[go: up one dir, main page]

RS20050932A - Kompozicije i postupci za povećanje mineralizacije kostiju - Google Patents

Kompozicije i postupci za povećanje mineralizacije kostiju

Info

Publication number
RS20050932A
RS20050932A YUP-2005/0932A YUP20050932A RS20050932A RS 20050932 A RS20050932 A RS 20050932A YU P20050932 A YUP20050932 A YU P20050932A RS 20050932 A RS20050932 A RS 20050932A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
tgf
polypeptide
bmp
Prior art date
Application number
YUP-2005/0932A
Other languages
English (en)
Inventor
Mary Brunkow
David Galas
Brian Kovacevich
John Mulligan
Bryan Paeper
Jeffrey Van Ness
David Winkler
Original Assignee
Celltech R & D. Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33563705&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS20050932(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celltech R & D. Inc., filed Critical Celltech R & D. Inc.,
Priority to MEP-31/08A priority Critical patent/MEP3108A/xx
Publication of RS20050932A publication Critical patent/RS20050932A/sr
Publication of RS52769B publication Critical patent/RS52769B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Otkrivena je nova klasa ili familija TGF-β vezujućih proteina. Takođe su otkriveni eseji za selekciju molekula za povećanje mineralizacije kostiju i metode za upotrebu ovakvih molekula. Posebno, obezbeđene su kompozicije i metode koje se odnose na antitela koja se specifično vezuju za TGF- β vezujuće proteine. Ove metode i kompozicije odnose se na promenu mineralne gustine kosti putem ometanja interakcije između TGF-β vezujućeg proteina sklerostina i člana TGF- β superfamilije, posebno morfogenog proteina kosti. Povećana mineralna gustina kosti ima upotrebu kod bolesti i stanja u kojima mala mineralna gustina kostiju karakteriše dato stanje, kao što su osteopenija, osteoporoza i frakture kostiju.

Description

KOMPOZICIJE I METODE ZA POVEĆAVANJE MINERALIZACIJE KOSTIJU
TEHNIČKA OBLAST
Ovaj pronalazak odnosi se generalno na farmaceutske proizvode i metode i još specifičnije na metode i kompozicije koje su pogodne za povećanje mineralnog sadržaja u kostima. Ovakve kompozicije i metode mogu se koristiti za tretiranje različitih stanja uključujući na primer, osteopeniju, osteoporozu, frakture, i druge poremećaje u kojima je glavno obeležje bolesti niska gustina minerala kostiju.
ISTORIJAT PRONALASKA
Tokom života jedne individue odigravaju se dve ili tri različite faze promena mase kostiju( videtiRiggs,West J. Med.154:63-77 (1991). Prva faza se odigrava i kod muškaraca i kod žena i traje do postizanja maksimuma koštane mase. Prva faza se postiže kroz linearan rast endohonralnih pločica za rast i radijalan rast usled stope periostealne (periosteal) apozicije. Druga faza počinje oko 30. godine za trabekularnu kost (ravne kosti kao što su pršljenovi i karlična kost) i oko 40. godine za kortikalne kosti (na primer, duge kosti koje se nalaze u udovima) i nastavlja se do starosti. Ovu ? fazu karakteriše spori gubitak kostiju i odigrava se i kod muškaraca i kod žena. Kod žena takođe se pdigrava treća faza gubitka kostiju, najverovatnije usled nedostatka estrogena u postmenopauzi. Samo tokom ove faze žene mogu izgubiti dodatnih 10% od koštane mase kortikalnih kostiju i 25% od trabekularnih prostora{ videtiRiggs, gore pomenuto).
Gubitak mineralnog sadržaja kostiju može biti uzrokovan različitim stanjima i može rezultovati u značajnim medicinskim problemima. Na primer, osteoporoza je oslabljujuća bolest kod ljudi i karakteriše je značajna smanjenja mase skeletnih mišića i mineralne gustine, strukturno razaranje kostiju, uključujući degradaciju mikroarhitekture kostiju i odgovarajuće povećanje lomljivosti kostiju i suspektnost na frakturu kod obolelih individua. Osteoporozi kod ljudi prethodi klinička osteopenija (mineralna gustina kosti koja je veća od standardne devijacije ali je manja nego 2.5 standardne devijacije ispod srednje vrednosti za kost mladog adulta), stanje koje se javlja kod otprilike 25 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. Dodatno 7-8 miliona pacijenata u Sjedinjenim Američkim Državama je dijagnostifikovano sa kliničkom osteoporozom (definisana kao sadržaj minerala u kosti koji je 2.5 standardne devijacije ispod zrele kosti mladog adulta). Osteoporoza je jedna od najskupljih bolesti za zdravstveni sistem, i košta nekoliko desetina milijardi dolara godišnje u Sjedinjenim Američkim Državama. Pored troškova vezanih za zdravstveni sistem, dugotrajna kućna nega, i gubitak radnih dana takođe doprinose finansijskim i socijalnim troškovima vezanim za ovu bolest. Širom sveta, oko 75 miliona ljudi nosi rizik za razvijanje osteoporoze.
Frekvenca osteoporoze u ljudskoj populaciji povećava se sa godinama, i među belcima, osteoporoza je predominantna kod žena (one sačinjavaju 80% u grupi koja predstavlja pacijente sa osteoporozom u Sjedinjenim Američkim Državama). Povećana fragilnost i suspektnost na frakturu skeletne kosti kod starijih je otežana sa povećanim rizikom od slučajnih padova u ovoj populaciji. Više od 1.5 miliona fraktura kostiju povezanih sa osteoporozom se svake godine prijavi u Sjedinjenim Američkim Državama. Frakture kukova, zgloba ruke i kičme su među najčešćim povredama povezanim sa osteoporozom. Frakture kuka su posebno nezgodne i skupe za pacijenta i za žene su u korelaciji sa visokim stopama mortaliteta i morbiditeta.
Iako je osteoporoza definisana kao povećanje rizika frakture usled smanjenja koštane mase, nijedan od trenutno dostupnih tretmana za poremećaje skeleta ne može da u značajnoj meri poveća gustinu kostiju kod adulta. Među svim lekarima postoji snažno zapažanje da su neophodni lekovi koji bi mogli da povećaju gustinu kostiju kod adulta, posebno kostiju ručnog zgloba, kičmenog stuba i kuka koji su rizični za osteopeniju i osteoporozu.
Sadašnje strategije za prevenciju osteoporoze mogu ponuditi neke pogodnosti pojedincima ali ne mogu obezbediti rešenje za bolest. Strategije uključuju umeravanje fizičke aktivnosti (posebno aktivnosti pri kojima se nosi teret) sa početkom poznih godina, obezbeđivanje adekvatnog kalcijuma u ishrani, i izbegavanju konzumiranja proizvoda koji sadrže alkohol ili duvan. Za pacijente sa kliničkom osteopenijom ili osteoporozom, sadašnji terapeutski lekovi i stretegije koji preovlađuju na tržištu su usmerene ka redukciji daljeg gubitka koštane mase putem inhibicije procesa absorbcije kostiju, prirodnog aspekta procesa ponovnog oblikovanja kostiju koji se konstitutivno odigrava.
Na primer, estrogen se sada prepisuje da bi se usporio gubitak kostiju. Međutim, postoje neke kontraverzije o tome da li pacijenti imaju dugoročne koristi i da li estrogen ima bilo kakav efekat na pacijente preko 75 godina starosti. Takođe, veruje se da upotreba estrogena povećava rizik od raka dojke i edometrijuma.
Visoke doze kalcijuma u ishrani, sa ili bez vitamina D, takođe su predloženi za žene u post menopauzi. Visoke doze kalcijuma međutim, mogu da daju neprijatne gastrointestinalnc sporedne pojave, i zato se moraju konstantno nadgledati koncentracije kalcijuma u serumu i urinu (na primer, Khosla and Rigss,Mayo Clin. Proc.70:978-982, 1995).
Drugi lekovi koji su predloženi uključuju kalcitonin, bibifosfonate, anaboličke steroide i natrijum fluoride. Ovakvi terapeutici međutim, imaju neželjene sporedne efekte (na primer, kalcitonin i steroidi mogu da izazovu mučninu i izazovu imunu reakciju, bifosfonati i natrijum fluorid mogu da inhibiraju popravku fraktura iako se gustina kostiju umereno povećava) koji mogu da spreće njihovo korišćenje (videti Khosla i
Rigsa, supra)
Posebno, nijedna trenutna primenjena strategija ne uključuje lck koji stimuliše ili povećava rast nove koštane mase. Ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije i metode koji se mogu koristiti za povećavanje mineralizacije kostiju, i koji zato se mogu koristiti za tertiranje različitih stanja u kojima je poželjno da se poveća koštana masa. Ovaj pronalazak takođe pruža druge srodne prednosti.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Kao što je ukazano gore u tekstu, ovaj pronalazak obezbeđuje novu klasu ili familiju TGF-beta vezujućih proteina, kao i eseje za selekciju jedinjenja koja povećavaju mineralni sadržaj kosti i mineralnu gustinu kosti i i metode za upotrebu ovakvih jedinjenja u tretiranju ili prevenciji širokog spektra stanja.
U okviru jednog aspekta ovog pronalaska obezbeđeni su izolovanai molekuli nukleinskih kiselina nazančeno time da su pomenuti molekuli nukleinskih kiselina odabrani iz grupe koja se sastoji od: (a) izolovanog molekula nukleinske kiseline koja obuhvata ID broj sekvence 1, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15, ili njegove komplementarne sekvence; (b) izolovanog molekula nukleinske kiseline koji specifično hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline (a) pod strogim (visoko restriktivnim) uslovima; i (c) izolovane nukleinske kiseline koja kodira TGF-beta vezujući protein na osnovu (a) ili (b). U okviru srodnih aspekata ovog pronalaska, izolovani molekuli nukleinskih kiselina obezbeđeni su na osnovu hibridizacije za samo deo jedne od gore identifikovanih sekvenci (na primer, za (a) hibridizacija može da bude sa probom od najmanje 20, 25, 50 ili 100 nukleotida koji su odabrani od nukleotida 156 do 539 ili 555 do 687 od ID broja sekvence 1). Kao što bi trebalo da je jednosatvno očigledno, neophodna restriktivnost koja se primenjuje za hibridizaciju može se varirati na osnovu veličine probe. Na primer, za probu koja je 25-mer visoko restriktivni uslovi mogu da uključe: 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 5x Denhardov, 6xSSC, 0.1% (w/v) N-laurilsarkozin, 0,5% (w/v) NP-40 (nejonski deterdžent P-40) preko noći na 45 stepeni C, nakon čega slede dva pranja sa 0.2x SSC / 0.1 % SDS na 45-50 stepeni. Za 100-mer probu u nisko restriktivnim uslovima, pogodna stanja mogu da uključe sledeće: 5x SSPE, 5x Denhardov, i 0.5% SDS preko noći na 42-45 stepeni, nakon čega slede dva pranja sa 2x SSPE (ili 2x SSC) / 0.1% SDS na 42-50 stepeni.
U okviru srodnih aspekata ovog pronalaska, obezbeđeni su izolovani molekuli nukleinskih kiselina koji imaju homologiju sa ID brojevima sekvenci: 1, 5, 7, 9, 11, 13 ih 15 pri 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% ili 98% nivou homologije upotrebom Wilbur-Lipman algoritma. Reprezentativni primeri ovakvih izolovanih molekula uključuju, molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju protein koji sadrži ID broj sekvence: 2, 6, 10, 12, 14 ili 16 ili ima homologiju sa ovim sekvencama od 50%, 60%, 75%, 80%o, 90%, 95% ili 98%> nivou homologije upotrebom Wilbur-Lipman algoritma.
Izolovani molekuli nukleinskih kiselina tipično su manji od 100 kb, u okviru određenih ostvarenja, manji od 50 kb, 25 kb, 10 kg ili 5 kb. Dalje, izolovani molekuli nukleinskih kiselina u okviru drugih ostvarenja ne postoje u "biblioteci" drugih nesrodnih molekula nukleinskih kiselina (na primer, subklon BAC kao što je opisano u GeneBank broju pristupa AC003098 i EMB No. AQ171546). Međutim, izolovani molekuli nukleinskih kiselina mogu se pronaći u bibliotekama srodnih molekula (na primer za "shuffling"-prebacivanje, kao što je opisano u U. S. Patent No: 5,837,4568; 5,830,721; i 5,81 1,238). Na kraju, izolovani molekuli nukleinskih kiselina kao što je ovde opisano, ne uključuju molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju Dan, Cerberus, Gremlin ili SCGF (U. S.
Patent No. 5,780,263).
U okviru drugih aspekata ovog pronalaska, obezbeđeni su ribozimi koji su sposobni da seku RNK koja kodira jedan od gore pomenutih TGF-beta vezujućih proteina (na primer ID broj sekvence: 2, 6, 10, 12, 14 ili 16). Ovakvi ribozimi mogu biti sačinjeni od DNK, RNK (uključujući 2'-0-metil ribonukleinske kiseline), analoga nukleinskih kiselina (na primer nukleinske kiseline koje imaju fosforotioat veze) ili njihove mešavine. Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina (na primer DNK ili cDNK) koji kodiraju ove ribozime, i vektori koji su sposobni da eksprimiraju ili proizvedu ribozime. Reprezentativni primeri vektora uključuju plazmide, retrotranspozone, kozmide, i vektore bazirane na virusima (na primer viralni vektori dobijeni makar delimično od retrovirusa, adenovirisa ili adeno-srodnih virusa). Takođe su obezbeđene domaćinske ćelije (na primer, humane, pseće, pacovske ili mišije ćelije) koje sadrže ove vektore. U određenim ostvarenjima domaćinska ćelija može biti stabilno transformisana sa vektorom.
U okviru daljih aspekata ovog pronalaska, obezbeđene su metode za proizvodnju ribozima ili sintetički, ili putemin vitroiliin vivotranskripcije. U okviru daljih ostvarenja ribozimi koji su tako proizvedeni mogu biti dalje prečišćeni i/ili formulisani u farmaceutske kompozocije (na primer, ribozim ili molekuli nukelinskih kiselina koji kodiraju ribozim zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom (rastvaračem)). Slično tome, antisens oligonukleotidi i antitela ili drugi selektovani molekuli kojio su ovde opisani mogu biti formulisani u farmaceutske kompozicije.
U okviru drugih aspekata ovog pronalaska, obezbeđeni su antisens (nekodirajući lanac) oligonukleotidi koji obuhvataju molekul nukleinske kiseline koja hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline na osnovu ID broja sekvenci 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15, ili njihovim komplementima, i naznačeno time da pomenuti oligonukleotid inhibira ekspresiju TGF-beta vezujućeg proteina kao što je ovde opisano (na primer oligonukleotid inhibira ekspresiju vezujućeg proteina kao što je ovde opisano (na primer., humani BEER). U okviru različitih ostvarenja oliginukleotid je 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 50 nukleotida dugačak. Poželjno, oligonukleotid je manje od 100, 75, ili 60 nukleotida dugačak. Kao što bi trebalo da bude očigledno, oligonukleotid može biti sačinjen od jednog ili više nukleinsko kiselinskih analoga, ribonuklrinskih kiselina, ili deoksiribonukleinskih kiselina. Dalje, oligonukleotid može biti modifikovan putem jednog ili više povezivanja uključujući na primer kovalentno povezivanje kao fosforotiolat povezivanje, fosfotioestar povezivanje, metilfosfonat povezivanje, metilen(metilimino) povezivanje, morfolino (C4H9NO) povezivanje, amidno povezivanje, poliamidno povezivanje, alkilno intrešećerno povezivanje preko kratkog lanca, cikloalkilno inter-šećerno povezivanje, heteroatomsko inter-šećerno povezivanej preko kratkog lanca, i heterociklično inter-šećerno povezivanje. Jedan reprezentativni primer himernog oligonukleotid je obezbeđen u U. S. Patent No. 5,989,912.
U okviru još jednog aspekta ovog pronalaska, obezbeđene su metode za povećanje mineralizacije kostiju, koje obuhvataju ubacivanje u toplokrvnu životinju efektivne količine ribozima kao što je gore opisano. U okviru srodnih aspekata ovakve metode sadrže korak unošenja u pacijenta efektivne količine molekula nukelinske kiseline ili vektora kao što je ovde opisano koji su sposobni da proizvedu željeni ribozim, u uslovima koji favorizuju transkripciju molekula nukleinske kiseline da bi se proizveo ribozim.
U okviru drugih aspekata pronalaska, obezbeđene su ne-humane životinje. U okviru jednog ostvarenja obezbeđena je transgena životinja čije germinativne i somatske ćelije sadrže molekul nukelinske kiseline koji kodira TGF-beta vezujući-protein kao što je gore opisano koji je operativno povezan sa promotorom koji je efektivan u ekspresiji gena, gen se unosi u ćeliju, ili pretka životinje, na embrionalnom nivou, pod uslovom da je pomenuta životinja nije čovek. U okviru drugih ostvarenja, obezbeđene su transgene nokautirane životinje koje obuhvataju životinju čije germinativne ćelije i somatske ćelije sadrže poremećaj najmanje jednog alela endogenog molekula nukleinske kiseline koji hibridizuje sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira TGF-beta vezujući protein koji je gore opisan, naznačeno time da poremećaj sprečava transkripciju (prepisivanje) informacione RNK iz pomenutog alela kada se uporedi sa životinjom bez poremećaja, pod uslovom da životinja nije čovek. U okviru različitih ostvarenja, poremećaj je nukleinsko kiselinska delecija, zamena ili insercija. U okviru rzaličitih ostvarenja, tarnsgena životinja je miš, pacov, ovca, prase ili pas.
U okviru sledećih aspekata pronalaska, obezbeđeni su paketi (kits) za detekciju ekspresije TGF-beta vezujućeg proteina, koji obuhvataju kontejner koji sadrži molekul amino kiseline, naznačeno time daje molekul nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od (a) molekula nukleinske kiseline koja obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101; (b) molekula nukleinske kiseline koji sadrži komplement nukleotidne sekvence od (a); (c) molekula nukleinske kiseline koji je fragment od (a) i (b) koji je najmanje 15, 20, 30, 50, 75 ili 100 nukleotida dugačak. Takođe su obezbeđeni paketi za detekciju TGF-beta vezujućeg proteina koji obuhvataju kontejner koji sadrži jedno od antitela RGF-beta vezujućeg proteina koja su ovde opisana.
Na primer, u okviru jednog aspekta ovog pronalaska obezbeđene su metode za određivanje da li je odabrani molekul sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti, koje obuhvataju korake (a) mešanja jednog ili više kandidatnih molekula sa TGF-beta vezujućim proteinom koji je kodiran od tsrane molekula nukleinske kiseline na osnovu patentnog zahteva 1 i odabranog člana TGF-beta familije proteina (na primer BMP 5 ili 6), (b) određivanja da li kandidatni molekul menja signalizaciju člana TGF-beta familije, ili menja vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. U okviru određenih ostvarenja, molekul menja sposobnost TGF-beta da funkcioniše kao pozitivan regulator diferencijacije mezenhimskih ćelija. U okviru ovih aspekata ovog pronalaska, kandidatni molekul(i) mogu da menjaju signalizaciju ili vezivanje putem na primer, ili smanjenja (na primer inhibicije) ili povećanja (na primer, pojačavanja) signalizacije ili vezivanja.
U okviru još jednog određenog aspekta, obezbeđene su metode za određivanje toga da li je odabrani molekul sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti, koje obuhvataju korak određivanja da li odabrani molekul inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za kost, ili analog kosti. Reprezentativni primeri kostiju i njihovih analoga uključuju hidroksiapatitne i pnmerne humane uzorke kostiju koje su dobijeni biopsijom.
U okviru određenih ostvarenja gore pomenutih metoda, odabrani molekul je sadržan u okviru mešavine molekula i metode mogu dalje da obuhvate korak izolovanja jednog ili više molekula koji su funkcionalni u okviru eseja. U okviru još drugih ostvarenja, TGF-beta familija proteina je vezana za čvrsti nosač i vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina se meri ili je TGF-beta vezujući protein vezan za čvrst nosač i meri se vezivanje TGF-beta vezujućih proteina.
Upotrebom metoda kao onih koje su gore opisane, mogu se uraditi eseji za širok dijapazon molekula za procenu njihove sposobnosti da povećaju mineralni sadržaj kosti putem inhibiranja vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina za familiju TGF-beta vezujućih proteina. Reprezentativni primeri ovakvih molekula uključuju proteine ili peptide, organske molekule, i molekule nukleinskih kiselina.
U okviru drugih srodnih aspekata pronalaska, obezbeđene su metode za povećanje mineralnog sadržaja kosti u toplokrvnoj životinji, koje obuhvataju korak dostavljanja toplokrvnoj životinji terapeutski efektivne količine molekula koji je identifikovan u eseju koji je ovde opisan. U okviru drugog spekta obezbeđene su metode za povećanje mineralnog sadržaja u toplokrvnoj životinji, koje obuhvataju korak dostavljanja toplokrvnoj životinji terapeutski efektivne količine molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za super-familiju TGF-beta proteina, uključujući morfogene proteine kosti (BMP-bone morfogenic proteins). Reprezentativni primeri pogodnih molekula uključuju antisens molekule, ribozime, ribozimske gene, antitela (na primer humanizovano antitelo) koja specifično prepoznaju i menjaju aktivnost TGF-beta vezujućeg proteina.
U okviru drugog aspekta ovog pronalaska, obezbeđene su metode za povećanje mineralnog sadržaja kosti u toplokrvnoj životinji, koje obuhvataju korake (a) unošenja, u ćelije koje odlaze u kost, vektora koji usmerava ekspresiju molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za TGF-beta proteinsku familiju i morfogene proteina kosti (BMP) i (b) dostavljanje ćelija koje sadrže vektor u toplokrvnu životinju. Kao što se ovde koristi, treba razumeti da "ćelije "odlaze u kost" ako su lokalizovane u okviru koštanog matriksa nakon perifernog dostavljanja. U okviru jednog ostvarenja, ovekve metode dalje obuhvataju, pre koraka dostavljanja, izolovanje ćelija iz koštane srži koja odlazi u kost. U okviru daljeg ostvarenja, ćelije koje odlaze u kost odabrane su iz grupe koja se sastoji od CD34+ ćelija i osteoblasta.
U okviru drugih aspekata ovog pronalaska, obezbeđeni su molekuli (poželjno izolovani) koji inhbiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za TGF-beta proteinsku super-familiju.
U okviru daljih ostvarenja, molekuli mogu biti obezbeđeni kao kompozicija, i mogu dalje sadržati inhibitor resorbcije kosti. Reprezentativni primeri ovakvih inhibitora uključuju kalcitonin, estrogen, bifosfonat, faktor rasta koji poseduje anti-resorbtivnu aktivnost i tamoksifen.
Reprezentativni primeri molekula koji se mogu koristiti u gore pomenutim terapeutskim kontekstima uključuju na primer, ribozim, gene ribozima, antisens molekule, i/ili antitela (na primer, humanizovana antitela). Ovakvi molekuli mogu zavisiti od njihove selekcije, koja se koristi da bi se promenila, antagonizovala, ili otežala (agonize) signalizacija ili vezivanje člana familije TGF-beta vezujućih proteina kao što je ovde opisano.
U okviru različitih ostvarenja pronalaska, gore-opisani molekuli i metode tretiranja ili prevencije mogu se upotrebiti na stanja kao što je osteoporoza, osteomalazija, perodontalna bolest, skorbut, Kušingova bolest, fraktura kosti i stanja usled imobilizacije udova i upotrebe steroida.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein, sklerostin (SOST), i obezbeđuje imunogene koji obuhvataju sklerostin peptide izvedene iz regiona sklerostina koji interaguju sa članom TGF-beta familije proteina kao što je morfogeni protein kosti. U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se specifično vezuje za sklerostinski polipeptid, pomenuti sklerostinski polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM 030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO: 110), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO: 111); NM_033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO: 114); CAA88759 (SEQ ID NO:115); ili NM 001204 (SEQ ID NO:113). U drugom ostvarenju , pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za sklerostinski polipeptid i koje oslabljuje formiranje sklerostinskog homodimera, naznačeno time da sklerostinski polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 14, 46 ili 65.
U određenim posebnim ostvarenjima pronalaska, antitelo je poliklonalno antitelo. U drugim ostvarenjima, antitelo je monoklonalno antitelo, koje je mišije, humano, pacovsko ili od hrčka antitelo. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje hibridoma ćeliju ili domaćinsku ćeliju koja je sposobna da proizvodi monoklonalno antitelo. U drugom ostvarenju pronalaska, antitelo je humanizovano antitelo ili himerno antitelo. Pronalazak dalje obezbeđuje domaćinsku ćeliju koja proizvodi humanizovano ili himerno antitelo. U određenim ostvarenjima fragment antitela za vezivanje antigena je F(ab')2, Fab', Fab, Fd ili Fv fragment. Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje je jednolančano antitelo i obezbeđuje domaćinsku ćeliju koja je sposobna da eksprimira jednolančano antitelo. U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži takvo antitelo i fiziološki prihvatljiv nosač.
U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje imunogen koji sadrži peptid koji se sastoji od najmanje 21 uzastopne amino kiseline i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM 001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NMJB0849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP 001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO: 110), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO: 111); NM_033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO.T14); CAA88759 (SEQ ID NO:115); ili NM 001204 (SEQ ID NO:113). Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje imunogenkoji sadrži peptid koji se sastoji od najmanje 21 uzastopne amino kiseline i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.
U određenim ostvarenjima, imunogeni koji su predmet pronalaska su povezani sa molekulom nosačem. U određenim ostvarenjima, mollekul nosač je polipeptidni nosač, i u određenim ostvarenjima, polipeptidni nosač je hemocijanin kapičastog puža.
Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži peptid koji obuhvata najmanje 21 uzastopnih amino kiselina i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, naznačeno time da (a) SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65; (b) antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP; (c) mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM_004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM 001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM_030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO:110), i (d) mesto za vezivanje receptora tipa II BMP je sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:lll); NM_033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO:114); CAA88759 (SEQ ID NO:115); ili NM 001204 (SEQ ID NO:113). i koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.
U drugom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom koji sadrži peptid koji obuhvata najmanje 21 uzastopnih amino kiselina i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time da antitelo otežava formiranje SOST homodimera.
Ovi kao i drugi aspekti ovog pronalaska postaće očigledni nakon detaljnog opisa i priloženih slika. Dodatno, dokumenti uključujući različite reference prikazane ovde u pronalasku koje detaljnije opisuju određene procedure ili kompozicije (na primer, plazmide, itd.) ugrađeni su ovde u potpunosti sa referencama.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 je šematska ilustracija poređenja amino kiselinske sekvence Humanog Dan; Humanog Gremline; Humanog Cerberus i Humanog Beer. Sterlice ukazuju na cisteinsku okosnicu (backbone).
Slika 2 sumarizuje rezultate dobijene od pregledanja različitih humanih tkiva za ekspresiju gena za TGF-beta vezujući protein, posebno Humani Beer gen. Upotrebljena je procedura za polu-kvantitativnu lančanu reakciju reverzne polimeraze (RT-PCR) za umnožavanje dela gena od prvog lanca cDNK sintetisanog od ukupne RNK (opisano detaljnije u PRIMERU 2A).
Slike 3A-3D sumiraju rezultate dobijene od RNKin situhibridizacije mišijih isečaka embriona, korišćenjem cRNK probe koja je komplementarna sa mišijim Beer transkriptom (detaljnije opisano u PRIMERU 2B). Sličica 3A je predstavlja transferzalni isečak od 10 dpc embriona. Sličica 3B je sagitalni isečak od 12.5 dpc embriona i sličice 3C i 3D su sagitalni preseci od 15.5 dpc embriona.
Slike 4A-4C ilustruju, putem 'Vestern blot" analize specifičnost tri različuita poliklonalna antitela za njihove odgovarajuće antigene (opisano detaljnije u PRIMERU 4) . Slika 4A prikazuje specifičnu reaktivnost anti-H. Beer antitela za H. Beer antigen, ali ne za H. Dan ili H. Gremlin. Slika 4B prikazuje reaktivnost anti-H. Gremline antitela na H. Gremline antigen ali ne na H. Beer ili H. Dan. Slika 4C prikazuje reaktivnost anti-H. Dan antitela za H. Dan, ali ne za H. Beer ili H. Gremlin.
Slika 5 ilustruje putem "Western blot" analize selektivnost TGF-beta vezujućeg proteina, Beeer, za BMP-5 i BMP-6 ali ne za BMP-4 (opisano detaljnije u PRIMERU 5) .
Slika 6 pokazuje da jonska interakcija između TGF-beta vezujućeg proteina, Beer, i BMP-5 ima konstantu disocijacije u opsegu 15-30 nM.
Slika 7 predstavlja upoređivanje (ravnanjem-alignment) regiona koji sadrže karakteristični cisteinski-čvor u SOST (sklerostin) polipeptidu sa njegovim najbližim homolozima. Tri disulfidne veze koje formiraju cisteinski-čvor su ilustrovane neisprekidanom linijom. Ekstra disulfidna veza, prikazana isprekidanom linijom, je jedinstvena za ovu familiju, i ona povezuje dva vrha P-šnale u 3D strukturi. Polipeptidi koji su prikazani su SOST: sklerostin (SEQ ID NO: 126); CGHB: Humani hronični gonadotropin P (SEQ ID NO: 127); FSHB: beta subjedinica hormona koji stimuliše folikul (SEQ ID NO: 128); TSHB prekursor beta lanca tirotropina (SEQ ID NO: 129); VWF: Von VVillebrand faktor (SEQ ID NO: 130); MUC2: prekursor humanog mucina 2 (SEQ ID NO: 131); CERI: Cerebrus 1(homolog Xenopus laevis)(SEQ ID NO: 132): DRM: "gremlin" (SEQ ID NO: 133); DAN: (SEQ ID NO: 134); CTGF: prekursor faktora rasta vezivnog tkiva (SEQ ID NO: 135); NOV: NovH (prekomerno eksprimirani gen za proteinski homolog nefroblastoma (SEQ ID NO: 136); CYR6: (SEQ ID NO: 137);
Slika 8 ilustruje 3D model regiona srži SOST (SOST srž).
Slika 9 predstavlja 3D model regiona srži SOST homodimera.
Slika 10A i 10B obezbeđuje poređenje amino kiselinskih sekvenci Noggin iz pet različitih životinja: čoveka (NOGGHUMAN, SEQ ID NO: 138); kokoške (NOGG_CHICK, SEQ ID NO: 139); Afričke "clawed" žabe (NOGG XENLA, SEQ ID NO:140); NOGGFUGRU, SEQ ID NO: 141); i Zebra ribice (NOGGZEBRA, SEQ ID NO: 142); i SOST čoveka (SOSTHUMAN, SEQ ID NO:46), pacova (SOSTRAT, SEQ ID NO:65); i miša (SOSTMouse, SEQ ID NO: 143).
Slika 11 ilustruje strukturu kompleksa Noggin/BMP-7. BMP homodimer je prikazan na donjem delu slike u površinskom modelu. Noggin homodimer je prikazan na vrhu BMP dimera u nacrtanom modusu. Kružići ističu N-terminalni vezujući region, region srži i vezujući deo (linker) između N-kraja i regiona srži.
Slika 12 pokazuje 3D model potencijalnog fragmenta za vezivanje BMP koji je lociran na N-terminalnom regionu SOST. BMP dimer je prikazan u površinskom modusu i potencijalni BMP-vezujući fragment je prikazan u modusu štapa. Fenilalaninski ostatak koji se uklapa u hidrofobni džep na BMP je takođe obeležen.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
Pre detaljnog prikazivanja pronalaska, može biti korisno da se shvate prikazane definicije određenih izraza iz pronalaska, kao i da se nabroje i definišu skraćenice koje će se ovde koristiti.
"Molekul" bi trebalo razumeti da uključuje proteine ili peptide (na primer, antitela rekombinantni vezujući partneri, peptidi sa željenoim afinitetom vezivanja), nukleinske kiseline (na primer, DNK, RNK, himerni molekuli nukleinskih kiselina, analozi nukleinskih kiselina kao PNA); i organska i neorganska jedinjenja.
"TGF-beta" bi trebalo razumeti da uključuje bilo kog poznatog ili novog člana TGF-beta super-fami lije, koji takođe uključuje morfogeni protein kosti (BMP).
"TGF-beta receptor" bi trebalo razumeti da se odnosi na receptore specifične za određenog člana ili podgrupu članova TGF-beta super-familije (uključujući morfogene proteine kosti (BMP)). Specifični primeri TGF-beta vezujućih proteina uključuje proteine kodirane sa SEQ ID NOS: 1,5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 i 101.
Inhibicija "vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina za TGF-beta familiju proteina i morfogene proteine kosti (BMP)" treba razumeti da se odnosi na molekule koji omogućavaju aktivaciju TGF-beta ili morfogenih proteina kosti (BMP), ili dozvoljava vezivanje članova TGF-beta familije uključujući morfogenih proteina kosti (BMP) za njihove odgovarajuće receptore, putem uklanjanja ili sprečavanja TGF-beta da se veže za TGF-beta vezujući protein. Ovakva inhibicija može se postići na primer sa molekulima koji inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za specifične članove TGF-beta super-familije.
"Vektor" se odnosi na skupinu koja je sposobna da usmeri ekspresiju željenog proteina. Vektor mora da uključi transkripcione promotorske elemente koji su operativno povezani sa genom(ima) od interesa. Vektor može biti sastavljen od deoksiribonukleinske kiseline ("DNK"), ribonukleinske kiseline ("RNK"), ili kombinacije ove dve (na primer DNK-RNK himerni). Opcionalno, vektor može da sadrži sekvencu za poliadenilaciju, jedno ili više restriktivnih mesta, kao i jedan ili više selektivnih markera kao neomicin fosfotransferaza ili higromicin fosfotransferaza. Dodatno, u zavisnosti od odabrane domaćinske ćelije i upotrebljenog vektora, drugi genetički elementi kao "origin" - početak replikacije, dodatna restrikciona mesta nukleinske kiseline, pojačivači (enhancers), sekvence koje obezbeđuju inducibilnost transkripocije, i selektivne markere, mogu takođe biti inkorporisani u ovde opisane vektore.
"Izolovani molekuli nukelinske kiseline" je molekul nukelinske kiseleine koji nije integrisan u genomsku DNK organizma. Na primer, DNK molekul koji kodira TGF-beta vezujući protein koji je odvojen od genomske DNK eukariotske ćelije predstavlja DNK molekul. Drugi prime izolovanog molekula nukleinske kiseline je hemijski-sintetisan molekul nukleinske kiseline koji nije integrisan u genom organizma. Izolovani molekul nukleinske kiseline mogu biti genomska DNK, cDNK, RNK, ili može biti sastavljen od analoga nukleinskih kiselina.
"Izolovani polipeptid" je polipeptid koji je suštinski oslobođen id kontaminirajućih ćelijskih komponenti kao što su ugljeni hidrati, lipidi, ili druge proteinske nečistoće koje su povezane sa polipeptidom u prirodi. Poželjno, ovako izolovani polipeptidi su najmanje oko 90% čisti, još poželjnije najmanje oko 95% čisti i najpoželjnije oko 99% čisti. U okviru određenih ostvarenja, određeni proteinski preparat sadrži izolovani polipeptid ako deluje nominalno kao jedna traka na SDS-PAGE gelu koji je obojen Coomasie Blue bojom. Izraz " izolovano" kada se odnosi na organske molekule (na primer male organske molekule) znači da su jedinjenja više od 90% čista upotrebom metoda koje su dobro poznate u nauci (na primer., NMR, tačka topljenja).
"Sklerosteozis" je izraz koji je primenio Hansen (Hansen, H. G.,Sklerosteoseu: Opitzet. al.,eds. Hanbuch der Kinderheilkunde, Berlin: Springer (pub) 6 1967. str. 351-355) za poremećaj sličan van Buchem-ovoj hiperosteozi "coricalis generalisata" ali se verovatno razlikuje po radiološkom izgledu promena kostiju i po prisustvu asimetrične kutanozne sindaktilije kažiprsta i srednjeg prsta u mnogim slučajevima. Vilica ima neobično kockast izgled pri ovakvom poremećaju (stanju).
" Humanizovano antitela" su rekombinantni proteini u kojima misiji i drugi ne-humani životinjski regioni za određivanje komplementarnosti monoklonalnih antitela su prebačeni sa varijabilnih lakih i teških lanaca imunoglobulina miša ili druge ne-humane životinje na na humani varijabilni region.
Kao što se ovde koristi, "fragment antitela" je deo antitela kao što je F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, i slični. Bez obzira na strukturu, fragment antitela se vezuje za isti antigen koji prepoznaje intaktno antitelo. Na primer, fragment anti-TGF-beta vezujućeg proteinskog monoklonalnog antitela se vezuje za epitop TGF-beta vezujućeg proteina.
Izraz fragment antitela ili antigen-vezujući fragment takođe uključuje bilo koji sintetički ili genetski konstruisan protein koji deluje kao antitelo putem vezuivanja za specifični antigen da bi se formirao kompleks. Na primer, fragmenti antitela uključuju izolovane fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona lakog lanca, "Fv" fragmenata koji se sastoje od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, rekombinantnih jednolančanih polipeptidnih molekula u kojima varijabilni regioni lakog i teškog lanca su povezani putem peptidnog "linkera" (vezujućeg peptida) ("sFv proteini"), i minimalnih jedinica za prepoznavanje koji se sastoje od amino kiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region.
"Detektabilno obeležje" je molekul ili atom koji može biti konjugovan sa polipeptidnom polovinom kao što je polovina antitela ili polovina nukleinske kisileine da bi se proizveo molekul koji je koristan za dijagnostifikovanje. Primeri detektabilnih obeležja uključuju helatore, fotoaktivne agense, radioizotope, fluorescentne agense, paramagnetične jone, enzime, i druge polovine markera.
Kao što se ovde koristi, "imunokonjugat" je molekul koji sadrži anti-TGF-beta vezujući protein antitelo, ili fragment antitela, i detektabilno obeležje ili efektorni molekul. Poželjno, imunokonjugat ima približno sličnu ili blago redukovanu sposobnost da se veže za TGF-beta vezujući protein nakon konjugacije u odnosu na pre konjugacije.
Skraćenice: TGF-beta -"Transformišući beta faktor rasta"; TGF-bBP"- "Transformišući beta faktor rasta vezujući protein" (jedan reprezentativni TGF-bBP je označen kao "H. Beer"); BMP- "morfogeni protein kosti"; PCR- "lančana reakcija polimeraze"; RT-PCR -PCR porces u kome se RNK prvo prevodi u DNK pomoću reverzne transkriptaze (RT); cDNK- bilo koja DNK napravljena kopiranjem RNK sekvence u formu DNK.
Kao što je gore navedeno, ovaj pronalazak obezbeđuje novu klasu TGF-beta vezujućih proteina, kao i metode i kompozicije za povećanje mineralnog sadržaja kosti u toplokrvnim životinjama. Ukratko, ovi pronalasci su bazirani na neočekivanom otkriću da mutacija u genu koji kodira novog člana familije TGF-beta vezujućih proteina što rezultira u nastanku retkog stanja (sklerosteozis) koje karakterišu mineralni sadržaji kosti koji se jedanput do četiri puta veći nego kod normalnih individua. Zato, kao što je diskutovano detaljnije u tekstu koji sledi ovo otkriće je dovelo do razvoja eseja koji se mogu koristiti za selektovanje molekula koji inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za TGF-beta familiju proteina i morfogene proteine kosti (BMP), i metode za upotrebu ovakvih molekula za povećanje mineralnog sadržaja kosti kod toplokrvnih životinja (uključujući na primer ljude).
DISKUSIJA BOLESTI POZANTE KAO SKLEROSTEOZIS
Skleorosteozis je bolest povezana sa nenormalnom gustinom kosti kod ljudi.
Sklerosteozis je izraz koji je primenio Hansen (Hansen, H. G.,Sklerosteoseu: Opitzet. al.,eds. Hanbuch der Kinderheilkunde, (Berlin: Springer 1967) 351-355) za poremećaj sličan van Buchem-ovoj hiperosteozi "coricalis generalisata" ali se verovatno razlikuje po radiološkom izgledu promena kostiju i po prisustvu, u mnogim slučajevima, asimetrične kutanozne sindaktilije kažiprsta i srednjeg prsta.
Za sklerosteozis se danas zna da je autozomalni polu-dominantni poremećaj koga karakteriše široko rasprostranjene sklerotske lezije kosti kod adulta. Ovo stanje je progresivno. Sklerosteozis takođe ima i razvojni aspekt koji je povezan sa sindaktilijom (dva ili više prsta srasla zajedno). Sklerosteozis Sindrom je povezan sa velikom saturom i mnoge obolele osobe dostižu visinu od šest fita ili više. Mineralni sadržaj homozigota može biti 1 do 6 puta veći nego kod normalnih individua i mineralna gustina kostiju može biti 1 do 4 puta iznad normalnih vrednosti (na primer, u poređenju sa blizancem koji nije zahvaćen bolešću).
Sklerosteozis Sindrom se javlja primarno kod Afrikanaca - Afrikaaners (Holanđana koji su potomci osoba iz Južne Afrike). Otprilike 1 /140 osoba u Afričkoj (Afrikaaners) populaciji je nosilac mutiranog gena (heterozigot). Mutacija pokazuje 100% penetrabilnost. Anegdotski izveštaji ukazuju na povećanu mineralnu gustrinu kostiju koja je primećena kod hetrerozigota ali oni nemaju nikakve druge povezane patologije (na primer, sindaktiliju ili prekomerno veliku lobanju).
Kod pacijenata sa sklerosteozom nije zabeležena nikakva nenormalnost na hipofizno-hipotalamusnoj osi. Posebno, izgleda da se kod obolelih osoba ne odigrava prekomerna proizvodnja hormona rasta i kortizona. Dodatno, nivoi seksualnih hormona su normalni kod ingdividua zahvaćenim ovim stanjem. Markeri preokreta kosti (turnover) (kao alkalna fosfataza specifična za osteoblaste, osteokalcin, prokolagen C' propeptid tipa 1 (PICP) i ukupna alkalna fosfataza( videtiComier,Curr. Opin. In Rheu.7:243 (1995) ukazuju na to da je hiperosteoblastična aktivnost povezana sa bolešću ali se zapaža normalna do slabo smanjena aktivnost osteoklasta kada se meri markerima resorbcije kosti (piridinolin, deoksipiirdinolin, N-telopeptid, urinarni hidroksiprolin, tartarat-rezistentna kisela fosfataza plazme i galaktozil hidroksilin plazme( videtiComier, već naveden)).
Sklerosteozis karakteriše kontinualna taloženje kosti u skeletu tokom čitavog života obolelih osoba. Kod homozigota kontinualna deponovanej minerala kosti dovodi do prekomernog rasta kosti u delovima skeleta gde ne postoje mehanoreceptori (na primer, lobanja, vilica, kranijum). Kod homozigota sa sklerosteozisom prekomerni rast kostiju lobanje dovodi do kranijalnoe kompresije i na kraju do smrti usled prekomernog hidrostatičkog pritiska na moždano stablo. Generalizovana i difuzna sklerosteozis se detektuje u svim drugim delovima skeleta. Kortikalne površine dugih kostiju su veoma zadebljane što dovodi do značajnog povećanja jačine kosti. Trabekularne veze su povećane u debljinu, što zauzvrat povećava jačinu trabekularne kosti. Sklerotične kosti izgledaju najčešće tamnim na X-zracima.
Kao što je detaljnije opisano u Primeru 1, lokalizovana je retka genetska mutacija koja je odgovorna za Sklerosteozis Sindrom i to u regionu humanog hromozoma 17, koja kodira novog člana TGF-beta familije vezujućih proteina (jedan reprezentativni primer je označen kao "H. Beer"). Kao što je detaljnije opisano u tekstu iznad, na osnovu otkrića, mehanizam mineralizacije kosti je još bolje shvaćen, što dozvoljava razvoj eseja za molekule koji povećavaju mineralizaciju kosti, i upotrebu ovakvih molekula za povećanje mineralnog sadržaja kosti, i tretman ili sprečavanje mnogih bolesti.
TGF BETA SUPER- FAMILIJA
Super-familija Transformišućih faktora rasta beta (TGF-beta) sadrži mnogobrojne fakore rasta koji dele slične elemente sekvenci i strukturne motive (i na sekundarnim i na tercijernim nivoima). Za ovu proteinsku familiju se zna da vrši širok dijapazon bioloških odgovora koji utiču na veliki broj različitih tipova ćelija. Mnogi članovi TGF-beta familije imaju važne funkcije u formiranju obrasca i tkivne specifikacije tokom embrionalnog razvića; kod adulta članovi TGF-beta familija učestvuju na primer u procesu zarastanja rane, popravci kostiju i remodelovanju kostiju i u modulaciji imunog sistema. Pored TGF-beta, super-familija uključuje morfogene proteine kosti (BMP-ove), Aktivine, Inhibine, Faktore Rasta i Diferencijacije (GDF-ove) i Neutrofične Faktore Izvedene iz Glije (GDNF). Primarna klasifikacija je zasnovana na opštim osobinama sekvenci koje pohranjuju specifični protein u opštu pod-familiju. Dodatna stratifikacija u okviru pod-familije moguća je na osnovu striktnije konzerviranosti sekvence kod članova manjih grupa. U određenim slučajevima, kao što su BMP-5, BMP-6 i BMP-7, procenat identičnosti amino kiselina može biti visok čak i do 75% među članovima manje grupe. Ovaj nivo identičnosti omogućava da jedna reprezentativna sekvenca ilustruje ključne biohemijske elemente pod-grupe koja ih odvaja od drugih članova veće familije.
Kristalna struktura TGF-beta2 je određena. Opšta savijenost TGF-beta 2 monomera sadrži stabilne, kompaktne, cisteinu slične, čvoru slične strukture formirane sa tri disulfidna mosta. Dimerizacija koja je stabilizovana jednim disulfidnim mostom je antiparalelna.
TGF-beta signalizuje putem indukcije stvaranja hetero-oligomernih kompleksa receptora tipa I tipa II. Transdukcija TGF-beta signala uključuje ova dva različita tipa I i tipa II pod-familije transmembranskih serin/treonin kinaznih receptora. Najmanje sedam receptora tipa I i pet receptora tipa II je identifikovano (videti Kawabata et al,Cytokine Growth Factor Rev.9:49-61 (1998); Mivazono et al.,Adv. Immunol.75:115-57 (2000). Članovi TGF-beta familije iniciraju svoju ćelijsku aktivnost putem vezivanja za receptore sa unutrašnjom serin/treonin kinaznom aktivnošću. Svaki član TGF-beta familije proteina vezuje se za karakterističnu kombinaciju receptora tipa I i tipa II i oba su neophodna za signalizaciju. U sadašnjem modelu aktivacije TGF-beta receptora, TGF-beta ligand se prvo vezuje za receptor tipa II (TbR-II), koji se nalazi u ćelijskoj membrani u oligomernoj formi sa aktiviranom kinazom. Nakon toga receptor tipa I (TbR-I), koji ne može vezati ligand u odsustvu TbR-II, se regrutuje u kompleks da bi se formirao ligand/tip I/tipII tercijarni kompleks. TbR-II zatim fosforiliše TbR-I predominantno u domenu koji je bogat glicinskim i serinskim ostacima (GS domen) u bliskom membranskom regionu, i tako aktivira TbR-I. Aktiviran kinazni receptor tipa I zatim fosforiliše određene članove Smad familije proteina koji se premeštaju u jedro gde modulišu transkripciju specifičnih gena.
MORFOGENI PROTEINI KOSTI ( BONE MORPHOGENIC PROTEINS, BMP) SU
KLJUČNI REGULATORNI PROTEINI MINERALNE GUSTINE KOSTI KOD
LJUDI
Glavni napredak u razumevanju procesa formiranja kosti bila je identifikacija morfogenih proteina kosti (BMP-ova), takođe poznatih kao osteogeni proteini (OP) koji regulišuin vivodiferencijaciju hrskavice i kostiju. BMP/OP indukuju diferencijaciju endohodralne kosti preko kaskade događaja koja uključuje formiranje hrskavice, hipertrofiju, i kalcifikaciju hrskavice, vaskularnu invaziju, diferencijaciju osteoblasta, i formiranje kosti. Kao što je ovde opisano, BMP-ovi/OP-ovi (BMP-2-14, i osteogeni protein 1 i -2, OP-1 i OP-2),( videti,na primer, GenBank P12643 (BMP-2); GenBank P12645 (BMP3); GenBank P55107 (BMP-3b, Faktor rasta i diferencijacije 10 (GDF-10); GenBank P12644 (BMP4); GenBank P22003 (BMP5); GenBank P22004 (BMP6); GenBank P18075 (BMP7); GenBank P34820 (BMP8); GenBank Q9UK05 (BMP9); GenBank 095393 (BM10); GenBank 095390 (BM11, prekursor faktora 11 rasta/diferencijacije (GDF-11)); GenBank 095972 (BM15)) su članovi TGF-beta super-familije. Zapanjujuća evolutivna konzerviranost među članovima BMP/OP pod-familije navodi na to da su oni kritični za normalni razvoj i funkcionisanje životinja. Takođe, prisustvo višestrukih formi BMP/OP postavlja važno pitanje o biološkoj relevantnosti ovog očiglednog prepterećenja. Pored postfetalne hondrogeneze i osteogeneze, BMP/OP imaju višestruke uloge u skeletogenezi (uključujući razvoj kraniofacijalnog i dentalnog tkiva), i embrionalnom razviću i organogenezi parenhimatoznih organa, uključujući bubreg. Sada je razumljivo da se priroda oslanja na opšte (i to ne mnogobrojne) molekularne mehanizme koji su skrojeni da obezbede nastanak specijalizovanih tkiva i organa. BMP/OP super-familja je elegantan primer prirodne ekonomičnosti u programiranju specijalizovanih funkcija koje koriste molekularne izoforme sa manjim varijacijama u amino kiselinskim motivima sa visoko konzerviranim karboksi-terminalnim regionima.
BMP-ovi se sintetišu kao veliki prekursorni proteini. Nakon dimerizacije, BMP se proteolitički seku u ćeliji i dobijaju se karboksi-terminalni zreli proteini koji se zatim sekretuju iz ćelije. BMP kao i drugi čalnovi TGF-beta familije, iniciraju signalnu transdukciju vezivanjem kooperativno i za tip I i tip II serin/treonin kinazne receptore. Receptori tipa I za koje BMP mogu da deluju kao ligandi uključuju BMPR-IA (takođe poznat kao ALK-3), BMPR-IB (takođe poznat kao ALK-6), ALK-1 i ALK-2 (takođe poznat kao ActR-I). Od receptora tipa II, BMP-ovi se vezuju za receptor tipa II BMP-a (BMPR-II), aktivin tipa II (ActR-II) i aktivin tipa IIB (ActR-IIB).( VidetiBalemans et. al., već navedeni, i reference citirane ovde). Polunukleotidne sekvence i kodirane amino kiselinske sekvence polipeptida receptora tipa I BMP obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank, na primer, GeneBank NM 004329 (SEQ ID NO: 102 kodiran sa SEQ ID NO: 116); D89675 (SEQ ID NO: 103 kodiran sa SEQ ID NO: 117); NM 001203 (SEQ ID NO: 104 kodiran sa SEQ ID NO:l 18); S75359 (SEQ ID NO: 105 kodiran sa SEQ ID NO:119); NMJ)30849 (SEQ ID NO:106 kodiran sa SEQ ID NO:120); D38082 (SEQ ID NO: 107 kodiran sa SEQ ID NO: 121). Druge polipeptidne sekvence receptora tipa I obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank i uključuju na primer, NP 001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO: 110). Polinukleotidne sekvence i kodirane amino kiselinske sekvence polipeptida receptora tipa II obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank i uključuju na primer, U25110 (SEQ ID NO:lll kodiran sa SEQ ID NO:122); NM 033346 (SEQ ID NO:112 kodiran sa SEQ ID NO:123); NM 001204 (SEQ ID NO:113 kodiran sa SEQ ID NO:124); Z48923 (SEQ ID NO: 114 kodiran sa SEQ ID NO: 125). Dodatne polipeptidne sekvence receptora tipa II obezbeđene su u bazi podataka Gene Bank, na primer CAA88759 (SEQ ID NO:115).
BMP-ovi, slično kao i drugi cistein-čvor proteini formiraju homodimernu strukturu (Scheufler et. al.,J. Mol. Biol.287:103-15 (1999)). Na osnovu analize evolutivnog traganja (evolutionarv trače) koja je sprovedena na BMP/TGF-p familiji, vezujuće mesto receptor tipa I BMP i vezujuće mesto receptor tipa II su mapirani na površini BMP strukture (Innis et al.,Protein Eng.13:839-47 (2000)). Lokacija vezujućeg mesta receptora tipa I BMP-a je kasnije potvrđena pomoću X-zraka sa BMP-2/BMP receptor IA kompleksom (Nickel et. al.,J. Joint Surg. Am.83A(Suppl l(Pt 1)):S7-S14 (2001)). Predloženo vezujuće mesto receptora tipa II je u skladu sa strukturom dobijenom X-zracima TGF-(33/TGF-P receptora tipa II kompleksa (Hart et al.,Nat. Struct. Biol.9:203-208 (2002)), koji je veoma sličan sa BMP/BMP receptorskim sistemom tipa IIA.
ANTAGONIZAM BMP
BMP i Aktivinske pod-familije su podložne značajnoj post-translacionoj regulaciji, kao što je od strane TGF-beta vezujućeg proteina. Postoji složen ekstracelularni kontrolni sistem, gde se sintetiše antagonist sa visokim afinitetom i zatim se eksportuje, nakon čega selektivno formira kompleks sa BMP-ovima ili Aktivinima da bi poremetio njihovu biološku ulogu (Smith,Trends Genet.15:3-6 (1999)). Identifikovan je veliki broj ovakvih prirodnih antagonista, i na osnovu divergencije sekvenci izgleda da su antagonisti nezavisno evoluirali jer im nedostaje konzerviranost primarne sekvence. Ranije studije ovih antagonista ukazale su na izrazitu sklonost za interakcijiu i neutralizaciju BMP-2 i BMP-4. Kod kičmenjaka, antagonisti uključuju "noggin," hordin, sličan hordinu, folistatin, FSRP, DAN/Cerberus proteinsku familiju i sklerostin (SOST)( videtiBalemans et. al., već naveden i reference citirane ovde). Mehanizam antagonizma izgleda da se razlikuje za različite antagoniste (Lemura et al., (1998)Proc. Natl. Acad. Sci USA95:9337-9342).
Vezujuća mesta receptora tipa I i II na BMP antagonistu "noggin" takođe su mapirana. Noggin se vezuje za BMP-ovima sa visokim afinitetom (Zimmerman et al., 1996). Studija noggin/BMP-7 kompleksne strukture otkrila je povezujuće interakcije između dva proteina (Groppe et al.,Nature420:636-42 (2002)). Superpozicija noggin-BMP-7 strukture na model BMP signalnog kompleksa pokazala je da noggin vezivanje efektivno maskira oba para vezujućih epitopa (to jest vezujuća mesta receptora tipa I i tipa II na BMP) na BMP-7. "Scaffold" (potka) sekvencama bogatim cisteinom u noggin prethodi N-terminalni segment od oko 20 amino kiselinskih ostataka koji su označeni kao spojnica (clip) (ostaci 28-48). Receptor-vezujuće mesto tipa I je zatvoren N-terminalnim delom domena spojnice Noggin-a, i mesto vezivanja receptora tipa II je zatvoren karboksilnim teminalnim delom domena spojnice. Dva P-lanca u regionu srži blizu C-terminusa noggin-a takođe kontaktiraju BMP-7 kod vezujućeg mesta receptora tipa II. Ovaj način vezivanja omogućava Noggin dimeru da efikasno blokira sva vezujuća mesta na receptorima (dva vezujuća mesta na tipu I i dva vezujuća mesta na tipu II receptora) na BMP dimeru.
NOVI TGF- BETA VEZUJUĆI PROTEINI
Kao što je gore pomenuto, ovaj pronalazak obezbeđuje novu klasu TGF-beta vezujućih proteina koji poseduju skoro identičan cisteinski (disulfidni) "scaffold" (potka) kada se uporede sa humanom DAN, humanom germinativnom linijom i humanim Cerberus-om, i SCGF (U.S. Patent 5,780,263) ali nema skoro niskakvu homologiju na nukleotidnom nivou (za istorijatvideti generalnoNsuet. al, Mol. Cell 1:673-683(1998)).
Reprezentativni primer nove klase molekula nukleinskih kiselina koje kodiraju TGF-beta vezujuće proteine opisane su u SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 i 101. Polinukleotidi koji su ovde otkriveni kodiraju polipeptid koji se zove Beer, koji se takođe ovde naziva sklerostin ili SOST. Trebalo bi shvatiti da reprezentativni članovi ovih klasa vezujućih proteina uključuju varijante TGF-beta vezujućih proteina (na primer., SEQ ID NO:5 i 7). Kao što se ovde koristi, "varijanta gena za TGF-beta vezujući protein" (na primer, izolovan molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu TGF-beta vezujućeg proteina) odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju polippetid koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je modifikacija SEQ ID NO:2, 10, 12, 14, 16, 46, ili 65. Ovakve varijante uključuju prirodne polimorfizme ili alelske varijante gena za TGF-beta vezujući protein kao i sintetičke gene koji sadrže konzervativne amino kiselinske zamene ovih amino kiselinskih sekvenci. Naučnicima su poznati različiti kriterijumi koji ukazuju na to da li su amino kiseline na određenoj poziciji u peptidu ili polipeptidu slične. Na primer, slična amino kiselina ili konzervativna amino kiselinska zamena je ona kod koje je amino kiselinski ostatak zamenjen sa amino kiselinskim ostatkom koji ima slični bočni lanac, koji uključuje amino kiseline sa baznim bočnim lancem (na primer lizin, arginin, histidin); kiseli bočni lanci (na primer asparaginska kiselina, glutamiska kiselina); nenaelektrisane polarne bočne lance (na primer, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirpsin, cistein, histidin); nepolarne bočne lance (na primer alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan); beta-razgranate bočne lance (na primer treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (na primer tirozin, fenilalanin, triptofan). Prolin koji se smatra najtežim za klasifikaciju, deli osobine amino kiselina koje imaju alfatične bočne lance (na primer Leu, Val, Ile, i Ala). U određenim okolnostima, zamena glutamina sa glutaminskom kiselinom ili asparagina sa asparaginskom kiselinom, mogu se smatrati sličnim zamenama, zato što su glutamin i asparagin amidni derivati glutaminske kiseline i asparaginske kiseline.
Dodatne varijante formi gena koji kodira TGF-beta vezujući protein su nukleinsko kiselinski molekuli koji sadrže zamene, insercije ili delecije nukleotidnih sekvenci koje su ovde opisane. Varijante gena za TGF-beta vezujući protein mogu se identifikovati određivanjem da li geni hibridizuju sa molekulom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 100 i 101 u visoko restriktivnim uslovima. Dodatno, varijante gena za TGF-beta vezujući protein trebalo bi da kodiraju protein koji ima cisteinsku okosnicu (backbone).
Kao alternativa, varijante gena za TGF-beta vezujući protein mogu biti identifikovane putem poređenja sekvenci. Kao što se ovde koristi, dve amino kiselinske sekvence imaju "100% identične amino kiselinske sekvence" ako su amino kiselinski ostaci dve amino kiselinske sekvence isti kada se poredaju i međusobno uporede sa maksimalnom međusobnom korespondencijom. Slično, dve nukleotidne sekvence imaju "100% identičnost u nukleotidnoj sekvenci" ako su nukleotidi dve nukleotidne sekvence iste kada se poredaju i međusobno uporede sa maksimalnim međusobnim podudaranjem. Poređenje sekvenci može da se izvede primenom programskih paketa kao što su oni obezbeđeni u LASERGENE bioinformatičkom kompjuterskom okruženju, koji proizvodi DNASTAR (Madison, Wisconsin). Druge metode za poređenje dve ili više nukleotidnih ili amino kiselinskih sekvenci putem određivanja optimalnog poređenja (alignment) su dobro poznate naučnicima iz ove oblasti( videti,na primer, Peruški and Peruški,The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc. 1997), Wu et al., (eds), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," uMethods in Gene Biotechnology,strane 123-151 (CRC Press, Inc. 1977) i Bishop (ed.),Guide to Human Genome Computing,2nd Edition (Academic Press, Inc. 1988)).
Varijanta TGF-beta vezujućeg proteina trebala bi da ima najmanje 50% amino kiselinsku identičnost sa SEQ ID NO:2, 6, 10, 12, 14, 16, 46, ili 65 i poželjno veću od 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identičnosti. Alternativno, varijante TGF-beta vezujućeg proteina mogu biti identifikovane tako što imaju najmanje 70% nukleotidne identičnosti sa SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101. Osim toga, ovaj pronalazak razmatra polinukleotidne varijante gena za TGF-beta vezujući protein koje poseduju više od 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sa SEQ ID NO: 100. Bez obzira na određenu metodu koja se koristi u identifikaciji varijante gena za TGF-beta vezujući protein ili varijante TGF-beta vezujućeg proteina, varijanta TGF-beta vezujućeg proteina ili polipeptida koja je kodirana od strane varijante gena za TGF-beta vezujući protein može funkcionalno biti okarakterisana sa, na primer svojom sposobnošću da se vežu za i/ili inhibiraju signalizaciju odabranog člana TGF-beta familije proteina ili na osnovu svoje sposobnosti da se specifično vežu za anti-TGF-beta vezujući-protein antitelo.
Ovaj pronalazak uključuje funkcionalne fragmente gena za TGF-beta vezujući protein. U okviru konteksa ovog pronalaska "funkcionalni fragment" gena za TGF-beta vezujući protein odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja kodira deo TGF-beta vezujućeg polipeptida koji ili (1) poseduje gore opisanu funkcionalnu aktivnost ili (2) specifično se vezuje za anti-TGF-beta vezujući-protein antitelo. Na primer, funkcionalni fragment gena za TGF-beta vezujući protein koji je ovde opisan sadrži deo nukleotidne sekvence SEQ ID NOs: 1,5, 9, 11, 13, 15, 100, ili 101.
2. Izolacija gena za TGF-beta vezujući protein
DNK molekuli koji kodiraju TGF-beta vezujući protein mogu se dobiti pregledanjem humanih cDNK ili genomskih biblioteka pomoću polinukleotidnih porba baziranih n na primer, SEQ ID NO:l. Na primer, prvi korak u pripremi cDNK biblioteke je izolovanje RNK pomoću metode za "lomljenje" ćelija, načinima za inhibiranje degradacije RNK od starne RN-aze, i metode za odvajanje RNK od DNK, proteina, i polisaharidnih zagađenja. Na primer, ukupna RNK može biti izolovana zaleđivanjem tkiva u tečnom azotu, usitnjavanjem tkiva koje je smrznuto sa avanom i tučkom da bi se ćelije lizirale, ekstrakcijom istnjenog tkiva sa rastvorom fenol/hloroform da bi se uklonili proteini i odvojila RNK od ostatka nečistoća putem selektivne precipitacije sa litijum hloridom videti na primer, Ausubel et al., (eds)Short Protocols in Molecular Biology,strane 4-1 do 4-6 (John Wiley & Sons, Inc., NY, 1985)("Ausubel (1995)");
Wu et al.,Methods in Gene Biotechnologystrane 33-41 (CRC Press, Inc. 1977) ("Wu
(1977)"). Alternativno, ukupna RNK može biti izolovana ekstrakcijom iseckanog tkiva sa guanidin izotiocijanatom, ekstrahovana sa organskim rastvaračima, i odvojena RNK od kontaminanata pomoću diferencijalnog centrifugiranja (videti na primer Ausubel
(1995) na stranama 4-1 do 4-6; Wu (1977) strane 33-41.
U cilju konstruisanja cDNK biblioteke, poli(A)<+>RNK se poželjno izoluje iz ukupne pripremljene RNK. Poli(A)<+>RNK može biti izolovana iz ukupne RNK upotrebom standardne tehnike oligo(dT)-celulozne hromatografije (videti na primer Ausubel
(1995) na stranama 4-11 do 4-12). Dvolančani molekuli cDNK mogu biti sintetisani od poli(A)<+>RNK pomoću tehnika koje su dobro poznate onima koji se bave naukom (videti na primer Wu (1997) na stranama 41-46). Takođe, komercijalno paketi (kits) mogu se koristiti za sintetisanje dvolančane cDNK molekula (na primer Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Marvland); CLONETECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, California; Promega Corporation (Madison, Wisconsin); i Stratagene Clonong Svstems (La Jolla, California).
Osnovni pristup za dobijanje cDNK klonova TGF-beta vezujućeg proteina može biti modifikovan putem konstruisanja "subtracted" biblioteke (oduzete, nekompletne) koja je obogaćena sa cDNK molekulima TGF-beta vezujućeg proteina. Tehnike za konstruisanje "subtracted" biblioteka dobro su poznate onima kojise bave ovim polejm nauke (videti na primer, Sargent, "Isolation of Differentialv Expressed Genes" u Meth. Enzvmol. 152:423, 1987; i Wu et al., (eds) "Construction and Screening of subtracted and Complete Expression cDNK Libraries" u Methods in Gene Biotechnologv, strane 29-65 (CRC Press, Inc. 1997)).
Različiti vektori za kloniranje su prigodni za konstruisanje cDNK biblioteke. Na primer, cDNK biblioteka može biti pripremljena u vektoru dobijenom iz bakteriofaga, kao što jeXgtlO vektor (videti na primer Huynh et al., "Constructing and Screening cDNK Libraries inXgtll", u DNA Cloning: A Practical Approach Vol I, Glover (ed.) starna 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) na stranama 47-52). Alternativno, dvolančani cDNK molekuli mogu biti ubačeni u plazmidni vektor kao što je pBluescript vektor (Stratagene Cloning Svstems; La Jolla California), Lambda GEM-4 (Pormega Corp,; Madison Wisconsin) ili druge komercijalno dostupne vektore. Pogodni vektori za kloniranje mogu se takođe dobiti od American Type Culture Collection (Rockville, Marvland), Američka kolekcija tipova kultura.
U cilju umnožavanja kloniranih cDNK molekula, cDNK biblioteka je ubačena u prokariotksog domaćina pomoću standardnih tehnika. Na primer, cDNK biblioteka može biti ubačena u kompetentneE. coliDH5 ćelije, koje se mogu nabaviti od Life Techologies, Inc. (Gaithersburg, Marvland).
Humana genomska DNK biblioteka može se pripremiti načinima koji su dobro poznati u nauci (videti na primer Ausubel (1995) na stranama 5-1 do 5-6; Wu (1997) na stranama 307-327). Genomskq DNK može biti izolovana liziranjem tkiva sa deterdžentom Sarkoziolom (Sarcosvl), sečenjem lizata sa proteinazom K, čišćenjem nerastvorljivih delova od lizata putem centri fugiranj a, precipitacijom nukleinske kiseline iz lizata pomoću izopropanola, i prečišćavanjem resuspendovane DNK na gradijentu gustine cezijum hlorida.
DNK fragmenti koji su pogodni za proizvodnju genomske biblioteke mogu se dobiti putem nasumičnog sečenja genomske DNK ili putem parcijalne digestije (delimično sečenje) genomske DNK sa restrikcionim endonukleazama. Genomski DNK fragmenti mogu biti ubačeni u vektor, kao što je bakteriofag ili kozmidni vektor, u skladu sa konvencionalnim tehnikama, kao što su upotreba sečenja restrikcionim enzimima da bi se obezbedili odgovarajući krajevi, upotreba tretmana sa alkalnom fosfatazom da bi se izbegla neželjena spajanja DNK molekula, i ligacija sa odgovarajućim ligazama. Tehnike za ovako manipulisanje dobro su poznate u nauci (videti na primer Ausubel
(1995) na stranama 5-1 do 5-6; Wu (1997) na stranama 307-327).
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju TGF-beta vezujući protein molgu se dobiti pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) sa oligonukleotidnim prajmerima koji imaju nukleotidne sekvence koje se baziraju na nukleotidnim sekvencama gena za humani TGF-beta vezujući protin, kao što je ovde opisano. Opšte metode za pregledavanje biblioteka sa PCR obezbeđene su od strane na primer Yu et al., "Use of the Polimerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," uMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Potocols: Current Methods and Applications,White (ed.) strane 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Dodatno, tehnike za upotrebu PCR-a za izolaciju srodnih gena opisane su od strane, na primer, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polvmerase Chain Reaction to Clone Gene Famolv Members," uMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications,White (ed.), strane 317-337 (Humana Press, Inc. 1993).
Alternativno, humane genomske biblioteke mogu se dobiti od komercijalnih izvora kao što su Researc Genetics (Huntsville, AL), i American Type Culture Collection (Rockville, Marvland). Biblioteka koja sadrži cDNK ili genomske klonove može se pregledati sa jednom ili više polinukleotidnih proba baziranih na SEQ ID NO:l, pomoću standardnih metoda kao što je ovde opisano i poznato u nauci (videti na primer, Ausubel (1995) na stranama 6-1 do 6-11).
Anti-TGF-beta vezujući protein antitela, proizvedena kao što je ovde opisano, mogu takođe biti iskorišćena za izolovanje DNK sekvenci koje kodiraju TGF-beta vezujući-protein iz cDNK biblioteka. Na primer, antitela mogu biti iskorišćena za pregledanje A.gt 11 ekspresionih biblioteka, ili antitela mogu biti iskorišćena za imuno-pregledanje nakon odabiranja hibrida i prevođenja (videti na primer, Ausubel (1995) na stranama 6-12 do 6-16; Margolis et al., "Screening X expression libraries with antibodv and protein probes" u DNA Cloning 2: Expression Svstems, 2nd Edition, Glover et al., (eds) strane 1-14 (Oxford Universitv Press 1995)).
Sekvenca cDNK TGF-beta vezujućeg proteina ili genomskog fragmenta TGF-beta vezujućeg proteina može se odrediti upotrebom standardnih metoda. Dalje, identifikacija genomskih fragmenata koji sadrže promotor ili regulatorni element TGF-beta vezujućeg proteina može se postići upotrebom dobro ustanovljenih tehnika, kao što je deleciona analiza( videti, generalno,Ausubel (1995)).
Kao alternativa, gen koji kodira TGF-beta vezujući protein može se dobiti sintetisanjem DNK molekula pomoću međusobno "priming" (mogu se međusobno spojiti) dugih oliginukleotida i nukleotidnih sekvenci koje su ovde opisane( videti,na primer, Ausubel
(1995) na stranama 8-8 do 8-9). Uspostavljene tehnike u kojima se koristi lančana erakcija polimeraze obezbeđuju mogućnost sinteze DNK molekula najmanje 2 kilobaze dugačkog molekula DNK (Adang et al.,Plant molec. Biol.21:1131, 1993; Bambot et al.,PCR Methods and Applications2:266, 1993; Dillon et al., "Use of Polvmerase Chain Reaction for Rapid Construction of Svnthetic Genes," uMethods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications,White (ed.), strane 263-268 (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al.,PCR Methods Appl.4:299, 1995).
3. Proizvodnja gena za TGF-beta vezujući-protein
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju gene za TGF-beta vezujući protein mogu se dobiti pregledavanjem različitih cDNK ili genomskih biblioteka sa polinukleotidnim probama koje imaju nukleotidne sekvence bazirane na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101 korišćenjem procedura koje su ovde opisane. Varijante gena za TGF-beta vezujući protein takođe se mogu sintetički konstruisati. Na primer, molekul nukleinske kiseline može se dizajnirati tako da kodira polipeptid koji ima konzervativnu amino kiselinsku promenu, kada se uporedi sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46, ili 65. To znači da se mogu dobiti varijante koje imaju jednu ili više amino kiselinskih zamena SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46, ili 65, u kojima je alkil amino kiselina zamenjena sa alkil amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, aromatična amino kiselina zamenjena sa aromatičnom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, amino kiselina koja sadrži sumpor zamenjena sa amino kiselinom koja sadrži sumpor u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, amino kiselina koja sadrži hidroksi grupu zamenjena sa amino kiselinom koja sadrži hidroksi grupu u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, kisela amino kiselina zamenjena sa kiselom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, bazna amino kiselina zamenjena sa baznom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina, ili dibazna monokarbokslina amino kiselina zamenjena sa dibaznom monokarbokslinom amino kiselinom u amino kiselinskoj sekvenci TGF-beta vezujućeg proteina. Među čestim amino kiselinama, na primer, "konzervativna amino kiselinska zamena" se ilustruje zamenom između amino kiselina u okviru svake od sledećih grupa: (1) glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin (2) fenilalanin, tirozin i triptofan (3) serin i treonin (4) aspartat i glutamat (5) glutamin i asparagin i (6) lizin, arginin i histidin. U pravljenu ovakvih zamena, važno je, naravno tamo gde je moguće, zadržati cisteinsku okosnicu podvučenu na slici 1.
Konzervativne amino kiselinske zamene u genu za TGF-beta vezujući protein mogu se uneti zamenom nukleotida sa nukleotidima pomenutim u bilo kom SEQ ID NO: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101. Ovakve varijante "konzervativnih amino kiselina" mogu se dobiti, na primer, mutagenezom usmerenom sa oliginukleotidom, mutagenezom skeniranja povezujuće sekvence, mutagenezom pomoću lančane reakcije polimeraze i sličnih( videtiAusubel (1995) na stranama 8-10 do 8-22; i McPherson (ed),Directed Mutagenesis: A Practical Approach(IRL Press 1991)). Funkcionalna sposobnost ovakvih varijanti može se odrediti upotrebom standardnih metoda i eseja koji su ovde opisani. Alternativno, varijanta polipeptida TGF-beta vezujućeg proteina može biti identifikovana na osnovu sposobnosti da se specifično veže za anti-TGF-beta vezujući protein antitela.
Rutinske delecione analize molekula nukleinskih kiselina mogu se izvesti da bi se dobili "funkcionalni fragmenti" molekula nukleinske kiseline koja kodira polipeptid TGF-beta vezujućeg proteina. U cilju ilustracije navodimo da DNK molekuli koji imaju nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:l mogu biti isečene saBal3\nukleazom da bi se dobila serija "nested" - ugnjezđenih delecija. Fragmenti se zatim ubacuju u ekspresione vektore u odgovarajućem smeru okvira čitanja i eksprimirani polipeptidi se izoluju i testira im se njihova aktivnost ili se testira njihova sposobnost da se vežu za anti- TGF-beta vezujući protein antitela. Jedna alternativa sečenju sa egzonukleazom je upotreba mutageneze sa usmerenim oligonukleotidom da bi se ubacile delecije ili stop kodoni, da bi se specifirala proizvodnja željenog fragmenta. Alternativno, određeni fragmenti gena za TGF-beta vezujući protein, mogu biti sintetisani pomoću lančane reakcije polimeraze.
Standardne tehnike za funkcionalnu analizu proteina opisane su u, na primer, Treuter et al.,Molec. Gen. Genet.240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminarv deletion analvsis of the 42kDa 2-5A svnfhetase induced by human interferon," u
Biological Interferon System, Proceedings of ISIR- TNO Meeting on Interferon Systems,
Cantell (ed.), strane 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," uControl of Animal Cell Proliferation, Vol. 1,Bovnton et al., (eds.) strane 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al.,J. Biol. Chem.270:29270, 1995; Fukunaga et al,J. Biol. Chem.270:25291, 1995; Yamaguchi et al.,Biochem. Pharmacol.50:1295, 1995; i Meisel et al.,Plant Molec. Biol.30:1, 1996.
Ovaj pronalazak takođe razmatra funkcionalne fragmente gena za TGF-beta vezujući protein koji imaju konzervativne amino kiselinske zamene.
Varijante gena za TGF-beta vezujući protein mogu biti identifikovane na osnovu strukture putem određivanja nivoa identičnosti sa nukleotidnim i amino kiselinskim sekvencama SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101 i 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46, ili 65, kao što je gore razmotreno. Alternativni pristup identifikaciji varijante gena na osnovu strukture je da se odredi da li molekul nukleinske kiseline koji kodira potencijalnu varijantu gena za TGF-beta vezujući protein može da hibridizuje u restriktivnim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 11, 13, 15, 100 ili 101, ili njegovim delom koji je dugačak najmanje 15 ili 20 nukleotida. Kao ilustracija restriktivnih uslova hibridizacijem molekul nukelinske kiseline koji ima varijantu sekvence TGF-beta vezujućeg proteina može se vezati za fragment molekula nukleinske kiseline koji ima sekvencu od SEQ ID NO:l u puferu koji sadrži na primer, 5XSSPE( 1XSSPE= 180 mM natrijum hlorid, 10 mM natrijum fosfat, 1 mM EDTA (pH 7.7), 5x Dehardov rastvor (100XDehardov rastvor = 2% (w/v) serum albumin govečeta, 2% (w/v) fikol (Ficoll), 2% (w/v) polivinilpirolidin) i 0,5% SDS inkubiran preko noći na 55-60°C. Ispiranja nakon hiobridizacije u visoko restriktivnim uslovima tipično se izvode u 0.5 x SSC (1XSSC= 10 mM natrijum hlorid, 15 mM trinatrijum citrat) ili u 0.5XSSPE na na 55-60°C.
Bez obzira na određenu nukleotidnu skevencu varijante gena za TGF-beta vezujući protein, gen kodira polipetid koji može biti okarakterisan na osnovu svoje funkcionalne aktivnosti, ili putem sposobnosti da se specifično veže za anti-TGF-beta vezujući protein antitelo. Još specifičnije, varijante gena za TGF-beta vezujući protein kodiraju polipeptide koji pokazuju najmanje 50% i poželjno više od 60, 70, 80 ili 90% aktivnosti polipeptida koji je kodiran od strane humanog gena za TGF-beta vezujući protein koji je ovde opisan.
4. Proizvodnja TGF-beta vezujućeg-proteina u ćelijama u kulturi
Da bi se gen za TGF-beta vezujući protein eksprimirao, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid mora biti operativno povezan sa regulatornim sekvencama koje kontrolišu transkripcionu ekspresiju u ekspresionom vektoru i zatim se moraju ubaciti u domaćinsku ćeliju. Pored sekvenci za regulaciju transkripcije, kao što su promotori i pojačivači, ekspresino vektori mogu uključiti translacione regulatorne sekvence i marker gen koji je pogodan za selekciju ćelija koje nose ekspresioni vektor. Ekspresioni vektori koji su sposobni da proizvedu starni protein u eukariotskim ćelijama tipično sadrže (1) prokariotske DNK elemente koji kodiraju bakterijski početak-"origin" replikacij i marker za antibiotsku rezistenciju da bi se obezbedio rast i selekcija ekspresionog vektora u bakterijskom domaćinu; (2) eukariotske DNK elemente koji kontrolišu inicijaciju transkripcije kao što je promotor; i (3) DNK elemente koji kontrolišu obradu transripta, kao skevence za terminaciju transkripcije/poliadenilaciju.
TGF-beta vezujući proteini iz ovog pronalaska poželjno se esprimiraju u sisarskim ćelijama. Primeri sisarskih domaćinskih ćelija uključuju ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (Vero; ATCC CRL 1587), humane embrionske ćelije bubrega (293-HEK; ATCC CRL 1573), ćelije bubrega bebe hrčka (BHK-21; ATCC CRL 8544), (BHK-21; ATCC CRL 8544), ćelije bubrega psa (MDCK; ATCC CCL 34), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1; ATCC CCL61), ćelije hipofize pacova (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 ćelije (ATCC CCL2.2.), hepatoma ćelije pacova (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-transformisane ćelije bubrega majmuna (COS-1; ATCC CRL 1650) i embrionske ćelije miša (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Za sisarskog domaćinam transkripcioni i translacioni regulatorni signali mogu biti izvedeni iz virusnih izvora, kao što je adenovirus, goveđi papiloma virus, ili slični, u kojima su regulatorni signali povezani sa određenim genom koji ima viško nivo ekspresije. Pogodne transkripcione i translacione regulatorne sekvence mogu se takođe dobiti iz sisarskih gena, kao što su geni za aktin, kolagen, mijozin, i metalotionein.
Transkrpicione regulatorne sekvence uključuju promotorski region koji je dovoljan da usmeri inicijaciju sinteze RNK. Pogodni eukariotski promotori uključuju promotor mišjeg metalotioneinskog I gena (Hamer et al.,J. Molec. Appl. Genet.1:273, 1982), SV40 rani promotor (Benoist et al.,Nature290:304, 1981); promotroRoussarkoma virusa (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. SCi. USA 79:6777, 1982), promotor citomegalovirusa (Foecking et al., Gene, 45:101, 1980) i promotor mišijeg virusa tumora dojke( videti,generalno Etcheverrv, "Exprcssion of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", inProtein Engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), strane 163-181 (Jonh Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Alternativno, prokariotski promotor, kao što je promotor T3 RNK polimeraze bakteriofaga, može se upotrebiti za kontrolu ekspresije gena za TGF-beta vezujući protein u sisirskim ćelijama ako je prokariotski promotor regulisan sa eukariotskim promotorom (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485, 1991.
Geni za TGF-beta vezujući protein mogu takođe biti eksprimirani u bakterijskim, kvaščevim, insektskim ili biljnim ćelijama. Pogodni promotori mogu biti upotrebljeni za ekspresiju polipeptida TGF-beta vezujućeg proteina u prokariotskim domaćinu dobro su poznati onima koji se bave ovom oblašću nauke i uključuju promotore koji su sposobni da prepoznaju T4, T3, Sp6 i T7 polimeraze, Pri Plpromotore lambda bakteriofaga,trp, recA,"heat schock" (toplotnog šoka),lacUV5, tac, Ipp- lacSpr, phoAilacZpromotoreE. coli,promotoreB. subtilis,promotore bakteriofagaBacillus, Streptomycespromotore,intpromotor bakteriofaga lambda,blapromotor pBR322 i CAT promotor gena za hloramfenikol acetil transferazu. Prokariotski promotori su objavlejni i opisani u Glick,J. Ind. Microbiol.1:277, 1987, Watson et al,Molecular Biology of the Gene 4th Ed.(Benjamin Cummins 1987) i Ausubel et al., (1995).
Poželjni prokariotski domaćini uključujuE. coliiBacillus subtillis.Pogodni sojeviE. coliulključuju BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 i ER1647( videti,na primer, Brown (Ed.),Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991)). Pogodni sojeviB. subtilis uključujuBR151, YB886, MI119, MI120 i B170( videti,na primer, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," uDNA Cloning: A practical Approach,Glover (Ed.) (IRL Press 1985)).
Metode za ekspresiju proteina u prokariotskim domaćinima dobro su poznate onima koji se bave ovim delom nauke (videti na primer, Williams et. al., "Expression of foreign proteins inE. coliusing plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," uDNA Cloning2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al. (eds.) strana 15 (Oxford University Press 1995); Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," uMonoclonal Antibodies: Principles and Applicationsstrana 137 (Wiley-Liss, Ine, 1995); i Georgiou, "Expression of proteins in bacteria" uProtein Engineering: Principles and practice, Cleland et al., ( eds),strana 101 (John Wiley&Sons Inc. 1996)).
Bakulovirusni sistem obezbeđuje efikasne načine za ubacivanje kloniranih gena zaTGF- beta vezujući proteinu insektsku ćeliju. Pogodni vektori su bazirani naAutographa californicavišestrukom nuklearnom polihedroznom (poliyhedrsois) virusu (AcMNPV), i sadrže dobro poznate promotore kao što je promotor proteina 70 toplotnog šoka (hsp, heat shock protein) kodDrosophilia,momentalni-rani genski promotor nuklearnog polihedroznog (poliyhedrsois) virusa( ie- l) Autographa califorminai odloženi rani39Kpromotor, bakulovirusni plO promotor i promotor metalotioneina kodDrosophilia.Pogodne insektske domaćinske ćelije uključuju ćelijske linije izvedene iz IPLB-S/-21, ćelijska linija jajnika lutkeSpodoptera frugiperdakao što je S/9 (ATCC CRC 1711), S/21 AE i S/21 (Invitrogen Coproration; San Diego, CA), kao i Schneider-2 ćelije kodDrosophilia.Utvrđene tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina u bakulovirusnim sistemima obezbeđene su od strane Bailey et al., "Manipulation of Bacilovirus Vectors;" uMethods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expressions Protocols,Murray (ed.), strane 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991); Patel et al., "The baculovirus expression system," uDNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al., (eds.), strane 205-244 (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) na stranama 16-37 do 16-57, by Richardson (ed.),Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995); i Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," uProtein engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), strane 183-218 (John WILEY & SONS, INC. 1996). Promotori za ekspresiju u kvascu uključuju promotore iz GALI (galaktoza), PGK (fosfoglicerat kinaza), ADH (alkoholna dehidrogenaza) AOXl (alkoholna oksidaza), HIS4 (histidinol dehidrogenaza) i slične. Dizajnirani su mnogi vektori za kloniranje u kvascu i lako su dostupni. Ovi vektori uključuju Yip bazirane vektore kao što je Yip5, YRp vektore kao što jeYRpl7, Yep vektore kao što je Yepl3 i YCP vektore kao što je YCpl9. Onaj ko se bavi naukom razumeće da je širok dijapazon pogodnih vektora dostupan za ekspresiju u ćelijama kvasca.
Ekspresioni vektori se takođe mogu ubaciti u biljne protoplaste, intaktna biljna tkiva ili izolovane biljne ćelije. Opšte metode za gajenje biljnih tkiva obezbeđena su na primer, od strane Miki et al., "Procedures for Introducing Foreigh DNA into Plants," uMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick et al., (eds.), strane 67-88 (CRC Press, 1993).
Ekspresioni vektori se takođe mogu ubaciti u domaćinske ćelije pomoću različitih standardnih tehnika uključujući transfekciju posredovanu kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu lipozomom, dostavljanje posredovano mikroprojektilom, elektroporaciju i slične. Poželjno, transfektovane ćelije se odabiraju i propagiraju da bi se obezbedile rekombinantne domaćinske ćelije koje sadrže ekspresioni vektor stabilno integrisan u genom ćelije domaćina. Tehnike za ubacivanje vektora u eukariotske ćelije i tehnike za odabiranje ovakvih stabilnih transformanata pomoću selektvinog markera opisane su od strane Ausubel (1995) i Murrav (ed.),Gene Transfer and Expression Protocols(Human Press 1991). Metode za za ubacivanje vektora u bakterijske, kvaščeve, insketske i biljne ćelije obezbedio je Ausubel (1995).
Opšte metode za ekspresiju i izolovanje stranog proteina koji je proizveden u sisraskom ćelijskom sistemu obezbedio je na primer, Etchverrv, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture",uProtein Engineering: Principles and Practice,Cleland et al., (eds.), strane 163 (Wiley-Liss Inc. 1996)). Standardne tehnike za dobijanje proteina koji je proizveden u bakterijskom sistemu obezbedio je na primer Grisshammeret al,"Purification of over-produced proteins fromE. colicells," uDNA Cloining 2: Expression Systems, 2nd Edition,Gloveret al.(eds), strane 59-92 (Oxford University Press 1995). Uspostavljene metode za izolovanje rekombinantnih proteina iz bakulovirusnog sistema opisao je Richardson (ed.), uBacilovirus Expression Protocols(Humana Press, Inc., 1995).
Još uopštenije, TGF-beta vezujući protein može biti izolovan standardnim tehnikama kao što je afinitativna hromatografija, hromatografija isključivanja po veličini, jonsko izmenjivačka hromatografija, HPLC i slični. Dodatne varijacije u izolaciji i prečišćavanju TGF-beta vezujućeg proteina mogu se osmisliti od strane naučnog kadra. Na primer, anti-TGF-beta vezujući protein antitela, dobijena kao što je ovde opisano, mogu se upotrebiti za izolovanje velikih količina proteina putem imuno-afinitativnog prečišćavanja.
5. Proizvodnja antitela na TGF-beta vezujući protein
Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za sklerostin kao što je ovde detaljno opisano. Antitela na TGF-beta vezujući protein mogu se dobiti na primer upotrebom proizvoda ekspresionog vektora kao antigena. Antitela koja se specifično vezuju za sklerostin mogu se pripremiti takođe upotrebom peptida dobijenih iz bilo koje polipeptidne sekvence sklerostina koja je ovde obezbeđena (SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 ili 65). Posebno korisna anti-TGF-beta vezujući protein antitela se "specifično vezuju" za TGF-beta vezujući protein sekvencni ID No: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 ili 65 ali se ne vezuju za druge TGF-beta vezujuće proteine kao što je Dan, Cerberus, SCGF, ili Gremlin. Antitela iz ovog pronalaska (uključujući njihove fragmente i derivate) mogu biti poliklonalna ili posebno monoklonalna antitela. Antitelo može pripadati bilo kojoj imunoglobulinskoj klasi, i može biti na primer IgG (uključujući izotipove IgG, koji su za humana antitela poznati u nauci kao IgGl, IgG2, IgG3, IgG4); IgE; IgM; ili IgA antitelo. Antitelo može biti dobijeno iz pernatih životinja ili sisara, poželjno, na primer iz mišijeg, pacovskog, huamnog ili drugog primarnog antitela. Kada je poželjeno antitelo može biti unutrašnje (internalising) antitelo.
Poliklonalna antitela na rekombinantni TGF-beta vezujući protein mogu se pripremiti pomoću metoda koje su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti( videti,na primer, Green et al., "Production of Polvclonal Antisera," uImmunochemical Protocols(Manson, ed.), strane 1-5 (Humana Press 1992); Williams et. al., "Expression of foreign proteins inE. coliusing plasmid vectors and purification of specific polvclonal antibodies," uDMA Cloning2: Expression Systems, 2nd Edition, G\ o\ QXet al. (eds.) strana 15 (Oxford Universitv Press 1995)). Iako se poliklonalna antitela tipično podižu u životinjama kao što su pacovi, zečevi, koze, ili ovce, anti-TGF-beta vezujući protein antitelo iz ovog pronalaska može se dobiti iz subhumanog primatnog antitela. Opšte tehnike za "podizanje" (stvaranje) dijagnostički i terapeutski korisnih antitela u babunima mogu se naći na primer u WO 91/11465 (1991) i u Losman et. al,Int. J. Cancer 46:310,1990.
Antitelo bi trebalo da sadrži najmanje domen varijabilnog regiona. Domen varijabilnog regiona može biti bilo koje veličine i amino kiselinske kompozicije i generalno će sadržati najmanje jednu hipervarijabilnu amino kiselinsku sekvencu koja je odgovorna za vezivanje antigena uronjenog u sekvencu okosnice. U opštim uslovima domen varijabilnog (V) regiona može biti bilo koji pogodan aranžman imunoglobulinskih teških (VH) i/ili lakih (VL) lanaca varijabilnih domena. Zato, na primer, domen V regiona može biti monomer i biti Vh ili Vldomen koji su sposobni za nezavisno vezivanje antigena sa prihvatljivim afinitetom. Alternativno, domen V regiona može biti dimer i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. u kojima su VHVLlanac ne-kovalentno povezani (ovde i od sada označeni kao Fv). Ako je potrebno, međutim, lanci mogu biti kovalentno vezani ili direktno na primer preko disulfidne veze između dva varijabilna domena ili preko spoja (linkera) na primer peptidnog spoja (linker) da bi se formirao jednolančani domen (ovde i od sada označeni kao scFv).
Domen varijabilnog regiona može biti bilo koji prirodni varijabilni region ili njegova konstruisna verzija. Pod konstruisanom verzijom misli se na domen varijabilnog regiona koji je kreiran upotrebom tehnika konstruisanja i rekombinantne DNK. Ovakve napravljene verzije uključuju one kreirane na primer, od varijabilnog regiona specifičnog antitela putem insercije, delecija ili promena u ili promena na amino kiselinskoj sekvenci prirodnog antitela. Posebni primeri ovog tipa uključuju konstruisane domene varijabilnih regiona koji sadrže makar jedan CDR (region za određivanje komplementarnosti) i opcionalno jednu ili više amino kiselinski sekvenci regiona okosnice od jednog antitela i ostatak domena varijabilnog regiona od drugog antitela.
Domen varijabilnog regiona može biti kovalentno vezan na C-terminalnoj amino kiselini za najmanje jedan drugi domen antitela ili njegov fragment. Zato, na primer, VHdomen koji je prisutan u domenu varijabilnog regiona može biti povezan sa imunoglobulinskim ChI domenom ili njegovim fragmentom. Slično tome VLdomen može biti povezan sa CKdomenom ili njegovim fragmentom. Na ovaj način, na primer, antitelo može biti Fab fragment, naznačeno time da domen za vezivanje antigena sadrži povezane Vhi Vldomene kovalentno vezane na njihovim C-terminusima sa CHI i C«domenom. CHI domen može biti produžen sa dodatnim amino kiselinama, na primer da bi se obezbedio region zgloba (hinge) ili deo domena regiona zgloba kao što se nalazi u Fab' fragmentu, ili da bi se obezbedili dalji domeni, kao što su domeni antitela CH2 i CH3.
Druga forma fragmenta antitela je peptid koji sadrži jedan region za određivanje kompelmentarnosti (CDR). CDR peptidi ("minimalne jedinice prepoznavanja") mogu se dobiti konstruisanjem gena koji kodiraju CDR antitela od interesa. Ovakvi geni se pripremaju na primer, upotrebom lančane reakcije polimeraze, da bi se sintetisao varijabilni region od RNK ćelija koje proizvode antitelo( videti,na primer, Larrick et al.,Methods: A Companion to Methods in Enzymology2.106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipualtion of Monoclonal Antibodies," uMonoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application,Ritter et al. (eds.), strana 166 (Cambridge University Press 1995); i Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"u Mnoclonal Antibodies: Principles and Applications,Birch et al., (eds), strana 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995).
Antitela za upotrebu u pronalasku uključuju monoklonalna antitela (koja se pripremaju konvencionalnom imunizacijom i procedurama za ćelijsku fuziju) ili u slučaju fragmenata, mogu se dobiti iz njih pomoću bilo koje standardne hemikalije kao što je redukcoja ili enzimsko sečenje i/ili tehnike digestije, na primer tretmanom sa tripsinom. Još specifičnije, monoklonalna anti-TGF-beta vezujući protein antitela mogu se generisati pomoću različitih tehnika. Glodarska monoklonalna antitela koja se vezuju za specifične antigene mogu se dobiti metodama koje stručnjaci iz nauke poznaju( videti,na primer, Kohler et. al.,Nature256:495, 1975; Coligan et al. (eds),Current Protocols in Immunology,1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991 ("Colligan"); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expresses inE. coli",uDNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition,Glover et al. (eds), strana 93 (Oxford University Press 1995)).
Ukrartko, monoklonalna antitela mogu se dobiti injektiranjem miša sa kompozicijom koja sadrži proizvod gena za TGF-beta vezujući protein, potvrđivanjem prisustva proizvodnje antitela putem uklanjanja uzorka seruma, uklanjanjem slezine da bi se dobili B-limfociti, fuzijom B-limfocita sa ćelijama mijelome da bi se proizvele hibridome, kloniranjem hibridoma, selekcijom pozitivnih klonova koji proizvode antitela na antigen, gajenjem klonova koji proizvode antitela na antigen, i izolovanjem antitela iz kultura hibridoma.
Dodatno, anti-TGF-beta vezujući protein antitelo iz ovog pronalaska može biti izvedeno iz humanog monoklonalnog antitela. Humana monoklonalan antitela se dobijaju iz transgenih miševa koji su konstruisani da proizvode specifična humana antitela kao odgovor na izazov sa antigenom. U ovoj tehnici, elementi lokusa za humani teški i laki lanac se ubacuju u sojeve miševa izvedenih iz embrionskih stem (ishodnih) ćelijskih linija koje sadrže ciljane poremećaje endogenih lokusa za teški i laki lanac. Transgeni miševi mogu sintetisati humana antitela specifična za humane antigene, i miševi mogu biti upotrebljeni za proizvodnju humanih hibridoma koje sekretuju antitelo. Metode za dobijanje humanih antitela iz transgenih miševa opisane su na primer u Green et. al.,Nature Genet.7:13, 1994; Lonberg et al.,Nature368:856, 1994; Tavlor et al.,Int. Immun.6:579, 1994;
Monoklonalna antitela mogu biti izolovana i prečišćena iz kultura hibridoma različitim dobro uspostavljenim tehnikama. Ovakve tehnike izolacije uključuju afinitativnu hromatografiju sa Protein-A sefarozom, hromatografiju isključivanja na osnovu veličine i jonsko-izmenjivačku hromatografiju( videti,na primer, Coligan - na stranama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," uMethods in Molecular Biology, Vol. 10,strane 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Za određene potrebe, može biti poželjno da se pripreme fragmenti anti-TGF-beta vezujući protein antitela. Ovi fragmenti antitela mogu se dobiti, na primer, digestijom sa pepsinom ili papainom čitavih atitela na osnovu konvencionalnih metoda. Kao ilustracija, fragmenti antitela mogu se proizvesti enzimatskim sečenjem antitela sa pepsinom pri čemi se dobija 5S fragment označen kao F(ab')2- Ovaj fragment može se dalje šeći pomoću tiol redukujućeg agensa da bi se proizveli 3.5S Fab' monovalentni fragmenti. Opcionalno, reakcija sečenja može se izvesti upotrebom grupa za blokiranje za sulfhidrilnihe grupa, što rezultuje u sečenju dizulfidnih veza. Kao alternativa, enzimatsko sečenje pomoću popaina proizvodi direktno dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment. Ove metode su opisane na primer od strane Goldenberg, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff et al.,Arch. Biochem. Biophys.89:230, 1960; Porter,Biochem J.73.T19, 1959; Edelman et al., uMethods in Enzymology7:422 (Academic Press 1967); i Coligan na stranama 2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4.
Druge metode za sečenje antitela, kao što je odvajanje teških lanaca da bi se formirali monovalentni fragmenti lakih-teških lanaca, dalje sečenje fargmenata ili druge enzimske, hemijske ili genetičke tehnike, takođe se mogu koristiti, sve dok se fragmenti vezuju za antigen koga prepoznaje intaktno antitelo.
Alternativno, antitelo može biti rekombinantno ili konstruisano antitelo dobijeno tehnikama rekombinantne DNK koje uključuju manipulaciju i ponovnu ekspresiju DNK kodirajućeh varijabilnih i/ili konstantnih regiona antitela. Ovakva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz DNK biblioteka uključujući na primer fagne biblioteke antitela( videtiChisvvell and McCaffertv,Tibtech.K> 80-84 (1992) ili se može po želji lako sintetisati. Standardne procedure molekularne biologije i/ili hernije mogu se koristiti radi sekvenciranja i manipulacije DNK, na primer, da bi se uneli kodoni u cilju kreiranja cisteinskih ostataka ili da bi se modifikovale, dodale, deletirale amino kiseline ili domeni, ako je potrebno.
Jedan ili više replikativnih vektora koji sadrže DNK koja kodira varijabilni i/ili konstantni region, mogu se pripremiti i koristiti za transformaciju odgovarajuće ćelijske linije, na primer mijeloma ćelijske linije koja nije proizvođač, kao što je mišija NSO linija ili bakterija kaoE. coli,u kojima će se odigrati proizvodnja antitela. U cilju dobijanja efikasne transkripcije (prepisivanje) i translacije (prevođenje), DNK sekvenca u svakom vektoru trabela bi da uključu odgovarajuće regulatorne sekvence, posebno promotorsku i vodeću (lider) sekvencu koje su operativno povezane sa sekvencom varijabilnog domena. Posebne metode za proizvodnju antitela na ovaj način generalno su dobro poznate i rutinski se koriste. Na primer osnovne procedure molekularne biologije opisane su u Maniatis et al.,( Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed., Cold Springs Harbor Laboratorv, New York, 1989;videtitakođe Maniatis et al., 3rd ed., Cold Springs Harbor Laboratorv, New York, (2001)). DNK sekvenciranje može se izvršiti na način opisan u Sanger et al., (PNAS 74:5463, (1977) i Amersham International plc priručnik za sekvenciranje; mutageneza usmerena na mesto može se obaviti u skladu sa metodom Kramer et al,( Nucleic Acids Res.12:9441, (1984); Anglianb Biotechologv Ltd ppriručnik; KunkelProc. Natl. Acad. Sci. USA82:488-92
(1985); Kunkel et al.,Methods in Enzymol.154:367-82 (1987). Dodatno, brojni radovi opisuju tehnike pogodne za pripremu antitela putem manipulacije sa DNK, kreiranjem ekspresionih vektora i transformisanjem odgovarajućih ćelija, na primer obrađeni su u Mountain A and Adair, J Rin Biotechnology and genetic Engineering Reviews ( ed.Tombs, MP, J_0, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK) i u International Patent Specification No. WO 91/09967).
U određenim ostvarenjima, antitelo na osnovu pronalaska može da ima jedan ili više efektornih ili reporter molekula vezanih za sebe i pronalazak je proširen i na ovakve modifikovane proteine. Reporter molekul može biti detektabilni deo (polovina) ili obeležje kao enzim, citotoksični agens ili drugi reporter molekul, uključujući boju, radionuklid (radionuclid), luninescentnu grupu, fluorescentnu grupu ili biotin, ili slične. TGF-beta vezujući protein-specifični imunoglobulin ili njegov fragment može biti radioaktivno obeležen za dijagnostičke ili terapeutske primene. Tehnike radio-obeležavanja antitela poznate su u nauci.Videti,na primer, Adams 1998In vivo12:11-21; Hiltunen 1993Acta Oncol.32:831-9. Terapeutske primene opisane su detaljnije u tekstu koji sledi i mogu uključiti upotrebu TGF-beta vezujući protein - specifičnih antitela (ili njihovih fragmenata) u konjunkciji sa drugim terapeutskim agensima. Efektorni ili reporter molekuli mogu biti vezani za antitelo preko bilo kog dostupog bočnog lanca amino kiseline, terminalne amino kiseline ili tamo gde je prisutna preko ugljovodonične funkcionalne grupe locirane u antitelu, pri čemu mora biti obezbeđeno da vezivanje ili proces vezivanja ne utiče nepovoljno na osobine vezivanja i korisnost molekula. Određene funkcionalne grupe uključuju na primer, bilo koju slobodnu amino, imino, tiol, hodroksi ili aldehidnu grupu. Vezivanje antitela i efektorskog i/ili reporter molekula može se ostvariti preko ovakvih grupa i odgovarajuće funkcionalne grupe u efektorskom ili reporter molekulu. Povezivanje može biti direktno ili indirektno preko grupa za povezivanje ili stvaranje mosta.
Efektorni molekuli uključuju na primer, antineoplastične agense, toksine (kao enzimatski aktivne toksine bakterijskog porekla (kaoPseudomonas aeruginosaegzotoksin A) ili biljnog porekla i njihove fragmente (na primer, ricinus i njegove fragmente, biljni gelonin, briodin izBrionia dioicaili slično.Videti,na primer, Thrush etal.,1996 Annu. Rev. Immunol.14:49-71; Frankel et al., 1996Cancer Res.56:926-32); biološki aktivne proteine, na primer enzime; nukleinske kiseline i njihove fragmente kao. DNK RNK ili nijihove fragmente; prirodne i sintetičke polimere, (na primer, polisaharide i polialkilne polimere kao što je poli(etilen glikol) i njihove derivate); radionuklide, posebno radiojodid; i helirane metale. Pogodne reporter grupe uključuju helirane metale, fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana NMR-om ili ESR spektrometrijom. Posebno korisne efektorne grupe su kalcihemicin i njegovi derivati( videti,na primer, South African Patent Specification Nos. 85/8794, 88/8127 i 90/2839).
Brojni drugi toksini, uključujući hemoterapeutske agense, anti-mitotičke agense, antibiotike, inducere apoptoze (ili "apoptogene"videti,na primer, Green i Reed,\ 998, Science281:1309-1312) ili slične, poznati su onima koji se bave naukom, i primeri koji su ovde obezbeđeni nalaze se ilustracije radi bez namere da ograničavaju opseg ili duh pronalaska. Određeni antineoplastični agensi uključuju citotoksične i citostatične agense, na primer aliklirajuće agense, kao što su azotni "mustards" (senf)
(na primer, hlorambucil, melfalan, mehloretamin, ciklofosfamid ili uracil "mustard") i njihove derivate, trietilenfosforamid, trietlienetiofosfor-amid, busulfan ili cispaltinu; antimetabolite kao metotreksat, fluoruracil, floksuridin, citarabin, merkaptopurin, tioguanin, fluorsirćetna kiselina ili fluor-limunska kiselina, antibiotici, kao bleomicini (na primer bleomicin sulfat), doksorubicin, daunorubicin, mitomicini (na primer mitomicin C), aktinomicini (na primer daktinomicin), plikamicin, kalihemicin i njihovie derivate ili esperamicin i njegove derivate; mitotičke inhibitore kao etopside, vinstriktin ili vinblastin i njihove derivate; alkaloide kao elipticin; poliole kao taksicin I ili taksicin II; hormone kao andorgene (na primer, demostanolon ili testolakton), progestine (na primer megestrol acetat ili medroksiprogesteron acetat), estrogene (na primer dimetilstilbestrol difosfat, poliestradiol fosfat ili estramustin fosfat) ili antiestrogene (na primer tamoksifen); antrakvinone, kao mitoksantron, uree, kao hidroksiurea; hidrazine kao prokarbazin; ili imidazole kao dekarbazin.
Helirani metali uključuju helate di- ili tripozitivnih metala koji imaju koordinantni broj od 2 do 8. Posebni primeri ovakvih metala uključuju tehnetijum (Tc), renijum (Re), kobalt (Co), bakar (Cu), zlato (Au), srebro (Ag), olovo (Pb), bizmut (Bi), indijum (In), galijum (Ga), itrijum (Y), terbijum (Tb), gadolinijum (Gd) i skandijum (Sc). Generalno poželjno je daje metal radionuklid. Posebni radionuklidi uključuju<9>9mTc,<186>Re,<188>Re, ?8Co,60Co,67Cu,195Au,199Au,110Ag,203Pb,206Bi, 207Bi, mIn,67Ga.68Ga,88Y, »V,<160>Tb,<153>Gdi<47>Sc.
Helirani metal može biti na primer jedan od gore navedenih metala heliranih sa bilo kojim pogodnim poliadenilatnih helirajućim agensom, na primer acikličnim ili cikličnim poliaminima, polietrima (na primer krunski etri ili njihovi derivati); poliamidima; porfirinima; i karvocikličnim derivatima. Generalno, tip helirajućeg agensa zavisiće od metala koji se koristi. Jedna posebno korisna grupa helirajućih egansa u konjugatima na osnovu pronalaska, međutim, sadrži dietilentiraminpenta sirćetnu kiselinu i njene derivate i makrociklične amine, na primer ciklične tri-aza i tetraza- derivate (na primer, kao što je opisano u International Patent Specification No. WO 92/22583); i poliamide, posebno deseferioksamin i njegove derivate.
Kada se tiolna grupa koristi u antitelu kao mesto spajanja, ovo se može postići preko reakcije koja se odigrava sa tiol-reaktivnom grupom koja je prisutna u efektornom ili reporter molekulu. Primeri ovakvih grupa uključuju a-halokarboksličnu kiselinu ili etar, kao što je jodoacetamid, imid, kao malemid, vinilsulfon ili disulfid. Ove i druge procedure povezivanja su generalno i detaljnije opisane u International Patent Specification No. WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/01476.
ESEJI ZA SELEKCIJU AGENASA KOJI POVEĆAVAJU GUSTINU KOSTIJU
Kao što je diskutovano prethodno u tekstu, ovaj pronalazak obezbeđuje metode za selekciju i/ili izolaciju agenasa koji su sposobni da povećaju gustinu kostiju. Na primer, u okviru jednog ostvarenja ovog pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje da li je odabrani molekul (na primer, kandidatni agens) sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i koje obuhvataju korake (a) mešanja (ili kontaktiranja) selektovanog molekula sa TGF-beta vezujućim proteinom i članom TGF-beta familije proteina (b) određivanja da li selektovani molekul stimuliše signalizaciju od strane TGF-beta familije proteina, ili inhibira vezivanje TGF-beta vezujući protein za najmanje jednog člana TGF-beta familije proteina. U okviru određenih ostvarenja, molekul pojačava sposobnost TGF-beta da funkcioniše kao pozitivni regulator diferencijacije mezemnhimalnih ćelija.
U okviru drugih aspekata pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje da li je odabrani molekul (na primer, kandidatni agens) sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i koje obuhvataju korake (a) izlaganja (kontaktiranja, mešanja, kombinovanja) selektovanog molekula sa ćelijama koje eksprimiraju TGF-beta vezujući protein i (b) određivanja da li ekspresija (ili aktivnost) TGF-beta vezujućeg proteina se smanjuje i odatle se određuje da li je jedinjenje sposobno da poveća mineralni sadržaj kosti.
U okviru jednog ostvarenja, ćelije su odabrane iz grupe koja se sastoji od spontano transformisanih ili netransformisanih humanih kostiju poreklom iz koštane biopsije ili pacovske parijetalne osteoblaste kosti. Metode za detekciju nivoa ekspresije TGF-beta vezujućeg proteina mogu biti postignute u okviru raznih mnogobrojnih formata eseja koji su poznati u nauci i ovde su opisani. Imunoeseji se mogu koristiti za detektovanje i kvantifikovanje ekspresije TGF-beta vezujućeg proteina i uključuju na primer Imuno-elektroforezu nasuprot smera struje (CIEP, Countercurrent Immuno-Electrophoresis), radioimunoeseje, radioimunoprecipitacije, ELISA (esej imunoabsorbcije povezan sa enzimom), eseje "immunoblot" kao što je tačkasti "blot" esej i "Western blot " esej, eseje inhibicije ili kompeticije i sendvič eseje{ videtiU.S. Patent Nos. 4,376,110 i 4,486,530;videti,takođeAntibodies: A Laboratory Manual,već naveden). Ovakvi imunoeseji mogu koristiti antitelo koje je specifično za TGF-beta vezujući protein kao ovde opisana anti-sklcrostin antitela ili mogu koristiti antitelo koje je specifično za reporter molekul koji je pričvršćen za TGF-beta vezujući protein. Nivo ekspresije polipeptida može se takođe odrediti kvantifikovanjem količine TGF-beta vezujućeg proteina koje se vezuje za ligand TGF-beta vezujućeg proteina. U cilju primera navodimo da se vezivanje sklerostina za BMP u uzorku može detektovati površinskom "plasmon" rezonancom (SPR- Surface Plasmon Resonance). Alternativno, može se detektovati nivo ekspresije iRNK koja kodira specifičan TGF-beta vezujući protein.
Reprezentativna ostvarenja ovakvih eseja obezbeđena su dole u primerima 5 i 6. Ukartko, član familije TGF-beta superfamilije ili TGF-beta vezujući protein prvo se vezuje za čvrstu fazu, nakon čega sledi dodavanje kandidatnog molekula. Obeleženi član familije TGF-beta super-familije ili TGF-beta vezujući protein se zatim dodaje u esej (to jest obeleženi polipeptid je ligand za koji je vezan bilo koji polipeptid za čvsrtu fazu), zatim se čvrsta faza ispira i određuje se količina vezanog ili obeleženog člana na čvrstoj potpori. Molekuli koji su pogodni za upotrebu u povećanju mineralnog sadržaja kosti, kao što je ovde opisano, su oni molekuli koji smanjuju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana ili članove TGF-beta super-familije na statistički značajan način. Očigledno je da bi eseji koji su korisni za upotrebu u okviru ovog pronalaska trebalo da budu limitirani na ostvarenja opisanau primerima 2 i 3. Posebno, brojni parametri mogu biti izmenjeni, ili na primer putem vezivanja TGF-beta za čvrstu fazu, ili putem eliminacije čitave čvrste faze.
U okviru drugih ostvarenja pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje toga da li je odabrani molekul sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i obuhvataju korake (a) izlaganja (kontaktiranja, mešanja, kombinovanja) selektovanog molekula (kandidatnog agensa) sa ćelijama koje eksprimiraju TGF-beta i (b) određivanje da li je aktivnost TGF-beta iz pomenutih izloženih ćelija izmenjena, i na osnovu toga određivanje da li je jedinjenje sposobno da poveća mineralni sadržaj kosti. Slično metodama koje su ovde opisane, širok dijapazon metoda može da se upotrebi za procenu pormena ekspresije TGF-beta vezujućeg proteina usled odabranog test jedinjenja. U jednom ostvarenju pronalaska, kandidatni agens je antitelo koje se vezuje za TGF-beta vezujući protein sklerostin koji je ovde opisan.
U poželjnom ostvarenju pronalaska, obezbeđena je metoda za identifikovanje antitela koje moduliše TGF-beta signalni put koji obuhvata kontaktiranje antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid sa SOST peptidom, uključujući ali bez ograničenja, peptide koji su ovde otkriveni, u uslovima i vremenskom periodu koji su dovoljni da se dozvoli formiranje antitelo plus (+) SOST (antitelo/SOST) kompleksa i zatim detektuje nivo (na primer kvantifikovanje količine) SOST/antitelo kompleksa, da bi se odredilo prisustvo antitela koje moduliše TGF-beta signalni put. Metoda se može izvesti pomoću SPR ili pomoću bilo kog broja imunoeseja poznatih u nauci koji su ovde opisani, uključujući ELISA, "immunoblot" analizu ili slične. TGF-beta signalni put obuhvata signalni put u kome se BMP vezuje za receptor tipa I i tipa II na ćeliji da bi se stimulisao ili indukovao put koji moduliše mineralni sadržaj kosti. U određenim poželjnim ostvarenjima pronalaska, antitelo koje se specifično vezuje za SOST stimuliše ili pojačava put za povećanje mineralnog sadržaja kosti. Ovakvo antitelo može biti identifikovano upotrebom metoda opisanih ovde, da bi se detektovalo vezivanje antitela za SOST specifične peptide.
Metode koje su predmet pronalaska takođe se mogu koristiti za identifikaciju antitela koja oslabljuju, inhibiraju (uključujući kompetitivno inhibiranje) ili sprečavaju vezivanje BMP za SOST polipeptid putem detektovanja da li se antitelo vezuje za SOST peptide koji su locirani u regionima ili delovima regiona na SOST za koje se BMP vezuje, kao što su peptidi na amino terminalno kraju SOST i peptidi koji uključuju amino terminalne amino kiselinske ostatke i deo regiona srži (srž za pristajanje) SOST (na primer SEQ ID NOs:47-64, 66-73 i 92-95). Metode iz ovog pronalaska mogu se takođe koristiti za identifikaciju antitela koje oslabljuje, sprečava ili inhibira formiranje SOST homodimera. Ovakvo antitelo koje se specifično vezuje za SOST može biti identifikovano putem detektovanja vezivanja antitela za peptide koji su izvedeni iz srži ili karboksi terminalnog regiona SOST (na primer SEQ ID NOs:74-91 i 96-99).
U okviru drugih ostvarenja pronalaska, obezbeđene su metode za određivanje da li je selektovani molekul sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti i obuhvataju korake (a) mešanja ili kontaktiranja selektovanog molekula (kandidatnog agensa) sa TGF-beta vezujućim proteinom i odabranim članom TGF-beta familije proteina (b) određivanja da li ekspresija selektovani molekul povećava ekspresiju ("up regulates") signalizaciju familije TGF-beta proteina ili inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za familiju TGF-beta proteina. U okviru određenih ostvarenja, molekul pojačava sposobnost TGF-beta da funkcioniše kao pozitivni regulator diferencijacije mezemnhimalnih ćelija.
Slično gore opisanim metodama, širok dijapazon metoda može se koristiti za procenu stimulacije TGF-beta usled odabranog test jedinjenja. Jedan takav reprezentativni metod obezbeđen je u primeru 6 (videti takođe Durham et al.,Endo.,136:1374-1380).
U okviru još drugih dodatnih ostvarenja, obezbeđene su metode za određivanje da li je selektovani molekul (kandidatni agens) sposoban da poveća mineralni sadržaj kosti, koje obuhvataju korak određivanja da li selektovani molekul inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za kost ili njegov analog. Kao što se ovde koristi, treba razumeti da se kost ili njegov analog odnose na hidroksiapatit, ili površinu koja je sastavljena od praškaste forme kosti, smrvljene kosti ili intaktne kosti. Slično ovde opisanim metodama, mogu se koristiti različite metode za procenu inhibicije TGF-beta vezujućeg proteina lokalizacije za matriks kosti (videti, na primer, Nicolas et al.,Calcif. Tissue Int.47:206-12 (1995)).
U jednom ostvarenju pronalaska, antitelo ili njegov antigen vezujući-fragement koji se specifično vezuju za sklerostinski polipeptid sposobni su za kompetitivnu inhibiciju vezivanja člana TGF-beta familije za sklerostinski polipeptid. Sposobnost antitela ili fragmenta antitela da oslabi ili blokira vezivanje člana TGF-beta familije, kao što je BMP, za sklerostin, može se odrediti na osnovu bilo kojih ovde opisanih metoda. Antitelo ili fragment antitela koje se specifično vezuje za sklerostin može da oslabljuje, blokira ili spreči vezivanje člana TGF-beta familije za sklerostin putem oslabljivanja formiranja sklerostin homodimera. Antitelo koje se specifično vezuje za sklerostin, može se takođe koristiti za identifikovanje aktivnosti sklerostina putem inhibiranja ili oslabljivanja vezivanje sklerostina za BMP. Alternativno, antitelo ili njegov fragment, može se ubaciti u esej baziran na ćelijama ili u životinjski model u kome sklerostin ima definisanu aktivnost, da bi se odredilo da li antitelo menja ovu aktivnost (povećava ili smanjuje na statistički značajan način). Antitelo ili njegov fragment, koje se specifično vezuje za sklerostin, može se koristiti za proučavanje efekta takvog antitela u putu signalne transdukcije i tako se može modulisati (stimulisati ili inhibirati) signalni put. Poželjno, vezivanje antitela za sklerostin rezultuje u stimulaciji ili indukciji signalnog puta.
Dok metode koje su ovde opisane mogu da se odnose na analizu pojedinačnog test molekula, ovaj pronalazak ne bi trebalo da bude ograničen na taj način. Posebno, selektovani molekul može da bude sadržan u okviru mešavine jedinjenja. Zato, opisane metode mogu dalje da sadrže korak izolacije molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije.
KANDIDATNI MOLEKULI
Širok dijapazon molekula može biti procenjen za njihovu sposobnost da inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Reprezentativni primeri opisani detaljnije dalje u tekstu uključuju organske molekule (na primer, male
oragnske molekule), proteine, ilil peptide, i molekule nukelinskih kiselina. Iako bi trebalo da bude očigledno iz diskusije koja sledi da kandidatni molekuli opisani ovde mogu da se koriste u ovde opisanim esejima, trebalo bi da bude očigledno da ovakvi molekuli mogu da se takođe koriste u različitim dijagnostičkim i terapeutskim postavkama.
Organski molekuli
Brojni mali organski molekuli mogu se obraditi esejom za njihovu sposobnost da inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Na primer, u okviru jednog ostvarenja pronalaska pogodni organski molekul može biti odabran ili iz hemijske biblioteke, nazančeno time da se hemikalije obrade pojedinačno u eseju, ili iz kombinatornih hemijskih biblioteka gde se esej radi odjedanput za više jedinjenja, i zatim se "odmota" da bi se odredila i izolovala većina aktivnih jedinjenja.
Reprezentativni primeri ovakvih kombinatornih hemijskih biblioteka uključuju one opisane od strane Agrafiotis et al., "Svstem and method of automaticallv generating chemical compounds with desired properties," U. S. Patent No. 5,463,564; Armstrong, R. W., "Svnthesis of combinatorial assavs of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array svntheisi" WO 95/02566; Baldvvin, J. J., et al., "Sulfonamid derivatives and their use" WO 95/24186; Baldwin, J. J., et al., " Combinatorial dihidrobenzopvran library" WO 95/30642; Brenner, S., "New kit for preparing combinatorial libraries" WO 95/16918; Chenera, B., et al., "Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds", WO 95/16712; Ellmann, J. A., "Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support" U. S. Patent No 5,288,514; Felder, E., et al., "Novel combinatorial compound libraries" WO 95/ 16209; Lerner, R. et al., " Encoded combinatorial chemical libraries" WO 93/20242; Pavia, M.R. et al., "A method for preparing and selecting pharmaceuticallu useful non-peptide compounds from structurally diverse universal library " WO 95/04277; Summerton, J.E and D.D Weller "Morpholino-subunit combinatorial library and method" U.S. Patent No 5,506,337; Holmes, C, " Methods for Solid Phase Synthesis of Thialidinones, Metathiazanones, and Benzimidazoles"Tet. Letters37:4887-90, 1996; Ruhland, B. et al., "Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse p-Lactams"J. Amer. Chem. Soc.111:253-4, 1996; Look, G.C et al., "The Identification of Cycloxygenase-l Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries",Bioorg and Med. Chem. Letters6:707-12. 1996.
Proteini i peptidi
Širok dijapazon proteina i peptida može takođe biti korišćeni kao kandidatni molekuli za inhibitore vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije.
a) Kombinatorne peptidne biblioteke
Peptidni molekuli koji su pretpostavljeni inhibitori vezivanja TGF-beta vezujućeg
proteina za člana TGF-beta familije mogu se dobiti preko pregledanja kombinatornih peptidnih biblioteka. Ovakve biblioteke mogu biti pripremljene ili od strane obučene osobe iz nauke (videti na primer, U. S. Patent No. 4,528,266 i 4,359,535 i Patent
Cooperation Treaty Publication Nos. WO 92/15679, WO 92/15677, WO 90/07862, WO 90/02809, ili kupljene od komercijalno dostupnih izvora (na primer, New England Biolabs Ph.D.™ Phage Display Peptide Library Kit).
b) Antitela
Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za sklerostin polipeptid i
metode za upotrebu ovakvih antitela. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje sklerostin polipeptidne imunogene koji se mogu koristiti za dobijanje i analizu ovih antitela. Antitela mogu biti korisna u blokiranju ili oslabljuju vezivanja sklerostin polipeptida, koji je TGF-beta vezujući protein, za ligand, posebno za morfogeni protein kosti i mogu takođe da blokiraju ili oslabljuju vezivanja SOST polipeptida za jedan ili više drugih liganda.
Molekul kao što je antitelo koje inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za jedan ili više članova TGF-beta familije proteina, uključujući jedan ili više morfogenih proteina kosti (BMP-ovi), trebalo bi shvatiti da se odnosi na primer, molekul koji omogućava aktivaciju člana TGF-beta familije ili BMP ili omogućava vezivanje članova TGF-beta familije uključujući jednog ili više BMP za njihove odgovarajuće receptore uklanjanjem ili sprečavanjem člana TGF-beta da se veže za TGF-vezujući protein.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje peptide i polipeptide imunogene koji mogu da se koriste za dobijanje i/ili identifikaciju antitela ili njihovih fragmenata koja su sposobna da inhibiraju, sprečavaju ili oslabljuju vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina sklerostina za jedan ili više BMP. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje peptide i polipeptide imunogene koji mogu da se koriste za dobijanje i/ili identifikaciju antitela ili njihovih fragmenata koja su sposobna da inhibiraju, sprečavaju ili oslabljuju (na primer, statistički značajno snižavanje) formiranje homodimera sklerostina. Antitela iz ovog pronalaska su korisna za povećanje mineralnog sadržaja i mineralne gustine kosti, i tako poboljšavaju brojna stanja koja rezultiraju u gubitku mineralnog sadržaja kosti, uključujući na primer, bolest, genetsku predispoziciju, nesrećne slučajeve koji rezultuju u gubitku upotrebljivosti kosti (na primer usled frakture), lekovi koji utiču na koštanu resorbciju ili koji ubijaju ćelije koje formiraju ćelije i normalno starenje.
Polipeptidi ili peptidi upotrebljivi za imunizaciju i/ili analizu sklerostin specifičnih antitela mogu se takođe odabrati analizom primarne, sekundarne, tercijarne strukture TGF-beta vezujućeg proteina na osnovu metoda poznatih onima koji se bave naukom i ovde opisanih, u cilju određivanja amino kiselinskih sekvenci koje će verovatnije generisati antigenio odgovor u domaćinskoj životinji.Videti,na primer, Novotnv,Mol. Immunol.28:201-207 (1991); Berzofsky,Science229:932-40 (1985)). Podaci dobijeni od modelovanja i kristalografije x-zracima mogu se takođe upotrebiti za predviđanje i/ili identifikaciju koji delovi ili regioni TGF-beta vezujućeg-proteina koji interaguju sa kojim delovima liganda TGF-beta vezujućeg-proteina, kao što je BMP. Peptidni imunogeni TGF-beta vezujućeg-proteina mogu se dizajnirati i pripremiti tako da uključe amino kiselinske sekvence u okviru ili one koje okružuju delove ili regione koji učestvuju u interakciji. Ova antitela mogu biti korisna za blokiranje ili oslabljivanje vezivanje TGF-beta vezujućeg-proteina za isti ligand i mogu takođe da blokiraju ili oslabljuju vezivanje TGF-beta vezujućeg-proteina za jedan ili više drugih liganda. Antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti razmatrani u ovom pronalasku, uključuju antitela koja su sposobna da se specifično vežu za sklerostin i kompetitivno inhibiraju vezivanje TGF-beta polipeptida, kao što je BMP za sklerostin. Na primer, antitela razmatrana u ovom pronalasku kompetitivno inhibiraju vezivanje sklerostin polipeptida za BMP mesto na receptom tipa I na BMP, ili za BMP mesto na receptom tipa II ili mogu kompetitivno da inhibiraju vezivanje sklerostina i za mesta za vezivanje na receptom tipa I i tipa II na BMP. Bez želje da se ograniči samo na teoriju, kada anti-sklerostin antitelo kompetitivno inhibira vezivanje vezujućih mesta na receptorima tipa I i/ili tipa II na BMP polipeptidu za sklerostin i tako blokira antagoniostičku aktivnost sklerostina, mesta za vezivanje receptora na BMP su dostupna da se vežu za receptore tipa I i tipa II i tako povećavaju mineralizaciju kosti. Interakcije vezivanja između TGF-beta vezujućeg-proteina kao što je sklerostin i TGF-beta polipeptida kao što je BMP, generalno se odigravaju kada svaki od parova liganda formira homodimer. Zato umesto ili pored toga što se koristi antitelo specifično za sklerostin da bi se blokiralo, oslabilo ili sprečilo vezivanje sklerostina za BMP putem kompetitivne inhibicije vezivanja sklerostina za BMP, sklerostin specifično antitelo može se koristiti za blokiranje ili oslabljivanje formiranja sklerostin homodimera.
Kao primer navodimo jedan dimer humanog Noggin-a, koji je BMP antagonist koji ima sposobnost da veže BMP sa visokim afinitetom (Zimmerman at al., gore naveden), koji je izolovan u kompleksu sa jednim dimerom humanog BMP-7 i analiziran pomoću "multiwavelenght anomalous diffraction" (MAD, anomalija difrakcije višestrukih talasnih dužina) (Groppe et. al.,Nature420:636-42 (2002)). Kao što je ovde diskutovano, ova studija je otkrila da Noggin dimer može efikasno da blokira sva mesta za vezivanje receptora (dva vezujuća mesta na receptom tipa I i dva na receptom tipa II) na BMP dimeru. Lokacija amino kiselina u Noggin koje kontaktiraju BMP-7 može biti korisna u modelovanju interakcije između drugih TGF-beta vezujućih proteina, kao što je skleroztin (SOST) i BMP-ova i tako pomaže dizajniranje peptida koji se mogu koristiti kao imunogeni da bi se dobila antitela koja blokiraju ili oslabljuju ovakvu interakciju.
U jednom ostvarenju ovog pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za SOST polipeptid, kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedan ili oba morfogena proteina kosti (BMP) i to za njihova mesta za vezivanje receptora tipa I i BMP mesta za vezivanje receptora tipa II koji su locirani na BMP. Epitopi na SOST za koja se vezuju ova antitela mogu uključiti ili biti uključeni u okviru susednih amino kiselinskih sekvenci i koje su locirane na N-terminusu SOST polipeptida (amino kiseline na približnim pozicijama 1-56 SEQ ID NO:l). Polipeptidi mogu takođe uključiti kratku povezujuću (linker) peptidnu sekvencu koja povezuje N-terminalni region sa regionom srži, na primer, polipeptide kao što je obezbeđeno u SEQ ID NO:92 (čovek) i SEQ ID NO:93 (pacov). Kraće reprezentativne N-terminalne peptidne sekvence humanog SOST (na primer SEQ ID NO:46) uključuju SEQ ID NOS:47-51 i reprezentativni SOST pacova (na primer, SEQ ID NO:65) peptidne sekvence uključuju SEQ ID NO: 57-60.
Antitela koja se specifično vezuju za SOST polipeptid i blokiraju ili kompetitivno inhibiraju vezivanje SOST polipeptida za BMP, na primer blokiranjem ili inhibiranjem vezivanja za amino kiseline u BMP koje odgovaraju jednom ili više receptorskih vezujućih mesta tipa 1 i tipa II, mogu takođe da se specifično vežu za peptide koji obuhvataju amino kiselinsku sekvencu koja odgovara regionu srži SOST (amino kiseline na približnim pozicijama 57-146 SEQ ID NO:46). Polipeptidi koji obuhvataju region srži mogu takođe sadržati dodatne amino kiseline koje se pružaju na jednom ili oba, N-terminusu i C-terminusu, na primer, da uključe cisteinske ostatke koji mogu biti korisni za konjugiranje polipeptida sa molekulom nosačem. Reprezentativni polipeptidi srži humanog i pacovskog SOST, na primer, obuhvataju amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:94 i SEQ ID NO:95. Ovakva antitela mogu takođe vezati kraće polipeptidne sekvence. Reprezentativnie humane SOST peptidne sekvence srži obezbeđene su u SEQ ID NO:66-69 i reprezentativne pacovske SOST peptidne sekvence srži obezbeđene su u SEQ ID NO:70-73.
U drugom ostvarenju, antitela koja se specifično vezuju za SOST polipeptid oslabljuju
(inhibiraju, sprečavaju ili blokiraju, na primer smanjenje na statistički značajan način)
formiranje SOST homodimera. Pošto interakcije između SOST i BMP mogu uključiti homodimer SOST i homodimer BMP, antitelo koje sprečava ili oslabljuje formiranje homodimera SOST može tako menjati mineralnu gustinu kosti, poželjno povećati mineralnu gustinu kosti. U jednom ostvarenju, antitela koja se vezuju za region srži SOST sprečavaju formiranje homodimera. Ovakva antitela takođe mogu da se vežu za peptide koji obuhvataju susedne amino kiselinske sekvence koje odgovaraju regionu srži, na primer, SEQ ID NO: 74, 75 i 98 (SOST čoveka) i SEQ ID Nos: 76 i 99 (SOST pacova). Antitela koja se vezuju za epitop koji se nalazi na C-terminusnom regionu SOST polipeptida (na približnim amino kiselinskim pozicijama 147-190 ili SEQ ID NO: 65) mogu takođe oslabiti formiranje homodimera. Reprezentativni C-terminalni polipeptidi humanog i pacovskog SOST, na primer, sadrže amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 96 i SEQ ID NO: 97. Ovakva antitela mogu takođe da se vežu za kraće polipeptidne sekvence. Reprezentativne humane SOST C-terminalne peptidne sekvence obezbeđene su u SEQ ID NO:78-81 i reprezentativne pacovske SOST C-terminalne peptidne sekvence obezbeđene su u SEQ ID NO:86-88.
SOST polipeptidi i peptidi ovde otkriveni za koje se mogu specifično vezati antitela su korisni kao imunogeni. Ovi imunogeni iz ovog pronalaska mogu se koristiti za imunizovanje životinje da bi se dobio humoralni imuni odgovor koji rezultuje u proizvodnji antitela koja se specifično vezuju za vezivno mesto receptora tipa I ili tipa II ili oba, koji su locirani na BMP uključuju peptide dobijene od N-terminalnog regiona SOST ili mogu da spreče formiranje SOST homodimera.
Ovakvi SOST polipeptidi i peptidi koji su korisni kao imunogeni, mogu takođe biti korišćeni u metodama za pregledavanje uzoraka koji sadrže antitela, na primer uzoraka prečišćenih antitela, antiseruma ili supernatanta ćelijskih kultura ili bilo kog drugog biološkog uzorka koji može da sadrži jedno ili više antitela specifičnih za SOST. Ovi peptidi mogu se takođe koristiti u metodama za identifikovanje i selekciju iz biološkog uzorka jedne ili više B ćelija koje proizvode antitelo koje se specifično vezuju za SOST (na primer esej za formiranje plaka i slični). B ćelije se mogu zatim koristiti kao izvor SOST specifičnog polinukleotida koji kodira antitelo, koji se može klonirati i/ili modifikovati tehnikama rekombinantne molekularne biologije poznatim u nauci i ovde opisanim.
"Biološki uzorak" koji se ovde koristi, odnosi se u nekim ostvarenjima na uzorak koji sadrži najmanje jedno antitelo specifično za SOST polipeptid i biološki uzorak može biti obezbeđen iz uzorka krvi, uzorka biopsijc, cksplanta tkiva, kulture organa ili bilo kog drugog tkiva ili ćelijskog preparata iz subjekta ili biološkog izvora. Uzorak se dalje
može odnositi na tkivo ili ćelijski preparat u kome je poremećen morfološki integritet ili fizičko stanje, na primer disekcijom, disocijacijom, solubilizacijom, frakcionacijom, homogenizacijom, biohemijskom ili hemijskom ekstrakcijom, pretvaranjem u prah liofilizacijom, sonifikacijom ili na bilo koji drugi način preradom uzorka dobijenog iz subjekta ili biološkog izvora. Subjekat ili biološki izvor može biti humana ili ne-humana životinja, primarna ćelijska kultura (na primer B ćelije imunizovanein vitro),ili ćelijska linija adaptirana na kulturu, uključujući ali bez limitiranja na njih, genetski konstruisane ćelijske linije koje mogu sadržati hromozomalno integrisane ili epizomalne rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina, besmrtne ili sklone besmrtnosti ćelijske linije, hibridne somatske ćelijske linije, diferencirane ćelijske linije ili one koje se mogu diferencirati, transformabilne ćelijske linije i slične.
SOS peptidni imunogeni mogu takođe biti pripremljeni sintezom serije peptida koji, u totalu, predstavljaju kompletnu polipeptdinu sekvencu SOST polipeptida i gde svaka ima zajednički deo SOST amino kiselinske sekvence sa drugim peptidom u seriji. Ovaj preklapajući deo poželjno bi trebalo da bude najmanje četiri amino kiseline i još poželjnije 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselina. Svaki peptid se može koristiti za imunizaciju životinje, serum koji se sakupi iz životinje i testira u eseju da bi se identifikovalo koja životinja proizvodi antitela koja oslabljuju ili blokiraju vezivanje SOST za TGF-beta protein. Antitela se zatim pripremaju iz ovako identifikovanih imunizovanih životinja na osnovu metoda poznatih u nauci i ovde opisanih.
Antitela koja inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije mogu se lako pripremiti na osnovu otkrivenog i ovde obezbeđeog pronalaska. Posebno pogodna su anti-TGF-beta vezujući-protein antitela koja "specifično vezuju" TGF-beta vezujući protein sa SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 46 ili 65, ali ne vezuju druge TGF-beta vezujuće proteine kao što su Dan, Cerberus, SCGF ili Gremlin. U kontekstu ovog pronalaska, antitela se shvataju da uključuju monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, jednolančana, himerna, CDR-ugrađeni imunoglobulini, anti-idiopatična antitela i njihovi fragmenti, (na primer, Fab, Fab', i F(ab')2, Fv varijabilni regioni, ili regioni koji određuju komplementarnost). Kao što je gore diskutovano, za antitela se shvata da su specifična za (protiv) TGF-beta vezujući protein, ili za specifičnog člana TGF-beta familije ako se vezuju sa Kavećim od ili jednakim 10<7>M"<1>, poželjnije većim od ili jednakim sa otprilike 10<8>M"<1>, ili i ne vezuje se za druge TGF-beta vezujuće proteine, ili se vezuju sa Kamanjim ili jednakim sa 10<6>M"1' Afinitet antitela za svoj srodan antigen je takođe često izraženo kao konstanta disocijacije Kdi anti-SOST antitelo se specifično vezuje za člana TGF-beta familije ako se vezuje sa KDmanjom ili jednakom od otprilike 10"<5>M, još poželjnije sa manjim ili jednakim 10"6 M, još poželjnije sa manjom ili jednakom od IO"<7>M i još uvek poželjnije sa manjom ili jednakom od 10"<8>M. Dalje, antitela iz ovog pronalaska preferencijalno blokiraju, oslabljuju, ili inhibiraju (na primer statistički značajno smanjuju) vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Afinitet monoklonalnog antitela ili vezujućeg partnera kao i inhibicija vezivanje mogu se jednostavno odrediti od strane običnog naučnika (videti Scatchard et. al.,Ann. N. Y. Acad. Aci.51:660-672, 1949) Afinitet se takođe može odrediti pomoću površinske "plasmon" rezonance (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Za površinsku "plasmon" rezonancu, ciljni molekuli su imobilisani na čvrstoj fazi i izloženi ligandima na mobilnoj fazi koji se kreću kroz protočnu ćeliju. Ako se dogodi vezivanje liganda za imobilisan cilj, menja se lokalni refraktorni indeks, što dovodi do promene SPR ugla, koja se može posmatrati u stvarnom vremenu putem detektovanja promena intenziteta reflektovane svetlosti. Stope promene SPR signala mogu se analizirati da bi se dobile očigledne konstante stope za asocijacione i disocijacione faze vezujuće reakcije. Odnos ovih vrednosti daje očiglednu ekvilibrijumsku konstantu (afinitet)( videti,takođe, VVolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).
Antitelo na osnovu ovog pronalaska može pripadati imunoglobulinskoj klasi, na primer IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA i može biti bilo koje od četiri različita izotipa koji mogu formirati klasu (IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 humane IgG klase). Može se dobiti iz ili izvesti iz životinje, na primer, živine (na primer kokoške) ili sisara, koji uključuju ali nisu njima limitirani, miša, pacova, hrčka, zeca ili druge glodare, kravu, konja, ovcu, kozu, kamilu, čoveka ili drugog primata. Antitelo može biti (internalising) unutrašnje antitelo.
Metode koje su dobro poznate u nauci mogu se koristiti za dobijanje antitela, poliklonalnih antiseruma ili monoklonalnih antitela koja su specifična za TGF-beta vezujući protein kao što je SOST. Antitela takođe mogu biti proizvedena kao genetski konstruisani imunoglobulini (Ig) ili Ig fragmenti koji su dizajnirani da imaju poželjne osobine. Na primer, ilustracije radi i ne zbog ograničenja, antitela mogu uključiti rekombinantni IgG koji je himerni fuzioni protein koji ima najmanje jedan domen varijabilnog regiona (V) od prve sisarske vrste i najmanje jedan domen konstantnog regiona od druge udaljene sisarske vrste. Najčešće, himerno antitelo ima misije sekvence varijabilnog regiona i humane sekvence konstantnog regiona. Ovakav mišiji/humani himerni imunoglobulin može biti "humanizovan" usađivanjem regiona za određivanje komplementarnosti (CDR, Complementarv Determining regions) izvedenih iz mišijeg antitela koji obezbedjuju specifičnost vezivanja za antigen, u V region regiona okosnice dobijenog iz čoveka i konstantne regione dobijene iz čoveka. Fragmenti ovih molekula mogu se dobiti proteolitičkim sečenjem ili opcionalno, proteolitičkim sečenjem, nakon čega sledi blaga redukcija disulfidnih veza i alkilacija. Alternativno ovakvi fragmenti mogu se takođe dobiti tehnikama rekombinantnog genetičkog inžcnjerstva.
Određena poželjna ostvarenja su ona antitela koja inhibiraju ili blokiraju aktivnost TGF-beta vezujućeg proteina uin vitroeseju, kao što je ovde opisano. Osobine vezivanja antitela za TGF-beta vezujući protein mogu biti generalno procenjene pomoću metoda imunodetekcije uključujući na primer, esej imunoabsorbcije povezan sa enzimom (ELISA), imunoprecipitaciju, "imunoblotting", elektroforezu nasuprot struje, radioimunoeseje, "dot blot" eseje, eseje inhibicije i kompeticije i slične koji se mogu jednostavno izvesti od strane običnih naučnika( videti,takođe, U.S. Patent Nos. 4,376,110 i 4,486,530; Harlow et. al.,Antibodies: A Laboratorj Manual,Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
Imunogen može biti sastavljen od ćelija koje eksprimiraju TGF-beta vezujući protein, prečišćenih ili delimično prečišćenih TGF-beta vezujućih polipeptida, ili njihovih varijanti ili fragmenata (to jest peptida) ili peptida dobijenih iz TGF-beta vezujućih polipeptida. Ovakvi peptidi mogu se dobiti proteolitičkim sečenjem većeg polipeptida, rekombinantnom molekularnom metodologijom ili se mogu hemijski sintetisati. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju TGF-beta vezujuće proteine ovde su obezbeđene, tako da stručnjaci iz ove oblasti mogu rutinski da pripreme TGF-beta vezujuće proteine za upotrebu kao imunogena. Peptidi mogu biti hemijski sintetisani metodama koje su ovde opisane i poznate u nauci. Alternativno, peptidi se mogu generisati proteilitičkim sečenjem TGF-beta vezujućeg proteina i pojedinačni peptidi mogu biti izolovani metodama poznatim u nauci kao što su elektroforeza na poliakfilamidnim gelovima ili mnogobrojne tečne hromatografije ili druge metode za separaciju. Peptidi korisni kao imunogeni tipično mogu imati amino kiselinsku sekvencu sa najmanje 4 ili 5 uzastopnih amino kiselina iz amino kiselinske sekvence TGF-beta vezujućeg proteina kao što su one opisane ovde u pronalasku, i poželjno ima 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 ili 20 uzastopnih amino kiselina iz TGF-beta vezujućeg proteina. Određeni poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 6 ali ne više od 12 ili više uzastopnih amino kiselina iz sekvence TGF-beta vezujućeg proteina, i drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 20, ali ne više od 75 uzastopnih amino kiselina i drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže najmanje 21 ali ne više od 50 uzastopnih amino kiselina iz SOST polipeptida. Drugi poželjni peptidni imunogeni sadrže 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50 ili celi broj amino kiselina između i uključujući 21 i 100 uzastopnih amino kiselina i između 100 i 190 uzastopnih amino kiselina iz sekvence TGF-beta vezujućeg proteina.
Kao što je ovde razmatrano, poliklonalna antitela mogu biti jednosatvno generisana od strane običnog naučnika iz različitih toplokrvnih životinja kao što su konji, krave, različita živina, zečevi, miševi, ovce, koze, babuni ili pacovi. Tipično, TGF-beta vezujući protein ili njegov jedinstveni peptid od 13-20 amino kiselina ili kao što je ovde opisano (poželjno konjugovan sa hemocijaninom kapičastog puža putem unakrsnog povezivanja sa glutar aldehidom) se koristi za imunizaciju životinje putem intrapeirtonalne, intramuskularne, intraokularne, intradermalne ili subkutanozne (potkožne) injekcije zajedno sa Freund-ov kompletnim ili nekompletnim adjuvanomt ili Ribi Adjuvant Svstem (Corixa Corporation, Seatlle, WA). Videti, na primer, Harlow et.
al., već naveden. U osnovi, posle prve injekcije, životinje primaju jednu ili više "booster" (za pojačavanje) imunizacija na osnovu poželjnog rasporeda koji može varirati u zavisnosti od, između ostalog, antigena, adjuvanta (ako postoji) i/ili od određene životinjske vrste. Imuni odgovor se može posmatrati periodičnim puštanjem krvi životinje i pripremom i analizom seruma u imunoeseju, kao što je ELISA ili Ouchterlony-jev difuzioni esej ili slični, kako bi se odredio specifični titar antitela. Posebno poželjni poliklonalni antiserumi daće detektabilan signal u jednom od ovih eseja, kao što je ELISA, koji je poželjno najmanje tri puta veći od pozadine (šuma). Kada titar antitela dostigne plato u smislu njegoe reaktivnosti sa proteinom, veće količine antiseruma mogu se dobiti ili iskrvavljivanjem na nedeljnoj bazi ili potpunim uklanjanjem krvi iz životinje.
Poliklonalna antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili peptid mogu se zatim prečistiti iz takvih antiseruma, na primer afinitativnom hromatografijom pomoću proteina A. Alternativno, afinitativna hromatografija se može izvesti, naznačeno time da je TGF-beta vezujući protein ili peptid ili antitelo specifično za konstantni region Ig određene imunizovane životinjske vrste imobilisan na pogodnu čvrstu potporu.
Antitela za upotrebu u pronalasku uključuju monoklonalna antitela koja se pripremaju konvencionalnom imunizacijom i procedurama za ćelijsku fuziju kao što je ovde opisano i poznato u nauci. Monoklonalna antitela mogu sejednostavno generisati pomoću konvencionalnih tehnika (videti, na primer, Kohler et. al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds), Current Protocols in Immunologv, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); U.S. Patent Nos. RE32,011, 4,902,614, 4,543,439 i 4,411,993 koji su ovde ugrađeni u potpunosti referencama; viseti takođe Monoclonal Antibodies, Hvbridomas; A New Dimesion in Biological Analvses, Plenum Press, Kennett, McKearn i Bechtol (eds.) (1980); i Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlow i Lane (eds)., Cold Springs Harbor Laboratorv Press (1988); koji su takođe ovde ugrađeni u potpunosti referencama; Prickslev et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expresses in E. coli", u DNA Cloning 2: Expression Svstems, 2nd Edition, Glover et al. (eds), strana 93 (Oxford Universitv Press 1995)). Fragmenti antitela mogu se dobiti iz njih pomoću bilo koje pogodne standardne tehnike kao što je proteolitičko sečenje, ili opcionalno, proteolitičkim sečenjem (na primer upotrebom papaina ili pepsina) nakon čega sledi redukcija disulfidnih veza i alkilacija. Alternativno, ovakvi fragmenti takođe mogu biti generisani tehnikama rekombinantnog genetičkog inženjerstva.
Ukratko, u okviru jednog ostvarenja subjekat odnosno životinja kao što je pacov ili hrčak se imunizuje sa TGF-beta vezujućim proteinom ili delom njigovog regiona, uključujući peptide u okviru regiona, kao što je ovde opisano. Protein može biti pomešan sa adjuvantom kao što je Freund-ov kompletan ili nekompletan adjuvant ili Ribi adjuvant u cilju povećanja rezultujućeg imunog odgovora. Između jedne ili tri nedelje nakon inicijalne imunizacije životinja može biti reimunizovana sa još jednom "booster" imunizacijom, i testirana na reaktivnost na protein pomoću ovde opisanih eseja. Kada životinja dostigne plato u smislu njegove reaktivnosti na injektiran protein, ona se žrtvuje, i sakuplaju se organi koji sadrže veliki broj B ćelija kao što je slezina i limfni čvorvi. Pokupljene ćelijske suspenzije slezine i/ili limfnih čvorova se zatim fuzionišu sa pogodnim ćelijama mijeloma koje su senzitivirane na lek u cilju stvaranja "hibridoma" koji sekretuju monoklonalno antitelo. Pogodne mijeloma linije uključuju na primer, NS-0, SP20, NS1 (ATCC No. TIB 18) i P3X63 - Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580);)
Ćelije limfoida (na primer slezine) i ćelije mijeloma mogu se kombinovati u periodu od nekoliko minuta sa membranskim agensom koji potpomaže srvaranje fuzije, kao što je polietilen glikol ili nejonski deterdžent i zatim se u niskoj gustini zasejavaju na selektivni medijum koji podržava rast hibridoma ćelija, a ne podržava rast nefuzionisanih ćelija mijeloma. Nakon fuzije, ćelije se mogu zasejati na ploče za gajenje sa pogodnim selektivnim medijumom kao što je RPMI 1640, ili DMEM (Dulbekov Modifikovani Eagle-ov Medijum) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) kao i sa dodatnim sastojcima kao što je fetalni serum govečeta (FBS, to jest, od Hvclone, Logan, Utah, ili JRH Biosciences) Dodatno, medijum treba da sadrži reagens koji selektivno dozvoljava rast fuzionisanih ćelija slezine i mijeloma ćelija kao što je HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis. Missouri). Nakon oko sedam dana, dobijene fuzionisane ćelije ili hibridome mogu biti pregledane u cilju određivanja prisustva antitela koja su reaktivna sa TGF-beta vezujućim proteinom (u zavisnosti od upotrcbljenog antigena) i koja blokiraju, oslabljuju ili inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Poželjne su hibridome koje proizvode monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za sklerostin ili njihovu varijantu.
Širok dijapazon eseja može se iskoristiti za određivanje prisustva antitela koja su reaktivna na proteine iz ovog pronalaska, uključujući na primer, elektroforezu nasuprot struje, radioimunoeseje, radioimunoprecipitacije, esej imunoabsorbcije povezan sa enzimom (ELISA), imunoprecipitaciju, "dot blot" eseje, "western blot",
imunoprecipitaciju, inhibitorne ili kompetitivne eseje, i "sendvič" eseje( videti,U.S.
Patent Nos. 4,376,110 i 4,486,530; videti takođeAntibodies: A Laboratory Manual,Harlow i Lane (eds), Cold Spring Harbor Laboratorv (1988)). Hzxxibiridome se kloniraju na primer kloniranjem pomoću ograničenih razblaženja ili izolacijom plaka na mekanom agaru, i ponovnim izvođenjem eseja. Zato, mogu biti izolovane hibridome koje proizvode antitela koja su reaktivna protiv željenog proteina.
Monoklonalna antitela iz kultura hibridoma mogu se izolovati iz supernatanata kultura hibridoma. Alternativna metoda za proizvodnju mišijeg monoklonalnog antitela je injektiranje hibridoma ćelija u peritonealnu šupljinu sinergenskog miša, na primer miša koji je tretiran (na primer "pristane-primed") da bi se olakšalo formiranje "ascites" tečnosti (hidroperitoneum-akumulirana tečnost u peritonelnoj duplji), koja sadrži monoklonalno antitelo. Monoklonalna antitela mogu biti izolovana i prečišćena različitim dobro uspostavljenim tehnikama. Ovakve tehnike izolacije uključuju afinitativnu hromatografiju sa Protein-A sefarozom, hromatografiju isključivanja na osnovu veličine i jonsko-izmenjivačku hromatografiju( videti,na primer, Coligan - na stranama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," uMethods in Molecular Biology, Vol. 10,strane 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Monoklonalna antitela mogu biti prečišćena putem afinitativne hromatografije pomoću odgovarajućeg liganda odabranog na osnovu određenih osobina antitela (na primer izotipa lakog ili teškog lanca, specifičnosti vezivanja itd.). Primeri pogodnih liganda, imobilisanih na čvrstoj potpori, uključuju Protein A, Protein G, anti-konstantni region antitela (lakog lanac ili teškog lanca), anti-idiopatsko antitelo i za TGF-beta vezujući protein ili njegov fragment ili varijanta.
Dodatno, anti-TGF-beta vezujući protein antitelo iz ovog pronalaska može biti humano monoklonalno antitelo. Humana monoklonalna antitela mogu biti generisana bilo kojom od mnogobrojnih tehnika sa kojima će oni koji se bave naukom biti familijarni. Ovakve metode uključuju, ali bez ograničenja, transformaciju humanih ćelija periferne krvi (na primer sadrže B limfocite) Epstein Barr virusom (EBV),in vitroimunizaciju humanih B ćelija, fuziju ćelija slezine iz imunizovanih transgenih miševa koji nose insertovane humane imunoglobulinske gene, izolaciju humanih fagnih biblioteka V regiona imunoglobulina ili druge procedure poznate u nauci koje se baziraju na ovde opisanom otrkriću. Na primer, humana monoklonalan antitela mogu se dobiti iz transgenih miševa koji su konstruisani da proizvode specifična humana antitela kao odgovor na izazov sa antigenom. Metode za dobijanje humanih antitela iz transgenih miševa opisane su na primer u Green et. al.,Nature Genet.7:13, 1994; Lonberg et al.,Nature368:856, 1994; Tavlor et al.,Int. Immun.6:579, 1994; U.S. Patent No. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58; Jakobovits et. al., 1995Ann. N. Y. Acad. Sci.764:525-35. U ovoj tehnici elementi humanih lokusa za teški i laki lanac se unose u soj miša koji je izveden iz embrionskih stem ćelijskih linija koje sadrže ciljana oštećenja u endogenim lokusima za teški i laki lanac.( Videtitakođe Bruggemann et al.,Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58 (1997)). Na primer, humani imunoglobulinski transgeni mogu biti mini-genski konstrukti ili translokusi na kvaščevim veštačkim hromozomima, koji podležu B-ćelijski-specifičnim DNK rearanžmanima i hipermutaciji u mišijem limfoidnom tkivu. Humana monoklonalna antitela mogu se dobiti imunizacijom transgenih miševa koji zatim mogu proizvesti humana antitela specifična za antigen. Limfoidne ćelije iz imunizovanih transgenih miševa mogu se koristiti za proizvodnju humanih hibridoma koje sekretuju antitela na osnovu metoda koje su ovde opisane. Poliklonalni serumi koji sadrže humana antitela mogu se dobiti iz krvi imunizovanih životinja.
Još jedna metoda za generisanje humanih monoklonalnih antitela specifičnih za TGF-beta vezujući protein uključuje prevođenje u besmrtno stanje humanih ćelija periferne krvi putem EBV transformacije.Videti,takođe, U.S: Patent No. 4,464,456. Ovakva besmrtna B ćelijska linija (ili limfoblastoidna ćelijska linija) koja proizvodi monoklono antitelo koje se specifično vezuje za TGF-beta vezujući protein (ili njegovu varijantu ili fragment) može se identifikovati metodama imunodetekcije koje su ovde obezbeđene, na primer ELISA testom i zatim izolovati standardnim tehnikama kloniranja. Stabilnost limfoblastoidne ćelijske linije koja proizvodi anti-TGF-beta vezujući protein antitelo može se poboljšati fuzionisanjem transformisane ćelijske linije sa mišijim mijelomom da bi se dobila mišija-humana hibridna ćelijska linija, na osnovu metoda poznatih u nauci( videti,takođe,Glaskv et.al.,Hybridoma8:377-89 (1989)). Još jedna metoda za generisanje humanih monoklonalnih antitela jein vitroimunizacija, koja uključuje povezivanje humanih B ćelija slezine sa antigenom, nako čega sledi fuzija vezanih (primed) B ćelija sa heterohibridnim fuzionim partnerom.Videti,takođe,Boerner et al.,1991 J. Immunol.147:86-95.
U određenim ostvarenjima, B ćelija koja proizvodi anti-SOST antitelo je odabrana i klonirani su varijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca iz B ćelije, na osnovu tehnika molekularne biologije poznatih u nauci (WO 92/02551; US patent 5,627,052; Babcook et al.,Proc. Natl. Acad Sci. USA93:7843-48 (1996) i koje su ovde opisane. Poželjne B ćelije iz imunizovane životinje izolovane su iz slezine, limfnog čvora ili uzorka periferne krvi, odabiranjem ćelije koja proizvodi antitelo koje se specifično vezuje za SOST. B ćelije mogu takođe biti izolovane iz čoveka, na primer iz uzorka periferne krvi. Metode za detektovanje pojedinačnih B ćelija koje proizvode antitelo sa željenom specifičnošću poznate su u nauci, na primer formiranje plaka, odabiranje ćelija koje su aktivirane fluorescenciojm,in vitrostimulacijom, nakon čega sledi detekcija specifičnog antitela i slični. Metode za odabiranje B ćelija koje proizvode specifično antitelo uključuju na primer, pripremu suspenzije pojedinačne ćelije B ćelija u mekom agaru koji sadrži SOST ili njegov peptidni fragment. Vezivanje specifičnog antitela koje se proivodi od strane B ćelije za antigen rezultuje u formiranju kompleksa, koji može da se vidi kao imunoprecipitat. Nakon što se odaberu B ćelije koje proizvode specifično antitelo, specifični geni za antitelo mogu se klonirati izolovanjem i umnožavanjem DNK ili iRNK na osnovu metoda poznatih u nauci i koje su ovde opisane.
Za određene potrebe, fragmenti antitela na anti-TGF-beta vezujući protein mogu biti poželjni. Fragmenti antitela F(ab')?, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd, zadržavaju mesto za vezivanje antigena od celog antitela i zato se vezuju za isti epitop. Ovi antigen-vezujući fragmenti izvedeni iz antitela mogu se dobiti, na primer proteolitičkom hidrolizom antitela, na primer digestijom sa pepsinom ili papainom čitavih antitela na osnovu konvencionalnih metoda. Kao ilustracija, fragmenti antitela mogu se proizvesti enzimatskim sečenjem antitela sa pepsinom pri čemi se dobija 5S fragment označen kao F(ab')2. Ovaj fragment može se dalje šeći pomoću tiol redukujućeg agensa da bi se proizveo 3.5S Fab' monovalentni fragment. Opcionalno, reakcija sečenja može se izvesti upotrebom grupa za blokiranje za sulfhidrilne grupe, što rezultuje u sečenju dizulfidnih veza. Kao alternativa, enzimatsko sečenje pomoću popaina proizvodi direktno dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment. Ove metode su opisane na primer od strane Goldenberg, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff et al.,Arch.Biochem. Biophys.59:230, 1960; Porter,Biochem J.73:119, 1959; Edelman et al., uMethods in Enzymology7:422 (Academic Press 1967); i Coligan na stranama 2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4. Druge metode za sečenje antitela, kao što je odvajanje teških lanaca da bi se formirali monovalentni fragmenti lakih-teških lanaca (Fd), dalje sečenje fargmenata ili druge enzimske, hemijske ili genetičke tehnike, takođe se mogu koristiti, sve dok se fragmenti vezuju za antigen koji prepoznaje intaktno antitelo
Fragment antitela može takođe biti sintetički ili genetski konstruisan protein koji deluje kao antitelo zato što se vezuje za specifičan antigen i formira kompleks. Na primer, fragmenti antitela uključuju izolovane fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona lakog lanca, "Fv" fragmentata koji se sastoje od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, rekombinantnih jednolančanih polipeptidnih molekula u kojima su varijabilni regioni lakih i teških lanaca spojeni peptidnim spojem (linker) (scFv proteini) i minimalne jedinice prepoznavanja koji se sastoje od amino kiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region. Antitelo iz ovog pronalaska poželjno sadrže najmanje jedan domen varijabilnog regiona. Domen varijabilnog regiona može biti bilo koje veličine ili amino kiselinskog sastava i generalno će sadržati najmanje jednu hipervarijabilnu amino kiselinsku sekvencu odgovornu za vezivanje antigena i koja je smeštena do ili u fazi sa jednom ili više sekvenci okosnica. U opštim uslovima domen varijabilnog (V) regiona može biti bilo koji pogodan aranžman imunoglobulinskih teških (VH) i/ili lakih (Vl) lanaca varijabilnih domena. Zato, na primer, domen V regiona može biti monomer i VHili VLdomen koji je sposoban za nezavisno vezivanje antigena sa prihvatljivim afinitetom. Alternativno, domen V regiona može biti dimer i sadržati Vh-Vh, Vh -Vl ili Vl-Vldimere. Poželjno, dimerni V region sadrži najmanje jedan Vhi najmanje jedan Vllanac koji su ne-kovalentno povezani (ovde i od sada označeni kao Fv). Ako je potrebno, lanci mogu biti kovalentno vezani ili direktno na primer preko disulfidne veze između dva varijabilna domena ili preko spoja (linkera) na primer peptidnog spoja (linker) da bi se formirao jednolančani Fv (scFv).
Domen varijabilnog regiona može biti bilo koji prirodni varijabilni region ili njegova konstruisna verzija. Pod konstruisanom verzijom misli se na domen varijabilnog regiona koji je kreiran upotrebom tehnika konstruisanja i rekombinantne DNK. Ovakve napravljene verzije uključuju one kreirane na primer, od varijabilnog regiona specifičnog antitela putem insercije, delecija ili promena u ili promena na amino kiselinskoj sekvenci specifičnog antitela. Posebni primeri uključuju konstruisane domene varijabilnih regiona koji sadrže makar jedan CDR (region za određivanje komplementarnosti) i opcionalno jednu ili više amino kiselinski sekvenci regiona okosnice od prvog antitela i ostatak domena varijabilnog regiona od drugog antitela.
Domen varijabilnog regiona može biti kovalentno vezan na C-terminalnoj amino kiselini za najmanje jedan drugi domen antitela ili njegov fragment. Zato, na primer, VHdomen koji je prisutan u domenu varijabilnog regiona može biti povezan sa imunoglobulinskim CH1 domenom ili njegovim fragmentom. Slično tome VLdomen može biti povezan sa Ckdomenom ili njegovim fragmentom. Na ovaj način, na primer, antitelo može biti Fab fragment, naznačeno time da domen za vezivanje antigena sadrži povezane VHi Vldomene kovalentno vezane na njihovim C-terminusima sa CHI i Ckdomenom. CHI domen može biti produžen sa dodatnim amino kiselinama, na primer da bi se obezbedio region zgloba (hinge) ili deo domena regiona zgloba kao što se nalazi u Fab' fragmentu, ili da bi se obezbedili dalji domeni, kao što su domeni antitela CH2 i CH3.
Druga forma fragmenta antitela je peptid koji sadrži jedan region za određivanje kompelmentarnosti (CDR). CDR peptidi ("minimalne jedinice prepoznavanja") mogu se dobiti konstruisanjem polinukleotida koji kodiraju CDR antitela od interesa. Ovakvi polinukleotidi se pripremaju na primer, upotrebom lančane reakcije polimeraze, da bi se sintetisao varijabilni region pomoću iRNK ćelija koje proizvode antitelo kao matrice( videti,na primer, Larrick et al.,Methods: A Companion to Methods in Enzymology2.106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipualtion of Monoclonal Antibodies," uMonoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application,Ritter et al.
(eds.), strana 166 (Cambridge University Press 1995); i Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," uMnoclonal Antibodies: Principles and Applications,Birch et al., (eds), strana 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995).
Alternativno, antitelo može biti rekombinantno ili konstruisano antitelo dobijeno tehnikama rekombinantne DNK koje uključuju manipulaciju i ponovnu ekspresiju DNK kodirajućeh varijabilnih i/ili konstantnih regiona antitela. Ovakva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz DNK biblioteka uključujući na primer fagne biblioteke antitela( videtiChiswell and McCafferty,Tibtech.10:80-84 (1992) ili se može po želji sintetisati. Standardne procedure molekularne biologije i/ili hernije mogu se koristiti radi sekvenciranja i manipulacije DNK, na primer, da bi se uneli kodoni u cilju kreiranja cisteinskih ostataka ili da bi se modifikovale, dodale, deletirale amino kiseline ili domeni, ako je potrebno.
Himerna antitela, specifična za TGF-beta vezujući protein i koja uključuju humanizovana antitela, mogu takođe biti generisana na osnovu ovog pronalaska. Himerno antitelo ima najmanje jedan domen konstantnog regiona izveden iz prve sisarske vrste i najmanje jedan domen varijabilnog regiona izveden iz druge različite sisarske vrste( videti,takođe, Morrison et al,Proc. Natl. Acad. Sci USA,81:6851-55
(1984)). U poželjnim ostvarenjima himerno antitelo se može konstruisati kloniranjem polinukleotidne sekvence koja kodira najmanje jedan domen varijabilnog regiona izveden iz ne-humanog monoklonalnog antitela, kao što je varijabilni region izveden iz mišijeg, pacovskog ili od hrčka monoklonalnog antitela, u vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan humani konstantni region( videti,takođe, Shin et. al.,Methods in Enzymol.178:459-76; Walls et al.,Nucleic Acids Res.21:2921-29 (1993)). Dajemo kao primer, da se polinukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca mišijeg monoklonalnog antitela može ubaciti u vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca. U odvojenom vektoru, polinukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca monoklonalnog antitela može se klonirati "in frame" (u fazi) sa sekvencama koje kodiraju konstantni region humanog IgG, na primer konstantni region humanog IgGl. Određeni humani konstantni region koji je odabran može zavisiti od efektornih funkcija koje se žele za određeno antitelo (na primer, fiksiranje komplementa, vezivanje za određeni Fc receptor, itd.). Poželjno, konstruisani vektori biće transfektovani u eukariotske ćelije za stabilnu ekspresiju himernog antitela. Druga metoda poznata u nauci za generisanje himernih antitela je homologa rekombinacija (na primer, U.S. Patent No. 5,482,856).
Ne-humano/humano himerno antitelo može se dalje konstruisati genetički da bi se dobilo "humanizovano" antitelo. Ovakvo humanizovano antitelo može da sadrži mnoštvo CDR-ova izvedenih iz imunoglobulina ne-humane sisarske vrste, najmanje jedan humani region okosnice (framework) i najmanje jedan konstantan region humanog imunoglobulina. Korisne strategije za dizajniranje humanizovanih antitela mogu uključiti, na primer, u cilju ilustracije a ne ograničenja, identifikaciju humanih varijabilnih regiona okosnice, koji su najviše homologi sa ne-humanim regionima okosnice himernog antitela. Bez namere da se vezujemo teorijom, ovakva strategija može da poveća verovatnoću da će humanizovano antitelo zadržati specifični afinitet vezivanja za TGF-beta vezujući protein, koji u nekim poželjnim ostvarenjima može biti u značajnoj meri isti afinitet za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment, i u određenim poželjnim ostvarenjima može biti veći afinitet za TGF-beta vezujući protein.Videti,na primer, Jones et al., 1986Nature321:522-25; Riechmann et al. 1988Nature332:323-27. Zato dizajniranje ovakvog humanizovanog antitela može uključiti određivanje konformacija CDR petlje i strukturnih determinanti ne-humanih varijabilnih regiona, na primer kompjuterskim modelovanjem i zatim poređenjem CDR petlji i determinanti sa poznatim humanim CDR strukturama petlji i determinanti.Videti,na primer, Padlan et al., 1995FASEB9:133-39; Chothia et al., 1989Nature,342:377-383. Kompjutersko modelovanje se takođe može koristiti za poređenje humanih strukturnih matrica odabranih na osnovu homologije sekvenci sa ne-humanim varijabilnim regionima.Videti,na primer, Bajorath et al., 1995Ther. Immunol.2:95-103; EP-0578515A3. Ako humanizacija ne-humanih CDR-ova rezultira u smanjenju afiniteta vezivanja, kompjutersko modelovanje može pomoći u identifikaciji specifičnih amino kiselinskih ostataka koji se mogu promeniti mutagenezom usmerenom na mesto (site directed) ili drugim tehnikama mutageneze da bi se delimično, kompletno ili supra-optimalno (to jest povećanje na nivo koji je veći od onog kod ne-humanizovanog antitela) restaurirao afinitet. Oni koji se bave naukom su familijarizovani sa ovim tehnikama i lako će shvatiti mnogobrojne varijacije i modifikacije koje se mogu primeniti na ove strategije dizajniranja.
Jedna ovakva metoda za pripremu humanizovanog antitela se zove površinsko premazivanje (veneerging). Kao što se ovde koristi, "površinsko premazani FR-ovi" i "rekombinantno površinsko premazani FR-ovi" odnose se na selektivnu zamenu FR ostataka iz, na primer glodarskog V regiona lakog ili teškog lanca, sa humanim FR ostacima, u cilju obezbeđivanja ksenogenih molekula koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje zadržava u najvećoj meri pakovanje strukture prirodnog (native) FR polipeptida. Tehnike površinskog premazivanja su bazirane na razumevanju da su karakteristike vezivanja liganda antigen-vezujućeg mesta određene primarno strukturom i relativnom dispozicijom CDR grupa teškog i lakog lanca u okviru antigen-vezujuće površine. Davies et al.,Ann. Rev. Biochem.59:439-73, 1990. Usled toga, specifičnost vezivanja antigena može se sačuvati u humanizovanom antitelu, naznačeno time da se oprezno održavaju CDR strukture, njihove međusobne interakcije i njihove interakcije sa ostatkom domena V regiona. Upotrebom tehnika površinskog premazivanja, spoljašnji (na primer dostupni rastvaraču) FR ostaci koji su lako dostupni imunom sistemu, selektivno se zamenjuju sa humanim ostacima da bi se obezbedo hibridni molekul koji obuhvata ili slabo imunogenu ili u najvećoj meri ne-imunogenu premazanu površinu.
Proces površinskog premazivanja čini upotrebu dostupnih podataka o sekvencama za humane varijabilne domene antitela opisane od strane Kabat et al., uSeguences of Proteins of Immunological Interesi,4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), dopunjeni u KABAT bazi podataka i drugim dostupnim SAD ili stranim bazama podataka (i nuklenskih kiselina i proteina). Dostupnost rastvaračima amino kiselina V regiona može se izvesti iz poznate trodimenzionalne strukture za humane i misije fragmente antitela. Inicijalno, FR-ovi varijabilnih domena molekula antitela od interesa se porede sa odgovarajućim FR sekvencama humanih varijabilnih domena dobijenih od gore identifikovanih izora. Najviše homologi humani V regioni se zatim porede ostatak po ostatak sa odgovarajućim mišijim amino kiselinama. Ostaci u mišijem FR koji se razlikuju od humanih odgovarajućih ostataka se zamenjuju sa ostacima prisutnim u humanoj polovini pomoću rekombinantnih tehnika koje su poznate u nauci. Zamena ostataka se izvodi samo u polovinama koje su najmanje delimično izložene (dostupne rastvaraču) i radi se oprezno pri zameni amino kiselinskih ostataka koji mogu imati značajni efekat na tercijarnu strukturu domena V regiona, kao što su prolin, glicin i naelektrisane amino kiseline.
Na ovaj način, dobijena površinski premazana antigen-vezujuća mesta se dizajniraju da bi zadržala glodarske CDR ostatke, ostatke značajno blizu CDR-ova, ostatke identifikovane kao ukopane ili u najvećoj meri ukopane (nedostupne rastvaraču), ostatke za koje se veruje da učestvuju u ne-kovalentnim (na primer elektrostatičkim i hidrofobnima) kontaktima između domena lakih i teških lanaca i ostatke iz konzerviranih strukturnih regiona FR-ova za koje se veruje da utiču na "kanonsku" tercijarnu strukturu CDR petlji. Ovi kriterijumi za dizajniranje se zatim koriste za pripremu rekombinantnih nukleinskih sekvenci koje kombinuju CDR-ove i lakog i teškog lanca od mesta za vezivanje antigena u FR-ovima koji deluju humano, koji se mogu upotrebiti za transfekciju sisarskih ćelija za ekspresiju rekombinantnih humanih antitela koja pokazuju antigensku specifičnost molekula antitela glodara.
Dodatna metoda za odabiranje antitela koja se specifično vezuju za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment je izlaganje faga (phage displav).Videti,na primer, Winter et al., 1994Annu. Rev. Immunol.12:433-55; Burton et al., 1994Adv. Immunol.57:191-280. Humane ili mišije kombinatorne genske biblioteke varijabilnog regiona imunoglobulina mogu se kreirati u fagnim vektorima koji se pregledaju da bi se odabrali Ig fragmenti (Fab, Fv, sFv ili njihovi multimeri) koji se vezuju specifično za TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili fragment.Videti,na primer, U.S. Patent No. 5,223,409; William D. Huse et al., "Generation of Large Combinational Librarv of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda"Science246:1275-81 December 1989; videti L. Sastrv ct al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalvtic Antibodies: Construction of Heavy Chain Variaible Region-Specific cDNK library"Proc. Natl. Acad Sci. USA86:5728-32 August 1989; videti takođe Michelle Alting-Mees et al, "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Altrenativno to Hvbridomas",Strategies in Molecular Biology3:1-9 January 1990; Kang et al., 1991Proc. Natl. Acad Sci. USA88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992,J. Molec. Biol.227:381-388; Schlebusch et al., 1997Hybridoma16:47-52 i reference citirane ovde). Komercijalni sistem je dostupan od Startagene (La Jolla, California) koji omogućava proizvodnju antitela putem tehnika rekombinacije. Ukratko, iRNK se izoluje iz populacije B ćelija i koristi za kreiranje cDNK ekspresione biblioteke teškog i lakog lanca imunoglobulina u A,ImmunoZap<IM>(H) i A.ImmunoZap™(L) vektorima. Pozitivne plake se zatim mogu prevesti u ne-litički plazmid koji omogućava visok nivo ekspresije fragmenata monoklonalnog antitela uE. coli.Alternativno, biblioteka koja sadrži mnoštvo polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente varijabilnog regiona Ig mogu se ubaciti u genom filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili njegova varijanta, u fazi sa sekvencom koja kodira protein omotača faga. Fuzioni protein može biti fuzioni protein omotača sa domenom varijabilnog regiona lakog lanca i/ili sa domenom varijabilnog regiona teškog lanca. Na osnovu određenih ostvarenja, imunoglobulinski Fab fragmenti mogu se takođe izložiti na čestici faga( videti,na primer U.S. Patent No. 5,698,426). Ovi vektori se mogu pregledati pojedinačno ili ko-eksprimirani da bi se formirali Fab fragmenti ili antitela( videtiHuse et. al, već navedeni;videtitakođe Sastrv et. al., već naveden).
Slično, delovi ili fragmenti, kao što su Fab i Fv fragmenti antitela mogu se takođe konstruisati upotrebom konvencionalne enzimatske digestije ili tehnika rekombinantne DNK, da bi se ugradili varijabilni regioni gena koji kodiraju antitelo specifično vezujuće antitelo. U okviru jednog ostvarenja, geni koji kodiraju varijabilbi region iz hibridome koja eksprimira monoklonalno antitelo od interesa se umnožavaju pomoću nukleotidnih prajmera za varijabilni regin. Ovi prajmeri mogu biti sintetisani od strane naučnika ili mogu biti kupljeni od komercijalno dostupnih izvora.( Videti,na primer, Stratagene (La Jolla, California), koji prodaje prajmere za mišije i humane varijabilne regione uključujući između ostalog, prajmere za VHa, Vnb, VHc, Vna, Cm, Vli Clregione). Ovi prajmeri mogu biti upotrebljeni za umnožavanje varijabilnih regiona teških ili lakih lanaca koji se zatim mogu ubaciti u vektore kao što su ImmunoZAP™ H ili ImmunoZAP™ L (Stratagene). Ovi se vektori zatim mogu ubacitiu E. coli,kvasac ili na sisarima bazirane sisteme za ekspresiju. Primenom ovih tehnika, velike količine jednolančanog proteina koji sadrži fuziju Vhi Vldomena može se proizvesti( videtiBird et. al.,Science242:423-426, 1988). Pored toga, ovakve tehnike se mogu koristiti za promenu "mišijeg" antitela u "humano" antitelo, bez promene specifičnosti vezivanja antitela.
U određenim posebnim ostvarenjima pronalaska, kombinatorne fagne biblioteke mogu se takođe koristiti za humanizaciju ne-humanih varijabilnih regiona.Videti,na primer, Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader et al., 1998Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:8910-15. Fagna biblioteka se može pregledati da bi se odabrao fragment varijabilnog regiona Ig od interesa pomoću metoda imunodetekcije poznatih u nauci i koje su ovde opisane i DNK sekvence ubačenog imunoglobulinskog gena u fagu odabrane na taj način mogu se odrediti standardnim tehnikama.Videti,Sambrook et al., 2001Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press. Odabrana Ig-kodirajuća sekvenca može se zatim klonirati u drugu pogodan vektor za ekspresiju Ig fragmenta ili opcionalno se može klonirati u vektor koji sadrži konstantne regione Ig, za ekspresiju celih imunoglobulinskih lanaca.
U određenim drugim ostvarenjima ovaj pronalazak razmatra SOST specifična antitela koja su multimerni fragmenti antitela. Korisne metodologije su otkrivene generalno, na primer u Havden et al., 1997,Curr. Opin. Immunol.9:201-12; Coloma et al., 1997Nat. Biotechnol.15:159-63. Na primer, multimerni fargmenti antitela mogu se kreirati tehnikama sa fazima da bi se formirala miniantitela (U.S. Patent No. 5,910,573) ili diatela (Holliger et al., 1997,Cancer Immunol. Immunother.45:128-130).
U određenim ostvarenjima pronalaska, antitelo specifično za SOST, može biti antitelo koje se eksprimira kao intracelulami protein. Ovakva intracelularna antitela se nazivaju i intratela i mogu sadržati Fab fragment ili poželjno scFv fragment( videti,na primer, Lecefert et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:4764-49 (2001). Regioni okosnice koji okružuju CDR regione mogu biti modifikovani da bi se poboljšali nivoi ekspresije i rastvorljivost intratela u intracelularnom redukujućem okruženju( videti,na primer, Worn et al.,J. Biol. Chem.275:2795-803 (2000). Intratelo može biti usmereno na određenu ćelijsku lokaciju ili organelu, na primer konstruisanjem vektora koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilne regione intratela koji mogu biti operativno fuzionisani sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira određeni ciljni antigen u ćeliji( videti,na primer, Graus-Porta et al.Mol. Cell. Biol.15:1182-91 (1995); Lener et al.,Eur. J. Biochem.267:1196-205 (2000)). Intratelo može biti ubačeno u ćeliju putem različitih tehnika dostupnih naučnicima uključujući preko vektora za gensku terapiju ili lipidne mešavine (na primer Provectin™ proizveden od strane Imgenex Corporation, San Diego, CA) ili na osnovu metoda fotohemijske internalizacije.
Ubacivanje amino kiselinskih mutacija u molekul imunoglobulina specifičnog za TGF-beta vezujući protein može biti korisno radi povećanja specifičnosti ili afiniteta za TGF-beta vezujući protein ili da bi se promenila efektorna funkcija. Imunoglobulini sa višim afinitetom za TGF-beta vezujući protein mogu biti generisani putem mutageneze usmerene na mesto određenih ostataka. Trodimenzionalno molekularno modelovanje pomoću kompjutera može se upotrebiti radi identifikovanja amino kiselinskih ostataka koji treba da se promene u cilju poboljšanja afiniteta za TGF-beta vezujući protein.Videti,na primer, Mountain et al., 1992,Biotechnol. Genet. Eng. Rev.10:1-142. Alternativno, kombinatorne biblioteke CDR-ova mogu biti generisane u Ml3 fagu i pregledane za imunoglobulinske fragmente sa poboljšanim afinitetom.Videti,na primer, Glaser et al., 1992,J. Immunol.149:3903-3913; Barbas et al., 1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3908-13; U.S. Patent No. 5,792,456.
Efektorne funkcije mogu biti promenjene putem mutageneze usmerene na mesto (site-directed).Videti,na primer, Duncan et al., 1988Nature332:563-64; Morgan et al., 1995Immunology86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997Biotechniques23:830-34. Na primer, mutacija mesta za glikozilaciju na Fc delu imunoglobulina može da promeni sposobnost imunoglobulina da fiksira komplement.Videti,na primer, Wright et al., 1997.Trends Biotechnol.15:26-32. Druge mutacije u domenima konstatnog regiona mogu promeniti sposobnost imunoglobulina da fiksira komplement ili da utiču na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela.Videti,na primer, Duncan et al., 1988Nature332:563-64; Morgan et al., 1995lmmunology86:319-24; Sensel et al., 1997Mol. Immunol.34:1019-29.
Na osnovu određenih ostvarenja, ne-humani, humani ili humanizovani varijabilni regioni teškog i lakog lanca bilo kog molekula Ig koji je ovde opisan mogu biti konstruisani kao jednolančani Fv (scFv) polipeptidni fragmenti (jednolančana antitela).Videti,na primer, Bird et al., 1988Science242:423-426; Huston et al., 1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883. Multifunkcionalni scFv fuzioni proteini mogu biti generisani povezivanjem polinukleotidne sekvence koja kodira scFv polipeptid u fazi sa najmanje jednom polinukleotidnom sekvencom koja kodira neki od mnogih poznatih efektornih proteina. Ove metode su poznate u nauci i otkrivene su, na primer u EP-B1-0318554, U.S. Patent No. 5,132,403, U.S. Patent No. 5,091,513 i U.S. Patent No. 5,476,786. Kao primer, efektorni proteini mogu da obuhvate sekvence konstantnih regiona imunoglobulina.Videti,na primer, Hollenbaugh et al., 1995J. Immunol. Methods188:1-7. Drugi primeri efektornih proteina su enzimi. U ne-limitirajućiem primeru ovakav enzim može da obezbedi biološku aktivnost za terapeutske svrhe( videti,na primer, Siemers et al., 1997Bioconjug. Chem.8:510-19) ili može obezbediti detektabilnu aktivnost, kao što je konverzija katalizovana peroksidazom rena bilo kog od brojnih poznatih substrata u detektabilni proizvod za dijagnostičke upotrebe. Još neki primeri scFv fuzionih proteina uključuju Ig-toksin fuzije ili imunotoksine, naznačeno time daje scFv polipeptid povezan sa toksinom.
scFv ili bilo koji fragment antitela koji je ovde opisan može u određenim ostvarenjima biti fuzionisan sa peptidnim ili polipeptidnim domenima koji dozvoljavaju detekciju specifičnog vezivanja između fuzionog proteina i antigena (na primer TGF-beta vezujući protein). Na primer, domen fuzionog polipeptida može biti afinitativni "tag"
(obeleživač) polipeptid za detekciju vezivanja scFv fuzionog proteina za TGF-beta vezujući protein pomoću različitih tehnika sa kojima će naučnici iz ove oblasti biti familijarni. Primeri "tag" (obeleživač) polipeptida, uključuju avidin, streptavidin ili His (na primer polihistidin). Tehnike detekcije mogu takođe uključiti na primer, vezivanje fuzionog proteina sa avidinom ili streptavidinom za biotin ili za sekvence koje oponašaju biotin( videti,na primer, Luo et al., 1998J. Biotechnol.65:225 i reference citirane ovde), direktnu kovalentnu modifikaciju fuzionog proteina sa detektabilnim delom (polovinom) (na primer polovina za obeležavanje), neko valentno vezivanje fuzionog proteina sa specifično obeleženim reporter molekulom, enzimatsku modifikaciju detektabilnog supstrata od strane fuzionog proteina koji uključuje deo koji poseduje enzimatsku aktivnost ili imobilizaciju (kovalentnu ili neko valentnu) fuzionog proteina na potpori čvrste faze. Drugi korisni afinitativni polipeptidi za konstruisanje scFv fuzionih proteina mogu uključiti streptavidin fuzione proteine, kao što je otkriveno u WO 89/03422, U.S: 5,489,528, U.S: 5,672,691, WO 93/24631, U.S: 5,168,049, U:S: 5,272,254; avidin fuzione proteine( videti,na primer, EP 511,747); enzim kao glutation-S-transferaza; i protein A polipeptidStaphylococcus aureus.
Polinukleotidi koji kodiraju antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za TGF-beta vezujući protein, kao što je ovde opisano, mogu biti propagirani i eksprimirani na osnovu bilo koje od mnogih dobro poznatih procedura za isecanje, ligaciju, transformaciju i transfekciju upotrebom mnogobrojnih poznatih vektora. Zato, u određenim ostvarenjima ekspresija fragmenta antitela može biti poželjna u prokariotskom domaćinu kao što jeEscherichia coli ( videti,na primer, Pluckthunet al.,1989Methods Enzymol.178:497-515). U određenim drugim ostvarenjima ekspresija antitela ili fragmenta antitela može biti poželjna u eukariotskoj domaćinskoj ćeliji, uključujući kvasac (na primer,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombeiPichia pastoris),životinjskim ćelijama (uključujući sisarske ćelije) ili biljnim ćelijama. Primeri pogodnih životinjskih ćelija uključuju, ali bez ograničavanja, mijeloma (kao mišija NSO linija), COS, CHO ili hibridoma ćelije. Primeri biljnih ćelija uključuju ćelije duvana, kukuruza, soje i pirinča.
Jednom kada se dobiju pogodna antitela, ona se mogu izolovati ili prečistiti putem mnogobrojnih tehnika poznatih onima koji se bave naukom (videti Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlow and Lane (eds.) Cold Spring Harbour Press, 1988). Pogodne tehnike uključuju pepridne ili proteinske afinitativne kolone (uključujući upotrebu anti-konstantnih regiona antitela vezanih za matriks kolone), HPLC, ili RP-HPLC, prečišćavanje na protein A i protein G kolonam ili bilo koju kombinaciju ovih tehnika.
c. Mutantni TGF-beta vezujući proteini
Kao što je opisano ovde i dalje u primerima (primeri 8 i 9) promenjene verzije TGF-beta vezujućeg proteina koje kompetiraju sa sposobnošću nativnog TGF-beta vezujućeg proteina da blokira aktivnost određenog člana TGF-beta familije trebalo bi da dovedu do povećane gustine kosti. Zato mutantiTGF-beta vezujućeg proteina koji se vezuju za člana TGF-beta familije koji nisu inhibirali funkciju člana TGF-beta familije ispuniće kriterijume. Mutantne vezrije moraju efektivno da kompetiraju sa endogenim inhibitornim funkcijama TGF-beta vezujućeg proteina.
d. Proizvodnja proteina
Ovde opisani peptidi uključuju TGF-beta vezujući protein skelrostin i njegove varijante i antitela ili njihove fragmente koji se specifično vezuju za sklerostin. Polinukleotidi koji kodiraju ove polipeptide uključuju derivate gena koji su u značajnoj meri slični genima i izolovanim molekulima nukleinskih kiselina i tamo gde je prigodno, proteine (uključujući peptid i polipeptide) koji su kodirani genima i njihovim derivatima. Kao što se ovde koristi, nukleotidna sekvenca se smatra da je "u značajnoj meri slična" ako (a) je nukleotidna sekvenca izvedena iz kodirajućeg regiona gore opisanih gena i molekula nukleinskih kiselina i uključuje na primer, delove sekvence ili alelske varijante sekvenci o kojima se raspravlja u tekstu iznad, ili alternativno, kodira molekul koji inhibira vezivanje TGF -beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije; (b) je nukleotidna sekvenca sposobna da hibridizuje sa nukleotidnim sekvencama iz ovog pronalaska u umerenim, jako ili izuzetno jako restriktivnim uslovima( videtiSambrookMolecular Cloning: A Laboratoij Manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Press, NY, 1989); i/ili (c) su DNK sekvence izrođene kao rezultat genetskog koda u odnosu na DNK opisanu u (a) ili (b). Dalje, ovde otkriveni molekul nukleinske kiseline uključuje i komplementarne i nekomplementarne sekvence, s' tim da sekvence na drugi način zadovoljavaju kriterijume koji su ovde postavljeni. U kontekstu ovog pronalaska, visoko restriktivni uslovi znače standardne uslove za hibridizaciju (na primer 5XSSPE, 0,5% SDS na 65°C ili ekvivalent).
Struktura proteina koji su kodirani od strane ovde opisanih molekula nukleinskih kiselina polipeptida mogu se predvideti na osnovu primarnih translacionih (prevođenje) proizvoda pomoću "plot" funkcije hidrofobnosti od na primer, P/C Gene ili Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, California), ili na osnovu metoda opisanih od straneKvte i Doolittle( J. Mol. Biol.157:105-132, 1982).
Proteini iz ovog pronalaska mogu biti pripremljeni u obliku kiselih ili baznih soli, ili u neutralnoj formi. Pored toga, pojedinačni amino kiselinski ostaci mogu biti modifikovani putem oksidacije ili redukcije. Dalje, različite zamene, delecije ili adicije mogu se izvršiti na amino kiselinskim ili nukleinsko kiselinskim sekvencama, čiji je ukupan efekat zadržavanje ili dalje pojačavanje ili smanjenje biološke aktivnosti mutantnog ili divljeg (prirodnog) proteina. Pored toga, usled izrođenosti genetičkog koda, na primer, nukleotidne sekvence koje kodiraju istu amino kiselinsku sekvencu mogu znatno da variraju.
Drugi derivati proteina koji su ovde obezbeđeni uključuju konjugate proteina sa drugim proteinima ili polipeptidima. Ovo se može postići na primer, putem sinteze N-terminalnih ili C-terminalnih proteina koji se mogu dodati da bi se olakšalo prečišćavanje ili identifikacija proteina( videtiU.S. Patent No. 4,851,341,videti takođe,Horp et al.,Bio/ Technology6:1204, 1988). Alternativno, fuzioni protein kao FLAG®/TGF-beta vezujući protein može se konstruisati u cilju pomaganja pri identifikaciji, ekspresiji i analizi proteina.
Proteini iz ovog pronalaska mogu se konstruisati upotrebom različitih tehnika koje su ovde opisane. Dalje, mutacije se mogu uneti u određene lokuse putem sinteze oligonukleotida koji sadrže mutantnu sekvencu i koji su okruženi restriktivnim mestima, što omogućava ligaciju fragmenata nativne sekvence. Nakon ligacije dobijena rekonstruisana sekvenca kodira derivat koji ima poželjnu amino kiselinsku inserciju, zamenu ili deleciju.
Alternativno, procedure mutageneze specifične za mesto (ili specifične za segment) usmerene oligonukleotidom, mogu se primeniti da bi se obezbedio promenjeni gen ili molekul nukleinske kiseline koji ima određene kodone koji su izmenjeni na osnovu potrebne zamene, delecije ili insercije. Metode koje mogu služiti kao primeri za pravljenje izmena koje su prikazane gore u tekstu otkrivene su u Walder et al.,( Gene42:133, 1986); Bauer et al.,( Gene37:73, 1985); Craik( BioTechniques,January 1985, 12-19); Smith et al.,( Genetic Engineering: Principles and Methods,Plenum Press, 1981); i Sambrook et al., (već naveden). Deletirani ili skraćeni derivati proteina (na primer solubilni ekstracelularni deo) mogu takođe biti konstruisani upotrebom pogodnih restrikcionih endonukleaznih mesta u blizini željene delecije. Nakon restrikcije, delovi koji štrče mogu biti popunjeni i DNK religirana. Primeri metoda za pravljenje promena koje su prikazane gore u tekstu otkrivene su u Sambrook et al.,( Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
Mutacije koje su napravljene u molekulima nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska poželjno je da zadrže okvir čitanja kodirajućih sekvenci. Dalje, mutacije neće poželjno kreirati komplementarne regione koji kada se prepišu mogu da hibridizuju i doprinesu stvaranju sekundarne iRNK strukture, kao što su ukosnice ili petlje, koje bi mogle nepovoljno da utiču na translaciju iRNK. Iako mesto mutacije može biti unapred određeno, nije potrebno da je priroda mutacijeper seunapred određena. Na primer, u cilju selekcije optimuma karakteristika mutanta na datom stupnju, slučajna mutageneza se može sprovesti na ciljnom kodonu i eksprimirani mutanti se mogu pregledati na dobijanje, gubitak ili zadržavanje biološke aktivnosti. Alternativno, mutacije mogu biti ubačene na određene lokuse sintezom oliginukleotida koji sadrže mutantnu sekvencu, koji su okruženi restrikcionim mestima koji omogućavaju ligaciju fragmenata nativne sekvence. Nakon ligacije, dobijena rekonstruisana sekvenca kodira derivat koji ima željenu amino kiselinsku inserciju, zamenu ili deleciju.
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju proteine iz ovog pronalaska mogu takođe biti konstruisani pomoću tehnika kao što je mutageneza pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), hemijska mutageneza (Drinkwater i Klinedinst,PNAS83:3402-3406, 1986) prinudno pogrešno ugrađivanje nukleotida (na primer, Liao i WiceGene88:107-111, 1990) ili upotrebom nasumično mutirajućih oligonukleotida (Horvvitz et al..
Genome 3:1 12-117, 1989).
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje manipulaciju i ekspresiju gore opisanih gena i molekula nukleinskih kiselina putem uzgajanja domaćiinskih ćelija koje sadrže vektor koji je sposoban da eksprimira gore opisane gene. Ovi vektori ili vektorski konstrukti uključuju molekule nukleinskih kiselina izvedene iz cDNK koji kodirajuželjeni protein, koji su operativno povezani sa pogdonim transkripcionim ili translacionim regulatornim molekulima. Pogodni regulatoni elemeti mogu biti izvedeni iz različitih izvora uključujući bakterijske, gljivične, viralne, sisarske, insektske ili biljne ćelije. Selekcija odgovarajućih regulatornih elemenata zavisi od odabrane ćelije domaćina i mogu lako biti izabrani od strane naučnika. Primeri regulatornih elemenata uključuju promotor transkripcije i pojačivač (enhancer) ili vezujuću sekvencu za RNK polimerazu, terminator transkripcije i sekvencu za vezivanje ribozoma, uključujući signal za inicijaciju translacije.
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koji od proteina koji je gore opisan, mogu lako biti eksprimirani u različitim prokariotskim i eukariotskim domaćinskim ćelijama uključujući bakterijske, sisarske, kvaščeve ili druge gljivične, viralne, insektske ili biljne ćelije. Metode za transformaciju ili transfekciju ovakvih ćelija koje se primenjuju da bi se eksprimirala strana DNK dobro su poznate u nauci( videti,na primer, Itakura et al., U.S. Patent No. 4,704,362; Hinnen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:1929-1933, 1978; Murray et al., U.S. Patent No. 4,801,542; Upshall et al., U.S. Patent No. 4,935,349; Hagen et al., U.S. Patent No. 4,784,950; Axel et al., U.S. Patent No. 4,399,216; Goeddel et al., U.S. Patent No. 4,766,075; i Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; za biljne ćelije videti Czako i Marton,Plant Physiol104:1067-1071, 1994; i Paszkowski eta\., Biotech.24:387-392, 1992).
Bakterijske domaćinske ćelije pogodne za izvođenje ovog pronalaska ulključujuE. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium;i različite vrste u okviru rodovaPseudomonas, StreptomicesiStaphylococcus,kao i mnoge druge bakterijske vrste koje su dobro poznate naučnicima koje se bave ovom oblašću nauke i kojesu ovde opisane. Reprezentativni primer bakterijske domaćinske ćelije uključujujeE. coliDH5cc (Stratagene, LaJolla, California).
Bakterijski ekspresioni vektori poželjno sadrže promotor koji funkcioniše u domaćinskoj ćeliji, jedan ili više fenotipskih selektivnih markera i bakterijski "origin"
(početak) replikacije. Reprezentativni promotori uključuju P-laktamazu (penicilinazu) i laktozni promotorski sistem( videti,Chang et al.,Nature275:615, 1978) T7 RNK polimerazni promotor (Studier et al.,Meth. Enzymol.185:60-89, lambda promotor (Elvin et al.,Gene87:123-126, 1990),trppromotor (Nichols i Yanofsky,Meth. In Enzymology101:155, 1983), itacpromotor (Russell et al.,Gene20:231, 1982). Reprezentativni selektivni markeri uključuju različite markere za rezistenciju na antibiotike kao što su geni za rezistenciju na kanamicin ili ampicilin. Mnogi plazmidi pogodni za transformaciju domaćinske ćelije dobro su poznati u nauci, i između ostalih uključuju pBR322( videtiBolivar et al.,Gene2:95, 1977), pUC plazmide pUC18, pUC19, pUC118, pUC119( videtiMessing,Meth. In Enzymology101:20-77,1983 i Vieira i Messing,Gene19:259-268, 1982) i pNH8A, pNH16a, pNH18a i Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, California).
Domaćinske ćelije kvasaca i gljiva pogodne za izvođenje ovog pronalaska obuhvataju, između ostalih,Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae,rodovePichiailiKluyveromycesi različite vrste rodaAspergillus(McKnight et al., U.S. Patent No. 4,935,349). Pogodni ekspresioni vektori za kvasac i gljive obuhvataju, između ostalih, Ycp50 (ATCC No. 37419) za kvasac i amdS vektor za kloniranje pV3 (Turnbull,Bio/ Technology7:169, 1989), YRp7 (Struhl et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA76:1035-1039, 1978), Yepl3 (Broach et al.,Gene8:121-133, 1979), pJDB249 i pJDB219 (Begges,Nature275:104-108, 1987) i njihove derivate.
Poželjni promotori za korišćenje u kvascu uključuju promotore iz glikolitičkih gena kvasca (Hitzeman, et al,J. Biol. Chem.255:12073-12080, 1980); Albert i Kavvasaki,J. Mol. Appl. Genet.1:419-434, 1982) ili gene alkohol dehidrogenaze (Young et al., uGenetic Engineering of Microorganisms for Chemicals,Hollaender et al., (eds), strana 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer,Meth. Enzymol.101:192-201, 1983). Primeri promotora korisnih za vektore gljiva obuhvataju one dobijene od glikolitičkih genaAspergillus nidulans,kao što suadh3promotor (McKnight et al.,EMBO J.4:2093-2099, 1985). Ekspresione jedinice mogu takođe sadržati transkripcioni terminator. Primer pogodnog terminatora jeadhSterminator (McKnightet al., već naveden, 1985).
Kao i za bakterijske vektore, vektori kvasca će generalno uključiti selektivni marker koji može biti jedan od bilo kojih mnogobrojnih gena koji pokazuju dominantni fenotip za koji postoji fenotipski esej koji omogućava selekciju transformanata. Poželjni selektivni markeri su oni koji u domaćinu komplementiraju auksotrofiju, obezbeđuju razistenciju na antibiotik ili omogućavaju ćeliji da koristi specifične izvore ugljenika i uključujuLeu2(Broach et al., na istom mestu),ura3(Botstein et al,Gene8:17, 1979) ilihis3(Struhl et al., na istom mestu). Još jedan pogodan selektabilni marker jecatgen, koji obezbeđuje razistenciju na hloramfenikol u ćelijama kvasca.
Tehnike za tranformaciju gljiva dobro su poznati u literaturi i opisani su, na primer, u Beggs (na istom mestu), Hinnen et al.,( Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:1929-1933, 1978), Yelton et al.,( Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:1740-1747, 1984) i Russell( Nature301:167-169, 1983). Genotip domaćinske ćelije može da sadrži genetski defekt koji je komplementiran sa selektivnim markerom koji je prisutan na ekspresionom vektoru. Odabir određenog domaćina i selektivnog markera je na nivou opštih znanja u ovoj oblasti nauke.
Protokoli za transformaciju kvasca poznati su onima koji se bave naukom. Na primer, transformacija se može lako izvesti ili pripremom sferoplasta kvasca sa DNK( videtiHinnen et al.,PNAS USA75:1929, 1978) ili tretmanom sa alkalnim solima kao što je LiCl( videtiItoh et al.,J. Bacteriology153:163, 1983). Tranformacija gljiva može se takođe izvršiti korišćenjem polietilen glikola kao što je opisao Cullen et al.,( Bio/ Technology5:369, 1987).
Viralni vektori uključuju one koji sadrže promotor koji usmerava ekspresiju izolovanog molekula nukleinske kiseline koja kodira željeni prtein kao što je gore opisano. Širok dijapazon promotora se može upotrebiti u okviru konteksta ovog pronalaska uključujući, na primer, promotore kao što su MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR, adenovirusni promotor (Ohno ct al.,Science265:781-784, 1994), neomicin fos foro trans ferazni promotor/pojačivač (enhancer), kasni promotor parvovirusa (Koering et al.,Hum. Gene Therap.5:457-463, 1994), Herpes TK promotor, SV40 promotor, pojačivač/promotor metalotionein Ha gena, citomegalovirusni momentalni rani promotor i citomegavirusni momentalni kasni promotor. U okviru posebno poželjnih ostvarenja pronalaska, promotor je tkivno specifični promotor( videti,na primer, WO 91/02805; EP 0,415,731 i WO 90/07936). Reprezentativni primeri pogodnih tkivno sepcifičnih promotora uključuju neuralni specifični enolazni promotor, beta promotor faktora rasta izvedenog iz trombocita, promotor morfogenog proteina kosti, promotor humanog alfal-himerina, promotor sinapsina I i promotor sinapsina II. Pored gore pomenutih promotora, drugi viralno specifični promotori (na primer retroviralni promotori (uključujući one gore pomenute kao i druge HIV promotore)), promotori specifični za hepatitis (žutica), herpes (na primer EBV) i za bakterije, gjlive ili parazite (na primer malariju) mogu se koristiti da bi se ciljala specifična ćelija ili tkivo koje je inficirano sa virusom, bakterijom, gljivom ili parazitom.
Sisarske ćelije pogodne za izvođenje ovog pronalaska uključuju, među ostalim COS, CHO, SaOS, osteosarkome, KS483, MG-63, primarni osteoblaste i humane ili sisarske strome koštane srži. Sisarski ekspresioni vektori koji se koriste u izvođenju ovog pronalaska uključiće promotor koji je sposoban da usmeri transkripciju kloniranog gena ili cDNK. Poželjni promotori uključuje viralne promotore i ćelijske promotore. Promotori specifični za kost, uključuju promotor za koštani "sialo"-protein (iz pljuvačne žljezde) i promotor za osteokalcin. Viralni promotori uključuju citomegavirusni momentalni rani promotor (Boshart et al.,Cell41:521-530, 1985), citomegavirusni momentalni kasni promotor, SV40 promotor (Subramani et al.,Mol. Cell. Biol.1:854-864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, metalotionein-1, adenovirus Ela. Ćelijski promotori uključuju misiji promotor metalotioneina-I (Palmiter et al., U.S. Patent No. 4,579,821), Vic promotor miša (Bergman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:7041-7045, 1983; Grant et al.,Nucleic Acids Res.15:5496, 1987) i VHpromotor miša (Loh et al.,Cell33:85-93, 1983). Izbor promotora zavisiće, makar delimično, od nivoa ekspresije koja je potrebna ili od recipijentnte ćelije koja treba da se transformiše.
Ovakvi ekspresioni vektori mogu takođe da sadrže grupu mesta za obradu primarnog transkripta (splicing) smeštenih nizvodno od promotora i uzvodno od DNK sekvence koja kodira peptid ili protein od interesa. Poželjna mesta za obradu RNK mogu se dobiti od adenovirudsnih i/ili imunoglobulinskih gena. Takođe se u ekspresionim vektorima nalazi signal za poliadenilaciju koji je lociran nizvodno od kodirajuće sekvence od interesa. Pogodni poliadenilacioni signali uključuju rane ili kasne poliadenilacione signale iz SV40 (Kaufmann i Sharp, na istom mestu), poliadenilacioni signal iz adenovirusnog 5 E1B regiona i genski terminator humanog hormona rasta (DeNoto et al.,Nucleic Acids Res.9:3719-3730, 1981). Ekspresioni vektori mogu uključiti nckodirajuću viralnu lider, kao što je adenovirusni 2 trodelni lider, lociran između promotora i mesta za obradu RNK. Poželjni vektori mogu takođe uključiti pojačivačke sekvence kao što je SV40 pojačivač. Ekspresioni vektori mogu takođe da uključe sekvence koje kodiraju adenovirusne VA RNK. Pogodni ekspresioni vektori mogu se dobiti iz komercijalnih izvora (na primer, Stratagene, LaJolla, California).
Vektorski konstrukti koji sadrže klonirane DNK sekvence mogu se uneti u gajene sisarske ćelije putem na primer, transfekcije posredovane kalcijum fosfatom (Wigler et al.,Cell14:725, 1978; Corsaro i Pearson,Somatic Cell Genetics7:603, 1981; Graham i Van der Eb,Virology52:456, 1973), elektroporacije (Neumman et al.,EMBO J.1:841-845, 1982) ili transfekcije posredovane DEAE-dekstranom (Ausubel et al., (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.,NY, 1987). Da bi se identifikovale ćelije koje su stabilno tranfektovane sa vektorom ili koje su integrisale kloniranu DNK, generalno se u ćeliju ubacuje selektivni marker zajedno sa genom ili cDNK od interesa. Poželjni selektivni markeri za upotrebu u kultivisanim sisarskim ćelijama uključuju gene koji obezbeđuju rezistenciju na lekove, kao neomicin, higromicin i metotreksat. Selektivni marker može biti umnožen selektivni marker. Poželjni umnoženi selektivni markeri su DHFR gen i gen za rezistenciju na neomicin. Selektivni markeri su opisani od strane Thillv et al.,{ Mammalian Cell Technology,Buttenvorth Publishers, Stoneham, Massachusetts).
Sisarske ćelije koje sadrže pogodan vektor se puštaju da rastu tokom vremenskog perioda, tipično 1-2 dana, da bi počeli da eksprimiraju DNK sekvencu(e) od interesa. Odabir lekova se zatim primenjuje da bi se selektovao rast ćelija koje eksprimiraju selektivni marker na stabilan način. Za ćelije koje su transfektovane sa umnožavajućim, selektabilnim markerom, koncentracije leka se mogu povećati kroz više koraka da bi se uradila selekcija na povećan broj kopija kloniranih sekvenci i tako se postiglo povećanje ekspresije. Ćelije koje eksprimiraju ubačene sekvence se selektuju i pregledaju na proizvodnju proteina od interesa u željenoj formi i na željenom nivou. Ćelije koje zadovoljavaju ove kriterijume se zatim mogu klonirati i podesiti za proizvodnju.
Protokoli za transfekciju sisarskih ćelija poznet su onima koji se bave naukom. Reprezentativne metode uključuju transfekciju posredovanu kalcijum fosfatom, elektroporaciju, lipofekciju, transfekciju posredovanu retrovirusima, adenovirusima i fuzijom proptoplasta (videti Sambrook et al, već navedeno). Goli vektorski konstrukti mogu se takođe uzeti od strane mišićnih ćelija ili drugih pogodnih ćelija nakon injektiranja u mišić sisara (ili druge životinje).
Brojne metode za upotrebu insektskih domaćinskih ćelija za proizvodnju polipeptida poznate su u nauci i ovde su opisane. Na primer, upotreba bakulovirusa kao vektora za ekspresiju heterolognih DNK sekvenci u insektskim ćelijama opisana je od strane Atkinson et al.,( Pestic Sci.28:215-224,1990). Brojni vektori i biljne domaćinske ćelije poznate su u nauci i mogu takođe biti korisne u okviru ovog pronalaska, na primer, upotrebaAgobacterium rhizogeneskao vektora za eksperesiju gena i molekula nukleinskih kiselina u biljnim ćelijama (videti revijski rad Sinkar et al.,J. Biosci.
( Bangalore)11:47-58, 1987).
U okviru srodnih ostvarenja ovog pronalaska, proteini iz ovog pronalaska mogu biti eksprimirani u transgenim životinjama čije germinativne i somatske ćelije sadrže gen koji kodira željeni protein i koji je operativno povezan sa promotorom koji je efektivan u ekspresiji gena. Alternativno, na sličan način, transgene životinje mogu da se pripreme tako da im nedostaje željeni gen ("nokautiran" miš). Ovakvi transgeni mogu biti pripremljeni u različitim ne-humanim životinjama, uključujući miševe, pacove, zečeve, ovce, pse, koze i svinje{ videtiHamer et al.,Nature315:680-683, 1985, Palmiter et al,Science222:809-814, 1983, Brinster et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.82:4438-4442, 1985, Palmiter i Brinster,Cell41:343-345, 1985, i U.S. Patent Nos. 5,175,383, 5,087,571, 4,736,866, 5,387,742, 5,347,075, 5,221,778 i 5,175,384). Ukratko, ekspresioni vektor, uključujući molekul nukleinske kiseline koji treba da se eksprimira zajedno sa kontrolnim sekvencama za ekspresiju koji su smešteni na odgovarajući način, unosi se u pronukleuse oplođenog jajeta, na primer putem mikroinjeciranja. Integracija injektirane DNK detektuje se tačkastom "blot" analizom DNK iz uzoraka tkiva. Poželjno je da se ubačena DNK ugradi u germinativnu liniju životinje tako sa se porenosi na potomstvo životinje. Tkivno-specifična ekspresija može se postići putem upotrebe tkivno-specifičnog promotora ili putem upotrebe inducibilnog promotora, kao što je promotor metalotioneinskiog gena (Palmiter et al., 1983, već navedeno) koji omogućavaju regulisanu ekspresiju transgena.
Jedna među mnogobrojnim metodama za izolaciju proteina je izolovanje putem gajenja podobnog domaćina i vektorskih sistema da bi se proizveli rekombinantni translacioni proizvodi kao što je ovde opisano. Supernatanti iz ovih ćelijskih linija ili proteinskih inkluzija ili celih ćelija iz kojih se protein ne sekretuje u suprenatant, mogu se zatim tretirati različitim procedurama za prečišćavanje u cilju izolovanja željenih proteina. Na primer, suprenatant može prvo da se koncentruje pomoću komercijalno dostupnih filtera za koncentrisanje proteina, kao što je Amicon ili Millipore Pellicon jedinica za filtriranje. Nakon koncentrisanja koncentrat se može naneti na pogodan matriks za prečišćavanje kao što je, na primer, anti-protein antitelo (na primer, antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid koji treba da se izoluje) vezano za pogodnu potporu. Alternativno, anjonske ili katjonske kuglice za razmenu mogu se upotrebiti za prečišćavanje proteina. Kao sledeća alternativa, može se koristiti jedan ili više koraka reverzno fazne tečne hromatografije visoke performance (RP-HPLC) može se koristiti za dalje prečišćavanje proteina. Druge metode izolovanja proteina iz ovog pronalaska dobro su poznate u nauci.
Stepen čistoće izolovanog proteina može se odrediti tehnikama poznatim u nauci i koje su ovde opisane, kao što je elektroforeza na gelu ili metodama hromatografije. Poželjno, polippetidi izolovani na ovaj način su najmanje oko 90% čisti, još poželjnije najmanje oko 95%) čisti, i još poželjnije najmanje oko 99% čisti. U okviru određenih specifičnih ostvarenja, protein se smatra "izolovanim" u kontekstu ovog pronalaska ako se nijedan drugi neželjeni protein ne detektuje putem SDS-PAGE analize za kojom sledi Coomassie blue bojenje ili bojenje sa srebrom. U okviru drugih ostvarenja, željeni protein može biti izolovan tako da se nijedan neželjeni protein ne detektuje putem SDS-PAGE analize nakon čega sledi bojenje sa srebrom.
Molekuli nukleinskih kiselina
U okviru drugih aspekata pronalaska, obezbeđeni su molekuli nukleinskih kiselina koji su sposobni da inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Na primer, u okviru jednog ostvarenja obezbeđeni su molekuli antisens (nekodirajući lanac) oligonukleotida koji specifično inhibiraju ekspresiju nukleinsko kiselinske sekvence TGF-beta vezujućeg proteina (videti generalno, Hirashima et al., u Molecular Biologv of RNA: New Perspectives (M. Inouve and B. S. Dudock, eds., 1987, Academic Press, San Diego, str. 402); Oligonucleotides: Antiscnse Inhibitors of Gene Expression (J. S. Cohen, ed., 1989, MacMillan Press, London); Stein and Cheng, Science 261:1004-1012, 1993; WO 95/10607; U. S. Patent No. 5,359; WO 92/06693; i EP-A2-612844). Ukratko, ovakvi molekuli su konstruisani tako da su komplementarni sa i sposobni da formiraju Watson-Krick-ove bazne parove sa, regionom prepisane sekvence iRNK TGF-beta vezujućeg proteina. Dobijena dvolančana nukleinska kiselina interferira sa daljom obradom iRNK, i tako sprečava sintezu proteina (videti primer 10).
U okviru drugih aspekata pronalaska, obezbeđeni su ribozimi koji su sposobni da inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Kao što se ovde koristi izraz "ribozimi" ima za cilj da uključi molekule RNK koji sadrže antisens (nekodirajuće) sekvence za specifično prepoznavanje, i enzimatsku aktivnost koja izvršava sečenje RNK. Katalitički lanac seče specifično mesto na ciljnoj RNK pri većoj stohiometrijskoj koncentraciji. Širok dijapazon ribozima može se koristiti u kontekstu ovog pronalaska, uključujući na primer, ribozim "glava čekića"
(hammerhead) (na primer kao što je opisano od strane Foster i Symons, Cell 48:211-220, 1987; Hasseloff and Gerlach, Nature 328:596-600, 1988; Walbot and Bruening, Ntaure 334:196, 1988; Hasseloff and Gerlach, Nature 334585, 1988); ribozim "šnala"
(na primer, kao što je opisano od starne Haseloff et al., U. S. Patent No. 5,254, 678 izdat 19 oktobra 1993 i Hampel te al., European Patent Publication No. 0 360 257, objavljeno 26 Marta, 1990); i ribozim baziran na ribozomalnoj RNK tetrahimena (videti Cech et al., U. S. Patent No. 4,987,071). Ribozimi iz ovog pronalaska tipično se sastoje od RNK, ali mogu biti sastavljeni od DNK, analoga nukleinskih kiselina (na primer, fosfortipoata), ili njihovih himera (na primer DNK/RNK/RNK).
Obeležja
Genski produkt ili bilo koji kandidatni molekul koji je opisan gore u tekstu ili dalje u tekstu, može biti obeležen sa različitim jedinjenima uključujući na primer, fluorescentne molekule, toksine i radionukleotide. Reprezentativni primeri fluorescentnih molekula uključuje fluorescin, Phvcobili proteine, kao fikoeretrin, rodamin, Teksas crveno i luciferaza. Reprezentativni primeri toksina uključuju ricinus, abrin toksin difterije, kolera toksin, gelonin, "pokeweed"( Phytolacca)antiviralni protein, tritin, toksinShigellai egzotoksin APseudomonas- a.Reprezentativni primeri radionuklida uključuju Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, 1-123, 1-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212, i Bi-212. Pored toga, antitela koja su gore opisana mogu takođe biti obeležena ili konjugovana sa jednim partnerom iz para vezanih liganda. Reprezentativni primeri uključuju avidin-biotin, streptavidin-biotin i riboflavin-riboflavin vezujući protein.
Metode za konjugaciju ili obeležavanje ovde opisanih molekula sa reprezantativnim obeležjima prikazane gore mogu se jednostavno izvesti od strane običnog naučnika( videti,Trichothecene Antobodv Conjugate, U.S. Patent No. 4,744,981; Antibodv Conjugate, U.S. Patent No. 5,106,951; Fluorogenic Materials and Labeling Tecniques, U.S. Patent No. 4,018,884; Metal Radionucleotide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapv, U.S. Patent No. 4,897,255; i Metal Radionucleiotide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, U.S. Patent No. 4,988,496;videti takođeInman,Methods In Enzymology,Vol. 34,Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B,Jakobv i Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974;videti takođeWilchek i Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalitical Applications,"Anal. Biochem. 171:\- 32,1988).
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
Kao što je gore navedeno, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje različite farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan od gore opisanih molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije zajedno sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim nosačem ekscipijentom ili rastvaračem. Generalno, ovakvi nosači trebali bi biti netoksični za recipijente (primaoce) za doze i koncentracije koje se koriste. Obično priprema ovakvih kompozicija obuhvata kombinovanje terapeutskog agensa sa puferima, antioksidansima kao što je askorbinska kiselina, polipeptidima male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka), proteinima, amino kiselinama, ugljenim hidratima uključujući glukozu, maltozu, saharozu ili dekstrine, helirajućim agensima kao što je EDTA, glutationom i drugim stabilizatorima i ekscipijentima. Neutralni fiziološki puferski rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa nespecifičnim serum albuminom predstavljaju primer rastvarača.
Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti pripremljene za dostavljenje putem različitih načina (puteva). Generalno tip nosača se bira na osnovu načina dostavljenja. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane za bilo koji prigodan način dostavljenja uključujući na primer, lokalno, oralno, nazalno , rektalno, vaginalno, podjezično ili parenteralno dostavljanje, uključujući potkožno, intravenozno, intramuskularno, intrasternalno, unutar šupljina (intracavital), intrametalno, intrauretalno injektiranje ili kao infuzija. Tečna farmaceutska kompozicija može da uključu na primer, jedan od sledećih: sterilne rastvarače kao što je voda za injektiranje, slani rastvor, posebno fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksirana ulja koja mogu da služe kao rastvarač ili razblaživački medijum, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge rastvarače; antibakterijske agense, antioksidanse; helirajuće agense; pufere kao acetate, citrate ili fosfate ili agense za podešavanje toničnosti kao natrijum hlorid ili dekstrozu. Parenteralni preparat može biti smešten u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili vajlc (bočice) za višestruke doze koje su od stakla ili plastike. Upotreba fiziološkog rastvora je poželjna i poželjno je da je injektabilna farmaceutska kompozicija sterilna.
Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti formulisane za odloženo oslobađanje (to jest, formulacija kao što je kapsula ili spužva koje imaju efekte laganog otpuštanja jedinjenja nakon dostavljanja). Ovakve kompozicije mogu generalno biti pripremljene pomoću dobro poznate tehnologije i mogu biti dostavljene putem na primer oralne, rektalne ili potkožne implantacije ili implantacijom na željeno ciljno mesto. Formulacije sa odloženim oslobađanjem mogu da sadrže agens raspršen u matriks nisača ili ili koji se nalazi u rezrevoaru koji je okružen sa membranu koja kontroliše stepen otpuštanja. Nosači za upotrebu u okviru formulacija su biokompatibilni i mogu biti takođe biodegradabilni; poželjno je da formulacija obezbeđuje relativno konstantan nivo oslobađanja aktivne komponente. Količina aktivnog jedinjenja koja se sadrži u okviru formulacije sa odloženim oslobađanjem zavisi od mesta implementacije, stope i očekivanog trajanja oslobađanja i prirode stanja koje treba da se tretira ili spreči. Ilustrativni nosači korisni u ovom smislu uključuju mikročestice poli(laktid-ko-glikolid), poliakrilata, lateksa, škroba, celuloze, dekstrana i sličnih. Drugi ilustrativni nosači sa odloženim oslobađanjem uključuju supramolekularne biovektore, koji sadrže ne-tečnu hidrofilnu srž (na primer unakrsno povezan polisaharid ili oligosaharid) i opcionalno spoljašnji sloj koji sadrži amfifilično jedinjenje, kao što je fosfolipid( videti,na primer, U.S. Patent No. 5,151,254 i PCT Applikacije WO 94/20078, WO/94/23701 i WO 96/06638).
U drugom ilustrativnom ostvarenju, biodegradabilne mikrosfere (na primer polilaktat poliglikolat), upotrebljavaju se kao nosači za kompozicije iz ovog pronalaska. Pogodne biodegradabilne mikrosfere otkrivene su na primer, u U.S. Patent Nos. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344; 5,407,609 i 5,942,252. Modifikovani nosač sistem proteina srži hepatitisa B, kao što je onaj opisan u WO/99 40934 i reference citirane ovde, biće takode koristan za mnoge primene. Još jedan ilustrativni nosački/dostavljački sistem koristi nosač koji sadrži posebne protein komplekse, kao što su oni opisani u U.S. Patent No. 5,928,647, koji je u sposoban da indukuje klasu I-restriktivnih odgovora citotoksičnih T limfocita u domaćinu.
U još jednom ilustrativnom ostvarenju, kalcijum fosfatne čestice srži su upotrebljene kao nosači ili kao matrice za kontrolisano oslobađanje za kompozicije iz ovog pronalaska. Primeri kalcijum fosfatnih čestica opisane su na primer, u objavljenoj patentnoj prijavi br. WO/0046147.
Za farmaceutske kompozicije koje sadrže polinukleotid koji kodira anti SOST antitelo i/ili modulišući agens (tako da se polipeptid i/ili modulišući agens generišein situ),polinukleotid može biti prisutan u okviru bilo kog sistema za dostavu koji je poznat onima koji se bave naukom, uključujući nukleinsku kiselinu i bakterijske, viralne i sisarske ekspresione sisteme. Tehnike za ugrađivanje DNK u ovakve ekspresione sisteme dobro su poznati onima koji se bave naukom. DNK može takođe biti "gola," kao što je opisano na primer od strane Ulmer et al.,Science259:1745-1749, 1993 i obrađeno u revijskom radu Cohen,Science259:1691-1692, 1993. Uzimanje gole DNK može biti povećano oblaganjem DNK na biodegradibilne kuglice, koje se efikasno transportuju u ćelije.
Razvoj pogodnog doziranja i režima tretiranja za upotrebu odgovarajućih kompozicija koje su ovde opisane u različitim režimima tretiranja, uključujući na primer oralno, parenteralno, intravenozno, intranazalno i intramuskularno dostavljanje i formulisanje, dobro je poznato u nauci i neki delovi su ukratko prokomentarisani dalje u tekstu, u cilju opšte ilustracije.
U određenim primenama, farmaceutske kompozicije koje su ovde otkrivene mogu se dostaviti putem oralnog dostavljanja u životinju. Kao takve, ove kompozicije mogu biti formulisane u inertnom rastvaraču ili sa asimilativnim jestivim nosačem, ili mogu biti zatvorene u želatinske kapsule sa tvrdom ili mekanom školjkom, ili mogu biti komprimovane u tablete, ili mogu biti ugrađene direktno sa hranom koja se koristi u ishrani.
Pod određenim okolnostima biće poželjno da se farmaceutske kompozicije koje su ovde otkrivene dostave parenteralno, intravenozno, intramuskularno ili čak intraperitonealno. Ovakvi pristupi dobro su poznati u nauci onima koji se bave ovom oblašću i neki su dalje opisani na primer u U.S. Patent No. 5,543,158; U.S. Patent No. 5,641,515 i U.S. Patent No. 5,399,363. U određenim ostvarenjima rastvori aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljeni kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli u vodi, i pogodno pomešani sa surfaktantom (površinska aktivna supstanca), kao što je hidroksipropilccluloza. Disperzije mogu takođe biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim mešavinama i u uljima. U normalnim uslovima čuvanja i upotrebe preparati će generalno sadržati prezervativ za sprečavanje rasta mikroorganizama.
Ilustrativne farmaceutske forme pogodne za upotrebu injektiranjem uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne pudere za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija (na primer, videti U.S. Patent No. 5,466,468). U svim slučajevima forma mora biti sterilna i mora biti tečna do nivoa da postoji laka upotreba šprica. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti prezervirana od kontaminišućih akcija mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži na primer, vodu, etanol, poliol (na primer glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slične) njihove pogodne mešavine i/ili biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost mora biti održana, na primer, upotrebom oblaganja na primer, kao što je oblaganje sa lecitinom, sa održavanjem željene veličine čestice u slučaju disperzije i/ili putem korišćenja surfaktanta. Prevencija delovanja mikroorganizama može biti olakšana različitim antibakterijskim i antiglj i vičnim agensima, na primer, parabenima, hlorbutanolom, fenolom, sorbičnom kiselinom, timerosalom i sličnim. U mnogim slučajevima biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa npr. šećera ili natrijum hlorida. Produžena absorbcija injektabilnih kompozicija može biti ostvaren upotrebom kompozicija agenasa koji odlažu absorbciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
U jednom ostvarenju, za parenteralno dostavljanje u vodenom rastvoru, rastvor bi trebao biti puferisan kako treba ako je to neophodno i tečni rastvarao treba prvo učiniti izotoničnim sa dovoljnom količinom slanog rastvora ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori posebno su pogodni za intravenozno, intramuskularno i intraperitonealno dostavljanje. U tom povezivanju, sterilni tečni medijum koji se može koristiti biće poznat naučnicima u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml NaCl izotoničnog rastvora i ili dodata u 1000 ml hipodermoklizične tečnosti ili injektirana na predviđenom mestu za infuziju( videti,na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju naravno će se desiti u zavisnosti od stanja subjekta koji se tretira. Takođe, za humano dostavljanje, preparati će naravno zadovoljiti poželjne zahteve da su sterilni, pirogenetski i zadovoljiće standarde sigurnosti i čistoće koji su postavljeni od strane FDA Office of Biologics standarda.
U drugom ostvarenju pronalaska, kompozicije koje su ovde otkrivene mogu biti formulisane u neutralnoj formi ili u obliku soli. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli koje se dodaju kiselinama (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su formirane sa neorganskim solima kao što su hidrohlorna ili fosforna kiselina ili organske kiseline kao sirćetna, okslana, tartarna, mandelična i slične. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe biti izvedene iz neorganskih baza kao što su natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid i organskih baza kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slični. Nakon formulisanja rastvori će biti dostavljeni na način koji je kompatibilan sa doziranjem formulacije i u onim količinama koje su teraputski efektivne.
Nosači dalje mogu sadržati bilo koji rastvarač, disperzioni medijum, transportere, oblagače, diluente, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense sa vremenskim odlaganjem, pufere, rastvore nosača, suspenzije, koloide i slične. Upotreba ovakvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u nauci. Kao što je i svaki konvencionalni medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova potreba u terapeutskim kompozicijama je razmatrana. Izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekularne entitete i kompozicije koje ne proizvode alergijsku ili sličnu neželjenu reakciju kada se dostavi čoveku.
U određenim ostvarenjima lipozomi, nanokapsule, mikročestice, lipidne čestice, vezikule i slični, upotrebljavaju se za unošenje kompozicija iz ovog pronalaska u pogodne domaćinske ćelije/organizme. Posebno, kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti formulisane za dostavu ili inkapsulirane u lipidnu česticu, lipozom, vezikulu, nanosferu ili nanočesticu ili slične. Alterantivno, kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti vezane ili kovalentno ili ne-kovalentno, za površinu takvih nosača transportera. Formiranje i upotreba lipozoma i lipozomu sličnih preparata kao potencijalnih nosača leka poznata je onima koji se bave naukom( videti,na primer, Lasic,Trends Biotechnol.76T7):307-21, 1998; Takakaura,Nippon Rinsho5đ(3):691-95, 1998; Chandran et al.,Indian J. Exp. Biol.35(8):801-09, 1997; Margalit,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.72(2-3):233-61, 1995; U.S. Patent No. 5,567,434; U.S. Patent No. 5,552,157; U.S. Patent No.5,565,213; U.S. Patent No.5,738,868 i U.S. Patent No. 5,795,587, svaki ponaosob u potpunosti ugrađen ovde sa referencom).
Lipozomi su uspešno upotrebljavani sa brojnim ćelijskim tipovima koji su normalno teški za transfekciju drugim procedurama uključujući suspenzije T ćelija, kulture primarnih hepatocita i PC 12 ćelije (Renneisen et. al.,J. Biol. Chem. 265( 21) : 16337-42,1990; Muller et al.,DNA Cell Biol.9(3):221-29, 1990). Dodatno, lipozomi su oslobođeni ograničenja dužine DNK, što je inače karakteristično za sisteme za dostavu koji se baziraju na virusima. Lipozomi su efektivno korišćeni za unošenje gena, različitih lekova, radioterapeutskih agenasa, enzima, virusa, transkripcionih faktora, alosteričnih efektora i sličnih, u različite gajene ćelijske linije i životinje. Dalje, upotreba lipozoma izgleda da nije povezana za autoimunim odgovorima ili neočekivanom toksičnošću nakon dostave sistema.
U određenim ostvarenjima, lipozomi su formirani od fosfolipida koji su raspršeni u vodenom medijumu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (nazivaju se i multilamelarne vezikule (MLV)).
Alternativno, u drugim ostvarenjima, pronalazak za farmaceutski prihvatljive nanokapsule, obezbeđuje formulacije kompozicija iz ovog pronalaska. Nanokapsule mogu generalno da u sebi sadrže jedinjenja na stabilan i reproducibilan način( videti,na primer, Quintanar-Guerrero et al.,Drug Dev. Ind. Pharm. 24(\ 2) :\ 113-28,1998). Da bi se izbegli efekti veličine usled unutarćelijskog polimernog pretrpavanja, ovakve ultrafine čestice (veličine oko 1 uM) mogu biti dizajnirane pomoću polimera koji mogu da se degradujuin vivo.Ovakve čestice mogu biti napravljene kao što je opisano od strane Couvreur et al,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20,1988; zur Muhlen et al,Eur. J. Pharm. Biopharm.45(2):149-55, 1998; Zambaux et al.,J. Controlled Release 50(\-3):31-40, 1998,U.S. Patent No. 5,145,684.
Dodatno, farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti smeštene u okviru kontejnera, zajedno sa materijalom za pakovanje koji obezbeđuje instrukcije koje se odnose na upotrebu ovakvih farmaceutskih kompozicija. Generalno, ovakve instrukcije uključiće deflnisanu formulu koja opisuje koncentraciju reagensa, kao i u određenim ostvarenjima relativne količine ekscipijentskih sastojaka ili rastvarača (na primer voda, slani rastvos ili PBS) koji mogu biti neophodni za rekonstituciju farmaceutske kompozicije.
METODE TRETIRANJA
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metode za povećanje mineralnog sadržaja kosti i mineralne gustine kosti. Ukratko, brojna stanja rezultuju u gubitku mineralnog sadržaja kosti, uključujući na primer bolest, genetsku predispoziciju, nesrećne slučajeve koji rezultuju u odsustvu upotrebe kosti (na primer usled frakture), terapeutike koji utiču na resorbciju kosti ili koji ubijaju ćelije koje formiraju kost i normalno starenje. Kroz upotrebu ovde opisanih molekula koji inhibiraju vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije, ovakva stanja mogu se tretirati ili sprečiti. Kao što se ovde koristi, mineralni sadržaj kosti se povećao kada se mineralni sadržaj kosti povećao na statistički značajan način (na primer više od jedne polovine standardne devijacije) na odabranom mestu.
Širok dijapazon stanja koja rezultuju u gubitku mineralnog sadržaja kosti može biti tretiran sa molekulima koji su ovde opisani. Pacijenti sa ovakvim stanjima mogu biti identifikovani kroz kliničku dijagnostiku upotrebom dobro poznatih tehnika( videti,na primer, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Reprezentativni primeri bolesti koje mogu biti tretirane uključuju displazije, naznačeno time daje rast ili razvoj kosti nenormalan. Reprezentativni primeri ovakvih stanja uključuju ahondroplaziju, kleidokranijalnu diostozu, enhondromatozu, fibroznu displaziju, Gaučerovu bolest, hipofosfatemičnu "rickets", Marfanovu osteoporozu, osteopoikilozu, sklerotične lezije, frakture, periodontalnu bolest, pseudoartrozis i piogenični osteomijelitis.
Druga stanja koja mogu biti tretirana ili sprečena uključuju širok dijapazon uzroka osteopenije (to jest, stanje koje uzrokuje veće od jedne standardne devijacije mineralnog sadržaja ili gustine ispod vrha (peak) mineralnog sadržaja skeleta u mladosti). Reprezentativni primeri ovakvih stanja uključuju anemična stanja, stanja izazvana steroidima, stanja izazvanih heparinom, poremećaja koštane srži, skorbut, neuhranjenost, nedostatak kalcijuma, idiopatska osteoporoza, kongenitalna osteopenija ili osteoporoza, alkoholizam, hronična bolest jetre, senilnost, stanje postmenopauze, oligomenoreja, amenoreju, trudnoću, dijabetes melitis, hipertireodizam, Kušingovu bolest, akromegaliju, hipogonadizam, imobilizacija ili prekid upotrebe, sindrom refleksne simpatetične distrofije, tranzijentna regionalnu osteoporozu i osteomalaciju.
U okviru ostvarenja iz ovog pronalaska, mineralni sadržaj kosti ili gustina mogu biti povećani dostavljanjem toplokrvnoj životinji terapeutski efektivne količine molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije. Primeri toplokrvnih životinja koje se mogu tretirati uključuju i kičmenjake i sisare, uključujući na primer, ljude, konje, krave, svinje, ovce, pse, mačke, pacove i miševe. Reprezentativni primeri terapeutskih molekula uključuju ribozime, gene za ribozime, antisens oligonukleotide i antitela (na primer, humanizovana antitela ili bilo koja antitela koja su ovde opisana).
U okviru drugih ostvarenja ovog pronalaska obezbeđene su metode za povećanje gustine kosti koje obuhvataju korake ubacivanja u ćelije koje naseljavaju kost, vektora koji usmerava ekspresiju molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije i dostavljanja ćelija koje sadrže vektor u toplokrvnu životinju. Ukratko, ćelije koje naseljavaju kost mogu se dobiti direktno iz kosti pacijenta (na primer ćelije dobijene iz koštane srži kao CD34+, osteoblaste, osteocite i slične) iz periferne krvi ili iz kultura.
Vektor koji usmerava ekspresiju molekula koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije može biti ubačen u ćeliju. Reprezentativni primeri pogodnih vektora uključuju viralne vektore kao herpes viralne vektore (na primer., U.S. Patent No. 5,288,641); anedovirusne vektore (na primer, WO 94/26914, WO 93/9191; Kolls et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA97(1):215-219, 1994; Kass-Eiseler et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90(24): 11498-502, 1993; Guzman et al.,Circulation55(6):2838-48, 1993; Guzman et al.,Cir. Res.73(6):1202-1207; Zabner et al.,Cell75(2):207-216, 1993; Li et al.,Hum. Gene Ther.4(4):403-409, 1993; Caillaud et et al.,Eur. J. Neurosci.5(10):1287-1291,1993; Vincent et al., Nt. Genet. J(2): 130-134, 1993;Jaffeetal,Nat Genet.7(5):371-378, 1992; i Levrero et al.,Gene 101( 2) : 195-202,1991); adeno-povezane viralne vektore (WO 95/13365; Flotte et al.,PNAS90(22):10613-10617, 1993); bakulovirusne vektore, parvovirusne vektore (Koering et al.,Hum. Gene Therap. 5:457-463,1994); "pox" virusne vektore (Panicali i Paoletti,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:4927-4931, 1982; i Ozaki et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.193(2):653-660, 1993), i retroviruse( na primer,EP 0,415,731; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 91/25234; U.S. Patent No. 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218). Viralni vektori mogu takođe biti konstruisani tako da sadrže mešavinu različitih elemenata (na primer, promotore, sekvence omotača i slične) iz različitih virusa ili iz ne-viralnih izvora. U okviru različitih ostvarenja, ili sami viralni vektor, ili viralna čestica koja sadrži viralni vektor može se koristiti u metodama i kompozicijama koje su dole opisane.
U okviru drugih ostvarenja pronalaska, molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju molekul koji inhibira vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina za člana TGF-beta familije mogu biti dostavljeni putem različitih tehnika uključujući na primer, dostavljanje "asialoosomucoid" (ASOR) konjugovanog sa poli-L-lizinskim DNK kompleksima (Cristano et al.,PNAS92122-92126, 1993); DNK povezana sa ubijenim adenovirusom (Curiel et al.,Hum. Gene. Ther.3(2): 147-154, 1992); citofektinom - posredovano ubacivanje (DMRIE-DOPE, Vical, California); direktno injektiranje DNK (Ascadi et al.,Nature352:815-818, 1991); DNK ligand (Wu et al.,J. Biol. Chem.264:16985-16987, 1989); lipofekcija (Felgner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:14\ ?>- 14\ 1, 1989); lipozomi (Pickering et al.,Circ.59(1):13-21, 1994; i Wang et al.,PNAS54:7851-7855, 1987); bombardovanje mikroprojektilima (Williams et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA55:2726-2730, 1991); i direktno dostavljanje nukleinske kiseline koja kodira sam protein ili samog (Vile i Hart,Cancer Res.53:3860-3864, 1993) ili korišćenjem PEG-nukleinsko kiselinskih kompleksa. Reprezentativni primeri molekula koji mogu biti eksprimirani od strane vektora iz ovog pronalaska uključuju ribozime i antisens molekule, svaki od njih je detaljnije obrađen gore u tekstu.
Određivanje povećanog mineralnog sadržaja kosti mode biti urađeno direktno upotrebom X-zraka (na primer absoroptometrija dvojnom energijom X-zraka ili "DEXA") ili interferencijim preko "turnover" markera kosti (kao što je alkalna fosfataza specifična za osteoblast, osteokalcin, C propeptid prokolagena tipa 1 (PICP) i ukupna alkalna fosfataza;v/ćfe/7Comier, Curr. Opin. In Rheu.7:243, 1955) ili sa markerima za resorbciju kosti (piridinolin, deoksipiridinolin, N-telopeptid, urinarni hidroksiprolin, plazma tartarat-rezistentne kisele fosfataze i galaktozil hidroksilizin;videtiComier, na istom mestu). Količina koštane mase može takođe biti izračunata na osnovu telesnih težina ili upotrebom drugih metoda (videti Guinness-Hey,Metab. Bone. Dis. Relat. Res.5:177-1811, 1984).
Kao što će biti očigledno onima koji se bave naukom, količina i frekvencija dostavljanja zavisiće naravno od faktora kao što su priroda i težina indikacija koje se tretiraju, željenog odgovora, stanja pacijenta i tako dalje. Tipično, kompozicije mogu biti dostavljene putem različitih tehnika kao što je pomenuto gore u tekstu.
Primeri koji slede služe za ilustraciju i nisu ograničavajući.
PRIMERI
PRIMER 1
MAPE SKLEROSTEOZE NA DUGOM KRAKU HUMANOG HROMOZOMA 17
Genetsko mapiranje defekta koji je odgovoran za sklerosteozis u ljudima lokalizovalo je gen koji je odgovoran za ovaj poremećaj u regionu humanog hromozoma 17 koji kodira novog člana familije TGF-beta vezujućih proteina. Kod sklerosteozisa, kosti skeleta pokazuju značajno povećanje u mineralnoj gustini u odnosu na zdrave jedinke. Kost u glavi pokazuje takođe prekomeran rast. Pacijenti sa sklerosteozom su generalno zdravi iako mogu pokazivati različite stepene sindaktilije pri rođenju i različite stepene kranijalne kompresije i nervne kompresije u lobanji.
"Linkage" analize (analize genetskog povezivanja) genskog defekta koji je povezan sa skleorosteozom izvedene su primenom metode mapiranja homozigotnosti na DNK uzorke sakupljene od 24 afričke (Afrikaaners-belci potomci holanđana koji su naselili Južnu Afriku) familije iz Južne Afrike kod kojih se javila bolest. (Scheffild et al., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. "Identification of Bardet-Biedl svndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an effecient approach to homozygosity mapping"). Afrička populacija Južne Afrike je genetski homogena; populacija vodi poreklo od nekolicine osnivača koji su kolonizovali područje pre nekoliko vekova, i bili su izolovani geografski i socijalnim barijerama od osnivanja. Sklerosteozis je retka bolest svuda u svetu van ove "Afrikaaner"-afričke zajednice, što ukazuje na to da je mutacija u genu bila prisutna u populaciji koja je osnovala zajednicu i od tada se povećavala zajedno sa rastom populacije. Upotreba mapiranja homozigotnosti se bazira na pretpostavci da je veća verovatnoća da markeri za mapiranje DNK bliski recesivnoj mutaciji budu homozigotni kod obolelih individua iz familija u krvnom srodstvu i izolovanih populacija.
Grupa od 371 mikrosatelitnih markera (Research Genetcis, Set 6) iz autozomalnih hromozoma odabrano je da se odrede skupine DNK iz uzoraka pacijenata sa sklerosteozom. DNK uzorci za ovu analizu došli su od 29 pacijenata sa sklerosteozom iz 24 familije, 59 zdravh nezahvaćenih ovom bolešću članova familija i grupe nesrodnih kontrlnih individua iz iste populacije. Grupa (pool) se sastojala do 4-6 individua, ili obolelih individua, obolelih individua iz familija u krvnom srodstvu, roditelja i neobolelih braća i sestara, ili nesrodne kontrole. U grupi sa nerodnim individuama i u većini grupa sa obolelim individuama ili članovima familja, analiza markera pokazala je nekoliko alelskih veličina za svaki marker. Jedan marker, D12S1299, pokazivao je indikaciju homozigotnosti: jednu traku u nekoliko grupa obolelih individua.
Svih 24 familija sa skleorsteozom su analizirane sa ukupno 19 markera u regionu D12S1299 (na 17ql2-q21). Obolele individue iz svake familije pokazivale su homozigotnost u ovom reghgionu, i 25 od 29 individua bilo je homozigotno za "ćore "-srž haplotip; svaka je imala isti alel između D17S1787 i D17S930. Druge četiri individue imale su jedan hromozom koji se poklapao sa ovim haplotipom i drugi koji nije. Sveukupno, ukazuju da ovaj region od 3 megabaze sadrži sklerosteoznu mutaciju. Analiza sekvenci većine egzona u ovom regionu od 3 megabaze identifikovana je kao besmislena "nonsense" mutacija u kodirajućoj sekvenci za novi TGF-beta vezujući protein (C>T mutacija na poziciji 117 SEQ ID NO 1 rezultuje u stop kodonu). Ova mutacija se pokazala kao jedinstvena za pacijente sa sklerosteozom i pronosioce koji vode poreklo od "Afrikaaner"-a. Identitet gena je dalje potvrđen identifikovanjem mutacije u intronu (A>T mutacija na poziciji +3 u intronu) koja rezultuje u nepravilnoj obradi iRNK u pojedinačnom, nesrodnm pacijentu sa dijagnozom sklerosteoze.
PRIMER 2
TKIVNA SPECIFIČNOST EKSPRESIJE GENA ZA TGF-BETA VEZUJUĆI
PROTEIN
A. Ekspresija Humanog Beer gena pomoću RT-PCR
Prvi lanac cDNK je pripremljen od sledećih uzoraka ukupne RNK pomoću komercijalno dostupnog kompleta (kit) ("Superscript Preamplification Svstem for First-Strand cDNA Svnthesis" Life Technologies, Rockville, MD): mozga čoveka, jetre čoveka, slezine čoveka, humane placente (posteljice), humanih skeletnih mišića, tiroidee čoveka, hipofize čoveka, osteoblasa čoveka (NHOst od Clonetics Corp., San Diego, CA), ćelijske linije humanog osteokarinoma (Saos-2, ATCC#HTB-85), kosti čoveka, koštane srži čoveka, humane hrskavice, kosti "vervet" majmuna,saccharomyces cerviseae,i humanih monocita periferne krvi. Svi uzorci RNK kupljeni su od komercijalnog izvora (Clontech, Palo Alto, CA) osim sledećih koji su pripremljeni "u-kući": humani osteoblast, ćelijska linija humanog osteokarcoma, humana ksot, humana hrskavica i kost "vervet" majmuna. Ovi RNK uzorci iz kuće pripremljeni su pomoću komercijalno dostupnog kompleta ("TRI Reagent", Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH).
PCR je izveden na ovim uzorcima i dodatno sa uzorskom humanog genoma kao kontrolom. "Sense" (kodirajući) Beer oligonukleotidni prajmer imao je skevencu 5'-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEQ ID NO: 19). "Antisense" (nekodirajući) Beer oligonukleotidni prajmer imao je skevencu 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3'
(SEQ ID NO:20). Dodatno, PCR je izveden sa prajmerima za humani beta-aktinski gen , kao kontrola. "Sense" (kodirajući) beta-aktin oligonukleotidni prajmer imao je skevencu 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA CC-3' (SEQ ID NO:21). "Antisense"
(nekodirajući) beta-aktin oligonukleotidni prajmer imao je skevencu 5'-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEQ ID NO:22). PCR je izveden pomoću standardnih uslova u reakciji od 25 ul, na temperaturi za vezivanje prajmera od 61 atepen celzijusa. Trideset dva ciklusa PCR izvedeno je sa prajmerima za Beer i dvadeset četiri ciklusa izvedeno je sa beta-aktin prajmerima.
Nakon umnožavanja, 12 ul od svake reakcije je analizirano na agaroznom gelu pomoću elektroforeze i bojenja sa etidijum bromidom. Videti sliku 2A.
B. RNKIn - situhibridizacija isečaka mišijih embriona
Kompletna cDNK mišijegBeer(SEQ ID NO: 11) klonirana je u pCR2.1 vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) u oba smera i kodiraj ućem i nekodirajućem pomoću protokola proizvođača.<35>S-alfa-GTP-obeleženi cRNK kodirajući i nekodirajući transkripti sintetisani su pomoćuin vitroreagensa za transkripciju obezbeđenih od Ambion, Ine (Austin, TX). In-situ hibridizacija izvedena je na osnovu protokola Lyons et al., (J. Cell. Biol. 111:2427-2436, 1990).
MišijaBeercRNK proba detektovala je specifičnu poruku koja je eksprimirana u neuralnoj cevi, pupoljcima udova, krsvnim sudovima i koštanoj hrskavici embriona miša koji se razvija. Sličica A na slici tri prikazuje ekspresiju u apikalnoj epidermalnoj brazdi (aer) izdanka uda (1), krvnim sudovima (bv) i nervnoj cevi (nt). Sličica B pokazuje ekspresiju u 4-oj ventrikuli mozga (4). Sličica C pokazuje ekspresiju u mandibuli (ma) cervikalnom pršlejnu (cv), okcipotalnoj kosti (oc), nepcu (pa) i krvnom sudu (bv). Sličica D prikazuje ekspresiju u rebrima (r) i srčanom zalisku (va). Sličica A je transverzalni isečak 10.5 dpc embriona. Sličica B je sagitalni isečak od 12.5 dpc embriona i sličice C i D su sagitalni isečci od 15.5 dpc embriona.
ba-branhijalni svod (arch), s=srce, te=telencefalon (veliki mozak), m=mozak, f=frontalna masa, c=creva, s=srce, v=vilica, j=jetra, pl=pluća, ot=ušni sud, ao=, ks=kičmeni stub, skm=skeletni mišić, ns=nazalni sinus, ti=timus, je=jezik, puv prednji udovi, di=dijafragma.
PRIMER 3
EKSPRESIJA I PREČIŠĆAVANJE REKOMBINANTNOG BEER PROTEINA
A. Ekspresija u COS-1 ćelijama
DNK sekvenc koja kodira kompletan Beer protein umnožena je pomoću sledećih PCR oligonukleotidnih prajmera: 5' oliginukleotidni prajmer imao je sekvencu 5'-AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' 'SEQ ID NO:23) i sadržao je Hindlll restrikciono mesto (bold) nakon čega sledi 19 nukleotidaBeergena počevši od 6 baznih parova pre pretpostavljnog amino terminalnog start kdona (ATG). 3' oliginukleotidni prajmer imao je sekvencu 5'-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGT AGGCGTTCTCCAGCT-3' (SEQ ID NO:24) i sadržao je HIndIl restrikciono mesto (bold) nakon čega je sledio reverzni kompelmentni stop kodom (CAT) nakon čega je sledio reverzni komplement FLAG epitopa (podvučen, Sigma-Aldrich Co., St. Louis MO) okružen sa reverznim komplementom nukleotida koji kodiraju karbokslini kra % amino kiselina u Beer-u. PCR proizvod je TA kloniran ("Original TA Clonong Kit", Invitrogen, Carlsbad, CA) i pojedinačni klonovi su pregledani sekvenciranjem DNK. Klon koji je potvrđen sekvencom je zatim sečen sa Hindlll i prečišćen na 1,5% agaroznom gelu pomoću komercijalno dostupnih reagensa ("QIAquick Gel Extraction Kis", Qiagen Inc., Valencia, CA). Ovaj fragment je zatim ligiran sa Hindll sečenim , tertiranim sa fosfatazom pcDNK3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) plazmidom sa T4 DNK ligazom. DH10BE. colisu transformisane i zasejanc na LB šolje sa 100 u.g/ml ampicilina. Kolonije koje su nosile željenog rekombinanta u odgovarajućoj orjentaciji identifikovane su sa PCR-om, pomoću 5' prajmera koji odgovara T7 promotoru/mestu za vezivanje u pcDNK3.1 i 3' prajmera sa sekvencom 5'-GCACTGGCCGGAGC ACACC-3' (SEQ ID NO:25). koji odgovara reverznom komplementu unutrašnje BEER sekvence. Sekvenca kloniranog fragmenta potvrđena je DNK skevenciranjem.
CSO-1 ćelije (ATCC# CRL-1650) korišćene su za transfekciju. 50 jag ekspresionog plazmida pcDNK-Beer-Flag je transfektovano pomoću komercijalno dostupnog kompleta na osnovu protokola koji je obezbedio proizviđač ("DEAE-dextran Transfection Kit", Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Finalni medijum nakon transfekcije bio je DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) koji sdarži 0.1% fetalni serum govečeta. Nakon 4 dana u kulturi medijum je uklonjen. Ekspresija rekombinantnog BEER je analizirana pomoću SDS-PAGE i "Western blot" analize pomoću anti-FLAG® M2 monoklonalnog antitela (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Prečišćavanje rekombinantnog Beer proteina izvedeno je pomoću anti-FLAG M2 afinitativne kolone ("Mammalkian, Transint Expression Svstem", Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Profil kolone je analiziran preko SDS-Page i "Western blot" analize pomoću anti-FLAG M2 monoklonalnog antitela.
B. Ekspresija u SF9 insketskim ćelijama
HumanaBeersekvenca umnožena je pomoću PCR-a sa standardnim uslovima i sledećim prajmerima:
"Sense" kodirajući prajmer:
"Antiense" nekodirajući prajmer:
Rezultujuća cDNK sadržala je kodirajući region Beere sa dev modifikacije. N-terminalni sekrecioni signal je uklonjen i FLAG epitop obeležje (Sigma) je fuzionisano u fazi - "in frame" u odnosu na C-terminalnim krajom inserta. BamHl i Hindlll mesta za kloniranje dodata su i gen je subkloniran u pMelBac vektor (Invitrogen) radi transfera u bakulovirusni ekspresioni vektor pomoću standardnih metoda.
Rekombinantni bakulovorusi koji eksprimiraju Beer protein napravljeni su pomoću Bac-N-Blue kompleta za transformaciju (invitrogen) i prečišćeni na osnovu uputstava proizviođača.
SF9 ćelije (Invitrogen) su održavane u TNM FH mcdijumu (Invitrogen) koji sadrži 10%) fetalni serum govečeta. Za ekspresiju proteina, SF9 kulture u bočicama za obrtanje (spinner flsaks) su inficirane pri MOI većoj od 10. Uzorci medijuma i ćelija uzimani su svakodnevno tokom par dana, i ekspresija Beer je monotorovana putem "Western blot" analize pomoću anti-FLAG M2 monoklonalnog antitela (Sigma) ili anti-Beer zečijeg poliklonalnog antiseruma.
Nakon pet dana SF9 ćelije koje su inficirane sa bakulovirusom pokupljene su centirfugiranjem i proteini vezani za ćeliju su ekstrahiovani pomoću ekstrakcije sa puferom sa soli (1.5 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5). Ekstrakt (20 ml po 300 ml kulture) je razbistren centri fugiranj em, urađena je dijaliza tri puta sa četiri litra fiziološkog rastvora puferisanog sa Tris-om (150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5) i ponovo centirfugiran. Frakcija bogata sa soli je nanesena na Hitrap Heparin (Pharmacia; 5 ml zapremina "bed"), intezivno oprana sa fiziološkim rastvorom puferisanim sa HEPES-om (25 mM HEPES, 150 mM NaCl) i vezani proteini su eluirani sa gradijentom od 150 mM NaCl do 1200 mM NaCl. Elucija Beer-a je primećena na otprilike 800 mM NaCl. Frakcijama koje sadrže Beer dodat je 10% glicerol i 1 mM DTT i zamrznute su na -80 stepeni C.
PRIMER 4
PRIPREMA I TESTIRANJE POLIKLONALNIH ANTITELA NA BEER, GREMLIN I
DAN
A. Priprema antigena:
DNK sekvence humanog Beer, humanog Gremlin, i humanog DAN umnožene su pomoću starndardnih PCR metoda sa sledećim oligionukleotidnim prajmerima:
U svakom slučaju gore navedeni prajmeri umnožavaju čitavi kodirajući region minus sekreciona signalna sekvenca. Ovi regioni ukljčuju restrikciona mesta za subkolniranje u nakterijski ekspresioni vektor pQE-30 (Qiagen Ine, Valencia, CA) na mestima BamHi/Hindlll za Beer i Gremlin, i mestima Sacl/Hindlll za Dan. pQE30 sadrži kodirujuću sekvencu za 6x His "tag" (nekoliko histidina jedan do drugoga služe kao obeležje) na 5' kraju regiona za kloniranje. Završeni konstrukti su transformisani uE. colisoj M-15/pRep (Qiagen Ine) i pojedinačni klonovi su potvrđeni sekvenciranjem. Ekspresija proteina u M-l 5/pRep i prečišćavanje (6x His afinitativno "tag" vezivanje za Ni-NTA vezan sa agarozom) izvedena jc kao što je opisao proizvođač (Qiagen, The Qiaexpressionist).
Beer protein izveden izE. colije dobijen u značajnoj količini pomoću solubilizacije u 6M guanidinu i urađena je dijaliza 2-4M da bi se sprečila precipitacija tokom skladištenja. Gremlin i Dan proteini su dobijeni u većoj količini sa solubilizeijom u 6M guanidinu i naknadno prečišćavanje je urađeno sa koncentracijom guanidina 0.5M.
B. Proizvodnja i testiranje poliklonalnih antitela:
Poliklonalna antitela za svako do tri antigena proizvedena su u domaćinima, zecu i u piletu, pomoću standardnih protokola (R&R Antibodv, Stanwood, WA; standardni protokol za imunizaciju i dobijanje antiseruma; Short protocols in Molecular Biologv. 2-go izdanje. 1992. 11.37-11.41. Učesnici Helen M. Cooper i Yvonne Paterson; antiserumi pileta dobijeni su Strategic Biosolutions, Ramona, CA).
Zečiji antiserumi i Igy frakcija jajeta pileta su pregledani na aktivnost pomoću "Western blot" analize. Svaki od tri antigena odvojen je pomoću PAGE i prebačeni su na nitrocelulozu 0.45 um (Novex, San Diego, CA). Membrana je isečena u trake pri čemu je svaka traka imala otprilike 75 ng antigena. Trake su blokirani u 3% "blotting Grade Block" (Bio-Rad Laboratoriee, Hercules, CA) i isprani su 3 puta u IX fiziološkom rastvoru puferisanom sa Tris-om (TBS)/0.02% TWEEN pufer. Primarno antitelo (preimunizaciona iskrvavljivanja, zečiji antiserumi ili pileći IgY jajeta u dilucijama od 1:100 do 1:10,000 u puferu za blokiranje) je inkubirano sa trakama tokom jednog sata sa blagim ljuljanjem. Nakon Druge serije od tri pranja IX TBS/0.02% TVVEEN sledila je tokom jednog sata inkubacije sa sekundarnim antitelom (sa peroksidazom konjugovan magareći anti-zečiji, Amersham Life Science, Piscataway, NJ; ili peroksidazom konjugovan magareći anti-pileći, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Izveden je finalni ciklus od 3X pranja u IX TBS/0.02% TWEEN i tarke su razvijene sa Lumi-Light Western Blotting Substraet (Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Germany).
C. Test unakrsne-reaktivnost antitela:
Nakon protokola koji je opisan u prethodnom odeljku, nitrocelulozn trake Beer, Gremline, ili Dan su inkubirane sa razblaženjima (1:5000 i 1:10000) njihovih odgovarajućih zečijih antiseruma ili IgY jajeta pileta kao i sa antiserumima ili pilećim Igy (razblaženja 1:1000 i 1:5000) napravljenim sa dva preostala antigena. Povećani nivoi nepoklapajućih antitela izvedeni su da bi se detektovao nizak afinitet vezivanja od strane onih antitela kooja se mogu videt samo pri povećanim koncentracijama. Protokol kao i trajanje razvijanja bilo je isto za sva tri događaja vezivanja u protokolima koji su gore opisani. Nije postojalo unakrsno vezivanje antigena kada su testirana sva tri antigena.
PRIMER 5
INTERAKCIJA BEER SA TGF-BETA SUPER-FAMILIJOM PROTEINA
Interakcija Beer sa proteinima iz različitih filogenetskih garna TGF-P super-familije proučavana je pomoću metoda imunoprecipitacije. Prečišćeni TGF-P-1, TGF-P-2, TGF-P-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 i GNDF dobijeni su iz komercijalnih izvora (R&D sistemi; Minneapolis, MN). Reprezentativni protokol sledi. Delimično prečišćeni Beer je dijaliziran u fiziološkim rastvorom puferisanim sa HEPES-om (25 mM HEPES 7.5, 150 mM NaCl). Imunoprecipitacija je izvedena u 300 ul IP pufera (150 mM NaCl, 25 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1.4 mM p-markaptoetanol, 0.5%. Triton X 100 i 10% glicerol). 30 ng rekombinantnog humanog BMP-5 proteina (R&D systems) dodato je u 15 ul FLAG afinitativnog matriksa (Sigma; St. Louis, MO)) u prisustvu i dosustvu 500 ng FLAG epitop-obeležen Beer. Proteini su inkubirani tokom 4 sata@ 4°C i zatim su proteini vezani za afinitativni matriks isprani 5 puta u IP puferu (1 ml po pranju). Veznai proteini su eluirani sa afinitativnog matriksa u 60 mikrolitara IX SDS PAGE puferu za uzorke. Proteini su razdvojeni putem SDS-PAGE i Beer povezani BMP-5 je detektovan "Western blot" analizom pomoću anti-BMP-5 antiseruma (research Diagnostics, ine) (videti sliku 5).
Esej za vezivanje Beer liganda
FLAG-Beer protein (20 ng) je dodat u 100 ul PBS/0.2% BSA i absorbovan je u svakom bunarčiću na mikrotitar ploči sa 96 bunarčića koji su prethodno obloženi sa anti-FLAG monoklonalnim antitelima (Sigma; St Louis MO) i blokiran sa 10% BSA u PBS. Ovo je sve izvedeno na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta. Rastvor proteina je uklonjen i bunarčići su oprani da bi se uklonio nevezani protein. BMP-5 je dodat u svaki bunarčić u kopncentracijama u opsegu od 10 pM do 500 nM u PBS/0.2% BSA. Nivoi BMP-5 su detektovani zatim pomoću BMP-5 anti-seruma preko ELISA testa (F.M. Ausubel et al.,
(1998) Current Protocols In Mol. Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22). Specifično vezivanje je izračunato oduzimanjem ne-specifičnog vezivanja od ukupnog vezivanja i analizirano putem LIGAND programa (Munson and Podbard, Anal. Biochem., 107, p220-239,
(1980).
U varijaciji ove metode, Beer je konstruiše i eksprimira kao humani Fc fuzioni protein. Kao i ligand BMP se konstruiše i eksprimira kao mišija Fc fuzija. Ovi proteini se zajedno inkubiraju i izvodi se esej kao što je opisao Mellor et al., pomoću fluorescentne detekcije homogeno razdvojenog vremena (G. W. Mellor et al., J. of Biomol Screening, 3(2) 91-99, 1998).
PRIMER 6
ESEJ ZA PREGLEDAVANJE INHIBICIJE VEZIVANJA TGF-BETA VEZUJUĆEG
PROTEINA ZA ČLANOVE TGF-BETA FAMILIJE
Esej koji je gore opisan se replicira uz dva izuzetka. Prvo, BMP se drži fiksiran na Kd koja je ranije određena. Drugo, kolekcija antagonističkih kandidata se dodaje u fiksnim koncentracijama (20 uM u slučaju kolekcije malih organskih molekula i 1 uM u studijama antitela). Ovi kandidatni molekuli (antagonosti) vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina uključuju organska jedinjenja izvedena iz komercijalnih izvora ili internih kolekcija koje predstavlaju raznolike hemijske strukture. Ova jedinjenja se pripremaju kao stoko vi rastvora u DMSO i dodaju se u eseju u bunarčiće <1% finalne zapremine u standardnim uslovima za izradu eseja. Oni se inkubiraju 2 sata na sobnoj temperaturi sa BMP i Beer, rastvor se uklanja i vezani BMP se kvantifikuje kao što je opisano. Agensi koji inhibiraju 40% vezivanje BMP koje se detektuje u odsustvu jedinjenja ili antitela smatraju se da su anatgonisti interakcije. Oni se dalje porocenjuju kao potencijalni inhibitori na osnovu studfija titracije da bi se odredile konstante inhibicije i njihov uticaj na afinitet vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina. Komparativni kontrolni eseji za afinitet takođe se mogu izvesti da bi se utvrdio selektivni profil za identifikovani antagonist kroz studije pomoću eseja u zavisnosti od akcije BMP liganda (na primer BMP/BMP studije kompeticvije receptora).
PRIMER 7
INHIBICIJA LOKALIZACIJE TGF-BETA VEZUJUĆEG PROTEINA ZA MATRIKS
KOSTI
Procena inhibicije lokalizacije za matriks kosti (hidroksiapatit) je sprovedena pomoću modifikacija metode Nicolas-a (Nicolas, V., Calcif Tissue Int 57:206, 1995). Ukratko,<125>I-obeležen TGF-beta vezujući protein se priprema kao što je opisano Nicolas (već navedeno). Hidroksiapatit se dodaje u svaki bunarčić na mikrotitar ploči sa 96 bunarčića koja je opremljena sa polipropilenskom filtracionom membranom (Polvfiltronic, Weymouth MA). TGF-beta vezujući protein se dodaje u 0.2% albumin u PBS puferu. Bunarčići koji sadrže matriks isprani su 3 puta sa ovim puferom. Absorbovani TGF-beta vezujući protein je eluiran sa 0.3M NaOH i kvantifikovan. Identifikacija inhibitora je izvedena preko inkubacije TGF-beta vezujućeg proteina sa test molekulom i nanošebnja mešavine na matriks kao što je gore opisano. Matriks se ispira 3 puta sa 0.2%) albuminom u PBS puferu. Absorbovani TGF-beta vezujući protein je eluiran sa 0.3M NaOH i kvantifikovan. Agensi koji inhibiraju 40% vezivanje BMP koje se detektuje u odsustvu jedinjenja ili antitela smatraju se da su inhibitori lokalizacije kosti. Ovi inhibitori se dalje karakterišu preko studija odgovora na doze da bi se odredile njihove konstante inhibicije i njihov uticaj na afinitet vezivanje TGF-beta vezujućeg proteina.
PRIMER 8
KONSTRUISANJE MUTANTA TGF-BETA VEZUJUĆEG-PROTEINA
A. Mutageneza
cDNK kompletne dužine od TGF-beta vezujućeg proteina u pBluescript SK služi kao matrica za mutagenezu. Ukratko, odgovarajući prajmeri, (videti u diskusiji koja je gore obezbeđena) su korišćeni za dobijanje DNK fragmenta pomoću lančane reakcije polimeraze pomoću Vent DNK polimeraze (New England Biolabs, Beverlv MA). Lanbčene reakcija polimeraze je izvedena 23 ciklusa u puferuima koji su obezbeđeni od strane proizviđača i korišćena je temperatura za vezivanje prajmera od 57°C. Proizvod je zatim izložen dvoma restrikcionim enzimima i nakon izolacije pomoću agarozne elektroforeze, ponovo je ligiran u pRBP-503 iz koga je odgovarajuća poklapajuća sekvenca uklonjena enzimatskim sečenjem. Integritet mutanta je potvrđen pomoću sekvenciranja DNK.
B. Ekspresija sisarskih ćelija i izolacija mutanata TGF-beta vezujućeg proteina: cDNK mutantnog TGF-beta vezujućeg proteina su prebačene su u pcDNA2.1 sisarski ekspresioni vektor opisan u primeru 3. Nakon potvrde sekvence rezultujući konstrukti su transfektovani u CO-1 ćelije, i sekretovani protein je prečišćen kao što je opisano u primer 3.
PRIMER 9
GENERISANJE TRANSGENIH MIŠEVA KOJI PREKOMERNO EKSPRIMIRAJU
BEER GEN
Približno 200 kilobaza (kb) BAC klona 15G5, izolovanog od CITB misije genomske DNK biblioteke (distribuirano od strane Research Genetics, Huntsville AL) upotreblejno je da se odredi kompletna sekvenca mišijeg Beer gena i njegovih 5' i 3' regiona koji ga okružuju. Sali fragment od 41 kb, koji sadrži kompletan gen, plus približno 17 kb 5' sekvence koje ga okružuje i približno 20 kb od 3' sekvence koje ga okružuje subkloniran u BamHi mesto u SuperCosI kozmidni vektor (Stratagene, La Jolla, CA) i propagiran je u E. coli soj DH10B. Iz ovog kozmidnog konstrukta, 35 kb MluI-AvilI restrikcioni fragment (broj sekvence 6) uključujući kompeltan mišiji Beer gen, kao i 17 kb i 14 kb 5' i 3' okolne sekvence, prečišćenio je na gelu, konvencionalnim putem, i upotrebljeno za minkroinjekciju u misije zigote (DNX Transgenics; US. Patent No. 4,873,191). Životinje osnivači u kojime je kloniran fragment DNK integrisan nasumice u genom dobijene su pri frekvenci od 5-30% od živorođenih mladunaca. Prisustvo trasngena potvrđeno je "Southren blot" analizom genomske DNk ekstrahovane iz male količine mišijeg tkiva, kao što je vrh repa. DNK je izdvojena pomoću sledećeg protokola; tkivo je digerirano preko noći na 55°C u puferu za liziranje koji sadrži 200 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, i 5 mg/ml Proteinaze K. Sledećeg dana DNK je ekstrahovana jednom sa fenol/hloroform (50:50), jednom sa hloroform/izoamil alkoholom (24:1) i precipitirana je sa etanolom. Nakon resuspendovanja u TE (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA) 8-10 ug svakog uzorka DNK je sečeno sa restrikcionom endonukleazom, kao što jeEcoRI, zatim je podvrgnut elektroforezi na gelu i prebačen je na naelektrisanu najlonsku membranu kao što je HyBondN+ (Amersham, Arlington,Heights, IL). Dobijeni filter je zatim hibridizovan sa radioaktivno obeleženim fragmentom DNK dobijenim od mišijegBeergenskog lokusa, i i koji je sposoban da prepozna i fragment endogenog genskog lokusa kao i fragment različite veličine koji vodi poreklo od transgena. Životinje osnivači su ukrštane sa normalnim ne-transgenim miševima da bi se dobio dovoljan broj transgenog i ne-transgenog potomstva u kome se određuju efekti prekomerne ekspresijeBeergena. Iz ovih studija, životinje različite starosti (na primer 1 dan, 3 nedfelje, 6 nedelja, 4 meseca) su podvrgnute različitim esejima čiji jc cilj utvrđivanje formiranje ukupnog skeleta, mineralne gustine kostiju, mineralnog sadržaja kostiju, aktivnosti osteoklasta i osteoblasta, nivoa endohondralnog okoštavanja, formiranje hrskavice itd. Transkripciona aktivnost transgena može se odrediti ekstrakcijom RNK iz različitih tkiva, i pomoću RT-PCR eseja koji koristi polimorfizam na nivou jednog nukleotida između mišijeg soja iz kog je izveden transgen (129Sv/J) i soja miševa koji se korsite za DNK mikroinjektiranje ((C57BL5/J X SJL/J)F2).
ŽIVOTINJSKI MODELI-II
POREMEĆAJ MIŠIJEG BEER GENA PUTEM HOMOLOGE REKOMBINACIJE
Homologa rekombinacija embrionskih stem (ishodnih) (ES) ćelija može se koristiti u cilju inaktiviranja endogenog mišijegBeergena nakon čega se dobijaju životinje koje nose mutaciju koja je dovela do gubitka funkcije. Reporter gen, kaoE. coligenza ( 5-galaktozidazu jekonstruisan u ciljni vektor tako daje ekspresija kontrolisana od starne endogenog promotoraBeergena i signala za inicijaciju transkripcije. Na ovaj način, prostorni i vremenski raspored ekspresijeBeergena može se odrediti u životinjama koje nose ciljane alele.
Ciljani vektor je konstruisan prvo kloniranjem promotora za fosfoglicerat kinazu (PGK) koji se selektuje lekom i koji je pod kontrolom genske kasete zarezistenciju na neomicin ( neo)iz pGT-N29 (New England Biolabs, Beverlv, MA) u vektor za kloniranje pSP72 (Pormega, Madson, WI). PCR je upotrebljen da se obuhvati PGKneo kaseta sa Pl i loxP metsima za bakteriofage, koji su mesta prepoznavanja za Pl Cre rekombinazu (Hoess et al., PNAS USA, 79:3398. 1982). Ovo omogućava naknadno uklanjanje markera za neo-rezistenciju u ciljanim ES ćelijama iliživotinjama izvedenim iz ES ćelija (US Patent 4,959,317). PCR prajmeri su obuhvatali 34 nukleotida (nt) loxP sekvence, 15-25 nt komplementarnih sa 5' i 3' krajevima PGKneo kasete, kao i restrikciona mesta koja prepoznaju restrikcioni enzimi (BamHI u kodirajućem prajmeru i EcoRI u nekodirajućem prajmeru) za klonoiranje u pSP72. Sekvenca kodirajućeg prajmera je bija 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGA
AGTTATCTGC AGG ATTCGAGGGCCCCT-3' (SEQ ID NO:34), sekvenca nekodirajućeg prajmera bila je 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAAT
AACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTG
A-3' (SEQ ID NO:35).
Sledeći korak bilo je kloniranje 3.6 kb XhoI-HindII fragmenta koji sadržiE. coligenza / 3- galaktozidazui SV40 signal za poliadenilaciju iz pSVp (Clonetech, Palo Alto, CA) u pSP72-PGKneo plazmid. "Kratak krak" homologije iz mišijeg Beer genskog lokusa dobijen je umnožavanjem fragmenta od 2.4 kb iz BAC klona 15G5. 3' kraj fragmenta koincidirao je sa mestom inicijacije translacije u Beer genu, i upotrebljen nekodirajući prajmer za PCR uključio je takođe 30 nt komplementarnih sa 5' krajem genaza ( 5-galaktozidazutako da kodirajući region može biti fuzionisan sa mestom za inicijaciju Beer gena u fazi čitanja. Pristup koji je koriščen za unošenje "kratkog kraka" u pSP72-pgal-PGKneo plazmid bio je da se linearizuje plazmid na mestu koje je uzvodno od /?-galgena i zatim da se ko-transormiše ovaj fragment sa "kratkim krakom" PCR produkta i da se odaberu plazmidi u kojima je PCR proizvod integrisan homologom rekombinacijom. Kodirajući prajmer za umnožavanje "kratkog kraka" uključio je 30 nt komplementarnih sa pSP72 vektorom da bi se dozvolio ovaj rekombinantni događaj. Sekvenca kodirajućeg parajmera bila je 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAG
CAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3' (SEQ ID NO:36),
sekvenca nekodirajućeg parajmera bila je 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAAT
CATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3' (SEQ ID NO:37).
"Dugi krak" iz genskog lokusa zaBeerdobijen je umnožavanjem fragmenta od 6.1 kb iz BAC klona 15G5 sa prajmerima koji takođe ubacuju mesta za enzime koji retko seku, SgrAI, Fsel, AscI i Pad. Posebno, sekvenca kodirajućeg prajmera bila je 5'-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (SEQ ID NO:38); sekvenca nekodirajućeg prajmera bila je 5'- ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATA
TGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT (SEQ ID NO:39). Dobijeni PCR proizvod kloniran je u TA vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kao intermedijerni korak.
Misiji konstrukt koji je ciljao Beer gen takođe je uklučio drugi selektivni marker, gen zatimidim kinazu herpes simpleks virus I(HSVTK) pod kontrolom dugih terminalnih elemenata ponovaka raus sarkoma virusa (RSV LTR, long terminal repeats). Ekspresija ovih gena čini sisarske ćelije osetljivim (i nevijabilnim) na ganciklovir; zato je ovo zgodan način za selekciju nasuprot ćelijama koje su rezistentne na neomicin kod kojih se konstrukt integrisao kao ne-homologi događaj (US Patent 5,464,464). RSV LTR-HSVTK kaseta je umnožena iz pPS1337 pomoći prajmera koji dozvoljavaju naknadno kloniranje u Fsel i AscI mesta u "dugom kraku" TA plezmidnog vektora .Za ovaj PCR sekvenca kodirajućeg prajmera bila je 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGATTCAAG CTCTGA-3' (SEQ ID NO:40); sekvenca nekodirajućeg parajmera bila je 5'-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT -3' (SEQ ID NO:41).
Finalni korak u konstruisanju ciljanog vektora uključuje kloniranje sgrAI-AscI fragmenta od 8.8 kb koji sdarži "dugi krak" RSV LTR- HSVTK gena u SgrAI i AscI mesta u pPS72 -"kratki krak"-pgal-PGKneo plazmida. Ovaj ciljani vektor linearizovan je sečenjem sa ili AscI ili PacI pre elektroporacije u ES ćelije.
PRIMER 10
INAKTIVACIJA BEER GENA POSREDOVANA NEKODIRAJUĆOM
(ANTISENSE) SEKVENCOM
Nekodirajući oligonujkleotidi od 17 nt pripremljeni su u preklapajućem formatu, tako da 5' kraj prvog oliginukleotida preklapa se sa AUG kodonom za inicijaciju translacije Beer transkripta, i 5' krajevi sukcesivnih oligonukleotida su svaki za po 5 nukleotida duži krećući se ka 5' kraju (do udaljenosti od 50 nukleotida), u odnosu na AUG Beer-a. Odgovarajući kontrolni oligonukleotidi dizajnirani su i pripremljeni pomoću ekvivalentne kompozicije baza ali su ponovo distribuirani u sekvenci da bi se inhibirala bilo kakva značajna hibridizacija za kodirajućom iRNK. Dostavljanje reagensa u test ćelijski sistem izvedeno je preko katjonskog lipidnog dostavljannja (P.L. Felgner,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84:7413, 1987). 2 ug nekodirajućeg oligonukleotida je dodato u 100 ul redukovanog serum medijuma (Opti_MEM I redukovani serum medijum; Life Technologies, Gaithersburg, MD) i ovo je pomešano sa Lipofektin reagensom (6 ul)
(Life Technologies, Gaithersburg, MD) u 100 ul redukovanog serum medijuma. Sastojci su pomešani, pušteno je da se formiraju kompleksi tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi i mešavina je dodata u prethodno zasejane MC3T3E21 ili KS483 ćelije. Ove ćelije su gajene i izolovana je RNK. Beer RNK je monitorovana pomoću RT-PCR u konjunkciji sa Beer specifičnim prajmerima. Dodatno, odvojeni eksperimentalni bunarčići su sakupljeni i okarakterisan je nivo proteina pomoću "\Vestren blot" metode opisane u primeru 4. Ćelije su sakupljene, rsuspendovane u puferu za liziranje (50 mM Tris pH 7.5, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS) i pokupljeni su solubilni proteini. Ovaj materijal je nanešen na 10-20% gradijent denaturišući SDS PAGE. Razdvojeni proteini su prebačeni na nitrocelulozu i izveden je ""Western blot" kao što je gore opisano pomoću antitela reagnesa koji su opisani. Paralelno sa ovim, kontrolni oligonukleotidi su dodavani u identične kulture i eksperimentalne operacije su ponovljene. Smanjenje u Beer iRNK ili smanjenje nivoa proteina smatra se značajnim ako tretman sa nekodirajućim oligonukleotidom rezultuje u 50% promeni na bilo kom nivou kada se uporedi sa kontrolnim "serambled" oligonukleotidom. Ovakva
metodologija omogućava selektvinu inaktivaciju gena i zatim karakterizaciju fenotipa mineralizovanih nodula u modelu kulture tkiva.
PRIMER 11
MODELOVANJE REGIONA SRŽI (ĆORE) SKLEROSTINA
Tehnike prepoznavanja homologije (na primer, PSI-BLAST (Alschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-402 (1997)), FUGUE (Shi et al.,J. Mol. Bio.310:243-57 (2001)) ukazale su na to da region srži SOS (SOST_Core tj SOSTSrž) zauzima strukturu cistinskog-čvora. FUGUE je senzitivan metod za detekciju homologije između sekvenci i struktura. Humani horionski gonadoptrin p (hCG-P), za koji je poznata eksperimentalno determinisana 3D struktura, identifikovanje sa FUGUE (Shi et al.,već naveden)kao najbliži homolog SOST_Srž. Zato, hCG-P je upotrebljen kao strukturna matrica da se izgrade 3D modeli za SOST Srž.
Ravnanje i poređenje SOST Srž i njegovih bliskih homologa prikazano je na slici 7. Među homolozima prikazanim u poređenju, samo hCG-P (CGHB) imao je poznatu 3D strukturu. Identičnost sekvence između SOST Srž i hCG-P bila je približno 25%. Osam CIS ostataka je konzervirano u okviru familije, što naglašava sveukupnu strukturnu sličnost između SOST_Srž i hCG-p. Tri para cisetina (1-5, 3-7, 4-8) formirala su disulfidne veze (prikazane kao pune linije na slici 7) u "čvor" konfiguraciju, koja je karakteristična za cisteinsku čvor strukturu (upakovanost). Ekstra disulfidna veza (2-6) prikazana tačkasto na slici 7, bila je jedinstvena za ovu familiju i razlikovala je familiju proteina od drugih cistein-čvor familja (na primer TGF-p, BMP).
SOST Srž je modeliran primenom PDB (Berman et al.,Acta Crystalograph. D. Biol. Crystallogr.58(Pt 6 Ptl):899-907 (2002) ulaz 1HCN, 3D struktura hCG-p (Wu et al.,Structure2:545-58 (1994)), kao strukturna matrica. Modeli su proračunati sa MODELER-om (Sali & Blundell,J. Mol. Biol.234:779-815 (1993)). Prikaz najboljeg modela prikazanje na Slici 8.
Najveći broj cistein-čvor proteina formira dimere jer im nedostaje hidrofobna srž u monomeru (Scheufler et al., već naveden; Schlunegger i Grutter,J. Mol. Biol.231:445-58 (1993)); Wu et al., već naveden). Izgleda da SOST sledi ovo pravilo i formira homodimer da bi povećao stabilnost. Konstruisanje modela za dimerizovan SOST Srž regiona predstavljalo jenekoliko izazova jer (1) sličnost sekvenci između SOST Srž i hCG-p je bila niska (25%); (2) umesto homodimera, hCG-p je formirala heterodimer sa hCG-a; i (3) broj različitih relativnih konformacija monomera je zapažena u dimerizovanom cisetin-srž proteinima iz različitih famlija (na primer, PDGF, TGF-P, Neurotrofin, IL-17F, gonadotropin), što ukazuje na to da bi konformacija dimera SOST mogla da odstupa znatno od heterodimerne konformacije hCG-a/p. U konstruisanju modela, hCG-a je zamenjne sa hCG-P iz heterodimerne strukture (1HCN) pomoću tehnika strukturne superimpozicije kombinovanih sa ručnim podešavanjem, i zatim je model homodimera SOST Srž izgrađen na osnovu pseudo hCG-P homodimerne strukture. Finalni model je prikazan na slici 9.
PRIMER 12
MODELOVANJE SOST-BMP INTERAKCIJE
Primer opisuje proteinsko modelovanje vezujućih mesta receptora tipa I i tipa II na BMP koja su uključena u interakciju između BMP i SOST.
Studije kompeticije su pokazale da SOST kompetira sa oba, i receptorom tipa I i receptorom tipa II za vezivanje za BMP. U ELISA-baziranom testu kompeticije BMP-6 je selektivno interagovao sa površinom obloženom sklerostinom (300 ng/bunarčiću) sa visokim afinitetom (Kd=3.4 nM). Rastuće koncentracije BMP receptora IA (FC fuzioni konstrukt) kompetirale su sa sklerostinom za vezivanje za BMP-6 (11 nM) (IC5o=114 nM). Desetostruki molarni višak BMP receptora je dovoljan sa se redukuje vezivanje sklerostina za BMP-6 za otprilike 50%. Ova kompeticija biće zabeležena sa BMP receptor II-FC fuzionim proteinom (IC5o=36 nM) i DAN (1050=43 nM). Specifičnost eseja je pokazana odsustvom kompeticije za vezivanje za BMP-6 između sklerostina i rActivin R1B-FC fuzionog proteina, člana familija TGF-P receptora koji se nije vezao za BMP.
Vezujuća mesta receptora tipa I i tipa II na BMP polipeptidu su mapirana i prostorno su razdvojena (Scheufler et al., već naveden; Innis et al., već naveden, Nickel et al., već naveden; Hart et al., već naveden). Noggin, još jedan BMP antagonist koji se vezuje za BMP sa visokim afinitetom, kontaktira BMP i na vezujućem mestu receptora tipa I i tipa II preko N-terminalnog dela Noggin-a (Groppe et al., već naveden). Dva P-lanca u regionu srži blizu C-terminusa takođe kontaktiraju BMP na vezujućem mestu receprora tipa II.
Ručno podešavajuće poređenje Noggin i SOST ukazalo je na to da dva polipeptda dele sekvencnu sličnost između N-terminalnih delova proteina i između regiona srži. Poređenje amino kiselinskih sekvenci prikazano je na slici 10. Cisteinski ostaci koji formiraju karakterističnu cis-čvor strukturu bili su konzervirani između Noggin i SOST. Sveukupna identičnost sekvenci bila je 24% i identičnost sekvenci u okviru N-terminalnog vezujućeg regiona (pozicije poređenja 1-45) bila je 33%. Dva ostatka u Noggin N-terminalnom vezujućem regionu, uglavnom Leu (L) na poziciji poređenja 21 i Glu (E) na poziciji 23 su primećeni da igraju važne uloge u vezivanju za BMP (Groppe et al., već naveden). Oba ostatka su konzervirana takođe i u SOST. Sličnost sekvenci u okviru regiona srži (pozicije poređenja 131-228) bile su oko 20%, ali cis-čvor "scaffold" je bio zadržan i dovoljan broj ključnih ostataka je konzerviran i podržavao je homologiju između Noggin i SOST.
Noggin struktura je upoređena sa SOST da bi se takođe razumelo kako dva SOST monomera dimerzijuju. Kao što je prikazano na slici 11, Noggin struktura predlaže da linker (povezivač) između N-terminalnog regiona i regiona srži ne samo da igra ulogu u povezivanju ova dva regiona, već formira takođe deo dimerizacionog interfejsa između Noggin monomera. Jedna glavna razlika između Noggin i SOST je da je linker između N-terminalnog regiona i regiona srži znatno kraći u SOST.
C-terminalni region SOST možda igra ulogu u SOST dimerizaciji. Sekvenca Noggin se završava u regionu srži, dok SOST ima ekstra C-terminalni region. U Noggin strukturi disulfidna veza povezuje C-terminuse Noggin monomera. Zato, C-terminalni region
SOST započinje bliže interfejsu dva monomera i mogao bi da doprinosi dimerizaciji. Dodatno, predikcija sekundarne strukture pokazuje da neki delovi C-terminalnog regiona SOST imaju tendenciju da formiraju helikse. Ovaj region u SOST može biti odgovoran za dimerizacionu aktivnost, verovatno preko heliks-heliks pakovanja, koje oponašaju funkciju dužeg linkera u Noggin. Još jedna razlika između strukture Noggin i SOST je amino kiselinska insercija u regionu sržu SOST na pozicijama poređenja 169-185 (videti sliku 4). Ova insercija je produžila p-ukosnicu koja je usmerena ka interfejsu dimerizacije u Noggin strukturi (prikazano na slici 11 kao region petlje u sredini monomera i iznad C-terminalnog Cis ostatka). Produžena p-ukosnica doprinosi SOST dimerizaciji.
PRIMER 13
DIZAJNIRANJE I PRIPREMA SOST PETIDNIH IMUNOGENA
Ovaj primer opisuje dizajniranje SOST peptidnih imunogena koji se koriste za imunizaciju životinja i generisanje antitela koja blokiraju interakcije između BMP i SOST i sprečavaju formiranje SOST monomera.
BMP vezujući fragmenti
Sveukupna sličnost između SOST i Noggin i sličnost između N-terminalnih regiona dva polipeptida ukazuje na to da SOST može da interaguje sa BMP na sličan način kao i sa Noggin. To znači da N-terminalni region SOST može da interaguje sa oba mesta za vezivanje i receptora tipa I i tipa II na BMP i deo regiona srži (amino kiselinska pozicija u poređenju 190-220 na slici 10) može da interaguje sa mestom za vezivanje receptora tip II tako da antitela specifična za ove SOST regione mogu da blokiraju ili oslabe vezivanje BMP za SOST.
Amino kiselinske sekvence ovih SOST polipeptdnih fragmenata za pacovski i humani SOST obezbeđeni su kao što sledi.
SOST N Linker: N-terminalni region (uključuje kratak linker (povezivač) koji povezuje sa regionom srži)
Humani:
Pacovski:
SOSTCoreBind (SOST Srž Vezivanje): Deo regiona srži koje verovatno kontaktira BMP na njegovom mestu za vezivanje receptora tipa II (produženo malo na oba kraja da bi uključio CIS ostatak sidra (anchors)):
Humani:
Pacovski:
Fragmenti dimerizacije SOST
C-terminalni region SOST verovatno je uključen u formiranje SOST homodimera (videti primer 12). Produžena P-ukosnica može takođe da igra ulogu u formiranju homodimera. Antitela koja se specifično vezuju za ovakve regione mogu da spreče ili oslabljuju dimerizaciju SOST monomera, koji zauzvrat mogu da se umešaju u interakciju između SOST i BMP. Polipeptidni fragemnti u pacovu i čoveku koji odgovaraju ovim regionima su sledeći.
SOST C: C-terminalni region
Humani:
Pacovski:
SOSTCoreDimer: Deo regiona srži koji je verovatno umešan u SOST dimerizaciju (produžen malo na oba kraja da bi uključio CIS ostatak sidra (anchors)):
Humani:
Pacovski:
Fragment za vezivanje BMP na SOST N- terminusu
Ključni N-terminalni vezujući region SOST-a (pozicije poređenja 1-35 na slici 10) je modelovan na bazi strukture Noggin/BMP-7 kompleksa (Protein Data Bank Entry No:lM4U) i poređenje amino kiselinske sekvence (videti sliku 10) da bi se identifikovali amino kiselinski ostaci na SOST N-terminusu koji verovatno interaguju sa BMP. Model SOST je prikazan na slici 12. U komparativnom modelu, fenilalanin (Phe, F) na poziciji poređenja 8 (videti strelicu i tekst uz nju) u SOST sekvenci projektuje se u hidrofobni džep na površini BMP dimera. Ista osobina "čvor-u-rupi" primećena je u strukturi BMP i receptor I kompleksa (Nickel et al., već naveden), gde Phe 85 receptor takođe se uklapa i isti džep, što predstavlja ključnu osobinu u prepoznavanju Ligand-tip I receptora za članove familije TGFp (uključujući na primer, TGFp familiju, BMP familiju i slične). Na osnovu ovog modela, prolin (Pro) usmerena zavojnica (tura) takođe je konzervirana, i omogućava da se N-terminalni vezujući fragment proteže duž površine BMP dimera, putujući od mesta za vezivanje receptora tipa I, do mesta za vezivanje receptora tip II na drugoj strani kompleksa. Takođe je konzervirana druga Pro-usmerena zavojnica, blizu karboksi kraja vezujućeg fragmenta, koja povezuje linker (povezivački) region. Produženi kontakti zimeđu SOST i BMP su evidentni na slici 12.
Peptidni imunogeni
Peptidi su dizajnirani da obuhvate SOST N-terminalni region koji je predviđen za mesto kontaktiranja sa BMP proteinima. Peptidne sekvence su predstavljene dalje u tekstu. Za imunizaciju životinja, peptidne sekvence su dizajnirane da se preklapaju i dodat je dodatni cistein na C-terminalnom kraju da bi se olakšalo unakrsno povezivanje sa KLH. Peptidi su zatim upotrebljeni za imunizaciju. Peptidne sekvence imunogena u sledeće.
Humani SOST:
Humani SOST peptidi sa dodatnim Cis:
SOST nacova:
SOST pacova sa dodatnim Cis:
Sledeći peptidi su dizajnirani da sadrže deo amino kiselina regiona srži za koji je predviđeno da pravi kontakt sa BMP proteinima. Cistein je dodat na C-terminalni kraj svakog peptida za konjugaciju sa KLH i konjugovani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju. U N-terminalnom peptidu dela za pristajanje u srži (Docking-Core N-Teminal Peptide) unutrašnji cistein je zamenjen u serin da bi se izbegla dupla konjugacija sa KLH.
Za Humani SOST:
Amino kiselinska sekvenca bez dodatih cis ostataka:
Docking Ćore N-terminal Peptid (Pristajanje Srž N-terminalni Peptid):
Dockins Ćore Cterm Pentid:
Docking Ćore N-term Peptid:
Docking Ćore Cterm Peptid:
Za SOS pacova:
Amino kiselinska sekvenca bez dodatih ili zamenjenih cis ostataka:
Docking CoreN-terminaln Peptid:
Docking Ćore Cterm Peptid:
Peptidni imunogeni sa dodatom i substituisanom Cis:
Docking Ćore N-terminal Peptid:
Docking Ćore Cterm Peptid:
Dva regiona u okviru SOST koji potencijalno interaguju i formiraju SOST homodimere uključuju amino kiseline sa SOST regionom srži koje nisu prisutne u Noggin. Humani SOST peptididi koji su dizajnirani da imaju ovu sekvencu imali su C-terminalni ilu N-terminalni cis koji je konjugiran sa KLH. Za pacovski SOST peptid, cistein je dodat na karboksi terminus sekvence (SEQ ID NO:76). KLH konjugirani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju.
Za humani SOS:
Za SOST pacova:
SOST peptid pacova sa dodatim cis:
Drugi region u okviru SOST koji potencijalno interaguje i formira SOST homodimere uključuje C-terminalni region. Peptidni imunogeni su dizajnirani da uključe amino kiselinske sekvence u okviru ovog regiona (vodeti dalje u tekstu). Za konjugaciju sa KLH, cisteinski ostatak je dodat na C-terminalni kraj i konjugovani peptidi su upotrebljeni za imunizaciju.
Za humani SOST:
Peptidni imunogeni sa cis dodatim na C-terminusu:
Za SOST pacova:
Peotidni imunoeeni sa cis dodatim na C-temirnusu:
PRIMER 14
ESEJ ZA DETEKCIJU VEZIVANJA ANTITELA ZA TGF-BETA
VEZUJUĆI PROTEIN
Ovaj primer opisuje esej za detekciju vezivanja liganda, na primer, antitela ili njegovog fragmenta za sklerostin.
FLAG®-slerostin fuzioni protein je pripremljen na osnovu protokola obezbeđenog od strane proizvođača (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i kao što je opisano u U.S. Patent No. 6,395,511. Svaki bunarčić mikrotitar ploče sa 96 bunarčića je obložen sa anti-FLAG® monoklonalnim antitelom (Sigma Aldrich) i zatim blokirano sa 10% BSA u PBS. Fuzioni protein (20 ng) dodat je u 100 ul PBS/0.2% BSA i absorbovan je na ploči sa 96 bunarčića tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Proteinski rastvor je uklonjen i bunarčići su isprani da bi se uklonio nevezani fuzioni protein. BMP, na primer, BMP-4, BMP-5, BMP-6 ili BMP-7, je rastvoren u PBS/0.2% BSA i dodat u svaki bunarčić u koncentracijama u opsegu od 10 pM do 500nM. Posle inkubacije od 2 sata na sobnoj temperaturi, rastvor za vezivanje je uklonjen i ploča je tri puta oprana sa 200 ui zapreminama PBS/0,2% BSA. Vezivanje BMP za sklerostin je detektovano upotrebom poliklonalnog antiseruma ili monoklonalnog antitela specifičnog za BMP i odgovarajueg enzim-konjugovanog drugog koraka reagensa na osnovu standardnih ELISA tehnika( videti,na primer, Ausubel et al.,Current Protocols in Mol. Biol.Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Specifično vezivanje je proračunato oduzimanjem ne-specifičnog vezivanja od ukupnog vezivanja i analizirano upotrebom LIGAND programa (Munson i Podband,Anal. Biochem.107:220-39 (1980)).
Vezivanje sklerostina za BMP takođe je detektovano detekcijom fluorescencije homogenim razdvajanjem vremena (Mellor et al.,J. Biomol. Screening3:91-99 (1998). Polinukleotidna sekvenca koja kodira sklerostin je operativno povezana sa humanim konstantnim regionom imunoglobulina u rekombinantnom nukleinsko kiselinskom konstruktu i eksprimiran kao humani Fc-sklerostin fuzioni protein na osnovu metoda koje su poznate u nauci i ovde opisane. Slično, BMP ligand je konstruisan i eksprimiran kao BMP-mišiji Fc fuzioni protein. Ova dva fuziona proteina inkubirana su zajedno i sproveden je esej kao što je opisano od strane Mellor et al.
PRIMER 15
ESEJ ZA PREGLEDANJE ANTITELA KOJA INHIBIRAJU VEZIVANJE ČLANOVA TGF-BETA FAMILIJE ZA TGF-BETA VEZUJUĆI PROTEIN
Ovaj primer opisuje metodu za detektovanje antitela koje inhibira vezivanje člana TGF-beta familije za sklerostin. ELISA se izvodi u suštini kao što je opisano u primeru 14 osim što je BMP koncentracija držana fiksiranom na njegovoj Kd (determinisano na primer putem BIAcore analize). Pored toda, antitelo ili bibliotekai ili kolekcija antitela dodata je u bunarčiće u koncentraciji od 1 uM. Antitela su inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa BMP i sklerostinom, uklonjen je rastvor i vezani BMP je kvantifikovan kao što je opisano (videti primer 14). Antitela koja inhibiraju 40% od primećenog BMP vezivanja u odsusutvu antitela smatraju se kao antagonosti ovih interakcija. Ova antitela se dalje procenjuju kao potencijalni inhibitori primenom studija titriranja da bi se odredila njihova konstanta inhibicije i njihov efekat na afinitet vezivanja za TGF-beta vezujući protein. Kontrolni eseji za poređenje specifičnosti takoeđ se mogu sprovesti da bi se utvrdio selektivni profil za identifikovani antagonist upotrebom eseja koji zavise od akcije BMP liganda (na primer, studija kompeticije BMP/BMP receptora).
PRIMER 16
INHIBIČIJA LOKALIZACIJE TGF-BETA VEZUJUĆEG
PROTEINA ZA KOŠTANI MATRIKS
Procena inhibicije lokalizaije za koštani matriks (hidroksiapatit) je izvedena pomoću modifikacija metode od Nicolas( Calcif. Tissue Int.57:206-12 (1995)). Ukratko<l25>I-obeležen TGF-beta vezujući protein je pripremljen kao što je opisao Nicolas (već naveden). Hidroksiapatit je dodat u svaki bunarčić na mikortitarskoj ploči sa 96 bunarčića koja je opremljena sa polipropilenskom filtracionom membranom (Polvfiltroninc, Weymuth MA). TGF-beta vezujući protein razblažen u 0.2% abuminu u PBS puferu je zatim dodat u bunarčiće. Bunarčići koji sadrže matriks su 3 puta isprani sa 0.2%) albuminom u PBS puferu. Absorbovan TGF-beta vezujući protein je eluiran u 0.3 M NaOH i zatim kvantifikovan.
Antitelo ili drugi agens koji inhibira ili oslabljuje vezivanje sklerostin TGF-beta vezujućeg proteina za hidroksiapatit identifikovano je inkubiranjem TGF-beta vezujućeg proteina sa antitelom i nanošenjem mešavine na matriks kao što je gore opisano. Matriks je 3 puta ispran sa 0.2% albuminom u PBS puferu. Absorbovan sklerostin je eluiran u 0.3 M NaOH i zatim kvantifikovan. Antitelo koje inhibira nivo vezivanja sklerostina za hidroksiapatit za najmanje 40% kada se uporedi sa nivoom vezivanja koje se detektije u odsustvu antitela se smatra za inhibitora koštane lokalizacije. Ovakvo antitelo se dalje karakteriše u studijama odgovora na dozu da bi se odredila njegova konstanta inhibicije i efekat na afinitet vezivanja TGF-beta vezujućeg proteina.
Iz svega gore navedenog, iako su specifična ostvarenja pronalaska ovde opisana ilustracije radi, različite modofikacije se mogu primeniti bez odstupanja od duha i polja pronalaska. Na osnovu toga, pronalazak nije ograničen osim sa patentnim prijavama.

Claims (20)

  1. Prijavljujemo sledeće patentne zahteve: 1. Antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koji se specifično vezuje za sklerostinski polipeptid, pomenuti sklerostinski polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO: 102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM 001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM 030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP 001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO:110), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:lll); NM 033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO:114); CAA88759 (SEQ ID NO:l 15); ili NM 001204 (SEQ ID NO:l 13).
  2. 2. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za sklerostinski polipeptid i koje oslabljuje formiranje sklerostinskog homodimera, naznačeno time da sklerostinski polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 14,46 ili 65.
  3. 3. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačeno time daje antitelo poliklonalno antitelo.
  4. 4. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačeno time da je antitelo monoklonalno antitelo.
  5. 5. Antitelo iz patentnog zahteva 4 naznačeno time daje monoklonalno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od mišijeg monoklonalnog antitela, humanog monoklonalnog antitela, pacovskog monoklonalnog antitela i monoklonalnog antitela hrčka.
  6. 6. Hibridoma ćelija koja proizvodi antitelo iz patentnog zahteva 4.
  7. 7. Domaćinska ćelija koja jc sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 4.
  8. 8. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačeno time daje antitelo huamnzovano antitelo ili himerno antitelo.
  9. 9. Domaćinska ćelija koja je sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 8.
  10. 10. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačeno time da je fragment koji vezuje antigen odabran iz grupe koja se sastoji od F(ab')2, Fab', Fab, Fd, i Fv.
  11. 11. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2 koje obuhvata jednolančano antitelo.
  12. 12. Domaćinska ćelija koja je sposobna da eksprimira antitelo iz patentnog zahteva 11.
  13. 13. Kompozicija koja obuhvata antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, na osnovu ili patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2 i fiziološki prihvatljiv nosač.
  14. 14. Imunogen koji sadrži peptid koji se sastoji od najmanje 21 uzastopne amino kiseline i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP, naznačeno time da mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO:102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM_001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM 030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP 001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO:l 10), i naznačeno time daje mesto za vezivanje receptora tipa II BMP sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO:lll); NM 033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO:114); CAA88759 (SEQ ID NO:115); ili NM_001204 (SEQ ID NO: 113).
  15. 15. Imunogen koji sadrži peptid koji se sastoji od najmanje 21 uzastopne amino kiseline i ne više od 50 uzastopnih amino kiselina SOST polipeptida, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, naznačeno time je peptid sposoban da izazove u ne-humanoj životinji antitelo koje se specifično vezuje za SOST polipeptid i koje oslabljuje formiranje SOST homodimera.
  16. 16. Imunogen iz patentnog zahteva 14 ili patentnog zahteva 15 naznačeno time daje peptid povezan sa molekulom nosačem.
  17. 17. Imunogen iz patentnog zahteva 16 naznačeno time daje molekul nosač polipeptidni nosač.
  18. 18. Imunogen iz patentnog zahteva 17 naznačeno time da je polipeptidni nosač hemocijanin kapičastog puža.
  19. 19. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom na osnovu patentnog zahteva 14, naznačeno time da (a) SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65; (b) antitelo kompetitivno inhibira vezivanje SOST polipeptida za najmanje jedno od (i) mesta za vezivanje receptora tipa I morfogenog proteina kosti (BMP) i (ii) mesta za vezivanje receptora tipa II BMP; (c) mesto za vezivanje receptora tipa I BMP je sposobno da veže polipeptid receptora tipa I BMP koji poseduje amino kiselinsku sekvencu prikazanu u GeneBank Acc. Nos. NM 004329 (SEQ ID NO:102); D89675 (SEQ ID NO: 103); NM 001203 (SEQ ID NO: 104); S75359 (SEQ ID NO: 105); NM 030849 (SEQ ID NO: 106); D38082 (SEQ ID NO: 107); NP_001194 (SEQ ID NO: 108); BAA19765 (SEQ ID NO: 109); ili AAB33865 (SEQ ID NO: 110), i (d) mesto za vezivanje receptora tipa II BMP je sposobno da se veže za BMP tipa II receptorski polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od GenBank Acc. Nos. U25110 (SEQ ID NO: 111); NM 033346 (SEQ ID NO: 112); Z48923 (SEQ ID NO:l 14); CAA88759 (SEQ ID NO:l 15); ili NM 001204 (SEQ ID NO:l 13).
  20. 20. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za SOST polipeptid, pomenuti SOST polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 6, 8, 14, 46 ili 65, koja obuhvata imunizaciju ne-humane životinje sa imunogenom na osnovu patentnog zahteva 15, naznačeno time da antitelo oslabljuje formiranje SOST homodimera.
YU20050932A 2003-06-16 2004-06-15 Kompozicije i postupci za povećanje mineralizacije kostiju RS52769B (sr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MEP-31/08A MEP3108A (xx) 2003-06-16 2004-06-15 Kompozicije i postupci za povećanje mineralizacije kostiju

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/463,190 US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2003-06-16 Compositions and methods for increasing bone mineralization
PCT/US2004/018910 WO2005003158A2 (en) 2003-06-16 2004-06-15 Compositions and methods for increasing bone mineralization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS20050932A true RS20050932A (sr) 2008-11-28
RS52769B RS52769B (sr) 2013-10-31

Family

ID=33563705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU20050932A RS52769B (sr) 2003-06-16 2004-06-15 Kompozicije i postupci za povećanje mineralizacije kostiju

Country Status (24)

Country Link
US (3) US20040009535A1 (sr)
EP (3) EP2341071A1 (sr)
JP (2) JP4818107B2 (sr)
KR (1) KR101221147B1 (sr)
CN (2) CN103319596A (sr)
AU (1) AU2004253870B2 (sr)
BR (1) BRPI0411535A (sr)
CA (1) CA2529578C (sr)
CY (1) CY1114701T1 (sr)
DK (1) DK1638999T3 (sr)
EA (2) EA014525B1 (sr)
ES (1) ES2428767T3 (sr)
HR (1) HRP20131014T1 (sr)
IL (2) IL172599A (sr)
ME (2) MEP3108A (sr)
NO (1) NO20060235L (sr)
NZ (1) NZ544617A (sr)
PL (1) PL1638999T3 (sr)
PT (1) PT1638999E (sr)
RS (1) RS52769B (sr)
SG (1) SG185824A1 (sr)
SI (1) SI1638999T1 (sr)
WO (1) WO2005003158A2 (sr)
ZA (1) ZA200600384B (sr)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE338120T2 (de) 1998-11-27 2006-09-15 Ucb Sa Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der knochenmineralisierung
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US7332276B2 (en) * 2002-03-01 2008-02-19 Celltech R&D, Inc. Methods to increase or decrease bone density
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
WO2003087763A2 (en) 2002-04-03 2003-10-23 Celltech R & D, Inc. Association of polymorphisms in the sost gene region with bone mineral density
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
AU2003276430A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
NZ544618A (en) * 2003-06-16 2009-02-28 Celltech R & D Inc Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US20100041599A1 (en) * 2006-11-14 2010-02-18 Dakai Liu Compositions and methods for bone formation, bone remodeling and toxin protection
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US8367822B2 (en) * 2003-09-22 2013-02-05 Enzo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8637506B2 (en) * 2003-09-22 2014-01-28 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US8343922B2 (en) * 2004-05-19 2013-01-01 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for the stimulation or enhancement of bone formation and the self-renewal of cells
US9052324B2 (en) 2004-05-19 2015-06-09 Enzo Biochem, Inc. Compounds and assays for controlling Wnt activity
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
US20100183695A1 (en) 2004-05-27 2010-07-22 John Knopf Cerberus/coco derivatives and uses thereof
EP3489257A1 (en) 2004-07-23 2019-05-29 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8202546B2 (en) 2005-08-04 2012-06-19 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US7998500B2 (en) * 2005-08-04 2011-08-16 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
US7901710B2 (en) * 2005-08-04 2011-03-08 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for use under physiologically stressful conditions
US8263137B2 (en) * 2005-08-04 2012-09-11 Vertical Pharmaceuticals, Inc. Nutritional supplement for women
EA026874B1 (ru) * 2005-11-23 2017-05-31 Акселерон Фарма Инк. Антагонисты активина-actriia и их применение для стимулирования роста кости
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US20090203041A1 (en) * 2006-04-21 2009-08-13 Wei Shi Bmp4 inhibitors
WO2008061013A2 (en) * 2006-11-10 2008-05-22 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2008133722A2 (en) * 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
EP2099471A2 (en) 2006-12-08 2009-09-16 Acceleron Pharma, Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP4176884A1 (en) 2006-12-29 2023-05-10 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
MX354099B (es) 2007-02-01 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de activina-actriia y usos para tratar o prevenir cancer de mama.
TW201940502A (zh) 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
PL2120999T3 (pl) 2007-02-09 2013-01-31 Acceleron Pharma Inc KOMPOZYCJE FARMACEUTYCZNE ZAWIERAJĄCE ANTAGONISTÓW AKTYWINY-ActRIIA I ICH ZASTOSOWANIE W ZAPOBIEGANIU LUB LECZENIU SZPICZAKA MNOGIEGO
PL2131860T3 (pl) 2007-03-20 2014-05-30 Lilly Co Eli Przeciwciała przeciwko sklerostynie
US8133553B2 (en) 2007-06-18 2012-03-13 Zimmer, Inc. Process for forming a ceramic layer
US8309521B2 (en) 2007-06-19 2012-11-13 Zimmer, Inc. Spacer with a coating thereon for use with an implant device
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
CN101861161B (zh) 2007-09-18 2017-04-19 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
US8608049B2 (en) 2007-10-10 2013-12-17 Zimmer, Inc. Method for bonding a tantalum structure to a cobalt-alloy substrate
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
MX2010006519A (es) * 2007-12-14 2010-10-15 Amgen Inc Metodo para tratar una fractura de hueso con anticuerpos anti-esclerostina.
WO2009110215A1 (ja) * 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
CA2728301A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Osteogenex Inc. Vinpocetine and eburnamonine derivatives for promoting bone growth
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
JP5922928B2 (ja) 2008-08-14 2016-05-24 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 赤血球レベルを高めるためのｇｄｆトラップの使用
WO2010083034A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
US8772236B2 (en) * 2009-02-06 2014-07-08 Pepscan Systems B.V. Truncated cystine-knot proteins
CA2757095C (en) 2009-03-30 2020-04-14 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
BRPI1010587A2 (pt) 2009-06-08 2019-04-09 Acceleron Pharma Inc. métodos para aumentar adipócitos termogênicos
BRPI1010704B1 (pt) 2009-06-12 2021-12-14 Acceleron Pharma Inc Polipeptídeo recombinante, proteína de fusão recombinante, preparação farmacêutica e uso da mesma
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
CA2795886A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
SMT202000095T1 (it) 2010-05-14 2020-03-13 Amgen Inc Formulazioni di anticorpi anti-sclerostina ad alta concentrazione
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
KR20180129991A (ko) 2010-11-05 2018-12-05 노파르티스 아게 Ｉｌ-１７ 길항제를 사용한 류마티스성 관절염의 치료 방법
EP2638065A4 (en) 2010-11-08 2014-04-09 Acceleron Pharma Inc ACTRIIA-BINDING SUBSTANCES AND ITS USES
CA2828000A1 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
JP2014511842A (ja) 2011-03-25 2014-05-19 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体結晶およびその製剤
FR2974061B1 (fr) 2011-04-13 2013-06-07 Michelin Soc Tech Procede et dispositif de comptage du nombre d'atterrissages d'un pneumatique d'un aeronef
HRP20181649T1 (hr) 2011-04-19 2018-12-14 Amgen Inc. Metoda liječenja osteoporoze
EP2702408A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Novartis AG Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
WO2013010254A1 (en) * 2011-07-19 2013-01-24 University Health Network Biomarkers for ankylosing spondylitis
HUE039786T2 (hu) 2011-08-04 2019-02-28 Amgen Inc Csonthiány-defektusok kezelési módszere
EP2753626B1 (en) 2011-09-02 2018-08-08 The Regents of The University of California Llp2a-bisphosphonate conjugates for osteoporosis treatment
IN2014CN04634A (sr) 2011-12-28 2015-09-18 Amgen Inc
JP6770312B2 (ja) 2012-07-05 2020-10-14 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 骨疾患の治療
CA3120678A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporaiton Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
ES2763869T3 (es) 2013-03-20 2020-06-01 Genzyme Corp Métodos para tratar la osteogénesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
EP2991685A4 (en) 2013-05-03 2016-11-16 Selecta Biosciences Inc LOCAL, SIMULTANEOUS ADMINISTRATION OF TOLEROGENIC SYNTHETIC NANOTORIES TO REDUCE TYPE I AND TYPE IV SENSITIVITIES
MA40008A (fr) 2014-06-13 2021-05-05 Acceleron Pharma Inc Antagoniste actrii pour le traitement et la prevention d'un ulcere cutane chez un sujet ayant l'anemie
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MD4801C1 (ro) 2014-12-03 2022-10-31 Celgene Corporation Antagonişti ai activin-ActRII şi utilizarea lor pentru tratamentul sindroamelor mielodisplazice
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
MA45921A (fr) 2016-08-08 2019-06-19 Amgen Inc Procédé d'amélioration de la fixation du tissu conjonctif à l'aide d'anticorps anti-sclérostine.
SI3478719T2 (sl) 2016-12-21 2025-07-31 Mereo Biopharma 3 Limited Uporaba protiteles proti sklerostinu pri zdravljenju osteogenesis imperfecte
JP2020502218A (ja) 2016-12-21 2020-01-23 メレオ バイオファーマ ３ リミテッド 骨形成不全症の処置における抗スクレロスチン抗体の使用
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
RU2651091C1 (ru) * 2016-12-22 2018-04-18 Федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) Способ диагностики остеомиелита у детей
US11426451B2 (en) 2017-03-11 2022-08-30 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions related to combined treatment with antiinflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
WO2019154410A1 (zh) * 2018-02-12 2019-08-15 翼高生物科技有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途
SG11202008206TA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
WO2020033788A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Amgen Inc. Method of preparing an antibody pharmaceutical formulation
MX2022001805A (es) 2019-08-12 2022-06-08 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos anti-esclerostina.
AR133302A1 (es) 2023-07-19 2025-09-17 Amgen Inc Métodos de preparación de amortiguador para una formulación de proteína terapéutica

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US751929A (en) 1904-02-09 Ash-pan
US793398A (en) 1905-03-24 1905-06-27 Herschel A Schermerhorn Fastening for wagon eng-gates.
US4018884A (en) 1975-06-26 1977-04-19 Hoffmann-La Roche Inc. Fluorogenic materials and labeling techniques
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4528266A (en) 1979-10-01 1985-07-09 George Pieczenik Method of inserting unique DNA sequences into DNA vectors
US4359535A (en) 1979-10-01 1982-11-16 George Pieczenik Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4427115A (en) 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58117537A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Toray Ind Inc 感光性樹脂組成物
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US5272254A (en) 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
DE3583940D1 (de) 1984-10-02 1991-10-02 Harry M Meade Herstellung von streptavidinaehnlichen polypeptiden.
US4801542A (en) 1984-10-12 1989-01-31 Zymogenetics, Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
SG64329A1 (en) 1984-11-16 1999-04-27 American Cyanamid Co Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4897255A (en) 1985-01-14 1990-01-30 Neorx Corporation Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4744981A (en) 1985-10-17 1988-05-17 Neorx Corporation Trichothecene antibody conjugates
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
EP0289121B1 (en) 1987-05-01 1995-12-27 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8723661D0 (en) 1987-10-08 1987-11-11 British Bio Technology Synthetic gene
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
DE3889063T2 (de) 1987-10-30 1994-12-01 American Cyanamid Co Dischwefel-Analoge von LL-E33288 Antitumor-Verbindungen.
US5254678A (en) 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
EP0329184A3 (en) 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US4988496A (en) 1988-05-31 1991-01-29 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5221778A (en) 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
GB8903022D0 (en) 1989-02-10 1989-03-30 Celltech Ltd Chemical compounds
US5175383A (en) 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
DK0471036T4 (da) 1989-05-04 2004-07-19 Southern Res Inst Indkapslingsfremgangsmåde
GB8914543D0 (en) 1989-06-23 1989-08-09 Parker David Chemical compounds
EP0845537A1 (en) 1989-08-18 1998-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5359051A (en) 1990-01-11 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Compounds useful in the synthesis of nucleic acids capable of cleaning RNA
SG46445A1 (en) 1990-01-26 1998-02-20 Immunomedics Inc Vaccines against cancer and infectious diseases
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
JPH06507782A (ja) 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
JPH06502311A (ja) 1990-10-22 1994-03-17 フォックス・チェイス・キャンサー・センター Ｒｎａ療法を提供するためのｄｎａ構造
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
ES2287206T3 (es) 1991-03-01 2007-12-16 Dyax Corporation Proceso para el desarrollo de mini-proteinas de union.
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
DE4135543A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes core-streptavidin
US5203975A (en) 1991-10-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for cathodic electrodeposition of a clear coating over a conductive paint layer
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
AU676150B2 (en) 1992-01-23 1997-03-06 Merck Patent Gmbh Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0578515A3 (en) 1992-05-26 1995-05-10 Bristol Myers Squibb Co Humanized monoclonal antibodies.
JPH07507449A (ja) 1992-05-29 1995-08-24 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのストレプトアビジンの産生
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
CA2137361A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 W. French Anderson Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
EP0678034B1 (en) 1993-01-11 1999-05-26 Dana Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic t lymphocyte responses
IL108719A0 (en) 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
CA2164505A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Phillip W. Berman Hiv envelope polypeptides
JPH09506857A (ja) 1993-07-16 1997-07-08 オントーゲン コーポレーション 多成分組合せアレイ合成による有機化合物の組合せアレイの合成
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
CA2168886A1 (en) 1993-08-03 1995-02-09 Michael Raymond Pavia A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
WO1995016209A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Ciba-Geigy Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
WO1995016712A1 (en) 1993-12-15 1995-06-22 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
WO1995016918A1 (en) 1993-12-15 1995-06-22 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
WO1995024186A1 (en) 1994-03-11 1995-09-14 Pharmacopeia, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
EP0756628B1 (en) 1994-04-29 2007-11-14 Curis, Inc. Morphogenic protein-specific cell surface receptors and uses therefor
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
WO1996039486A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
WO1997044461A2 (en) 1996-05-22 1997-11-27 Novopharm Biotech, Inc. Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
WO1998046588A2 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
AU729035B2 (en) 1997-06-12 2001-01-25 Novartis Ag Artificial antibody polypeptides
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
JP2001512016A (ja) 1997-08-01 2001-08-21 ジェンセット 筋肉およびその他中胚葉組織中で発現される分泌タンパク質の５’ｅｓｔ
US6815201B2 (en) 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
EP1054689B1 (en) 1998-02-12 2003-09-10 Immune Complex, Corporation Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives
US6544485B1 (en) 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
ATE338120T2 (de) * 1998-11-27 2006-09-15 Ucb Sa Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der knochenmineralisierung
US6355271B1 (en) 1999-02-03 2002-03-12 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
ES2332916T3 (es) 1999-06-09 2010-02-15 Genentech Inc Composiciones y metodo para el tratamiento de tumores.
JP4141095B2 (ja) 1999-10-29 2008-08-27 三洋電機株式会社 半導体装置とその製造方法
EP1266000A1 (en) 2000-03-02 2002-12-18 Amgen Inc. Chordin-like-2 molecules and uses thereof
US20020106650A1 (en) 2000-06-01 2002-08-08 Paszty Christopher J. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
AU2001272482A1 (en) 2000-06-19 2002-01-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Osteolevin gene polymorphisms
EP1341814A2 (en) 2000-09-01 2003-09-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
FR2838379B1 (fr) 2002-04-12 2005-06-24 Valeo Climatisation Dispositif de purification de l'air de l'habitacle d'un vehicule automobile
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
AU2003276430A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
DE10255152A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Von Langen Ursula Lang Schadstoffsauger
US20040141875A1 (en) 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
NZ544618A (en) * 2003-06-16 2009-02-28 Celltech R & D Inc Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
PL2131860T3 (pl) * 2007-03-20 2014-05-30 Lilly Co Eli Przeciwciała przeciwko sklerostynie
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1835968B (zh) 2013-01-30
IL172599A (en) 2016-05-31
JP2011246482A (ja) 2011-12-08
JP4818107B2 (ja) 2011-11-16
EP2341071A1 (en) 2011-07-06
CN103319596A (zh) 2013-09-25
WO2005003158A2 (en) 2005-01-13
NO20060235L (no) 2006-03-14
NZ544617A (en) 2009-11-27
PT1638999E (pt) 2013-09-03
DK1638999T3 (da) 2013-10-14
EA201001528A1 (ru) 2011-06-30
US20060233801A1 (en) 2006-10-19
KR101221147B1 (ko) 2013-01-10
EA022991B1 (ru) 2016-04-29
AU2004253870B2 (en) 2011-11-10
ES2428767T3 (es) 2013-11-11
IL172599A0 (en) 2006-04-10
KR20060064568A (ko) 2006-06-13
EP1638999A2 (en) 2006-03-29
BRPI0411535A (pt) 2006-08-01
ZA200600384B (en) 2008-10-29
CY1114701T1 (el) 2016-10-05
US20100151524A1 (en) 2010-06-17
EP1638999B1 (en) 2013-07-24
CN1835968A (zh) 2006-09-20
MEP3108A (xx) 2010-02-10
HRP20131014T1 (hr) 2013-12-20
EP2338906A1 (en) 2011-06-29
PL1638999T3 (pl) 2014-04-30
US7578999B2 (en) 2009-08-25
ME00023B (me) 2010-06-10
US20040009535A1 (en) 2004-01-15
CA2529578C (en) 2014-11-18
SI1638999T1 (sl) 2013-12-31
US7985834B2 (en) 2011-07-26
AU2004253870A1 (en) 2005-01-13
EA014525B1 (ru) 2010-12-30
WO2005003158A3 (en) 2005-05-26
HK1088907A1 (en) 2006-11-17
JP2008505843A (ja) 2008-02-28
SG185824A1 (en) 2012-12-28
EA200600037A1 (ru) 2006-06-30
RS52769B (sr) 2013-10-31
CA2529578A1 (en) 2005-01-13
IL222756A0 (en) 2012-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240209075A1 (en) Antibodies Specific for Sclerostin and Methods for Increasing Bone Mineralization
CA2529578C (en) Antibodies for use in increasing bone mineralization
MXPA05013796A (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
HK1154606A (en) Compostion and methods for increasing bone mineralization
AU2012200748A1 (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
HK1189900A (en) Compositions and methods for increasing bone mineralization
HK1154603A (en) Compostion and methods for increasing bone mineralization
SG182001A1 (en) Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization