PT98866A

PT98866A - Metodo de inibicao de geracao de superoxido, utilizando tioeteracidos fenolicos

Info

Publication number: PT98866A
Application number: PT98866A
Authority: PT
Inventors: Richard August Mueller; Akira Nakao; Richard Allen Partis
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1992-07-31
Also published as: US5064860A; WO1992004020A1; AU8741091A; IE913142A1

Description

ί * ί *

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Fundamento do Invento l. Campo do Invento O presente invento dirige-se a um método de inibição da geração de superóxido que utiliza tioeterácidos fenólicos que inibem a geração de superóxido. 2. Fundamento do Invento e Técnica Relacionada

Recentemente, os radicais oxigénio foram implicados na patogénese de muitas doenças. Esta implicação é reflectida pelas muitas conferências dedicadas a este tópico, livros sobre o assunto referente aos radicais livres e doenças e o aparecimento de duas novas revistas especializadas: Free Radical Research Communications e Free Radical Bioloqy and Medicine.

Conhece-se muito sobre as propriedades físico-químicas de vários radicais de oxigénio, mas o conhecimento da sua importância global na iniciação e amplificação de doenças humanas é limitado. Algumas condições clínicas nas quais os radicais de oxigénio se pensa estarem envolvidos são discutidas em Cross, C. E., et al., "Oxigen Radicais and Human Disease", ANN. INT. MED., 107: 526-545 (1987) (ver Tabela 1, p. 527) e Ward, P. A., et al., "Oxigen Radicais, Inflammation, and Tissue Injury", FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE, 5: 403-408 (1988). De entre as condições clínicas em que se pensa que os radicais de oxigénio estão envolvidos destacam-se, por exemplo, trauma inflamatória imune, doenças autoimunes, isquemia - estados de refluxo, desordens da idade, cancro, efeitos do fumo do cigarro, enfisema, síndroma da angustia respiratória aguda (ARDS), aterosclerose, artrite reumatóide, demência senil, cataratogénese,. retinopatia da prematuridade, lesão por radiação e dermatite de contacto.

Os radicais de oxigénio são capazes de reversível ou irreversivelmente causar danos a compostos de todas as classes bioquímicas, incluindo ácidos nucleicos, proteínas e aminoãcidos livres, lípidos e lipoproteínas, hidratos de carbono e macromo-léculas de tecido conjuntivo. Estas espécies podem ter um impacto nestas actividades celulares como função de membrana, metabolismo e expressão do gene. Os radicais de oxigénio são formados em tecidos por muitos processos (ver Cross, et al., p. 528, Tabela 2) . Acredita-se que são não só endógenos, tal como cadeias de transporte de electrão de mitocôndrio, microssoma e cloroplasto; enzimas oxidantes tais como oxidase de xantina, dioxigenase de indolamina, dioxigenase de triptofano, oxidase de galactose, ciclooxigenase, lipoxigenase e oxidase de monoamina; células fagocíticas tais como neutrófilos, monõcitos e células macrófagas, eosinófilas e endoteliais; e reacções de antioxida-ção; mas também exógenos, tais como substâncias de ciclização redox, oxidações de drogas, fumo de cigarro, radiação ionizante, luz solar, choque térmico e substâncias que oxidam a glutationa. Eles podem estar envolvidos na acção de toxinas tais como paraqua-to, fumo de cigarro e drogas antitumores de quinona. Vários compostos de tioéter foram já anteriormente descritos. Por exemplo, a U.S. 4 711 903 e a sua Continuação em Parte, U.S. 4 755 524 revelam compostos de fórmula -5- νγ. 1

1 2 Ρ em que R e R sao iguais ou diferentes e, independentemente, representam tert-alquilo ou fenilo; A representa metilenò ou metileno substituído por alquilo, dialquilo ou hidroxi, com a condição de que quando A inclui hidroximetileno, o grupo hidroxi-metileno não está adjacente a um heteroãtomo; B representa enxofre, sulfóxido, sulfona, oxigénio, -NH- ou azoto substituído por alquilo, fenilo, benzilo, fenilo substituído ou benzilo substituído; C representa metileno ou metileno substituído por 3

alquilo; R representa CC^H, C02~alquilo ou um grupo tetrazole; m éOoul, né2, 3 ou 4 e p é 1, 2 ou 3; eos seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis. Os compostos são inibidores específicos de 5-lipoxlgenase e são úteis no tratamento da inflamação local e sistémica, alergia e reacções de hipersensibilidade e outras desordens nas quais estão envolvidos os agentes formados no percurso metabólico da 5-lipoxigenase. Não há revelação da actividade de inibição de superóxido. 0 Pedido de Patente Europeia N2 o 131 221 revela compostos de fórmula

Aj—<J“A—S*~R -6- I t

P em que Ar representa fenilo ou fenilo substituído por um até três substituintes variados, por exemplo, alquilo, ãlcoxi, hidroxi, etc.; Q representa oxigénio, enxofre ou um grupo NH; A representa uma cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituída, alquileno e R representa hidrogénio ou alquilo linear ou ramificado, facultativamente substituído por alcoxi, hidroxilo, carbo-xilo, alcoxicarbonilo, etc.; e a é 0, 1 ou 2. Os compostos revelados são indicados como tendo propriedades anti-inflamató-rias e anti-alérgicas por meio de inibição de reacções anafilác-ticas e anafilactóides não definidas, ainda que não sejam proporcionados nenhuns dados de testes. Os compostos preferidos são indicados como sendo aqueles em que Q representa oxigénio e n é 0 sem menção de qualquer preferência entre os numerosos substituintes possíveis para R ou fenil substituído como Ar. Em contraste com o invento revelado na EPA 0 131 221, os compostos utilizados no método do presente invento têm todos um átomo de enxofre na posição que corresponde a Q assim como têm grupos di(terciário)--alquilo ou difenilo como substituintes na porção de fenol que corresponde ao grupo Ar substituído no anterior pedido de patente que, como aqui se descreve, pode ou não compreender um fenol. Os compostos de fórmula I do presente invento, incluindo as suas surpreendentes propriedades inibidoras de superóxido específicas, não são, por conseguinte, especificamente descritos na EPA 0 131 221.

Sumário do invento

0 presente invento refere-se a um método de inibição de geração de superóxido que se caracteriza por compreender a administração a um mamífero com necessidade de um tal tratamento de uma quantidade de um composto de fórmula I ί

12-.. em que R e R sao iguais ou diferentes e, mdependentemente, representam tert-alquilo ou fenilo, Alk1 representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 10 átomos de carbono, X representa enxofre ou oxigénio, Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 4 átomos de carbono e m é 0, 1 ou 2; ou um seu sal ou estereómero ou isómero geométrico farmaceuticamente aceitável, que é eficaz para inibir a geração de superóxido.

Os compostos de fórmula I são inibidores da geração de superóxido em neutrófilos e são úteis no tratamento terapêutico ou profiláctico de condições de doença que são completa ou parcialmente mediadas pela geração de superóxido, tais como síndroma da angustia respiratória do adulto, condições inflamatórias ou alérgicas mediadas por superóxido e outras condições clínicas que são causadas por ou agravadas por superóxido.

Ainda que tenha sido especulado que a 5-lipoxigenase possa estar envolvida na geração de superóxido, os Pedidos de Patente têm revelado que a geração de superóxido não é governada pela 5-lipoxigenase. Por conseguinte, a actividade dos compostos de fórmula I na inibição da geração de superóxido não está' relacionada com a capacidade de inibir a 5-lipoxigenase. -8- i f

Descricão Detalhada do Invento 0 presente invento também se refere a um método de inibição de geração de superõxido que é caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de um tal tratamento de uma quantidade de um composto de fórmula

3 4 em que R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono, X representa enxofre ou oxigénio eméO, lou2; ou um seu sal ou estereómero ou isómero geométrico farmaceuticamente aceitável, que é eficaz para inibir a geração de superóxido. 0 termo "tert-alquilo", conforme aqui usado, em refe rência a R e R , refere-se a porções alquilo de cadeia ramifica- X u da desde 4 até 10 átomos de carbono que têm um carbono terciário ligado ao anel de fenilo substituído por R1 e R2· Exemplos de tais grupos são tert-butilo. i.e., 1,1-dimetiletilo, 1,1-dimetil-propilo, l-metil-l-(etil)pentilo, 1,1-dietilpropilo, 1-etil-l-(propil)butilo e semelhantes. O termo "alquileno" refere-se a grupos alquileno de cadeia linear ou ramificada que têm entre 1 e 10 átomos de carbono que incluem, por exemplo, metileno, etileno, propileno, -9- ί -9- ί

1,2-dimetiletileno, pentileno, neopentileno, etc.. 0 termo "alquilo" refere-se a radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada que têm de 1 até 4 átomos de carbono que incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, t-butilo, etc.

Os compostos de fórmula I particularmente preferidos são aqueles em que R e R2 são ambos tert-alcruilo. São também preferidos para utilização no invento os compostos e isómeros de fórmula

A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" pretende incluir os sais capazes de serem formados com os compostos do presente invento sem materialmente alterarem a estrutura química ou as suas propriedades farmacológicas. Tais sais incluem sais de catióes inorgânicos e orgânicos ou sais por adição de ácido, tais como de sódio, potássio, cálcio, amónio, trietanolamina, lisina, hidrocloreto, hidrobrometo, etc., bem como conhecidos dos peritos da técnica. Os sais anteriores são preparados de uma maneira convencional por neutralização dos compostos de fórmula I com a base ou ácido desejados.

Os compostos do presente invento podem ser administrados em formas de dosagem oral como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, elixires ou xaropes bem como aerossóis para inalação. Semelhantemente, a administração pode ser efectuada de forma intravascular, subcutânea ou intramuscular, utilizando formas de dosagem conhecidas dos peritos habituais nas técnicas farmacêuticas. Em geral, a forma preferida de administração é a oral. Uma quantidade eficaz mas não tóxica do composto é empregue no tratamento. O regime de dosagem do presente invento e escolhido de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a severidade da condição a ser tratada; e a via de admnistração. Um médico com perícia normal pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da droga requerida para prevenir, tratar ou parar o progresso da comdição particular. A quantidade eficaz para administração é vulgarmente a quantidade que é necessária para assegurar que os neutrófilos de mamífero envolvidos na geração de superóxido estarão expostos a uma concentração suficiente da droga para inibir a geração de superóxido. 0 regime de dosagem pode ser eficazmente determinado para cada paciente ou animal por infusão intravenosa inicial a um nível de dosagem, e.g. 0,01 jLíg/kg/min e depois disso aumentar a dosagem até ser obtido o efeito desejado. Desta meneira, podem ser determinadas as dosagens orais que produzirão equivalentes níveis de sangue da droga. As dosagens dos compostos do presente invento, variarão geralmente entre 0,1/mg/kg/dia até 100 mg/kg/dia e preferivelmente entre 0,5/mg/kg/dia até 50 mg/kg/dia quando administrados a pacientes que sofrem de reacções alérgicas ou de hipersensibili-dade ou inflamação. Os compostos podem também ser administrados transdermicamente ou topicamente pata tratar condições de pele p+roliferativas tais como a psoríase. A dosagem diária pode ser administrada numa dose única ou em doses divididas iguais três ou quatro vezes por dia.

Nas composições e nos métodos do presente invento, pelo menos um dos compostos activos do invento, ou um seu sal farma-ceuticamente aceitável, serão tipicamente admnistrados em mistura com diluentes, excipientes ou agentes de suporte (colectivamente referidos daqui em diante como materiais "agente de suporte") farmaceuticamente adequados, adequadamente escolhidos em relação à forma pretendida de administração, isto é, comprimidos orais, cápsulas, elixires, xaropes e semelhantes orais, e consistentes com as práticas farmacêuticas convencionais.

Por exemplo, para admnistração oral na forma de um comprimido ou cápsula, a componente da droga activa pode ser combinada com um agente de suporte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como lactose, amido, sacarose, celulose, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol e semelhantes; para admnistração oral na forma líquida, a componente da droga activa pode ser combinada com qualquer agente de suporte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como etanol e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, podem também ser incorporados na mistura agentes ligantes, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes de coloração adequados. Os ligantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, agentes adoçantes de grão de cereal, gomas naturais e sintéticas tais como acácia, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno-glicol e ceras. Os lubrificantes utilizados em tais formas de dosagem incluem ácido bórico, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Os agentes de desintegração incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, ãgar, bentonite, goma de guar e semelhantes.

Os compostos utilizados na prática do presente invento podem ser preparados como se descreve nas U.S. 4 711 903 e U.S. 4 755 524 sendo ambas aqui incorporadas por referência.

Em aditamento, os compostos de formula I em que X 2 representa oxigénio e Alk representa metileno podem ser preparados como se descreve no seguinte esquema de reacção:

ESQUEMA A

1) NaH/THF 2) CICHjCOONa/DMSO 3) H+

(VI)

Avaliações Biológicas

Os compostos do invento são avaliados em relação â inibição da 5-lipoxigenase de acordo com o seguinte processo de ensaio.

Inibição da 5-lipoxicrenase, in vitro: actividades anti-inflamatória e anti-alércrica A fracção sobrenadante a 100 000 x g de Homogenato de Célula de Leucemia Basofílica de Ratazana (RBL-1) serve como fonte da enzima 5-lipoxigenase. A enzima é incubada com ácido (l-14c)-araquidónico e Ca++ na presença e ausência de composto de teste. 0 produto de 5-lipoxigenase/ ácido 5-hidroxieicosatetraenóico (5-HETE), é separado por cromato- grafia de camada fina e medido por radioactividade. Um composto que inibe a síntese por 30 % ou mais é considerado activo a essa concentração. As doses de rastreio inicial são de 1 x IO*"4 M. Quando o composto inibe mais do que 50 % -4 da síntese do 5-HETE a 10 M, essse composto é testado em níveis de dose múltipla para determinar o valor IC5Q (concentração inibidora para inibir 50 %).

Os compostos do invento são avaliados em relação à actividade de modulação de superóxido de acordo com o seguinte processo de ensaio:

Geração de superóxido de neutrófilo humano: A geração de superóxido por neutrófilos estimulados por formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP) foi quantificada pela redução do citocromo C (Badwey, J. A., Curnutte, J. T. e Karnovsky, M. L., ácidos gordos cis-poliinsaturados induzem altos níveis de produção de superóxido por neutrófilos humanos; J. Biol. Chem.. 256. 12640-12643, 1981). A 5 milhões de neutrófilos em 2,85 mL de tampão fosfato de Krebs-Ringer, pH = 7,2, foram adicionados 5 /iL de inibidor (em DMSO a 10 %/tampão) e 50 /JL de ferricitocromo C (5 mM, armazém) e foram pré-incubados durante 3 minutos a 37 °C. -14-

As medidas de absorção a 550 nm foram registadas no início da pré-incubação. Foram adicionados 50 μL (6 μΜ, armazém) para iniciar a reacção. Foi atingido um patamar dentro de 3 minutos e esta leitura - leitura inicial (antes da adição de FMLP) - foi usada para calcular as nanomoles de superóxido gerados com base num coeficiente de extinção molar de 2,1 x 10^ cm "''•moí

Isolamento de neutrofilos humanos: »

Foram isolados neutrofilos humanos a partir de colheitas de sangue recente de dadores saudáveis. Dois mL de dextrano a 5 % (PM 200 000-300 000) em salina foi adicionado a alíquotas de 10 mL de sangue, misturados, e colocados em reposo durante 45 min a 37 °C. Aproximadamente 8-10 mL de suspensão de glóbulos brancos do plasma da sedimentação de dextrano foram acamados em 3 mL de Ficol-paque num tubo de 15 mL e centrifugados a 400 g durante 30 minutos. O sobre-nadante, que continha plasma e plaquetas, foi separado por aspiração e as plaquetas, que continham predominantemente neutrofilos, foram ressuspensas em 1 mL de salina. A suspensão foi transferida para um tubo limpo e combinado com outros alíquotas de sangue tratado de modo senelhante. A suspensão combinada foi centrifugada a 350 g durante 5 min e o sobrenadante foi separado. O pelete foi ressuspenso em 5 mL de NaCl a 0,05 % com uma pipeta de Pasteur plástica durante 25 segundos para lisar por contaminação os glóbulos vermelhos e, em seguida, foi adicionado 5 mL de NaCl a 1,75 % para recuperação da isotonicidade. 0 processo de lise dos glóbulos vermelhos foi repetido, as células suspensas em tampão apropriado (dependendo do ensaio) e contadas. -15- -15-

Para comparação, foi utilizado o composto de fórmula IV, um conhecido inibidor de 5-lipoxigenase descrito na U.S. 4 663 333.

Os resultados em relação a alguns compostos do presente invento são indicados na Tabela 1 seguinte:

P i TABELA 1

Composto do Exemplo Número Inibição de 5-lipoxigenase IC50(MM) Inibição de superóxido induzida por FMLP ICS0(MM) 9, 11 4,9 11 18 3,5 10 17 4,3 10 4, 5 3,3 5 1/4 12 inibição de 12 % -50 a 100 μΜ 13 inibição de 4 % -30 a 100 μΜ Fórmula IV Estimula a (comparação) 0,32 geração de 1 _ superóxido _ 0 composto de fórmula IV inibiu a 5-lipoxigenase, mas não inibiu a geração de superóxido. Pelo contrário, estimulou a geração de superóxido. A 5 μΜ induziu os neutrófilos a um crescimento de 50 % de superóxido e a 10 μΜ o composto de fórmula IV induziu um crescimento de 227 % no superóxido gerado. Estes dados indicam que a geração de superóxido não depende da 5-lipoxigenase e que a capacidade de um composto de inibir a 5-lipoxigenase não é preditora da sua capacidade de inibir a geração de superóxido. A geração de superóxido induzida pelo Complemento C5a é também inibida pelos compostos do presente invento.

Os seguintes exemplos não limitativos ilustram ainda os detalhes para a preparação dos compostos utilizados na prática do presente invento. Os que são peritos na técnica compreenderão e apreciarão de pronto que variações conhecidas das condições e processos nos métodos preparativos seguintes podem ser utilizados. Todas as temperaturas estão em grau Celcius a menos que se indique de outra maneira. Os pontos de fusão são determinados num aparelho de ponto de fusão de . Thomas-Hoover e não estão corrigidos.

Exemplo 1 3,5-bis(l,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenil-tiocianato HO·

SCN A um frasco de 5 L de fundo redondo de três tubulado-ras, equipado com um agitador mecânico , entrada de gás, termómetro e saída de gás, foi adicionado 2.6-di-tert-butilfenol (474 g; 2,30 mol), tiocianato de amónio (76,12 g; 4,83 mol) e metanol (1200mL). A mistura de reacção foi agitada e arrefecida até 0 °c num banho de água/gelo). Mantendo a temperatura em 0 até 10 °C, foi lentamente borbulhado cloro gasoso através da mistura durante cerca de 1 hora apôs o que a mistura de reacção ficou de uma cor amarela heterogénea. Foi em seguida borbulhada amónia através da mistura de reacção durante cerca de 1,5 horas, mantendo a mistura de reacção a uma temperatura entre 0 e 10 °C. A mistura de reacção foi agitada durante mais 1 hora a 0 °C, vertida em 2 L de água destilada fria e refrigerada durante a noite. A fase aquosa foi decantada e o sólido foi recebido em metanol, precipitado por adição de água, filtrado e seco durante 2 dias sobre pentóxido de fósforo. 0 sólido amarelo gomoso resultante foi recristalizado a partir de pentano e seco in vacuo para dar o produto na forma de um pó branco; p.f. 61,5-63 °C.

Análise calculada para C^H^NSO:

Teoria: C - 68,40; H - 8,03; N - 5,32; S - 12,17;

Encontrado: C - 68,85; H - 8,05; N - 5,29; S - 12,12.

Exemplo 2 2.6-bis(1.1-Dimetiletil)-4-mercaptofenol qcHjjj

3,5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxi-feniltiocianato (55 g; 0,209 mol) foi dissolvido em acetona (200 mL) sob uma atmosfera de árgon. Foi adicionada água (7,6 g; 0,42 mmol) e a mistura de reacção foi arrefecida até 0 °C. Foi adicionada gota a gota durante um período de 1 hora trietilfosfina (24,7 g; 0,209 mol) e, em seguida, aquecida até â temperatura ambiente com

agitação. A solução foi concentrada, os solventes foram removidos e o óleo resultante foi purificado por cromatografia sobre sílica. As fracções que continham o tiol foram combinadas e os solventes foram removidos para se obter um pó branco que recris-talizou a partir de metanol/ãgua e que foi seco para produzir 43,3 g do produto desejado. A análise por RMN confirmou a identidade do produto.

Exemplo 3

I Ácido Γ Γ2-Γ Γ3.5-bis(1.1-dimetiletil)-4-hidroxifenill-tioletilltiolacético, sal monossôdico ααωι

C(CHj)j Ácido mercaptoacético (1,3 g; 0,0144 mol) foi adicionado a uma solução de etóxido de sódio, preparada a partir de sódio (0,66 g; 0,0228 mol) em álcool etílico (25 mL). Após agitação durante 1 hora, foi adicionado de uma só vez l-bromo-2-cloroetano (6 mL; 0,072 mol) e a solução foi agitada durante 2 horas. Depois de refluxo durante 4 horas, o excesso de l-bromo-2-cloro-etano foi removido por um evaporador rotativo. Foi adicionado álcool etílico (50 mL) ao resíduo e o sal de sódio de 2,6-bis(l,l--dimetiletil)-4-mercaptofenol preparado a partir de sódio (0,33 g; 0,0144 mol) e 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-mercaptofenol (3,43 g; 0,0144 mol) em álcool etílico (25 mL) foi adicionado por meio de uma cânula. Após agitação durante 16 horas, a mistura foi refluxada durante 1 hora, arrefecida até à temperatura ambiente e -20-

0 álcool 0 resíduo combinado, 0 resíduo O sólido para dar o foi adicionada água (50 mL) com agitação rápida, etílico foi removido com um evaporador rotativo, aquoso foi extraído com acetato de etilo (2 x 100 mL), seco sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado, foi cristalizado a partir de acetato de etilo/hexano. foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano composto mencionado em título.

Análise calculada para C18H2703S2Na (378,54):

Teoria: C - 57,11 H - 7,19; S - 16,94;

Encontrado: C - 56,75; H - 7,24; S - 16,84.

Exemplo 4 Ácido ΓΓ2-Γ Γ3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenill tioletilltiolacético acHjh

acHjb

P 0 composto mencionado em título-do Exemplo 3 (0,90 g) foi dissolvido em água (40 mL), acidificado com ácido clorídrico a 10 % e extraído para acetato de etilo (2 x 50 mL). Os extrac-tos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e 1 concentrados utilizando um evaporador rotativo para dar um óleo. 0 óleo foi cristalizado a partir de hexano para dar o composto mencionado em título, p.f. ca. 86 °C.

Análise calculada para ci8H28°3S2 (356*54):

Teoria: C - 60,64 H - 7,92; S - 17,98;

Encontrado: C - 90,93; H - 7,87; S - 17,81.

Exemplo 5 O composto mencionado em titulo do Exemplo 4 foi também preparado pelo processo do Exemplo 3 sem o isolamento do sal de sódio. A solução de acetato de etilo que continha o sal de sódio foi tratada com ácido clorídrico a 10 %, agitada durante 30 minutos e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada utilizando um evaporador rotativo para dar um sólido que foi recristalizado a partir de hexano.

Análise calculada para ci3H28°3S2 (356'54):

Teoria: C - 60,64 H - 7,92; S - 17,98;

Encontrado: C - 60,73; H - 7,84; S - 17,92.

Exemplo 6

2.6-bis(1,i-Dimetiletil) -4-Γ(2-hidroxi-l-metilpropil) tio!fenol

(18,2 g; 2,6-bis(1,1-Dimetiletil) -4-mercaptofenol -22-

0,076 mol) foi adicionado a uma solução de etóxido de sódio, preparada recentemente a partir de sódio (3,5 g; 0,15 mol) em álcool etílico (100 mL) e agitado durante 1 hora. Após arrefecimento até 5 °C com um banho de gelo, foi adicionado trans-2,3-e-poxibutano (5,0 g; 0,069 mol) e o banho de gelo foi removido. Após agitação durante 5,5 horas, a mistura de reacção foi vertida em ácido clorídrico a 10 % (50 mL). O álcool etílico foi removido utilizando um evaporador rotativo e o resíduo aquoso foi extraído com acetato de etilo (2 x 75 mL). Os extractos foram combinados, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados até um óleo laranja. 0 produto foi purificado por cromato-grafia sobre sílica para dar um sólido amarelo que foi recrista- lizado a partir de hexano para dar um sólido branco, p.f. ça. 73 °C.

Análise calculada para c18H3q°2S (31°/5):

Teoria: C - 69,63 H - 9,74; S - 10,33;

Encontrado: C - 69,75; H - 9,60; S - 10,35.

Exemplo 7

I 2,6-bis(1,1-Dimetiletil)-4-Γ(2-hidroxietil)tio]fenol -p- «CHjfc

Ho

,OH

Trietilamina (0,42 g; 0,0042 mol), 2-bromoetanol (0,52 g; 0,0044 mol) e o composto mencionado em título do Exemplo 2 (1,0 g; 0,0042 mol) foram agitados em cloreto de metileno -23-

(50 mL) durante 20 horas. A mistura de reacção foi condensada e foi adicionado acetato de etilo (25 mL) ao resíduo. Após filtração do sólido branco, o filtrado foi concentrado e o produto foi purificado por cromatografia sobre sílica, p.f. ça. 66 °C.

Análise calculada para cigH26°2S (282,4):

Teoria: C - 68,04 H - 9,28; S - 11,35;

Encontrado: C - 67,98; H - 9,20; S - 11,24.

Exemplo 8 Ácido_f 2-ΓΓ3,5-bis(1.1-dimetiletil)-4-hidroxifenin- tioletoxilacético

,COjH Ácido cloroacético (1,88 g) foi adicionado a uma solução do produto do Exemplo 7 (5,64 g) em álcool tert-butílico. tert-Butóxido de potássio (8,96 g) foi adicionado e a mistura foi refluxada durante 22 horas. A mistura de reacção foi tornada básica com bicarbonato de sódio a 5 % e extraída com éter etílico (3 x 50 mL). Os extractos de NaHCO^ foram acidificados até cerca de pH = 2 com HC1 1 N e extraídos 3 vezes com éter etílico (100 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com água, duas vezes com água salgada saturada, secos sobre sulfato de sódio e o solvente foi removido utilizando um evapora-dor rotativo para dar o produto impuro. O produto foi purificado por cromatografia sobre sílica, p.f. ça. 86 °C. -24-

9,42; 9,46.

Análise calculada para cigH28°4S (340'47) Teoria: C - 63,50 H - 8,29; S -Encontrado: C - 63,52; H-8,02; S -

Exemplo 9 Ácido T2S*-r Γ3,5-bis(1.1-dimetiletil)-4-hidroxifenin-tiol-lR -metilpropoxilacético

Partindo com o 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-[(2-hidroxi-l-metilpropil)tio]feno1 do Exemplo 6 e utilizando o método do Exemplo 8 obteve-se o composto mencionado em título, p.f. ca. 89-92 °C; esp. massa 368 (M+).

I

Exemplo 10 2,6-bis(1,1-Dimetiletil)-4-Γ(2S*-hidroxi-lR*-metilpro-pil)tiolfenol (±)

Um recipiente com purga de árgon foi carregado com 54 L de metanol anidro que foi em seguida purgado com árgon durante 5 min. Cerca de 12 L de metanol foi separado por destilação à pressão atmosférica e o restante metanol foi transferido para recipientes de pressão sob árgon. O recipiente com purga de árgon seco foi carregado com 3,03 kg de metóxido de sódio seguido por 29,7 kg de metanoldos recipientes de pressão. A mistura foi agitada'clurante 10 min, e foi adicionado 6,7 kg de 2,6-bis(1,1--dimetiletil)-4-mercaptofenol em pequenas quantidades sob árgon. A mistura foi agitada durante 1 h à temperatura ambiente e arrefecida até 0 °C ponto em que foi adicionado 2,23 kg' de trans-2 f3-epoxibutano seguido por um enxaguamento de 2,7 kg de metanol. A mistura foi agitada a 0 °C durante 4 h e, em seguida, a menos do que 25 °C durante 16 h. Quando a reacção se completou, conforme indicado por cromatografia de camada fina, a mistura de reacção foi adicionada a 59 L de ácido clorídrico 1 N e a solução aquosa foi extraída duas vezes com um total de 89 L de acetato de etilo. A fase orgânica combinada foi lavada uma vez com 34 L de solução aquosa diluída de cloreto de sódio e uma vez com 13 L de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi seca sobre 3,5 kg de sulfato de magnésio anidro e foi filtrada. O solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. 0 produto cru foi dissolvido em 6,7 L de n-hexano em refluxo e a solução foi arrefecida até 5 °C. 0 sólido foi recolhido por filtração, lavado com n-hexano frio (a cerca de o °c) e seco a 50 °c num forno de vácuo para dar 7,44 kg •fç (58 % do teórico) de 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-[(2S -hidroxi--IR -metilpropil)tio]fenol (±).

Exemplo 11

Um recipiente seco com purga de ãrgon foi carregado com 1,6 kg de hidreto de sódio (dispersão a 60 % em óleo) que foi em seguida lavado três vezes com um total de 21 kg de n-heptano. 0 recipiente de reacção foi arrefecido até -20 °C e foi adicionado 41 L de tetra-hidrofurano (THF) seco sob ãrgon. Foi adicionada lentamente uma solução de 4,0 kg de 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-[(2S -hidroxi-lR -metilpropil)tio]fenol (±) em 16 L de tetra-hidrofurano à suspensão de hidreto de sódio e a mistura foi aqueci-' da até 0-5 °C e agitada durante 1,5 h. 0 tetra-hidrofurano foi removido a pressão reduzida e foi adicionado sob ãrgon 12 L de dimetilsulfóxido. Uma solução de 1,9 kg de cloroacetato de sódio em 40 L de dimetilsulfóxido foi adicionada e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante aproximadamente 15 h. Quando a reacção se completou, conforme indicado por cromatogra-fia de camada fina, a mistura de reacção foi adicionada a, aproximadamente, 178 L de água a 5-10 °C e a solução aquosa foi extraída duas vezes com um total de 60 L de n-heptano. A fase aquosa foi acidificada com 14 L de ácido clorídrico 4 N e foi extraída três vezes com um total de 95 L de acetato de etilo. A fase orgânica combinada foi lavada duas vezes com um total de 74 L de água e uma vez com 20 L de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi seca sobre 2,0 kg de sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. O produto foi dissolvido em 40 L de n-hexano em refluxo e a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. 0 produto foi recolhido por. filtração, lavado com um total de 20 L n-hexano e seco à temperatura ambiente num forno de vácuo para dar 4,27 kg (90 % do teórico) de ácido [2S -[[3,5-bis(1,l-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metilpro-poxi]acético (±) (primeira colheita). O filtrado de hexano foi concentrado sob vácuo para dar um adicional de 0,23 kg de produto (4,80 % do teórico).

Exemplo 12 Ácido F2S*-r Γ3,5-bis (1.1-dimetiletil) -4-hidroxifenil'| - • Λ sulfinill-iR -metilpropoxilacético (t)

Ácido m-cloroperoxibenzõico (0,87 g; 0,0051 mol) foi adicionado a uma solução fria (0 °C) de ácido [2S -[[3,5-bis(l,l- Λ -dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-lR -metilpropoxi]acético (1,5 g; 0,0041 mol) em cloreto de metileno (50 mL) e a mistura foi agitada durante 4 horas. Depois de filtração, o filtrado foi lavado com uma solução saturada de tiossulfato de sódio (50 mL), seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado até um sólido''oleoso. 0 produto foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica e cristalizado a partir de acetato de etilo hexano. A estrutura foi suportada por RMN, espectroscopia de infravermelho e análise elementar.

Análise calculada para c2oH32°5S (MM: 384,54):

Teoria: C - 62,47 H - 8,39; S - 8,34;

Encontrado: C - 62,16; H - 8,27; S - 8,00. -29-

Exemplo 13 & ácido T2S “lT3,5-bis(l,l-aimetiletil)-4-hidroxifenill- jfc sulfonill-lR -metilpropoxilacético (±)

Ácido m-cloroperoxibenzôico (1,75 g; 0,0107 mol) foi “fi » adicionado a uma solução fria (0 °C) de acido [2S -[[3,5-bis(1,1--dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metilpropoxi]acético (1,5 g; 0,0041 mol) em cloreto de metileno (50 mL) e a mistura foi agitada durante 4 horas. Depois de filtração, o filtrado foi lavado com uma solução saturada de tiossulfato de sódio (50 mL), seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado até um sólido "'oleoso. 0 produto foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica e cristalizado a partir de acetato de etilo -hexano. A estrutura foi suportada por RMN, espectroscopia de infravermelho e análise elementar.

Análise calculada para

Teoria: Encontrado:

C - 59,98 H C - 59,89; H

OgS (MM: - 8,05; - 7,82; 400,54): S - 8,01; S - 7,94.

-30-

Exemplo 14 f2S*-r r3,5-bis(1,í-dimetiletil)-4-hidroxifenintiol- ff -IR -metilpropill-ΓIR-(l-naftalenil)etillcarbamato ou f 2R*-r Γ3,5-bis (l. l-dimetiletil) -4-hidroxifenin tiol --IS -metilpropin-ΓIR-íl-naftalenil)etillcarbamato

2,6-bis(1,1-Dimetiletil)-4-[(2-hidroxi-l-metilpropil)-tiojfenol (6,3 g; 0,0203 mol) e (R)-(l)-1-(l-naftil)tio]fenol isocianato foram aquecidos em tolueno (75 mL) durante 20 horas. Os carbamatos foram separados por cromatografia sobre gel de sílica (tolueno) para dar o Isómero A (primeiro a separar) e o"· Isómero B (último a separar).

Exemplo 15 2,β-bis(1,l-Dimetiletil)-4-Γ(2S*-hidroxi-iR*-metilpro-pil)tiolfenol ou 2,6-bis(1,1-Dimetiletil)-4-Γ(2R*-hidroxi-ls*-metilpro-pil)tiolfenol

Triclorossilano (1,02 g; 0,00752 mol) foi adicionado gota a gota por meio de uma seringa a uma solução agitada do Isómero A (do Exemplo 14) (1,80 g; 0,00375 mol) e: trietilamina (0,75 g; 0,00757 mol) em benzeno (25 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 28 horas. A mistura de reacção foi vertida numa mistura de acetato de etilo (50 mL) e cloreto de amónio saturado (50 mL), agitou-se durante 15 minutos e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada até um óleo. 0 produto foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica e a estrutura foi verificada por RMN.

-32- r t X

Exemplo 16 λ 2.6- bis (1,1-Dimetiletil)-4-H2S -hidroxi-lR -metilpro-pil)tiolfenol ou 2.6- bis 11.1-Dimetiletil) -4-Γ (2R*-hidroxi-lS*-metilpro-pil)tiolfenol

Triclorossilano (0,79 g; 0,00584 mol) foi adicionado gota a gota por meio de uma seringa a uma solução agitada do Isómero'B (do Exemplo 14) (1,40 g; 0,00292 mol) é trietilamina (0,59 g; 0,00584 mol) em benzeno (40 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 28 horas. A mistura de reacção foi vertida numa mistura de hexano (100 mL) e cloreto de amónio saturado (15 mL), agitou-se durante 15 minutos e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada até um óleo. O produto foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica. A estrutura foi suportada por RMN. t» ι

Exemplo 17

Preparação do Enanteómero (-): Ácido—r2S*-Γ Γ 3,5-bis(i,1-aimefeiiatiH-4-hidroxifenill -tiol-lR -metilpropoxil acêtier» {-)

ou ch3 t> CH3 » 0 composto do Exemplo 15 (Enanteómero A) (0,36 g; 0,00116 mol) em dimetilsulfóxido (1,5 mL) foi adicionado a uma mistura de hidreto de sódio (0,086 g; 0,00360 mol) em dimetilsulfóxido (1 mL). Depois de agitação durante 1 hora à temperatura ambiente, foi adicionado sal de sódio do ácido cloroacético (0,162 g; 0,00139 mol) e a mistura de reacção foi agitada durante 20 horas. A mistura de reacção foi vertida em água (10 mL) e lavada com hexano (25 mL). A camada aquosa foi acidificada com ácido clorídrico a 10 % e o produto foi extraído para acetato de etilo. A camada de acetato de etilo foi lavada com agua (10 mL) , seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada até um óleo. O produto foi purificado por cromatografia sobre gel de silica. A estrutura foi suportada por EMN, espectroscopia de infravermelho, rotação óptica ([“^355 = “174°, CHCl^) e análise elementar.

Análise calculada para c2oH32°4S (MM: 368,5):

Teoria: C - 65,18 H - 8,75;

Encontrado: C - 65,33; H - 9,09. * * ι

Exemplo 18

Preparação do Enanteómero (+): Ácido T2S*-Γ Γ3 #5-bis f 1.i—díme-failetil)-4-hidroxifenill-tiol-lR -metilpropoxilacético 1+)

ou

CH3

T

g/N^OCHaCOOH m m CH, » O composto do Exemplo 16 (Enanteómero B) (0,19 g; 0,000613 mol) em dimetilsulfóxido (DMSO) (2,5 mL) foi adicionado a uma mistura de hidreto de sódio (0,045 g; 0,00180 mol) em dimetilsulfóxido (1,5 mL). Depois de agitação durante 1 hora à temperatura ambiente, foi adicionado sal de sódio do ácido . cloroacético (0,086 g; 0,000736 mol) e a mistura de reacção foi agitada durante 64 horas. A mistura de reacção foi vertida em água (10 mL) e lavada com hexano (25 mL) . A camada aquosa foi acidificada com ácido clorídrico a 10 % e o produto foi extraído L ** i L ** i

-3 6- para acetato de etilo. A camada de acetato de etilo foi lavada com água (10 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada até um óleo. 0 produto foi purificado por cromato-grafia sobre gel de sílica. A estrutura foi suportada por EMN, espectroscopia de infravermelho, rotação óptica ([α3365 = +168°, CHCl^) e análise elementar.

I

Análise calculada para c2oH32 Teoria: C - 65,18 H Encontrado: C - 65,03; H 04S (MM: - 8,75; - 8,95. 368,5): Í

Claims

Reivindicações
12. Método de inibição de geração de superóxido, caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de um tal tratamento de uma quantidade de um coniposto de fórmula I: ...... ..

1 2 em que R e R são iguais ou diferentes e, independentemente, 1 representam tert-alquilo ou fenilo, Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 10 átomos de carbono, X 2 representa enxofre ou oxigénio, Alk representa alquileno de cadeia "linear ou ramificada de 1 até 4 átomos de carbono; em é 0, 1 ou 2; ou de um seu sal ou estereoisómero ou isómero geométrico farmaceuticamente aceitável, que é eficaz para inibir a geração de superóxido; sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia.
22. Método de acordo com a reivindicação 1 de inibição de geração de superóxido, caracterizado por compreender a a**

administração a um mamífero com necessidade de um tal tratamento de uma quantidade de um composto de fórmula

I 3 4... . . em que R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono, X representa enxofre ou oxigénio e m é 0, 1 ou 2; ou de um seu sal ou estereoisómero ou isómero geométrico farmaceuticamente aceitável, que é eficaz para inibir a geração de superóxido. 3 â. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ter a fórmula: »

σο i «- » Λ

4ã. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ser o ácido [2S -[[3,5-bis(l,l-dime-tiletil)-4-hidroxifenil] tio]-lR*-metilpropoxi] acético (±) . 5 a. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ser o ácido [ [2-[ [^S-bisfl/l-dime-tiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]acético. 6®. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ser o ácido [2S -[ [3,5-bis (1,1-dime-tiletil)-4-hidroxifenil] sulfinil]-lR -metilpropoxi] acético (±) . 7 a. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ser o ácido [2S -[[3,5-bis(1,1-dime-tiletil) -4-hidroxifenil] sulfonil] -IR -metilpropoxi] acético (±) . 8â. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri- •j|p zado por o referido composto ser o ácido [2S -[[3,5-bis(1,1-dime- £ tiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metilpropoxi]acético (-). 9®. Método de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por o referido composto ser o ácido [2S -[[3,5-bis(1,1-dime- •jç tiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metilpropoxi]acético (+). Lisboa, 5 de Setembro de 1991

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