PT92176B - Processo para a dissociacao selectiva de proteinas de fusao - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSHAFT, alema, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alema, (inventores: Dr. Lászlo Vértesy, Dr. Klaus Sauber e Dr. Eberhard Ehlers, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A DISSOCIAÇÃO SELECTIVA DE PROTEÍNAS DE FUSÃO.

Descrição

A presente invenção refere-se a úm processo para a preparaçao de polipeptídeos ou de proteinas por dissociação enzimática de uma proteína de fusão por meio de uma endopeptidase semelhante a tripsina.

A importância crescente da tecnologia de DNA recombinante para a obtenção de polipeptídeos e de proteínas exige o desenvolvimento de novos processos para o enriquecimento e purificação dos produtos, que estejam adapta_ dos aos novos produtos de partida.

Na preparaçao semi-sintética da insu lina humana que e utilizada no tratamento de diabetes mellitus, de acordo com o chamado processo em 2 passos, realiza-se a permuta do éster de aminoácido na posição B (insulina de porco = Ala— insulina humana=Thr) em 2 passos de reacçao su 30 cessivos, separados. No l⁹ passo da reacçao o radical B -Ala da insulina de porco é removido por dissociação enzimática

com proteases do tipo tripsina, e no 2² passo da reacçao é en tao acoplado um derivado de treonina por exemplo o éster t-bu. tílico de treonina (ThrOBu¹) - que é igualmente realizado na presença de enzimas do tipo tripsina. Como enzima para os 2 passos da reacçao é descrita a Achrmobacter-protease I, por exemplo por K.Morihara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 92, n^e 2, 1980, págs 396-402. Trata-se de uma das chamadas endopeptidases, que dissociam a cadeia peptídica especialmente no lado de carboxilo do aminoá_ eido lisina e eventualmente também a reconstroem de novo.

Depois de terminada a dissociação de alanina e o acoplamento do derivado de treonina, os grupos de bloqueio introduzidos com o derivado de treonina, com a finalidade de obtenção da insulina humana isenta de grupos de blo^ queio, sao dissociados de novo; para o efeito sao conhecidos diversos métodos, dos quais é eventualmente preferida a disso, ciaçao dos grupos de bloqueio por meio de ácido trifluoracétjL co .

A dissociação do radical B -Ala da insulina de porco e o acoplamento de um derivado de treonina também podem ser realizados num unico passo da reacçao (processo num passo). Também neste caso se tem que trabalhar na presença de um enzima, utilizando-se como enzima praticamente exclusivamente tripsina e endopeptidases do tipo tripsina; ver por exemplo EP-B-56951. Depois de terminada a transpept.i daçao, os grupos de bloqueio introduzidos com o derivado de treonina sao novamente dissociados.

Por razoes idênticas ensaiou-se também, na preparaçao de insulina humana, partir-se do produto de partida natural insulina de porco, o que, desde o desenvojL vimento da tecnologia genética, também foi conseguido com êxji to-pelo menos em parte. Assim, por exemplo, na especificação EP-B-89007 descreve-se um processo para a preparaçao de insulinas - especialmente de insulina humana - a partir de compos. tos análogos de pré-proinsulina obtidos por tecnologia geneti^ ca, no qual se fazem reagir os análogos de préproinsulina, a um valor de pH inferior ao ponto isoeléctrico da correspondeji

te insulina, com auxílio de uma tripsina ou de endopeptidases semelhantes a tripsina, com um éster de aminoacidos naturais, ou com os seus derivados, que contêm grupos de bloqueio (trans. peptidaçao) e seguidamente se dissocia o grupo éster e eventuaj mente os grupos de bloqueio existêntes. Para a preparaçao de insulina humana utiliza-se como derivado de aminoácido, nesta reacção, de preferência Thr(Bu^t) - OEu¹.

Como analogos de pré-proinsulina de partida referem-se na especificação mencionada aqueles que transportam, no terminus N da proinsulina, lisina ou arginina, ou os seus radicais acilaminoacilo, como extremidades carboxjl lo de uma pre-sequência; de acordo com a especificação EP-B é a seguinte a fórmula deste análogo de pré-proinsulina:

Cadeia C

AO Y ladeia A

OH _rB29

S

S

BO |

R -y -¹Cadeia na qual Y representa Lys ou Arg e R¹ representa hidrogénio, um L-aminoácido ou o radical peptídico X descrito adiante. X pode ser qualquer peptídeo que sirva de sequência sinal. Como parte proinsulina presta-se qualquer produto que seja codificado com uma proinsulina natural ou sintética, modificada segundo processos conhecidos de preparaçao de nucleótidos. Os análogos de pré-proinsulina com um segmento C-peptídeo encurtado, como é o caso por exemplo do C-peptídeo de vitelo relativamente ao C-peptídeo de porco, interessam igualmente para o processo. Sao também apropriados análogos de pre-proinsulina humana. É essencial para a estrutura do C-peptideo que esteja acoplado através de um L-aminoácido básico (Y=L-Arg ou L-Lys) com a glicina da cadeia A da insulina; ou seja, que exista uma estrura Y-(AS) -Y, na qual AS significa todos os

aminoácidos codificáveis e n é 0 a 35. Podem ser também escolhidos para o processo ésteres de aminoácidos e/ou os seus de rivados com grupos amino livres, tais que se forme eventualmente um análogo de insulina de sequência não natural.

Na reacçao enzimática a parte pré

R - Y bem como a cadeia C Υ^θ-Β^θ, sao dissociados e na po . - 30 siçao B e acoplado o correspondente derivado de aminoácido.

É previsível que neste caso se possa também obter a des-B -insulina sem adiçao do correspondente derivado de aminoácido.

Se bem que este processo possua vantagens consideráveis, especialmente devido à sua indepêndencia de insulinas animais como produtos de partida, todavia a necessidade de uma purificação cromatografica por coluna dos produtos da reacçao e a perda de substância daí resultante - frequentemente nao desprezível - consistuem uma desvantagem importante. A necessidade da purificação cromatográfica por coluna é justificada, uma vez que na reacçao enzimática se formam frequentemente produtos de dissociação dos peptideos, que só muito dificilmente se conseguem separar da insulina pretendida (ou derivado) sobretudo devido a um comprimento de cadeia molecular semelhante.

Subsistia, pois, uma necessidade de se modificar o processo da especificação ja mencionada EP-B-89007 de forma que se obtivessem polipeptídeos ou proteinas30

- de preferência des-B -insulina ou insulina humana - e que os produtos pretendidos ocorram numa forma facilmente purificável com menores perdas na purificação.

Este problema pode ser solucionado, de acordo com a invenção, por uma dissociação enzimática de proteínas de fusão especiais com uma endopeptidase semelhante a tripsina. As proteínas de fusão especiais sao compostos com a seguinte fórmula geral I

Lys - P - (Lys ^r2)„, - (Lys)_n (I)

na qual

R representa -(AS ) θ-( inib idor de 0(-amilase peptídico), em que AS representa um aminoácido codificavel geneticamente, com ejc cepçao de Lys, o. representa números inteiros de 0 até 200, de preferência de 5 a 100, especiaimente de 10 a 12, e inibidor de -amilase peptídico representa o radical de um inibidor de ot-amilase conhecido da literatura,

P representa o polipeptídeo ou proteína pretendidos,

R representa -(AS) -, em que AS tem o mesmo significado indi^ cado para R (aminoácido codificavel geneticamente, com excepçao de Lys), p representa números inteiros de 1 a 35, de preferência 1 a 10, especiaimente 1 a 3, e m e 0 ou 1>_ n.

objecto da invenção é, por conseguinte, um processo para a preparaçao de polipeptideos ou de proteínas, por dissociação enzimatica de uma proteína de fusão com uma endopeptidase semelhante a tripsina, o qual é caracterisado pelo facto de se utilizar como proteína de fusão especial compostos com a fórmula anterior.

Os polipeptideos ou proteinas forma- i dos por esta reacçao enzimatica - sao preferidos insulinas, como por exemplo des-B -insulina ou insulina humana - devido ao radical de inibidor de «-amilase da proteína de fusão, sao especiaimente fáceis de purificar. Os compostos sao facilmente solúveis em meio aquoso, sao fáceis de cristalizar e têm uma afinidade para ri-amilases, o que pode ser igualmente uti30 lizado para a sua preparaçao. Por exemplo, as des-B -insulinas sao susceptiveis de purificação, com menores custos e pe£ das mais reduzidas, do que os produtos de reacçao do processo da especificação EP-B-89007. Em casos favoráveis o tratamento do preparado reactivo pode mesmo ser simplesmente realizado por uma cristalizaçao - e por consequência sem a necessidade de uma purificação cromatográfica em coluna. É surpreendente que o radical de inibidores de «-amilase conhecidos da litera_ tura nao sejam dissociados na reacçao de acordo com a invenção pelas endopeptidases semelhantes a tripsina, porque estes

inibidores de οί-amilase possuem na sua cadeia peptídica um ra dical lisilo no qual se realiza qualquer dissociação - por exemplo, ao contrário dos radicais lisilo nas posições Αθ, Βθ e B dos compostos de partida da des-B -insulina (ver pág.

3); através de uma dissociação deste tipo formam-se fragmen- 30 tos que so se podem separar das des-B -insulinas com elevados custos, se for possível.

Os aminoácidos codificáveis genetica. mente (excepto Lys) que interessam para AS são Gly , Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Me t, Arg, His,

Tyr, Phe, Trp, Pro (os aminoácidos neutros estão sublinhados).

radical P representa de preferência as cadeias peptídicas A e B da insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente da insulina humana, ou de porco.

radical R consiste de preferência apenas nos aminoácidos Ala ou Thr, especialmente apenas em Thr .

Uma parte -(AS) - do radical R especialmente preferida é a cadeia peptídica: -Gly-Asn-Ser-Asn-Gly-Thr-Ala-Met-Ala-Asn-Phe-.

Como radical inibidor de ιχ'-amilase, de tipo peptidico, em R interessam praticamente todos os radji cais de inibidores de X-amilase conhecidos da literatura, como estão descritos por exemplo em:

L. Vértesy et al . , Euro. J. Biochem. 141, 505-512 (1984);

L. Vértesy, D. Tripier, FEBS-Letters Vol. 185, 187-190 (1985); 0. Hoffmann et al., Biol. Chem. Hoppe-Sey1ers Vol. 366, 1161-1168 (1985); H. Murai et al., J. Biochem. 97, 1129-33 (1985);

S. Murao et al. , Agric. Biol. Chem. 49 , 107-110 (1985) e 49, 793-797 (1985); Japan KoKai 75/77594 (20. Nov. 1973) H. Goto et al .

Ί

Os produtos especialmente preferidos | sao os compostos de fórmula I em que P é a sequência peptídi- | 2 !

ca da insulina humana ou insulina de porco, R representa Thr !

e R representa as sequências peptidicas anteriormente indicadas como preferidas.

A preparaçao das proteínas de fusão de formula I e realizada em microorganismos, segundo métodos genericamente conhecidos, por introdução de uma sequência de uma proteina estranha (inibidor de oí-amilase) antes da sequêri cia de aminoácidos do polipeptídeo ou proteína pretendidos (ver por exemplo F.A.O. Harston, Biochem. J. 240 (1986) 1-12).

Os análogos de pré-proinsulina prefje ridos, as proteínas de fusão de fórmula I na qual P representa as cadeias peptidicas A e B da insulina humana, insulina de porco ou insulina de vitelo, sao preparados por tecnologia genetica, de preferência segundo o processo do pedido de patente depositado simultaneamente, intitulado processo para a preparaçao de um precursor de insulina em estreptomicetos (HOE 88/F 313). 0 isolamento dos precursores de insulina, que em regra se separam no meio de cultura, é realizado de preferência a partir dos filtrados das caídas de fermentação. Descobriu-se que muitas das propriedades dos compostos caracteri. zados pela fórmula I se assemelham ao compostamento dos chama dos inibidores de fc-amilase. Consequentemente, muitos passos de isolamento e purificação dos referidos inibadores de ami la. se microbianos, para a obtenção dos percursores de proteínas de fusão, especialmente dos precursores de insulina, podem também ser aqui empregues.

Estes passos de purificação referidos sao precipitações com sais, como cloreto de sodio, sulfato de amónio, etc., com ácidos, como por exemplo ácido metafosfórico, taninos, ácido tricloroacético, acido sulfurico e semelhantes, com sais de metais pesados e outros agentes de precipitação, como por exemplo polietilenoiminas, bentonite ou outros .

Enquanto que as proteínas obtidas por tecnologia genética frequentemente apresentam comportamen

tos indesejáveis de solubilidade, e consequentemente se afastam da característica de fácil tratamento posterior, os compos tos de formula I, bastante solúveis, tais como os análogos de pré-proinsulina, podem ser concentrados numa forma muito elegante por ulta-filtraçao e ser simultaneamente sujeitos à eljL minaçao dos sais. Sao apropriadas para a ultra-filtração, por exemplo, membranas de celulose existentes no comércio.

Podem igualmente ser utilizadas resi. nas de adsorçao para a acumulaçao e purificação dos precursores dos compostos de fórmula I, como por exemplo os precursores de insulina. Estas resinas de adsorçao à base de c o políme. ros de poliestireno ou estireno/divinilbenzeno, podem ser obtidas comerciaimente e podem ser identificadas pelas designações (R) Amberlite XAD (Rohm & Haas, USA) (R)Diaion HP-2O (Mitsubishi Chemical Corp.) etc.

isolamento de uma proteína com resinas de adsorpçao, como por exemplo Diaion HP-2O, já foi de_s crita em DOS 3 038 130. As proteínas obtidas pela tecnologia genetica, como por exemplo precursores de insulina, nao podem ser concentradas com resinas de adsorçao, ou podem-no apenas à custa de grandes perdas. Isto é devido, entre outras razoes, à aderência demasiado forte da substância ao suporte. Surpreeji dentemente, verificou-se agora que se podem utilizar ainda vantajosamente resinas de adsorçao se se procurar uma ligaçao do material mais moderada e mais fraca. Esta inactivaçao pode ser conseguida, por exemplo, por tratamento do suporte e/ou por meio de aditivos apropriados ao suporte a separar. Como exemplos para o caso do tratamento do suporte citam-se: lavagem com dissolventes orgânicos aquosos (2 a 70%, de preferência 5 a 30% de proporção de dissolvente). Como dissolventes orgânicos interessam aqueles que sao miscíveis com agua; os preferidos são álcoois inferiores e acetona. 0 tratamento pre_ vio do suporte pode ser ainda realizado por lavagem com soluçoes aquosas de detergentes, por exemplo com solução a 0,02 a 3% de (R) Triton X-100, mas de preferência com uma solução 0,1 a 1%, mas também sao igualmente apropriados, como ê evidente, um grande número de outros detergentes.

É igualmente adequada a mistura da s<3 lução de separaçao e/ou do eluente com aditivos apropriados. Estes aditivos são dissolventes e detergentes orgânicos inferiores, miscíveis com agua, cada um nas concentrações mencionadas previamente, ou as chamadas substâncias caótropas, como por exemplo perclorato de potássio (0,1 a 3%), ureia (1 a 8 molar) ou cloridrato de guanidínio, etc.

Os precursores de proteínas de fusão (por exemplo, precursores de insulina) eventualmente enriquecidos e isentos de sais, podem ser posteriormente purificados por cromatografia por permuta de ioes em permutadores de catioes, bem como também em permutadores de anioes. Os permutadores de catiões apropriados sao por exemplo

SP- ^Sephadex, (Pharmacia, Suécia) CM-Celulose,

S-(R)Sepharo se (Pharmacia, Suécia), ^^Fractogel TSK CM (E. Merck, Darmstadt), ^^Fractogel TSK SP (E. Merck, Darmsta dt) e outros. Os permutadores de anioes apropriados sao (R^Fractogel TSK DEAE (E. Merck, Darmstadt), DEAE-Celulose, DEAE-)Sephadex (Parmacia, Suécia), Q-Sepharose, QAE-Sephadex, QAE-Celulose e outros. As separações sao realizadas de forma conhecida por si em solução aquosa. Revelou-se conveniente, no entanto, em muitos casos, adicionar a agua, nas sepa rações, auxiliares de dissolução e/ou substâncias caótropas. Estes aditivos sao ureia 2 a 8 molar, betaina, álcoois inferiores, tais como metanol, isopropanol, etanol, etilenoglicol e outros. As operaçoes de purificação apropriadas sao ainda a cromatografia hidrófoba, por exemplo através de f enil-Sephar o_ se, cromatografia através de crivo molecular, por exemplo por meio de Biogel, crornatografia líquida de alta pressão prepara tiva, ou a cromatografia através de uma coluna carregada com anti-corpos contra o inibidor de X-amilase.

As propriedades semelhantes ao inibjç dor de x-amilase do precursor de insulina possibilitam também a purificação por cristalizaçao.

Pode-se promover a cristalizaçao tan to na vizinhança de cada um dos pontos isoeléctricos, ou em meio ácido, eventualmente com utilização de aditivos, como

rea por exemplo cloreto de sodio ou outros. Também e possivel lizar-se a cristalizaçao em solução aquosa por adição de agen tes que promovem a cristalização, como por exemplo de iões de metais pesados, tais como Zn^ , Cu^*” e outros, de acido pícri co e semelhantes.

É ainda bastante vantajoso fazer-se uso das propriedades inibidoras de β-amilase das proteínas de formula I ou dos seus produtos de dissociação, para a purificação. Descobriu-se, designadamente, que as proteínas obtidas por tecnologia genetica, que transportam as sequências de ami noácidos dos inibidores, também inibem as o(-amilases por complexaçao. Os complexos inibidor/κ-amilases são mais dificilmen te solúveis do que os componentes de partida e, por conseguin_ te, pode recorrer-se a eles para a separaçao. Pode-se também separar selectivamente, do filtrado da cultura, os compostos de formula I por meio de amilases fixadas ao suporte, e separar em seguida os complexos obtidos por meio de agentes apropriados, como por exemplo gradientes de pH ou gradientes saU nos. Esta via de processo é vantajosa também no tratamento de hidrolisados proteolíticos do composto de fórmula I. Elimina-se da mistura reactiva no presente caso, com p(-amilases fixa_ das, o produto de dissociação do inibidor já desnecessário. 0 produto remanescente (composto de fórmula I, especialmente des- -insulina humana) está então já tao pura, que pode ser utilizada directamente na cristalizaçao. A cristalizaçao e realizada por métodos conhecidos por si.

Para a dissociação enzimatica dos compostos correspondentes a fórmula I sao utilizados precurso res purificados, mas também podem utilizar-se produtos de par_ tida apenas purificados parcialmente.

A concentração dos produtos de parti_ da de fórmula I na mistura reactiva pode oscilar dentro de M mites relativamente amplos. É preferida uma concentração de cerca de 0,02 a 15% em peso, especialmente de cerca de 0,05 a 5% em peso, referida à mistura reactiva global.

Como endopeptidases semelhantes a tripsina interessam as endopeptidases que já sao conhecidas

da literatura como semelhantes à tripsina, isto é, aquelas que dissociam especificamente ligações peptídicas na extremidade carboxilo de aminoácidos básicos; são indicadas algumas fontes de literatura correspondente na especificação já mencionada atrás EP-B89 007, ou as que dissociam selectivamente atras da lisina, ver por exemplo EP—A—092 829 ou patente americana US-A-4 414 332. A endopeptidase semelhante à tripsina preferida é a lisilendopeptidase oriunda de Lysobacter enzymo genes, a qual dissocia ligações peptídicas na extremidade car boxilo, especialmente do aminoácido básico lisina. A literatjj ra que especificamente se refere às lisilendopeptidases é por exemplo

P. A. Jeckel et al . , Analytical Biochemistry, vol 134 (1983), págs. 347 - 354 e

T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Akad . , Vol. 660, págs.

44f e 51 f e seguintes (1981).

A concentração das endopeptidases se melhantes a tripsina na mistura reactiva é ajustada convenien temente para um valor entre cerca de 1/50 e 1/10 000, de preferência entre 0,5 e 1,5^ (p/p)» especialmente de cerca de 1/1000 do peso da proteina de fusão de fórmula I.

A dissociação enzimática dos compostos de fórmula I é realizada em solução aquosa, eventualmente na presença de um auxiliar de dissolução (como por exemplo ureia, isopropanol, etc.) a um valor de pH compreendido entre cerca de 5 e 11, de preferência entre cerca de 7 e 9,5. Para o ajustamento e a manutenção constante do valor do pH e conve niente utilizar-se um sistema tampao corrente, como por exemplo tampao de fosfato, tris/HCl, NaC0/NaHCO.

A temperatura da dissociação enzimatica pode situar-se entre cerca de 1 e 60°C; trabalha-se de preferência a um valor entre cerca de 15 e 40°C.

A dissociação em geral está terminada após cerca de 0,1 a 2 horas, todavia - consoante as condiçoes especiais da reacçao - também podem ter lugar períodos de tempo mais curtos ou mais longos.

Depois do termo da dissociação enzi12

matica o que pode ser determinado por exemplo, cromatográfi camente - para-se também, de forma conhecida, uma outra disso ciaçao provável, indesejável, por modificação do meio reactivo, por exemplo por modificação do pH, arrefecimento, adição on de inibidores, etc. , e a des —B — insulina formada e isolada por processos conhecidos por si. 0 isolamento pode ser realizado nomeadamente por cromatografia, como no processo conheci, do descrito, mas no presente caso em princípio também é possí vel realizar-se o isolamento por cristalização, porque a desB -insulina se distingue profundamente dos produtos secundários no que se refere ao comprimento da cadeia e, consequente mente, ao peso molecular.

Uma trans-peptidaçao é realizada numa solução aquosa-orgânica (por exemplo água: dimetilformamida , água: sulfóxido de dimetilo) em todas as proporçoes de mistura, de preferência misturas de 1:4 até 1:1 (dissolvente: água). 0 valor do pH deverá estar compreendido entre 4 e 8, de preferência entre 5 e6; a temperatura devera situar-se entre 1 e 50°C, preferivelmente entre 15 e 30°C.

Depois de terminada a tr ans-peptida_ çao enzimática, o qual pode ser determinado por exemplo por

HPLC, impede-se uma possível reacçao contrária, como por exem 30 pio de des-B -insulina, por adiçao de inibidores, como por exemplo aprotinina, butilamina ou tosil-L-lisinocloromet il-ce_ tona. Seguidamente pode diluir-se sem qualquer problema e purificar-se preparativamente através de cromatografia em coluna, e deste modo também se podem eliminar produtos de partida nao reagidos. É igualmente possível, neste caso uma cristalização. A dissociação dos grupos de bloqueio é realizada segun do métodos conhecidos da literatura.

processo de acordo com a invenção será agora elucidado mais pormenorizadamente através dos seguintes exemplos. Depois dos exemplos (da invenção) segue-se ainda um exemplo de comparaçao, o qual mostra que a dissociação enzimatica de um analogo de pre —proinsu 1 ina de formula ge_ ral descrita na especificação EP-B-89 007 com lisilendopeptidase, produz um produto de reacçao cujo tratamento pós-react^

vo é mais difícil e origina maiores perdas.

Exemplo 1 litros da calda de cultura que foi fermentada para obtenção do construído pGF2 são centrifugados e em seguida filtram-se de novo para esterilização. A solução, ajustada a pH 7,2, e misturada com 3 litros de iso — propanol e é passada através de uma coluna de 4 litros de Diaion HP—20 que tinha sido previamente lavada com isopropanol a 10%. Por aplicaçao de um gradiente 10-50% elui-se da co luna a proteína reconstruída pGF2. As fracçoes contendo o pro. duto pretendido sao em seguida aplicadas directamente a uma / n \ coluna Fast Flow já preparada de DEAE- ' Sepharose (Pharmacia, Suécia) pH 7,2, 300 ml (5 x 15 cin ) lavam-se com tampao de fosfato e finalmente elui-se com um gradiente de cloreto de sódio 0 a 0,5 molar, pH 7,2. A proteína pGF2 encontra-se nas fracçoes nas quais a conductibilidade da solução é de 20 a mS. Estas sao reunidas e promove-se a precipitação com sulfato de amónio (saturaçao 35%). 0 sedimento assim formado e removido por centrifugação depois de 16 horas, e lavado com água, é novamente precipitado por ajustamento do pH ao valor 4,6 e este último sedimento é recuperado por centrifugação de. pois de 2 horas. Obtém-se a proteína pGF2 já bastante concentrada. A purificação final é realizada sobre 'Macrobore Nucleosil (Macherey e Nagel, Duren) 120-10 C4, sendo o comprimento da coluna dimensionado de modo que se separem 100 mg de pGF2 em 100 ml de volume da coluna. A eluição da coluna HPLC preparativa é realizada igualmente com o sistema acido trifluoracético 0,1/acetonitrilo. A eluição da proteína de fusão é realizada com acetonitrilo a 33%. A secagem em vácuo conduz à substância solida.

Exemplo 2 mg da proteína de fusão que foi obtida segundo o exemplo 1, são dissolvidos em 0,4 ml de tampão de acetato de sódio, pH 5,3, e 0,1 ml de dimetilformamida. Adicionam—se-lhes 140 mg de Thr(Bu )0Bu e 50 1 de lisil^

endopeptidase (2,7 mg/ml; dissolvido em água). 0 todo é deixa do em repouso à temperatura ambiente. Por meio de HPLC (siste ma idêntico ao do exemplo 3) acompanha-se a reacçao analítica mente.

A intervalos de tempo regulares reti_ ram-se amostras que se fazem precipitar com o dobro de volume de metanol e com um volume décuplo de éter metil-butílico. 0 sedimento e tomado num volume décuplo de ácido trifluoracético a 0,1% e e analizado por HPLC. Depois de 40 horas formam-se cerca de 55% do ester de insulina humana. 0 resto e essen cialmente des-B^-insulina .

Exemplo 3 sedimento obtido no exemplo 1 e to mado na quantidade mínima possível de ácido trif1uoracético a

0,1% e é separado por HPLC preparativa. Como fase estacionaria TM utiliza-se uma Bakerbond Wide-Pore Cg/5 ^{um COm aS me}di4as 4,6 x 250 mm. A fase móvel é composta do seguinte modo:

A: 0,1 % TFA

B: A/CH₃CN 10/90 débito é de 1,3 ml/min. 0 gradiente é constituído do seguinte modo:

t	%
0	25
20	45
25	45
28	25
35	25

A des-B -insulina e eluida a 15,14 min., o éster de insulina aos 20,92 min. As fracções sao submetidas a eliminação do dissolvente em vacuo, o solido e lava_ do repetidamente com acetonitrilo e elimina-se depois o dissoJL vente em vacuo.

Exemplo 4 latwUi ffiBnaÍ

100 mg da proteína pGF2 são dissolvi, dos em 10 ml de tampão tris/HCL, pH 8, e são incubados com 50 mU de lisilendopeptidase. Após 2,5 h a reacção é parada por adiçao de ácido até pH 3, de ácido trif luoracético, e a mistu, ra reactiva é separada em fase reversa. Um pico nítido, eluído por meio de acetonitrilo a 30%, marca o aparecimento da 30

B -destreonina-insulina humana no eluido da coluna. 0 produto, depois de removido o dissolvente, pesa 35 mg, correspondentes a 95% do rendimento teórico.

Exemplo 5 mg de o(-amilase de pâncreas de porco sao dissolvidos em 35 ml de tampao de fosfato de potássio 0,5 M, pH 7,8, e sao dialisados uma noite contra o mesmo tampao.

g de ^(R)Affigel 10 (BioRad 153-6046) são lavados segundo as recomendações do fabricante e sao equilibrados com tampao 0,5 M de fosfato de potássio (ver acima), 0 gel húmido assim obtido é levado a reagir com a solução do enzima, mediante leve agitaçao, à temperatura ambien te, durante 2 h. Seguidamente é isolado por filtraçao e e lavado rapidamente com o tampao de ligaçao. Em seguida realiza—se a inactivaçao do suporte durante 1/2 h com etanolamina a 0,1 M, pH 8,0, e finalmente filtra-se de novo para isolamento, e lava-se várias vezes com cloreto de sodio 1 molar e tampao de ligação, alternadamente. Obtêm-se cerca de 44 g do gel húmido, que e guardado a 4 C em azida a 0,02%, em tampao de fos_ fato de potássio 50 mM. Obtem-se o seguinte balanço de liga— çao:

inicial:	1004 unidades	= 100%
água de lavagem absorvida:	705 unidades	= 70%
suporte:	181 unidades	= 18%
processo de ensaio;	Test-Ki t	Testomar de

Behring; realizaçao segundo as reco mendaçoes do fabricante.

Exemplo 6 g da amilase fixada segundo o exemplo 4 sao agitadas em 200 ml de agua conjuntamente com 10 mg de pGF2 obtida segundo o exemplo 4, sem purificação, median te adiçao de um inibidor de prótese. Depois de um quarto de hora isola-se por filtraçao e a fase líquida é liofilisada. Resultam daqui 5 mg de um produto incolor que é tomado num pouco de agua e, mediante adiçao de Zn , conduz à des-B^J -in. sulina cristalina.

Claims (4)

1. Reivindicações

   - I^a Processo para a preparaçao de um po_ lipeptídeo ou proteína por dissociação enzimática de uma proteína de fusão com uma endopeptidase semelhante a tripsina, caracterizado pelo facto de se utilizar como proteína de fusão um composto de formula 1

   1 \ Γ

   R - Lys P - (Lys - R )_m - (Lys)_n (I) na qual

   R representa -(AS)θ-(inibidor de rf-amilase peptídico) em que AS representa um aminoácido codificável geneticamente, com excepçâo de Lys, representa números inteiros de 0 até 200, de preferência de 5 a 100, especialmente 10 a 12, e inibidor de d-amilase peptídico representa o radical de um inibidor de <-amilase conhecido da literatura,

   P representa o polipeptideo ou proteína pretendida, r
2. 2 representa -(AS) —, em que AS tem o mesmo significado indi;. cado para R (aminoácido codificável genêticamente com excep— çao de Lys)

   P representa numeros inteiros de 1 a 35, de preferencia 1 a 10, especialmente 1 a
3. 3, e

   17 lí

   - 2^a Processo de acordo com a reivindica^ çao 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como proteína de fusão um composto de fórmula I no qual R consiste apenas em Ala ou Thr, especialmente apenas em Thr, e m e n têm cada um o valor 1.

   - 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado pelo facto de se utilizar como proteína de fusão um composto de fórmula I no qual

   R = -Gly-Asn-Ser-Asn-Gly-Thr-Ala-Met-Ala-Asn-Phe

   -Leu-Cys-S-S-Cys-Leu-Gly-Glu-Thr-Asp-Asp-Glu-Tyr-Val-Val-Lys-

   Arg AÍa Tyr Leu l Ala Tyr vÁi 1 ^A(g Ala Ala Pyo Hys Gly G)-y Gin His iíe 1 Ser Thr Gly Thr Ile vÁi Tyr Gly Gly- —Asp

   '—Val-Thr-Val-Thr-Glu-Ala-Cys-S-S-Cys-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu-Ser-Val-Thr-ThrGÍy I -Asp ι

   Asn y_ai Asp 1 Thr 1 Ala Leu GÍn 1 Tyr Ser Gin Tyr Ser Aég —Trp

   fc
4. 4^a

   Processo de acordo cora uma ou mais das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo facto de se utili. zar a proteína de fusão de fórmula I numa concentração de cer ca de 0,02 a 15% em peso, de preferência de cerca de 0,5 a 5% em peso, referido à mistura reactiva global.

   - 5^a Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo facto de se utili. zar como endopeptidase semelhante a tripsina a lisilendopepti. dase .

   - 6^a Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo facto de se utili. zar a endopeptidase semelhante a tripsina numa concentração compreendida entre cerca de 1 quinquagésimo (1/50) e um décimo milésimo 1/10 000) do peso da proteína de fusão de fórmula I.

   - 7^a Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo facto de se reali zar a dissociação enzimatica em solução aquosa, eventualmente na presença de um auxiliar de dissolução, de pH compreendido entre cerca de 5 e 11, preferivelmente entre cerca de 7 e 9,5.

   - 8^a Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7 caracterizado pelo facto de se tratar o preparado reactivo, depois de terminada a dissociação enzimática, por cristalização.

   j!

   A requerente reivindica a priorida! de do pedido alemao apresentado em 3 de Novembro de 1988, sob ! o n².P 38 37 271.1.

   Lisboa, 2 de Novembro de 1989 0 AGENTE OTICÍAL DA PKOPUIEDAOE INDESTRUr,

   A invenção refere-se a um processo para a preparaçao de um polipeptídeo ou proteína por dissocia, çao enzimatica de uma proteína de fusão com uma endopeptidase semelhante a tripsina, que compreende utilizar-se como proteí. na de fusão um composto de formula I

   R - Lys - P - (Lys - R ) - (Lys) (I)