MD4801C1

MD4801C1 - Antagonişti ai activin-ActRII şi utilizarea lor pentru tratamentul sindroamelor mielodisplazice

Info

Publication number: MD4801C1
Application number: MDA20180012A
Authority: MD
Inventors: Кеннет М. АТТИ; Кристофер РОВАЛДИ; Абдеррахман ЛААДЕМ
Original assignee: Celgene Corporation; Acceleron Pharma Inc.
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2022-10-31
Also published as: ES2946160T3; NZ770419A; TWI773117B; PT3227675T; HK1248807A1; CN114675039B; CN107533040A; AU2015358469A1; TW201636044A; US11471510B2; RS64214B1; BR112017011722A2; CN114675039A; WO2016090077A1; DK3227675T3; KR20170098851A; AU2015358469B2; CA2969572A1; IL252631B2; JP2021038249A

Abstract

Invenţia se referă la metode pentru tratamentul la un subiect al sindroamelor mielodisplazice (SMD) cu risc scăzut sau intermediar-1 la mamifere, în care metodele cuprind administrarea inhibitorilor semnalizării activin-ActRII la un subiect, care necesită tratament.Secvenţe: 47

Description

1. REFERINŢE ÎNCRUCIŞATE LA CERERILE AFERENTE

Prezenta cerere revendică beneficiul priorităţii cererii de brevet provizorii US 62/086,977, depuse la 3 decembrie 2014. Prezenta cerere revendică, de asemenea, beneficiul priorităţii cererii de brevet provizorii US 62/088,478, depuse la 5 decembrie 2014; a cererii de brevet provizorii US 62/153,872, depuse la 28 aprilie 2015; a cererii de brevet provizorii US 62/173,782, depuse la 10 iunie 2015; şi a cererii de brevet provizorii US 62/218,728, depuse la 15 septembrie 2015.

2. LISTA DE SECVENŢE

Prezenta cerere este depusă cu o copie a formei citibile de un calculator (FCC) a listei de secvenţe, depuse ca nume de fişier „12827_978_228_Sequence_Listing.txt”, de o mărime de 93,638 baiţi, care a fost creată la 19 noiembrie 2015, care este identică cu copia pe hârtie a listei de secvenţe.

3. DOMENIUL

Divulgate sunt în prezenta invenţie metode pentru tratamentul de lungă durată la un subiect cu (i) anemie; (ii) anemie care necesită transfuzie de CRS; (iii) sindroame mielodisplazice (SMD); şi/sau (iv) leucemie mielomonocitară cronică neproliferativă (LMMC), în care metodele conţin administrarea unui inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII la un subiect care are nevoie de tratamentul de lungă durată. Un astfel de inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII poate fi un inhibitor al semnalizării ActRIIA şi/sau al semnalizării ActRIIB. Sunt Dezvăluite în prezenta invenţie metode de tratament de lungă durată al unui subiect cu (i) anemie; (ii) anemie care necesită transfuzie de celule roşii sanguine (CRS); (iii) SMD; şi/sau (iv) LMMC neproliferativă, în care subiectul are sideroblaşti inelari.

4. PREMISELE DE CREARE A INVENŢIEI

Anemia este scăderea numărului de celule roşii sanguine sau un număr mai mic decât cantitatea normală de hemoglobină din sânge. Anemia poate fi, de asemenea, cauzată de capacitatea scăzută de legare a oxigenului de hemoglobină. Anemia este cea mai frecventă tulburare a sângelui. Anemia poate fi cauzată de eritropoieza ineficientă. Eritropoieza ineficientă este prezentă dacă are loc eritropoieza activă, dar celulele roşii sanguinemature nu reuşesc să se dezvolte la viteza corespunzătoare. Celulele progenitoare sunt supuse apoptozei înainte de atingerea stadiului de celule roşii sanguine mature. SMD conţine tulburări ale celulelor stem hematopoietice caracterizate prin hematopoieză ineficientă. Mai mult decât atât, tulburările SMD includ tulburări caracterizate de sideroblaştii inelari. Sideroblaştii inelari sunt eritroblaşti anormali. În plus, anumite mutaţii somatice asociate cu SMD determină formarea sideroblaştilor inelari şi eritropoieza ineficientă. Mutaţiile dominante în factorul de matisare 3B1 (SF3B1) sunt asociate cu formarea sideroblaştilor inelari. Sideroblaştii inelari sunt eritroblaşti în care există cel puţin cinci granule care conţin fier (siderotice) care acoperă cel puţin o treime din circumferinţa nucleului. A se vedea, de exemplu, Mufti et al. Haematologica, no 93 (11), p. 1712-1717. Sideroblaştii inelari conţin mitocondrii încărcate cu fier. Prezenţa sideroblaştilor inelari poate fi detectată prin colorarea cu Albastru de Prusia şi vizualizare. Sideroblaştii inelari pot fi detectaţi în sângele periferic şi/sau frotiurile măduvei osoase.

Doi receptori de tip II înrudiţi, ActRIIA şi ActRIIB, au fost identificaţi în calitate de receptori ai activinei de tip II (Mathews şi Vale, Cell, no 65, 1991, p. 973-982, Attisano et al. Cell, no 68, 1992, p. 97-108). Pe lângă activină, ActRIIA şi ActRIIB pot interacţiona biochimic cu alte câteva proteine din familia TGF-beta, inclusiv BMP7, Nodal, GDF8 şi GDF11 (Yamashita et al. J. Cell Biol., no 130, 1995, p. 217-226; Lee and McPherron. Proc. Natl. Acad. Sci., no 98, 2001, p. 9306-9311; Yeo and Whitman, Mol. Cell, no 7, 2001, p. 949-957; Oh et al. Genes Dev., no 16, 2002, p. 2749-2754). ALK4 este receptorul primar de tip I pentru activine, în particular pentru activina A, iar ALK-7 poate servi şi în calitate de receptor pentru activine, în particular pentru activina B.

O proteină de fuziune umanizată constând din domeniul extracelular (DEC) al receptorului activinei de tip IIA (ActRIIA) şi domeniul Fc al IgG1 umane se leagă cu afinitate mare la semnalizarea de blocare a activinei A prin intermediul receptorului ActRIIA endogen. Activina A este un factor de diferenţiere eritroid care afectează etapele tardive ale maturării CRS (Murata M, Onomichi K, Eto Y, Shibai H, and Muramatsu M. Expression of erythroid differentiation factor in Chinese hamster ovary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, no 151, p. 230-235). Au fost descrişi inhibitori ai semnalizării ActRII pentru creşterea nivelelor de CRS (de exemplu, publicaţia cererilor de brevet [1]; [2]; [3]; [4]; [5] şi [6]).

5. ESENŢA

Invenţia prezintă un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) pentru utilizare într-o metodă de tratament al sindroamelor mielodisplazice (SMD) la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) administrarea la subiect a unei doze de un inhibitor al semnalizării ActRII cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg, dacă cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul menţionat sunt sideroblaşti inelari şi în care inhibitorul semnalizării ActRII menţionat este o polipeptidă care cuprinde: (i) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 90% identică cu SEQ ID NR:25; (ii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID NR:25; (iii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 98% identică cu SEQ ID NR:25; (iv) secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NR:25; sau (v) un fragment al domeniului extracelular al ActRIIB, în care fragmentul constă din secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NR:23; un linker; şi un Fc al unei IgG.

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, care include (a) determinarea unui procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg, dacă cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau 20% din eritroblaşti sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, tulburarea de sânge este anemie, sindroame mielodisplazice (SMD) sau leucemie mielomonocitară cronică neproliferativă (LMMC). În anumite exemple, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat la prima dată. În anumite exemple, prima dată este în termen de 1 zi, 2 zile, 3, zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni de administrare a dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII la subiect.

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al a unei tulburări de sânge la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi/sau (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%. În anumite exemple, tulburarea de sânge este anemie, SMD sau LMMC neproliferativă. Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al anemiei la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi/sau (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. Prezentat în prezenta invenţie este un inhibitor al semanilzării ActRII pentru utilizare într-o metodă de tratament al SMD la un subiect, metoda incluzând administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi/sau (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 15 %. Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al LMMC neproliferative la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi/sau (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%.

În anumite variante de realizare, perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII este de 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni. În anumite variante de realizare, procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este un procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este menţinută pentru cel puţin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 sau 10,0 ori sub procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari pentru cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, nivelul de hemoglobină iniţial la subiect este nivelul de hemoglobină la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, nivelul de hemoglobină iniţial la respectivul subiect este mai mic de aproximativ 11 g/dL. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este menţinută pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este un nivel de hemoglobină la subiect cuprins între aproximativ 11 g/dL şi 18 g/dL pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, subiectul nu necesită transfuzie de celule roşii sanguine timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat o dată la fiecare trei săptămâni. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat (i) o dată la fiecare 28 zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat prin injectare. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subcutanat.

În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a unui procent suplimentar de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari la 6, 12, 18 şi/sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti din subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat prin colorarea cu Albastru de Prusia. În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a unui nivel suplimentar de hemoglobină la 6, 12, 18 şi/sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

De asemenea, divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a unui prim procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) (i) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă scurtă dacă primul procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% sau (ii) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă lungă dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%. În anumite exemple, tulburarea de sânge este anemie, anemie care necesită transfuzie, SMD sau LMMC neproliferativă. De asemenea, divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al anemiei la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a unui prim procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b)(i) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă scurtă dacă primul procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% sau (ii) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă lungă dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzii de sânge. De asemenea, divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al SMD la un subiect, în care metoda include (a) determinarea la subiect a unui prim procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b)(i) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă scurtă dacă primul procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% sau (ii) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă lungă dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%. De asemenea, divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al LMMC neproliferative la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a primului procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) (i) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă scurtă dacă primul procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% sau (ii) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă lungă dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%.

În anumite variante de realizare, primul procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari la subiectul căruia i s-a administrat inhibitorul semnalizării ActRII pentru o perioadă scurtă este redus la mai puţin de 10%, 9%, 8%, 7% 6%, 5%, 4%, 3%, 2% sau mai puţin de 1% timp de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada scurtă de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, nivelul de hemoglobină la subiect este mai mic de aproximativ 11 g/dL. În anumite variante de realizare, nivelul de hemoglobină la subiectul căruia i s-a administrat inhibitorul semnalizării ActRII pentru o perioadă scurtă este între aproximativ 11 g/dL şi 18 g/dL timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada scurtă este de 1, 2, 3, 4 sau 5 luni. În anumite variante de realizare, perioada lungă este de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni. În anumite variante de realizare, subiectul nu necesită transfuzie de celule roşii sanguine timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat o dată la fiecare trei săptămâni. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat (i) o dată la fiecare 28 de zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat prin injectare. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subcutanat.

În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaştii inelari timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat prin colorarea cu Albastru de Prusia. În anumite variante de realizare, metoda cuprinde suplimentar determinarea la subiect a unui nivel de hemoglobină timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

În prezenta invenţie este, de asemenea, divulgată o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea faptului că subiectul are un procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari de cel puţin 10% 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (b) administrarea la subiect a unei doze iniţiale cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII; (c) determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari după o perioadă de timp; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, tulburarea de sânge este anemie, anemie care necesită transfuzie, SMD sau LMMC neproliferativă. În prezenta invenţie este, de asemenea, prezentată o metodă de tratament al anemiei la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea faptului că subiectul are un procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13 %, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (b) administrarea la subiect a unei doze iniţiale cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII; (c) determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari după o perioadă de timp; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzii de sânge. Divulgat în prezenta invenţie este un inhibitor al semnalizării ActRII pentru utilizare într-o metodă de tratament al SMD la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea faptului că subiectul are un procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari de cel puţin 15%; (b) administrarea la subiect a unei doze iniţiale cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII; (c) determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari după o perioadă de timp; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII. Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al leucemiei mielomonocitare cronice neproliferative (LMMC) la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea faptului că subiectul prezintă un procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari de cel puţin 10% , 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (b) administrarea la subiect a unei doze iniţiale cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII; (c) determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari după o perioadă de timp; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, perioada de timp este de 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată prin injectare. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată subcutanat. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată o dată la trei săptămâni. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată (i) o dată la fiecare 28 de zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile.

În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată subiectului imediat după determinarea primului procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari sau în cel mult 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile , 6 zile sau 1 săptămână, 2 săptămâni, 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 12 luni. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată subiectului imediat după determinarea celui de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari sau în cel mult 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 1 săptămână, 2 săptămâni, 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 12 luni. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este mai mare decât doza iniţială dacă cel de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%. În anumite variante de realizare, doza ajustată este de aproximativ 0,05 mg/kg, aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,15 mg/kg, aproximativ 0,25 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,35 mg/kg, aproximativ 0,4 mg/kg sau aproximativ 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,5 mg/kg sau aproximativ 1,75 mg/kg mai mare decât doza iniţială. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată mai frecvent decât doza iniţială. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată la fiecare 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35 sau 40 de zile. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată prin injectare. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată subcutanat. În anumite variante de realizare, doza ajustată nu este administrată subiectului dacă cel de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% sau mai mic de 1%. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată timp de cel mult 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni.

În anumite variante de realizare, subiectul nu necesită transfuzii de celule roşii sanguine timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat o dată la trei săptămâni. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat (i) o dată la fiecare 28 zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat prin colorarea cu Albastru de Prusia.

Divulgată în prezenta invenţie este, de asemenea, o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg dacă procentul de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari la subiectul respectiv este de cel puţin 10%, 11% , 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (c) determinarea la subiect a unui nivel de hemoglobină după ce inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului; şi (d) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă nivelul de hemoglobină la subiect este de cel puţin 11 g/dL. În anumite exemple, tulburarea de sânge este anemie, anemie care necesită transfuzie, SMD sau LMMC neproliferativă. Divulgată în prezenta invenţie este, de asemenea, o metodă de tratament al anemiei la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg dacă procentul de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari la subiectul respectiv este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (c) determinarea la subiect a unui nivel de hemoglobină după ce inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului; şi (d) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă nivelul de hemoglobină la subiect este de cel puţin 11 g/dL. În anumite exemple, subiectul necesită transfuzii de CRS. Divulgat în prezenta invenţie este un inhibitor al semnalizării ActRII pentru utilizare într-o metodă de tratament al SMD la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 15%; (c) determinarea la subiect a unui nivel de hemoglobină după ce inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului; şi (d) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă nivelul de hemoglobină la subiectul respectiv este de cel puţin 11 g/dL. Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al LMMC neproliferative la un subiect, în care metoda cuprinde: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12% , 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%; (c) determinarea la subiect a unui nivel de hemoglobină după ce inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului; şi (d) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă nivelul de hemoglobină la subiectul respectiv este de cel puţin 11 g/dL.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului o dată la fiecare trei săptămâni. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat (i) o dată la fiecare 28 de zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat prin injectare. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subcutanat.

În anumite variante de realizare, nivelul de hemoglobină este determinat timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII.

Divulgată în prezenta invenţie este, de asemenea, o metodă de promovare a eritropoiezei la un subiect având o tulburare de sânge, metoda incluzând: (a) determinarea la subiect a unui procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic a unui inhibitor al semnalizării ActRII pentru o primă perioadă de timp; c) după prima perioadă de timp, în cazul în care procentul de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari la subiectul respectiv din etapa (a) a fost peste 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17% , 18%, 19% sau 20%, reducând doza inhibitorului semnalizării ActRII administrat subiectului, reducând frecvenţa administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRIIsau întrerupând administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este anemie, anemie care necesită transfuzie, SMD sau LMMC neproliferativă. În anumite variante de realizare, metoda cuprinde suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) reducerea sau întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat. În anumite exemple, metoda include suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) reducerea dozei de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII la subiect dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat. În anumite exemple, metoda include suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) reducerea frecvenţei administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat. În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat. În anumite exemple, parametrul hematologic normalizat la subiect este un nivel al parametrului hematologic într-o populaţie de referinţă. În anumite exemple, parametrul hematologic normalizat la subiect este o ameliorare a parametrului hematologic la subiect de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% comparativ cu parametrul hematologic la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, perioada de timp anterioară administrării la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de cel puţin 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este nivelul de hemoglobină, hematocritul, numărul de celule roşii sanguine sau procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari.

În anumite variante de realizare, subiectul prezintă o probabilitate crescută de a atinge normalizarea unui sau mai multor parametri hematologici dacă cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19% sau 20% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este nivelul de hemoglobină, hematocritul, numărul de celule roşii sanguine sau procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari.

În anumite variante de realizare, parametrul hematologic normalizat este un nivel al parametrului hematologic într-o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic normalizat este o ameliorare de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% comparativ cu parametrul hematologic la subiect, la cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp anterioară administrării la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni.

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament îndelungat al anemiei la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a unui raport al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali comparativ cu un raport iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect; şi (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină la subiect înainte de administrarea la subiect a inhibitorului ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care raportul iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect este de cel puţin 1:10, cel puţin 1:7 sau cel puţin 1:5. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie.

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament îndelungat al sindroamelor mielodisplazice cu risc scăzut sau intermediar-1 (SMD) la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a unui raport al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali comparativ cu un raport iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect; şi (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină la subiect înainte de administrarea la subiect a inhibitorului ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care raportul iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect este de cel puţin 1:10, cel puţin 1:7 sau cel puţin 1:5.

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament îndelungat al leucemiei mielomonocitare cronice neproliferative (LMMC) la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a unui raport al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali comparativ cu un raport iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect; şi (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină la subiect înainte de administrarea la subiect a inhibitorului ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care raportul iniţial al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali la subiect este de cel puţin 1:10, cel puţin 1:7 sau cel puţin 1:5.

Divulgat în prezenta invenţie este, de asemenea, un procedeu de creştere a nivelului de neutrofile la un subiect, care include administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII).

Divulgat în prezenta invenţie este, de asemenea, un procedeu de creştere a nivelului de trombocite la un subiect, care conţine administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic a unui inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII).

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: (a) 90% identică cu SEQ ID NO:2; (b) 95% identică cu SEQ ID NO:2; (c) 98% identică cu SEQ ID NO:2; (d) SEQ ID NO:2; (e) 90% identică cu SEQ ID NO:3; (f) 95% identică cu SEQ ID NO:3; (g) 98% identică cu SEQ ID NO:3; (h) SEQ ID NO:3; (i) 90% identică cu SEQ ID NO:6; (j) 95% identică cu SEQ ID NO:6; (k) 98% identică cu SEQ ID NO:6; (l) SEQ ID NO:6; (m) 90% identică cu SEQ ID NO:7; (n) 95% identică cu SEQ ID NO:7; (o) 98% identică cu SEQ ID NO:7; (p) SEQ ID NO:7; (q) 90% identică cu SEQ ID NO: 2; (r) 95% identică cu SEQ ID NO:12; (s) 98% identică cu SEQ ID NO:12; (t) SEQ ID NO:12; (u) 90% identică cu SEQ ID NO:17; (v) 95% identică cu SEQ ID NO:17; (w) 98% identică cu SEQ ID NO:17; (x) SEQ ID NO:17; (y) 90% identică cu SEQ ID NO:20; (z) 95% identică cu SEQ ID NO:20; (aa) 98% identică cu SEQ ID NO:20; (bb) SEQ ID NO:20; (cc) 90% identică cu SEQ ID NO:21; (dd) 95% identică cu SEQ ID NO:21; (ee) 98% identică cu SEQ ID NO:21; (ff) SEQ ID NO:21. Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă care cuprinde: (i) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 90% identică cu SEQ ID NO:25; (ii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID NO:25; (iii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 98% identică cu SEQ ID NO:25; (iv) o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO:25; (v) un fragment al domeniului extracelular al ActRIIB, în care fragmentul constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NR:23; un linker; şi un Fc al unei IgG.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIA este o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: (a) 90% identică cu SEQ ID NO:2; (b) 95% identică cu SEQ ID NO:2; (c) 98% identică cu SEQ ID NO:2; (d) SEQ ID NO:2; (e) 90% identică cu SEQ ID NO: 3; (f) 95% identică cu SEQ ID NO: 3; (g) 98% identică cu SEQ ID NO:3; (h) SEQ ID NO:3; (i) 90% identică cu SEQ ID NO:6; (j) 95% identică cu SEQ ID NO:6; (k) 98% identică cu SEQ ID NO:6; (l) SEQ ID NO:6; (m) 90% identică cu SEQ ID NO:7; (n) 95% identică cu SEQ ID NO:7; (o) 98% identică cu SEQ ID NO:7; şi (p) SEQ ID NO:7.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă care conţine secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:7. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este o proteină de fuziune umanizată constând din domeniul extracelular al ActRIIA şi domeniul Fc al IgG1 umane.

Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: (a) 90% identică cu SEQ ID NO:25; (b) 95% identică cu SEQ ID NO:25; (c) 98% identică cu SEQ ID NO:25; (d) SEQ ID NO:25.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă care conţine secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:25.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este o proteină de fuziune umanizată constând din domeniul extracelular al ActRIIA şi domeniul Fc al IgG1 umane.

În anumite variante de realizare, subiectul este uman.

În anumite exemple, doza inhibitorului semnalizării ActRII este cuprinsă între 0,1 şi 2,25 mg/kg. Conform invenţiei, doza inhibitorului semnalizării ActRII este cuprinsă între 0,1 şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este cuprinsă între 0,7 şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,7 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,25 mg / / kg, 1,5 mg/kg, 1,75 mg/kg, 2,0 mg/kg sau 2,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 0,5 mg/kg, între 0,3 mg/kg şi 0,7 mg/kg, între 0,5 mg/kg şi 1,0 mg/kg, între 0,7 mg/kg şi 1,25 mg/kg, între 1,0 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

6. DESCRIEREA SUCCINTĂ A FIGURILOR

Fig. 1 - descrie schema de dozare şi proiectul studiului pentru Exemplul 2. A se vedea - Secţiunea 8.2. ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 2 - descrie proporţia subiecţilor care ating independenta de transfuzie a CRS (IT-CRS) mai mare de sau egală cu 56 zile pentru subiecţii cu sarcină de transfuzie ridicată (STR) sau IT-CRS mai mare de sau egală cu 56 zile cu creşterea medie a hemoglobinei (Hb) mai mare de sau egală cu 1,5 g/dL în decursul unei perioade fără transfuzie de 8 săptămâni pentru subiecţii cu sarcină de transfuzie scăzută (STS). ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 3 - prezintă nivelul hemoglobinei (Hb, g/dL) şi numărul de unităţi de transfuzie de CRS primite de un subiect cu STR exemplar care a primit o doză de 1,0 mg/kg de ActRIIA (SEQ ID NO:7). Figura 3 demonstrează că subiectul cu STR exemplar atinge IT-CRS mai mare de 56 de zile.

Fig. 4 - demonstrează durata maximă a răspunsului la sarcina de transfuzie în rândul respondenţilor cu STR (n=19) după tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO: 7) la dozele indicate. ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 5 - demonstrează durata maximă a răspunsului IT-CRS la subiecţii cu STR care au obţinut IT-CRS mai mare de sau egală cu 56 zile (n=5) după tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7) la dozele indicate. ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 6 - demonstrează proporţia subiecţilor cu STS care au obţinut IT-CRS mai mare de sau egală cu 56 zile şi o creştere medie a Hb mai mare de sau egală cu 1,5 g/dL (n=9) după tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7) la dozele indicate. ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 7 - demonstrează durata maximă a răspunsului IT-CRS la subiecţii cu STS care au obţinut IT-CRS pentru mai mult de sau egală cu 56 zile şi o creştere medie a Hb mai mare de sau egală cu 1,5 g/dL (n = 5) după tratamentul cu ActRIIA (SEQ ID NO:7) la dozele indicate. ActRIIA-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7).

Fig. 8 - descrie schema de dozare şi proiectul de studiu pentru Exemplul 2. A se vedea - Secţiunea 8.3. NI = nivelul iniţial. ActRIIB-I se referă la inhibitorul semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25).

Fig. 9 - descrie creşterea maximă a hemoglobinei la subiecţii cu STS după tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate.

Fig. 10 - descrie creşterea reticulocitelor la subiecţii cu STS după tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate.

Fig. 11 - descrie nivelele de hemoglobină la un subiect cu STS exemplar căruia i s-a administrat un inhibitor al semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate şi în conformitate cu schema de tratament indicată. NI = nivelul iniţial.

Fig. 12 - descrie nivelele de hemoglobină la un subiect cu STS exemplar căruia i s-a administrat un inhibitor al semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate şi în conformitate cu schema de tratament indicată. NI = nivelul iniţial.

Fig. 13 - descrie nivelele de hemoglobină la un subiect cu STR exemplar căruia i s-a administrat un inhibitor al semnalizării ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate şi în conformitate cu schema de tratament indicată. NI = nivelul iniţial.

Fig. 14 - prezintă nivelul hemoglobinei (Hb, g/dL) şi numărul de unităţi de transfuzie a CRS primite de către un subiect cu STR exemplar care a primit o doză de 1,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Figura 14 demonstrează că subiectul cu STR exemplar atinge IT-CRS timp de cel puţin 337 de zile după iniţierea tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).

Fig. 15 - prezintă nivelul hemoglobinei (Hb, g/dL) şi numărul de unităţi de transfuzie a CRS primite de către un subiect cu STS exemplar care a primit o doză de 1,0 mg/kg de ActRIIA (SEQ ID NO:7). Figura 15 demonstrează că subiectul cu STS exemplar atinge o creştere stabilă a nivelelor de Hb timp de cel puţin 337 zile după iniţierea tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).

Fig. 16 - prezintă sarcina de transfuzie la subiecţii eligibili pentru atingerea independenţei de transfuzie. Subiecţii au fost trataţi cu între 0,75 mg/kg şi 1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc.

Fig. 17 - descrie proporţia subiecţilor care ating independenta de transfuzie de CRS (IT-CRS) cu o creştere medie a hemoglobinei egală cu sau mai mare de 1,5 g/dL pentru pacienţii cu STS timp de o perioadă de 8 săptămâni la pacienţii care primesc proteină de fuziune ActRIIA-hFC (SEQ ID NO:7). Nuanţa gri închis indică pacienţii cu STR şi nuanţa gri deschis indică pacienţii cu STS.

Fig. 18 ilustrează reacţia hemoglobinei unui subiect cu STS exemplar în cursul studiului de extindere a tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 luni. Prima şi ultima doză de tratament este indicată prin săgeţi. Evenimentele de transfuzie a sângelui sunt indicate prin bare. Rezultatele hemoglobinei (Hgb) (în g/dL) sunt reprezentate grafic în funcţie de timp (în zile).

Fig. 19 - ilustrează reacţia hemoglobinei unui subiect cu STS exemplar în cursul studiului de extindere a tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 luni. Modificarea medie a Hgb (în g/L) este reprezentată grafic în funcţie de timp (în luni).

Fig. 20 - ilustrează reacţiile la independenta de transfuzie observate la şase subiecţi în cursul studiului de extindere a tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 luni, în timp ce au primit tratamente cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la doze de 1,0 mg/kg (subiecţi reprezentaţi de cele patru bare inferioare) şi 1,75 mg/kg (subiectul reprezentat de bara superioară). Patru pacienţi au prezentat independenţă de transfuzie continuă pe tot parcursul studiului (4 bare de mijloc). Un pacient a atins independenţa de transfuzie după aproximativ o lună de tratamente cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) (bara superioară). Un pacient a experimentat independenţa de transfuzie intermitent timp de aproximativ 2 luni (bara inferioară).

7. DESCRIEREA DETALIATĂ

7.1 PREZENTARE GENERALĂ

S-a descoperit în mod neaşteptat că nivelurile de sideroblaşti inelari la pacienţii cu o tulburare de sânge pot fi folosite pentru a identifica pacienţii receptivi la tratamentul cu un inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII. Astfel de tulburări de sânge pot fi (i) anemie; (ii) anemie care necesită transfuzie de CRS; (iii) SMD; şi/sau (iv) LMMC neproliferativă. A se vedea - Secţiunea 7.8. Fără limitare la teorie, aproximativ 15% sau mai mult din sideroblaştii inelari care sunt eritroblaşti la un pacient cu tulburare de sânge sunt predictivi pentru un răspuns clinic îmbunătăţit la un inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII la pacient, relativ la pacientul cu aceeaşi tulburare de sânge dar cu mai puţin de 15% de sideroblaştii inelari din eritroblaşti. Un astfel de răspuns clinic îmbunătăţit poate fi răspunsul crescut al unui parametru hematologic (cum ar fi nivelele de hemoglobină, nivelele de celule roşii sanguine şi hematocritul). Un astfel de răspuns clinic îmbunătăţit se poate manifesta printr-o sarcină de transfuzie redusă. În plus, un astfel de răspuns clinic îmbunătăţit poate avea drept rezultat un beneficiu pe termen lung pentru pacient, fără o administrare suplimentară a inhibitorului semnalizării Activinei-ActRII. Cu alte cuvinte, metodele prezentate în prezenta invenţie pot conduce la ameliorarea unuia sau mai multor parametri hematologici la un pacient pentru o perioadă de timp după întreruperea administrării inhibitorului semnalizării Activinei-ActRII.

În consecinţă, dezvăluite în prezenta invenţie sunt metode pentru tratamentul unui pacient cu tulburare de sânge, în care metoda include (a) determinarea procentului de sideroblaşti inelari în rândul eritroblaştilor; şi (b) administrarea la pacient a unui inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII, dacă aproximativ 15% sau mai mult din eritroblaşti sunt sideroblaşti inelari. Mai specific, sunt prezentate în prezenta invenţie metode pentru tratarea unui pacient cu tulburare de sânge, în care metoda cuprinde (a) determinarea la pacient a procentului de sideroblaşti inelari în rândul eritroblaştilor; (b) administrarea la pacient a unui inhibitor al semnalizării Activinei-ActRII; şi (c) dacă cel puţin aproximativ 15% din eritroblaşti sunt sideroblaşti inelari, atunci (i) reducerea dozei sau întreruperea administrării inhibitorului semnalizării Activinei-ActRII după o perioadă de timp şi/sau (ii) scăderea frecvenţei de administrare a inhibitorului semnalizării Activinei-ActRII după o perioadă de timp. O descriere detaliată a acestor metode poate fi găsită în Secţiunile 7.3 şi 7.4.

Prezentat în prezenta invenţie este un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) pentru utilizare într-o metodă de tratament al sindroamelor mielodisplazice (SMD) la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea unui procent de eritroblaşti la un subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) administrarea unei doze de inhibitor al semnalizării ActRII cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg la subiect, dacă cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi în care inhibitorul semnalizării ActRII menţionat este o polipeptidă care cuprinde : (i) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 90% identică cu SEQ ID NR:25; (ii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID NR:25; (iii) o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 98% identică cu SEQ ID NR:25; (iv) secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NR:25; sau (v) un fragment al domeniului extracelular al ActRIIB, în care fragmentul constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NR:23; un linker; şi un Fc al unei IgG.

7.2 TERMENI ŞI ABREVIERI

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ActRII” se referă la receptorul activinei de tip II. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ActRIIA” se referă la receptorul activinei de tip IIA. A se vedea, de exemplu, Mathews şi Vale. Cell no 65, 1991, p. 973-982. Numărul de acces NM_001278579.1 al GenBank™ prezintă un exemplu de secvenţă de acizi nucleici a ActRIIA uman. Numărul de acces NP_001265508.1 al GenBank™ prezintă un exemplu de secvenţă de aminoacizi a ActRIIA uman. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ActRIIB” se referă la receptorul activinei de tip IIB. A se vedea, de exemplu, Attisano et al. Cell no 68, 1992, p. 97-108. Numărul de acces NM_001106.3 al GenBank™ prezintă un exemplu de secvenţă de acizi nucleici a ActRIIB uman. Numărul de acces NP_001097.2 al GenBank™ prezintă un exemplu de secvenţă de aminoacizi a ActRIIB uman.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ActRIIA-mFc” sau „mActRIIA-Fc” se referă la o proteină de fuziune IgG1-receptor al activinei de tip IIA de şoarece. A se vedea, de exemplu, brevetul US 8,173,601. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „mActRIIB-Fc” sau „ActRIIB-mFc” se referă la o proteină de fuziune IgG1-receptor al activinei de tip IIB de şoarece. A se vedea, de exemplu, brevetul US 8,173,601. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „hActRIIA-Fc” sau „ActRIIA-hFc” se referă la o proteină de fuziune IgG1-receptor al activinei de tip IIA umană. A se vedea, de exemplu, brevetul US 8,173,601. Într-o variantă de realizare specifică, hActRIIA-Fc este sotatercept (SEQ ID NO:7). Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „hActRIIB-Fc” sau „ActRIIB-hFc” se referă la o proteină de fuziune IgG1-receptor al activinei de tip IIB umană. A se vedea, de exemplu, brevetul US 8,173,601. Într-o variantă de realizare specifică, hActRIIB-Fc este luspatercept (SEQ ID NO:25).

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „KLA” se referă la kinaza limfomului anaplazic.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „NI” se referă la nivelul iniţial.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „BMP7” se referă la proteina morfogenetică osoasă 7.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „LMMC” se referă la leucemia mielomonocitară cronică.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „DEXA” se referă la absorbţiometria cu raze X cu energie duală.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „DNMT3A” se referă la ADN (citozin-5)-metiltransferaza 3A. Numerele de acces GenBank™ NM_153759.3, NM_022552.4, NM_175629.2 şi NM_175630.1 prezintă exemple de secvenţe de acizi nucleici pentru DNMT3A umană. Numerele de acces GenBank™ NP_715640.2, NP_783329.1, NP_783328.1 şi NP_072046.2 prezintă exemple de secvenţe de aminoacizi pentru DNMT3A umană.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „DEC” se referă la domeniul extracelular.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „EPO” se referă la eritropoietină.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ASE” se referă la agent de stimulare a eritropoiezei.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „G-CSF” se referă la factorul de stimulare a coloniilor de granulocite.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „GM-CSG” se referă la factorul de stimulare a coloniilor de granulocite-macrofage.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „Hb” se referă la hemoglobină.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „HBML” se referă la melitina din veninul de albine.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „AH-E” se referă la ameliorarea hematologică eritroidă. În anumite variante de realizare, AH-E este definită de IWG. În anumite variante de realizare, AH-E este definită conform criteriilor IWG modificate din anul 2006. În anumite variante de realizare, AH-E pentru un pacient cu sarcină de transfuzie scăzută este o creştere a concentraţiei de hemoglobină la pacient cu cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 8 săptămâni. În anumite variante de realizare, AH-E pentru un pacient cu sarcină de transfuzie ridicată este o reducere d cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „STR” se referă la o sarcină de transfuzie ridicată. În anumite variante de realizare, un subiect cu STR primeşte o CRS mai mare de sau egală cu 4 unităţi pe parcursul a 8 săptămâni.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „IgG” se referă la imunoglobulina G.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „Int-1” se referă la scorul IPSS al intermediarului 1. A se vedea - Secţiunea 7.8.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „IPSS” se referă la Sistemul International de Evaluare a Prognosticului (International Prognostic Scoring System). A se vedea - Secţiunea 7.8.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „IWG” se referă la Grupul de Lucru Internaţional. A se vedea, de exemplu, (Cheson et al. Blood. no 96, 2000, p. 3671-3674). În anumite variante de realizare, IWG se referă la criteriile modificate din anul 2006. A se vedea, de exemplu, (Cheson et al. Blood, no 108(2), 2006).

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „STS” se referă la o sarcină de transfuzie scăzută. În anumite variante de realizare, un subiect cu STS primeşte mai puţin de 4 unităţi de CRS pe parcursul a 8 săptămâni.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SMD” se referă la sindroamele mielodisplazice.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „FD” se referă la farmacodinamică.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „FC” se referă la farmacocinetică.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „CTc” se referă la tomografie computerizată cantitativă.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „ARSI” se referă la anemie refractară cu sideroblaşti inelari.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „CRS” se referă la celule roşii sanguine.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „IT-CRS” se referă la independenţa de transfuzie de celule roşii sanguine.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „CRDM-SI” se referă la citopenia refractară cu displazie multiliniară cu sideroblaşti inelari.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SI” se referă la sideroblast inelar.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SC” se referă la subcutanat.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SETBP1” se referă la proteina de legare a SET 1. Numerele de acces GenBank™ NM_015559.2 şi NM_001130110.1 prezintă exemple de secvenţe de acizi nucleici pentru SETBP1 umană. Numerele de acces GenBank™ NP_056374.2 şi NP_001123582.1 prezintă exemple de secvenţe de aminoacizi pentru SETBP1 umană.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SF3B1” se referă la factorul de matisare 3B1. Numerele de acces GenBank™ NM_012433.3, NM_001005523.2 şi NM_001308824.1 prezintă exemple de secvenţe de acizi nucleici pentru SF3B1 umană. Numerele de acces GenBank™ NP_001295753.1, NP_001005526.1 şi NP_036565.2 prezintă exemple de secvenţe de aminoacizi pentru SF3B1 umană.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „RPS” se referă la rezonanţa plasmonului de suprafaţă.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SRSF2” se referă la factorul de matisare bogat în serină/arginină 2. Numerele de acces GenBank™ NM_003016.4 şi NM_001195427.1 prezintă exemple de secvenţe de acizi nucleici pentru SRSF2 umană. Numerele de acces GenBank™ NP_001182356.1 şi NP_003007.2 prezintă exemple de secvenţe de aminoacizi pentru SRSF2 umană.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „TET2” se referă la tet metilcitozin dioxigenaza 2. Numerele de acces GenBank ™ NM_001127208.2 şi NM_017628.4 prezintă exemple de secvenţe de acizi nucleici pentru TET2 umană. Numerele de acces GenBank™ NP_001120680.1 şi NP_060098.3 prezintă exemple de secvenţe de aminoacizi pentru TET2 umană.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „TGF” se referă la factorul de creştere transformant.

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „TPA” se referă la activatorul tisular al plasminogenului.

7.3 METODE DE TRATAMENT

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al unui subiect cu tulburare de sânge, în care metoda cuprinde (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic a unui inhibitor al semnalizării ActRII, dacă cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat subiectului, dacă cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat pentru prima dată. În anumite variante de realizare, prima dată este o perioadă de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni de administrare la subiect a dozei eficiente farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite exemple, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite variante de realizare, nivelele de hemoglobină la subiect au scăzut comparativ cu cele la o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul prezintă anemie. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. Conform invenţiei, subiectul prezintă SMD. În anumite exemple, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă o probabilitate crescută de a obţine normalizarea unuia sau mai multor parametri hematologici, dacă cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19 % sau 20% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă o probabilitate crescută de a obţine o normalizare a unuia sau mai multor parametri hematologici, dacă cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este nivelul hemoglobinei. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este hematocritul. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este numărul de celule roşii sanguine. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic este procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, parametrul hematologic normalizat este un nivel al parametrului hematologic într-o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este o populaţie de referinţă astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, normalizarea unuia sau mai multor parametri hematologici este o ameliorare de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% comparativ cu parametrul hematologic la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi în funcţie de colorarea cu Albastru de Prusia. În anumite variante de realizare, eritroblaştii sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, nivelul hemoglobinei la subiect este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

Divulgată în prezenta invenţie este o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, care include administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) într-o doză eficientă farmaceutic şi pentru o perioadă de timp pentru a atinge (i) o reducere pe termen lung la subiect a unui procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu un procent iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari; şi (ii) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg şi în care cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. Conform invenţiei, tulburarea este sindroamele mielodisplazice (SMD) şi cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „sideroblaşti inelari” şi „sideroblaşti inelaţi” şi „SI” sunt utilizaţi interschimbabil. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat cel mult 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni. În anumite variante de realizare, procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este un procent de eritroblaşti la subiectul care sunt sideroblaşti inelari cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este menţinută timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este menţinută timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 sau 10,0 ori sub procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari timp de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este menţinută timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este un nivel de hemoglobină la subiect cuprins între aproximativ 11 g/dL şi 18 g/dLtimp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, subiectul nu necesită transfuzie de CRS timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda elimină necesitatea transfuziei de CRS la subiect timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 sau 10,0 ori sub procentul iniţial de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari timp de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este menţinută timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este un nivel de hemoglobină cuprins între aproximativ 11 g/dL şi 18 g/dL timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau la 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, subiectul nu necesită transfuzie de CRS timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda elimină necesitatea transfuziei de CRS la subiect timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea suplimentară a inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a unui procent suplimentar de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda cuprinde suplimentar determinarea la subiect a unui nivel suplimentar al hemoglobinei timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi conform colorării cu Albastru de Prusia. În anumite variante de realizare, eritroblaştii sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, nivelul hemoglobinei la subiect este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. Conform invenţiei, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite variante de realizare, nivelele de hemoglobină la subiect au scăzut comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. Conform invenţiei, subiectul prezintă SMD. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă anemie. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS.. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă LMMC neproliferativă.

În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7.

Inhibitorul semnalizării ActRII este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

Descrisă în prezenta invenţie este o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) (i) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă scurtă de timp, dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% sau (ii) administrarea la subiect a unui inhibitor al semnalizării ActRII într-o doză eficientă farmaceutic între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg pentru o perioadă lungă de timp, dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%, 9%, 8%, 7%, 6% , 5%, 4%, 3%, 2% sau 1%. Tulburarea de sânge este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, perioada scurtă de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII la subiect este de 1, 2, 3, 4 sau 5 luni. În anumite variante de realizare, perioada îndelungată de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII la subiect este de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni. Într-o variantă de realizare specifică, perioada scurtă de administrare este urmată de testarea nivelelor de sideroblaşti inelari timp de cel puţin 0, 3, 4, 5, 6, 12, 28, 24 sau 48 de luni după ultima administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare,inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a unui procent suplimentar de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda include suplimentar determinarea la subiect a nivelului de hemoglobină timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda elimină necesitatea transfuziei de celule roşii sanguine timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, metoda elimină necesitatea transfuziei de celule roşii sanguine la subiect timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni de la administrarea ultimei doze a inhibitorului semnalizării ActRII şi fără administrarea ulterioară a inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, sideroblaştii inelari sunt identificaţi conform colorării cu Albastru de Prusia. În anumite variante de realizare, eritroblaştii sunt identificaţi conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, nivelul hemoglobinei la subiect este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, nivelul hemoglobinei la subiect este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10.

În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. Conform invenţiei, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul menţionat sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite variante de realizare, nivelele de hemoglobină la subiect au scăzut comparativ cu cele la o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.10. Conform invenţiei, subiectul prezintă SMD. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă anemie. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă LMMC neproliferativă.

Inhibitorul semnalizării ActRII este descris în Secţiunea 7.9. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). Conform inven'iei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

Dezvăluite în prezenta invenţie sunt metode pentru tratarea unei tulburări de sânge la un subiect care includ administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) şi în care subiectul exprimă SF3B1 care conţine una sau mai multe mutaţii. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii se află într-o regiune necodificatoare. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii sunt într-o regiune codificatoare. În anumite exemple, SF3B1 este proteina SF3B1. În anumite exemple, SF3B1 este gena care codifică SF3B1. În anumite exemple, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii în SF3B1 sunt astfel cum sunt descrise în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite exemple, subiectul are nivelele de hemoglobină scăzute comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite exemple, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul prezintă anemie. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite exemple, subiectul prezintă SMD. În anumite exemple, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite exemple, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă trombocitopenie. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială. În anumite exemple, doza iniţială este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite exemple, doza ajustată este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite exemple, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25). Subiectul care are nevoie de niveluri crescute de neutrofile poate fi un subiect cu sideroblaşti inelari, anemie, anemie care necesită transfuzie de CRS, LMMC neproliferativă şi/sau SMD.

7.3.1 MARKERI GENETICI

Dezvăluite în prezenta invenţie sunt metode pentru tratarea unei tulburări de sânge la un subiect care includ administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic a unui inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) şi în care subiectul exprimă SF3B1 care conţine una sau mai multe mutaţii. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii se află într-o regiune necodificatoare. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii sunt într-o regiune codificatoare. În anumite exemple, SF3B1 este proteina SF3B1. În anumite exemple, SF3B1 este gena care codifică SF3B1. În anumite exemple, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, una sau mai multe mutaţii în SF3B1 sunt cele descrise în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple are, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite exemple, subiectul are nivele de hemoglobină scăzute comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite exemple, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul prezintă anemie. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite exemple, subiectul prezintă SMD. În anumite exemple, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite exemple, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă trombocitopenie. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială. În anumite exemple, doza iniţială este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite exemple, doza ajustată este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite exemple, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple lizare, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25). Subiectul care are nevoie de nivele crescute de neutrofile poate fi un subiect cu sideroblaşti inelari, anemie, anemie care necesită transfuzie de CRS, LMMC neproliferativă şi/sau SMD.

7.4 PROCEDEE DE DOZARE AJUSTATĂ

În anumite variante de realizare, în prezenta invenţie este prezentat un inhibitor al semnalizării ActRII pentru utilizare într-o metodă de tratament al unei tulburări de sânge la un subiect, în care metoda includde: (a) determinarea faptului că cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul menţionat sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unei doze iniţiale cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg de inhibitor al semnalizării ActRII; (c) după o perioadă de timp, determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, doza iniţială este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, doza iniţială este administrată subiectului imediat după determinarea primului procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari sau timp de cel mult 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 1 săptămână, 2 săptămâni, 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 12 luni. În anumite variante de realizare, perioada de timp dintre administrarea la subiect a dozei iniţiale şi determinarea celui de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 1 săptămână, 2 săptămâni, 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 12 luni. În anumite variante de realizare, doza ajustată este administrată subiectului imediat după determinarea celui de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari sau timp de cel mult 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 1 săptămână, 2 săptămâni, 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 12 luni. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este mai mică decât doza iniţială dacă cel de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20%. În anumite variante de realizare, al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 15%. În anumite variante de realizare, doza ajustată nu este administrată subiectului dacă cel de-al doilea procent de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este mai mic de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% sau 1%. În anumite variante de realizare, metoda elimină necesitatea transfuziei de celule roşii în sânge pentru o perioadă de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII.

În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul menţionat sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite variante de realizare, subiectul are nivele de hemoglobină scăzute comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. Conform invenţiei, subiectul prezintă SMD. În anumite variante de realizare subiectul prezintă anemie. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza este o doză ajustată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). Conform invenţiei, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

Descrisă în prezenta invenţie este o metodă de promovare a eritropoiezei la un subiect care are o tulburare de sânge, metoda cuprinzând: (a) determinarea la subiect a unui procent de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari; (b) administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic a unui inhibitor al semnalizării ActRII pentru o primă perioadă de timp; şi (c) după prima perioadă de timp, dacă procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari din etapa (a) a fost peste 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17 %, 18%, 19% sau 20%, reducând doza inhibitorului semnalizării ActRII administrat subiectului, reducând frecvenţa administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII sau întreruperea administrării inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite exemple, metoda include suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) reducerea (de exemplu, reducerea dozei sau reducerea frecvenţei) sau întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat, de exemplu, dacă parametrul hematologic la subiect este cel puţin la nivelul parametrului hematologic într-o populaţie de referinţă. În anumite exemple, populaţia de referinţă este populaţia de referinţă descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, metoda cuprinde suplimentar (i) monitorizarea la subiect a unui parametru hematologic în timpul primei perioade de timp; şi (ii) reducerea (de exemplu, reducerea dozei sau reducerea frecvenţei) sau întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă parametrul hematologic la subiect este normalizat, de exemplu, dacă parametrul hematologic la subiect este îmbunătăţit cu cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% comparativ cu parametrul hematologic la subiect o a doua perioadă de timp, în care a doua perioadă de timp este cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, prima perioadă este de cel puţin 1 lună, 2 luni, 3 luni, 4 luni, 5 luni, 6 luni, 7 luni, 8 luni, 9 luni, 10 luni, 11 luni sau 1 an. În anumite exemple, a doua perioadă de timp este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite exemple, parametrul hematologic îl constituie nivelele de hemoglobină. În anumite exemple, parametrul hematologic este hematocritul. În anumite exemple, parametrul hematologic este numărul de celule roşii sanguine. În anumite exemple, parametrul hematologic este procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, doza redusă de inhibitor al semnalizării ActRII este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, frecvenţa redusă de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII este o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza este o doză ajustată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite exemple, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

7.5 PROCEDEE DE CREŞTERE A NIVELELOR DE NEUTROFILE

Descrise în prezenta invenţiesunt procedee de creştere a nivelului de neutrofile la un subiect care are nevoie de creşterea nivelului de neutrofile, cuprinzând administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII). În anumite exemple, nivelele de neutrofile sunt numere absolute de neutrofile. În anumite exemple, nivelul neutrofilelor la subiect este crescut cu cel puţin 0,1x109 per litru, 0,5x109 per litru, 1,0x109 per litru, 5x 09 per litru, 1,0x1010 per litru, 5x1010 per litru sau 1,0x1011 per litru comparativ cu nivelul de neutrofile la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de neutrofile la subiect este crescut de cel puţin 1,2 ori, 1,3 ori, 1,4 ori, 1,5 ori, 2 ori, 2,5 ori, 3 ori, 3,5 ori, 4 ori, 4,5 ori, 5 ori, 6 ori, 7 ori, 8 ori, 9 ori sau 10 ori comparativ cu nivelul neutrofilelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de neutrofile la subiect este crescut de cel mult 1,2 ori, 1,3 ori, 1,4 ori, 1,5 ori, de 2 ori, de 2,5 ori, de 3 ori, de 3,5 ori, de 4 ori, de 4,5 ori, de 5 ori, de 6 ori de 7 ori, de 8 ori, de 9 ori sau de 10 ori comparativ cu nivelul neutrofilelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de neutrofile la subiect este crescut timp de cel puţin 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni după administrarea la subiect a dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de neutrofile la subiect este crescut timp de cel puţin 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni după administrarea dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII la pacient. A se vedea, de asemenea, Secţiunea 7.4. În anumite exemple, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite exemple, nivelul de neutrofile este măsurat astfel cum este descris în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, numărul absolut de neutrofile este măsurat astfel cum este descris în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite exemple, subiectul are nivelele de hemoglobină scăzute comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite exemple, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul prezintă anemie. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite exemple, subiectul prezintă SMD. În anumite exemple, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite exemple, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă trombocitopenie. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială. În anumite exemple, doza iniţială este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite exemple, doza ajustată este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite exemple, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25). Subiectul care are nevoie de nivele crescute de neutrofile poate fi un subiect cu sideroblaşti inelari, anemie, anemie care necesită transfuzie de CRS, LMMC neproliferativă şi/sau SMD.

7.6 PROCEDEE DE CREŞTERE A NIVELELOR DE TROMBOCITE

Descrise în prezentul dcument sunt procedee de creştere a nivelului de trombocite la un subiect care are nevoie de creşterea nivelului de trombocite, care conţine administrarea la subiect a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII). În anumite exemple, nivelul de trombocite la subiect este crescut cu cel puţin 1x1010 per litru, 3x1010 per litru, 5x1010 per litru, 1x1011 per litru, 5x1011 per litru sau cel puţin 1x1012 per litru comparativ cu nivelul de trombocite la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de trombocite la subiect este crescut de cel puţin 1,2 ori, 1,3 ori, 1,4 ori, 1,5 ori, 2 ori, 2,5 ori, 3 ori, 3,5 ori, 4 ori, 4,5 ori, 5 ori, 6 ori, 7 ori, 8 ori, 9 ori sau 10 ori comparativ cu nivelul de trombocite la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de trombocite la subiect este crescut de cel mult 1,2 ori, 1,3 ori, 1,4 ori, 1,5 ori, 2 ori, 2,5 ori, 3 ori, 3,5 ori, 4 ori, 4,5 ori, 5 ori, 6 ori, 7 ori, 8 ori, 9 ori sau 10 ori comparativ cu nivelul trombocitelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite exemple, nivelul trombocitelor la subiect este crescut timp de cel puţin 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni după administrarea la subiect a dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple, nivelul de neutrofile la subiect este crescut timp de cel puţin 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni după administrarea dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII la pacient. A se vedea, de asemenea, Secţiunea 7.4. În anumite exemple, nivelul trombocitelor este măsurat astfel cum este descris în Secţiunea 7.10.

În anumite exemple, subiectul este un subiect astfel cum este descris în Secţiunea 7.8. În anumite exemple, cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite exemple, subiectul are nivele de hemoglobină mai mici de 11 g/dL. În anumite exemple, subiectul are nivelele de hemoglobină scăzute comparativ cu o populaţie de referinţă. În anumite exemple, populaţia de referinţă este cea descrisă în Secţiunea 7.10. În anumite exemple, subiectul prezintă anemie. În anumite exemple, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite exemple, subiectul prezintă SMD. În anumite exemple, subiectul prezintă LMMC neproliferativă. În anumite exemple, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă neutropenie.

În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză iniţială. În anumite exemple, doza iniţială este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic este o doză ajustată. În anumite exemple, doza ajustată este administrată conform unei metode descrise în Secţiunea 7.4.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este administrat ca o compoziţie astfel cum este descris în Secţiunea 7.11. În anumite exemple, compoziţia este administrată la o frecvenţă descrisă în Secţiunea 7.7. În anumite exemple, compoziţia este administrată astfel cum este descris în Secţiunea 7.7.

În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în Secţiunea 7.9. În anumite exemple alizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIA este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple izare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRIIA-Fc, cum ar fi ActRIIA-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:7). În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRIIB este administrat subcutanat o dată la fiecare 21 de zile. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este un ActRII-Fc, cum ar fi ActRIIB-hFc (de exemplu, SEQ ID NO:25).

Subiectul care are nevoie de nivele crescute de neutrofile poate fi un subiect cu sideroblaşti inelari, anemie, anemie care necesită transfuzie de CRS, LMMC neproliferativă şi/sau SMD.

7.7 DOZA

În prezenta invenţie este prezentat un inhibitor al semnalizării ActRII pentru utilizare în metode pentru tratamentul la un subiect al SMD, în care metodele includ administrarea la un subiect care are nevoie de tratament a unei doze eficiente farmaceutic de un inhibitor al semnalizării ActRII (a se vedea Secţiunea 7.9). În anumite exemple, un inhibitor al semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIA astfel cum este prezentat în Secţiunea 7.9.1. În alte variante de realizare, un inhibitor al semnalizării ActRII este un inhibitor al semnalizării ActRIIB astfel cum este prezentat în Secţiunea 7.9.2. În anumite variante de realizare, un inhibitor al semnalizării ActRII este o combinaţie de un inhibitor al semnalizării ActRIIA şi un inhibitor al semnalizării ActRIIB. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este SEQ ID NO: 7. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este SEQ ID NO: 25.

[Doza prezentată în prezenta invenţie poate fi utilizată în tratamentul bolilor consangvine, cum ar fi, de exemplu, anemie, anemie care necesită transfuzie de CRS, SMD şi/sau LMMC neproliferativă. În anumite variante de realizare doza este o doză eficientă farmaceutic.

În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a ameliora unul sau mai multe simptome ale anemiei. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a preveni agravarea cel puţin a unui simptom al anemiei. Exemplele nelimitate de anemie includ oboseală, pierdere de energie, bătăi rapide ale inimii, dispnee, cefalee, dificultăţi de concentrare, ameţeli, piele palidă, crampe la picioare şi insomnie.

În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a ameliora unul sau mai multe simptome ale LMMC neproliferative. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a preveni agravarea unuia sau mai multor simptome ale LMMC neproliferative. Exemplele nelimitate de simptome ale CMML includ splenomegalie, hepatomegalie, anemie, oboseală, dispnee, leucopenie, infecţii frecvente, trombocitopenie, contuzie sau hemoragie uşoară, febră, pierdere în greutate, piele palidă şi pierderea apetitului.

În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a ameliora unul sau mai multe simptome ale SMD. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este o doză suficientă pentru a preveni agravarea unuia sau mai multor simptome ale SMD. Exemplele nelimitate de simptome ale SMD includ anemie, dispenee, oboseală, piele palidă, leucopenie, infecţii frecvente, neutropenie, trombocitopenie, contuzie sau hemoragie uşoară, scădere în greutate, febră, pierderea apetitului, slăbiciune şi durere osoasă.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este dozat la intervale şi cantităţi suficiente pentru a atinge concentraţii serice de 0,2 micrograme/kg sau mai mari, de exemplu niveluri serice de 1 micrograme/kg sau 2 micrograme/kg sau mai mari. Schemele de dozare pot fi proiectate pentru a atinge concentraţii serice cuprinse între 0,2 şi 15 micrograme/kg şi, opţional, între 1 şi 5 micrograme/kg. La om, nivelurile serice de 0,2 micrograme/kg pot fi obţinute cu o singură doză de 0,1 mg/kg sau mai mare şi pot fi obţinute niveluri serice de 1 microgram/kg cu o singură doză de 0,3 mg/kg sau mai mare. Durata perioadei de înjumătăţire observată a moleculei este cuprinsă între aproximativ 20 şi 30 de zile, ceea ce este semnificativ mai mare decât majoritatea proteinelor de fuziune Fc şi astfel un nivel seric eficient stabil poate fi atins, de exemplu, prin dozarea cu 0,2-0,4 mg/kg pe o bază săptămânală sau bisăptămânală sau doze mai mari pot fi utilizate cu intervale mai mari între doze. De exemplu, dozele de 1-3 mg/kg ar putea fi utilizate pe o bază lunară sau bilunară, iar efectul asupra oaselor poate fi suficient de durabil, încât dozarea să fie necesară numai o dată la fiecare 3, 4, 5, 6, 9, 12 sau mai multe luni. Nivelele serice ale inhibitorului semnalizării ActRII pot fi măsurate prin orice mijloace cunoscute specialiştilor în domeniu. De exemplu, anticorpii împotriva inhibitorului semnalizării ActRII pot fi utilizaţi pentru a determina nivelele serice ale inhibitorului semnalizării ActRII utilizând, de exemplu, o analiză ELISA. Într-o variantă de realizare specifică, metoda prezentată în prezenta invenţie atinge de asemenea efecte semnificative asupra densităţii şi rezistenţei osoase.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,5 mg/kg, aproximativ 0,75 mg/kg, aproximativ 1,0 mg/kg, aproximativ 1,25 mg/kg, aproximativ 1,5 mg/kg, aproximativ 1,75 mg/kg sau aproximativ 2,0 mg/kg. În anumite exemple, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 1 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,3 mg/kg şi 1,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este cuprinsă între 0,5 mg/kg şi 1,5 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,75 mg/kg şi 1,0 mg/kg, între 1,0 mg/kg şi 1,25 mg/kg, între 1,25 mg/kg şi 1,5 mg/kg, între 1,5 mg/kg şi 1,75 mg/kg sau între 1,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este o doză eficientă farmaceutic. Când se utilizează în asociere cu o doză prezentată în prezenta invenţie (de exemplu, o doză a unui inhibitor al semnalizării ActRII sau o doză a unui al doilea agent activ), cuvântul „aproximativ” se referă la orice număr în intervalul de 1, 5 sau 10% din numărul referit.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este o doză eficientă farmaceutic. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,5 mg/kg, aproximativ 0,75 mg/kg, aproximativ 1,0 mg/kg, aproximativ 1,25 mg/kg, aproximativ 1,5 mg/kg, aproximativ 1,75 mg/kg sau aproximativ 2,0 mg/kg. În anumite exemple, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 1 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,3 mg/kg şi 1,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,5 mg/kg şi 1,5 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza eficientă farmaceutic a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,75 mg/kg şi 1,0 mg/kg, între 1,0 mg/kg şi 1,25 mg/kg, între 1,25 mg/kg şi 1,5 mg/kg, între 1,5 mg/kg şi 1,75 mg/kg sau între 1,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este o doză iniţială. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,5 mg/kg, aproximativ 0,75 mg/kg, aproximativ 1,0 mg/kg, aproximativ 1,25 mg/kg, aproximativ 1,5 mg/kg, aproximativ 1,75 mg/kg sau aproximativ 2,0 mg/kg. În anumite exemple, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială de inhibitor al semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 1 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,3 mg/kg şi 1,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,5 mg/kg şi 1,5 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,75 mg/kg şi 1,0 mg/kg, între 1,0 mg/kg şi 1,25 mg/kg, între 1,25 mg/kg şi 1,5 mg/kg, între 1,5 mg/kg şi 1,75 mg/kg sau între 1,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată (i) o dată la fiecare 28 de zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată o dată la fiecare trei săptămâni.

În anumite variante de realizare, doza este o doză ajustată. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,5 mg/kg, aproximativ 0,75 mg/kg, aproximativ 1,0 mg/kg, aproximativ 1,25 mg/kg, mg/kg, aproximativ 1,75 mg/kg sau aproximativ 2,0 mg/kg. În anumite exemple, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 1 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,3 mg/kg şi 1,25 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,5 mg/kg şi 1,5 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este între 0,75 mg/kg şi 1,0 mg/kg, între 1,0 mg/kg şi 1,25 mg/kg, între 1,25 mg/kg şi 1,5 mg/kg, între 1,5 mg/kg şi 1,75 mg/kg sau între 1,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată (i) o dată la fiecare 28 de zile; sau (ii) o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată o dată la fiecare trei săptămâni.

În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este mai mare decât doza iniţială. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 2,5 mg, aproximativ 5 mg, aproximativ 10 mg, aproximativ 15 mg, aproximativ 20 mg sau aproximativ 35 mg mai mare decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII sau aproximativ 0,05 mg/kg, aproximativ 0,15 mg/kg, aproximativ 0,25 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,35 mg/kg, aproximativ 0,4 mg/kg sau aproximativ 0,5 mg/kg mai mare decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată mai frecvent decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată la fiecare 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35 sau 40 de zile. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată la fiecare 1 sau 2 săptămâni.

În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este mai mică decât doza iniţială. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este de aproximativ 2,5 mg, aproximativ 5 mg, aproximativ 10 mg, aproximativ 15 mg, aproximativ 20 mg sau aproximativ 35 mg mai mică decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII sau aproximativ 0,05 mg/kg, aproximativ 0,1 mg/kg, aproximativ 0,15 mg/kg, aproximativ 0,25 mg/kg, aproximativ 0,3 mg/kg, aproximativ 0,35 mg/kg, aproximativ 0,4 mg/kg sau aproximativ 0,5 mg/kg mai mică decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată mai rar decât doza iniţială a inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată la fiecare 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80 sau 90 de zile. În anumite variante de realizare, doza ajustată a inhibitorului semnalizării ActRII este administrată la fiecare 4, 5, 6, 7 sau 8 săptămâni.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată prin injectare. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată o dată la fiecare 28 de zile sau o dată la fiecare 42 de zile. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată o dată la fiecare 21 de zile. În anumite exemple, inhibitorul semnalizării ActRII este SEQ ID NO: 7.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată prin injectare. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată subcutanat. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII este administrată o dată la 3 săptămâni. În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este SEQ ID NO:25.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a scădea procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel puţin 100% comparativ cu procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel mult 100% comparativ cu procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 , 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la subiect care sunt sideroblaşti inelari este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelele de sideroblaşti inelari la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel puţin 100% comparativ cu nivelele de sideroblaşti inelari la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelele de sideroblaşti inelari la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel mult 100% comparativ cu nivelul de sideroblaşti inelari la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată la un subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelul de sideroblaşti inelari la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelul de sideroblaşti inelari la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, nivelul de sideroblaşti inelari la subiect este determinat conform unei analize descrise în Secţiunea 7.10.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a mări nivelul de hemoglobină la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel puţin 500% comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de hemoglobină la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel mult 500% comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de hemoglobină la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% sau cel puţin 60% comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul hemoglobinei la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% sau cel mult 60% comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul hemoglobinei cu cel puţin 0,5 g/dL, 1,0 g/dL, 1,1 g/dL, 1,3 g/dL, 1,5 g/dL, 1,8 g/dL, 2,0 g/dL, 2,2 g/dL, 2,4 g/dL, 2,6 g/dL, 3,6 g/dL, 3,8 g/dL, 4,0 g/dL, 4,2 g/dL, 4,4 g/dL sau cel puţin 4,6 g/dL comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul hemoglobinei cu cel mult 0,5 g/dL, 1,0 g/dL, 1,1 g/dL, 1,3 g/dL, 1,5 g/dL, 1,8 g/dL, 2,0 g/dL, 2,2 g/dL, 2,4 g/dL, 2,6 g/dL, 3,6 g/dL, 3,8 g/dL, 4,0 g/dL, 4,2 g/dL, 4,4 g/dL sau cel mult 4,6 g/dL comparativ cu nivelul hemoglobinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a mări nivelul hemoglobinei la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul hemoglobinei la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a este suficient pentru a creşte nivelul de reticulocite la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau 100% în comparaţie cu nivelul de reticulocite la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de reticulocite la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95% sau cel mult 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel mult 500% comparativ cu nivelul de reticulocite la subiect o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de reticulocite la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul reticulocitelor la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea dependenţa de transfuzie de celule roşii sanguine la subiect în comparaţie cu perioada de dependenţă de transfuzie de celule roşii sanguine înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce frecvenţa transfuziilor de celule roşii sanguine la subiect în comparaţie cu frecvenţa transfuziilor de celule roşii sanguine la subiect o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite exemple de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce transfuziile de celule roşii sanguine cu cel puţin cu cel puţin 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau cu cel puţin 100%. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce frecvenţa transfuziilor de celule roşii sanguine cu cel mult 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau cu cel mult 100%. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce unităţile de celule roşii transfuzate la subiect cu cel puţin 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 sau 13 unităţi în comparaţie cu unităţile de celule roşii transfuzate la subiect o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3, zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza de inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce frecvenţa transfuziilor de celule roşii sanguine cu cel puţin 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau cu 100%. În anumite exemple de realizare, doza de inhibitor de semnalizare ActRII administrată unui subiect tratat conform metodelor prezentate aici este suficientă pentru a reduce frecvenţa transfuziilor de celule roşii sanguine cu cel mult 30%, 40%, 50%, 60%, 70% , 80%, 90% sau cu 100%. În anumite variante de realizare, doza de inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a abroga necesitatea de transfuzie a celulelor roşii din sânge la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizăriie ActRII. În anumite variante de realizare, doza de inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a elimina necesitatea de transfuzie a celulelor roşii din sânge la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, o unitate de CRS se referă la aproximativ 150 mL, 200 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 100…200 mL, 150…250 mL, 200…300 mL sau 250…350 mL de CRS.

În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce sarcina de transfuzie la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel puţin 100% comparativ cu sarcina de transfuzie la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce sarcina de transfuzie la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel mult 100% comparativ cu sarcina de transfuzie la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce sarcina de transfuzie la subiect cu cel puţin 33% comparativ cu sarcina de transfuzie la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a reduce povara de transfuzie la subiect cu cel puţin 50% comparativ cu sarcina de transfuzie la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată la un subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce sarcina de transfuzie la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza inhibitorului semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea sarcina de transfuzie la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrat unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect cu cel puţin 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel puţin 100% comparativ cu terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrat unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a reduce terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15% 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau cel mult 100% comparativ cu terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a reduce terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a reduce terapia de chelare cu fier (de exemplu, doză sau frecvenţă) la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelurile serice ale feritinei la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 40%, 45% sau cel puţin 50% comparativ cu nivelurile serice ale feritinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelurile serice ale feritinei la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% comparativ cu nivelurile serice ale feritinei la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a scădea nivelurile serice ale feritinei la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta este suficientă pentru a scădea nivelele serice ale feritinei la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru obţine ameliorarea hematologică eritroidă la subiect cu cel puţin 1,5 g/dL, 1,8 g/dL, 2,0 g/dL, 2,2 g/dL, 2,4 g/dL, 2,6 g/dL, 2,8 g/dL, 3,0 g/dL, 3,2 g/dL, 3,4 g/dL sau cel puţin 4,0 g/dL comparativ cu ameliorarea hematologică eritroidă la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a obţine ameliorarea hematologică eritroidă la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a obţine ameliorarea hematologică eritroidă la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, ameliorarea hematologică eritroidă pentru un pacient cu sarcină la transfuzie scăzută este o creştere a concentraţiei de hemoglobină la pacient cu cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 8 săptămâni. În anumite variante de realizare, ameliorarea hematologică eritroidă pentru un pacient cu sarcină de transfuzie ridicată este o reducere cu cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrat unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de neutrofile la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel puţin 500% comparativ cu nivelul de neutrofile la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a creşte nivelul de neutrofile la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel mult 500% comparativ cu nivelul de neutrofile la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de neutrofile cu cel puţin 0,1x109 per litru, 0,5x109 per litru, 1,0x109 per litru, 5x109 per litru, 1,0x1010 per litru, 5x1010 per litru sau 1,0x1011 per litru comparativ cu nivelul de neutrofile la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrat unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul de neutrofile la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a creşte nivelul de neutrofile la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul trombocitelor la subiect cu cel puţin 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel mult 500% comparativ cu nivelul trombocitelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor oferite în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul trombocitelor la subiect cu cel mult 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% sau cel mult 500% comparativ cu nivelul trombocitelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul trombocitelor cu cel puţin 1x1010 per litru, 3x1010 per litru, 5x1010 per litru, 1x1011 per litru, 5x1011 per litru sau cel puţin 1x 012 per litru comparativ cu nivelul trombocitelor la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, perioada de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII este de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în prezenta invenţie este suficientă pentru a creşte nivelul trombocitelor la subiect pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 sau 48 de luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza unui inhibitor al semnalizării ActRII administrată unui subiect conform metodelor prezentate în acest document este suficientă pentru a creşte nivelul trombocitelor la subiect pe termen nelimitat după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg. În anumite variante de realizare, doza este cuprinsă între 0,75 mg/kg şi 2,0 mg/kg.

Când se utilizează împreună cu o doză furnizată în prezenta invenţie (de exemplu, o doză a unui inhibitor al semnalizării ActRII sau o doză a unui al doilea agent activ), cuvântul „aproximativ” se referă la orice număr în intervalul de 1,5 sau 10% din numărul referit.

În anumite variante de realizare, un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în prezenta invenţie este administrat subcutanat sau intravenos. În anumite variante de realizare, un inhibitor al semnalizării ActRII astfel cum este descris în prezenta invenţie este administrat subcutanat o dată la fiecare trei săptămâni. În anumite exemple, ActRIIA-hFC (SEQ ID NO:7; denumită de asemenea sotatercept) este administrat unui subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie subcutanat o dată la fiecare trei săptămâni. În anumite variante de realizare, ActRIIB-hFC (SEQ ID NO:25; denumită de asemenea luspatercept) este administrat unui subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie subcutanat o dată la fiecare trei săptămâni.

7.8 POPULAŢII DE PACIENŢI

Subiecţii trataţi în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot fi orice mamifere, cum ar fi rozătoarele şi primatele, iar Într-o variantă de realizare preferată, oameni. În anumite variante de realizare, subiectul este un om. În anumite variante de realizare, metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a trata anemia, anemia care necesită transfuzie de CRS, SMD şi/sau LMMC neproliferativă la orice mamifere, cum ar fi rozătoarele şi primatele, iar Într-o variantă de realizare preferată, la subiecţii umani. În anumite variante de realizare, metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a creşte nivelele de neutrofile la orice mamifere, cum ar fi rozătoarele şi primatele, iar într-o variantă de realizare preferată, la subiecţii umani. În anumite variante de realizare, metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a creşte nivelele de trombocite la orice mamifere, cum ar fi rozătoarele şi primatele, iar într-o variantă de realizare preferată, la subiecţi umani.

Conform invenţiei, procentul de eritroblaşti la un subiect, care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 15%. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie, care sunt sideroblaşti inelari este de aproximativ 15%. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie, care sunt sideroblaşti inelari este de aproximativ 20%. În anumite variante de realizare, procentul de eritroblaşti la un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie, care sunt sideroblaşti inelari este de aproximativ 17%. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are un raport al sideroblaştilor inelari faţă de eritroblaştii normali de cel puţin 1:10, cel puţin 1:7 sau cel puţin 1:5.

Conform invenţiei, tulburarea de sânge este SMD. În anumite variante de realizare, un subiect tratat conform metodelor oferite în prezenta invenţie are o tulburare de sânge. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este anemie. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este anemie care necesită transfuzie. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este LMMC neproliferativă.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu anemie. În unele aspecte, subiecţii anemici au un nivel de Hb mai mic sau egal cu 9,0 g/dL. În unele aspecte, subiecţii anemici au nevoie de 2 sau mai multe unităţi de transfuzii de CRS timp de 84 de zile înainte de tratament, conform metodelor oferite în prezenta invenţie. În anumite variante de realizare, subiectul are o sarcină de transfuzie ridicată (STR). Subiecţii cu STR necesită cel puţin 4 unităţi de transfuzii de CRS în 56 de zile. În anumite variante de realizare, subiectul are o sarcină de transfuzie scăzută (STS). Subiecţii cu STS necesită mai puţin de 4 unităţi de transfuzii de CRS în 56 de zile. În anumite variante de realizare, subiectul este un subiect care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie are o anemie sideroblastică, cum ar fi, de exemplu, anemia sideroblastică legată de cromozomul X, anemia sideroblastică piridoxin-refractară autozomal-recesivă, anemia sideroblastică legată de cromozomul X şi ataxia spinocerebelară, miopatie, acidoză lactică şi anemie sideroblastică, miopatie, acidoză lactică şi anemie sideroblastică, anemie megaloblastică sensibilă la tiamină, sindrom Pearson (pancreas - măduvă osoasă), anemie refractară cu sideroblaşti inelari, anemie refractară cu sideroblaşti inelari şi trombocitoză marcată, precum şi anemii sideroblastice indusă de etanol şi indusă de medicamente. În anumite exemple, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu anemie şi cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19 % sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu SMD definit prin IPSS. În anumite exemple, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu SMD definit prin IPSS şi cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari.

IPSS se referă la Sistemul Internaţional de Evaluare a Prognosticului, care este utilizat în evaluarea prognosticului în sindroamele mielodisplazice. A se vedea, de exemplu, (Greenberg et al. Blood, no 89(6), 1997, p. 2079-2088, şi Erratum in Blood, no 91, 1998, p. 1100). IPSS utilizează un sistem de puncte de criterii pentru a caracteriza rezultatele pacientului cu sindrom mielodisplazic ca risc scăzut (0 puncte, supravieţuire mediană de 5,7 ani), intermediar 1 (0,5…1,0 puncte, supravieţuire mediană de 3,5 ani); risc intermediar 2 (1,5…2,0 puncte, supravieţuire mediană de 1,2 ani); sau risc înalt (2,5…3,5 puncte, supravieţuire mediană de 0,4 ani). Sistemul de puncte evaluează (i) procentul de blaşti în măduva osoasă la subiect; (ii) cariotipul subiectului; şi (iii) şi citopenia la subiect (definită ca concentraţie a hemoglobinei mai mică de 10 g/dL, număr absolut de neutrofile mai mic de 1800/µL şi număr de trombocite mai mic de 100,000/µL).

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu SMD definit prin IPSS-R. În anumite exemple, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu SMD definit prin IPSS-R şi cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, cel puţin 15% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari.

IPSS-R se referă la Sistemul Internaţional Revizuit de Evaluare a Prognosticului, care este utilizat în evaluarea prognosticului în sindroamele mielodisplazice. A se vedea, de exemplu, (Greenberg et al. Blood, no 120(12), 2012, p. 2454-2465 şi Erratum in Blood, no 91, 1998, p. 1100. IPSS-R) utilizează un sistem de puncte de criterii pentru a caracteriza rezultatele pacientului cu sindrom mielodisplazic ca risc foarte scăzut (mai mic sau egal cu 1,5 puncte, supravieţuire mediană de 8,8 ani), risc scăzut (mai mare de 1,5 puncte, mai mic sau egal cu 3 puncte, supravieţuire mediană de 5,3 ani); risc intermediar (mai mare de 3 puncte, mai mic sau egal cu 4,5 puncte, supravieţuire mediană de 3 ani); risc înalt (mai mare de 4,5 puncte, mai mic sau egal cu 6 puncte, supravieţuire mediană de 1,6 ani); sau foarte înalt (mai mare de 6 puncte, supravieţuire mediană de 0,8 ani). Sistemul de puncte evaluează, inter alia, (i) procentul de blaşti în măduva osoasă la subiect; (ii) cariotipul subiectului; şi (iii) şi citopenia la subiect (definită ca concentraţie a hemoglobinei mai mică de 10 g/dL, număr absolut de neutrofile mai mic de 1800/µL şi număr de trombocite mai mic de 100,000/µL).

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu LMMC neproliferativă. În anumite exemple, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a fost diagnosticat cu LMMC neproliferativă şi cel puţin 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19% sau cel puţin 20% din eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari.

Conform invenţiei, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă SMD. În anumite exemple, SMD este SMD cu risc scăzut definit prin IPSS. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc intermediar-1 definit prin IPSS. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc intermediar-2 definit prin IPSS. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc înalt definit prin IPSS. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc foarte scăzut definit prin IPSS-R. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc scăzut definit prin IPSS-R. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc intermediar definit prin IPSS-R. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc înalt definit prin IPSS-R. În anumite variante de realizare, SMD este SMD cu risc foarte înalt definit prin IPSS-R. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD şi (ii) are CRDM-SI. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD şi (ii) are CRDM-SI. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI şi (iii) are CRDM-SI. Conform invenţiei, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD şi (ii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI şi (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are CRDM-SI şi (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI şi (iv) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are CRDM-SI şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI şi (iv) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI, (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iv) exprimă SF3B1 cu un sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are CRDM-SI, (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iv) exprimă CF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă SMD, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI, (iv) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari, şi (v) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă LMMC neproliferativă. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă şi (ii) are ARSI. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă şi (ii) are CRDM-SI. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI şi (iii) are CRDM-SI. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă şi (ii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI, şi (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are CRDM-SI şi (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI şi (iv) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă şi (ii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are CRDM-SI şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI şi (iv) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iii) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii . În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI, (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iv) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie (i) prezintă LMMC neproliferativă, (ii) are CRDM-SI, (iii) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (iv) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele oferite în prezenta invenţie are (i) LMMC neproliferativă, (ii) are ARSI, (iii) are CRDM-SI, (iv) cel puţin 15% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari şi (v) exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă o genă cu o mutaţie asociată cu eritropoieza ineficientă. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă una sau mai multe gene ale factorului de matisare cuprinzând una sau mai multe mutaţii. Într-o variantă de realizare specifică, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă SF3B1 cu una sau mai multe mutaţii. În anumite variante de realizare, una sau mai multe mutaţii se află într-o regiune necodificatoare. În anumite variante de realizare, SF3B1 este gena care codifică SB3B1. În anumite variante de realizare, una sau mai multe mutaţii sunt într-o regiune codificatoare. În anumite variante de realizare, SF3B1 este proteina SF3B1. În anumite variante de realizare, una sau mai multe mutaţii în proteina SF3B1 este selectată din grupul constând din E622D, R625C, H662Q, H662D, K66N, K666T, K666Q, K666E, A672D, K700E, I704N. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia E622D. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia R625C. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia H662Q. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia H662D. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia K66N. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia K666T. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia K666Q. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia K666E. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia A672D. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia K700E. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă proteina SF3B1 cu mutaţia I704N. Într-o variantă de realizare specifică, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă SRSF2 cu una sau mai multe mutaţii. Într-o variantă de realizare specifică, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă DNMT3A cu una sau mai multe mutaţii. Într-o variantă de realizare specifică, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă TET2 cu una sau mai multe mutaţii. Într-o variantă de realizare specifică, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie exprimă SETBP1 cu una sau mai multe mutaţii.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are trombocitopenie. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are mai puţin de 1x1011 trombocite per litru. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are neutropenie. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are un număr absolut de neutrofile mai mic de 1x109 per litru.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are mai puţin de 13,000 de celule albe sanguine per µL, mai puţin de 12,000 de celule albe sanguine per µL, mai puţin de 11,000 celule albe sanguine per µL, mai puţin de 10,000 de celule albe sanguine per µL, mai puţin de 7500 de celule albe sanguine per µL sau mai puţin de 500 de celule albe sanguine per µL.

În anumite variante de realizare, nivelele de hemoglobină la un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie sunt mai mici de 10 g/dL, 9 g/dL, 8 g/dL sau 7 g/dL. În anumite variante de realizare, nivelele de hemoglobină la un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie sunt între 7 g/dL şi 7,5 g/dL, între 7,5 g/dL şi 8 g/dL, între 8 g/dL şi 8,5 g/dL, între 8,5 g/dL şi 9,0 g/dL, între 9,0 g/dL şi 9,5 g/dL sau între 9,5 g/dL şi 10,0 g/dL.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are o sarcină de transfuzie scăzută. În anumite variante de realizare, subiectul cu o sarcină de transfuzie scăzută tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie necesită cel mult 0, 1, 2 sau 3 unităţi de celule roşii sanguine timp de 8 săptămâni. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are o sarcină de transfuzie ridicată. În anumite variante de realizare, subiectul cu o sarcină de transfuzie ridicată tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie necesită cel puţin 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 sau 13 unităţi de celule roşii sanguine timp de 8 săptămâni.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie nu are un răspuns, o pierdere de răspuns sau şanse scăzute de răspuns la unul sau mai mulţi ASE.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a urmat un tratament anterior cu unul sau mai mulţi ASE sau urmează în prezent un tratament cu unul sau mai mulţi ASE. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie a urmat un tratament anterior cu agenţi de hipometilare. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie urmat un tratament anterior cu lenalidomină. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie nu a urmat un tratament cu azacitidină, decitabină, ASE, G-FSC, GM-FSC sau lenalidomidă. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie nu răspunde la tratamentul cu unul sau mai mulţi ASE. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie este refractar la tratamentul cu unul sau mai mulţi ASE. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie devine refractar la tratamentul cu unul sau mai mulţi ASE. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie este refractar la tratamentul anterior cu ASE. În anumite variante de realizare, un subiect care este refractar la tratamentul anterior cu ASE a documentat non-răspuns sau răspuns care nu mai este menţinut la schema anterioară de tratament care conţine ASE, fie ca agent unic sau ca o combinaţie (de exemplu, cu G-FSC); schema ASE trebuie să fi fost fie (a) eritropoietină umană recombinantă mai mare de 40,000 UI/săptămână pentru cel puţin 8 doze sau echivalent sau (b) darbepoetină alfa mai mare de 500 µg o dată la trei săptămâni pentru cel puţin 4 doze sau echivalent. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie este intolerant la tratamentul anterior cu ASE. În anumite variante de realizare, un subiect care este intolerant la tratamentul anterior cu ASE a documentat întreruperea tratamentului anterior cu ASE, fie ca agent unic sau ca o combinaţie (de exemplu, cu G-FSC), în orice moment după introducere din cauza intoleranţei sau a unui eveniment advers. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie este ineligibil la ASE. În anumite variante de realizare, un subiect care este ineligibil la ASE are o şansă scăzută de răspuns la ASE pe baza unui nivel al eritropoietinei serice endogene mai mare de 200 U/L pentru subiecţii care nu au fost trataţi anterior cu ASE.

În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi de orice vârstă. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie este mai mic de 18 ani. Într-o variantă de realizare specifică, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie este mai mic de 13 ani. Într-o altă variantă de realizare specifică, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie este mai mic de 12, mai mic de 11, mai mic de 10, mai mic de 9, mai mic de 8, mai mic de 7, mai mic de 6 sau mai mic de 5 ani. Într-o altă variantă de realizare specifică, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie este de 1…3 ani, 3…5 ani, 5…7 ani, 7…9 ani, 9…11 ani, 11…13 ani, 13…15 ani, 15…20 ani, 20…25 ani, 25…30 ani sau mai mare de 30 de ani. Într-o altă variantă de realizare specifică, subiectul tratat conform metodelor dezvăluite în prezenta invenţie este de 30…35 de ani, 35…40 de ani, 40…45 de ani, 45…50 de ani, 50…55 de ani, 55…60 de ani sau mai mare de 60 de ani. Într-o altă variantă de realizare specifică, subiectul tratat conform metodelor dezvăluite în prezenta invenţie este de 60…65 ani, 65…70 ani, 70…75 ani, 75…80 ani sau mai mare de 80 de ani.

Conform invenţiei, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie prezintă SMD. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie prezintă SMD şi cromozomul 5q intact. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă SMD, cromozomul 5q intact şi nu are eşecul tratamentului cu lenalidomidă confirmat documentar. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă SMD, cromozomul intact 5q şi eşecul tratamentului cu lenalidomidă confirmat documentar. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele dezvăluite în prezenta invenţie prezintă SMD cu deleţia cromozomului 5q. SMD cu deleţia cromozomului 5q conţine o deleţie a braţului lung al cromozomului 5 şi se caracterizează, inter alia, prin anemie macrocitară cu macrocite ovale, număr de celule albe sanguine normal până la uşor redus, număr de trombocite normal până la crescut şi blaşti mai mici de 5% în măduva osoasă şi sânge. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă SMD cu deleţia cromozomului 5q şi nu are eşecul tratamentului cu lenalidomidă confirmat documentar. În anumite variante de realizare, subiectul tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie prezintă SMD cu deleţia cromozomului 5q şi eşecul tratamentului cu lenalidomidă confirmat documentar. În anumite variante de realizare, eşecul tratamentului cu lenalidomidă include pierderea răspunsului la lenalidomidă, lipsa răspunsului la lenalidomidă după 4 luni de tratament cu lenalidomidă, intoleranţa la tratamentul cu lenalidomidă sau citopenie care împiedică tratamentul cu lenalidomidă.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are mai puţin de 5% de blaşti în măduva osoasă şi sânge.

În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are o concentraţie serică de EPO mai mare de 500 mUI/mL. În anumite variante de realizare, un subiect tratat în conformitate cu metodele prezentate în prezenta invenţie are o concentraţie serică de EPO mai mare de 200 mUI/mL.

7.9 INHIBITORI AI SEMNALIZĂRII RECEPTORILOR ACTRII

Inhibitorii receptorilor ActRII includ inhibitori ai semnalizării ActRIIA şi inhibitori ai semnalizării ActRIIB (a se vedea mai jos). În anumite exemple, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII este specific pentru ActRIIA. În anumite exemple, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII este specific pentru ActRIIB. În alte variante de realizare, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII inhibă preferenţial ActRIIA. În alte variante de realizare, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII inhibă preferenţial ActRIIB. În anumite variante de realizare, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII inhibă atât ActRIIA, cât şi ActRIIB.

Inhibitorii semnalizării receptorilor ActRII pot fi polipeptide care conţin domenii de legare a activinei ale ActRII. Fără limitare la teorie, un astfel de domeniu de legare a activinei care conţine polipeptide sechestrează activina şi astfel împiedică semnalizarea activinei. Aceste polipeptide care conţin domeniul de legare a activinei pot conţine întregul domeniu sau o porţiune a domeniului extracelular al unui receptor ActRII (adică, întregul domeniu sau o porţiune a domeniului extracelular al ActRIIA sau întregul domeniu sau o porţiune a domeniului extracelular al ActRIIB). În exemplele de realizare specifice, domeniul extracelular al unui receptor ActRII este solubil.

Domeniul de legare a activinei care conţine polipeptide poate fi legat la o porţiune Fc a unui anticorp (adică este generat un conjugat care conţine un domeniu de legare a activinei care conţine polipeptida unui receptor ActRII şi o porţiune Fc a unui anticorp). Fără limitare la teorie, porţiunea de anticorp conferă o stabilitate crescută conjugatului. În anumite variante de realizare, domeniul de legare a activinei este legat la o porţiune Fc a unui anticorp prin intermediul unui linker, de exemplu, un linker peptidic.

Inhibitorii semnalizării receptorilor ActRII utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie inhibă ActRIIB, direct sau indirect, fie extracelular, fie intracelular. În unele variante de realizare, inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie inhibă ActRIIB prin interacţiuni cu însuşi receptorul (receptorii). În alte variante de realizare, inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie inhibă ActRIIB prin interacţiuni cu un ligand ActRIIB, de exemplu Activina.

7.9.1 INHIBITORI AI SEMNALIZĂRII ACTRIIA

Astfel cum se utilizează în prezenta invenţie, termenul „ActRIIA” se referă la o familie de proteine ale receptorului activinei de tip IIa(ActRIIA) din orice specie şi variante derivate din astfel de proteine ActRIIA prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ActRIIA în prezenta invenţie este înţeleasă ca o referire la oricare dintre formele identificate în prezent. Membrii familiei ActRIIA sunt, în general, proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular de legare a liganzilor cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate serin/treonin-kinazică prezisă.

Inhibitorii semnalizării ActRIIA care trebuie utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie includ, fără limitare, polipeptide ActRIIA solubile care se leagă de activină; anticorpi care se leagă de activină (în special subunităţile A sau B ale activinei, de asemenea denumite ßA sau ßB) şi perturbă legarea ActRIIA; anticorpi care se leagă de ActRIIA şi perturbă legarea activinei; proteine non-anticorp selectate pentru legarea activinei sau ActRIIA (a se vedea, de exemplu, WO 2002/088171, WO 2006/055689, WO 2002/032925, WO 2005/037989, US 2003/0133939 şi US 2005/0238646, pentru exemple de astfel de proteine şi metode de proiectare şi selectare a acestora); şi peptide randomizate selectate pentru capacitatea de legare la activină sau ActRIIA, care pot fi hibridizate cu un domeniu Fc.

În anumite exemple, două sau mai multe proteine diferite (sau alte fragmente) cu activitate de legare a activinei sau ActRIIA, în special lianţi pentru activină care blochează situsurile de legare a tipului I (de exemplu, un receptor al activinei solubil de tip I) şi, respectiv, a tipului II (de exemplu, un receptor al activinei solubil de tip II), pot fi legate împreună pentru a crea o moleculă de legare bifuncţională sau multifuncţională care inhibă ActRIIA şi astfel pot fi utilizate în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie. În anumite exemple, antagonişti ai axei de semnalizare a Activinei-ActRIIA care inhibă ActRIIA, aptameri ai acizilor nucleici, molecule mici şi alţi agenţi sunt utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie.

(a) Inhibitori ai semnalizării ActRIIA care conţin polipeptide ActRIIA

Termenul „polipeptidă ActRIIA” include polipeptide care conţin orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei ActRIIA, precum şi orice variante ale acesteia (inclusiv mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. De exemplu, polipeptidele ActRIIA includ polipeptide derivate din secvenţa oricărui ActRIIA cunoscut având o secvenţă cel puţin aproximativ 80% identică cu secvenţa unei polipeptide ActRIIA şi opţional identică cel puţin cu 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau mai mult. De exemplu, o polipeptidă ActRIIA poate lega şi inhiba funcţia unei proteine ActRIIA şi/sau a activinei. O polipeptidă ActRIIB poate fi selectată pentru capacitatea sa de a promova creşterea osoasă şi mineralizarea osoasă. Exemplele de polipeptide ActRIIA includ polipeptida precursorului ActRIIA uman (SEQ ID NO:1) şi polipeptide ActRIIA solubile umane (de exemplu, SEQ ID NO:2, 3, 7 şi 12). În ceea ce priveşte polipeptida precursorului ActRIIA a cărei secvenţă de aminoacizi este descrisă în SEQ ID NO:1, peptida semnal a polipeptidei precursorului ActRIIA uman este localizată la poziţiile aminoacizilor 1 până la 20; domeniul extracelular este localizat la poziţiile aminoacizilor 21 la 135 şi situsurile de glicozilare N-linkate ale polipeptidei precursorului ActRIIA uman (SEQ ID NO:1) sunt localizate la poziţiile aminoacizilor 43 şi 56 din SEQ ID NO:1. Secvenţa de acizi nucleici care codifică polipeptida precursorului ActRIIB uman din SEQ ID NO:1 este descrisă ca SEQ ID NR: 4 (nucleotidele 164-1705 ale înregistrării Genbank NM_001616). Secvenţa de acizi nucleici care codifică polipeptida ActRIIA solubilă umană din SEQ ID NO:2 este descrisă ca SEQ ID NO: 5. A se vedea tabelul 21 pentru o descriere a secvenţelor.

În exemple specifice, polipeptidele ActRIIA utilizate în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie sunt polipeptide ActRIIA solubile. Un domeniu extracelular al unei proteine ActRIIA se poate lega de activină şi este, în general, solubil şi, prin urmare, poate fi denumit o polipeptidă ActRIIA care se leagă de activină. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul „polipeptidă ActRIIA solubilă” se referă, în general, la polipeptide care conţin un domeniu extracelular al unei proteine ActRIIA, inclusiv orice domeniu extracelular natural al proteinei ActRIIA, precum şi orice variante ale acesteia (inclusiv mutanţi, fragmente şi forme peptidomimetice). Polipeptidele ActRIIA solubile se pot lega de activină; totuşi, proteina ActRIIA de tip sălbatic nu prezintă selectivitate semnificativă în legarea de activină faţă de GDF8/11. Proteinele ActRIIA native sau modificate pot avea o specificitate adăugată pentru activină prin cuplarea acestora cu un al doilea agent de legare la activină selectiv. Exemplele de polipeptide solubile ActRIIA care se leagă de activină includ polipeptidele solubile ilustrate în SEQ ID NO:2, 3, 7, 12 şi 13. Alte exemple de polipeptide ActRIIA solubile care se leagă de activină conţin o secvenţă semnal pe lângă domeniul extracelular al unei proteine ActRIIA, de exemplu, secvenţa lider a melitinei din veninul de albine (SEQ ID NO:8), secvenţa lider a activatorului tisular al plasminogenului (ATP) (SEQ ID NO:9) sau secvenţa lider nativă a ActRIIA (SEQ ID NO:10). Polipeptida ActRIIA-hFc ilustrată în SEQ ID NO:13 utilizează o secvenţă lider a ATP.

În anumite exemple, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin un conjugat/proteină de fuziune care conţine un domeniu de legare a activinei al ActRIIA legat la o porţiune Fc a unui anticorp. În anumite exemple, domeniul de legare a activinei este legat la o porţiune Fc a unui anticorp prin intermediul unui linker, de exemplu, un linker peptidic. Opţional, domeniul Fc are una sau mai multe mutaţii la resturi cum ar fi Asp-265, lizina 322 şi Asn-434. În anumite cazuri, domeniul Fc mutant care are una sau mai multe din aceste mutaţii (de exemplu, o mutaţie Asp-265) are o capacitate redusă de a se lega la receptorul Fcγ comparativ cu un domeniu Fc de tip sălbatic. În alte cazuri, domeniul Fc mutant care are una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de exemplu, o mutaţie Asn-434) are o capacitate crescută de a se lega la receptorul Fc legat de clasa I CMH (FcRN) comparativ cu un domeniu Fc de tip sălbatic. Exemplele de proteine de fuziune care conţin un domeniu extracelular solubil al ActRIIA fuzionat cu un domeniu Fc sunt prezentate în SEQ ID NO:6, 7, 12 şi 13.

Într-o variantă de realizare specifică, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin domeniul extracelular al ActRIIA sau o porţiune a acestuia, legată la o porţiune Fc a unui anticorp, în care inhibitorul semnalizării ActRIIA menţionat conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 75% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:6, 7, 12 şi 13. Într-o altă variantă de realizare specifică, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin domeniul extracelular al ActRIIA sau o porţiune a acestuia, legată de o porţiune Fc a unui anticorp, în care inhibitorul semnalizării ActRIIA menţionat conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO: 6, 7, 12 şi 13.

În anumite exemple, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin o formă trunchiată a unui domeniu extracelular al ActRIIA. Trunchierea poate fi la capătul carboxi şi/sau la capătul amino al polipeptidei ActRIIA. În anumite exemple, trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 de aminoacizi în lungime faţă de domeniul extracelular al polipeptidei ActRIIA mature. În anumite exemple, trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 aminoacizi N-terminali ai domeniului extracelular al polipeptidei ActRIIA mature. În anumite exemple, trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 de aminoacizi C-terminali ai domeniului extracelular al polipeptidei ActRIIA mature. De exemplu, formele trunchiate ale ActRIIA includ polipeptide cu aminoacizii 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; şi 25-131, în care poziţiile aminoacizilor se referă la poziţiile aminoacizilor din SEQ ID NO:1.

În anumite exemple, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin un domeniu extracelular al ActRIIA cu una sau mai multe substituţii de aminoacizi. În anumite exemple, inhibitorii semnalizării ActRIIA utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin o formă trunchiată a unui domeniu extracelular ActRIIA care poartă, de asemenea, o substituţie de aminoacizi.

Într-o variantă de realizare specifică, inhibitorul semnalizării ActRIIA care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este o proteină de fuziune între domeniul extracelular al receptorului ActRIIA uman şi porţiunea Fc a IgG1. Într-o altă variantă de realizare specifică, inhibitorul semnalizării ActRIIA care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este o proteină de fuziune între un domeniu extracelular trunchiat al receptorului ActRIIA uman şi porţiunea Fc a IgG1. Într-o altă variantă de realizare specifică, inhibitorul semnalizării ActRIIA care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este o proteină de fuziune între un domeniu extracelular trunchiat al receptorului ActRIIA uman şi porţiunea Fc a IgG1, în care domeniul extracelular trunchiat al receptorului ActRIIA uman posedă una sau mai multe substituţii de aminoacizi.

Fragmentele funcţional active din polipeptidele ActRIIA pot fi obţinute, de exemplu, prin screening-ul polipeptidelor produse în mod recombinant din fragmentul corespunzător al acidului nucleic care codifică o polipeptidă ActRIIA. În plus, fragmentele pot fi sintetizate chimic utilizând tehnici cunoscute în domeniu, cum ar fi chimia convenţională f-Moc sau t-Boc în fază solidă Merrifield. Fragmentele pot fi produse (prin recombinare sau prin sinteză chimică) şi testate pentru a identifica acele fragmente peptidilice care pot funcţiona ca antagonişti (inhibitori) ai proteinei ActRIIA sau ai căii de semnalizare mediate de activină.

În plus, variantele funcţional active ale polipeptidelor ActRIIA pot fi obţinute, de exemplu, prin screening-ul bibliotecilor de polipeptide modificate produse prin recombinare din acizii nucleici mutagenizaţi corespunzători care codifică o polipeptidă ActRIIA. Variantele pot fi produse şi testate pentru a identifica acele care pot funcţiona ca antagonişti (inhibitori) ai proteinei ActRIIA sau ai căii de semnalizare mediate de activină. În anumite exemple, o variantă funcţională a polipeptidelor ActRIIA conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 75% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:2 sau 3. În anumite cazuri, varianta funcţională are o secvenţă de aminoacizi cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:2 sau 3.

Variantele funcţionale pot fi generate, de exemplu, prin modificarea structurii unei polipeptide ActRIIA pentru astfel de scopuri, cum ar fi creşterea eficacităţii sau stabilităţii terapeutice (de exemplu, durata de depozitare ex vivo şi rezistenţa la degradarea proteolitică in vivo). Astfel de polipeptide ActRIIA modificate când sunt selectate pentru a păstra legarea de activină, sunt considerate echivalente funcţionale ale polipeptidelor ActRIIA care apar în mod natural. Polipeptidele ActRIIA modificate pot fi, de asemenea, produse, de exemplu, prin substituţie, deleţie sau adăugare de aminoacizi. De exemplu, este rezonabil să se aştepte ca o înlocuire izolată a unei leucine cu o izoleucină sau valină, un aspartat cu un glutamat, o treonină cu o serină sau o înlocuire similară a unui aminoacid cu un aminoacid legat structural (de exemplu, mutaţii conservatoare) nu va avea un efect major asupra activităţii biologice a moleculei rezultate. Înlocuirile conservatoare sunt cele care au loc într-o familie de aminoacizi care sunt legaţi în lanţurile lor laterale. Dacă o modificare a secvenţei de aminoacizi a unei polipeptide ActRIIA are drept rezultat un omolog funcţional poate fi uşor determinată prin evaluarea capacităţii variantei de polipeptidă ActRIIA de a produce un răspuns în celule într-o manieră similară cu polipeptida ActRIIA de tip sălbatic.

În anumite exemple, în prezenta invenţie sunt prezentate mutaţii specifice ale polipeptidelor ActRIIA care pot modifica glicozilarea polipeptidei. Astfel de mutaţii pot fi selectate astfel încât să introducă sau să elimine unul sau mai multe situsuri de glicozilare, cum ar fi situsurile de glicozilare O-linkate sau N-linkate. Situsurile de recunoaştere a glicozilării asparagină-linkate conţin în general o secvenţă tripeptidică, asparagină-X-treonină (sau asparagină-X-serină) (unde „X” este orice aminoacid) care este recunoscută în mod specific de către enzimele de glicozilare celulară adecvate. Modificarea se poate face, de asemenea, prin adăugarea sau substituirea cu unul sau mai multe resturi de serină sau treonină la secvenţa polipeptidei ActRIIA de tip sălbatic (pentru situsurile de glicozilare O-linkate). O varietate de substituţii sau deleţii de aminoacizi la una sau ambele dintre prima sau a treia poziţie a aminoacizilor a unui situs de recunoaştere a glicozilării (şi/sau deleţia aminoacidului în a doua poziţie) conduce la neglicozilare la secvenţa tripeptidică modificată. Un alt mijloc de creştere a numărului de fragmente de carbohidrat pe o polipeptidă ActRIIA este prin cuplarea chimică sau enzimatică a glicozidelor la polipeptida ActRIIA. În funcţie de modul de cuplare utilizat, zahărul(zaharurile) poate (pot) fi ataşat(e) la (a) arginină şi histidină; (b) grupări carboxil libere; (c) grupări sulfhidril libere, cum ar fi cele ale cisteinei; (d) grupări hidroxil libere, cum ar fi cele ale serinei, treoninei sau hidroxiprolinei; (e) resturi aromatice, cum ar fi cele ale fenilalaninei, tirozinei sau triptofanului; sau (f) gruparea amidă a glutaminei. Aceste metode sunt descrise în (WO 87/05330 publicată la 11 septembrie 1987 şi în Aplin şi Wriston CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, p. 259-306). Îndepărtarea unui sau mai multor fragmente de carbohidrat prezente pe o polipeptidă ActRIIA poate fi realizată chimic şi/sau enzimatic. Deglicozilarea chimică poate implica, de exemplu, tratarea polipeptidei ActRIIA cu acid trifluorometansulfonic sau un compus echivalent. Acest tratament are drept rezultat scindarea majorităţii sau tuturor zaharurilor, cu excepţia zahărului de legare (N-acetilglucozamina sau N-acetilgalactozamina), lăsând totodată secvenţa de aminoacizi intactă. Deglicozilarea chimică este descrisă în continuare de (Hakimuddin et al. Arch. Biochem. Biophys. no 259, 1987, p. 52 şi de Edge et al. Anal. Biochem. no 118, 1981, p. 131). Clivajul enzimatic al fragmentelor de carbohidrat pe polipeptide ActRIIA poate fi realizat prin utilizarea unei varietăţi de endo- şi exo-glicozidaze, astfel cum este descris de (Thotakura et al. Meth. Enzymol. 1987, no 138, p. 350). Secvenţa unei polipeptide ActRIIA poate fi ajustată, după caz, în funcţie de tipul sistemului de exprimare utilizat, cum ar fi celule de mamifer, drojdie, insectă şi plantă, toate putând introduce modele diferite de glicozilare care pot fi afectate de secvenţa de aminoacizi a peptidei. În general, proteinele ActRIIA pentru utilizare la om vor fi exprimate într-o linie celulară de mamifere care asigură glicozilarea adecvată, cum ar fi liniile celulare HEK293 sau CHO, deşi alte sisteme de expresie, cum ar fi alte linii celulare de exprimare de mamifere, linii celulare de drojdie cu enzime de glicozilare modificate şi celule de insecte, sunt de aşteptat să fie de asemenea utile.

În continuare, în prezenta invenţie sunt prezentate metode de generare a mutanţilor, în special a seturilor de mutanţi combinatorii ai unei polipeptide ActRIIA, precum şi a mutanţilor de trunchiere; populaţiile de mutanţi combinatorii sunt deosebit de utile pentru identificarea secvenţelor de variante funcţionale. Scopul screening-ului unor astfel de biblioteci combinatoriale poate fi de a genera, de exemplu, variante de polipeptidă ActRIIA care pot acţiona ca agonişti sau antagonişti, sau alternativ, care posedă toate activităţile noi împreună. O varietate de analize de screening sunt prezentate mai jos şi astfel de analize pot fi folosite pentru a evalua variantele. De exemplu, o variantă a polipeptidei ActRIIA poate fi testată pentru capacitatea de a se lega la un ligand ActRIIA, pentru a preveni legarea unui ligand ActRIIA la o polipeptidă ActRIIA sau pentru a interfera cu semnalizarea cauzată de un ligand ActRIIA.

Pot fi generate variante derivate combinatoriu care au o potenţă selectivă sau în general crescută în raport cu o polipeptidă ActRIIA care apare în mod natural. În mod similar, mutageneza poate da naştere la variante care au perioade de înjumătăţire intracelulare dramatic diferite de cele ale polipeptidei ActRIIA de tip sălbatic corespunzătoare. De exemplu, proteina modificată poate fi produsă fie mai stabilă, fie mai puţin stabilă la degradarea proteolitică sau alte procese celulare care conduc la distrugerea sau altă inactivare a unei polipeptide ActRIIA native. Astfel de variante şi genele care le codifică pot fi utilizate pentru a modifica nivelurile polipeptidei ActRIIA prin modularea nivelului perioadei de înjumătăţire al polipeptidelor ActRIIA. De exemplu, o durată de înjumătăţire scurtă poate determina efecte biologice mai tranzitorii şi poate permite un control mai strict al nivelurilor polipeptidelor ActRIIA recombinante la subiect. Într-o proteină de fuziune Fc, pot fi făcute mutaţii în linker (dacă există) şi/sau în porţiunea Fc pentru a modifica perioada de înjumătăţire a proteinei.

O bibliotecă combinatorială poate fi produsă printr-o bibliotecă de gene degenerate care codifică o bibliotecă de polipeptide, fiecare dintre care include cel puţin o porţiune din secvenţele polipeptidice ActRIIA potenţiale. De exemplu, un amestec de oligonucleotide sintetice poate fi legat enzimatic în secvenţe genetice, astfel încât setul degenerat de potenţiale secvenţe nucleotidice ale polipeptidei ActRIIA să fie exprimat ca polipeptide individuale sau, alternativ, ca un set de proteine de fuziune mai mari (de exemplu, pentru afişarea fagelor).

Există multe moduri prin care biblioteca omologilor potenţiali poate fi generată dintr-o secvenţă oligonucleotidică degenerată. Sinteza chimică a unei secvenţe de gene degenerate poate fi efectuată într-un sintetizator automat de ADN, iar genele sintetice sunt apoi ligate într-un vector de exprimare adecvat. Sinteza oligonucleotidelor degenerate este bine cunoscută în domeniu (a se vedea, de exemplu, Narang, SA Tetrahedron, no 39, 1983, p. 3; Itakura et al. Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier, 1981, p. 273-289; Itakura et al. Annu. Rev. Biochem., no 53, 1984, p. 323; Itakura et al. Science, no 198, 1984, p. 1056; Ike et al. Nucleic Acid Res., no 11, 1983, p. 477). Astfel de tehnici s-au folosit în evoluţia direcţionată a altor proteine (a se vedea, de exemplu, Scott et al. Science, no 249, 1990, p. 386-390; Roberts et al. PNAS USA, no 89, 1992, p. 2429-2433; Devlin et al. Science, no 249, 1990, p. 404-406; Cwirla et al. PNAS USA, no 87, 1990, p. 6378-6382; US 5,223,409, 5,198,346 şi 5,096,815).

Alternativ, alte forme ale mutagenezei pot fi utilizate pentru a genera o bibliotecă combinatorie. De exemplu, variantele polipeptidei ActRIIA pot fi generate şi izolate dintr-o bibliotecă prin intermediul screening-ului utilizând, de exemplu, mutageneza de scanare a alaninei şi altele asemenea (Ruf et al. Biochemistry, no 33, 1994, p.1565-1572; Wang et al. J. Biol. Chem., no 269, 1994, p. 3095-3099; Balint et al. Gene, no 137, 1993, p. 109-118; Grodberg et al. Eur. J. Biochem., no 218, 1993, p. 597-601; Nagashima et al. J. Biol. Chem., no 268, 1993, p. 2888-2892; Lowman et al. Biochemistry, no 30, 1991, p. 10832-10838; and Cunningham et al. Science, no 244, 1989, p. 1081-1085), mutageneza de scanare a linkerului (Gustin et al. Virology, no 193, 1993, p. 653-660; Brown et al. Mol. Cell Biol., no 12, 1992, p. 2644-2652; McKnight et al. Science, no 232, 1982, p. 316); prin mutageneză de saturaţie (Meyers et al. Science, no 232, 1986, p. 613); prin mutageneza RLP (Leung et al. Method Cell Mol. Biol., no 1, 1989, p. 11-19); sau prin mutageneză aleatorie, inclusiv mutageneză chimică etc. (Miller et al. A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992; and Greener et al. Strategies in Mol. Biol., no 7, 1994, p. 32-34). Mutageneza de scanare a linkerului, în special într-un set combinatorial, este o metodă atractivă pentru identificarea formelor trunchiate (bioactive) ale polipeptidelor ActRIIA.

O gamă largă de tehnici sunt cunoscute în domeniu pentru screening-ul produselor genetice ale bibliotecilor combinatoriale realizate prin mutaţii şi trunchieri punctiforme şi, de asemenea, pentru screening-ul bibliotecilor de cADN pentru produsele genetice având o anumită proprietate. Astfel de tehnici vor fi în general adaptabile pentru screening-ul rapid al bibliotecilor de gene generate de mutageneza combinatorie a polipeptidelor ActRIIA. Cele mai utilizate tehnici de screening pentru bibliotecile de gene mari includ în mod obişnuit clonarea bibliotecii de gene în vectori de exprimare replicabili, transformarea celulelor adecvate cu biblioteca de vectori obţinută şi expresia genelor combinatorii în condiţii în care detectarea unei activităţi dorite facilitează izolarea relativ uşoară a vectorului care codifică gena a cărui produs a fost detectat. Analizele preferate includ analize de legare a activinei şi analize ale căilor de semnalizare celulară mediate de activină.

În anumite exemple, polipeptidele ActRIIA pot conţine suplimentar modificări post-translaţionale pe lângă oricare din ele care sunt prezente în mod natural în polipeptidele ActRIIA. Astfel de modificări includ, dar nu se limitează la, acetilare, carboxilare, glicozilare, fosforilare, lipidare şi acilare. Drept rezultat, polipeptidele ActRIIA modificate pot conţine elemente neaminoacide, cum ar fi polietilenglicoli, lipide, poli- sau monozaharide şi fosfaţi. Efectele unor astfel de elemente neaminoacide asupra funcţionalităţii unei polipeptide ActRIIA pot fi testate prin orice metodă cunoscută specialiştilor în domeniu. Atunci când o polipeptidă ActRIIA este produsă în celule prin clivarea unei forme native a polipeptidei ActRIIA, procesarea post-translaţională poate fi, de asemenea, importantă pentru plierea corectă şi/sau funcţia proteinei. Diferitele celule (cum ar fi CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 sau HEK293) au structuri celulare specifice şi mecanisme caracteristice pentru astfel de activităţi post-translaţionale şi pot fi alese pentru a asigura modificarea şi procesarea corectă a polipeptidelor ActRIIA.

În anumite aspecte, variantele funcţionale sau formele modificate ale polipeptidelor ActRIIA includ proteine de fuziune având cel puţin o porţiune din polipeptidele ActRIIA şi unul sau mai multe domenii de fuziune. Exemplele bine cunoscute de astfel de domenii de fuziune includ, dar nu se limitează la, polihistidină, Glu-Glu, glutation-S-transferază (GST), tioredoxină, proteină A, proteină G, o regiune constantă a lanţului greu al imunoglobulinei (Fc), proteină de legare a maltozei (BLM) sau albumină serică umană. Un domeniu de fuziune poate fi selectat astfel încât să confere o proprietate dorită. De exemplu, unele domenii de fuziune sunt deosebit de utile pentru izolarea proteinelor de fuziune prin cromatografie de afinitate. În scopul purificării prin afinitate, se utilizează matrice relevante pentru cromatografia de afinitate, cum ar fi răşinile conjugate cu glutation, amilază şi nichel sau cobalt. Multe dintre aceste matrici sunt disponibile în forma de „kit-uri”, cum ar fi sistemul de purificare Pharmacia GST şi sistemul QIAexpressTM (Qiagen) util cu partenerii de fuziune (HIS6). În calitate de alt exemplu, un domeniu de fuziune poate fi selectat astfel încât să faciliteze detecţia polipeptidelor ActRIIA. Exemplele de astfel de domenii de detecţie includ diverse proteine fluorescente (de exemplu, GFP) precum şi „etichete epitopice”, care sunt de obicei secvenţe peptidice scurte pentru care este disponibil un anticorp specific. Etichetele epitopice bine cunoscute pentru care anticorpii monoclonali specifici sunt uşor disponibili includ FLAG, hemaglutinina virusului gripal (HA) şi c-myc. În unele cazuri, domeniile de fuziune au un situs de clivaj al proteazei, cum ar fi Factorul Xa sau Trombina, care permite proteazei relevante să digere parţial proteinele de fuziune şi astfel să elibereze proteinele recombinante din acestea. Proteinele eliberate pot fi apoi izolate din domeniul de fuziune prin separare cromatografică ulterioară. În anumite exemple preferate, o polipeptidă ActRIIA este fuzionată cu un domeniu care stabilizează polipeptida ActRIIA in vivo (un domeniu „stabilizator”). Prin „stabilizare” se înţelege orice ce măreşte perioada de înjumătăţire în ser, indiferent dacă aceasta se datorează distrugerii reduse, clearance-ului renal redus sau alt efect farmacocinetic. Fuziunile cu porţiunea Fc a unei imunoglobuline sunt cunoscute pentru a conferi proprietăţi farmacocinetice dorite unei game largi de proteine. De asemenea, fuziunile cu albumina serică umană pot conferi proprietăţi dorite. Alte tipuri de domenii de fuziune care pot fi selectate includ domenii de multimerizare (de exemplu, dimerizare, tetramerizare) şi domenii funcţionale (care conferă o funcţie biologică suplimentară, cum ar fi stimularea suplimentară a creşterii osoase sau a creşterii musculare, la dorinţă).

Se înţelege că diferite elemente ale proteinelor de fuziune pot fi aranjate în orice mod care este în concordanţă cu funcţionalitatea dorită. De exemplu, o polipeptidă ActRIIA poate fi plasată C-terminal la un domeniu heterologic sau, alternativ, un domeniu heterologic poate fi plasat C-terminal la o polipeptidă ActRIIA. Domeniul polipeptidic ActRIIA şi domeniul heterologic nu trebuie să fie adiacente într-o proteină de fuziune, iar alte domenii sau secvenţe de aminoacizi suplimentare pot fi incluse C- sau N-terminal la oricare domeniu sau între domenii.

În anumite exemple, polipeptidele ActRIIA dezvăluite în prezenta invenţie conţin una sau mai multe modificări care sunt capabile să stabilizeze polipeptidele ActRIIA. De exemplu, astfel de modificări sporesc perioada de înjumătăţire in vitro a polipeptidelor ActRIIA, sporesc perioada de înjumătăţire circulatorie a polipeptidelor ActRIIA sau reduc degradarea proteolitică a polipeptidelor ActRIIA. Astfel de modificări de stabilizare includ, dar nu se limitează la, proteine de fuziune (inclusiv, de exemplu, proteine de fuziune care conţin o polipeptidă ActRIIA şi un domeniu stabilizator), modificări ale unui situs de glicozilare (inclusiv, de exemplu, adăugarea unui situs de glicozilare la o polipeptidă ActRIIA) şi modificări ale fragmentului de carbohidraţi (inclusiv, de exemplu, eliminarea fragmentelor de carbohidrat dintr-o polipeptidă ActRIIA). În cazul proteinelor de fuziune, o polipeptidă ActRIIA este fuzionată la un domeniu stabilizator, cum ar fi o moleculă IgG (de exemplu, un domeniu Fc). Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul „domeniu stabilizator” nu se referă numai la un domeniu de fuziune (de exemplu, Fc) ca în cazul proteinelor de fuziune, ci include şi modificări neproteinice, cum ar fi un fragment de carbohidraţi sau un polimer neproteinic, cum ar fi polietilenglicol.

În anumite exemple, formele izolate şi/sau purificate ale polipeptidelor ActRIIA, care sunt izolate din sau altfel în mod substanţial libere de alte proteine pot fi utilizate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie. Polipeptidele ActRIIA vor fi în general produse prin expresia acizilor nucleici recombinanţi.

În anumite aspecte, sunt prezentate în prezenta invenţie acizi nucleici izolaţi şi/sau recombinanţi care codifică oricare dintre polipeptidele ActRIIA (de exemplu, polipeptidele ActRIIA solubile), inclusiv fragmente, variante funcţionale şi proteine de fuziune dezvăluite în prezenta invenţie. De exemplu, SEQ ID NO: 4 codifică precursorul natural al polipeptidei ActRIIA umane, în timp ce SEQ ID NO: 5 codifică domeniul extracelular procesat al ActRIIA. Acizii nucleici examinaţi pot fi monocatenari sau dublu-catenari. Astfel de acizi nucleici pot fi molecule ADN sau ARN. Aceşti acizi nucleici pot fi utilizaţi, de exemplu, în metodele de obţinere a polipeptidelor ActRIIA sau ca agenţi terapeutici direcţi (de exemplu, într-o abordare a terapiei genice).

În anumite aspecte, acizii nucleici care codifică polipeptidele ActRIIA sunt în continuare înţeleşi ca incluzând acizii nucleici care sunt variante ale SEQ ID NO: 4 sau 5. Secvenţele nucleotidice alternative includ secvenţe care diferă prin una sau mai multe substituţii, adiţii sau deleţii de nucleotide, cum ar fi variantele alelice.

În anumite exemple, sunt prezentate în prezenta invenţie secvenţe de acizi nucleici izolate sau recombinate care sunt cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identice cu SEQ ID NO: 4 sau 5. Un specialist în domeniu va aprecia că secvenţele de acizi nucleici complementare la SEQ ID NO: 4 sau 5 şi variantele din SEQ ID NO: 4 sau 5 sunt de asemenea cuprinse în prezenta invenţie. În alte exemple, secvenţele de acizi nucleici prezentate în prezenta invenţie pot fi izolate, recombinate şi/sau fuzionate cu o secvenţă nucleotidică heterologă sau într-o bibliotecă de ADN.

În alte exemple, acizii nucleici prevăzuţi în prezenta invenţie includ, de asemenea, secvenţe nucleotidice care hibridizează în condiţii foarte stricte cu secvenţa nucleotidică desemnată în SEQ ID NO: 4 sau 5, secvenţa complementară din SEQ ID NO: 4 sau 5 sau fragmente ale acesteia. După cum s-a discutat mai sus, un specialist în domeniu va înţelege cu uşurinţă că condiţiile de stringenţă corespunzătoare care promovează hibridizarea ADN pot fi variate. Un specialist în domeniu va înţelege că condiţiile de stringenţă corespunzătoare care promovează hibridizarea ADN pot fi variate. De exemplu, se poate efectua hibridizarea în condiţiile 6,0× clorură de sodiu/citrat de sodiu (SSC) la aproximativ 45 grade Celsius, urmată de o spălare 2,0×SSC la 50 grade Celsius. De exemplu, concentraţia de sare în etapa de spălare poate fi selectată de la o stringenţă redusă de aproximativ 2,0×SSC la 50 grade Celsius până la o stringenţă ridicată de aproximativ 0,2×SSC la 50 grade Celsius. În plus, temperatura la etapa de spălare poate fi mărită de la condiţii de stringenţă redusă care includ temperatura camerei, aproximativ 22 de grade Celsius, la condiţii de stringenţă ridicată la aproximativ 65 grade Celsius. Atât temperatura, cât şi concentraţia de sare pot fi variate, sau temperatura sau concentraţia de sare poate fi menţinută constantă în timp ce cealaltă variabilă este schimbată. Într-un exemplu de realizare, acizii nucleici care hibridizează în condiţii de stringenţă redusă, care corespunde 6×SSC la temperatura camerei cu spălarea ulterioară 2×SSC la temperatura camerei, pot fi utilizaţi cu metodele şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie.

Acizii nucleici izolaţi care diferă de acizii nucleici astfel cum au fost prezentaţi în SEQ ID NO: 4 sau 5 datorită degenerării în codul genetic sunt, de asemenea, cuprinşi în prezenta invenţie. De exemplu, un număr de aminoacizi sunt desemnaţi de mai mult de un triplet. Codonii care codifică acelaşi aminoacid sau sinonime (de exemplu, CAU şi CAC sunt sinonime pentru histidină) pot avea drept rezultat mutaţii „silenţioase” care nu afectează secvenţa de aminoacizi a proteinei. Totuşi, este de aşteptat ca polimorfisme ale secvenţei de ADN care să conducă la modificări în secvenţele de aminoacizi ale proteinelor codificate vor exista în celulele de mamifere. Un specialist în domeniu va aprecia că aceste variaţii în unul sau mai multe nucleotide (până la aproximativ 3…5% din nucleotide) ale acizilor nucleici care codifică o anumită proteină pot exista la indivizii unei anumite specii datorită variaţiei alelelor naturale. Orice şi toate asemenea variaţii nucleotidice şi polimorfisme ale aminoacizilor rezultate sunt incluse în prezenta invenţie.

În anumite exemple, acizii nucleici recombinanţi pot fi legaţi funcţional cu una sau mai multe secvenţe nucleotidice reglatoare într-o construcţie de expresie. Secvenţele nucleotidice reglatoare vor fi, în general, adecvate pentru celula gazdă utilizată pentru expresie. Numeroase tipuri de vectori de exprimare adecvaţi şi secvenţe reglatoare adecvate sunt cunoscute în domeniu pentru o varietate de celule gazdă. În mod tipic, una sau mai multe secvenţe nucleotidice reglatoare pot include, dar nu se limitează la, secvenţe promotor, secvenţe lider sau semnal, situsuri de legare ale ribozomului, secvenţe ale iniţierii şi terminării transcripţiei, secvenţe ale iniţierii şi terminării translaţiei şi secvenţe amplificatoare sau activatoare. Promotori constitutivi sau inducibili, astfel cum sunt cunoscuţi în domeniu, sunt contemplaţi în prezenta invenţie. Promotorii pot fi fie promotori naturali, fie promotori hibrizi care combină elemente ale mai multor promotori. O construcţie de expresie poate fi prezentă într-o celulă pe un episom, cum ar fi o plasmidă sau construcţia de expresie poate fi inserată într-un cromozom. Într-o variantă de realizare preferată, vectorul de exprimare conţine o genă marker selectabilă pentru a permite selecţia celulelor gazdă transformate. Genele marker selectabile sunt bine cunoscute în domeniu şi vor varia în funcţie de celula gazdă utilizată.

În anumite aspecte, acidul nucleic subiect este furnizat într-un vector de exprimare care conţine o secvenţă nucleotidică care codifică o polipeptidă ActRIIA, care este legată funcţional cu cel puţin o secvenţă reglatoare. Secvenţele reglatoare sunt recunoscute în domeniu şi sunt selectate pentru a exprima direct polipeptida ActRIIA. În consecinţă, termenul de secvenţă reglatoare include promotori, amplificatori şi alte elemente de control al expresiei. Exemple de secvenţe reglatoare sunt descrise în Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. De exemplu, oricare dintr-o mare varietate de secvenţe de control al expresiei care controlează expresia unei secvenţe de ADN, atunci când sunt legate funcţional cu aceasta, poate fi utilizată în aceşti vectori pentru expresia secvenţelor de ADN care codifică o polipeptidă ActRIIA. Astfel de secvenţe de control al expresiei utile includ, de exemplu, promotorii timpuriu şi tardiv ai SV40, promotorul tet, promotorul pretimpuriu al adenovirusului sau citomegalovirusului, promotori ai RSV, sistemul lac, sistemul trp, sistemul TAC sau TRC, promotorul T7 a cărui expresie este dirijată de polimeraza T7 ARN, regiunile promotoare şi operatoare majore ale fagului lambda, regiunile de control pentru proteina învelişului fd, promotorul 3-fosfogliceratkinazei sau alte enzime glicolitice, promotorii fosfatazei acide, de exemplu Pho5, promotorii factorilor de α- împerechere la drojdii, promotorul poliedric al sistemului baculoviral şi alte secvenţe cunoscute pentru a controla expresia genelor de celule procariote sau eucariote sau a virusurilor acestora şi diferite combinaţii ale acestora. Trebuie înţeles că construcţia vectorului de exprimare poate depinde de factori cum ar fi alegerea celulei gazdă care urmează să fie transformată şi/sau tipul de proteină dorită a fi exprimată. Mai mult decât atât, numărul de copii ale vectorului, capacitatea de a controla numărul de copii şi expresia oricărei alte proteine codificate de vector, cum ar fi markerii antibiotici, ar trebui, de asemenea, luate în considerare.

Un acid nucleic recombinant prezentat în prezenta invenţie poate fi produs prin ligarea genei clonate sau a unei porţiuni a acesteia într-un vector adecvat pentru exprimarea fie în celule procariote, fie în celule eucariote (de drojdii, păsări, insecte sau mamifere) sau ambele. Exprimarea vehiculelor pentru producerea unei polipeptide ActRIIA recombinante include plasmide şi alţi vectori. De exemplu, vectorii adecvaţi includ plasmidele de următoarele tipuri: plasmide derivate din pBR322, plasmide derivate din pEMBL, plasmide derivate din pEX, plasmide derivate din pBTac şi plasmide derivate din pUC pentru exprimare în celule procariote, cum ar fi E. coli.

Unii vectori de exprimare de mamifere conţin ambele secvenţe procariote pentru a facilita propagarea vectorului în bacterii şi una sau mai multe unităţi de transcripţie eucariote care sunt exprimate în celule eucariote. Vectorii derivaţi din pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo şi pHyg sunt exemple de vectori de exprimare de mamifere adecvaţi pentru transfecţia celulelor eucariote. Unii dintre aceşti vectori sunt modificaţi cu secvenţe de plasmide bacteriene, cum ar fi pBR322, pentru a facilita replicarea şi selecţia rezistenţei la medicamente atât în celule procariotice, cât şi în celule eucariote. În mod alternativ, pentru expresia tranzitorie a proteinelor în celulele eucariote pot fi utilizaţi derivaţi ai virusurilor, cum ar fi virusul papilomului bovin (VPB-1) sau virusul Epstein-Barr (pHEBo, pREP-derivat şi p205). Exemple de alte sisteme de expresie virale (inclusiv retrovirale) pot fi găsite mai jos în descrierea sistemelor de administrare a terapiei genice. Diferitele metode utilizate în obţinerea plasmidelor şi în transformarea organismelor gazdă sunt bine cunoscute în domeniu. Pentru alte sisteme de expresie adecvate atât pentru celulele procariotice, cât şi pentru celulele eucariote, precum şi proceduri generale recombinante, a se vedea Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch şi Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). În unele cazuri, poate fi de dorit să se exprime polipeptidele recombinante prin utilizarea unui sistem de exprimare baculoviral. Exemplele de astfel de sisteme de expresie baculovirale includ vectori derivaţi din pVL (cum ar fi pVL1392, pVL1393 şi pVL941), vectori derivaţi din pAcUW (cum ar fi pAcUW1) şi vectori derivaţi din pBlueBac (cum ar fi pBlueBac III conţinând .beta.-gal).

Într-o variantă de realizare preferată, un vector va fi construit pentru producerea polipeptidelor ActRIIA ţintă în celule CHO, cum ar fi un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, California), vectori pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif. ) şi vectori pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). După cum va fi evident, construcţiile anumitor gene pot fi utilizate pentru a determina expresia polipeptidelor ActRIIA ţintă în celulele propagate în cultură, de exemplu, pentru a produce proteine, inclusiv proteine de fuziune sau proteine variante, pentru purificare.

Această descriere se referă, de asemenea, la o celulă gazdă transfectată cu o genă recombinantă care include o secvenţă codificatoare (de exemplu, SEQ ID NO: 4 sau 5) pentru una sau mai multe din polipeptidele ActRIIA ţintă. Celula gazdă poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă. De exemplu, o polipeptidă ActRIIA prezentată în prezenta invenţie poate fi exprimată în celule bacteriene cum ar fi E. coli, celule de insecte (de exemplu, folosind un sistem de exprimare baculoviral), celule de drojdii sau celule de mamifere. Alte celule gazdă adecvate sunt cunoscute specialiştilor în domeniu.

În consecinţă, prezentate în prezenta invenţie sunt procedee de producere a polipeptidelor ActRIIA. De exemplu, o celulă gazdă transfectată cu un vector de exprimare care codifică o polipeptidă ActRIIA poate fi cultivată în condiţii adecvate pentru a permite expresia polipeptidei ActRIIA. Polipeptida ActRIIA poate fi secretată şi izolată dintr-un amestec de celule şi mediu conţinând polipeptida ActRIIA. În mod alternativ, polipeptida ActRIIA poate fi reţinută într-o fracţiune citoplasmatică sau de membrană, în acest caz celulele sunt recoltate, lizate şi proteina izolată. O cultură celulară include celule gazdă, medii şi alte produse secundare. Mediile adecvate pentru cultura celulară sunt bine cunoscute în domeniu. Polipeptidele ActRIIA ţintă pot fi izolate din mediul de cultură celulară, celulele gazdă sau ambele, utilizând tehnici cunoscute în domeniu pentru purificarea proteinelor, inclusiv cromatografia de schimb ionic, cromatografia de filtrare cu gel, ultrafiltrarea, electroforeza, purificarea imunoafinităţii cu anticorpi specifici pentru epitopii particulari ai polipeptidelor ActRIIA şi purificarea afinităţii cu un agent care se leagă la un domeniu fuzionat cu polipeptida ActRIIA (de exemplu, o coloană cu proteină A poate fi utilizată pentru a purifica o fuziune ActRIIA-Fc). Într-o variantă de realizare preferată, polipeptida ActRIIA este o proteină de fuziune care conţine un domeniu care facilitează purificarea acesteia. Într-o variantă de realizare preferată, purificarea este realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, inclusiv, de exemplu, trei sau mai multe din următoarele, în orice ordine: cromatografie pe proteină A, cromatografie pe sefaroză Q, cromatografie pe fenilsefaroză, cromatografie de excludere a mărimii şi cromatografie de schimb cationic. Purificarea poate fi completată cu filtrarea virusului şi schimbarea tamponului. Astfel cum s-a demonstrat în prezenta invenţie, proteina ActRIIA-hFc a fost purificată până la o puritate de > 98% determinată prin cromatografie de excludere a mărimii şi > 95% determinată prin gel-electroforeză pe poliacrilamidă-dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE). Acest nivel de puritate a fost suficient pentru a obţine efectele dorite asupra oaselor la şoareci şi un profil de siguranţă acceptabil la şoareci, şobolani şi primate neumane.

Într-o altă variantă de realizare, o gena de fuziune care codifică o secvenţă lider de purificare, cum ar fi o secvenţă a situsului de clivaj al poli-(His)/enterokinazei, la capătul N-terminal al porţiunii dorite a polipeptidei ActRIIA recombinante, poate permite purificarea proteinei de fuziune exprimate prin cromatografie de afinitate folosind o răşină care conţine metal Ni2+. Secvenţa lider de purificare poate fi apoi îndepărtată prin tratarea cu enterokinază pentru a obţine polipeptida ActRIIA purificată (a se vedea, de exemplu, Hochuli et al., J. Chromatography, no 411, 1987, p. 177; şi Janknecht et al., PNAS USA, no 88, 1987, p. 8972).

Tehnicile pentru producerea genelor de fuziune sunt bine cunoscute. În general, legarea diferitelor fragmente de ADN, care codifică diferite secvenţe polipeptidice, se efectuează în conformitate cu tehnicile convenţionale, folosind terminaţii drepte sau în zig-zag pentru ligare, digestia enzimatică restrictivă pentru a asigura terminaţiile corespunzătoare, umplerea capetelor coezive, dacă este necesar, tratarea fosfatazei alcaline pentru a evita cuplarea nedorită şi ligarea enzimatică. Într-un exemplu de realizare, gena de fuziune poate fi sintetizată prin tehnici convenţionale, inclusiv prin sintetizatoare automate de ADN. În mod alternativ, amplificarea prin metoda RPL a fragmentelor de gene poate fi realizată utilizând primeri de ancoră care dau naştere unor extensii complementare între două fragmente de gene consecutive, care pot fi ulterior renaturate pentru a genera o secvenţă de gene himerice (a se vedea, de exemplu, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).

Proteina de fuziune ActRIIA-Fc poate fi exprimată în celule CHO-DUKX Bl1 transfectate stabil dintr-un vector pAID4 (SV40 sau/amplificator, CMV promotor), utilizând o secvenţă lider a plasminogenului tisular SEQ ID NO: 9. Porţiunea Fc este o secvenţă Fc a IgGl umane, astfel cum se arată în SEQ ID NO: 7. În anumite exemple, după exprimare, proteina conţinută are, în medie, între aproximativ 1,5 şi 2,5 moli de acid sialic per moleculă de proteină de fuziune ActRIIA-Fc.

În anumite exemple, perioada de înjumătăţire mai lungă în ser a unei fuziuni ActRIIA-Fc poate fi de 25…32 zile la subiecţii umani. În plus, materialul exprimat în celula CHO poate avea o afinitate mai mare pentru ligandul activinei B decât cea raportată pentru o proteină de fuziune ActRIIA-hFc exprimată în 293 de celule umane (del Re et al., J. Biol Chem., no 279(51), 2004 Dec, 17, p. 53126-53135). În plus, fără limitare la teorie, utilizarea secvenţei lider TPA a asigurat o producţie mai mare decât alte secvenţe lider şi, spre deosebire de ActRIIA-Fc exprimat cu un lider nativ, poate asigura o secvenţă N-terminală foarte pură. Utilizarea secvenţei lider native poate conduce la două specii majore de ActRIIA-Fc, fiecare având o secvenţă N-terminală diferită.

7.9.2 INHIBITORI AI SEMNALIZĂRII ACTRIIB

Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul „ActRIIB” se referă la o familie de proteine ale receptorului activinei de tip Iib (ActRIIB) din orice specie şi variante derivate din astfel de proteine ActRIIB prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ActRIIB în prezenta invenţie este înţeleasă ca o referire la oricare dintre formele identificate în prezent ale receptorului. Membrii familiei ActRIIB sunt, în general, proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular de legare a liganzilor cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate serin/treonin kinazică prezisă.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB includ polipeptide ActRIIB solubile care se leagă de activină; anticorpi care se leagă de activină (în special subunităţile A sau B ale activinei, de asemenea denumite ßA sau ßB) şi perturbă legarea ActRIIB; anticorpi care se leagă de ActRIIB şi perturbă legarea activinei; proteine non-anticorp selectate pentru legarea activinei sau ActRIIB; şi peptide randomizate selectate pentru legarea activinei sau ActRIIB, care pot fi conjugate cu un domeniu Fc.

În anumite exemple, două sau mai multe proteine diferite (sau alte fragmente) cu activitate de legare a activinei sau ActRIIB, în special lianţi pentru activină care blochează situsurile de legare a tipului I (de exemplu, un receptor al activinei solubil de tip I) şi, respectiv, a tipului II (de exemplu, un receptor al activinei solubil de tip II), pot fi legate împreună pentru a crea o moleculă de legare bifuncţională sau multifuncţională care inhibă ActRIIB şi astfel pot fi utilizate în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie. În anumite exemple, antagonişti ai axei de semnalizare a Activinei-ActRIIB care inhibă ActRIIB, aptameri ai acizilor nucleici, molecule mici şi alţi agenţi sunt utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie.

(b) Inhibitori ai semnalizării ActRIIB care conţin polipeptide ActRIIB

Termenul „polipeptidă ActRIIB” include polipeptide care conţin orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei ActRIIB, precum şi orice variante ale acesteia (inclusiv mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. De exemplu, polipeptidele ActRIIB includ polipeptide derivate din secvenţa oricărui ActRIIB cunoscut având o secvenţă cel puţin aproximativ 80% identică cu secvenţa unei polipeptide ActRIIB şi opţional identică cel puţin cu 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau mai mult.. De exemplu, o polipeptidă ActRIIB poate lega şi inhiba funcţia unei proteine ActRIIB şi/sau a activinei. Un exemplu de polipeptidă ActRIIB include precursorul polipeptidei ActRIIB umane (SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28). În ceea ce priveşte precursorul polipeptidei ActRIIB a cărei secvenţă de aminoacizi este descrisă ca SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 (adică precursorul polipeptidei ActRIIB umane), peptida semnal a precursorului polipeptidei ActRIIB este localizată la aminoacizii 1 până la 18; domeniul extracelular este localizat la aminoacizii 19 la 134 şi situsurile potenţiale de glicozilare N-linkate sunt localizate la poziţiile aminoacizilor 42 şi 65. Secvenţa de acizi nucleici care codifică precursorul polipeptidei ActRIIB umane din SEQ ID NO:16 este dezvăluită ca SEQ ID NO:19 (SEQ ID NO:19 prezintă o alanină la codonul corespunzător poziţiei aminoacidului 64, dar poate fi uşor modificată de către un specialist în domeniu folosind metode cunoscute în domeniu pentru a furniza o arginină la codonul corespunzător poziţiei aminoacidului 64).A se vedea tabelul 21 pentru o descriere a secvenţelor.

Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele legate de ActRIIB dezvăluite în prezenta invenţie se bazează pe numerotarea aminoacizilor pentru SEQ ID NO:16 şi SEQ ID NO:28 (care diferă numai în aminoacidul exprimat în poziţia 64), cu excepţia cazului în care se specifică altfel. De exemplu, dacă o polipeptidă ActRIIB este descrisă ca având o substituţie/mutaţie la poziţia aminoacidului 79, atunci este de înţeles că poziţia 79 se referă la cel de-al 79-lea aminoacid din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, din care derivă polipeptida ActRIIB. De asemenea, dacă o polipeptidă ActRIIB este descrisă ca având o alanină sau o arginină la poziţia aminoacidului 64, atunci trebuie să se înţeleagă că poziţia 64 se referă la aminoacidul 64 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, din care derivă polipeptida ActRIIB.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin polipeptide care conţin un domeniu de legare a activinei al ActRIIB. Domeniile de legare a activinei ale ActRIIB conţin domeniul extracelular al ActRIIB sau o porţiune a acestuia. În variante de realizare specifice, domeniul extracelular al ActRIIB, sau porţiunea acestuia, este solubil. Formele modificate ilustrative ale polipeptidelor ActRIIB sunt dezvăluite în cererile de brevet (US 20090005308 şi 20100068215).

Polipeptidele ActRIIB utilizate în compoziţiile şi metodele descrise în prezenta pot fi polipeptide ActrIIB solubile. Termenul „polipeptidă ActRIIB solubilă” se referă, în general, la polipeptide care conţin un domeniu extracelular al unei proteine ActRIIB, inclusiv orice domeniu extracelular natural al unei proteine ActRIIB precum şi orice variante ale acestuia (inclusiv mutanţi, fragmente şi forme peptidomimetice). Polipeptidele ActRIIB solubile se pot lega de activină; totuşi, proteina ActRIIB de tip sălbatic nu prezintă selectivitate semnificativă în legarea de activină comparativ cu GDF8/11. De exemplu, formele modificate ale ActRIIB cu proprietăţi de legare diferite pot fi utilizate în metodele prezentate în prezenta invenţie. Astfel de forme modificate sunt dezvăluite, de exemplu, în publicaţiile cererilor internaţionale de brevet (WO 2006/012627 şi WO 2010/019261). Proteinelor ActRIIB native sau modificate li se pot atribui o specificitate adăugată pentru activină prin cuplarea acestora cu un al doilea agent selectiv de legare a activinei. Exemplele de polipeptide ActRIIB solubile includ domeniul extracelular al unei polipeptide ActRIIB umane (de exemplu, SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43).

S-a demonstrat că o proteină de fuziune Fc având secvenţa extracelulară ActRIIB descrisă de Hilden et al. (Blood, no 83(8), 1994, p. 2163-2170), care are o alanină la poziţia corespunzătoare aminoacidului 64 din secvenţa de aminoacizi a precursorului ActRIIB, adică SEQ ID NO:16 (denumită în continuare „A64” ), posedă o afinitate relativ scăzută pentru activină şi GDF-11. Prin contrast, o proteină de fuziune Fc cu o arginină la poziţia 64 a secvenţei de aminoacizi a precursorului ActRIIB (denumită în continuare „R64”) are o afinitate pentru activină şi GDF-11 în intervalul picomolar mic până la ridicat (a se vedea, de exemplu, Publicaţia cererii de brevet US 20100068215). O secvenţă de aminoacizi a precursorului ActRIIB cu o arginină la poziţia 64 este prezentată în SEQ ID NO:28. Ca atare, polipeptidele ActRIIB utilizate în conformitate cu compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine fie (i) o alanină în poziţia corespunzătoare aminoacidului 64 din secvenţa de aminoacizi a precursorului ActRIIB, adică, SEQ ID NO:16; sau (ii) o arginină în poziţia 64 a secvenţei de aminoacizi a precursorului ActRIIB, adică SEQ ID NO:28. Alternativ, polipeptidele ActRIIB utilizate în conformitate cu compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine un aminoacid care nu este alanină sau arginină în poziţia corespunzătoare aminoacidului 64 din secvenţa de aminoacizi a precursorului ActRIIB, adică, SEQ ID NR:16 sau SEQ ID NO:28.

S-a demonstrat că o deleţie a nodului prolinic la capătul C al domeniului extracelular al ActRIIB reduce afinitatea receptorului pentru activină (a se vedea, de exemplu, Attisano et al., Cell, no 68(1), 1992, p. 97-108). O proteină de fuziune ActRIIB-Fc conţinând aminoacizii 20-119 din SEQ ID NO:28 (adică, SEQ ID NO:32), „ActRIIB (20-119)-Fc”, a redus legarea de GDF-11 şi activină comparativ cu proteina de fuziune ActRIIB-Fc care conţine aminoacizii 20-134 din SEQ ID NO:28 (adică, SEQ ID NO:31), „ActRIIB (20-134)-Fc”, care include regiunea nodului prolinic şi domeniul juxtamembranic complet. Totuşi, o proteină de fuziune ActRIIB-Fc conţinând aminoacizii 20-129 din SEQ ID NO:28, „ActRIIB (20-129)-Fc”, păstrează o activitate similară dar puţin redusă în raport cu domeniul extracelular netrunchiat al ActRIIB, chiar dacă regiunea nodului prolinic este perturbată. Astfel, se aşteaptă ca polipeptidele ActRIIB cuprinzând domenii extracelulare care se opresc la aminoacizii 134, 133, 132, 131, 130 şi 129 din SEQ ID NO:28 (sau SEQ ID NO:16) să fie toate active, dar construcţiile care se opresc la aminoacidul 134 sau 133 pot fi cele mai active. În mod similar, mutaţiile la oricare dintre resturile 129-134 nu sunt de aşteptat să modifice afinitatea de legare a ligandului prin margini mari, astfel cum este indicat de faptul că mutaţiile P129 şi P130 din SEQ ID NO:28 nu reduc în mod substanţial legarea ligandului. Prin urmare, polipeptidele ActRIIB utilizate în conformitate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie se pot termina cât mai devreme cu aminoacidul 109 (adică cisteina finală) din SEQ ID NO:28 (sau SEQ ID NO:16), totuşi, formele care se termină la sau între poziţiile aminoacizilor 109 şi 119 din SEQ ID NO:28 (sau SEQ ID NO:16) sunt de aşteptat să aibă capacitate de legare a ligandului redusă.

Aminoacidul 29 din SEQ ID NO:16 şi SEQ ID NO:28 reprezintă cisteina iniţială din secvenţa precursorului ActRIIB. Este de aşteptat ca o polipeptidă ActRIIB care începe la aminoacidul 29 al capătului N al SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, sau înainte de aceste poziţii ale aminoacizilor, să reţină activitatea de legare a ligandului. O mutaţie alanină la asparagină în poziţia 24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 introduce o secvenţă de glicozilare N-linkată fără a afecta substanţial legarea ligandului. Aceasta confirmă faptul că mutaţiile din regiune între peptida de clivare a semnalului şi regiunea reticulată a cisteinei, corespunzătoare aminoacizilor 20-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, sunt bine tolerate. În particular, polipeptidele ActRIIB care încep la poziţiile aminoacizilor 20, 21, 22, 23 şi 24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 vor păstra activitatea şi polipeptidele ActRIIB care încep la poziţiile aminoacizilor 25, 26, 27, 28 şi 29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 sunt, de asemenea, de aşteptat să menţină activitatea. O polipeptidă ActRIIB care începe la poziţia aminoacizilor 22, 23, 24 sau 25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 va avea cea mai mare activitate.

Luate împreună, porţiunile active (adică, polipeptidele ActRIIB) ale proteinei precursoare ActRIIB (adică, SEQ ID NO: 16 sau SEQ ID NO: 28), care vor fi utilizate în conformitate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie,vor conţine în general aminoacizii 29-109 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi astfel de polipeptide ActRIIB pot, de exemplu, să înceapă la un rest corespunzător oricărui dintre aminoacizii 19-29 din SEQ ID NO:16 sau SECV ID NO:28 şi să se termine la o poziţie corespunzătoare oricărui dintre aminoacizii 109-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Exemplele specifice de polipeptide ActRIIB cuprinse de prezenta invenţie includ pe acelea care încep la o poziţie a aminoacidului de la 19-29, 20-29 sau 21-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină la o poziţie a aminoacidului de la 119-134, 119-133 sau 129-134, 129-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Alte exemple specifice de polipeptide ActRIIB cuprinse în prezenta invenţie includ pe cele care încep la o poziţie a aminoacidului de la 20-24 (sau 21-24, sau 22-25) din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină la o poziţie a aminoacidului de la 109-134 (sau 109-133), 119-134 (sau 119-133) sau 129-134 (sau 129-133) din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Sunt luate în considerare şi polipeptidele ActRIIB variate care se încadrează în aceste domenii, în special acelea care au cel puţin 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% identitate de secvenţă sau omologie de secvenţă cu porţiunea corespunzătoare din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine o formă trunchiată a unui domeniu extracelular al ActRIIB. Trunchierea poate fi la capătul carboxi şi/sau la capătul amino al polipeptidei ActRIIB. Trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 de aminoacizi în lungime în raport cu domeniul extracelular al polipeptidei ActRIIB mature. Trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 de aminoacizi N-terminali ai domeniului extracelular al polipeptidei ActRIIB mature. Trunchierea poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 23, 24 sau 25 de aminoacizi C-terminali ai domeniului extracelular al polipeptidei ActRIIB. De exemplu, formele trunchiate ale ActRIIB includ polipeptidele cu aminoacizii 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; şi 25-131, în care poziţiile aminoacizilor se referă la poziţiile aminoacizilor din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28.

Exemplele suplimentare de forme trunchiate ale ActRIIB includ (i) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 21-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 (opţional începând cu 22-25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28) şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 109-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (ii) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 (opţional începând cu 22-25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28) şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 109-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (iii) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-24 din SEQ ID NO: 16 sau SEQ ID NO: 28 (opţional începând cu 22-25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28) şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 109-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (iv) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 21-24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 109-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (v) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 118-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (vi) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 21-24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 118-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (vii) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 128-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (viii) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 128-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (ix) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 21-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 118-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; (x) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 118-133 din SEQ ID NO: 16 sau SEQ ID NO: 28; (xi) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 21-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 128-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28; şi (xii) polipeptide care încep cu oricare dintre aminoacizii 20-29 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu oricare dintre aminoacizii 128-133 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. O polipeptidă ActRIIB poate include, conţine sau consta în mod esenţial dintr-o secvenţă de aminoacizi care începe cu poziţia aminoacidului 25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu poziţia aminoacidului 131 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Mai specific, o polipeptidă ActRIIB poarte coţine sau consta în mod esenţial din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 sau 43.

Oricare dintre polipeptidele ActRIIB dezvăluite în prezenta invenţie pot fi produse ca un homodimer. Oricare dintre polipeptidele ActRIIB dezvăluite în prezenta invenţie pot fi formulate ca o proteină de fuziune având o porţiune heterologă care conţine o regiune constantă dintr-un lanţ greu al IgG, cum ar fi un domeniu Fc. Oricare dintre polipeptidele ActRIIB dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine un aminoacid acid în poziţia corespunzătoare poziţiei 79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, opţional în combinaţie cu una sau mai multe substituţii, deleţii sau inserţii de aminoacizi în raport cu SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine un domeniu extracelular al ActRIIB cu una sau mai multe substituţii/mutaţii de aminoacizi. O astfel de substituţie/mutaţie de aminoacizi poate fi, de exemplu, o schimbare de la leucină la poziţia aminoacidului 79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 la un aminoacid acid, cum ar fi acid aspartic sau acid glutamic. De exemplu, poziţia L79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 poate fi modificată în polipeptidele domeniului extracelular ActRIIB pentru a conferi proprietăţi de legare (GDF-11) activină-miostatină modificate. Mutaţiile L79A şi L79P reduc legarea GDF-11 într-o măsură mai mare decât legarea activinei. Mutaţiile L79E şi L79D păstrează legarea GDF-11, în timp ce demonstrează o legare a activinei redusă foarte mult.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine o formă trunchiată a unui domeniu extracelular ActRIIB care poartă, de asemenea, o substituţie de aminoacizi, de exemplu o schimbare de la leucină la poziţia aminoacidului 79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 la un aminoacid acid, cum ar fi acid aspartic sau acid glutamic. Într-o variantă de realizare specifică, forma trunchiată a unui domeniu extracelular al polipeptidei ActRIIB care poartă, de asemenea, o substituţie de aminoacizi utilizată în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este SEQ ID NO:23. Formele ActRIIB care sunt trunchiate şi/sau poartă una sau mai multe substituţii de aminoacizi pot fi legate la un domeniu Fc al unui anticorp astfel cum s-a discutat mai sus.

Fragmente funcţional active ale polipeptidelor ActRIIB pot fi obţinute, de exemplu, prin screening-ul polipeptidelor produse în mod recombinant din fragmentul corespunzător al acidului nucleic care codifică o polipeptidă ActRIIB. În plus, fragmentele pot fi sintetizate chimic utilizând tehnici cunoscute în domeniu, cum ar fi f-Moc sau t-Boc chimia în fază solidă Merrifield convenţională. Fragmentele pot fi produse (prin recombinare sau prin sinteză chimică) şi testate pentru a identifica acele fragmente peptidilice care pot funcţiona ca antagonişti (inhibitori) ai proteinei ActRIIB sau ai căii de semnalizare mediate de activină.

În plus, variantele funcţional active ale polipeptidelor ActRIIB pot fi obţinute, de exemplu, prin screening-ul bibliotecilor de polipeptide modificate obţinute prin recombinare din acizii nucleici mutagenizaţi corespunzători care codifică o polipeptidă ActRIIB. Variantele pot fi produse şi testate pentru a identifica acele care pot funcţiona ca antagonişti (inhibitori) ai proteinei ActRIIB sau ai căii de semnalizare mediate de activină. O variantă funcţională a polipeptidelor ActRIIB poate conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 75% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43. În anumite exemple, varianta funcţională are o secvenţă de aminoacizi cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99 % identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43.

Variante funcţionale pot fi generate, de exemplu, prin modificarea structurii unei polipeptide ActRIIB în scopuri precum creşterea eficacităţii sau stabilităţii terapeutice (de exemplu, durata de depozitare ex vivo şi rezistenţa la degradarea proteolitică in vivo). Astfel de polipeptide ActRIIB modificate, când sunt selectate pentru a păstra legarea activinei, sunt considerate echivalente funcţionale ale polipeptidelor ActRIIB care apar în mod natural. Polipeptidele ActRIIB modificate pot fi de asemenea produse, de exemplu, prin substituţie, deleţie sau adăugare de aminoacizi. De exemplu, este rezonabil să se aştepte ca o înlocuire izolată a unei leucine cu o izoleucină sau valină, a unui aspartat cu un glutamat, a unei treonine cu o serină sau o înlocuire similară a unui aminoacid cu un aminoacid legat structural (de exemplu, mutaţii conservatoare) nu va avea un efect major asupra activităţii biologice a moleculei rezultate. Înlocuirile conservatoare sunt cele care au loc într-o familie de aminoacizi cu lanţuri laterale asemănătoare. Prin evaluarea capacităţii variantei polipeptidei ActRIIB de a produce un răspuns în celule într-o manieră similară cu polipeptida ActRIIB de tip sălbatic se poate determina cu uşurinţă dacă o modificare a secvenţei de aminoacizi a unei polipeptide ActRIIB are drept rezultat un omolog funcţional.

Divulgate în prezenta invenţie sunt metode de generare a mutanţilor, în special a seturilor de mutanţi combinatorii ai unei polipeptide ActRIIB, precum şi mutanţi de trunchiere; populaţiile de mutanţi combinatorii sunt deosebit de utile pentru identificarea variantelor funcţionale ale secvenţei. Scopul screening-ului unor astfel de biblioteci combinatoriale poate fi de a genera, de exemplu, variante ale polipeptidei ActRIIB care pot acţiona ca agonişti sau antagonişti, sau alternativ, care toate împreună posedă activităţi inedite.

S-a demonstrat că punga de legare a ligandului a ActRIIB este definită prin resturile Y31, N33, N35, L38 până la T41, E47, E50, Q53 până la K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 până la N83, Y85, R87, A92 şi E94 până la F101 din SEQ ID NO:6 sau SEQ ID NO:28. În aceste poziţii, este de aşteptat ca mutaţiile conservatoare să fie tolerate, deşi o mutaţie K74A este bine tolerată, ca şi R40A, K55A, F82A şi mutaţiile la poziţia L79. R40 este un K în Xenopus, indicând faptul că aminoacizii bazici în această poziţie vor fi toleraţi. Q53 este R în ActRIIB bovin şi K în ActRIIB Xenopus şi, prin urmare, aminoacizii incluzând R, K, Q, N şi H vor fi toleraţi în această poziţie. Astfel, o formulă generală pentru o polipeptidă ActRIIB pentru utilizare în metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie este aceea care conţine aminoacizii 29-109 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28, dar care opţional începe cu o poziţie a aminoacidului care variază de la 20-24 sau 22-25 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi se termină cu o poziţie a aminoacidului care variază de la 129-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 şi conţine nu mai mult de 1, 2, 5 sau 15 modificări conservative ale aminoacidului în punga de legare a ligandului şi zero, una sau mai multe modificări neconservative la poziţiile aminoacizilor 40, 53, 55, 74, 79 şi/sau 82 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 în punga de legare a ligandului. O astfel de polipeptidă ActRIIB poate păstra mai mult de 80%, 90%, 95% sau 99% identitate a secvenţei sau homologie a secvenţei cu secvenţa de aminoacizi 29-109 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Situsurile din afara pungii de legare, la care variabilitatea poate fi deosebit de bine tolerată, includ capetele amino şi carboxi ale domeniului extracelular al ActRIIB şi poziţiile 42-46 şi 65-73. O înlocuire a asparaginei cu alanină la poziţia 65 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 (N65A) îmbunătăţeşte de fapt legarea ligandului în fundalul A64 şi, prin urmare, se aşteaptă să nu aibă nici un efect negativ asupra legării ligandului în fundalul R64. Această modificare probabil elimină glicozilarea la N65 în fundalul A64, demonstrând astfel că este probabil să se tolereze o schimbare semnificativă în această regiune. În timp ce o modificare R64A este puţin tolerabilă, R64K este bine tolerat şi astfel un alt rest bazic, cum ar fi H, poate fi tolerat la poziţia 64.

În calitate de exemplu specific al unei polipeptide ActRIIB cu o mutaţie în domeniul de legare a ligandului, restul de aminoacid încărcat pozitiv Asp (D80) al domeniului de legare a ligandului al ActRIIB poate fi mutat la un rest de aminoacid diferit astfel încât varianta de polipeptidă ActRIIB se leagă preferenţial de GDF8, dar nu de activină. Într-o variantă de realizare specifică, restul D80 este schimbat cu un rest de aminoacid selectat din grupul constând din: un rest de aminoacid neîncărcat, un rest de aminoacid negativ şi un rest de aminoacid hidrofob. Ca un exemplu specific suplimentar, restul hidrofob L79 poate fi modificat până la aminoacizii acizi, acidul aspartic sau acidul glutamic pentru a reduce în mod semnificativ legarea activinei menţinând în acelaşi timp legarea de GDF11. Astfel cum va fi recunoscut de către un specialist în domeniu, majoritatea mutaţiilor, variantelor sau modificărilor descrise pot fi făcute la nivelul acidului nucleic sau, în unele cazuri, prin modificarea post-translaţională sau prin sinteza chimică. Astfel de tehnici sunt bine cunoscute în domeniu.

Inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie pot conţine un conjugat/o proteină de fuziune care conţine un domeniu extracelular (de exemplu, un domeniu de legare a activinei) al unui receptor ActRIIB legat la o porţiune Fc a unui anticorp. Astfel de conjugate/proteine de fuziune pot conţine oricare dintre polipeptidele ActRIIB dezvăluite în prezenta invenţie (de exemplu, oricare din SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 sau 43), orice polipeptide ActRIIB cunoscute în domeniu sau orice polipeptide ActRIIB generate folosind metode cunoscute în domeniu şi/sau prezentate în prezenta invenţie.

Domeniul extracelular poate fi legat la o porţiune Fc a unui anticorp prin intermediul unui linker, de exemplu, un linker peptidic. Exemplele de linkeri includ secvenţe polipeptidice scurte, cum ar fi resturile de aminoacizi 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 (de exemplu, resturi de glicină), cum ar fi, de exemplu, un linker Gly-Gly-Gly. Într-o variantă de realizare specifică, linkerul conţine secvenţa de aminoacizi Gly-Gly-Gly (GGG). Într-o altă variantă de realizare specifică, linkerul conţine secvenţa de aminoacizi Thr-Gly-Gly-Gly (TGGG). Opţional, domeniul Fc are una sau mai multe mutaţii la resturi cum ar fi Asp-265, lizina 322 şi Asn-434. În anumite cazuri, domeniul Fc mutant care are una sau mai multe din aceste mutaţii (de exemplu, o mutaţie Asp-265) posedă o capacitate redusă de a se lega la receptorul Fcr comparativ cu un domeniu Fc de tip sălbatic. În alte cazuri, domeniul Fc mutant care are una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de exemplu, o mutaţie Asn-434) posedă o capacitate crescută de a se lega la receptorul Fc legat de clasa I MHC (FcRN) comparativ cu domeniul Fc de tip sălbatic. Exemplele de proteine de fuziune care conţin un domeniu extracelular solubil al ActRIIB fuzionat cu un domeniu Fc sunt prezentate în SEQ ID NO:20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46 şi 47.

Într-un exemplu specific, inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin domeniul extracelular al ActRIIB sau o porţiune a acestuia, legată la o porţiune Fc a unui anticorp, în care respectivul inhibitor al semnalizării ActRIIB conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 75% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46 şi 47. Într-un alt exemplu specific, inhibitorii semnalizării ActRIIB utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie conţin domeniul extracelular al ActRIIB sau o porţiune a acestuia, legată la o porţiune Fc a unui anticorp, în care respectivul inhibitor al semnalizării ActRIIB conţine o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80% , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată dintre SEQ ID NO:20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 40, 41, 44, 46 şi 47.

Inhibitorul semnalizării ActRIIB care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi o proteină de fuziune între domeniul extracelular al receptorului ActRIIB uman şi porţiunea Fc a IgG1. Inhibitorul semnalizării ActRIIB care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi o proteină de fuziune între un domeniu extracelular trunchiat al receptorului ActRIIB uman şi porţiunea Fc a IgG1. Inhibitorul semnalizării ActRIIB care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi o proteină de fuziune între un domeniu extracelular trunchiat al receptorului ActRIIB uman şi porţiunea Fc a IgG1, în care domeniul extracelular trunchiat al receptorului ActRIIB uman posedă o substituţie de aminoacizi la poziţia aminoacizilor corespunzătoare aminoacidului 79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Substituţia de aminoacizi la poziţia aminoacizilor corespunzătoare aminoacidului 79 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 poate fi substituţia Leucinei pentru Acidul Aspartic (adică, o mutaţie L79D).

Inhibitorul semnalizării ActRIIB care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi SEQ ID NO:24 sau 25, care reprezintă o proteină de fuziune între domeniul extracelular al receptorului ActRIIB uman şi porţiunea Fc a IgG1, în care respectivul domeniu extracelular ActRIIB conţine aminoacizii 25-131 din SEQ ID NO:28 cu o mutaţie L79D. Secvenţa de acizi nucleici care codifică proteina de fuziune ActRIIB-Fc din SEQ ID NO:24 în prezenta invenţie este prezentată în SEQ ID NO:45.

Inhibitorul semnalizării ActRIIB care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie poate fi SEQ ID NO:34 sau 35, care reprezintă o proteină de fuziune între domeniul extracelular al receptorului ActRIIB uman şi porţiunea Fc a IgG1, în care respectivul domeniu extracelular ActRIIB conţine aminoacizii 25-131 din SEQ ID NO: 6 cu o mutaţie L79D.

Situsurile de recunoaştere a glicozilării legate de asparagină conţin în general o secvenţă tripeptidică, asparagină-X-treonină (sau asparagină-X-serină) (unde „X” este orice aminoacid), care este recunoscută în mod specific de către enzimele de glicozilare celulară adecvate. Modificarea poate fi de asemenea realizată prin adăugarea sau substituirea cu unul sau mai multe resturi de serină sau treonină la secvenţa polipeptidei ActRIIB de tip sălbatic (pentru situsurile de glicozilare O). O varietate de substituţii sau deleţii de aminoacizi la una sau la ambele din prima sau a treia poziţii ale aminoacizilor ale situsului de recunoaştere a glicozilării (şi/sau deleţia aminoacidului în a doua poziţie) conduce la neglicozilare la secvenţa tripeptidică modificată. Un alt mijloc de creştere a numărului de fragmente de carbohidrat pe o polipeptidă ActRIIB este prin cuplarea chimică sau enzimatică a glicozidelor la polipeptida ActRIIB. În funcţie de modul de cuplare utilizat, zahărul poate fi legat la (a) arginină şi histidină; (b) grupări carboxil libere; (c) grupări sulfhidril libere, cum ar fi cele ale cisteinei; (d) grupări hidroxil libere, cum ar fi cele ale serinei, treoninei sau hidroxiprolinei; (e) resturi aromatice, cum ar fi cele ale fenilalaninei, tirozinei sau triptofanului; sau (f) gruparea amidă a glutaminei. Aceste metode sunt descrise în cererea de brevet internaţională (WO 87/05330 publicată la 11 septembrie 1987 şi în Aplin şi Wriston CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, p. 259-306). Îndepărtarea unuia sau mai multor fragmente de carbohidrat prezente pe o polipeptidă ActRIIB poate fi realizată chimic şi/sau enzimatic. Deglicozilarea chimică poate fi efectuată, de exemplu, prin tratarea polipeptidei ActRIIB cu acidul trifluorometansulfonic sau cu un compus echivalent. Acest tratament are drept rezultat scindarea majorităţii sau tuturor zaharurilor, cu excepţia zahărului care leagă (N-acetilglucozamină sau N-acetilgalactozamină), lăsând în acelaşi timp secvenţa de aminoacizi intactă. Deglicozilarea chimică este descrisă în continuare de (Hakimuddin et al. Arch. Biochem. Biophys., no 259, 1987, p. 52 şi de Edge et al. Anal. Biochem., no 118, 1981, p. 131). Clivajul enzimatic al fragmentelor de carbohidrat pe polipeptidele ActRIIB poate fi realizată prin utilizarea unei varietăţi de endo- şi exoglicozidaze, astfel cum este descris de (Thotakura et al. Meth. Enzymol., no 138, 1987, p. 350). Secvenţa unei polipeptide ActRIIB poate fi ajustată, după cum este adecvat, în funcţie de tipul sistemului de expresie utilizat, cum ar fi celule de mamifere, drojdie, insecte şi plante, toate putând introduce modele diferite de glicozilare care pot fi afectate de secvenţa de aminoacizi a peptidei. În general, proteinele ActRIIB pentru utilizare la om vor fi exprimate într-o linie celulară de mamifere care asigură glicozilare adecvată, cum ar fi linii celulare HEK293 sau CHO, deşi alte sisteme de expresie, cum ar fi alte linii celulare de expresie de mamifere, linii celulare de drojdie cu enzime de glicozilare modificate şi celule de insecte, sunt de aşteptat să fie de asemenea utile.

În exemple specifice, sunt cuprinse în prezenta invenţie polipeptidele ActRIIB mutante care conţin adăugarea unui alt situs de glicozilare N-linkat (N-X-S/T) care măreşte perioada de semieliminare din ser a unei proteine de fuziune ActRIIB-Fc, în raport cu forma ActRIIB (R64)-Fc. Într-un exemplu specific, introducerea unei asparagine în poziţia 24 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28 (A24N) are drept rezultat crearea unei secvenţe NXT care conferă o perioadă de înjumătăţire mai lungă. Alte secvenţe NX(T/S) pot fi găsite la 42-44 (NQS) şi 65-67 (NSS), deşi acestea din urmă nu pot fi glicozilate eficient cu R la poziţia 64 (adică, în polipeptidele R64). Secvenţele N-X-S/T pot fi introduse în general în poziţiile din afara pungii de legare al ligandului ActRIIB, care este detaliat mai sus. Situsuri deosebit de potrivite pentru introducerea secvenţelor N-X-S/T non-endogene includ aminoacizii 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 sau 129-134 din SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28. Secvenţele N-X-S/T pot fi, de asemenea, introduse în linker între secvenţa ActRIIB şi Fc sau altă componentă de fuziune. Un astfel de situs poate fi introdus cu un efort minim prin introducerea unui N în poziţia corectă faţă de un S sau T preexistent sau prin introducerea unui S sau T într-o poziţie corespunzătoare unui N preexistent. Astfel, modificările dorite care ar crea un situs de glicozilare N-linkat sunt: A24N, R64N, S67N (posibil combinate cu o modificare N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S şi R112T (cu toate poziţiile aminoacizilor corespunzătoare poziţiilor care pot fi găsite în SEQ ID NO:16 sau SEQ ID NO:28). Orice S care este prezis a fi glicozilat poate fi modificat până la un T fără a crea un situs imunogenic datorită protecţiei oferite de glicozilare. De asemenea, orice T care este prezis a fi glicozilat poate fi modificat până la un S. Astfel, modificările S67T şi S44T sunt cuprinse în prezenta invenţie. De asemenea, într-o variantă A24N, poate fi utilizată o modificare S26T. În consecinţă, o polipeptidă ActRIIB poate include una sau mai multe secvenţe consens de glicozilare N-linkate non-endogene.

O varietate de analize de screening pot fi utilizate pentru a evalua variantele polipeptidei ActRIIB. De exemplu, o variantă a polipeptidei ActRIIB poate fi testată pentru capacitatea de a se lega la un ligand ActRIIB, pentru a preveni legarea unui ligand ActRIIB la o polipeptidă ActRIIB sau pentru a interfera cu semnalizarea cauzată de un ligand ActRIIB. Activitatea unei polipeptide ActRIIB sau a variantelor acesteia poate fi, de asemenea, testată într-o analiză pe bază de celule sau in vivo.

Pot fi generate variante derivate combinatoriu care au o potenţă selectivă sau în general crescută în raport cu o polipeptidă ActRIIB naturală. În mod similar, mutageneza poate da naştere la variante care au timpi de înjumătăţire intracelulari semnificativ diferite de polipeptida ActRIIB de tip sălbatic corespunzătoare. De exemplu, proteina modificată poate o rezistenţă mai mare sau mai mică la degradarea proteolitică sau alte procese celulare care conduc la distrugerea sau la altă inactivare a unei polipeptide ActRIIB native. Astfel de variante, precum şi genele care le codifică, pot fi utilizate pentru a modifica nivelele polipeptidei ActRIIB prin modularea perioadei de înjumătăţire a polipeptidei ActRIIB. De exemplu, o perioadă de înjumătăţire scurtă poate conduce la apariţia efectelor biologice mai tranzitorii şi poate permite un control mai strict al nivelelor polipeptidei ActRIIB recombinante în interiorul subiectului. Într-o proteină de fuziune Fc, pot fi făcute mutaţii în linker (dacă acesta este prezent) şi/sau în porţiunea Fc pentru a modifica perioada de înjumătăţire a proteinei.

O bibliotecă combinatorială poate fi produsă printr-o bibliotecă de gene degenerate care codifică o bibliotecă de polipeptide, fiecare dintre care include cel puţin o porţiune din secvenţele polipeptidice ActRIIB potenţiale. De exemplu, un amestec de oligonucleotide sintetice poate fi legat în mod enzimatic în secvenţe genetice, astfel încât setul degenerat de secvenţe nucleotidice ale polipeptidei ActRIIB potenţiale să fie exprimat ca polipeptide individuale sau, alternativ, ca un set de proteine de fuziune mai mari (de exemplu, pentru afişarea fagelor).

Există multe moduri prin care biblioteca de omologi potenţiali poate fi generată dintr-o secvenţă oligonucleotidică degenerată. Sinteza chimică a unei secvenţe de gene degenerate poate fi efectuată într-un sintetizator automat de ADN, iar genele sintetice sunt apoi ligate într-un vector de exprimare adecvat. Sinteza oligonucleotidelor degenerate este bine cunoscută în stadiul tehnicii (a se vedea, de exemplu, Narang, SA Tetrahedron, no 39, 1983, p. 3; Itakura et al. Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier, 1981, p. 273-289; Itakura et al. Annu. Rev. Biochem., no 53, 1984, p. 323; Itakura et al. Science, no 198, 1984, p. 1056; Ike et al. Nucleic Acid Res., no 11, 1983, p. 477). Astfel de tehnici s-au utilizat în evoluţia direcţionată a altor proteine (a se vedea, de exemplu, Scott et al. Science, no 249, 1990, p. 386-390; Roberts et al. PNAS USA, no 89, 1992, p. 2429-2433; Devlin et al. Science, no 249, 1990, p. 404-406; Cwirla et al. PNAS USA, no 87, 1990, p. 6378-6382, precum şi brevetele US 5,223,409, 5,198,346, şi 5,096,815).

Alternativ, alte forme de mutageneză pot fi utilizate pentru a genera o bibliotecă combinatorială. De exemplu, variantele polipeptidei ActRIIB pot fi generate şi izolate dintr-o bibliotecă prin intermediul screening-ului utilizând, de exemplu, mutageneza de scanare a alaninei şi altele asemenea (Ruf et al. Biochemistry, no 33, 1994, p. 1565-1572; Wang et al. J. Biol. Chem., no 269, 1994, p. 3095-3099; Balint et al. Gene, no 137, 1993, p. 109-118; Grodberg et al. Eur, J. Biochem., no 218, 1993, p. 597-601; Nagashima et al. J. Biol. Chem., no 268, 1993, p. 2888-2892; Lowman et al. Biochemistry, no 30, 1991, p. 10832-10838 şi Cunningham et al. Science, no 244, 1989, p. 1081-1085), prin mutageneza de scanare a linkerului (Gustin et al. Virology, no 193, 1993, p. 653-660; Brown et al. Mol. Cell Biol., no 12, 1992, p. 2644-2652; McKnight et al. Science, no 232, 1982, p. 316); prin mutageneză de saturaţie (Meyers et al. Science, no 232, 1986, p. 613); prin mutageneza RPL (Leung et al. Method Cell Mol. Biol., no 1, 1989, p. 1-19); sau prin mutageneză aleatorie, inclusiv mutageneză chimică etc. (Miller et al. A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992 şi Greener et al. Strategies in Mol. Biol., no 7, 1994, p. 32-34). Mutageneza de scanare a linkerului, în special în chimia combinatorie, este o metodă atractivă pentru identificarea formelor trunchiate (bioactive) ale polipeptidei ActRIIB.

O gamă largă de tehnici sunt cunoscute în domeniu pentru screening-ul produselor genetice ale bibliotecilor combinatoriale, obţinute prin mutaţii şi trunchieri punctiforme şi, de asemenea, pentru screening-ul bibliotecilor de cADN pentru produsele genetice care au o anumită proprietate. Astfel de tehnici vor fi în general adaptabile pentru screening-ul rapid al bibliotecilor de gene generate de mutageneza combinatorie a polipeptidelor ActRIIB. Cele mai utilizate tehnici de screening pentru bibliotecile de gene mari includ de obicei clonarea bibliotecii de gene în vectori de exprimare replicabili, transformarea celulele adecvate cu biblioteca de vectori obţinută şi exprimarea genelor combinatorii în condiţii în care detecţia unei activităţi dorite facilitează izolarea relativ uşoară a vectorului care codifică gena a cărei produs a fost detectat. Analizele preferate includ analize de legare a activinei şi analize ale căilor de semnalizare celulare mediate de activină.

În anumite variante de realizare, polipeptidele ActRIIB pot conţine suplimentar modificări post-translaţionale în afară de oricare care sunt prezente în mod natural în polipeptidele ActRIIB. Astfel de modificări includ, dar nu se limitează la, acetilare, carboxilare, glicozilare, fosforilare, lipidare şi acilare. Drept rezultat, polipeptidele ActRIIB modificate pot conţine elemente non-aminoacide, cum ar fi polietilenglicoli, lipide, poli- sau monozaharide şi fosfaţi. Efectele unor astfel de elemente non-aminoacide asupra funcţionalităţii unei polipeptide ActRIIB pot fi analizate prin orice metodă cunoscută specialiştilor în domeniu. Atunci când o polipeptidă ActRIIB este produsă în celule prin clivarea unei forme native a polipeptidei ActRIIB, procesarea post-translaţională poate fi, de asemenea, importantă pentru plierea şi/sau funcţionarea corectă a proteinei. Diferite celule (cum ar fi CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 sau HEK293) au structuri celulare specifice şi mecanisme caracteristice pentru astfel de activităţi post-translaţionale şi pot fi alese pentru a asigura modificarea şi procesarea corectă a polipeptidelor ActRIIB.

În anumite aspecte, variantele funcţionale sau formele modificate ale polipeptidelor ActRIIB includ proteine de fuziune având cel puţin o porţiune din polipeptidele ActRIIB şi unul sau mai multe domenii de fuziune. Exemplele bine cunoscute de astfel de domenii de fuziune includ, dar nu se limitează la, polihistidină, Glu-Glu, glutation-S-transferază (GST), tioredoxină, proteina A, proteina G, o regiune constantă a lanţului greu al imunoglobulinei (Fc), proteina care leagă maltoza (MBP) sau albumina serică umană. Un domeniu de fuziune poate fi selectat astfel încât să confere o proprietate dorită. De exemplu, unele domenii de fuziune sunt deosebit de utile pentru izolarea proteinelor de fuziune prin cromatografia de afinitate. În scopul purificării afinităţii, se utilizează matrice relevante pentru cromatografia de afinitate, cum ar fi răşinile conjugate cu glutation, amilază şi nichel sau cobalt. Multe dintre aceste matrici sunt disponibile sub formă de „kit”, cum ar fi sistemul de purificare Pharmacia GST şi sistemul QIAexpressTM (Qiagen) utile cu partenerii de fuziune (HIS6). În calitate de un alt exemplu, un domeniu de fuziune poate fi selectat astfel încât să faciliteze detecţia polipeptidelor ActRIIB. Exemplele de astfel de domenii de detecţie includ diverse proteine fluorescente (de exemplu, GFP), precum şi „etichete epitopice”, care sunt de obicei secvenţe peptidice scurte pentru care este disponibil un anticorp specific. Marcherii epitopici bine cunoscuţi pentru care anticorpii monoclonali specifici sunt uşor disponibili includ FLAG, hemaglutinina virusului gripal (HA) şi c-myc. În unele cazuri, domeniile de fuziune au un situs de clivaj de către protează, cum ar fi Factorul Xa sau Trombina, care permite proteazei relevante să digere parţial proteinele de fuziune şi astfel să elibereze proteinele recombinante din acestea. Proteinele eliberate pot fi apoi izolate din domeniul de fuziune prin separarea cromatografică ulterioară. În anumite variante de realizare preferate, o polipeptidă ActRIIB este fuzionată cu un domeniu care stabilizează polipeptida ActRIIB in vivo (un domeniu „stabilizator”). Prin „stabilizare” se înţelege orice ce măreşte durata perioadei de înjumătăţire în ser, indiferent dacă aceasta se datorează distrugerii reduse, clearance-ului renal redus sau altui efect farmacocinetic. Fuziunile cu porţiunea Fc a unei imunoglobuline sunt cunoscute pentru a conferi proprietăţi farmacocinetice dorite unei game largi de proteine. În mod similar, fuziunile cu albumina serică umană pot conferi proprietăţi dorite. Alte tipuri de domenii de fuziune care pot fi selectate includ domenii de multimerizare (de exemplu, dimerizare, tetramerizare) şi domenii funcţionale (care conferă o funcţie biologică suplimentară, cum ar fi stimularea suplimentară a creşterii osoase sau a creşterii musculare, la dorinţă).

Se înţelege că diferite elemente ale proteinelor de fuziune pot fi aranjate în orice mod care este în concordanţă cu funcţionalitatea dorită. De exemplu, o polipeptidă ActRIIB poate fi plasată C-terminal la un domeniu heterolog sau, alternativ, un domeniu heterolog poate fi plasat C-terminal la o polipeptidă ActRIIB. Domeniul polipeptidei ActRIIB şi domeniul heterolog nu trebuie să fie adiacente într-o proteină de fuziune, iar alte domenii sau secvenţe de aminoacizi pot fi incluse C- sau N-terminal la oricare domeniu sau între domenii.

În anumite variante de realizare, polipeptidele ActRIIB conţin una sau mai multe modificări care sunt capabile să stabilizeze polipeptidele ActRIIB. De exemplu, astfel de modificări sporesc durata de înjumătăţire in vitro a polipeptidelor ActRIIB, sporesc durata semivieţii în ser a polipeptidelor ActRIIB sau reduc degradarea proteolitică a polipeptidelor ActRIIB. Astfel de modificări de stabilizare includ, dar nu se limitează la, proteine de fuziune (inclusiv, de exemplu, proteine de fuziune care conţin o polipeptidă ActRIIB şi un domeniu stabilizator), modificări ale situsului de glicozilare (inclusiv, de exemplu, adăugarea unui situs de glicozilare la o polipeptidă ActRIIB) şi modificări ale fragmentului de carbohidraţi (inclusiv, de exemplu, eliminarea fragmentelor de carbohidrat dintr-o polipeptidă ActRIIB). În cazul proteinelor de fuziune, o polipeptidă ActRIIB este fuzionată cu un domeniu stabilizator, cum ar fi o moleculă IgG (de exemplu, un domeniu Fc). Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul „domeniu stabilizator” nu se referă numai la un domeniu de fuziune (de exemplu, Fc) ca în cazul proteinelor de fuziune, ci include şi modificări neproteice, cum ar fi un fragment carbohidrat sau un polimer neproteic, cum ar fi polietilenglicol.

În anumite variante de realizare, formele izolate şi/sau purificate ale polipeptidelor ActRIIB, care sunt izolate sau altfel eliberate de alte proteine, pot fi utilizate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie. Polipeptidele ActRIIB vor fi în general produse prin expresia acizilor nucleici recombinanţi.

În anumite aspecte, sunt prezentate în prezenta invenţie acizi nucleici izolaţi şi/sau recombinanţi care codifică oricare dintre polipeptidele ActRIIB (de exemplu, polipeptide ActRIIB solubile), inclusiv fragmente, variante funcţionale şi proteine de fuziune dezvăluite în prezenta invenţie. De exemplu, SEQ ID NO: 19 codifică precursorul natural al polipeptidei ActRIIB umane. Acizii nucleici examinaţi pot fi monocatenari sau dublu-catenari. Astfel de acizi nucleici pot fi molecule ADN sau ARN. Aceşti acizi nucleici pot fi utilizaţi, de exemplu, în procedee de obţinere a polipeptidelor ActRIIB sau ca agenţi terapeutici direcţi (de exemplu, într-o abordare a terapiei genice).

În anumite aspecte, acizii nucleici care codifică polipeptidele ActRIIB sunt în continuare înţeleşi ca incluzând acizii nucleici care sunt variante ale SEQ ID NO:19, precum şi variantele acelor secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActrIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43). Variantele de secvenţe nucleotidice includ secvenţe care diferă prin una sau mai multe substituţii, adiţii sau deleţii nucleotidice, cum ar fi variantele alelice.

În anumite exemple, secvenţele de acizi nucleici izolate sau recombinate care pot fi utilizate sunt cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identice cu SEQ ID NO:19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActrIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43 ). Un specialist în domeniu va aprecia că secvenţele de acizi nucleici complementare cu SEQ ID NO:19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActRIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27 , 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43) şi variantele SEQ ID NO:19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActRIIB solubile (de exemplu acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43) pot fi utilizate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie. În alte exemple, secvenţele de acizi nucleici pot fi izolate, recombinate şi/sau fuzionate cu o secvenţă nucleotidică heterologă sau într-o bibliotecă de ADN.

În alte exemple, acizii nucleici care pot fi utilizaţi includ, de asemenea, secvenţe nucleotidice care hibridizează în condiţii de stringenţă ridicată cu secvenţa nucleotidică desemnată în SEQ ID NO: 19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActrIIB solubile (de exemplu, acizi nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43), secvenţa complementară din SEQ ID NO:19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActrIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43), sau fragmentele acestora. După cum s-a discutat mai sus, un specialist în domeniu va înţelege cu uşurinţă că condiţiile de stringenţă adecvate care promovează hibridizarea ADN pot fi variate. Un specialist în domeniu va înţelege că condiţiile de stringenţă adecvată care promovează hibridizarea ADN pot fi variate. De exemplu, se poate efectua hibridizarea în condiţii 6,0×clorură de sodiu/citrat de sodiu (SSC) la aproximativ 45 grade Celsius, cu spălarea ulterioară 2,0×SSC la 50 grade Celsius. De exemplu, concentraţia de sare la etapa de spălare poate fi selectată de la o stringenţă scăzută, care include aproximativ 2,0×SSC la 50 grade Celsius până la o stringenţă ridicată, care include aproximativ 0,2×SSC la 50 grade Celsius. În plus, temperatura la etapa de spălare poate fi crescută de la condiţii de stringenţă scăzută, care includ temperatura camerei, aproximativ 22 de grade Celsius, până la condiţii de stringenţă ridicată, care corespund cu aproximativ 65 grade Celsius. Atât temperatura, cât şi concentraţia de sare pot fi variate, sau temperatura sau concentraţia de sare poate fi menţinută constantă în timp ce cealaltă variabilă este schimbată. Într-un exemplu, acizii nucleici care hibridizează în condiţii de stringenţă redusă, corespunzătoare 6×SSC la temperatura camerei cu spălarea ulterioară 2×SSC la temperatura camerei, pot fi utilizaţi cu metodele şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie.

Acizi nucleici izolaţi care diferă de acizii nucleici astfel cum sunt expuşi în SEQ ID NO: 19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptidele ActrIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43) datorită degenerării în codul genetic, de asemenea pot fi utilizaţi în prezenta invenţie. De exemplu, un număr de aminoacizi sunt desemnaţi de mai mult de un triplet. Codonii care specifică acelaşi aminoacid sau sinonimele (de exemplu, CAU şi CAC sunt sinonime pentru histidină) pot avea drept rezultat mutaţii „silenţioase” care nu afectează secvenţa de aminoacizi a proteinei. Totuşi, este de aşteptat ca polimorfisme ale secvenţei de ADN care conduce la modificări în secvenţele de aminoacizi ale proteinelor codificate vor exista în celulele de mamifere. Un specialist în domeniu va aprecia că aceste variaţii ale unuia sau mai multor nucleotide (până la aproximativ 3…5% de nucleotide) ale acizilor nucleici care codifică o anumită proteină pot exista la indivizii unei anumite specii datorită variaţiei alelelor naturale. Oricare şi toate astfel de variaţii nucleotidice şi polimorfisme ale aminoacizilor rezultate pot fi utilizate cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie.

În anumite variante de realizare, acizii nucleici recombinanţi pot fi legaţi funcţional cu una sau mai multe secvenţe nucleotidice reglatoare într-o construcţie de expresie. Secvenţele nucleotidice reglatoare vor fi, în general, adecvate pentru celula gazdă utilizată pentru exprimare. Numeroase tipuri de vectori de exprimare adecvaţi şi secvenţe reglatoare adecvate sunt cunoscute în domeniu pentru o varietate de celule gazdă. În mod tipic, una sau mai multe secvenţe nucleotidice reglatoare pot include, dar nu se limitează la, secvenţe promotor, secvenţe lider sau semnal, situsuri de legare a ribozomilor, secvenţe de iniţiere şi terminare a transcripţiei, secvenţe de iniţiere şi terminare a translaţiei şi secvenţe amplificatoare sau activatoare. Promotorii constitutivi sau inducibili, astfel cum sunt cunoscuţi în domeniu, pot fi utilizaţi cu metodele şi compoziţiile dezvăluite în prezenta invenţie. Promotorii pot fi naturali sau hibrizi care combină elemente ale mai multor promotori. O construcţie de exprimare poate fi prezentă într-o celulă pe un episom, cum ar fi o plasmidă sau construcţia de exprimare poate fi inserată într-un cromozom. Într-o variantă de realizare preferată, vectorul de exprimare conţine o genă marker selectabilă pentru a permite selecţia celulelor gazdă transformate. Genele marker selectabile sunt bine cunoscute în domeniu şi vor varia în funcţie de celula gazdă utilizată.

În anumite aspecte, acidul nucleic este furnizat într-un vector de exprimare, care conţine o secvenţă nucleotidică, care codifică o polipeptidă ActRIIB, legată funcţional cu cel puţin o secvenţă reglatoare. Secvenţele reglatoare sunt recunoscute în domeniu şi sunt selectate pentru a controla expresia polipeptidei ActRIIB. În consecinţă, termenul de secvenţă reglatoare include promotori, amplificatori şi alte elemente de control al expresiei. Exemplele de secvenţe reglatoare sunt descrise în Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). De exemplu, oricare dintr-o mare varietate de secvenţe de control al expresiei care controlează expresia unei secvenţe de ADN, atunci când este legată funcţional de ea, poate fi utilizată în aceşti vectori pentru expresia secvenţelor de ADN care codifică o polipeptidă ActRIIB. Astfel de secvenţe de control de expresie utile includ, de exemplu, promotorii timpuriu şi tardiv ai SV40, promotorul tet, promotorul pretimpuriu al adenovirusului sau citomegalovirusului, promotorii RSV, sistemul lac, sistemul trp, sistemul TAC sau TRC, promotorul T7 a cărui expresie este dirijată de polimeraza T7 ARN, regiunile promotoare şi operatoare majore ale fagului lambda, regiunile de control pentru proteina învelişului fd, promotorul pentru 3-fosfoglicerat kinază sau alte enzime glicolitice, promotorii fosfatazei acide, de exemplu Pho5, promotorii factorilor de α-împerechere la drojdii, promotorul poliedric al sistemului baculoviral şi alte secvenţe cunoscute pentru a controla expresia genelor de celule procariote sau eucariote sau a virusurilor acestora şi diferite combinaţii ale acestora. Trebuie înţeles că construcţia vectorului de exprimare poate depinde de factori cum ar fi alegerea celulei gazdă care urmează să fie transformată şi/sau tipul de proteină dorită a fi exprimată. Mai mult decât atât, numărul de copii ale vectorului, capacitatea de a controla numărul de copii şi expresia oricărei alte proteine codificate de vector, cum ar fi markerii antibiotici, ar trebui, de asemenea, luate în considerare.

Un acid nucleic recombinant poate fi produs prin legarea genei clonate sau a unei porţiuni a acesteia într-un vector adecvat pentru exprimarea fie în celule procariote, fie în celule eucariote (de drojdie, pasăre, insectă sau mamifer), fie ambele. Exprimarea vehiculelor pentru producerea unei polipeptide ActRIIB recombinante include plasmide şi alţi vectori. De exemplu, vectorii adecvaţi includ plasmidele de următoarele tipuri: plasmide derivate din pBR322, plasmide derivate din pEMBL, plasmide derivate din pEX, plasmide derivate din pBTac şi plasmide derivate din pUC pentru exprimare în celule procariote, cum ar fi E. coli.

Unii vectori de exprimare de mamifere conţin ambele secvenţe procariote pentru a facilita propagarea vectorului în bacterii şi una sau mai multe unităţi de transcripţie eucariote care sunt exprimate în celule eucariote. Vectorii pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo şi pHyg sunt exemple de vectori de exprimare de mamifere adecvaţi pentru transfecţia celulelor eucariote. Unii dintre aceşti vectori sunt modificaţi cu secvenţe de plasmide bacteriene, cum ar fi pBR322, pentru a facilita replicarea şi selecţia rezistenţei la medicamente atât în celule procariotice, cât şi în celule eucariote. În mod alternativ, pentru expresia tranzitorie a proteinelor în celulele eucariote pot fi utilizaţi derivaţi ai virusurilor, cum ar fi virusul papilomului bovin (BPV-1) sau virusul Epstein-Barr (pHEBo, pREP-derivat şi p205). Exemple de alte sisteme de exprimare virale (inclusiv retrovirale) pot fi găsite mai jos în descrierea sistemelor de administrare a terapiei genice. Diferitele metode utilizate în prepararea plasmidelor şi în transformarea organismelor gazdă sunt bine cunoscute în domeniu. Pentru alte sisteme de exprimare adecvate pentru ambele celule procariotice şi eucariote, precum şi procedee generale de recombinare, a se vedea - Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). În unele cazuri, poate fi de dorit să se exprime polipeptidele recombinante prin utilizarea unui sistem de exprimare baculoviral. Exemplele de astfel de sisteme de exprimare baculovirirale includ vectori derivaţi din pVL (cum ar fi pVL1392, pVL1393 şi pVL941), vectori derivaţi din pAcUW (cum ar fi pAcUW1) şi vectori derivaţi din pBlueBac (cum ar fi pBlueBac III conţinând .beta.-gal).

Într-o variantă de realizare preferată, un vector va fi construit pentru producerea polipeptidelor ActRIIB ţintă în celule CHO, cum ar fi un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectori pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif. ) şi vectori pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). După cum va fi evident, construcţiile anumitor gene pot fi folosite pentru a determina expresia polipeptidelor ActRIIB ţintă în celulele propagate în cultură, de exemplu, pentru a produce proteine, inclusiv proteine de fuziune sau proteine variante, pentru purificare.

Această dezvăluire se referă, de asemenea, la o celulă gazdă transfectată cu o genă recombinantă care include o secvenţă codificatoare (de exemplu, SEQ ID NO:19 sau acele secvenţe de acizi nucleici care codifică polipeptide ActRIIB solubile (de exemplu, acizii nucleici care codifică SEQ ID NO:17 , 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 şi 43) pentru una sau mai multe polipeptide ActRIIB. Celula gazdă poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă. De exemplu, o polipeptidă ActRIIB poate fi exprimată în celule bacteriene, cum ar fi E. coli, celule de insecte (de exemplu, utilizând un sistem de exprimare baculoviral), celule de drojdii sau celule de mamifere. Alte celule gazdă adecvate sunt cunoscute specialiştilor în domeniu.

În consecinţă, descrise în prezenta invenţie sunt procedee de producere a polipeptidelor ActRIIB. De exemplu, o celulă gazdă transfectată cu un vector de exprimare care codifică o polipeptidă ActRIIB poate fi cultivată în condiţii adecvate pentru a permite apariţia expresiei polipeptidei ActRIIB. Polipeptida ActRIIB poate fi secretată şi izolată dintr-un amestec de celule şi mediu care conţine polipeptida ActRIIB. În mod alternativ, polipeptida ActRIIB poate fi reţinută într-o fracţiune citoplasmatică sau de membrană, în acest caz celulele sunt recoltate, lizate şi proteina izolată. O cultură celulară include celule gazdă, medii şi alte produse secundare. Mediile de cultură celulară adecvate sunt bine cunoscute în domeniu. Polipeptidele ActRIIB pot fi izolate din mediul de cultură celulară, celulele gazdă sau ambele, utilizând tehnici cunoscute în domeniu pentru purificarea proteinelor, inclusiv cromatografia de schimb ionic, cromatografia de filtrare pe gel, ultrafiltrarea, electroforeza, purificarea de imunoafinitate cu anticorpi specifici pentru epitopii particulari ai polipeptidelor ActRIIB şi purificarea de afinitate cu un agent care se leagă la un domeniu fuzionat cu polipeptida ActRIIB (de exemplu, o coloană cu proteina A poate fi utilizată pentru a purifica o fuziune ActRIIB-Fc). Într-o variantă de realizare preferată, polipeptida ActRIIB este o proteină de fuziune care conţine un domeniu care facilitează purificarea acesteia. Într-o variantă de realizare preferată, purificarea este realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, inclusiv, de exemplu, trei sau mai multe din următoarele, în orice ordine: cromatografie pe proteina A, cromatografie pe sefaroză Q, cromatografie pe fenilsefaroză, cromatografie de excludere a mărimii şi cromatografie de schimb cationic. Purificarea poate fi completă cu filtrare virală şi schimb de tampon. Astfel cum s-a demonstrat în prezenta invenţie, proteina ActRIIB-hFc a fost purificată până la o puritate de > 98% determinată prin cromatografie de excludere a mărimii şi de > 95% determinată prin SDS PAGE. Acest nivel de puritate a fost suficient pentru a obţine efectele dorite asupra oaselor la şoareci şi un profil de siguranţă acceptabil la şoareci, şobolani şi primate neumane.

Într-o altă variantă de realizare, o gena de fuziune care codifică o secvenţă lider de purificare, cum ar fi o secvenţă a situsui de clivaj al poli- (His)/enterokinazei la capătul N-terminal al porţiunii dorite a polipeptidei ActRIIB recombinante, poate permite purificarea proteinei de fuziune exprimate prin cromatografie de afinitate utilizând o răşină care conţine metal Ni2+. Secvenţa lider de purificare poate fi ulterior îndepărtată prin tratarea cu enterokinază pentru a produce polipeptida ActRIIB purificată (a se vedea, de exemplu, Hochuli et al. J. Chromatography no 411, 1987, p. 177; and Janknecht et al. PNAS USA, no 88, p. 8972).

Tehnicile pentru producerea genelor de fuziune sunt bine cunoscute. În esenţă, legarea diferitelor fragmente de ADN care codifică secvenţe polipeptidice diferite se efectuează în conformitate cu tehnicile convenţionale, folosind capete terminale drepte sau în zigzag pentru ligare, digestia cu enzime de restricţie pentru a asigura capetele terminale corespunzătoare, completarea capetelor coezive, după caz, tratamentul cu fosfatază alcalină pentru a evita cuplarea nedorită şi ligarea enzimatică. Într-un exemplu de realizare, gena de fuziune poate fi sintetizată prin tehnici convenţionale, inclusiv prin sintetizatoare automate de ADN. În mod alternativ, amplificarea RPL a fragmentelor de gene poate fi realizată utilizând primeri de ancoră care dau naştere unor extensii complementare între două fragmente de gene consecutive, care pot fi ulterior recuperate pentru a genera o secvenţă de genă himerică (a se vedea, de exemplu, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).

Proteina de fuziune ActRIIB-Fc poate fi exprimată în celule CHO-DUKX Bl1 transfectate stabil dintr-un vector pAID4 (SV40 ori/enhancer, promotor CMV), utilizând o secvenţă lider a plasminogenului tisular din SEQ ID NO:8. Porţiunea Fc poate conţine o secvenţă Fc a IgGl umane, astfel cum se arată în SEQ ID NO:7. În anumite variante de realizare, după exprimare, proteina conţinută are, în medie, între aproximativ 1,5 şi 2,5 moli de acid sialic per moleculă de proteină de fuziune ActRIIB-Fc.

În anumite variante de realizare, durata semivieţii în ser pe termen lung al unei fuziuni ActRIIB-Fc poate fi de 25-32 zile la subiecţii umani. În plus, materialul exprimat în celula CHO poate avea o afinitate mai mare pentru ligandul activinei B decât cea raportată pentru o proteină de fuziune ActRIIB-hFc exprimată în celulele 293 umane (del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17; 279(51):53126-35). În plus, fără limitare la teorie, utilizarea secvenţei lider a TPA a oferit o producţie mai mare decât alte secvenţe lider şi, spre deosebire de ActRIIB-Fc exprimată cu un lider nativ, poate furniza o secvenţă N-terminală foarte pură. Utilizarea secvenţei lider native poate avea drept rezultat două specii majore de ActRIIB-Fc, fiecare având o secvenţă N-terminală diferită.

7.9.3 ALŢI INHIBITORI AI SEMNALIZĂRII RECEPTORULUI ACTRII

În anumite exemple, inhibitorii semnalizării receptorilor ActRII utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie sunt compuşi ai acidului nucleic.

Exemplele de categorii de compuşi ai acidului nucleic care inhibă receptorii ActRII includ acizii nucleici antisens, construcţiile de siRNA sau ARNi şi construcţiile de acid nucleic catalitic. Un compus cu acid nucleic poate fi mono- sau dublu-catenar. Un compus dublu-catenar poate include, de asemenea, regiuni de extensie sau necomplementaritate, în care una sau alta dintre catene este monocatenară. Un compus monocatenar poate include regiuni de auto-complementaritate, ceea ce înseamnă că compusul poate forma o aşa-zisă structură „în ac de păr” sau „tulpină-buclă”, cu o regiune cu structură dublă elicoidală.

În anumite exemple, compuşii de acid nucleic care inhibă receptorii ActRII pot conţine o secvenţă nucleotidică care este complementară unei regiuni constând din nu mai mult de 1000, nu mai mult de 500, nu mai mult de 250, nu mai mult de 100 sau nu mai mult de 50, 35, 30, 25, 22, 20 sau 18 nucleotide din secvenţa de acizi nucleici a receptorului ActRII cu lungime totală sau din secvenţa de acizi nucleici a activinei (de exemplu, secvenţa de acizi nucleici a unei subunităţi a activinei A sau activinei B, ßA sau ßB). În exemple specifice, regiunea de complementaritate va fi de cel puţin 8 nucleotide şi opţional cel puţin 10 sau cel puţin 15 nucleotide şi opţional între 15 şi 25 nucleotide. O regiune de complementaritate poate cădea într-un intron, o secvenţă codificatoare sau o secvenţă necodificatoare a transcriptului ţintă, cum ar fi porţiunea de secvenţă codificatoare. În general, un compus de acid nucleic care inhibă un receptor ActRII va avea o lungime de aproximativ 8 până la aproximativ 500 nucleotide sau perechi de baze în lungime şi, opţional, lungimea va fi de aproximativ 14 până la aproximativ 50 nucleotide. Un compus de acid nucleic care inhibă un receptor ActRII poate fi un ADN (în special pentru utilizare ca un antisens), un ARN sau un hibrid ARN:ADN. Orice catenă poate conţine un amestec de ADN şi ARN, precum şi forme modificate care nu pot fi uşor clasificate fie ca ADN sau ARN. De asemenea, un compus cu acid nucleic dublu-catenar poate fi ADN:ADN, ADN:ARN sau ARN:ARN şi orice catenă poate include de asemenea un amestec de ADN şi ARN, precum şi forme modificate care nu pot fi uşor clasificate ca ADN sau ARN.

Compuşii de acid nucleic care inhibă un receptor ActRII pot include oricare dintr-o varietate de modificări, inclusiv una sau mai multe modificări ale scheletului (porţiunea zahăr-fosfat într-un acid nucleic natural, inclusiv legături internucleotidice) sau porţiunea de bază (porţiunea purină sau pirimidină a unui acid nucleic natural). În anumite exemple, un compus de acid nucleic antisens va avea o lungime de aproximativ 15 până la aproximativ 30 nucleotide şi va conţine adesea una sau mai multe modificări pentru a îmbunătăţi anumite caracteristici, cum ar fi stabilitatea în ser, stabilitatea într-o celulă sau stabilitatea într-un loc în care compusul este susceptibil de a fi administrat, cum ar fi, de exemplu, stomacul în cazul compuşilor eliberaţi oral şi plămânul pentru compuşii inhalatori. În cazul unui construct ARNi, catena complementară transcriptului ţintă va fi, în general, ARN sau modificări ale acestuia. Cealaltă catenă poate fi ARN, ADN sau orice altă variantă. Porţiunea duplex a constructului ARNi „în ac de păr” dublu-catenar sau monocatenar poate, în anumite exemple, să aibă o lungime de 18 până la 40 nucleotide în lungime şi opţional de aproximativ 21 până la 23 nucleotide în lungime, atâta timp cât serveşte ca substrat Dicer. Acizii nucleici catalitici sau enzimatici pot fi ribozime sau enzime ADN şi pot conţine, de asemenea, forme modificate. În anumite variante de realizare, compuşii de acid nucleic care inhibă receptorii ActRII pot inhiba expresia ţintei lor cu aproximativ 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% sau mai mult în condiţii fiziologice şi la o concentraţie în care un control nonsens sau sens are un efect redus sau nu are nici un efect. Concentraţiile pentru testarea efectului compuşilor de acid nucleic includ 1, 5, 10 micromolari sau mai mult.

În alte exemple, inhibitorii semnalizării receptorilor ActRII utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie sunt anticorpi. Astfel de anticorpi includ anticorpi care se leagă de activină (în special subunităţile A sau B ale activinei, de asemenea denumite ßA sau ßB) şi perturbă legarea receptorului ActRII; şi anticorpi care se leagă de polipeptidele receptorului ActRII (de exemplu, o polipeptidă ActRIIA solubilă sau ActRIIB solubilă) şi perturbă legarea activinei.

Prin utilizarea imunogenilor derivaţi dintr-o polipeptidă a receptorului ActRII sau o polipeptidă a activinei, antiserurile anti-proteină/anti-peptidă sau anticorpii monoclonali pot fi produşi prin protocoale standard (a se vedea, de exemplu, Antibodies: A Laboratory Manual ed., by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, 1988)). Un mamifer, cum ar fi un şoarece, un hîrciog sau un iepure, poate fi imunizat cu o formă imunogenă a polipeptidei receptorului ActRII, un fragment antigenic, care este capabil să provoace o geneză de anticorpi, sau o proteină de fuziune. Tehnicile pentru conferirea imunogenităţii unei proteine sau peptide includ conjugarea la purtători sau alte tehnici bine cunoscute în domeniu. O porţiune imunogenă a unui receptor ActRII sau polipeptidă a activinei poate fi administrată în prezenţa adjuvantului. Progresul imunizării poate fi monitorizat prin detectarea titrurilor de anticorpi în plasmă sau ser. ELISA standard sau alte imunoanalize pot fi utilizate cu imunogenul ca antigen pentru a evalua nivelurile de anticorpi.

După imunizarea unui animal cu un preparat antigenic al unei polipeptide a receptorului ActRII, pot fi obţinute antiseruri şi, dacă se doreşte, anticorpi policlonali pot fi izolaţi din ser. Pentru a produce anticorpi monoclonali, celulele producătoare de anticorpi (limfocitele) pot fi recoltate de la un animal imunizat şi fuzionate prin proceduri standard de fuziune a celulelor somatice cu celule imortalizatoare cum ar fi celulele mielomului pentru a produce celule de hibridom. Astfel de tehnici sunt bine cunoscute în domeniu şi includ, de exemplu, tehnica hibridomului (iniţial dezvoltată de Kohler şi Milstein, Nature, no 256, 1975, p. 495-497), tehnica hibridomului celular B uman (Kozbar et al. Immunology Today, no 4, 1983, p. 72) şi tehnica hibridomului EBV pentru a produce anticorpi monoclonali umani (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, p. 77-96). Celulele de hibridom pot fi analizate imunochimic pentru producerea de anticorpi capabili să interacţioneze în mod specific cu o polipeptidă a receptorului ActRII şi cu anticorpi monoclonali izolaţi dintr-o cultură cuprinzând astfel de celule de hibridom.

Termenul „anticorp”, astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, este destinat pentru includerea fragmentelor acestuia care sunt, de asemenea, capabile să interacţioneze în mod specific cu o polipeptidă concretă. Anticorpii pot fi fragmentaţi utilizând tehnici convenţionale şi fragmentele examinate pentru utilitate în acelaşi mod ca cel descris mai sus pentru anticorpi întregi. De exemplu, fragmentele F(ab)2 pot fi generate prin tratarea anticorpului cu pepsină. Fragmentul F(ab)2 rezultat poate fi tratat pentru a reduce punţile disulfidice pentru a produce fragmente Fab. Un anticorp este destinat suplimentar pentru includerea moleculelor bispecifice, monocatenare, himerice, umanizate şi complet umane având afinitate pentru o polipeptidă a receptorului ActRII sau a activinei conferită de cel puţin o regiune CDR a anticorpului. Un anticorp poate conţine suplimentar o etichetă ataşată la aceasta şi capabilă să fie detectată (de exemplu, eticheta poate fi un radioizotop, un compus fluorescent, o enzimă sau un co-factor de enzime).

În anumite exemple, anticorpul este un anticorp recombinant, a cărui termen conţine orice anticorp generat în parte prin tehnici de biologie moleculară, inclusiv anticorpi CDR-grefaţi sau himerici, anticorpi umani sau alţi anticorpi asamblaţi din domeniile de anticorp selectate de bibliotecă, anticorpi cu lanţ unic şi anticorpi cu domeniu unic (de exemplu, proteine VH umane sau proteine VHH camelide). În anumite exemple, un anticorp poate fi un anticorp monoclonal. De exemplu, o metodă de generare a unui anticorp monoclonal care se leagă în mod specific la o polipeptidă a receptorului ActRII sau la o polipeptidă a activinei poate conţine administrarea la şoarece a unei cantităţi de o compoziţie imunogenică care conţine polipeptida antigenică eficientă pentru a stimula un răspuns imun detectabil, obţinând celule producătoare de anticorpi (de exemplu, celule din splină) de la şoarece şi fuzionând celulele producătoare de anticorpi cu celule de mielom pentru a obţine hibridoame producătoare de anticorpi şi testând hibridoamele producătoare de anticorpi pentru a identifica un hibridom care produce un anticorp monoclonal care se leagă în mod specific la antigen . Odată obţinut, un hibridom poate fi propagat într-o cultură celulară, opţional în condiţii de cultură în care celulele derivate din hibridom produc anticorpul monoclonal care se leagă în mod specific la antigen. Anticorpul monoclonal poate fi purificat din cultura celulară.

Adjectivul „capabil să interacţioneze în mod specific cu”, astfel cum este utilizat în legătură cu un anticorp, intenţionează să însemne, astfel cum este în general înţeles în domeniu, că anticorpul este suficient de selectiv în privinţa antigenului care prezintă interes (de exemplu, a unei polipeptide a receptorului ActRII) comparativ cu alţi antigeni care nu prezintă interes pentru ca anticorpul să poată fi utilizat cel puţin pentru detecţia prezenţei antigenului care prezintă interes într-un anumit tip de probă biologică. În anumite metode de utilizare a anticorpului, cum ar fi utilizarea terapeutică, poate fi de dorit un grad mai mare de specificitate de legare. Anticorpii monoclonali au, în general, o tendinţă mai mare (comparativ cu anticorpii policlonali) de a discrimina în mod eficient între antigenele dorite şi polipeptidele care reacţionează încrucişat. O caracteristică care influenţează specificitatea unei interacţiuni anticorp:antigen este afinitatea anticorpului pentru antigen. Deşi specificitatea dorită poate fi atinsă cu o serie de afinităţi diferite, anticorpii preferaţi în general vor avea o afinitate (o constantă de disociere) de aproximativ 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 sau mai mică. Având în vedere legătura extraordinar de strânsă între activină şi un receptor ActRII, se aşteaptă ca un anticorp de neutralizare anti-ActRII receptor sau anti-activină să aibă în general o constantă de disociere de 10-10 sau mai mică.

În plus, tehnicile pentru screening-ul anticorpilor utilizate pentru a identifica un anticorp dorit pot influenţa proprietăţile anticorpului obţinut. De exemplu, dacă un anticorp urmează să fie utilizat pentru legarea unui antigen în soluţie, poate fi de dorit să se testeze legarea în soluţie. O varietate de tehnici diferite sunt disponibile pentru testarea interacţiunii dintre anticorpi şi antigeni pentru a identifica anticorpi în mod special dezirabili. Astfel de tehnici includ ELISA, analize de legare ce utilizează rezonanţa plasmonică de suprafaţă (de exemplu, analiza de legare BiacoreTM, Biacore AB, Uppsala, Suedia), sandwich-analize (de exemplu, sistemul cu utilizarea granulelor paramagnetice al IGEN International, Inc., Gaithersburg, Md.), Western-blotinguri, analize de imunoprecipitare şi imunohistochimie.

În anumite exemple, inhibitorii semnalizării receptorului ActRII care urmează să fie utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie includ forme alternative ale activinei, în special cele cu modificări în domeniul de legare al receptorului de tip I care se pot lega de receptorii de tip II şi nu reuşesc să formeze un complex ternar activ. În anumite exemple, în compoziţiile şi metodele descrise în prezenta invenţie pot fi utilizaţi acizi nucleici, cum ar fi molecule antisens, siRNAs sau ribozimi care inhibă expresia activinei A, B, C sau E sau, în special, a receptorului ActRII. În anumite exemple, inhibitorii semnalizării receptorului ActRII care urmează să fie utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie prezintă selectivitate pentru inhibarea căii de semnalizare mediate de activină comparativ cu alţi membri ai familiei TGF-beta, în special, cum ar fi GDF8 şi GDF11.

În alte exemple, inhibitorii semnalizării receptorilor ActRII utilizaţi în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie sunt proteine non-anticorp cu activitate antagonistă faţă de receptorul ActRII, inclusiv inhibină (adică, subunitatea alfa a inhibinei), folistatină (de exemplu folistatină-288 şi folistatină-315), Cerberus, proteina înrudită cu folistatina („FSRP”), endoglină, activină C, alfa(2)-macroglobulină şi o activină A mutantă M108A (schimbarea metioninei cu alanină în poziţia 108).

Într-un exemplu specific, inhibitorul semnalizării receptorului ActRII care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este o polipeptidă a folistatinei care antagonizează bioactivitatea activinei şi/sau se leagă la activină. Termenul „polipeptidă a folistatinei” include polipeptide care conţin orice polipeptidă naturală a folistatinei precum şi orice variante ale acesteia (inclusiv mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care menţin o activitate utilă şi include suplimentar orice monomer sau multimer funcţional de folistatină. Variante ale polipeptidelor folistatinei care păstrează proprietăţile de legare a activinei pot fi identificate pe baza studiilor anterioare care implică interacţiunile folistatină-activină. De exemplu, W02008/030367 dezvăluie domenii specifice ale folistatinei („DSF”) care se dovedesc a fi importante pentru legarea activinei. Polipeptidele folistatinei includ polipeptide derivate din secvenţa oricărui follistatin cunoscut având o secvenţă cel puţin aproximativ 80% identică cu secvenţa unei polipeptide a folistatinei şi opţional cel puţin 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identică sau mai mult. Exemplele de polipeptide ale folistatinei includ polipeptida matură a folistatinei sau izoforme mai scurte sau alte variante ale polipeptidei precursoare a folistatinei umane, astfel cum este descris, de exemplu, în (WO2005/025601).

Într-un exemplu specific, inhibitorul semnalizării receptorului ActRII care urmează să fie utilizat în compoziţiile şi metodele dezvăluite în prezenta invenţie este o genă înrudută asemănătoare follistatinului (FLRG) care antagonizează bioactivitatea activinei şi/sau se leagă la activină. Termenul „polipeptidă a FLRG” include polipeptide care conţin orice polipeptidă naturală a FLRG, precum şi orice variante ale acesteia (inclusiv mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care menţin o activitate utilă. Variante ale polipeptidelor FLRG care păstrează proprietăţile de legare a activinei pot fi identificate utilizând metode de rutină pentru a analiza interacţiunile FLRG-activină. A se vedea, de exemplu, brevetul (US 6,537,966). Exemplele de polipeptide ale FLRG includ polipeptide derivate din secvenţa oricărei FLRG cunoscute având o secvenţă cel puţin aproximativ 80% identică cu secvenţa unei polipeptide a FLRG şi opţional cel puţin 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identică sau mai mult.

În anumite exemple, variantele funcţionale sau formele modificate ale polipeptidelor follistatinului şi polipeptidelor FLRG includ proteine de fuziune având cel puţin o porţiune din polipeptidele follistatinului sau polipeptidele FLRG şi unul sau mai multe domenii de fuziune, cum ar fi, de exemplu, domenii care facilitează izolarea, detecţia, stabilizarea sau multimerizarea polipeptidei. Domeniile de fuziune adecvate sunt discutate în detaliu mai sus cu referire la polipeptidele ActRIIA şi ActRIIB. Într-un exemplu, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII este o proteină de fuziune care conţine o porţiune de legare a activinei a unei polipeptide a follistatinului fuzionată cu un domeniu Fc. Într-un exemplu de realizare, un inhibitor al semnalizării receptorului ActRII este o proteină de fuziune care conţine o porţiune de legare a activinei a unei polipeptide FLRG fuzionată cu un domeniu Fc.

7.10 ANALIZE

Diferite variante ale polipeptidei ActRII sau variante ale polipeptidei ActrII solubile pot fi testate pentru capacitatea lor de a inhiba ActRII. În plus, compuşii pot fi testaţi pentru capacitatea lor de a inhiba ActRII. După confirmarea activării inhibitorilor semnalizării ActRII, aceşti compuşi pot fi utilizaţi cu metodele descierii. ActRII poate fi ActRIIA sau ActRIIB. Analizele de mai jos sunt descrise pentru ActRIIA, dar pot fi efectuate în mod analog pentru ActRIIB. Aceste analize pot fi utilizate pentru (i) identificarea la un subiect a anemiei, a anemiei care necesită transfuzie de CRS, a SMD şi/sau a subpopulaţiilor de LMMC neproliferative; (ii) diagnosticarea la un subiect a anemiei, a anemiei care necesită transfuzie de CRS, a SMD şi/sau LMMC neproliferative; (iii) monitorizarea la un subiect a continuării şi/sau progresiei anemiei, a anemiei care necesită transfuzie de CRS, a SMD şi/sau CMML non-proliferative; (iv) monitorizarea la un subiect a eficacităţii metodelor oferite în prezenta invenţie pentru tratamentul la un subiect a anemiei, a anemiei care necesită transfuzie de CRS, a SMD şi/sau LMMC neproliferative; şi/sau (v) monitorizarea la un subiect a eficacităţii inhibitorilor semnalizării ActRII descrişii în prezenta invenţie.

7.10.1 POPULAŢIA DE REFERINŢĂ

În anumite variante de realizare, mărimea populaţiei de referinţă poate fi de aproximativ 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 400, 500 sau 1000 de indivizi. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din voluntari aleatorii. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din oameni sănătoşi. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din oameni de aceeaşi vârstă, greutate şi/sau sex ca populaţia de pacienţi, astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din oameni fără tulburare de sânge. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă este compusă din persoane cu tulburare de sânge, în care persoanele din populaţia de referinţă nu au sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane cu tulburare de sânge, în care mai puţin de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% , 5%, 4%, 3%, 2% sau 1% din eritroblaşti la persoane sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane cu tulburare de sânge, în care mai puţin de 15% din eritroblaşti la persoane sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, tulburarea de sânge este o tulburare de sânge astfel cum este descrisă în Secţiunea 7.8. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane fără anemie. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane fără anemie care necesită transfuzie de CRS. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane fără SMD. În anumite variante de realizare, populaţia de referinţă constă din persoane fără LMMC neproliferativă.

7.10.2 SIDEROBLAŞTI INELARI

Sideroblaştii inelari sunt eritroblaşti anormali. Pe deasupra, anumite mutaţii somatice asociate cu SMD determină formarea sideroblaştilor inelari şi eritropoieza ineficientă. Mutaţiile dominante în factorul de matisare 3B1 (SF3B1) sunt asociate cu formarea sideroblaştilor inelari. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SI+” se referă la un subiect în care cel puţin 15% din eritroblaştii sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, procentul de sideroblaşti inelari este procentul de eritroblaşti care sunt sideroblaşti inelari. În anumite variante de realizare, procentul de sideroblaşti inelari este procentul precursorilor eritroizi care sunt sideroblasti inelari. Sideroblaştii inelari sunt eritroblaşti în care există cel puţin cinci granule care conţin fier (siderotice) care acoperă cel puţin o treime din circumferinţa nucleului. A se vedea - Mufti et al. Haematologica, no 93(11), 2008, p. 1712-7 pentru o descriere a identificării sideroblaştilor inelari într-o probă. În sideroblaştii inelari, mitocondriile încărcate cu fier sunt vizualizate ca un inel perinuclear de granule albastre atunci când sunt colorate cu albastru de Prusia. Sideroblaştii inelari pot fi detectaţi în sângele periferic şi/sau frotiurile măduvei osoase. În aspectele particulare ale metodelor prezentate în prezenta invenţie, sideroblaştii inelari sunt în aspiraţii ale măduvei osoase.

7.10.3 ANALIZE DE SCREENING

Diferite variante ale polipeptidei ActRII sau variante ale polipeptidei ActRII solubile pot fi testate pentru capacitatea lor de a inhiba ActRII. În plus, compuşii pot fi testaţi pentru capacitatea lor de a inhiba ActRII. După confirmarea activării inhibitorilor semnalizării ActRII, aceşti compuşi pot fi utilizaţi cu metodele prezentate în prezenta invenţie. ActRII poate fi ActRIIA sau ActRIIB. Testele de mai jos sunt descrise pentru ActRIIA, dar pot fi efectuate în mod analog pentru ActRIIB.

De exemplu, se poate evalua efectul unei variante a polipeptidei ActRIIA asupra exprimării genelor implicate în producţia osoasă sau distrugerea osoasă. Aceasta poate fi efectuată, la necesitate, în prezenţa unei sau mai multor proteine recombinante ale ligandului ActRIIA (de exemplu, activina) şi celulele pot fi transfectate astfel încât să producă o polipeptidă ActRIIA şi/sau variante ale acesteia şi, opţional, un ligand ActRIIA. În mod similar, o polipeptidă ActRIIA poate fi administrată la un şoarece sau alt animal şi pot fi evaluate una sau mai multe proprietăţi osoase, cum ar fi densitatea sau volumul. Rata de vindecare pentru fracturile osoase poate fi, de asemenea, evaluată. Absorbţiometria duală a energiei cu raze X (DEXA) este o tehnică cantitativă bine stabilită, neinvazivă pentru evaluarea densităţii osoase la un animal. La oameni, sistemele centrale DEXA pot fi folosite pentru a evalua densitatea osoasă a coloanei vertebrale şi a bazinului. Aceştia sunt cei mai buni indici prognostici ai densităţii osoase globale. Sistemele periferice DEXA pot fi utilizate pentru evaluarea densităţii osoase în oasele periferice, inclusiv, de exemplu, oasele mâinii, încheieturii, gleznei şi piciorului. Sistemele tradiţionale de imagistică cu raze X, inclusiv scanările CAT, pot fi utilizate pentru evaluarea creşterii osoase şi vindecarea fracturilor. În plus, densitatea osoasă poate fi măsurată utilizând tomografia computerizată cantitativă (qCT). Rezistenţa mecanică a osului poate fi, de asemenea, evaluată.

În anumite aspecte, descrisă în prezenta invenţie este utilizarea polipeptidelor ActRIIA (de exemplu, polipeptidele ActRIIA solubile) şi a polipeptidelor activinei pentru a identifica compuşii (agenţii) care sunt agonişti sau antagonişti ai căii de semnalizare a activinei-ActRIIA. Compuşii identificaţi prin acest screening pot fi testaţi pentru a evalua capacitatea lor de a modula creşterea osoasă sau mineralizarea in vitro. Opţional, aceşti compuşi pot fi în continuare testaţi pe modele de animale pentru a evalua capacitatea acestora de a modula creşterea tisulară in vivo.

Există numeroase abordări pentru screening-ul agenţilor terapeutici pentru modularea creşterii ţesuturilor prin ţintirea polipeptidelor activinei şi ActRIIA. În anumite exemple, poate fi efectuat un screening de înaltă productivitate al compuşilor pentru a identifica agenţi care perturbă efectele mediate de activină sau ActRIIA asupra osului. În anumite exemple, analiza este efectuată pentru a examina şi identifica compuşii care inhibă sau reduc în mod specific legarea unei polipeptide ActRIIA de activină. În mod alternativ, analiza poate fi utilizată pentru a identifica compuşii care îmbunătăţesc legarea unei polipeptide ActRIIA de activină. Într-un alt exemplu de realizare, compuşii pot fi identificaţi prin capacitatea lor de a interacţiona cu o polipeptidă a activinei sau ActRIIA.

O varietate de formate analitice vor fi suficiente şi, în lumina prezentei dezvăluiri, cele care nu sunt descrise în mod expres în prezenta invenţie vor fi totuşi luate în consideraţie de un specialist în domeniu. Astfel cum s-a descris în prezenta invenţie, test-compuşii (agenţii) utilizaţi în prezenta invenţie pot fi obţinuţi prin orice metodă chimică combinatorie. În mod alternativ, compuşii studiaţi pot fi biomolecule naturale sintetizate in vivo sau in vitro. Compuşii (agenţii) care urmează să fie testaţi pentru capacitatea lor de a acţiona ca modulatori ai creşterii ţesuturilor pot fi produşi, de exemplu, cu utilizarea bacteriilor, drojdiilor, plantelor sau altor organisme (de exemplu produse naturale) produse chimic (de exemplu molecule mici, inclusiv peptidomimetice) sau produse recombinant. Test-compuşii contemplaţi în prezenta invenţie includ molecule organice nepeptidilice, peptide, polipeptide, peptidomimetice, zaharuri, hormoni şi molecule de acid nucleic. Într-o variantă de realizare specifică, test-agentul este o mică moleculă organică având o greutate moleculară mai mică de aproximativ 2000 daltoni.

Test-compuşii pot fi prezentaţi ca entităţi unice, discrete sau prezentaţi în biblioteci cu o complexitate mai mare, cum ar fi cele produse prin chimie combinatorială. Aceste biblioteci pot conţine, de exemplu, alcooli, halogenuri de alchil, amine, amide, esteri, aldehide, eteri şi alte clase de compuşi organici. Prezentarea test-compuşilor în sistemul de testare poate fi fie în formă izolată, fie ca amestecuri de compuşi, în special în etapele iniţiale de screening. În mod opţional, compuşii pot fi derivatizaţi cu alţi compuşi şi au grupări de derivatizare care facilitează izolarea compuşilor. Exemplele nelimitative de grupări de derivatizare includ biotină, fluoresceină, digoxigenină, proteină fluorescentă verde, izotopi, polihistidină, granule magnetice, glutation-S-transferază (GST), agenţi de suturare încrucişată fotoactivabili sau orice combinaţii ale acestora.

În multe programe de screening pentru medicamente care testează bibliotecile compuşilor şi extractelor naturale, sunt de dorit analize de înaltă productivitate pentru a maximiza numărul de compuşi chestionaţi într-o anumită perioadă de timp. Analizele care se efectuează în sisteme fără celule, cum ar fi cele care pot fi obţinute cu proteine purificate sau semi-purificate, sunt adesea preferate ca scrining-uri „primare” prin aceea că ele pot fi generate pentru a permite dezvoltarea rapidă şi detectarea relativ uşoară a unei modificări într-o ţintă moleculară care este mediată de un compus testat. În plus, efectele toxicităţii celulare sau biodisponibilitatea test-compusului pot fi în general ignorate în sistemul in vitro, analiza fiind concentrată în primul rând asupra efectului medicamentului asupra ţintei moleculare care se poate manifesta într-o modificare a afinităţii de legare a polipeptidei ActRIIA cu activina.

Doar pentru a ilustra, într-un exemplu de analiză de screening, compusul care prezintă interes este contactat cu o polipeptidă ActRIIA izolată şi purificată care este de obicei capabilă să se lege la activină. La amestecul de compus şi polipeptidă ActRIIA se adaugă apoi o compoziţie care conţine un ligand ActRIIA. Detecţia şi cuantificarea complecşilor ActRIIA/activină asigură un mijloc de determinare a eficacităţii compusului la inhibarea (sau potenţarea) formării unui complex dintre polipeptida ActRIIA şi activină. Eficacitatea compusului poate fi evaluată prin generarea de curbe doză-răspuns din datele obţinute cu utilizarea diferitor concentraţii ale test-compusului. Mai mult, poate fi efectuată o analiză de control pentru a obţine o linie de bază pentru comparaţie. De exemplu, într-o analiză de control, activina izolată şi purificată este adăugată la o compoziţie care conţine polipeptida ActRIIA şi formarea complexului ActRIIA/activină este cuantificată în absenţa test-compusului. Se va înţelege că, în general, ordinea în care reactanţii pot fi amestecaţi poate fi variată şi poate fi amestecată simultan. În plus, în loc de proteine purificate, extracte şi lizate celulare pot fi utilizate pentru a obţine un sistem analitic fără celule adecvat.

Formarea complexului dintre polipeptida ActRIIA şi activină poate fi detectată printr-o varietate de tehnici. De exemplu, modularea formării complexelor poate fi cuantificată utilizând, de exemplu, proteine marcate detectabile, cum ar fi polipeptida ActRIIA sau activina marcată cu izotopi radioactivi (de exemplu, 32P, 35S, 14C sau 3H), marcată fluorescent (de exemplu, FITC) sau marcată enzimatic, prin imunoanaliză sau prin detecţie cromatografică.

În anumite exemple, contemplată în prezenta invenţie este utilizarea analizelor de polarizare a fluorescenţei şi a analizelor de transfer prin rezonanţă a energiei fluorescenţei (FRET) pentru măsurarea, fie directă, fie indirectă, a gradului de interacţiune a polipeptidei ActRIIA cu proteina de legare a acesteia. Pe deasupra, alte moduri de detectare, cum ar fi cele bazate pe ghiduri de undă optice (WO 96/26432 şi brevetul US 5677196), rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR), senzorii de sarcină de suprafaţă şi senzorii de forţă de suprafaţă sunt compatibile cu multe variante de realizare descrise în prezenta invenţie.

Mai mult decât atât, o analiză de interacţiune cu captare, cunoscută şi ca „analiză dublu hibridă”, poate fi utilizată pentru identificarea agenţilor care perturbă sau potenţializează interacţiunea polipeptidei ActRIIA cu proteina de legare a acesteia. A se vedea, (de exemplu, US 5283317; Zervos et al. Cell, no 72, 1993, p. 223-232; Madura et al. J. Biol. Chem., no 268, 1993, p. 12046-12054; Bartel et al. Biotechniques, no 14, 1993, p. 920-924 şi Iwabuchi et al. Oncogene, no 8, 1993, p. 1693-1696). Într-un exemplu specific, inclusă în prezenta invenţie este utilizarea sistemelor dublu hibride inverse pentru a identifica compuşii (de exemplu molecule mici sau peptide) care disociază interacţiunile polipeptidei ActRIIA cu proteina de legare a acesteia. A se vedea, (de exemplu, Vidal şi Legrain. Nucleic Acids Res., no 27, 1999, p. 919-29; Vidal şi Legrain. Trends Biotechnol, no 17, 1999, p. 374-381 şi brevetele US 5,525,490; 5,955,280; şi 5,965,368).

În anumite exemple, compuşii studiaţi sunt identificaţi prin capacitatea lor de a interacţiona cu o polipeptidă a ActRIIA sau activina. Interacţiunea compusului cu polipeptida ActRIIA sau activina poate fi covalentă sau necovalentă. De exemplu, o astfel de interacţiune poate fi identificată la nivelul proteinei folosind metode biochimice in vitro, inclusiv foto-legarea încrucişată, legarea ligandului radiomarcat şi cromatografia de afinitate (Jakoby W B et al. Methods in Enzymology, no 46, 1974, p. 1). În anumite cazuri, compuşii pot fi supuşi screening-ului printr-o analiză bazată pe un mecanism de acţiune, cum ar fi o analiză pentru detecţia compuşilor care se leagă la activină sau o polipeptidă ActRIIA. Aceasta poate include un eveniment de legare în fază solidă sau în fază fluidă. În mod alternativ, gena care codifică activina sau o polipeptidă ActRIIA poate fi transfectată într-o celulă cu un sistem reporter (de exemplu, β-galactozidază, luciferază sau proteină fluorescentă verde) şi supusă ulterior screening-ului referitor la bibliotecă, utilizând de preferinţă un screening de înaltă productivitate, sau împotriva membrilor individuali ai bibliotecii. Pot fi utilizate şi alte analize de legare bazate pe mecanisme de acţiune, de exemplu, analize de legare cu detecţia modificărilor energiei libere. Analizele de legare pot fi efectuate cu ţinta fixată pe un godeu, granulă sau chip sau capturată de un anticorp imobilizat sau rezolvată prin electroforeză capilară. Compuşii legaţi pot fi detectaţi de obicei prin metoda rezonanţei colorimetrice, metoda rezonanţei fluorescente sau metoda rezonanţei plasmonilor de suprafaţă.

În anumite aspecte, prezentate în prezenta invenţie sunt metode şi agenţi pentru modularea (stimularea sau inhibarea) formării osoase şi a creşterii masei osoase. Prin urmare, orice compus identificat poate fi testat în celule întregi sau ţesuturi, in vitro sau in vivo, pentru a confirma capacitatea lor de a modula creşterea osoasă sau mineralizarea. Pentru acest scop pot fi utilizate diferite metode cunoscute în domeniu. În particular, compuşii pot fi testaţi pentru capacitatea lor de a creşte restabilirea osului.

De exemplu, efectul polipeptidelor ActRIIA sau activinei sau al test-compuşilor asupra creşterii osului sau a cartilajului poate fi determinat prin măsurarea inducţiei Msx2 sau diferenţierii celulelor osteoprogenitoare în osteoblaşti în analizele pe bază de celule (a se vedea, de exemplu, Daluiski et al. Nat. Genet., no 27(1), 2001, p. 84-88; Hino et al. Front Biosci., no 9, 2004, p. 1520-1529). Un alt exemplu de analize pe bază de celule include analizarea activităţii osteogene a polipeptidelor ActRIIA sau activinei şi a test-compuşilor în celule progenitoare mezenchimale şi osteoblastice. Pentru a ilustra, adenovirusurile recombinante care exprimă o polipeptidă ActRIIA sau a activinei pot fi construite pentru a infecta celule C3H10T1/2 progenitoare pluripotente mezenchimale, celule C2C02 preosteoblastice şi celule TE-85 osteoblastice. Activitatea osteogenică este apoi determinată prin măsurarea inducţiei fosfatazei alcaline, a osteocalcinei şi a mineralizării matricei (a se vedea, de exemplu, Cheng et al., J. Ossh. Joint Surg. Am., no 85-A(8), 2003, p. 1544-1552).

De asemenea, divulgate în prezenta invenţie sunt analize in vivo pentru măsurarea creşterii osului sau cartilajului. De exemplu, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001) dezvăluie un model de osteoporoză la şobolan în care este studiată restabilirea oaselor în perioada timpurie după fractură. (Kubo et al. Steroid Biochemistry & Molecular Biology, no 68, 1999, p. 197-202) dezvăluie, de asemenea, un model osteoporotic de şobolan în care se studiază restabilirea oaselor în perioada tardivă după fractură. (Andersson et al. J. Endocrinol., no 170, p. 529-537) descriu un model de osteoporoză la şoarece în care şoarecii sunt ovariectomizaţi, ceea ce determină şoarecii să-şi piardă conţinutul substanţial de minerale osoase şi densitatea minerală osoasă, osul trabecular pierzând aproximativ 50% din densitatea minerală osoasă. Densitatea osoasă poate fi crescută la şoarecii ovariectomizaţi prin administrarea de factori cum ar fi hormonul paratiroidian. În anumite aspecte, se pot utiliza analize de vindecare a fracturilor cunoscute în domeniu. Aceste analize includ tehnica de fracturare, analiza histologică şi analiza biomecanică, care sunt descrise, de exemplu, în (brevetul US 6,521,750) pentru dezvăluirea protocoalelor experimentale pentru determinarea, precum şi măsurarea gradului de fractură şi a procesului de restabilire.

7.11 COMPOZIŢII FARMACEUTICE

Antagoniştii activinei-ActRII (de exemplu, polipeptidele ActRII) pot fi formulaţi cu un purtător acceptabil farmaceutic pentru utilizare cu metodele prezentate în prezenta invenţie. De exemplu, o polipeptidă ActRII poate fi administrată singură sau ca o componentă a unei formulări farmaceutice (compoziţii terapeutice). Compuşii indicaţi pot fi formulaţi pentru administrare în orice mod convenabil pentru utilizare în medicina umană sau veterinară. ActRII poate fi ActRIIA sau ActRIIB.

În anumite variante de realizare, metoda terapeutică a invenţiei include administrarea sistemică sau locală a compoziţiei sub forma unui implant sau dispozitiv. Când se administrează, compoziţia terapeutică pentru utilizare în această invenţie este, desigur, într-o formă acceptabilă fiziologic fără pirogeni. Agenţii utili terapeutic, alţii decât antagoniştii ActRII care pot fi, de asemenea, opţional incluşi în compoziţia descrisă mai sus, pot fi administraţi simultan sau secvenţial cu compuşii indicaţi (de exemplu, polipeptidele ActRII, cum ar fi polipeptidele ActRIIA şi/sau ActRIIB (a se vedea - Secţiunea 7,9)).

În mod tipic, antagoniştii ActRII vor fi administraţi parenteral. Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru administrare parenterală pot conţine una sau mai multe polipeptide ActRII în combinaţie cu una sau mai multe soluţii, dispersii, suspensii sau emulsii apoase sau neapoase sterile izotonice acceptabile farmaceutic sau pulberi sterile care pot fi reconstituite în soluţii sau dispersii sterile injectabile imediat înainte de utilizare, care pot conţine antioxidanţi, tampoane, substanţe bacteriostatice, substanţe dizolvate care fac ca formularea să fie izotonică cu sângele recipientului potenţial sau agenţi de suspendare sau îngroşare. Exemplele de purtători apoşi şi neapoşi adecvaţi care pot fi utilizaţi în compoziţiile farmaceutice ale invenţiei includ apă, etanol, polioli (cum ar fi glicerina, propilenglicolul, polietilenglicolul şi alţii asemenea) şi amestecuri adecvate ale acestora, uleiuri vegetale, cum ar fi uleiul de măsline şi esteri organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea materialelor de acoperire, cum ar fi lecitina, prin menţinerea mărimii particulelor necesare în cazul dispersiilor şi prin utilizarea surfactanţilor.

În plus, compoziţia poate fi încapsulată sau injectată într-o formă de livrare către o zonă a ţesutului-ţintă (de exemplu, oase). În anumite exemple, compoziţiile prezentate în prezenta invenţie pot include o matrice capabilă să livreze unul sau mai mulţi compuşi terapeutici (de exemplu, polipeptide ActRIIA) către o zonă a ţesutului-ţintă (de exemplu, oase), având o structură pentru ţesutul în curs de dezvoltare şi capacitatea optimă de resorbţie în organism. De exemplu, matricea poate asigura eliberarea lentă a polipeptidelor ActRIIA. Astfel de matrice pot fi formate din materiale utilizate în prezent pentru alte aplicaţii medicale implantate.

Alegerea materialului matricei se bazează pe biocompatibilitate, biodegradabilitate, proprietăţi mecanice, aspectul cosmetic şi proprietăţile interfeţei. Aplicarea particulară a compoziţiilor menţionate va defini formularea corespunzătoare. Matricele potenţiale pentru compoziţii pot fi sulfatul de calciu, fosfatul tricalcic, hidroxiapatita, acidul polilactic şi polianhidridele biodegradabile şi definite chimic. Alte materiale potenţiale sunt compuşii biodegradabili şi bine definiţi din punct de vedere biologic, cum ar fi colagenul osos sau dermic. Matricele suplimentare sunt compuse din proteine pure sau componente ale matricei extracelulare. Alte matrice potenţiale care nu sunt biodegradabile şi sunt definite chimic, includ hidroxiapatita sinterizată, biosticla, aluminatele sau alte materiale ceramice. Matricele pot fi compuse din combinaţii ale oricăror tipuri de materiale menţionate mai sus, cum ar fi acidul polilactic şi hidroxiapatita sau colagenul şi fosfatul tricalcic. Substanţele bioceramice poate fi modificate în compoziţie, cum ar fi în fosfatul de aluminat de calciu şi prelucrate pentru a modifica dimensiunea porilor, dimensiunea particulelor, forma particulelor şi biodegradabilitatea.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semanlizării ActRII poate fi administrat pe cale orală, de exemplu, sub formă de capsule, caşete, pilule, tablete, pastile (folosind o bază aromatizată, de obicei zaharoză şi acacia sau tragacant), pulberi, granule sau ca o soluţie sau o suspensie într-un lichid apos sau neapos, sau ca o emulsie lichidă ulei-în-apă sau apă-în-ulei, sau ca elixir sau sirop, sau ca pastile (folosind o bază inertă, cum ar fi gelatină şi glicerină sau zaharoză şi acacia) şi/sau ca gargare şi altele asemenea, fiecare conţinând o cantitate predeterminată de agent în calitate de ingredient activ. Un agent poate fi, de asemenea, administrat sub formă de bolus, electuar sau pastă.

În formele medicamentoase solide pentru administrare orală (capsule, tablete, pilule, drajeuri, pulberi, granule şi altele asemenea), unul sau mai mulţi compuşi terapeutici prevăzuţi în prezenta invenţie pot fi amestecaţi cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic, cum ar fi citrat de sodiu sau fosfat dicalcic şi/sau oricare dintre următoarele: (1) umpluturi sau solvenţi, cum ar fi amidon, lactoză, zaharoză, glucoză, manitol şi/sau acid silicic; (2) lianţi, cum ar fi, de exemplu, carboximetilceluloză, alginaţi, gelatină, polivinilpirolidonă, zaharoză şi/sau acacia; (3) umectanţi, cum ar fi glicerolul; (4) dezintegranţi, cum ar fi agar-agar, carbonat de calciu, amidon de cartof sau tapioca, acid alginic, anumiţi silicaţi şi carbonat de sodiu; (5) agenţi de retardare a soluţiei, cum ar fi parafina; (6) acceleratori de absorbţie, cum ar fi compuşi cuaternari de amoniu; (7) umectanţi, cum ar fi, de exemplu, alcool cetilic şi monostearat de glicerină; (8) absorbanţi, cum ar fi caolin şi lut bentonit; (9) lubrifianţi, cum ar fi talc, stearat de calciu, stearat de magneziu, polietilenglicoli solizi, lauril sulfat de sodiu şi amestecuri ale acestora; şi (10) coloranţi. În cazul capsulelor, tabletelor şi pilulelor, compoziţiile farmaceutice pot de asemenea să conţină agenţi de tamponare. Compoziţiile solide de tip similar pot fi de asemenea utilizate ca agenţi de umplutură în capsule gelatinoase moi şi tari folosind excipienţi, cum ar fi lactoză sau zaharuri din lapte, precum şi polietilenglicoli macromoleculari şi alţii asemenea.

Formele medicamentoase lichide pentru administrare orală includ emulsii, microemulsii, soluţii, suspensii, siropuri şi elixiruri acceptabile farmaceutic. În afară de ingredientul activ, formele medicamentoase lichide pot conţine diluanţi inerţi utilizaţi în mod tradiţional în domeniu, cum ar fi apa sau alţi solvenţi, agenţi de solubilizare şi emulgatori, cum ar fi alcool etilic, alcool izopropilic, carbonat de etil, acetat de etil, benzoat de benzil, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, uleiuri (în particular, ulei de seminţe de bumbac, arahide, porumb, germeni, măsline, ricin şi susan), glicerol, alcool tetrahidrofurilic, polietilenglicoli şi esteri ai sorbitanului cu acizii graşi; amestecuri ale acestora. În afară de diluanţii inerţi, compoziţiile orale pot include, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi agenţi de umectare, agenţi de emulsionare şi suspendare, agenţi de îndulcire, aromatizare, colorare, parfumare şi conservare.

Suspensiile, în afară de compuşii activi, pot conţine agenţi de suspendare cum ar fi alcooli izostearilici etoxilaţi, polioxietilensorbitol şi esteri ai sorbitanului, celuloză microcristalină, metahidroxid de aluminiu, bentonită, agar-agar şi tragacant şi amestecuri ale acestora.

Compoziţiile invenţiei pot conţine, de asemenea, adjuvanţi, cum ar fi conservanţi, agenţi de umectare, agenţi de emulsifiere şi agenţi de dispersie. Prevenirea acţiunii microorganismelor poate fi asigurată prin includerea de diverşi agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, paraben, clorbutanol, acid fenolsorbic şi altele asemenea. De asemenea, poate fi de dorit includerea în compoziţie a agenţilor izotonici, cum ar fi zaharuri, clorură de sodiu şi altele asemenea. În plus, absorbţia prelungită a formei farmaceutice injectabile poate fi realizată prin includerea agenţilor care întârzie absorbţia, cum ar fi monostearatul de aluminiu şi gelatina.

Se înţelege că schema de dozare va fi determinată de medicul curant ţinând cont de diverşi factori care modifică acţiunea compuşilor invenţiei (de exemplu, polipeptidele ActRIIB (a se vedea - Secţiunea 7,9)). Factorii diverşi includ, dar nu se limitează la, cantitatea de greutate osoasă dorită a fi formată, gradul de pierdere a densităţii osoase, locul leziunii osoase, starea osului deteriorat, vârsta, sexul şi dieta subiectului, severitatea oricărei boli care poate contribui la pierderea osoasă, timpul de administrare şi alţi factori clinici. Opţional, doza poate varia în funcţie de tipul de matrice utilizat în reconstituire şi de tipurile de compuşi din compoziţie. Adăugarea altor factori de creştere cunoscuţi la compoziţia finală poate, de asemenea, să afecteze doza. Progresul poate fi monitorizat prin evaluarea periodică a creşterii şi/sau restabilirii osoase, de exemplu, utilizând raze X (inclusiv DEXA), prin determinări histomorfometrice şi etichetare cu tetraciclină.

Divulgată în prezenta invenţie este terapia genică pentru producerea in vivo a polipeptidelor ActRII. O astfel de terapie ar obţine efectul său terapeutic prin introducerea secvenţelor polinucleotidice ActRII în celulele sau ţesuturile afectate de tulburările menţionate mai sus. Livrarea secvenţelor polinucleotidice ActRII poate fi realizată cu ajutorul unui vector de expresie recombinant, cum ar fi un virus himeric sau un sistem de dispersie coloidală. Preferată pentru livrarea terapeutică a secvenţelor polinucleotidice ActRII este utilizarea lipozomilor vizaţi. Polipeptidele ActRII pot fi polipeptide ActRIIA şi/sau ActRIIB (a se vedea - Secţiunea 7.9)).

Diferiţi vectori virali care pot fi utilizaţi pentru terapia genică în conformitate cu prezenta descriere includ adenovirusul, virusul herpes, vaccina sau, de preferinţă, un virus ARN cum ar fi un retrovirus. De preferinţă, vectorul retroviral este un derivat al unui retrovirus murin sau aviar. Exemplele de vectori retrovirali în care poate fi inserată o singură gena străină includ, dar nu se limitează la: virusul leucemiei murine Moloney (MoMuLV), virusul sarcomului murin Harvey (HaMuSV), virusul tumorii mamare murine (MuMTV) şi virusul sarcomului Rous VSR). Un număr de vectori retrovirali suplimentari pot încorpora mai multe gene. Toţi aceşti vectori pot transfera sau încorpora o genă pentru un marker selectabil astfel încât celulele transducate să poată fi identificate şi generate. Vectorilor retrovirali li se pot atribui specificitate faţă de ţintă prin legarea, de exemplu, a unui zahăr, a unui glicolipid sau a unei proteine. Direcţionarea preferată este realizată prin utilizarea unui anticorp. Specialiştii în domeniu vor recunoaşte că secvenţele polinucleotidice specifice pot fi inserate în genomul retroviral sau ataşate la un înveliş viral pentru a permite livrarea specifică ţintită a vectorului retroviral care conţine polinucleotida ActRII. Într-un exemplu preferat, vectorul este orientat către os sau cartilaj.

În mod alternativ, celulele de cultură tisulară pot fi direct transfectate cu plasmide care codifică genele structurale retrovirale gag, pol şi env, prin transfecţia convenţională cu fosfat de calciu. Aceste celule sunt apoi transfectate cu plasmidul vector care conţine genele de interes. Celulele rezultate eliberează vectorul retroviral în mediul de cultură.

Un alt sistem de livrare ţintită a polinucleotidelor ActRII este un sistem de dispersie coloidală. Sistemele de dispersie coloidală includ complexe macromoleculare, nanocapsule, microsfere, granule şi sisteme pe bază de lipide, incluzând emulsii ulei-în-apă, miceli, miceli amestecaţi şi lipozomi. Sistemul coloidal preferat al acestei invenţii este un lipozom. Lipozomii sunt a se vedeacule de membrană artificială care sunt utile în calitate de vehicule de livrare in vitro şi in vivo. ARN-ul, ADN-ul şi virionii intacţi pot fi încapsulaţi în mediul apos şi pot fi livraţi către celule într-o formă biologic activă (a se vedea, de exemplu, Fraley, et al. Trends Biochem Sci., no 6, 1981, p. 77). Metodele pentru transferul eficient al genelor cu utilizarea unui vehicul lipozomic sunt cunoscute în domeniu, (a se vedea, de exemplu, Mannino et al., Biotechniques, no 6, 1988, p. 682). Compoziţia lipozomului este de obicei o combinaţie de fosfolipide, de obicei în combinaţie cu steroizi, în special colesterolul. Pot fi de asemenea utilizate alte fosfolipide sau alte lipide. Caracteristicile fizice ale lipozomilor depind de pH, de concentraţia ionică şi de prezenţa cationilor bivalenţi.

Exemplele de lipide utile în producţia de lipozomi includ compuşi fosfatidil, cum ar fi fosfatidilglicerol, fosfatidilcolină, fosfatidilserină, fosfatidiletanolamină, sfingolipide, cerebrozide şi gangliozide. Fosfolipidele ilustrative includ fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina şi distearoilfosfatidilcolina din gălbenuşul de ou. Direcţionarea lipozomilor este de asemenea posibilă pe baza, de exemplu, a specificităţii organelor, a specificităţii celulelor şi a specificităţii organelelor şi este cunoscută în domeniu.

În anumite variante de realizare, inhibitorul semnalizării ActRII este substanţial pur într-o compoziţie farmaceutică. În mod specific, cel mult 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,1% sau cel mult 0,05% dintre compuşii din compoziţia farmaceutică sunt alţi compuşi decât inhibitorul semnalizării ActRII şi purtătorul acceptabil farmaceutic.

Într-o variantă de realizare preferată, compoziţia farmaceutică este formulată pentru administrare subcutanată.

8.0 EXEMPLE

8.1 Exemplul 1

8.1.1 Proteine de fuziune ActRIIA-Fc

Prezentată este o proteină de fuziune ActRIIA solubilă care conţine domeniul extracelular al ActRIIA uman fuzionat cu un domeniu Fc uman sau de şoarece printr-un linker minimal între ele. Construcţiile sunt desemnate ActRIIA-hFc şi ActRIIA-mFc, respectiv. ActRIIA-hFc este prezentată ca SEQ ID NO:7.

Proteinele ActRIIA-hFc şi ActRIIA-mFc au fost exprimate în linii celulare CHO. Trei secvenţe lider diferite au fost luate în considerare:

(i) Melitina din veninul de albine (HBML): SEQ ID NO:8

(ii) Activatorul tisular al plasminogenului (ATP): SEQ ID NO:9

(iii) ActRIIA nativ: SEQ ID NO:10

Forma selectată utilizează liderul ATP şi are următoarea secvenţă de aminoacizi neprocesată prezentată în SEQ ID NO:13. Această polipeptidă este codificată de SEQ ID NO: 14.

8.1.2 Proteine de fuziune ActRIIB-Fc

Structura cristalină a unui domeniu extracelular al ActRIIB uman fuzionat cu un domeniu Fc uman şi Activina nu a prezentat nici un rol pentru 15 aminoacizi finali (C-terminali) (în continuare denumiţi „coadă”) din domeniul extracelular în legarea ligandului. Această secvenţă nu a reuşit să rezolve pe structura cristalină, sugerând că aceste resturi sunt prezente într-o bucla flexibilă care nu a fost împachetată uniform în cristal. Thompson et al. EMBO J. 2003 Apr. 1; 22(7):1555-66. Această secvenţă este, de asemenea, slab conservată între ActRIIB şi ActRIIA. În consecinţă, aceste resturi au fost omise în construcţia de fuziune ActRIIB-Fc de bază sau de fond. În plus, poziţia 64 în forma de fundal este ocupată de o alanină, care este considerată în general forma „de tip sălbatic”, deşi o alelă A64R apare în mod natural. Astfel, fuziunea ActRIIB-Fc de bază are secvenţa dezvăluită ca SEQ ID NO:21.

În mod surprinzător, s-a descoperit că coada C-terminală amplifică legarea activinei şi GDF-11, astfel o versiune preferată a ActRIIB-Fc are o secvenţă SEQ ID NO:20.

O varietate de variante ale ActRIIB care pot fi utilizate conform metodelor dezvăluite în prezenta invenţie sunt dezvăluite în (cererea de brevet internaţională publicată ca W02006/012627).

8.2 Exemplul 2

Studiu deschis, de Faza 2, privind stabilirea dozei de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la subiecţi cu SMD sau LMMC neproliferativă şi anemie care necesită transfuzie de CRS cu risc scăzut sau intermediar-1 (Int-1)

8.2.1 Introducere

Anemia, un semn distinctiv al SMD, este dificil de tratat, în special după eşecul agenţilor stimulatori ai eritropoiezei (ASE). ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7; „sotatercept”) este o proteină de fuziune a receptorului activinei de tip IIA care acţionează asupra eritropoiezei în stadiu tardiv pentru a creşte eliberarea eritrocitelor mature în circulaţie (Carrancio et al., Br J Haematol., no 165, 2014, p. 870-882). Tratamentul subiecţilor cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a stimulat eritropoieza şi a crescut semnificativ nivelele de hemoglobină (Hb) la subiecţii sănătoşi (Sherman et al. J. Clin. Pharmacol., no 53, 2013, p. 1121-1130), susţinând dezvoltarea clinică pentru tratamentul anemiei la subiecţii cu SMD cu risc mai scăzut.

8.2.2 Materiale şi metode

Scopul primar al acestui exemplu este de a determina o doză sigură, tolerabilă şi eficientă de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) care are drept rezultat ameliorarea hematologică eritroidă (AH-E, criterii 2006 IWG modificate) la subiecţii cu anemie şi SMD cu risc scăzut-1-Int sau scăzut definit prin IPSS sau LMMC neproliferativă (celule albe sanguine <13000/µL). Obiectivele secundare includ rata independenţei de transfuzie de CRS (IT-CRS) mai mare sau egală cu 8 săptămâni. Subiecţii eligibili au prezentat o anemie (mai mare sau egală cu 2 cerinţe de transfuzie de unităţi de CRS în cele 12 săptămâni înainte de înregistrarea pentru Hb mai mică sau egală cu 9,0 g/dL) fără răspuns, pierderea răspunsului sau şansă scăzută de răspuns la ASE (eritropoietină [EPO] serică mai mare de 500 mUI/m;). A se vedea - Tabelul 1 pentru o descriere a subiecţilor studiaţi în acest exemplu. Subiecţii au primit ActRIIA-hFc subcutanat (SEQ ID NO:7) la doze de 0,1, 0,3, 0,5 sau 1,0 mg/kg o dată la 3 săptămâni. A se vedea - Figura 1 pentru o schiţă a proiectului de studiu.

8.2.3 Rezultate

Un total de 54 de subiecţi cu SMD au fost studiaţi: 7, 6, 21 şi 20 în grupurile care au primit doze de 0,1, 0,3, 0,5 şi 1,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Vârsta medie a fost de 71 de ani (intervalul 56…86) şi durata mediană de la diagnostic a fost de 4 ani (intervalul 0…31); majoritatea subiecţilor au fost bărbaţi (70%). Subiecţii au primit o medie de 6 unităţi de CRS (intervalul 0…18) în cele 8 săptămâni înainte de începerea tratamentului. Patruzeci şi cinci de subiecţi (83%) au primit mai mult sau egal cu 4 unităţi de CRS timp de 8 săptămâni înainte de începerea tratamentului (sarcină de transfuzie ridicată; STR) şi 9 subiecţi (17%) au primit mai puţin de 4 unităţi în cele 8 săptămâni înainte de începerea tratamentului (sarcină de transfuzie scăzută; STS). Nouăzeci de subiecţi (35%) aveau IPSS scăzut şi 34 de subiecţi (63%) aveau SMD cu risc-Int-1 IPSS; datele privind riscul IPSS lipsesc pentru 1 pacient. Cincizeci şi unu de subiecţi (94%) au fost trataţi anterior cu ASE, 30 (56%) cu agenţi hipometilanţi, 26 (48%) cu lenalidomidă şi 26 (48%) cu alte tratamente ale SMD; 15 subiecţi (28%) au avut EPO serică > 500 mUI/mL.

Din cei 53 de subiecţi evaluabili pentru eficacitate, AH-E a fost observată la 21 subiecţi (40%) în ansamblu: 0,4 (67%), 8 (40%) şi 9 subiecţi (45%) în grupurile care au primit 0,1, 0,3, 0,5 şi respectiv 1,0 mg/kg de doză de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7). Nouăsprezece dintre cei 44 de subiecţi cu STR au răspuns cu o reducere a sarcinii de transfuzie mai mare sau egală cu 4 unităţi de CRS/8 săptămâni; durata răspunsului la transfuzie pare să fie dependentă de doză. A se vedea - Figura 3 pentru un exemplu de subiect cu STR care a obţinut o IT-CRS mai mult de 56 de zile după tratamentul cu ActRIIA-hFc. A se vedea - Figura 4, care demonstrează durata maximă a răspunsului la sarcina de transfuzie în rândul respondenţilor cu STR după tratamentul cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7). Cinci subiecţi cu STR au obţinut IT-CRS mai mare sau egală cu 8 săptămâni, durata IT-CRS variind între 59-345 + zile. A se vedea - Figura 5, care demonstrează durata maximă a răspunsului la IT-CRS la subiecţii cu STR care au obţinut IT-CRS timp de cel puţin 56 de zile după tratamentul cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7). A se vedea - de asemenea, Tabelul 2.

Un subgrup de subiecţi cu STR care au obţinut IT-CRS mai mare sau egală cu 8 săptămâni a avut procente crescute de eritroblaşti care erau sideroblaşti inelari înainte de tratamentul cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).

Opt din 9 subiecţi cu STS au prezentat creşteri de Hb care nu au fost influenţate de transfuzie, variind de la 1,3…3,8 g/dL. Dintre aceştia, 2 subiecţi au avut o creştere a Hb mai mare de sau egală cu 1,5 g/dL, susţinută pentru o perioadă mai mare sau egală cu 8 săptămâni. Subiecţii cu Hb mai mare de 11,0 g/dL au fost supuşi unei întârzieri de doză per protocol, ceea ce ar fi putut afecta stabilitatea creşterii Hb. IT-CRS pentru mai mult sau egal cu 8 săptămâni a fost obţinută la 6 subiecţi cu STS. A se vedea - Figura 6, care demonstrează proporţia subiecţilor cu STS care au obţinut IT-CRS timp de cel puţin 56 de zile şi o creştere a Hb medie de cel puţin 1,5 g/dL după tratamentul cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). A se vedea - Figura 7, care demonstrează durata maximă a răspunsului la IT-CRS în rândul subiecţilor cu STS obţinând IT-CRS timp de cel puţin 56 de zile şi o creştere a Hb medie de cel puţin 1,5 g/dL după tratamentul cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Creşteri ale nivelelor trombocitelor şi neutrofilelor au fost observate la subiecţii cu trombocitopenie iniţială şi, respectiv, la subiecţii cu neutropenie iniţială.

ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a fost în general bine tolerat. Douăzeci de subiecţi (37%) au raportat mai mult de sau egal cu 1 eveniment advers (EA) suspectat legat de tratament; oboseală (11%), cefalee (9,3%), scăderea apetitului alimentar (7,4%) şi greaţă (7,4%) au fost cele mai frecvente.

Din 35 subiecţi (65%) care au întrerupt tratamentul, 28 au întrerupt tratamentul din cauza lipsei efectului terapeutic şi 4 din cauza EA. Dintre acele EA care au dus la întreruperea tratamentului, 3 au fost suspectate a fi legate de tratament: 1 pacient cu anemie hemolitică de gradul 2, 1 pacient cu hipertensiune arterială de gradul 3 şi 1 pacient cu slăbiciune musculară de gradul 2 în grupurile care au primit 0,5 şi respectiv 1,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7). Alte motive pentru întreruperea tratamentului au fost retragerea consimţământului (n = 2; 4%) şi decizia pacientului (n = 1; 2%).

8.2.4 Concluzii

ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) este bine tolerat la subiecţii cu SMD cu risc scăzut la nivelurile de doză testate, cu doa se vedea promiţătoare ale activităţii clinice în această cohortă în mare parte cu STR de subiecţi cu SMD cu risc scăzut, anemici, refractari la ASE. În plus, aceste date indică faptul că prezenţa sideroblaştilor inelari la subiecţi înainte de tratamentul cu un inhibitor al ActRII, de exemplu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7), poate fi un indicator pentru tratamentul de lungă durată, independenţa de transfuzie de CRS şi creşterea pe termen lung a nivelelor de hemoglobină.

Caracteristicile de bază ale subiectului

Tabelul 1

Caracteristica Grupul cu doză de inhibitor al ActRIIA (SEQ ID NO:7) Total (N = 54) 0,1 mg/kg (n = 7) 0,3 mg/kg (n = 6) 0,5 mg/kg (n = 21) 1,0 mg/kg (n = 20) Vârsta, media (intervalul), ani 65 (58-79) 73 (66-86) 69 (56-82) 74 (60-84) 71 (56-86) Femeie, n (%) 3 (42,9) 0 4 (19,0) 9 (45,0) 16 (29,6) Timpul de la diagnosticul iniţial, mediana (interval), ani 4 (1-6) 7 (4-8) 6 (0-31)a 3 (0-20)a 4 (0-31)a Sarcina de transfuzie de CRS, unităţi mediane (interval)/8 săptămâni 9 (4-10) 8 (6-11) 6 (2-18) 6 (0-14) 6 (0-18) Starea transfuziei de CRS, n (%) STRb 7 (100) 6 (100) 18 (85,7) 14 (70,0) 45 (83,3) STSc 0 0 3 (14,3) 6 (30,0) 9 (16,7) Risc IPSS, n (%) Scăzut 3 (42,9) 4 (66,7) 5 (23,8) 8 (40,0) 20 (37,0) Int-1 4 (57,1) 2 (33,3) 16 (76,2) 12 (60,0) 34 (63,0) Nivel EPO seric, n (%) ≤ 500 mUI/mL 4 (57,2) 5 (83,4) 7 (33,4) 13 (65,0) 29 (53,7) > 500 mUI/mL 3 (42,9) 1 (16,7) 6 (28,6) 5 (25,0) 15 (27,8) Absent 0 0 8 (38,1) 2 (10,0) 10 (18,5) Utilizarea anterioară a ASE, n (%) 6 (85,7) 6 (100,0) 20 (95,2) 19 (95,0) 51 (94,4) Utilizarea anterioară a agenţilor hipometilatanţi, n (%) 6 (85,7) 6 (100,0) 13 (61,9) 5 (25,0) 30 (55,6) Utilizarea anterioară a lenalidomidei, n (%) 5 (71,4) 5 (83,3) 10 (47,6) 6 (30,0) 26 (48,1) Utilizarea anterioară a altor tratamente ale SMD, n (%) 6 (85,7) 5 (83,3) 9 (42,9) 6 (30,0) 26 (48,1)

a0 ani indică <1 an de la diagnosticul iniţial; bSubiecţi cu sarcină de transfuzie de CRS ≥ 4 unităţi/8 săptămâni; cSubiecţi cu sarcină de transfuzie de CRS <4 unităţi/8 săptămâni; dNon-ASE, tratamentul cu agenţi non-hipometilatanţi şi non-lenalidomidă pentru SMD; EPO, eritropoietină; ASE, agenţi de stimulare a eritropoiezei; Hb, hemoglobină; STR, sarcină de transfuzie ridicată; Int, Intermediar; IPSS, Sistemul Internaţional de Evaluare a Prognosticului; STS, sarcină de transfuzie scăzută; SMD, sindroame mielodisplastice; CRS, celule roşii sanguine.

Răspunsul la transfuzie în rândul subiecţilor cu STR (n=44)

Tabelul 2

Caracteristica Grupul cu doză de inhibitor al ActRIIA (SEQ ID NO:7 Total (N = 54) 0,1 mg/kg (n = 7) 0,3 mg/kg (n = 6) 0,5 mg/kg (n = 21) 1,0 mg/kg (n = 20) Reducerea sarcinii de transfuzie ≥ 4 unităţi de RBC/8 săptămâni, n (%) 0 4 (66.7) 7 (41.2) 8 (57.1) 19 (43.2) Durata celui mai lung răspuns, mediana (interval), zile N/A 67.5 (62-144) 150 (83-345) 87.5 (62-154) 106.0 (62-345+) IT-CRS≥ 56 zile, n (%) 0 1 (16.7) 2 (11.8) 2 (14.3) 5 (11.1)

8.3 Exemplul 3

ActRIIB-hFc creşte hemoglobina şi reduce sarcina de transfuzie la subiecţii cu SMD cu risc scăzut sau intermediar-1: Rezultatele preliminare ale unui studiu de fază 2

8.3.1 Introducere

ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25; denumit şi luspatercept), o proteină de fuziune recombinantă care conţine receptorul activinei de tip Iib modificat şi IgG Fc a fost, de asemenea, utilizat pentru tratarea anemiilor din cauza eritropoiezei ineficace, cum ar fi SMD. Subiecţii cu SMD au adesea niveluri crescute de eritropoietină (EPO) şi pot fi non-responsivi sau refractari la agenţii de stimulare a eritropoiezei (ASE). S-a dovedit, de asemenea, că subiecţii cu SMD au nivele serice de GDF11 crescute (Suragani R et al. Nature Medicine, 2014) şi semnalizare Smad 2/3 crescută în măduva osoasă (Zhou L et al. Blood, 2008). ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) se leagă la liganzii din superfamilia TGF-ß, inclusiv GDF11, inhibă semnalizarea Smad 2/3 şi promovează diferenţierea eritroidă în stadiu tardiv printr-un mecanism diferit de ASE. mActRIIB-Fc (versiunea murină a ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25)) a redus semnalizarea Smad 2, a crescut nivelele de hemoglobină (Hb) şi a redus hiperplazia eritroidă a măduvei osoase într-un model de SMD de şoarece (Suragani R et al. Nature Medicine, 2014). Într-un studiu cu voluntari sănătoşi, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) a fost bine tolerată şi a crescut nivelele de Hb (Attie K et al. Am. J. Hematol., 2014).

8.3.2 Materiale şi metode

Acest exemplu prezintă datele de determinare a dozei pentru a evalua efectele ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) asupra anemiei la subiecţi (a se vedea - Tabelul 3 şi Tabelul 4) cu SMD cu risc scăzut sau int-1 care au fie o sarcină de transfuzie ridicată (STR, definită ca mai mare sau egală cu 4 unităţi de CRS/8 săptămâni înainte de nivelul iniţial) fie o sarcină de transfuzie scăzută (STS, definită ca mai puţin de 4 unităţi de CRS/8 săptămâni înainte de nivelul iniţial). Rezultatele includ răspunsul eritroid (fie creşterea Hb la subiecţii cu STS sau sarcina de transfuzie scăzută la subiecţii cu STR), siguranţa, tolerabilitatea şi biomarkerii FC şi FD.

Criteriile de includere au inclus SMD cu risc scăzut sau Int-1, vârsta de cel puţin 18 ani, anemia (definită fie ca fiind subiect cu STR, fie având o valoare iniţială a Hb mai mică de 10,0 g/dL la subiectul cu STS), EPO mai mare de 500 U/L sau non-responsivă/refractară la ASE, fără azacitidină sau decitabină anterioară şi fără tratament curent cu ASE, G-CSF, GM-CSF sau lenalidomidă. În faza de escaladare a dozei, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a fost administrat prin injectare subcutanată (SC) o dată la fiecare 3 săptămâni în 7 cohorte secvenţiale (n=3-6) la doze de 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,33 şi 1,75 mg/kg până la 5 doze, cu o perioadă de supraveghere de 3 luni. Este planificată o cohorta de expansiune (n=30), iar toţi subiecţii care completează acest studiu se pot înscrie într-un studiu de extensie de 12 luni. A se vedea - Figura 8 pentru o descriere a schemei experimentale şi a schemei de dozare.

8.3.3 Rezultate

Au fost disponibile date pentru 26 subiecţi (7 STS/19 STR). Vârsta medie a fost de 71 ani (interval: 27-88 ani), 50% au fost femei, 54% au avut tratament anterior cu EPO şi 15% au avut tratament anterior cu lenalidomidă. 69% au fost cu CRDM cu subtipul WHO, iar subiecţii rămaşi au fost cu del(5q), ASII sau AREB-1. Nivelul iniţial medie (DS) a Hb pentru subiecţii cu STS (n=7) a fost de 9,1 (0,4) g/dL. Unităţile medii (DS) de CRS transfuzate în cele 8 săptămâni înainte de tratament au fost 0,9 (1,1) unităţi pentru subiecţii cu STS şi 6,3 (2,4) unităţi pentru subiecţii cu STR. A se vedea - Tabelele 3 şi 4.

Doi dintre cei 7 subiecţi cu STS au avut o creştere a mediei Hb ≥1,5 g/dL în decurs de 8 săptămâni în comparaţie cu nivelul iniţial. Creşterea medie maxima a Hb la subiecţii cu STS a fost 0,8, 1,0, 2,2 si 2,7 g/dL în grupurile care au primit o doză de 0,125 (n = 1), 0,25 (n = 1), 0,75 (n = 3) mg/kg, respectiv. A se vedea - Figura 9, care demonstrează creşterea maximă a hemoglobinei la subiecţii cu STS după tratamentul cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Subiecţii cu STS cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) au prezentat niveluri crescute de reticulocite şi hemoglobină. A se vedea - Figurile 10-12 şi Tabelul 5. Şase dintre cei 7 subiecţi cu STS au obţinut independenţa de transfuzie de CRS (IT-CRS) timp de ≥8 săptămâni în timpul studiului.

Şase dintre 19 subiecţi cu STR au prezentat o reducere cu ≥ 4 unităţi sau ≥50% a unităţilor de CRS transfuzate pe o perioadă de 8 săptămâni în timpul perioadei de tratament, comparativ cu cele 8 săptămâni anterioare tratamentului; cinci dintre aceşti 6 subiecţi au obţinut IT-CRS ≥ 8 săptămâni în timpul studiului (intervalul 71-152 zile). Creşteri ale nivelului hemoglobinei au fost observate la subiecţii cu STR cărora li s-a administrat un ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). A se vedea, de exemplu, Figura 13. Creşterea numărului de neutrofile după administrarea medicamentului de studiu a fost observată la unii subiecţi. Un subgrup al subiecţilor care au obţinut IT-CRS mai mare sau egală cu 8 săptămâni, a avut procente crescute de eritroblaşti care au fost sideroblaşti inelari înainte de tratamentul subiecţilor cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). A se vedea - Tabelul 7.

ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a fost, în general, bine tolerat. Cele mai frecvente reacţii adverse, indiferent de cauzalitate, au fost: diareea (n=4, gradul 1/2), durerea osoasă, oboseala, spasmele musculare, mialgia şi nazofaringita (n=3 fiecare, gradul 1/2).

Caracteristicile de bază

Tabelul 3

Parametrul N=26 Vârsta, anul, mediana (interval) 71 (27-88) Sexul, bărbaţi (%) 13 (50%) Tratamentul anterior cu ASE, n (%) 14 (54%) Tratamentul anterior cu lenalidomidă, n (%) 5 (19%) Sarcina de transfuzie scăzută (STS) N = 7 (27%) Hemoglobina, g/dL, mediana (interval) 9,1 (8,3-9,7) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 0 (0-2) Sarcina de transfuzie ridicată (STR) N = 19 (73%) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 6 (4-13)

Rezumatul eficacităţii ratei de răspuns la AH-E la subiecţii trataţi cu ActRIIB (SEQ ID NO:25) la dozele indicate

Tabelul 4

Subgrupul de subiecţi 0,125-0,5 mg/kg (N=9) n (%) 0,75-1,75 mg/kg (N=17) n (%) Subiecţi cu STS (N=7) 0/2 (0%) 2/5 (40%) Subiecţi cu STR (N=19) 2/7 (29%) 5/12 (42%) Toţi subiecţii (N=26) 2/9 (22%) 7/17 (41%)

Reacţia hemoglobinei la subiecţii cu STS

Tabelul 5

Criterii de răspuns 0,125-0,5 mg/kg (N=2) n (%) 0,75-1,75 mg/kg (N=5) n (%) Subiecţi cu STS (N=7) 0 4 (80%) Subiecţi cu STR N=19) 0 2 (40%)

Răspunsul la transfuzie la subiecţii cu STR, trataţi cu ActRIIB (SEQ ID NO: 25) la dozele indicate Tabelul 6

Criterii de răspuns (8 săptămâni), n (%) 0,125-0,5 mg/kg (N=7) n (%) 0,75-1,75 mg/kg (N=12) n (%) Subiecţi cu STS (N=7) 3 (43%) 5 (42%) Subiecţi cu STR (N=19) 2 (29%) 5 (42%) IT-CRS 1 (14%) 3 (25%)

Rata de răspuns conform criteriilor IWG prin analiza mutaţională şi morfologia sideroblaştilor inelari (SI)

Tabelul 7

Răspuns + Rata (IWG) Cohortele 4-7a, n=17; 0,75-1,75 mg/kg; n (%) Toţi subiecţii 7/17 (41%) Sideroblaşti inelari - mai mare decât sau egală cu 15% Sideroblaşti inelari - positivă 7/13 (54%) Sideroblaşti inelari - negativă 0/4 (0%) Analiza mutaţională SF3B1+ 6/9 (67%)b SF3B1- 1/8 (13%)

aCohorta 4: 0,75 mg/kg (n=3); cohorta 5: 1,0 mg/kg (n=3); cohorta 6: 1,33 mg/kg (n=6); cohorta 7: 1,75 mg/kg (n=2); bInclude 3 subiecţi care au devenit independenţi de transfuzie.

8.3.4 Concluzii

Pe baza datelor preliminare la subiecţii cu SMD cu risc scăzut sau Int-1, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) administrată SC la fiecare 3 săptămâni până la 5 doze a crescut nivelurile de Hb sau a scăzut cerinţa de transfuzie, cu un profil de siguranţă favorabil. Aceste date susţin pe deplin evaluarea ulterioară a tratamentului de lungă durată al subiecţilor cu SMD cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25).

8.4 Exemplul 4

ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) creşte hemoglobina şi reduce sarcina de transfuzie la subiecţii cu SMD cu risc scăzut sau intermediar-1: Rezultatele preliminare din studiul PACE-SMD de fază 2

8.4.1 Introducere

ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) este o proteină de fuziune (receptorul activinei de tip IIB/IgG Fc modificat) care este în prezent investigată pentru tratamentul anemiilor cu eritropoieză ineficientă. Subiecţii cu SMD au crescut nivelele de GDF11 (Suragani, Nat Med 2014) şi semnalizarea Smad2,3 aberantă în măduva osoasă. ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) leagă liganzii superfamiliei TGF-β, inclusiv GDF11, Activina B şi BMP6 inhibă semnalizarea Smad2,3 şi promovează diferenţierea eritroidă în stadiul tardiv, diferită de ASE. Într-un studiu cu voluntari sănătoşi, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a fost bine tolerat şi a crescut nivelele de Hb (Attie. Am. J. Hematol., 2014).

8.4.2 Obiective

Datele prezentate în acest exemplu provin dintr-un studiu de fază 2, cu eticheta deschisă, multicentric, privind stabilirea dozei pentru a evalua efectele ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) asupra anemiei la subiecţii cu dependenţă de transfuzie (DT) sau SMD cu risc scăzut sau int-1 non-transfuzie dependentă (NTD). Rezultatele studiului au inclus răspunsul eritroid, siguranţa, tolerabilitatea, biomarkerii farmacocinetici şi biomarkerii farmacodinamici. La subiecţii cu sarcină la transfuzie scăzută (STS), răspunsul eritroid a fost definit ca o creştere a concentraţiei de hemoglobină. La subiecţii cu sarcină de transfuzie ridicată (STR), răspunsul eritroid a fost definit ca o sarcină de transfuzie scăzută.

8.4.3 Metode

Criteriile de includere au inclus subiecţi cu SMD cu risc scăzut sau int-1, vârsta ≥ 18 ani, cu anemie definită fie ca Hb <10,0 g/dL (STS, definită ca <4 unităţi de CRS/8 săptămâni înainte de nivelul iniţial) sau ≥4 unităţi de CRS/8 săptămâni înainte de nivelul iniţial (STR), EPO> 500 U/L sau neresponsivi/refractari la ASE, fără tratament anterior cu azacitidină sau decitabină şi fără tratament curent cu ASE, G-CSF, GM-CSF sau lenalidomidă. ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) a fost administrat prin injectare subcutanată (SC) o dată la fiecare 3 săptămâni în cohorte secvenţiale (n=3-6 fiecare) la doze cuprinse între 0,125 şi 1,75 mg/kg până la 5 doze cu o perioadă de supraveghere de 3 luni. O cohorta de expansiune (n=30) este în curs de desfaşurare, cu titrarea individuală a dozei subiectului până la raspunsul permis. Subiecţii care completează acest studiu se pot înscrie într-un studiu de extensie de 12 luni.

8.4.4 Rezultate

Acest exemplu prezintă date preliminare privind siguranţa şi eficacitatea pentru 44 de subiecţi (19 femei, 25 bărbaţi, 15 subiecţi cu STS, 29 subiecţi cu STR) din 58 de subiecţi înscrişi în studiul de faza II. Vârsta medie a subiecţilor a fost de 71 de ani. 61% dintre subiecţi au avut anterior tratament cu EPO. 21% dintre subiecţi au avut anterior tratament cu lenalidomidă. 73% dintre subiecţi au avut ASII sau CRDM-SI. 80% dintre subiecţi aveau mai mult de 15% de sideroblaşti inelari în măduva osoasă.

Subiecţii cu STS trataţi cu între 0,75 mg/kg şi 1,75 mg/kg (n=13) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) au avut o rată de răspuns de 77% pentru obiectivul primar (creşterea Hb ≥1,5 g/dL timp de ≥ 2 săptămâni) şi o rată de răspuns la AH-E conform criteriilor IWG (ameliorarea hematologică eritroidă conform criteriilor Grupului de Lucru Internaţional) de 62% (creşterea Hb ≥1,5 g/dL timp de ≥8 săptămâni). Schimbarea maximă (deviaţia standard) medie a hemoglobinei a fost 2,7 (deviaţia standard: 1,1) g/dL în grupurile cu doză mai mare comparativ cu 0,9 (deviaţia standard: 0,1) g/dL în grupurile cu doză mai mică.

Subiecţii cu STR trataţi cu între 0,75 mg/kg şi 1,75 mg/kg (n=13) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) au avut o rată de răspuns la AH-E de 50% (reducere cu >4 unităţi de CRS/8 săptămâni). Rata de răspuns la AH-E a fost de 63% pentru subiecţii cu ≥ 15% sideroblaşti inelari (n=30) şi 80% pentru subiecţii cu mutaţii SF3B1 (n=10). ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) a fost în general bine tolerat. Cele mai frecvente evenimente adverse indiferent de cauzalitate au fost diareea, nazofaringita, mialgia, durerea osoasa, bronşita, cefaleea şi spasmele musculare.

8.4.5 Concluzii

Pe baza datelor preliminare la subiecţii cu SMD cu risc scăzut/Int-1, tratamentul cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) la doze terapeutice timp de 3 luni a condus la răspunsul la AH-E pentru nivele crescute de Hb şi/sau cerinţa de transfuzie scăzută la 54% dintre subiecţi, cu un profil de siguranţă favorabil. Au fost observate rate mai mari de răspuns la subiecţii cu mutaţii SF3B1şi sideroblaşti inelari. Aceste date susţin puternic utilizarea nivelurilor de sideroblaşti inelari şi prevalenţa mutaţiei SF3B1 ca biomarkeri pentru tratamentul eficient cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) la subiecţii cu SMD.

8.5 Exemplul 5

Studiu de fază 2 , cu eticheta deschisă, privind stabilirea dozei de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7) la subiecţii cu SMD cu risc scăzut sau Intermediar-1 (Int-1) sau LMMC neproliferativă şi cu anemie care necesită transfuzie de CRS

8.5.1 Introducere

A se vedea - Introducere (Secţiunea 8.2.1) şi Materiale şi Metode (Secţiunea 8.2.2) pentru Exemplul 2 (Secţiunea 8.2). Acest exemplu prezintă date suplimentare din Exemplul 2 (Secţiunea 8.2), obţinute la o dată ulterioară în studiul de fază 2.

8.5.2 Rezultate

Un total de 59 de subiecţi cu SMD au fost trataţi cu o doză de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7) fie de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, fie de 2,0 mg/kg. Tabelul 8 prezintă caracteristicile de bază ale subiecţilor pentru fiecare grup de tratament.

Din cei 53 de subiecţi evaluabili pentru eficacitate, AH-E a fost observată la 23 subiecţi (43%) în total: 0,4 (67%), 9 (45%) şi 10 subiecţi (50%) în grupurile care au primit o doză de ActRIIA- hFc (SEQ ID NO:7) de 0,1, 0,3, 0,5 şi respectiv 1,0 mg/kg. Mai mult, tratamentul subiecţilor cu STR cu o doză de 0,3 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a avut drept rezultat o reducere a sarcinii de transfuzie mai mare sau egală cu 4 unităţi de CRS/8 săptămâni (a se vedea - Tabelul 9). Durata răspunsului la transfuzie pare a fi dependentă de doză. În plus, din 45 de subiecţi cu STR evaluabili, 6 (13) au obţinut IT-CRS timp de cel puţin 8 săptămâni (a se vedea - Tabelul 9). A se vedea - Figura 13 pentru un exemplu de subiect cu STR care a obţinut IT-CRS timp de cel puţin 337 zile după iniţierea tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la o doză de 1,0 mg/kg.

Caracteristicile de bază ale subiectului

Tabelul 8

Caracteristica Grupul cu doză de inhibitor al ActRIIA (SEQ ID NO:7) Total (N = 59) 0,1 mg/kg (n = 7) 0,3 mg/kg (n = 6) 0,5 mg/kg (n = 21) 1,0 mg/kg (n = 20) Vârsta, mediana (interval), ani 65 (58-79) 73 (66-86) 69 (56-82) 74 (60-84) 73 (47-81) 71 (47-86) Femeie, n (%) 3 (42,9) 0 4 (19,0) 9 (45,0) 4 (80) 20 (34) Timpul de la diagnosticul iniţial, mediana (interval), ani 4 (1-6) 8 (4-10) 6 (0-31)a 3 (0-20)a 2 (0-5) 4 (0-31)a Sarcina de transfuzie de CRS, unităţi mediane (interval)/8 săptămâni 9 (4-10) 8 (6-11) 6 (2-16) 6 (0-10) 4(3-8) 6 (0-16) Starea transfuziei de CRS, n (%) STRb 7 (100) 6 (100) 18 (86) 15 (75) 4 (80) 50 (85) STSc 0 0 3 (14) 5 (25) 1 (2) 9 (15) Risc IPSS, n (%) Scăzut 4 (57) 4 (67) 5 (24) 7 (35) 0 20 (34) Int-1 3 (43) 2 (33) 16 (76) 13 (65) 5 (100) 39 *66) Nivel EPO seric, n (%) ≤ 500 mUI/mL 4 (57) 5 (83) 11 (52) 13 (65) 2 (40) 35 (59) > 500 mUI/mL 3 (43) 1 (17) 8 (38) 6 (30) 1 (20) 19 (32) Absent 0 0 2 (10) 1 (5) 2 (40) 5 (9) Utilizarea anterioară a ASE, n (%) 6 (86) 6 (100) 20 (95) 20 (100) 4 (80) 56 (95) Utilizarea anterioară a agenţilor hipometilatanţi, n (%) 6 (86) 6 (100) 13 (62) 6 (30) 0 31 (53) Utilizarea anterioară a lenalidomidei, n (%) 5 (71) 5 (83) 10 (48) 6 (30) 1 (20) 27 (46) Utilizarea anterioară a altor tratamente ale SMD, n (%) 6 (86) 5 (83) 8 (38) 7 (35) 0 26 (44)

a0 ani indică <1 an de la diagnosticul iniţial; bSubiecţi cu sarcină de transfuzie a CRS ≥ 4 unităţi/8 săptămâni; cSubiecţi cu sarcină de transfuzie a CRS <4 unităţi/8 săptămâni; dTratamentul cu non-ASE, non-hipometilant şi non-lenalidomidă pentru SMD; EPO, eritropoietină; ASE, agenţi de stimulare a eritropoiezei; Hb, hemoglobină; STR, sarcină de transfuzie ridicată; Int, Intermediar; IPSS, Sistemul Internaţional de Evaluare a Prognosticului; STS, sarcină de transfuzie scăzută; SMD, sindroame mielodisplastice; CRS, celule roşii sanguine.

Răspunsul la transfuzie în rândul subiecţilor cu STR (n=45)

Tabelul 9

Caracteristica Grupul cu doză de inhibitor al semnalizării ActRIIA (SEQ ID NO:7) Total (N = 45) 0,1 mg/kg (n = 7) 0,3 mg/kg (n = 6) 0,5 mg/kg (n = 17) 1,0 mg/kg (n = 15) Reducerea sarcinii de transfuzie ≥ 4 unităţi de RBC/8 săptămâni, n (%) 0 4 (67) 8 (47) 6 (40) 18 (40) Durata celui mai lung răspuns, mediana (interval), zile NA 68 (62-173) 109 (83-345+) 123 (62-353+) 99 (62-345+) IT-CRS≥ 56 zile, n (%) 0 1 (17) 2 (12) 3 (20) 6 (13) Durata IT-CRS ≥8 săptămâni, mediana (interval), zile NA 124 (124-124) 347 (154-540) 78 (59-353) 139 (59-540)

În plus, din cei 8 subiecţi cu STS trataţi cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7), 5 (63%) au obţinut IT-CRS cu o creştere medie a Hb de cel puţin 1,5 g/dL în orice perioada fără transfuzie de 8 săptămâni. În special, 33% dintre subiecţii cu STS trataţi cu 0,5 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) şi 80% din subiecţii cu STS trataţi cu 1,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7) au obţinut IT-CRS cu o creştere medie de Hb de cel puţin 1,5 g/dL în orice perioadă fără transfuzie de 8 săptămâni. Creşterea medie maximă a Hb la subiecţii trataţi cu STS trataţi cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a variat între 1,45 g/dL şi 4,44 g/dL. Durata IT-CRS la subiecţii cu STS trataţi cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a variat între 76 şi 472 zile. Subiecţii cu STS cu niveluri de Hb mai mari de 11,0 g/dL au fost supuşi întârzierii dozei, ceea ce ar fi putut avea impact asupra evaluării duratei creşterii nivelului de Hb. A se vedea - Figura 14 pentru un exemplu de subiect cu STS care a atins IT-CRS şi o creştere stabilă a nivelului hemoglobinei timp de cel puţin 358 zile după iniţierea tratamentului cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la o doză de 1,0 mg/kg.

Mai mult decât atât, s-a evaluat asocierea dintre eficacitatea tratamentului şi prezenţa sideroblaştilor inelari (SI) la nivelul iniţial (a se vedea - Tabelul 10). AH-E a fost obţinută la 50% dintre subiecţii SI-pozitivi. În contrast, AH-E a fost obţinută doar la 10% dintre subiecţii SI-negativi.

Starea sideroblaştilor inelari la subiecţii trataţi cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7)

Tabelul 10

Starea SIa Nivelul EPO mediu la nivelul iniţial (mIU/ml) Sarcina de transfuzie medie la nivelul iniţial (unităţi de CRS/8 săptămâni înainte de prima doză) Grupul cu AH-E prin doza de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) şi Starea SI n/N (%) 0,1 mg/kg 0,3 mg/kg 0,5 mg/kg 1,0 mg/kg Total SI-positivib 346,53 7,04 0/6 (0) 4/4 (100) 5/9 (56) 5/9 (56) 14/28 (50) SI-negativic 1447,40 6,40 0/1 (0) 0/3 (0) 0/2 (0) 1/5 (20) 1/10 (10)

aStarea SI este de la nivelul iniţial, dacă este disponibilă şi de la post-nivelul iniţial de altfel; Starea SI a fost necunoscută pentru 16 subiecţi; b> 15% SI; c ≤ 15% SI

ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a fost în general bine tolerat. A se vedea - Tabelul 11. Patru subiecţi au întrerupt tratamentul din cauza evenimentelor suspectate legate de tratament: Subiectul A (grupul de doză de 0,3 mg/kg), anemie hemolitică de gradul 2; Subiectul B (grupul de doză de 0,5 mg/kg), hipertensiune de gradul 3; Subiectul C (grupul de doze de 1,0 mg/kg), slăbiciune musculară de gradul 2; Subiectul D (grupul de doze de 2,0 mg/kg) şi gradul 2 a determinat creşterea tensiunii arteriale cu diaree de gradul 2.

8.5.3 Concluzii

ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) este bine tolerat la subiecţii cu SMD cu risc scăzut la nivelurile de doză testate, cu doa se vedea promiţătoare ale activităţii clinice în această cohorta în mare parte cu STR de subiecţi cu SMD cu risc scăzut, anemici, refractari. În plus, aceste date indică faptul că prezenţa sideroblaştilor inelari la subiecţi înainte de tratamentul cu un inhibitor al semnalizării ActRII, de exemplu, ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) poate fi un indicator pentru tratamentul de lungă durată cu independenţa de transfuzie a CRS, creşterea pe termen lung a nivelelor de hemoglobină şi creşterea eficienţei tratamentului.

Evenimente adverse la subiecţii trataţi cu ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la dozele indicate

Tabelul 11

Grupul cu doză de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) Total (N = 59) 0,1 mg/kg (n = 7) 0,3 mg/kg (n = 6) 0,5 mg/kg (n = 21) 1,0 mg/kg (n = 20) 2,0 mg/kg (n = 5) Subiecţi cu ≥ 1 EAET 6 (86) 3 (50) 20 (95) 19 (95) 4 (80) 52 (88) EAET ≥ 10% de subiecţi Oboseală/asteniea 0 1 (17) 10 (48) 12 (60) 1 (20) 24 (41) Edem periferic 2 (29) 2 (33) 4 (19) 4 (20) 0 12 (20) Diaree 0 3 (50) 11 (52) 8 (40) 2 (40) 12 (20) Greaţă 0 1 (17) 4 (19) 4 (20) 1 (20) 10 (17) Constipaţie 0 1 (17) 6 (29) 2 (10) 0 9 (15) Vărsături 0 1 (17) 2 (10) 3 (15) 1 (20) 6 (10) Apetit scăzut 0 0 3 (14) 3 (15) 0 6 (10) Durere la extremitate 0 1 (17) 2 (10) 3 (15) 1 (20) 6 (10) Cefalee 3 (43) 1 (17) 2 (10) 2 (10) 1 (20) 9 (15) Ameţeală 1 (14) 1 (17) 5 (24) 6 (30) 0 6 (10) Tuse 1 (14) 1 (17) 2 (10) 5 (25) 0 9 (15) Dispnee 0 1 (17) 4 (19) 2 (10) 0 7 (12) EAET de gradul 3-4 1 (14) 1 (17) 9 (43) 5 (25) 2 (40) 18 (31)

8.6 Exemplul 6

8.6.1 Introducere

A se vedea - Introducerea (Secţiunea 8.3.1) şi Materialele şi Metodele (Secţiunea 8.3.2) pentru Exemplul 3 (Secţiunea 8.3). Acest exemplu prezintă date suplimentare din Exemplul 3 (Secţiunea 8.3), obţinute la o dată ulterioară în studiul de fază 2.

8.6.2 Rezultate

Au fost disponibile date pentru 44 subiecţi (15 cu STS/29 cu STR). Tabelul 12 oferă caracteristicile de bază pentru subiecţii studiaţi în acest exemplu.

Răspunsul eritroid a fost evaluat la subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Pentru subiecţii cu STS, punctul final principal a fost o creştere a hemoglobinei de cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 2 săptămâni. Pentru subiecţii cu STR, obiectivul final principal a fost o reducere a transfuziei de CRS cu cel puţin 4 unităţi sau cel puţin 50% timp de 8 săptămâni. 33% (3/9) din subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mici (0,125…0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au atins punctul final primar, în timp ce 63% (22/35) din subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mari (0,75…1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au atins punctul final primar.

În plus, a fost evaluată AH-E conform criteriilor IWG. Pentru subiecţii cu STS, AH-E conform criteriilor IWG este o creştere a hemoglobinei de cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 8 săptămâni. Pentru subiecţii cu STR, AH-E conform criteriilor IWG este o reducere cu cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni. 22% (2/9) dintre subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mici (0,125…0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut AH-E conform criteriilor IWG, în timp ce 54% (19/35) dintre subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mari (0,75…1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut AH-E conform criteriilor IWG.

Sideroblaştii inelari sunt eritroblaşti anormali. Mai mult, anumite mutaţii somatice asociate cu SMD determină formarea sideroblaştilor inelari şi eritropoieza ineficientă. Mutaţiile dominante în factorul de matisare 3B1 (SF3B1) sunt asociate cu formarea sideroblaştilor inelari. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, „SI+” se referă la cel puţin 15% de sideroblaşti inelari. Astfel, a fost evaluată asocierea dintre prezenţa sideroblaştilor inelari, mutaţiile somatice şi eritropoieza ineficientă şi răspunsul eritroid şi independenţa de transfuzie la subiecţii trataţi cu doze mai mari (0,75 mg/kg…1,75 mg/kg) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) (a se vedea - Tabelul 13 şi Tabelul 14). Subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc au obţinut AH-E conform criteriilor IWG şi independenţa de transfuzie (a se vedea - Tabelul 13, Tabelul 14 şi Figura 16). Aceste date indică faptul că a existat un răspuns eritroid crescut la subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) atunci când subiecţii au fost SI+ şi/sau au avut mutaţie(ţii) SF3B1.

Caracteristicile de bază pentru subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)

Tabelul 12

Parametrul N=44 Vârsta, anul, mediana (intervall) 71 (27-88) Sexul, bărbaţi (%) 25 (57%) Tratamentul anterior cu ASE, n (%) 27 (61%) Tratamentul anterior cu lenalidomidă, n (%) 9 (21%) Sarcina de transfuzie scăzută (STS) N = 15 (34%) Hemoglobina, g/dL, mediana (interval) 9,0 (6,8-10,1) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 2 (toţi subiecţii) Sarcina de transfuzie ridicată (STR) N = 19 (73%) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 6 (4-14) IPSS N = 44; n (%) Scăzut 22 (50%) Int-1 20 (46%) Int-2 2 (4%) IPSS-R N = 44; n (%) Foarte scăzut 2 (4,5%) Scăzut 25 (57%) Intermediar 14 (32%) Ridicat 3 (7%) Sideroblast inelar (SI) N = 44; n (%) SI+ 35 (80%) SI- 8 (18%) SI neevaluabili 1 (2%) Mutaţie de splicing (SF3B1) N = 44; n (%) SF3B1 + (mutaţia prezentă) 25 (57%) SF3B1 - (mutaţia absentă) 18 (41%) SF3B1 neevaluabilă 1 (2%)

Răspunsul eritroid la subiecţii pozitivi ai mutaţiilor SI+ şi SF3B1. Pentru subiecţii cu STS, AH-E conform criteriilor IWG este o creştere a hemoglobinei de cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 8 săptămâni. Pentru subiecţii cu STR, AH-E conform criteriilor IWG este o reducere cu cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni

Tabelul 13

Populaţia de pacienţi AH-E conform criteriilor IWG Toţi pacienţii (N=35) 19/35 (54%) SI+ Pacienţi (N=30) 19/30 (63%) SI- Pacienţi (N=5) 0/5 (0%) SF3B1+ Pacienţi (N=22) 16/22 (73%) SF3B1- Pacienţi (N=13) 3/13 (23%)

Independenţa de transfuzie la subiecţii pozitivi ai mutaţiilor SI+ şi SF3B1. Independenţa de transfuzie se referă la netransfuzia de CRS timp de cel puţin 8 săptămâni de tratament

Tabelul 14

Populaţia de pacienţi Independenţa de transfuzie Toţi pacienţii (N=35) 10/28 36%) SI+ Pacienţi (N=30) 9/23 (39%) SI- Pacienţi N=5) 1/4 (25%) SF3B1+ Pacienţi (N=22) 7/17 (41%) SF3B1- Pacienţi (N=13) 3/11 (27%)

8.6.3 Concluzii

Administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) la subiecţii cu SMD subcutanat la fiecare trei săptămâni a fost în general sigură şi bine tolerată. Răspunsul eritroid (IWG HI-E) a fost atins la 54% dintre subiecţii trataţi cu doze de cel puţin 0,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Mai mult, au fost observate rate mai mari de răspunsuri eritroide la subiecţii cu sideroblaşti inelari sau mutaţii în SF3B1. În plus, independenţa de transfuzie a fost obţinută la 36% dintre subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) cu doze de cel puţin 0,75 mg/kg.

8.7 Exemplul 7

Studiu de fază 2 privind stabilirea dozei de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) la pacienţi cu SMD cu risc scăzut şi anemie care necesită transfuzie

A se vedea - Introducere (Secţiunea 8.2.1) şi Materiale şi Metode (Secţiunea 8.2.2) pentru Exemplul 2 (Secţiunea 8.2). Acest exemplu prezintă datele suplimentare din Exemplul 2 (Secţiunea 8.2), obţinute la o dată ulterioară în Studiul de fază 2.

A fost evaluată suplimentar asocierea dintre eficacitatea tratamentului şi prezenţa sideroblaştilor inelari la nivelul iniţial (a se vedea - Tabelul 15).

Atingerea IT-CRS (cu o creştere medie a Hb ≥ 1,5 g/dL pentru pacienţii cu STS) în orice perioadă de 8 săptămâni este prezentată în Figura 17.

Răspunsul eritroid: SMD sideroblastic vs. nesideroblastic la subiecţii trataţi cu proteina de fuziune ActRIIA-hFc (SEQ ID NO: 7). AH-E obţinută la 64% pacienţi sideroblastici şi 20% pacienţi nesideroblastici în grupul cu doză de 1,0 mg/kg sotatercept (test Chi-pătrat P = 0,11)

Tabelul 15

Sideroblaşti inelaria Grupul cu AH-E prin doză sotatercept şi starea SI, n/N (%) 0,1 mg/kg 0,3 mg/kg 0,5 mg/kg 1,0 mg/kg 2,0 mg/kg > 15% 0/6 4/4 (100) 7/13 (54) 7/11 (64) 2/3 (67) < 15% 0/1 0/2 2/6 (33) 1/5 (20) 0/2 aStarea SI este de la nivelul iniţial, unde este disponibilă; Starea SI nu a fost cunoscută pentru 6 pacienţi.

8.8 Exemplul 8

ActRIIB-hFc creşte hemoglobina şi reduce sarcina de transfuzie la subiecţii cu SMD cu risc scăzut sau intermediar-1: Rezultatele preliminare dintr-un Studiu de fază 2 (continuare)

8.8.1 Introducere

A se vedea - Introducerea (Secţiunea 8.3.1) şi Materialele şi Metodele (Secţiunea 8.3.2) pentru Exemplul 3 (Secţiunea 8.3). Acest exemplu prezintă datele suplimentare din Exemplul 3 (Secţiunea 8.3), obţinute la o dată ulterioară în Studiul de fază 2.

8.8.2 Rezultate

Au fost studiaţi un total de 49 de subiecţi cu SMD. 27 dintre cei 49 de subiecţi cu SMD au fost înscrişi într-un studiu de escaladare a dozei (0,125 mg/kg - 1,75 mg/kg) ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) de 3 luni şi 22 de subiecţi au fost înscrişi într-un studiu de escaladare a dozei, astfel cum este prezentat în Tabelul 16. Tabelul 17 prezintă caracteristicile de bază pentru subiecţii studiaţi în acest exemplu.

Studiu de escaladare a dozei de 3 luni

Răspunsul eritroid a fost evaluat la subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). A se vedea - Tabelul 18. Pentru subiecţii cu STS, obiectivul final principal a fost o creştere a hemoglobinei de cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 2 săptămâni. Pentru subiecţii cu STR, obiectivul final principal a fost o reducere cu cel puţin 4 unităţi sau de cel puţin 50% în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni. 33% (3/9) din subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mici (0,125…0,5 mg/kg ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au atins punctul final primar, în timp ce 58% (23/40) din subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mari (0,75…1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25)) au atins punctul final primar.

În plus, a fost evaluată AH-E conform criteriilor IWG. A se vedea - Tabelul 18. Pentru subiecţii cu STS, AH-E conform criteriilor IWG este o creştere a hemoglobinei de cel puţin 1,5 g/dL pentru cel puţin 8 săptămâni. Pentru subiecţii cu STR, AH-E conform criteriilor IWG este o reducere cu cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni. 22% (2/9) dintre subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mici (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut AH-E conform criteriilor IWG, în timp ce 48% (19/40) dintre subiecţii cărora li s-au administrat doze mai mari (0,75…1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut AH-E conform criteriilor IWG.

Mai mult decât atât, a fost evaluată independenţa de transfuzie. A se vedea - Tabelul 18. Pentru subiecţii cărora li s-au administrat cel puţin două unităţi de CRS înainte de terapia cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25), independenţa de transfuzie a fost definită ca atingerea a cel puţin 8 săptămâni fără transfuzie în timp ce s-a primit tratamente cu ActrIIB-hFc (SEQ ID NO:25). 14% (1/7) dintre subiecţi cărora li s-au administrat doze mai mici (0,125…0,5 mg/kg ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut independenţa de transfuzie, în timp ce 37% (11/30) dintre subiecţi cărora li s-au administrat doze mai mari (0,75…1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) au obţinut independenţa de transfuzie. 4/6 subiecţi cu STS şi 7/24 subiecţi cu STR au obţinut independenţa de transfuzie. 10 dintre cei 11 pacienţi independenţi de transfuzie au avut debut în primele 6 săptămâni de tratament cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25).

Asocierea dintre prezenţa sideroblaştilor inelari, mutaţiilor somatice şi eritropoiezei ineficiente şi răspunsul eritroid şi independenţa de transfuzie a fost evaluată la subiecţii trataţi cu doze mai mari (0,75 mg/kg…1,75 mg/kg) de ActRIIB-hFc ( SEQ ID NO: 25). A se vedea - Tabelul 19. 19/40 (48%) dintre toţi subiecţii din grupurile cu doză mai mare au obţinut AH-E conform criteriilor IWG. 19/35 (54%) dintre subiecţii pozitivi cu sideroblaşti inelari (definiţi ca având cel puţin 15% precursori eritroizi în măduva osoasă) au obţinut AH-E conform criteriilor IWG şi 0/4 (0%) dintre subiecţii negativi cu SI au obţinut AH-E conform criteriilor IWG. Subiecţii cu SI pozitivi cu niveluri de EPO mai mici de 200 mU/mL au obţinut AH-E conform criteriilor IWG şi 5/12 (42%) dintre subiecţii pozitivi cu SI cu niveluri de EPO mai mici de 200 mU/mL au obţinut AH-E conform criteriilor IWG. 16/26 (62%) dintre subiecţi care poartă mutaţia SF3B1 şi 3/13 (23%) dintre subiecţi care nu poartă mutaţia SF3B1 au obţinut AH-E conform criteriilor IWG.

Astfel, rezultatele prezentate în acest exemplu au demonstrat că tratamentele cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) au condus la un răspuns eritroid robust şi independenţă de transfuzie, în special la subiecţii din grupurile cu doză mai mare. În plus, a fost găsit un răspuns eritroid îmbogăţit la subiecţii SI+ pozitivi şi pozitivi cu mutaţii ale SF3B1.

ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a fost în general bine tolerat. A se vedea - Tabelul 20. Majoritatea evenimentelor adverse (EA) au fost de gradul 1 sau 2. Au fost observate două evenimente adverse severe (EAS): durerea musculară de gradul 3 (ziua 90 de debut) şi gradul 3 de agravare a afecţiunii generale (ziua 44 de debut, ziua 66 recurentă, fără legătură). S-a observat un EA nesever de gradul 3 cu legătură în numărul de celule blaste.

Schema de dozare a subiecţilor trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25)

Tabelul 16

Escaladarea dozei Extinderea Nivelul dozei (mg/kg) 0,125 0,25 0,5 0,75 1,0 1,33 1,75 1,0a Nr. de subiecţi 3 3 3 6 3 6 3 22

aNivelul dozei iniţiale; nivelul dozei a crescut până la 1,33 mg/kg la 8 subiecţi şi până la 1,75 mg/kg la 2 subiecţi.

Tabelul 17

Parametrul N=44 Vârsta, anul, mediana (interval) 71 (27-88) Sexul, bărbaţi (%) 27 (55%) Tratamentul anterior cu ASE, n (%) 30 (61%) Tratamentul anterior cu lenalidomidă, n (%) 9 (18%) Timpul de la diagnosticare, ani, mediana (interval) 2,8 (0,2-13,6) Sarcina de transfuzie scăzută (STS) N = 17 (35%) Hemoglobina, g/dL, mediana (interval) 8,7 (6,8-10,1) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 2 (2-2) (n=6) Sarcina de transfuzie ridicată (STR) N = 32 (65%) Unităţi de CRS/8 săptămâni, mediana (interval) 6 (4-14) (n=32) IPSS N = 49; n (%) Scăzut 27 (55%) Int-1 20 (41%) Int-2 2 (4%) IPSS-R N = 44; n (%) Foarte scăzut 2 (4,5%) Scăzut 30 (61%) Intermediar 14 (29%) Ridicat 3 (6%) Sideroblast inelar (SI) N = 48; n (%) SI+ 40 (83%) SF3B1 + (mutaţia prezentă) 29 (73%) SF3B1 - (mutaţia absentă) 11 (27%) SI- 8 (17%)

Răspunsul eritroid şi independenţa de transfuzie la subiecţii trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)

Tabelul 18

Criterii de răspuns Grupuri cu doze mai mici 0,125-0,5 mg/kg N=9 n% Grupuri cu doze mai mari 0,75-0,175 mg/kg N=40 n (%) Punctul final primar al eficacităţii 3 (33%) 23 (58%) AH-E conform criteriilor IWG 2 (22%) 19 (48%) Independenţa de transfuzie 1/7 (14%) 11/30 (37%)* STS STR 4/6 7/24

* 10 dintre cei 11 pacienţi independenţi de transfuzie au avut debut în primele 6 săptămâni de tratament cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25).

Tabelul 19

Populaţia de pacienţi AH-E conform criteriilor IWG Toţi pacienţii 19/40 (48%) SI pozitivi 19/35 (54%) EPO < 200 14/23 (61%) EPO ≥ 200 5/12 (42%) SF3B1 mutaţia prezentă 16/26 (62%) SF3B1 mutaţia prezentă 3/13 (23%)

Evenimentele adverse (toate gradele) raportate la ≥ 4 subiecţi trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25), indiferent de cauzalitate

Tabelul 20

Termenul preferat N (%) Grupuri cu doze mai mici 0,125-0,5 mg/kg N=9 n% Grupuri cu doze mai mari 0,75-0,175 mg/kg N=40 n (%) Total N-49 Mialgie 2 (22) 5 (13) 7 (14) Diaree 2 (22) 4 (10) 6 (12) Rinofaringită 1 (11) 5 (13) 6 (12) Cefalee 0 5 (13) 5 (10) Durere abdominală superioară 1 (11) 3 (8) 4 (8) Durere osoasă 1 (11) 3 (8) 4 (8) Bronşită 0 4 (10) 4 (8) Oboseală 0 4 (10) 4 (8) Hipertensiune 0 4 (10) 4 (8) Spasme musculare 2 (22) 2 (5) 4 (8)

Studiu de extensie

Subiecţii care au completat studiul de escaladare a dozei de 3 luni au fost eligibili să se înscrie într-un studiu ulterior de extensie de 12 luni. Nivelurile dozei iniţiale de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) au fost de 1,0 mg/kg pentru subiecţii a căror tratament a fost întrerupt pentru mai mult de 3 luni. Subiecţii a căror tratament cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a fost neîntrerupt, au continuat tratamentul la acelaşi nivel de doză ca ultima lor doză în protocolul de tratament de 3 luni.

Un număr de 58 de subiecţi au fost înscrişi în studiul de tratament pe 3 luni. Dintre aceştia, 22 de subiecţi au fost înscrişi într-un studiu de extensie de 12 luni, 9 pacienţi cu sarcină de transfuzie scăzută şi 13 pacienţi cu sarcină de transfuzie ridicată. În studiul de extensie, 17/22 subiecţi au continuat tratamentul cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fără întrerupere şi 5/22 subiecţi au intrat după o întrerupere de >3 luni.

Pentru cei 9 pacienţi cu sarcină de transfuzie scăzută, creşterea medie a hemoglobinei la o lună a fost de aproximativ 2 g/dL, crescută între 2,5 şi 3,0 g/dL şi a fost menţinută pentru o perioadă de 6 luni pentru care sunt disponibile date.

Pentru cei 13 pacienţi cu sarcină de transfuzie ridicată, 43% au obţinut independenţă de transfuzie, cu câţiva pacienţi menţinând această independenţă de transfuzie timp de mai mult de 6 luni, cu un pacient cu cea mai lungă perioadă de independenţă de transfuzie de aproape 8 luni. Toţi aceşti pacienţi au rămas în studiu.

Figura 18 prezintă rezultatele pentru un subiect exemplar. Un pacient cu STR SI-pozitiv a fost tratat cu o doză de 0,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) în studiul de tratament iniţial de 3 luni şi a fost înscris în studiul de extensie de 12 luni după o întrerupere a tratamentului cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) de 11 luni, în timpul căruia subiectul a primit EPO.

Un răspuns durabil al hemoglobinei a fost observat la subiecţii cu STS. 8/9 subiecţi au obţinut AH-E conform criteriilor IWG. Figura 19 prezintă răspunsul hemoglobinei al unui subiect exemplar.

Subiecţii din studiul de extensie de 12 luni au prezentat un răspuns durabil în ceea ce priveşte independenţa de transfuzie. Figura 20 ilustrează rezultatele a 6 subiecţi. 5 subiecţi prezintă un răspuns continuu la independenţa de transfuzie după 2…7 luni în timp ce au primit tratamente cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) la doze de 1,0 mg/kg (4 subiecţi) şi 1,75 mg/kg (1 subiect). Un subiecţi (ultimul rând din Figura 20) au primit două titrări de doză de la 1,0 mg/kg până la 1,33 mg/kg şi 1,75 mg/kg. Acest ultim subiect a experimentat independenţa de transfuzie intermitent timp de aproximativ 2 luni şi continuă să atingă răspunsul la AH-E conform criteriilor IWG.

În concluzie, rezultatele prezentate în acest exemplu au demonstrat că subiecţii cu SMD cu risc scăzut SI-pozitivi trataţi cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) au demonstrat o ameliorare hematologică robustă, în special dacă au fost trataţi cu doze de ≥ 0,75 mg/kg. Tratamentele cu ActrIIB-hFc (SEQ ID NO:25) au fost în general bine tolerate. Tratamentul de lungă durată cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a demonstrat creşteri stabile ale nivelului de hemoglobină şi menţinerea independenţei de transfuzie.

8.9 Exemplul 9

Studiu de fază III privind ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) pentru tratarea anemiei datorată SMD cu IPSS-R cu risc foarte scăzut, scăzut sau intermediar

Acest exemplu prezintă o trecere în revistă a unui studiu randomizat, multicentric, controlat cu placebo, dublu-orb, de fază 3 pentru a determina eficacitatea şi siguranţa ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) pentru tratamentul anemiei datorate SMD cu IPSS-R cu risc foarte scăzut, scăzut sau intermediar la subiecţii cu sideroblaşti inelari (cel puţin 15% din eritroblaşti sunt sideroblasti inelari) care necesită transfuzii de CRS.

Anemia este considerată a fi una dintre citopeniile cele mai răspândite la pacienţii care au sindrom mielodisplazic, un termen umbrelă folosit pentru a descrie tulburările legate de producerea ineficientă de celule roşii sanguine, celule albe sanguine şi/sau trombocite. Variind în severitate de la uşoară (asimptomatică) până la severă, anemia poate avea drept rezultat pacienţi care necesită transfuzii de CRS, ceea ce poate duce la complicaţii suplimentare din cauza supraîncărcării cu fier. Scopul acestui studiu este de a evalua siguranţa şi eficacitatea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) faţă de placebo la pacienţii anemici care sunt clasificaţi ca SMD cu IPSS-R cu risc foarte scăzut, scăzut sau intermediar, au prezenţi sideroblaşti inelari şi necesită transfuzii de CRS. Proiectul studiului va permite o perioadă de randomizare iniţială a pacienţilor fie în grupul cu ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25), fie în grupul cu placebo, urmată de o perioadă de tratament dublu-orb şi apoi de o vizită de evaluare a bolii SMD. Pentru acei pacienţi care sunt hotărâţi să profite de un beneficiu clinic, după cum a stabilit Anchetatorul studiului prin această vizită de evaluare a bolii, acestora li se va permite să intre în faza de extensie dublu-oarbă a studiului. Odată ce pacienţii sunt întrerupţi de la tratamentul de studiu, aceştia vor intra într-o perioadă de supraveghere ulterioară tratamentului.

8.9.1 Proiectul studiului

Subiecţilor li se va administra o doză iniţială de 1,0 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25), subcutanat, o dată la fiecare trei săptămâni. Subiecţilor de control li se va administra placebo, subcutanat, o dată la trei săptămâni.

(a) Criterii de includere

Criteriile de includere pentru participarea subiectului în acest studiu includ: (1) subiectul este de ≥ 18 ani la momentul semnării formularului de consimţământ informat; (2) subiectul are un diagnostic de SMD care corespunde clasificării Sistemului Internaţional de Evaluare a Prognosticului Revizuit (IPSS-R) de boală cu risc foarte scăzut, scăzut sau intermediar şi are: (a) mai mult de 15% din precursorii eritroizi în măduva osoasă sunt sideroblaşti inelari şi (b) mai puţin de 5% blaşti în măduva osoasă; (3) subiecţii care necesită > 2 unităţi de transfuzii de celule roşii sanguine într-o perioadă de 8 săptămâni; (4) scorul Grupului Estic de Cooperare Oncologică (ECOG) de 0, 1 sau 2; (5) subiecţii care sunt refractari/intoleranţi/neeligibili la tratamentul anterior cu ASE; refractar la tratamentul anterior cu ASE necesită documentarea non-răspunsului sau a răspunsului care nu mai este menţinut la schema anterioară care conţine ASE, fie ca agent unic, fie ca o combinaţie (de exemplu, cu G-CSF); schema ASE trebuie să fi fost fie (a) eritropoietină umană recombinantă mai mare de 40.000 UI/săptămână pentru cel puţin 8 doze sau echivalent sau (b) darbepoetină alfa mai mare de 500 µg o dată la fiecare trei săptămâni pentru cel puţin 4 doze sau echivalent; intolerant la tratamentul anterior cu ASE necesită documentarea întreruperii tratamentului anterior cu ASE, fie ca agent unic sau ca o combinaţie (de exemplu, cu G-CSF), în orice moment după introducere din cauza intoleranţei sau a unui eveniment advers; ASE-neeligibil necesită o şansă scăzută de răspuns la ASE pe baza unui nivel al eritropoietinei serice endogene mai mare de 200 U/L pentru subiecţii care nu au fost trataţi anterior cu ASE.

(b) Criterii de excludere

Prezenţa oricăruia dintre următoarele va exclude un subiect de la înscrierea în studiu: (1) terapie anterioară cu agenţi de modificare a bolii (de exemplu, medicamente imunomodulatoare, agenţi hipometilanţi sau terapie imunosupresoare) sau agenţi experimentali pentru boala SMD de baza; (2) SMD asociat cu anomalie citogenetică del(5q); (3) SMD secundar, adică SMD care este cunoscut că a apărut drept rezultat al leziunii chimice sau tratamentului cu chimioterapie şi/sau radiaţii pentru alte boli; (4) anemie semnificativă clinic cunoscută din cauza deficientei de fier, vitamina B12 sau folat sau anemie hemolitică autoimună sau ereditară sau hemoragie gastrointestinală; deficienţa de fier va fi determinată de o coloraţie a punctatului medular pentru fier, saturaţia transferinei calculată (capacitatea de legare a fierului/fierului total) ≤ 20% sau feritina serică ≤ 15 µg/L; (6) transplant alogen sau autolog de celule stem anterior; (7) istoricul cunoscut al diagnosticului de leucemie acută mieloidă (LAM); (8) utilizarea oricăruia dintre următoarele timp de 5 săptămâni înainte de randomizare: agent sau tratament chimioterapeutic citotoxic anticanceros, corticosteroid, cu excepţia subiecţilor aflaţi pe o doză stabilă sau descrescătoare timp de ≥ 1 săptămână înainte de randomizare pentru alte afecţiuni decât SMD, agenţi de chelare a fierului, cu excepţia subiecţilor aflaţi pe o doză stabilă sau descrescătoare timp de cel puţin 8 săptămâni înainte de randomizare, alţi factori de creştere hematopoietici pentru CRS (de exemplu, interleukina-3); (9) preistoricul tumorilor maligne, altele decât SMD, cu excepţia cazului în care subiectul nu a avut boală timp de ≥ 5 ani; se admit subiecţi cu următorul istoric/tulburări concurente: carcinomul pavimentos sau bazal al pielii, carcinomul in situ al colului uterin, carcinomul in situ mamar, constatarea histologică incidentală a cancerului de prostată (T1a sau T1b folosind sistemul de stadializare clinică a tumorii, nodurilor, metastazei); sau (10) chirurgie majoră în termen de 8 săptămâni înainte de randomizare; subiecţii ar fi trebuit să se recupereze complet după orice intervenţie anterioară înainte de randomizare.

(c) Măsurători ale rezultatelor

Măsurarea primară a rezultatelor pentru acest studiu este determinarea proporţiei subiecţilor cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) care sunt independenţi de transfuzia de CRS (adică, nu necesită transfuzie de CRS) pentru orice perioadă consecutivă de 56 de zile.

Măsurătorile rezultatelor secundare includ determinarea proporţiei de subiecţi cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) având independenţă de transfuzie de CRS (adică, nu necesită transfuzie de CRS) pentru orice perioadă consecutivă de 84 de zile după administrarea ActRIIB- hFc (SEQ ID NO:25). Proporţia subiecţilor cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) având o scădere a numărului de unităţi de CRS transfuzate timp de o perioadă de 16 săptămâni după administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) va fi de asemenea determinată. În plus, va fi de asemenea determinată durata maximă a independenţei de transfuzie de CRS la subiecţii cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). În final, va fi determinat şi timpul necesar pentru subiecţii cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) pentru a atinge independenţa de transfuzie de CRS; timpul înainte de independenţa de transfuzie de CRS este definit ca timpul dintre randomizare şi data la care independenţa de transfuzie este observată pentru prima dată (de exemplu, ziua 1 din 56 de zile fără transfuzii de CRS).

Se va determina, de asemenea, proporţia subiecţilor cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) care obţin o ameliorare hematologică eritroidă modificată în orice perioadă consecutivă de 56 de zile după administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). În anumite aspecte, ameliorarea hematologică eritroidă este cea definită de IWG. În anumite aspecte, ameliorarea hematologică eritroidă este în concordanţă cu definiţia modificată în 2006 de IWG. În anumite aspecte, ameliorarea hematologică eritroidă pentru un pacient cu sarcină de transfuzie scăzută este o creştere a concentraţiei de hemoglobină la pacient de cel puţin 1,5 g/dL timp de cel puţin 8 săptămâni. În anumite aspecte, ameliorarea hematologică eritroidă pentru un pacient cu sarcină de transfuzie ridicată reprezintă o reducere cu cel puţin 4 unităţi în transfuzia de CRS timp de 8 săptămâni.

Proporţia subiecţilor cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) şi atingerea unei creşteri în cel puţin 1,0 g/dL de hemoglobină (comparativ cu concentraţia de hemoglobină la subiect înainte de administrarea la subiect a ActRIIB-hFc (SECV ID NO:25)) pentru orice perioadă consecutivă de 56 de zile în absenţa transfuziei de CRS.

Se va determina scăderea medie a nivelurilor de feritină serică la subiecţii cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) în comparaţie cu nivelele de feritină serică înainte de administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Analiza covarianţei (ANCOVA) va fi utilizată pentru a compara diferenţa de tratament între grupuri, cu factorii de stratificare şi valoarea iniţială (pre-ActRIIB-hFC (SEQ ID NO:25)) a feritinei serice în calitate de covariante.

Se va determina reducerea medie a utilizării terapiei de chelare a fierului la subiecţii cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) în comparaţie cu utilizarea terapiei de chelare a fierului înainte de administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Schimbarea dozei zilnice de terapie de chelare a fierului pentru fiecare subiect este calculată ca diferenţa dintre doza zilnică medie după iniţierea tratamentului şi doza zilnică medie iniţială. Analiza covarianţei (ANCOVA) va fi utilizată pentru a compara diferenţa de tratament între grupuri, factorii de stratificare şi valorile iniţiale ale terapiei de chelare a fierului şi covariantele.

Proporţia subiecţilor cărora li s-a administrat ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) care ating o ameliorare hematologică neutrofilă în orice perioadă consecutivă de 56 de zile după administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) va fi, de asemenea, determinată. În anumite aspecte, ameliorarea hematologică neutrofilă este cea definită de IWG. În anumite aspecte, ameliorarea hematologică neutrofilă este o creştere a neutrofilelor cu cel puţin 100% şi mai mare de 500/uL într-o perioadă de 56 de zile consecutive la subiect după administrarea ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) la subiect.

Se va determina, de asemenea, proporţia subiecţilor care progresează la leucemia acută mieloidă.

Se va utiliza şi se va evalua, de asemenea, Chestionarul privind Calitatea Vieţii al Organizaţiei Europene pentru Cercetarea şi Tratamentul Cancerului.

Se vor evalua, de asemenea, evenimentele adverse, supravieţuirea globală şi farmacocinetica populaţiei.

9. DESCRIEREA SECVENŢELOR

1. US 2011038831 A1 2011.02.17

2. US 2010204092 A1 2010.08.12

3. US 2010068215 A1 2010.03.18

4. US 2010028332 A1 2010.02.04

5. US 2010028331 A1 2010.02.04

6. US 2009163417 A1 2009.06.25

Claims

1. Inhibitor al semnalizării receptorului activinei de tip II (ActRII) pentru utilizare într-o metodă de tratament al sindroamelor mielodisplazice (SMD) la un subiect, în care metoda include: (a) determinarea la subiect a procentului de eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari; şi (b) administrarea la subiect a unei doze de un inhibitor al semnalizării ActRII cuprinse între 0,1 mg/kg şi 2,0 mg/kg, dacă cel puţin 15% de eritroblaşti la subiectul respectiv sunt sideroblaşti inelari, şi în care inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă, care conţine: (i) o secvenţă de aminoacizi, care este cel puţin 90% identică cu SEQ ID No: 25; (ii) o secvenţă de aminoacizi, care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID No: 25; (iii) o secvenţă de aminoacizi, care este cel puţin 98% identică cu SEQ ID No: 25; (iv) o secvenţă de aminoacizi SEQ ID No: 25; sau (v) un fragment al domeniului extracelular al ActRIIB, în care fragmentul constă din secvenţa de aminoacizi SEQ ID NR:23; un linker; şi un Fc al unei IgG.

2. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 1, în care metoda atinge: (a) o reducere pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari comparativ cu procentul iniţial de eritroblaşti la subiect, care sunt sideroblaşti inelari, în care reducerea pe termen lung este o reducere a procentului de eritroblaşti menţinută pentru cel puţin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII; şi/sau (b) o creştere pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină comparativ cu nivelul de hemoglobină iniţial, în care nivelul de hemoglobină iniţial la subiect este un nivel de hemoglobină la subiect cu o perioadă de timp înainte de administrarea la subiect a unei doze iniţiale de inhibitor al semnalizării ActRII; în care creşterea pe termen lung la subiect este o creştere a nivelului de hemoglobină menţinută pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

3. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 1 sau 2, în care inhibitorul semnalizării ActRII este administrat pentru o perioadă scurtă de timp, şi în care perioada scurtă de timp este de 1, 2, 3, 4 sau 5 luni.

4. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 1 sau 2, în care metoda include suplimentar: (c) determinarea la subiect a unui al doilea procent de eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari după o perioadă de timp, opţional, în care perioada de timp este de 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 luni; şi (d) opţional administrarea la subiect a unei doze ajustate de inhibitor al semnalizării ActRII.

5. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 1 sau 2, în care metoda include suplimentar: (c) determinarea la subiect a nivelului de hemoglobină după administrarea la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, opţional, în care nivelul de hemoglobină este determinat timp de 6, 12, 18 şi/sau 24 luni după administrarea inhibitorului semnalizării ActRII; şi (d) întreruperea administrării la subiect a inhibitorului semnalizării ActRII, dacă nivelul de hemoglobină la subiect este de cel puţin 11 g/dL.

6. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 1, în care procentul de eritroblaşti din subiect, care sunt sideroblaşti inelari este determinat timp de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 1 săptămâni, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 7 săptămâni, 8 săptămâni, 3 luni, 4 luni, 5 luni sau 6 luni de administrare la subiect a dozei eficiente farmaceutic de inhibitor al semnalizării ActRII.

7. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 2, în care reducerea pe termen lung la subiect a procentului de eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari este de cel puţin 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 sau 10,0 ori sub procentul iniţial de eritroblaşti la subiect, care sunt sideroblaşti inelari pentru cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

8. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 2, în care creşterea pe termen lung la subiect a nivelului de hemoglobină este un nivel de hemoglobină la subiect cuprins între aproximativ 11 g/dL si 18 g/dL pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

9. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 3, în care: (i) primul procent de eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari la subiectul căruia i s-a administrat inhibitorul semnalizării ActRII pentru o perioadă scurtă este redus la mai puţin de 10%, 9%, 8%, 7% 6%, 5%, 4%, 3%, 2% sau mai puţin de 1% timp de cel puţin 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada scurtă de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII; şi/sau (ii) nivelul de hemoglobină la subiectul căruia i s-a administrat inhibitorul semnalizării ActRII pentru o perioadă scurtă este între aproximativ 11 g/dL si 18 g/dL pentru cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

10. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform oricărei din revendicările 1-9, în care subiectul prezintă o probabilitate crescută de a obţine normalizarea unui sau mai multor parametri hematologici dacă cel puţin 15%, 16%, 17%, 18 %, 19% sau 20% din eritroblaşti la subiect sunt sideroblaşti inelari comparativ cu subiectul care are cel mult 15% din eritroblaşti, care sunt sideroblaşti inelari.

11. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform revendicării 10, în care parametrul hematologic este nivelul de hemoglobină, hematocritul, numărul de celule roşii din sânge sau procentul de eritroblaşti la subiect, care sunt sideroblaşti inelari.

12. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform oricărei din revendicările 1-11, în care subiectul nu necesită transfuzie de celule roşii din sânge timp de cel puţin 3, 4, 5, 6, 12, 18 sau 24 de luni după perioada de administrare a inhibitorului semnalizării ActRII.

13. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform oricărei din revendicările 1-12, în care inhibitorul semnalizării ActRII este administrat: (a) (i) o dată la fiecare trei săptămâni; (ii) o dată la fiecare 28 de zile; sau (iii) o dată la fiecare 42 de zile; şi/sau (b) prin injecţie, opţional, în care injecţia este subcutanată.

14. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform oricărei din revendicările 1-13, în care inhibitorul semnalizării ActRII este o polipeptidă, care conţine o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO: 25.

15. Inhibitor al semnalizării receptorului ActRII, conform oricărei din revendicările 1-14, în care subiectul este un om.