PT97101B - Processo para a preparacao de lipossomas heterovesiculares - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE LIPOSSOMAS HETEROVESICULARES

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a vesículas lipídicas ou lipossomas heterovesiculares, aos processos para a sua preparação e encapsulação de várias substâncias nestes e ao tratamento de doentes com os mesmos.

Antecedentes da Invenção

Os lipossomas multivesiculares são um dos três tipos principais de lipossomas, primeiramente preparados por Kim et al.,

I Biochim. Biophys. Acta, 782 ( 1983) 339-348 7 e são notavelmente diferentes dos lipossomas uni lamelares £Huang, B í õ c h è mestry, 8_ (1969) 344-352; Kim et al., Biochim. Biophys. Acta,

646, ( 1981 ) 1-10,7 θ multilamelares Z?Bangham et al., J. Mol.

Bio., 13 ( 1965) 238-252 7 pelo facto de possuírem no seu interior múltiplas câmaras aquosas não concêntricas. As técnicas descritas anteriormente para a preparação de lipossomas referem-se à produção de lipossomas não multivesiculares; por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas N⁹s. 4 522 803- Lenk; 4 310 506 - Baldeschwieler; 4 235 871 - Papahadjopoulos; 4 224 179 - 4 078 052 - Papahadjopoulos; 4 394 372 - Taylor;

f

308 166 - Marchetti; 4 485 054 - Mezei; e 4 508 703 - Redziniak. Para uma revisão completa dos vários processos de preparação de lipossomas vide Szoka et al., Ann. Rev. Bíophys. Bioeng., 9 (1980) 467-508.

Os lipossomas heterovesiculares são vesículas lipídicas ou lipossomas com múltiplas câmaras aquosas internas com, pelo menos, duas substâncias diferentes, encapsuladas em câmaras separadas em um lipossoma. As vesículas lipídicas ou lipossomas com múltiplas câmaras aquosas internas incluem, mas não estão limitadas a, lipossomas multi1 amei ares, lipossomas paucilamelares estáveis e lipossomas multivesículares. E muito vantajoso proporcionar um sistema de libertação de um lipossoma no qual duas ou mais substâncias diferentes estão encapsuladas em compartimentos separados de um lipossoma individual em vez de estarem encapsulados conjuntamente em cada compartimento do lipossoma.

Sumário da Invenção

A composição da presente invenção contém lipossomas heterovesiculares, isto é, vesículas lipídicas ou lipossomas _:©onr múltiplas câmaras aquosas internas onde duas ou mais substâncias de composições diferentes estão encapsuladas separadamente, em câmaras diferentes em um lipossoma.

Resumidamente, o processo da presente invenção consiste em preparar uma emulsão de água-em-1ípido mediante a dissolução de lípido anfipático em um ou mais dissolventes orgânicos, para obter o primeiro componente lipídico, adição de um primeiro componente aquoso miscível incluindo uma substância a enca/

-3psular, de preferência na presença de ácido clorídico, e em seguida emulsionar mecanicamente a mistura. Na emulsão, as gotículas de água suspensas no dissolvente orgânico formarão as câmaras aquosas internas e a monocamada de lípidos anfipáticos que reveste as câmaras aquosas tornar-se-á no folheto da membrana de camada dupla do produto final. Forma-se em seguida um segundo componente lipídico mediante a dissolução dos lípidos anfipáticos num dissolvente orgânico volátil e adição de um segundo componente aquoso miscível incluindo uma segunda substância para ser encapsulada, de preferência na presença de ácido clorídrico. Prepara-se, então, uma segunda emulsão. Forma-se depois uma emulsão quimérica pela associação da primeira com a segunda emulsão. A emulsão quimérica é constituída por múltiplas gotículas de água suspensas num dissolvente orgânico no qual as substâncias das duas composições diferentes estão dissolvidas separadamente em diferentes gotículas aquosas. A emulsão quimérica é depois imersa num. terceiro componente aquoso imiscível, contendo, de preferência, um ou mais agentes osmóticos não iónicos e um agente de neutralização do ácido de força iónica baixa e, depois, dividindo-o mecanicamente para formar esférulas de dissolvente suspensas no terceiro componente aquoso. As esférulas de dissolvente contêm múltiplas gotículas aquosas estando as substânci as das duas composições diferentes cada uma dissolvida separadamente em diferentes gotículas aquosas em cada esférula de dissolvente. Evapora-se o dissolvente orgânico volátil das esférulas, de preferência fazendo passar uma corrente de gás sobre a suspensão. Quando o dissolvente se evapora completamente, as esférulas convertem-se em lipossomas heterovesiculares com múltiplas câmaras aquosas internas nas quais estão encapsuladas duas substâncias de composições diferentes, separada·

mente, em câmaras diferentes de um lipossoma.

uso de ácido clorídrico com um agente de neutralização ou outros cloridratos, os quais reduzem a velocidade de libertação, é preferencial para grande eficiência de encapsulação e para, uma baixa velocidade de libertação das moléculas encapsuladas em fluidos biológicos e in vivo. Também é preferível utilizar um agente neutralizante de força iónica baixa para impedir que as esférulas de dissolvente adiram umas às outras.

Deste modo, constitui um objectivo desta invenção proporcionar uma vesícula lipídica heterovesicular ou um lipossoma contendo pelo menos duas substâncias de composições diferentes, cada uma encapsulada separadamente em câmaras diferentes da vesícula ou do lipossoma.

E ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um lipossoma heterovesicular contendo, pelo menos, duas substâncias com actividade biológica de composições diferentes, estando cada uma delas encapsulada separadamente em câmaras do lipossoma na presença de ácido clorídrico ou de outros cloridratos, os quais retardam a respectiva libertação.

E ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um lipossoma heterovesicular contendo, pelo menos, duas substâncias com actividade biológica com composições diferentes, estando cada uma encapsulada separadamente em câmaras do lipossoma na presença de ácido clorídrico ou de outros cloridratos e de um agente de neutralização.

Constitui ainda um objectivo da presente invenção proporcionar processos para a preparação destas vesículas lipídicas ou lipossomas heterovesiculares.

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-5Ζ

Ε ainda um objectivo da presente invenção proporcionar processos para a preparação destas vesículas lipídicas ou lipossomas heterovesiculares, que consistem em dispor de um primeiro componente 1ipídico dissolvido em um ou mais dissolventes orgânicos e adicionar ao componente lipídico um primeiro componente aquoso imiscível contendo uma primeira substância destinada a ser encapsulada, formando uma primeira emulsão de água-em-óleo, dos dois primeiros .componentes imiscíveis; dispor de um segundo componente lipídico dissolvido em um ou mais dissolventes orgânicos e adicionar ao componente lipídico um segundo componente aquoso imiscível contendo uma segunda substância destinada a ser encapsulada; formar uma segunda emulsão de água-em-óleo dos dois segundos componentes imiscíveis; formar uma emulsão quimérica por associação da primeira emulsão de ãgua-em-óleo com a segunda emulsão de ãgua-em-óleo, transferir e imergir a emulsão quimérica num terceiro componente aquoso imiscível; dispersar a emulsão quimérica para formar esférulas de dissolvente contendo múltiplas gotículas do primeiro componente aquoso contendo a primeira substância e do segundo componente aquoso contendo a segunda substância; e evaporar o dissolvente orgânico das esférulas de dissolvente para se formarem vesículas lipídicas heterovesiculares ou lipossomas.

Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um processo pelo qual diversas substâncias com actividade biológica hidrófilas possam ser encapsulados separadamente em câmaras de vesículas lipídicas ou lipossomas heterovesicu1 ares.

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Ε ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de um doente com pelo menos duas substâncias biologicamente activas, separadas, com composições diferentes, mediante a respectiva administração a um doente, encapsuladas separadamente nas câmaras de uma vesícula ou lipossoma heterovesicular.

Outros objectivos e vantagens da presente invenção serão evidenciados através da memória descritiva e das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1 a 8 são diagramas esquemáticos que representam a preparação de uma vesícula ou lipossoma heterovesicular.

Descrição de Aspectos Preferidos

A designação lipossomas multivesiculares é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações para significar vesículas lipídicas microscópicas fabricadas pelo homem constituídas por membranas de duas camadas lipídicas encerrando múltiplas câmaras aquosas, não concêntricas, que contêm todas o mesmo componente. Em contraste, a designação lipossomas heterovesiculares como utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações significa vesículas lipídicas microscópicas constituídas por membranas de duas camadas lipídicas, encerrando múltiplas câmaras aquosas, em que pelo menos duas das câmaras contêm separadamente substâncias de diferentes composições. As vesículas lipídicas microscópicas incluem mas não estão limitadas a lipossomas mui ti 1 amei ares, lipossomas /

pauci1 amei ares estáveis e lipossomas multivesículares.

A designação emulsão quimérica é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações para significar uma emulsão constituída por múltiplas gotículas de ãgua suspensas num dissolvente orgânico, estando as substâncias de duas composições diferentes dissolvidas separadamente em diferentes gotículas aquosas.

A designação esférulas de dissolvente é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações para significar uma gotícula esferóide microscópica dum dissolvente orgânico entre as quais existem múltiplas gotículas mais pequenas de solução aquosa. As esférulas de dissolvente estão suspensas e totalmente imersas numa segunda solução aquosa.

A designação lípido neutro significa óleos ou gorduras que não têm capacidade para formarem membrana por si mesmos e carecem de um grupo de cabeça hidrófilo.

A designação lípidos anfipãticos refere-se àquelas moléculas que têm um grupo de cabeça hidrófilo e um grupo de cauda hidrófóbio e que têm capacidade para formarem membrana.

As composições da presente invenção são vesículas lipídicas ou lipossomas heterovesiculares que contêm pelo menos duas substâncias de composições diferentes, encapsuladas separadamente em câmaras diferentes da vesícula ou do lipossoma.

Muitas ou variadas substâncias biológicas podem ser incorporadas por encapsulação nos lipossomas mui tivesiculares. Estas incluem fãrmacos e outros tipos de materiais, como, por exemplo, DNA, RNA, proteínas de várias espécies hormonas proteínicas produzidas por tecnologia de recombinação de DNA efi-8cazes nos seres humanos, factores de crescimento hematopoiético, monocinas, linfocinas, factor de necrose tumoral, inibina, factor de inibição de desenvolvimento de tumores 0/ e

substância inibidora mulleriana, factor de crescimento do nervo, factor de crescimento de fibroblastos, factor de crescimento derivado de plaquetas, hormonas da pituitária e da hipofisal incluindo LH e outras hormonas de libertação, calcitonina, proteínas que actuam como imunogénios para vacinação e sequências de DNA e de RNA.

Quadro 1 seguinte inclui uma lista de substâncias com actividade biológica representativas que podem ser encapsuladas em lipossomas heterovesiculares na presença de um cloridrato e que são eficazes nos seres humanos.

Quadro 1

Anti asmáticos

Anti arrítmi cos

Tranqui1izantes metaproterenol aminofi1ina teofi1ina terbutalina tegretol efedrina i soproterenol adrenalina norepi nefri na propanolol atenolol verapami1 captopri1 isossorbido clorpromazi na benzodiazepina butirofenonas hidroxizinas meprobamato penotiazinas reserpi na tioxanti nas

Glicósidos cardiotónicos Hormonas

Esteróides digitálicos digitoxi na lanatosido C antidiurética corticosterói des testosterona predni sona triancinolona hidrocorti sona

digoxina	estrogéneos tiróide crescimento ACTH progesterona gonadotropina mineralocorticóide LH LHRH FSH calcitonina	dexametasona betametosona predni solona
Anti-hi potensores	Anti di abéti cos	Anti-histamínicos
apresoli na	Diabenese	piribenzamina
atenolol	insulina	clorfeniramina difenidrami na
Anti parasitários	Citostãticos	Sedativos e Analgésicos
praziquantel	azatioprina	morfina
metronidazol	bleomicina	di1audi d
pentamidina	ciclofosfamida adriamicina daunorubici na vincristina metotrexato 6-TG 6-MP vinblastina VP-16 VM-26 ci splatina FU	codeína compostos de síntese similares à codeína demerol oximorfona fenobarbital barbituratos
Antibióticos	Immunoterãpicos	Vacinas
penici1ina	i nterferões	contra a gripe
tetraciclina	interleucina-2	sincicial respiratória
eritromicina	anticorpos monoclonais	contra vírus
cefaloti na	gamaglobulina	vacina contra Hemo-

philus influenza /

-10/

Antibióticos (Cont.) Antifúngicos

Antivirais imi penem cefotaxima carbenici1ina vancomicina gentamicina tobramicina piperaci1ina moxalactam amoxicilina ampicilina .

anfotericina B aciclovir e derivados miconazol dipéptido muramilo clotrimazole

Anti-hipertensores dopamina dextroanfitamina

Winthrop-51711 ri bavi ri na rimantadina/amantadina azidotimidina e derivados adenina-arabinosido inibidores da protease do tipo da amidina cefazolina cefadroxi1 cefoxiti na outros aminoglicosídos

Proteína e G1icoproteína

1i nfocinas interleuxinas - 1, 2, 3, 4, 5 e 6 citoei nas GM-CSF ⁷

Outros bloqueadores dos receptotores da superfície celular *

Ácidos nucleicos e análogos

M-CSF DNA

G-CSF RNA factor da necrose tumoral metiIfosfonatos e análogos inibina factor de crescimento tumoral substância dos inibidores Mullerianos factor do crescimento dos nervos factor do crescimento fibroblãstico factor do crescimento derivado das plaquetas factores de coagulação (por exemplo VIII, IX, VII) insulina activador do plasminogênio tecidual antigénicos da compatibilidade dos tecidos produtos oncogênicos /

-1/proteína básica da mielina colagénio fibronectina

1aminina outras proteínas obtidas por tecnologia de recombinação do DNA.

Um método preferido para a preparação de vesículas ou lipossomas heterovesiculares está representado no desenho a que seguidamente, se fará referência no passo 1 (Figura 1) uma primeira substância aquosa, de composição 10, destinada a ser encapsulada, é adicionada a um primeiro componente lipídico 12 no frasco-ampola 14. Este frasco-ampola 14 é fechado e no passo 2 (Figura 2) é misturado e agitado, sendo ligado à cabeça de um misturador de vórtex, para formar a primeira emulsão de água-em-óleo 16 contendo a primeira substância de composição 10 destinada a ser encapsulada. No passo 3 (Figura 3) um segundo frasco-ampola 14a, uma segunda solução aquosa 10a destinada a ser encapsulada é adicionada a um segundo componente lipídico 12a e o frasco 14a é fechado e no passo 4 (Figura 4) é misturado mediante ligação à cabeça de um misturador de vórtex para formar uma segunda emulsão de água-em-óleo 16, contendo a substância de composição 10a destinada a ser encapsulada.

No passo 5 (Figura 5) a primeira e a segunda emulsões de ãgua-em-óleo, 16 e 16a, são reunidas e misturadas, por exemplo, manualmente, de modo a formarem uma emulsão quimérica..

No passo 6 (Figura 6) uma parte da emulsão quimérica proveniente do passo 5 é introduzida em frascos-ampolas contendo um terceiro componente imiscível 18a de forma a esguichar rapidamente através de uma pipeta pasteur de ponta estreita para

dois frascos de, aproximadamente, 1,8 g, (one-dram), aqui representados como um.

No passo 7 (Figura 7) os frascos provenientes do passo 6 são agitados, por exemplo por um misturador de vórtex e, no passo 8 (Figura 8) a suspensão de esférulas de clorofórmio em cada frasco do passo 7 é transferida e o clorofórmio é evaporado, por exemplo por uma corrente de azoto gasoso, proporcionando, deste modo, o lipossoma heterovesicular que contém uma primeira substância em uma ou mais câmaras aquosas internas e uma segunda substância nas restantes câmaras aquosas internas dentro de cada lipossoma.

De preferência, cada uma das substâncias destinadas a ser encapsuladas é encapsulada na presença de um cloridrato tal como o ácido clorídrico, que torna mais lenta a velocidade de libertação do lipossoma ou da vesícula.

Tal como se referiu anteriormente, qualquer substância com actividade biológica, tal como as representadas no Quadro 1, pode ser encapsulada separadamente nas câmaras da vesícula ou lipossoma.

Os exemplos seguintes indicam os métodos presentemente preferidos de encapsulação de duas substâncias com composições diferentes em câmaras separadas de uma vesícula ou lipossoma.

Exemplo 1

Preparação de Lipossomas Heterovesiculares de didesoxicítidina/glucose

Passo 1: Introduziu-se a primeira substância aquosa (1 ml de uma solução a 20 mg/ml de didesoxicitidina em água com ácido clorídrico 0,1 N), num frasco-ampola de, aproximadamente, 3,9 / ..

-13g (one-dram) contendo o primeiro componente lipídico (9,3 yimoles de dioleiol-lecitina, 2,1^moles de dipalmatoil-fosfatidilglicerol, 15 yjmoles de colesterol, 1,8 jumoles de trioleína e 1 ml de clorofórmio).

Passo 2: Fechou-se o primeiro frasco-ampola e ligou-se a um misturador de vórtex e agitou-se à velocidade máxima durante 6 minutos para formar a primeira emulsão de água-em-óleo.

Passo 3: No segundo frasco-ampola adicionou-se a segunda substância aquosa (1 ml de uma solução de glucose e 30 mg/ml em água com ácido clorídrico 0,1 N) ao segundo componente lipídico (idêntico ao primeiro componente lipídico).

Passo 4: Fechou-se o segundo frasco-ampola e ligou-se a um misturado de vórtex e agitou-se à velocidade máxima durante 6 minutos para formar a segunda emulsão de água-em-óleo.

Passo 5: Adicionou-se 0,5 ml da primeira emulsão ao segundo frasco-ampola e misturou-se manualmente para obter uma emulsão quimérica.

Passo 6: Dividiu-se a emulsão quimérica em duas partes iguais e introduziram-se . . rapidamente por meio de uma pipeta pasteur de ponta estreita em dois frascos-ampola de aproximadamente,

3,9 g (one-dram), contendo, cada um, um terceiro componente aquoso imiscível (2,5 ml de água, 32 mg/ml de glucose e lisina 40 mM sob a forma de base livre).

Passo 7: Agitaram-se os frascos provenientes do passo 6 num misturador de vórtex, durante 3 segundos à velocidade 5, para formar esférulas de dissolvente contendo múltiplas gotículas da primeira e da segunda substâncias aquosas.

Passo 8: Transferiram-se as suspensões de esférulas de clorofórmio, em cada um dos frascos, para o fundo de um copo de 2 litros contendo 4,5 ml de água, 35 ml de glucose e lisina 22 mM sob a forma de base livre. Fez-se passar através do copo uma corrente de azoto gasoso com a velocidade de 7 1itros/minuto para evaporar o clorofórmio, durante 15 minutos a 15 deg. C.

exemplo anterior descreve um processo para a preparação de lipossomas heterovesiculares que contêm, separadamente, glucose, em aproximadamente 5/6 de câmaras aquosas internas e contêm também, separadamente, didesoxicitidina no restante 1/6 das câmaras aquosas internas, em cada lipossoma.

Os lipossomas heterovesiculares que contêm solução de didesoxicitidina como uma substância aquosa e glucose como segunda substância aquosa são acentuadamente mais estáveis do que os lipossomas não heterovesiculares.

Exemplo 2

Este exemplo refere-se à síntese de lipossomas heterove) siculares contendo interleucina-2 (IL-2) e clorodrato de lisina: Para cada lote de lipossomas preparado introduziu-se num frasco de, aproximadamente, 3,9 g (one-dram) contendo 9,3 yjmoles de dioleiol-lecitina, 2,1 ^timoles de dipalmitoi 1-fosfatidilglicerol, 15 jumoles de colesterol e 1,8 jjmoles de trioleína e 1 ml de clorofórmio (constituindo isto a primeira emulsão de água-em-óleo).

Para obter segunda emulsão de água-em-óleo, adicionou-se 1 ml de cloridrato de lisina (sem IL-2) a um frasco-ampola de 3,9 g

-15'' · contendo 9,3 ^imoles de dioleiol-lecitina, 2,1 yimoles de dipalmitoil-fosfatidilglicerol, 15yimoles de colesterol, 1,8yimoles de trioleína e 1 ml de clorofórmio. Agitaram-se os frascos-ampola individualmente num misturador de vórtex, sequencialmente à velocidade máxima durante 6 minutos.

Adicionou-se 0,5 ml da primeira emulsão de água-em-óleo a 2 ml da segunda emulsão e misturaram-se para se obter uma emulsão de água-em-óleo quimérica. Pipetou-se rapidamente a emulsão quimérica dividida em duas partes iguais, com uma pipeta pasteur de ponta fina para dois frascos-ampola de 3,9 g, contendo cada um 2,5 ml de glucose a 4% em água e 0,1 ml de lisi na sob a forma de base livre, 200 mM, e agitaram-se à velocidade mãxima durante 3 segundos para se formarem esférulas de clorofórmio. Transferiram-se as suspensões de esférulas de clorofórmio para um balão Erlenmeyer de 250 ml, contendo 5 ml de solução aquosa a 4% de glucose e 0,2 ml de lisina sob a forma de base livre, 200 mM. Fez-se passar uma corrente de azoto gasoso com o cocudal de 7 litros/minuto, através do balão para evaporar o clorofórmio, durante 5 minutos à temperatura de 37° C.

Exemplo 3

Este exemplo ilustra a síntese de lipossomas heterovesiculares contendo uma solução de ara-C como primeira substância aquosa e água destilada como segunda substância aquosa. Para cada lote de lipossomas preparados, adicionou-se 1 ml de água contendo 100 mg/ml de ara-C, a pH 1,1, a um frasco-ampola de 3,9 g contendo 9,3jjmoles de dioleiol-lecitina, 2,1 ^imoles de dipalmitoi 1-fosfatidi Igl icerol, 15 íimoles de colesterol e 1,8 /

-16jjmoles de trioleina e 1 ml de clorofórmio, colocou-se num misturador de vórtex e agitou-se à velocidade máxima durante 6 minutos (constituindo esta a primeira emulsão de água em óleo) Para a obtenção in sltu da segunda emulsão de água-em-óleo, retirou-se metade do conteúdo da primeira emulsão de água-em-óleo e, em seguida, adicionou-seΊ ml de água destilada à parte restante da primeira emulsão de água-em-óleo e agitou-se o frasco-ampola de 3,9 g, durante 10 segundos à velocidade máxima. Formou-se uma emulsoa quimérica de água-em-óleo. Metade da emulsão quimérica foi introduzida rapidamente por meio de uma pipeta pasteur de ponta fina em cada um de dois frascos-ampola de 3,9 g contendo cada um, 2,0 ml de glucose a 4% em água e 0,5 ml de lisina sob a forma de base livre, 200 mM, e agitou-se à velocidade máxima durante 3 segundos para se formarem esférulas de clorofórmio. Transferiram-se as suspensões de esférulas de clorofórmio para um balão Erlenmeyer de 250 ml, contendo 4 ml de glucose a 4% em água e 0,5 ml de lisina sob a forma de base livre, 200 mM. Fez-se passar uma corrente de azoto gasoso com um caudal de 7 litros/ ^ninuto, através do balão para se evaporar o clorofórmio, durante 5 minutos à temperatura de 37°C.

Exemplo 4

Síntese de lipossomas heterovesiculares contendo factor de estimulação de colónias na macrofase granulocítica (GM-CSF)

Foi utilizado exactamente o mesmo procedimento que se descreveu no Exemplo 2, com excepção de a interleucina-2 ter sido substituída por 1 yjg de GM-CSF.

Exemplo 5

Síntese de lipossomas heterovesiculares com diversas composições lipídicas e incorporação de diversas substâncias nos lipossomas

Em vez de se utilizarem dileiol-lecitina, dipalmitoil-fosfatidilglicerol, colesterol e trioleina (TO) e outros lípidos antipáticos, tais como as fosfatidil-colinas (PC), podem utilizar-se cardiolipina (CL), dimiristoíl-fosfatidilglicerol (DMPG), fosfatidil-etanolaminas (PE), fosfatidilserinas (PS), ácido dimiristoíl-fosfatídico (DMPA) e outros lípidos neutros, como a tricaprilina (TC), em várias associações com resultados similares. Por exemplo, podem utilizar-se PC/C/CL/TO numa relação molar de 4,5/4,5/1/1; DOPC/C/PS/TO numa relação molar de 4,5/4,5/1/1; PC/C/DPPG/TC numa relação molar 5/4/1/1 ; PC/C/PG/ /TC numa relação molar 5/4/1/1; PE/C/CL/TO numa relação molar de 4,5/4,5/1/1; e PC/C/DMPA/TO numa relação molar de 4,5/4,5/1/1,

Para incorporar outras substâncias solúveis na água, tais como glucose, sacarose, metotrexato, Ponceau S, substitui-se simplesmente a interleucina-2, referida no Exemplo 2, pelas substâncias pretendidas. Também, tal como no Exemplo 2, a interleucina-2 pode ser identicamente substituída por outras substâncias com actividade biológica, tais como as substâncias indicadas no Quadro 1, em doses apropriadas.

-18- -y.^·

Exemplo 6

Neste exemplo, a trioleína e os componentes 1ipídicos dos exemplos descritos anteriormente são substituídos, isoladamente ou em associação, por outros triglicéridos, óleos vegetais, gorduras animais, tocoferóis, ésteres do tocoferol, ésteres colesterílicos ou hidrocarbonetos, com bons resultados.

Exemplo 7 ) Para se prepararem lipossomas mais pequenos dos que os dos exemplos anteriores e com referência aos Exemplos 1 ou 2, aumentou-se a força mecânica ou o período de agitação ou homogeneização do Passo 4 nesses exemplos. Para se prepararem lipossomas maiores, diminuiu-sea força mecânica ou o período de agitação ou homogeneização do Passo 4 do Exemplo 1 ou 2.

Podem administrar-se lipossomas heterovesiculares a doentes do modo normal, quando se pretende proporcionar dois compostos com actividade biológica, separados, a esse doente para um fim particular de tratamento.

I

A dose apropriada para seres humanos está compreendida entre 1 e 6 000 mg/m² de superfície do corpo. A razão para este intervalo ser tão grande é que para algumas aplicações, tais como a aplicação subcutânea, a dose requerida pode ser muito pequena mas para outras aplicações, como a administração intraperitonial, a dose pretendida a utilizar pode ser, muito grande. Embora se possam administrar doses fora do intervalo referido anteriormente, este intervalo abrange a gama de utilização para praticamente todas as substâncias com actividade biológica.

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-19Podem administrar-se os lipossomas multivesiculares por qualquer via pretendida. Por exemplo, por via intratecal, intraperitonial, subcutânea, endovenosa, intralinfática, oral ou submucosa, sob muitos diferentes tipos de epitélios, incluindo o epitélio brônquico, gastrintestinal, epitélio urogenital e várias mucosas corporais, e por via intramuscular.

Quando se faz a encapsulação de mais de duas substâncias em câmaras separadas de um lipossoma, mistura-se um terceiro (ou quarto) componente aquoso contendo a terceira ou a quarta substância com actividade biológica para se formar uma terceira ou quarta emulsão de água-em-óleo e, em seguida, juntam-se a primeira e a segunda emulsões e mistura-se para se formar uma emulsão quimérica contendo três ou mais substâncias com actividade biológica. A parte restante do processo é idêntica à descrita quando se faz a encapsulação de dois compostos ou substâncias com actividade biológica.

A presente invenção, portanto, permite alcançar os objectivos e finalidades e tem as vantagens mencionadas, assim como outras inerentes a estas. Embora os exemplos da presente invenção tenham fins de descrição, podem fazer-se alterações que estão incluídas no espírito desta invenção, tal como é definido pelas reivindicações apensas.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de vesículas lipídicas ou lipossomas heterivesiculares com, pelo menos, duas substâncias diferentes, das quais pelo menos uma é biologicamente activa, encapsuladas separadamente nas suas câmaras aquosas, caracte rizado pelo facto:

   (a) de se adquirir um primeiro componente lipídico dissolvido em um ou mais dissolventes orgânicos e de se adicionar a esse componente lipídico um primeiro componente aquoso imiscível contendo uma primeira substância biologicamente activa que se pretende encapsular;

   (b) de se formar uma primeira emulsão água-em-óleo a /-21partir dos dois primeiros componentes imiscíveis;

   (c) de se adquirir um segundo componente lipídico dissol. vido em um ou mais dissolventes orgânicos e de se adicionar a e£ se componente lipídico um segundo componente aquoso imiscível contendo uma segunda substância que se pretende encapsular;

   (d) de se formar uma segunda emulsão ãgua-em-õleo a par tir dos dois segundos componentes imiscíveis;

   (e) de se formar uma emulsão aparente associando a primeira emulsão água-em-óleo com a segunda emulsão também água-em-óleo;

   (f) de se transferir e de se fazer imergir o produto preparado na fase (e) em ura terceiro meio imiscível com os dissolventes orgânicos citados antes;

   (g) de se dispersar a emulsão aparente para se obterem esférulas de dissolvente contendo múltiplas gotículas do primei ro componente aquoso contendo a primeira substância e do segundo componente aquoso contendo a segunda substância; e (h) de se evaporarem os dissolventes orgânicos das esférulas de dissolvente para se obterem lipossomas heterovesiculares.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de se utilizarem como primeiro e segundo componentes lipídicos um fosfolípido ou uma mistura de diversos fosfolípidos.
3. 3.-

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se associarem três ou mais emulsões ãgua-em-óleo contendo três ou mais componentes aquosos imiscíveis para se obter uma emulsão aparente.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizarem primeiros e segundos componentes lipídicos similares.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de se utilizarem fosfolxpidos escolhidos entre fosfatidilcolina, cardiolipina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina, lisofosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidil inositil, fosfatididilglicerol e ácido fosfatídico.
6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte | rizado pelo facto de se utilizar(em) um ou mais componente (s) contendo um lípido com uma ou mais carga(s) negativa(s) livre (s) .
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de se utilizar pelo menos um dos fosfolxpidos misturado com colesterol.
8. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte /23ζ rizado pelo facto de se utilizar pelo menos um dos fosfolípidos misturado com estearilamina.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de pelo menos uma das primeira e segunda substâncias ser um material lipofrlico biologicamente activo.

   I
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de pelo menos um dos primeiro e segundo componentes lipídicos ser um lípido neutro isolado ou em associação com uma subastãncia escolhida entre trigliceridos, óleos vegetais, gorduras animais, tocoferóis, ésteres de um to coferol, ésteres colesterílicos ou hidrocarbonetos.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar um dissolvente orgânico escolhido entre éteres, hidrocarbonetos eventualmente halogenados éteres halogenados, ésteres ou associações destes compostos.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar um cloridrato escolhido entre ácido clorídrico, cloridrato de lisina, cloridrato de histidina ou associações destes compostos.
13. 13.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar uma substância biologicamen te activa hidrofílica.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se escolher a substância hidrofílica biologicamente activa entre interleucina-2, citosina-arabinosi do, metotrexato, 5-fluorouracilo, cisplatina, floxuridina, mel falan, mercaptopurina, tioguanina, tiotepa, vincristina, vinblastina, estreptozocina, leuprolide, interferon, calcitonina, doxorubicina, daunorubicina, mitoxantrona, amacrina, actinomicina e bleomicina.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se preparar a emulsão dos dois componen _r tes utilizando métodos escolhidos entre agitação mecânica, energia ultra-sónica e atomização através de um pulverizador.

    )
16. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto do terceiro componente aquoso conter, pelo menos, um agente neutralizante de ácidos.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se utilizar um agente neutralizante de ácidos isoladamente ou em associação escolhido entre a lisina sem carácter básico e a histidina também sem carácter bã-25ζ sico.
18. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar um terceiro componente aquo so com uma força iõnica inferior a, aproximadamente, 0,05.
19. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se utilizar como terceiro componente aquoso uma solução aquosa contendo ainda compostos dissolvidos escolhidos entre hidratos de carbono e aminoácidos.
20. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se utilizar como terceiro componente aquoso uma solução aquosa contendo compostos dissolvidos, indi vidualmente ou em associação, escolhidos entre glucose, sacaro se, lactose, lisina sem carácter básico e histidina também sem carácter básico.
21. 21. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se prepararem esférulas do dissolvente mediante dispersão utilizando métodos escolhidos entre agitação mecânica, energia ultra-sónica e atomizaçâo através de um pulverizador.
22. 22.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se conseguir a evaporação do dissolven te orgânico fazendo passar azoto sobre o segundo componente aquoso.
23. 23.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se escolherem as substâncias biologicamente activas entre compostos antiarrítmicos, antiasmãticos, antibióticos, citostãticos, antidiabéticos, antifúngicos, anti -histamínicos, hipotensores, hipertensores, antiparasitários, antivirais, bloqueadores dos receptores da superfície celular, glicosídeos cardiotónicos, hormonas, imunoterãpicos, ácidos nu cleicos e seus análogos, proteínas e glicoproteínas, sedativos e analgésicos, esteróides, tranquilizantes e vacinas.
24. 24.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se encapsular uma substância biologicamente activa escolhida entre os compostos reunidos no

    Antiasmãticos metaproterenol aminofilina teofilina terbutalina tegretol efedrina

    QUADRO I Antiarrítmicos propanolol atenolol verapamil captopril isossorbido

    Tranquilizantes clorpromazina benzodiazepina butirofenonas hidroxizinas meprobamato fenotiazinas

    isoproterenol reserpina adrenalina tioxantinas norepinefrina Glicosídeos cardiotónicos Hormonas Esteróides digitãlicos antidiurética prednisona digitoxina corticosteróides triancinolona lanatosido C testosterona hidrocortisona digoxina estrogéneos dexametasona tiróide betametosona do crescimento ACTH progesterona gonadotropina mineralocorticóide prednisolona LH LHRH FSH calcitonina Hipotensores Antidiabéticos Anti-histamínicos apresolina diabenese piribenzamina atenolol insulina clorfeniramina difenilidramina Antiparasitários Citostáticos Sedativos e analgésicos praziquantel azatioprina morfina

    metronidazol bleomicina dilaudid pentamidina ciclofosfamida codeína adriamicina compostos de sín tese similares à codeína daunorubicina demerol vincristina oximorfona 1 metotrexato fenobarbital 6-TG 6-MP vinblastina VP-16 VM-26 barbituratos cisplatina FU Antibióticos Imunoterãpicos Vacinas | penicilina interferoes contra a gripe tetraciclina interleucina-2 sincicial respira tõria eritomicina anticorpos mono clonais contra vírus cefalotina imipenem cefotaxima gama globu1ina vacina contra hemophilus in- fluenza

    carbenicilina

    -29f

    - β*

    Antibióticos (cont.) Antifúngicos vancomicina anfotericina B Antivirais gentamicina miconazol aciclovir e derivados tobramicina dipeptido mura milo piperacilina clotrimazol Winthrop-51711 raoxalactam ribavirina amoxicilina rimantadina/amantadina ampicilina Hipertensores azidotimidina e derivados cefazolina dopamina cefadroxil dextroanf etamina adenina arabinosido cefoxitina inibidores da protease do tipo da amidina outros aminoglicosí deos Proteínas e Glicoprot eínas Outros linfocinas bloqueadores dos recepto res da superfície celular interleucinas - 1, 2, 3, 4, 5 e 6 citocinas GM-CSF Ãcidos nucleicos e análogos M-CSF DNA G-CSF RNA

    factor da necrose tumoral metilfosfonatos e análogos

    -30/

    Τ'

    Λ

    -ζ

    Λϊ