PT89806B

PT89806B - Processo de preparacao de antibioticos macrolidos antiparasiticos

Info

Publication number: PT89806B
Application number: PT89806A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; David Austen Perry; Junsuke Tone; Mark Andrew Haxell
Original assignee: Pfizer Ltd
Priority date: 1988-02-25
Filing date: 1989-02-23
Publication date: 1994-04-29
Also published as: DK86589D0; GB8804440D0; ES2113340T3; DE68928606T2; US5589366A; US5510372A; JPH0699437B2; JPH01272588A; EP0334484A2; ATE164161T1; DK169738B1; DE68928606D1; EP0334484A3; PT89806A; US5573946A; DK86589A; CA1339965C; EP0334484B1

Description

Este invento diz respeito a novos agentes antiparasíticos e em particular a umas séries de novos antibióticos macrólidos relacionados com as milbemicinas e avermectinas, e ao processo para a sua preparação e a suas composições.

As avermectinas e as milbemicinas formam um grupo importante de agentes antiparasíticos num largo espectro, possuindo actividades antelmíntica, ectoparasíticida, insecticida, antibacteriana, antifungicida e a actividade promotora de crescimento comaplicação nas áreas de saúde animal e humana, na agricultura e na horticultura. Ascavermectinas, anteriormente conhecidas como os compostos C-076, são produzidos através de fermentação de uma estirpe dos microorganismos Streptomyces avermitilis ATCC 31267, 31271 ou 31272, sob condições aerôbicas em meio nutriente aquoso, que contem sais inorgânicos e fontes assimiláveis de carbono e de azoto.

A produção, o isolamento e a estrutura química dos oito componentes individuais que formam o complexo C-076 estão descritos na especificação de patente Britânica 1573955. As milbemicinas são antibióticos macrólidos estruturalmente relacionados, com falta de resíduos de açúcar na posição 13. Elas são produzidos por fermentação, por exemplo usando o Streptomyces hygroscopicus spp aureolacrimosus B-41-146, como descrito na especificação de patente Britânica 1390336, ou usando o Streptomyces cyaneogriseus spp noncyanogenus NRRL 15773, como descrito em EP-A-0170006, ou usando o Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, como descrito na aplicação de patente Britânica GB 2 2166436.

Na pesquisa de novos antibióticos, a modificação estrutural dos antibióticos conhecidos ê tentada sempre quando possivel. Contudo, esta tentativa é limitada a modificações que retêm a actividade desejada. Muitos antibióticos, incluindo as avermectinas e as milbemicinas, têm uma estrutura tão complexa que muitas modificações podem ser di-5-

fíceis de fazer por meios químicos. Por consegiijíite, a descoberta de novos antibióticos produzidos por processos de fermentação contínua, ê de maior importância mesmo nos casos onde o antibiótico, uma vez reconhecido, ê bastante similar a um antibiótico previamente conhecido.

Descobriu-se agora um grupo de novos antibióticos macrólidos, colectivamente designados, nesta memória descritiva, como N787-182, que são produzidos através de cultura de um novo microorganismo do género Strepmyces como aqui descrito, em conjunto com alguns compostos relacionados, preparados a partir de compostos N787-182 por processos de transformação química simples. Os compostos possuem um espectro largo de actividade contra pestes de insectos, acarídeos, nematoídes de vida livre e endo- e ectoparasítas que afligem os animais e os humanos.

Deste modo, o presente invento fornece compostos com a estrutura seguinte:

OR

em que os substituintes R, no quadro seguinte:

são .os representados

Compound	R	R_	R_	R_
N787-182	- 1	^CH3	OH	OH	H
N787-182	- 2	H	OH	OH	ococh(ch₃)
N787-182	- 3	ch₃	OH	OH	ococh(ch₃)
N787-182	- 4	H	ococh(ch₃)₂	OH	H
N787-182	- 5	ch₃	ococh(ch₃)₂	OH	H
N787-182	- 6	H	OCOCH(CH₃)₂	OH	ococh(ch₃)
N787-182	- 7	ch₃	OCOCH(CH₃)₂	OH	ococh(ch₃)
N787-182	- 8	11	H	OH	0C0CH(CH₃)
N787-182	- 9	H	OCOCH(CH₃)₂	H	H
N787-182	- 10	CH₃	OCOCH(CH₃)CH₂CH₃	OH	0C0CH(CH₃)
N787-182	- 11	^CH3	H	OH	OCOCH(CH₃)
N787-182	- 12	CH_?	OCOCH(CH„)„	H	H

esqueleto de carbono da estrutura anterior apresenta uma semelhança próxima à das avermectinas e milbemicinas. Contudo, os vários componentes individuais definidos acima, nunca tinham sido anteriormente obtidos. Em particular, alguns dos compostos N787-182 são unicamente diferenciados das milbemicinas e das avermectinasnaturais conhecidos por elas possuem um substituinte Beta-òxígénio ligado na posição C-13 (indicado por ligações em cunha a cheio mostrada na fórmula I). Este aspecto estrutural é impostante para as actividades biológicas destes compostos. Outros detalhes de estereoquímica não foram completamente definidos, mas a estrutura apresentada na fórmula (I) ê proposta por analogia com, membros conhecidos desta classe.

Os antibióticos macrôlidos N787-182 factores 1-12 são produzidos por fermentação aerôbica submersa em meio nutriente aquoso de um microorganismo isolado de uma amostra do solo tirada em Kinashiki City, Okayama Prefecture, Japan. 0 microorganismo ê classificado do gênero Streptomyces, na base da morfologia e química da célula e ê considerado como sendo da nova estirpe Streptomyces hygroscopicus designado, nesta memória descritiva, como Streptomyces sp ATCC 53718.

Alguns dos compostos N787-182 podem ser obtidos por interconversão, usando procedimentos químicos publicados. Por exemplo, aqueles compostos que contêm um substituinte metoxi na posição C-5, podem ser convertidos aos compostos hidroxi na posição C-5. Esta reacção ê realizada através do tratamento do composto 5-metoxi, ou um seu derivado adequadamente protegido, com acetato de mercúrio e hidrólise do éter de 3-acetoxi-enol com ácido diluído para originar o composto 5-ceto. Isto ê depois reduzido, usando por exemplo, boro-hidreto de sódio, para dar o derivado 5-hidroxi. Os reagentes e as condições reaccionais apropriados para estes passos estão descritos na patente N.A. 4423209. Assim, por exemplo, ο N787-182 factor 12 pode ser convertida no N787-182 factor 9, usando este procedimento. Mutuamente, os compostos contendo um grupo 5-hidroxi podem ser convertidos no derivado 5-metoxi correspondente. Esta reacção ê realizada através do tratamento do composto 5-metoxi, ou um seu derivado adequadamente protegido, com iodeto de metilo e óxido de prata (I) num solvente inerte. Os reagentes e as condições reaccionais

apropriados estão descritos na patente N.A. 42.005.81. tes meios, por exemplo, ο N787-182 factor 9*pode ser do a N787-182 factor 12.

Por esconvertiAqueles compostos com falta de um substituinte na posição C-22 podem ser obtidos a partir do composto hidroxi na posição C-22 correspondente, ou de um seu derivado adequadamente protegido, por um procedimento redutivo apropriado. Por exemplo, o factor 5 pode ser reagido com o p-toli1-cloro-tionoformato na presença de uma base como a piridina, com ou sem adição de um solvente inerte. 0 tionocarbonato na posição C-22 resultante ê depois reagido com hidreto de tri-n-butiltina num solvente inerte na presença de um inibidor de radical adequado, como azo-bis-isobutironitrilo para dar o factor 12.

Esses compostos com falta de um substituinte na posição C-13 pode ser oxidados nesta posição, usando o composto 5-ceto correspondente, como um intermediário. Isto pode ser preparado a partir do composto 5-metoxi através do tratamento com acetato de mercúrio, como descrito acima, ou por oxidação de um composto 5-hidroxi, ou um seu derivado adequadamente protegido, com dióxido de manganésio, como descrito por exemplo em EP-A-0238258. 0 composto 5-ceto ê depois tratado com dióxido de selénio num ácido carboxílico como solvente, como o ãcido fórmico, para originar um produto que contem um substituinte 13-beta-aciloxi. Se desejado, o grupo 13-aciloxi pode ser hidrolizado a um grupo 13-hidróxi através do tratamento com um ãcido ou uma base, por exemplo, usando ãcido clorídrico ou ãcido p-tolueno-sulfônico, num solvente orgânico como metanol ou dioxano.

Em alternativa, o grupo 13-aciloxi pode ser hidrolizado por tratamento com um ácido de Lewis, como trifluoreto de boro num solvente alcoólico, como metanol, para dar um composto 13-hidroxi.

grupo 13-hidroxi phde por sua vez, ser acilado com um grupo carboxílico diferente, por tratamento com um haleto de acilo ou um anidrido na presença de uma base, como a piridina. Os reagentes e as condições reaccionais apropriadas estão descritos em EP-A-0184308. Finalmen te o grupo 5-ceto ê reduzido a um grupo 5-hidroxi, usando boro-hidreto de sódio, como descrito acima. Deste modo, usando estes procedimentos, por exemplo ο N787-182 factor 8 pode ser convertido no N787-182 factor 6, por meio do N787-182 factor 2, como um intermediário.

Finalmente, o grupo acilo na posição 13 pode ser removido do N787-182 factor 4, do N787-182 factor 9 ou do N787-182 factor 12 para dar os novos compostos 13-hidroxi correspondentes.

A quebra do éster pode ser obtida por vários meios, que incluem a hidrólise catalisada por ácido ou base ou através tratamento com um agente redutor, como hidreto de alumínio e lítio num solvente inerte, como o éter di-etílico ou tetra-hidrofurano, a uma temperatura entre os -80⁹C e Os 30^aC, preferencialmente aos -23²C.

Deste modo o presente invento também fornece compostos tendo a fórmula (I) anterior, em que os substituintes são:

Composto	R		ή	s!
Composto 13	H	OH	OH	H
Composto 14	H	OH	H	H
Composto 15	ch₃	OH	H	H

Os compostos, preferidos, basiados na sua actividade antiparasítica, são N787-182 factores 4, 6, e 9.

Os microorganismos são caracterizados por serem plantados, a partir de um plano inclinado, num caldo ATCC n⁹. 172 e incubados durante quatro dias aos 28^{1 2 3 4 S 6}C, num agitador. Depois são centrifugados durante 20 minutos, lavados três vezes com ãgua destilada estéril e plantados num meio, normalmente usado para a identificação dos membros dos Actinomicetalor, como serâ depois aqui descrito. A cultura foi incubada aos 28⁹C e os resultados foram lidos a tempos varidos, mas mais normalmente tirados aos 14 dias. As cores foram descritos em terminologia comum, mas as cores exac tas foram determinadas por comparação com amostras de cor de Colour Harmony Manual, quarta edição. Os métodos de análise do açúcar e dos amino-âcidos de célula total são os descritos em Becker, B et al, Appl. Microbiol., 12, 412-423, 1964; e em Lechevalier, M.P., J. Lab. Clin. Med., 7j_, 934-944, 1968.

A indentificação do meio usado para a caracterização da cultura e as referências para a sua composição são as seguintes:

1. Caldo de extracto de levedura-triptona-(meio ISP n⁹. 1, Difco).

2. Agar de Extracto de Malte-Extracto de Levedura (meio ISP n⁹. 2. Difco).

3. Agar de farinha de aveia (meio ISP. n⁹.3, Difco)

4. Agar de amido-sais inorgânicos-(meio ISP n⁹. 4, Difco)

5. Agar de AsparaginâèGlicerol-(meio ISP n⁹ 5, Difco).

6. Agar de ferro de Extrato de levedura-peptona-(meio ISP n⁹. 6, difco)

7. Agar de Sacarose-Czapek-(S.A. Waksman,.;jTtie.Xctinomycetes, Vol. 2, meio n^e. 1, p. 328, 1961.

8. Agar de Asparagina-Glucose - Ibid, meio n^Q. 2, p 328.

9. Agar de Bennett - inib, meio n^s. 30, pág. 331.

10. Agar de Emerson - Ibid, meio n². 28, pãg. 331.

11. Agar Nutriente - Ibid, meio n²14, pãg 330.

12. Agar de tirosina de Gordon e Smith - R. E. Gordon and M.

M. Smith, J. Bact., 69, 147-150, 1955.

13. Agar de Caseína - Ibid.

14. Agar de Gelatina - R.E. Gordon and J. M. Mihm, J. Bact., 73, 15-27, 1957.

15. Agar de amido - Ibid

16. Caldo de nitrato orgânico - Ibid.

17. Agar de Cenoura-batata - Μ. P. Lechevalier, J. Lab. and Clin. Med., 71, 934-944, 1968, mas usar unicamente 30 g de batata, 2,5 g de cenoura e 20 g de agar.

18. Agar de água de torneira a 2%.

19. Caldo de nitrato de destrose - S. A. Waksman, The Actino mycetes, vol. 2, meio n². 1, p. 328, 1961, com 3 g de dextrose substituído por 30 g de sacarose e agar omitido.

20. Utilização de Celulose

a) H. L. Jensen, Proc. Linn, Soc. N.S.W., 55, 231-248, 1930.

b) M. Levine e H. W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, meio n^s. 2511, 1930.

21. Skimmed Milk - Difco.

22. Utilização de hidrato de carbono - (meio ISP n^s. 9, Difco)

23. Gama de temperatura - meio ATCC 172 em ATCC Culture Collection Catalogue, 15th ed., p. 608, 1982.

As observações de. Ore-scimento aparência do organismo foram os seguintes:

Agar de Extracto de Malte - Extracto de levedura - Bom crescimento, castanho amarelado claro, amarelado, cinzento amarelado a cinzento (3 ec., 1 1/2 ec, 1 1/2 ge, 1 1/2 ig); expandido, com vincos; micêlio gasoso amarelado, cinzento amarelado e cinzento (1 1/2 ea, 1 1/2 ec; 1 1/2 ge, 1 1/2 ig); castanho amarelado claro invertido (2 gc); pigmento solúvel castanho amarelado (3 1c).

Agar de farinha de Aveia - Crescimento moderado; creme, cinzento claro, cinzento, cinzento rosado, cinzento escuro a preto (2 ca, séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe, 5 fe, 3 ml, po); ligeiramente expandido, liso a granular; micélio gasoso cinzento claro, cinzento, cinzento rosado, cinzento escuro a preto (séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe, 5 fe, 3 ml, po) com algumas partes higroscópicas; cremes, cinzento, cinzento escuro a preto invertidos (2 ca, séries de cinzento próximas 3 fe, 3 ml, 3 po); pigmento solúvel creme a amarelado claro (2 ca, 2 ca).

Agar de amido - Sais inorgânicos - Crescimento moderado, creme (2 ca); com micélio gasoso amarelado claro, cinzento claro a cinzento escuro (2 ca, 2 ea, séries de cinzento próximos 3 dc, 3 fe, 3 ih, 3 ml); ligeiramente expandido; liso a granular, pode estar ligeiramente enrugado em direcção a uma esquina; creme, cinzento claro, cinzento a cinzento escuro invertidos (2 ca, séries de cinzento próximos 3 fe, 3 ih, 3 ml, dc); pigmento solúvel amarelado claro (2 ia).

Agar de Asparagina-Glicerol - Crescimento pobre, creme (2 ca), fino, liso, nenhum micélio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Sacarose - Czapek - Crescimento moderado, creme (2 ca); fino, liso, com umas poucas partes'dé micêlio gasoso j branco; creme invertido (2 ca); pigmento solúvel creme (2 ca)

Agar de Asparagina-Glucose - Bom crescimento, creme (2 ca), com micélio gasoso branco, amarelo claro, amarelo, cinzento claro, cinzento, cinzento rosado a cinzento escuro (1 1/2 ca; 1 1/2 ga, séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe, 5 fe, 3 ih) ligeiramente expandido, com vincos; creme, amarelo claro, cin zento claro a cinzento invertido (2 ca, 2 ea, séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe, 3 ih^{* 3}); pigmento solúvel amarelado claro (2 ea).

Agar de Tirosina de Gordon e Smith - crescimento moderado, castanho (41 g), ligeiramente expandido, liso a ligeiramente enrugado, com uma poucas manchas pequenas de micélio gasoso branco; castanho amarelado claro invertido (3 gc); pigmento solúvel castanho escuro (4 ni).

Agar de Caseína - Crescimento moderado, cor de canela a castanho rosado claro (3 ec, 4 ec), ligeiramente expandida, liso a ligeiramente enrugado, nenhum micélio gasoso; castanho amarelado claro invertido (3 gc); pigmento solúvel castanho amarelado (3 1c).

Agar de Bennett - Bom crescimento; creme, amarelado claro, cinzento claro, cinzento, cinzento rosado a cinzento rosado escuro (2 ca, 2 ea, sáries de cinzento próximas 3 de, 3 fe, fg, 3 ih, 5 ih, 5 ml); expandido, com vineos, micélio gasoso igual ã superfície; amarelado claro, cinzento claro o cinzento escuro invertidos (2 ea, séries de cinzento próximos dc, 3 fe, 3 ih, 3 ml); pigmento solúvel amarelado claro (2 ga) Agar de Emerson - Bom crescimento, cor de canela (3 ec), expandido, com vincos, com umas poucas manchas de micélio gasoso branco; castanho amarelado claro invertido (3 gc); pigmen-14-

to solúvel castanho amarelo (3 1c). .... ' * « » “

Agar Nutriente - Crescimento pobre a moderado, creme (2 ca), ligeiramente expandido, liso a ligeiramente enrugado, nenhum micêlio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel .

Agar de Gelatina - Crescimento moderado a bom, creme (2 ca), ligeiramente expandido, liso mas com vincos em direcção a uma esquina, nenhum micêlio gasoso; creme invertido (2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Amido - Crescimento moderado a bom, creme a cor de canela (2 ca, 3 ec), com algumas manchas de micêlio gasoso branco, ligeiramente expandido, com vincos; amarelado claro, castanho amarelado a castanho invertido (2 ca, 3 gc, 3 ie); nenhum pigmento solúvel.

Agar de cenoura e batata - crescimento moderado; creme, cinzento claro a cinzento rosado (2 ca, séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe, 3 ih); ligeiramente expandido, liso a granular micêlio gasoso igual à superfície; creme a cinzento invertido (2 ca, séries de cinzento próximo 3 fe, 3 dc); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Agua da torneira - Crescimento pobre, cinzento claro a cinzento (séries de cinzento próximas 3 dc, 3 fe), fino, liso, micêlio gasoso igual à superfície; creme, cinzento claro a cinzento invertido (2 ca, séries de cinzento próximos 3 dc, 3 fe); nenhum pigmento solúvel.

Propriedades Morfológicas - As propriedades morfológicas foram observadas depois de duas semanas de incubação no agar de cenoura e batata: massa dos esporos em séries de cor cinzento; as cadeias de esporos em secções espirais, fortemente enredados ou ligeiramente abertos, de diâmetro pequeno, atê sete voltas por cadeia de esporos, podem estar agregadas em massas

higroscópicas; esporoforos monopolármene ramidUffados, espo ros em forma de haste pequena, em forma dè haste, ou angulares, 1,2-1,8 x 0,9-1,2 um; com nós, como revelado por registo em microscopia electróniea.

Propriedades Bioquímicas - A melanina não foi produzida no caldo de extracto de levedura-triptona; o sulfeto de hidrogénio foi produzido no agar de ferro com extracto de levedura-peptona; a gelatina foi liquidificada; o amido hidrolizado; o nitrato não foi reduzido a nitrito em qualquer um do caldo de nitrato orgânico ou caldo de nitrato de dextrose; bom crescimento mas nenhuma desintegração em ambos os caldos de celulose; coagulação e peptonização no leite. Utilização de hidratos de carboro; a gmose, a arabinose, a fructose, o isonitol, o manitol, a rafinose, a ramnose, a sacarose e axilose foram utilizados.

Relações de temperatura:

212 c	28^eC	372C	452C
bom crescimento	bom crescimento	bom crescimento	bom crescimentc

Análise da Parede da célula - os hidrolisatos da célula total continham ãcido LL-diaminopimêlico e manose.

A cultura ê caracterizada pelos esporos cinzentos em massa, por a reacção de melanina ser negativa, e pelos os esporos com nós arranjados em cadeias espj_ ralmente enrolados. As cadeias de esporos podem coalescer em massas higroscópicas. A cultura utilizou glucose, arabinose fructose, inositol, manitol, rafinose, ramnose, sacarose, e

xilose. 0 hidrolisato de célula total ácido LL-diaminopimêlico e a ausência tico.

indica a .presença do dè 'açúcares de diagnôsNa base dos dados mencionados acj_ ma e de acordo com um conceito lato de espécie publicado por Tresner e Backus em Appl. Microbiol., 4: 243-250, 1956, a cuj_ tura é considerada como sendo uma nova estirpe de Streptomy ces hygroscopicus (Jensen) Waksman & Henrici. Foi depositada em AmêEican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Roekville, Maryland 20852, U.S.A. sob as provisões de Buda pest Treaty de 27 de Janeiro, 1988 sob o numero de acesso AT CC 53718.

A cultura e o isolamento de antibióticos N787-182 podem ser conduzidos sob condições idênti cas às geralmente empregues para produzir antibióticos para fermentação. A cultura pode tomar lugar em meio nutriente aquoso, que contêm fontes adequadas de carbono, azoto e ele mentos vestigiários, durante um período de vários dias sob condições aerôbicas, a uma temperatura na gama de 24 a 36^SC. Como, com a maioria das fermentações antibióticas, as quantidades e proporções dos compostos N787-182 variarão com a modi^ ficação das condições de fermentação especialmente com respej_ to a componentes de nutriente, condições de arejamento e pH.

produto do micêlio ê depois recuperado por centrifugação ou filtração e extractada com acetona ou metanol. 0 extracto de solvente ê concentrado e os produtos desejados são extractados para um solvente orgânico imiscível com âgua, como cloreto de metileno, acetato de etilo, clorofórmio, butanol ou metil-isobutil-cetona. 0 extracto de solvente ê concentrado e os produtos brutos de fórmula (I) são ainda purificados como necessário, por cromatografia. A purificação e separação finais dos componentes individuais podem ser obtidos por re petição de cromatografia em coluna ou usando uma técnica como a cromatografia líquida de alto rendimento em fase invertida (HPLC).

Em alternativa,· á cultura pode tomar lugar em pratos de agar de um meio adequado, sob condições aeróbicas a uma temperatura na gama de 24 a 36⁹C, durante vários dias. 0 agar ê depois extractado com um solvente orgânico como metanol, filtrado e o filtrado concentrado. Um maior enriquecimento e separação dos antibióticos N787-182 de fórmula (I) ê depois realizada como descrito acima.

Os antibióticos macrôlidos N787-182 são geralmente obtidos como uma mistura de compostos ten12 3 do a fórmula (I), em que R, R , R e R são como previamente definidos; contudo as proporções dos factores 1-12 podem variar dependendo nas condições de fermentação particulares empregadas.

Deste modo, o presente invento fornece um processo para a produção de compostos antibióticos N787-182 de fórmula (I) como aqui definidos, que compreende a cultura de microorganismos Streptomyces sp ATCC 53718, ou um mutante, geneticamente transformado ou seu recombinante tendo a capacidade para produzir um ou mais dos antibióticos N787-182, em meio de cultura de agar sólido ou aquoso submerso, que contêm uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inor gânicos, sob condições de fermentação aeróbicas submersos, até que uma quantidade recuperável do referido antibiótico seja obtida.

termo mutante inclui qualquer estirpe mutante que surja espontaneamente ou por aplicação das técnicas conhecidas, como a exposição a radiação de ionização, luz ultra-violeta, e/ou mutageneses químicas como N-metil-N-nitroso-uretano, nitroso-guanidina e etano-metano-sulfato, etc. Mutante geneticamente transformado e as formas recombinadas incluem mutantes e variantes genéticas produzidas por técnicas da engenharia genética, incluem por exemplo a recombinação, e transformação, a transducção, e a fusão do protoplastos, etc.

Como previamènte mencionado os compostos doiinvento são agentes antiparasíticos altamente activos tendo utilidade particular como agentes antêlmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas, acarícidas e propotores do crescimento animal.

Assim, os compostos são eficazes no tratamento de uma série de condições causadas por endo parasitas incluindo, em particular, helmintíases que são mais frequentemente causadas por um grupo de vermes para síticos, descritos como nematoídes e que podem causar perdas económicas graves em porcos, carneiros, cavalos e gado, assim como afectar animais domésticos e aves domésticas. Os compostos são também eficazes contra outros nematoídes que afectam várias espécies de animais incluindo, por exemplo, a Dirofilenia em cães e vários parasitas que podem infectar humanos incluindo parasitas gastro-intestinais como Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capiliaria, Trichuris, Enterobius e parasitas que são encontrados no sangue ou em outros tecidos e orgãos, como germes do filária e estágio extra-intestinais de Strongyloides e trichinella.

Os compostos são também de valor no tratamento de infeeções ectoparasítas, que incluem em particular ectoparasítas artrópodes de animais e de aves, eomo carraças, piolhos, acarinos, pulgas, mosca varejeira, insectos mordedores e larvas diptéreas migradoras, que podem afectar gado e cavalos.

Os compostos são também insecticidas activos contra pestes caseiras como baratas, traças de roupa, escaravelhos de carpete e a mosca caseira, assim cornos são úteis contra pragas de insectos em grãos armazenados e em plantas agrículas como aranhas, acarineos, pulgões, lagartas e contar ortopteranos migratórios como gafanhotos.

Os compostos?-de fórmuia (I) são administrados na forma de uma formulação apropriada ao uso específico em vista e às espécies particulares do animal hosdeiro a ser tratado e ao parasita ou insecto envolvido. Para serem utilizados como um antêlmíntico, os compostos são preferêncialmente administrados por injecção, tanto subcutaneamente como intramuscularmente, em alternativa eles podem ser administrado oralmente na forma de uma cápsula, pírula grande, comprimido ou remédio liquido, ou eles podem ser administrados na forma de uma formulação por vazamento ou como um implante. Estas formulações são preparadas num modo convencional de acor do com a prática veterinária padrão. Estas cápsulas, pírulas grandes ou comprimidos podem ser preparados por mistura do ingrediente activo com um diluente ou suporte finamente dividido adequado, adicionalmente contendo um agente de desintegração e/ou agente de ligação como amido, lactose, talco, ou estearato de magnésio. Uma formulação de remédio para animais pode ser preparada por dispersão do ingrediente activo numa solução aquosa em conjunto com agentes de dispersão ou de humidificação e as formulações injectáveis podem ser preparadas na forma de uma solução estéril ou emulsão. Estas formulações variarão em relação ao peso de composto activo, dependendo da espécie do animal hospedeiro a ser tratado, a gravidade e o tipo de infecção e do peso corporal do hospedeiro. Geralmente para a administração oral uma dose desde cerca de 0,001 a 10 mg por kg do peso corporal do animal, dado como uma dose única ou em doses divididas durante um período desde 1 a 5 dias, será satisfatória, mas naturalmente pode haver casos onde uma gama de dosagem superior ou menOE seja indicados e essas hipóteses estão no âmbito deste invento.

Como alternativa os compostos podem ser administrados com o produto alimentar do animal e para este fim um aditivo ou prê-mistura de alimento concentrado pode ser preparado por mistura com o alimento do animal normal.

-20Para ser utiííi-zado como um insecticida a para o tratamento de pestes agrícolas, os compostos são aplicados como pulverizadores, pôs, formulações de vazamento, emulsões e semelhante de acordo com a prática agrícola padrão.

Para ser utilizado como um promotor do crescimento ou para melhorar a razão carne magra dordura na quinta ou nos animais domésticos, os compostos podem ser administrados com o produto alimentar do animal ou com a água de beber. Em alternativa, eles podem ser administrados oralmente na forma de uma cápsula, pírula grande, comprimido ou remédio líquido, ou parènteralmente por injecção ou como um implante. Estas formulações são preparadas numa maneira convencional de acordo com a prática veterinária padrão.

Para ser utilizado em humanos, os compostos são administrados como uma formulação farmacêuticamente aceitável de acordo com a prática médica normal.

invento é ilustrado pelos Exemplos seguintes dos quais os Exemplos 1-9 descrevem a preparação, o isolamento e a identificação dos N787-182 factores 1-12 de fórmula (I), os Exemplos 10-14 ilustram as transformações químicas incluindo a preparação dos compostos 13-15, e os Exemplos 14 e 15 ilustram as suas actividades antelmíntica e insecticida.

Nos exemplos seguintes^:

A peptona Oxoid e Oxoid Lab Lemco foram fornecidos por Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, U.K.

Espectro de ultravioleta foi registado em linha usando um detector sistema diôdio Hewlett-Packard HP 1090 (quadro 2).

V

pacto electrónico foi realizado usando um espectrofetómetro de massa VG modelo 7070F (Quadro 3).

A Espectroscopia de massa por bombardeamento electrónico a alta velocidade foi realizada usando um espectrofetometro de massa VG modelo 7070E (Quadro 4).

AS amostras foram introduzidas usando uma matriz que consiste em glicerol, tio-glicerol, cloreto de sódio e água.

A espectroscopia de massa ACE foi realizada usando um espectrofetómetro de massa VG modelo 7070E (gás reagente CH^) (Quadro 5).

OS dados espectrais de ressonância magnética nuclear foram obtidos usando um espectrofetómetro Nicolet QE300 ou um General Electric GN500 (Quadro 6).

EXEMPLO 1

Fermentação em Agar do Streptomyces hygroscopicus sp ATCC 53718

Uma preparação de mieêlio do Strep tomyces hygroscopicus 5p ATCC 53718 (2 ml) que foi armazenada aos -80^eC em glicerol aquoso a 10% (v/v), foi inoculado em 100 ml de um meio estéril, que contêm extracto de carne de vaca (0,3 g), polipteptona (0,5 g), glucose (0,1 g), dextrina (2,4 g), extracto de levedura (0,5 g), carbonato de cálcio (0,4 g) em água da torneira a pH 7. Isto foi incubado num Erlenmeyer de 300 mi aos 28^SC num operador de agitação rotatória a 200 rpm, durante 3 dias. Cinco ml deste inôculo foi adicionado a 100 ml de um meio de agar fundidq?M-eix'àdo a 45-50^aC, preparado por dissolução de amido de milho (18 g), farinha de feijão de soja (12,5 g), MgSO^/^O (0,25 g), KH^PO^ (0,5 g), Na₂HP0₄.12K₂0 (3,1 g), COC1₂.6H₂0 (2,5 ml), FeSo₄.7H₂0 (5 mg), ôleo de semente de algodão (2,35 g) e agar (18 g) em água desionizada (1 litro) a pH 7. Isto foi depois vazado em 400 ml do mesmo meio de agar que foi deixado solidificar num prato (255x255 mm). Este prato foi depois incubado aos 28^aC, durante 10 dias.

Um volume total de 3 litros do agar fermentado desta maneira foi extractado com metanol, filtrado e concentrado a uma suspensão aquosa. Isto foi extractado com acetato de etilo e a camada orgânica foi concentrada a um resíduo oleoso. Este material em bruto foi dissolvido em metanol (50 ml) e armazenado durante a noite a ^20^aC, antes de ser filtrado e evaporado para dar um Óleo escuro (2,05 g). Este meterial (1,85 g) foi cromatografado em sílica gel (80 g de Kieselgei 60, malte de 230-400 Merck), eluição inicialmente com uma mistura 4:1 de diclorometano e acetato de etilo, seguido por uma mistura 1:1 destes solventes e finalmente com acetato de etilo. Um total de dez fracções foram recolhidas, evaporadas sob vácuo e cristalizadas usando uma coluna de CLAR (4,6 x 250 mm) Ultrasphene-ODS (trademark Beckman) de 5 pm, eluição com um gradiente de âgua-metanol com detecção UV a 243 nm. Os factores individuais de N787-182 foram depois isolados a partir do produto apropriado contido nas fracções ainda por CLAR, como descrito nos Exemplos 4 a 7.

EXEMPLO 2 fermentação em frascos agitados do Streptomyces hygroscopicus sp ATCC 53718 * I 1.1 · — I

Um frasco contendo mieêlio de

Streptomtces hygroscopicus sp ATCC 53718 armazenado a -70²C em glicerol aquoso a 20% (v/v) (1,8 ml) foi deixada derreter e foi usado para inocular 50 ml de um meio estéril, que consiste em glucose (0,05 g) amido (1,2 g), peptona Oxoid (0,25 g), extracto de levedura (0,25 g), Lab Lemco (0,15 g) e carbonato de cálcio (0,2 g) contidos num frasco de Erlenmeyer de 300 ml. Isto foi incubado aos 28^aC num operador de agitação rotatória a 170 rpm durante 1 dia. Depois desse periôdo de tempo, aliquotas de 1 ml foram usados para inocular 50 ml de um meio que consiste de amido (0,5 g), ácido 3-(N-morfolino)propano-sulfônico (1,0 g), farinha de feijão de soja (0,625 g) óleo de semente de algodão (0,42 g), Na₂HP0₄.12H₂0 (0,15 g), KH₂P0₄ (0,025 g), MgS0₄.7H₂0 (0,01 g), FeS0₄.7H₂0 (12 mg) e CaCl₂-6H₂0 (5 mg) que está ajustado a pH 6,7, por adição de hidróxido de sódio, contidos em frascos de 300 ml. Estes frascos foram incubados durante 10 dias num agitador como acima descrito, a 28^aC.

Os caldos de fermentação foram combinados e o mieêlio foi recuperado por filtraçãoo 0 bolo de mieêlio foi agitado com acetona e cloreto de metileno foi adicionado. A mistura foi filtrada e a solução evaporada para dar um óleo escuro. A análise deste material por CLAR, como descrito no Exemplo 1, mostrou que continha uma mistura de factores de N787-182 idênticos aos que foram obtidos no Exemplo 1.

-24EXEMPLO 3

Fermentação Submersa do Streptomyces hygroscopicus sp ATCC

53718

Dois frascos que contêm o micêlio de Streptomyces hygroscopicus ATCC 53718 armazenados a -70^sC em glicerol aquoso a 20% (v/v) (1,8 ml), foram deixados a descongelar e usados para inocular dois frascos Erlenmeyer de 300 ml cada um contendo 50 ml de um meio estéril que consiste em glucose (0,05 g), amido (1,2 g), peptona Oxoid (0,25 g), extracto de levedura (0,25 g), Lab Lemco (0,15 g) e carbonato de cálcio (0,2 g). Isto foi incubado aos 28⁹C, num operador de agitação rotatório a 170 rpm, durante um dia, apôs o qual 40 ml foram removidos de cada um dos frascos e usados para inocular dois frascos de 3 litros, cada um contendo 700 ml de um meio, que consiste em glucose (0,7 g), amido (16,8 g), peptona Oxoid (3,5 g) extracto de Levedura (3,5 g), Lab Lemco (2,25 g) e carbonato de cálcio (2,8 g). Estes frascos foram incubados como anteriormente, durante um dia e usados para inocular um fermentador de 100 litros, que contêm 70 litros de um meio que consiste em amido (700 g), farinha de feijão de soja (875 g), óleo de semente de algodão (584,5 g), MgSO^. 7H₂0 (35 g), KH₂P0₄ (35 g), Na₂HP0₄.12H₂0 (217 g), CaCl₂.6H₂0 (0,35 gl, FeS0₄.7H₂0 (0,35 g) e ácido 3-(N-morfolino)-propano-sulfônico (1,4 kg) ajustado a pH 6,7, por adição de hidróxido de sódio. Este fermentador foi operado aos 28^eC com uma velocidade de agitação de 200 rpm e um fluxo de ar de 35 litros por minuto, durante 12 dias. A espuma excessiva foi controlada por adição de poiipropi1ino-glicol (peso molecular de 2000).

micêlio foi recuperado por filtração e extractado com acetona (2 x 50 litros). A solução foi evaporada para dar uma suspensão aquosa que foi extractada

com acetato de etilo (3 x 10 litros). Este?extracto foi evaporado para dar um resíduo oleoso que foi analizado e purificado por um procedimento equivalente ao descrito no Exemplo 1 As fracções recolhidas por cromatografia em coluna de sílica foram analizadas por CLAR e evaporadas sob vácuo. As fracções que contêm os factores de N787-182 desejadas foram depois ain da processados como descrito nos Exemplos 8 e 9.

EXEMPLO 4

Isolamento de N787-182 - 1,2 e 3

A fracção 9, obtida pelo método descrito no Exemplo 1, continha N787-182 factores 1,2 e 3 por CLAR. Este material (44,7 mg) foi cromatografado numa coluna de CLAR ( 10 x 250 mm) Ultrasphere-ODS (5 jjm) (trademark Beckman), eluição com água:metanol a 25:75, a 3 mlsppor minuto.

As fracções eluídas entre os 12 e os 15 minutos continham N787-182-1, entre os 18 e os 20 minutos ο N787-182-2 e entre os 24 e os 28 minutos ο N787-182-3. As fracções apropriadas foram combinados, evaporados sob vácuo e os componentes foram caracterizados pelas suas propriedades espeetroscópicas e cro matográficas que estão sumarizados nos Quadros 1-6, seguintes

EXEMPLO 5

Isolamento de N787-182-5, 7, 10 e 11

A fracção 4 obtida pelo método descrito no Exemplo 1, continha ο N787-182 factores 5, 7, 10 e 11 por CLAR. Este material (136 mg) foi cromatografado numa coluna de CLAR (21,2 x 25 mm) C18 Zorbax ODS (8 jirn) (trademarck, Dupont), eluição com metanol:água a 82:18, a 9 mis por minuto. As fraeções eluídas entre os 30 e os 32 minutos contêm ο N787-182-5, entre os 40 e os 44 minutos, ο N787-182-7, entre os 52 e os 55 minutos ο N787-182-10 e entre os 55 e os 65 minutos ο N787-182-11. As fraeções apropriadas foram combi nadas, evaporadas sob vácuo e os componentes foram caracterizados pelas suas propriedades espectroscôpicas e cromatográfi cas sumarizadas nos Quadro 1-6.

Em adição o composto N787-182-5 deu um espectro de ressonância magnética nuclear de carbono-13 caracteristico, em deutêrio-clorofôrmio, com picos nos seguintes desvios químicos em partes por milhão, relativamente ao tetrametilsilano: J₁₇₆^₄₄« 173^93; 141,34/137^.55/

136,19,' 135,89,' 134,06,’ 125,88) 124_;84? 124,07,' 119,42*, 118_;56,’

99,04,* 83,45; 82^,23; 80,57) 77,75’, 77_;O1‘, 71.72) 68,70*, 68,38*.

67.62,' 58.00, 45,71,’ 40,11? 37_r05; 36,58,' 36,50,’ 34.61? 34,.49)

32,21,' 20.10/ 19,16 (números não resolvidos) jg,79, 17,64,° 13,29/

11.14 and 11,07.

Isolamento de N787-182-4 e 8

As fracções 7 e 8, obtidos pelo método descrito no Exemplo 1, ambos continham N787-182 factores 4 e 8, por CLAR analítica e foram combinados. Este material (160 mg) foi cromatografado numa coluna de CLAR (21,2 x 250 mm) C18 Zorbax ODS (8 pm) (trademarck, Dupont), eluição com metanol:5gua a 82:18, a 9 mis por minuto. As fracções eluí_ das entre os 25 e os 30 minutos continham N787-182-4 e entre os 37 e os 45 minutos ο N787-182-8. As fracções apropriadas foram combinadas e evaporadas sob vácuo e os componentes foram caracterizado pelas suas propriedades espectroseõpieas e cromatográficas, que estão sumarizadas nos Quadros 1-6.

EXEMPLO 7

Isolamento do N787-182-12

A fracção 2, obtida pelo método descrito no Exemplo 1 continha ο N787-182-12 por CLAR. Este material (49 mg) foi cromatografado numa coluna de CLAR (10 x 250 mm) Ultrasphere ODS (5 jim) (Trademarck-Beckman), eluição com água:metanol a 15:85, a 3 mis por minuto. As fracções elu£ das entre os 43 e os 50 minutos foram combinados e evaporados sob vácuo. Oproduto bruto N787-182-12 foi repurificado por cromatografia,'usando as mesmas condições descritas acima para dar o produto puro N787-182-12, que foi caracterizado pelas

suas propriedades espectroscópicas e cromatograficas que estão sumerizadas nos Quadros 1-6.

EXEMPLO 8

Isolamento do N787-182-6

As fracções obtidas peio procedimento descrito no Exemplo 3, que por CLAR descobriu-se que eram ricos no factor N787-182-6, foram combinados. Impurezas não polares foram removidas ainda por cromatografia em sílica gel (Kieselgel 60, mesh de 230-400, Merck), eluição inicialmente com diclorometano-hexano a 1:1. 0 material enriquecido com N787-182-6 ’fol depois recuperado por eluição com acetato de etilo. Depois de remoção do solvente sob vácuo, este material (150 mg) foi cromatografado numa coluna de CLAR (21,2 x 250 mm) C18 Zorbax ODS (8 pm) (Trademarck, Dupont), eluição com metanol:âgua a 80:20, a 9 mis por minuto. As fracções eluí^ das entre os 22 e os 25 minutos foram combinadas e evaporadas sob vácuo para dar o produto puro N787-182-6, que foi caracterizado pelas suas propriedades espectroscópicas e cromatográficas, sumarizadas nos Quadros 1-6.

Isolamento do N787-182-9

As fraeções obtidas pelo procedimento descrito no Exemplo 3, que foram encontrados por CLAR ricas no factor N787-182-9 foram combinados. As impurezas nao polares foram removidos por ainda cromatografia em sílica gel (Kieselgel 60, massa de 230-400, Merck), eluição inicialmente com diclorometano:hexano 1:1. 0 material enriquecido com N787-182-9 foi depois recuperado por eluição com acetato de etilo. Depois de remoção do solvente sob vácuo, este material (150 mg) foi cromatografado numa coluna de GLAR (21,2 x 25 mm) C18 Zorbax ODS (8 pm) (Trademarck, Dupont), eluição com metanol: água a 80:20 a 9 mis por minuto, durante 80 minutos, seguido por metanol:água a 85:15, a 9 mis por minuto, durante 60 minutos. As fraeções entre os 90 e os 100 minutos foram combinadas e evaporadas sob vácuo para dar o produto puro N787-182-9 que foi caracterizado pelas suas propriedades espectroscôpicas e cromatográficas sumarizados nos Quadros 1-6.

EXEMPLO 10

Preparação do N787-182-12 a partir do H787-182-5

A uma solução de N787-182-5 (93mg) em diclorometano anidro (1 ml) sob uma atmosfera de azoto aos 20^sC, foi adicionado piridina anidra (500 pl) e p-toli1-clorotionoformato (200 pl). A solução amarela foi magneticamente

agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Arós este período de tempo nenhum material de partida restava, verificado por cromatografia em camada fina. Qualquer precipitado formado durante o curso de reacção foi redissolvido através do pequenas adições de diclorometano. A mistura reaccional foi vazada em ãcido clorídrico 0,1M arrefecido em gelo e extractado três vezes com diclorometano. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporado sobre vácuo. 0 produto de tionocarbonato bruto foi purificado por cromatografia em colu na de silica gel (10 g de Kieselgel 60, massa de 230-400, Merck), eluição com diclorometano e subsequentemente com uma mistura de dielorometano:acetato de etilo (4:1). As fracções desejadas foram combinadas, evaporadas sob vãcuo e o resíduo foi dissolvido em tolueno anidro (2,5 ml). Hidreto de tri-n-butiltina (500 pl) e azo-bis-isobutironitrilo (1 mg) foram adicionados e a mistura foi aquecida sob refluxo sob azoto, durante 2 horas, quando a cromatografia em camada fina indicou que a reacção estava completa. 0 solvente foi evaporado sob vácuo e o produto desejado foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (15 g de Kieselgel 60, massa de 230-400, Merck), eluição com diclorometano. A purificação final foi atingida por cromatografia numa coluna (21,2 x 250 mm) C18 Zorbax ODS (8 ^im) (trademarck, Dupont), eluição com metano:água (85:15) a 9 mis por minuto. As fracções eluídas entre os 56 e os 68 minutos foram combinados e evaporados sob vácuo para dar o produto puro N787-182-12 (25 mg) idêntico ao que foi obtido no Exemplo 7.

-31Preparação do composto 15 a partir de N787-182-12

EXEMPLO 11

A uma solução de N787-182-12 (9 mg) em metanol (8 ml) foi adicionado âgua (2 ml) e ácido p-tolueno-sulfônico (5 mg6. A solução foi aquecida sob refluxo durante 12 dias e o solvente foi evaporado sob vácuo. 0 resíduo foi parcialmente purificado pela passagem através de uma torcida de sílica gel (0,6 g), eluição com diclorometano-acetato de etilo (1:1) e finalmente purificado por cromatografia numa coluna de CLAR (10 x 250 mm) Ultrasphere ODS (5 pm) (tra demarck-Beckman), eluição com água-metanol (15:85) a 3 mis por minuto. As fracções eluídas entre os 33 e os 45 minutos foram combinados e evaporados sob vácuo para dar o composto 15 puro (1,4 mg) caracterizado pelas suas propriedades espectroscôpicas que estão sumarizadas nos Quadros 2-6.

EXEMPLO 12

Preparação do Composto 14 a partir do N787-182-9

Uma solução de N787-182-9 (10 mg) em éter anidro (2 ml) sob azoto, foi arrefecido a -23⁹C e uma solução de hidreto de alumínio e litio em éter (1M, Aldrich Chemical Company, 200 pl) foi adicionado, goto a gota. Depois de 20 minutos, acetato de etilo (100 pl) foi adicionado e, depois de aquecimento a temperatura ambiente, com mistu ra foi vazada em ácido clorídrico arrefecido em gelo (0,1M) e

extractado com éter dietilico. A solução orgãnioá/amarela foi seca sobre sulfato de sódio anidro e evapaí-ado/sòb vácuo. 0 produto bruto foi cromatografado em sílica gel (Kieselgel 60, Merck, malha de 230-400), eluição com diclorometano-acetato de etilo (1:1) para dar 0 composto 14 puro (8,0 mg) caracterizado pelas suas propriedades espectroscópicas, que estão sumarizadas nos Quadros 2-6.

EXEMPLO 13

Preparação do Composto 13 a partir do N787-182-4

A uma solução de N787-182-4 (13,4 mg) numa mistura de metanol e dioxano (2:1) (2 ml) foi adi cionado ácido clorídrico 3N (150 ul). A mistura foi aquecida sob refluxo, durante 5 dias e o solvente foi evaporado sob vácuo. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia numa coluna de CLAR (10 χ 250 mm) Ultrasphere ODS (5 um) (trade mark-Beckman), eluição com âgua:metanol (30:70), a 3 mis por minuto. As fracções eluidas entre os 10 e os 19 minutos foram combinados e evaporados sob vácuo para dar o composto 13 puro (4,3 mg), caracterizado pelas suas propriedades espectroscó picas, que estão sumarizadas nos Quadros 2-6.

Actividade Anteimíntica

A actividades anteimíntica foi avji liada contra 0 Caenorhabditis elegans usando o teste de regis^ to em quadro. Luminoso in vitro descrito por K.G. Simpkin and G, L. Coles in Parasitology, 1979, 79, 19. Os antibióticos N787-182 factores 4,6,8 e 9 mataram pelo menos 95% dos germes a uma boa concentração de 0,01 partes por milhão.

EXEMPLO 15

Actividade Insecticida

Actividade contra o estágio de larva da mosca varejeira Lucilia cuprina (estirpe 0) ê dernon^ trada usando um procedimento padrão no qual em primeiro lugar as larvas instar são deixadas em contacto com papel de filtro tratado com o composto teste. 0 composto teste ê primeiro aplicado ao papel na forma de uma solução de acetona. Os pa pêis de filtro tratados são depois colocados em tubos contendo 1 ml de soro de vitela recém nascida e os primeiros larvas instar são adicionados. Os antibióticos N787-182 factores

4,6,8 e 9 mataram 100% das larvas quando aplicadas ao papel de filtro a níveis de 1 mg por metro quadrado.

QUADRO 1

Cromatografia em camada fina-Valores de Rf para factores de N787-182 seleccionados

A cromatografia em camada fina foi realizada usando pratos de sílica gel Merck 5735 Kieselgel 60 e desenvolvido usando diclorometano: acetato de etilo 4:1 e visualizada por extinção da fluorescência UV a 254 nm.

Factor

	—F
1	0,07
3	0,10
4	0,10
5	0,30
6	0,23
7	0,38
8	0,17
9	0,48
11	0,40
12	0,60

QUADRO 2

Propriedades do Espectro Ultravioleta do N787-182 factores 1-12 e dos compostos 13-15

N787-182 Factor

Absorvância máxima a (uv)

		solução de metanol	em	água
1		240	(fino),	246,	255	(fino)
2		240	(fino),	246,	255	(fino)
3		240	(fino),	246,	255	(fino)
4		239	(fino),	246,	255	(fino)
5		239	(fino),	246,	255	(fino)
6		238	(fino),	244,	253	(fino)
7		239	(fino),	246,	255	(fino)
8		238	(fino),	244,	253	(fino)
9		238	(fino),	244,	253	(fino)
10		239	(fino),	245,	255	(fino)
11		239	(fino),	246,	255	(fino)
12		240	(fino),	246,	254	(fino)
Composto	13	238	(fino),	245,	254	(fino)
Composto	14	238	(fino),	244,	253	(fino)
Composto	15	238	(fino),	245,	253	(fino)

QUADRQ 3

Espectrometria de Impacto electrônico:Fragmentos de iões prin pais para o N-787-182 factores 1-12 e para os compostos 13-15

N787-182-1 m/e 614 (M⁺), 596 (M-H₂O)⁺

N787-182-3 m/e 682 (M - H₂O)⁺

N787-182-5 m/e 684 (M⁺), 666 (M - H₂O)⁺, 597, 578, 456, 436

N787-182-7 m/e 770 (M⁺), 752 (M - H₂0)⁺, 682, 151

N787-182-8 m/e 670 (M⁺), 652 (M - H2O)⁺, 634 (M - 2H2O)⁺, 560,

454, 436, 151

N787-182-9 m/e 654 (M⁺), 566, 548, 530, 151

N787-182-10 m/e 766 (M - H₂O)⁺, 682

N787-182-11 m/e 684 (M⁺), 666 (M-H₂0)⁺, 634, 542, 524, 454, 436, 15.1

N787-182-12 m/e 668 (M⁺), 580 composto 13 m/e 600 (M⁺), 582 (M-H20)⁺, 564 (M-2H2O)⁺ composto iz, _m/_e 584 (M⁺), 568 (M-H20)⁺, 548 (M-2H2O)⁺ composto 15 m/e 598 (M⁺), 580 (M-H₂O)⁺

ς·

QUADRO 4

Espectroscopia de Massa por Bombardiamento atómico a alta velocidade

N787-182-1:	m/e	637	(M	Φ	Na⁺)	(teórico	637)
N787-182-2:	m/e	709	(M	+	Na⁺)	(teórico	709)
N787-182-3:	m/e	723	(M	+	Na⁺)	(teórico	723)
N787-182-5:	m/e	707	(M	+	Na⁺)	(teórico	707)
N787-182-6:	m/e	779	(M	+	Na⁺)	(teórico	779)
N787-182-8:	m/e	693	(M	+	Na⁺)	(teórico	693)
N787-182-9:	m/e	677	(M	+	Na⁺)	(teórico	677)
N787-182-11	:m/e	707	(M	+	Na⁺)	(teórico	707)
Composto 13	:m/e	623	(M	+	Na⁺)	(teórico	623)
Composto 14	:m/e	607	(M	+	Na⁺)	(teórico	607)

Composto 15: m/e 621 (M + Na⁺) (teórico 621)

QUADRO 5

Espectroscopia de massa por ionização química (Cl~):Iões principais

N787-182-4: m/e 671 (Μ + Η) , 582

N787-182-7: m/e 769 (M - H)“, 682, 652, 87 N787-182-10: m/e 784 (M)“, 754, 682, 652, 101, 87 N787-182-11: m/e 685 (M + H)~, 653, 635 N787-182-12: m/e 581 (M + H)~ 87

PLC 468

-39' J ' fa

QUADRO 6 /

Espectroscopia de Ressonância Magneticã Nuclear_(ÇDC1 g_)_.

N787-182-1: 5,9-5,7 (m, 2H) J 5.5-5,25 (m, 5H)‘ 4,75-4,6 (m, 2H),'

4,05 (d, 1H); 3,97 (m, 1H) 1 3/75 (d, J = 11, IH)', 3^.53 (s, 3Η)ζ 3.42 (d, 1H); l_f85 (largc$H) ’ 1/68 (d, 3H),“ 1_;15 (d. 3H),<- 0/72 (d, 3H).

N787-182-2: 5.9-5,7 (m, 2Η)ζ 5.55-5.2 (m, 5H), 4.95 (t, 1H)\ 4.68 ' I / ι (m, 2H), 4.29 (t, 1H), 3,98 (d, 1H)Í 3/83 (s, 1H),* 3.73 (d, 1H)-;

3.60 (d, 1H), 2.62 (hepteto 1H) ,^J 1.90 (largo 3lj)l.65 (d, 3H), 1.22 Z / (d, 6H), 1.17 (d, 3H); 0.95 (q, 1H), 0.70 (d, 3H).

' i

N787-182-3: 5.9-5.7 (m, 2H), 5,48 (q, 1H), 5.42 (largo 1H) 5,.4-5,2 (m, 3H)Í 4.95 (t, 1H) J 4_;68 (m, 2H)?4j05 (d, IH)⁴, 4_f00 (m, 1H)’, 3.90 (s, 1H), 3.75 (d, J = 11, 1H), 3,60 (d, IH), 3,53 (s, 3H);

i

3j45/m, IH),’ 3,25 (m, 1H) i 2/63 (hepteto, IH)', 2^40 (m, 1H), 1^85 (largo 3H) 70 (d, 3H) ,⁶ 1.,17 (d, 3Η)Ϊ 0,98 (q, IH); 0_?70 (d, 3H).

N787-182-4: 5.9-5.7 (m, 2H),‘ 5^45-5/3 (m, 5H), 4_;95 (d, IH); 4.7 (m, 2H), 4.32 (m, IH), 3.98 (d, IH) i 3,63 (m, IH)3.39 (d, IH)',

3,30 (m, IH), 2.67-2.5 (m, 2H)i 2.4-2,2 (m,.2H)í 1,90 (s, 3H)' / ‘ I ι

1,67 (d, 3H)¹, 1,60 (s, 3H) i 1,58 (s, 3H)1,42 (q, IH) i 1.20 (d, 'tf !

3H); 1.18 (d, 3H)'; 1.02 (d, 3H) ,< 0.92 (q, IH)', 0,70 (d, 3H).

I Z /

N787-182-5: 5.9-5.7 (m, 2H); 5.45-5,3 (m, 5H)J 4,95 (d, IH)? 4,7 (m, 2H), 4.05 (d, IH)¹, 3,97 (m, IH) 3_y62 (m, IH)3.53 (s, 3H)', 3,38 (d, IH), 3.33 (m, IH) 2,6 (m, IH)2,57 (hepteto, IH); 2,4-2,2 (m, 2H),' 1^82(largo 3H); 1.65 (d, 3H); 1.58 (s, 3H); 1.56 (s, 3H), 1.42 (q, IH), 1,2 (d, 3H)1.18 (d, 3H), 1.02 (d, 3H),

0.93 (q, IH), 0.70 (3H, d).

Ν787-182-6: 5.82 (dd, J = 11,3? 14,4, 1H)Í 5,75 largo j _{e 11<3};

IH), 5,43 (q, J = 6,6, IH), 5.42(largo 1H); _5<36 (dd, J = 12, 4, ' ' ' _ _

IH), 5.31 (dd, J = 14.4, 10,2, IH), 5,29 (m, IH), 4,92 (d, J =

10.5, IH), 4.91 (t, J = 10, IH)*, 4.,68 (m, 2H) ? 4.,28 (t, J = 7.2,

IH),’ 3.95 (d, J = 6j3, 1H)‘, 3,84 (s, IH)’, 3_;59 (m, IH)*, 3^.54 (d, J = 10,4, IH), 3.27 (largo, 1H)‘;3,20 (dd, J = 11.5, 9^5, IH)', 2^60 hepteto, J = 7, IH)? 2_;58 (m, 1H)?2_?55 hepteto j = 7, lHb 2.31 (d, J = 8.3), 2,28-2.20 (m, 2H), 1,87 (largo 3H);1,66 (d, J = 6.6

3H), 1.59 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 1,20 (d, J = 6.6, 3H); 1.19 (d, J = 6.6, 3H), 1.18 (d, J = 6.6, 3H), 1.17 (d, J = 6.6, 3H), 0.99 (d,

J = 6.6, 3H), 0.91 (q, J = 12, IH)0,68 (d, J = 6,6, 3H).

N787-182-7: 5.9-5.7 (m, 2H)J 5.5-5.25 (m, 5H)i 4,95 (dd, IH),

4,95 (d, IH)', 4.78-4.62 (m, 2H), 4.05 (d, IH), 3,99 (m, IH), 3.58 / ¹ (d,. IH), 3.52 (s, 3H)Í 3.35 (m, 1H),'3.23 (m, IH),'2,7-2.5 (m,

3H), 1,83 (largo 3H) 1.02 (d, 3H) / 0,70 (d, 3H).

N787-182-8: 5.8-5.7 (m, 2H)/5_f45 (dq, J = 6.7J 1,2, IH)’, 5.42 (bs, IH), 5.36-5.27 (m, 2H),' 4,97 (m, lH)/4.93 (dd, J = 10,,6,'

9.5, IH), 4.72-4.65 (m, 2H),’ 4,29 (largo, J=6, IH) / 3.95 (d, J =

6.2, IH), 3.89 (s, IH), 3.61 (m, IH) / 3.58 (d, J = 10.4, IH), 3.27 (sexteto J = 2.3, IH), 3.21 (dd, J = 11.2,' 9.6, IH), 2.61 (hepteto

J = 7, IH), 2.43 (m, IH), 2,33 (d, J = 7.9, IH), 2.27-2.18 (m,

3H), 1.88 (bs, 3H), 1,66 (dd, J = 6.7/ 1, 3H), 1.60 (s, 3H)1.54 (s, 3H), 1.20 (d, J = 7, 3H), 1.20 (d, J = 6.95, 3H), 1.00 (d, J =

6.7, 3H) / 0.90 (q, J = 12..4, IH),' 0,68 (d, J = 6.6, 3H).

' / 7 f

Ν787-182-9: 5.9-5.75 (ro, 2H), 5.45-5.3 (ro, 5H), 4.94 (d, J = 11,

IH), 4.70 (m, 2H), 4.32 (largol = 6, IH); 3,98 (d, J = 6,5, IH),

3.57 (ro, IH), 3.44 (d, J = 8, IH)·, 3.29 (m, IH) ί 2.65-2.5 (m, 2Η)ζ 1,89(largo _{3H)j lí67 (d>} j _{= 7> 3H)1<61 (Sj 3H)}, _{1>56 {g> 3H)},

1.20 (d, J = 7.5, 3H)^J, l_z18 (d, J = 6_;5, 3H), }.O2 (d, J = 7, 3H)', 0,70 (largo 3H).

N787-182-10: 5.9-5.7 (m, 2H), 5.5-5.25 (ro, 5H), 4.93 (m, 2H)

4.68 (m, 2H), 4.05 (d, IH), 3.98 (m, IH), 3,57 (d, IH), 3.52 (s, 3H), 3.23 (m, IH), 2.7-2,5 (m, 3H) ,' 1.86(largo ,3H); o. 71 (d, 3H). N787-182-11: 5.82-5.7 (m, 2H)i 5.48 (q, IH)5.43 (largo, 1H); 5.4-5,25 (m, 2H), 4.98 (m, IH) ί 4.95 (dd, IH), 4.78-4.6 (m, 2H) 4.05 (d, IH), 3.98 (ro, lH)^ 4.95 (s, IH) J 3,60 (d, 1H),^J3,52 (s, 3H), 3.35 (m, IH), 3.25 (d, IH); 2.63(^heP^teto> 2.45 (m, IH)',

1,85 (largo,3H) 1.68 (d, 3H),‘l,60 (s, 3H) í 1.55 (s, 3H), 1.20 (d, 3H), 1.00 (d, 3H), 0.70 (d, 3H).

N787-182-12: 5.9-5.7 (m, 2H)', 5.5-5.3 (m, 5H)4.,95 (d, 1H)‘, 4.7 (m, 2H), 4.06 (d, IH) · 3.98 (m, IH),’ 3,51 (s, 3H)3.33 (ra, IH)',

2.58 (hepteto, IH) ' 1,82 (largo,1H)1,65 (d, 3H) ζ 1,20 (d, 3H)’, 1.18 (d, 3H), 1.02 (d, 3H)i 0^69 (largo, 3H).

Compound 13: 5.82-5.72 (m, 2H)5.45-5,23 (m, 5H) ζ 4.73-4.64 (m,

2H), 4.29 (t, J = 6,3, IH)3.,95 (d, J = 6, IH),' 3 .£8 (s, IH)',

3,71 (d, J = 9.7, IH),¹ 3,66-3,59 (m, IH)', 3.,39 (d, J = 10,2, IH)

3,35 (dt, J = 4.4, 10.8, IH) J 3.26 (sexteto, J=2,2; IH),' l_y87 Largo, 3H1-65 (d, J = 6.,5, 3H); 1.41 (q, J = 12, IH)1.25 (largo,

3H), 1.12 (d, J = 6.5, 3H), 0.91 (q, j = 12, IH),' 0.70 (d, J =

6.6, 3H).

Compound 14: 5.85-5..72 (m, 2H)', 5^48-5,25 (m, 5H)‘, 4,78-4.65 (m,

2H), 4.31 (t, IH); 3.99 (d, IH)', 3,97 (s, 1H); 3,74 (d, IH) ,· 3.,60 (in, IH), 3.48 (d, IH) J 3,30 (sexteto, 1H)2,45-2,28 (m, 4H)“, 2,06 (m, IH), 1.90( largo, 3HJ 1..68 (d, 3H),'1,36 (t, IH),' 1.15 (d, 3Η)ζ

0.92 (q, IH), 0,72 (m, 3H).

Compound 15: 5.79 (dd, J = 14,5,' 11,3, IH) í 5.71 (dt, J = 11,3,'

2.3, IH), 5.43-5.23 (m, 5H),-»4,69 (dd, J = 14.5/2.4, lH)/4,63 (dd, J = 14.5, 2.4, IH), 4.01 (d, J = 5.6, IH),' 3,97 (largo, IH); 3_Z 70 (d, J = 10, IH) /3^.55-3.52 (m, IH),’ 3_;50 (s, 3H) ; 3.46-3.43 (m, IH), 3.30 (m, IH) ,^J 2.40-2.27 (m, 3H) 2.1-2,0 (m, IH)', 1,81 (largo,3H)i.64 (d, J = 6.7, 3H) ,* 1,34 (t, J = 11.8, IH)', 1,12 (d, J = 6.5, 3H), 0.90 (q, J = 12.5, IH) / 0,68 (m, 3H).

Claims

1^â. - Processo para a preparação de um composto antibiótico de fórmula

1 2 3 em que os substituintes R, R , R , e R no quadro seguinte:

estão representados

R R¹ jl Composto N787-182 - 1 ch₃ OH OH H N787-182 - 2 H OH OH ococh(ch₃)₂ N787-182 - 3 ch₃ OH OH OCOCH(CH₃)₂ N787-182 - 4 H ococh(ch₃)₂ OH H N787-182 - 5 ch₃ ococh(ch₃)₂ OH H N787-182 - 6 H OCOCH(CH₃)₂ OH ococh(ch₃)₂ N787-182 - 7 ch₃ OCOCH(CH₃)₂ OH 0C0CH(CH₃)₂ N787-182 - 8 H H OH 0C0CH(CH₃)₂ N787-182 - 9 H OCOCH(CH₃)₂ H H N787-182 - 10 ^CH3 OCOCH(CH₃)CH₂CH 3 ^0H OCOCH(CH₃)₂ N787-182 - 11 ch₃ H OH OCOCH(CH₃)₂ N787-182 - 12 CH₃ OCOCH(CH₃)₂ H H composto 13 H OH OH H composto H OH H H composto ic, CH. OH ° H H

caracterizado por compreender a cultura do mieroorganismo Streptomyces Sp ATCC 53718, ou de uma sua forma mutante, geneticamente transformado ou recombinante, tendo a capacidade de produzir um ou mais dos' antibióticos N787-182, num meio de cultura de agar sólido ou aquoso submerso, contendo uma fonte assimilável de carbono, azoto e de saFs^ijt^-gtri^tos, sob condições de fermentação aeróbica submersa, áfe que uma quantidade recuperável do referido antibiótico Ν787-Ί82 seja obtido, e a recuperação do referido antibiótico e opcionalmente o isolamento e a purificação de um mais dos referidos factores do N787-182, e a remoção do grupo acilo da posição 13 do N787-182 factor 4, do N787-182 factor 9 ou do N787-182 factor 12 para originar os compostos 13, 14 ou 15 da fórmula (I) como atrás definidos, respectivamente.

2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir o composto N787 -182-4 de fórmula (I), em que R ê H, R¹ ê -OCOCH(CH^)_P, R² ê OH e R³ é H.

3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir o composto N787-182-6 de fórmula (I), em que R é H, R¹ ê -OCOCH(CH3)3, R²é OH e R³ ê 0C0CH(CH3)₂.

4^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por produzir o composto N787-182-8 de fórmula (I), em que R ê H, R^ ê H, R² é OH e R³ ê -ococh(ch₃)₂.

5-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir o composto N787 -182-9 de fórmula (I), em que R é H, R¹ ê -OCOCH(CH₃)₂, R² ê H e R³ ê H.

6^â. - Cultura biologicamente pura caracterizada por ser de uma estirpe do gênero Streptomyces, uma sua forma mutante, geneticamente transformada ou forma recombinante, sendo o referido microorganismo capaz de produzir o composto antibiótico da reivindicação 1, numa quantidade recuperâvel, por cultura num meio nutriente aquoso, conten do fontes assimiláveis de carbono, azoto e de sais inorgânicos.

7^â. - Microorganismo caracterizado por ser o Streptomyces hygroscopicus AJ.CC 53718.