 16, naznačeno time, što formulacija farmaceutske kompozicije sadrži 10-50 mg HCTZ ili hlortalidona.

18. Metod za lečenje ljudi kod kojih je dijagnostikovan tip 2 dijabetes melitusa ili kod kojih se sumnja na predijabetično stanje, za prevenciju dijabetesa ili za lečenje metaboličkog sindroma i rezistencije na insulin kod pacijenata sa normalnim krvnim pritiskom, naznačeno time, što je primenjena farmaceutska kompozicija koja sadrži antagonist angiotenzin II receptora.

19. Metod prema zahtevu 18, naznačeno time, što antagonist angiotenzin II receptora je aktivna supstanca telmisartan.

20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži telmisartan zajedno sa a) amlodipinom ili nifedipinom, b) eplerenonom ili spironolaktonom, c) simvastatinom ili atorvastatinom, d) roziglitazonom ili pioglitazonom ili repaglinidom ili metforminom, e) dipiridamolom ili klopidogrelom, opciono kombinovanim sa acetilsalicilnom kiselinom, sulfonilureom, f) antagonistom aldosterona, g) inhibitorom HMG-Co A reduktaze, h) inhibitorom DPP4, i) sulfonilureom ili j) inhibitorom agregacije trombocita.