PT96230B - Processo para a producao de um polipeptideo e anticorpos antagonistas da interleuquina-4 humana - Google Patents

Description

A interleuquina-4 <íL~4> é unia proteína que afecta um largo espectro de células hematopoiéticas CStrober et al», Pediatr» Res» 24x549 (1988)3= IL-4 aumenta uma série de actividades incluindo as funções dos macréfagos, produção de IgG e de IgE s a proliferação células B estimuladas por imunoglobulinas» células T estimuladas por antígénios células progenitoras dos glóbulos vermelhos do sangue estimuladas por eritropoietxna» Ela também aumenta -a proliferação de mastócitos estimulada por IL-3» . tj C.Í ΜζΆΖΖί CUC. C-l-fZO j_tCCCOCC»;í i~rCO3 X S iOílil IAM Ρ'^Ρ central nas reacçSes alérgicas» Os mastócitos são células do tecido conjuntivo contendo grânulos as quais estão situadas nas proximidades dos capilares .ao longo do corpo, com concentrações especialmente altas nos pulmões, pele e tractos gastointestinal e genito-urinário» Após exposição a uma substância antigénica, os mastócitos desgranulam e libertam histamina, serotonina, heparina pí* uGLtZXt tÁíltcá rBãCÇSu £5.1 $ê?Ç|XCcl» prostaq1andina esc lb COsTiQ « para.

Devido aos efeitos estimul IgE s na proliferação de masoocxtos, ser útil para o tratamento de al mastócitos e produção adores da IL um antagoni ergias pelo de IgE»

-4 na produção de sta de IL—4 pode descréscimo do

Alguns investigadores u zar a actividade biológica de ILEProc» Natl» Acad» Sei» USA 83s monoclonal contra BSF-1 (agora produção de IgE induzida por ILparasita nemátodo Mippostronqv1us saram anticorpo 4» For ex em pio, 9675 (1986)3 u designado IL—4 4 em ratinhos br-asil iens ou s para antagonit i n k s 1 man et a 1.. sou um anticorpo ) para inibir a infectados com o injBetados com um anticorpo de cabf purificada contra IgD de ratinho»

Sabe-se que

ο \ imbos os tratamentos estimulam a produção de IqE? sabecambêm que este último estimula a secreção de IL·

Mais recenteissnte, Chretien et al

Immunol» Meth.

ϊ 1/g 6/ (1989)3 descreveu um antx—soro polxcloual coe i no contra IL-4 humana recombinante pareialmente purificada neutralizou alqumas das actividades hiolócixcas de IL-4 in vitro,

IMO entanto anticorpos monoclonais contra polipeptídeos sintéticos tendo as sequências da aminoácidos correspondendo aos resíduos

31-46,

12-127 da IL-4 humana madura falharam íe bem qu« ã lyUtíiii

SUMARIO DO INVENTO

Este inventa proporciona polipeptídeos contendo entre cerca de 5 e cerca de 26 aminoácidos que têm as sequências de aminoácidos correspondendo á sequência de resíduos de aminoácidos 61 a 82 ou 104 a 129 da IL-4 humana ou uma sua subsequência» Os polipeptídeos preferidos têm as sequências tíe aminoácidos

Lis-Asp—!re-Arg-Cxs,

T re—Ala-Gln-GIn—Fen-His-Arg-His,

L is—Asp-T re—Arg-Cis-Leu-G1í-Ala—Tre™A1a G1n-G1n-Fen-His-Arg-His-Lis-G1n-Leu-Ile Arg-Fen e

A1a-Asn-G1n—Ser-Tre-Leu-G1u-Asn—Fen-LeuSlu-Arg-Leu-Lis-Tre-I1e-Met-Arg-Glu-LisTif—Ser-Lis-Cis-Ser-Ser.

presente invento proporciona ainda anticorpos que inibem a ligação de IL-4 humana a receptores celulares e especificamente liga-se a tal IL-4 e as polipepíídeos contendo entre cerca de 5 e cerca de 26 resíduos da aminoácidos e tendo sequências de aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos ds aminoácidos 61 a 82 ou 1@4 a 129 de IL-4 ou uma» sua subsequência, anticorpos esses que inibem a ligação de IL-4 humana & receptores celulares»

Este invento ainda proporciona métodos para fazer anticorpos que se ligam especificamente a IL-4 humana e inibem a ligação a receptores celulares, compreendendo a administração a um animal ds uma quantidade suficiente de um polipeptídeo contendo entre cerca tíe 5 e cerca de 26 resíduos de aminoácidos e tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos de aminoácidos 61 a 82 ou 104 a Í29 de IL—4 humana ou uma sua subsequência, pelo que o anxmal produz anticorpos contra o polipeptídeo que se liga especificamente a ÍL—4 humana s inibe i »umana

Este invento ainda proporciona anticorpos anti-idícstí· picos contra anticorpos atr-á·—

-af eri dos.

an cxcorpc presumiveimen te an taqon i zam actividade biológica tíe

II :ompetindo com IL—4 para a ligação aus seus receptores celulares.

Este invento ainda proporciona um método para a inibição da ligação de IL-4 humana a receptores celulares, caracterizado por se pôr IL-4 humana em contacto com· um anticorpo que especificamente se liga a IL—4 humana e a um polipeptídeo contende» entre cerca tíe 5 e cerca de 26 resíduos de aminoácidos e tendo uma sequência de amxnoácxdos correspondendo a sequência de resíduos tíe aminoácidos 61 a 82 ou í®4 s 129 de IL-4 humana ou

Este invento ainda proporciona um método para inibição da ligação de IL-4 a receptores celulares» caracterizado por se pôr as células portadoras de receptores de IL-4 humana em contacto com anticorpos anti-idiotípicos contra um anticorpo que se liga especif icamente a IL-4 humana, e a um polipeptídeo contendo entre cerca ds S e cerca de 26 resíduos de aminoácidos e tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo â sequência de resíduos- de aminoácidos 61 a tí2 ou 1(34 a 129 ds IL—4 humano ou uma sua subsequência, anticorpos anti—idiotípicos esses que inibem a ligação de IL-4 humana a receptores celulares»

Os antagonistas de anticorpos do invento são úteis estudos in vitro de mecanismo de acção de IL-4 ou tr os a n t agon i s ta s ligação a receptores pa de IL-4 tístsriiiinar e/ou para identificar aqonistas Conforme referido atrás, eles poi em o

OU.

também ssr úteis no tratamento de alergias através do decréscimo da proliferação d-e mastócitos estimulados por IL-4 e da produção de IqE»

BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS

Este invento pode ser mais fácilmente compreendido por referência às figuras juntas, em que?

tig» í mostra a sequência de aminoácidos da IL-4 humana madura, do seu extremo amina para o extremo carbonilo»

Fig» 2 é uma representação gráfica da. ligação de IL—4 (curva inferior) e do polipeptídeo NS 7 (curva superior? ver

Tabela 15 por uma fracção de IgQ de coelho contra o polipeptídeo.

em análises ds ELISA directa» A quantidade de proteína/ροlipeptídec ligado em picomoles está apresentada em função da absorvSncia a 414 nm,

Fig» 3 e uma representação gráfica da inibição da IOS ligação especifica de ***I-IL-4 a células Daudx pela fracção de IgG contra o palipeptídeo MS 7_S mostrando a percentagem ds radioactividade ligada em função do aumento da concentração ds IgG»

Fig» 4 é uma representação gráfica da inibição da 1 OS ligação específica de ~ ”I-IL-9 a células Daudi por anti-soro anti-idiotípico 1443,, mostrando a. 7 de inibição de radioactividade ligada especificamente em função do decréscimo da concentração ds anti-soro»

Fig» 5 ê uma representação gráfica dos resultados da análise de epitopos realizada em anti—soro de coalho contra o polipeptídeo N2 7» São apresentadas as absorvãncias de ELISA produzidas por ligação do -anti-soro a uma série de octapeptídeos usados na análise» Qs números dos octapeptídeos correspondem aos números na Tabela 3»

Fig» 6 é uma representação gráfica dos resultados da análise de epitopos realizada em anti-soro de coelho contra o polipeptídeo N2 6» São apresentadas as absorvãncias de ELISA produzidas por ligação do anti-soro a uma série de octapeptídeos usados na análise» 0 antisoro usado para obter os resultados mostrados no painel A foi colhido no início da imunização do coelho e não inibiu a ligação ds ^'-'I-IL^ a células D-audi» 0 anti-soro usado no painel B foi colhido mais tarde e mostrou-se um forte inibidor da. ligação da. IL—4 marcada.» Os números dos octapeptídeos correspondem aos números na. Tabela 4»

Todas as referências aqui citadas, são incluídas na sua. total idade como referência» As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos apresentadas n-a forma convencional de uma letra ou de três letras ÍLehninger Inc», New York, p»96)« presente .invento proporciona anticorpos que antagonizam a ligação de IL-4 humana a receptores celulares- por Ca) combinação com uma região da IL-4 que.aparentemente está própria IL-4, c celulares» bsvj a ρ r o1i feração -a 1 érg 3. c -as , os tratamento de v3. tro dtí ι ioaçc r| OiS· alerqias» Elec ds acção da IL-4 ou ou agonistas de IL-4.

envolvi

,υΓκ5 OU puf (bí Hi	λ líifef L.X ώΐχίΓϊζϊο s.
! ela. na ligação ao	e r eceptores
a produção de ant	.icorpos IgE e
dois- efectores d	s.s respostas
.stas do invento	são úteis no
ι também úteis em	sistemas in
L-4, para elucidar	Ο ίΠ £5ϋ ·5 Π ÍS 0
lespiste de outros	antagonistas

Domo aqui é usado, IL-4^K humana significa uma proteína que (a) tem uma sequência de amino-ácidos que é substancialments idêntica à da sequência de IL-4 madura mostrada na Figura í e Cb) tem actividade biológica comum á IL-4 nativa»

Identidade substancial das sequências de aminoácidos significa qus a sequência de uma outra IL-4 comparada com a sequência da Fig» í ê idêntica ou difere em um ou mais amino-ácidos ídeleções» .adições, substituições) que não inibem substancialments a actividade biológica»

Certamente, as sequências ds aminoácidos nas regiões IL-4 referidas atrás podem diferir no caso de IL-4s substancialmente idênticas»

As investigações com polipeptídeos sintéticos descritos abaixo demonstraram que existem duas regiões dentro da molécula de IL-4 humana que parecem estar envolvidas na ligação a receptores» Para referência conveniente, as sequências de aminoácidos destes polipeptídeos serão aqui definidas pelas posições dos resíduos na sequência de aminoácidos tía IL-4 humana madura na Fig» ί, com 1 sendo o resíduo histidina amino-terminal e 129 sendo o resíduo serina carboxi-termirsal»

Como resultado destas investigações, encontrou-se que os polipeptídeos sintéticos tendo as sequências de aminoácidos correspondendo às sequências dos resíduos 52 a 82 e 104 a 129 ou subsequências suas dai IL-4 humana podem ser usados como antigénios para induzir a produção em animais de anticorpos que se ligam a polipeptídeos e a IL-4 humana» Devido à sua capacidade para se ligar a tais regiões específicas de IL—4, os anticorpos do xnvento inibem pelo menos 60% da ligação específica ds 'I•~1L~4 a células portadoras de receptores de IL—4»

A maior das regiões -ds ligação anteriores de IL-4 (resíduos 52-82) contêm cerca de 30 resíduos de aminoácidos» é do conhecimento geral que os determinantes antigénicos (epítopos) geralmente contêm pelo menos cerca de 5 resíduos de aminoácidos

COhno et_ah, Proc» Natl.» Acad» Sei» USA 82 s 2945 (1985)3»

Portanto os polipeptídeos do invento compreendem cerca de 5 a? cerca ds 30 resíduos de aminoácidos a têm as sequências de aminoácidos atrás referidas» Se um determinado polipeptídeo cai dentro do âmbito deste invento pode ser fácilmente determinado por experimentação de rotina usando os métodos descritos abaixo»

Ρ

Os polipeptídeos são sintetizados por um método adequado tal como sintese exclu-sivamente em fase sólida, métodos em fase sólida parcial, condensação de fragmentos ou síntese clássica em solução» Os polipeptídeos são preferencialmente preparados por sintese de peptídeos em fase sólida como, descrito por Merrifield, J» Am» Chem» Soo» S5s 2149 <1963). A síntese foi efectuada com aminoácidos que estão protegidos no extremo alfa-amino» Aminoãcidos trif uncionais com cadeias laterais susceptíveis são também protegidos com grupos adequados para evitar reacçSes químicas indesejáveis ocorram durante a montagem dos polipeptídeos» 0 grupo protector ds alfa-amina é removido selectivamente para permitir subsequente reacção com no extremo amina» As condiçSes para a remoção do grupo protector de alfa-amina não removem os grupos protectores das cadeias laterais»

Os grupos protectores de alfa-amina são os conhecidos como sendo úteis na sintese de polipeptídeos passo por passo» Estão incluídos grupos protectores tipo acilo Ce»g>= formilo, trifluoroacet.ilo, acetilo), grupos protectores aromáticos tipo urstano Cs»g» benziloxicarbonilo CCbz), benziloxicarbonilo substituido e 9-fluorometiloxicarbonilo CFmoc)3, grupos protsctores alifáticos tipo uretano íe»g=, t—butilcu<icarboniIo íBod), isopropiloxicarbcnilo, ciclo-hexiloxicarbonilo.1 e grupos protectores do tipo alquilo <e»g» benzilo, trifeniImetilo)» 0 grupo protector preferido é Boc» Qs grupos protectores ds cadeias laterais para Tir incluem tetra-hidropiranilo, ter.-butilo, tritilo, benzilo, Cbz, 4-Br-Cbz e 2»ó-diclorobsnzilo» 0 grupo protector de cadeias laterais preferido para Tir é 2,6-diclorobenzilo» Qs grupos protectores de cadeias laterais paras Asp incluam benzilo, 2,ó-diclorobenzilo, metilo, etilo e ciclo—hexilo» Os grupos protectores ds cadeias laterais preferidos para Tre e Ser incluem acetilo, benzoilo» tritilo, tetra-hidropiranilo, benzilo, 2,6-dicIorobenzílo e Cbz» 0 grupo protector

preferido para Tre e Ser ê benziio» Os grupos protectores ds cadeias laterais para Arg incluem nitro. Tos, Cbz, adamantiloxiçarbonilo e Boc» 0 grupo protector preferido para Arg έ Tos., 0 grupo amina da. cadeia lateral de Lis pode ser protegido com Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos ou. Boc, Q grupo 2-Cl-Cbz ê o grupo protector preferido tía Lís,

Os grupos protectores das cadeias laterais seleccionados devem permanecer intactos durante a acoplagem e não devem ser removidos durante a desprotecção dos grupos protectores do extremo amina ou nas condições de acoplagem»

Os grupos protectores das cadeias lateraisdevem também ser reemovíveis quando acabada a síntese, usando condições ds reacção que não alterem o polipeptídeo acabado»

A síntese em fase sólida é geralmente realizada a. partir do extremo carbonilo por acoplagem do aminoácido com alfa-amina protegido (cadeia lateral protegida) a um suporte sólido adequado» Forma—se uma ligação éster quando a ligação é feita a uma resina clorometilada ou. hidroximetilada e o polipeptídso resultante terá um grupo carbonilo livre no extremo C, Como alternativa, quando se usa uma resina benzidrilamina ou p-metilbenzidilamina forma-se uma ligação amida s o polipeptídeo resultante terá um grupo carboxamida no extremo C» Estas resinas podem ser adquiridas comercialmente e a sua preparação foi descrita por Stewart et al,, Solid Phase Peptide Synthesis <2ã Edição), Pierce Chemical Co», Rockford» II, 1984» aminoácido C-terminal, protegido na cadeia lateral se necessário e no grupo alfa-amina, é acoplado à resina bsnz.idr.ilamina usando vários agentes de activação incluindo diciclo-hexilcarbodiimida CDCC), N,M^?--diisopropilcarbodiimida e ϊ

carbonildiimidazole» Após a ligação protector ds alfa-amina é removido usando ácick CTFA) ou HCl em dioxana a uma temperatura entre 0° e 25^C’C« Adiciona-se dimetílsulfito ao TFA após a introdução de metionina (Met) para suprimir possível S-alquilação» Após remoção do grupo protector de álfa-amina, os restantes aminoácidos protegidos são acoplados passo a passo na ordem pretendida para se obter a sequsncia dsssjaoa»

Podem ser usados vários agentes de activação para as reaccSes de acoplagem incluindo DCC, N,N⁵-diisopropiIcsrbodiimid a _s benzo tr ia zo1-1-i1-οχ i-tris-{d ime ti1am ino)-fosf ón io hexa f1uorofosfato CBDP) e DCC-hidroxibenzotriazole CHDBt)» Cada um dos aminoácidos protegidos é usado em excesso 02,0 equivalentes) e as acoplagens são geralmente efectuadas em N-metilpirrolidona CNMP) ou em DMF, CH^Cl^ ou suas misturas.. 0 grau de completamento da reacção de acoplagem é controlado em cada uma das fases, e.g. por reacção com ninidrina como descrito por Kaiser et al« Anal» Biochem. 54 s 595 CÍ970)» Nos casos em que se encontrou acoplagem incompleta, a reacção de acoplagem foi repetida» As reacções de. acoplagem podem ser realizadas automáticamente com instrumentos ad q u i r i d os c craerci a1men te.

Após toda montagem do polipaptídeo pretendido, polipeptídeo-resina ê clivado com um reagente tal como HF líquido durante 1-2 horas a ®*C, o que cliva o polipaptídeo da resina e remove todos os grupos protectores de cadeias laterais» Normalmente usa-se um captador tal como anisole juntamente com HF liquido para evitar que os catiões formados durante a clivagem alquil em os resíduos de aminoácidos presentes no p-olipeptídeo» 0 polipeptídeo-resina pode ser desprotegido com TFA/ditioetano antes da clivagem caso ss pretenda» ortogonal que permita a clivagem selectiva das funções das cadeias laterais dos aminoácidos- acídicos- íe.g», Asp) e dos aminoácidos básicos Ce = g, Lis), 0 grupo protector 9-fluorenilmetilo (Fm) da cadeia lateral de Asp ε o grupo protector na1me t :iloxicarbonilo CFmoc) para a cadeia lateral de Lis pode ser usado com esta finalidade os grupos protectone?

. x _í >tes ca?

das cadeias laterais do polipeptideo-rssina protegido com Boc sao sei©etivamente removidos com piperidina em DMF, A ciclização © conseguida no suporte sólido usando vários agentes de activação incluindo DCC, DCC/HDBt ou BOP, A reacção com HF ê realizada no polipeptideo resina cicliz-ado como descrito atrás»

A metodologia ds DNA recombinante pode também ser usada para preparar os polipeptídeos» 0 código genético conhecido, adaptado caso se queiram codões preferidos conhecidos para ums expressão mais eficaz num determinado organismo hospiedei.ro, podem ser usados para sintetizar oligonucleótidos codificadores das sequências de aminoácidos pretendidas» 0 método do suporte sólido com fosforamideto de Matteucci et al», Cd, Am» Chem» Soc» 10-3;3185 C198DJ ou outros métodos conhecidos podem ser usados para tais sínteses» Os oligonucleótidos resultantes podem ser inseridos num vector adequado e expressos num organismo hospedei-r o c om pa t í ve1» □s polipeptídeos do invento podem ser purificados filtração em gel, cromatograf ia de permuta iónica ε-; distribuição contra corrente ou outros métodos bem usando HPLC, de partição, conhecidos»

Os anticorpos podem ser preparados contra polipeptídeos do invento usando métodos convencionais» Tal como aqui é usada, a

Í3

palavra “anticorpo” refere-se a anticorpos pWi-éí&nais -a monacionais» Ela inclui também imunoglobulinas completas e seus fragmentos de ligação a antigénio»

Ds anticorpos policlonais podem ser produzidos por imunização de um animal hospedeiro tal como coelho, rato, cabra, carneiro, murganho, etc» com um dos polipeptídeos. De preferência, são dadas uma ou. mais injecçSes de reforço após a injecção inicial, para aumentar o título de anticorpos» Retira-se então o sangue ao animal e o soro é preparado s despistado por métodos convencionais tais como ensaio imuno-sorvente, ligado a enzima (ELISA) usando o polipeptídeo como antigénio»

De preferência, a imunogenicidade dos polipeptídeos é aumentada por combinação com um adjuvante e/ou por conversão para uma forma maior antes da imunização»

Adjuvantes adequados para a vacinação de animais incluem mas não estão limitados ao Adjuvante 65 (contendo ólepo tíe amendoim, mono-oleatcs de manido e monostearato de aluminio ) sj adjuvante completo ou imcompleto cie Freundg géis minerais tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e alumj tensioactivos tais como hexacleci lamina, octadecilamina, lisolecitina, brome to ds d i me ti 1 d i oc tad ec i 1 amón i σ, Ν, M~d ioc tad ec i 1 -Ν, N⁵ - b i s (2™ —hidroximetil)propanodiamina, metoxi-hexadeciIglicerol e polióis plurónicos, palianiSes tais como pirana, dextrano sulfato, poli IC, ácido poliacrílico e carbopols peptideos tais como muramil-dipeptídeo, dimetilglicina e “tuftsin”? e emulsões com óleo» Os polipeptídeos podem também ser administrados após incorporação em lipossomas ou outros mieroveículos»

A imunogenicidade dos polipeptídeos pode também ser aumentada por ligação cruzada ou por acoplagem a uma molécula ' *'V..

hospedeira, aa qual as palipeptídeas do inventa podem ser covalentemente ligados)» A ligação cruzada ou conjugação a uma molécula veiculo pode ser necessária pois palipeptídeas pequenas por vezes actuam como haptenos (moléculas que são capazes de ss ligarem especificamente a um anticorpo mas incapazes.de induzirem a produção d-e anticorpos, i.e» não são imunogénicos)» A conjugação de tais palipeptídeas a uma molécula veículo imunogéncia torna os fragmentos imunogénicas através do que ê normalmente conhecido como ^Befeito de veículo¹¹*

As moléculas veículo adequadas incluem., e.g» proteínas s compostos poliméricos naturais ou sintéticos tais como polipeptídeos, polissacáridos, lipopolissacáridos, etc» Um veiculo - útil é um glucósido designado Quil A» o qual fai descrita por Morein et al», Nature 508s457 C19841» As moléculas veiculo proteicas são espeeialmente preferidas, incluindo mas não estando limitado a hemocianina ds lapa e proteínas do soro de mamífero tais como gamaglohulina humana ou bovina, albumina -sérica humana, bovina ou de coelho, ou derivados metilados destas proteínas ou outros» Outros veículos proteicas serão aparentes para as familiarizados com a matéria» De preferência, mas não necessariamente, o veículo proteico será estranho para o animal hospedeiro em que os anticorpos contra os polipeptídeos vão ser induzidos»

A acoplagem covalente a uma molécula veículo pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na área, a escolha exacta dos quais será ditada pela natureza da molécula veículo usada» Quando a molécula veiculo imunoqénica é uma proteína, os polipeptídeos do invento podem ser acoplados, e»g„ usando carbodiimidas solúveis em água tais como diciclo-hexilcarbodiimida. ou glutaraldeído»

ser usados para liqar de forma cruzada os polipeptídeos a eles próprios sem usar uma uma molécula veículo separada» Tal ligação cruzada em agregados pode também aumentar a imunogsnicida.de » soro produzido por animais assim imunizados poda ser usado directamente. Como alternativa, a fracção de IgG pode ser separada do soro usando métodos convencionais tais como plasmaforéseou cromatografia de adsorção usando adsorventes específicos de ISq tais como Proteína A imobilizada»

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser prepara o d es c r i to mmunol„ ó s511 dos usando métodos convencionais,e.g. como descrito por Kohler et al», EíMature 25&s495 (1975)? Eur» J Essenciaimente, um animal foi imunizado como descrito atrás para produzir células somáticas produtoras de anticorpos» Estas células foram então removidas do animal imunizado para a fusão com células de mieloma»

Células somáticas com o potencial para produzir anticorpos, particularmente células 8, são adequadas para a fusão com uma linha celular de mieloma» Estas células somáticas podem ser derivadas tíe nódulos linfáticos, baços e sangue periférico ds animais sensibilizados. Nos exemplos deste invento foram usadas células do baço de murganho, am parte devido a estas células produzirem uma. percentagem rslativamente elevada de fusões estáveis com linhas de mieloma de murganho» Deverá ssr possível., no entanto, usar em seu lugar células de rato, coelho, rã ou outras»

Linhas celulares de mieloma especializadas foram desenvolvidas a partir ds tumores linfocitários para usar em processos de produção de hibridomas [Kohler 276?269 <1978)? Volk ;elulares foram e al», Ue Vi r ο χ n 42 ? 220 (1982 J 3 . desenvolvidas pelo menos por três facilitar a selecção de hibridomas nxdamente e«i autu--prupagação. usando mielomas com deficiência zes de crescer e

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BeraImente utilização de técnicas monoclonais ê obter linhas celulares híbridas fundidas com tempo de vida ilimitado que- produzem o anticorpo sob o controle genético do componente célula som-ática do hibridoma» Para eliminar a produção de anticorpos pelas células tumorais pelos hibridomas, são usadas linhas celulares de mieloma incapazes de produzir cadeias leves ou pesadas de imunoglobulinas ou mecanismos deficientes na secreção de anticorpos» Uma terceira razão para a selecção destas linhas celulares é serem adequadas e eficazes na fusão»

Muitas linhas celulares de mieloma podem ser usadas na produção de híbridos celulares fundidos, incluindo e.g. P3X63“Ag8₅ P3/NSÍ--Ag4-l ÍÍMS-Í 3 , 8p2/0-Agl4 e S194/5. XXO»Bu» 1» As linhas celulares de F’3X6.5-Ag8 Hilstein CEur.J.Immunol«6s511

NS-Í -foram descritas por Kohler e shtíiiTi-sn al tNature desi_rii_-a por 1 rowbrxoge LU ot-xpaMed

576ê269 (1978)3 desenvolveram a linha de mieloma Sp2D/Agi4» A 1inha S194/5»XXO»Bu«1 fo 148s3í3 C1979)3» •^»-2

Os métodos pare a geração de híbridos- ds células do baço ou de nódulos linfáticos e células ds mieloma, produtores de anticorpos geralmente envolvem a mistura de células somáticas com células de mieloma numa proporção de 10;1 Cse bem a proporção pos vsnar entre cerca de

X fcí Ld Ci© X » X 7 fexvHfnsn t.© íj

> ? $ C 9 na presença ds usí agente ou agentes (químicos, virais ou. eléctricos ) que promovam a fusão de membranas celulares» Métodos de fusão foram descritos por Kohler e Milstein, supra» Geffcer et al», [Somatic Cell Benet» 3s23í (1977)3 e Volk et al._?(J. Virol» e2s ζ2® (1982) j » Os· agences cie tusso usados por aqusxes investigadores foram o vírus Sen-dai e polistilenoglicoi CPEB)» 0 processo de fusão do exemplo do presente invento utiliza PE8»

Devido aos processos de fusão produzirem híbridos viáveis com frequências muito baixas (e»g=, quando os baços são usados como fonte de células somáticas, apenas se obtem um híbrido por cada 1® x células de baço), é essecial ter um meio de selecção de híbridos de células fundidas de entre as restantes células não fundidas, particularmente as células de mieiorna não fundidas» é também necessário um meio de detectar os hibridomas produtores dos anticorpos pretendidos entre os outros híbridos resultantes» c· selecção de híbridos celulares fundido?

e evitam o crescimento da? s quais normalmente continuaBera1men te, uonseguxoa pela cultura das células crescimento de hibridomas usas que células de mieloma não fundidas» riam a dividir-se indefini ti vamente· As células som-áticas usadas na fusão não mantêm viabilidade a longo termo em cultura in vitro e portanto não colocam problema» No exemplo do presente invento, foram usadas células de mieloma sem hipoxantina-fosforribosil—transferase ÍHPRT-negativas)» A selecção contra estas células foi feita sm meio com hipoxantina/aminopterina/timidina CHAT), um meio em que as células híbridas fundidas devido ao genótipo HPRT-posifcivo das células do baço» έ também possível a utilização ds células de mieloma com diferentes deficiências genéticas (sensibilidades a drogas» etc») que podem ser selsccionadas em

mexos qus suportam o crescimento ds competentes» híbridc g en o t χ ρ x c amen re

híbridos	que prodi
posssni	ser sub
C£f Γυ·5;	de- 109»

t3uÍO Γ’õdC Γ* J.ctto Vár*Xci—· S&dílicinjSír- ’p<5.Γ*â. Ct; 2 XIVeíF SS-H? x tc^:L·. l1V-5‘ niente os híbridos celulares fundidos» No início deste período dí tempo ê necessário identificar o= corpo pretendido, de forma a c;

híbridos obtidos produzem o anticorpo pretendido, no entanto não é rara uma gama entre cerca de 1 e cerca de 30%« A detecção de híbridosprodutores de anticorpos pode ser conseguida por qualquer um de vários métodos de ensaio convencionais, incluindo o imuno-ensaío ligado a enzimas e- técnicas de radío-imunoensaio que foram descritas na literatura Ever e.g» Kennet et al» (editores), Monoclonal Antibodies and Hybridoniãss A New Dimension in 384» Plenum Press, New York C1980)3» idos de cáluias fundxdas pretendidos s xndívxduaxs produtoras de anticorpos, cada uma das linhas celulares pode ser propagada por uma de

Biological	Analyses,	PP
UíHS. V82	eccionados	ex
£? C 1 OrpJidOS	em linhas

□uas íTí-ansxr lonvencionais» Uma suspensão das células de hibri doma pode ser injectatía num animal histocompatível» G animal mjectado desenvolverá então tumores que secretam o anticorpos monoclonal específico produzido pelo híbrido de células fundidas» Os fluidos do corpo dos animais, tais como soro ou ascites podem ser colhidos para dar anticorpos monoclonais snt altas concentrações» Como alternativa, as linhas celulares individuais podem ser propagadas in vitro no laboratório» G meio de cultura contendo concentrações altas ds um único anticorpo monoclonal especifico pode ser colhido por decantação, filtração ou centrifugação»

Ue os anLxcorpos anxi—polipeptideíOs Tex uos como des-crx— to atrás são adequados para usar neste invento é determinado por um processo de despiste de duas partes envolvendo (a) análise por

ELISA usando o polipeptideo imunizante e IL-4 humano coíbo anrxgénios e Cb) análise de ligação a receptores de ligandos marcados radioactivamente, em que é medida a inibição da ligação específi1 2S ca de “ 'I-IL-4 a receptores celulares»

A IL~4 humana recombinante para usar em tais ensaios foi adquirida comercialmente, podendo ser comprada è Genzyme Corporation, Boston, MA» Como alternativa, ela pode ssr produzida usando a sequência de nucleótidos conhecida do gene da IL-4 CYokoto et al», Proc» Natl. Acad» Sei» USA 83§5894 <1986)3 e métodos de DNA recombinante convencionais Cver, e.g», Publicação do Pedido de Patente Internacional IMS WO 57/Ô29990; Kimmenade et al»₃ Eur«J«Biochem» 1/3«i©9 (1988)3«

A análise por ELISA foi realizada por métodos convencionais tais como o método de Chretien et al», CJ»Immunol» Meth» 117s67 (1989)3 usando um polipeptideo ou IL—4 adsorvids a uma placa de microtitulação» A presença de anticorpos ligados ao polipeptideo ou proteína imobilizada é detectada com um segundo anticorpo marcado anti-IgG» Taís segundos anticorpos são de preferência marcados com tsma enzima tal como peroxidase, glucoss-oxidase, b-galactosidase ou fosfatase alcalina» A peroxidase de rábano silvestre pode ser detectada por análise espectrofotomé— trica da sua actividade num substrato tal como pirogalol, o-fenilenodiamina ou ácido

-sulfónico)»

Os anticorpos que se ligaram especificamente ao pol: peptídeo imunizante e a IL-4 foram ainda avaliadas quanto ícidade para inibi?

ligação . espeuxTica d·— *>· ÍTict L. S Lí cl receptores nas células alvo adequadas» Os anticorpos anti—polipeptídeos do invento foram caracterizados por por uma capacidade para inibir pelo menos 6©% de tal ligação»

Podem ssr usadas quaisquer células portadoras de receptores de IL-4 tais como células uijoye, U-937, CCRF-CEM e CEM-CM3 na realisaç-ao do ensaio ds ligação, mas as células Daudi são convenientes e podem ser fácilments adquiridas. As células Daudi s-So uma linha celular de limfoblastos B derivados de um paciente com linfoma de Burkitt que pode ser adquirida â American Type Culture Collection com NQ de Acesso CCL 213= I-IL-4 £ i usar no ensaio ?de ser preparado por marcação de IL-4 sando, e.g_M α método da lactoperoxidase LUavití et al.,

X OC KOífs X £· ΧΙ** V ,1014 (19/4)3 ou o método de bolton st

CSiocbem» J» i53s529 0.973)3= A IL-4 humana recombinante glicosilada pode ser adquirida comercialmente, e = g=, ã Benzyme Corporation, Boston, MA»

Os anticorpos anti-idiotípicos do invento são dirigidos contra anticorpos específicos dos determinantes antigénicos de

IL-4 ρresen tes nos >1ipeptídeos do invento» lais anticorpos anti-idiotípicos mimetizam ou actuam tal como os determinantes antigénicos originais (ver, e = g-_- Patente LLB. NQ 4,731,237 de Reagan st al»), Tal como .3 própria IL-4 , estes anticorpos são pressupostos ligarem-se a especificamente e directamente aos receptores de iL—4, Os anticorpos anti xcxotipicos, no encanto, não possuem a actividade biológica tíe IL—4.

an t ico rpos an ti-idiotío i c ossão preparados por vacinação de um animal com um anticorpo (policlonal ou monoclonal) contra um polipeptídeo do inventa. Eles podem ser. recuperados como um anti-soro policlonal global ou como uma fracção IgG dele, ou como anticorpos monoclonais produzidos por hibridomas clonados, como descrito atrás»

Podem sar preparadas composições farmacêuticas que contenham quantidades eficazes de um ou mais dos anticorpos do ο

.ν''^ν invento ε um veículo fisiolóqicaments aceitável = Tais veículossão bem conhecidos dos familiarizados com a matéria» Os anticorpos podem ser administrados directamente ou na forma de uma composição a um doenze numí-ano para o tracamenco de axe^ qias ou composições farmacêuticas

QUt§	ras condições mediadas	. por IL-4»	As ;
são	ΐ si ias m x s ou r a n d o um	veículo f	isio
uma	quantidade eficaz de	um ou mais	dOS

A determinação da dosagem adequada de um anticorpo do invento para uma situação particular esta dentro das competências dos familiarizados com a matéria» De uma forma geral, o tratamento é iniciado com dosagens mais pequenas qus são inferiores às óptimas» A seguir, a dosagem è aumentada por pequenos incrementos até se atingir o efeito óptimo nas circunstâncias» Por conveniência, â dosagem total diária pode ser dividida e administrada em fracções durante o dia caso ss pretenda»

A quantidade e frequência de administração dos anticorpos do invento será regulado·de acordo com o critério do médica assistente tendo em consideração factores tais- como a idade, estado e tamanho do doente e qravidade doCs) sintomaCs) a serem

EXEMPLOS

A menos que de outra percentagens dadas abaixo para

Oi· ÍB& is-feíj ~ sólidos em especincaao, as misturas sólidas» líquidos em líquidos- e sólidos em líquidos· são numa base de ρ/ρ»

V*j £ / VQ1 Sí ρ/vol, respectivamente»

As determinações de proteína foram efectuadas pelo método da Lowrv et al

Biol» Chem, í 93s265 (1951)3 usando albumina séric-a bovina como padrão» 0 bioensaio de IL-4 foi realizado como descrito por Mossman Cd» Immunol» Methods 65s55 (198393, medindo a estimulação da prol iteração celular como tomada de MTT (brometo de 3-C4,5-dimstiltiaxol-2-il3-2,5-difeniltetrazolium) em linfócitos humanos do sangue periférico estimulados com PHA» Uma unidade de actividade. de IL-4 é uma quantidade

ST de íL-4 que provoczf metade da estimulação máxima em 2 x 1©^J células no ensaio» Um micrograma de IL-4 humana pura tem cerca de 2© 00Θ unidades- de actividade no ensaia»

Sintese de polipeptídeos

Uma série de polipeptídeos foram sintetizados, as sequências de aminoácidos dos quais-, consideradas em conjunto, correspondem à sequência de aminoácidos de toda a proteína IL-4 humana madura»

Os polipeptídeos foram fase sólida da Merrifield CJ» fiun·. sistetizador Applied Biosystems qrupo protector ds amina t—butilc co»» Hpós reíTíOção dos grupos proLsutores, os polipeptídeos foram resina com fluoreto de hidrogénio» clivados da sintetizados usando o método de Chem» Soc» 85.= 2149 (1963)3 e um íuusI 4o0h« roram empregues o icarbonilo e anidridos simétri4

er» fase reversa usando uma coluna Rainin Dyr com um gradiente acetonitrilo em 0,1% de ácit 0 eluato ιοί controlado por absorvência de amax C-Bdesenvolvida o tri f1uoroscético„ u11 ravi o1etas a 214 nm» As identidades dos polipsptídeos das por sequenciação de aminoácidos usando métodos convencionais» purificados foram ' confirmaanálise espectral de massa.

Lis polipeptídeos p aminoácidos e os resíduos da psptídso sinal? ver Fig» 1> polipeptídicas estão apresent.

reduzidos, as suas sequ IL-4 humana madura íi»e aos quais correspondem ados na sabela 1» , sem •squêni

UIH

Ici

±ãfesIâ_A

Resíduos IL-4

Po 1 i pep t.í d eo NS	Sequência	c o rres ραπ d en tes
í	HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTE.	1-26
2	CDITLQEIIKTLNSLT	3-18
3	TEQKTLCTELTVTD	18-31 .
4	DIFAASKNTTEKETFC	31-46
5	ETFSRAATVLRQFYS*	43-57
6	LRSFYSHHEKDTRC	52-65
7	KDTRCLSATAQQFHRHKQLIRF	61-82
8	LKRLDRNLWSLASLÍM5CPVK	83-102
9	AQQFHRHKQLΪ RFLKRLDRNLWS	70-92
1®	CPVKEANQSTLEN	99-111
11	ANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS	104-129
12	FLERLKTIMREKYSKC	112-127
>£ A sequência	de aminoácidos do polipeptxdeo Nsb corresponde aos
resíduos 43·-	57 da IL-4 humana, excepto o	resíduo de cisteína
na posição	46 da IL-4 humana ter sido	substituido por um

resíduo serina no polipeptideo»

A análise de hidrof ilicida.de ds IL-4 humana realizada por Hopp et al» EProc» Natl» Acad» Sei» USA 78s3824 C198133 mostra qus a região correspondendo ao polipeptxdeo N2 7 contem resíduos· hidrofilicos e.hidrofóhicos que que são previstos pelos urna

'-eparauão xzaçao d© Hncicoroos

Duas miligramas ds polipeptideo NS 7 (Tabela í) corresondendo aos resíduos 61—82 de

IL-4 humana foram dissolvidos em pH 6,8 e 0,1 ml de vacina da tosse convuisa (fonte, estirpe 18334, morta pelo calor, 20 Unidades/ml, diluição 1/Í0 0®0 de timerosal)= Adicionou—se adjuvante completo de Frsund <0,5 ml) e a amostra foi homogenizada com um-a seringa., Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados com í ml da p

@,4 ml d , 1 e ,

Tris-HCl amostra por injecções intradérmicas. de 0,1 ml (200 pg dí •po i .1.· peptídeo)»

RpcS UIR p(=*r.iu/uu?

Ss?

iepoxs pGrxodxcamentGj toram dadas xnjecçbss qs rsrrorço como Retirou-se sangue periódicamente das veias da orelha ou do tíos coelhos e deixou-se coagular.

fémur

Uma fracção de Igtí foi isolada a partir do soro de um dos coelhos A-Se p ha r os e jor adsorção do mesmo a uma coluna de Proteína ^:‘harmacia, Piscataway, NJ) equilibrada com tamoão glicina 1,5 M, pH 8,9» A cromatagrafia foi métodos convencionais pela Forton Biochem. Co, rea1i cada usando D material purificado calculou-se ser cerca de 98% de IgS pura por electroforese em gel ds 8-DS-pol iacrilamida CLaemmli, Nature 227s680 (1970)3, fcste material foi designado como fracção de IqG 343—6 do anti—soro »

Usando métodos semelhantes, prepararam-se também fracções de IgG do mostrados na Tabela :

atiti-bOfu uontra o?

outros polipeptideos

Lindo plac so r o T x s χ o j. u?cf 3. c o

Realizou-se ELISA nas fracções de IgS isoladas revssmierotitulação de 96 cavidades CBecton—Dickinsoní com csrca de @,25 p.g de um dos vérios pol ipeptídeos em 5© μΐ de tamponado com Tris (TBS; 5© mti

NaCl₅ pH 7,0} durante uma hora ã temperatura ambiente» A seguir incubação, :svidades foram lavadas cinco vezes com iBu contendo 0,1% Tween 2© ímonolaurato de polioxietilenossorbitano)» fts cavidades lavadas foram bloqueadas com 17 de albumina sérica. bovina ÍBSA) sm TBS durante 1 hora â temperatura, ambiente, lavadas cinco vezes com TBS, bloqueadas com ©,17 de IgG inespecífica como descrito atrás» Amostras de cinco microlitros de várias diluições das fracçSes ds IgG em TBS foram então adicionadas às cavidades e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante í hora e depois lavadas como anteriormente» .A cada uma das cavidades foi adicionado 5© j.ig de TBS contendo 2,5 ng de imunoglobulinas de cabra anti-IgS de coelho marcadas com peroxidase de rábano silvestre e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura -ambiente» Após lavagem como atrás as cavidades foram reveladas com peróxido de hidrogénio e 2,2-Azino~di--<3-etil~benztiazoIina sulfonatoí» •I

Foram também reveladas cavidades testemunha em que um dos três componentes do ensaio íi»e», antigénio, anticorpo ou segundo anticorpo marcado) foi eliminado» As amostras foram lidas num espectoíotómetro Dynatech Modelo 65®»

Qs do ant humana como absorvância resultados de tal análise realiz i-soro usando o polipeptideo NQ 7 antigénios estão apresentados na F a 414 nm como medida da ligação sm função da quantidade de polip ada na. fracção IgG ίTabeIa í) e I L—4 ig» 2» Ali, onde a de antigénio está eotídeo ou de IL—4 por cavidade, pode-se ver que os anticorpos se ligaram a ambos os antigénios» Para produzir estes resultados, a fracção de IgS

343-6 tío anti-soro foi diluida a 1;200 antes do revestimento das cavidades com 50 μΐ.

Para determinar se os anticorpos nas fracções de IgG anti-polipeptídeos, através da ligação especifica a IL-4 humana poderiam assim inibir a ligação de IL-4 aos receptores celulares foram realizadas análises de ligação de ligandos marcados radioac t i vamen te«

IL-4 humana recombinante purificada expressa em células CHO ELe et al», J« Biol» Chem» 265¾10817 (1988)3 foi marcada com iodo-125por urna modificação do método ds Bolton-Hunter da BuPont-NEN, Boston, MA» Resumidamente, 2 mCi do reagente de Bolton-Hunter reagiram com 5,0 pg ds IL-4 purificada em 1©G μΐ de tampão fosfato de sódio 5G mM, pH 8,0, durante 2 horas a 22°C» A reacção foi parada durante 1 hora pela adição de um volume igual de glicina 1,0 M»

A proteína iodinada foi isolada por filtração sm gel numa coluna PD-1 {Pharmacia, Piscataway, HJ) equilibrada com G,2X de gelatina em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4» 0 material radioactivo eluindo da coluna no volume de exclusão foi reunido e analisado» A rsdioaetividada específica da IL-4 marcada foi de 15©0 Ci/mmole conforme determinado pelo método de auto-deslocamento ds Calvo et al.,, Biochem»J„ 212s259 <1983)3 e a proporção de incorporação molar foi de 0,68 moles de iodes por mede de proteína »

Volumes de um décimo de mililitro de diluições seriadas das várias fracçSss ds IgG anti—polipeptídeo em meio de ligação CRPMl 1640 com 1G3 de soro fetal de vitela (FCS)3 foram incubados com quantidades constantes de

Ι,® ml de meie de ligação em tubos de í,5 ml durante 18 horas a 4*C antes da realização dos ensaios ds ligação» Após esta pré-incubação os conteúdos dos tubos foram combinados com 2 x 10° células Daudi e as misturas foram incubadas durante 2 horas a 4*C»

Após a incubação, as células foram sedimentadas- por centrifugação a 800 ou 12 000 x g durante 3© segundos a 4‘-‘C e os sobrenadantes foram rejeitados» As células foram ressuspensas em 0,1 ml de meio de ligação fresca sem 1L-4 marcada a 4°C, sedimentadas como atrás, ressuspensas em 100 μϊ de meio de ensaio e colocadas sobre Í00 pg ds dibutil-ftalato e dioctil-ftalato C1s1)» As células foram sedimentadas a 13 000 x q durante 2 minutos, congeladas em azoto liquido e foram então contadas num contador gama» A ligação inespecifica fo determinada em amostras paralelas contendo 1,0 mg de XL-4 humana não marcada»

Os resultados das análises anteriores estão apresentados na Tabela 2= t

Tabela 2

Análise das Fracções de IqG Anti-Folipeptídeos

Fo 1 i pept í deo Usado como Antiqénio'

Reactividade do Anticorpo com

Folipeptídeo IL-4 □a Lxgação

125, .

2,4 @

T g ?

VA í W

A p

1-3 1 í 12 m t

2o i-í fts sequênciste de aniincácido corresponden tes reg iSes den □os ρο 1 ipepr»2.det_-u e ss o da molécula. de 1L--4 humana

UiH presenrada determinai·;

,o absorvãncia r-_s

Ta bei da reactividade a 414 nm >0,05, dcta asetXí-Dr puS após subtração o .i. q π i i x t- s.

sorvãncia das cavidades testemunha.

Os resultados da tabela produzidos contra os polipaptídeo;

í mostram que os anticorpos correspondendo -aos resíduos

52-65 (polipeptídeo My 6) , 61-82 (polipeptídeo IMS z) e Í04--Í29 <polipeptídeo MS íi) da IL-4 humana fora® fortes inibidores da 1 05 ligação de ”^í'I~IL-4 ás células Daudi» Estes anticorpos ligam-se especificamente a ambos os polipeptídeos imunizantes e a IL-4, se bem que o soro pré-imune não se tenha ligado a qualquer um deles e não tenha efeito na ligação a receptores»

Como se mostra ainda na Tabela 2, os anticorpos contra os polipeptídeos 6 e 7 foram igualmente potentes na inibição da ligação de IL-4 marcada» A Tabela í mostra que estes polipeptídeos partilham uma subsequência de aminoácidos KDTRC. Tal evidência combinada sugere que esta subsequência possa comnstituir um epítopo importante e proporciona apoio aos polipeptídeos do inbvento que possam conter 5 resíduos de aminoácidos»

I

A inibição da ligação produzida pelos anticorpos policlonais contra o polipeptídeo IMS 6 é particularmente interessante» Como se referiu atrás, Chretien et al» encontrou que um anticorpo monoclonal produzido contra o mesmo polipeptídeo não neutralizou a bioactividade de IL-4» A análise subsequente de epítopos descrita abaixo mostrou no entanto que aquele anticorpo é provávelmente dirigido contra resíduos do extremo amina do polipeptídeo, não contra a subsequência Lis-Asp-Tre-Arg-Cis no extremo carbonilo» Presumivelmente, o anti-soro policlonal deste exemplo inibiu a ligação de IL-4 pois -alguns anticorpos eram dirigidos contra o epítopo compreendendo esta subsequência especifica» □s resultadas obtidos com a fracção Ig© 343-6 do anti-soro contra o polipeptídeo N2 7 estão apresentados graficamente na-Fig» 3, em que 2 x í®^u células Daudi foram incubadas com 50 pH de ⁱ‘^£““I--IL-4 e as concentrações de anticorpo indicadas durante 2 horas a 4’^:'C» A ligação específica na ausência de

tói : — »i. O í p Ο ϊ Ο Λ.	KJ© Ο »2»	i_ pm»	A for
da, ac ο ρ1ada	©.O ÍSCto	de os	sn t i c
ρο1i peptídeo	N0 7 © a	Jí -4-	sugor

orpos especif icamente ligados- ao e que qs resíduos de aminoácidos dirigidos possam estar expostos contra os quais os anticorpos são na superfície de ÍL-4»

Anticorpos lionoc 1 ona is An * Po1i peptídeos

Us anticorpos monoclonais foram preparados essenciaimente como descrito por Kohler e liilstein ENature 256s495 (1975)3. Todas as incubações foram realizadas a 37°C numa incuba— dor de 5% de CQ_

Murganhos Balb/c (Charles River) foram imunológicamente sensibilizados pela administração de 5®0 μϊ de 2,6,1®,14-tetrametilpentadecano CPrista.no) intraperitonealmente íi.p»). Cerca de quatro dias mais tarde, 25© ug do polipeptídeo N2 7 (Tabela í; correspondendo aos resíduos 61-82 de IL-4 humana) foram dissolvidos em volumes de 25© μϊ de tampão de fosfatos salino (PBS), adicionou-se quantidades ds 25® pl de adjuvante completo de Freund e as misturas foram homogenizadas e administradas i.p, a cada um dos murganhos» Cerca de um mês mais tarde, foram dadas injecçSes da reforça contendo 125 pg do polipeptídeo em adjuvante incompleto de Freund diluido a Isi administradas intraperitonealmen te ., injecçass- i.p» finais de 25© Periódicamente no decurso da veias da cauda e analizou-se Quatro dias soós a última imun

Três ou quatro semanas mais tarde, foram administradas pg do polipeptídeo NS7 em PBS» imunização, colheu-se sangue das por ELISA como descrito atrás» ização os animais foram mortos e removidos os seus baços.

Qs baças foram macerado? fresco RPMI 1640 contendo 100 p.q/ml ds estreptomicina e 100 unidades/ml de penicilina (meio RPMI pen/estrep) e depois transterxoos para um durante i minuto, transferidas para tubo grande» Após sedimentação dos detritos as células na camada, superior do tubo foram um tubo de 5 ml» Quatro mililitros do meio RPMI pen/estrep foram adicionados e as células foram ressuspensas e depois sedimentadas por centrifugação a cerca de ύ88 x g durante minutos»

Preparou-se uma proporção de 5sl de células de baço para células de mieloma NS-Í ds murganho (ATCC ΤΣΒ 18) e lavou-se uma vez com o meio RPMI pen/estrep» Após sedimentação das células como anteriormente s rejeição do meio, adicionou-se 0,5 ml de PEG C2g por litro em tampão HEPES 75 mM) tendo um peso molecular de aproximadaments ISO© dal tons, gota a gota durante um período de í minuto a 37°C, com agitação suave de 20 em 2© segundos» A adição de PEG foi. rspetxda, primeiro com í©,5 s depoxs com 1,0 ml da solução d© PEG»

Zestrep» As cél	ula^ ds	fusãi
sente e o meio	foi rejei	tado,
:s de baço de um	murganho	não
omo células de	suporte	sm me
mg/ml de glutami	na e 104	de so

Após fusão, as células foram sedimentadas e lavada; durante períodos de í minuto cons 0,5, í₅0, 2,0, 4,0, 9,0, 16,0 *

32,0 ml do meio RPMI pen/estrep» As células ds fusão foram sedimentadas como anteriormente e o meio foi rejeitado, após o

5-ensibi. o RPM i o fetal ds vitela CFCS) e as células foram misturadas e depois sedimentasolamento co murganho no dx suporte foram incubados durante das como anteriormente» Após anterior os- esplenócitos de noite a 37*C em meio RPMI pen/estrep contendo a glutamína e FCS»

«trep contendo	02933
χ IO ~ M, aminopterina
em placas de ;	microti-
( COST AR) s X 50	pi por
ί ΠΚ5Ί.Ο ©fíj	uma das

conjunto durante / dias em meio RPMI per mg/ml de glutamina, 10% FCS, hipoxantina — —“t x í@ Μ s timidina 1,6 x 10 (meio Hí tulação de 96 cavidades, de fundo plant cavidade» Após este periodo de incubação, cavidades foi substituído por meio HT (meio HAT sem aminopterina) e continuada a incubação»

Após vários dias, realizou—se ELISA nos sobrenadantes dos hibridomas como descrito atrás» excepto ter sido usado um anticorpo marcado anti-IgB de murganho» Os hibridomas nas cavidades que deram sinais positivos foram clonados por diluição limite meio

4T

Um total ds 3tí2 hibridomas cicuadus iorara pruduzidus desta forma, todos eles produzindo anticorpos monoclanais» Após despiste destes hibridomas por ELISA usando o polipeptídeo N27 corno antigénio, foram identificadas í'2 linhas celulares positivas» Destas» 10 mostraram-se positivas contra IL-4 por despiste com ELISA» despiste por Duchterlony de 8 destes clones po em agar realizado segundo métodos específicos para imunoglobulinas ;xvos convencionais com anti-soros mostrou que 6 destes clones produziram IgGí, u,ni produziu IgG2a e um produziu anticorpos IgM.

Preparação de Anticorpos Antl-idiotípicos anticorpos anti-idiotípicos, í,o mg da fracção IqG 343—6 ds n vi—soro oesr atrás sm 0,5 ml ds tampão de fosfatos salino foi adicionada a 0,0 ml de adjuvante completo de Freund e bem misturados para formar uma emulsão» A amostra foi

íí ϊ j μ. ua.ua sudlum íteíSiíten -se vacinações de reforço com intervalos de forma idântica, excepto t

Freund« sr-ss usado o adjuvante incompleto de

Ocasionalmente ΐο-ram retiradas amostra de sngue no decurso da imunização que foram submetidas a análise por ELISA usando a fracção JgS 343--6 de anti-soro como antigénio coma descrito atrás, excepto ter-se omitido o bloqueamento com imunoglobulina e ter-se usado como segundo anticorpo anticorpos de burro anti-IgG ds carneiro marcados com peroxidase de rábano silvestre» Encontrou-se qus o anti-soro ds carneiro assim obtido (designado anti-soro 1448) se liga especificamente à fracção IgS 343-6 de anti-soro de coelho mas não a IL-4 ou ao polipsptídeo

Para determinar se o anti-soro de carneiro 1448 de facto contem anticorpos anti-idiotínicos, uma diluição seriada do a análise de liqação a receptores 125.

anui-soru íoi sujeiua ligando marcado radioactivamente com “ⁱ''‘í-IL-4 e células Daudí como descrito atrás, com os resultados apresentados ns. Fig »4» Cada uma das amostras no ensaio continha 2 x 1©“ células e 50 pM cpm)» A liqação específica na ausência de usando i o=; s de ^-1-3^-4 (2 x 10^J

L-omo se moscra na ng, foi um inibidor competitivo forte da ligação da 11-4 marcada às células, abolindo mais de 807 da ligação específica, nas diluições mais baixas» Peio contrário, o soro pré—imune de teve efeito ns ligação ds IL—4» carneiro não

t eti z.-. u;

polipeptídeos NS 6 ε 7 eram críticos para a produção de anticorpos qus pudessem inibir a ligação ds IL-4 a receptores celulares, fez—se a análise de epítopos essencialmente como descrito pos Natl» Acad-, Sei.. USA BI?3998 <1984)3» ueysen et íProc método de Geysen et -a.l» permite a síntese rápida em suportes sólidos de centenas de pequenos polipeptídeos de pureza suficiente e em quantidade suficiente para realizar a f bem que os polipeptídeos ainda estejam ligados a suporte nos quais foram sintetizados» Em princípio, a ELISA foi realizada em tais polipeptídeos usando anticorpos que tinham sido preparados contra um polipeptídeo ou proteína maior tendo uma sequência de aminoácidos que inclui as sequências dos polipeptídeos peque— nos» Se os anticorpos são específicos para um epítopo dentro do imunogênio maior que è abrangido por vários peptídeos sintéticos pequenos, os anticorpos ligar-se-ão aos polipeptídeos ε podem ser detestados por ELISA»

Usando o método de Beysen et al., supra, sintetizou-se uma série de 15 octapeptídeos em pinos de polietileno (Cambridge Research Biochemicals, Inc», Valley Stream, N»Y»), as sequências de aminoácidos que nos agregados sedimentaram todos os resíduos no polipeptídeo NS 7<correspondendo aos resíduos 61—82 da IL—4As sequências destes octapeptídeos estão apresentadas na rabela ι ato

Octapeptxdeos baseados nos resíduos &Í—82 da 1L-4 humana madura

Octapeptídeo

NO

Oeouêncxa c or r esponCten tes cen t r o®

	KDTRCLGA	6 1 -&S	65
z	dTRíJLbAT	62-69	86
	TRCLGATA	63-7®	67
4	RCL8ATAQ	64-71	68
5	CLSATAQQ	65-72	69
6	L.BATAQGF	66— /-5	7©
7	GAT AQQFH	67-74	71
8	AT AQOFHR	68-75	“77
o	TAQQFHRH	69-76	73
'1®	AQQFHRHK	7®-77	74
11	Í3QFHRMKQ	71-78
12	QFHRHKÍ3L	72-79	Z é3
13	FHRHKQLI	73-8®	-•V / z
í 4	HRHKQLIR	/ Λ	/8

ι o

KHKULIRb

75-8;

# U'z- resíduos do centro dos octapeptícieos foram arbitráriamente designados pela adição de quatro è. posição do resíduo na IL—4 humana madura, ao qual correspondia o resíduo N-terminal de cada oc ta pep t í deo =

De mod o seme1hante,

.1 / gem todos os resíduos correspondendo aos resíduos 47-7® da IL-4 humana madura» As sequências de aminoácidos destes octapeptídeos estão apresentadas na Tabela 4»

Octapeptídeos baseados nos

	resíduos 47-7® da IL-4 human	a (oadtir a
peptídeo	ρ ,	duos IL-4	Resíduo ;
	Sequência corr	esponden tes	centro:
a X	RAATVLRQ	47-54	51
	AATVLRQF	48-55	E=T-“7 Xu.'A-
<	ATVLRQFY	49-56	crrr
*·£·	TVLRQFYS	/*	íx; 21
5	VLRQFYSH	51-59	55
6	LRQFYSHH	«’Ο-.ετ.Ο 1-/A» 1«/ f	56
7	LRQFYHHE	3nmΓ	57
s		·_/·”! ” o I	58
o	QFYSHHED		iSTÇ?
10	cvouucvt Í 3 -lJí ÍI rU-f·. 3		Λ0
í 1	YSHHEKDR	57-64	61
12	8HHEKDTC	58-65	A/?
13	HHEKD 1 RL	59-66	òo
14	HEK.DTRCS	éè La fc /	64
15	KDTRCLGA	61-68	65
16	V! RL.-L.13hT	62—69	66
17	TRCLGATA	63—	67

'-,*·' $ Os resíduos do centro dos octapeptídeos foram arbitrâriamente designados pela adição de quatro à posição do residuo na IL-4 humana madura, ao qual correspondia o residuo W—terminal de cada oc tapeptídeo =

Para realizar a análise ds epítopos no polipeptídeo N27, O anti-soro designado 129-88 de um coelho imunizado com o polipeptídeo como descrito atrás foi sujeito -a ELISA, usando os octapeptídeos imobilizados em pinos ds polietileno mostrados na Tabela 3 como antigénio. Encontrou-se que este anti-soro inibe •5 “icr fortemente a ligação de ^“^i-IL-A a células Daudi, num ensaio realizado como descrito atrás» A ELISA foi realizada em anti-soro 129-83 essencialments como descrito atrás em placas de microtitulação de 96 cavidades, excepto os pinos serem usados nas cavidades em vez do revestimento das cavidades com antigénio livre. Antes da leitura da cor desenvolvida usando um leitor de ELISA Titsrtek MCC 34Ô, os pinos foram removidos das cavidades»

Os resultados desta análise está apresentado na Fig» 5, onde a absorvância a 414 nm está apresentada para cada um dos octapeptídeos» Ds números dos octapeptídeos mostrados na Fig» 5 correspondem aos números na Tabela 3» Na Fig,5 pode ssr observado uma ligação forte dos anticorpos aos octapeptídeos 5-12» Referindo a Tabela 3, pode-se observar que os centros aproximados destes octapeptídeos correspondiam aos resíduos 69-76 da IL-4 humana inadura» Estes dados, combinados com o facto de o anti-soro 129-88 ter inibido a ligação da IL-4 marcada aos receptores celulares sugere que os resíduos 69-76 da IL-4 humana madura constituiem um epítopoCs), anticorpos contra o qual inibem a ligação de IL-4 humana a receptores celulares,

De modo semelhante, os octapeptídeos imobilizados mostrados na Tabela 4 foram usados para analisar o anti-soro de coelho produzido contra o polipeptídeo NS6» Este anti—soro, designado 342-6» foi avaliado duas vezes quanto á capacidade para inibir a ligação de - IL-4 a cèl ulas Daudi, Prepararam—se amostras de soro no início da imunização (anti-soro inicial

Qs resultados destas análises estão para o anti-soro inicial e tardio,

6ft %2 B respectivamente» Ds números das actapeptídeos mostradas na rig»6 correspondem aos números na

Como se mostra na Fig» 6A, o anti-soro inicial não inibidor 342-6 contra o polipeptídeo NS6 continham anticorpos reactivos com os octapeptídeos 3-7 e 9-13» Referindo a Tabela 4, pode-ss observar que os centros destes octapeptídeos correspondiam aproximadamente aos resíduos 53-57 e 59—63, respectivamente,

Tí —4 I-, anti-soro inibidor tardio 342-6 produziu um padrão de ligação semelhante íFig» 6B), excepto conter também anticorpos gue apresentaram ligação mais forte aos octapeptídeos 11-16, os centros dos quais correspondiam aos resíduos 61-66 da IL-4 humana» Qs resultados dos painés A e B da Fig» 6, considerados em conjunto, sugerem que os resíduos 61-66 da IL-4 humana madura constituem um epítopo, anticorpos contra o qual inibem a ligação de IL-4 humana a receptores celulares»

Esta sugestão está fortalecida pelos estudos de ELISA realizados como descrito atrás usando os polipeptídeos N2 6 e 7 e um dos anticorpos monoclonais contra o polipeptídeo >M27» Este anticorpo ligou—se fortemente a ambos os polipeptídeos» Ele também inibiu fortemente a ligação de ^“‘l-IL-^- a células Dautíi»

A única subssquência comum nos polipeptídeos ê KDTRC corresponde aos resíduos 61-65 da IL-4 humana madura» que este anticorpo monoclona:

contra esta subsequência e a suhsequêncis epí topo importan te» a qua.i Seque—se inibidor deve ter sido dirigido deve constituir um π to sem 31 as te.mer

deste ._ X &Η ap&r esps e o ser ente para cs familiarizados com a matéria» As realizações cíficas aqui descritas sMo proporcionadas como, exemplo apenas invento deve ser limitado apenas pelos termos das reivindicac, fm* te í*í Isi’ 3 a

Claims (5)

1. iâ„ - Processo para & produção ds um polipeptídeo contendo entre cerca de 5 ε cerca de 26 resíduos ds aminoácidos e tsndo uma sequência ds aminoácidos correspondendo à sequência dos resíduos de aminoácidos 61 a 82 ou 1Θ4 a 129 da IL—4 humana ou uma sua subsequência, caracterizado por compreender o acoplamento tío número requerido de resíduos de amino-ácidos protegidos na cadeia lateral e a remoção dos referidos grupos protectores da modo a produzir-se o referido polipeptídeo»
2. 2ã» - Processo da acordo com a reivindicação i, caracterizado por o polipeptídeo ser covalentemente acoplado a um-a molécula vexculo»
3. 3®» - Processo de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo ter a sequência de aminoácidoss

   Lis—Asp—T re—Arg—Cis,

   T re-Ala-Gln—Gin—Fen-His-Arg-His,

   Li s-Asp-Tre-Arg-Cis-Leu-Gli-AIa-T re-A1a~B1n~Bln-Fen —His—Arg-Hi s-Lis-G1n--Lsu—11e~Arq—Fen ou

   AIa-Asn—G1n-Ser-Tre—Leu—G1u—Asn—Fen-Leu—G1u—Arg— •-Leu—L i s—T re— Ile—ne t - Ar g -Θ 1 u -L i s—T i r—Se r—Lis —C i s U fc? í CJ í ts
4. 4â_c - Anticorpo, caracterizado por se ligar especificamente a IL-4 humana e a um polipeptídeo contendo entre cerca de 5 e cerca de 26 resíduos de aminoácidos e tendo uma sequência de -aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos de aminoácidos

   1 íSá. “, ·! -~‘O ai a tíz ou anticorpo esse que inibe celulares»

   IL-4 humana, a liqação de uu Uiiiá^Wua subsequêi iu i a, IL-4 humana a receptores
5. 5ã» - Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado por ser contra um anticorpo que ss liga especificamente a IL-4 humana e a um polipeptídeo contendo entre cerca de 5 e cerca de 26 resíduos ds aminoácidos e tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos de aminoácidos 61 a 82 ou 104 a 129 da IL-4 humana» ou uma sua subsequência, anticorpo esse que inibe a ligação de IL—4 a receptores celulares-» rtecodo ptóí· e imbiçao da ixgaçáo oe Ic. 4 numana a receptores celulares, caracterizado por compreender o contacto de IL-4 humana com uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo :os! a reivindicação

   72·» - Método para inibição da receptores celulares, caracterizada por das células portadoras dos receptores quantidade eficaz de um anticorpo anti-i reivind icação 5« ligação de IL-4 humana a compreender o contacto da IL—4 humana com uma diotípico de -acordo com a

   Método paira produção de uma composição farmapUf f is an t .ica para tratamento de al IL-4, caracterizado por c οiogiuamencs aceicavel e corpos de acordo com uma er yiâb ou de uutrus estados empreender a mistura de um uma quantidade eficaz de um das reivindicações 4 ou 5» mediados veículo ou ma.is